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TW201905461A - 用以檢測大腸癌之生物標記 - Google Patents

用以檢測大腸癌之生物標記

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Publication number
TW201905461A
TW201905461A TW107122527A TW107122527A TW201905461A TW 201905461 A TW201905461 A TW 201905461A TW 107122527 A TW107122527 A TW 107122527A TW 107122527 A TW107122527 A TW 107122527A TW 201905461 A TW201905461 A TW 201905461A
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TW
Taiwan
Prior art keywords
colorectal cancer
sequence number
annexin
serial
proteins
Prior art date
Application number
TW107122527A
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English (en)
Inventor
朝長毅
白水崇
Original Assignee
國立研究開發法人醫藥基盤．健康．營養研究所
日商電化生研股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 國立研究開發法人醫藥基盤．健康．營養研究所, 日商電化生研股份有限公司 filed Critical 國立研究開發法人醫藥基盤．健康．營養研究所
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Abstract

本發明提供一種用以早期地檢測大腸癌之生物標記。 本發明之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記包含以下之1～22之22個蛋白質中之至少1個蛋白質、或1～22個蛋白質之部分肽中之至少1個肽： 1.膜聯蛋白A11(Annexin A11)(ANXA 11)(序列編號1)； 2.膜聯蛋白A3(Annexin A3)(ANXA 3)(序列編號2)； 3.膜聯蛋白A4(Annexin A4)(ANXA 4)(序列編號3)； 4.腱生蛋白-N(Tanascin-N)(TNN)(序列編號4)； 5.轉鐵蛋白受體蛋白1(Transferrin receptor protein 1)(TFRC)(序列編號5)； 6.葡萄糖轉運蛋白1(GLUT-1)(SLC2A1)(序列編號6)； 7.補體成分C9(Complement component C9)(C9)(序列編號7)； 8.CD88抗原(CD88 antigen)(C5AR1)(序列編號8)； 9.78kDa葡萄糖調節蛋白(78kDa glucose-regulated protein)(HSPA5)(序列編號9)； 10.α-1-酸性糖蛋白(α-1-acid glycoprotein)(ORM1)(序列編號10)； 11.基質金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase-9)(MMP9)(序列編號11)； 12.血管生成素-1(Angiopoietin-1)(ANGPT1)(序列編號12)； 13.CD67抗原(CD67 antigen)(CEACAM8)(序列編號13)； 14.黏蛋白-5B(Mucin-5B)(MUC5B)(序列編號14)； 15.銜接蛋白GRB2(Adapter protein GRB2)(GRB2)(序列編號15)； 16.膜聯蛋白A5(Annexin A5)(ANXA 5)(序列編號16)； 17.嗅質蛋白-4(Olfactomedin-4)(OLFM4)(序列編號17)； 18.中性胺基酸轉運蛋白B(0)(Neutral amino acid transporter B(0))(SLC1A5)(序列編號18)； 19.三肽基肽酶1(Tripeptidyl-peptidase 1)(TPP1)(序列編號19)； 20.熱休克相關70kDa蛋白2(Heat shock-related 70kDa protein 2)(HSPA2)(序列編號20)； 21.蛋白酶體次單元α型-5(Proteasome subunit alpha type-5)(PSMA5)(序列編號21)；或 22.嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin)(LCN2)(序列編號22)。

Description

用以檢測大腸癌之生物標記
本發明係關於一種可用於檢測大腸癌之新穎之蛋白質或肽生物標記。
大腸癌(CRC)為世界上頻度最高之癌症之一，用於CRC之較有效之生物標記之開發對人類之生存率提高而言必不可少。然而，目前所使用之大腸癌之診斷法僅為糞便潛血或CEA(carcinoembryonic antigen，癌胚抗原)等精度非常低者，尚未發現可早期地高精度地診斷大腸癌之新穎之生物標記，而切實地要求血中生物標記。
迄今為止根據大規模之組學研究，雖然發現了大量癌症相關因子及癌症之生物標記候選，但尚不存在實現了臨床應用之血中生物標記。作為證明該情況之證據，近年來之由美國食品藥物管理局(FDA)所承認之生物標記極少而為每年2件以下。認為該停滯之原因之一係於生物標記開發之戰略方面存在嚴重之問題。
先前，於多數臨床檢査中，蛋白質生物標記之檢測係藉由抗體基質之定量化分析法(主要使用酵素結合抗體免疫測定法(ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，酵素結合免疫吸附分析法)))而進行。該等方法由於較大地依賴於抗體之品質，故而於精度、尤其是特異度方面存在問題，又，難以同時評價多項目之標記候選。
因質譜儀(MS)之最近之進步，出現了臨床檢査法大幅改變之可能性。其原因在於，作為代表靶向蛋白質組學(Targeted Proteomics)之方法之選擇反應監視/多重反應監視法(SRM/MRM)不僅能夠以高精度進行生物標記蛋白質之定量，亦可同時定量多項之標記。於以前之報告中，Whiteaker等人係使用SRM/MRM法而實施患者血漿中之多項之乳癌生物標記候選蛋白質之定量(參照非專利文獻1)。除此以外，亦包括本發明者等人之團體之報告在內，報告有若干使用SRM/MRM法而驗證各種癌症之生物標記候選蛋白質之例(參照非專利文獻2～4)。
如此，使用SRM/MRM法之靶向蛋白質組學成為用以發現生物標記之強有力之工具。 [先前技術文獻] [非專利文獻]
非專利文獻1：Whiteaker, J. et al., Nat. BIotechnol. 29, 625-634 (2011) 非專利文獻2：Kume, H. et al., Mol. Cell. Proteomics 13, 1471-1484 (2014) 非專利文獻3：Muraoka, S. et al., J. Proteome Res. 11, 4201-4210 (2012) 非專利文獻4：Narumi, R. et al., J. Proteome Res. 11, 5311-5322 (2012)
[發明所欲解決之問題]
本發明之目的在於提供一種用以早期地檢測大腸癌之生物標記。 [解決問題之技術手段]
本發明者等人首先利用PubMed之文獻檢索而檢索CRC生物標記候選蛋白質。業界為了於血中檢測該等生物標記候選蛋白質，而著眼於血中之細胞外囊泡(EV)。其原因在於，EV不僅最近被關注到作為細胞間通訊之介質而發揮作用，亦據稱與各種疾病之發病或發展相關，且認為含有大量生物標記候選。又，於欲使用質譜儀檢測血中之微量之蛋白質時，存在因白蛋白等大量存在於血中之夾雜蛋白質，而阻礙微量之標記候選蛋白質之檢測之情形。然而，於對血中之EV進行純化時，由於去除大量之夾雜蛋白質，故而可進行EV中之微量之生物標記候選蛋白質之檢測。因此，認為含EV之蛋白質為有前景之生物標記候選。
本發明者等人於在文獻檢索中發現之生物標記候選蛋白質之中，於有可能存在於血中EV之蛋白質中鎖定候選，並使用SRM/MRM法進行該等蛋白質之定量。作為其結果，特定出用於CRC之早期診斷之若干生物標記候選，從而完成本發明。
即，本發明之態樣係如下所述。 [1]一種用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其包含以下之1～22之22個蛋白質中之至少1個蛋白質、或1～22個蛋白質之部分肽中之至少1個肽： 1.膜聯蛋白A11(Annexin A11)(ANXA 11)(序列編號1)； 2.膜聯蛋白A3(Annexin A3)(ANXA 3)(序列編號2)； 3.膜聯蛋白A4(Annexin A4)(ANXA 4)(序列編號3)； 4.腱生蛋白-N(Tanascin-N)(TNN)(序列編號4)； 5.轉鐵蛋白受體蛋白1(Transferrin receptor protein 1)(TFRC)(序列編號5)； 6.葡萄糖轉運蛋白1(GLUT-1)(SLC2A1)(序列編號6)； 7.補體成分C9(Complement component C9)(C9)(序列編號7)； 8.CD88抗原(CD88 antigen)(C5AR1)(序列編號8)； 9.78kDa葡萄糖調節蛋白(78kDa glucose-regulated protein)(HSPA5)(序列編號9)； 10.α-1-酸性糖蛋白(α-1-acid glycoprotein)(ORM1)(序列編號10)； 11.基質金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase-9)(MMP9)(序列編號11)； 12.血管生成素-1(Angiopoietin-1)(ANGPT1)(序列編號12)； 13.CD67抗原(CD67 antigen)(CEACAM8)(序列編號13)； 14.黏蛋白-5B(Mucin-5B)(MUC5B)(序列編號14)； 15.銜接蛋白GRB2(Adapter protein GRB2)(GRB2)(序列編號15)； 16.膜聯蛋白A5(Annexin A5)(ANXA 5)(序列編號16)； 17.嗅質蛋白-4(Olfactomedin-4)(OLFM4)(序列編號17)； 18.中性胺基酸轉運蛋白B(0)(Neutral amino acid transporter B(0))(SLC1A5)(序列編號18)； 19.三肽基肽酶1(Tripeptidyl-peptidase 1)(TPP1)(序列編號19)； 20.熱休克相關70kDa蛋白2(Heat shock-related 70kDa protein 2)(HSPA2)(序列編號20)； 21.蛋白酶體次單元α型-5(Proteasome subunit alpha type-5)(PSMA5)(序列編號21)；或 22.嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin)(LCN2)(序列編號22)。 [2]如[1]之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其係組合如[1]之1～22之22個蛋白質之2個以上之蛋白質、或1～22個蛋白質之部分肽之2個以上之肽而成。 [3]如[1]或[2]之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其中如[1]之1～22個蛋白質之部分肽係包含序列編號23～59所表示之胺基酸序列之肽。 [4]如[1]之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其包含以下之12個蛋白質中之至少1個蛋白質、或該12個蛋白質之部分肽中之至少1個肽： 1.膜聯蛋白A11(序列編號1)； 2.膜聯蛋白A3(序列編號2)； 3.膜聯蛋白A4(序列編號3)； 4.腱生蛋白-N(序列編號4)； 5.轉鐵蛋白受體蛋白1(序列編號5)； 6.葡萄糖轉運蛋白1(序列編號6)； 8.CD88抗原(序列編號8)； 11.基質金屬蛋白酶9(序列編號11)； 16.膜聯蛋白A5(序列編號16)； 17.嗅質蛋白-4(序列編號17)； 19.三肽基肽酶1(序列編號19)；或 22.嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白(序列編號22)。 [5]如[4]之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其係組合如[4]之12個蛋白質之2個以上之蛋白質、或該12個蛋白質之部分肽之2個以上之肽而成。 [6]如[4]或[5]之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其中如[4]之12個蛋白質之部分肽係包含序列編號23～34、37、38、43、44、53、54、56及59所表示之胺基酸序列之肽。 [7]如[1]之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其包含膜聯蛋白A4或膜聯蛋白A11、或該等之部分肽。 [8]如[7]之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其係組合膜聯蛋白A4與膜聯蛋白A11、或膜聯蛋白A4之部分肽與膜聯蛋白A11之部分肽而成。 [9]如[7]或[8]中所記載之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其中膜聯蛋白A4及膜聯蛋白A11之部分肽係包含序列編號23、24、27及28所表示之胺基酸序列之肽。 [10]一種用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其係組合如[1]至[9]中任一項之大腸癌生物標記與CEA而成。 [11]一種大腸癌之檢測方法，其包括測定生物體試樣中之如[1]至[10]中任一項之大腸癌生物標記。 [12]一種大腸癌之檢測方法，其係測定生物體試樣中之如[1]至[10]中任一項之大腸癌生物標記，於該生物標記與健康人相比以高濃度存在之情形時，判斷為罹患有大腸癌。 [13]如[11]或[12]之大腸癌之檢測方法，其中生物體試樣為血液中之細胞外囊泡(EV)。 [14]如[11]至[13]中任一項之大腸癌之檢測方法，其中檢測係藉由免疫學測定法或質譜法而進行。 [15]一種大腸癌之檢測套組，其包含針對生物體試樣中之如[1]至[10]中任一項之大腸癌生物標記之抗體。
本說明書包含成為本案之優先權之基礎之日本專利申請編號2017-129941號之揭示內容。 [發明之效果]
藉由本發明之生物標記，可高感度且高特異性地檢測大腸癌，尤其可檢測早期之大腸癌。進而，藉由組合生物標記，可進行更高感度且高特異之檢測。
以下，詳細地說明本發明。
本發明係作為用以檢測大腸癌(CRC，colorectal cancer)之生物標記之蛋白質或其部分肽。又，本發明係使用該生物標記檢測大腸癌之方法。進而，本發明係取得用以使用該生物標記而診斷大腸癌之輔助性資料之方法。藉由使用本發明之生物標記，可早期地檢測大腸癌。
本發明中所使用之生物標記例如可藉由蛋白質組學分析技術而進行搜尋。例如可由以下之步驟進行搜尋。
首先，使用大腸癌患者之組織藉由定量鳥槍法蛋白質組學而搜尋成為生物標記之候選之蛋白質。此時，可於健康人之大腸組織或大腸良性腫瘤組織、無轉移之大腸癌病例之組織及存在轉移之大腸癌病例之組織之間進行比較定量，且將於組織間確認到變動之蛋白質鎖定為候選蛋白質。又，生物標記候選蛋白質之搜尋亦可藉由使用於先前研究中被認為與大腸癌之發病或發展相關之蛋白質而進行。藉由使用SRM/MRM(Selected reaction monitoring(選擇反應監視)/Multiple reaction monitoring(多重反應監視))法(Gillette MA et al., Nat Methods. 2013; 10: 28-34)之靶向蛋白質組學法，可進行於組織間之表現量之變動之驗證，該SRM/MRM法可藉由對該等生物標記候選，選擇性地破壞特定之質量之親體離子，並檢測所生成之子體離子中之特定之離子，而自複雜之樣品內高感度地檢測來自成為靶之蛋白質之肽。藉由該驗證，可選拔大腸癌生物標記之最終候選。繼而，確認該等生物標記候選是否可於血液等生物體試樣中進行檢測、定量。此時，較佳為於血中之細胞外囊泡(EV)部分中進行檢測、定量。
於本發明之方法中，作為用以檢測大腸癌之生物標記，可列舉以下之蛋白質。 1.膜聯蛋白A11(Annexin A11)(ANXA 11)(序列編號1) 2.膜聯蛋白A3(Annexin A3)(ANXA 3)(序列編號2) 3.膜聯蛋白A4(Annexin A4)(ANXA 4)(序列編號3) 4.腱生蛋白-N(Tanascin-N)(TNN)(序列編號4) 5.轉鐵蛋白受體蛋白1(Transferrin receptor protein 1)(TFRC)(序列編號5) 6.葡萄糖轉運蛋白1(GLUT-1)(SLC2A1)(序列編號6) 7.補體成分C9(Complement component C9)(C9)(序列編號7) 8.CD88抗原(CD88 antigen)(C5AR1)(序列編號8) 9.78kDa葡萄糖調節蛋白(78kDa glucose-regulated protein)(HSPA5)(序列編號9) 10.α-1-酸性糖蛋白(α-1-acid glycoprotein)(ORM1)(序列編號10) 11.基質金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase-9)(MMP9)(序列編號11) 12.血管生成素-1(Angiopoietin-1)(ANGPT1)(序列編號12) 13.CD67抗原(CD67 antigen)(CEACAM8)(序列編號13) 14.黏蛋白-5B(Mucin-5B)(MUC5B)(序列編號14) 15.銜接蛋白GRB2(Adapter protein GRB2)(GRB2)(序列編號15) 16.膜聯蛋白A5(Annexin A5)(ANXA 5)(序列編號16) 17.嗅質蛋白-4(Olfactomedin-4)(OLFM4)(序列編號17) 18.中性胺基酸轉運蛋白B(0)(Neutral amino acid transporter B(0))(SLC1A5)(序列編號18) 19.三肽基肽酶1(Tripeptidyl-peptidase 1)(TPP1)(序列編號19) 20.熱休克相關70kDa蛋白2(Heat shock-related 70kDa protein 2)(HSPA2)(序列編號20) 21.蛋白酶體次單元α型-5(Proteasome subunit alpha type-5)(PSMA5)(序列編號21) 22.嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin)(LCN2)(序列編號22)
又，作為可用作用以檢測大腸癌之生物標記之上述蛋白質之部分肽，可列舉： 包含序列編號23或24所表示之胺基酸序列之肽(膜聯蛋白A11之部分肽)、 包含序列編號25或26所表示之胺基酸序列之肽(膜聯蛋白A3之部分肽)、 包含序列編號27或28所表示之胺基酸序列之肽(膜聯蛋白A4之部分肽)、 包含序列編號29或30所表示之胺基酸序列之肽(腱生蛋白-N之部分肽)、 包含序列編號31或32所表示之胺基酸序列之肽(轉鐵蛋白受體蛋白1之部分肽)、 包含序列編號33或34所表示之胺基酸序列之肽(葡萄糖轉運蛋白1之部分肽)、 包含序列編號35或36所表示之胺基酸序列之肽(補體成分C9之部分肽)、 包含序列編號37或38所表示之胺基酸序列之肽(CD88抗原之部分肽)、 包含序列編號39或40所表示之胺基酸序列之肽(78kDa葡萄糖調節蛋白之部分肽)、 包含序列編號41或42所表示之胺基酸序列之肽(α-1-酸性糖蛋白之部分肽)、 包含序列編號43或44所表示之胺基酸序列之肽(基質金屬蛋白酶9之部分肽)、 包含序列編號45或46所表示之胺基酸序列之肽(血管生成素-1之部分肽)、 包含序列編號47或48所表示之胺基酸序列之肽(CD67抗原之部分肽)、 包含序列編號49或50所表示之胺基酸序列之肽(黏蛋白-5B之部分肽)、 包含序列編號51或52所表示之胺基酸序列之肽(銜接蛋白GRB2之部分肽)、 包含序列編號53所表示之胺基酸序列之肽(膜聯蛋白A5之部分肽)、 包含序列編號54所表示之胺基酸序列之肽(嗅質蛋白-4之部分肽)、 包含序列編號55所表示之胺基酸序列之肽(中性胺基酸轉運蛋白B(0)之部分肽)、 包含序列編號56所表示之胺基酸序列之肽(三肽基肽酶1之部分肽)、 包含序列編號57所表示之胺基酸序列之肽(熱休克相關70kDa蛋白2之部分肽)、 包含序列編號58所表示之胺基酸序列之肽(蛋白酶體次單元α型-5之部分肽)、 包含序列編號59所表示之胺基酸序列之肽(嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白之部分肽)。
於本發明中，使用上述蛋白質或該蛋白質之部分肽作為生物標記，於序列編號1～59所表示之胺基酸序列中，亦包含含有1個或數個胺基酸缺失、置換、附加之胺基酸序列之蛋白質或肽，該等蛋白質或肽亦可於本發明之方法中用作生物標記。此處，所謂「1個或數個」係指「1個或3個」、「1個或2個」或「1個」。
肽通常係指分子量1萬以下之胺基酸利用肽鍵連結而成者，作為胺基酸殘基之數量，係指數個至50個以下左右者。於本說明書中，可使用蛋白質或其部分肽作為生物標記，於部分肽之情形時，係指具有蛋白質所具有之胺基酸序列之一部分之部分胺基酸序列之肽，且分子量並無特別限定，較佳為1萬以下者。部分肽有於利用轉錄、轉譯之表現合成過程中生成之情形，又，亦有於合成為蛋白質後，於活體內受到消化分解而生成為消化分解產物肽之情形。
於該等蛋白質及肽中，較佳為使用ROC分析之結果得知能夠以良好之檢測感度及特異度檢測大腸癌的葡萄糖轉運蛋白1、轉鐵蛋白受體蛋白1、膜聯蛋白A5、基質金屬蛋白酶9、膜聯蛋白A4、膜聯蛋白A11、腱生蛋白-N、膜聯蛋白A3、嗅質蛋白-4、CD88抗原、嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白或三肽基肽酶1、或其等之部分肽作為用以檢測大腸癌之生物標記。進而較佳為使用膜聯蛋白A4或膜聯蛋白A11、或其等之部分肽作為用以檢測大腸癌之生物標記。
於本發明中，可使用上述22個蛋白質及部分肽中之至少一個蛋白質及/或部分肽作為生物標記，若使用較佳為2種以上、進而較佳為3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、10種以上、11種以上、12種以上、13種以上、14種以上、15種以上、16種以上、17種以上、18種以上、19種以上、20種以上、21種以上、或22種蛋白質或部分肽，則能夠以更高精度檢測大腸癌。於該情形時，可為不同之蛋白質之組合，亦可為某蛋白質與該蛋白質以外之蛋白質之部分肽或部分肽之組合。又，可僅將複數個完整之蛋白質作為生物標記。如此，藉由使用複數個蛋白質或部分肽作為生物標記，可更正確地檢測大腸癌，又，可準確地判斷大腸癌之發展狀態。
例如可列舉：葡萄糖轉運蛋白1與轉鐵蛋白受體蛋白1之組合、葡萄糖轉運蛋白1與血管生成素-1之組合、基質金屬蛋白酶9與轉鐵蛋白受體蛋白1之組合、轉鐵蛋白受體蛋白1與嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白之組合、轉鐵蛋白受體蛋白1與血管生成素-1之組合、轉鐵蛋白受體蛋白1與銜接蛋白之組合、78kDa葡萄糖調節蛋白與三肽基肽酶1之組合、腱生蛋白-N與嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白之組合、轉鐵蛋白受體蛋白1與嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白與血管生成素-1之組合、轉鐵蛋白受體蛋白1與嗅質蛋白-4之組合、腱生蛋白-N與血管生成素-1之組合、嗅質蛋白-4與血管生成素-1之組合、腱生蛋白-N與嗅質蛋白-4之組合、嗅質蛋白-4與三肽基肽酶1之組合等。亦可為各蛋白質之部分肽之組合。
又，藉由將上述蛋白質或部分肽與自先前以來一直作為大腸癌之生物標記而為大眾所知之CEA(癌胚抗原)組合而用作用以檢測大腸癌之生物標記，與單獨使用相比，能夠以高感度且高特異度進行檢測。
於大腸癌患者體內，上述蛋白質或部分肽之表現上升。因此，只要對血液中之該等蛋白質或部分肽進行定量即可。此處，血液包含血清及血漿。又，上述蛋白質係存在於細胞外囊泡(EV)中。因此，可單離存在於血中之EV，必要時濃縮後，檢測EV中之蛋白質或部分肽。EV例如可藉由超離心分離而分離為EV部分。又，可利用對EV特異性之標記進行單離。作為EV之標記，可列舉：CD9、CD63、CD81等，可利用結合有針對該等標記之抗體之磁珠等而進行分離。又，作為其他EV之標記，可列舉磷脂醯絲胺酸(PS)，可利用結合有對磷脂醯絲胺酸具有親和性之磷脂醯絲胺酸結合蛋白之磁珠等而進行分離。作為磷脂醯絲胺酸結合蛋白，例如有含T細胞免疫球蛋白、黏蛋白區之分子4(Tim4)、膜聯蛋白A5(Annexin A5)、膜聯蛋白V(Annexin V)、乳脂肪球-EGF因子(Vascular Endothelial Growth Factor，血管內皮生長因子)蛋白8(MFG-E8)等。
於本發明之方法中，對生物體試樣中之蛋白質/部分肽分佈進行調查，但所使用之生物體試樣並無限定。例如可列舉可自活體採集之液體試樣、例如全血、血清、血漿、尿、唾液等體液。再者，根據生物體試樣之保存狀態，生物體試樣中之蛋白質、部分蛋白質及部分肽有時亦會進而受到分解，故而生物體試樣較佳為不反覆進行冷凍融解而使用。又，可向生物體試樣中添加蛋白酶抑制劑等。或者，亦可使用FACS(Fluorescence activated cell sorter，螢光活化細胞分選儀)或流式細胞儀，以上述標記為指標而分離外泌體(Exosome)。
只要自所單離之外泌體萃取蛋白質或肽，並測定上述蛋白質或肽即可。
蛋白質或部分肽可藉由各種方法而進行檢測。於以下進行例示，但並不限定於該等。
例如可藉由使用針對欲檢測之各蛋白質或部分肽之抗體之免疫學測定法而進行測定。作為免疫學測定法，例如可列舉：固相免疫測定法(RIA(Radioimmunoassay，放射免疫分析法)、EIA(Enzyme immunoassay，酵素免疫分析法)、FIA(Fluorescence Immunoassay，螢光免疫分析法)、CLIA(Chemiluminescence Immunoassay，化學發光免疫分析法)等)、斑點印跡(dot blotting)法、乳膠凝聚法(LA：Latex Agglutination-Turbidimetric Immunoassay(乳膠凝聚-免疫比濁法))、免疫層析法等。抗體可固定於基板上而使用。
其中，就定量性之觀點而言，較佳為作為EIA(Enzyme Immunoassay)法之1種之ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，酵素結合免疫吸附分析)法。於ELISA法中，可向將抗體固相化而成之微量滴定盤之孔中添加檢體，進行抗原、抗體反應，進而添加進行了酵素標記之抗體，而進行抗原、抗體反應，洗淨後，與酵素基質反應、顯色，測定吸光度並檢測樣品中之標記蛋白質或部分肽，並且根據其測定值而算出檢體中之蛋白質或部分肽濃度。又，亦可使用進行了螢光標記之抗體，於進行抗原、抗體反應後測定螢光。抗原抗體反應可於4℃～45℃、更佳為20℃～40℃、進而較佳為25℃～38℃下進行，又，反應時間為10分鐘～18小時，更佳為10分鐘～1小時，進而較佳為30分鐘～1小時左右。
於免疫學方法中所使用之針對標記蛋白質或部分肽之抗體可為單株抗體，亦可為多株抗體，亦可使用單株抗體之Fab、F(ab')、F(ab')2 等結合活性片段。
本發明亦包含大腸癌檢測用檢査試劑或套組，其包含針對上述22種蛋白質或其部分肽之一種或複數種之抗體。
亦可藉由使用質譜儀之質譜法分析用以檢測大腸癌之生物標記蛋白質或其部分肽。質譜法尤其適合部分肽之檢測。
又，亦可使用質譜儀進行檢測。尤其於生物標記蛋白質之部分肽之檢測中較適合利用質譜儀。質譜儀包含試樣導入部、離子化室、分析部、檢測部、記錄部等。作為離子化法，只要使用電子衝擊離子化(EI)法、化學離子化(CI)法、場脫附(FD)法、二次離子化(SIMS(Secondary Ion Mass Spectrometry，二次離子質譜))法、高速原子碰撞(FAB)法、基質輔助雷射脫附離子化(MALDI，matrix-assisted laser desorption ionization)法、電噴霧離子化(ESI)法等即可。又，分析部可使用雙聚焦質譜儀、四極型質譜儀、飛行時間型質譜儀、傅立葉變換質譜儀、離子回旋質譜儀等。為了精密之分析，亦可使用使2台質譜儀結合而成之串聯質譜儀(MS/MS)。
質譜儀可單獨使用，亦可與液相層析儀等分離設備或測定設備等連接，可利用與高速液相層析儀組合而成之液相層析質譜分析儀(LC/MS(Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，液相層析-質譜聯用儀)、LC/MS/MS(Liquid Chromatography/Mass Spectrometry/Mass Spectrometry，液相層析-串聯質譜儀))進行分析。為了肽之定量檢測，質譜分析可藉由在該領域中廣泛地使用之LC/MS(LC/MS/MS)系統之利用三重四極型質譜儀之選擇反應監視(SRM，Selected reaction monitoring)或多重反應監視(MRM，Multiple reaction monitoring)而進行。藉由SRM/MRM，可同時測定多因子，且能夠以1次之測定同時測定數百種蛋白質或肽。
於在自被試驗體採集之樣品中大量存在上述生物標記蛋白質或部分肽之情形時，即為陽性之情形時，可判斷該被試驗體罹患有大腸癌。
於本發明中，亦可將自健康人採集之樣品作為陰性對象而同時進行測定。於該情形時，於被試驗體罹患有大腸癌之情形時，被試驗體之檢體中之生物標記蛋白質或部分肽濃度與健康人相比上升，故而於被試驗體中之生物標記蛋白質或部分肽濃度多於健康人之情形時，生物標記蛋白質或部分肽被判斷為陽性，而可判斷被試驗體罹患有大腸癌。樣品中之生物標記蛋白質或部分肽是否為陽性係預先對藉由SRM/MRM法檢測之生物標記肽之峰值面積值與作為內部標準之穩定同位素標記肽之峰值面積值的比或抗體測定值決定截止值，於將該截止值作為基準而超過截止值之情形時，可判斷為陽性。
截止值例如可藉由ROC(receiver operating characteristic curve，受試者工作特性曲線)分析而決定。又，藉由ROC分析可決定本發明之方法之診斷精度(感度及特異性)。ROC分析係對作為試樣之自大腸癌患者採集之試樣與自健康者採集之試樣測定生物標記蛋白質或部分肽，算出各截止值下之感度及偽陽性率(1-特異性)，並繪製於將橫軸設為1-特異性，且將縱軸設為感度之座標上。
對本發明之方法之測定結果藉由ROC分析而分析診斷精度之情形時之曲線下表面積(AUC，area under the curve)高至0.9以上，感度為70%以上，較佳為80%以上，進而較佳為85%以上，進而較佳為90%以上，特異性為70%以上，較佳為75%以上，進而較佳為80%以上。藉由本發明之方法，能夠以非常高之精度檢測初期之大腸癌。 [實施例]
藉由以下之實施例具體地說明本發明，但本發明並不受該等實施例之限定。
方法 大腸癌患者及健康者血清及大腸癌培養細胞 採集大腸癌患者51名、及健康者26名之血清(於千葉大醫學部採集)。各檢體血清樣品在分析之前於-80℃下保存。
4個大腸癌細胞株HCT116(ATCC; CCL-247)、DLD-1(ATCC; CCL-221)、SW480(ATCC; CCL-228)與SW620(ATCC; CCL-227)係利用含10%牛血清(FBS)及抗生素之RPMI-1640培養基(Gibco Laboratories)進行培養。
於細胞增殖至亞融合前，各細胞係於5%CO2 之培養箱中維持為37℃而進行培養，並使之增殖至亞融合。其後，該等培養細胞係利用不含FBS之培養基洗淨，並添加不含新鮮FBS之培養基。進而，於在培養箱中培養48小時後，收集適應上清液培養基，而將EV(extracellular vesicle)設為單離用之樣品。
EV(extracellular vesicle：細胞外囊泡)之單離 EV之單離係藉由超離心法進行。藉由在離心管之底部鋪上蔗糖緩衝劑，可於EV回收時高效率地分離低密度之夾雜物。作為超離心前之處理，以300 g將血清100 μl離心分離10分鐘，而去除較大之夾雜物。其後，使所回收之上清液通過0.22 μm旋轉過濾器(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)，以100,000 g利用30%之蔗糖/D2 O緩衝劑離心分離90分鐘。回收緩衝劑，進而以100,000 g再次利用超離心分離機處理70分鐘後，回收沈澱於離心管中之EV部分。
自EV之蛋白質萃取及消化 蛋白質萃取及蛋白質消化係藉由相間轉移溶解劑(PTS：Phase transfer surfactant)操作說明(Masuda T et al. J. Proteome Res. 7, 731-740 (2008))而進行。EV部分蛋白質係於利用MPEX PTS試劑套組(GL Science、日本)進行溶解後，以終濃度5 mM添加二硫蘇糖醇於室溫下進行還原反應30分鐘，進而以終濃度20 mM添加碘乙醯胺而進行烷基化反應。
其後，向樣品中添加1%(w/w)胰蛋白酶(蛋白質組學級(proteomics grade)，Roche Mannheim，德國)，於37℃下徹夜進行消化。消化後，添加與液量等量之乙酸乙酯與終濃度1%之三氟乙酸並進行旋渦混合，而使液中之界面活性劑分離為有機層。離心分離後，回收包含肽之水相，並進行利用Stage Tips(Rappsilber J. et al., Nat. Protoc. 2, 1896-1906 (2007))之脫鹽。
液相層析儀(LC)-質譜儀(MS/MS)及蛋白質組學之資料分析 消化之肽係利用C18-SCX StageTip層析管柱分餾7次。其後，利用連結有LC(UltiMate3000 Nanoflow HPLC system(Dionex、Sunnyvale、CA))之質譜儀(Q-Exactive(Thermo Scientific，Bremen，德國))進行分析。樣品向質譜儀中之導入係使用於內徑75 μm長度300 mm之針中封入有1.9 μm之C18-AQ樹脂之自製之分析管柱。LC之流動相係由緩衝液A(0.1%甲酸及2%乙腈)及B(0.1%甲酸及90%乙腈)所構成。使消化之肽溶解於緩衝液A中，並裝載於捕獲管柱(0.075×20 mm, Acclaim PepMap RSLC Nano-Trap Column; Thermo Scientific)中。奈米LC係以280 nL/min進行液體輸送，流動相係以120分鐘以5～35%B之梯度展開。質譜分析係利用完全MS掃描(350～1800 m/z、離子累計3×106 解析度70,000)及MS/MS掃描(Top10母離子、注射時間120 ms、解析度35,000、MS/MS離子選擇閾值5×104 計數、分離寬度3.0 Da)進行測定。資料檔案之分析係利用MaxQuant軟體(Ver 1.5.1.2)而進行。檢索引擎係對Andromeda、UniProt人類蛋白質資料庫進行峰值清單之檢索。前驅物質量誤差範圍係設定為7 ppm，片段離子質量誤差範圍係設定為0.01 Da。鑑定蛋白質及肽係利用相對於逆向工程資料庫未達1%之偽陽性率(FDR 1%＞)而進行判定。
LC-SRM/MRM分析 LC-SRM/MRM分析係藉由以前所報告之方法而進行(Kume, H. et al., Mol. Cell. Proteomics 13, 1471-1484 (2014): Muraoka, S. et al., J. Proteome Res. 11, 4201-4210 (2012): Narumi, R. et al., J. Proteome Res. 11, 5311-5322 (2012))。消化肽係溶解於包含0.1%之三氟乙酸(TFA)之2%之乙腈溶液中，其後，使用連結有Nanoflow LC Paradigm MS2(Michrom BioResources, Auburn, CA)之三重四極質譜儀TSQ-Vantage(Thermo Fisher Scientific, Bremen, 德國)進行分析。樣品向質譜儀中之導入係使用於內徑75 μm長度100 mm之針中封入有1.9 μm之C18-AQ樹脂之自製之分析管柱。LC之流動相係由緩衝液A(0.1%甲酸及2%乙腈)及B(0.1%甲酸及90%乙腈)所構成。使消化之肽溶解於緩衝液A中，並裝載於捕獲管柱(0.075×20 mm, Acclaim PepMap RSLC Nano-Trap Column; Thermo Scientific)中。奈米LC係以280 nL/min進行液體輸送，流動相係以60分鐘以5～35%B之梯度展開。SRM模式下之分析係於如下條件下進行(Q1峰寬度0.7 FWHM，循環時間：1 sec，碰撞氣壓(Collision Gas Pressure) 1.8 mTorr)。碰撞能量係於每一SRM轉換中最佳化，各轉換之強度係以峰值時間寬度5分鐘之排程模式進行測定。
使用SI-肽之靶肽之定量 利用SRM之靶肽之定量係將作為內部標準之與靶肽同序列之穩定同位素標記肽(Stable isotope-labeled peptide，SI-肽)混合至利用各檢體血清製備而成之EV中，藉由利用SRM分析檢測到之內源性肽/SI-肽之峰面積比(Peak Area Ratio)而算出。與靶肽同序列之SI-肽之尖峰量係藉由實行事先分析而調整為接近內源性肽。
利用SRM分析之峰面積比率之統計分析 為了根據藉由SRM分析算出之各檢體之峰面積比，進行靶肽之作為大腸生物標記之評價，而進行SRM資料之統計分析。統計分析係使用SPSS軟體(版本23)(SPSS Inc., Chicago, IL)。首先，利用ROC分析(ROC，Receiver Operating Characteristic)算出AUC(AUC，Area under the Curve)之值而進行各靶肽單獨時之作為生物標記之評價。進而，亦進行組合有複數種靶肽時之作為多標記之評價。靶肽之組合係使用SPSS軟體製作羅吉斯回歸模型而進行評價。對於模型較有效之肽之組合，同樣地藉由利用ROC分析算出之AUC之值而進行評價。
結果 CRC相關生物標記候選蛋白質之搜尋 圖1中表示本案之生物標記候選搜尋之戰略。自醫學與生物學文獻之PubMed資料庫獲得CRC生物標記候選蛋白質之清單。使用「癌症(cancer)」、「大腸(colorectal)」及「表現(expression)」作為檢索式，進行2003年至2014年之資料庫上之文獻檢索，對大腸癌相關之687個蛋白質，以CRC生物標記候選之形式進行清單化。候選蛋白質之選擇係藉由以下之(1)～(4)之基準而進行。 (1)藉由西方點墨、ELISA或免疫組織化學而確認人類CRC組織或血液中之蛋白質表現。 (2)確認到靶蛋白質於癌症中表現上升。(由於表現上升之蛋白質與表現減少之蛋白質相比容易檢測，故而適於生物標記)。 (3)癌症之表現及發展相關之靶蛋白質之分子功能係藉由RNAi(Ribonucleic Acid interference，核糖核酸干擾)或分子之過度表現而以實驗方式確認。 (4)僅利用大規模之分析(例如組學分析)特定之蛋白質除外。
進而，本發明者等人藉由以前臨床檢體之靶蛋白質組學而特定出44個CRC生物標記候選蛋白質(Kume, H. et al., Mol. Cell. Proteomics 13, 1471-1484 (2014))。該等44個蛋白質與上述生物標記候選合併，選擇除重複之蛋白質以外之合計725個蛋白質作為CRC生物標記候選。
利用鳥槍法蛋白質組學分析之含EV之生物標記候選之選擇 為了自所選擇之生物標記候選蛋白質中，選擇存在於EV之蛋白質，而使用利用血清及培養細胞上清液製備之EV，並藉由鳥槍法蛋白質組學分析進行EV蛋白質之定性分析。將鳥槍法蛋白質組學之工作流程示於圖2a。
利用血清與細胞上清液之EV之製備係藉由超離心法進行。血清EV係自健康者、無轉移之癌患者、存在轉移之癌患者各8人採集。培養細胞上清液係自4種CRC細胞(HCT116、DLD-1、SW480、SW620)採集。所萃取之蛋白質藉由使用相關轉移溶解劑(PTS)法而進行消化後，利用C-18 Stage SCX Tip管柱進行分餾(Masuda, T et al., J. Proteome Res. 7, 731-740 (2008); Adachi, J. et al. Anal. Chem. 88, 7899-7903 (2016))。藉由LC-MS/MS分析分餾樣品，藉由Mascot資料庫檢索，分別對702(血清EV)及4749之(細胞上清液EV)蛋白質進行鑑定。藉由該等EV鑑定蛋白質與生物標記候選蛋白質之比較，356之蛋白質被鑑定為含EV蛋白質之生物標記候選(圖2b)。
自於EV中所鑑定之生物標記候選蛋白質之SRM靶肽之選擇 為了驗證候選蛋白質作為生物標記是否有效，而進行自CRC患者血清採集之EV部分之SRM分析。SRM候選肽係選自利用鳥槍法蛋白質組學特定出之肽。作為候選肽選擇之基準，使用以下之(1)～(3)。 (1)所鑑定之蛋白質係於蛋白質中固有之肽序列，於存在複數個之情形時，於鳥槍分析中選擇強度較高之靶。 (2)具有由胰蛋白酶所引起之切斷錯誤、或不適於SRM分析之胺基酸修飾(例如經氧化之甲硫胺酸等)之肽除外。 (3)過長之肽(＞20胺基酸)由於難以合成穩定同位素標記肽(SI-肽)，故而自靶肽中排除。
滿足該等基準之肽於所有經鑑定之肽中存在3316個肽(346個蛋白質)。
其次，為了自該等候選中選擇SRM靶肽，使用利用非癌症對照之健康者(N)混合血清(n＝26)、無轉移之癌症患者(C)之混合血清(n＝26)、存在轉移之癌症患者(Cm)之混合血清(n＝25)製備之EV部分而進行SRM分析。根據鳥槍分析之結果，每一個肽選擇3個或4個轉換(母離子與產物離子之對)。SRM分析係於各混合血清中重複測定3次，肽峰面積係使用Skyline軟體進行定量化。選擇峰面積於混合樣品(N相對於C或C相對於Cm)之間顯著(p＜0.01)地增加2倍以上之靶肽作為標記候選肽。關於檢測到二個以上之候選肽之蛋白質，選擇SRM分析中之峰值強度較高之2個肽。考慮該等基準，選擇71個肽(46個蛋白質)作為生物標記候選之靶肽(圖3)。
血清EV部分中之靶肽之利用SRM之定量 對利用各患者之血清製備之EV部分中之37個生物標記候選肽，利用SRM進行定量分析。各EV部分係利用3個組之患者血清(健康者(N)：n＝26，無轉移之癌症患者(C)：n＝26，存在轉移之癌症患者(Cm)：n＝25)之群製備。向各檢體中添加等量之SI-肽作為內部標準，使用Skyline軟體算出相對於內源性之靶肽之峰面積比。對各靶肽，藉由t檢驗進行N、C及Cm之群間之定量值之比較，結果於N與C或C與Cm之間可見顯著之定量值之增加(p＜0.05)(圖4及圖5-1、5-2、5-3、5-4、5-5及5-6)。
利用靶肽之統計分析之作為生物標記之評價 為了進行生物標記之候選肽之評價，對37個肽進行ROC(Receiver Operating Characteristic，受試者工作特性)分析。對各候選肽，評價N與C之間及C與Cm之間之區別。4個肽(3個蛋白質)為感度非常高之蛋白質(AUC＞0.9、圖6-1a、b)。並且，關於22個肽，為了識別N與C，感度充分地高(0.7-0.9AUC、圖7-1、7-2、7-3、7-4、7-5及7-6)。另一方面，關於11個肽，為了識別C與Cm(圖6-2c、d)，感度充分地高。
其次，藉由羅吉斯回歸分析調查是否組合候選肽而獲得作為多標記之更高之感度。關於肽之顯著之組合，係使用SPSS軟體進行評價。利用2個以上之肽進行之羅吉斯分析之結果係藉由多標記之ROC曲線之AUC而進行評價。關於候選肽之14個之組合，AUC較標記單獨之值增加(圖8-1及8-2)，尤其是關於8個之組合，AUC為0.9＜(圖9)。最高之AUC(0.97)係利用3個肽(轉鐵蛋白受體蛋白1、嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白及血管生成素-1)之組合而獲得。該等結果提示複數個標記之組合對改善大腸癌之診斷之精度較有效。
廣泛地使用之腫瘤標記(癌胚抗原CEA)與靶肽之感度之比較 CEA目前為最廣泛地利用之大腸癌之血中標記之1種。然而，報告稱CEA之感度對發現早期階段患者而言並不充分，對於2階段之患者之感度為30%左右。因此，進行新確立之37個生物標記候選與CEA比較之比較。各靶肽之SRM定量值之臨界點由於CEA特異性為大致100%，故而設定為100%之特異性。CEA對於驗證中所使用之檢體群C之感度為38.8%。另一方面，37個靶肽中之17個肽(12個蛋白質：膜聯蛋白A3、膜聯蛋白A4、膜聯蛋白A5、膜聯蛋白A11、腱生蛋白-N、轉鐵蛋白受體蛋白1、GLUT-1、基質金屬蛋白酶-9、嗅質蛋白-4、CD88抗原、三肽基肽酶1、嗜中性球明膠酶相關之脂質運載蛋白)之感度大幅超過CEA(圖10-1、10-2及10-3)。尤其是膜聯蛋白A4及A11之3個肽之感度為80%＜(圖11)。 [產業上之可利用性]
藉由本發明之方法可早期地檢測大腸癌。 [序列表非關鍵文字]
序列編號23～59 合成
本說明書中所引用之所有刊物、日本專利及日本專利申請係直接藉由引用而併入至本說明書中。
圖1係表示用於搜尋細胞外囊泡(EV)中之大腸癌標記之戰略之圖。於圖中表示於各步驟中所選拔之候選蛋白質之數量。 圖2係表示用於EV中之CRC生物標記候選蛋白質之鳥槍法蛋白質組學分析之方法之圖。圖2a表示EV之製備及MS分析之步驟，圖2b表示藉由鳥槍法蛋白質組學分析而鑑定之生物標記候選蛋白質及EV蛋白質之汾恩圖(Venn diagram)分析之結果。利用血清或細胞培養上清液鑑定之EV蛋白質之中，356個大腸癌生物標記候選蛋白質被鑑定為EV蛋白質。 圖3係表示SRM靶蛋白質(46)及肽(71)之圖。 圖4係表示以高度之正確性(AUC＞0.7)驗證之蛋白質之清單之圖。 圖5-1係表示利用SRM分析之3組(N、C及Cm)之間之血清中肽之相對定量之結果之圖。N表示非癌症對照患者，C表示無轉移之癌症患者，Cm表示存在轉移之癌症患者。點陣圖表示內在肽相對於SI肽之峰面積比(﹡：p＜0.05，﹡﹡：p＜0.01，N.S：無有意義差)。縱軸表示面積比(Area Ratio)。 圖5-2係表示利用SRM分析之3組(N、C及Cm)之間之肽之相對定量之結果之圖(圖5-1續)。 圖5-3係表示利用SRM分析之3組(N、C及Cm)之間之肽之相對定量之結果之圖(圖5-2續)。 圖5-4係表示利用SRM分析之3組(N、C及Cm)之間之肽之相對定量之結果之圖(圖5-3續)。 圖5-5係表示利用SRM分析之3組(N、C及Cm)之間之肽之相對定量之結果之圖(圖5-4續)。 圖5-6係表示利用SRM分析之3組(N、C及Cm)之間之肽之相對定量之結果之圖(圖5-5續)。 圖6-1係表示靶肽之統計分析之結果之圖(其1)。圖6-1a表示利用SRM分析之3組(N、C及Cm)之間之肽之相對定量之結果。N表示非癌症對照，C表示無轉移之癌症，Cm表示存在轉移之癌症。點陣圖表示內在肽相對於SI肽之峰面積比(﹡：p＜0.05，﹡﹡：p＜0.01，N.S：無有意義差)。縱軸表示面積比(Area Ratio)。圖6-1b表示用以識別N與C之ROC(Receiver Operating Characteristic，受試者工作特徵)曲線分析之結果(1)及用以識別C與Cm之ROC曲線分析之結果(2)。將用以識別之曲線下之面積(AUC)示於各圖表。縱軸表示感度(sensitivity)，橫軸表示1-特異性(specificity)。 圖6-2係表示靶肽之統計分析之結果之圖(其2)。圖6-2c表示利用SRM分析之3組(N、C及Cm)之間之肽之相對定量之結果。N表示非癌症對照，C表示無轉移之癌症，Cm表示存在轉移之癌症。點陣圖表示內在肽相對於SI肽之峰面積比(﹡：p＜0.05，﹡﹡：p＜0.01，N.S：無有意義差)。縱軸表示面積比(Area Ratio)。圖6-2d表示用以識別N與C之ROC曲線分析之結果(1)及用以識別C與Cm之ROC曲線分析之結果(2)。將用以識別之曲線下之面積(AUC)示於各圖表。縱軸表示感度(sensitivity)，橫軸表示1-特異性(specificity)。 圖7-1係表示用以識別N與C之ROC曲線(1)及用以識別C與Cm之ROC曲線(2)之圖(其1)。將用以識別之曲線下之面積(AUC)示於各圖表。縱軸表示感度(sensitivity)，橫軸表示1-特異度(specificity)。 圖7-2係表示用以識別N與C之ROC曲線(1)及用以識別C與Cm之ROC曲線(2)之圖(圖7-1續)。 圖7-3係表示用以識別N與C之ROC曲線(1)及用以識別C與Cm之ROC曲線(2)之圖(圖7-2續)。 圖7-4係表示用以識別N與C之ROC曲線(1)及用以識別C與Cm之ROC曲線(2)之圖(圖7-3續)。 圖7-5係表示用以識別N與C之ROC曲線(1)及用以識別C與Cm之ROC曲線(2)之圖(圖7-4續)。 圖7-6係表示用以識別N與C之ROC曲線(1)及用以識別C與Cm之ROC曲線(2)之圖(圖7-5續)。 圖8-1係表示靶肽之組合之ROC曲線分析之結果之圖(其1)。於N與C之間評價組合肽時之診斷之感度。將曲線下之面積(AUC)、感度(sensitivity)及特異度(specificity)示於各圖表。 圖8-2係表示靶肽之組合之ROC曲線分析之結果之圖(其2)。於N與C之間評價組合肽時之診斷之感度。將曲線下之面積(AUC)、感度(sensitivity)及特異性(specificity)示於各圖表。 圖9係表示靶肽之組合之ROC曲線分析之結果之圖。於N與C之間評價肽之組合時之診斷之感度。將曲線下之面積(AUC)、感度(sensitivity)及特異度(specificity)示於各圖表。圖9表示較高之正確性(AUC＞0.9)之組合。其他組合係示於圖8-1及圖8-2。 圖10-1係表示靶肽與CEA之感度(sensitivity)之比較結果之圖。將截止值設定為N之最大峰面積之情形時之感度係以樣品之比率之形式算出(虛線表示特異度為100%)。縱軸表示面積比(Area Ratio)。 圖10-2係表示靶肽與CEA之感度(sensitivity)之比較結果之圖(圖10-1續)。 圖10-3係表示靶肽與CEA之感度(sensitivity)之比較結果之圖(圖10-2續)。 圖11係表示靶肽與CEA之感度之比較結果之圖。將截止值(Cutoff)設定為N之最大峰面積之情形時之感度(sensitivity)係以樣品之比率之形式算出(虛線表示特異性為100%)。於圖11中表示N與C之識別中之感度最高之3個肽。與3個肽相關之圖表之縱軸表示面積比(Area Ratio)。感度高於CEA之其他肽係示於圖10-1～10-3。

Claims (15)

  1. 一種用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其包含以下之1～22之22個蛋白質中之至少1個蛋白質、或1～22個蛋白質之部分肽中之至少1個肽： 1.膜聯蛋白A11(Annexin A11)(ANXA 11)(序列編號1)； 2.膜聯蛋白A3(Annexin A3)(ANXA 3)(序列編號2)； 3.膜聯蛋白A4(Annexin A4)(ANXA 4)(序列編號3)； 4.腱生蛋白-N(Tanascin-N)(TNN)(序列編號4)； 5.轉鐵蛋白受體蛋白1(Transferrin receptor protein 1)(TFRC)(序列編號5)； 6.葡萄糖轉運蛋白1(GLUT-1)(SLC2A1)(序列編號6)； 7.補體成分C9(Complement component C9)(C9)(序列編號7)； 8.CD88抗原(CD88 antigen)(C5AR1)(序列編號8)； 9.78kDa葡萄糖調節蛋白(78kDa glucose-regulated protein)(HSPA5)(序列編號9)； 10.α-1-酸性糖蛋白(α-1-acid glycoprotein)(ORM1)(序列編號10)； 11.基質金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase-9)(MMP9)(序列編號11)； 12.血管生成素-1(Angiopoietin-1)(ANGPT1)(序列編號12)； 13.CD67抗原(CD67 antigen)(CEACAM8)(序列編號13)； 14.黏蛋白-5B(Mucin-5B)(MUC5B)(序列編號14)； 15.銜接蛋白GRB2(Adapter protein GRB2)(GRB2)(序列編號15)； 16.膜聯蛋白A5(Annexin A5)(ANXA 5)(序列編號16)； 17.嗅質蛋白-4(Olfactomedin-4)(OLFM4)(序列編號17)； 18.中性胺基酸轉運蛋白B(0)(Neutral amino acid transporter B(0))(SLC1A5)(序列編號18)； 19.三肽基肽酶1(Tripeptidyl-peptidase 1)(TPP1)(序列編號19)； 20.熱休克相關70kDa蛋白2(Heat shock-related 70kDa protein 2)(HSPA2)(序列編號20)； 21.蛋白酶體次單元α型-5(Proteasome subunit alpha type-5)(PSMA5)(序列編號21)；或 22.嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin)(LCN2)(序列編號22)。
  2. 如請求項1之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其係組合如請求項1之1～22之22個蛋白質之2個以上之蛋白質、或1～22個蛋白質之部分肽之2個以上之肽而成。
  3. 如請求項1或2之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其中如請求項1之1～22個蛋白質之部分肽係包含序列編號23～59所表示之胺基酸序列之肽。
  4. 如請求項1之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其包含以下之12個蛋白質中之至少1個蛋白質、或該12個蛋白質之部分肽中之至少1個肽： 1.膜聯蛋白A11(序列編號1)； 2.膜聯蛋白A3(序列編號2)； 3.膜聯蛋白A4(序列編號3)； 4.腱生蛋白-N(序列編號4)； 5.轉鐵蛋白受體蛋白1(序列編號5)； 6.葡萄糖轉運蛋白1(序列編號6)； 8.CD88抗原(序列編號8)； 11.基質金屬蛋白酶9(序列編號11)； 16.膜聯蛋白A5(序列編號16)； 17.嗅質蛋白-4(序列編號17)； 19.三肽基肽酶1(序列編號19)；或 22.嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白(序列編號22)。
  5. 如請求項4之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其係組合如請求項4之12個蛋白質之2個以上之蛋白質、或該12個蛋白質之部分肽之2個以上之肽而成。
  6. 如請求項4或5之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其中如請求項4之12個蛋白質之部分肽係包含序列編號23～34、37、38、43、44、53、54、56及59所表示之胺基酸序列之肽。
  7. 如請求項1之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其包含膜聯蛋白A4或膜聯蛋白A11、或該等之部分肽。
  8. 如請求項7之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其係組合膜聯蛋白A4與膜聯蛋白A11、或膜聯蛋白A4之部分肽與膜聯蛋白A11之部分肽而成。
  9. 如請求項7或8之用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其中膜聯蛋白A4及膜聯蛋白A11之部分肽係包含序列編號23、24、27及28所表示之胺基酸序列之肽。
  10. 一種用以檢測大腸癌之大腸癌生物標記，其係組合如請求項1至9中任一項之大腸癌生物標記與CEA而成。
  11. 一種大腸癌之檢測方法，其包括測定生物體試樣中之如請求項1至10中任一項之大腸癌生物標記。
  12. 一種大腸癌之檢測方法，其係測定生物體試樣中之如請求項1至10中任一項之大腸癌生物標記，於該生物標記與健康人相比以高濃度存在之情形時，判斷為罹患有大腸癌。
  13. 如請求項11或12之大腸癌之檢測方法，其中生物體試樣為血液中之細胞外囊泡(EV)。
  14. 如請求項11至13中任一項之大腸癌之檢測方法，其中檢測係藉由免疫學測定法或質譜法而進行。
  15. 一種大腸癌之檢測套組，其包含針對生物體試樣中之如請求項1至10中任一項之大腸癌生物標記之抗體。
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