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TW201840854A - 準確診斷牙科疾病的方法與設備 - Google Patents

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TW201840854A
TW201840854A TW107110719A TW107110719A TW201840854A TW 201840854 A TW201840854 A TW 201840854A TW 107110719 A TW107110719 A TW 107110719A TW 107110719 A TW107110719 A TW 107110719A TW 201840854 A TW201840854 A TW 201840854A
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彥燾 招
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Abstract

本發明提供了一種用嵌入ATPS 組分的預塗多孔材料來濃縮和檢測溶液中的靶標分析物的方法和設備。在一個實施例中，水溶性納米粒子包含，但不限於，二氧化矽，氧化鐵，二氧化鈦，氧化銀及其任何組合。在一個實施例中，本發明提供了一種設備，該設備包含 ATPS 組分作為濃縮模塊與作為檢測模塊的橫向流動免疫分析法 (LFA) 相連接。在一個實施例中，當樣品在毛細管作用下被汲取進入裝置和ATPS組分經過相分離，其分析物在流體流動的前沿位置濃縮。然後，已濃縮的分析物經過檢測模塊檢測得到可見測試結果。在一個實施例中，本方法和設備用於檢測導致齲齒的變異鏈球菌。

Description

準確診斷牙科疾病的方法與設備
相關申請 本申請主張 2017年3月28日提交的美國臨時專利申請號62 / 478,021的優先權，該專利申請之全部內容以引用之方式併入本申請案中。本申請案亦引用多個公開出版物，該等公開出版物的全部內容以引用之方式併入本申請案中以更充分地描述本發明所涉及的工藝狀況。
本發明涉及一種提高檢測精度和診斷性能的方法和設備。該方法把與雙液相系統(ATPS) 組分完全嵌入在多孔材料中，允許相自發分離，因此，使用者只需要一步便可純化和濃縮分析物。本發明還提供了一種用診斷檢測設備來執行本發明的方法。
最近幾年發現或發明了許多與疾病有關的新的生物標誌物和藥物。然而，每年仍有許多患者死於這些疾病。造成死亡的原因之一是無法在早期發現疾病或根本沒有發現疾病。許多疾病在他們的早期階段無明顯症狀。當症狀發展到明顯時，患者已經是在晚期或末期。醫療保健專業人員可以為治療患者或挽救他們的生命而做的已經不多。如果這些疾病能及早被診斷出來，患者有可能通過應用正確的步驟或使用適當的藥物完全被治癒。在為患者作檢查時，有經驗的醫護人員可能會懷疑患者有某些疾病。然而，早期患者的生物標誌物濃度通常是很微量，以致無法被檢測到。如果診斷技術不能證實疾病的存在，衛生保健專業人員就不能開出合適的藥品。目前的困境是，疾病相關的生物標誌物存在於患者身上，但無法被檢測到。治療疾病的藥物雖然存在，但沒有被醫生處方。所有這些問題都是由於不能及早檢測到疾病造成的。
檢測濃度極微的分析物是否存在是一個巨大的挑戰。分析物可以是一種疾病的生物標記物，如游離循環DNA (ccfDNA)，游離循環腫瘤DNA (ctDNA) 或蛋白質，可能存在於患者的血液，唾液，尿液或其他體液中。如果濃度過低，許多本發明的診斷或檢測方法可能會錯誤地報導分析物不存在。如果分析物濃度極低，PCR 和 ELISA 等診斷的黃金標準也可能產生假陰性結果。
從液體活檢中提取的游離DNA (cfDNA) 已成為受很多病理歡迎的生物標誌物。例如，cfDNA 可能從凋亡或壞死的腫瘤細胞中被釋放出來，它可以用來監測癌症的進展和復發，其潛在的靈敏度比目前的黃金標準成像法更好，如電腦斷層掃描 (CT)，正電子發射斷層掃描 (PET) 和磁共振成像 (MRI)。與來自實體腫瘤區域的腫瘤活檢相比，液體活檢是無侵害性的，可以於多個時間點收集，並能獲得更能代表腫瘤多樣性的 cfDNA，這有助於識別耐藥性突變。
此外，胎兒的 cfDNA 可以顯示懷孕期間的各種異常情況，如非整倍體，這比目前產前檢測方法如絨膜絨毛取樣和羊膜穿刺術更早，而且不會引發的流產風險。心臟移植患者的液體活檢可以顯示捐獻者的 cfDNA，這是一個警告信號，表示病人可能在移植術後的數周或數月產生排斥。
儘管近年來發現和發明了許多與疾病相關的新的生物標誌物，由於這些新的生物標誌物的診斷測試，如 cfDNA 測試，缺乏敏感性和特異性，並未在常規臨床中採用。在生物標誌物存在量低的時，準確的檢測取決於能否將生物標記與背景分離並濃縮的方法。取決於分離方法，問題可能會因爲片段大小的差異和受測試抑制劑的影響而變得更複雜。
文獻報導了很多可以濃縮游離DNA (cfDNA) 和其他癌症生物標記物的純化產品。然而，這些昂貴的試劑盒往往受制於可以處理的最大樣品量，以及在血液樣品堵塞之前可以純化的DNA量。專利 WO2017041030 中公開了一種使用嵌入ATPS的多孔材料來濃縮分析物的方法。不幸的是，用於檢測導致齲齒的主要細菌 (變異鏈球菌) 濃縮的倍數只有大約10到60倍。這很難滿足齲齒診斷對準確度和靈敏度的要求。能夠達到濃縮的倍數60倍以上的優化方法和設備是非常需要的。
為了克服這些限制，本發明提供了一種改進的方法和設備，用於從樣品中純化靶標分析物，並將純化的靶標分析物濃縮，以供進一步分析，上述操作可以在一步中簡單快速地完成。不需要複雜的設備。使用嵌入ATPS的多孔材料，本發明提供的方法和設備可以同時執行許多工序，包含細胞裂解，分離靶標生物分子，移除非靶標生物分子和雜質，並濃縮靶標生物分子。濃縮生物分子或移除抑制劑以提高檢測精度和診斷性能。
使用嵌入 ATPS 的多孔材料，本發明的方法和設備可以從樣品中純化靶標分析物，並將其濃縮到100倍或以上。
總的來說，本發明的方法和設備可以提高對生物分子的檢測和定量的準確性、靈敏度和效率，因此能夠提高各種需要依賴生物分子作檢測和/或定量的技術分析或診斷的性能。如果早期發現疾病，許多危及生命的疾病就會痊癒。
本發明涉及一種提高檢測精度和診斷性能的改進方法和設備。本發明的方法和設備涉及把雙液相系統（ATPS) 的組分完全嵌入在多孔材料中，允許相自發分離，因此，使用者只需要一步便可純化和濃縮分析物。
在一個實施例中，本發明提供了一種使用嵌入ATPS組分和預塗的多孔材料對溶液中的靶標分析物進行濃縮和檢測的方法和設備。水溶性納米粒子被預塗在多孔材料上。水溶性納米粒子包含但不限於二氧化矽、氧化鐵、二氧化鈦、氧化銀及其任何組合。
在一個實施例中，本發明提供了一種設備，其包含濃縮模塊 ATPS與檢測模塊橫向流動免疫分析 (LFA) 相連接。在一個實施例中，檢測模塊安裝在帶有視窗和金納米探針的塑膠外殼中。當樣品隨毛細管作用被汲取到設備中，其與ATPS 組分一起經過相分離，分析物會在流體流動的前沿位置被濃縮。然後，已濃縮的分析物經過LFA 模塊檢測而得到可見測試結果。
前面的概述，以及本發明以下的詳細描述，在結合附圖一起閱讀時將可以更好地理解。所附圖示只為說明本發明的目的，而不應受限制。本發明不限於所示的精確安排和手段。
在下面的描述中，描述了本發明的幾個實施例。為解釋起見，提出了具體的配置和細節，以便對實施例提供透徹的理解。此外，對於一個詞的複數或單數形式，以及說明實施例的方向程度被描述為“頂部”，“底部”，“前面”，“後面”，“左”，“右” 之類的，這些字眼是幫助讀者理解實施例，並不意味著要限制本發明。對於本領域的技術人員來說，本發明可以在沒有具體細節的情況下被實踐。以下的實施例讓本發明更容易理解，本領域技術人員將很容易明白，具體的例子只是為了說明目的，而不應被隨後的申請專利範圍所限制。應當指出的是，“包含”或“包括”這一過渡性術語是“包容性的”或“具有特性的”，是包容性的或開放式的，並且不排除額外的、未列舉的元素或方法步驟。
本發明涉及一種提高檢測精度和診斷性能的改進方法和設備。本發明的方法和設備涉及把雙液相系統 (ATPS) 的組分完全嵌入在多孔材料中，允許自發相分離，因此，使用者只需要一步便可純化和濃縮分析物。
在一個實施例中，本發明提供了一種使用嵌入ATPS組分的預塗多孔材料對溶液中的靶標分析物進行濃縮和檢測的方法和設備。水溶性納米粒子被預塗在多孔材料上。水溶性納米粒子包含但不限於二氧化矽、氧化鐵、二氧化鈦、氧化銀及其任何組合。
在一個實施例中，本發明提供了一種設備，其包含濃縮模塊 ATPS與檢測模塊橫向流動免疫分析法 (LFA) 相連接。在一個實施例中，檢測模塊安裝在帶有視窗和金納米探針的塑膠外殼中。當樣品隨毛細管作用被汲取到設備中，其與 ATPS 組分一起經過相分離，分析物會在流體流動的前沿位置被濃縮。然後，濃縮的分析物經過LFA 模塊檢測而得到可見的測試結果。
在一個實施例中，本發明提供了一種可提高各種檢測和診斷技術性能的方法，例如，在準確性、靈敏度和效率方面。
在一個實施例中，本發明還提供了一種使用診斷檢測設備來執行本發明的方法。樣品和分析物 的 種類
在一個實施例中，本發明的方法和設備可以將靶標分析物從非靶標分子中分離出來 (例如，天然来源的小分子和大分子可能干擾靶標分析物的檢測或定量分析)，從而得到更準確的檢測和診斷。
在一個實施例中，本方法和設備適用於任何樣品類型。在一個實施例中，樣品包含但不限於血液、血漿、血清、組織、細菌、病毒、RNA 病毒、塗片、細菌培養、細胞培養 (如細胞懸浮物和黏附細胞)，尿液、唾液、糞便和身體分泌物 (如淚水、痰、鼻咽粘液、陰道分泌物和精液)、聚合酶鏈反應 (PCR) 混合物和體外核酸修飾反應混合物。
在一個實施例中，用本發明的方法和設備來純化和濃縮來自血液的靶標分析物。本方法能夠溶解血細胞使釋放胞內物質，將靶標物與非靶標分子 (包含細胞碎片) 分離，同時將靶標分析物濃縮在一起。
在一個實施例中，用本發明的方法和設備從唾液或尿液中純化和濃縮靶標生物標誌物。如圖 4顯示，本發明適用於尿液和唾液。儘管額外的有機和無機成分存在於其他樣品中，但濃縮現象與 PBS 相似。此外，多孔材料可以過濾掉任何會干擾 LFA 性能的大型分子。
在一個實施例中，靶標分析物包含但不限於蛋白質、核酸、碳水化合物、脂質、細菌、病毒和納米粒子等。
在一個實施例中，靶標分析物是一種游離分子，包含但不限於游離DNA (ccfDNA)、游離蛋白、外泌體和在主體體液中循環的游離分子。在一個實施例中，生物標記物是依附在細胞表面或包含在細胞中的分子。
在一個實施例中，靶標分析物是各種類型的核酸 (例如，DNA 包含 cDNA；RNA 包含 mRNA 和 rRNA)、形式 (如單鏈的，雙股的，盤繞的，作為一個質粒，非編碼或編碼) 和長度 (如寡核苷酸、基因、染色體和基因組DNA)，起源於主體或外源體或兩者。
在一個實施例中，靶標分析物是一種蛋白質，它是一種肽或多肽，包含完整的蛋白質分子、降解的蛋白質分子和蛋白質分子的消化片段。在一個實施例中，生物標記物包含但不限於抗原、受體和抗體，起源於主體或外源體或兩者。
在一個實施例中，靶標分析物是一個小分子，如代謝物。在一個實施例中，代謝產物是與疾病相關的代謝物，它標明疾病的存在或程度或健康情況。在一個實施例中，代謝產物是與藥物有關的代謝物，如一種藥物副產品，其水平隨藥物的主體體內消耗而發生變化。
在一個實施例中，靶標分析物來源於主體自己 (例如從任何器官、組織或細胞中衍生或釋放的分子)、外源體 (病原體如與某種疾病有關的病毒或與細菌)。或來源於由該主體所攝取的食物或藥物。
在一個實施例中，靶標分析物是由腫瘤或癌症產生的分子，或由主體的身體對腫瘤或癌症作出的反應。
在一個實施例中，靶標分析物通常不能在健康的主體中發現。在一個實施例中，靶標生物標記物是一種通常能在健康的主體中發現的分子，但它的濃度水平反映出某種疾病或健康情況。雙液相 系統 ( ATPS)
在一個實施例中，提供了一個完全被嵌入在多孔材料中的雙液相系統 (ATPS)，用於純化和濃縮樣品中的靶標分析物。
在一個實施例中，ATPS 組分完全嵌入在多孔材料中，允許自發相分離，因此，使用者只需一步即可純化和濃縮分析物。
在一個實施例中，ATPS 的兩個組分完全嵌入在預塗水溶性納米粒子的多孔材料中。
在一個實施例中，ATPS 在多孔材料 (如紙張) 上被使用，當ATPS的兩相溶液流經多孔材料時，ATPS 的兩個相會分離。因為兩個相具有不同的物理化學性質，所以它們在多孔材料上的流動的速度不同。混合物中的不同分子會因為其不同的性質而在兩個相之間分配，因此，只需要最簡單的設備和人力，便可以利用ATPS來分離和濃縮靶標生物標記物。相可以分離是因為依賴等溫動力學原理和毛細管作用使液體流動。過程完全不需要電源或設備。
本發明的優點是可以輕易地獲得高純度和濃度的靶標分析物，無需進一步純化或濃縮便可以直接應用在下游分析上。
本發明提供的方法和設備是穩定性強、價格低廉、簡單、易於處理、安全、方便使用、快捷的。本方法能夠純化和濃縮靶標分析物，而且可以確保應用在下游的分析結果不會受到原樣品中雜質的影響。由於本發明不需要任何額外的電源、複雜的儀器或電子硬件來操作，因此它可以提供快速簡便的快速核酸分離和純化方法。
由於本發明的獨特功能，本發明可以方便快捷地純化和濃縮靶標分析物，而無需使用額外電源或複雜儀器，並且適用於含靶標分析物量非常低或體積小的樣品。此外，本方法易用於自動化上，包含高通量篩選體系。設計嵌入 ATPS 的多孔材料
在一個實施例中，本發明提供了一種嵌入ATPS組分的多孔材料。在本發明中可以使用各種ATPS，包含但不限於聚合物-聚合物 (如 PEG-右旋糖酐)、聚合物-鹽 (如 PEG-鹽) 和膠束 (Triton X-114)。多孔材料可以使用任何可以吸收和轉移液體的合適的多孔材料。本發明適用的多孔材料包含但不限於玻纖紙、棉基紙、其他類型的紙張、聚合物泡沫塑膠、纖維素泡沫塑膠、其他類型的泡沫塑膠、人造絲織物、棉織物、其他類型的織物、木材、石材和任何其他能吸收和轉移液體的材料。
在一個實施例中，多孔材料是商用的或由內部製造的。
圖 1 說明了三家供應商的幾種類型的多孔材料在嵌入了ATPS後的分離能力 (玻纖紙、棉基紙、單層基質紙和聚烯烴泡沫墊) 。靶標分析物是用紫色表示的。如圖1所示，來自供應商1的 玻纖紙 FG1、來自供應商2 的玻纖紙FG1 和 玻纖紙FG2，和來自供應商3 的聚烯烴泡沫墊，在流體流動的前沿位置有深紫色，它們都是濃縮能力最好的。製備預塗水溶性 納米粒子的多孔材料
在一個實施例中，本發明提供了一種使用嵌入ATPS組分的預塗多孔材料對溶液中的靶標分析物進行濃縮和檢測的方法和設備。
在一個實施例中，本發明提供的多孔材料是嵌入ATPS組分和預塗了水溶性納米粒子的。預塗多孔材料能夠通過提高ATPS在多孔材料上的粘附性和促進 ATPS 在多孔材料的嵌入程度，最後顯著地提高靶標分析物的濃度。
在一個實施例中，本發明的多孔材料被預塗了水溶性納米粒子。水溶性納米粒子包含但不限於二氧化矽、氧化鐵、二氧化鈦、氧化銀及其任何組合。
在一個實施例中，多孔材料包含表面和多個孔隙/毛細管系統。在一個實施例中，多孔材料的表面預塗了水溶性納米粒子。在另一個實施例中，多孔材料的孔隙/毛細管系統預塗了水溶性納米粒子。在另一個實施例中，多孔材料的表面和孔隙/毛細管系統都預塗了水溶性納米粒子。在一個實施例中，多孔材料的表面和孔隙/毛細管系統都預塗了二氧化矽。
水溶性納米粒子 (如二氧化矽) 具有正電荷和負電荷，對 ATPS 與多孔材料的分子間的相互作用起著重要影響。本發明發現，預塗了水溶性納米粒子的多孔材料可顯著促進 ATPS 嵌入在多孔材料上的效率。ATPS 在多孔材料上的穩定性也較好，最終提高了濃度。在一個實施例中，本發明所達到的濃縮倍增可達100倍或更多。
在一個實施例中，多孔材料，例如多孔玻纖紙，是塗了水溶性納米粒子的，如二氧化矽。由以下過程製備：二氧化矽溶解在水溶液中，濃度5M。多孔玻纖紙浸泡在5M 二氧化矽水溶液中，劇烈攪拌一小時。在 80o C 下保持24小時。然後取出並用清水衝洗兩次，最後在壓縮空氣中乾燥。調整 濃 縮 倍 數
在一個實施例中，多孔材料中 ATPS 組分的相對量可以調整。
通過改變嵌入在多孔材料上的ATPS組分的量，即兩個相的體積比，靶標生物標記物可以優先在一個相中被濃縮。在一個實施例中，靶標分析物被保留在ATPS的流動前沿位置，然後收集這些分析物，並可選擇使用適當的技術作進一步分析。在本中所提供的一個實施例中，靶標分析物在嵌入了ATPS的多孔材料的頂部被純化，與沒有嵌入ATPS的對照紙疊相比，濃縮倍數增加了多達50-100倍。
在一個實施例中，可根據需要調整多孔材料上的 ATPS 組分的順序。在一個實施例中，一個或多個組分可以被嵌入到多孔材料上。
為了更好地量化與本發明相關的發明，本發明開發了一種分析方法，以評估嵌入在多孔材料上的ATPS 組分的相對量與所能達到的濃縮倍數之間關係。通過調整ATPS 兩個組分的相對量，可以選擇和微調濃縮倍數。
在一個實施例中，將 ATPS 組分整合到多孔材料中，ATPS 組分在水中 (或適當的緩衝液) 是可溶性的，在一定比例下被應用在多孔材料上。然後將多孔材料放置在凍幹機中除去水，從而使ATPS 組分直接被嵌入在多孔材料上。當樣品被加入到多孔材料後，ATPS 組分立即進行補液，從而將樣品中的分子分離，並將靶標分析物在流體流動的前沿位置濃縮，而無需任何外部動力或設備來提供推動力。
如圖 3所示，測試了兩種ATPS 的組合 (膠束ATPS和聚合物/鹽ATPS)，靶標分析物的濃度可達到100倍或更多。同樣數量的紫色分析物被加入到嵌入了不同量的 ATPS 組分的 多孔材料上，以及不加ATPS 的多孔材料作為一個對照。在對照中，淺紫色的分析物被均勻分佈在多孔材料上。另一方面，在嵌入了ATPS的多孔材料中，分析物可以在流體流動的前沿位置濃縮，如深紫色所示。本文的資料表明，濃度倍數可達到30倍 至100倍之間。更重要的是，這裡的資料表明，通過調整嵌入在多孔材料上的 ATPS 組分的比率，本發明可以根據需要調整濃度倍數。此外，資料表明，多種 ATPS 組分 (聚合物/鹽體系和膠束體系) 嵌入在多孔材料中可以實現純化和濃縮分析物。其他聚合物/鹽，膠束，聚合物/聚合物體系也可以同樣實施與進一步優化。
在一個實施例中，本發明提供了一種設備，包含嵌入 ATPS 的多孔玻纖紙，它由聚合物-聚合物，如 PEG-右旋糖酐組成。當含有多個分析物的樣品加入到多孔玻纖紙上的ATPS 時，多孔玻纖紙使含分析物的組分優先流動，跑在其他 ATPS 組分前面。因此，含靶標分析物的ATPS 組分在流體流動的前沿位置濃縮。
在一個實施例中，本發明提供了一種設備，包含嵌入ATPS的預處理的多孔玻纖紙，它由聚合物-鹽基，如PEG 鹽組成。當含有多個分析物的樣品加入到預處理的多孔玻纖紙上的ATPS 時，多孔玻纖紙使含分析物的組分優先流動，跑在其他 ATPS 組分前面。因此，含靶標分析物的ATPS 組分在流體流動的前沿位置濃縮。
在一個實施例中，本發明提供了一種設備，包含嵌入ATPS的多孔玻纖紙，它由膠束基表面活性劑溶液組成的。當含有多個分析物的樣品加入到多孔玻纖紙上的ATPS 時，多孔玻纖紙使含分析物的組分優先流動，跑在其他 ATPS 組分前面。因此，含靶標分析物的ATPS 組分在流體流動的前沿位置濃縮。
在一個實施例中，這裏使用的緩衝液包含，但不限於，磷酸鹽緩衝液 (PBS)，TE 緩衝液。在本發明中，優選緩衝液為 9.57 mM PBS 緩衝液 (8 mM 氯化鈉，0.2 mM 氯化鉀，1.15 mM磷酸磷酸鈉，0.2 mM磷酸二氫鉀，溶液 pH 值為 7.35-7.65)。本發明中，首選緩衝液為 TE 緩衝液，含有2% 牛血清白蛋白 (BSA)、0.1% Tween-20、0.1%PEG 和20mM Tris，pH 值為 7.5。
在一個實施例中，多個 ATPS 組分被合併到多孔材料中，以控制靶標分析物的濃度倍數。
在一個實施例中，優化聚合物/鹽 ATPS 組分的比率來控制濃度倍數。
在一個實施例中，優化聚合物/聚合物 ATPS 組分的比率來控制濃度倍數。
在一個實施例中，優化膠束 ATPS 組分的比率來控制濃度倍數。
在一個實施例中，嵌入在多孔材料上的 ATPS允許生物分子在流體流動的前沿位置濃縮。調整ATPS 組分的比率以達到濃度倍數在10至和100倍之間。
在一個實施例中，有各種不同 ATPS 體系，包含但不限於聚合物 (如 PEG-右旋糖酐)、聚合物-鹽 (如 PEG-鹽) 和膠束 (如TritonX-114)。第一和/或第二組分包含聚合物。聚合物包含但不限於聚乙二醇，如疏水改性聚亞烷基二醇，聚（氧化烯）聚合物，聚（氧化烯）共聚物，如疏水改性的聚（氧化烯）共聚物，聚乙烯醇吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯醇己內醯胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性劑、烷氧基化澱粉、烷氧基化纖維素、烷基羥烷基纖維素、有機矽改性聚醚、聚N-異丙基丙烯醯胺。在另一個實施例中，第一個聚合物包含聚乙二醇、聚丙烯乙二醇或右旋糖酐。
在一個實施例中，第一組分或第二組分的聚合物濃度在大約0.01% 到大約90% 的範圍內(w/w) (按水溶液的總重量)。在各實施例中，聚合物溶液的濃度是約0.01% w/w，約0.05% w/w，約0.1% w/w，約0.15% w/w，約0.2% w/w，約0.25% w/w，約0.3% w/w，約0.35% w/w，約0.4% w/w，約0.45% w/w，約0.5% w/w，約0.55% w/w，約0.6% w/w，約0.65% w/w，約0.7% w/w，約0.75% w/w，約0.8% w/w，約0.85% w/w，約 0.9%) w/w，約0.95% w/w，或約1% w/w。在某些實施例中，聚合物溶液的濃度是約為1% w/w，約2% w/w，約3% w/w，約4% w/w，約5% w/w，約6% w/w，約7% w/w，約8% w/w，約9% w/w，約10% w/w，約 1 1% w/w，約12% w/w，約13% w/w，約14% w/w，約15% w/w，約16% w/w，約17% w/w，約18% w/w，約19% w/w，約20% w/w，約21% w/w，約22% w/w，約23% w/w，約24% w/w，約25% w/w，約26% w/w，約27% w/w，約28% w/w，約29% w/w，約30% w/w，約31% w/w，約32% w/w，約33% w/w，約34% w/w，約35% w/w，約36% w/w，約37% w/w，約38% w/w，約39% w/w，約40% w/w，約41% w/w，約42% w/w，約43% w/w，約44% w/w，約45% w/w，約46% w/w，約47% w/w，約48% w/w，約49% w/w，約50% w/w。
在一個實施例中，第一個和/或第二個組分包含鹽，鹽包含但不限於親液鹽、離液鹽、含有陽離子的無機鹽，如直鏈或支鏈三甲基銨、三乙基銨、三丙基銨，三丁基銨，四甲基銨，四乙基銨，四丙基銨和四丁基銨，和陰離子，如磷酸鹽，硫酸鹽，硝酸鹽，氯化物和碳酸氫。在另一實施例中，鹽選自氯化鈉、磷酸鈉、磷酸鉀、硫酸鈉、檸檬酸鉀、硫酸銨、檸檬酸鈉、醋酸鈉和其組合組成。其他鹽，例如醋酸銨，也可以使用。
在一個實施例中，鹽總濃度在0.001至100mM 的範圍內。本領域的技術人員會明白，在 ATPS中所需的鹽的量會受到聚合物分子量、濃度和物理狀態的影響。
在各種實施例中，鹽相選自鹽溶液，濃度約為0.001% 到90% w/w.在各種實施例中，鹽溶液濃度約0.01% w/w，約0.05% w/w，約0.1% w/w，約0.15% w/w，約0.2% w/w，約0.25% w/w，約0.3% w/w，約0.35% w/w，約0.4% w/w，約0.45% w/w，約0.5% w/w，約0.55% w/w，約0.6% w/w，約0.65% w/w，約0.7% w/w，約0.75% w/w，約0.8% w/w，約0.85% w/w，約 0.9%) w/w，約0.95% w/w，或約1% w/w。在某些實施例中，鹽溶液濃度約為1% w/w，約2% w/w，約3% w/w，約4% w/w，約5% w/w，約6% w/w，約7% w/w，約8% w/w，約9% w/w，約10% w/w，約 11% w/w，約12% w/w，約13% w/w，約14% w/w，約15% w/w，約16% w/w，約17% w/w，約18% w/w，約19% w/w，約20% w/w，約21% w/w，約22% w/w，約23% w/w，約24% w/w，約25% w/w，約26% w/w，約27% w/w，約28% w/w，約29% w/w，約30% w/w，約31% w/w，約32% w/w，約33% w/w，約34% w/w，約35% w/w，約36% w/w，約37% w/w，約38% w/w，約39% w/w，約40% w/w，約41% w/w，約42% w/w，約43% w/w，約44% w/w，約45% w/w，約46% w/w，約47% w/w，約48% w/w，約49% w/w，約50% w/w。
在一個實施例中，ATPS 中的第一個組分和/或第二個組分包含與水不相容的溶劑。在某些實施例中，溶劑包含非極性有機溶劑。在某些實施例中，溶劑包含油。在某些實施例中，溶劑選自戊烷、環戊烷、苯、1,4二惡烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿、甲苯和己烷。
在一個實施例中，ATPS 中的第一個組分和/或第二個組分包含膠束溶液。在某些實施例中，膠束溶液包含非離子表面活性劑。在某些實施例中，膠束溶液包含洗滌劑。在某些實施例中，膠束溶液包含Triton-X。在某些實施例中，膠束溶液包含類似於Triton-X的聚合物，如 Igepal CA-630 和 Nonidet P-40。在某些實施例中，膠束溶液主要由Triton-X組成。
在一個實施例中，ATPS 中的第一個組分包含膠束溶液，液相中的第二組分包含聚合物。在一個實施例中，液相中的第二組分包含膠束溶液，液相中的第一組分包含聚合物。在一個實施例中，液相中的第一組分包含膠束溶液，液相中的第二組分包含鹽。在一個實施例中，液相中的第二組分包含膠束溶液，第一組分包含鹽。在一個實施例中，膠束溶液為Triton-X 溶液。在一個實施例中，第一組分包含第一聚合物，第二組分包含第二聚合物。在一個實施例中，第一/第二聚合物從聚乙二醇和右旋糖酐中選擇。在一個實施例中，第一組分包含聚合物，第二組分包含鹽。在一個實施例中，第二組分包含聚合物，第一組分包含鹽。在某些實施例中，第一組分包含聚乙二醇，第二組分包含磷酸鉀。在某些實施例中，第二組分包含聚乙二醇，第一組分為磷酸鉀。在一個實施例中，第一組分包含鹽，第二組分包含鹽。在一個實施例中，第一組分包含親液鹽，第二組分包含離液鹽 。在某些實施例中，第二組分包含親液鹽和第一組分包含離液鹽。
在一個實施例中，第一個組分與第二個組分的比率在1:1 到1:1000 之間。在某些實施例中，第一個組分與第二個組分的比率選自大約 1:1，約 1:2，約 1:3，約 1:4，約 1:5，約 1:6，約 1:7，約 1:8，約 1:9，約1:10。在某些實施例中，第一個組分與第二個組分的比率選自大約1:20，約1:30，約1:40，約1:50，約 1:60，約1:70，約 1:80，約 1:90，約 1:100。在某些實施例中，第一個組分與第二個組分的比率選自大約 1:200，約 1:300，約 1:400，約 1:500，約 1:600，約 1:700，約 1:800，約 1:900，約1:1000。
在一個實施例中，第二個組分與第一個組分的比率選自大約 1:1，約 1:2，約 1:3，約 1:4，約 1:5，約 1:6，約 1:7，約 1:8，約 1:9，約1:10。在某些實施例中，第二個組分與第一個組分的比率選自大約 1:20，約1:30，約 1:40，約 1:50，約 1:60，約 1:70，約 1:80，約 1:90，約1:100。在某些實施例中，第二個組分與第一個組分的比率選自大約 1:200，約 1:300，約 1:400，約 1:500，約 1:600，約 1:700，約 1:800，約 1:900，約 1:1000。已分離的分析物的下游處理
在各種實施例中，本發明可與一個或多個工序或試劑結合使用，用於洗滌和洗脫保留在多孔基質中分析物，或保存分析物作後處理。
在一個實施例中，分析物與 ATPS接觸以後，一次或多次用洗滌緩衝液洗ATPS，以除去非靶標分析物或留在多孔基質中的雜質。洗滌緩衝液可包含不同離子強度、pH 值或含有添加劑的洗滌溶液。洗滌緩衝液包含但不限於 20%-50% 乙醇和 20%-50% 異丙醇； 約 0.1-4.0M鹽酸胍的溶液，洗滌劑和達到約80% 乙醇；或約80% 乙醇。
在一個實施例中，靶標分析物被加到ATPS 的多孔基質上並流向多孔基質的一端。在一個實施例中，本發明所分離的靶標分析物使用適當的洗脫緩衝液或去離子水洗脫多孔基質。在一個實施例中分離的靶標分析物不洗脫，但保存在多孔基質中以便將來使用。例如，使用本發明分離分析物之後，含有靶標分析物 (如 DNA) 的多孔材料 (紙) 被烘乾和保存。在一個實施例中，在多孔基質上保存的分析物可以洗脫作進一步分析或處理。洗脫緩衝液的選擇可能取決於對純化生物標記物的預期用途。核酸類分析物的適合洗脫緩衝液的例子包含，但不限於，TE緩衝液，重/雙蒸餾水和 PCR 緩衝液。在一個實施例中，在多孔紙上的已純化分析物被洗脫在含有TE 緩衝液的試管中 (10 mM Tris-Cl，1 mM EDTA溶液，pH 7.5)，已純化的分析物在相對較小的體積內回收，例如，低於 10 ul 。
本發明獲得的分析物可以廣泛地在下游被應用，如法醫學、診斷學、治療學中對生物標記物的檢測或分析，以及實驗室處理，如測序，擴增，反轉錄，標記，消化，免疫印跡法等。預計本發明能夠提高分析物在下游的特性或處理步驟。
在一個實施例中，分析物在下游應用包含但不限於任何檢測、分析或診斷過程，包含檢測或定量已純化的分析物。在一個實施例中，與本發明結合的檢測、分析或診斷過程，包含但不限於在商業臨床實驗室執行，以及在實驗室執行測序，擴增 (如 PCR，逆轉錄PCR (RT-PCR)，實時PCR (real-time PCR)，實時逆轉錄 (real-time RT-PCR)，反轉錄，標記，消化，免疫印跡法，ELISA，放射免疫 (RIA)，免疫分析法，酶分析法，GC/MS，蛋白質生物學等方法，等等。
在一個實施例中，本發明所獲得的分析物可以通過 LFA 來進行分析。診斷檢測設備
在一個實施例中，本發明提供了一種設備，其包含濃縮模塊 ATPS與檢測模塊橫向流動免疫分析法 (LFA) 相連接。在一個實施例中，檢測模塊安裝在帶有視窗和金納米探針的塑膠外殼中。當樣品隨毛細管作用被汲取到設備中，其與 ATPS 組分一起經過相分離，分析物會在流體流動的前沿位置被濃縮。然後，濃縮的分析物經過LFA 模塊檢測而得到可見的測試結果。
在一個實施例中，本發明的設備與其他診斷檢測 (如 LFA) 結合在一起。濃縮與檢測靶標分析物之間的無縫銜接使患者或使用者在一個簡單的單一步驟中獲得測試結果。
在一個實施例中，本發明的設備是一個診斷設備，它包含一個 LFA 檢測模塊和一個包含 ATPS 組分的濃縮模塊。
橫向流動免疫分析 (LFA) 方法和設備已經在以前被廣泛地描述了，例如，專利US-4,956,302，Gordon 和Pugh；專利WO 90/06511，H. Buck, et al.；專利US-6,764,825，T. Wang；專利US-5,008,080，W. Brown, et al.；專利US-6,183,972和專利EP00987551A3，Kuo 和 Meritt。這些分析包含檢測和判斷分析物，它是由配體和受體組成的特定結合中的其中一個組分。配體和受體是相關的，受體特定地與配體結合，能夠區分特定的配體或從樣品的其他具有相似特徵的成分區分出配體。免疫分析涉及抗體和抗原之間的反應是一個特定結合的例子。其他的例子包含 DNA 和 RNA 雜交反應以及含有激素和其他生物受體的結合反應。
在一個實施例中，嵌入ATPS 組分在預塗多孔材料上作為濃縮模塊，與橫向流動免疫分析法 (LFA) 結合在一起。
圖 7 本發明濃縮模塊製造過程的一個實施例。多孔材料 (不同材料類型的紙或泡沫墊) 被預塗和用含有 ATPS 的不同溶液處理和用凍幹機乾燥。預塗紙被切成片狀 (或其他形狀)，並有一個尖尖的尖端，便於收集濃縮的相。泡沫墊材料在處理前也先切成片。
如圖 7所示，ATPS 組分被嵌入到多孔材料中。按照圖7所示的一個實施例，在 DI水中的聚合物溶液 (PEG) 被加到以下各種多孔材料的窄孔中，其中包含玻纖紙、棉基紙、專用單層基質紙和聚烯烴泡沫墊。紙的寬度相同，但長度可調，以適應吸收的差異。然後將含有蛋白質的TE緩衝液 (如牛血清白蛋白)、表面活性劑 (Triton X-114)、Tween-20 和 PEG 聚合物，在一定比例下立即隨第一溶液被加入。然後將多孔材料置於凍幹機中以去除溶劑，以將 ATPS 組分直接嵌入多孔材料中。
在一個實施例中，紙切成0.5 cm寬的紙片。紙片被疊起 (例如，每4張紙片成一疊)，並從拐角處切開，形成一個尖尖的尖端，便於收集濃縮成分。然後將此紙疊放置在包含指示劑的緩衝液 (如膠體金) 中，鹽的濃度不同 (5%、4.5% 和 4% w/w 磷酸鉀在磷酸鹽緩衝液中，以取得30倍、50倍 和100倍的濃縮。隨著鹽濃度的降低，濃縮倍數增加。所需鹽的最少量取決於每個獨立的聚合物配方。
圖 8 演示在濃縮模塊中更改 ATPS 組分的位置和順序的可行性，表明預塗多孔材料可以以不同區域被浸泡在聚合物或鹽中 (左) 或聚合物與鹽互相覆蓋成為連續區域 (右)。本發明分兩步處理。第一步是在不同的區域內鹽和聚合物在不同區域乾燥。這類似於將不同的溶液在附近立即乾燥。第二步是先用凍幹機把聚合物區乾燥，然後直接在幹的聚合物上將鹽溶液乾燥，每隔一小時再用凍幹機幹燥一次。這種方法使分析物濃縮。含有分析物的流動緩衝液使ATPS兩個組分在流體流動時吸水補液，導致在設備的前沿位置的紫色指示劑濃縮。在這種情況下，流動緩衝液不需要預先定量ATPS 組分，而且任何液體樣品，包含尿液，唾液等，也可以使用，為使用者(例如，患者) 提供更大的靈活性。
在一個實施例中，凖備了兩個完全相同的多孔材料，分別嵌入聚合物/鹽和膠束，除嵌入在多孔材料上的溶液組分和流動溶液組分外，其他都一樣。為了達到40倍、70倍 和100倍的濃縮倍數，調整嵌入在紙上的含表面活性劑溶液的量和濃度。表面活性劑濃度增加，導致了較高的濃縮倍數。在一個實施例中，含指示劑的磷酸鹽緩衝液在三個濃縮倍數中都作為流動緩衝液。
各種不同多孔材料都可以用做濃縮模塊，各種不同設計能促進分析物濃縮和轉移到 LFA 樣品墊和測試條。在一個實施例中，所有這些設計都可以用毛細管作用汲取大量的體積，並為具體的應用進行優化。
本發明可以以多種型式實現，其中包含圖 6所示。ATPS 濃縮模塊經設計以促進分析物的濃縮和轉移到 LFA 樣品墊和測試帶。該設計可以吸取大量體積的樣品。此外，不同的多孔材料因具體的應用而有不同的設計。在一個實施例中，本發明提供紙疊設計，其中多個多孔材料並排疊起，溶液從紙疊底部垂直向頂部流動。本發明的紙疊設計不限於檢測S. mutans 或本發明所描述的試驗。如文中所述，本發明的一個主要特點是ATPS 組分可以用任何型式嵌入在多孔材料上並浸泡在任何樣品中 (如尿液，唾液，血液，緩衝液等)，相自動分離和濃縮/移除感興趣的分析物。檢測變異鏈球菌
本文提供了用於檢測變異鏈球菌( S. mutans ) 的一步性診斷試驗以証明本發明可用來改善 LFA 的檢測極限。 變異鏈球菌( S. mutans ) 是導致齲齒 (蛀牙) 的主要細菌 [1，2]。因此，濃度對診斷測試至關重要。在這個試驗中，此細菌的檢測極限提高了100 倍，從 106 CFU/ml到 104 CFU/ml，如圖 5所示。將ATPS膠束直接嵌入預塗多孔材料中，將濃縮的組分與 LFA 測試帶結合使用。這種一步法測試也可以用於聚合物/鹽 ATPS。
圖 5 示範了對S. mutans 的檢測極限比單用 LFA 檢測高了100倍。左面板顯示用於測試的3PS 設備的一個實施例 (包含用於測試的ATPS兩組分、一個 LFA 檢測模塊、一個濃縮模塊)。LFA 檢測模塊與濃縮模塊在上游結合。右面板顯示比較了使用沒有濃縮模塊的LFA 檢測模塊 (頂部) 和 3PS 設備 (底部)對 指定濃度的S. mutans 的測試結果。 對照線的存在表示測試的有效性，並且測試線的出現表明了陽性的結果。測試線用黑色箭頭表示。“C”是對照線；“T”是測試線。單獨使用 LFA 檢測模塊中，陰性樣品沒有可見的測試線，確認對照的有效性。在S. mutans 濃度為 106 CFU/ml 的情況下，測試線可見，確認了陽性的結果。但是在 104 CFU/ml 中沒有可見的測試線。在3PS 設備中，陰性樣品的測試線不顯示，確認對照的有效性。在 106 CFU/ml 中，測試線可見，而且測試線強度在 106 CFU/ml比單用 LFA強，這證實了濃縮模塊成功地濃縮了 S. mutans 並顯示檢測S. mutans 的濃度被濃縮了大約100倍。此外，本發明的3PS 設備能夠在 104 CFU/ml 檢測到細菌，這是無法在單用 LFA時可以檢測到的。因此，本發明的3PS 設備能夠實現對S. mutans 的檢測極限有100倍的改進。
在一個實施例中，本發明的診斷測試設備使使用者只需要一個步驟既可以濃縮和檢測分析物。
在一個實施例中，本發明提供了一步的診斷設備，包含 ATPS 組分的濃縮模塊和 LFA 測試的檢測模塊。如圖 2所示，提供了一個診斷測試設備使使用者只需要一個步驟便可濃縮和檢測目標分析物。
本發明的設備使使用者從把樣品放到分析物收集點開始 ，只需要一步。ATPS 組分依附著分析物的收集點，形成濃縮模塊。在一個實施例中，檢測模塊還包含一個塑膠外殼。塑膠外殼包含一個可以顯示測試結果的視窗。在一個實施例中，LFA檢測模塊和金納米探針被包含在塑膠外殼內。濃縮模塊與檢測模塊相連成一個簡單的連結點。兩個模塊之間以膠帶緊密纏繞在一起，並促進流動。在一個實施例中，該設備可以稍微長一些，以容納更多的樣品量。使用者在分析物收集點加入樣品後，樣品經毛細管作用進入設備，ATPS 組分進行了補液而使相分離發生。當流入塑膠外殼時，這些分析物主要在流體流動的前沿位置濃縮。將已濃縮的分析物與金納米探針結合，並通過嵌入式的常規 LFA 檢測模塊進行檢測。與 LFA 試驗相同的可見測試結果將在塑膠外殼的視窗中顯示。通過使用本發明的的設備，使用者一步就能夠得到直觀而準確的測試結果。
在一個實施例中，本發明的3PS 設備可以封裝在盒式外殼中。
如圖 10所示，3PS 設備所包含的盒式外殼，具有許多重要功能： 1) 它保護脆弱的3PS 設備組分免受損壞，避免浪費或無效測試。 2) 它提供了一個直觀式的使用者介面，以支持正確使用3PS 設備； 3) 在專用位置提供的壓力點可以改善測試過程中的整體流動和配合釋放； 4) 3PS 設備的方向確保使用者能夠以正確的方式測試； 5) 它防止使用者接觸到任何在不同墊上脫水的化學品； 6) 保存樣品的樣品槽防止使用者因不斷使用而接觸釋放出來的樣品。
在一個實施例中，3PS 設備的盒式外殼設計可能類似於常規的 LFA 測試盒式外殼的設計。然而，由於3PS 設備能夠處理較大的體積，改善濃縮倍數，其外殼尺寸和樣品槽也比常規的 LFA 測試盒大，以配合額外的容量和流體。在一個實施例中，濃縮模塊與 LFA 檢測模塊整合成一個新設備 (3PS)，它可以處理濃縮和檢測之間的無縫銜接，使使用者能夠實現一步得到結果。在一個實施例中，濃縮模塊能以多種方式整合到 LFA檢測模塊上，包括用膠帶，如圖9所示，封裝在外殼內。在一個實施例中，濃縮模塊可以有不同的大小以容納不同的樣品量。由於3PS 設備的性質，能容納大容量樣本 (例如，5 毫升或以上)。在一個實施例中，濃縮模塊的格式可以更改變，包含本發明顯示的格式。在一個實施例中，本發明的設備是一個平臺設備，除了檢測S. mutans ，也可以有許多不同的應用，包含但不限於檢測衣原體，瘧疾，寨卡病毒等。
在一個實施例中，本發明提供了各種設計，包含兩個垂直方向和兩個水平方向的設計。在一個設計中，設計是面是垂直的，是由一個外殼來保護測試帶和一個獨立的樣品槽，外殻可以和啟動流動聯鎖 (圖 9A)。在另一種設計中，它是垂直方向的，由單一的外殼組成，樣品槽和外殼是不可分割的 (圖 9B)。在另一種設計中，該設備是水平方向的，並有一個大的樣品槽在測試帶上 (圖 9C)。在另一種設計中，該設備還是水平方向，並有一個大的樣品槽在測試帶下，其中測試帶是懸臂的 (圖 9D)。
圖 9中設計的主要差異是： 1) 在圖9A 中，實際測試帶可能暴露於環境中； 2) 在圖9B 中，需要額外的密封膠帶，如橡膠 O型圈； 3) 在圖9C 中，在頂部加樣品，重力使液體從樣品槽往下流到測試帶中. 4) 在圖9D 中，將樣品加到位於測試帶下的樣品槽中，並將懸臂測試帶插入槽中，以允許毛細管引導流動.
在一個實施例中，本發明提到的一種用於濃縮和檢測樣品溶液中的靶標分析物的設備， 包含： (a) 用於保存樣品溶液的樣品槽； (b) 與所述樣品槽相連接的濃縮模塊, 該模塊包含塗了水溶性納米粒子和篏入雙液相系統ATPS的組分, 其中, 當水溶液流經所述多孔材料時，其中一個相溶液比另一個相溶液流動更快，而形成兩個相溶液, 其中樣品溶液通過所述樣品槽引入設備, 所述多孔材料時吸取樣品溶液, 其中樣品溶液中的靶標分析物會分配到流動較快的相溶液中並在所述流動較快的相溶液的前沿位置被濃縮；和 與濃縮模塊相連接的檢測模塊用來檢測靶標分析物，所述檢測模塊包含橫向流動分析測試和結合墊，其中濃縮模塊的多孔材料與結合墊給合起來，其中已濃縮的靶標分析物從多孔材料流到給合墊，並隨後用橫向流動分析測試來分析，出現顏色反應出有靶標分析物的存在。
在這裡所描述的一個實施例中，納米粒子選自二氧化矽， 氧化鐵， 二氧化鈦， 氧化銀， 及其任何組合。
在這裡所描述的一個實施例中，多孔材料選自玻纖紙， 棉基紙， 單層基質紙和聚烯烴泡沫墊。
在這裡所描述的一個實施例中，ATPS 組分選自聚合物， 鹽和表面活性劑。
在這裡所描述的一個實施例中，聚合物選自聚乙二醇， 聚（氧化烯）聚合物， 聚（氧化烯）共聚物， 聚乙烯醇吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯醇己內醯胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性劑、烷氧基化澱粉、烷氧基化纖維素、烷基羥烷基纖維素、有機矽改性聚醚、聚N-異丙基丙烯酰胺。聚乙二醇、聚丙烯乙二醇和右旋糖酐。
在這裡所描述的一個實施例中，鹽選自親液鹽、離液鹽、含有如直鏈或支鏈三甲基銨、三乙基銨、三丙基銨， 三丁基銨， 四甲基銨， 四乙基銨， 四丙基銨和四丁基膦銨陽離子， 及如磷酸鹽， 硫酸鹽， 硝酸鹽， 氯化物和碳酸氫陰離子的無機鹽。在另一實施例中， 鹽選自氯化鈉、磷酸鈉、磷酸鉀、硫酸鈉、檸檬酸鉀、硫酸銨、檸檬酸鈉、醋酸鈉和其組合組成。
在這裡所描述的一個實施例中，表面活性劑選自非離子表面活性劑， 洗滌劑， Triton-X， Igepal CA-630 和 Nonidet P-40。
在這裡所描述的一個實施例中，樣品溶液包含一個或多個血液、血漿、血清、 尿液、唾液、糞便和身體分泌物。
在這裡所描述的一個實施例中，分析物是 DNA， 游離 DNA，循環腫瘤 DNA， 蛋白質， 核酸， 碳水化合物， 脂質， 細菌， 病毒或納米粒子。
在這裡所描述的一個實施例中， ATPS 組分在所述多孔材料上完全分開或部分重疊。
在這裡所描述的一個實施例中，分析物可以被濃縮至100倍以上。
在這裡所描述的一個實施例中，多孔材料格式是多層紙片，紙條的其中一端是一個尖端。
在這裡所描述的一個實施例中，樣品溶液是磷酸鹽緩衝液或具有指示劑的Tris-EDTA緩衝液。
在這裡所描述的一個實施例中，濃縮模塊和檢測模塊是可分離的， 而且都在外殼內， 其中的設備可以選擇性包含橡膠圈用來密封外殼之間的連接處。
在這裡所描述的一個實施例中， 其中的濃縮模塊和檢測模塊是不可分割的。
在整個申請過程中，過渡性術語“包含”與“包含”“含有”或“ 特點是”是同義詞，是包容性的或開放式的，並且不排除額外的、未列舉的元素或方法步驟。
通過參考下面的實施例可以更好地理解本發明。本領域技術人員將很容易理解，所提供的例子僅僅是為了說明目的，而不意味著限制本發明的範圍。本發明由隨後的申請專利範圍作界定。具體實施例 實施例 1 - 嵌入 ATPS的預塗多孔材料
不同的多孔材料，包含玻纖紙、棉基紙、專用單層基質紙和聚烯烴泡沫墊 (寬度2.2 cm和可調的長度) 分別浸泡在 5M二氧化矽水溶液後，劇烈攪拌一個小時。溶液在 80o C 下保持24小時。然後，多孔材料被取出並用水清洗兩次，最後在壓縮空氣中乾燥。
配制好的ATPS 組分在預塗多孔紙上脫水，ATPS 組分是20% (w/w) PEG 4600，2% (w/w) SDS，16% (w/w) Triton-X114 和 18.5%(w/w) 硫酸鈉Na2 SO4 。PEG 溶液 (在DI水中) 被加到多孔材料的每個窄道。50uL TE緩衝液 (包含2% 牛血清白蛋白 (BSA)、0.1% Tween-20 和0.1% PEG、20 mM TE，pH 值 7.5) 立即隨第一個溶液也被加入。根據本發明的實施例，圖7展示了一個典型的過程。
上述嵌入 ATPS 的預塗多孔材料在凍幹機中乾燥1小時，切割成4 cm x 0.5 cm的紙片。然後把紙片疊起 (四張紙片成一疊)，從角落到離末沿位置0.5cm 處的點切開 (形成一個三角形，看見圖 7)。嵌入ATPS的多孔材料然後被浸泡在包含指示劑 (膠體金) 的PBS緩衝液中 (pH 值 7.4)，其包含鹽 (在這裡是磷酸鉀)。在毛細管作用下產生流動。實施例 2- 濃縮唾液中的 DNA
將實施例1中所制備的嵌入 ATPS 組分的預塗多孔玻纖紙，空白紙 (沒有 ATPS 或預塗) 和對照紙 (ATPS 嵌入在沒有預塗的紙上) 都蘸在唾液混合物中，包含pH 值7.4的 PBS 緩衝液和 200 ng/ml的 DNA 分子量標準品。以毛細管作用汲取樣品大約2分鐘，直到溶液到達頂端位置。
允許溶液在紙片上向上流動，在流體流動的前沿位置取樣並通過UV分光光度法進行分析。測量結果與空白紙 (濃度倍數為 1) 的類似實驗進行了比較。請注意，使用的指示劑是膠體金。濃縮倍數在表1中概述。 表1.本發明方法的 DNA 濃縮倍數 實施例 3- 使用 3PS 檢 測 設備
用於 LFA 檢測模塊的： 條狀的硝酸纖維膜上有：1) 濃度為1mg/ml的抗S. mutans 抗體，2) 濃度為0.2 mg/ml蛋白 (牛血清白蛋白，BSA)。按照供應商的指導，膠體金納米粒子與抗S. mutans 抗體結合並用凍幹機乾燥。樣品墊包含浸泡了Tris 緩衝液的樣品墊材料，其包含 2% 牛血清白蛋白BSA，16% 表面活性劑 (Triton X-114)，0.1% PEG 聚合物和20Mm Tris鹽。吸收墊包含未經處理的紙張。在沒有濃縮模塊的情況下單獨使用 LFA 測試，各種材料組裝在粘性的板上，將裝置浸入包含不同濃度的S. mutans 溶液中。並通過直接觀察來分析結果。
用於3PS 設備的： 制備濃縮模塊，300 pL 的表面活性劑 (Triton X-114) 溶液加到預塗的玻纖紙上FG1 (尺寸4cm X 2.2 cm)。該紙片隨後在凍幹機乾燥，切成0.5 cm長的紙片。四張紙片疊成一疊成為濃縮模塊。
前面已經介紹了把濃縮模塊連結到LFA 檢測模塊，檢測模塊的樣品墊和濃縮模塊直接連接。為了將此連接保持並促進流動，膠帶被緊密纏繞在圍繞兩個模塊之間。雖然這個新設備稍長，需要更多的量，但運行測試是相同的。如圖 5所示，使用3PS 設備成功地濃縮了的S. mutans ，並實現了100倍的濃縮倍數。對照線的存在表明了測試的有效性，測試線的存在表明結果呈陽性。測試線用黑色箭頭表示。“C”是對照線；“T”是測試線。僅使用 LFA 檢測模塊進行測試時，陰性樣品沒有可見的測試線，表明對照的有效性。在S. mutans 濃度為 106 CFU/ml 的情況下，檢測線可見，表明結果為陽性。但是，在 104 CFU/ml 濃度下卻沒有可見的測試線。在本發明的3PS 設備中，陰性樣品沒有可見的測試線，表明對照的有效性。當S. mutans 濃度為 106 CFU/ml時，測試線可見，而且測試線顯色度比僅用LFA 檢測強。當S. mutans 濃度為 104 CFU/ml時，測試線依然可見，這證實了濃縮模塊成功地濃縮了S. mutans 並在檢測變異鏈球菌時，濃縮倍數為100。總的來說，實驗結果展示了本發明的3PS 設備能夠檢測到濃度低至 104 CFU/ml的細菌，這是單用 LFA無法檢測得到的。本發明的3PS 設備將S. mutans 的檢測極限降低了100倍。 參考： 1. Aas, J.A., Paster, B.J., Stokes, L.N., Olsen, I. and Dewhirst, F.E., 2005. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of clinical microbiology, 43(11), pp.5721-5732. 2. Corby, P.M., Lyons-Weiler, J., Bretz, W.A., Hart, T.C., Aas, J.A., Boumenna, T., Goss, J., Corby, A.L., Junior, H.M., Weyant, R.J. and Paster, B.J., 2005. Microbial risk indicators of early childhood caries. Journal of clinical microbiology, 43(11), pp.5753-5759.
圖 1 顯示嵌入ATPS兩個組分的不同多孔材料的相分離。所用的預塗多孔材料包含玻纖紙 (FG)、棉基紙 (C)、單層基質紙 (SM) 和聚烯烴泡沫墊 (PO)，來自3家不同的供應商。
圖 2 顯示本發明的設備原理圖，其中分析物濃縮在流體流動的前沿位置，並檢測到可見測試結果。
圖 3 顯示本發明的一個實施例，其中生物分子在嵌入ATPS多孔材料的前沿位置被濃縮成不同的倍數。
圖 4 顯示使用本發明的嵌入ATPS組分的預塗多孔材料來濃縮不同類型的樣品 (尿液和唾液) 中的生物分子。
圖 5 顯示本發明的設備，包含用嵌入ATPS兩個組分的多孔材料來增強檢測S.mutans 的靈敏度。結果表明，S. mutans 的檢測極限比僅使用 LFA 模塊低了100倍。
圖 6 顯示本發明的設備，其使用嵌入ATPS兩個組分的多孔材料作為濃縮模塊的各種設計。
圖 7 提出一個實施例，說明了濃縮模塊的製造過程。
圖 8 演示如何改變在濃縮模塊上 ATPS 組分的位置和次序的可行性。
圖 9 顯示本發明對設備的各種設計。圖 9A顯示了一個封閉式 (已組裝) 和開放式的垂直方向的盒式外殼設計。該設備包含獨立的樣品槽。圖 9B顯示了一個封閉式 (已裝配) 和開放式的垂直方向的盒式外殼設計，該設備包含連結的樣品槽。圖 9C顯示了一個封閉式 (已組裝) 和開放式的水平方向盒式外殼設計，允許從測試帶上方加樣品。圖 9D顯示了一個封閉式 (已組裝) 和開放式的水平方向盒式外殼設計，允許從測試帶下面加樣品。
圖 10 顯示本發明幾種盒式外殻設計的 CAD 模型。

Claims (15)

  1. 一種用於濃縮和檢測樣品溶液中的靶標分析物的設備，包含： (a) 用於保存樣品溶液的樣品槽； (b) 與所述樣品槽相連接的濃縮模塊, 該模塊包含塗了水溶性納米粒子和篏入雙液相系統ATPS的組分, 其中, 當水溶液流經所述多孔材料時，其中一個相溶液比另一個相溶液流動更快，從而形成兩個相溶液, 其中樣品溶液通過所述樣品槽引入設備, 所述多孔材料時吸取樣品溶液, 其中樣品溶液中的靶標分析物會分配到流動較快的相溶液中並在所述流動較快的相溶液的前沿位置被濃縮；和 (c) 與濃縮模塊相連接的檢測模塊用來檢測靶標分析物，所述檢測模塊包含橫向流動分析測試和結合墊，其中濃縮模塊的多孔材料與結合墊給合起來，其中已濃縮的靶標分析物從多孔材料流到給合墊，並隨後用橫向流動分析測試來分析，出現顏色反應出有靶標分析物的存在。
  2. 如請求項1所述的設備，其中所述納米粒子選自二氧化矽﹑氧化鐵﹑二氧化鈦﹑氧化銀及其任何組合。
  3. 如請求項1所述的設備，其中所述多孔材料選自玻纖紙﹑棉基紙﹑單層基質紙和聚烯烴泡沫墊。
  4. 如請求項1所述的設備，其中所述ATPS 組分選自聚合物﹑鹽和表面活性劑。
  5. 如請求項4所述的設備，其中所述聚合物選自聚乙二醇﹑聚（氧化烯）聚合物﹑聚（氧化烯）共聚物﹑聚乙烯醇吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯醇己內醯胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性劑、烷氧基化澱粉、烷氧基化纖維素、烷基羥烷基纖維素、有機矽改性聚醚、聚N-異丙基丙烯醯胺。聚乙二醇、聚丙烯乙二醇和右旋糖酐。
  6. 如請求項4所述的設備，其中所述鹽選自親液鹽、離液鹽、含有三甲基銨、三乙基銨、三丙基銨、三丁基銨、四甲基銨、四乙基銨、四丙基銨或四丁基銨陽離子和含有磷酸鹽，硫酸鹽，硝酸鹽，氯化物或碳酸氫陰離子的無機鹽、氯化鈉、磷酸鈉、磷酸鉀、硫酸鈉、檸檬酸鉀、硫酸銨、檸檬酸鈉、醋酸鈉和其組合。
  7. 如請求項4所述的的設備，其中所述表面活性劑選自非離子表面活性劑、洗滌劑、Triton-X、Igepal CA-630 和 Nonidet P-40。
  8. 如請求項1所述的設備，其中所述樣品溶液包含一個或多個血液、血漿、血清、 尿液、唾液、糞便和身體分泌物。
  9. 如請求項1所述的設備，其中所述分析物是 DNA、游離 DNA、循環腫瘤DNA、蛋白質、核酸、碳水化合物、脂質、細菌、病毒或納米粒子。
  10. 如請求項1所述的設備，其中所述ATPS 組分在所述多孔材料上完全分開或部分重疊。
  11. 如請求項1所述的設備，其中所述分析物可以被濃縮至100倍以上。
  12. 如請求項1所述的設備，其中所述多孔材料格式是多層紙條, 紙條的其中一端是一個尖端。
  13. 如請求項1所述的設備，其中所述樣品溶液是磷酸鹽緩衝液或具有指示劑的Tris-EDTA緩衝液。
  14. 如請求項1所述的設備，其中所述濃縮模塊和檢測模塊都是在外殼內並且可分離的，其中所述設備可以選擇性包含橡膠圈用來密封外殼之間的連接處。
  15. 如請求項13或14所述的設備，其中的所述濃縮模塊和檢測模塊是不可分割的。
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