TW201840584A

TW201840584A - 針對vegf之僅含重鏈之抗體

Info

Publication number: TW201840584A
Application number: TW107109337A
Authority: TW
Inventors: 元斌梁; 丹尼爾Ｗ吉爾
Original assignee: 美商歐樂根公司
Priority date: 2017-03-20
Filing date: 2018-03-19
Publication date: 2018-11-16
Also published as: WO2018175319A1

Abstract

本文揭示對VEGF具有特異性之單特異性HCAb抗體、對VEGF-A及PDGF或對VEGF-A及ANG-2具有特異性之雙特異性抗體或對VEGF、PDGF及ANG-2具有特異性之三特異性抗體。亦揭示該等抗體之使用方法。

Description

針對VEGF之僅含重鏈之抗體

所描述之發明一般係關於抗體及其治療使用方法。

血管生成係新血管自先前存在之脈管系統形成，其為諸如早產兒視網膜病、增生性糖尿病性視網膜病、糖尿病性黃斑水腫及年齡相關之黃斑變性的引起失明之若干視網膜血管疾病中之主要組分。眼睛之新血管形成係眼睛中血管之異常或過度形成。已顯示眼睛之新血管形成與糖尿病性視網膜病及年齡相關之黃斑變性均相關。

年齡相關之黃斑變性(Age-related macular degeneration，AMD)係老年人群中失明之主要原因，且公認其呈乾性及濕性AMD形式。乾性或非滲出性形式包括視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)之萎縮及過度生長變化。乾性形式之特徵在於黃斑之脈網膜小疣，其為含有死細胞及代謝產物之有色區域，該等死細胞及代謝產物使視網膜變形且最終引起敏銳視力之喪失。患有非滲出性AMD (乾性形式)之患者可進展至濕性或滲出性或新生血管性AMD，其中病理性脈絡膜新生血管膜(CNVM)在視網膜下滋長，漏出流體及血液，且若未進行治療，則最終在相對較短之時間框內引起中心致盲性橢圓形疤。脈絡膜新血管形成(CNV)係新血管自脈絡膜毛細管網，跨過布魯赫膜/RPE界面生長至神經視網膜中，引起視網膜剝離、視網膜下及視網膜內水腫以及結疤。

糖尿病可藉由多種方式影響眼睛。糖尿病性視網膜病(Diabetic retinopathy，DR)係一種糖尿病併發症，由眼睛後面之感光組織(視網膜)之血管遭到破壞引起。開始時，糖尿病性視網膜病可能未引起症狀或僅僅引起輕度視力問題。但是，最終糖尿病性視網膜病可引起失明。糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)係糖尿病中視網膜由於流體自黃斑內之血管漏出而膨脹。

本文揭示對VEGF具有特異性之僅含重鏈之單特異性抗體(HCAb)、對VEGF及ANG-2或對VEGF及PDGF具有特異性之雙特異性抗體或對VEGF、PDGF及ANG-2具有特異性之三特異性抗體。

在一些實施例中，揭示對VEGF具有特異性之僅含重鏈之抗體(HCAb)。在一些實施例中，VEGF為VEGF-A。在某些實施例中，HCAb具有SEQ ID NO: 5、9或13中之一者的可變重鏈(VH)區序列。在其他實施例中，HCAb VH區序列與SEQ ID NO: 5、9或13中之一者的全長序列具有至少85%或95%之一致性。

在一些實施例中，HCAb之互補決定區(CDR)中之一或多者係選自SEQ ID NO:6-8及10-12。在某些實施例中，HCAb CDR與選自SEQ ID NO:6-8及10-12之全長CDR序列具有至少85%或95%之一致性。

在一些實施例中，對VEGF-A具有特異性之HCAb包含SEQ ID NO:6之CDR。在一些實施例中，對VEGF-A具有特異性之HCAb包含SEQ ID NO:7之CDR。在一些實施例中，對VEGF-A具有特異性之HCAb包含SEQ ID NO:8之CDR。在一些實施例中，對VEGF-A具有特異性之HCAb包含SEQ ID NO:10之CDR。在一些實施例中，對VEGF-A具有特異性之HCAb包含SEQ ID NO:11之CDR。在一些實施例中，對VEGF-A具有特異性之HCAb包含SEQ ID NO:12之CDR。

在一些實施例中，VH區之至少一個胺基酸經取代、添加或缺失，且HCAb保留其對VEGF-A之特異性。

亦揭示人類或人類化抗體，其與HCAb LA-C5、LA-D6及/或Hu-C5競爭結合於VEGF-A。

在一些實施例中，提供對VEGF具有第一特異性且對PDGF具有第二特異性之雙特異性抗體。在某些實施例中，第一特異性由如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之HCAb展現。在某些實施例中，第二特異性由選自以下之VH區展現：P36F3 (SEQ ID NO:16)、P36E10 (SEQ ID NO:17)、P36E8 (SEQ ID NO:18)、P36C12 (SEQ ID NO:19)、P36A4 (SEQ ID NO:20)、P36A3 (SEQ ID NO:21)、P36D9 (SEQ ID NO:22)、P36E4 (SEQ ID NO:23)、P36E9 (SEQ ID NO:24)、P36G9 (SEQ ID NO:25)及P36H4 (SEQ ID NO:26)。

在一些實施例中，提供一種對VEGF具有第一特異性且對ANG-2具有第二特異性之雙特異性抗體。在某些實施例中，第一特異性由如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之HCAb展現。在一些實施例中，第二特異性由選自以下之VH區展現：A33A8 (SEQ ID NO:27)、A1G2 (SEQ ID NO:28)、A1F8 (SEQ ID NO:29)、A2B6 (SEQ ID NO:30)及A1B1 (SEQ ID NO:31)。在一個實施例中，雙特異性抗體具有SEQ ID NO:15之胺基酸序列。

亦揭示一種對VEGF具有第一特異性，對ANG-2具有第二特異性，且對PDGF具有第三抗原之三特異性抗體。在一些實施例中，三特異性抗體具有SEQ ID NO:32之重鏈序列。在某些實施例中，三特異性抗體視情況包括SEQ ID NO:33之輕鏈序列。

本文亦揭示治療眼科病症之方法，其包括向有需要之個體投與本文揭示的結合VEGF之具有VH區之HCAb或本文揭示之雙特異性或三特異性抗體。

本文亦揭示本文揭示的結合VEGF之具有VH區之HCAb或本文揭示之雙特異性或三特異性抗體的用途，其用於製造供治療有需要之個體之眼科病症的藥劑。

在一些實施例中，眼科病症包含年齡相關之黃斑變性(AMD)、脈絡膜新血管形成(CNV)、囊樣黃斑水腫(CME)、近視相關之脈絡膜新血管形成、血管樣紋、糖尿病性黃斑水腫(DME)、黃斑水腫、視網膜靜脈阻塞、異常角膜血管生成、翼狀胬肉結膜、視網膜下水腫或視網膜內水腫。在一些實施例中，異常角膜血管生成係由角膜炎、角膜移植、角膜成形術或缺氧引起。

相關申請案之交叉引用

本申請案主張於2017年3月20日申請之標題為「Heavy Chain Only Antibodies to VEGF」的美國臨時專利申請案第62/473,996號之優先權益，該臨時專利申請案之內容以引用之方式整體併入本文中。

本文揭示對血管內皮生長因子(VEGF)具有特異性之僅含重鏈之單特異性抗體(HCAb)、對VEGF及血管生成素-2 (ANG-2)或對VEGF及血小板衍生生長因子(PDGF)具有特異性之雙特異性抗體及對VEGF、PDGF及ANG-2具有特異性之三特異性抗體。

哺乳動物中之VEGF家族由五個成員構成：VEFG-A、胎盤生長因子(placenta growth factor，PGF)、VEGF-B、VEGF-C及VEGF-D。VEGF家族之所有成員均藉由結合於細胞表面上之酪胺酸激酶受體(VEGFR)，使其二聚來刺激細胞反應且雖然位點、時間及程度不同，但均經由轉磷酸作用而活化。VEGF受體具有由七個免疫球蛋白樣結構域組成之細胞外部分、單跨膜區及含有分裂酪胺酸激酶結構域之細胞內部分。VEGF-A結合於VEGFR-1 (Flt-1)及VEGFR-2 (KDR/Flk-1)。VEGFR-2似乎介導幾乎所有已知之對VEGF之細胞反應。VEGFR-1之功能不太明確，不過認為其調節VEGFR-2信號傳導。VEGFR-1之另一功能可為充當假/誘餌受體，使VEGF無法結合VEGFR-2 (此似乎在胚胎中血管發生期間尤其重要)。VEGF-C及VEGF-D，而非VEGF-A，為介導淋巴管生成之第三受體(VEGFR-3/Flt4)之配位體。VEGFR-3為主要配位體(VEGF-C及VEGF-D)之結合位點，其介導配位體對標靶細胞之長期作用與功能。VEGF-C刺激淋巴管生成(經由VEGFR-3)且經由VEGFR-2刺激血管生成。VEGF-A為232個胺基酸序列(UniProtKB-P15692；MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMD VYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVYVGARCCLMPWSLPGPHPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR；SEQ ID NO:1)。

因此，本文揭示針對VEGF之單特異性及雙特異性HCAb抗體及使用所揭示之抗體治療眼科病症之方法。

用於治療疾病之抗體為所屬領域中所熟知。如本文所用，術語「抗體」係指包含一或多個包含抗原結合位點之多肽鏈的單體或多聚體蛋白質。抗體特異性地結合於抗原且能夠調節抗原之生物活性。如本文所用，術語「抗體」可包括「全長抗體」及「抗體片段」。如本文所用，術語「結合位點」或「抗原結合位點」表示配位體實際上結合之抗體分子區域。

抗體特異性係指抗體選擇性識別抗原之特定抗原決定基。天然抗體例如為單特異性的。如本文所用，術語「單特異性」表示具有一或多個各結合於相同抗原之相同抗原決定基之結合位點的抗體。本文揭示之單價單特異性抗體對VEGF具有特異性。如本文所用，「特異性」及「抗原結合特異性」可互換使用且係指相同活性。

「雙特異性抗體」係指具有兩種不同抗原結合特異性之抗體。本文揭示之雙特異性抗體對VEGF具有第一特異性且對PDGF或ANG-2具有第二特異性。

術語「三特異性抗體」係指具有三種不同抗原結合特異性之抗體。本文揭示之三特異性抗體對VEGF、PDGF及ANG-2具有特異性。

如本文所用，術語「價數」表示抗體分子中存在規定數目之結合位點。因而，術語「二價」、「四價」及「六價」表示抗體分子中分別存在兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。本文揭示之雙特異性抗體為「二價」的。但是，單特異性二價抗體在本發明之範疇內，其中兩個抗原結合位點結合相同抗原。單特異性二價抗體之抗原結合位點可結合抗原上之相同抗原決定基或不同抗原決定基。本文揭示之三特異性抗體為「三價」的。

本文中「全長抗體」意謂構成抗體之天然生物形式的結構，包括可變區及恆定區。舉例而言，在包括人類及小鼠之大部分哺乳動物中，IgG類別之全長抗體為四聚體，且由兩對相同的雙免疫球蛋白鏈組成，每對具有一個輕鏈及一個重鏈，每個輕鏈包含免疫球蛋白結構域VL及CL，且每個重鏈包含免疫球蛋白結構域VH、CH1、CH2及CH3。在一些哺乳動物中，例如在駱駝及美洲駝中，IgG抗體僅僅由兩個重鏈(HCAb)組成，每個重鏈包含連接於Fc區(CH2及CH3結構域)之可變域。

天然抗體結構單元通常包含四聚體。每個四聚體通常由兩對相同的多肽鏈構成，每對具有一個「輕」鏈(通常具有約25 kDa之分子量)及一個「重」鏈(通常具有約50-70 kDa之分子量)。輕鏈及重鏈各由兩個稱為可變區及恆定區之不同區域組成。對於免疫球蛋白之IgG類別，重鏈由四個免疫球蛋白結構域構成，該四個免疫球蛋白結構域自N至C端以VH-CH1-CH2-CH3順序連接，分別稱為重鏈可變域、重鏈恆定域1、重鏈恆定域2及重鏈恆定域3 (亦稱為VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3，分別稱為重鏈可變域、恆定γ1結構域、恆定γ2結構域及恆定γ3結構域)。IgG輕鏈由兩個免疫球蛋白結構域構成，該兩個免疫球蛋白結構域自N至C端以VL-CL連接，分別稱為輕鏈可變域及輕鏈恆定域。恆定區展示更少序列多樣性，且負責許多天然蛋白質之結合以引起重要的生物化學事件。

抗體之可變區含有分子之抗原結合決定子，因此決定抗體對其標靶抗原之特異性。可變區如此命名係因為其在序列上與相同類別內之其他抗體最為不同。在可變區中，重鏈及輕鏈之各V結構域之三個環聚集，形成抗原結合位點。各環稱為互補決定區(以下稱為「CDR」)，其中胺基酸序列之變化係最顯著的。總共存在六個CDR，每個重鏈及輕鏈各三個，稱為VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在CDR外之可變區稱為構架(FR)區。雖然FR區不如CDR多變，但不同抗體之間FR區中存在序列變化性。總體上，抗體之此特徵構造提供一種穩定骨架(FR區)，免疫系統可在上面探查相當大之抗原結合多樣性(CDR)，以獲得對一系列廣泛抗原之特異性。

抗體中CDR區之測定為所屬領域之技術人員所熟知。存在至少兩種用於測定CDR之技術：(1)基於物種間序列變化性之方法(Kabat等人 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)；及(2)基於抗原抗體複合物之結晶學研究之方法(Chothia等人 (1989) Nature 342:877；Al-lazikani等人(1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)。如本文所用，CDR可指由任一方法或由兩種方法之組合界定的CDR。

編碼免疫球蛋白基因座之基因包含多個V區序列以及稱為「D」及「J」之較短核苷酸序列，且其為產生VH多樣性之V、D及J核苷酸序列之組合。

如基因學上由恆定區決定，抗體分成多個類別，亦稱為同型。人類恆定輕鏈分類為κ (Cκ)及λ (Cλ)輕鏈。重鏈分類為μ (μ)、δ (δ)、γ (γ)、α (α)或ε (ε)，且分別定義抗體之同型為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG類別最常用於達成治療目的。在人類中，此類別包含子類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在小鼠中，此類別包含子類IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。IgM具有子類，包括(但不限於) IgM1及IgM2。IgA具有若干子類，包括但不限於IgA1及IgA2。因此，如本文所用之「同型」意謂由恆定區之化學及抗原特徵定義的免疫球蛋白之任何類別或子類。已知之人類免疫球蛋白同型為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD及IgE。所揭示之HCAb抗體及雙特異性抗體可具有包含所有或部分上述同型之恆定區。

抗體片段亦在本發明之範疇內，包括(但不限於) (i) Fab片段，其包含VL、CL、VH及CH1結構域；(ii) Fd片段，其包含VH及CH1結構域；(iii) Fv片段，其包含單一抗體之VL及VH結構域；(iv) dAb片段，其包含單個可變區；(v)分離之CDR區；(vi) F(ab')₂ 片段，一種包含兩個連接之Fab片段的二價片段；及(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結構域及VL結構域由允許兩個結構域締合形成抗原結合位點之肽連接子連接。在某些實施例中，抗體藉由重組DNA技術產生。在額外實施例中，抗體藉由天然存在之抗體之酶促或化學裂解產生。

如本文所用，「人類化」意謂包含人類構架區(FR)及一或多個來自非人類(通常小鼠或大鼠，但其他物種亦可)抗體之互補決定區(CDR)的抗體。提供CDR之非人類抗體稱為「供體」，且提供構架之人類免疫球蛋白稱為「接受體」。在某些實施例中，人類化主要依賴於供體CDR移植至接受體(人類) VL及VH構架上。此策略稱為「CDR移植」。經常需要所選接受體構架殘基「回復突變」成對應供體殘基，以重新獲得在最初移植之構築體中喪失的親和力。人類化抗體亦可包含通常人類免疫球蛋白之免疫球蛋白恆定區之至少一部分，因此通常包含人類Fc區。人類化或其他降低非人類抗體可變區之免疫原性的方法可包括表面重塑法。在一個實施例中，基於選擇之方法可用以使抗體可變區人類化及/或親和力成熟，亦即，增加可變區對其標靶抗原之親和力。其他人類化方法可包括僅僅移植CDR之一部分，包括但不限於US 6,797,492中描述之方法，關於CDR移植之所有揭示內容以引用之方式併入本文中。基於結構之方法可用於人類化及親和力成熟，例如如US 7,117,096中所述，關於人類化及親和力成熟之所有揭示內容以引用之方式併入本文中。

在本文中之多個實施例中，抗體為僅含重鏈之抗體(HCAb)。駱駝科動物(駱駝、單峰駱駝及美洲駝)除正常重鏈及輕鏈抗體(一個抗體中2個輕鏈及2個重鏈)之外亦含有僅含重鏈之單鏈抗體(參見圖1)。此等由稱為VHH基因之不同類之VH區段編碼。VH及VHH分散在基因組中(亦即其看起來混在彼此之間)。VH及VHH cDNA中相同D區段之鑑別表明VH及VHH共同使用D區段。天然含VHH抗體失去重鏈恆定區之整個CH1結構域。雖然編碼CH1結構域之外顯子存在於基因組中，但由於在CH1外顯子之5'側喪失功能性剪接接受體序列而剪接出來。結果，VDJ區剪接至CH2外顯子上。當VHH重組至此類恆定區(CH2、CH3)上時，產生用作單鏈抗體之抗體(亦即具有兩個重鏈，但無輕鏈相互作用之抗體)。雖然抗原之結合不同於在習知抗體下所見之結合，但高親和力以相同方式實現，亦即經由可變區之高突變及選擇表現此類高親和力抗體之細胞。

在一示例性實施例中，藉由對其中已消除內源鼠科抗體表現且已引入人類轉殖基因之轉殖基因小鼠進行免疫接種來產生HCAb。HCAb小鼠揭示於US8,883,150、US8,921,524、US8,921,522、US8,507,748、US8,502,014、US 2014/0356908、US2014/0033335、US2014/0037616、US2014/0356908、US2013/0344057、US2013/0323235、US2011/0118444及US2009/0307787中，關於僅含重鏈之抗體及其在轉殖基因小鼠中之產生的所有揭示內容均以引用之方式併入本文中。對HCAb小鼠進行免疫接種，且所得到之經預致敏之脾細胞與鼠科骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤。接著可藉由用人類序列替換鼠科CH2及CH3區，使所得HCAb成為完全人類的。

在其他例示性實施例中，藉由用所需抗原對諸如美洲駝之駱駝科動物進行免疫接種，且自動物獲得經預致敏之外周血單核細胞(PBMC)來產生HCAb。自PBMC分離之RNA可用於產生噬菌體呈現文庫以分離抗原特異性VHH序列。

本文亦揭示雙官能抗體，其中單個雙特異性分子中接合兩個抗原結合域。雙官能抗體可採取許多形式，包括(i)雙特異性Fv片段(圖2A)；(ii)與具有第二特異性之第二VH結構域締合的具有第一特異性之HCAb (圖2B及2C)；(iii)與具有第二特異性之第二VH結構域締合的具有第一特異性之四聚體單株抗體，其中第二VH結構域與第一VH結構域締合(圖2D)；及(iv)與具有第二特異性之第二VH結構域締合的具有第一特異性之Fab片段(VH-CH1/VL/CL)(圖2E)。例示性Fab片段描繪於圖2E中，其中具有第二特異性之第二VH序列與第一VH結構域之C端或N端或者第一CH1或第一CL結構域之C端或N端締合。在亦描繪於圖2E中之額外實施例中，具有第二及/或第三特異性之VH序列可與第一VH結構域之C端或N端或者第一CH1或第一CL結構域之C端或N端締合。本文亦揭示其中單個三特異性分子中接合三個抗原結合域之抗體。用於產生雙特異性抗體之相同方法可用於產生三特異性抗體。

雙特異性及三特異性抗體可包括將本文揭示之結合VEGF之抗體的序列連接至具有第二(或第三)特異性之VH區的連接子序列，其允許序列適當摺疊以產生所需三維構形及抗原結合特徵。合適連接子包括(但不限於) EPKSCD (SEQ ID NO:2)、ASTKGP (SEQ ID NO:3)及(GGGGS)_n (SEQ ID NO:4)，其中n為介於0與8之間的整數。在一個實施例中，n為1。

本文揭示之雙特異性抗體為二價的，其包含對VEGF之第一特異性，且第二特異性可包括(但不限於) PDGF或ANG-2。雙特異性抗體在本發明之範疇內，其中第一特異性及第二特異性係獨立地為ANG-2、VEGF或PDGF，唯一限制為第一特異性與第二特異性不能相同。

發現人類血管生成素-1及-2 (ANG-1及ANG-2 (UniProtKB-O15123；或縮寫為ANGPT2或ANG2))為Ties之配位體，Ties為在血管內皮內選擇性表現之酪胺酸激酶家族。血管生成素家族存在四個確定的成員。血管生成素-3及血管生成素-4 (ANG-3及ANG-4)可代表相同基因座在小鼠及男性中之廣泛差異之對應物。ANG-1及ANG-2最初在組織培養實驗中分別鑑別為促效劑及拮抗劑。所有已知之血管生成素主要結合於Tie-2。ANG-1支援內皮細胞(EC)存活且促進內皮完整性，而ANG-2具有相反作用且在缺少存活因子VEGF或鹼性纖維母細胞生長因子時加速血管失穩及退化。但是，關於ANG-2功能之許多研究已提出更複雜之情況。ANG-2可能為在血管萌芽與血管退化中起作用的血管重塑之複雜調節因子。支持ANG-2之此類作用，表現分析揭露在血管生成萌芽之成人環境下，ANG-2與VEGF一起迅速誘發，而在血管退化之環境下在缺少VEGF時誘發ANG-2。與環境依賴性作用一致，ANG-2特異性結合於由ANG-1活化之相同內皮特異性受體Tie-2，但對其活化具有環境依賴性作用。

在角膜血管生成分析中ANG-1及ANG-2具有相似作用，其與VEGF協同用於促進新血管生長。在高濃度下，在血清剝奪之細胞凋亡期間ANG-2經由經PI-3激酶及Akt路徑活化Tie-2而充當內皮細胞之細胞凋亡存活因子。認為ANG-1之作用在成人中得以保存，其中其廣泛及組成性表現。相比之下，ANG-2表現主要限於血管重塑位點，其中認為其阻斷ANG-1之組成性穩定化或成熟功能，允許血管回復及保持塑性狀態，此種狀態可對萌芽信號起更大反應。在發育期間ANG-2在存在血管重塑之位點表現。在成人個體中，ANG-2表現限於血管重塑位點以及高度血管化之腫瘤。出生後血管生成需要ANG-2。眼睛中玻璃體脈管結構之發育程式化退化在ANG-2敲除小鼠中不存在，且其視網膜血管無法自中心視網膜動脈萌發出。ANG-2之缺失在淋巴脈管結構之圖案化及功能中引起極大缺陷。在基因上用ANG-1進行拯救校正淋巴缺陷，而非血管生成缺陷。

PDGF在血管形成(血管生成，血管自已存在之血管組織生長)中起重要作用。PDGF為包括纖維母細胞、平滑肌細胞及膠質細胞之間質來源細胞的有效促細胞分裂原。PDGF為由兩個A (-AA)或兩個B (-BB)次單元或兩者組合(-AB)構成之二聚體醣蛋白。A次單元為211個胺基酸之序列(UniProtKB-P04085)；且B次單元為241個胺基酸之序列(UniProtKB-P01127)。因此，在多個實施例中，揭示對PDGF-AA、PDGF-BB及/或PDGF-AB或其片段具有特異性之抗體。在小鼠與人類中，PDGF信號傳導網由四種配位體PDGFA-D及兩種受體PDGFRα及PDGFRβ (受體酪胺酸激酶)組成。所有PDGF均充當分泌之經二硫鍵連接之同源二聚體，但僅僅PDGFA及B可形成功能性雜二聚體。因此，在某些實施例中，PDGF為PDGF-AA、PDGF-BB或PDGF-AB。

因此，本文揭示對VEGF具有特異性之HCAb、對VEGF與ANG-2具有特異性之雙特異性抗體或對VEGF與PDGF具有特異性之雙特異性抗體。在其他實施例中，VEGF/PDGF雙特異性抗體由本文揭示之人類抗VEGF A HCAb抗體Hu-C5及任何人類或人類化PDGF特異性抗體之VH及/或VL區形成。例示性人類化抗PDGF抗體揭示於WO2014/072876、WO2005087812及WO2014109999中，關於PDGF特異性抗體之所有揭示內容以引用之方式併入本文中。例示性PDGF抗體包括由P36F3、P36E10、P36E8、P36C12、P36A4、P36A3、P36D9、P36E4、P36E9、P36G9及P36H4表示之VH區，該等VH區揭示於2016年8月11日申請之國際專利申請案PCT/US2016/046595中，關於PDGF特異性抗體之所有揭示內容以引用之方式併入。

在其他實施例中，VEGF/ANG-2雙特異性抗體由本文揭示之人類抗VEGF A HCAb抗體Hu-C5及任何人類或人類化ANG-2特異性抗體之VH及/或VL區形成。例示性人類化抗ANG-2抗體揭示於例如US2010/0159587及US20130259868中，關於抗ANG-2抗體之所有揭示內容以引用之方式併入本文中。例示性結合ANG-2之抗體包括由A33A8、A1G2、A1F8、A2B6及A1B1表示之VH區，該等VH區揭示於2016年7月29日申請之國際專利申請案PCT/US2016/044838中，關於結合ANG-2之抗體之所有揭示內容以引用之方式併入。

本文亦揭示對VEGF、ANG-2及PDGF三者均具有特異性之三特異性抗體。如本文揭示之三特異性抗體包括本文揭示之三個VH序列，其中各VH區具有不同特異性。視情況該等VH區中之一者可為抗體重鏈之一部分。視情況，如本文揭示之一或多個連接子在VH區及/或重鏈之間。在一個實施例中，三特異性抗體由VH (特異性1)-重鏈(特異性2)-連接子-VH (特異性3)表示。第一、第二及第三特異性可由SEQ ID NO.:39、43、47、49-60(如US2010/0159587所揭示)及61-65(如US20130259868所揭示)中之任一者展現。三特異性抗體可為HCAb或包含重鏈與輕鏈。

一種例示性三特異性抗體具有與SEQ ID NO:48之全長重鏈及視情況SEQ ID NO:49之輕鏈(如US2010/0159587所揭示)具有至少85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。

藉由將適當核苷酸變化引入抗體DNA或藉由肽合成製備的人類抗VEGF單特異性、雙特異性或三特異性抗體之胺基酸序列變異體亦在本發明之範疇內。此類變異體包括例如本文實例之抗體之胺基酸序列內的殘基的缺失及/或插入及/或取代。缺失、插入及取代進行任何組合以實現最終構築體，條件為最終構築體具有所需特徵。胺基酸變化亦可改變人類化或變異抗體之轉譯後過程，諸如改變糖基化位點之數目或位置。

用於鑑別對於誘變而言為較佳位置之抗體之某些殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」。鑑別殘基或一組標靶殘基(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且經中性或帶負電胺基酸(最佳丙胺酸或聚丙胺酸)替換以影響胺基酸與抗原之相互作用。接著藉由在取代位點或針對取代位點引入進一步或其他變異體，細化對取代顯示功能敏感性之彼等胺基酸位置。因此，雖然用於引入胺基酸序列變異之位點預先確定，但突變性質本身無需預先確定。舉例而言，為分析既定位點處突變之效能，在標靶密碼子或區域進行丙胺酸掃描或隨機誘變且針對所需活性篩選所表現之抗體變異體。

胺基酸序列插入物包括長度在一個殘基至含有一百或更多個殘基之多肽範圍內的胺基及/或羧基端融合物，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入物。末端插入物之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗VEGF抗體或與抗原決定基標籤融合之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N端或C端與增加抗體血清半衰期之酶或多肽的融合物。

另一類變異體為胺基酸取代變異體。此等變異體在抗體分子中具有至少一個經移除且在其位置插入不同殘基之胺基酸殘基。取代誘變最相關之位點包括高變區，但亦涵蓋FR改變。保守性取代在表1中展示在標題「較佳取代」下。若此類取代引起生物活性變化，則可引入表1中稱為「例示性取代」或如以下關於胺基酸類別進一步描述的更大變化，且對產物進行篩選。表 1

抗體之生物特性之大量修飾藉由選擇對以下的作用差別顯著之取代來實現：(a)取代區域內抗體主鏈之結構，例如呈片狀或螺旋構形；(b)在標靶位點處分子之電荷或疏水性；或(c)側鏈體積。根據常見側鏈特性，將天然存在之殘基分成多組： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr； (3) 酸性：Asp、Glu； (4) 鹼性：Asn、Gin、His、Lys、Arg； (5) 影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；及 (6) 芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守性取代將需要此等類別中之一者的成員換成另一類別。

不參與維持單特異性、雙特異性或三特異性抗VEGF抗體之適當構形的任何半胱胺酸殘基亦可經取代，一般經絲胺酸取代，以提高分子之抗氧化性且防止異常交聯。相反地，半胱胺酸鍵可添加至多肽以提高其穩定性(尤其在抗體為抗體片段，諸如Fv片段之情況下)。

另一類取代變異體包括取代親本抗體之一或多個高變區殘基(例如人類化或人類抗體)。一般而言，選擇用於進一步發展之所得變異體將相對於產生其之親本抗體具有提高的生物特性。一種適於產生此類取代變異體之方式為使用噬菌體呈現之親和力成熟。簡言之，使若干高變區位點(例如6-7個位點)突變以在各位點產生全部可能之胺基取代。由此產生之抗體變異體以單價方式自絲狀噬菌體粒子呈現為與包裝在各粒子內之M13之基因IIII產物的融合物。接著如本文中所揭示，針對生物活性(例如結合親和力)篩選經噬菌體呈現之變異體。為鑑別用於修飾之候選高變區位點，可進行丙胺酸掃描誘變以鑑別顯著影響抗原結合之高變區殘基。可替代地或另外，宜分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與人類VEGF之間的接觸點。根據本文中詳細說明之技術，此類接觸殘基及鄰近殘基為候選取代殘基。一旦產生此類變異體，即對該組變異體如本文中所述進行篩選，且可選擇在一或多個相應分析法中具有優良特性之抗體用於進一步發展。

多肽之另一類胺基酸變異體改變抗體之原始糖基化模式。改變意謂在抗體中發現之一或多個碳水化合物部分缺失，及/或添加一或多個在抗體中不存在之糖基化位點。

抗體之糖基化通常為N連接或O連接。N連接係指碳水化合物部分附接於天冬醯胺酸殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸)為碳水化合物部分酶促連接於天冬醯胺酸側鏈之識別序列。因此，多肽中此等三肽序列中任一種之存在產生潛在糖基化位點。O連接之糖基化係指糖N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者連接於羥基胺基酸，最常絲胺酸或蘇胺酸，不過亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。

糖基化位點添加至抗體宜藉由改變胺基酸序列，使得其含有一或多個上述三肽序列(對於N連接之糖基化位點)來實現。改變亦可藉由添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基至初始抗體序列或用一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代來進行(對於O連接之糖基化位點)。

編碼單特異性、雙特異性或三特異性抗VEGF抗體之胺基酸序列變異體的核酸分子藉由所屬領域中已知之多種方法來製備。此等方法包括(但不限於)自天然來源分離(在天然存在之胺基酸序列變異體的情況下)或藉由抗VEGF抗體之早期製備之變異體或非變異體型式的寡核苷酸介導(或定點)誘變、PCR誘變及卡閘式誘變來製備。

涵蓋單特異性、雙特異性或三特異性抗VEGF抗體之其他修飾。舉例而言，可能需要在效應功能方面修飾抗體，以便例如增強抗體治療疾病之效力。舉例而言，半胱胺酸殘基可引入Fc區中，從而允許此區中形成鏈間二硫鍵。由此產生之同二聚體抗體可具有提高之內在化能力及/或增強之補體介導之細胞殺死及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。具有增強之抗腫瘤活性的同二聚體抗體亦可使用異雙官能交聯劑來製備。可替代地，抗體可經工程改造，以具有雙重Fc區且從而具有增強之補體溶解及ADCC能力。

與本文揭示之抗VEGF HCAb之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性、至少93%一致性、至少96%一致性或至少98%一致性的抗VEGF HCAb亦在本發明之範疇內。

例示性變異體或突變抗VEGF HCAb包含SEQ ID NO: 5、9及13之一或多個序列，或選自SEQ ID NO: 6-8及10-12之一或多個CDR，其中一或多個胺基酸經根據表1之胺基酸取代。在一些實施例中，添加、取代或缺失多達1個、多達2個、多達3個、多達4個、多達5個、多達6個、多達7個、多達8個、多達9個、多達10個、多達12個、多達14個、多達16個、多達18個或多達20個胺基酸，條件為經取代之序列保留未經取代之序列的結合特異性，或具有增加之結合特異性。在其他實施例中，添加、取代或缺失多達1個、多達2個、多達3個、多達4個、多達5個、多達6個、多達7個、多達8個、多達9個、多達10個、多達12個、多達14個、多達16個、多達18個或多達20個胺基酸，條件為經取代之序列保持與未經取代之序列整個長度至少85%一致性、至少90%一致性、至少93%一致性、至少96%一致性或至少98%一致性。

在某些實施例中，變異體或突變抗VEGF HCAb在可變區中包括一或多個添加、取代或缺失。在一些實施例中，變異體或突變抗VEGF HCAb在一或多個互補決定區中包括一或多個添加、取代或缺失。在一些實施例中，變異體或突變抗VEGF HCAb在一或多個構架區中包括一或多個添加、取代或缺失。在更多實施例中，變異體或突變抗VEGF HCAb在一或多個恆定區中包括一或多個添加、取代或缺失。

在某些實施例中，變異體或突變抗VEGF HCAb在CDR1中包括一或多個添加、取代或缺失。在一些實施例中，變異體或突變抗VEGF HCAb在CDR2中包括一或多個添加、取代或缺失。在一些實施例中，變異體或突變抗VEGF HCAb在CDR3中包括一或多個添加、取代或缺失。

在某些實施例中，變異體或突變抗VEGF HCAb在構架1區中包括一或多個添加、取代或缺失。在一些實施例中，變異體或突變抗VEGF HCAb在構架2區中包括一或多個添加、取代或缺失。在一些實施例中，變異體或突變抗VEGF HCAb在構架3區中包括一或多個添加、取代或缺失。在一些實施例中，變異體或突變抗VEGF HCAb在構架4區中包括一或多個添加、取代或缺失。在一些實施例中，變異體或突變抗VEGF HCAb在鉸鏈區中包括一或多個添加、取代或缺失。

本文亦揭示免疫結合物，其包含結合於細胞毒性劑，諸如化學治療劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即放射性結合物)的本文所述之抗體。

已描述適於產生此類免疫結合物之化學治療劑。可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa ))、篦麻毒素A鏈、肉毒毒素、相思豆毒蛋白A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麯黴素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美國商陸(Phytolaca americana )蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒素、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、絲林黴素(mitogellin)、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及單端孢黴烯(tricothecenes)。多種放射性核素可用於產生放射性結合之單特異性或雙特異性抗PDGF抗體。實例包括²¹² Bi、¹³¹ I、¹³¹ In、⁹⁰ Y及¹⁸⁶ Re。

使用諸如以下之多種雙官能蛋白質偶合劑製造抗體與細胞毒性劑之結合物：N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞醯胺基酯之雙官能衍生物(諸如二甲基己二醯亞胺酯HCL)、活性酯(諸如二丁二醯亞胺基辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如伸甲苯基2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。碳-14標記之1-異硫氰酸基苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於將放射性核苷酸結合於抗體之示例性螯合劑。

在另一實施例中，抗體可結合於「受體」(諸如抗生蛋白鏈菌素)以用於預先靶向，其中向患者投與抗體-受體結合物，接著使用清除劑自循環中移除未結合之結合物，然後投與結合於細胞毒性劑(例如放射性核素)之「配位體」(例如抗生物素蛋白)。

本文揭示之單特異性、雙特異性或三特異性抗VEGF抗體亦可在脂質體中調配。含有抗體之脂質體藉由所屬領域中已知，諸如US4,485,045、US4,544,545及US5,013,556中所述之方法製備。尤其有用之脂質體可藉由用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物進行逆相蒸發法來產生。經由界定孔徑之過濾器擠壓脂質體，以產生具有所需直徑之脂質體。抗體之Fab'片段可經由二硫化物互換反應結合於脂質體。

單特異性、雙特異性或三特異性抗VEGF抗體之共價修飾亦包括在本發明之範疇內。適用時，其可藉由化學合成或藉由抗體之酶促或化學裂解製成。藉由使靶向之抗體胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或N或C端殘基反應之有機衍生化劑反應，將抗體之其他類共價修飾引入分子中。多肽之例示性共價修飾描述於US5,534,615中，關於多肽之共價修飾的所有揭示內容均以引用之方式特別地併入本文中。抗體之一類例示性共價修飾包含以US4,640,835、US4,496,689、US4,301,144、US4,670,417、US4,791,192或US4,179,337中所闡述之方式將抗體連接至多種非蛋白質聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。

本文揭示之單特異性、雙特異性及三特異性抗體可藉由重組方式產生。因此，本文揭示編碼抗體之核酸、含有編碼抗體之核酸的表現載體及包含編碼抗體之核酸的細胞。用於重組產生之方法為目前先進技術中所普遍已知的，且包含在原核細胞及真核細胞中表現蛋白質，隨後分離抗體及通常純化至醫藥學上可接受之純度。為使如上所述之抗體在宿主細胞中表現，藉由標準方法將編碼抗體序列之核酸插入表現載體中。表現在如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母或大腸桿菌細胞之適當原核或真核宿主細胞中進行，且自細胞回收抗體(上清液或溶解之後的細胞)。

因此，本文揭示之某些實施例包括一種製備單特異性、雙特異性及三特異性抗體之方法，該方法包括以下步驟：a)用至少一種包含編碼抗體之核酸分子的表現載體使宿主細胞轉型；b)在允許抗體分子合成之條件下培養宿主細胞；及c)自培養物回收該抗體分子。

藉由習知免疫球蛋白純化程序，諸如蛋白A-瓊脂糖凝膠、羥磷灰石層析法、凝膠電泳、滲析或親和層析法，適當將抗體與培養基分離。

如本文所用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換使用，且所有此類名稱均包括後代。因此，詞語「轉型體」及「轉型細胞」包括初級個體細胞及自其衍生之培養物，不考慮轉移次數。亦瞭解由於故意或無意突變，所有後代不可能在DNA內含物方面精確一致。包括具有與在最初轉型細胞中篩選相同之功能或生物活性的變異後代。在意欲不同名稱下，將自上下文顯而易見。

如本文所用，術語「轉型」係指載體/核酸轉移至宿主細胞之過程。若無強大細胞壁屏障之細胞用作宿主細胞，則可例如藉由磷酸鈣沈澱法進行轉染。但是，亦可使用諸如藉由核注射或藉由原生質體融合將DNA引入細胞中之其他方法。若使用原核細胞或含有結實細胞壁構造之細胞，則例如一種轉染方法為使用氯化鈣之鈣處理。

如本文所用，「表現」係指核酸轉錄成mRNA之過程及/或經轉錄之mRNA (亦稱為轉錄物)隨後轉譯成肽、多肽或蛋白質之過程。轉錄物及編碼多肽統稱為基因產物。若多核苷酸來源於基因組DNA，則在真核細胞中之表現可包括mRNA之剪接。

「載體」為將插入之核酸分子轉移至宿主細胞中及/或宿主細胞之間的核酸分子，尤其自我複製型。該術語包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中(例如染色體整合)的載體、主要用於DNA或RNA複製之載體複製及用於轉錄及/或轉譯DNA或RNA之表現載體。亦包括提供超過一種所述功能之載體。

「表現載體」為當引入適當宿主細胞中時可轉錄及轉譯成多肽之多核苷酸。「表現系統」通常係指由可用於產生所需表現產物之表現載體構成的合適宿主細胞。

如本文所用，術語「宿主細胞」表示可經工程改造以產生本文揭示之抗體的任一類細胞系統。在一個實施例中，HEK293細胞及CHO細胞用作宿主細胞。

適合於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、強化子及聚腺苷酸化信號。

當核酸與另一核酸序列處於功能關係時，其係「可操作地連接」。舉例而言，若用於前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其可操作地連接於多肽之DNA；若啟動子或強化子影響編碼序列之轉錄，則其可操作地連接於該序列；或若核糖體結合位點之位置有助於轉譯，則其可操作地連接於編碼序列。一般地，「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列相鄰，且在分泌前導序列之情況下，相鄰且處於閱讀框內。但是，強化子無需相鄰。藉由在適宜限制位點連接實現連接。若此類位點不存在，則根據習知實踐使用合成寡核苷酸銜接子或連接子。

本文亦揭示編碼單特異性、雙特異性或三特異性抗VEGF抗體之分離之核酸序列、包含核酸之載體及宿主細胞以及用於產生抗體之重組技術。

為重組產生抗體，可分離編碼其之核酸且插入可複製載體中，以供進一步選殖(DNA擴增)或表現。在一些實施例中，抗體可藉由例如如US5,204,244中所述之同源重組產生，關於抗體產生之所有揭示內容以引用之方式特別地併入本文中。容易使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合於編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)分離編碼抗體之DNA且進行測序。可利用許多載體。載體組分一般包括(但不限於)以下一或多種：信號序列、複製起點、一或多種標記物基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列，例如如US5,534,615中所述，關於蛋白質表現之所有揭示內容以引用之方式特別地併入本文中。

本文中適用於在載體中選殖或表現DNA之宿主細胞為上述原核生物、酵母或高等真核生物細胞。用於達成此目的之合適原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae )，諸如埃希氏桿菌屬(Escherichia )，例如大腸桿菌(E. coli )、腸桿菌屬(Enterobacter )、歐文氏菌屬(Erwinia )、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella )、變形桿菌屬(Proteus )、沙門氏桿菌屬(Salmonella )(例如鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium ))、沙雷氏菌屬(Serratia )(例如黏質沙雷氏菌(S. marcescans ))及志賀桿菌屬(Shigella )以及桿菌屬(Bacilli )，諸如枯草芽孢桿菌(B. subtilis )及地衣芽孢桿菌(B. licheniformis )、假單胞菌屬(Pseudomonas )(諸如綠膿桿菌(P. aeruginosa ))及鏈黴菌屬(Streptomyces )。一種例示性大腸桿菌選殖宿主為大腸桿菌294 (ATCC 31,446)，不過諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776 (ATCC 31,537)及大腸桿菌W3110 (ATCC 27,325)之其他菌株亦為合適的。此等實例為說明性的，而非限制性的。

除原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適於編碼單特異性或雙特異性人類抗PDGF抗體之載體的選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )或常見麵包酵母(baker's yeast)為最常用之低等真核宿主微生物。但是，本文中通常可利用及使用許多其他屬、物種及菌株，諸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )；克魯維酵母屬(Kluyveromyces )宿主，諸如乳酸克魯維酵母(K. lactis )、脆壁克魯維酵母(K. fragilis )(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus )(ATCC 16,045)、魏氏克魯維酵母(K. wickeramii )(ATCC 24,178)、瓦氏克魯維酵母(K. waltii )(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K. drosophilarum )(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans )及馬克斯克魯維酵母(K. marxianus )；耶氏酵母(Yarrowia )(EP 402,226)；巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris )(EP 183,070)；念珠菌屬(Candida )；瑞氏木黴(Trichoderma reesia )(EP 244,234)；粗糙鏈孢黴(Neurospora crassa )；許旺酵母屬(Schwanniomyces )，諸如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis )；及絲狀真菌，諸如脈孢菌(Neurospora )、青黴菌(Penicillium )、彎頸黴屬(Tolypocladium )及麴菌屬(Aspergillus )宿主，諸如構巢麴菌(A. nidulans )及黑麴菌(A. niger )。

適用於表現糖基化單特異性或雙特異性人類抗PDGF抗體之宿主細胞源自於多細胞生物體，包括無脊椎動物細胞，諸如植物及昆蟲細胞。已鑑別許多桿狀病毒菌株及變異體以及來自諸如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda )(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti ) (蚊子)、白紋伊蚊(A. albopictus )(蚊子)、果蠅(Drosophila melanogaster ) (果蠅)及家蠶(Bombyx mori )之宿主的對應容許之昆蟲宿主細胞。可公開獲得多種用於轉染之病毒株，例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica ) NPV之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5病毒株，且此類病毒可用作本發明之本文中之病毒，尤其用於轉染草地貪夜蛾細胞。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及菸草之植物細胞培養物亦可用作宿主。

但是，最關注脊椎動物細胞，且在培養物中繁殖脊椎動物細胞(組織培養)已成為一種常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為由SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎細胞株(293或經次選殖以懸浮培養生長之293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO)；小鼠足細胞(TM4)；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝癌細胞(Hep G2)。

宿主細胞用上述表現載體轉型以產生單特異性、雙特異性或三特異性抗VEGF抗體，且在視情況而改變之習知培養基中培養，以誘發啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因。

用於產生單特異性、雙特異性或三特異性抗VEGF抗體之宿主細胞可在多種培養基中培養。諸如Ham's F10 (Sigma)、最低必需培養基((MEM) (Sigma))、RPMI-1640 (Sigma)及達爾貝科改質伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM，Sigma)適合於培養宿主細胞。此外，US4,767,704、US4,657,866、US4,927,762、US4,560,655或US5,122,469、WO 90/03430、WO 87/00195或US Re. 30,985可用作宿主細胞之培養基。此等培養基中之任一者可根據需要補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCIN™)、痕量元素(定義為通常以微莫耳範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或同等能量來源。任何其他所需補充劑亦可以所屬領域之技術人員已知之適當濃度包括。諸如溫度、pH值及其類似物之培養條件為以前與經選擇用於表現之宿主細胞一起使用的條件，且將為一般技術者顯而易見。

當使用重組技術時，抗體可在細胞內、在周質間隙中產生或直接分泌至培養基中。若抗體在細胞內產生，則作為第一步驟，例如藉由離心或超濾來移除微粒碎片，亦即宿主細胞或溶解片段。

由細胞製備之抗體組合物可使用例如羥磷灰石層析法、凝膠電泳、滲析及親和層析法來純化，其中親和層析法為較佳純化技術。蛋白A作為親和力配位體之適合性視物種及抗體中存在之任何免疫球蛋白Fc結構域之同型而定。蛋白A可用於純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈之抗體。對於所有小鼠同型及人類γ3，推薦蛋白G。親和力配位體所連接之基質最常為瓊脂糖，但可利用其他基質。諸如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯之機械穩定基質允許比用瓊脂糖可實現更快之流速及更短之加工時間。在抗體包含CH3結構域之情況下，Bakerbond ABX™樹脂適用於純化。亦可利用用於純化蛋白質之其他技術，諸如在離子交換管柱上分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽上層析法、肝素SEPHAROSE™上層析法、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)上層析法、聚焦層析、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱，視待回收之抗體而定。

在任何初始純化步驟後，包含所關注抗體及污染物之混合物可經受低pH值疏水性相互作用層析法，使用溶析緩衝液，pH值在約2.5-4.5之間，較佳在低鹽濃度(例如約0-0.25M鹽)下進行。

本文亦揭示使用單特異性、雙特異性或三特異性抗VEGF抗體治療眼科病症之方法。眼科病症之實例包括(但不限於)年齡相關之黃斑變性(AMD)、脈絡膜新血管形成(CNV)、囊樣黃斑水腫(CME)、近視相關之脈絡膜新血管形成、血管樣紋、糖尿病性黃斑水腫(DME)、黃斑水腫、由視網膜靜脈阻塞引起之黃斑水腫及眼睛前部血管生成，如例如角膜炎、角膜移植或角膜成形術後角膜血管生成；由缺氧引起之角膜血管生成(廣泛佩戴隱形眼鏡)、翼狀胬肉結膜、視網膜下水腫及視網膜內水腫。年齡相關之黃斑變性(AMD)之實例包括但不限於乾性或非滲出性AMD或者濕性或滲出性或新生血管性AMD。

黃斑變性亦稱為年齡相關之黃斑變性，係美國50歲以上人群視力損失之最常見原因，且其發病率隨著年齡而增加。AMD分成濕性(新生血管性)或者乾性(非新生血管性)。該疾病之乾性形式為最常見的。其發生在中心視網膜已變形、有顏色或最通常變薄時，此為與視網膜色素上皮細胞萎縮及黃斑光感受器損失有關的過程。結果為中心地圖狀萎縮。該疾病之濕性形式引起最嚴重之視力損失。雖然濕性形式通常與老化有關，但可引起濕性黃斑變性之其他疾病包括嚴重近視及一些眼內感染，諸如組織胞漿菌病，此等在AIDS個體可能加重。濕性形式之特徵在於異常血管穿過視網膜色素上皮細胞生長，引起出血、滲出、結疤或視網膜剝離。

本文揭示用於治療眼部病症之單特異性、雙特異性或三特異性抗VEGF抗體之持續釋放調配物。因此，單特異性、雙特異性及三特異性抗VEGF抗體可經3至6個月時間自持續釋放藥物遞送系統釋放至玻璃體，以長期治療諸如乾性AMD之慢性眼睛病狀。

水凝膠為一種膠狀凝膠，其呈於水或其他水性介質中之分散液形成。因此，在形成膠體時，形成水凝膠，其中分散相(聚合物)與連續相(亦即水)組合，產生黏性膠狀產物；例如凝結矽酸。水凝膠為經由化學或物理鍵結交聯的親水性聚合物鏈之三維網狀物。因為聚合體鏈具有親水性，所以水凝膠吸水且膨脹(除非其已吸收最大量之水)。膨脹過程與未交聯之親水性聚合物的溶解相同。根據定義，水佔水凝膠總重量(或體積)之至少10%。

水凝膠之實例包括合成聚合物，諸如多羥基甲基丙烯酸乙酯，及化學或物理交聯之聚乙烯醇、聚丙烯醯胺、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚氧化乙烯及水解聚丙烯腈。作為有機聚合物之水凝膠之實例包括共價或離子交聯之基於多醣之水凝膠，諸如海藻酸鹽、果膠、羧甲基纖維素、肝素、透明質酸鹽及來自幾丁質、殼聚糖、普魯蘭多糖、結冷膠及黃原膠之水凝膠的多價金屬鹽。用於實驗之特定水凝膠為纖維素化合物(亦即羥丙基甲基纖維素[HPMC])及高分子量透明質酸(HA)。

在一些實施例中，揭示用於玻璃體內注射之水凝膠調配物，其使用聚合透明質酸及本文揭示之單特異性及/或雙特異性人類抗PDGF抗體。此藥物遞送系統可提供3至6個月時間內低日劑量之單特異性、雙特異性或三特異性抗VEGF抗體的持續釋放，且防止自乾性AMD轉變成濕性AMD。藥物遞送系統亦可包含單特異性、雙特異性或三特異性抗VEGF在水凝膠中之微球囊封。持續釋放之藥物遞送系統可提供眼睛中必要之抗VEGF阻斷，以降低自乾性進展至新生血管性AMD之可能性。另外，在持續時間段內在眼睛中釋放之低劑量不提供全身毒性水準之藥劑。

持續釋放之藥物遞送系統亦可用於提供患有中心視網膜靜脈阻塞之處於新血管形成風險下之患者中及患有重度非增生性糖尿病性視網膜病之處於進展至新生血管性疾病風險下之患者中持續釋放之抗VEGF阻斷。

可替代地，藥物遞送系統可為PLGA植入物、視情況夾持在交聯透明質酸中之脂質體囊封之抗體。另外，微球、微膠囊(在0.001至100微米範圍內)及脂質體具有改質之表面，以產生與水凝膠聚合物之相互作用，從而改變釋放。

本文中亦涵蓋特定藥物遞送系統調配物及用於投與此等藥物遞送系統以治療眼部病狀之方法。眼球內投與可藉由植入或注射至眼睛之玻璃腔(後房)中。在本發明之範疇內的藥物遞送系統可為生物可降解之植入物及/或微球。藥物遞送系統可為整體的，亦即活性劑均勻分配或分散在可生物降解之聚合物中。治療劑可自根據本發明製造之藥物遞送系統釋放，歷時介於約2小時至12個月或更長時間之間的時間段。藥物遞送系統之一種重要特徵為其不包括用於將藥物遞送系統固定至其投與之眼球內位置的任何方式(諸如帽、突起或縫線拉片)。

在本發明範疇內之藥物遞送系統的一個重要特徵在於其可植入或注射至眼球內位置(諸如前筋膜下、結膜下、玻璃體內或脈絡膜上位置)，以提供治療劑之持續釋放，而在眼球內植入或注射部位處或相鄰處不會發生或持續顯著免疫原性。

聚丙交酯(PLA)聚合物呈兩種化學形式聚(L-丙交酯)及聚(D,L-丙交酯)存在。純聚(L-丙交酯)為立體規則的，因此，亦高度結晶，因此在活體內以極緩慢速率降解。聚(D,L-丙交酯)為立體隨機的，此導致在活體內更快速降解。因此，作為主要聚(L-丙交酯)聚合物之混合物，其餘為聚(D-丙交酯)聚合物的PLA聚合物在活體內之降解速率比主要為聚(D-丙交酯)聚合物之PLA聚合物慢。PLGA為將聚(D,L-丙交酯)與聚(乙交酯)以多種可能比率組合的共聚物。PLGA中乙交酯含量愈高，聚合物降解愈快。

在一些實施例中，用於眼球內投與(亦即藉由玻璃體內植入或注射)之藥物遞送系統包含至少75重量百分比PLA及至多約25重量百分比之聚(D,L-丙交酯-共乙交酯)聚合物、由其組成或基本上由其組成。

微球(併有抗新生血管性劑)懸浮在水凝膠(諸如聚合物透明質酸)中之懸浮液亦在範疇內，其可經由注射器針頭投與眼球內位置。投與此類懸浮液需要微球懸浮液在25℃下之黏度小於約300,000 cP。水在25℃下之黏度為約1.0 cP (cP或cps為厘泊，黏度之一種量度)。在25℃下，橄欖油之黏度為84 cP，蓖麻油之黏度為986 cP，且丙三醇之黏度為1490 cP。

藥物遞送系統中存在之抗體可均勻分散在藥物遞送系統之可生物降解之聚合物中。可生物降解之聚合物的選擇可隨所需釋放動力學、患者耐受性、待治療之疾病的性質及其類似因素而變。考慮之聚合物特徵包括(但不限於)在植入部位之生物相容性及生物可降解性、與所關注活性劑之相容性及加工溫度。可生物降解之聚合物基質通常包含至少約10重量百分比、至少約20重量百分比、至少約30重量百分比、至少約40重量百分比、至少約50重量百分比、至少約60重量百分比、至少約70重量百分比、至少約80重量百分比或至少約90重量百分比之植入物。在一種變體中，可生物降解之聚合物基質包含約40重量%至50重量%之藥物遞送系統。

可使用之可生物降解之聚合物包括(但不限於)由諸如有機酯或醚之單體製成之聚合物，其在降解時產生生理學上可接受之降解產物。亦可使用單獨或與其他單體組合之酸酐、醯胺、原酸酯或其類似物。聚合物一般為縮聚物。聚合物可為交聯或非交聯的。

在很大程度上，除碳及氫之外，聚合物將包括氧及氮、尤其氧。氧可呈氧基，例如羥基或醚、羰基(例如非側氧基羰基，諸如羧酸酯)及其類似物存在。氮可呈醯胺、氰基及胺基存在。可使用之可生物降解之聚合物的例示性清單描述於Heller, Biodegradable Polymers in Controlled Drug Delivery, 「CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems」, 第1卷. CRC Press, Boca Raton, Fla. (1987)中。

尤其關注羥基脂族羧酸之聚合物，均聚物或共聚物，及多醣。所關注之聚酯包括D-乳酸、L-乳酸、外消旋乳酸、乙醇酸、己內酯之均聚物或共聚物及其組合。尤其關注乙醇酸與乳酸之共聚物，其中生物降解速率由乙醇酸與乳酸之比率控制。聚(乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)共聚物中每種單體之百分比可為0-100%、約15-85%、約25-75%或約35-65%。在某些變體中，使用25/75 PLGA及/或50/50 PLGA共聚物。在其他變體中，PLGA共聚物與聚丙交酯聚合物結合使用。

其他試劑可用於藥物遞送系統調配物中以達成多種目的。舉例而言，可採用緩衝劑及防腐劑。可使用之防腐劑包括(但不限於)亞硫酸氫鈉、硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、氯化苯甲烴銨、氯丁醇、硫柳汞、乙酸苯汞、硝酸苯汞、對羥基苯甲酸甲酯、聚乙烯醇及苯乙醇。可採用之緩衝劑之實例包括(但不限於)碳酸鈉、硼酸鈉、磷酸鈉、乙酸鈉、碳酸氫鈉及其類似物，如FDA批准用於所需投藥途徑。可用於在膠體及/或諸如氯化鈉及氯化鉀之電解質中穩定粒子的界面活性劑亦可包括於調配物中。藥物遞送系統亦可包括酸及鹼賦形劑以控制微環境中以及界面(擴散停滯層)之pH值。

生物可降解之藥物遞送系統亦可包括加速或延遲活性劑釋放之額外親水性或疏水性化合物。另外，諸如美國專利第5,869,079號中所述之釋放調節劑的釋放調節劑可包括於植入物中。所採用之釋放調節劑之量將視所需釋放特徵、調節劑活性及缺少調節劑時糖皮質激素之釋放特徵而定。在緩衝劑或釋放增強劑或調節劑為親水性的情況下，其亦可充當釋放促進劑。親水性添加劑用以經由包圍藥物粒子之物質的更快溶解增加釋放速率，此增加暴露之藥物之表面積，從而增加藥物擴散速率。類似地，疏水性緩衝劑或增強劑或調節劑可更緩慢地溶解，減緩藥物粒子之暴露，從而減慢藥物擴散速率。

在本發明範疇內之藥物遞送系統可用分散在可生物降解之聚合物內之活性劑抗體粒子調配。不受理論束縛，咸信活性劑之釋放可藉由可生物降解之聚合物基質侵蝕及藉由微粒劑擴散至眼內液，例如玻璃體液中，隨後聚合物基質溶解及活性劑釋放來實現。影響活性劑自植入物釋放之動力學之因素可包括諸如植入物之尺寸及形狀、活性劑粒子之尺寸、活性劑之溶解性、活性劑與聚合物之比率、製造方法、暴露表面積、植入物之密度及聚合物之侵蝕速率的特徵。

活性劑之釋放速率可至少部分地視構成可生物降解之聚合物基質之聚合物骨架組分的降解速率而定。舉例而言，縮聚物可藉由水解(以及其他機制)降解，因此，增強植入物對水之吸收的植入物組成之任何改變將可能增加水解速率，從而增加聚合物降解及侵蝕速率，因此增加活性劑釋放速率。活性劑之釋放速率亦可受活性劑之結晶度、植入物中之pH值及界面處之pH值影響。

本發明之藥物遞送系統之釋放動力學可部分地視藥物遞送系統之表面積而定。較大表面積使更多聚合物及活性劑暴露於眼內液，引起聚合物更快侵蝕且眼內液中活性劑粒子更快溶解。

本文亦揭示包含單特異性人類抗VEGF HCAb、其中一種特異性為VEGF之雙特異性抗體或其中一種特異性為VEGF之三特異性抗體的醫藥組合物。亦揭示本文所述之抗體用於製造醫藥組合物之用途。亦揭示使用所揭示之抗體及包含抗體之醫藥組合物治療眼部病症之方法。

如本文所用，「醫藥載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑以及生理學上相容之其類似物。較佳地，載劑適合於靜脈內、肌肉內、眼球內、玻璃體內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。

本文揭示之組合物可藉由所屬領域中已知之多種方法投與。如熟練技術人員所瞭解，投與途徑及/或模式將視所需結果而變。為藉由某些投藥途徑投與所揭示之抗體，可能需要將抗體與防止其失活之物質相關聯或抗體與此物質共同投與。舉例而言，抗體可在適當載劑，例如脂質體或稀釋劑中投與個體。醫藥學上可接受之稀釋劑包括鹽水及水性緩衝溶液。醫藥載劑包括無菌水溶液或分散液及臨用時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。此類用於醫藥活性物質之介質及試劑的用途為所屬領域中已知。

如本文所用，短語「非經腸投與(parenteral administration)」及「非經腸投與(administered parenterally)」意謂除經腸及局部投與以外之投與模式，通常藉由注射進行，且包括不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、眼球內、玻璃體內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。

此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。可藉由上述滅菌程序及藉由包括多種抗細菌及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其類似物來預防微生物之存在。亦需要在組合物中包括等滲劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可藉由包括諸如單硬脂酸鋁及明膠之延遲吸收之試劑，延長可注射醫藥形式之吸收。

不管所選投藥途徑如何，可呈合適水合形式使用之所揭示之抗體及/或含有該等抗體之醫藥組合物均可藉由所屬領域之普通技術人員已知之習知方法調配成醫藥學上可接受之劑型。

醫藥組合物中活性成分之實際劑量水準可變化，以便獲得針對特定患者、組合物及投與模式，活性成分有效實現所需治療反應且對患者無毒之量。所選劑量水準將視多種藥物動力學因素而定，該等因素包括所採用之本發明之特定組合物的活性、投藥途徑、投與時間、所採用之特定化合物之排泄速率、治療持續時間、與所採用之特定組合物組合的所使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療之患者的年齡、性別、體重、情況、整體健康及先前病史以及醫學領域中熟知之類似因素。

當在玻璃體內遞送時適用於本文揭示之醫藥組合物的劑量在每隻眼睛約0.1 mg至約50 mg範圍內。其他合適劑量包括(但不限於)每隻眼睛約0.2 mg至約40 mg、每隻眼睛約0.3 mg至約30 mg、每隻眼睛約0.4 mg至約20 mg、每隻眼睛約0.5 mg至約15 mg、每隻眼睛約0.5 mg至約10 mg、每隻眼睛約0.5 mg、每隻眼睛約0.75 mg、每隻眼睛約1 mg、每隻眼睛約1.5 mg、每隻眼睛約2 mg、每隻眼睛約2.5 mg、每隻眼睛約3 mg、每隻眼睛約3.5 mg、每隻眼睛約4 mg、每隻眼睛約4.5 mg、每隻眼睛約5 mg、每隻眼睛約5.5 mg、每隻眼睛約6 mg、每隻眼睛約6.5 mg、每隻眼睛約7 mg、每隻眼睛約7.5 mg、每隻眼睛約8 mg、每隻眼睛約8.5 mg、每隻眼睛約9 mg、每隻眼睛約9.5 mg、每隻眼睛約10 mg、每隻眼睛約11 mg、每隻眼睛約12 mg、每隻眼睛約13 mg、每隻眼睛約14 mg、每隻眼睛約15 mg、每隻眼睛約15 mg、每隻眼睛約17 mg、每隻眼睛約18 mg、每隻眼睛約19 mg或每隻眼睛約20 mg。

組合物必須無菌且呈流體狀，達至組合物可藉由注射器遞送之程度。除水之外，載劑較佳為等滲緩衝生理食鹽水溶液。

可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。多數情況下，較佳組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)及氯化鈉。

包括單特異性、雙特異性及/或三特異性抗VEGF抗體之醫藥組合物及藥物遞送系統可藉由注射器注射至眼球內位置，或可藉由多種方法插入(植入)眼中，該等方法包括在鞏膜中形成切口之後藉由鑷子、藉由套管針或藉由其他類塗藥器置放。在一些情況下，套管針或塗藥器可在不產生切口下使用。在一較佳變體中，手持式塗藥器用於將一或多個生物可降解之植入物插入眼中。手持式塗藥器通常包含18-30 GA不鏽鋼針、控制桿、致動器及活塞。適用於將植入物插入後眼部或部位之裝置包括US7,090,681中揭示之裝置。

投與方法一般首先包括用針、套管針或植入裝置進入眼部內之目標區域。一旦在例如玻璃腔之目標區域內，可降低手持式裝置上之控制桿以引起致動器驅動器活塞向前。當活塞向前移動時，其可推動植入物至目標區域(亦即玻璃體)中。

可採用多種技術製造在本發明之範疇內的植入物。適用技術包括相分離法、界面法、擠壓法、壓縮法、模製法、射出模製法、熱壓法及其類似方法。

術語「眼球內注射」係指藉由進入患者眼球而投與的注射。術語「眼周注射」係指在眼睛後面，但在眼壁外面投與之注射。術語「經晶狀體懸韌帶」係指經由作為連接眼睛之睫狀體及晶狀體之一系列纖維的晶狀體懸韌帶投與的注射。術語「玻璃體內」係指經由患者眼睛直接投與眼睛內腔的注射。

本文所述之醫藥調配物可經由眼球內玻璃體內注射遞送，注射可經晶狀體懸韌帶或必要時不經晶狀體懸韌帶。此調配物之眼球內玻璃體內注射，無論經由經晶狀體懸韌帶亦或經由直接平坦部(經鞏膜)注射進行，均直接遞送有效廣譜抗生素至化膿性組織，無需多次個別藥物治療或多次個別注射緊急混配至眼睛中。

通常，上述醫藥組合物將在眼球內投與需要治療之哺乳動物個體(例如人類、貓、犬、其他寵物、家畜、野生動物或農畜)。使用眼科學領域之一般技術人員已知之方法及技術將組合物經玻璃體內及經晶狀體懸韌帶注射。

通常，可採用經由典型27規格套管之遞送，利用1 mL TB注射器，注意在即將注射時使用瞬間彈開及震盪使調配物再懸浮。此調配物所需之醫藥體積(亦即劑量)基於眼睛病症之類型及關於添加至密閉眼球內空間之注射可用體積的解剖學因素而變化。

另外，前房內(亦即前房)注射在本發明之範疇內。

在替代實施例中，必要時或需要時，調配物亦可呈滴眼劑或眼部噴霧之形式以及經由結膜下注射、眼球內前房內注射、前筋膜下注射、關節內注射或病變內注射來遞送，尤其但不限於在必要時在保證患者需要時遞送其他藥物治療的一些情況下。

提供以下實例、序列表及圖以幫助瞭解本發明，其真正範疇闡述於隨附申請專利範圍中。應瞭解在不脫離本發明之精神下可在所闡述之程序中進行修改。實例實例 1. 用 VEGF-A 對美洲駝進行免疫接種

所有動物程序均根據實驗動物照護與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)建立之準則在USDA及OLAW驗證合格之設備(Abcore, Inc., San Diego, CA)中進行。

最初將美洲駝用500 μg經純化之人類VEGF-A及完全弗氏佐劑(CFA, Sigma, St. Louis, MO)在第0天在8個不同部位(每個部位62.5 μg)皮下(SC)進行免疫接種。將美洲駝用500 μg經純化之人類VEGF-A及不完全弗氏佐劑(IFA, Sigma, St. Louis, MO)在第15天、第29天、第57天及第84天在8個不同部位(每個部位62.5 μg) SC加強。在第111天，以相同劑量及方式將美洲駝用VEGF- A- KLH (匙孔-血藍蛋白)加強。

在第43天、第69天、第98天及第125天獲得生產出血(各500 ml)。測定血清抗體滴度且來自各出血之PBMC儲存在RNA溶解緩衝液中。

當收集來自各出血之抗血清且亦包括來自前述出血之抗血清時，藉由ELISA測試抗血清對VEGF-A的反應性及特異性。進行兩次獨立測試，不同結合情況下各一次，以確定活性。在免疫接種方案結束時，抗血清滴度在超過600,000稀釋下呈陽性，且超過10,000稀釋下呈絕對陽性。表 2. 如藉由ELISA測定之抗血清滴度實例 2. 抗 VEGF 文庫構築

基於抗血清結果，在第125天收集之PMBC用於構築VHH文庫。自溶解細胞純化總RNA且用作RT-PCR之模板以構築單域抗體文庫。在使用特定引子進行PCR之後純化編碼VHH之DNA。噬菌體呈現載體pADL20c (AbDesign Labs, San Diego)用於選殖。獲得1.3×10⁸ 個獨立純系之文庫。隨機挑選十個純系且測序。所有純系均在正確閱讀框中具有VHH插入物。

用塗佈抗原之盤篩選噬菌體呈現抗體文庫。四輪淘選之後，隨機挑選95個純系以選擇個別陽性純系。超過80%純系為陽性。檢查陽性溶解產物對其他抗原之特異性結合。

選擇兩種純系LA-C5及LA-D6用於進一步分析(表3)。表 3. 抗VEGF-A VH 實例 3. 抗 VEGF-A HCAb 人類化

LA-C5美洲駝VHH與人類生殖系序列IGHV3-23高度同源。因此，CDR-1、CDR-1及CDR-2自LA-C5移植至IGHV-23以產生PA-C5。將來自美洲駝主鏈之兩種胺基酸引入PA-C5位置47 (L至W)及78 (L至Y)處。

在GS SYSTEM™ (Lonza, Basel, Switzerland)表現質體中來自LA-C5之人類化抗VEGF-A VH區與IgG1鉸鏈區及CD2/CH3區融合，形成HCAb序列。將表現質體轉染至CHO細胞株中以產生完全重組Hu-C5 HCAb (表4)。表 4. 人類化Hu-C5 實例 4. 測定抗 VEGF-A HCAb Hu-C5 之結合親和力

生物層干涉測量法(BLI)為一種無標記技術，其用於量測人類VEGF A (R & D systems)與抗VEGF A HCAb抗體之結合動力學。用裝備有抗人類IgG Fc捕捉(AHC)生物感測器尖端(FortéBio®, Menlo Park, CA)之Octet QK^e 量測親和力。在30℃下在1x PBS緩衝液(Gibco®, PBS pH7.2)中進行分析。在1000 rpm下攪動樣品。在分析前，將感測器濕潤15分鐘。測試經純化之抗VEGF A HCAb抗體與AHC感測器尖端之結合能力。使用20 μg/ml抗VEGF A HCAb抗體負載尖端。負載進行300秒，使得捕捉水準在1.8與2 nm之間。藉由在1x PBS中稀釋至100 nM、150 nM、250 nM、350 nM之濃度，製備人類VEGF-A抗原以供結合分析。開始締合且監測200秒，接著將尖端轉移至無因子蛋白質(Gibco, PBS pH 7.2)之1x PBS緩衝液，以監測解離。在整個實驗中收集感測器資料，且使用Octet資料分析軟體7 (FortéBio®)加工及分析。結合結果呈現於表5中。

動力學資料分析指示抗VEGF-A HCAb Hu-C5分子以高結合親和力結合於人類VEGF A。表 5. 抗 VEGF-A HCAb 與人類 VEGF-A 之結合特徵 *超過偵測極限實例 5. 抗 VEGF-A HCAb Hu-C5 之基於細胞之功能表征

在人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中量測VEGF依賴性鈣動員。在補充有SingleQuots生長因子及補充劑(LONZA)之EGM-Plus完全培養基中將HUVEC稀釋至1.6×10⁵ 個細胞/毫升，且將50 μl添加至384孔黏連蛋白盤之各孔中。將培養盤在37℃及5% CO₂ 下培育隔夜。在刺激前一小時，接著移除培養基，且將HUVEC負載含鈣敏感染料Fluo4 NW (Invitrogen, Inc.)之分析緩衝液(AB (1L)：880 mL H₂ O；20 mL HEPES；100 mL 10x HBSS；10 mL FBS；0.7 g 丙磺舒+ 7.5 mL 1M NaOH；每孔40 μl)。將溶液與細胞在37℃及5% CO₂ 下一起培育60分鐘。洗滌細胞且替換為25 μl分析緩衝液。藉由添加濃度在7.8 pM至2.0 nM範圍內之Hu-C5、貝伐單抗(bevacizumab)及蘭尼單抗(ranibizumab)來測定VEGF-A之抑制作用，與50 pM VEGF-A一起培育4小時，接著添加至細胞，且記錄鈣反應(圖4)。使用在所測試之各抑制劑濃度下的平均峰值螢光，一式四份地分析資料。功能分析指示抗VEGF-A HCAb Hu-C5分子完全中和VEGF A活性。實例 6. 抗 VEGF-A/ANG-2 雙特異性抗體之表徵

對VEGF-A及ANG-2具有特異性之雙特異性抗體的結構描繪於圖5中。雙特異性抗體由ANG-2特異性HCAb A33A8 VH序列(揭示於PCT/US2016/044838中，所有關於A33A8之揭示內容以引用之方式併入)藉由免疫球蛋白Fc區接合至Hu-C5 VH序列形成。(SEQ ID NO:15. QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSNTGMSWVRQAPGKGLEL VSAITPSGSGTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAKGGGNYYYISNYDYWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLVWVSRINSDGSSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGYSSGGQFDYWGQGTLVTVSS.

可用於本文揭示之雙特異性抗體中的PDGF及ANG-2序列之實例分別可見於表6及7以及共同待審之申請案PCT/US2016/046595及PCT/US2016/044838中，關於抗PDGF及抗ANG-2抗體之所有揭示內容均以引用之方式併入本文中。表 6. 抗PDGF-BB VH之序列表 7. 抗ANG-2 VH之序列

使用裝備有抗hIgG Fc捕捉(AHC)生物感測器尖端(fortéBIO, Menlo Park, CA)之fortéBIO OCTET® QK^e 系統量測親和力。為量測AHC親和力，測試經純化之抗VEGF/ANG-2雙特異性抗體與AHC感測器尖端之結合能力。使用20 μg/ml抗VEGF/ANG-2雙特異性抗體負載尖端。負載進行300秒，使得捕捉水準在1.8與2 nm之間。藉由在1x PBS中稀釋至400 nM之濃度，製備VEGF-A (R & D systems)抗原以供結合分析。開始締合且監測200秒，接著將尖端轉移至無因子蛋白質(Gibco, PBS pH 7.2)之1xPBS緩衝液，以監測解離300秒，接著將尖端轉移至第二抗原ANG-2 (R & D systems)且監測200秒，接著在1 x PBS中洗滌600秒(圖6A)，此亦藉由先負載AGN-2後負載VEGF A抗原，再負載ANG-2來進行(圖6B)。接著使用生物層干涉測量分析即時監測抗VEGF/ANG-2雙特異性抗體結合活性。基於量測之締合(「K _assoc 」)及解離(「K _dissoc 」)常數計算抗原結合親和力。使用OCTET®資料分析軟體6.4 (fortéBIO)加工及分析資料。

Octet結合曲線展示兩種抗原之連續結合，在暴露於第二抗原時第一抗原未相應解離，此表明雙特異性抗體可呈非競爭性締合同時結合所有抗原。實例 7. 針對 PDGF BB 、 VEGF-A 及 ANG-2 之三特異性抗體

用對VEGF-A、PDGF及ANG-2具有特異性之抗原結合區產生三特異性抗體。

在GS SYSTEM™ (Lonza, Basel, Switzerland)表現質體中將揭示於共同待審之申請案PCT/US2016/046595中的抗PDGF BB VH1 (P36C12)與Lucentis LgG1在N端融合，且抗ANG-2 VH3 (A33A8) (PCT/US2016/044838)與相同Lucentis IgG1在C端融合，形成三特異性序列(重鏈)(圖1)。將重鏈質體與輕鏈質體一起轉染至CHO細胞株中以產生完全人類重組三特異抗體P36-LCNT-A33 (圖8)。

圖7A-F中描繪針對VEGF-A、PDGF BB及ANG-2之三特異性抗體的Octet即時結合。

使用裝備有抗hIgG Fc捕捉(AHC)生物感測器尖端(fortéBIO, Menlo Park, CA)之fortéBIO OCTET® QK^e 系統量測親和力。為量測AHC親和力，測試經純化之抗PDGF/VEGF/ANG2三特異性抗體與AHC感測器尖端之結合能力。使用20 μg/ml抗PDGF/VEGF/ANG2三特異性抗體負載尖端。負載進行300秒，使得捕捉水準在1.8與2 nm之間。藉由在1x PBS中稀釋至400 nM之濃度，製備ANG-2 (R & D systems)抗原以供結合分析。開始締合且監測200秒，接著將尖端轉移至無因子蛋白質(Gibco, PBS pH 7.2)之1xPBS緩衝液，以監測解離300秒，接著將尖端轉移至第二抗原(VEGF-A)且監測200秒，接著在1 x PBS中洗滌300秒，接著將尖端轉移至第三抗原(PDGF BB)(圖7A)。此亦藉由先負載PDGF BB後負載VEGF A抗原，再負載ANG-2來進行(圖7B-F)。接著使用生物層干涉測量分析即時監測抗PDGF/VEGF/ANG2三特異性抗體結合活性。基於量測之締合(「K _assoc 」)及解離(「K _dissoc 」)常數計算抗原結合親和力。使用OCTET®資料分析軟體6.4 (fortéBIO)加工及分析資料。Octet結合曲線展示兩種抗原之連續結合，在暴露於第二及第三抗原時第一抗原未相應解離，此表明三特異性抗體可呈非競爭性締合同時結合所有抗原。

除非另外指示，否則說明書及申請專利範圍中所用之表述成分之量、性質(例如分子量、反應條件)等的所有數值均應理解為在一切情況下由術語「約」修飾。如本文所用，術語「約」及「大約」意謂10%至15%內，較佳5%至10%內。因此，除非相反指示，否則說明書及隨附申請專利範圍中闡述之數字參數為近似值，其可視設法由本發明獲得之所需性質而變化。至少且不試圖將同等物之原理之應用限於申請專利範圍之範疇，各數字參數將至少按照報導之有效數字及應用常規捨入技術解釋。儘管闡述本發明之寬範疇的數值範圍及參數為近似值，但特定實例中闡述之數值儘可能精確地報導。但是，任何數值均固有地含有必然由相應測試量測中存在之標準偏差引起的某些誤差。

除非本文另外指示或上下文明顯相矛盾，否則在描述本發明之上下文中(特別是在以下申請專利範圍之上下文中)使用的術語「一(a/an)」及「該」以及類似指示物將視為涵蓋單數與複數。本文中對數值範圍之敍述僅僅意欲用作個別提及該範圍內之各單獨值的一種速記方法。除非本文中另外指示，否則各個別值如同其在本文中個別地敍述一般併入說明書中。除非本文中另外指示或與上下文另外明顯相矛盾，否則本文所述之所有方法均可按任何合適順序進行。除非另外主張，否則關於本文提供之任何及所有實例或示例性語言(例如「諸如」)的使用僅僅係為更好地說明本發明，而非對本發明之範疇施加限制。說明書中之語言不應視為指示實施本發明所必要之任何未主張之要素。

本文揭示之本發明之替代要素或實施例的分組不應看作是限制。各組成員可個別或以與該組其他成員或本文中發現之其他要素的任何組合提及及主張。預期出於方便及/或可專利性之原因，組中之一或多個成員可包括在組內或自組中刪除。當出現任何此類包括或刪除時，認為說明書含有經修改之組，因此滿足隨附申請專利範圍中所用之所有馬庫什組(Markush group)的書面描述。

本文描述本發明之某些實施例，包括本發明人已知之用於實施本發明之最佳方式。當然，所屬領域之一般技術者在閱讀以上描述後，將顯而易見此等所述實施例之變體。本發明人預期熟練技術人員視情況採用此類變體，並且本發明人意欲本發明以除本文特別描述外的方式實施。因此，本發明包括隨附申請專利範圍中敍述之主題物質的為適用法律所允許的所有修改及同等物。此外，除非本文中另外指示或上下文另外明顯相矛盾，否則本發明涵蓋上述要素呈所有可能變體之任何組合。

本文揭示之特定實施例可在申請專利範圍中使用由……組成或基本上由……組成之語言進一步限制。當用於申請專利範圍時，無論每個修正申請亦或添加，過渡術語「由……組成」排除在申請專利範圍中未指定之任何要素、步驟或成分。過渡術語「基本上由……組成」將申請專利範圍之範疇限於指定物質或步驟及實質上不影響基本及新穎特徵之物質或步驟。本文中固有地或明確地描述所主張之本發明之實施例且使其能夠進行。

此外，在本說明書通篇，已經大量提及專利及印刷出版物。以上引用之各參考文獻及印刷出版物均個別地以引用之方式整體併入本文中。

最後，應瞭解本文揭示之本發明之實施例說明本發明之原理。可採用之其他修改在本發明之範疇內。因此，舉例而言(但不限制)，可根據本文中之教示利用本發明之替代構型。因此，本發明不限於如準確所示及所述之內容。

圖1描繪HCAb抗體結構。

圖2A-G描繪多價抗體之若干形式，包括雙特異性單域VH (圖2A)；雙特異性HCAb抗體(圖2B及2C)；四聚體抗體/VH雙特異性抗體(圖2D)；雙特異性Fab/VH抗體(圖2E)；重鏈/輕鏈雙特異性抗體(圖2F)；及三特異性抗體(圖2G)。第二及第三抗原結合域描繪成橢圓形。第二抗原結合域之視情況選用之位置由星號指示。

圖3描繪本文揭示之人類化HCAb之基因結構。

圖4描繪Hu-C5對人類臍靜脈內皮細胞中之VEGF依賴性鈣動員的作用。

圖5描繪雙特異性抗VEGF-A/ANG-2抗體之結構。

圖6A-C描繪使用裝備有抗hIgG Fc捕捉生物感測器尖端及塗有抗生蛋白鏈菌素之生物感測器的fortéBio OCTET® QK^e 系統對雙特異性抗VEGF-A/ANG-2 HCAb之親和力結合的不同分析。

圖7A-F描繪針對VEGF-A、PDGF BB及ANG-2之三特異性抗體的Octet即時結合之六個不同分析。

圖8描繪一種例示性三特異性抗體。

Claims

一種對VEGF具有特異性之僅含重鏈之抗體(HCAb)，其中該HCAb具有SEQ ID NO: 5、9或13中之一者的可變重鏈(VH)區序列。
一種對VEGF具有特異性之HCAb，其中該HCAb VH區序列與SEQ ID NO: 5、9或13中之一者的序列具有至少85%之一致性。
如申請專利範圍第1項或第2項之HCAb，其中VEGF為VEGF-A。
一種對VEGF-A具有特異性之HCAb，其中互補決定區(CDR)中之一或多者係選自SEQ ID NO:6-8及10-12。
一種對VEGF-A具有特異性之HCAb，其中CDR中之一或多者與選自SEQ ID NO:6-8及10-12之CDR序列具有至少85%之一致性。
一種對VEGF-A具有特異性之HCAb，其中至少一個CDR包含SEQ ID NO:6。
一種對VEGF-A具有特異性之HCAb，其中至少一個CDR包含SEQ ID NO:7。
一種對VEGF-A具有特異性之HCAb，其中至少一個CDR包含SEQ ID NO:8。
一種對VEGF-A具有特異性之HCAb，其中至少一個CDR包含SEQ ID NO:10。
一種對VEGF-A具有特異性之HCAb，其中至少一個CDR包含SEQ ID NO:11。
一種對VEGF-A具有特異性之HCAb，其中至少一個CDR包含SEQ ID NO:12。
如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之HCAb，其中該VH區之至少一個胺基酸經取代、添加或缺失，且該HCAb保留其對VEGF-A之特異性。
一種人類或人類化抗體，其與HCAb LA-C5、LA-D6及/或Hu-C5競爭結合於VEGF-A。
一種雙特異性抗體，其對VEGF具有第一特異性且對PDGF具有第二特異性。
如申請專利範圍第14項之雙特異性抗體，其中該第一特異性係由如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之HCAb展現。
如申請專利範圍第14項之雙特異性抗體，其中所述第二特異性係由選自以下之VH區展現：P36F3 (SEQ ID NO:16)、P36E10 (SEQ ID NO:17)、P36E8 (SEQ ID NO:18)、P36C12 (SEQ ID NO:19)、P36A4 (SEQ ID NO:20)、P36A3 (SEQ ID NO:21)、P36D9 (SEQ ID NO:22)、P36E4 (SEQ ID NO:23)、P36E9 (SEQ ID NO:24)、P36G9 (SEQ ID NO:25)及P36H4 (SEQ ID NO:26)。
一種雙特異性抗體，其對VEGF具有第一特異性且對ANG-2具有第二特異性。
如申請專利範圍第17項之雙特異性抗體，其中該第一特異性係由如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之HCAb展現。
如申請專利範圍第17項之雙特異性抗體，其中該第二特異性係由選自以下之VH區展現：A33A8 (SEQ ID NO:27)、A1G2 (SEQ ID NO:28)、A1F8 (SEQ ID NO:29)、A2B6 (SEQ ID NO:30)及A1B1 (SEQ ID NO:31)。
如申請專利範圍第17項之雙特異性抗體，其具有SEQ ID NO:15之胺基酸序列。
一種三特異性抗體，其對VEGF具有第一特異性，對ANG-2具有第二特異性，且對PDGF具有第三特異性。
如申請專利範圍第21項之三特異性抗體，其具有SEQ ID NO:32之重鏈序列。
如申請專利範圍第21項之三特異性抗體，其視情況包括SEQ ID NO:33之輕鏈序列。
一種治療眼科病症之方法，其包括向有需要之個體投與如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之結合VEGF之HCAb、如申請專利範圍第14項至第20項中任一項之雙特異性抗體或如申請專利範圍第21項至第23項中任一項之三特異性抗體。
如申請專利範圍第24項之方法，其中該眼科病症包含年齡相關之黃斑變性(AMD)、脈絡膜新血管形成(CNV)、囊樣黃斑水腫(CME)、近視相關之脈絡膜新血管形成、血管樣紋、糖尿病性黃斑水腫(DME)、黃斑水腫、視網膜靜脈阻塞、異常角膜血管生成、翼狀胬肉結膜、視網膜下水腫或視網膜內水腫。
如申請專利範圍第24項之方法，其中該異常角膜血管生成係由角膜炎、角膜移植、角膜成形術或缺氧引起。
一種如申請專利範圍第1項至第13項中任一項的具有VH區之結合VEGF之HCAb、如申請專利範圍第14項至第20項中任一項之雙特異性抗體或如申請專利範圍第21項至第23項中任一項之三特異性抗體的用途，其用於製造供治療有需要之個體之眼科病症的藥劑。
如申請專利範圍第27項之用途，其中該眼科病症包含年齡相關之黃斑變性(AMD)、脈絡膜新血管形成(CNV)、囊樣黃斑水腫(CME)、近視相關之脈絡膜新血管形成、血管樣紋、糖尿病性黃斑水腫(DME)、黃斑水腫、視網膜靜脈阻塞、異常角膜血管生成、翼狀胬肉結膜、視網膜下水腫或視網膜內水腫。
如申請專利範圍第27項之用途，其中該異常角膜血管生成係由角膜炎、角膜移植、角膜成形術或缺氧引起。