TW201840855A - 用於無模板酶促核酸合成的組成物及方法 - Google Patents
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Abstract
本揭露提供用於無模板核酸合成的組成物與方法。例示的方法包括去保護包括至少三個核苷酸的引子，其中該引子包括3’可逆的終止核苷酸(rtNTP)；藉由具有終端轉移酶活性的酶或核糖酶，併入至少一游離的rtNTP；並且重複這些步驟，直到產生所欲之合成核酸。可使用在溶液中的引子，及連接至基材之引子(例如，包含陣列)以進行本揭露的方法。
Description
本揭露提供使用可逆的終止核苷酸之用於無模板酶促核酸合成之組成物與方法。
在過去的十年中，用於一系列分子生物應用的合成DNA分子之需求增加。DNA定序技術的進步部分地推動了此增長。然而，雖然DNA定序技術已有顯著發展，但DNA合成技術並沒有以同樣的速度進展，因而本領域技術狀態無法滿足當前的市場需求。本揭露提供用於無模板酶促DNA合成的組成物與方法，其為本領域長期以來一直未被滿足的需求提供了解決方案，由本揭露所述之組成物和方法有效生產具有優異的合成精準度與速度之長DNA序列。
本揭露提供使用可逆的終止核苷酸三磷酸(reversible terminating nucleotide triphosphate，rtNTP)之用於無模板酶促核酸(nucleic acid，NA)聚合物的合成之組成物與方法。TdT用以將個別的rtNTP併入到單股NA分子的3’端。可藉由添加一個rtNTP，而後移除阻擋基團(blocking group)，接著添加新的rtNTP至反應的連續循環而合成獨特的NA。
本揭露提供一種組成物，包括：(a)包括至少三個核苷酸的引子，其中該引子包括3’可逆的終止核苷酸(rtNTP)；(b)至少一個游離的(free) rtNTP；以及(c)具有終端轉移酶(terminal transferase)活性的酶或核糖酶。在一些實施例中，組成物另包括(d)反應緩衝液。在一些實施例中，反應緩衝液包括終濃度為50 mM的醋酸鉀、20 mM的Tris-醋酸鹽(Tris-Acetate)以及10 mM的醋酸鎂。在一些實施例中，提供二價陽離子的來源，二價陽離子包含但不限於Zn2+
、Co2+
、Mn2+
。在一些實施例中，組成物另包括一或多種二價陽離子。在組成物的一些實施例中，二價陽離子為Zn2+
、Co2+
或Mn2+
。在一些實施例中，反應緩衝液另包括一或多種二價陽離子。在反應緩衝液的一些實施例中，二價陽離子為為Zn2+
、Co2+
或Mn2+
。
在本揭露的組成物的一些實施例中，該至少一種游離的可逆的終止核苷酸(rtNTP)包括化學可逆的阻擋基團。在一些實施例中，組成物另包括化學逆轉該阻擋基團的試劑。在一些實施例中，該試劑為路易士酸。在一些實施例中，路易士酸包括CoCl2
。在一些實施例中，化學可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基(2-nitrobenzyl group)、胺基、疊氮基甲基(azidomethyl group)或烯丙基。在一些實施例中，化學可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基。
在本揭露的組成物的一些實施例中，該至少一種游離的可逆終止核苷酸(rtNTP)包括光可逆的阻擋基團。在一些實施例中，光可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基、丹磺醯基(dansyl group)、對羥基苯甲醯甲基(p-hydroxyphenacyl group)、或7-甲氧基-4-甲基香豆素基(7-methyoxy-4-methylcoumarin group)。在一些實施例中，光可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基。
在本揭露的組成物的一些實施例中，引子包括5’修飾。在一些實施例中，5’修飾包括可選擇的標記(selectable tag)。可選擇的標記可用以從反應中分離或純化出所得之合成的DNA聚合物。在一些實施例中，可選擇的標記是鍵結或雜交至引子。在一些實施例中，可選擇的標記是鍵結至基材(substrate)或雜交至與基材鍵結的NA鏈。在一些實施例中，基材包括平坦表面或珠。在一些實施例中，基材包括玻璃、聚合物或基質。在一些實施例中，基材包括孔洞或通道。在一些實施例中，基材包括聚合物，其中該聚合物包括聚丙烯醯胺凝膠。在一些實施例中，基質包括固定件(anchor)。
在本揭露的組成物的一些實施例中，引子包括5’修飾。在一些實施例中，5’修飾包括生物素(biotin)。在一些實施例中，基質包括珠，其中該珠包括聚丙烯醯胺凝膠，其中聚丙烯醯胺凝膠包括固定件以及其中固定件包括抗生物素蛋白(avidin)或鏈黴親和素(streptavidin)。
在本揭露的組成物的一些實施例中，引子包括去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)、核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)、胺基酸、或是其之任何組合。在一些實施例中，引子包括至少一個非天然存在的鹼基(base)或至少一個非天然存在的主鏈(backbone)。在一些實施例中，引子包括至少一個非天然存在的鹼基(base)與至少一個非天然存在的主鏈(backbone)。在一些實施例中，該至少一個非天然存在的鹼基包括dBTP、dKTP、dPTP、dXTP、dZTP、dInDTP、5-氟吲哚基-2’-去氧核糖核苷三磷酸(d5FITP)、5-胺基-吲哚基-2’-去氧核糖核苷三磷酸(dAITP)、5-硝基-吲哚基-2’-去氧核糖核苷三磷酸(dNITP)、5-環己基-吲哚基-2’-去氧核糖核苷三磷酸(dCHITP)、dCEITP、5-苯基吲哚基-2’-去氧核糖核苷三磷酸(d5PhITP)、5-萘基吲哚基-2’-去氧核糖核苷三磷酸(d5NapITP)、或d5AnITP。在一些實施例中，該至少一個非天然存在的主鏈包括環己烯核酸(cyclohexenyl nucleic acid，CeNA)、阿拉伯核酸(arabinonucleic acid，ANA)、2’-氟-阿拉伯核酸(FANA)、α-L-蘇型呋喃糖基核酸(α-L-threofuranosyl nucleic acid，TNA)、或是鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)。在一些實施例中，LNA包括2’-O,4’-C-亞甲基-β-D-核糖核酸。
在本揭露的組成物的一些實施例中，引子包括可逆的終止核苷酸(rtNTP)，並且rtNTP包括化學可逆的阻擋基團。在一些實施例中，化學可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基(2-nitrobenzyl group)、胺基、疊氮基甲基(azidomethyl group)或丙烯基。在一些實施例中，化學可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基。
在本揭露的組成物的一些實施例中，引子包括可逆的終止核苷酸(rtNTP)，並且rtNTP包括光可逆的阻擋基團。在一些實施例中，光可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基、丹磺醯基(dansyl group)、對羥基苯甲醯甲基(p-hydroxyphenacyl group)、或7-甲氧基-4-甲基香豆素基(7-methyoxy-4-methylcoumarin group)。在一些實施例中，光可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基。
在本揭露的組成物的一些實施例中，引子在溶液中。
在本揭露的組成物的一些實施例中，引子連接(linked)至基材。
在本揭露的組成物的一些實施例中，引子連接至基材。在一些實施例中，引子直接連接至基材，並且引子接觸基材。在一些實施例中，引子間接連接至基材，並且引子接觸與基材接觸的連接子(linker)。
在本揭露的組成物的一些實施例中，引子連接至基材。在一些實施例中，引子直接連接至基材，並且引子接觸基材。在一些實施例中，引子間接連接至基材，並且引子接觸與基材接觸的連接子。在一些實施例中，基材為珠。在一些實施例中，珠包括玻璃、聚合物、或基質。在一些實施例中，珠為多孔。在一些實施例中，珠包括聚丙烯醯胺凝膠。
在本揭露的組成物的一些實施例中，引子連接至基材。在一些實施例中，引子直接連接至基材，並且引子接觸基材。在一些實施例中，引子間接連接至基材，並且引子接觸與基材接觸的連接子。在一些實施例中，基材為實質上平坦的表面。在一些實施例中，基材為平坦表面。在一些實施例中，基材包括玻璃、聚合物、或基質。
在本揭露的組成物的一些實施例中，引子連接至基材。在一些實施例中，引子直接連接至基材，並且引子接觸基材。在一些實施例中，引子間接連接至基材，並且引子接觸與基材接觸的連接子。在一些實施例中，基材為實質上平坦的表面。在一些實施例中，基材為平坦表面。在一些實施例中，基材包括玻璃、聚合物、或基質。在一些實施例中，引子為複數個引子，並且其中該複數個引子中的每一個引子於陣列(array)中連接至基材。在一些實施例中，複數個引子包括具有第一序列的第一引子以及具有第二序列的第二引子，其中該第一序列與該第二序列不同。在一些實施例中，複數個引子包括該至少第一引子的至少一個重複(duplicate)以及該第二引子的至少一重複。
在本揭露的組成物的一些實施例中，引子連接至基材。在一些實施例中，引子直接連接至基材，並且引子接觸基材。在一些實施例中，引子間接連接至基材，並且引子接觸與基材接觸的連接子。在一些實施例中，基材為實質上平坦的表面。在一些實施例中，基材為平坦表面。在一些實施例中，基材包括玻璃、聚合物、或基質。在一些實施例中，引子為複數個引子，並且其中該複數個引子中的每一個引子於陣列(array)中連接至基材。在一些實施例中，複數個引子包括具有第一序列的第一引子以及具有第二序列的第二引子，其中該第一序列與該第二序列不同。在一些實施例中，複數個引子中的每一個引子包括獨特序列。
在本揭露的組成物的一些實施例中，酶為終端去氧核苷酸基轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)。
在本揭露的組成物的一些實施例中，酵素為pol θ、pol λ、pol μ、Dpo 1、或引子酶(primase)。
在本揭露的組成物的一些實施例中，核糖酵素為RNA依賴性RNA聚合酶。
本揭露提供一種無模板核酸合成的方法，包括(a)獲得本揭露的組成物；(b)將組成物的引子之3’ rtNTP去保護；以及(c)藉由組成物的酶或核糖酶，將組成物的至少一游離的rtNTP併入組成物的引子中，藉以合成核酸。在一些實施例中，組成物的至少一游離的rtNTP為複數個游離的rtNTP。在一些實施例中，步驟(b)與(c)在少於1分鐘完成。在一些實施例中，該方法另包括在去保護步驟(b)之後的第一次沖洗，以及在併入步驟(c)之後的第二次沖洗。在一些實施例中，包含該方法另包括在去保護步驟(b)之後的第一次沖洗以及在併入步驟(c)之後的第二次沖洗，步驟(b)與(c)在少於1分鐘完成。在一些實施例中，包含其中該方法另包括在去保護步驟(b)之後的第一次沖洗以及在併入步驟(c)之後的第二次沖洗的那些，該方法另包括步驟(d)重複步驟(b)與(c)。在一些實施例中，包含其中該方法另包括在去保護步驟(b)之後的第一次沖洗以及在併入步驟(c)之後的第二次沖洗的那些，該方法另包括步驟(e)在進行步驟(d)之前，移除未併入的rtNTP。
在本揭露之無模板核酸合成的方法的一些實施例中，引子的3’ rtNTP包括光可逆的阻擋基團，以及去保護包括將該光可逆的阻擋基團暴露至光照射。在一些實施例中，光照射包括UV照射。
在本揭露之無模板核酸合成的方法的一些實施例中，引子的3’ rtNTP包括化學可逆的阻擋基團，以及去保護包括將化學可逆的阻擋基團暴露至路易士酸。在一些實施例中，路易士酸包括CoCl2
。
在本揭露之無模板核酸合成的方法的一些實施例中，引子在溶液中。
在本揭露之無模板核酸合成的方法的一些實施例中，引子連接至基材。
在本揭露之無模板核酸合成的方法的一些實施例中，引子連接至基材。在一些實施例中，引子為複數個引子，並且其中複數個引子中的每一個引子於陣列中連接至基材。在一些實施例中，複數個引子包括具有第一序列的第一引子與具有第二序列的第二引子，其中該第一序列與該第二序列不同。在一些實施例中，複數個引子包括第一引子的至少一個重複以及第二引子的至少一個重複。
在本揭露之無模板核酸合成的方法的一些實施例中，引子連接至基材。在一些實施例中，引子為複數個引子，並且其中複數個引子中的每一個引子於陣列中連接至基材。在一些實施例中，複數個引子包括具有第一序列的第一引子以及具有第二序列的第二引子，其中第一序列與第二序列不同。在一些實施例中，複數個引子中的每一個引子包括獨特序列。
在本揭露之無模板核酸合成的方法的一些實施例中，該方法另包括以下步驟：在合成過程中，將合成核酸接觸隨機引子、非專一性引子、一組隨機短終止的核酸序列、非催化性單股結合蛋白質與非催化性單股結合化合物中的一或多者，以於一或多回的rtNTP之去保護與併入過程中，維持實質上線狀構形(linear conformation)、抑制二級與/或三級結構形成、或解開該合成核酸之抑制構形(inhibitory conformation)。在一些實施例中，非催化性單股結合蛋白質或非催化性單股結合化合物包括聚胺(polyamine)。在一些實施例中，聚胺包括精胺(spermine)、五-L-離胺酸(penta-L-lysine)、多分散的聚-L-離胺酸(polydisperse poly-L-lysine)、或精三胺(spermidine)。
在本揭露之無模板核酸合成的方法的一些實施例中，包含其中該方法另包括在合成過程中，將合成核酸接觸隨機引子、非專一性引子、一組隨機短終止的核酸序列、非催化性單股結合蛋白質與非催化性單股結合化合物中的一或多種者之步驟那些實施例，一旦合成核酸包括至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000個核苷酸或這之間任何數目的核苷酸，則進行該接觸步驟。或者，或是此外，在一些實施例中，在產生合成核酸內可形成二級或三級結構的序列之前，進行接觸步驟。或者，或此外，在一些實施例中，在產生具有足夠長度序列使得合成核酸可折疊為實質上非線狀構形之前，進行接觸步驟。在一些實施例中，該方法另包括步驟(f)：在合成完成之後，從合成該核酸移除隨機引子、非專一性引子、一組隨機短終止的核酸序列、非催化性單股結合蛋白質與非催化性單股結合化合物中的一或多者。
所揭示為使用可逆的終止核苷酸三磷酸(rtNTP)之用於酶促不依賴模板的核酸(NA)聚合物合成之組成物與方法。根據本揭露的方法，終端去氧核苷酸基轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)，其亦已知為DNA核苷酸基外轉移酶(DNA nucleotidylexotransferase，DNTT)或終端轉移酶，將個別的rtNTP併入單股NA分子的3’端。可藉由添加一個rtNTP，而後移除阻擋基團，接著添加新的rtNTP至反應的連續循環而合成獨特的NA序列。 提高之 DNA 合成的速度與長度以及降低之成本
相較於現有技術，本揭露的組成物與方法生產較長的合成DNA分子，並且降低NA合成的成本。
亞磷醯胺DNA合成(Phosphoramidite DNA synthesis)為有機化學方法，其已被使用許多年，用於合成短核酸(NA)分子，稱為寡核苷酸。自1980年代以來，此方法已經被自動化，且常見用以生產15至25個核苷酸長度的寡核苷酸。然而，由於反應不完全及副反應，因而限制了此方法可合成之DNA分子的長度。實際上，此限制為100個核苷酸。這呈現出問題，因為平均人類基因的編碼序列為1000個核苷酸。因此，為了以現有技術合成整個基因，需要將較短的DNA片段拼接在一起，這增加了商品成本，限制了合成生物學中的許多應用。此外，亞磷醯胺方法典型對於在增長的NA鏈，每增加一個核苷酸需要至少5分鐘的循環時間，使得長NA鏈的生產令人卻步。因此，需要新的NA合成技術(亦即，本揭露的組成物與方法)生產較長的NA分子，提高合成的速度並且降低NA合成的成本。
相較於現有的方法，本揭露的組成物與方法提高合成的速度並且降低NA合成的成本。例如，引子或增長的NA之3’ rtNTP的去保護與併入新rtNTP的每一循環可在少於一分鐘完成。即使在去保護步驟和併入步驟之後插入沖洗步驟，此循環也可以在少於一分鐘完成。 增加之核酸的多樣性 (diversity)
本揭露的組成物與方法增加可得NA之多樣性，以用於其他應用，例如小分子(例如，代謝物)的偵測。
該領域額外需要以非天然鹼基或主鏈來合成NA。此需求來自於適配體(aptamer)的實用性，適配體為專一性結合小分子(例如，各種代謝物與短胜肽)的NA。儘管傳統上單股RNA已經作為適配體，但目前使用各種非天然鹼基與主鏈用以增加小分子結合與酶促可能性的多樣性。本揭露的組成物與方法可包括具有非天然存在鹼基與/或非天然存在主鏈的替代核苷酸，以產生非天然存在NA。非天然存在NA可用以增加結合本揭露之NA的小分子的專一性與多樣性。終端去氧核苷酸基轉移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferases
)
本揭露說明牛的TdT將3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dNTP併入至待合成之單股DNA分子的3’端。提供光線除去2-硝基苄基阻擋基團並且允許添加另一個3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dNTP。可使用具有適當終端轉移酶活性的其他酶。此外，已經描述各種演化上不同的終端轉移酶，並且亦可使用這些。通常，使用有效率的酶之併入(incorporation)速度是非常快，通常少於1分鐘。
終端去氧核苷酸基轉移酶(TdT)為聚合酶，其可用不依賴模板的方式將去氧核苷酸或核糖核苷酸添加至單股NA分子的3’端。TdT可合成超過1500核苷酸長度的DNA分子。許多實例已經顯示DNA聚合酶可將在它們的3’端具有可移除之阻擋基團的dNTP併入至依賴模板的合成。使用循環，此方法允許個別核苷酸的併入。TdT亦可將經修飾的dNTP併入至單股DNA合成反應中，包含在3’或2’位置具有疊氮(azide)基團的dNTP。在一些實施例中，本揭露的組成物與方法包括在3’位置具有修飾之dNTP，包含3’-O-疊氮基甲基dATP與3’-O-疊氮基甲基dCTP。
雖然哺乳動物TdT為最常使用且最被了解的終端轉移酶，但是具有末端轉移酶活性的其他不同酶，亦即，以非模板化方式延長核酸鏈的能力。通常在其他生物化學條件下發現這些活性，例如在二價陽離子交替的環境中。可使用在本揭露之組成物與方法中之具有終端轉移酶活性的替代酶與核糖酶包含但不限於Pol θ、Pol λ、Pol μ、Dpo 1、引子酶(Primase)、RdRPs與核糖酶(Ribozyme)。
Pol θ可藉由將二價陽離子從Mg2+
改變為Mn2+
而在模板化與非模板化的終端轉移酶活性之間切換。
Pol μ (PolX家族的另一成員，其包含TdT)可於環(Loop)1區域中突變後在模板化與非模板化活性之間切換(請見A.F. Moon等人發表之DNA Repair (Amst) 6(12) (2007) 1709-25；P. Andrade發表之Proc Natl Acad Sci U S A 106(38) (2009) 16203-8；以及J. Yamtich與J.B. Sweasy發表之Biochim Biophys Acta 1804(5) (2010) 1136-50；各自內容藉由引用全文而併入本文中)。與此相關的是TdT可自非模板化切換至在環(Loop)1區域中具有突變之模板化(請見F. Romain等人發表之Nucleic Acids Res 37(14) (2009) 4642-56；其內容藉由引用全文而併入本案中)。
Pol λ (PolX家族的另一成員)具有內在的終端轉移酶活性以及其DNA聚合酶活性(請見K. Ramadan等人發表之J Mol Biol 328(1) (2003) 63-72；其內容藉由引用全文而併入本案中)。
引子酶(其參與複製的DNA合成)通常產生短的RNA引子以起始DNA合成。來自古細菌生物的這些引子酶之非常不同的版本具有非模板化的終端轉移酶活性(請見M. De Falco等人發表之Nucleic Acids Res 32(17) (2004) 5223-30；S.H. Lao-Sirieix等人發表之Trends Genet 21(10) (2005) 568-72；S. Gill等人發表之Nucleic Acids Res 42(6) (2014) 3707-19；以及S.H. Lao-Sirieix與S.D. Bell.發表之J Mol Biol 344(5) (2004) 1251-63；其各自內容藉由引用全文而併入本案中)。
古菌的DNA合成酶I (來自Sulfolobus solfataricus的Dpo1)具有終端轉移酶活性(請見 Z. Zuo等人發表之Biochemistry 50(23) (2011) 5379-90，其內容藉由引用全文而併入本案中)。
一些病毒的RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)已證明終端轉移酶活性，以及所有的RdRP可具有終端轉移酶活性(請見C.T. Ranjith-Kumar等人發表之J Virol 75(18) (2001) 8615-23；Z. Wang等人發表之J Biol Chem 288(43) (2013) 30785-801；T. Yamashita等人發表之J Biol Chem 273(25) (1998) 15479-86；以及W. Wu等人發表之PLoS One 9(1) (2014) e86876；其內容藉由引用全文而併入本案中)。
最近已經產生之RdRP的核糖酶版本亦可具有終端轉移酶活性(請見D.P. Horning與G.F. Joyce等人發表之Proc Natl Acad Sci U S A 113(35) (2016) 9786-91；其內容藉由引用全文而併入本案中)。可逆的終止核苷酸 (Reversible-Terminating Nucleotide
)
關於受控制的NA鏈合成，本揭露的方法一次僅添加一個鹼基。若TdT與天然的NTP一起存在，則TdT會隨著時間將NTP併入以形成長的隨機的序列。若僅有一種核苷酸存在，則TdT將產生該核苷酸之長的均聚物片段(homopolymeric tract)。因此，本揭露的組成物與方法控制反應，使得每一循環僅併入一個核苷酸，而後可產生任意但特定的NA序列。
為了得到聚合酶之一個且僅一個核苷酸之併入，Sanger和Coulson設計了二去氧核苷酸終止子方法(dideoxy nucleotide terminator method)，該方法允許在每個鏈的3’末端僅併入單個核苷酸(請見F. Sanger與A.R. Coulson之J Mol Biol 94(3) (1975) 441-8；其內容藉由引用全文而併入本案中)。然而，二去氧核苷酸無法被延長。因此，該組成物與方法使用各種可逆的終止核苷酸，其在經控制移除阻擋基團之後允許再產生3’-OH基團。本揭露將此經修飾的核苷酸稱為可逆的終止核苷酸三磷酸(rtNTP)。
根據本揭露的組成物與方法，可用以阻擋給定核苷酸之3’-OH的一或多個光可移除保護基團包含但不限於2-硝基苄基、丹磺醯基(dansyl group)、對羥基苯甲醯甲基(p-hydroxyphenacyl group)、以及7-甲氧基-4-甲基香豆素基(7-methyoxy-4-methylcoumarin group)。或者，或此外，根據本揭露的組成物與方法，可用以阻擋給定核苷酸之3’-OH的一或多個化學可切除之保護基團包含但不限於胺基、疊氮基甲基(azidomethyl group)或烯丙基。根據本揭露的組成物與方法，可使用可移除的保護基團(光與化學二者都可切除)以阻擋給定之核苷酸的3’-OH。例如，藉由路易士酸/胺組合處理，2-硝基苄基(2-nitrobenzyl group)為光可轉換與化學可切除的。
核苷酸的其他部分的修飾提供可逆終止活性。例如，核苷酸的2’修飾可以可逆終止由T7 RNA聚合酶媒介之正在成長的RNA鏈。因此，在本揭露的組成物與方法的一些實施例中，核糖核苷酸可包括一或多個2’修飾，其在藉由T7 RNA聚合酶的合成中可逆終止RNA聚合物。或者，或此外，包括一或多個2’修飾的核糖核苷酸(其在藉由T7 RNA聚合酶的合成過程中可逆終止RNA聚合物)可包括一或多個可移除的阻擋基團(例如，光可逆或化學可逆的阻擋基團)。
雖然已經顯示各種不同RNA與DNA聚合酶來併入不同的rtNTP，但對於TdT或具有末端轉移酶活性的其他酶尚未證實此類活性。 5’ 核酸修飾
根據本揭露的組成物與方法，TdT之非模板化的合成反應催化添加核苷酸至成長的NA鏈，該鏈需要至少三個核苷酸長度。因此，本揭露的方法使用具有至少三個可得之3’核苷酸之NA引子，以起始使用TdT的合成。
關於使用TdT與rtNTP之溶液中的合成在一次一個鹼基的情況下，可分離成長中的NA鏈可為重要的。在本揭露之組成物與方法的一些實施例中，成長中的NA鏈可包括用於分離所得合成DNA聚合物的5’修飾。在一些實施例中，5’修飾可包含鍵結或雜交至成長中的NA鏈或所得合成DNA聚合物之標示或寡核苷酸，並且任意地可進一步附接至基材。
在一些實施例中，5’修飾可包含生物素標示，其可鍵結至抗生物素蛋白(avidin)塗覆的基材或鏈黴親和素(streptavidin)塗覆的基材。在一些實施例中，基材可為固體或半固體基材。本揭露的半固體基材可包括玻璃。或者，或此外，本揭露的半固體基材可包括一或多個孔洞或通道。在一些實施例中，基材形式可為實質上平坦的表面或珠。 連接至基材的酶促合成
典型地，亞磷醯胺(phosphoramidite)合成使用用於批量生產單一NA序列之受控的多孔玻璃或聚苯乙烯珠。最近，已經將陣列用於多個NA序列的合成。這些陣列反應以各種方式進行，包含使用光遮罩來光啟動特定區域而使得在每一個循環中僅有限數量之成長中的鏈接受下一個核苷酸；使用基於微鏡的掃描系統(micromirror-based scanning system)以專一性光啟動併入下一個核苷酸的位置；使用噴墨印表機技術以產生合成之NA序列的陣列；以及使用藉由微加熱控制之表面衍生(surface derivatization)，然而，相較於本揭露之組成物與方法產生之合成的DNA聚合物，在這些系統的每一個中所合成的DNA聚合物之長度是短的。儘管這四種微陣列產生方法已經提出或使用了亞磷醯胺合成，但當結合本揭露之組成物與酶促合成方法(例如，通過TdT以及密集孔徑陣列上之光可逆dNTP，以及可單獨尋址的區域)時，可改良這些現有的為陣列產生方法以於非常短的時間內提供許多長的NA序列。微流體系統
於溶液中或在珠上的大量合成產生足夠數量的少量NA序列用於許多分子生物學實驗。在另一個極端情況下，許多不同NA序列的陣列可用於全基因組和適配體實驗，然而，每個NA序列可用的材料量可能受到限制。作為中等規模的合成，根據本揭露的方法，可使用包括TdT與rtNTP的組成物而於微流體液滴系統中合成NA序列。微流體系統可適用於使用化學或光可逆的rtNTP並且適用於合成許多不同的NA序列，各自產生的量可用於許多應用。非催化性單股結合蛋白質
當單股NA合成時，它們會開始形成可能抑制併入其他核苷酸的二級與三級結構構形。例如，自身互補的短區域可能會以TdT無法延伸NA鏈的方式遮蔽3’-終端三個鹼基。有一些方法可克服此抑制。
在本揭露的組成物與方法的一些實施例中，在一些併入循環之後，加入特定或隨機的引子，並且進行第二股合成反應，以解開抑制構形。以維持實質上線形構形的雙股NA，原始成長中的NA之3’端可藉由TdT媒介而自由併入其他核苷酸。
在本揭露的組成物與方法的一些實施例中，在一些併入循環之後，在足以進行雜交以解開抑制構形的條件下，提供一組隨機短終止的NA序列（不含5’-PO4
，3’-二去氧）。
在本揭露的組成物與方法的一些實施例中，加入非催化性單股結合蛋白質以使原始成長中的NA鏈之3’端自由。在本揭露的組成物與方法的一些實施例中，加入非催化性單股結合化合物以使原始成長中的NA鏈之3’端自由。例如，可使用聚胺(polyamine)：精胺(spermine)、五-L-離胺酸(penta-L-lysine)、多分散的聚-L-離胺酸(polydisperse poly-L-lysine)以及精三胺(spermidine)中之一或多者，以藉由與負電荷NA主鏈交互作用而解開打結的NA鏈。 非天然存在的 DNA 核苷酸
可使用具有非天然鹼基與/或主鏈之各種非天然存在的核苷酸於本揭露的組成物與方法中。
例示之包括非天然鹼基的非天然存在之核苷酸包含但不限於dBTP、dKTP、dPTP、dXTP與dZTP(請見圖3與K. Sefah等人發表之Proc Natl Acad Sci U S A 111(4) (2014) 1449-54；其內容藉由引用全文而併入本案中)。例示之包括非天然鹼基的非天然存在之核苷酸包含但不限於dInDTP、d5FITP、dAITP、dNITP、dCHITP、dCEITP、d5PhITP、d5NapITP與d5AnITP(請見A.J. Berdis與D. McCutcheon發表之Chembiochem 8(12) (2007) 1399-408；其內容藉由引用全文而併入本案中)。
例示之包括非天然主鏈的非天然存在的核苷酸包含但不限於CeNA(環己烯基核酸)、ANA(阿拉伯核酸)、FANA (2’-氟-阿拉伯核酸)、TNA (α-L-蘇型呋喃糖基核酸)以及LNA (2’-O,4’-C-亞甲基-β-D-核糖核酸；鎖核酸)(請見V.B. Pinheiro等人發表之Science 336(6079) (2012) 341-4；其內容藉由引用全文而併入本案中)。 DNA 合成方法
為了使用TdT的不依賴模板合成性質且發展芯的DNA合成技術，本揭露的組成物與方法使用TdT以將rtNTP併入於成長中的NA鏈之3’端的合成反應。在成長中的NA鏈之3’端併入rtNTP阻擋進一步合成，因而造成在NA合成過程過程中僅添加一個核苷酸。去除終止子(terminator)修飾允許添加另一種修飾的核苷酸，並且使用該逐步方法導致合成DNA分子的產生。 DNA 合成陣列
本揭露的組成物可包括(a)複數個引子，其中每一個引子包括至少三個核苷酸，其中每一個引子包括3’可逆終止核苷酸(rtNTP)，以及其中每一個引子連接至實質上平坦的基材而呈陣列；(b)複數個游離的(free) rtNTP；以及(c)具有終端轉移酶活性的酶或核糖酶。
在本揭露的陣列的一些實施例中，引子可直接連接至基材，使得引子接觸基材。或者，在一些實施例中，引子可間接連接至基材，使得引子接觸進而直接接觸基材的連接子。本揭露的連接子可為任何長度。本揭露之例示的連接子可包括任何材料，包含但不限於有機或無機分子或聚合物。在一些實施例中，有機聚合物包括DNA、RNA或胺基酸單體中的一或多者。
連接至基材的複數個引子可包括具有第一序列的第一引子與具有第二序列的第二引子，其中第一序列與第二序列不同。在一些實施例中，連接至基材的複數個引子可包括具有第一序列的第一引子、具有第二序列的第二引子、以及具有第三或後續序列的第三或後續引子，其中第一序列、第二序列、以及第三或後續序列為不同。在一些實施例中，複數個引子包括第一引子、第二引子與第三或後續不同引子中之每一個的至少一個重複(duplicate)。在一些實施例中，複數個引子包括每一個不同引子的二或更多個重複。在一些實施例中，複數個引子包括每一個不同引子之5、10、50、100、200、500、100個重複或在其間的任何數目之重複。
在一些實施例中，連接至基材的複數個引子的每一個可包括不同於該複數個引子之其他引子的每一個的獨特序列(亦即，該複數個引子中的每一個引子為不同引子)。
在本揭露的陣列組成物的一些實施例中，該陣列產生的合成核酸可包括具有第一序列的第一合成核酸以及具有第二序列的第二合成核酸，其中第一序列與第二序列不同。在一些實施例中，連接至基材的複數個合成核酸可包括具有第一序列的第一合成核酸、具有第二序列的第二合成核酸、以及具有第三或後續序列的第三或後續合成核酸，其中第一、第二與第三或後續序列為不同。在一些實施例中，複數個合成核酸包括第一合成核酸、第二合成核酸與第三或後續不同合成核酸中的每一個的至少一個重複。在一些實施例中，複數個合成核酸包括每一個不同合成核酸的二或多個重複。在一些實施例中，複數個合成核酸包括每一個不同合成核酸之5、10、50、100、200、500、100個重複或在其間的任何數目之重複。
在本揭露的陣列的一些實施例中，連接至基材的複數個合成核酸的每一個可包括不同於該複數個合成核酸之其他合成核酸的每一個的獨特序列 (亦即，該複數個合成核酸的每一個合成核酸是不同的合成核酸)。
在本揭露的陣列的一些實施例中，連接至基材的複數個合成核酸可包括至少一個合成DNA。或者，或此外，在本揭露的陣列的一些實施例中，連接至基材的複數個合成核酸可包括至少一合成RNA。在一些實施例中包含其中連接至基材的複數個合成核酸可包括至少一合成RNA的那些實施例，本揭露的組成物與/或方法可另包括使用RNAse抑制劑。
在本揭露的陣列的一些實施例中，連接至基材的複數個合成核酸的每一個包括合成DNA。
在本揭露的陣列的一些實施例中，連接至基材的複數個合成核酸的每一個包括合成RNA。在一些實施例中，本揭露的組成物與/或方法可另包括使用RNAse抑制劑。
在本揭露的陣列的一些實施例中，複數個引子與自其所產生之複數個合成核酸可採重複或非重複圖案配置在基材上。在一些實施例中，重複圖案可用以包含重複的引子與/或重複的合成核酸。包含重複的引子與/或重複的合成核酸可增加使用陣列之分析的統計效力，於該分析中偵測鍵結或雜交至合成核酸中之一或多個的分析物(analyte)。在一些實施例中，可使用非重複圖案以增加存在陣列上之引子與/或合成核酸的多樣性。多樣性的此增加可對於分析物的初始篩選特別有用，以辨識進一步分析的目標或辨識大量分析物中的稀有分析物。
在本揭露的陣列的一些實施例中，該陣列可用在用於偵測鍵結或雜交至陣列之合成核酸的分析物的裝置中。例示的偵測裝置如美國專利9,410,887(其內容藉由引用全文而併入本案中)所述。實例
實例1：3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dNTP組成物與T7 RNA聚合酶及用以移除2-硝基苄基部分之UV輻射併用
在本揭露的組成物與方法的一些實施例中，藉由T7 RNA聚合酶，將經修飾的dNTP(在2’位置具有2-硝基苄基)併入至依賴模板反應中。當僅添加一個經修飾的dNTP，2-硝基苄基作為可逆終止子，並且UV輻射移除2-硝基苄基部分，留下OH基團作為後續合成的位置。儘管小牛的TdT可併入3’位置具有修飾的dNTP，然而在本揭露之前，未顯示TdT可併入3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dNTP或此可用於NA合成。
為了測試此方法，使用包括3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP(取自Trilink，請見圖1)與重組的小牛TdT(取自NEB)。為了起始模板依賴性合成，TdT需要至少三個核苷酸長度的單股DNA分子。使用24個核苷酸的寡核苷酸，其在5’端具有alexa-488標示(圖2A)。
若TdT成功地將3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP併入在寡核苷酸的3’端，則在變性聚丙烯醯胺凝膠上會有降低的移動率(mobility)，等於加入一個核苷酸。當在變性聚丙烯醯胺凝膠上分析時，5’標示的存在降低此寡核苷酸的移動率，因而相較於階梯(ladder)(圖2B，第1行與第2行)，它解析為27個核苷酸。當寡核苷酸與TdT但無核苷酸培養(incubated)時，凝膠上寡核苷酸的解析結果沒有非特異性變化(圖2B，第3行)。寡核苷酸與TdT及未修飾的dNTP培養造成長的DNA分子之聚合作用(圖2B，第7行)。然而，寡核苷酸與TdT及3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP培養造成凝膠上的解析結果偏移，這相當於是僅添加一個核苷酸(圖2B，第4行)。在寡核苷酸與TdT及3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP培養之後，以UV照射樣品，而後旋轉管柱清理樣品(Zymo，寡核苷酸清理與濃縮器管柱)，並且進一步與3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP及TdT培養。這造成凝膠之解析結果偏移，相當於是添加另一個阻擋的核苷酸(blocked nucleotide)(圖2B，第5行)，證實在寡核苷酸的3’端逐步添加單個核苷酸。
在寡核苷酸與TdT及3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP培養之後，樣品進一步與未修飾的dNTP培養(圖2B，第6行)。此樣品的凝膠分析顯示與用TdT和3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP培養寡核苷酸後觀察到的大小相當的弱帶。然而，亦觀察到較長的DNA分子(圖2B，第6行)。
整體而言，結果證實儘管TdT可在寡核苷酸的3’端添加3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP，但一些寡核苷酸尚未接收到3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP且仍保持游離(free)以供進一步的合成反應。因此，添加未修飾的dNTP導致在這些未阻擋的寡核苷酸上合成長的DNA分子。然而，該較長的DNA分子仍短於培養寡核苷酸與TdT及未修飾的dNTP之後觀察到的DNA分子長度(圖2B，比較第6行與第7行)。這是反應中仍保有游離3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP的結果。當TdT以未修飾的dNTP進行合成，其亦併入3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP，它阻擋其他dNTP的添加。這與使用二去氧核苷酸(其缺少3’ OH基並且阻擋進一步的DNA聚合作用)造成的Sanger DNA定序階梯(sequencing ladder)相當。此觀察進一步支持TdT可併入3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP且此阻擋進一步DNA合成之申請專利範圍。 實例2：DNA合成反應條件
實例1的反應是在5微升(ml)體積中進行，於37℃培養1小時。藉由培養1微升的10 μM寡核苷酸(顯示於圖2A中)與0.2微升的TdT(20單位/μl，NEB)、0.5微升的CoCl2
(最終濃度為0.25 mM)、0.5微升的反應緩衝液(最終濃度為50 mM醋酸鉀、20 mM Tris-醋酸鹽、10 mM醋酸鎂)以及1微升的10mM dNTP或dATP或3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP，以進行合成反應。這提供寡核苷酸與核苷酸酯比例為1：1000。關於控制組實驗，將核苷酸替換為1微升的水。以UV照射在UV光下培養10分鐘進行。藉由添加1微升的100 mM EDTA且於80℃培養5分鐘，以停止反應。以變性的20%聚丙烯醯胺凝膠(8M尿素)進行樣品分析。藉由引用而併入
除非明確排除或另有限制，否則本文中引用的每個文件(包括任何交叉引用或相關專利或申請案)均通過引用而全文併入本案。任何文件的引用並非承認它是關於在此揭示或請求保護的任何發明的現有技術，或者它單獨或與任何其他參考文獻任何組合一起教導、建議或揭示任何這樣的發明。再者，如果本文件中術語的任何含義或定義與通過引用併入的文件中的相同術語的任何含義或定義相衝突，則以本文件中賦予該術語的含義或定義為準。其他實施例
儘管已經說明且描述了本揭露之特定實施例，但可以在不脫離本揭露的精神和範圍的情況下做出各種其他改變和修改。所附申請專利範圍的範圍包含在本揭露範圍內的所有這些變化和修飾。
圖1為說明3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP之結構的圖式。
圖2A為單股寡核苷酸的序列(SEQ ID NO: 1)，其係用以作為圖2B所示之DNA合成的起始點。5’端的星號表示alexa-488標記。
圖2B為說明在100V於20%聚丙烯醯胺凝膠(8M尿素)跑膠35分鐘的照片。凝膠而後藉由以10%乙醇固定5分鐘，接著以含有SybrGold的1xTBE清洗3分鐘而染色。第1行=階梯(ladder)；第2行=圖2A所示之寡核苷酸；第3行=寡核苷酸加TdT；第4行=以TdT與3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP培養的(incubated)寡核苷酸；第5行=第4行所示之樣品，但經UV照射而後清理並且進一步以TdT與3’-O-(2-硝基苄基)-2’-dATP培養；第6行=第4行所示之樣品，但未經UV照射而後進一步以未阻擋的dNTP培養；第7行=以游離的dNTP培養之寡核苷酸。
圖3為說明dBTP、dKTP、dPTP、dXTP與dZTP核苷酸之大小互補且氫鍵互補之Watson-Crick配對規則的示意圖。轉載自K. Sefah等人發表之PNAS 2014；111：1449-1454。
圖4為說明本揭露之例示的非天然存在的核酸鹼基(2’-去氧核苷三磷酸)之結構的示意圖。「dR」是用以表示核苷酸之去氧核糖三磷酸部分。部分轉載自A.J. Berdis與D. McCutcheon.的Chembiochem 8(12) (2007) 1399-408。
Claims (77)
- 一種組成物，包括： (a)包括至少三個核苷酸的引子，其中該引子包括3’可逆的終止核苷酸(rtNTP)； (b)至少一個游離的(free)rtNTP；以及 (c)具有終端轉移酶活性的酶或核糖酶。
- 如申請專利範圍第1項之組成物，另包括： (d)反應緩衝液。
- 如申請專利範圍第2項之組成物，其中該反應緩衝液包括最終濃度為50 mM的醋酸鉀、20 mM Tris-醋酸鹽、以及10 mM的醋酸鎂。
- 如申請專利範圍第2或3項之組成物，其中該反應緩衝液包括Zn2+ 、Co2+ 或Mn2+ 。
- 如申請專利範圍第1至4項中任一項之組成物，其中該至少一個游離的可逆的終止核苷酸(rtNTP)包括化學可逆的阻擋基團。
- 如申請專利範圍第4項之組成物，另包括試劑，以化學逆轉該阻擋基團。
- 如申請專利範圍第6項之組成物，其中該試劑為路易士酸。
- 如申請專利範圍第7項之組成物，其中該路易士酸包括CoCl2 。
- 如申請專利範圍第1至8項中任一項之組成物，其中該化學可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基(2-nitrobenzyl group)、胺基、疊氮基甲基(azidomethyl group)或烯丙基。
- 如申請專利範圍第1至8項中任一項之組成物，其中該化學可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基(2-nitrobenzyl group)。
- 如申請專利範圍第1至10項中任一項之組成物，其中該至少一個游離的可逆的終止核苷酸(rtNTP)包括光可逆的阻擋基團。
- 如申請專利範圍第1至11項中任一項之組成物，其中該光可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基、丹磺醯基(dansyl group)、對羥基苯甲醯甲基(p-hydroxyphenacyl group)、或7-甲氧基-4-甲基香豆素基(7-methyoxy-4-methylcoumarin group)。
- 如申請專利範圍第1至11項中任一項之組成物，其中該光可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基。
- 如申請專利範圍第1至13項中任一項之組成物，其中該引子包括5’修飾。
- 如申請專利範圍第14項之組成物，其中該5’修飾包括可選擇的標記(selectable tag)。
- 如申請專利範圍第15項之組成物，其中該可選擇的標記是鍵結或雜交至該引子。
- 如申請專利範圍第16項之組成物，其中該可選擇的標記是鍵結或雜交至基材。
- 如申請專利範圍第17項之組成物，其中該基材包括平坦表面或珠。
- 如申請專利範圍第18項之組成物，其中該基材包括玻璃、聚合物、或基質。
- 如申請專利範圍第19項之組成物，其中該基材包括聚合物，以及其中該聚合物包括聚丙烯醯胺凝膠。
- 如申請專利範圍第17至20項中任一項之組成物，其中該基材包括固定件(anchor)。
- 如申請專利範圍第14至21項中任一項之組成物，其中5’修飾包括生物素(biotin)。
- 如申請專利範圍第22項之組成物，其中該基材包括珠，其中該珠包括聚丙烯醯胺凝膠，其中該聚丙烯醯胺凝膠包括固定件，以及其中該固定件包括抗生物素蛋白(avidin)或鏈黴親和素(streptavidin)。
- 如申請專利範圍第1至23項中任一項之組成物，其中該引子包括去氧核醣核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、胺基酸、或其之任何組合。
- 如申請專利範圍第1至24項中任一項之組成物，其中該引子包括至少一個非天然存在的鹼基或至少一個非天然存在的主鏈(backbone)。
- 如申請專利範圍第1至24項中任一項之組成物，其中該引子包括至少一個非天然存在的鹼基與至少一個非天然存在的主鏈(backbone)。
- 如申請專利範圍第1至26項中任一項之組成物，其中該至少一個非天然存在的鹼基包括dBTP、dKTP、dPTP、dXTP、dZTP、dInDTP、5-氟吲哚基-2’-去氧核糖核苷三磷酸(d5FITP)、5-胺基-吲哚基-2’-去氧核糖核苷三磷酸(dAITP)、5-硝基-吲哚基-2’-去氧核糖核苷三磷酸(dNITP)、5-環己基-吲哚基-2’-去氧核糖核苷三磷酸(dCHITP)、dCEITP、5-苯基吲哚基-2’-去氧核糖核苷三磷酸(d5PhITP)、5-萘基吲哚基-2’-去氧核糖核苷三磷酸(d5NapITP)、或d5AnITP。
- 如申請專利範圍第1至26項中任一項之組成物，其中該至少一個非天然存在的主鏈包括環己烯核酸(cyclohexenyl nucleic acid，CeNA)、阿拉伯核酸(arabinonucleic acid，ANA)、2’-氟-阿拉伯核酸(FANA)、α-L-蘇型呋喃糖基核酸(α-L-threofuranosyl nucleic acid，TNA)、或是鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)。
- 如申請專利範圍第28項之組成物，其中該LNA包括2’-O,4’-C-亞甲基-β-D-核糖核酸。
- 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該可逆的終止核苷酸(rtNTP)包括化學可逆的阻擋基團。
- 如申請專利範圍第30項之組成物，其中該化學可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基、胺基、疊氮基甲基、或烯丙基。
- 如申請專利範圍第30項之組成物，其中該化學可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基。
- 如申請專利範圍第30項之組成物，其中該可逆的終止核苷酸(rtNTP)包括光可逆的阻擋基團。
- 如申請專利範圍第33項之組成物，其中該光可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基、丹磺醯基、對羥基苯甲醯甲基、或7-甲氧基-4-甲基香豆素基。
- 如申請專利範圍第33項之組成物，其中該光可逆的阻擋基團包括2-硝基苄基。
- 如申請專利範圍第1至35項中任一項之組成物，其中該引子是在溶液中。
- 如申請專利範圍第1至35項中任一項之組成物，其中該引子連接至基材。
- 如申請專利範圍第37項之組成物，其中該引子直接連接至該基材，以及其中該引子接觸該基材。
- 如申請專利範圍第37項之組成物，其中該引子間接連接至該基材，以及其中該引子接觸與該基材接觸的連接子。
- 如申請專利範圍第37至39項中任一項之組成物，其中該基材是珠。
- 如申請專利範圍第40項之組成物，其中該珠包括玻璃、聚合物、或基質。
- 如申請專利範圍第40或41項之組成物，其中該珠是多孔的。
- 如申請專利範圍第40至42項中任一項之組成物，其中該珠包括聚丙烯醯胺凝膠。
- 如申請專利範圍第37至39項中任一項之組成物，其中該基材是實質上平坦表面。
- 如申請專利範圍第44項之組成物，其中該基材是平坦表面。
- 如申請專利範圍第45項之組成物，其中該基材包括玻璃、聚合物、或基質。
- 如申請專利範圍第45至46項中任一項之組成物，其中該引子是複數個引子，以及其中該複數個引子的各個引子連接至陣列中的該基材。
- 如申請專利範圍第47項之組成物，其中該複數個引子包括具有第一序列的第一引子以及具有第二序列的第二引子，其中該第一序列與該第二序列不同。
- 如申請專利範圍第48項之組成物，其中該複數個引子包括該第一引子的至少一個重複以及該第二引子的至少一個重複。
- 如申請專利範圍第49項之組成物，其中該複數個引子的各個引子包括獨特序列。
- 如申請專利範圍第1至50項中任一項之組成物，其中該酶是終端去氧核苷酸基轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)。
- 如申請專利範圍第1至50項中任一項之組成物，其中該酶是pol θ、pol λ、pol μ、Dpo 1、或引子酶(primase)。
- 如申請專利範圍第1至50項中任一項之組成物，其中該核糖酶是RNA依賴性RNA聚合酶。
- 一種無模板核酸合成方法，包括： (a)獲得如申請專利範圍第1至53項中任一項之組成物； (b)去保護該組成物的該引子的該3’ rtNTP；以及 (c)藉由該組成物的該酶或核糖酶，將該組成物的該至少一個游離的rtNTP併入至該組成物的該引子中， 藉以產生合成核酸。
- 如申請專利範圍第54項之方法，其中該組成物的該至少一個游離的rtNTP是複數個游離的rtNTP。
- 如申請專利範圍第54或55項之方法，其中步驟(b)與(c)是在少於1分鐘完成。
- 如申請專利範圍第56項之方法，另包括在該去保護步驟(b)之後的第一次沖洗以及在該併入步驟(c)之後的第二次沖洗。
- 如申請專利範圍第57項之方法，其中步驟(b)與(c)是在少於1分鐘完成。
- 如申請專利範圍第54至58項中任一項之方法，另包括以下步驟： (d)重複步驟(b)與(c)。
- 如申請專利範圍第59項之方法，另包括以下步驟： (e)在進行步驟(d)之前，移除未併入的rtNTP。
- 如申請專利範圍第54至60項中任一項之方法，其中該引子的該3’ rtNTP包括光可逆的阻擋基團，以及該去保護包括將該光可逆的阻擋基團暴露於光照射。
- 如申請專利範圍第61項之方法，其中該光照射包括UV照射。
- 如申請專利範圍第54至60項中任一項之方法，其中該引子的該3’ rtNTP包括化學可逆的阻擋基團，以及該去保護包括將該化學可逆的阻擋基團暴露於路易士酸。
- 如申請專利範圍第63項之方法，其中該路易士酸包括CoCl2 。
- 如申請專利範圍第54至64項中任一項之方法，其中該引子是在溶液中。
- 如申請專利範圍第54至64項中任一項之方法，其中該引子連接至基材。
- 如申請專利範圍第66項之方法，其中該引子是複數個引子，以及其中該複數個引子的各個引子連接至陣列中的該基材。
- 如申請專利範圍第67項之方法，其中該複數個引子包括具有第一序列的第一引子以及具有第二序列的第二引子，其中該第一序列與該第二序列不同。
- 如申請專利範圍第68項之方法，其中該複數個引子包括該第一引子的至少一個重複以及該第二引子的至少一個重複。
- 如申請專利範圍第68項之方法，其中該複數個引子的各個引子包括獨特序列。
- 如申請專利範圍第54至70項中任一項之方法，另包括以下步驟： 在合成過程中，將該合成核酸接觸隨機引子、非專一性引子、一組隨機短終止的核酸序列、非催化性單股結合蛋白質與非催化性單股結合化合物中的一或多者，以於一或多次的rtNTP之去保護與併入過程中維持實質上線狀構形(linear conformation)、抑制二級與/或三級結構形成、或解開該合成核酸之抑制構形(inhibitory conformation)。
- 如申請專利範圍第71項之方法，其中該非催化性單股結合蛋白質或該非催化性單股結合化合物包括聚胺。
- 如申請專利範圍第72項之方法，其中該聚胺包括精胺(spermine)、五-L-離胺酸(penta-L-lysine)、多分散的聚-L-離胺酸(polydisperse poly-L-lysine)、或精三胺(spermidine)。
- 如申請專利範圍第70至73項中任一項之方法，其中一旦該合成核酸包括至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000個核苷酸或是之間任何數目的核苷酸，則進行該接觸步驟。
- 如申請專利範圍第70至74項中任一項之方法，其中在產生該合成核酸內可能形成二級或三級結構的序列之前，進行該接觸步驟。
- 如申請專利範圍第70至74項中任一項之方法，其中在產生具有足夠長度的序列使得該合成核酸可折疊成實質上非線狀構形之前，進行該接觸步驟。
- 如申請專利範圍第70至76項中任一項之方法，另包括以下步驟： (f)在合成完成之後，從該合成核酸移除該隨機引子、非專一性引子、一組隨機短終止的核酸序列、非催化性單股結合蛋白質與非催化性單股結合化合物中的一或多者。
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