TW201840849A - 編輯核酸序列之組成物及方法 - Google Patents
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Abstract
本揭露提供一種用於在體外、離體或體內同時靶向核酸序列，並在細胞中提供內含子選擇(intron selection)的組成物。該組成物包括一或多個核酸分子，每個核酸分子包含兩端與封端序列(capping sequence)相接的人工核酸序列，以及λ-β蛋白質，或包含編碼該λ-β蛋白質之核酸序列的線性或環狀載體，其中每個封端序列與位於該目標核酸序列中的區域為同源(homologous)，且該人工核酸序列係內含子序列。本揭露亦提供一種藉由將該組成物引入細胞中以編輯目標核酸序列之方法。
Description
本揭露係關於一種在體外、離體或體內用於編輯細胞中之目標基因體基因座(genomic locus)的組成物及方法，更特定言之，係關於在真核細胞中用於重組工程、基因體修飾、基因嵌入或基因剔除的組成物及方法。
細菌基因體編輯已被充分地確立及應用於嵌入/剔除細菌基因，例如成簇規律間隔短回文重複序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)相關蛋白質(CRISPR/Cas)、cre-lox系統及λ-Red系統。
數十年來，cre-lox系統已應用於真核系統的基因修飾。源自噬菌體的cre-lox系統主要係用於經基因修飾之動物。對於藉由cre蛋白質識別及同源重組的外源片段及目標生物體，需要一個特殊的lox序列。殖入片段係與選擇標記及/或外源基因組合，並經lox序列雙封端(bi-capping)的線性化DNA。為了重組工程，應事先在目標生物體基因體上創建特殊序列lox。
CRISPR/Cas系統則完全不同於cre-lox系統，其衍生自細菌針對噬菌體的自我防衛及免疫記憶，如lox之特別序列係不必要的。用於CRISPR/Cas的機器係由Cas蛋白質與引導RNA(guidant RNA,gRNA)所構成的核糖蛋白質複合物。該引導RNA攜帶短的同源區域(大約17bp至24bp)以專一性地靶向基因體。用於I型及II型CRISPR的核心Cas蛋白質Cas3及Cas9係作為核糖酵素，用以切割目標序列附近的DNA。此種機制被細菌及古細菌廣泛採用。由於Cas-gRNA複合物的組成物，使衍生自聚球藻(Synechococcus sp.)的II型CRISPR較為簡單且更容易在其他生物系統中進行編輯。
目前，cre-lox及CRISPR/Cas系統係於真核生物中進行基因體編輯的主要工具。惟，基於其機制的限制，使得遺傳修飾既耗時且效率甚低。在基因轉殖動物中建立cre-lox系統以及在目標生物體上創建特殊序列lox係如此地困難，以致在大多數生物體中，位於預計位點的lox序列並不常見。相對地，CRISPR/Cas較為優越，並採用使用者設計的序列。CRISPR/Cas的gRNA靶向使用者設計的特定區域。惟，gRNA的序列太短而不能在整個基因體上定位，其將導致大量的非專一性靶向(即所謂的脫靶效應(off-target effect))。再者，CRISPR在基因體編輯中的作用係透過引入由核心Cas蛋白質引起的雙股斷裂(double-strand breaking,DSB)，以及藉由非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)整合外源片段而 完成。惟，NHEJ之效率甚低，且經基因修飾的細胞無法直接有效地被選擇，以致進一步限制了CRISPR/Cas的應用。
λ-Red系統最初係於大腸桿菌(E.coli)的recA基因研究中被發現。於recA缺陷的大腸桿菌菌株中，在λ噬菌體中編碼的系統顯示重組效率增加了約100倍，而recA+的大腸桿菌菌株，其重組效率則顯示下降。因此，該系統命名為「Red」(Recombination defective(重組缺陷))，以區別於大腸桿菌宿主中的重組系統。該λ-Red系統包括α、β及γ蛋白質，其分別作用為核酸外切酶、單股DNA(ssDNA)貼合(annealing)蛋白質及RecBCD複合物的抑制劑。已知λ-Red重組包括三個主要步驟：(1)α-蛋白質從5’到3’分解雙股DNA(dsDNA)；(2)β-蛋白質結合dsDNA的黏端(sticky end)；(3)藉由RecA的侵入將單股DNA(ssDNA)與目標序列貼合。λ-Red不僅能夠構建包含選擇標記及/或外源基因的大DNA片段，亦可藉由在一或兩個不同區域處同源的兩個序列封蓋該片段的兩端而加以高度特定及重組。
λ-Red重組工程已在大腸桿菌中用於單基因嵌入/剔除之可治癒質體(curable plasmid)中構建。最近，其亦用於枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的基因體編輯。又，亦從其他噬菌體中發現類似的系統，並證實其在原核生物中的重組效率。惟，作為跨物種或多生物系統之基因體編輯的迫切要求，利用λ-Red及其相關噬菌體重組系統在真核細胞 及生物體(包括植物、動物及人類)中提供更直接、有效及精確的基因體編輯方法仍係一個重要課題。
鑒於上述課題，本揭露提供一種在體外、離體或體內用於編輯細胞中之目標核酸序列的組成物，其包括：一或多個核酸分子，每個核酸分子包含兩端與封端序列(capping sequence)相接的人工核酸序列；以及λ-β蛋白質，或包含編碼該λ-β蛋白質之核酸序列的載體。
於本揭露之一實施方式中，每個封端序列與目標核酸序列中的區域為同源(homologous)。目標核酸序列可為外顯子(exon)或內含子(intron)，取決於目的，如嵌入、剔除、框內埴入(in-frame insertion)、基因體修飾或重組工程。再者，人工核酸序列可為內含子序列。此外，該人工核酸序列可包含選擇標記(selection marker)，其允許直接、有效且精確地選擇基因體中的整合體(integrant)。又，該載體可進一步包括可操作地連接至編碼λ-β蛋白質之核酸序列的啟動子，及選自於由編碼核酸外切酶之核酸序列、編碼抗RecBCD蛋白質之核酸序列及報導基因(reporter gene)所組成之群組中的至少一者。
於本揭露之一實施方式中，該組成物進一步包括核酸外切酶及抗RecBCD蛋白質中之至少一者。於本揭露之另一實施方式中，該組成物係與選自鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFN)系統、類轉錄活化因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs) 系統及成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)/Cas系統中的至少一者組合使用。
根據另一實施方式，本揭露進一步提供一種在體外、離體或體內用於編輯細胞中之目標核酸序列之方法。該方法包括：將上述組成物引入細胞中，以誘導於該目標部位中發生遺傳改變。該方法進一步包括在適於誘導核酸分子及目標核酸序列之間之同源重組的條件下培養該細胞。於本揭露之一實施方式中，引入細胞中或由細胞中的載體編碼的λ-β蛋白質係與核酸分子結合，並進一步促進核酸分子的封端序列與目標核酸序列中的區域之間的貼合(annealing)，藉以在細胞中形成重組體(recombinant)。此外，作為內含子序列之人工核酸序列將在目標核酸序列的RNA產物成熟期間藉由RNA剪接而被除去，同時於細胞中發生遺傳改變。於本揭露之一實施方式中，可基於選擇標記檢測及選殖具有遺傳改變的細胞。
綜上所述，本揭露提供一種用於在體外、離體或體內同時靶向核酸序列，並在細胞中提供內含子選擇(包括選擇標記之內含子)的組成物。又，本揭露提供一種用於編輯細胞中的目標部位以進行諸如重組工程、基因體修飾、基因嵌入及基因剔除之更直接、有效且精確的方法。此外，該細胞可為真核細胞，包括但不限於哺乳動物細胞，例如人類細胞及人類誘導性多能幹細胞。
本揭露可藉由參考附圖並閱讀下述實施例之詳細描 述，而更全面地理解之。
第1A圖顯示包含兩端與封端序列相接之人工核酸序列的核酸分子的配置。
第1B圖顯示質體pAB-mCherry之構建。
第2A圖至第2C圖顯示藉由螢光顯微鏡術(第2A圖)或流式細胞測量術(第2B圖)觀察到的使用GJB2-EX-AF及質體pAB-mCherry以不同比率共轉染人類HEK293T細胞48小時的結果圖，並基於藉由流式細胞測量術評估之EGFP陽性細胞數加以定量(第2C圖)。數據表示為平均值±sem，*p<0.05，**p<0.01，n=5。
第2D圖顯示源自GJB2-EX-AF及質體pAB-mCherry共轉染之HEK293T細胞的DNA，對EGFP基因及GJB2基因進行PCR擴增之電泳結果。
第3圖係使用GJB2-EX-AF及質體pAB-mCherry共轉染人類誘導性多能幹細胞(iPSC)48小時的結果圖。白色方框及箭頭表示具有eGFP綠色螢光之兩個獨立的人類iPSC殖株(左及右圖)。比例尺：100μm。
第4A圖係兩端與GJB2基因之外顯子1及外顯子2相接的人工內含子的示意圖。GJB2_EXON2_wt表示GJB2基因的正常外顯子2；GJB2_EXON2_c35_mut表示GJB2基因之外顯子2中的c.35delG突變；而GJB2_EXON2_c109_mut表示GJB2基因之外顯子2中的c.109G>A突變。
第4B圖係使用質體pAB-mCherry及GJB2-EX35-AF 或GJB2-EX109-AF共轉染人類HEK293T細胞48小時的結果圖。觀察到具有eGFP綠色螢光的HEK293T細胞。比例尺：100μm。
第4C圖顯示源自不同組轉染之HEK293T細胞的DNA，對EGFP基因進行PCR擴增之電泳結果，其中泳道M、1、2及3分別表示kb梯標、c.35delG組、媒液對照組及c.109G>A組。
第4D圖及第4E圖顯示源自不同組轉染之HEK293T細胞的DNA之GJB2基因的外顯子2定序結果。
第5A圖及第5B圖顯示藉由流式細胞測量術分析本揭露之方法及CRISPR/Cas9n(D10A)系統(第5A圖)之GJB2基因c.35的基因編輯效率比較，並使用條形圖表示(第5B圖)，其中(a)為媒液(vehicle)對照組，(b)為GJB2-EX35-AF組，(c)為GJB2-EX35-AF+質體pAB組，以及(d)為GJB2-EX35-AF+CRISPR/Cas9n(D10A)R+L組。數據表示為平均值±sem，** p<0.01相較於單獨GJB2-EX-AF，# p<0.05，n=6。
下述實施例為舉例說明本揭露。鑒於說明書所揭露的內容，本技術領域中具有通常知識者可了解本揭露之其他優點。本揭露亦可如其他具體實施例所說明般的來實施或應用。於不違反本揭露精神及範疇下，可據不同的態樣及應用進而修改及/或更改該實施例。
本揭露提供一種用於在體外、離體或體內編輯細胞中 之目標核酸序列的組成物。該組成物包括：一或多個核酸分子，每個核酸分子包含兩端與封端序列相接的人工核酸序列；以及λ-β蛋白質，或包含編碼該λ-β蛋白質之核酸序列的載體。
本揭露之組成物可用於在體外、離體或體內同時靶向核酸序列，並於細胞中提供內含子選擇。本文所述之術語「內含子選擇」係意指使用包括用於基因工程之選擇標記之人工內含子序列的過程。
於本揭露之一實施方式中，該載體係環狀質體或線性DNA。
於本揭露之一實施方式中，每個封端序列與位於目標核酸序列中的區域為同源。於本揭露之另一實施方式中，位於目標核酸序列之區域係外顯子或內含子。
於本揭露之一實施方式中，每個封端序列各自獨立地具有長度為10至5000個核苷酸；例如，每個封端序列之長度範圍係選自於由10至500、500至1000、1000至1500、1500至2000、2000至2500、2500至3000、3000至3500、3500至4000、4000至4500及4500至5000個核苷酸所組成之群組。於本揭露之另一實施方式中，兩種封端序列均有長度為10至500個核苷酸。
於本揭露之一實施方式中，該載體可包括可操作地連接至編碼λ-β蛋白質之核酸序列的啟動子。於本揭露之另一實施方式中，該啟動子係組成型啟動子(constitutive promoter)，例如：細胞巨大病毒(cytomegalovirus,CMV) 啟動子；可誘導型啟動子，如四環素可誘導型啟動子(四環素On及Off系統)；或細胞或組織專一性啟動子，如多巴胺神經元專一性啟動子(酪胺酸羥化酶啟動子)、星狀細胞專一性啟動子(GFAP啟動子)及感覺毛細胞專一性啟動子(Myo7A啟動子)。
於本揭露之一實施方式中，該載體進一步包括選自於由編碼核酸外切酶之核酸序列、編碼抗RecBCD蛋白質之核酸序列及報導基因所組成之群組中的至少一者。於本揭露之另一實施方式中，該核酸外切酶係5’至3’核酸外切酶，例如：T5或λ核酸外切酶。於本揭露之又一實施方式中，該報導基因係螢光報導基因、酵素性報導基因或抗生素選擇基因。
於本揭露之一實施方式中，該載體包括啟動子、編碼λ-β蛋白質的核酸序列、編碼λ核酸外切酶之核酸序列，以及報導基因。於本揭露之另一實施方式中，該載體(環狀質體或線性DNA)沿5’至3’的下游方向包含：啟動子、編碼λ-β蛋白質的核酸序列、編碼核酸外切酶之核酸序列及報導基因。可理解的係，於本揭露之另一實施方式中，λ核酸外切酶可經由其他5’至3’核酸外切酶替代。
於本揭露之一實施方式中，該人工核酸序列係內含子序列。於本揭露之另一實施方式中，該人工核酸序列包括剪接供體位點(splice donor site)、剪接受體位點(splice acceptor site)及分支位點(branch site)。
於本揭露之一實施方式中，該核酸分子係單股DNA 或雙股DNA。於一實施方式中，該核酸分子係雙股DNA。於另一實施方式中，該核酸分子係聚合酶連鎖反應(PCR)之產物。
於本揭露之一實施方式中，該人工核酸序列包括選擇標記。於本揭露之另一實施方式中，該選擇標記包括可操作地連接至報導基因的啟動子。於本揭露之另一實施方式中，該報導基因係螢光報導基因、酵素性報導基因或抗生素抗性基因，且該啟動子係組成型啟動子，例如：細胞巨大病毒(cytomegalovirus,CMV)啟動子；可誘導型啟動子，如四環素可誘導型啟動子(四環素On及Off系統)；或細胞或組織專一性啟動子，如多巴胺神經元專一性啟動子(酪胺酸羥化酶啟動子)、星狀細胞專一性啟動子(GFAP啟動子)及感覺毛細胞專一性啟動子(Myo7A啟動子)。
於本揭露之一實施方式中，該核酸分子係以0.05μg至5μg的量存在於該組成物中。於一實施方式中，該核酸分子量的下限值係選自0.05μg、0.06μg、0.1μg、0.12μg、0.15μg及0.2μg，而其上限值係選自0.25μg、0.5μg、1μg、1.2μg、1.5μg及2.5μg。於本揭露之另一實施方式中，該核酸分子係以0.05μg至1.5μg的量存在於該組成物中。於本揭露之又一實施方式中，該核酸分子係以0.1μg至1.5μg的量存在於該組成物中。於本揭露之再一實施方式中，該核酸分子係以0.12μg至1.2μg的量存在於該組成物中。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可了解該核酸分子之量可依據細胞密度而調整。
於本揭露之一實施方式中，該核酸分子對該載體之重量比係2：1至1：10，例如1：1至1：8。
於本揭露之一實施方式中，該組成物進一步包括核酸外切酶或抗RecBCD蛋白質。於本揭露之另一實施方式中，該核酸外切酶係5’至3’核酸外切酶，例如T5或λ核酸外切酶。於本揭露之又一實施方式中，該組成物進一步包括λ核酸外切酶及/或抗RecBCD蛋白質。
於本揭露之一實施方式中，該組成物進一步包括ZFN、TALEN或CRISPR/Cas系統。於本揭露之另一實施方式中，該組成物係與選自ZFN、TALEN或CRISPR/Cas系統之至少一者組合使用。
依據本揭露之再一實施方式，本揭露提供一種用於在體外、離體或體內編輯細胞中目標核酸序列之方法。該方法包括將上述組成物引入細胞中，以誘導於目標核酸序列中發生遺傳改變。
於本揭露之一實施方式中，將上述組成物引入細胞後，該核酸分子係結合於細胞中被引入或藉由載體編碼的λ-β蛋白質。再者，該λ-β蛋白質促進核酸分子的封端序列與位於目標核酸序列中與封端序列同源的區域之間的貼合，以形成重組體。於本揭露之一實施方式中，該細胞係在適於誘導核酸分子與目標核酸序列之間同源重組的條件下培養。
於本揭露之一實施方式中，該人工核酸序列係內含子序列，其可於細胞中具有遺傳改變之目標核酸序列的RNA 產物成熟期間藉由RNA剪接去除。
於本揭露之一實施方式中，該目標核酸序列的編輯係選自於由重組工程、基因體修飾、基因嵌入及基因剔除所組成之群組中的至少一者。
於本揭露之一實施方式中，該細胞可係真核細胞。於一實施方式中，該真核細胞可係哺乳動物細胞。於另一實施方式中，該哺乳動物細胞可係人類細胞。於又一實施方式中，該人類細胞係幹細胞，例如：誘導性多能幹細胞(induced pluripotent stem,iPSCs)；或轉分化細胞，如誘導性神經元或誘導性心肌細胞。
菌株及培養基
使用細菌菌株大腸桿菌DH5a(Yeastern Biotech Co.,Ltd.)來培育選殖載體及構建。大腸桿菌DH5a係在由0.5%之酵母提取物(DIFCO，USA)、1%之胰蛋白腖(tryptone)(DIFCO，USA)、1%之NaCl(第一化工，台灣)所構成的Luria-bertani培養基中培養。應用100μg/ml胺芐青黴素(ampicillin)培養重組的大腸桿菌，以選擇及維持質體。
人胚胎腎(HEK293T)細胞的培養
將人胚胎腎(HEK293T)細胞(ATCC® CRL-3216TM)維持在含有10%之胎牛血清(FBS，GIBCO)、1%之青黴素及鏈黴素溶液(GIBCO)之Dulbecco改良的Eagle培養 基(DMEM，GIBCO)中，並在37℃、5%之CO2培養箱中培養。細胞每週分裂兩次。
人類誘導性多能幹細胞(hiPSC)的產生
人類iPSCs係由正常人類真皮纖維母細胞(NHDF，PromoCell)產生。如先前所述(Maekawa等，Nature，2011，474(7350)；225-9)，iPSC係藉由轉導編碼四種轉錄因子的逆轉錄病毒載體而重新編程。簡言之，質體pMXs-OCT4、SOX2、KLF4及GLIS1(Addgene)係個別地包裝成逆轉錄病毒顆粒，藉由使用TransIT-X2(Mirus)轉染至纖維母細胞。逆轉錄病毒轉導係每隔一天進行兩次。轉導1週後，將1x105之感染的纖維母細胞重新接種在作為餵養細胞(feeder cell)之失活的鼠胚胎纖維母細胞(MEF)上。該MEF細胞之初代培養物係如先前所述(Lei Y,Methods Mol.Biol.,2013,1031：59-64)。隔一天，將培養基換成人胚胎幹細胞(hESC)培養基，並每天更換。在接種21至28天後，將細胞群各自轉移至器官培養皿(ODC；BD)中的餵養細胞培養物，以開發額外用於表徵的細胞群。
DNA轉染
所有使用的DNA構建體係在大腸桿菌中繁殖，並藉由Midi質體試劑盒(Geneaid)分離。HEK293T細胞與iPSC的轉染係藉由分別使用TransITX2及TransIT-LT1(Mirus)而實現。依據用戶手冊得知，在每個轉染中需要80%匯合 (confluent)的HEK293T細胞，且每個轉染中係於6孔板中每孔含有7.5μl之TransITX2及2.5μg之DNA。此外，人類iPSC之轉染條件係如下所述：每個轉染中含有2x106之細胞、4μg之DNA及12μl之TransIT-LT1。
實施例1：質體pAB-mCherry、pAB及pAF-INTRON之構建
為了構建質體pAB-mCherry(第1B圖，使用SnapGene®創建)，PCR引子經設計以擴增源自攜帶λ-Red系統的質體pKD46(Coli Genetics Stock Center，CGSC)的bet與exo基因、源自質體pRECIVER-L122的IRES序列(Genecopoeia)及pcDNA3.1-mCherry之骨架(Genecopoeia)。所有PCR產物係藉由單步恆溫DNA裝配(one-step ISO DNA assembly)(Gibson DG,Methods Enzymol.,2011,498：349-61)於50℃純化及連接。pAB-mCherry之序列係如SEQ ID NO.1所示。
無mCherry之質體pAB係衍生於pAB-mCherry，該pAB-mCherry係藉由XbaI分解除去mCherry基因，並隨後自我連接。作為陰性對照組的無能力質體pABDN係藉由SpeI-NheI分解從質體pAB去除CMV啟動子而構建。
為了構建在本揭露之一實施方式中，用於製備包含兩端與封端序列相接之人工核酸序列之核酸分子的質體pAF-INTRON，源自pRECEIVER-LV122之CMV啟動子及EGFP基因係藉由PCR擴增及單步恆溫DNA裝配，作為質 體pQE-EGFP次選殖至質體pQE70(QIAGEN)中。所有的剪接點、剪接供體及受體，以及分支點皆係藉由定點突變方法創建(Kunkel TA,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1985,82：488-92)。將構建體轉形到大腸桿菌DH5a中，並藉由DNA定序證實具有全部人工剪接點。所獲pAF-INTRON序列係如SEQ ID NO.2所示。
實施例2：GJB2-EX-AF、GJB2-EX35-AF及GJB2-EX109-AF的製備
從人類HEK293T細胞的基因體DNA中分別擴增GJB2基因之外顯子1及2。藉由PCR從質體pAF-INTRON製備線性化人工內含子。GJB2外顯子1及2，以及線性化人工內含子係藉由單步恆溫DNA裝配而組裝，並次選殖至質體pQE70中，獲得質體pQE-GJB2-EXAF。質體pQE-GJB2-EXAF藉由PCR於GJB2基因之外顯子2上產生缺失突變(c.35delG)或從G至A(c.109G>A)的點突變，並使用DpnI消除原始質體的模板，以獲得質體pQE-GJB2-EX35AF及pQE-GJB2-EX109AF。正常或含突變c.35delG或c.109G>A之GJB2基因的外顯子2分別係如SEQ ID NOs.3至5所示。
為富集線性化的GJB2-EX-AF、GJB2-EX35-AF及GJB2-EX109-AF，源自質體pQE-GJB2-EXAF、pQE-GJB2-EX35AF及pQE-GJB2-EX109AF之PCR擴增係藉由用於選殖GJB2基因之外顯子1及2(第4A圖)的引 子進行。GJB2-EX-AF、GJB2-EX35-AF及GJB2-EX109-AF的序列分別係如SEQ ID NOs.6至8所示。
下述表1表示用於實施例1及2之引子序列。
實施例3：質體pAB-mCherry及GJB2-EX-AF至人類HEK293T細胞及iPSC細胞的共轉染
使用不同比例的pAB-mCherry及GJB2-EX-AF轉染至人類HEK293T及iPSC細胞，並在6孔板中培養48小時。藉由螢光顯微鏡術觀察結果。再者，藉由流式細胞測量術分析重組效率。
螢光顯微鏡術之觀察
如第2A圖所示，大部分HEK293T細胞係表現eGFP，其係由包埋於GJB2-EX-AF人工內含子的EGFP所編碼，並以CMV啟動子驅動。再者，還觀察到兩個獨立人類iPSC殖株中eGFP的表現(第3圖)。因此，此種結果證實於GJB2-EX-AF與人類HEK293T細胞及iPS細胞中的目標部位之間發生重組。
流式細胞測量術之分析
使用流式細胞測量術進行定量分析以進一步評估重組效率。具體言之，所有的分析均使用SH800細胞分選系統(Sony)，其係由馬偕紀念醫院(台灣新北市)之流式細胞儀核心設備所提供。使用SH800軟體(Sony)進行數據分析。根據前向角及側向散射光圈選(gating)，將壞死細胞及碎片排除在分析之外。盡可能收集10,000個圈選事件進行分析。
表2表示第2B圖及第2C圖顯示不同比例的 pAB-mCherry與GJB2-EX-AF之人類HEK293T細胞中的重組效率。
此外，將經1μg之pAB-mCherry及0.12μg之GJB2-EX-AF轉染之人類HEK293T細胞中的EGFP(+)/mCherry(+)細胞分選，以驗證GJB2-EX-AF整合入GJB2基因部位，並藉由RT-PCR分析內源性GJB2 mRNA的表現。如第2D圖所示，結果顯示pAB重組工程系統並不會干擾HEK293T細胞的內源性GJB2基因mRNA的表現。
實施例4：將GJB2-EX35-AF及GJB2-EX109-AF與質體pAB-mCherry共轉染至人類HEK293T細胞
如實施例2所述，GJB2-EX35-AF及GJB2-EX109-AF設計為在GJB2基因的外顯子2中分別含有c.35delG或c.109G>A突變。於GJB2基因之c.35delG及c.109G>A突變在高加索人的耳聾突變中佔大多數，故已確定其等為聽力損傷的重要遺傳原因。
將GJB2-EX35-AF及GJB2-EX109-AF分別與pAB-mCherry一起轉染至HEK293T細胞48小時(線性DNA：載體=0.12μg：1μg)，並藉由螢光顯微鏡觀察結果。 如第4B圖所示，一些HEK293T細胞表現eGFP，其係於GJB2-EX35-AF及GJB2-EX109-AF的人工內含子中編碼，並藉由CMV啟動子驅動。
此外，藉由凝膠電泳確認源自經轉染之HEK293T細胞之基因體DNA的PCR擴增EGFP基因。如第4C圖所示，泳道2係不含DNA樣品的媒液對照組，且僅泳道1及3(即c.35delG及c.109G>A突變)顯示EGFP條帶，其證明基因體編輯。
此外，經轉染之HEK293T細胞之基因體DNA係藉由DNA定序進一步證實。如第4D圖及第4E圖所示，定序結果顯示GJB2基因的遺傳改變確實發生在使用GJB2-EX35-AF或GJB2-EX109-AF轉染的HEK293T細胞中。
因此，此種結果證明於GJB2-EX35-AF及GJB2-EX109-AF與人類HEK293T細胞中的目標部位之間發生重組。又，此種結果顯示，本揭露導致人類細胞中從突變型外顯子至正常外顯子之目標置換。類似地，可以理解的是，透過本揭露的使用，可將特定疾病中的突變外顯子替換為正常外顯子。即證實本揭露有用於基因體編輯及基因治療。
實施例5：pAB重組工程系統與CRISPR/Cas9n(D10A)之基因靶向效率的比較
產生c.35突變的質體係經設計及構建成 pCRISPR/Cas9n(D10A)L(SEQ ID NO.27)及pCRISPR/Cas9n(D10A)R(SEQ ID NO.28)，其係由Cold Spring Biotech Corp(台灣)生產。合成pCRISPR/Cas9n(D10A)R及pCRISPR/Cas9n(D10A)L的gRNA，其等序列分別係如SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30所示。GJB2基因的c.35delG係藉由Cas9蛋白質與gRNA進行，其係從質體pCRISPR/Cas9n(D10A)R表現。亦使用NdeI分解啟動子區域，以去活化gRNA及cas9基因的表現，藉以構建作為陰性對照的無能力質體pCRISPR/Cas9n(D10A)DN(SEQ ID NO.31)。
將人類HEK293T細胞與媒液(vehicle)處理以作為對照組，或與GJB2-EX35-AF及pAB或CRISPR/Cas9n(D10A)R+L共轉染48小時。然後，使用流式細胞測量術觀察並分析表現GFP的HEK293T細胞。進一步分析及分選GFP(+)細胞，以評估基因靶向的效率。
如第5A圖及第5B圖所示，人類HEK293T細胞係經(a)媒液、(b)GJB2-EX35-AF、(c)GJB2-EX35-AF及質體pAB、或(d)GJB2-EX35-AF及CRISPR/Cas9n(D10A)R+L處理，其中pAB對於GJB2基因c.35delG突變的基因編輯效率為52.4%，其係顯著高於CRISPR/Cas9n(D10A)的42.3%。
根據上述實施例可知，本揭露顯示人工內含子EGFP報導基因與HEK293T細胞中的目標GJB2基因體基因座之間發生λ-Red重組。藉由pAB重組工程系統在HEK293T 細胞中成功編輯GJB2基因的耳聾基因突變c.35delG及c.109G>A，並由dsDNA/EGFP報導基因監測。上述數據表明，透過pAB重組工程系統可實現於HEK293T細胞中從野生型基因體序列至經設計的突變基因體序列之目標置換。因此，本揭露的pAB重組工程系統藉由利用dsDNA/EGFP報導基因及FACS系統的結合而提供用於人類基因體編輯之高效且易於選擇的平台。其可應用於體外及體內創建人類疾病模型，以促進發現疾病機制及藥物開發。總而言之，本揭露的pAB重組工程系統不僅在基礎科學領域中，且在臨床及再生醫學領域中皆能促進精確及高效的人類基因體靶向/編輯。
上述為詳細描述本揭露之示例性實施例。惟，應理解的，本揭露之範圍不限於所揭露的實施例。反之，其意在涵蓋各種修改及類似的重新排列。是以，申請專利範圍應賦予最廣泛的解釋，以涵蓋所有此種修改及類似的安排。
Claims (20)
- 一種用於編輯目標核酸序列之組成物，包括：一或多個核酸分子，各該核酸分子包含兩端與封端序列相接的人工核酸序列，其中，各該封端序列與位於該目標核酸序列中的區域為同源，以及λ-β蛋白質，或包含編碼該λ-β蛋白質之核酸序列的線性或環狀載體。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中，該核酸分子係雙股DNA。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中，該人工核酸序列係內含子序列。
- 如申請專利範圍第3項所述之組成物，其中，該人工核酸序列包括剪接供體位點、剪接受體位點、分支位點、選擇標記及其組合中之至少一者。
- 如申請專利範圍第4項所述之組成物，其中，該選擇標記包括可操作地連接至報導基因的啟動子。
- 如申請專利範圍第5項所述之組成物，其中，該啟動子係組成型啟動子、可誘導型啟動子、或細胞或組織專一性啟動子，以及該報導基因係螢光報導基因、酵素性報導基因或抗生素選擇基因。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中，位於該目標核酸序列中的該區域係外顯子或內含子。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物，進一步包括核 酸外切酶及抗RecBCD蛋白質中之至少一者。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中，該載體進一步包括可操作地連接至該編碼λ-β蛋白質之核酸序列的啟動子。
- 如申請專利範圍第9項所述之組成物，其中，該載體包括該啟動子及選自於由編碼核酸外切酶之核酸序列、編碼抗RecBCD蛋白質之核酸序列及報導基因所組成之群組中的至少一者。
- 如申請專利範圍第10項所述之組成物，其中，該啟動子係組成型啟動子、可誘導型啟動子、或細胞或組織專一性啟動子，以及該報導基因係螢光報導基因、酵素性報導基因或抗生素選擇基因。
- 如申請專利範圍第10項所述之組成物，其中，該載體沿5’至3’的下游方向包含：該啟動子、該編碼λ-β蛋白質的核酸序列、該編碼核酸外切酶的核酸序列及該報導基因。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中，該核酸分子係以0.05μg至5μg的量存在。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物，係與選自鋅指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)、類轉錄活化因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)及成簇規律間隔短回文重複序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas系統中的至少一者組合使用。
- 一種編輯目標核酸序列之方法，包括：將如申請專利範圍第1項所述之組成物引入細胞中，以誘導該目標核酸序列中發生遺傳改變。
- 如申請專利範圍第15項所述之方法，進一步包括檢測具有遺傳改變的該細胞。
- 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中，該目標核酸序列的編輯係選自於由重組工程、基因體修飾、基因嵌入及基因剔除所組成之群組中的至少一者。
- 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中，該細胞係真核細胞。
- 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中，該真核細胞係哺乳動物細胞。
- 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中，該哺乳動物細胞係人類細胞。
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