TW201905201A

TW201905201A - 體外剔除Ｔ細胞中靶基因的方法以及該方法中使用的ｃｒＲＮＡ

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Publication number: TW201905201A
Application number: TW107121137A
Authority: TW
Inventors: 彭作翰; 沈連軍; 陶維康
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
Priority date: 2017-06-20
Filing date: 2018-06-20
Publication date: 2019-02-01
Also published as: KR20200018572A; WO2018233596A1; CN109963944A; EP3650545A1; US20200181608A1; MX2019014516A; CA3064807A1; EP3650545A4; RU2020100919A; JP2020528738A; AU2018288048A1

Abstract

本發明涉及體外剔除T細胞中靶基因的方法以及該方法中使用的crRNA。具體地，本發明涉及基於CRISPR-Cas9系統的體外剔除T細胞中靶基因的方法。另一方面，本發明提供了針對靶基因TRAC、B2M和PD1的crRNA以及包含所述crRNA與Cas9蛋白對應的tracrRNA連接形成的的sgRNA、Cas9蛋白、寡聚去氧核糖核酸(N-oligo)或魚精DNA片段的用於剔除T細胞中的TCR、B2M和/或PD1基因的試劑盒。本發明還提供了根據本發明的方法所獲得的基因剔除的T細胞及其用途。

Description

體外剔除T細胞中靶基因的方法以及該方法中使用的crRNA

本發明屬於生物醫藥領域。具體地說涉及一種體外剔除T細胞中靶基因的方法、該方法中使用的crRNA以及該方法所獲得的T細胞及其用途。

過繼性細胞免疫療法(adoptive cell therapy,ACT)，涉及離體(ex vivo)產生的自體抗原特異性T細胞的轉移，是治療病毒感染和癌症的有前途的策略。可以藉由抗原特異性T細胞的擴增或藉由遺傳設計的T細胞重定向產生過繼性免疫療法使用的T細胞(Park，Rosenberg et al.Trends Biotechnol.2011,29(11)：550-557)。

CART是將分離的T細胞，藉由基因工程嵌入特定的抗原受體(CAR)，使得T細胞的靶向性、殺傷活性和持久性增強，並且對腫瘤細胞表面抗原的識別不依賴MHC的限制性。CARs由胞外抗原結合區、跨膜區、以及胞內的T細胞受體的信號轉導區(如CD3ζ和共刺激分子)組成。胞外抗原結合區由單株抗體的輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)組成，中間由鉸鏈連接形成單鏈抗體(single chain fragment variable，scFv)，能夠識別特定的腫瘤抗原。有相關臨床試驗表明，CAR在其它治療方法無效的淋巴癌患者身上具有較好的治療效果。美國賓夕法尼亞大學Carl June進行的CART-19研究表明在75名白血病患者(包括成人和兒童患者)，有45人經過CART細胞治療之後病情完全緩解(complete remission)。

然而，現有的CART療法通常是利用來自腫瘤患者自身的淋巴細胞，經體外修飾、培養、啟動和擴增之後回輸給患者。除了會導致細胞因子風暴等副作用外，還存在3大問題：首先，對於一些因淋巴細胞數量較低或品質較差的晚期患者失去CART治療的機會；其次，CART療法在實體瘤中的療效仍不顯著，可能因為免疫抑制檢驗點信號通路的影響，導致免疫細胞在腫瘤組織內的存活率較差、活性不高；最後，由於CART是個體化治療，成本昂貴，增加了病人負擔。因此開發同種異體來源的通用CAR-T細胞(UCART)能夠推廣其應用。

早期曾利用同源重組打靶載體、或RNAi技術對基因進行剔除，但均存在操作繁瑣，效率低等問題。Cellectis公司則藉由TALEN技術開發的異體CAR-T療法UCART19定向剔除TCRα基因(降低GVHD)和CD52基因(使細胞對alemtuzumab耐藥)已經成功治癒了多例復發性急性淋巴細胞白血病患兒(ALL)。但是Cellectis藉由TALEN剔除TCR 需要繁瑣的構建過程和大規模測序。當前，規律成簇間隔短回文重複系統(clustered regularly interspaced short palindromic repeat；CRISPR-associated,CRISPR-Cas9)藉由識別特定的DNA序列實現對基因的編輯，並且比TALEN更簡單、高效。

目前，已存在基於CRISPR/Cas9系統進行基因剔除的實例，如CN104395463A、CN105518146A和CN106191062A。但仍存在目的基因剔除率低、或需要多次轉染或轉化，操作繁瑣，且對T細胞造成更多傷害，或者存在脫靶率高等問題。因此，仍需要優化基於CRISPR/Cas9系統的TCR等基因剔除方法和更高準確性的crRNA。

本發明的目的在於克服現有技術在免疫治療中存在的問題，提供一種TCR-陰性T細胞的構建方法，藉由CRISPR/Cas9基因編輯技術剔除TCR，並提供利用該方法獲得的TCR陰性T細胞。

本發明的目的在於提供一種TCR和PD1或B2M雙陰性T細胞及其構建方法。

本發明的另一目的在於提供一種TCR、B2M和PD1三陰性T細胞及其構建方法。

更進一步地，藉由磁珠分選出上述TCR陰性T細胞、TCR和PD-1或B2M雙陰性T細胞和TCR/B2M/PD1三陰性T細胞，用於腫瘤的過繼細胞免疫治療等方面。

在第一實施方案中，提供一種體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法，該方法包括如下步驟： 1)使用靶向該T細胞中的一個或多個靶基因的sgRNA分別與Cas9蛋白接觸，形成蛋白RNA複合體(RNP)；2)將RNP與寡聚去氧核糖核酸(N-oligo)或魚精DNA片段混合後轉化所述T細胞，其中該sgRNA將Cas9蛋白分別引導至相應靶基因的靶序列，並且與該靶序列雜交，其中該靶基因被裂解，並且其中該靶基因的裂解效率大於75%。

在一種較佳的實施方式中，在本發明的體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法中，該靶基因選自TRAC、TRBC、B2M和PD1基因中的一個或多個，該sgRNA靶向該靶基因的編碼序列或其表達的調控序列。

進一步地，在本發明的體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法中，該sgRNA從5’到3’依次由長度為17-20nt的靶向靶基因的crRNA和與Cas9蛋白對應的tracrRNA連接而成，其中該crRNA的長度較佳為17nt。

在一種較佳的實施方式中，在本發明的體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法中，該寡聚去氧核糖核酸是長度為100-250bp的雙鏈DNA或長度為100-250nt的單鏈DNA。

在一種較佳的實施方式中，在本發明的體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法中，該靶向TRAC基因的crRNA選自SEQ ID NO：1-12所示crRNA中的任何一種或多種，該靶向B2M基因的crRNA序列如SEQ ID NO：13所示，該靶向PD1基因的crRNA選自SEQ ID NO：14-16所示crRNA中的任何一種或多種。

在一種較佳的實施方式中，在本發明的體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法中，該Cas9蛋白為來自釀膿鏈球菌的Cas9蛋白，序列如SEQ ID NO：18所示。

在一種較佳的實施方式中，在本發明的體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法中，該Cas9蛋白為來自釀膿鏈球菌的Cas9蛋白，該Cas9蛋白對應的tracrRNA序列如SEQ ID NO：17所示。

在一種較佳的實施方式中，在本發明的體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法中，該T細胞選自輔助性T細胞、細胞毒性T細胞、記憶性T細胞、調節性T細胞、自然殺傷T細胞、γδT細胞、CAR-T細胞和TCR-T細胞。

另一方面，本發明還提供根據上述方法獲得的靶基因剔除的T細胞。

另一方面，本發明還提供用於剔除靶向基因的crRNA，其中該crRNA包含一種或多種選自SEQ ID NO：1-16的序列。

在一種較佳的實施方式中，本發明用於剔除靶向基因的crRNA靶向靶向基因的編碼序列或其表達的調控序列，其中該靶向基因選自TRAC、TRBC、B2M和PD1基因中的一個或多個。

在一種較佳的實施方式中，本發明用於剔除靶向基因的crRNA，其中該靶向基因為TRAC基因，該crRNA選自SEQ ID NO：1-12所示的一個或多個。

在一種較佳的實施方式中，本發明用於剔除靶向基因的crRNA，其中該靶向基因為B2M基因，該crRNA序列如SEQ ID NO：13所示。

在一種較佳的實施方式中，本發明用於剔除靶向基因的crRNA，其中該靶向基因為PD1基因，該crRNA選自SEQ ID NO：14-16所示的一個或多個。

另一方面，本發明還提供用於剔除靶向基因的sgRNA，該sgRNA由crRNA與Cas9蛋白對應的tracrRNA連接形成，其中該crRNA包含一種或多種選自SEQ ID NO：1-16的序列。

在一種較佳的實施方式中，本發明用於剔除靶向基因的sgRNA，其中該靶向基因選自TRAC、TRBC、B2M和PD1基因中的一個或多個。

在一種較佳的實施方式中，本發明用於剔除靶向基因TRAC的sgRNA，該sgRNA由crRNA與Cas9蛋白對應的tracrRNA連接形成，該crRNA選自SEQ ID NO：1-12所示的一個或多個。

在一種較佳的實施方式中，本發明用於剔除靶向基因B2M的sgRNA，該sgRNA由crRNA與Cas9蛋白對應的tracrRNA連接形成，該crRNA如SEQ ID NO：13所示。

在一種較佳的實施方式中，本發明用於剔除靶向基因PD-1的sgRNA，該sgRNA由crRNA與Cas9蛋白對應的 tracrRNA連接形成，該crRNA選自SEQ ID NO：14-16所示的一個或多個。

在一種較佳的實施方式中，本發明用於剔除靶向基因的sgRNA，其中該Cas9蛋白為來自釀膿鏈球菌的Cas9蛋白如SEQ ID NO：18所示。

在一種較佳的實施方式中，本發明用於剔除靶向基因的sgRNA，其中該與Cas9蛋白對應的tracrRNA序列如SEQ ID NO：17所示。

在另一方面，本發明提供了一種用於基因剔除的試劑盒，其包含：a：一種或多種如前該crRNA，或一種或多種如前該sgRNA；b：Cas9蛋白；c：寡聚去氧核糖核酸或魚精DNA片段。

在一種較佳的實施方式中，在該該用於基因剔除的試劑盒中，該寡聚去氧核糖核酸是長度為100-250bp的雙鏈DNA或長度為100-250nt的單鏈DNA。

在一種較佳的實施方式中，在該用於基因剔除的試劑盒中，該Cas9蛋白為來自釀膿鏈球菌的Cas9蛋白，該Cas9蛋白對應的tracrRNA序列如SEQ ID NO：17所示。

在一些實施方式中，本發明提供本發明該該基因剔除的T細胞在製備抗腫瘤藥物中的用途。

在一些實施方式中，本發明還提供本發明該基因剔除的T細胞在製備防治病毒或細菌引起的感染性疾病藥物中的用途。

在一些實施方式中，利用所設計的crRNA及方法，TCR、B2M或PD1均被有效剔除。TCR及B2M和/或PD1剔除後的CART細胞的體外殺傷活性不受TCR、B2M和/或PD1基因剔除的影響。

第1圖為不同遞送系統剔除效率比較。結果顯示RNP遞送方式在Jurkat細胞中基因剔除效率最高。

第2A及2B圖為N-oligo對基於CRISPR-Cas9系統對T細胞基因剔除效率的影響。第2A圖是在T細胞中基因剔除效率的比較；第2B圖是在CART細胞中基因剔除效率的比較。

第3圖為魚精DNA片段對T細胞基因剔除效率的影響。

第4圖為B2M基因剔除效率的檢測。

第5圖為篩選的crRNA對PDl基因剔除效果的檢測。

第6A及6B圖為RNP與N-Oligo或魚精DNA造成的基因突變分析。第6A圖是針對TRAC的分析結果，第6B圖是針對B2M的分析結果。

第7A至7C圖為RNP脫靶率分析。第7A圖為TRAC基因脫靶率分析結果；第7B圖為B2M基因脫靶率分析結果；第7C圖為PD1基因脫靶率分析結果。

第8A及8B圖為TRAC基因剔除T細胞的CD25和CD69啟動情況分析。第8A圖為CD69啟動情況比較，第 8B圖為CD25啟動情況比較。

一方面，本發明提供一種改變細胞中的靶基因的方法。

本文該該研究展示了使用CRISPR/Cas系統的等位點基因靶向方法以高達80%的效率產生突變細胞。具體地說，本文所述的工作出人意料地且意外地證明一種多重開機策略，提供特異性地鑒定有用的RNA引導序列的方法，連同適用於靶向特異性基因(例如，TRAC、TRBC、B2M、PD1)的特定引導序列。

CRISPR系統用於本發明所提供的方法和組合物還包括那些國際公開號為WO 2013142578A1和WO2013098244A1所描述的CRISPR系統，其內容在此全部併入本發明。

一種改變細胞中的靶基因的多核苷酸序列的示例性方法包括使該多核苷酸序列與CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成簇規律間隔的短回文重複)序列相關(Cas)蛋白質和一至兩種核糖核酸相接觸，形成RNP，其中該核糖核酸將Cas蛋白引導至該靶基因的多核苷酸序列的靶基序並且與該靶基序雜交，其中該靶基因的多核苷酸序列被裂解，並且其中轉化RNP的細胞的改變效率是75%以上。

本發明考慮以任何方式改變靶基因的多核苷酸序列，該方式是熟練的技術人員利用本發明的CRISPR/Cas系統可獲得的。可以使用能夠改變細胞中的靶基因的多核苷酸序列的任何CRISPR/Cas系統。這類CRISPR/Cas系統可採用多種Cas蛋白(Haft等PLoS Comput Biol.2005；1(6)e60)。這類Cas蛋白允許CRISPR/Cas系統改變細胞中的靶基因的多核苷酸序列的分子包括RNA結合蛋白、核酸內切酶和核酸外切酶、解旋酶以及聚合酶。在一些實施方案中，該CRISPR/Cas系統是CRISPR I型系統。在一些實施方案中，該CRISPR/Cas系統是CRISPR II型系統。

本發明的CRISPR/Cas系統可用於改變細胞中的靶基因的多核苷酸序列。本發明考慮出於任何目的改變細胞中的靶基因的多核苷酸序列。在一些實施方案中，改變細胞中的靶基因的多核苷酸序列以產生突變細胞。

本文中Cas9蛋白示例性地可以是釀膿鏈球菌Cas9蛋白或其功能部分。在一些實施方案中，該Cas9蛋白是來自任何細菌物種的Cas9蛋白或其功能部分。Cas9蛋白是II型CRISPR系統的成員，該II型CRISPR系統通常包括反式編碼的小RNA(tracrRNA)、內源性核糖核酸酶3(rnc)以及Cas9蛋白。

藉由基因工程手段對crRNA(CRISPR-derived RNA，CRISPR衍生RNA)和tracrRNA(trans-activating RNA，反式啟動RNA)進行改造，將二者連接在一起得到sgRNA(single guide RNA，sgRNA，單導RNA)。最終再藉由將表達sgRNA的序列與Cas9形成複合物，轉化至細胞，便能夠對目的基因進行剔除。

在一些實施方案中，該改變使得該靶基因的多核苷酸序列從不想要的序列修正為所需序列。本發明的CRISPR/Cas系統可用於修正靶基因的多核苷酸序列中的任何類型的突變或錯誤。例如，本發明的CRISPR/Cas系統可用於插入由於缺失而在靶基因的多核苷酸序列中缺少的核苷酸序列。本發明的CRISPR/Cas系統還可用於從靶基因的多核苷酸序列中缺失或切除由於插入突變所致的核苷酸序列。在一些實例中，本發明的CRISPR/Cas系統可用於用正確的核苷酸序列替代不正確的核苷酸序列(例如，以恢復靶基因的多核苷酸序列的由於功能突變的損失而受損的功能，即SNP)。

與常規CRISPR/Cas系統相比，本發明的CRISPR/Cas系統可以出人意料地高效率裂解靶基因。在某些實施方案中，該靶基因的裂解效率是至少約5%。在某些實施方案中，該靶基因的裂解效率是至少約10%。在某些實施方案中，該靶基因的裂解效率是約10%至約80%。在某些實施方案中，該靶基因的裂解效率是約30%至約80%。在某些實施方案中，該靶基因的裂解效率是約50%至約80%。在一些實施方案中，該靶基因的裂解效率大於或等於約75%，或大於或等於約80%。

在一些實施方案中，該靶基因是基因組。在一些實施方案中，該靶基因是人基因組。在一些實施方案中，該靶基因是哺乳動物基因組。在一些實施方案中，該靶基因是脊椎動物基因組。

使用本發明的CRISPR/Cas系統剔除靶基因的多核苷酸序列或其部分可適用於多種應用。例如，剔除細胞中的靶基因的多核苷酸序列可出於研究目的在體外進行。出於離體目的，剔除細胞中的靶基因的多核苷酸序列可適用於治療或預防與該靶基因的多核苷酸序列的表達相關的病症(例如，藉由離體剔除細胞中的突變等位基因並且將包含剔除的突變等位基因的那些細胞引入受試者中)。

另一方面，本發明提供一種治療或預防受試者的與多核苷酸序列的表達相關的病症的方法。

為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

一.術語

如本文所用，術語"接觸"(即，使多核苷酸序列與成簇規律間隔的短回文重複序列相關(Cas)蛋白質和/或核糖核酸相接觸)意圖包括在體外孵育Cas蛋白和/或核糖核酸或離體接觸細胞。如本文所公開使靶基因的多核苷酸序列與Cas蛋白和/或核糖核酸相接觸的步驟可以任何適合的方式進行。例如，可以貼壁培養或懸浮培養的形式處理該細胞。應瞭解如本文所公開與Cas蛋白和/或核糖核酸相接觸的細胞還可同時或隨後與另一種試劑，如生長因子或其他分化劑或環境相接觸以穩定該細胞或使該細胞進一步分化。

當應用於分離的細胞時，術語"處理"等包括使該細胞經受任何類型的過程或條件，或對該細胞進行任何類型的操作或工序。當應用於受試者時，該術語是指向個體提供細胞，在該細胞中己根據本文該該方法離體改變靶基因的多核苷酸序列。該個體通常是生病的或受傷的，或相對於群體的平均成員處於增加的生病風險並且需要這種注意、護理或管理。

如本文所用，術語"治療"是指向受試者施用有效量的具有根據本文該該方法離體改變的靶基因的多核苷酸序列的細胞，以使得該受試者具有該疾病的至少一種症狀的減少或該疾病的改善，例如，有益的或所需的臨床結果。出於本發明的目的，有益的或所需的臨床結果包括但不限於一種或多種症狀的減輕、疾病程度的減小、疾病狀態的穩定(即不惡化)、疾病進展的延遲或減慢、疾病狀態的改善或緩和，以及緩解(無論是部分緩解還是全部緩解)，無論是可檢測的或是不可檢測的。治療可指與未接受治療情況下的預期存活期相比，延長存活期。因此，本領域的技術人員意識到治療可改善疾病狀況，但可能不是疾病的完全治癒。如本文所用，術語"治療"包括預防。或者，治療在疾病的進展減少或停止的情況下是"有效的"。“治療”還可意指與在未接受治療情況下的預期存活期相比，延長存活期。需要治療的那些包括已經被診斷具有與多核苷酸序列的表達相關的病症的那些，以及由於遺傳易感性或其他因素可能發展這種病症的那些。

如本文所用"突變細胞"是指具有與其原始基因型不同的所得基因型的細胞。在一些實例中"突變細胞"表現出突變表型，例如當使用本發明的CRISPR/Cas系統改變功能正常的基因時。在其他實例中"突變細胞"表現出野生型表型，例如當本發明的CRISPR/Cas系統用於修正突變基因型時。在一些實施方案中，改變細胞中的靶基因的多核苷酸序列以修正或修復基因突變(例如，以恢復該細胞的正常基因型)。在一些實施方案中，改變細胞中的靶基因的多核苷酸序列以誘導基因突變(例如，以破壞基因或基因組元件的功能)。

在一些實施方案中，該改變是插入缺失。如本文所用"插入缺失"是指由插入、缺失或其組合產生的突變。如本領域的技術人員將理解，除非插入缺失的長度是三的倍數，否則基因組序列的編碼區中的插入缺失將導致移碼突變。在一些實施方案中，該改變是點突變。如本文所用"點突變"是指替代核苷酸中的一個的取代。本發明的CRISPR/Cas系統可用於誘導靶基因的多核苷酸序列中的任何長度的插入缺失或點突變。

“寡聚去氧核糖核酸”或“N-oligo”是指在利用RNP遞送系統進行基因剔除時，與RNP一同轉化至細胞內的隨機序列的去氧核糖核酸片段，較佳長度為100-250bp的雙鏈DNA或100-250nt的單鏈DNA。

“魚精DNA片段”是指含鮭魚精DNA的溶液經機械剪切，將魚精DNA剪切成的小分子片段。如1%鮭魚精DNA溶液用7號針頭重複抽打以剪切DNA成為小分子，分裝後貯藏。

如本文所用"剔除"包括以干擾靶基因的多核苷酸的功能的方式缺失該靶基因的多核苷酸的全部或一部分。例如，剔除可藉由改變靶基因的多核苷酸序列來實現，該改變是藉由在該靶基因的多核苷酸序列中誘導該靶基因的多核苷酸序列的功能結構域(例如，DNA結合結構域)中的插入缺失來進行的。基於本文所述的細節，本領域的技術人員將容易地理解如何使用本發明的CRISPR/Cas系統來剔除靶基因的多核苷酸或其部分。

在一些實施方案中，該靶基因的裂解導致該靶基因的表達降低。術語"降低"在本文中通常都用於意指降低統計上顯著的量。然而，為避免疑惑"降低"意指與參考水準相比降低至少10%，例如與參考水準相比降低至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約90%，或多達且包括100%降低(即與參考樣品相比不存在的水準)，或10%-100%之間的任何降低。

術語"統計上顯著的"或"顯著地"是指統計顯著性並且通常意指在正常標記物濃度以下或低於標記物濃度的兩個標準差(2SD)。該術語是指存在差異的統計證據。它被定義為當假設實際上為真實時做出拒絕假設的決定的概率。該決定經常使用p值表示。

在一些實施方案中，該靶基因的裂解是純合靶基因的裂解。在一些實施方案中，該靶基因的裂解是雜合靶基因的裂解。

Cas9蛋白(還被稱為CRISPR相關的核酸內切酶Cas9/Csn1)是包含1368個胺基酸的多肽。Cas9蛋白的示例性胺基酸序列如SEQ ID NO：18所示。Cas9含有2個核酸內切酶結構域，包括RuvC樣結構域(殘基7-22、759-766和982-989)，其裂解與crRNA非互補的靶DNA；和HNH核酸酶結構域(殘基810-872)，其裂解與crRNA互補的靶DNA。

T細胞受體(TCR)，是呈遞在主組織相容性複合體(MHC)上的特異性抗原肽的異源二聚體蛋白受體。在免疫系統中，藉由抗原特異性的TCR與pMHC複合物的結合引發T細胞與抗原呈遞細胞(APC)直接的物理接觸，然後T細胞及APC兩者的其他細胞膜表面分子就發生相互作用，這就引起了一系列後續的細胞信號傳遞和其他生理反應，從而使得不同抗原特異性的T細胞對其靶細胞發揮免疫效應。

TCR是由α鏈/β鏈或者γ鏈/δ鏈以異質二聚體形式存在的細胞膜表面的糖蛋白。在95%的T細胞中TCR異質二聚體由α和β鏈組成，而5%的T細胞具有由γ和δ鏈組成的TCR。天然αβ異質二聚TCR具有α鏈和β鏈，α鏈和β鏈構成αβ異源二聚TCR的亞單位。廣義上講，α和β各鏈包含可變區、連接區和恒定區，β鏈通常還在可變區和連接區之間含有短的多變區，但該多變區常視作連接區的一部分。各可變區包含嵌合在框架結構(framework regions)中的3個CDR(互補決定區)，CDR1、CDR2和CDR3。CDR區決定了TCR與pMHC複合物的結合，其中CDR3由可變區和連接區重組而成，被稱為超變區。TCR的α和β鏈一般看作各有兩個“結構域”即可變域和恒定域，可變域由連接的可變區和連接區構成。TCR恒定域的序列可以在國際免疫遺傳學資訊系統(IMGT)的公開資料庫中找到，如TCR分子α鏈的恒定域序列為“TRAC*01”，TCR分子β鏈的恒定域序列為“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。此外，TCR的α和β鏈還包含跨膜區和胞質區，胞質區很短。

B2M，也稱為β-2微球蛋白，是MHC I類分子的輕鏈，並因此是主要組織相容性複合體的不可缺少的部分。在人類中，由位於15號染色體上、與在6號染色體上以基因簇定位的其他MHC基因相對的b2m基因編碼B2M。人源蛋白由119個胺基酸組成，並具有11800道爾頓的分子量。β-2微球蛋白缺陷的鼠模型已經證明，B2M是MHC I類的細胞表面的表達和肽結合槽的穩定性所必需的。

“PD-1”或“PD1”為50-55kDa的I型跨膜受體，其最初是在經歷啟動誘導的細胞凋亡的T細胞系中鑒定的。PD-1表達於T細胞、B細胞和巨噬細胞之上。PD-1的配體為B7家族成員PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)。

PD-1是免疫球蛋白(Ig)超家族成員，在其胞外區含有單個IgV-樣結構域。PD-1胞漿結構域含有兩個酪胺酸，其中最接近於膜的酪胺酸(小鼠PD-1中的VAYEEL)位於 ITIM(免疫受體酪胺酸的抑制基序)之內。PD-1上ITIM的存在預示著該分子藉由募集胞漿磷酸酶發揮作用以削弱抗原受體的信號傳導。人和鼠PD-1蛋白共有大約60%的胺基酸同一性，具有保守的四個潛在的N-糖基化位點以及限定Ig-V結構域的殘基。胞漿區中的ITIM以及羧基末端酪胺酸(人和小鼠中的TEYATI)周圍的ITIM-樣基序在人和鼠直系同源物(orthologue)之間也是保守的。

二.實施例與測試例

以下結合實施例用於進一步描述本發明，但這些實施例並非限制本發明的範圍。

本發明實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例

實施例1：PBMC提取

招募健康志願者，無感冒發燒症狀，簽署知情同意書。由專業醫務人員於靜脈取血100ml到BD抗凝血管。血液與等量的PBS緩衝液(含2%的胎牛血清)混合。取PBMC分離管Sepmate-50(STEMCELL Technology)，加入15ml的Ficoll緩衝液(GE healthcare)，再加入血液PBS的混合液。離心後PBS重新懸浮沉澱細胞。對重新懸浮細胞計數，取10μl混懸液加入10μl 0.1%的台盼藍混勻，計細胞數和存活率。

實施例2：T細胞純化

300g離心PBMC 5分鐘後，棄去上清，加入相應量的PBS緩衝液(含2mM的EDTA和1%的胎牛血清)重新懸浮細胞使細胞密度調整為5×10⁷個/ml。用STEMCELL Technology公司的試劑盒EasySep^TM Human T Cell Enrichment Kit來純化人T細胞，首先加入50μl/ml的Cooktail到PBMC混懸液中，混勻後室溫靜置10分鐘。然後加入50μl/ml的EasySep^TM D Magnetite Particles混勻，室溫靜置5分鐘。將細胞懸液加入到5ml流式管中，再放入磁極中5分鐘。快速倒出細胞懸液，補充PBS緩衝液到流式管中並重新懸浮，重複3次。將得到的細胞懸液300g離心5分鐘，棄上清，細胞沉澱用LONZA公司的VIVO-15培養基重新懸浮，並調整密度為1×10⁶個/ml，再加入rIL-2(R&D)使之濃度為100IU/ml。然後放入37度細胞培養箱中培養。

實施例3：T細胞啟動

抗-CD3/抗-CD28磁珠(Life Technology)用PBS緩衝液(含2mM的EDTA和1%的胎牛血清)重新懸浮，後加入磁極中靜置2分鐘後棄去上清。重複4次上述過程。取洗後磁珠，磁珠數量按1：1加入純化好的T細胞中，混勻，放入37度培養3天。3天後取出磁珠，首先將目的細胞用移液器重新懸浮多次。將細胞懸液置於磁極中，靜置兩分鐘後，棄去管壁上的磁珠。

實施例4：CAR病毒感染T細胞

CAR慢病毒質體構建： CD19 CAR結構由外到內依次為CD19 scFv,Hinge結構，跨膜結構，4-1BB和CD3z，CD19 CAR和載體pHR-CAR構建表達載體。慢病毒質體pHR-CAR與兩個輔助質體dR8.91和pCMV-VSV-G質體用天根公司的大提質體試劑盒大提質體。

CAR慢病毒包裝和濃縮：293T細胞(購自ATCC)在轉染前一天在75cm²培養皿中長滿，按1：3繼代，每個培養皿培養基為15ml。轉染按照Lipo3000的步驟進行，先配轉染體系：

混勻體系1和2，靜置5分鐘後將二者混勻，再靜置10分鐘。小心加入293T細胞中。6小時後換新鮮培養基。48小時後收培養基存於4℃，重新加入新培養基15ml，過24小時再收上清。將得到的病毒上清用0.45μm的濾膜過濾，裝入超速離心管中。在4℃條件下50000g離心2小時45分鐘，將上清小心徹底去除，剩下肉眼可見的白色病毒沉澱用百分之一上清體積的PBS緩衝液重新懸浮，病毒重新懸浮後於4℃溶解30分鐘左右。溶解完成後分裝成小份凍存於-80℃冰箱。

CAR慢病毒感染T細胞：人原代T細胞在抗-CD3/抗-CD28磁珠啟動一天後，重新懸浮細胞，置於磁極中靜置兩分鐘，取細胞懸液。對細胞懸液進行細胞計數。取約1×10⁷個細胞300g離心5分鐘後棄去培養基，加入新培養基1ml重新懸浮。加入濃縮的慢病毒調整MOI為5，混勻。32℃條件下2000g離心90分鐘，棄去上清，加入新培養基(100IU/ml的rIL-2)使之細胞密度調整為1×10⁶個/ml，重新懸浮後加入剛分離的抗-CD3/抗-CD28磁珠。37℃培養箱中繼續培養。獲得CAR-T細胞。

實施例5：TCR，B2M，PD1基因剔除

(1)crRNA的設計

基於TRAC、B2M和PD1的核苷酸序列選取適當的靶區域，設計長度為17-20nt的crRNA，crRNA與所使用Cas9蛋白相應的tracrRNA序列連接形成sgRNA。藉由實驗比較篩選剔除效率高、脫靶率低的crRNA。所選取部分crRNA序列如下：

Cas9蛋白來自釀膿鏈球菌(Cas9 Nuclease NLS,S.pyogenes(BioLabs))，所對應的tracrRNA序列(SEQ ID NO：17)：

所應用的Cas9(含NLS)蛋白的胺基酸序列(SEQ ID NO：18)：

製備表1所示crRNA與上述與Cas9蛋白對應的tracrRNA連接的sgRNA，crRNA位於tracrRNA的5’端。

(2)sgRNA體外轉錄：

先進行sgRNA的模板PCR擴增：

再進行PCR產物回收：參考Tiangen普通DNA產物純化試劑盒DP214說明書。獲得可用於體外轉錄sgRNA的DNA。利用Ambion體外轉錄試劑盒MEGAshortscript^TM Kit Cat# AM1354)，轉錄sgRNA。參考Ambion MEGAclear^TM Kit說明書cat#AM1908。純化所獲得的sgRNA，經分光光度計和變性瓊脂糖凝膠電泳檢測，均達到要求立即進行分裝，備用。

(3)電轉化CRISPR-Cas9剔除T細胞中TRAC基因：

我們電轉化所獲得的CAR-T細胞(該方法也可用於剔除原代T細胞)，主要利用LONZA 4D電轉化儀，採用的試劑盒為：P3 Primary Cell 4D-Nucleofector^TM X kit。

首先，配電轉化體系：10μl的Nucleofector緩衝液、30μg的Cas9蛋白(約9μg/μl)再加4μg的sgRNA在室溫混合孵育10分鐘。CAR-T細胞在啟動了三天以後，用磁極去除抗-CD3/抗-CD28磁珠。取5×10⁶個細胞/管，300g離心5分鐘，徹底去除上清。加入孵育好的電轉化體系到細胞沉澱中，另外再加72μl的Nucleofector緩衝液和18μl的Supplement緩衝液，混勻加入到100μl的LONZA電轉化杯中。放入LONZA-4D電穿孔儀中按E0-115程式電轉化。電轉化完成後，電轉化杯室溫靜置5分鐘。將電轉化杯中細胞移入預熱的VIVO-15培養基中，調成細胞密度1×10⁶個/ml，37℃繼續培養。

實施例6：TCR陰性細胞篩選

CAR-T細胞在CRISPR-Cas9剔除TRAC後培養至第10天，做TCR陰性細胞富集。首先把所有細胞離心：300g離5分鐘。用PBS緩衝液(含2mM的EDTA和1%胎牛血清)洗兩遍。調細胞密度為：1×10⁷個/ml，然後加入100μl/ml的Biotin-TCR抗體(購自德國美天旎公司)，4℃避光孵育10分鐘。用PBS緩衝液洗一遍後重新調細胞密度為：1×10⁷個/ml，按50μl/ml加入Anti-Biotin Microbeads，放4℃避光15分鐘。PBS緩衝液洗一遍後用500μl的緩衝液重新懸浮。LD column(購自美天旎)放置於磁極中用2ml的PBS緩衝液潤洗1遍後，加入500μl的細胞懸液，目的細胞從LD管柱底下流出收集，待細胞懸液流完後重複2次加入2ml PBS緩衝液於LD管柱上。接收的細胞懸液離心：300g離5分鐘。重新懸浮於預熱的培養基中。

測試例

測試例1：選取最優的crRNA來CRISPR-Cas9剔除TRAC

對實施例5所示針對TRAC設計的crRNA序列進行試驗比較。體外轉錄得到sgRNA後，和Cas9蛋白被電轉入啟動的原代T細胞，48小時後用流式細胞儀檢測胞外TCR蛋白的表達，結果顯示，crRNA均能不同程度地剔除TRAC基因，其中crRNA-11的剔除效率最高。

測試例2：不同遞送系統比較分析

三種遞送系統：質體、mRNA和RNP(蛋白RNA複合體)，crRNA針對的是TRAC，質體大量提取參照實施例4實施，Cas9的mRNA體外轉錄首先用T7引子PCR得到含T7啟動子的DNA模板，然後利用Ambion的T7體外轉錄試劑盒體外轉錄得到Cas9的mRNA。sgRNA和Cas9蛋白複合物同實施例5得到。Jurkat細胞分別取5×10⁶個細胞離心棄去上清，分別用三種不同遞送物質在Invitrogen的電轉系統Neon MPK5000上電轉。48小時後取0.5×10⁶個細胞，用PBS緩衝液洗2遍後用100μl的緩衝液重新懸浮，加入10μl的PE-TCR抗體(eBioscience)，混勻後4℃孵育30分鐘。PBS緩衝液洗一遍後加入500μl緩衝液重新懸浮細胞，上流式細胞儀檢測TCR通道，結果如第1圖所示。

測試例3：隨機N-oligo或魚精DNA增加CRISPR-Cas9剔除TRAC效率

在利用RNP遞送系統進行基因剔除時，RNP與隨機序列N-oligo(寡聚去氧核糖核酸)或魚精DNA混勻後同時電轉化。

示例性的N-oligo序列： (SEQ ID NO：19)

在實施例5(3)的基礎之上，向RNP複合物中再加入100-200nM的N-oligo DNA，N-oligo DNA為Page級。N-oligo對CRISPR-Cas9剔除TRAC效率影響如第2A圖及第2B圖所示，結果顯示N-oligo無論是對T細胞或是CAR-T細胞，都能有效的提高CRISPR-Cas9剔除TRAC基因的效率。

在實施例5(3)的基礎之上，向RNP複合物中再加入100-200nM的魚精DNA片段，魚精DNA片段對剔除TRAC效率影響如第3圖所示，結果顯示魚精DNA片段提高TRAC基因剔除效率，其效率較N-oligo效率更高。

測試例4：T細胞剔除B2M，PD1效率檢測

同樣設計多條crRNA，藉由實驗比較，篩選出剔除效率最高，脫靶率最低的crRNA進行B2M基因的剔除。基於實施例5(3)相同的方法，利用RNP遞送系統和N-oligo，對T細胞的B2M和/或PD1基因進行剔除。

對於B2M蛋白，因B2M基因表達與HLA-ABC在細胞膜上的展示呈緊密聯繫，利用APC-HLA-ABC抗體(eBioscience)對B2M基因的剔除效率進行檢測。結果(如第4圖所示)顯示B2M基因的剔除效率大於80%。

對於PD1基因，RNP和N-oligo混合物電轉化細胞後48小時，分別取1×10⁶個細胞，用PBS緩衝液洗2遍後徹底吸去上清，參照試劑盒GeneArt® Genomic Cleavage Detection Kit(Thermo Fisher)進行T7E1實驗，結果(如第5圖所示)顯示所選取的PD1的三個crRNA能有效的剔除PD1基因，剔除效率均大於80%。

測試例5：CRISPR-Cas9造成的基因突變分析

首先在TRAC，B2M和PD1基因的打靶位點附近設計引子。T細胞基於CRISPR-Cas9系統，利用RNP+N-oligo或魚精DNA片段剔除TRAC，B2M和PD1後，分別取正常T和基因剔除T細胞各1×10⁶個提取基因組DNA。將得到的PCR產物DNA片段和T平端載體(pEASY-Blunt Simple Cloning Kit，北京全式金生物技術有限公司)連接。連接後轉化TOP10受容細胞，塗Amp抗性的固體培養板。第二天將得到純株進行測序，每板至少測30個以上純株。將得到的測序結果與野生型序列對比分析，結果(如第6A圖至第6B圖所示，PD1突變分析結果未示出)顯示CRISPR-Cas9分別造成了三個基因在crRNA對應的基因組DNA處發生了基因突變。

測試例6：脫靶分析

在http：//crispr.mit.edu/網站上，基於所設計crRNA對可能出現的脫靶位點進行預測，TRAC，B2M和PD1分別選取8或9個潛在的脫靶位點(OT1-OT9)，針對這些潛在的脫靶位點設計引子進行PCR擴增並測序。剔除細胞基因組DNA脫靶位點與對照(目標基因TRAC、B2M或PD1)的峰圖測序結果在網站https：//tide.nki.nl/上進行TIDE比對分析，結果(如第7A圖至第7C圖所示)顯示，所選取的crRNA及剔除方法的脫靶率極低。

測試例7：TCR剔除對細胞信號通路及殺傷活性的影響分析

配置CD3抗體溶液(5μg/ml)包被96孔板，每孔加100μl體積，37℃包被兩個小時，取出後，用PBS洗兩遍。分別加入TCR陰性T細胞和普通T細胞，細胞密度為1×10⁶個/ml，37℃培養24小時後，取出染流式抗體CD25和CD69，結果(如第8A圖和第8B圖所示)，表明T細胞在TRAC基因剔除後無法被CD3抗體誘導表達CD25和CD69。藉由針對CD19的TCR陽性CAR-T和TCR陰性(如TRAC剔除)CAR-T細胞對CD19陽性的腫瘤細胞系(K562-CD19)的殺傷作用比較顯示，TCR的剔除對CAR-T的殺傷作用無顯著影響。

雖然為了清楚的理解，已經借助於圖式和實例詳細描述了上述發明，但是描述和實例不應當解釋為限制本發明的範圍。本文中引用的所有專利和科學文獻的公開內容藉由引用完整地清楚結合。

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司、上海恆瑞醫藥有限公司

<120> 體外剔除T細胞中靶基因的方法以及該方法中使用的crRNA

<130> 780046CPCT

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crRNA-1

<400> 1

<210> 2

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crRNA-2

<400> 2

<210> 3

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> crRNA-3

<400> 3

<210> 4

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> crRNA-4

<400> 4

<210> 5

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> crRNA-5

<400> 5

<210> 6

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<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> crRNA-6

<400> 6

<210> 7

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<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> crRNA-7

<400> 7

<210> 8

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<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> crRNA-8

<400> 8

<210> 9

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<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> crRNA-9

<400> 9

<210> 10

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<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> crRNA-10

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<210> 11

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<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> crRNA-11

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> crRNA-12

<400> 12

<210> 13

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<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> crRNA-13

<400> 13

<210> 14

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> crRNA-14

<400> 14

<210> 15

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

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<223> crRNA-15

<400> 15

<210> 16

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crRNA-16

<400> 16

<210> 17

<211> 80

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tracrRNA

<400> 17

<210> 18

<211> 1378

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cas9核酶NLS，釀膿鏈球菌

<400> 18

<210> 19

<211> 127

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 隨機N-oligo

<400> 19

Claims

一種體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法，該方法包括如下步驟：1)使用靶向該T細胞中的一個或多個靶基因的sgRNA分別與Cas9蛋白接觸，形成蛋白RNA複合體；2)將該蛋白RNA複合體與寡聚去氧核糖核酸或魚精DNA片段混合後轉化該T細胞，其中該sgRNA將Cas9蛋白分別引導至相應靶基因的靶序列，並且與該靶序列雜交，其中該靶基因被裂解，並且其中該靶基因的裂解效率大於75%。
如申請專利範圍第1項所述的體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法，其中該靶基因選自TRAC、TRBC、B2M和PD1基因中的一個或多個，該sgRNA靶向該靶基因的編碼序列或其表達的調控序列。
如申請專利範圍第1或2項所述的體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法，其中該sgRNA從5’到3’依次由長度為17-20nt的靶向靶基因的crRNA和與Cas9蛋白對應的tracrRNA連接而成。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法，其中該寡聚去氧核糖核酸是長度為100-250bp的雙鏈DNA或長度為100-250nt的單鏈DNA。
如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法，其中該靶向TRAC 基因的crRNA選自SEQ ID NO：1-12所示crRNA中的任何一種或多種，該靶向B2M基因的crRNA序列如SEQ ID NO：13所示，該靶向PD1基因的crRNA選自SEQ ID NO：14-16所示crRNA中的任何一種或多種。
如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法，其中該Cas9蛋白為來自釀膿鏈球菌的Cas9蛋白如SEQ ID NO：18所示。
如申請專利範圍第1至6項中任一項所述的體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法，其中該與Cas9蛋白對應的tracrRNA序列如SEQ ID NO：17所示。
如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的體外剔除T細胞中一個或多個靶基因的方法，其中該T細胞選自輔助性T細胞、細胞毒性T細胞、記憶性T細胞、調節性T細胞、自然殺傷T細胞、γδT細胞、CAR-T細胞和TCR-T細胞。
一種如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的方法獲得的靶基因剔除的T細胞。
一種用於剔除靶向基因的crRNA，其中該crRNA包含一種或多種選自SEQ ID NO：1-16的序列。
如申請專利範圍第10項所述的用於剔除靶向基因的crRNA，其中該靶向基因選自TRAC、TRBC、B2M和PD1基因中的一個或多個。
如申請專利範圍第10或11項所述的用於剔除靶向基因的crRNA，其中該靶向基因為TRAC基因，該crRNA 選自SEQ ID NO：1-12所示的一個或多個。
如申請專利範圍第10或11項所述的用於剔除靶向基因的crRNA，其中該靶向基因為B2M基因，該crRNA序列如SEQ ID NO：13所示。
如申請專利範圍第10或11項所述的用於剔除靶向基因的crRNA，其中該靶向基因為PD1基因，該crRNA選自SEQ ID NO：14-16所示的一個或多個。
一種用於剔除靶向基因的sgRNA，由crRNA與Cas9蛋白對應的tracrRNA連接形成，其中該crRNA包含一種或多種選自SEQ ID NO：1-16的序列。
如申請專利範圍第15項所述的用於剔除靶向基因的sgRNA，其中該靶向基因選自TRAC、TRBC、B2M和PD1基因中的一個或多個。
如申請專利範圍第15或16項所述的用於剔除靶向基因的sgRNA，其中該靶向基因為TRAC基因，該crRNA選自SEQ ID NO：1-12所示的一個或多個。
如申請專利範圍第15或16項所述的用於剔除靶向基因的sgRNA，其中該靶向基因為B2M基因，該crRNA如SEQ ID NO：13所示。
如申請專利範圍第15或16項所述的用於剔除靶向基因的sgRNA，其中該靶向基因為PD1基因，該crRNA選自SEQ ID NO：14-16所示的一個或多個。
如申請專利範圍第15項所述的用於剔除靶向基因的sgRNA，其中該Cas9蛋白為來自釀膿鏈球菌的Cas9 蛋白如SEQ ID NO：18所示。
如申請專利範圍第15項所述的用於剔除靶向基因的sgRNA，其中該與Cas9蛋白對應的tracrRNA序列如SEQ ID NO：17所示。
一種用於基因剔除的試劑盒，其中所述試劑盒包含：a：一種或多種選自申請專利範圍第9至14項中任一項所述的crRNA，或一種或多種選自申請專利範圍第15至21項中任一項所述的sgRNA；b：Cas9蛋白；c：寡聚去氧核糖核酸或魚精DNA片段。
如申請專利範圍第22項所述的用於基因剔除的試劑盒，其中該寡聚去氧核糖核酸是長度為100-250bp的雙鏈DNA或長度為100-250nt的單鏈DNA。
如申請專利範圍第22項所述的用於基因剔除的試劑盒，其中該Cas9蛋白為來自釀膿鏈球菌的Cas9蛋白如SEQ ID NO：18所示。
一種申請專利範圍第9項所述的靶基因剔除的T細胞的用途，其係用在製備抗腫瘤藥物。
申請專利範圍第9項所述的靶基因剔除的T細胞的用途，其係用在製備防治病毒或細菌引起的感染性疾病藥物。