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TW201831203A - 己糖激酶２專一性抑制劑在急性中樞神經系統損傷疾病中的應用 - Google Patents

己糖激酶２專一性抑制劑在急性中樞神經系統損傷疾病中的應用 Download PDF

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TW201831203A
TW201831203A TW107104211A TW107104211A TW201831203A TW 201831203 A TW201831203 A TW 201831203A TW 107104211 A TW107104211 A TW 107104211A TW 107104211 A TW107104211 A TW 107104211A TW 201831203 A TW201831203 A TW 201831203A
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Abstract

本發明屬於生物醫藥領域，係關於己糖激酶專一性抑制劑在防治急性中樞神經系統損傷疾病中的應用。本發明首次發現己糖激酶2專一性抑制劑以及選擇性基因敲低己糖激酶2均可透過抑制小神經膠質細胞所介導的神經發炎反應，有效減輕大鼠中大腦動脈梗塞所造成的腦損傷，其顯示各種選擇性抑制己糖激酶2的藥物具備神經保護作用。

Description

己糖激酶2專一性抑制劑在急性中樞神經系統損傷疾病中的應用
本發明屬於生物醫藥領域，係關於己糖激酶2專一性抑制劑等在防治急性中樞神經系統損傷疾病中的應用。
腦中風又稱腦卒中，是一種急性腦血管疾病，是由於腦部血管突然破裂或因血管堵塞導致腦血流減少而引起腦組織損傷的一種疾病，包括缺血性和出血性腦中風，其中缺血性腦中風占總病例的85%左右。
目前組織漿胞素原活化劑(t-PA)是美國食品藥物管理局(FDA)批准用於抗中風的藥物。但t-PA只適用於中風發生後的3-6小時內，同時患者接受治療後也存在腦出血和腦水腫的風險，這些缺陷使得t-PA的應用十分受限，並且受益患者也非常少。因此安全有效的能用於急性缺血性腦中風防治的藥物顯得備受期待。
急性缺血性腦中風後免疫系統介導的發炎反應是一個被廣泛研究的治療靶點。但目前以此機制為治療靶點的藥物在臨床試驗中的結果並不理想。例如：芬戈莫德(Fingolimod)和那他珠(Natalizumab)單株抗體這些針對周邊免疫系統發炎反應的藥物儘管可有效抑制淋巴細胞向腦實質的滲透，但臨床試驗結果顯示接收治療後並不能使得中風患者群體受 益。因此，對缺血後小神經膠質細胞(microglia)所介導的中樞神經系統發炎反應進行深入探索可望為急性缺血性腦中風的防治提供新的治療靶點和策略。
本發明的發明人透過篩選獲得了一系列糖酵解路徑基因，鑑定出己糖激酶2(hexokinase 2)的選擇性上調介導了缺氧誘導的小神經膠質細胞的活化過程。發明人證實，具有己糖激酶2選擇性抑制活性的一系列生物活性物質可抑制缺氧誘導的小神經膠質細胞的活化過程。而且，發明人還發現，己糖激酶1和己糖激酶3干擾不能抑制缺氧誘導的小神經膠質細胞的活化過程。
因此，本發明一方面提供己糖激酶2專一性抑制劑用於製備預防和治療急性中樞神經系統損傷疾病的藥物的用途。
本發明另一方面提供包含己糖激酶2專一性抑制劑的組合物用於製備預防和治療急性中樞神經系統損傷疾病的藥物的用途。
本發明再一方面提供一種預防和治療急性中樞神經系統損傷疾病的方法，該方法包含向有需要的個體施予預防有效劑量或治療有效劑量的己糖激酶2專一性抑制劑或包含己糖激酶2專一性抑制劑的組合物。
本發明發現了己糖激酶2專一性抑制劑在防治急性中樞神經系統損傷疾病中的神經保護作用。細胞學實驗和體內動物實驗顯示選擇性己糖激酶2上調表現調控了缺氧誘導的小神經膠質細胞的活化過程以及 缺血後小膠質細胞介導的神經發炎反應，而己糖激酶2選擇性抑制劑和基因敲低(knockdown)都可顯著抑制小神經膠質細胞介導的發炎反應從而發揮神經保護作用。
本文中所使用的用語之縮寫簡稱說明如下：2-NBDG：2-[N-(7-硝基苄基-2-氧雜-1,3-二唑-4-基)胺基]-2-去氧-D-葡萄糖(2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-D-glucose)；ChIP：染色質免疫沉澱(chromatin immunoprecipitation)；DAB：3,3'-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽(3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)；DAMPs：損害相關分子模式(damage-associated molecular patterns)分子；DHAP：二羥丙酮磷酸(dihydroxyacetone phosphate)；FBP：果糖-1,6-二磷酸(fructose-1,6-biphosphate，F-1,6-2BP)；G-3-P：甘油醛-3-磷酸(glyceraldehyde 3-phosphate)；HK2：己糖激酶2(hexokinase 2)；IL-1β：介白素(interleukin-1β)；LPS：酯多醣(lipopolysaccharides)；MCAo：中大腦動脈梗塞(middle cerebral artery occlusion)；NMDA：N-甲基-D-天冬胺酸(N-methyl-D-aspartate)；PKM2：丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2)；qRT-PCR：即時定量聚合酶連鎖反應(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)；rAAV：重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus)；ROS：活性含氧物(reactive oxygen species)；siRNA：短小干擾RNA(short-interfering RNA)；和TTC：2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)。
圖1 為糖酵解路徑的增強對於缺氧所引起的小神經膠質細胞的活化是必須的。(A)為暴露於缺氧(hypoxia)環境所示時間後，BV2小神經膠質細胞的代表性圖像。比例尺：100μm(數量為4)。(B)為圖(A)中具有形態學變化的小神經膠質細胞之百分比的定量分析(數量為4)。(C)為缺氧引起的小神經膠質細胞的活化透過分子標記物CD11b的上調而確認。比例尺：25μm(數量為3)。(D)為BV2細胞缺氧顯著誘導促發炎細胞因子的產生且呈時間依賴性(數量為3)。(E)和(F)為缺氧對BV2細胞的存活率沒有影響。流式細胞儀分析顯示，在暴露於1%氧氣24小時後，AnnexinV+或PI+細胞的數量沒有顯著增加(數量為3)。(G)為在與2-[N-(7-硝基苄基-2-氧雜-1,3-二唑-4-基)胺基]-2-去氧-D-葡萄糖(2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-D-glucose，2-NBDG)共同培養並暴露於正常氧(normoxia)或缺氧1小時的細胞中2-NBDG攝取試驗的代表性圖片。比例尺：100μm。(H)為使用多功能酵素免疫分析儀定量(G)中的平均螢光強度(數量為4)。(I)為糖酵解路徑中關鍵代謝物的分析圖；標記出暴露於缺氧6小時後顯著增強的代謝物(數量為4)。(J)、(K)和(L)為糖酵解路徑的抑制劑2-去氧葡萄糖(2-DG)顯著阻斷缺氧期間的小神經膠質細胞活化。(J)為當暴露於1%氧氣時，添加或不添加2-DG的BV2細胞的圖像對比。(K)為在(J)中用2-DG處理後，活化細胞的百分比下降。比例尺：50μm(數量為4)。(L)為在缺氧條件下促發炎細胞因子的生成被2-DG顯著破壞。*<0.05；**<0.01；***<0.001。
圖2 為缺氧誘導的小神經膠質細胞活化過程涉及到己糖激 酶家族成員的上調表現。(A)為即時定量聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)分析酶的mRNA水準。圖片顯示在缺氧6小時後，這些基因的mRNA水準整體上增加(數量為3)。(B)和(C)為在缺氧所示時間後，BV2細胞(B)和原代小神經膠質細胞(primary microglial cells，pMG)(C)中的己糖激酶1(HK1)、己糖激酶2(HK2)和己糖激酶3(HK3)的蛋白水準(數量為4)。
圖3 為己糖激酶2干擾能有效抑制由缺氧誘導的小神經膠質細胞的活化過程。(A)為專一性的HK2敲低(knockdown)足以阻斷BV2小神經膠質細胞的活化表型(數量為3)。使用或不使用HK2 siRNA轉染BV2細胞24小時，並於缺氧條件下另外刺激24小時後，以西方墨點法(western blot)雜交分析所示蛋白的水準。(B)為BV2細胞轉染入己糖激酶2(HK2)不同的干擾片段後，能有效抑制由缺氧誘導的小神經膠質細胞形態學改變。(C)為HK2敲低細胞在缺氧條件下活化形態的小神經膠質細胞的百分比降低。(D)為HK2敲低顯著抑制CD11b的表現。#1、#2和#3：分別代表三個不同的HK2 siRNA(si HK2)。
圖4 為己糖激酶1(HK1)和己糖激酶3(HK3)干擾不能抑制缺氧誘導的小神經膠質細胞的活化過程。使用HK1和HK3干擾片段分別干擾己糖激酶1和己糖激酶3後(A和C)，並不能有效抑制由缺氧引起的小神經膠質細胞的活化相關的形態學改變(B和D)(數量為3)。NC：負對照組；siHK1的#1和#2：代表兩個不同的HK1 siRNA(siHK1)；siHK3的#1和#2：代表兩個不同的HK3 siRNA(siHK3)。
圖5 為丙酮酸激酶M2亞型(PKM2)干擾不能抑制缺氧誘 導的小神經膠質細胞的活化過程。(A)為缺氧刺激的BV2細胞中PKM2蛋白表現的免疫墨點法分析。(B)為PKM2敲低不影響缺氧誘導的CD11b的上調。(C)為代表性圖片顯示PKM2敲低無法抑制缺氧誘導的形態學改變。比例尺：50μm。NC：負對照組；si PKM2的#1和#2：代表兩個不同的PKM2 siRNA(si PKM2)。
圖6 為己糖激酶2抑制劑氯尼達明(lonidamine)能有效抑制由缺氧誘導的小神經膠質細胞的活化過程。(A)為缺氧期間原代小神經膠質細胞(pMG)和BV2培養物的活化狀態在存在氯尼達明(50μM)的情況下被顯著抑制。比例尺：50μm。(B)為圖片顯示在(A)中用氯尼達明處理後活化的小神經膠質細胞的百分比降低。(C)為免疫螢光試驗顯示缺氧刺激下的BV2和pMG細胞在存在氯尼達明時，CD11b表現降低。H24：缺氧24小時。比例尺：50μm。*<0.05；**<0.01；***<0.001。n.s.：無顯著差異。
圖7 為己糖激酶2的上調表現導致組蛋白乙醯化的增加和促發炎細胞因子Il1b的轉錄表現。(A)為BV2細胞暴露於缺氧條件下6小時後，糖酵解和三羧酸(TCA)循環的代謝物之圖譜。資料表示缺氧對正常氧的倍數變化。下調代謝物以綠色方塊表示，上調代謝物以紅色方塊表示(數量為4)。(B)和(D)分別為己糖激酶2(HK2)抑制逆轉了BV2細胞的細胞內乙醯輔酶A的積聚並抑制乙醯化組蛋白(acetyl-histone)的上調。(C)為BV2細胞和原代小膠質細胞(pMG)在暴露缺氧後，組蛋白乙醯化的表現水準(數量為3)。(E)為mRNA水準的Il1b的缺氧誘導的上調 可透過HK2抑制顯著降低(數量為3)。(F)為氯尼達明預先處理降低了乙醯化組蛋白H3(AcH3)、乙醯化組蛋白H4(AcH4)與Il1b活化子的結合。每個處理組中的具有AcH3或AcH4的Il1b活化子的豐富度是相對於具有相同引子的相應輸入樣品而言的(數量為3)。*<0.05；**<0.01；***<0.001。n.s.：無顯著差異。BrPA：3-溴丙酮酸。
圖8 為氯尼達明有效保護大鼠免於中大腦動脈梗塞(MCAo)所造成的腦損傷。(A)為每個處理組(對照組、缺血再灌注組(I/R)、溶劑對照組(缺血再灌注並給予溶劑；I/R+V)和藥物處理組(缺血再灌注並給予氯尼達明；I/R+L))中2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色的腦切片的代表性圖片。(B)為每組和藥物處理組(I/R+L)中大腦梗死大小的定量，顯示氯尼達明給藥後可顯著降低MCAo造成的梗死大小(數量為6/組)。*<0.05；**<0.01；***<0.001。n.s.：無顯著差異。
圖9 為體內基因敲低己糖激酶2(HK2)有效保護大鼠免於中大腦動脈梗塞(MCAo)所造成的腦損傷。(A)為在注射AAV載體21天後，利用全腦成像基於eGFP表現來監測病毒分佈(數量為3)。(B)為大腦紋狀體切片的HK2和CD 11b染色顯示CD 11b在小神經膠質細胞中與HK2表現呈正相關(數量為6/組)。比例尺：20μm。(C)為TTC染色顯示MCAo手術後用AAV shHK2處理組中梗死面積減小(數量為6/組)。(D)為圖(C)中梗死大小的定量(數量為6/組)。(E)為紋狀體Iba-1免疫反應性試驗顯示AAV-shHK2處理顯著抑制梗死的腦半球的小神經膠質細胞的活化。比例尺：50μm。(F)為缺血腦半球的大腦皮質和紋狀體的代表性圖像， 顯示在大鼠MCAo模型中AAV9-shHK2處理後IL-1β的產生減少。
以下實施方式是對本發明作進一步說明，但本發明的實施方式不侷限於以下的實施例介紹，凡依照本發明的原理或理念所作的等同的變化或變通都應視為本發明保護的範疇。
在一方面，本發明提供一種己糖激酶2專一性抑制劑用於製備預防和治療急性中樞神經系統損傷疾病的藥物之用途。該己糖激酶2專一性抑制劑是指能夠專一性或選擇性抑制己糖激酶2(hexokinase 2)(也稱為己糖激酶II或HK2)的生物學活性的物質。
在一些實施方式中，該己糖激酶2專一性抑制劑包括己糖激酶2的抗體或其片段。該抗體是指能夠專一性結合至己糖激酶2並抑制或淬滅己糖激酶2的活性的蛋白質。該抗體的片段可包括例如Fab、Fab'、(Fab')2和Fv。該抗體或其片段的生產及純化在本領域是已知的。
在一些實施方式中，本發明所述的己糖激酶2抗體可進一步以編碼該抗體的胺基酸序列、核苷酸序列、包含該核苷酸序列或胺基酸序列的表現載體的形式存在。在一些實施方式中，本發明所述的己糖激酶2抗體可進一步以融合蛋白的形式存在於表現載體或宿主細胞中。
在一些實施方式中，該己糖激酶2專一性抑制劑包括能夠專一性抑制己糖激酶2的mRNA轉譯的物質，或能夠專一性降解己糖激酶2的mRNA的物質，例如短小干擾RNA(siRNA)、小髮夾式RNA(shRNA)、 微小RNA(miRNA)或其修飾物，從而透過RNA干擾(RNAi)機制干擾己糖激酶2的合成。siRNA、shRNA或miRNA可通過體外合成技術獲得，這在本領域是熟知的。在一些實施方式中，本發明的該siRNA、shRNA或miRNA存在於特定載體中，例如細胞中。
在一些實施方式中，該急性中樞神經系統損傷疾病是指由急性缺血或缺氧引起的中樞神經系統損傷的疾病或病症，包括但不限於，急性脊柱損傷、腦外傷、視網膜損傷、缺氧性腦損傷、急性缺血性腦損傷、缺血性腦中風、缺氧性腦中風、新生兒缺氧缺血性腦病變、中毒性腦病變、急性腦梗塞、腔隙性腦梗死、短暫性腦缺血發作、重型顱腦損傷、及腦脊髓手術和腦脊髓放射線治療等導致的腦、脊髓神經損傷。
在另一方面，本發明提供包含己糖激酶2專一性抑制劑的組合物用於製備預防和治療急性中樞神經系統損傷疾病的藥物之用途。
在一些實施方式中，該組合物中所包含的己糖激酶2專一性抑制劑如上所述，並且該組合物還可包含其他己糖激酶2抑制劑。該其他己糖激酶2抑制劑包括但不限於，2-去氧葡萄糖；氯尼達明(Lonidamine)；3-溴丙酮酸(bromopyruvic acid)；6-磷酸葡萄糖(glucose 6-phosphate)；伊馬替尼(Imatinib)；5-硫代葡萄糖(5-thio-glucose)；和茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonate)。
本發明再一方面提供一種預防和治療急性中樞神經系統損傷疾病的方法，所述方法包括向有需要的個體施予預防有效劑量或治療有效劑量的己糖激酶2專一性抑制劑或包含己糖激酶2專一性抑制劑的組合 物。
在一些實施方式中，該個體係指哺乳動物，例如人類。該施予是指透過皮下、經皮、肌內、靜脈內、動脈內、舌下、口腔或胃腸道等給藥方式將藥物用於該個體，例如人體。在一些實施方式中，可通過基因療法將己糖激酶2專一性抑制劑(例如核酸形式)施予至被治療或預防的個體。
本發明再一方面提供一種預防和治療急性中樞神經系統損傷疾病的方法，所述方法包括有此需要的個體體內選擇性或專一性降低或滅活己糖激酶2的活性。所述降低或滅活己糖激酶的活性可透過例如基因工程方式降低或消除己糖激酶2蛋白質的表現來實現。一個示例性的手段為透過單點突變改變己糖激酶2編碼核苷酸的序列。另一個示例性的手段為透過RNAi技術干擾己糖激酶2的mRNA的轉譯過程。任何本領域技術人員已知的在細胞內降低特定蛋白質表現的方法預期都可以用於本發明的方法中。
在沒有特別指明的情況下，本發明採用的材料及實驗方法為常規材料及方法。
實施例1 缺氧所引起的糖酵解路徑的增強對於小膠質細胞的活化是必須的
材料：小鼠BV2小神經膠質細胞株，高糖DMEM培養基(Gibco，11965-118)，胎牛血清(Gibco，10099-141)，2-去氧葡萄糖(Sigma-Aldrich，D8375)，2-[N-(7-硝基苄基-2-氧雜-1,3-二唑-4-基)胺基]-2-去氧- D-葡萄糖(2-NBDG，Thermo Fisher Scientific，N13195)，Annexin/PI染色試劑盒(Biotool，B32115)，流式細胞分析儀(CytoFLEX S)，雷射共軛焦顯微鏡(Nikon A1 Spectral Confocal Microscope)，缺氧工作台(Coy LABORATORY PRODUCTS)。
免疫墨點法以及免疫螢光使用抗體資訊如下：CD 11b抗體(Novus biologicals，NB 110-89474)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體(CST,11498)；介白素-1β(IL-1β)抗體(CST，12507)；IL-6抗體(Bioss，bs-6309R)；α-微管蛋白(α-Tubulin)抗體(Bioworld，AP0064)。
方法：
(a)細胞的培養：小鼠小神經膠質細胞株BV2生長在含有10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養基中，置於5% CO2，37℃的恒溫密閉式培養箱(相對濕度95%)內培養傳代，在倒置顯微鏡下觀察生長情況。大約2-3天傳代一次，取對數生長期細胞用於正式實驗。缺氧處理組細胞置於Coy缺氧工作台中，氧氣含量設置為1%，二氧化碳(CO2)含量設置為5%，其餘以氮氣(N2)填充；其他同正常培養條件。
(b)細胞蛋白提取與促發炎細胞因子蛋白表現檢測：細胞接種至35mm培養基中靜置24小時後，給以缺氧處理相應時間。之後提取細胞總蛋白檢測促發炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表現。
(c)免疫螢光檢測CD 11b表現：BV2細胞接種於雷射共軛焦專用培養盤中，給予缺氧處理24小時後使用4%多聚甲醛於室溫固定 20分鐘，之後使用PBST洗滌三次，每次5分鐘。洗滌結束後，加人由DAKO抗體稀釋液稀釋過的CD 11b抗體在4℃孵育過夜。次日加入對應的螢光標記二級抗體於37℃下孵育1小時。孵育結束後，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)反應液進行細胞核染色10分鐘。處理結束後，以PBST洗滌三次並利用雷射共軛焦顯微鏡進行成像。
(d)2-NBDG攝取實驗：BV2細胞接種於96孔板培養盤(側邊黑色，底部透明)中，24小時後更換為含有200μM 2-NBDG的DPBS緩衝液，分別置於正常氧或者缺氧環境中培養1小時，之後更換為新鮮的DPBS在螢光顯微鏡下拍照，並利用多功能酵素免疫分析儀檢測各個處理組的螢光值以代表葡萄糖的相對攝取量。
(e)Annexin/PI染色：細胞接種至35mm培養皿中靜置24小時後，給以缺氧處理24小時。用0.25%胰酶消化收集細胞。之後按照試劑盒說明書加入聯膜蛋白(Annexin)和碘化丙啶(PI)染料，30分鐘後利用流式細胞儀細胞檢測缺氧是否引起細胞的死亡。
(f)代謝物質的檢測：BV2細胞接種至60mm培養皿靜置24小時後，給以正常氧或者缺氧培養6小時。以預冷PBS洗滌細胞三次後，加入1.5ml冰凍的80%的甲醇，於-80℃冰箱中培養30分鐘。收集細胞，4℃下以14,000g離心15分鐘。取上層甲醇/水相轉移至新的離心管中，於-80℃冰箱中再次培養30分鐘。離心收集上清液至新的離心管中，在氮氣氛圍中吹乾樣品。樣品經液相-質譜分析之前置於-80℃保存。
結果：
如圖1A所示，缺氧可以誘導小膠質細胞的形態呈現出明顯的活化狀態，特點為胞體增大，偽足增多；且這種變化具有時間依賴性，在缺氧24小時後，出現活化形態的細胞大約占總細胞的52%左右(如圖1B所示)。同時，在圖1C之免疫螢光的結果中可以看到缺氧24小時後，小神經膠質細胞被活化的分子標記物CD 11b也有顯著增強。另外，如圖1D所示，促發炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6在正常對照組幾乎無表現，隨著缺氧時間的延長這些蛋白的表現量也有明顯增加。而在整個缺氧過程中，並沒有發現1%的缺氧環境會造成細胞的死亡(如圖1E和1F所示)。以上結果表明，缺氧可使得小神經膠質細胞呈現一種發炎性的活化表型。
隨著缺氧的進行，BV2細胞的正常氧糖酵解路徑也明顯增強。如圖1G和1H所示，缺氧1小時即可以引起BV2細胞葡萄糖攝取量增加約1.6倍。同時，這個過程也伴隨著糖酵解路徑代謝物的累積增加，如圖1I所示，相比於正常對照組，果糖-1,6-二磷酸(FBP)、二羥丙酮磷酸(DHAP)和甘油醛-3-磷酸(G-3-P)在缺氧處理6小時都有顯著的增加。而在使用2-去氧葡萄糖對糖酵解路徑進行抑制後，由缺氧引起的小神經膠質細胞的活化表型被顯著抑制(如圖1J-1L所示)。綜合以上所述，糖酵解路徑的增強對於缺氧誘導的小神經膠質細胞的活化是必須的。
實施例2 缺氧誘導的小神經膠質細胞活化過程涉及到己糖激酶家族成員的上調表現
材料：小鼠BV2小膠質細胞株，原代培養小鼠小神經膠質細胞，高糖DMEM培養基(Gibco，11965-118)，胎牛血清(Gibco，10099- 141)，RNA提取試劑TRIzol(Thermo Fisher Scientific，15596-018)，RNA定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific，Q10211)，SuperReal qPCR PreMix(SYBR Green)(Tiangen，FP202-01)，即時螢光定量PCR儀(Applied Biosystems)，缺氧工作台(Coy LABORATORY PRODUCTS)。
免疫墨點法使用抗體資訊：己糖激酶1(Hexokinase 1；HK1)抗體(Abcam，150423)；己糖激酶2(Hexokinase 2；HK2)抗體(CST，2867s)；己糖激酶3(Hexokinase 3；HK3)抗體(Santa Cruz，sc-28890)；α-Tubulin抗體(Bioworld，AP0064)。
即時螢光定量PCR所使用的引子資訊如下：小鼠HK1順向引子：GTAGGGGTACGCTTAGGTGG(SEQ ID NO：1)；小鼠HK1反向引子：ACCCAGGAGTCCATAAAGCC(SEQ ID NO：2)；小鼠HK2順向引子：GAGAAAGCTCAGCATCGTGG(SEQ ID NO：3)；小鼠HK2反向引子：TCCATTTGTACTCCGTGGCT(SEQ ID NO：4)；小鼠HK3順向引子：GCTCCGTTGAGAGCAGATTT(SEQ ID NO：5)；小鼠HK3反向引子：TTGCTGCAAGCATTCCAGTT(SEQ ID NO：6)；小鼠PFKM順向引子：GTTTGGAAGCCTCTCCTCCTC(SEQ ID NO：7)；小鼠PFKM反向引子：GACGGCAGCATTCATACCTT(SEQ ID NO：8)；小鼠PFKL順向引子：CGCAAGGTATGAATGCTGCT(SEQ ID NO：9)；小鼠PFKL反向引子：CGATGGTCAAGTGTGCGTAG(SEQ ID NO：10)；小鼠PGK1順向引子：CGAGCCTCACTGTCCAAACT(SEQ ID NO：11)；小鼠PGK1反向引子：GTCTGCAACTTTAGCGCCTC(SEQ ID NO：12)；小鼠PKM1順向引子：CGTCCGCAGGTTTGATGAGA(SEQ ID NO：13)；小鼠PKM1反向引子：TTCAAACAGCAGACGGTGGA(SEQ ID NO：14)；小鼠PKM2順向引子：GGCTCCTATCATTGCCGTGA(SEQ ID NO：15)； 小鼠PKM2反向引子：AAGGTACAGGCACTACACGC(SEQ ID NO：16)；小鼠Actb順向引子：TGAGCTGCGTTTTACACCCT(SEQ ID NO：17)；及小鼠Actb反向引子：TTTGGGGGATGTTTGCTCCA(SEQ ID NO：18)。
方法：
(a)細胞的培養：小鼠小神經膠質細胞株BV2生長在含有10%FBS的高糖DMEM培養基中，置於5% CO2，37℃恒溫密閉式培養箱(相對濕度95%)內培養傳代，在倒置顯微鏡下觀察生長情況。大約2-3天傳代一次，取對數生長期細胞用於正式實驗。
原代培養小神經膠質細胞：細胞分離至出生後0-2天的C57BL/6J乳鼠，具體如下：取出大腦皮層，去除腦膜和血管；用組織剪剪碎組織塊，用0.125%的胰酶於37℃消化15分鐘。以含有10% FBS的DMEM終止消化，分離的單細胞接種於培養皿中。待混合培養細胞長至融合時，輕搖培養皿分離出懸浮的小神經膠質細胞。細胞的純度使用小神經膠質細胞專一性的分子標記物CD 11b來確定。
(b)細胞蛋白提取與己糖激酶家族蛋白表現檢測：細胞接種至35mm培養中靜置24小時後，給以缺氧處理相應時間。之後提取細胞總蛋白檢測己糖激酶家族的蛋白表現。
結果：
如圖2A所示，相比於正常對照組，BV2細胞缺氧處理6小時後糖酵解路徑代謝酶在mRNA水準都有不同程度的上調表現。其中，己糖激酶1、己糖激酶2和己糖激酶3都有顯著升高。另外，BV2細胞和原代培養小神經膠質細胞在缺氧處理不同時間後，圖2B和2C中也可以看到己糖激酶家族成員在蛋白質水準都有暫時性或者持續性上調表現。
實施例3 己糖激酶2，而不是其他己糖激酶家族成員介導缺氧誘導的小神經膠質細胞的活化過程
(1)己糖激酶2干擾能有效抑制由缺氧誘導的小神經膠質細胞的活化過程
材料：小鼠BV2小神經膠質細胞株，原代培養小鼠小神經膠質細胞，高糖DMEM培養基(Gibco，11965-118)，胎牛血清(Gibco，10099-141)，siRNA片段，siRNA轉染試劑(Lipofectamine RNAiMAX Reagent，Thermo Fisher Scientific，13778-500)，倒置相差顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ti Microscope)，雷射共軛焦顯微鏡(Nikon A1 Spectral Confocal Microscope)，缺氧工作台(Coy LABORATORY PRODUCTS)。
免疫墨點法使用抗體資訊如下：己糖激酶1(Hexokinase 1，HK1)抗體(Abcam，150423)；己糖激酶2(Hexokinase 2，HK2)抗體(CST，2867s)；己糖激酶3(Hexokinase 3，HK3)抗體(Santa Cruz，sc-28890)；CD 11b抗體(Novus biologicals，NB 110-89474)；α-Tubulin抗體(Bioworld， AP0064)。
方法：
(a)細胞的培養：小鼠小神經膠質細胞株BV2生長在含有10%FBS的高糖DMEM培養基中，置於5% CO2，37℃恒溫密閉式培養箱(相對濕度95%)內培養傳代，在倒置顯微鏡下觀察生長情況。大約2-3天傳代一次，取對數生長期細胞用於正式實驗。
(b)RNA干擾：細胞接種至35mm培養中靜置24小時後，採用RNAiMAX轉染50nM siRNA片段，亂序RNA作為對照，12小時後更換為新鮮的培養基。之後給予缺氧處理24小時以檢測相應蛋白的表現量。
結果：
如圖3A-3D所示，BV2細胞轉染入HK2不同的干擾片段(si HK2)後，能有效抑制由缺氧誘導的小神經膠質細胞形態學改變；同時缺氧引起的細胞活化的標記物CD 11b的上調表現也有明顯減少。而在過程中，HK2的干擾對HK1和HK3的表現並沒有影響。
(2)己糖激酶1和己糖激酶3干擾不能抑制缺氧誘導的小神經膠質細胞的活化過程
材料：小鼠BV2小神經膠質細胞株，高糖DMEM培養基(Gibco，11965-118)，胎牛血清(Gibco，10099-141)，siRNA片段，siRNA轉染試劑(Lipofectamine RNAiMAX Reagent，Thermo Fisher Scientific，13778-500)，倒置相差顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ti Microscope)，缺氧工作台 (Coy LABORATORY PRODUCTS)。免疫墨點法使用抗體資訊如下：Hexokinase 1抗體(Abcam，150423)；Hexokinase 3抗體(Santa Cruz，sc-28890)；α-Tubulin抗體(Bioworld，AP0064)。
方法：
(a)細胞的培養：小鼠小神經膠質細胞株BV2生長在含有10%FBS的高糖DMEM培養基中，置於5% CO2，37℃恒溫密閉式孵箱(相對濕度95%)內培養傳代，在倒置顯微鏡下觀察生長情況。大約2-3天傳代一次，取對數生長期細胞用於正式實驗。
(b)RNA干擾：細胞接種至35mm培養中靜置24小時後，採用RNAiMAX轉染50nM siRNA片段，亂序RNA作為對照，12小時後更換為新鮮的培養基。之後給予缺氧處理24小時以檢測相應蛋白的表現量。
結果：
如圖4A和4C所示，使用HK1和HK3干擾片段(siHK1和siHK3)分別干擾己糖激酶1和己糖激酶3後，並不能有效抑制由缺氧引起的小神經膠質細胞的活化相關的形態學改變(圖4B和4D所示)。
(3)丙酮酸激酶M2亞型(PKM2)干擾不能抑制缺氧誘導的小神經膠質細胞的活化過程
材料：小鼠BV2小神經膠質細胞株，高糖DMEM培養基(Gibco，11965-118)，胎牛血清(Gibco，10099-141)，siRNA片段，siRNA轉染試劑(Lipofectamine RNAiMAX Reagent，Thermo Fisher Scientific， 13778-500)，倒置相差顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ti Microscope)，缺氧工作台(Coy LABORATORY PRODUCTS)。免疫墨點法使用抗體資訊如下：丙酮酸激酶M2亞型(PKM2)抗體(Abcam，150423)；CD 11b抗體(Novus biologicals，NB 110-89474)；α-Tubulin抗體(Bioworld，AP0064)。
方法：
(a)細胞的培養：小鼠小神經膠質細胞株BV2生長在含有10%FBS的高糖DMEM培養基中，置於5% CO2，37℃恒溫密閉式培養箱(相對濕度95%)內培養傳代，在倒置顯微鏡下觀察生長情況。大約2-3天傳代一次，取對數生長期細胞用於正式實驗。
(b)RNA干擾：細胞接種至35mm培養中靜置24小時後，採用RNAiMAX轉染50nM siRNA片段，亂序RNA作為對照，12小時後更換為新鮮的培養基。之後給予缺氧處理24小時以檢測相應蛋白的表現量。
結果：
如圖5A所示，在缺氧誘導的小神經膠質細胞的活化過程中，PKM2蛋白呈現出暫時上升表現的趨勢；但使用PKM2干擾片段(si PKM2)干擾PKM2的表現後，並不能有效抑制由缺氧引起的小神經膠質細胞的活化相關的形態學改變(圖5B和5C所示)。
(3)己糖激酶2抑制劑氯尼達明能有效抑制由缺氧誘導的小神經膠質細胞的活化過程
材料：小鼠BV2小神經膠質細胞株，原代培養小鼠小神經 膠質細胞，高糖DMEM培養基(Gibco，11965-118)，胎牛血清(Gibco，10099-141)，氯尼達明(lonidamine)(Selleck，S2610)，倒置相差顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ti Microscope)，雷射共軛焦顯微鏡(Nikon A1 Spectral Confocal Microscope)，缺氧工作台(Coy LABORATORY PRODUCTS)。免疫螢光使用抗體資訊如下：CD 11b抗體(Novus biologicals，NB 110-89474)；α-Tubulin抗體(Bioworld，AP0064)。
方法：
(a)細胞的培養：小鼠小神經膠質細胞株BV2生長在含有10%FBS的高糖DMEM培養基中，置於5% CO2，37℃恒溫密閉式培養箱(相對濕度95%)內培養傳代，在倒置顯微鏡下觀察生長情況。大約2-3天傳代一次，取對數生長期細胞用於正式實驗。
原代培養小神經膠質細胞：細胞分離至出生後0-2天的C57BL/6J乳鼠，具體如下：取出大腦皮層，去除腦膜和血管；用組織剪剪碎組織塊，用0.125%的胰酶於37℃消化15分鐘。以含有10% FBS的DMEM終止消化，分離的單細胞接種於培養皿中。待混合培養細胞長至融合時，輕搖培養皿分離出懸浮的小神經膠質細胞。細胞的純度使用小神經膠質細胞專一性的分子標記物CD 11b確定。
(b)免疫螢光檢測CD 11b表現：BV2細胞和原代培養小膠質細胞接種於雷射共軛焦專用培養盤中，給予缺氧處理24小時後使用4%多聚甲醛於室溫下固定20分鐘，之後使用PBST洗滌三次，每次5分鐘。洗滌結束後，加入由DAKO抗體稀釋液稀釋過的CD 11b抗體在4℃孵育 過夜。次日加入對應的螢光標記二級抗體37℃孵育1小時。孵育結束後，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)反應液進行細胞核染色10分鐘。處理結束後，以PBST洗滌三次並利用雷射共軛焦顯微鏡進行成像。
結果：
如圖6A和6B所示，BV2細胞和原代小神經膠質細胞中，給予缺氧處理24小時後，CD 11b的蛋白表現明顯上調，同時也可以觀察到呈現明顯的活化形態；但在己糖激酶2抑制劑氯尼達明存在時，CD 11b的上調表現被明顯抑制，而加入二甲基亞碸(DMSO)的溶劑對照組對CD 11b的表現並沒有影響。氯尼達明使用劑量為：50μM，DMSO為其溶劑。
實施例4 己糖激酶2的上調表現導致組蛋白乙醯化的增加和促發炎細胞因子Il1b的轉錄表現
材料：小鼠BV2小膠質細胞株，原代培養小鼠小神經膠質細胞，高糖DMEM培養基(Gibco，11965-118)，胎牛血清(Gibco，10099-141)，氯尼達明(Selleck，S2610)，3-溴丙酮酸(Sigma，16490)，RNA提取試劑TRIzol(Thermo Fisher Scientific，15596-018)，RNA定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific，Q10211)，SuperReal qPCR PreMix(SYBR Green)(Tiangen,FP202-01)，即時螢光定量PCR儀(Applied Biosystems)，染色質免疫沉澱試劑盒(Millipore，17-245)，缺氧工作台(Coy LABORATORY PRODUCTS)，倒置相差顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ti Microscope)。免疫墨點法使用抗體資訊如下：乙醯化組蛋白(acetyl-Histone)H3抗體(Millipore,06-599)；acetyl-Histone H4抗體(Millipore，06-866)；α-Tubulin抗體(Bioworld， AP0064)。
方法：
(a)細胞的培養：
小鼠小神經膠質細胞株BV2生長在含有10%FBS的高糖DMEM培養基中，置於5% CO2，37℃恒溫密閉式培養箱(相對濕度95%)內培養傳代，在倒置顯微鏡下觀察生長情況。大約2-3天傳代一次，取對數生長期細胞用於正式實驗。
原代培養小神經膠質細胞：細胞分離至出生後0-2天的C57BL/6J乳鼠，具體如下：取出大腦皮層，去除腦膜和血管；用組織剪剪碎組織塊，用0.125%的胰酶於37℃消化15分鐘。以含有10% FBS的DMEM終止消化，分離的單細胞接種於培養皿中。待混合培養細胞長至融合時，輕搖培養皿分離出懸浮的小神經膠質細胞。細胞的純度使用小神經膠質細胞專一性的分子標記物CD 11b確定。
(b)細胞蛋白提取與乙醯化組蛋白表現檢測：BV2細胞和原代培養小神經膠質細胞接種至35mm培養中靜置24小時後，給以缺氧處理相應時間。之後提取細胞總蛋白檢測乙醯化組蛋白蛋白的表現。
(c)代謝物質的檢測：BV2細胞接種至60mm培養皿靜置24小時後，給以正常氧或者缺氧培養6小時。以預冷PBS洗滌細胞三次後，加入1.5ml冰凍的80%的甲醇，-80℃冰箱中培養30分鐘。收集細胞，4℃下以14,000g離心15分鐘。取上層甲醇/水相轉移至新的離心管中-80℃ 冰箱中再次培養30分鐘。離心收集上清液至新的離心管中，在氮氣氛圍中吹乾樣品。樣品經液相-質譜分析之前置於-80℃保存。
(d)染色質免疫沉澱實驗檢測乙醯化組蛋白H3和乙醯化組蛋白H4與Il1b基因活化子區域的結合：BV2細胞接種於100mm培養皿中靜置24小時，以DMSO或者氯尼達明預處理1小時後給予缺氧處理6小時。缺氧處理結束後，在細胞培養基中加入甲醛溶液(Sigma，F8775)使之最終濃度為1%，交聯10分鐘。收集細胞，使用超聲波細胞破碎儀使之DNA斷裂成為100-1000bp。稀釋樣品，取出10%作為輸入用(input)。剩餘樣品加入乙醯化組蛋白H3或者乙醯化組蛋白H4抗體於4℃下孵育過夜。同時，等量的正常兔來源的IgG作為陰性對照。次日，加入蛋白G-瓊脂糖反應2小時。之後以洗滌液洗滌樣品，在0.2M氯化鈉(NaCl)溶液中65℃孵育4小時以解交聯。酚-氯仿法提取DNA後進行後續定量PCR反應以檢測Il1b的結合量。Il1b活化子區域的引子序列如下：順向：5’-AGGTCAAAGGTTTGGAAGCAG-3’(SEQ ID NO：19)；反向：5’-ATGGAAGTCTGTCTGCTCAGTATTG-3’(SEQ ID NO：20)。
結果：
如圖7A所示，相比於正常對照組，缺氧6小時處理組後糖酵解路徑，三羧酸循環路徑和戊糖磷酸路徑代謝物都有不同程度的改變，其 中缺氧使得乙醯輔酶A的累積最為明顯；同時這種改變可以被己糖激酶2的抑制劑氯尼達明(使用劑量：50μM)和3-溴丙酮酸(BrPA)(使用劑量：10μM)所抑制(如圖7B所示)。另外，如圖7C所示，隨著缺氧時間的延長，BV2和原代小神經膠質細胞中的乙醯化組蛋白H3和乙醯化組蛋白H4也呈現出與暫時上調表現或者持續上調表現的趨勢。
在BV2細胞中，缺氧6小時所導致的乙醯化組蛋白的上調表現也是可以被己糖激酶2的抑制劑所逆轉的，圖7D所示。進一步對促發炎細胞因子的mRNA表現水準進行檢測，如圖7E所示，即時螢光定量PCR結果顯示缺氧引起Tnfa、Il1b和Il6的mRNA上調表現，但只有Il1b可明顯被氯尼達明(使用劑量：50μM)和3-溴丙酮酸(使用劑量：10μM)所抑制。染色質免疫沉澱結果進一步顯示：缺氧後可以使得乙醯化組蛋白和Il1b的活化子結合增加，而氯尼達明預處理顯著抑制兩者的結合(圖7F所示)。
實施例5 己糖激酶2的抑制通過抑制小神經膠質細胞介導的神經發炎有效保護大鼠免於中大腦動脈梗塞所造成的腦損傷。
(1)氯尼達明有效保護大鼠免於中大腦動脈梗塞所造成的腦損傷
材料：氯尼達明(Selleck，S2610)，健康雄性SPF級Spague-Dawley(SD)大鼠，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-TriphenylTetrazolium Chloride，TTC)(分析純)，水合氯醛(分析純)(購自天津市科密歐化學試劑有限公司)，MCAo尼龍栓線。
方法：
(a)採用右側頸內動脈尼龍線線栓法製作中大腦動脈梗塞(Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAo)模型。SD大鼠手術前禁食12小時，可自由飲水。大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定於37℃恒溫手術臺上，保持呼吸通暢。頸正中切口，鈍性分離下頜下腺，顯微鏡下游離右側頸總動脈，使用微血管夾夾閉。游離右側頸外動脈，結紮其遠端，在右頸總動脈分叉至前一頸外動脈結紮線之間打一鬆結，游離右頸內動脈並用微血管夾夾閉。用顯微眼科手術剪刀在兩結紮線之間剪一小口，將尼龍栓線向下插入至頸總動脈處，將鬆結紮緊，在頸外動脈遠端結紮處下方、栓線插入的上方剪斷右頸外動脈，撤離頸內動脈處的微血管夾，並使栓線插入端在右頸總動脈分叉處。將頸外動脈拉向外下方，使其與頸內動脈處於同一直線。將栓線向頸內動脈方向插入直至感受到阻力，為防止出血將栓線紮緊。撤離微血管夾，縫合切口。手術2小時後，給予氯尼達明或者相對應溶劑對照10mg/kg，之後拔出線刷，再灌注24小時後進行腦梗死體積測量。
(b)根據相關文獻介紹方法進行腦梗死體積測量，具體為斷頭處死大鼠，迅速取出鼠腦，置於冰鹽水中10分鐘，取冠狀面均勻切成2mm厚腦切片，迅速放入1%的TTC溶液中於37℃下染色30分鐘，然後用4%多聚甲醛緩衝液固定。24小時後用數位相機拍照，輸入電腦，用影像處理軟體(ADOBE PHOTOSHOP CS6)計算每片腦片的梗死面積(粉紅色區為正常腦組織，白色區為梗死區)後積分轉換為梗死體積。梗死體積百分比=(每片腦片的梗死區域體積之和/每片腦片的全腦組織體積之和)×100%。
結果：
如圖8A所示，經TTC染色後觀察，腦缺血2小時再灌注24小時後模型組大鼠腦組織和溶劑對照組(I/R+V)腦組織都出現明顯的梗死區域，與之相比，藥物處理組(I/R+L)相應腦區的梗死程度明顯減輕。計算腦梗死體積經過統計學分析顯示，與溶劑對照組相比，10mg/kg的氯尼達明對大鼠中腦動脈梗塞造成的缺血腦損傷具有顯著保護作用(如圖8B)。
(2)體內基因敲低己糖激酶2有效保護大鼠免於中大腦動脈梗塞所造成的腦損傷
材料：氯尼達明(Selleck，S2610)，健康雄性SPF級Spague-Dawley(SD)大鼠，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-TriphenylTetrazolium Chloride，TTC)(分析純)，水合氯醛(分析純)(購自天津市科密歐化學試劑有限公司)，MCAo尼龍栓線，攜帶shHK2片段的重組腺相關病毒血清型9型(AAV-shHK2)，攜帶亂序對照片段的重組腺相關病毒血清型9型(AAV-shNC)，免疫組織化學試劑盒(Abcam，ab80436)，腦立體定位儀，倒置相差顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ti Microscope)，雷射共軛焦顯微鏡(Nikon A1 Spectral Confocal Microscope)。
方法：
(a)採用右側頸內動脈尼龍線線栓法制作中大腦動脈梗塞(Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAo)模型。SD大鼠手術前禁食12 小時，可自由飲水。大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定於37℃恒溫手術臺上，保持呼吸通暢。頸正中切口，鈍性分離下頜下腺，顯微鏡下游離右側頸總動脈，使用微血管夾夾閉。游離右側頸外動脈，結紮其遠端，在右頸總動脈分叉至前一頸外動脈結紮線之間打一鬆結，游離右頸內動脈並用微血管夾夾閉。用顯微眼科手術剪刀在兩結紮線之間剪一小口，將尼龍栓線向下插入至頸總動脈處，將鬆結紮緊，在頸外動脈遠端結紮處下方、栓線插入的上方剪斷右頸外動脈，撤離頸內動脈處的微血管夾，並使栓線插入端在右頸總動脈分叉處。將頸外動脈拉向外下方，使其與頸內動脈處於同一直線。將栓線向頸內動脈方向插入直至感受到阻力，為防止出血將栓線紮緊。撤離微血管夾，縫合切口。
(b)根據相關文獻介紹方法進行腦梗死體積測量，具體為斷頭處死大鼠，迅速取出鼠腦，置於冰鹽水中10分鐘，取冠狀面均勻切成2mm厚腦切片，迅速放入1%的TTC溶液中於37℃下染色30分鐘，然後用4%多聚甲醛緩衝液固定。24小時後用數位相機拍照，輸入電腦，用影像處理軟體(ADOBE PHOTOSHOP CS6)計算每片腦片的梗死面積(粉紅色區為正常腦組織，白色區為梗死區)後積分轉換為梗死體積。梗死體積百分比=(每片腦片的梗死區域體積之和/每片腦片的全腦組織體積之和)×100%。
(c)腦紋狀體注射rAAV9病毒：在293T細胞進行病毒包裝，qPCR測定其滴度為3.2×1012-3.5×1012V.G./ml。使用的針對於HK2的干擾序列(rAAV9-shHK2，或稱AAV9-shHK2)為：5'-GCGCAACATTCTCATCGATTT-3'(SEQ ID NO：21)；5'- AAATCGATGAGAATGTTGCGC-3'(SEQ ID NO：22)；亂序對照組shRNA序列(rAAV9-shNC，或稱AAV9-shNC)為TTCTCCGAACGTGTCACGT(SEQ ID NO：23)。使用腦立體定位儀將上述病毒分別注入大腦紋狀體區域，具體座標為：前囟前方1.0mm，中線右側3.0mm，硬膜下4.5mm。注射病毒體積為2μL，注射速度為每分鐘0.2μL。注射完畢後，微量注射劑停留在注射部位5分鐘之後再拔出。
(d)組織免疫螢光檢測病毒在腦內的分佈(eGFP)，己糖激酶2以及Iba-1(小神經膠質細胞活化的另一個分子標記物)的表現：大鼠腦缺血2小時再灌注24小時後經麻醉取出完整的腦組織，經固定石蠟包埋後切片，腦切片厚度大約為4μm。腦切片經過脫蠟，復水以及抗原修復後孵育上述抗體，於4℃下過夜。次日加入螢光標記二級抗體，37℃孵育1小時。孵育結束後，加入DAPI反應液進行細胞核染色10分鐘。處理結束後，以PBST洗滌三次並利用雷射共軛焦顯微鏡進行成像。
(e)免疫組織化學檢測IL-1β的表現：大鼠腦缺血2小時再灌注24小時後經麻醉取出完整的腦組織，經固定石蠟包埋後切片，腦切片厚度大約為4μm。腦切片經過脫蠟，復水以及抗原修復後孵育上述抗體，於4℃下過夜。次日樣品經過PBS洗滌後加入山葵過氧化酵素(HRP)連接的二級抗體，室溫孵育15分鐘後，加入DAB顯色液孵育1分鐘。最後，用蘇木精進行細胞核染色，之後利用尼康(Nikon)顯微鏡進行成像。
結果：
注射rAAV9-shHK2和rAAV9-shNC 20天後，稱量兩組動物 體重，經過統計分析後並沒有顯著差異(兩組動物體重分別為273.2±6.9g和269.3±5.0g)。手術前每組挑選三隻取出完整腦組織後根據eGFP的表現檢測病毒在腦內的分佈，圖9A成像結果顯示病毒在大腦內有較好的組織分佈。手術後切片經染色顯示：與正常對照相比，手術梗死側己糖激酶2顯著上調表現。而隨著病毒的擴散，AAV9-shHK2組的己糖激酶2表現被明顯抑制，而注射AAV9-shNC後對己糖激酶2的表現並沒有顯著影響(如圖9B所示)。TTC染色結果表明(圖9C和9D所示)，與AAV9-shNC組大鼠相比，AAV9-shHK2組大鼠的腦梗死面積有顯著減少。同時如圖9E所示，紋狀體區域Iba-1染色顯示在AAV9-shNC組大鼠腦梗死半球，小神經膠質細胞突起縮起，呈現活化形態；而AAV9-shHK2組，小神經膠質細胞呈現正常形態，且Iba-1的表現也有明顯下降。如圖9F所示，對大腦皮層和紋狀體區域的IL-1β進行免疫組織化學染色顯示：體內己糖激酶2的敲低所介導的神經保護作用是與降低IL-1β的表現相關的；在對照組(AAV9-shNC)，IL-1β分佈在皮層和紋狀體區域，而在AAV9-shHK2組，IL-1β的表現被顯著抑制。
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<223> 亂序對照組shRNA序列
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Claims (10)

  1. 一種己糖激酶2專一性抑制劑用於製備預防和治療急性中樞神經系統損傷疾病的藥物之用途。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該己糖激酶2專一性抑制劑為己糖激酶2的抗體或其片段；或干擾己糖激酶2的mRNA之siRNA、shRNA、miRNA或其修飾物。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該己糖激酶2的抗體以編碼該抗體的胺基酸序列、核苷酸序列、或包含該核苷酸序列或胺基酸序列的表現載體的形式存在。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該己糖激酶2的抗體以融合蛋白的形式存在於表現載體或宿主細胞中。
  5. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該抗體的片段為Fab、Fab'、(Fab') 2或Fv。
  6. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該siRNA、該shRNA、該miRNA或其修飾物存在於特定的載體中。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該急性中樞神經系統損傷疾病選自由急性脊柱損傷、腦外傷、視網膜損傷、缺氧性腦損傷、急性缺血性腦損傷、缺血性腦中風、缺氧性腦中風、新生兒缺氧缺血性腦病變、中毒性腦病變、急性腦梗塞、腔隙性腦梗死、短暫性腦缺血發作、重型顱腦損傷、及腦脊髓手術和腦脊髓的放射線治療等導致的腦、脊髓神經 損傷所組成的群組。
  8. 一種組合物用於製備預防和治療急性中樞神經系統損傷疾病的藥物之用途，其中該組合物包含一己糖激酶2專一性抑制劑。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該己糖激酶2專一性抑制劑為己糖激酶2的抗體或其片段；或干擾己糖激酶2的mRNA之siRNA、shRNA、miRNA或其修飾物。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該組合物進一步包含以下化合物中的一種或多種：2-去氧葡萄糖、氯尼達明(lonidamine)、3-溴丙酮酸、6-磷酸葡萄糖、伊馬替尼(Imatinib)、5-硫代葡萄糖和茉莉酮酸甲酯。
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