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TW201842923A - 包含ｍｉｒ－３０２前驅體的組合物在製造用於肺癌治療之藥物上的用途 - Google Patents

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TW201842923A
TW201842923A TW107106212A TW107106212A TW201842923A TW 201842923 A TW201842923 A TW 201842923A TW 107106212 A TW107106212 A TW 107106212A TW 107106212 A TW107106212 A TW 107106212A TW 201842923 A TW201842923 A TW 201842923A
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Abstract

本發明大體上關於使用人造小RNA，諸如小干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)及其髮夾型前驅體(pre-miRNA)作為腫瘤抑制抗癌藥之組合物及方法，其用於治療人類腫瘤及癌症，尤其(但不限於)用於治療皮膚癌(黑色素瘤)、血液癌(白血病)、前列腺癌、乳癌、肝癌及肺癌以及各種贅生性腫瘤，諸如含有源自組織之全部三個胚層，包括外胚層、中胚層及內胚層之多種腫瘤細胞及癌細胞之腦腫瘤及畸胎癌。更特定言之，本發明係關於miR-302類siRNA(siR-302)及/或miR-302前驅體(pre-miR-302)用於開發針對多種人類癌症，特別是肺癌之新穎藥物及療法之用途。

Description

包含MIR-302前驅體的組合物在製造用於肺癌治療之藥物上的用途 相關申請案之交互參照
標記於隨本申請案提交之申請資料表中的國外或國內優先權主張之任何及所有申請案於此將以引用之方式併入。
本申請案主張於2017年2月24日申請的名稱為「A COMPOSITION AND METHOD OF USING MIR-302 PRECURSORS AS ANTI-CANCER DRUGS FOR TREATING HUMAN LUNG CANCER」之PCT專利申請案第PCT/US2017/019511號之優先權。
序列表之引用
如通過EFS-Web以ASCII格式檔案提交之序列表根據35 U.S.C.§1.52(e)於此以引用之方式併入。序列表之ASCII格式檔案之名稱為23415553.TXT，ASCII格式檔案之創建日期為2017年2月23日，且ASCII格式檔案之大小為99KB。
本發明大體上關於使用重組小RNA，諸如小干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)及其髮夾型前驅體(pre-miRNA)作為腫瘤 抑制抗癌藥之組合物及方法，其用於治療人類腫瘤及癌症，尤其但不限於是用於治療皮膚癌(黑色素瘤)、血液癌(白血病)、前列腺癌、乳癌、肝癌及肺癌以及各種贅生性腫瘤(neoplastic tumors)，諸如含有源自組織之全部三個胚層，包括外胚層、中胚層及內胚層之多種腫瘤細胞及癌細胞之腦腫瘤及畸胎癌。更特定言之，本發明係關於人造miR-302類siRNA(siR-302)及/或miRNA前驅體(pre-miR-302)用於開發用於多種抗癌療法，特別是用於人類肺癌治療之新穎藥物之用途。此等siRNA/pre-miR-302藥物可在原核生物中以表現勝任DNA載體及/或所得髮夾型RNA產物形式產生。由於原核細胞不天然地轉錄或加工髮夾型RNA，其中該等RNA之結構類似於原核生物之基因表現系統中之轉錄終止代碼，且另外考慮到原核生物中缺乏之若干必需酵素，諸如第二型RNA聚合酶(Pol-2)及RNase III Dicer，本發明另外教示使用新發現的原核生物中髮夾型RNA轉錄機制(其首先揭示於發明人之美國專利申請案第13/572,263號之優先權中)來於原核生物中表現pre-miRNAs，或稱作原核生物產生之miRNA前驅體(pro-miRNA)之新穎基因表現方法。另外，由於miR-302為人類胚胎幹細胞(hESCs)中之腫瘤抑制因子微小RNA，本發明中呈現之發明人之發現可另外用於設計及開發適用於治療其他腫瘤及癌症相關疾病之新藥物、疫苗及/或療法。
幹細胞為含有許多適用於刺激新細胞生長及組織再生、修復或再生受損/老化組織、治療衰老相關疾病及預防腫瘤形成及癌症進展之有效成分之資源豐富的百寶箱。因此，可設想，發明人可使用此等幹細胞作為篩檢、鑑別及製造此等幹細胞特異性成分之工具以開發針對多種人類疾病之新穎藥物及療法。因此，由此獲得之藥物及療法可用於許多醫藥及治 療應用，諸如用於研究、診斷及/或治療之生物醫學套組、裝置及設備，或其組合。
微RNA(miRNA)為人胚胎幹細胞(hESCs)中的主要有效成分之一。主要hESC特異性miRNA種類包括但不限於miR-302家族、miR-371至373家族及miR-520家族之成員。其中，已發現miR-302家族在腫瘤抑制中起功能性作用(Lin等人，2008及2010；Lin等人之美國專利第9,394,538號、第9,399,773號及第9,422,559號)。MiR-302含有八(8)個家族成員(miR-302s)，包括四(4)個正義miR-302(a、b、c及d)及四(4)個反義miR-302*(a*、b*、c*及d*)。此等正義及反義miRNA成員部分匹配且可彼此形成雙鏈雙螺旋。miR-302之前驅體由miR-302a與a*(pre-miR-302a)、miR-302b與b*(pre-miR-302b)、miR-302c與c*(pre-miR-302c)及miR-302d與d*(pre-miR-302d)形成，在一端有連接序列(莖環)。為了活化miR-302功能，miR-302前驅體(pre-miR-302s)首先由細胞RNase III Dicer加工為成熟miR-302s且進一步與某些阿爾古(AGO)蛋白形成RNA誘導之沉默複合物(RISCs)，隨後導致許多靶基因轉錄物(mRNAs)、尤其包括一些主要致癌基因mRNAs之RNA干擾(RNAi)介導之直接降解或轉譯抑制，如發明人之先前美國專利第9,394,538號、第9,399,773號及第9,422,559號(Lin等人)中所揭示。
MiR-302為hESCs及誘導多能幹細胞(iPSCs)中發現之最富集非編碼(ncRNA)種類。發明人之先前研究已顯示，miR-302超出hESC H1或H9細胞中所發現水平之異位過度表現能夠以類似於桑椹胚階段早期人類受精卵之多能幹細胞的幾乎無致腫瘤性之情況下將人類正常及癌細胞兩者重新編程為hESC類iPSCs(Lin等人，2008、2010及2011；Lin等人之EP 2198025；Lin等人之美國專利申請案第12/149,725號及第12/318,806 號；Lin等人之美國專利第9,394,538號)。相對靜止(Relative quiescence)為此等miR-302誘導之iPSCs之確定特徵，而晚期囊胚源性hESCs及其他先前報導之三/四因子誘導之(Oct4-Sox2-Klf4-c-Myc或Oct4-Sox2-Nanog-Lin28)iPSCs全部展示類似於贅生性腫瘤/癌細胞之極快速細胞增殖速率(12-15小時/週期)(Takahashi等人，2006；Yu等人，2007；Wernig等人，2007；Wang等人，2008)。為揭示miR-302之此腫瘤抑制效應，發明人為鑑別涉及兩種miR-302靶向G1-檢查點調節子，包括週期素依賴性激酶2(CDK2)(Lin等人，2010；Lin等人之美國專利第9,394,538號)及BMI-1(Lin等人，2010；Lin等人之美國專利第9,422,559號)之第一批研究人員。發明人之研究發現miR-302同時沉默此兩種主要靶基因以在細胞週期之G1-S轉化期間抑制細胞週期素-E-CDK2以及細胞週期素-D-CDK4/6路徑，以預防多能幹細胞之致腫瘤性。此外，發明人亦發現miR-302之重新編程功能可經由部分重新編程機制將高級惡性癌症重新編程至低級良性或甚至幾乎正常狀態(Lin等人之美國專利第9,399,773號)。
然而，尚不知曉此等先前發現之miR-302之腫瘤抑制功能是否可直接用於人類肺癌療法。鑒於各種各樣的肺癌類型，發明人之先前專利及其相關申請不可確定此可能性。不同於其他人類癌症，肺癌之病理性病因複雜，包括空氣污染、吸菸、石棉沉著病、病毒、長期發炎、基因突變及其他癌症轉移至肺組織中，或甚至其組合。由於如此大的複雜度，即使專家亦不可容易地預測其他癌症之新療法用於治療肺癌之成效。可能需要涉及更新穎治療機制以處理肺癌之複雜度。
miR-302與肺癌之間不存在直接基因聯繫。編碼miR-302之基因體序列位於人類染色體4，常與長壽相關之保守區之4q25基因座中。更確切地說，miR-302編碼於La核糖核蛋白結構域家族成員7(LARP7) 基因之內含子區中且經由發明人發現之內含子miRNA生物合成路徑表現(Ying及Lin，2004；Barroso-delJesus，2008；圖13；SEQ.ID.NO.5)。在發明人之先前研究中，發明人觀測到引入miR-302可在轉染細胞中刺激許多其他hESC特異性miRNAs之表現，諸如miR-92、miR-93、miR-367、miR-371~373、miR-374及miR-520家族成員(Lin等人，2008、2010及2011；Lin等人之EP 2198025；Lin等人之美國專利申請案第12/149,725號及第12/318,806號)。使用在線「TARGETSCAN」及「PICTAR-VERT」程式之分析另外顯示miR-302於此等經刺激miRNAs共用超過400個靶基因，表明其亦可與mir-302起類似功能作用。此等共用靶基因包括但不限於以下之成員：RAB/RAS相關致癌基因、ECT相關致癌基因、多形性腺瘤基因(pleiomorphic adenoma genes)、E2F轉錄因子、細胞週期素D結合Myb類轉錄因子、HMG-盒轉錄因子、Sp3轉錄因子、轉錄因子CP2類蛋白、NFkB活化蛋白基因、細胞週期素依賴性激酶(CDKs)、MAPK/JNK相關激酶、SNF相關激酶、肌球蛋白輕鏈激酶、TNF-α誘導蛋白基因、DAZ相關蛋白基因、LIM相關同源盒基因、DEAD/H盒蛋白基因、叉頭盒蛋白基因(forkhead box protein genes)、BMP調節因子、Rho/Rac鳥嘌呤核苷酸交換因子、IGF受體(IGFR)、內皮素受體、左右決定因子(Lefty)、細胞週期蛋白、p53誘導性核蛋白基因、RB蛋白類1(Rb-like 1)、RB結合蛋白基因、Max結合蛋白基因、c-MIR細胞免疫識別調節子(c-MIR cellular modulator of immune recognition)、Bcl2類細胞凋亡易化子、原鈣黏蛋白、TGFß受體、整合素ß4/ß8、抑制素(inhibin)、錨蛋白、SENP1、NUFIP2、FGF9/19、SMAD2、CXCR4、EIF2C、PCAF、MECP2、組蛋白乙醯轉移酶MYST3、細胞核RNP H3及許多細胞核受體及因子。大多數此等靶基因參與胚胎發育及致腫瘤性。因此，可設想，miR-302可另外刺激其同源 miRNAs，諸如miR-92、miR-93、miR-367、miR-371~373、miR-374及miR-520，以增強及/或維持其功能。
儘管miR-302適用於設計及開發新穎抗癌藥物/疫苗，但其製造成問題，因為天然miR-302僅可見於人類多能幹細胞(諸如hESCs)中，其原始來源極有限且高度引起爭論。或者，合成小干擾RNAs(siRNA)可用以模擬pre-miR-302；然而，因為pre-miR-302之結構由兩個錯配之miR-302及miR-302*股形成，所以彼等完美匹配之siRNA模擬物無法置換miR-302*之功能，miR-302*之序列完全不同於siRNA之反義鏈。舉例而言，siRNA-302a模擬物之反義鏈為5'-UCACCAAAAC AUGGAAGCAC UUA-3'(SEQ.ID.NO.1)，而天然miR-302a*為5'-ACUUAAACGU GGAUGUACUU GCU-3'(SEQ.ID.NO.2)。因為完整miR-302功能必須由其正義miR-302及反義miR-302*鏈兩者產生，所以使用siRNA模擬物之許多先前報導已顯示與自然界中之天然miR-302功能不同之結果。另一方面，發明人近期之iPSCs探索可提供pre-miR-302製造之替代性解決方案(Lin等人之EP 2198025；Lin等人之美國專利申請案第12/149,725號及第12/318,806號)。儘管如此，使此等iPSCs生長之成本及風險仍過高以致無法用於現在的工業製造。
或者，使用原核勝任細胞可為製造人類miRNAs及其前驅體(pre-miRNAs)之可能方法。然而，原核細胞不具有真核miRNA表現及加工所需之若干必需酵素，諸如Drosha及Dicer蛋白質。此外，原核RNA聚合酶不會高效地轉錄具有高二級結構之小RNA，諸如髮夾型pre-miRNAs及shRNAs。事實上，由於如pre-miRNAs之髮夾型RNA結構與原核基因表現系統中之內在轉錄終止代碼類似(McDowell等人，Science 1994)，故不存在細菌基因組中編碼之真正miRNA種類，且細菌不會天然地表現miRNA。因此，若發明人可在原核生物中表現人類miRNAs，則所得miRNAs 將保持其類似於pri-miRNA(多個pre-miRNAs之大初級團簇(large primary cluster))及/或pre-miRNA(一個單髮夾RNA)之前驅體形式。然而，如上所述，真正的挑戰為如何促使人類miRNAs於原核生物中之表現。為克服此問題，發明人之美國專利申請案第13/572,263號、第14/502,608號及第14/527,439號之優先權發明已確立一種用於產生原核生物產生之微RNA(pro-miRNA)之方法。經測試，由此獲得之pro-miRNAs與其天然pre-miRNA對應物具有相同序列、結構及功能。
如自當前教科書習得，所屬技術領域中具有通常知識者皆熟知原核與真核轉錄機制極不同且因此彼此不兼容。舉例而言，基於當前理解，真核RNA聚合酶不直接結合至啟動子序列且需要額外輔助蛋白(輔因子)來起始轉錄，而原核RNA聚合酶為直接結合至啟動子序列以起始轉錄的單一全酶。亦為常識的還有：真核信使RNA(mRNA)係藉由第二型RNA聚合酶(Pol-2)於細胞核中合成，且隨後經加工且輸出至細胞質用於蛋白質合成，而原核RNA轉錄及蛋白質轉譯在相同段DNA外在相同位置同時發生。此係因為原核生物諸如細菌及古菌不具有任何細胞核樣結構。因此，此等天然差異使得原核細胞難以或甚至不可能使用真核啟動子產生真核RNA。
先前技術嘗試使用細菌或噬菌體啟動子在細菌細胞中產生哺乳動物肽及/或蛋白質，諸如Buechler之美國專利第7,959,926號及Mehta之美國專利第7,968,311號。為了起始表現，將所要基因選殖至由細菌或噬菌體啟動子驅動之質體載體中。基因不得含有任何非編碼內含子，因為細菌不具有用以加工內含子之任何RNA剪接機構。隨後，將由此獲得之載體引入至細菌細胞之勝任菌株，諸如大腸桿菌(Escherichia coli；E.coli)中，以便表現基因之轉錄物(mRNAs)且隨後將mRNAs轉譯為蛋白質。儘管 如此，細菌及噬菌體啟動子，諸如Tac、Lac、Tc、T1、T3、T7及SP6 RNA啟動子不為Pol-2啟動子且其轉錄活動傾向於為易錯過程，其造成突變且不能表現任何髮夾型RNA結構，如McDowell等人(Science 1994)所報導。另外，Mehta進一步教示，甘油(glycerol/glycerin)可用以增加細菌轉化之效率；然而，無教示係關於RNA轉錄、尤其是Pol-2啟動子驅動之原核RNA轉錄的增強。由於真核與原核轉錄系統之間不具有兼容性，所以此等先前技術仍受限於將原核RNA啟動子用於原核生物中之基因表現，且原核RNA啟動子中無一者適用於表現髮夾型RNA，諸如pre-miRNAs及shRNAs。
歸因於系統不兼容性，在發明人之pro-miRNAs發明之前不存在於原核生物中產生pre-miRNA/shRNA類藥物之方法。此外，pre-miRNA/shRNA的大小約為70至85個核苷酸長，其太大且成本太高以致無法藉由RNA合成機器製得。為克服此等問題，本發明採用pro-miRNAs。藉由添加模擬真核轉錄輔因子之一些確定化學誘導劑，發明人可為原核細胞建立新穎適應環境，以將真核Pol-2及/或Pol-2類病毒啟動子用於轉錄髮夾型pre-miRNAs及shRNAs。優勢為：第一，歸因於細菌之快速生長而有成本效益地大批量生產；第二，由於不需要培育生長專用hESCs或iPSCs而易於處置；第三，就Pol-2啟動子驅動之RNA轉錄而言，存在高保真度生產率；第四，歸因於原核生物中不具有真正的miRNA，所得pre-miRNAs及siRNAs的純度高；及最後，無內毒素，其可藉由某些化學品處理而進一步移除。因此，一種產生高品質及高數量之pro-miRNAs作為治療人類肺癌之藥物的方法為高度理想的。
本發明係關於髮夾型RNAs，諸如pre-miR-302s (SEQ.ID.NO.6至SEQ.ID.NO.9)及其siRNA模擬物(siR-302)用於治療人類肺癌之用途。pre-miR-302及siR-302係藉由使用某些化學誘導劑刺激及增強原核細胞中之真核啟動子驅動之髮夾型RNA轉錄的新穎pro-miRNA產生方法製得。此等化學誘導劑包括3-嗎啉基丙烷-1-磺酸[或稱作3-(N-嗎啉基)丙磺酸；MOPS]、甘油(或稱作丙三醇)及乙醇、以及其功能類似物，諸如2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)及甘露醇。另外，可設想與此等誘導劑具有類似結構之化學品可具有相同功能。然而，MOPS通常用作細菌細胞溶解中之緩衝劑，乙醇為熟知消毒劑，且甘油藉由使細菌細胞壁不穩定而頻繁用作為細菌轉化(transformation)中之抑菌劑。鑒於MOPS、乙醇及甘油之此等已知功能，沒有人將預期使用0.001%至4%(體積/體積)濃度之此等化學品以在原核生物中誘發真核啟動子驅動之基因表現。
基於以上描述，本發明亦含有使用原核細胞產生作為用於癌症療法之治療藥物及/或疫苗之人類微RNA前驅體(pre-miRNAs)及/或shRNAs的設計及方法。更特定言之，本發明為使用原核細胞產生特殊種類之pre-miRNA類藥劑的設計及方法，該等藥劑稱為原核生物產生之miRNA前驅體(pro-miRNA)，能夠將高級惡性/轉移性人類癌細胞重新編程為低級良性或甚至正常樣狀態。較佳地，此等pro-miRNAs為腫瘤抑制因子微RNAs(TS-miRNA)，與miR-302a、b、c、d、e、及/或f之前驅體(pre-miR-302s)及其天然家族簇以及其人工重新設計之小髮夾型RNAs(shRNAs)及/或其組合類似。pre-miR-302類shRNAs之結構包括pre-miR-302莖-臂序列之不完全及完全匹配雙螺旋構形，其可形成於單一單元或多個單元簇中。另外，pre-miR-302類shRNA之錯配部分可位於莖臂或環區中，與預期pre-miR-302序列具有約30%至100%同源性。此等設計可提高標靶特異性及/或減少 有效遞送及癌症療法所需的pro-miR-302之複本數。適合於此類藥物治療之人類細胞包括活體外、離體及/或活體內正常細胞、腫瘤細胞及癌細胞。
較佳地，用於本發明之原核細胞為細菌勝任細胞，特定言之大腸桿菌(Escherichia coli；E.coli)，且化學誘導劑為MOPS、乙醇或甘油，或其混合物。另外較佳地，使用之真核RNA啟動子為真核Pol-2啟動子(亦即EF1α啟動子)或Pol-2相容的(Pol-2類)病毒啟動子(亦即巨細胞病毒CMV啟動子)。藉由真核RNA啟動子介導之基因可編碼選自由以下組成之群組的非編碼或蛋白質編碼RNA或兩者(諸如含內含子之基因轉錄物)：微RNA(miRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、小干擾RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、其前驅體及同系物，及其組合。為了誘導基因表現，原核細胞經真核RNA啟動子介導之基因轉染，且接著在與魯利亞-貝爾塔尼(Luria-Bertani；LB)培養液之細菌培養基類似之培養基中在37℃下在添加化學誘導劑之情況下生長>24小時。
為了展示該等化學誘導劑對於原核生物中之人類微RNA產生之可誘導性，發明人將來自發明人之優先權美國專利申請案第12/149,725號及第12/318,806號之慢病毒載體pSpRNAi-RGFP-miR302修飾為新質體載體pLenti-EF1a-RGFP-miR302，其中SpRNAi-RGFP基因表現係藉由真核Pol-2或Pol-2類啟動子，諸如EF1α及/或CMV啟動子，或兩者之重組組合驅動(圖1A)。此後，發明人藉由其轉化大腸桿菌勝任細胞且接著使用紅色螢光蛋白(RGFP)之表現作為用於量測pre-miR-302s(pro-miR-302s)之轉錄及產生速率之可見標記物，如圖1B中所示。由於miR-302家族簇(SEQ.ID.NO.5)亦經進一步修飾以編碼於RGFP基因之5'-內含子區[例如5'-非轉譯區(5'-UTR)或第一內含子]中，各RGFP mRNA之轉錄導致產生一個4-髮夾miR-302前驅體簇(pri-miR-302)及/或四個1-髮夾miR-302前 驅體(pre-miR-302s)，如圖5及圖6中所示。由於原核生物中不具有RNase III Dicer，pri-miR-302轉錄物將最終(藉由大腸桿菌中之某些單鏈RNA酶)分解為1-髮夾pre-miR-302s，其全部可經提取且另外用作本發明之治療藥物。廣義地說，將5'-UTR及3'-UTR視為本發明之內含子的一部分。
所有miR-302成員在其前5'-十七(17)個核苷酸中共用完全相同的序列5'-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3'(SEQ.ID.NO.3)，且在其成熟微RNA之全長23核苷酸中具有>82%同源性。基於藉由在線計算程式TARGETSCAN及PICTAR-VERT預測之結果，此等miR-302s同時靶向幾乎相同基因，包括>600種人類基因。另外，miR-302亦與mir-92、mir-93、mir-200c、mir-367、mir-371、mir-372、mir-373、mir-374及mir-520家族成員共用許多重疊靶基因，該等家族成員全部可具有類似功能。大部分此等靶基因是在早期胚胎發生期間參與啟動及/或建立某些譜系特異性細胞分化之發育信號及轉錄因子(Lin等人，2008)。許多此等靶基因亦為熟知致癌基因；因此，miR-302s可能充當腫瘤抑制因子以預防正常hESC生長偏離為腫瘤/癌細胞。
在一些實施例中，揭示抑制癌細胞增殖之方法。方法包括使該癌細胞與一定量的含有SEQ.ID.NO.3之髮夾型pre-miRNA接觸，該量足以抑制癌細胞增殖。在一些實施例中，該量不足以抑制正常細胞增殖。在一些實施例中，該量在10至200μg/mL範圍內。在一些實施例中，該量為10μg/mL、15μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL、200μg/mL或其間的值。在一些實施例中，pre-miRNA為甘胺醯甘油(glycylglycerin)囊封之pro-miR-302。在一些實施例中，癌細胞在動物中且將甘胺醯甘油囊封之pro-miR-302注射至動物之血流中以處理癌細胞。在一些實施例中，甘胺醯甘油囊封之pro-miR-302以每毫升動 物血液10至200微克之間的濃度注射至動物中。在一些實施例中，甘胺醯甘油囊封之pro-miR-302以10μg/mL、15μg/mL、25μg/rmL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL、200μg/mL或其間的值之濃度注射至動物中。在一些實施例中，甘胺醯甘油囊封之pro-miR-302以每天兩次、每天一次、每週兩次、每週一次、每兩週一次、每四週一次或其間的值之頻率注射至動物中。在一些實施例中，甘胺醯甘油囊封之pro-miR-302以每週兩次之頻率注射至動物中。在一些實施例中，癌細胞來自選自由以下組成之群組的癌症：膀胱癌、肺癌、腦癌、肝癌、乳癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、子宮頸癌、卵巢癌及骨癌。在一些實施例中，癌細胞為肺癌細胞。
在原核生物中誘導真核啟動子驅動之基因表現。
大腸桿菌(E.coli)勝任細胞係以pLenti-EF1α-RGFP-miR302質體，使用z-勝任大腸桿菌轉化套組(Zymo Research,Irvine,CA)轉化(圖1A)，且在37℃下在以170rpm頻繁攪拌之情況下在補充有0.1%(v/v)MOPS及0.05%(v/v)甘油(誘導劑)之混合物的魯利亞-貝爾塔尼(LB)培養液中培養。在隔夜培育之後，轉化之大腸桿菌勝任細胞表現可在LB培養液之顏色中明顯可見的高豐度紅色RGFP蛋白質，而空白對照大腸桿菌未呈現RGFP，如圖2中所示。功能性RGFP之存在指示其編碼之RNA及蛋白質均在勝任細胞中成功地產生及處理。
為了進一步確認藉由化學誘導劑誘導之基因表現的特異性，製備兩個轉化之大腸桿菌菌株：一個攜有含有CMV啟動子驅動之綠色螢光蛋白(GFP)基因的pLVX-Grn-miR302+367質體載體，且另一個攜有上述pLenti-EF1α-RGFP-miR302載體。在僅與0.1%(v/v)MOPS一起隔夜培育之後，經pLVX-Grn-miR302+367轉化之大腸桿菌變為綠色，而經 pLenti-EF1α-RGFP-miR302轉化之另一個仍顯示紅色，如圖3中所示。此結果指示如MOPS之化學誘導劑可經由真核pol-2或Pol-2類病毒啟動子刺激特定RNA轉錄及其相關蛋白質生產。特定言之，注意到RGFP及GFP產量如此豐富以致即使大腸桿菌細胞亦藉由對應紅色及綠色可視地染色。
在本發明測試之所有化學品中，前三種最強力誘導劑為MOPS、甘油及乙醇，如圖4中所示。誘導性RGFP生產之定量結果係藉由西方墨點分析(Western blot analysis)進一步確認，如圖5及實例3中所示。細菌RuvB蛋白質充當標準化RGFP表現之管家標準。亦發現此等經識別誘導劑之可誘導性與其濃度成比例地具劑量依賴性。在無任何處理的情況下，陰性對照大腸桿菌細胞在不存在任何螢光染色之情況下僅顯示其原始顏色。因此，根據所有此等結果，本發明明確提供新穎化學誘導性組合物及其用於調節原核細胞中之真核pol-2驅動或Pol-2類病毒啟動子驅動之RNA生產之應用。鑒於以上論證，對於所屬技術領域中具有通常知識者而言，使用其他基因或相關cDNAs代替RGFP基因在原核生物中產生功能性RNAs及相關蛋白質係為顯而易見的。
在原核生物中誘導真核啟動子驅動之pre-miRNA表現。
伴隨上文顯示之RGFP誘導實驗，發明人另外量測pri-/pre-miR-302s及其成熟miR-302s在具有或不具有化學誘導之pLenti-EF1α-RGFP-miR302轉化之細胞中之表現。如圖6及實例4中所示，已藉由北方墨點分析(Northern blot analysis)確認誘導之pri-/pre-miR-302生產之定量結果。與圖4及5中之RGFP誘導之結果類似，在用MOPS、甘油或乙醇處理之轉化細胞，但未在空白對照中強烈偵測到pri-/pre-miR-302表現，指示此等化學誘導劑實際上經由真核pol-2啟動子刺激編碼pri-/pre-miRNAs於原核細胞中之表現(圖6)。由於pre-miRNAs及 shRNAs之結構相似性，對於所屬技術領域中具有通常知識者而言，使用本發明以產生其他類型的pri-/pre-miRNA種類係為顯而易見的，諸如但不限於miR-34、miR-125、miR-146、miR-200、miR-371~373及miR-520。為了澄清，將此等人造原核生物產生之pri-/pre-miRNAs稱作pro-miRNAs。
由於pLenti-EF1α-RGFP-miR302含有位於RGFP基因之5'-UTR中之miR-302家族簇(圖1A及圖1B)，誘導之RGFP基因表現亦將產生miR-302簇(pri-miR-302)及其衍生物pre-miR-302a、b、c及d(pre-miR-302s)，如圖1B中所展示。由於原核生物中不具有RNase III Dicer，發現由此獲得之pri-miR-302及pre-miR-302s保持為髮夾型微RNA前驅體，該等前驅體適用於開發治療藥物。在人類細胞中，此等pre-miR-302s及pri-miR-302可處理成成熟miR-302以引發其腫瘤抑制功能。類似地，本發明亦可用於產生其他類型的TS-miRNA種類及其前驅體，諸如miR-34a、miR-146a、miR-373及miR-520家族。
所得pro-miRNAs可自勝任大腸桿菌細胞容易地提取(實例5及6)且藉由高效液相層析(HPLC)進一步純化(圖10A及10B)。在純化之pro-miR-302s內，發明人已使用微RNA微陣列分析(圖11B及12)及RNA定序[圖13A(pri-miR-302)及13B(pre-miR-302s)]識別鑑定所有miR-302家族成員(miR-302a、a*、b、b*、c、c*、d及d*)。特定言之，定序結果顯示此等pro-miR-302s全部與其天然pre-miR-302對應物共有完全相同的序列(圖13B)。此外，發明人已將此等pro-miR-302s調配為靜脈內(IV)/活體內注射之可溶藥物以測試其對於活體內人類肝癌之治療效果(實例11)。如圖14中所示，在3次注射治療之後，pro-miR-302藥物成功地減小活體內移植人類肝癌之>90%體積，將平均癌症尺寸縮小至相比於未治療癌症之<10%。此外，藉由蘇木精及曙紅(H&E)染色之組織學檢查另外展 示此顯著治療效果不僅起因於miR-302之經報導腫瘤抑制功能(Lin等人，2010)，且亦起因於先前尚未觀測到的另一新穎重新編程功能。舉例而言，圖15明顯地顯示pro-miR-302藥物可在活體內將高級人類肝癌之惡性特性重新編程至與正常肝組織幾乎類似之良性得多的階段。此等經治療癌症可甚至形成正常肝樣結構，諸如經典肝小葉、中央靜脈(CV)及門脈三聯管(portal triads；PT)。因此，此等證據強有力地指示pro-miR-302不僅能夠抑制腫瘤/癌細胞生長，且亦能夠在活體內將人類癌症之惡性重置為相對良性或正常狀態，對於癌症藥物設計產生完全新穎的治療效果。
在本發明中，質體載體及其編碼之非編碼RNAs(亦即pre-miRNA/shRNA及pri-miRNA)均可在原核細胞，較佳大腸桿菌DH5α勝任細胞中同時擴增(實例1、5及6)。用於分離擴增之pLenti-EF1α-RGFP-miR302質體DNA及轉錄之pri-/pre-miR-302s之方法描述於實例5及6中。用於將質體載體(亦即pLenti-EF1α-RGFP-miR302)遞送至原核細胞中之技術稱作細胞轉化，而用於將擴增之ncRNAs(亦即pro-/pri-/pre-miR-302s)遞送至真核細胞中之方法可選自由以下組成之群組：細胞內飲、化學/甘果糖輸注(glycerol infusion)、肽/脂質/化學物質介導之轉染、電穿孔、基因槍穿透、微注射、轉座子/反轉錄轉座子插入、及/或腺病毒/反轉錄病毒/慢病毒感染。
pro-miR-302誘導之多能幹細胞分化作用。
已報導miR-302將哺乳動物體細胞重新編程為人胚胎幹細胞(hESC)類誘導多能幹細胞(iPSC)，如發明人之優先權美國專利申請案第12/149,725號及第12/318,806號中所展示。已使用此等iPSCs設計及開發許多幹細胞應用及療法。儘管如此，由於培養此等iPSCs及hESCs成本極高且費力，因此自此等多能幹細胞收集miR-302及其前驅體為困難且低 效的。另一方面，製造合成shRNA模擬物為pre-miR-302生產之另一可能的替代方案；然而成本仍極昂貴。另外，合成shRNA與天然pre-miR-302之間的相似性為存有疑慮的。為了解決此等問題，本發明提供一種用於在原核生物中大批量產生pre-miR-302之簡單、廉價且高效的方法。此外，此等原核生物產生之pre-miR-302s(pro-miR-302s)之提取及純化相對容易且具成本效益，如本發明之圖6及實例6中所示。
發明人已使用pLenti-EF1α-RGFP-miR302轉化之大腸桿菌細胞產生及分離高數量及品質的pLenti-EF1α-RGFP-miR302載體及pro-miR-302s，如實例5及6中所示。pLenti-EF1α-RGFP-miR302及pro-miR-302s均適用於產生iPSCs。遵循實例2，當藉由本發明產生之pro-miR-302s轉導(transduced)至人類皮膚原代角質細胞中時，轉染之角質細胞重新編程為表現強力hESC標記物Oct4之hESC類iPSCs(圖7)。在圖8及實例8中，發明人另外進行亞硫酸氫鹽DNA定序檢定以顯示全DNA脫甲基確實發生於Oct4及Sox2基因兩者之啟動子中，該等基因為關鍵重新編程因子以及hESC標記物中之兩者。由於已知全DNA脫甲基及Oct4表現為體細胞重新編程以形成hESC類iPSCs之第一步(Simonsson及Gurdon,Nat Cell Biol.6：984-990,2004)，自MOPS誘導之大腸桿菌細胞提取物分離之pro-miR-302s經證實有效地作為適用於iPSC分化之天然pre-miR-302s。因此，pro-miR-302及pre-miR-302在幹細胞誘導中具有相同功能。
pre-miR-302誘導之CD34陽性成體幹細胞擴增及/或再生。
已發現微RNA miR-302將哺乳動物體細胞重新編程為hESC類iPSCs(Lin,2008,2010,2011；Lin的美國專利申請案第12/149,725號及第12/318,806號)。使用此等iPSCs，已開發出許多推進現代再生醫學 之幹細胞相關生物醫學應用及療法。然而，miR-302僅大量發現於hESCs而非分化組織細胞中。另外，自hESCs分離miR-302為高度有爭議、高成本且繁瑣的。為解決此等問題，發明人之美國專利申請案第15/167,226號之優先權已提供一種用於在原核生物中大批量產生pre-miRNAs(或稱作pro-miRNAs)及其siRNA模擬物之簡單、廉價、快速且誘導性的組合物及方法。使用此方法，自原核細胞產生及分離pre-miR-302(pro-miR-302s)相對容易且具成本效益，如本發明之圖6及實例6中所示。
經分離pre-miR-302s之一種較佳應用為在正常組織或癌組織中誘導CD34陽性成體幹細胞之擴增。如圖17A及17B中所示，發明人使用新穎甘胺醯甘油調配之基於pre-miR-302之藥物在創傷癒合及癌症療法中之近期研究顯示相對較低濃度(50至500μg/mL)之調配pre-miR-302作為候選藥物之治療不僅極大地增強無疤創傷癒合，且亦在小鼠及豬皮膚中之受損組織區域周圍活體內誘導CD34陽性成體幹細胞擴增。基於與圖17A之對照(僅抗生素軟膏)結果相比的圖17B之miR-302治療(pre-miR-302s+抗生素軟膏)結果，明顯地顯示在pre-miR-302治療之後，活體內CD34陽性成體幹細胞群體(藉由綠色螢光抗CD34抗體標記)具40倍增加。當前已知的CD34陽性幹細胞類型包括但不限於皮膚、毛髮、肌肉、血液(造血)、間充質及神經幹細胞。鑒於此發現，由於miR-302可用於活體內誘導CD34陽性成體幹細胞擴增及/或再生，此治療效果亦可幫助再生長及/或複生功能性成體幹細胞以治療人體之退行性疾病，諸如但不限於阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、帕金森氏症(Parkinson's disease)、骨質疏鬆、糖尿病及癌症。
將pro-miR-302在活體內用於肝癌療法。
發明人之先前研究已展示此方法在活體外治療人類肝細胞 癌HepG2細胞中之可行性(Lin等人，2010)。如圖9中所示，治療之腫瘤/癌細胞重新編程為iPSCs(標記為mirPS-HepG2)且形成擬胚體樣細胞集落(embryoid body-like cell colonies)。此外，亦發現miR-302在治療之癌細胞群體中誘發>95%細胞凋亡。圖9之頂圖另外顯示DNA含量之流式細胞術分析，回應於細胞週期階段而在miR-302治療之後展現有絲分裂細胞群體之顯著減少(45.6%至17.2%)。此等結果指示miR-302可有效地減弱人類肝癌細胞之快速細胞週期速率且因此造成此等癌細胞之顯著細胞凋亡。
由於累積基因突變而認為癌症進展過程不可逆；然而，本發明揭示可在活體內將高級惡性癌症重新編程回低級良性或甚至正常樣階段之新穎pre-miRNA(pro-miR-302)功能，其中該機制可與稱作自發癌症消退(spontaneous cancer regression)之極稀有自然治癒過程相關。自發癌症消退以100,000個癌症患者中小於1個之比率罕見地出現。發明人發現pro-miR-302治療能夠在人類肝癌中將此稀有治癒比率增加至>90%。如圖14中所示，使用pro-miR-302s作為治療SCID-灰棕色裸小鼠(n=6)之人類肝癌異種移植物之藥物的治療結果展示此pro-miR-302藥物成功地將癌症尺寸自728±328mm3(未處理空白對照，C)減小至75±15mm3(經pro-miR-302治療，T)，指示平均癌症尺寸之約90%減小率，而其他合成siRNA模擬物(siRNA-302)之治療不提供任何類似治療效果。
進一步的組織學檢查(圖14之最右圖)顯示僅在pro-miR-302治療之癌症移植物，但未在其他治療或對照中觀測到正常肝小葉樣結構(圈出且藉由黑色箭頭指出)，表明已出現重新編程機制以將惡性癌細胞特性重置回相對正常樣狀態(癌症逆轉)。此新穎重新編程機制可能起因於miR-302對人類致癌基因，特別是參與癌症進展之彼等突變致癌基因的基因沉默效應。藉由使彼等突變致癌基因沉默，pro-miR-302能夠將癌 基因表現模式重置回正常樣狀態，因此產生癌症逆轉之治療結果。儘管如此，此活體內重新編程機制可不同於先前報導之活體外體細胞重新編程(Lin等人，2008及2011)，因為未在pro-miR-302治療之後在活體內識別到Oct4陽性多能幹細胞。
更詳細組織學檢查(圖15)進一步確認pro-miR-302藥物確實將高級(IV級)人類肝癌移植物重新編程至更良性低級(小於II級)狀態。如圖15中所示，治療之癌症移植物形成含有中央靜脈(CV)樣及門脈三聯管(PT)樣結構(藉由黑色箭頭指示)之經典肝小葉，與正常肝組織結構(頂部)高度類似。未治療、siRNA治療、pro-miR-302治療之人類肝癌移植物及正常肝組織之間的活體內組織學比較(圖16)亦顯示未經治療之移植人類肝癌(頂部)侵略性地侵入周圍正常組織，諸如肌肉及血管中，且形成塊狀細胞-細胞及癌症-組織融合結構，表明其高惡性及轉移。siRNA模擬物(siRNA-302)之治療不顯著降低移植肝癌之惡性(上中部)，可能歸因於siRNA在活體內之短半衰期。相比之下，pro-miR-302之治療不僅將移植癌細胞重新編程至正常肝細胞樣形態(未融合)，且亦成功地抑制任何向周圍組織中之癌症侵襲(下中部)。相比於正常肝組織(底部)，pro-miR-302治療之癌症明顯地顯示類似小葉結構、正常腺細胞樣佈置及細胞-細胞與癌症-組織接合處之間的極清晰邊界(黑色箭頭)，表明此等經治療癌症已極大地降級至極良性狀態。經6至10次之pro-miR-302藥物的進一步連續治療可完全消除所有6個樣品(n=6)中之癌症異種移植物。
pro-miR-302在活體內用於肺癌療法的運用。
在本發明中，發明人想要擴展miR-302治療於肺癌療法中之應用。為達成此目標，發明人首先測試甘胺醯甘油囊封之pro-miR-302(或稱作配方#6；F6)對於自患者分離之不同肺癌細胞類型之生長的劑量依賴 性腫瘤抑制效應，且發現活體外使用25至50μg/mL之F6溶液呈現針對所有測試之肺癌細胞增殖，但不會針對正常細胞生長之最佳抑制結果(圖18)。為了進一步量測F6藥物針對惡性肺癌細胞類型之生長的效能，進行軟瓊脂集落(soft agar colony)形成檢定。如圖19A及19B中所示，發明人發現此軟瓊脂系統中之典型人類惡性肺癌細胞株-A549之集落形成能力在F6治療之後顯著降低，尤其在大型集落(直徑200μm)的群體中。此結果明顯地展示調配的pre-miR-302s對惡性/轉移性肺癌細胞之增殖的治療效果。此外，圖20顯示多種不同人類肺癌細胞類型，包括EGFR、p53及K-Ras致癌基因之突變類型中之若干驅動基因之突變狀態。圖20之中欄中示出的圖片為源自未經任何治療之四種不同人類肺癌細胞株(類型)之原始癌細胞所形成之集落，而圖片中欄之右側上的圖顯示一次F6治療對此等肺癌類型之集落形成的抑制效應，其中所得藥物效能分類為四組：敏感組(平均集落大小減小>50%)、部分敏感組(減小25至50%)、部分耐藥組(減小<25%)及耐藥組(無效0%)。結合在一起，此等結果確認經設計之pro-miR-302治療可顯著抑制許多惡性/轉移性肺癌類型之生長及集落形成能力。特定言之，PC9/IR細胞之劇烈藥物敏感反應亦暗示酪胺酸激酶抑制劑(TKI)介導之耐藥路徑與miR-302介導之腫瘤抑制路徑之間可能的抵消關係(counteractive relationship)，導出用於克服高級惡性/轉移性肺癌之耐藥性問題的改良方法。
在使用活體內原位肺癌檢定之進一步動物試驗(圖22A-22C)中，發明人將肺癌細胞注射於各測試小鼠之左胸腔中以觀測肺間癌轉移。結果，發現於右葉中之癌結節應指示肺癌自左葉中之原發癌植入側轉移。圖22A展示不同實驗及對照組中之肺癌結節的數目，且圖22B顯示代表性照片。在圖22A中，黑色條說明左葉中發現之結節，且白色條顯 示右葉中發現之結節。作為圖22A及22B中示出的結果，兩個治療組(50及100μg/ml)中之結節數目在肺左葉及右葉中均顯著減少。對照組之結節數目為分別為左葉及右葉中之8.7±6.0及23.8±12.0。在治療之後，調配pre-miR-302(F6)藥物成功地將結節數目分別減少為50μg/mL組中之1.6±1.9及8.3±5.3及100μg/mL組中之22.5±1.4及4.75±3.9。此外，組織活檢體之組織學檢查(圖22C)顯示仍在全部三組中觀測到典型肺腺癌結構(圈出且藉由黑色箭頭指出)，但腫瘤數目及尺寸在兩個治療組之肺組織中均顯著減小。此等資料確認此調配pre-miR-302(F6)藥物對於在活體內，尤其在轉移性肺腺癌區域中抑制非小細胞肺癌(NSCLC)之生長及轉移而言之治療效能極強。
為了進一步評估F6藥物對轉移性肺腺癌之強治療效果，發明人降低活體內原位肺癌模型(對於兩個治療組，n=11，且對於對照組，n=5)中之F6溶液之治療頻率。如圖23A及23B中所示，在此重複動物試驗性實驗中，小鼠如下地用F6治療：在第3週及第4週期間每週經由尾端靜脈注射兩次且接著在第5週之後每週注射一次，直到犧牲。基於體重與總血容量之比計算F6之施用劑量，以在所有測試小鼠中保持相同F6治療濃度。每週觀測及量測螢光素酶信號(Luciferase signals)一次以追蹤轉移癌生長。最後，在治療後第42天犧牲小鼠。為了進一步評估pre-miR-302藥物之急性毒性效應，一個測試組之小鼠僅在第3週及第4週期間用F6治療四次，其接著標記為50(4)組(圖23B)。此外，發明人亦測試僅甘胺醯甘油之配方在此活體內小鼠模型中之毒性以排除藥物遞送調配方案之任何可能的毒性干擾。
治療頻率降低之第二動物試驗之治療結果(圖24A至24C)顯示與前述活體內原位肺癌實驗(圖22A至22C)中所觀測高度一致的抗 癌效應及結節抑制模式。對照組之結節數目(圖24A)分別為左葉及右葉中之9.4±2.2及34.8±7.7，而F6(pre-miR-302)治療成功地將結節數目減少為50(4)μg/mL組中之6.75±4.6及29.3±3.9，50μg/mL組中之5.9±2.7及16.3±4.4，及100μg/mL組中之4.3±2.9及10.5±4.4。圖24B進一步展示圖24A中之所有對照及經治療肺癌組織之代表性照片。有趣的是，自治療組分離之肺組織之照片不僅顯示左葉及右葉兩者中之結節數目的顯著減少，且亦顯示肺表面下的癒合疤痕組織，表明亦在肺癌之受損組織區域中藉由F6治療刺激增強型正常組織修復效應(圖24C)。此外，自F6治療組分離之活檢組織的進一步組織學檢查顯示腫瘤中的淋巴細胞浸潤(圈出且藉由黑色箭頭指出)，指示亦藉由F6治療刺激強免疫反應，尤其是在高劑量F6治療組(100μg/mL組；圖24C之最右欄)之組織中。
總之，所有此等發現明顯地總結出F6(調配pre-miR-302藥物)對高度惡性及轉移性肺癌，諸如NSCLC之生長之活體內治療效果。本發明之此等觀測治療效果包括但不限於抑制肺癌細胞生長、抑制癌結節形成、抑制癌轉移、預防耐藥性、增加免疫系統反應及增強癌症受損組織區域中之正常組織修復。本發明之pre-/pro-miR-302藥物之所有此等治療效果極適用於設計及開發用於多種醫藥及治療應用之新穎藥物及療法。
A.定義
為了便於理解本發明，下文定義多個術語：
核苷酸：由糖部分(戊醣)、磷酸酯及含氮雜環鹼基組成之DNA或RNA之單體單元。鹼基經由糖苷碳(戊醣之1'碳)連接至糖部分且鹼基及糖之該組合為核苷。含有至少一個結合至戊醣之3'或5'位置之磷酸酯基的核苷為核苷酸。DNA及RNA分別由稱作去氧核糖核苷酸及核糖核苷酸之不同類型的核苷酸單元組成。
寡核苷酸：由兩個或更多個、較佳大於三個、且通常大於十個DNA及/或RNA單體單元組成之分子。長於13個核苷酸單體之寡核苷酸亦稱作多核苷酸。精確大小將取決於許多因素，其轉而取決於寡核苷酸之最終功能或用途。寡核苷酸可以任何方式產生，包括化學合成、DNA複製、RNA轉錄、反轉錄或其組合。
核苷酸類似物：在結構上與腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)不同，但與核酸分子中之正常核苷酸之替代物充分類似之嘌呤或嘧啶核苷酸。
核酸組合物：核酸組合物係指單鏈或雙鏈分子結構中之寡核苷酸或多核苷酸，諸如DNA或RNA序列，或混合DNA/RNA序列。
基因：寡核苷酸或多核苷酸序列編碼RNA及/或多肽(蛋白質)之核酸組合物。基因可為RNA或DNA。基因可編碼非編碼RNA，諸如小髮夾RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、及其RNA前驅體以及衍生物。或者，基因可編碼蛋白質/肽合成必需的蛋白質編碼RNA，諸如信使RNA(mRNA)及其RNA前驅體以及衍生物。在一些情況下，基因可編碼亦含有至少微RNA或shRNA序列之蛋白質編碼RNA。
初級RNA轉錄物：在無任何RNA處理或修飾的情況下直接自基因轉錄之RNA序列，其可選自由以下組成之群組：mRNA、hnRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、pre-microRNA、病毒RNA及其RNA前驅體以及衍生物。
前驅體信使RNA(pre-mRNA)：蛋白質編碼基因之初級RNA轉錄物，其經由稱為轉錄之細胞內機制由真核生物中之真核第二型RNA聚合酶(Pol-II)機構生產。pre-mRNA序列含有5'-非轉譯區(UTR)、3'-UTR、 外顯子及內含子。
內含子：編碼非蛋白質閱讀框架之基因轉錄物序列之一或多個部分，諸如框內內含子、5'-UTR及3'-UTR。
外顯子：編碼蛋白質閱讀框架之基因轉錄物序列(cDNA)之一或多個部分，諸如用於細胞基因、生長因子、胰島素、抗體及其類似物/同系物以及衍生物之cDNA。
信使RNA(mRNA)：pre-mRNA外顯子之集合體，其在藉由細胞內RNA剪接機構(剪接體)移除內含子之後形成且充當肽/蛋白質合成之蛋白質編碼RNA。由mRNAs編碼之肽/蛋白質包括但不限於酵素、生長因子、胰島素、抗體及其類似物/同系物以及衍生物。
互補DNA(cDNA)：含有與mRNA序列互補之序列且不含任何內含子序列之單鏈或雙鏈DNA。
正義鏈：與同源mRNA呈相同序列順序及組成之核酸分子。正義構形藉由「+」、「s」或「正義」符號標明。
反義鏈：與對應mRNA分子互補之核酸分子。反義構形以「-」或「*」符號或以DNA或RNA前面的「a」或「反義」標定，例如「aDNA」或「aRNA」。
鹼基對(bp)：雙鏈DNA分子中腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)，或胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)之配對關係。在RNA中，尿嘧啶(U)取代胸腺嘧啶。一般而言，配對關係經由氫鍵結實現。舉例而言，正義核苷酸序列「5'-A-T-C-G-U-3'」可與其反義序列「5'-A-C-G-A-T-3'」形成完全鹼基配對。另外，G及U可形成非沃森及克里克配對(non-Watson-and-Crick pairing)，諸如「5'-T-G-C-3」與「5'-G-U-A-3'」之配對。
5'-端：在連續核苷酸之5'位處不具有核苷酸之末端，其中一 個核苷酸之5'-羥基藉由磷酸二酯鍵聯接合至下一核苷酸之3'-羥基。其他基團，諸如一或多個磷酸根可存在於末端上。
3'-端：在連續核苷酸之3'位處不具有核苷酸之末端，其中一個核苷酸之5'-羥基藉由磷酸二酯鍵聯接合至下一核苷酸之3'-羥基。其他基團，最通常羥基可存在於末端上。
模板：由核酸聚合酶複製之核酸分子。取決於聚合酶，模板可為單鏈、雙鏈或部分雙鏈的。合成複本與模板，或與雙鏈或部分雙鏈模板之至少一條鏈互補。RNA及DNA均沿5'至3'方向合成。核酸雙螺旋之兩條鏈始終對準以使得兩條鏈之5'端在雙螺旋之相對端(且必然地，3'端亦如此)。
核酸模板：雙鏈DNA分子、雙鏈RNA分子、雜交分子諸如DNA-RNA或RNA-DNA雜合體、或單鏈DNA或RNA分子。
保守：若核苷酸序列非隨機地雜交至預先選擇序列之精確互補段(exact complement)，則核苷酸序列相對於預先選擇(基準(referenced))序列保守。
同源或同源性：指示多核苷酸與基因或mRNA序列之間的相似性之術語。舉例而言，核酸序列可與特定基因或mRNA序列部分或完全同源。同源性可表示為藉由類似核苷酸之數目相比於核苷酸之總數目所測定之百分比。另外，胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)彼此同源。
互補的或互補性或互補：基於依據上述「鹼基對(bp)」規則建立關係的兩個聚核苷酸(亦即mRNA及cDNA之序列)之間的匹配鹼基配對所使用的術語。舉例而言，序列「5'-A-G-T-3'」與序列「5'-A-C-T-3」以及「5'-A-C-U-3'」互補。另外，G及U可在RNA雙螺旋或RNA-DNA配對序列中彼此互補。舉例而言，序列「5'-U-G-C-3'」與序列「5'-G-U-A-3'」、 以及「5'-G-U-G-3'」、以及「5'-G-C-G-3'」及「5'-G-C-A-3'」互補。互補可在兩條DNA鏈、DNA與RNA鏈之間或兩條RNA鏈之間。互補性可為「部分」或「完全」或「總體」。部分互補性或互補僅在根據鹼基配對規則只有核酸鹼基中的一些匹配時出現。完全或總體互補性或互補在鹼基在核酸鏈之間完全或完美匹配時出現。核酸鏈間之間的互補程度對核酸鏈之間的雜交之效率及強度具有顯著影響。在擴增反應中，以及在取決於核酸之間的結合之偵測方法中，此尤其重要。百分比互補性或互補係指核酸之一條鏈中失配鹼基相對總鹼基的數目。因此，50%互補意謂一半鹼基錯配且一半匹配。即使核酸之兩條鏈的鹼基數不同，兩條鏈的核酸亦可互補。在此情況下，互補出現於對應於較長鏈上之一些鹼基的較長鏈之一部分之間，其中該較長鏈上之該等鹼基與較短鏈上之鹼基配對。
互補鹼基：通常在DNA或RNA採用雙鏈組態，諸如DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA雙螺旋以及由部分DNA及部分RNA雜交序列之間的配對所形成之任何雙螺旋時配對的核苷酸。
互補核苷酸序列：與另一單鏈上之核苷酸序列充分互補以藉由由此產生的氫鍵結在兩條鏈之間特異性雜交的DNA或RNA之單鏈分子中之核苷酸序列。
雜交(Hybridize/Hybridization)：在充分互補以經由鹼基配對形成複合物的核苷酸序列之間形成雙螺旋。當引子(或剪接模板)與標靶(模板)「雜交」時，此類複合物(或雜合體)足夠穩定以提供DNA聚合酶起始DNA合成所需的引發功能(priming function)。在可競爭性抑制的兩個互補聚核苷酸之間存在特異性，亦即非隨機相互作用。
轉錄後基因沉默：在mRNA降解或轉譯抑制層級上之靶向基因敲除(knockout)或基因敲落(knockdown)效應，其通常藉由外來/ 病毒DNA或RNA轉殖基因(transgenes)或小抑制RNAs觸發。
RNA干擾(RNAi)：真核生物中之轉錄後基因沉默機制，其可藉由小抑制RNA分子，諸如微RNA(miRNA)、小髮夾RNA(shRNA)及小干擾RNA(siRNA)觸發。此等小RNA分子通常充當基因沉默子，干擾與小RNAs具有完全或部分互補性之細胞內基因之表現。
基因沉默效應：在基因功能經抑制之後的細胞反應，包含但不限於細胞週期衰減、G0/G1-檢查點阻滯、腫瘤抑制、抗致腫瘤性、癌細胞凋亡及其組合。
非編碼RNA(ncRNA)：無法用於經由細胞內轉譯機構合成肽或蛋白質之RNA轉錄物。非編碼RNA包括長及短調節RNA分子，諸如微RNA(miRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、小干擾RNA(siRNA)及雙鏈RNA(dsRNA)。此等調節RNA分子通常充當基因沉默子，干擾與非編碼RNAs具有完全或部分互補性之細胞內基因之表現。
微RNA(miRNA)：能夠結合至與微RNA之序列具有部分互補性之靶向基因轉錄物(mRNAs)之單鏈RNA。成熟微RNA通常設定大小為約17-27個寡核苷酸之長度，且能夠取決於微RNA與其標靶mRNA(s)之間的互補性而直接降解其細胞內mRNA標靶或抑制其靶向mRNA(s)之蛋白質轉譯。天然微RNAs發現於幾乎所有真核生物中，充當針對病毒感染之防禦且允許在植物及動物發育期間調節特定基因表現。原則上，一個微RNA通常靶向多個標靶mRNAs以履行其完整功能，而另一方面，多個miRNAs可靶向相同基因轉錄物以增強基因沉默效應。
微RNA前驅體(pre-miRNA)：髮夾型單鏈RNA，其含有莖-臂及莖-環區，用於與細胞內RNase III Dicer核糖核酸內切酶相互作用以產生一或多個成熟微RNAs(miRNAs)，該一或多個成熟微RNAs(miRNAs) 能夠沉默與成熟微RNA序列具有完全或部分互補性之靶向基因或特定靶向基因之族群。pre-miRNA之莖-臂可形成完全(100%)或部分(錯配)雜交雙螺旋，而莖-環連接莖-臂雙螺旋之一端，以形成組裝至具有一些阿爾古蛋白(AGO)之RNA誘導沉默複合物(RISC)中所需的圓或髮夾-環構形。
原核生物產生之微RNA前驅體(pro-miRNA)：與天然微RNA前驅體(pre-miRNA)類似，但自藉由原核勝任細胞中之真核啟動子驅動之人工重組微RNA表現質體所轉錄的髮夾型RNAs。舉例而言，pro-miR-302在結構上與pre-miR-302相同(圖13A及圖13B)，但自大腸桿菌DH5α勝任細胞中之pLVX-Grn-miR302+367或pLenti-EF1α-RGFP-miR302載體所轉錄(實例1)。由於原核細胞通常不表現短髮夾型RNAs，諸如真核pre-miRNAs，其中結構類似於原核生物中之轉錄終止代碼，原核生物中之pro-miRNAs產生通常需要添加一些限定的化學誘導劑以刺激真核啟動子驅動之髮夾型RNA轉錄(圖2-4)。
小干擾RNA(siRNA)：大小為約18-27個完全鹼基配對之核糖核苷酸雙螺旋且能夠降解具有幾乎完美的互補性之靶基因轉錄物的短雙鏈RNA。
小或短髮夾RNA(shRNA)：含有一對部分或完全匹配之莖-臂核苷酸序列之單鏈RNA，該對核苷酸序列由不匹配環寡核苷酸分開以形成髮夾型結構。許多天然miRNA以shRNA形式保留於細胞中，諸如前驅體微RNA(pre-miRNA)。
載體：能夠在不同基因環境中移動及滯留之重組核酸組合物，諸如重組DNA(rDNA)。一般而言，另一核酸可操作地連接於其中。載體可能能夠在細胞中自主複製，在此情況下，載體及附接段會複製。一種類型之較佳載體為游離基因體(episome)，亦即能夠進行染色體外複製之 核酸分子。較佳載體為能夠自主複製及表現核酸者。能夠引導編碼一或多種多肽及/或非編碼RNA之基因之表現的載體在本文中稱為「表現載體」或「表現勝任載體」。尤其重要的載體允許自使用逆轉錄酶產生之mRNA選殖cDNA。載體可含有由以下各者組成之組分：病毒或第二型RNA聚合酶(Pol-II或pol-2)啟動子或兩者、Kozak共同轉譯起始位點、聚腺苷酸化信號、複數個限制/選殖位點、pUC複製起點、用於表現複製勝任原核細胞中之至少一個抗生素抗性基因之SV40早期啟動子、視情況存在之用於在哺乳動物細胞中複製之SV40來源及/或四環素反應元件。載體之結構可為選自由質體、病毒載體、轉座子、反轉錄轉座子、DNA轉殖基因、跳躍基因及其組合組成之群的單鏈或雙鏈DNA之線性或環狀形式。
啟動子：聚合酶分子識別，或可能結合至，且引發RNA轉錄之核酸。出於本發明之目的，啟動子可為已知聚合酶或其輔因子結合位點、增強子及其類似物、可藉由所需聚合酶起始RNA轉錄物合成之任何序列。
真核啟動子：核酸基元序列，其為RNA及/或基因轉錄所需且可藉由真核第二型RNA聚合酶(Pol-2)、Pol-2等效物及/或Pol-2相容性(Pol-2類)病毒聚合酶識別用於引發RNA/基因轉錄。
第二型RNA聚合酶(Pol-II或Pol-2)啟動子：可藉由真核第二型RNA聚合酶(Pol-II或Pol-2)識別且因此能夠起始真核信使RNA(mRNA)及/或微RNA(miRNA)之轉錄的RNA啟動子。舉例而言，Pol-2啟動子可為哺乳動物RNA啟動子，如EF1α啟動子，或病毒/反轉錄病毒啟動子，如巨細胞病毒(CMV)啟動子，或其組合，但不限於此。
第二型RNA聚合酶(Pol-II或Pol-2)等效物：選自由哺乳動物第二型RNA聚合酶(Pol-II或pol-2)及Pol-II相容性(Pol-2類)病毒 RNA聚合酶組成之群的真核轉錄機構。
Pol-II相容性(Pol-2類)病毒啟動子：能夠使用真核Pol-2或Pol-2等效轉錄機構引發基因及/或RNA表現之病毒RNA啟動子。舉例而言，Pol-2類病毒啟動子可為巨細胞病毒(CMV)啟動子或反轉錄病毒長末端重複序列(LTR)啟動子，但不限於此。
順反子：編碼胺基酸殘基序列且包括上游及下游DNA表現控制元件之DNA分子中之核苷酸序列。
內含子切除：造成RNA加工、成熟及降解，包括RNA剪接；外來體消化；無意義介導衰變(NMD)加工；及其組合之細胞機制。
RNA處理加工：造成RNA成熟、修飾及降解，包括RNA剪接；內含子切除；外來體消化；無意義介導衰變(NMD)；RNA編輯；RNA加工；及其組合之細胞機制。
靶細胞：單個或複數個選自由以下組成之群的人類細胞：體細胞、組織、幹細胞、生殖系細胞、畸胎瘤細胞、腫瘤細胞、癌細胞及其組合。
癌組織：源自由以下組成之群的贅生性組織：皮膚癌、前列腺癌、乳癌、肝癌、肺癌、腦腫瘤/腦癌、淋巴瘤、白血病及其組合。
表現勝任載體：選自由質體、病毒載體、轉座子、反轉錄轉座子、DNA轉殖基因、跳躍基因及其組合組成之群的單鏈或雙鏈DNA之線性或環狀形式。
抗生素抗性基因：能夠降解選自由以下組成之群的抗生素之基因：青黴素G、鏈黴素、安比西林(ampicillin；Amp)、新黴素、G418、卡那黴素(kanamycin)、紅黴素、巴龍黴素(paromycin)、霍火黴素(phophomycin)、大觀黴素(spectromycin)、四環素(Tet)、多西環素(Dox)、 利福平(rifapicin)、兩性黴素B、健大黴素、氯黴素、先鋒黴素、泰樂菌素及其組合。
限制/選殖位點：用於限制酶裂解之DNA基元，包括(但不限於)AatII、AccI、AflII/III、AgeI、ApaI/LI、AseI、Asp718I、BamHI、BbeI、BclI/II、BglII、BsmI、Bsp120I、BspHI/LU11I/120I、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/U1/XI、ClaI、Csp6I、DpnI、DraI/II、EagI、Ecl136II、EcoRI/RII/47III/RV、EheI、FspI、HaeIII、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、NruI、NsiI、PmlI、Ppu10I、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、SspI、StuI、TaiI、TaqI、XbaI、XhoI、XmaI裂解位點。
基因遞送：選自由以下組成之群的基因工程改造方法：多聚核糖體轉染、脂質轉染、化學轉染、電穿孔、病毒感染、DNA重組、轉座子插入、跳躍基因插入、顯微注射、基因槍穿透及其組合。
基因工程改造：選自由以下組成之群的DNA重組方法：DNA限制及接合、同源重組、轉殖基因併入、轉座子插入、跳躍基因整合、反轉錄病毒感染及其組合。
細胞週期調節因子：參與控制細胞分裂及增殖速率之細胞基因，由(但不限於)CDK2、CDK4、CDK6、細胞週期蛋白、BMI-1、p14/p19Arf、p15Ink4b、p16Ink4a、p18Ink4c、p21Cip1/Waf1及p27Kip1及其組合組成。
腫瘤抑制效應：細胞抗腫瘤及/或抗癌機制及反應，由(但不限於)細胞週期衰減、細胞週期停滯、抑制腫瘤細胞生長、抑制細胞致腫瘤性、抑制腫瘤/癌細胞轉化、誘導腫瘤/癌細胞凋亡、誘導正常細胞恢復、將高級惡性癌細胞重新編程至更良性低級狀態(腫瘤消退)及其組合組成。
癌症治療效應：起因於藥物治療之細胞反應及/或細胞機制，包括(但不限於)抑制癌基因表現、抑制癌細胞增殖、抑制癌細胞侵襲及/或遷移、抑制癌轉移、誘導癌細胞死亡、預防腫瘤/癌症形成、預防癌症復發、抑制癌症進展、修復受損組織細胞、將高級惡性癌症重新編程至更良性低級狀態(癌症消退/緩解)及其組合。
基因沉默效應：在基因功能經抑制之後的細胞反應，由(但不限於)抑制癌基因表現、抑制細胞增殖、細胞週期停滯、腫瘤抑制、癌症消退、癌症預防、細胞凋亡、細胞修復及/或復原、細胞重新編程、將患病細胞重新編程至相對正常狀態(自發治癒)及其組合組成。
癌症逆轉：在活體外、離體或活體內將高級癌症之惡性特性重置回相對正常樣低級狀態之重新編程機制。
靶細胞：單個或複數個選自由以下組成之群的人類細胞：體細胞、組織、幹細胞、生殖系細胞、畸胎瘤細胞、腫瘤細胞、癌細胞及其組合。
癌組織：源自由以下組成之群的贅生性組織：皮膚癌、前列腺癌、乳癌、肝癌、肺癌、腦腫瘤/腦癌、淋巴瘤、白血病及其組合。
轉錄誘導劑：可誘導及/或增強自原核細胞中之pol-2或Pol-2類啟動子之真核RNA及/或基因轉錄的化學劑。舉例而言，轉錄誘導劑含有(但不限於)與MOPS、乙醇、甘油以及其功能類似物，諸如2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)及甘露醇，或其混合物類似之化學結構。
抗體：具有編碼能夠結合預先選擇配位體之受體之預先選擇保守域結構的肽或蛋白質分子。
醫藥及/或治療應用：適用於診斷、幹細胞產生、幹細胞研 究及/或療法開發、組織/器官修復及/或復原、創傷癒合治療、腫瘤抑制、癌症療法及/或預防、疾病治療、藥物生產及其組合之生物醫學利用、裝置及/或設備。
B.組合物及應用
一種使用髮夾型RNA治療人類肺癌之組合物及方法，其包含：(a)提供至少一個含有SEQ.ID.NO.3之髮夾型RNA；及(b)使(a)之髮夾型RNA與含有至少一個肺癌細胞之癌症個體接觸，以在肺癌細胞中釋放髮夾型RNA之腫瘤抑制功能且因此對癌症產生抗癌療法效應。髮夾型RNA之結構可呈pre-miRNA、shRNA及siRNA，或其組合之形式。較佳地，含有SEQ.ID.NO.3之髮夾型RNA係藉由原核生物中之真核啟動子介導之轉錄系統製得，其中此真核啟動子介導之轉錄系統之活化係藉由含有與3-(N-嗎啉基)丙烷-1-磺酸(MOPS)、乙醇或甘油，或其混合物類似之化學結構的一些化學誘導劑於原核細胞中誘導。較佳地，真核啟動子介導之轉錄系統為位於質體載體中之Pol-2及/或Pol-2類啟動子驅動之基因表現卡匣且原核生物為大腸桿菌(E.coli)細胞之勝任菌株，其已藉由含有真核啟動子介導之轉錄系統之質體載體轉化。較佳地，用於誘導該等髮夾型RNA之真核啟動子介導之轉錄的條件為細菌培養條件，諸如在添加化學誘導劑之情況下在37℃下之魯利亞-貝爾塔尼(LB)培養液。
僅出於說明目的且非限制地尤其參看圖式，說明：
圖1A及圖1B顯示真核啟動子驅動之表現載體組合物(1A)及其關於原核生物中之RNA轉錄物及/或蛋白質產生之表現機制(1B)。為展現本發明，新pLenti-EF1α-RGFP-miR302載體(圖1A)充當在MOPS、 甘油及/或乙醇刺激下轉化大腸桿菌DH5α勝任細胞以產生RGFP蛋白質以及miR-302及其前驅體(pre-miR-302)之實例組合物。pLenti-EF1α-RGFP-miR302為經本發明人設計以含有編碼經修飾紅色螢光蛋白(RGFP)基因之5'-UTR區中之miR-302家族簇序列(SEQ.ID.NO.5)之基因表現卡匣的慢病毒質體載體。pLenti-EF1α-RGFP-miR302之設計適用於表現原核生物及真核生物中之多種多樣的微RNA、shRNA及siRNA之前驅體。根據所揭示之機制(1B)，一般熟習此項技術者易於使用任何微RNA/shRNA/siRNA代替miR-302來誘導本發明所描述之真核啟動子介導之基因表現。黑色箭頭指示原核及真核細胞中存在之路徑，而空白箭頭指示僅存在於真核細胞中之步驟。
圖2描繪用(左側)或不用(右側)0.1%(v/v)MOPS及0.05%(v/v)甘油之混合物處理之細菌培養液之結果。大腸桿菌勝任細胞已在化學誘導劑處理之前經pLenti-EF1α-RGFP-miR302轉化。
圖3顯示在用0.1%(v/v)MOPS處理之後的不同細菌糰粒之結果。大腸桿菌勝任細胞已在MOPS處理之前經pLVX-Grn-miR302+367(綠色)或pLenti-EF1α-RGFP-miR302(紅色)轉化。
圖4顯示各種化學誘導劑在大腸桿菌勝任細胞中誘導Pol-2啟動子驅動之基因表現的可誘導性。在所有測試之化學品中，前三種最強力誘導劑為MOPS、甘油及乙醇。所用化學品濃度可介於約0.001%至4%、最佳0.01%至1%範圍內。
圖5顯示分別由MOPS、甘油及乙醇誘導之紅色RGFP蛋白質表現之西方墨點法結果。細菌RuvB蛋白質用作管家標準以標準化所偵測之RGFP表現。自空白大腸桿菌細胞提取(亦即未經載體轉化)之蛋白質用作陰性對照。
圖6顯示分別由MOPS、甘油及乙醇誘導之miR-302家族簇(約700nt)及其衍生前驅體(具有1至4個髮夾之pre-miR-302)之表現的北方墨點法結果。自空白大腸桿菌細胞提取之RNA用作陰性對照。
圖7顯示使用自細菌勝任細胞提取物(BE)分離的miR-302及/或pre-miR-302之iPSC生成，其藉由如圖6中所示之北方墨點分析證實。如所報導，miR-302重新編程iPSC(或稱為mirPSC)形成球樣細胞集落且表現強Oct4作為標準hESC標記物。
圖8顯示由自細菌勝任細胞提取物(BE)分離的miR-302及/或pre-miR-302誘導之Oct4及Sox2基因啟動子之全DNA脫甲基，其藉由如圖6中所示之北方墨點分析證實。如Simonsson及Gurdon(Nat Cell Biol.6,984-990,2004)所論證，全DNA脫甲基及Oct4表現兩種跡象皆為體細胞重新編程以形成iPSC所需。
圖9顯示人類肝癌細胞株HepG2響應於miR-302轉染之活體外致腫瘤性檢定。在miR-302轉染之後獲得的細胞標記為mirPS-HepG2，指示其癌細胞特性變至誘導多能幹細胞(iPSC)樣狀態。比較miR-302轉染前後的形態及細胞週期速率之變化。藉由對細胞形態之流式細胞量測術分析之峰圖表(n=3，p<0.01)展示對應於細胞週期階段之各細胞DNA含量。
圖10A及10B顯示使用合成標準uDNA(來自Sigma-Genosys)及自pLenti-EF1α-RGFP-miR302轉化之大腸桿菌細胞分離的新鮮提取之pro-miR-302之HPLC純化及分析的結果。標準uDNA經設計以等於呈以下形式之天然pre-miR-302a：5'-CCACCACUUA AACGUGGAUG UACUUGCUUU GAAACUAAAG AAGUAAGUGC UUCCAUGUUU UGGUGAUGG-3'(SEQ.ID.NO.4)。
圖11A及11B顯示使用自空白大腸桿菌勝任細胞或pLenti-EF1α-RGFP-miR302(RGFP-miR302)轉染細胞提取之小RNA的微RNA(miRNA)微陣列分析之結果。所提取之小RNA如圖10B之綠色標記區域中所示藉由HPLC進一步純化。圖11A顯示，來自空白大腸桿菌細胞之RNA幾乎不呈現微RNA(綠色點意謂在統計學上不顯著，而紅色點指示陽性結果)。此係因為原核生物不具有微RNA表現及加工所需之若干必需酶，諸如Pol-2、Drosha及RNase III Dicer。此外，原核RNA聚合酶不會高效地轉錄具有高二級結構之小RNA，諸如髮夾型pre-miRNA及shRNA。因此，僅使用本發明，發明人可刺激特定微RNA(諸如miR-302a、a*、b、b*、c、c*、d及d*，如圖11B中所示)於原核細胞中之表現。因為原核細胞不具有Dicer，所以所有微RNA保持呈其前驅體構形，諸如pri-miRNA(4髮夾之簇)及/或pre-miRNA(1髮夾之前驅體)。綜合而言，圖10B及11B之結果已確定兩個事實：(1)自RGFP-miR302轉染細胞提取之小RNA主要含有純miR-302前驅體，及(2)大腸桿菌勝任細胞中幾乎不存在其他種類之微RNA污染。
圖12顯示自空白大腸桿菌勝任細胞(第1組，如圖11A中所示)或pLenti-EF1α-RGFP-miR302轉染細胞(第2組，如圖11B中所示)提取之經表現微RNA之清單。小於500之信號在統計學上不顯著(如圖11A及11B中之綠色所示)，其可能由低複本數表現或高背景造成。
圖13A及圖13B顯示miR-302家族簇(家族)(13A，SEQ.ID.NO.13，其中pro-miR-302a、pro-miR-302b、pro-miR-302c及pro-miR-302d之序列加底線)及個別pro-miR-302a(SEQ.ID.NO.6)、pro-miR-302b(SEQ.ID.NO.7)、pro-miR-302c(SEQ.ID.NO.8)及pro-miR-302d(SEQ.ID。NO.9)序列(13B)之測序結果。在轉錄之後，miR-302家族簇 (=pri-miR-302)之序列為 (SEQ.ID.NO.5)，而pro-miR-302a、pro-miR-302b、pro-miR-302c及pro-miR-302d之個別序列分別如下：5'-CCACCACUUA AACGUGGAUG UACUUGCUUU GAAACUAAAG AAGUAAGUGC UUCCAUGUUU UGGUGAUGG-3'(SEQ.ID.NO.6)、5'-GCUCCCUUCA ACUUUAACAU GGAAGUGCUU UCUGUGACUU UAAAAGUAAG UGCUUCCAUG UUUUAGUAGG AGU-3' (SEQ.ID.NO.7)、5'-CCUUUGCUUU AACAUGGGGG UACCUGCUGU GUGAAACAAA AGUAAGUGCU UCCAUGUUUC AGUGGAGG-3'(SEQ.ID.NO.8)及5'-CCUCUACUUU AACAUGGAGG CACUUGCUGU GACAUGACAA AAAUAAGUGC UUCCAUGUUU GAGUGUGG-3'(SEQ.ID.NO.9)。
圖14顯示使用pro-miR-302作為注射藥物處理SCID-灰棕色裸小鼠中的人類肝癌異種移植物之預試驗新藥(pre-IND)試驗之活體內治療結果。在三次處理(每週一次)之後，pro-miR-302藥物(=pre-miR-302)成功地將癌症大小自728±328mm3(未經處理之空白對照，C)減小至75±15mm3(經pro-miR-302處理，T)，指示平均癌症大小減小約90%比率！合成siRNA模擬物(siRNA-302)處理中未發現顯著治療效果。進一步組織學檢查(最右圖)發現，正常肝小葉樣結構(由黑色箭頭指出之圓圈)僅於經pro-miR-302處理之癌症中形成但不於其他處理或對照中形成，表明重新編程機制可發生以將惡性癌細胞特性重置回相對正常樣狀態(稱為「癌症逆轉」)。
圖15顯示活體內正常肝組織與經pro-miR-302處理之人類肝癌異種移植物之間的組織學類似性。在三次處理(每週一次)之後，pro-miR-302藥物成功地將高級(IV級)人類肝癌移植物重新編程至更良性低級(低於II級)狀態。類似於正常肝組織(頂圖)，經處理之癌症移植物可形成含有中央靜脈(CV)樣及門脈三聯管(PT)樣結構(由黑色箭頭指示)之經典肝小葉。因為癌細胞通常比正常肝細胞酸性更大，所以蘇木精與曙紅(H&E)染色之結果展示癌細胞中更多紫色而正常肝細胞中更多紅色。
圖16顯示SCID-灰棕色裸小鼠中未經處理、經siRNA處理、 經pro-miR-302處理之人類肝癌移植物及正常肝組織之間的病理組織學比較。在未經處理之情況下(頂圖)，移植之人類肝癌侵襲性侵入至正常組織(諸如肌肉及血管)中且形成大規模細胞-細胞及癌症-組織融合結構，指示其惡性及高轉移。siRNA模擬物(siRNA-302)處理不顯著降低移植之癌症之惡性(中上圖)，可能歸因於siRNA之短半衰期。相比之下，pro-miR-302處理不僅將移植之癌症重新編程至相對正常樣形態(無融合)，且亦極大地抑制癌症侵入至周圍組織中(中下圖)。與正常肝組織(底圖)相比，經pro-miR-302處理之癌症形成正常樣小葉結構、腺樣細胞配置以及細胞-細胞及癌症-組織接合處之間的清楚邊界(黑色箭頭)，表明此等經處理之癌症已降級至極良性狀態。
圖17A及17B顯示活體內未經處理(17A)及經miR-302處理(17B)之傷口之間的癒合結果之比較。將分離之miR-302分子(20-400μg/mL)與二-/三-胺醯化甘油(di-/tri-glycylglycerin)、遞送試劑及抗生素軟膏一起調配以形成候選藥物，用於測試豬背皮膚上2cm×2cm大開放傷口之活體內處理(各組之n=6)。在十(10)次處理之後，將癒合之傷口剝離且進一步製成組織切片用於在顯微鏡下進行組織學檢查。資料顯示，經miR-302處理之傷口中無可見疤痕或可見極小疤痕(無疤痕)(17B頂圖，n=6/6)，而幾乎所有未經處理(僅經抗生素軟膏處理)之傷口含有大疤痕(17A)。此外，顯著大量CD34陽性成體幹細胞擴增簇(經綠色螢光抗體標記)見於經miR-302處理之傷口中(17B底圖，n=6/6)，但未見於未經處理之對照傷口中(17A底圖，n=0/6)。此等結果表明，pre-miR-302能夠誘導CD34陽性成體幹細胞增殖及/或再生，以便增強組織修復及再生，對由人類退行性疾病(諸如阿茲海默氏症、帕金森氏症、骨質疏鬆症、糖尿病及癌症)造成之病變產生極有益的治療效果。此類治療效果亦可幫助將高級 惡性癌症重新編程為低級良性或甚至正常樣組織，一種稱為「癌症逆轉」或「癌症消退」之新穎機制。
圖18分別顯示使用pro-miR-302作為抗癌藥以治療正常肺上皮細胞株BEAS2B(左上圖)、自肺癌患者CL1-0分離之癌性肺腺癌組織細胞(中上圖)及自另一癌症患者A549分離之肺腺癌組織細胞(右上圖)之劑量依賴性癌症療法的結果，以及此等肺癌回應於50(左下圖)及100(右下圖)微克(μg)/mL之兩種不同濃度之pro-miR-302治療之劑量依賴性治療結果。
圖19A及19B顯示使用軟瓊脂集落形成檢定，調配pre-miR-302(F6)藥物針對活體外惡性肺癌細胞生長之治療效能。圖19A展示F6對人類惡性肺癌A 549細胞株之集落數及大小之抑制效應的條形圖結果。圖19B顯示不同F6處理之前及之後平均癌症集落大小之照片，從左往右分別為：對照(用PBS處理之原始癌症)、F5(僅用基於甘胺醯甘油之調配物溶液處理)、F6-25(用25μg/mL F6處理)及F6-50(用50μg/mL F6處理)。
圖20顯示多種不同人類肺癌細胞株及類型，包括EGFR、p53及K-Ras致癌基因之突變類型中之若干驅動基因之突變狀態(如不同癌細胞集落之圖片中欄之左圖上所示)。圖20之中欄顯示藉由源自未經任何治療之四種不同人類肺癌細胞株(類型)之原始癌細胞形成之集落，而圖片中欄之右圖顯示一次F6治療(50μg/mL)對此等不同肺癌類型之集落形成的抑制效應，其中所得藥物效能分類為四組：敏感組(平均集落大小減小>50%)、部分敏感組(減小25至50%)、部分耐藥組(減小<25%)及耐藥組(無效0%)。
圖21A及21B顯示使用稱作F6之調配pro-miR-302 (=pre-miR-302)藥物治療小鼠之高度惡性及轉移性人類肺癌植入物的第一動物試驗性實驗之治療頻率(21A)及影像攝取頻率(21B)之時間表流程圖。
圖22A、22B及22C顯示使用稱作F6之調配pro-miR-302(=pre-miR-302)藥物治療小鼠之高度惡性及轉移性人類肺癌植入物的第一動物試驗性實驗之治療結果。分別地，圖22A展示小鼠之不同治療及對照組中發現之肺癌結節之數目，且圖22B顯示治療組及對照組中發現之所有肺癌組織之代表性照片。圖22C顯示典型肺腺癌結構(圈出且藉由黑色箭頭指出)之組織學檢查結果。
圖23A及23B顯示使用調配pre-miR-302(F6)藥物治療小鼠之高度惡性及轉移性人類NSCLC植入物之第二動物試驗性實驗的治療頻率(23A)及影像攝取頻率(23B)之時間表流程圖。
圖24A、24B及24C顯示使用調配pre-miR-302(F6)藥物治療小鼠之高度惡性及轉移性人類NSCLC的藥物治療頻率相比於第一動物試驗降低之第二動物試驗實驗之治療結果。分別地，圖24A展示小鼠之不同治療組及對照組中發現之肺癌結節之數目，且圖24B顯示治療組及對照組中發現之所有肺癌組織之代表性照片。圖24C顯示淋巴細胞浸潤，在F6治療之後的植入腫瘤/癌症(圈出且藉由黑色箭頭指出)中發生的典型抗癌免疫反應。
在以下實驗公開內容中，以下縮寫適用：M(莫耳)；mM(毫莫耳)；μm(微莫耳)；mol(莫耳)；pmol(皮莫耳)；gm(公克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(奈克)；L(公升)；ml(毫升)；μl(微升)；℃ (攝氏度)；RNA(核糖核酸)；DNA(去氧核糖核酸)；dNTP(三磷酸去氧核糖核苷酸)；PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)；NaCl(氯化鈉)；HEPES(N-2-羥基乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)；HBS(HEPES緩衝生理鹽水)；SDS(十二烷基硫酸鈉)Tris-HCl(參-羥基甲胺基甲烷-鹽酸鹽)；ATCC(美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville,MD)；hESC(人類胚胎幹細胞)；及iPSC(誘導多能幹細胞)。
實例
1.細菌細胞培養及化學處理
大腸桿菌DH5α勝任細胞以一部分的形式獲自z-勝任大腸桿菌轉化套組(Zymo Research,Irvine,CA)且接著藉由與5μg預製質體載體，諸如pLenti-EF1α-RGFP-miR302或pLVX-Grn-miR302+367混合而轉化。未經轉化的細胞通常在37℃下在以170rpm頻繁攪拌之情況下於補充有10mM MgSO4及0.2mM葡萄糖之魯利亞-貝爾塔尼(LB)培養液中生長，而經轉化的細胞在另外補充有額外100μg/ml安比西林之上述LB培養液中培養。為進行化學誘導，將0.5至2ml之MOPS、甘油及/或乙醇分別或以組合形式添加至存在100μg/ml安比西林的補充有10mM MgSO4及0.2mM葡萄糖之1公升LB培養液中。對於陰性對照，經轉化的細胞在上述補充有安比西林之LB培養液中培養，但不添加任何化學誘導劑。結果顯示於圖2-4中。
2.人類細胞培養及微RNA轉染
人類肝癌細胞株HepG2係獲自ATCC且根據製造商的建議進行維持。為進行轉染，將15μg pre-miR-302溶解於1ml新鮮RPMI培養基中且與50μl X-tremeGENE HP DNA轉染劑(Roche,Indianapolis,IN)混合。在10分鐘培育之後，將混合物添加至含有50%至60%融合度之HepG2 的100mm細胞培養皿中。在12至18小時後更新培養基。在此等轉染細胞形成球樣iPSC集落之後，將培養基變為補充有20%基因敲除血清、1% MEM非必需胺基酸、100μM ß-巰基乙醇、1mM GlutaMax、1mM丙酮酸鈉、10ng/ml bFGF、10ng/ml FGF-4、5ng/ml LIF、100IU/ml青黴素/100μg/ml鏈黴素、0.1μM A83-01及0.1μM丙戊酸(Stemgent,San Diego,CA)之基因敲除DMEM/F-12培養基(Invitrogen)，且在37℃下在5% CO2以下培養細胞。結果顯示於圖9中。
3.蛋白質提取及西方墨點分析
遵循製造商的建議，細胞(106)經補充有蛋白酶抑制劑抗纖維蛋白溶酶肽(Leupeptin)、TLCK、TAME及PMSF之CelLytic-M溶解/提取試劑(Sigma)溶解。溶解物在4℃下在12,000rpm下離心20分鐘且回收上清液。使用E-max微盤讀取器(Molecular Devices,CA)上之經改良SOFTmax蛋白質檢定套裝來量測蛋白質濃度。將各30μg細胞溶解物在還原(+50mM DTT)及非還原(無DTT)條件下添加至SDS-PAGE樣品緩衝液，且煮沸3分鐘，隨後負載至6至8%聚丙烯醯胺凝膠上。藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)分解蛋白質，電轉染至硝化纖維素膜上且在室溫下在Odyssey阻斷試劑(Li-Cor Biosciences,Lincoln,NB)中培育2小時。接著，將一級抗體施加至試劑且在4℃下培育混合物。一級抗體包括Oct3/4(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)、RuvB(Santa Cruz)及RGFP(Clontech)。在隔夜之後，膜用TBS-T沖洗三次且接著在室溫下將山羊抗小鼠IgG結合二級抗體暴露於Alexa Fluor 680反應性染料(1：2,000；Invitrogen-Molecular Probes)1小時。在三次額外TBS-沖洗之後，使用Li-Cor Odyssey Infrared Imager及Odyssey軟體v.10(Li-Cor)進行免疫印跡之螢光掃描及影像分析。結果係顯示於圖5中。
4.RNA提取及北方墨點分析
總RNA(10μg)經mirVanaTM miRNA分離套組(Ambion,Austin,TX)分離，藉由15% TBE-脲聚丙烯醯胺凝膠或3.5%低熔點瓊脂糖凝膠電泳分級，且電轉染至耐綸膜上。藉由[LNA]-DNA探針(5'-[TCACTGAAAC]ATGGAAGCAC TTA-3')(SEQ.ID.NO.10)探針進行miR-302及相關pre-miR-302之偵測。探針已藉由高效液相層析(HPLC)純化且在[32P]-dATP(>3000Ci/mM，Amersham International,Arlington Heights,IL)存在下經末端轉移酶(20單位)進行尾端標記20分鐘。結果顯示於圖6中。
5.質體擴增及質體DNA/總RNA提取
轉化之後的大腸桿菌DH5α勝任細胞(來自實例1)在37℃下在以170rpm頻繁攪拌之情況下於補充有10mM MgSO4及0.2mM葡萄糖之LB培養液中培養。為誘導真核啟動子驅動之RNA轉錄，將0.5至2ml MOPS、甘油及/或乙醇添加至每1公升LB培養液中以傳播經轉化的細胞隔夜。使用HiSpeed質體純化套組(Qiagen,Valencia,CA)，遵循製造商的方案，但伴以不向P1緩衝液中添加RNA酶A之小改動而分離經轉化的細胞中之擴增之質體DNA及表現之mRNA/微RNA。此後，將含有質體及mRNA/微RNA之最終提取產物溶解於DEPC處理之ddH2O中且在使用前儲存於-80℃下。為了僅純化擴增之質體載體，將RNA酶A添加至P1緩衝液中且遵循製造商的方案進行提取程序。
6.微RNA及pre-miRNA分離/純化
為了純化微RNA及pre-miRNA，使用mirVanaTMmiRNA分離套組(Ambion,Austin,TX)，遵循製造商的方案進一步提取自實例5分離之總RNA。將由此獲得之最終產物溶解於DEPC處理之ddH2O中且在使用 前儲存於-80℃下。由於細菌RNA極快速(在幾小時內)地天然降解，而真核髮夾型微RNA前驅體(pre-miRNA及pri-miRNA)在4℃下在很大程度上保持穩定(半衰期至多3-4天)，發明人可使用此半衰期差異來獲取相對純的pri-/pre-miRNA用於其他應用。舉例而言，由此獲得之pre-miR-302可用於將體細胞重新編程為hESC類iPSC，如圖9中所示。
7.免疫染色檢定
如先前報導地對組織樣品進行包埋、切片及免疫染色(Lin等人，2008)。一級抗體包括Oct4(Santa Cruz)及RGFP(Clontech,Palo Alto,CA)。螢光染料標記之山羊抗兔或馬抗小鼠抗體用作二級抗體(Invitrogen-Molecular Probes,Carlsbad,CA)。在具有Metamorph imaging程序(Nikon)之螢光80i微觀定量系統下以100×或200×放大率檢查及分析陽性結果。結果顯示於圖7中。
8.亞硫酸氫鹽DNA定序
使用DNA分離套組(Roche)自約2,000,000個細胞分離基因組DNA且遵循銷售商的建議，另外用亞硫酸氫鹽(CpGenome DNA修飾套組，Chemicon,Temecula,CA)處理1μg經分離DNA。亞硫酸氫鹽處理將所有未甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶仍保持為胞嘧啶。對於亞硫酸氫鹽DNA定序，發明人藉由以下PCR引子擴增Oct4基因之啟動子區：5'-GAGGCTGGAG CAGAAGGATT GCTTTGG-3'(SEQ.ID.NO.11)及5'-CCCTCCTGAC CCATCACCTC CACCACC-3'(SEQ.ID.NO.12)。對於PCR，亞硫酸氫鹽修飾之DNA(50ng)與引子(總共100pmol)在1×PCR緩衝液中混合，加熱至94℃後維持2分鐘，且緊接著在冰上冷卻。隨後，如下進行25個PCR循環：94℃維持1分鐘及70℃維持3分鐘，使用Expand High Fidelity PCR套組(Roche)。具有適當尺寸之PCR產物藉由3%瓊脂糖 凝膠電泳進一步分級，藉由凝膠提取過濾器(Qiagen)純化，且接著用於DNA定序。此後，藉由比較經轉化之DNA序列與未經轉化之DNA序列中之不變胞嘧啶產生DNA甲基化位點之詳細概況，如圖8中所示。
9.DNA-密度流動式細胞測量術
使細胞胰蛋白酶化，球粒化且藉由在-20℃下再懸浮於1ml含預冷70%甲醇之PBS中1小時而固定。細胞經球粒化且用1ml PBS洗滌一次且接著再次球粒化且在37℃下再懸浮於1ml含1mg/ml碘化丙錠、0.5μg/ml RNA酶之PBS中30分鐘。此後，在BD FACSCalibur(San Jose,CA)上分析約15,000個細胞。藉由繪製相對於脈衝面積之脈衝寬度且在單細胞上閘控而排除細胞二重峰。使用套裝軟體Flowjo，使用「沃森實用(Watson Pragmatic)」算法分析收集之資料。結果顯示於圖9之頂圖中。
10.微RNA(miRNA)微陣列分析
在約70%融合度下，使用mirVanaTM miRNA分離套組(Ambion)分離來自各細胞培養物之小RNA。使用1%甲醛-瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計量測(Bio-Rad)評估經分離之小RNA之純度及數量，且緊接著在乾冰中冷凍且提交至LC Sciences(San Diego,CA)用於miRNA微陣列分析。各微陣列晶片經雜交，經Cy3或Cy5標記之單一樣品或分別經Cy3及Cy5標記之一對樣品。根據製造商的建議進行背景減除及標準化。對於雙樣品檢定，進行p值計算且產生大於3倍之差異表現轉錄物之清單(黃色-紅色信號)。最終微陣列結果顯示於圖11A及11B中，且差異表現微RNA之清單顯示於圖12中，其比較自空白大腸桿菌細胞溶解物(第1組)提取之小RNA與自pLenti-EF1α-RGFP-miR302轉化之細胞溶解物(第2組)提取之彼等小RNA。
11.活體內肝癌療法試驗
將人類肝癌異種移植至免疫功能不全SCID-灰棕色小鼠中為研究肝癌轉移及療法之有效動物模型。為建立此模型，發明人混合5百萬個人類肝癌(HepG2)細胞與100μL基質凝膠且將混合物分別皮下移植至小鼠後胺之各側腹中。因此，小鼠後胺兩側經受大致相同量之癌細胞移植。在移植後約兩週觀測癌症且平均尺寸為約15.6±8mm3(治療之前的起始癌症尺寸)。對於各小鼠，發明人選擇具有較大癌症的一側作為治療組且較小的另一側作為對照組。由於相同小鼠在一側用空白調配物試劑(陰性對照)且在另一側用調配藥物(pro-miR-302)治療，由此獲得之結果可使由個體差異所致之任何可能的變化最小化。
為了將pro-miR-302活體內遞送至目標癌症區域中，發明人與專業調配物公司Latitude(San Diego,CA)訂約將pro-miR-302脂質體囊封至160至200nm直徑奈米粒子中。經測試，此等含pro-miR-302之奈米粒子在室溫下持續超過兩週，且在4℃下持續超過一個月保持幾乎100%穩定，而其他合成siRNA模擬物(siRNA-302)全部在相同條件下在3至5天內快速降解超過50%，指示pro-miRNA而非siRNA足夠穩定地用作療法藥物。對於毒性檢定，發明人分別另外最大限度地注射300μL調配pro-miR-302(1mg/mL)至小鼠尾端靜脈(n=8)中，且在六個月內在所有測試小鼠中未觀測到可偵測副作用。一般而言，未經修飾之核糖核酸相對無免疫原性且可容易地經組織細胞代謝，使得成為活體內療法之安全工具。
為測試藥物效能，發明人分別在小鼠之一側皮下注射200μL調配pro-miR-302且在另一側皮下注射200μL空白調配物試劑，且繼續相同注射模式三次(每週注射一次)。將藥物及試劑施加至癌症部位之周圍區域且由癌症及其周圍組織在18小時內吸收。在第三次注射之後的一週收集樣品。移除心臟、肝、腎及移植腫瘤用於進一步組織學檢查。藉由觸診 監測腫瘤形成且使用式(長度×寬度2)/2計算腫瘤體積。對腫瘤病變進行計數、解剖、稱重且使用H&E及免疫染色檢定進行組織學檢查。組織學檢查顯示心臟、肝及腎中無可偵測組織病變。結果顯示於圖14、15及16中。
12.活體內創傷癒合試驗
在此狀況下，甘胺醯甘油囊封之pre-miR-302藉由基於乳膏之抗生素軟膏調配以用於活體內治療。由於miR-302為人類ESC及iPSC中之最豐富ESC特異性miRNA物種，發明人提出miR-302之體細胞重新編程功能可能亦能夠誘導及/或維持成體幹細胞再生，以促進活體內組織修復及再生過程。為了測試此理論，由解剖刀解剖產生豬皮創傷且尺寸為大致二平方公分(2cm2)。將具有或不具有pre-miR-302(5mg/mL)之預製備軟膏(0.5mL)分別均勻塗覆於傷口上，且覆蓋整個受傷區域，且接著另外藉由液體繃帶密封。在第0、1、2、3、4、5、7、9、11、14及17天施加治療。在第0、1、2、3、4、5、7、9、11、14、17及20天藉由Sony DSC-H9相機拍攝各傷口之照片。使用Image Pro Plus 7.0成像軟體測定各時間點處之各傷口之面積。根據下式計算各治療時間點處之傷口癒合或閉合之百分比：(第0天傷口面積-第N天傷口面積)/第0天傷口面積×100。最終，自各傷口收集組織樣品且浸泡於10%(v/v)福馬林溶液中，隨後用於製備H&E染色組織學切片。此動物試驗之結果展示相比於其他miR-434治療及空白對照，miR-302治療顯著增強傷口愈合速度，快兩倍以上。此外，在治療之後十七(17)天，miR-302治療之傷口區域留下較少或幾乎無疤痕(n=6/6)，而其他治療及對照導致相對較大疤痕。為了進一步量測皮膚中之miRNA穿透率，發明人已自新癒合組織之活檢體分離總RNA且接著藉由一組miR-302a特異性引子運作定量反轉錄-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢定以確認甘胺醯甘油囊封之pre-miR-302成功地在治療組織中活體內遞送且加工 為成熟miR-302。
13.活體外肺癌針對藥物之敏感性測試
甘胺醯甘油囊封之pre-miR-302/pro-miRNA藥物(或稱作配方#6；F6)對不同肺癌細胞類型之生長的劑量依賴性腫瘤抑制效應係使用在0至200μg/mL範圍內，較佳在25至100μg/mL之間的各種pre-miR-302濃度測試(圖18)。為了進一步測試F6藥物針對惡性肺癌細胞生長之效能，進行軟瓊脂集落形成檢定，如圖19A及19B中所示。發現典型人類惡性肺癌細胞株A549之生長及集落形成能力均在一次F6治療(25或50μg/mL)之後經顯著抑制，尤其在大型集落(直徑200μm)的群體中。另外，圖20進一步展示若干驅動致癌基因於多種不同人類肺癌細胞類型中之突變狀態，包括突變EGFR、p53及K-Ras致癌基因之狀態。圖20之中欄顯示由未經任何治療之四種不同人類惡性/轉移性肺癌細胞株(類型)之原始癌細胞形成之癌症集落之圖片，而中欄右側之圖顯示一次F6治療(50μg/mL)對此等肺癌類型之集落形成之抑制效應，其中此等癌細胞類型中之所得藥物效能分類為四組：敏感組(平均集落大小減小>50%)、部分敏感組(減小25至50%)、部分耐藥組(減小<25%)及耐藥組(0%)。
14.活體內肺癌療法試驗
在理解發明人之調配pre-miR-302藥物(F6)對不同人類肺癌細胞類型之效能之後，發明人另外使用原位肺癌小鼠模型分析其活體內治療效能。圖21A及21B顯示用於活體內生物成像系統(IVIS)之F6治療頻率及影像攝取頻率之時間表流程圖。對於原位腫瘤植入檢定，將A549-Luci肺癌細胞(20μl含有10ng基質膠之PBS中之1×105個細胞)注射至6週齡NOD SCID小鼠(治療組中n=9且對照組中n=3)之胸腔中。藉由螢光素酶影像觀測之生物成像研究指示此等植入小鼠在植入之後四 (4)週產生許多肺癌轉移結節。此後，小鼠經由尾端靜脈注射每週用F6治療兩次，直至殺死(圖21A)。在植入後第14天，將小鼠分成三組：標準生理鹽水(NS)，及50或100μg/mL F6治療組，如IVIS之成像結果(圖21B)中所示。基於體重與總血容量之比計算所用F6溶液之體積以在相同測試小鼠組中保持相同F6治療濃度。每週觀測及量測螢光素酶信號一次。最後，在第一次F6治療之後42天殺死小鼠。收集諸如肺、肝、脾及腎之主要器官且藉由10%福馬林固定，且接著使用肉眼及微觀鏡檢查來計數所得肺結節。用於實驗之小鼠的數目係基於在P<0.05處，具有98%偵測到結節數目之2倍組間差異之能力的目標。
在使用活體內原位肺癌檢定之動物試驗(圖22A-22C)中，發明人將肺癌細胞注射於各測試小鼠之左胸腔中以觀測肺間癌轉移。結果，發現於右葉中之癌結節指示肺癌自左葉中之原發癌植入側轉移。圖22A展示不同實驗及對照組中之肺癌結節的數目，且圖22B顯示代表性照片。在圖22A中，黑色條說明左葉中發現之結節，且白色條顯示右葉中發現之結節。作為圖22A及22B中示出的結果，兩個治療組(50及100μg/ml)中之結節數目在肺左葉及右葉中均顯著減少。亦進行進一步的組織學檢查(圖22C)以觀測所有組中之典型肺腺癌結構(圈出且藉由黑色箭頭指出)。
為了進一步評估F6藥物對轉移性肺腺癌之強治療效果，發明人降低活體內原位肺癌模型(對於兩個治療組，n=11，且對於對照組，n=5)中之F6溶液之治療頻率。如圖23A及23B中所示，在此重複動物試驗中，小鼠如下地用F6治療：在第3週及第4週期間每週經由尾端靜脈注射兩次且接著在第5週之後每週注射一次，直到殺死。基於體重與總血容量之比計算F6之施用劑量以在所有測試小鼠中保持相同F6治療濃度。每週觀測及量測螢光素酶信號一次。最後，在治療後第42天殺死小鼠。為了 評估pre-miR-302藥物之急性毒性效應，一個測試組之小鼠僅在第3週及第4週期間用F6治療四次，將其標記為50(4)組(圖23B)。此外，發明人亦測試僅甘胺醯甘油配方於此活體內小鼠模型中之毒性以排除遞送調配物藥劑(F5)之任何可能的毒性干擾，該遞送調配物藥劑實際上對癌細胞既不呈現毒性亦不呈現任何顯著效應。
15.統計分析
免疫染色、西方墨點法及北方墨點法分析中任何超過75%之信號強度變化視為陽性結果，其轉而經分析且呈現為平均值±SE。藉由單向方差分析(one-way ANOVA)進行資料之統計分析。當主效應顯著時，鄧尼特事後測試(Dunnett's post-hoc test)用於識別與對照顯著不同之組。為在兩個治療組之間進行成對比較，使用雙尾學生t測試(two-tailed student t test)。對於涉及超過兩個治療組之實驗，進行方差分析，接著進行事後多範圍測試。p<0.05之概率值視為顯著。所有p值測定自雙尾測試。
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<160> 13
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<210> 1
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<212> RNA
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Claims (20)

  1. 一種組合物在製造用於肺癌的治療之藥物上之用途，其中該組合物包含：(a)含有SEQ.ID.NO.3之至少一個髮夾型微RNA前驅體(pre-miRNA)，及(b)囊封(a)之該pre-miRNA之甘胺醯甘油(glycylglycerin/glycylglycerol)。
  2. 如請求項1所述之用途，其中用於治療罹患肺癌之個體之該組合物的有效量介於每毫升(mL)該個體之血液之10至200微克範圍內。
  3. 如請求項1所述之用途，其中含有SEQ.ID.NO.3之該pre-miRNA為SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.7、SEQ.ID.NO.8或SEQ.ID.NO.9、或其組合。
  4. 如請求項1所述之用途，其中含有SEQ.ID.NO.3之該pre-miRNA為miR-302a、miR-302b、miR-302c或miR-302d之前驅體、或其組合。
  5. 如請求項1所述之用途，其中含有SEQ.ID.NO.3之該pre-miRNA能夠在人類肺癌細胞中被處理為miR-302a、miR-302b、miR-302c或miR-302d、或其組合。
  6. 如請求項1所述之用途，其中該pre-miRNA由原核細胞中之真核啟動子驅動之RNA轉錄產生。
  7. 如請求項6所述之用途，其中誘導該真核啟動子驅動之RNA轉錄所需的DNA序列為位於質體載體中之基因表現卡匣。
  8. 如請求項7所述之用途，其中該基因表現卡匣編碼SEQ.ID.NO.5之序列。
  9. 如請求項7所述之用途，其中該質體載體為含有巨細胞病毒CMV啟動子或哺乳動物EF1α啟動子或兩者之pLenti-EF1α-RGFP-miR302載體。
  10. 如請求項6所述之用途，其中該真核啟動子驅動之RNA轉錄係藉由使 含有3-(N-嗎啉基)丙烷-1-磺酸(MOPS)之化學劑與攜有至少一個基因表現卡匣之至少一個轉化原核細胞接觸而誘導，該至少一個基因表現卡匣編碼SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.7、SEQ.ID.NO.8或SEQ.ID.NO.9之序列、或其組合。
  11. 如請求項1所述之用途，其中該肺癌為肺腺癌。
  12. 如請求項1所述之用途，其中該肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)。
  13. 如請求項1所述之用途，其中該組合物適用於活體內治療該肺癌。
  14. 如請求項13所述之用途，其中該組合物之該治療抑制癌細胞生長。
  15. 如請求項13所述之用途，其中該組合物之該治療抑制肺癌細胞之集落及結節形成。
  16. 如請求項13所述之用途，其中該組合物之該治療抑制癌轉移。
  17. 如請求項13所述之用途，其中該組合物之該治療預防癌細胞之耐藥性。
  18. 如請求項13所述之用途，其中該組合物之該治療刺激針對癌細胞生長之免疫系統反應。
  19. 如請求項13所述之用途，其中該組合物之該治療增強癌症受損組織區域中之正常組織修復。
  20. 如請求項1所述之用途，其中該肺癌之該治療包括抑制肺癌細胞生長、抑制癌結節形成、抑制癌轉移、預防耐藥性、增加免疫系統反應及增強癌症受損組織區域中之正常組織修復。
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