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TW201837173A - ｓｈＲＮＡ表達框、攜帶其的多核苷酸序列及其應用 - Google Patents

ｓｈＲＮＡ表達框、攜帶其的多核苷酸序列及其應用 Download PDF

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TW201837173A
TW201837173A TW107110446A TW107110446A TW201837173A TW 201837173 A TW201837173 A TW 201837173A TW 107110446 A TW107110446 A TW 107110446A TW 107110446 A TW107110446 A TW 107110446A TW 201837173 A TW201837173 A TW 201837173A
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TW
Taiwan
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sequence
shrna
plastid
shrna expression
aav
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Application number
TW107110446A
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王超
張婷婷
蔣立新
Original Assignee
大陸商舒泰神（北京）生物製藥股份有限公司
大陸商北京三諾佳邑生物技術有限責任公司
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Publication date
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Abstract

本發明公開了shRNA表達框、攜帶其的多核苷酸序列及其應用，屬於生物技術和基因治療領域。一種shRNA表達框，按照5’-3’的順序，所述shRNA表達框依次含表達shRNA的DNA序列及填充序列，所述shRNA表達框序列長度接近野生型AAV基因組長度。本發明的有益效果：1、裸露shRNA在生物體內半衰期較短，採用AAV病毒為載體進行遞送的方式，使shRNA能夠發揮長效性、安全無致病性、大大提高shRNA藥物療效；本發明提供的shRNA表達框，包裝效率最高；並且明顯提高目的基因表達量，並增強shRNA治療效果。

Description

shRNA表達框、攜帶其的多核苷酸序列及其應用
本發明涉及shRNA表達框、攜帶其的多核苷酸序列及其應用，屬於生物技術和基因治療領域。
小干擾RNA(Small interfering RNA；siRNA)有時稱為短干擾RNA(short interfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)，是一個長20到25個核苷酸的雙股RNA，在生物學上有許多不同的用途。將針對目標基因的siRNA設計成髮夾結構送入體內時，該髮夾結構表達形成shRNA，shRNA是short hairpin RNA的縮寫，翻譯為“短髮夾RNA”，shRNA包括兩個短反向重複序列。目前已知shRNA主要參與RNA干擾(RNAi)現象，以帶有專一性的方式調節基因的表達。此外，也參與一些與RNAi相關的反應途徑，例如抗病毒機制或是染色質結構的改變。shRNA進入細胞後，被宿主細胞內RNA解旋酶解旋為正義RNA鏈與反義RNA鏈，反義RNA鏈與體內的一些酶結合成沉默複合物RNA-induced silencing complex(RISC)，識別含有其互補序列的mRNA，並與之結合。此時的RISC具有核酸酶的功能，能夠切割降解mRNA，從而抑制相應基因表達的現象，稱為RNA干擾(RNA interference,RNAi)。
shRNA特點包括基因序列特異性、高效性和可遺傳性。體外合成shRNA進入細胞後容易降解，半衰期短，難以穿透細胞膜及血管內皮，轉 染效率有限，且進入細胞後，shRNA的量不受控制，容易在脾臟堆積。需要有效的媒介或遞送途徑將外源shRNA遞送到生物體內。一種方法是利用化學修飾的方法直接遞送，如脂質體轉染、PEG修飾，無需克隆到載體即可將shRNA直接導入細胞，抑制特定基因的表達。與直接使用shRNA表達框導入細胞相比，質體或病毒類載體介導的shRNA體內表達的方法顯示了其優勢。將shRNA對應的dsRNA序列克隆到含有適合啟動子的質體載體或病毒載體中，再用質體轉染細胞或用病毒感染細胞，在啟動子的操縱下轉錄生成所需的shRNA，在體內法可持續產生siRNA作用。
腺相關病毒(Adeno-Associated Virus,AAV)屬微小病毒(parvovirus)家族的成員，為無包膜的單鏈線狀DNA病毒，作為基因治療載體，具有非常多的優勢。如感染效率高，感染範圍廣，長期表達的高安全性等。臨床中用於治療腫瘤、視網膜疾病、關節炎、愛滋病、心力衰竭、肌營養不良症、神經系統疾病及其它一系列基因缺陷疾病。但因本發明中涉及的shRNA長度很短，只有幾十個base pair(bp)，當使用AAV病毒載體表達時，包裝效率和表達量均為難題之一。
本公開的部分實施例是提供一種shRNA表達框、攜帶該shRNA表達框的多核苷酸序列、攜帶該多核苷酸序列的重組載體質體、shRNA、宿主、病毒顆粒、經分離並改造的細胞、藥物組合物、它們在製備預防和治療乙型肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征、治療Duchenne型肌營養不良症(DMD)、治療高膽固醇血症等的藥物中的應用、以及重組載體質體的載體製備系統。
本發明的表達框採用填充序列進行擴充且使得表達框序列長度 接近野生型AAV基因組長度，該表達框或攜帶其的多核苷酸序列在使用AAV病毒載體進行表達時，能保證病毒包裝產量，並且經過大量實驗發現，當填充序列位於shRNA序列3’端時，該表達框或攜帶其的多核苷酸序列在使用AAV病毒載體進行表達時，不僅病毒包裝產量能得到保證，還能大大提高目標基因shRNA的表達量，提高藥物治療效果。
根據本發明的一個方面，本發明提供一種shRNA表達框，按照5’-3’的順序，所述shRNA表達框依次含表達shRNA的DNA序列及填充序列，所述shRNA表達框序列長度接近野生型AAV基因組長度。所述填充序列可選為人非編碼序列。
可選地，所述人非編碼序列是惰性或無害的，沒有功能和活性。在各種特別的方面，人非編碼序列不是編碼蛋白或多肽的序列，不同於任何以下物質：shRNA、AAV末端反向重複(Inverted Terminal Repeat,ITR)序列、啟動子、複製點、多腺苷酸序列等。
所述人非編碼序列為人因數IX的內含子(intron)序列(GenBank：K02402.1)、人因數IX的內含子I片段、人黏粒C346的序列或HPRT-intron序列1704-14779(GenBank：M26434.1)的一段序列或多段序列組合形式；甚至可選為HPRT-intron序列1704-14779(GenBank：M26434.1)的一段序列。人非編碼序列長度可根據不同血清型AAV包裝容量或其他需求進行調整，不局限于固定長度。
可選地，該表達框在使用單鏈AAV病毒載體進行表達或直接使用時，所述序列長度為3.2kb-5.2kb，可選為3.8kb-5.1kb，甚至可選為3.8kb-4.6kb、4.6kb-5.1kb，尤其可選為4.6kb。
甚至可選地，該表達框在使用雙鏈AAV病毒載體進行表達時，所述shRNA表達框序列長度為使用單鏈AAV病毒載體進行表達或直接使用時所述shRNA表達框序列長度的一半。可選為3.2kb-5.2kb的一半，可選為3.8kb-5.1kb的一半，甚至可選為3.8kb-4.6kb或4.6kb-5.1kb的一半，尤其可選為4.6kb的一半，即2.3kb。
本發明所述的shRNA表達框中，表達shRNA的DNA序列5’端含有啟動子，所述啟動子可為任意來源啟動子，所述啟動子包含選自RNA聚合酶II啟動子和RNA聚合酶III啟動子中的一種或多種。RNA聚合酶II啟動子為通常所採用的啟動子，例如CAG、CMV、SV40、EF1、Ub。針對不同發病組織或細胞，可根據具體病理特徵選擇組織或細胞特異性啟動子，如LP1、CK1、DC172、DC190、ApoE/hAAT、ApoA-I、TBG、LSP1、HD-IFN等，為了保證目標基因shRNA高效表達，啟動子可為一個或多個的組合；啟動子可為根據實際情況改造的突變體或嵌合體。進一步地，所述啟動子選自RNA聚合酶III啟動子中的至少一個，所述RNA聚合酶III啟動子是U6啟動子、H1啟動子、7SK啟動子，尤其可選的啟動子為H1。
表達shRNA的DNA序列為表達任意可用於治療疾病的shRNA的DNA序列。可選地，所述表達任意可用於治療疾病的shRNA的DNA序列為序列表SEQ ID No：1至序列表SEQ ID No：3中的任一個或多個。例如表達治療HBV疾病的shRNA的DNA序列、表達治療HIV疾病的shRNA的DNA序列，可選地，表達治療Duchenne型肌營養不良症(DMD)的DNA序列、用於表達治療高膽固醇血症的DNA序列等。
如1)用於表達治療HBV疾病的任意shRNA的DNA序列，其中所述 shRNA的目標序列可由下述DNA序列中的19-23核苷酸(nucleotide,nt)的片 段組成，如：(1)catcctgctgctatgcctcat(SEQ ID No：7)
(2)aaggtatgttgcccgtttgtcc(SEQ ID No：8)
(3)cctattgattggaaagtatgtcaaa(SEQ ID No：9)
(4)tcgccaacttacaaggcctttct(SEQ ID No：10)
(5)tgtgctgccaactggatcct(SEQ ID No：11)
(6)ccgtgtgcacttcgcttcacct(SEQ ID No：12)
(7)ggaggctgtaggcataaattggtctgt(SEQ ID No：13)
(8)ggagtgtggattcgcactcct(SEQ ID No：14)
2)用於表達治療HIV疾病的DNA序列，所述shRNA的目標序列可由下述RNA序列中的19-23nt的片段組成，如：
(1)aucaaugaggaagcugcagaaugg(SEQ ID No：15)
(2)gggaagugacauagcaggaacuacuag(SEQ ID No：16)
(3)uaaauaaaauaguaagaauguauagcccu(SEQ ID No：17)
(4)uaugggguaccugugugga(SEQ ID No：18)
(5)gccaauucccauacauuauugugc(SEQ ID No：19)
(6)uuaaauggcagucuagcagaa(SEQ ID No：20)
(7)accacacacaaggcuacuucccugau(SEQ ID No：21)
(8)acagccgccuagcauuucaucac(SEQ ID No：22)
(9)ggauggugcuucaagcuaguaccaguu(SEQ ID No：23)
3)用於表達治療Duchenne型肌營養不良症(DMD)的DNA序列，其中所述shRNA的目標序列可由下述RNA序列中的19-23nt的片段組成，如：
(1)ugaguaucaucgugugaaag(SEQ ID No：24)
(2)uccuuucaucucugggcuc(SEQ ID No：25)
(3)aacuuccucuuuaacagaaaagcauac(SEQ ID No：26)
(4)aacuuccucuuuaacagaaaagcauac(SEQ ID No：27)
(5)caaggaaguuggcauuucaa(SEQ ID No：28)
4)用於表達治療高膽固醇血症的DNA序列，其中所述shRNA的目 標序列可由下述RNA序列中的19-23nt的片段組成，如：
(1)uuccgaauaaacuccaggc(SEQ ID No：29)
(2)aaccgcaguucuuuguagg(SEQ ID No：30)
(3)uugguauucagugugauga(SEQ ID No：31)
(4)ucaucacacugaauaccaa(SEQ ID No：32)
所述表達shRNA的DNA序列可以是同時表達兩個或兩個以上shRNA的DNA序列的組合形式，組合形式可以是2條表達shRNA的DNA序列的組合，也可以是3條表達shRNA的DNA序列的組合，但不僅限於2條或3條；2條相鄰表達shRNA的DNA序列可以直接相連或通過接頭相連；所述表達的shRNA針對治療目標點可以是單目標點，也可以是多目標點。
本發明提供了一種攜帶shRNA表達框的多核苷酸序列，其中在所述shRNA表達框的兩端分別為AAV末端反向重複序列。
所述AAV末端反向重複序列選自不同血清型的AAV，可選地所述AAV末端反向重複序列選自進化支A-F中的任意血清型的AAV或AAV1型、AAV2型、AAV3型、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型或其雜交/嵌合型中的任意一個，可選地，所述AAV末端反向重複序列來 源於AAV2血清型的末端反向重複序列。其中末端反向重複序列可在相應位點進行改造、或缺失、或截短，以上方法可合併使用。
本發明所述的多核苷酸序列中，兩個末端反向重複序列間的序列長度為3.2kb-5.2kb，可選為3.8kb-5.1kb，甚至可選為3.8kb-4.6kb、4.6kb-5.1kb，尤其可選為4.6kb；當其中一個末端反向重複序列中的terminal resolution site(trs)被改造，通過插入、缺失、或替代等方式導致Rep蛋白切割位元點突變不能進行有效切割時，兩個末端反向重複序列間的序列長度可選為3.2kb-5.2kb的一半，可選為3.8kb-5.1kb的一半，甚至可選為3.8kb-4.6kb或4.6kb-5.1kb的一半，尤其可選為4.6kb的一半，即2.3kb。
可選地，所述多核苷酸序列中5’末端反向重複序列缺失D序列，所述多核苷酸序列兩個ITR間的序列長度可選為4.6kb-5.1kb的一半，甚至可選為4.6kb的一半。
本發明提供了一種攜帶上述shRNA表達框或多核苷酸序列的重組載體質體。
本發明所述的多核苷酸序列可以是商品化合成，可採用分子克隆的方法構建到重組載體質體中。
所述重組載體質體選自腺相關病毒載體。
可選地，所述腺相關病毒載體為各種血清型，如AAV進化支A-F中的任一型(參見公開號WO200533321的專利)，具體地為AAV1型(GenBank：AF063497.1)、AAV2型(GenBank：AF043303.1)、AAV3型(GenBank：U48704.1)、AAV4型(GenBank：NC_001829)、AAV5型(GenBank：NC_006152)、AAV6型(GenBank：AF028704)、AAV7型 (GenBank：AF513851)、AAV8型(GenBank：AF513852)、AAV9型(GenBank：AY530579)或其雜交/嵌合型。
甚至可選地，所述腺相關病毒載體為AAV2/8型，即所述腺相關病毒載體外殼蛋白為血清型VIII型、所述腺相關病毒載體基因組末端反向重複序列為血清型II型的AAV2/8載體。所述兩端末端反向重複序列間插入與HBV基因組目標點鹼基序列完全匹配的本發明的核苷酸序列，形成的靶向序列向肝臟細胞分佈、表達產物高效特異抑制HBV複製的基因治療藥物。
所述腺相關病毒載體最後包裝為病毒，在所述多核苷酸序列兩側的ITR選自正常AAV血清型ITR時，包裝入病毒的序列為單鏈，所述病毒稱為單鏈AAV；當其中任意一個ITR通過插入、缺失、或替代等方式導致Rep蛋白切割位元點突變不能進行有效切割時，包裝入病毒的序列為雙鏈，所述病毒稱為雙鏈AAV。
本發明還提供了一種shRNA，其中，所述shRNA是由上述的shRNA表達框，或多核苷酸序列，或重組載體質體表達得到的。
本發明還提供了一種宿主，其中，所述宿主含有本發明所述的重組載體質體。所述宿主為選自大腸桿菌、HEK293細胞系、HEK293T細胞系、HEK293A細胞系、HEK293S細胞系、HEK293FT細胞系、HEK293F細胞系、HEK293H細胞系、HeLa細胞系、SF9細胞系、SF21細胞系、SF900細胞系、BHK細胞系的一種或幾種。
本發明還提供了一種病毒顆粒，其包括上述的重組載體質體，或宿主中的重組載體質體的載體基因組。所述病毒顆粒非選擇性或選擇性地在肝組織或肝癌細胞中表達。
本發明還涉及一種經分離並改造的細胞，所述細胞表達或包含上述shRNA表達框、多核苷酸序列、重組載體質體、病毒顆粒。該細胞為導入了本發明提供的重組載體質體、或宿主中的重組載體質體的載體基因組的改造的細胞，包括原核細胞和真核細胞(如真菌細胞，昆蟲細胞，植物細胞，動物細胞)，可選為哺乳動物細胞，可選為人的細胞，可選為人肝細胞和幹細胞。
本發明還涉及包含上述細胞的組織和生物，如動物。
本發明還涉及包含上述細胞的藥物組合物。
本發明還提供了一種藥物組合物，其中，所述藥物組合物含有活性成分和藥學上可接受的賦形劑，其中活性成分為選自本發明所述的shRNA表達框、攜帶shRNA表達框的多核苷酸序列、shRNA、重組載體質體、病毒顆粒或經分離並改造的細胞中的一種或幾種。
所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學上可接受的賦形劑以及上述的活性成分。
本發明還提供了上述shRNA表達框、攜帶shRNA表達框的多核苷酸序列、或重組載體質體、或shRNA、宿主、病毒顆粒或經分離並改造的細胞，在製備預防和治療乙型肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征、治療Duchenne型肌營養不良症(DMD)、治療高膽固醇血症等的藥物中的應用。
常規AAV載體製備系統均可用於本發明重組載體質體的包裝。如兩質體包裝系統、三質體包裝系統、桿狀病毒包裝系統和以Adenovirus(Ad)或Herpes Simplex Virus(HSV)為輔助病毒的AAV包裝系統等。其中所述三質體包裝系統包括質體pscAAV-H1-shRNA-Stuffer、質體pHelper和質體 pAAV-R2CX，其中：所述質體pHelper提供腺病毒的E2A、E4和VA區域；所述質體pAAV-R2CX提供含rep和cap基因序列；所述質體pscAAV-H1-shRNA-Stuffer含上述多核苷酸序列。
其中，X指代構成pAAV-R2CX重組載體質體的cap基因來源所對應的AAV血清型名稱。
本發明還提供了一種使用上述製備系統製備本發明所述病毒載體的方法。
本發明具有如下有益效果：
1、本發明的shRNA表達框採用AAV病毒為載體進行遞送的方式，使shRNA能夠發揮長效性；相比裸露shRNA或其他化學修飾的shRNA，選擇AAV作為運載體具有更低的免疫反應原性，安全無致病性；裸露shRNA在生物體內無明顯組織細胞偏好，但是AAV不同血清型具有明顯的組織目標向性，可大大提高shRNA藥物療效。
2、本發明提供的shRNA表達框，選擇合適的填充序列進行使得其長度接近AAV野生型基因組長度，使得選擇AAV病毒載體攜帶時，保證了包裝效率最高；當填充序列位於shRNA序列3’端時，該表達框或攜帶其的多核苷酸序列在使用AAV病毒載體進行表達時，不僅病毒包裝產量能得到保證，還能大大提高目的基因shRNA的表達量，提高藥物治療效果。
下面結合附圖和具體實施方式對本發明做進一步說明，並非對本發明的限制。凡是依照本專利申請公開內容所進行的任何本領域等同替換，均屬於本專利的保護範圍。
圖1為pSNAV2.0-H1-shRNA1質粒圖譜。
圖2為pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron質體圖譜。
圖3為pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron1質體圖譜。
圖4為pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron2質體圖譜。
圖5為pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron3質體圖譜。
圖6為pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron4質體圖譜。
圖7為pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron5質體圖譜。
圖8為pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron6質體圖譜。
圖9為pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron7質體圖譜。
圖10為pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron8質體圖譜。
圖11為pSC-H1-shRNA2質體圖譜。
圖12為pSC-H1-shRNA2-intron’質體圖譜。
圖13為pSC-H1-shRNA2-intron1’質體圖譜。
圖14為pSC-H1-shRNA2-intron2’質體圖譜。
圖15為pSC-H1-shRNA2-intron3’質體圖譜。
圖16為pSC-H1-shRNA2-intron4’質體圖譜。
圖17為pSC-H1-shRNA2-intron5’質體圖譜。
圖18為pSC-H1-shRNA2-intron6’質體圖譜。
圖19為pSNAV2.0-shRNA1-shRNA3質體圖譜。
圖20為pSNAV2.0-shRNA1-shRNA3-intron1”質體圖譜。
圖21為pSNAV2.0-shRNA1-shRNA3-intron2”質體圖譜。
圖22為pSNAV2.0-shRNA1-shRNA3-intron3”質體圖譜。
圖23為實施例2中HBV的螢光PCR檢測結果1。
圖24為實施例2中HBV的螢光PCR檢測結果2。
圖25為實施例2中HBV的螢光PCR檢測結果3。
圖26為實施例4中HBV的螢光PCR檢測結果1。
圖27為實施例4中HBV的螢光PCR檢測結果2。
圖28為實施例4中HBV的螢光PCR檢測結果3。
圖29為實施例5中HBV的螢光PCR檢測結果1。
圖30為實施例5中HBV的螢光PCR檢測結果2。
圖31為實施例5中HBV的螢光PCR檢測結果3。
圖32為實施例6中檢測結果1。
圖33為實施例6中檢測結果2。
圖34為實施例6中檢測結果3。
圖35為實施例6中檢測結果4。
圖36為實施例6中檢測結果5。
圖37為實施例6中檢測結果6。
圖38為實施例6中檢測結果7。
圖39為實施例6中檢測結果8。
圖40為實施例8中HBsAg檢測結果。
圖41為實施例8中HBV DNA檢測結果。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。
實施例1、單鏈AAV包裝容量對產量的影響
1、包裝質體構建：
參照《分子克隆》進行質體載體構建，pSNAV2.0-CMV-EGFP(購自本元正陽基因技術有限公司，北京)為單鏈AAV包裝所使用穿梭質體，該質體只保留來源於AAV2的ITR。利用XhoI和SalI為酶切位點，合成H1啟動子(GenBank：X16612)及表達shRNA1的DNA序列(SEQ ID No：1，後續在描述質體時簡寫為shRNA1)，替換pSNAV2.0-CMV-EGFP的CMV-EGFP序列。通過定點突變，引入EcoRV酶切位點，形成質體pSNAV2.0-H1-shRNA1，質體圖譜見圖1。質體構建方法為本領域常規方法(Xiao Xiao,Juan Li,and Richard Jude Samulski.Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.J.Virol.1998,72(3)：2224.)。
以pSNAV2.0-H1-shRNA1質體為骨架質體，合成填充序列intron，利用酶切位點BglII和SalI為插入位點，構建到表達shRNA1的DNA序列的3’端，形成pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron質體，intron來源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)2161-3860位(1.7kb)，質體圖譜見圖2；以pSNAV2.0-H1-shRNA1質體為骨架質體，合成填充序列intron1，利用酶切位點BglII和SalI為插入位點，構建到表達shRNA1的DNA序列的3’端，形成pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron1質體，intron1來源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)2161-5360位(3.2kb)，質體圖譜見圖3；以pSNAV2.0-H1-shRNA1質體為骨架質體，合成填充序列 intron2，利用酶切位點BglII和SalI為插入位點，構建到表達shRNA1的DNA序列的3’端，形成pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron2質體，intron2來源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)2161-6160位(4.0kb)，質體圖譜見圖4；以pSNAV2.0-H1-shRNA1質體為骨架質體，合成填充序列intron3，利用酶切位點BglII和SalI為插入位點，構建到表達shRNA1的DNA序列的3’端，形成pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron3質體，intron3來源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)2161-6660位(4.5kb)，質體圖譜見圖5；以pSNAV2.0-H1-shRNA1質體為骨架質體，合成填充序列intron4，利用酶切位點BglII和SalI為插入位點，構建到表達shRNA1的DNA序列的3’端，形成pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron4質體，intron4來源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)2161-7560位(5.4kb)，質體圖譜見圖6；其它包裝質體還包括pR2C8及AAV helper，編碼來源於AAV2的Rep蛋白和來源於AAV8的Cap蛋白；Ad Helper提供AAV複製所需的最小化的Adenovirus(Ad)部分元件。質體構建方法為本領域常規方法。(參見Gao GP,Alvira MR,WangL,Calcedo R,Johnston J,Wilson JM.Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene theraph.Proc Natl Acad Sci USA,2002 Sep 3；99(18)：11854-9)。
2、病毒包裝及純化
本發明採用HEK293細胞(購于ATCC)作為生產細胞系，常規三質體包裝系統生產AAV病毒載體。所使用實驗方法均為本領域常規方法。(參見Xiao Xiao,Juan Li,and Richard Jude Samulski.Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J.Virol.1998,72(3)：2224；)
3、基因組滴度檢測
取適量純化AAV樣品，按下表(表1-1)配製DNase I消化反應混合液，37℃培養30min，75℃培養10min令DNase I失活。
處理後的AAV純化樣品稀釋適當的倍數後，參照下表(表1-2)配置Q-PCR反應體系，並按照下列程式進行檢測。
其中使用的啟動子H1引物探針列表如下：
包裝產量結果見下表2-1：
由上述表2-1顯示，在相同包裝條件、同等包裝規模以及相同終產品體積條件下，當包裝長度為3.2~5.2kb範圍時，包裝產量能滿足需求，具體地說，當包裝序列長度越接近野生型AAV長度(4.6kb)時，即包裝長度為4.6kb、5.1kb時，包裝產量最高；當包裝序列長度逐漸低於3.8kb時，包裝產量開始下降但基本能滿足需求；當包裝序列長度為野生型長度的1.5倍時，包裝產量明顯降低。
實施例2、填充序列插入位置對目的基因表達影響，以單鏈AAV載體為例
1、包裝質體構建
實施例1結果說明單鏈AAV病毒載體包裝長度接近野生型時，可保證病毒載體產量。所以在保證有填充序列插入時，AAV包裝長度始終為4.6kb。調整填充序列長度及位置，並與無填充序列的藥物結構進行藥效比較。ssAAV2/8-H1-shRNA1-intron2對應質體載體構建參見實施例1。
以pSNAV2.0-H1-shRNA1質體為骨架質體，合成填充序列，源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)第2161-6160位(4.0kb)，利用酶切位點EcoRV和XhoI為插入位點，構建到H1啟動子序列5’端，形成pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron5質體，質體圖譜見圖7；以pSNAV2.0-H1-shRNA1質體為骨架質體，分段合成填充序列，源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)第2161-4160(2.0kb)段序列利用酶切位點EcoRV和XhoI為插入位點，構建到H1啟動子序列5’端。源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)第4161-6160(2.0kb)段序列利用酶切位點BglII和SalI為插入位點，構建到表達shRNA1的DNA序列的3’端，形成pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron6質體，質體圖譜見圖8；以pSNAV2.0-H1-shRNA1質體為骨架質體，分段合成填充序列，源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)第2161-2660(0.5kb)段序列利用酶切位點EcoRV和XhoI為插入位點，構建到H1啟動子序列5’端。源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)第2961-5960(3.5kb)段序列利用酶切位點BglII和SalI為插入位點，構建到表達shRNA1的DNA序列的3’端，形成pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron7質體，質體圖譜見圖9；以pSNAV2.0-H1-shRNA質體為骨架質體，分段合成填充序列，源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)第2161-5660(3.5kb)段序列利用酶切位點EcoRV和XhoI為插入位點，構建到H1啟動子序列5’端。源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)第5661-6160(0.5kb)段序列利用酶切位點BglII和SalI為插入位點，構建到表達shRNA1的DNA序列的3’端，形成pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron8質體，質體圖譜見圖10。其它包裝質體還包 括pR2C8和Helper，構建方法參見實施例1。
2、病毒包裝及純化
參見實施例1“2、病毒包裝及純化”。
3、基因組滴度檢測
參見實施例1“3、基因組滴度檢測”，實驗結果參見表2-2。
實驗結果顯示，5組AAV病毒載體產量相當，只要保證包裝序列長度接近野生型AAV基因組全長時，填充序列插入位置對包裝效率沒有影響。
4、目的基因shRNA表達及檢測
用以上5組病毒樣品以相同病毒感染倍數(Multiplicity of infection；MOI)進行HepG2.2.15細胞感染實驗，病毒感染為本領域常規方法。(具體實驗方法參見；Grieger JC,Choi VW,Samulski RJ.Production and characterization of adneo-associated viral vectors.Nat Protoc.2006；1(3)：1412-28.)感染24h後開始，每24h吸取一次細胞培養上清液。連續取樣4次後，進行藥效相關指標檢測。本實施例檢測指標為感染後細胞培養上清液 中HbsAg、HbeAg、HBV DNA，依據三項指標表達情況與未經感染的HepG2.2.15細胞培養上清液三項指標進行對比分析。抗體檢測方法為雙抗體夾心法(具體參見北京萬泰生物藥業試劑盒說明書)。HBV DNA檢測方法為螢光即時定量PCR法，為常規操作方法(具體參見QIAGEN檢測試劑盒說明書)。結果如圖23至圖25和表2-3所示。
結果顯示當填充序列全部位於表達shRNA1的DNA序列的3’端時，其藥物結構對HBV抑制效果最強。從表中資料結果來看，ssAAV2/8-H1-shRNA1-intron2相對於其他實施例具有統計學意義，P<0.01。
實施例3、雙鏈AAV包裝容量對產量的影響
1、包裝質體構建：
參照《分子克隆》進行質體載體構建，pSC-CMV-EGFP為雙鏈AAV包裝所使用穿梭質體，該質體只保留來源於AAV2的ITR。利用BglII和XhoI為酶切位點，合成H1啟動子及表達shRNA2的DNA序列(SEQ ID No：2，後續在描述質體時簡寫為shRNA2)，替換pSC-CMV-EGFP的CMV-EGFP序列。通過定點突變，引入EcoRV酶切位點，形成質體pSC-H1-shRNA，質體圖譜見圖11。pSC-CMV-EGFP質體構建方法為本領域常規方法(參見Wu,J,Zhao,W,Zhong,L,Han,Z,Li,B,Ma,W et al.(2007).Self-complementary recombinant adeno-associated viral vectors：packaging capacity and the role of rep proteins in vector purity.Hum Gene Ther.2007,18：171-182.中對應pAAV-hrGFP載體構建)。
以pSC-H1-shRNA2質體為骨架質體，合成填充序列intron’，利用酶切位點BglII和HindIII為插入位點，構建到表達shRNA2的DNA序列的3’端，形成pSC-H1-shRNA2-intron’質體，intron’來源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)2161-3060(0.9kb)，質體圖譜見圖12；以pSC-H1-shRNA2質體為骨架質體，合成填充序列intron1’，利用 酶切位點BglII和HindIII為插入位點，構建到表達shRNA2的DNA序列的3’端，形成pSC-H1-shRNA2-intron1’質體，intron1’來源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)2161-3460(1.3kb)，質體圖譜見圖13；以pSC-H1-shRNA2質體為骨架質體，合成填充序列intron2’，利用酶切位點BglII和HindIII為插入位點，構建到表達shRNA2的DNA序列的3’端，形成pSC-H1-shRNA2-intron2’質體，intron2’來源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)2161-3860(1.7kb)，質體圖譜見圖14；以pSC-H1-shRNA2質體為骨架質體，合成填充序列intron6’，利用酶切位點BglII和HindIII為插入位點，構建到shRNA2表達框的3’端，形成pSC-H1-shRNA2-intron3’質體，intron6’來源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)2161-4160(2.0kb)，質體圖譜見圖15；以pSC-H1-shRNA2質體為骨架質體，合成填充序列intron3’，利用酶切位點BglII和HindIII為插入位點，構建到表達shRNA2的DNA序列的3’端，形成pSC-H1-shRNA2-intron4’質體，intron4’來源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)2161-4860(2.7kb)，質體圖譜見圖16；其它包裝質體還包括pR2C8和Helper構建方法參見實施例1。
2、參見實施例1“2、病毒包裝及純化”。
3、基因組滴度檢測
實驗方法具體參見實施例1“3、基因組滴度檢測”。包裝產量結果見表2-4。
結果顯示，當包裝序列長度接近野生型AAV基因組長度一半時，即包裝長度為1.9kb、2.3kb和2.6kb時，包裝產量最高；包裝序列長度接近野生型長度四分之一或更短時，包裝產量開始明顯下降；當包裝序列長度接近野生型長度一半的1.5倍時，包裝產量也非常低。
實施例4、填充序列插入位置對目的基因表達影響，以雙鏈AAV載體為例
1、包裝質體構建：
實施例3結果說明雙鏈AAV病毒載體包裝長度接近野生型AAV基因組長度一半時，可保證病毒載體產量。所以在保證有填充序列插入時，AAV包裝長度始終為2.3kb。調整填充序列長度及位置，並與無填充的藥物結構進行藥效比較。scAAV2/8-H1-shRNA2-intron2’對應質體載體構建參見實施例3。
以pSC-H1-shRNA2質體為骨架質體，合成填充序列，源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)第2161-3860(1.7kb)位，利用酶切位點EcoRV和XhoI為插入位點，構建到H1啟動子序列5’端，形成pSC-H1-shRNA2-intron5’質體，質體圖譜見圖17；以pSC-H1-shRNA2質體為骨架質體，分段合成填充序列，源於 HPRT-intron(GenBank：M26434.1)第2161-3010(0.85kb)段序列利用酶切位點EcoRV和XhoI為插入位點，構建到H1啟動子序列5’端。源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)第3011-3860(0.85kb)段序列利用酶切位點BglII和SalI為插入位點，構建到表達shRNA2的DNA序列的3’端，形成pSC-H1-shRNA2-intron6’質體，質體圖譜見圖18；其它包裝質體還包括pR2C8和Helper構建方法參見實施例1。
2、參見實施例1“2、病毒包裝及純化”。
3、基因組滴度檢測
實驗方法具體參見實施例1“3、基因組滴度檢測”。實驗結果參見表2-5。
實驗結果顯示，3組AAV病毒載體產量相當，只要保證包裝序列長度接近野生型AAV基因組全長時，填充序列插入位置對包裝效率沒有影響。
4、目的基因表達及檢測
實驗方法參見實施例2“4、目的基因表達及檢測”。
檢測結果見圖26至圖28和表2-6所示。
結果顯示當填充序列全部位於表達shRNA2的DNA序列的3’端時，其藥物結構對HBV抑制效果最強。從表中資料結果來看，ssAAV2/8-H1-shRNA2-intron2相對於其他實施例具有統計學意義，P<0.01。
實施例5、填充序列插入位置對雙表達盒的目的基因表達影響，以單鏈AAV載體為例
1、包裝質體構建：
本實施例以pSNAV2.0-H1-shRNA1為骨架質體，合成U6啟動子及表達shRNA3的DNA序列(SEQ ID No：3，後續在描述質體時簡寫為shRNA3)序列，插入表達shRNA3的DNA序列的3’端，形成pSNAV2.0-shRNA1-shRNA3質體，質體圖譜見圖19。填充序列來源 HPRT-intron序列2161-5880(GenBank：M26434.1)，調整填充序列長度及位置，並保證AAV包裝長度始終為4.6kb。
以pSNAV2.0-shRNA1-shRNA3質體為骨架質體，合成填充序列，源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)第2161-5880位(3.8kb)，利用酶切位點EcoRV和XhoI為插入位點，構建到H1啟動子序列5’端，形成pSNAV2.0-shRNA1-shRNA3-intron1”質體，質體圖譜見圖20；以pSNAV2.0-shRNA1-shRNA3質體為骨架質體，合成填充序列，源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)第2161-5880(3.8kb)位，利用酶切位點BglII和SalI為酶切位點，構建到表達shRNA3的DNA序列3’端，形成pSNAV2.0-shRNA1-shRNA3-intron2”質體，質體圖譜見圖21；以pSNAV2.0-shRNA1-shRNA3質體為骨架質體，分段合成填充序列，源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)第2161-4020(1.9kb)段序列利用酶切位點EcoRV和XhoI為插入位點，構建到H1啟動子序列5’端。源於HPRT-intron(GenBank：M26434.1)第4021-5880(1.9kb)段序列利用酶切位點BglII和SalI為插入位點，構建到表達shRNA3的DNA序列的3’端，形成pSNAV2.0-shRNA1-shRNA3-intron3”質體，質體圖譜見圖22；其它包裝質體還包括pR2C8和Helper構建方法參見實施例1。
2、參見實施例1“2、病毒包裝及純化”。
3、基因組滴度檢測
實驗方法具體參見實施例1“3、基因組滴度檢測”。實驗結果參見表2-7。
表2-7
實驗結果顯示，3組AAV病毒載體產量相當，只要保證包裝序列長度接近野生型AAV基因組全長時，填充序列插入位置對包裝效率沒有影響。
4、目的基因表達及檢測
參見實施例2“4、目的基因表達及檢測”。
檢測結果見圖29至圖31和表2-8所示。
結果顯示當填充序列全部位於表達shRNA3的DNA序列的3’端時，其藥物結構對HBV抑制效果最強。從表中資料結果來看，ssAAV2/8-shRNA1-shRNA3-intron2”相對於其他實施例具有統計學意義，P<0.01。
實施例6、多血清型AAV載體中，填充序列插入位置對目的基因表達影響
1、包裝質體構建：
穿梭質體pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron5(對應ssAAV-H1-shRNA1-intron5病毒包裝)、pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron2(對應ssAAV-H1-shRNA1-intron2病毒包裝)、pSNAV2.0-H1-shRNA1-intron6(對應ssAAV-H1-shRNA1-intron6病毒包裝)已構建，具體參見實施例2“包裝質體構建”。結構質體為pR2C2，或為pR2C3，或為pR2C5，或為pR2C7，或為pR2MH31，或為pR2MH39，或為pR2MH43，或為pR2MH47，或為pR2MH31，不同血清型來源cap基因為合成產品，替換掉pR2C8質體cap基因(其中MH31、MH39、MH43、MH47來自US9186419)。其它包裝質體還包括Helper構建方法參見實施例1。
2、參見實施例1“2、病毒包裝及純化”。
3、基因組滴度檢測
實驗方法具體參見實施例1“3、基因組滴度檢測”。實驗結果參見表2-9。
實驗結果顯示，同血清型3組AAV病毒載體產量相當，只要保證包裝序列長度接近野生型AAV基因組全長時，填充序列插入位置對包裝效率沒有影響。
4、目的基因表達及檢測
參見實施例2“4、目的基因表達及檢測”。
檢測結果見圖31至圖38和表2-10所示。
結果顯示同血清型3種結構AAV病毒載體比較時，當填充序列全 部位於表達shRNA1的DNA序列的3’端時，其藥物結構對HBV抑制效果最強。從資料結果來看，填充序列全部位於shRNA的3’端的藥物結構相對於其他實施例具有統計學意義，P<0.01。
實施例7、兩種病毒載體製備方法
本發明還提供了另外兩種病毒包裝方法，AAV病毒載體包裝時不局限於上述包裝方法。
1、Ad輔助包裝方法：所述包裝體系須包括pSNAV2.0-H1-shRNA1、pAAV2/8，及Ad5病毒液。所述包裝方法所使用的細胞係為HeLa細胞。細胞經過上述兩質體轉染後24h，用Ad5進行輔助感染，獲得ssAAV2/8-H1-shRNA1。(具體參見JY Dong,PD Fan,Raymond A,Frizzell.Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus.Human Gene Therapy,1996,7：2101-2112.及實施例1)。依照同樣的方法依次合成ssAAV2/8-H1-shRNA1-intron、ssAAV2/8-H1-shRNA1-intron1、ssAAV2/8-H1-shRNA1-intron2、ssAAV2/8-H1-shRNA1-intron3、ssAAV2/8-H1-shRNA1-intron4、ssAAV2/8-H1-shRNA1。後續病毒純化及檢測方法參見實施例1。
2、桿狀病毒包裝系統：本方法需分別構建pFBD-cap8、pFBD-rep2、pFB-shRNA1(pFB-shRNA1原始載體pFB-EGFP，根據《分子克隆》改造而成)三質體，轉化DH10Bac感受態細胞，形成Bac-cap8、Bac-rep2、Bac-GFP三桿粒，分別感染SF9細胞後，獲得含有三種基因表達盒的桿狀病毒。再用三種桿狀病毒同時感染SF9細胞，生產ssAAV2/8-H1-shRNA1。(具體方法參見Haifeng Chen.Intron splicing-mediated expression of AAV rep and cap genes and production of AAV vectors in insect cells.Mol Ther.2008 May；16(5)：924-30.及實施例1)。依照同樣的方法依次合成ssAAV2/8-H1-shRNA1-intron、ssAAV2/8-H1-shRNA1-intron1、ssAAV2/8-H1-shRNA1-intron2、ssAAV2/8-H1-shRNA1-intron3、ssAAV2/8-H1-shRNA1-intron4、ssAAV2/8-H1-shRNA1。後續病毒純化及檢測方法參見實施例1。
此方法也可通過改造，將cap及rep構建到同一個桿狀病毒中，最終形成兩種桿狀病毒共感染，來達到生產AAV的目的。
上述實驗結果說明，無論選用何種病毒包裝系統，選擇合適長度的填充序列使得包裝序列長度接近AAV野生型基因組長度，即3.8kb-5.1kb時，均可以保證較高的包裝效率。
實施例8、體內藥效實驗
利用scAAV2/8-H1-shRNA2-intron2和scAAV2/8-H1-shRNA2-intron5兩種結構藥物與商品化藥物拉米夫定及恩替卡韋進行體內藥效比較。給藥方式為靜脈注射，14天為一個採血週期，分離血清樣品後，進行HBsAg及HBV DNA檢測。動物實驗分組情況如下：
本實驗共進行266天(38周)。實驗方法參見實施例2“4、目的基因表達及檢測”。檢測結果見圖40和表2-12(HBsAg檢測)、及圖41和表2-13(HBV DNA檢測)。
由上可知，當scAAV2/8-H1-shRNA2-intron5的使用劑量是scAAV2/8-H1-shRNA2-intron2使用劑量的5倍時，兩種藥物對模型動物血清中HBsAg抑制水準相當，在給藥後D14時抑制效果達到最強，且抑制作用持續到D266天，兩種結構藥物藥效均強於商品化藥物所使用劑量藥效；其中scAAV2/8-H1-shRNA2-intron2結構藥物對模型動物血清中HBV DNA抑制水準與拉米夫定所使用劑量藥效相當，scAAV2/8-H1-shRNA2-intron5結構藥物對模型動物血清中HBV DNA抑制水準略差。
故本案不僅於技術思想上確屬創新，並具備習用之傳統方法所不及之多項功效，已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
<110> 舒泰神(北京)生物製藥股份有限公司 北京三諾佳邑生物技術有限責任公司
<120> shRNA表達框、攜帶其的多核苷酸序列及其應用
<130> PCT180159CN
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列，引物
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<212> DNA
<213> 人工序列，引物
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<213> 人工序列，探針
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 32

Claims (29)

  1. 一種shRNA表達框，其中，按照5’-3’的順序，所述shRNA表達框依次含表達shRNA的DNA序列及填充序列，所述shRNA表達框序列長度接近野生型AAV基因組長度；所述填充序列可選為人非編碼序列。
  2. 如請求項1所述的shRNA表達框，其中，所述人非編碼序列為人因數IX的內含子序列、人黏黏粒C346的序列或HPRT-intron序列的一段序列或多段序列組合形式。
  3. 如請求項1或2所述的shRNA表達框，其中，所述人非編碼序列為HPRT-intron序列的一段序列。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的shRNA表達框，其中，所述shRNA表達框在使用單鏈AAV病毒載體進行表達或直接使用時，所述shRNA表達框序列長度為3.2kb-5.2kb，亦可選自於3.8kb-5.1kb。
  5. 如請求項1-3中任一項所述的shRNA表達框，其中，所述shRNA表達框在使用雙鏈AAV病毒載體進行表達時，所述shRNA表達框序列長度為使用單鏈AAV病毒載體進行表達或直接使用時所述shRNA表達框序列長度的一半。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的shRNA表達框，其中，所述shRNA表達框中，表達shRNA的DNA序列5’端含有啟動子。
  7. 如請求項6所述的shRNA表達框，其中，所述啟動子包含選自RNA聚合酶II啟動子和RNA聚合酶III啟動子中的一種或多種。
  8. 如請求項7所述的shRNA表達框，其中，所述RNA聚合酶II啟動子為組織特異性啟動子；可選地所述RNA聚合酶II啟動子為肝臟特異性啟 動子；可選地，所述肝臟特異性啟動子為LP1、ApoE/hAAT、DC172、DC190、ApoA-I、TBG、LSP1或HD-IFN。
  9. 如請求項7所述的shRNA表達框，其中，所述RNA聚合酶III啟動子為U6啟動子、H1啟動子、7SK啟動子；可選地，所述RNA聚合酶III啟動子為H1啟動子。
  10. 如請求項1-9中任一項所述的shRNA表達框，其中，表達shRNA的DNA序列為表達任意可用於治療疾病的shRNA的DNA序列；可選地，所述表達任意可用於治療疾病的shRNA的DNA序列為序列表SEQ ID No：1至序列表SEQ ID No：3中的任一個或多個。
  11. 一種多核苷酸序列，其攜帶權利要求1-10中任一項所述的shRNA表達框，其中，所述shRNA表達框的兩端分別為AAV末端反向重複序列。
  12. 如請求項11所述的多核苷酸序列，其中，所述AAV末端反向重複序列選自不同血清型的AAV，可選地，所述AAV末端反向重複序列選自進化支A-F中的任意血清型的AAV或AAV1型、AAV2型、AAV3型、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型或其雜交/嵌合型中的任意一個，可選地，所述AAV末端反向重複序列來源於AAV2血清型的末端反向重複序列。
  13. 如請求項12所述的多核苷酸序列，其中，所述多核苷酸序列中，兩個末端反向重複序列間的序列長度可選為3.2kb-5.2kb；當其中一個末端反向重複序列中的terminal resolution site(trs)被改造，通過插入、缺失、或替代等方式導致Rep蛋白切割位元點突變不能進行有效切割時，兩個末端反向重複序列間的序列長度可選為3.2kb-5.2kb的一半。
  14. 如請求項11-13中任一項所述的多核苷酸序列，其中，所述多核苷酸序列中5’末端反向重複序列缺失D序列，所述多核苷酸序列兩個末端反向重複序列間的序列長度可選為4.6kb-5.1kb的一半。
  15. .一種重組載體質體，其攜帶請求項1-10中任一項所述的shRNA表達框、或請求項11-14中任一項所述的多核苷酸序列。
  16. 如請求項15所述的重組載體質體，其中，所述重組載體質體為腺相關病毒載體。
  17. 如請求項16所述的重組載體質體，其中，所述腺相關病毒載體為AAV2/8型，即所述腺相關病毒載體的外殼蛋白為血清型VIII型、所述腺相關病毒載體的末端反向重複序列為血清型II型的AAV2/8載體。
  18. 一種shRNA，其是由請求項1-10中任一項所述的shRNA表達框、請求項11-14中任一項所述的多核苷酸序列、或請求項15-17中任一項所述的重組載體質體表達得到的。
  19. 一種宿主，其含有權利要求15-17中任一項所述的重組載體質體。
  20. 如請求項19所述的宿主，其中，所述宿主為選自大腸桿菌、HEK293細胞系、HEK293T細胞系、HEK293A細胞系、HEK293S細胞系、HEK293FT細胞系、HEK293F細胞系、HEK293H細胞系、HeLa細胞系、SF9細胞系、SF21細胞系、SF900細胞系和BHK細胞系中的一種或幾種。
  21. 一種病毒顆粒，其包括權利要求15-17中任一項所述的重組載體質體或請求項19-20中任一項所述的宿主中的重組載體質體的載體基因組。
  22. 如請求項21所述的病毒顆粒，其中，所述病毒顆粒非選擇性或選擇性地在肝組織或肝癌細胞中表達。
  23. 一種經分離並改造的細胞，其中，所述細胞表達或包含請求項1-10中任一項所述的shRNA表達框、請求項11-14中任一項所述的多核苷酸序列、請求項15-17中任一項所述的重組載體質體、請求項21或22所述的病毒顆粒。
  24. 如請求項23所述的改造的細胞，其中，所述細胞是哺乳動物細胞，可選為人細胞，甚至可選為人幹細胞或肝細胞。
  25. 一種藥物組合物，其包括活性成分和藥學上可接受的賦形劑，其中活性成分為選自請求項1-10中任一項所述的shRNA表達框、請求項11-14中任一項所述的多核苷酸序列、請求項15-17中任一項所述的重組載體質體、請求項18所述的shRNA、請求項21或22所述的病毒顆粒和請求項23或24所述的經分離並改造的細胞中的一種或幾種。
  26. 如請求項25所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學上可接受的賦形劑以及所述活性成分。
  27. 一種利用請求項1-10中任一項所述的shRNA表達框、請求項11-14中任一項所述的多核苷酸序列、請求項15-17中任一項所述的重組載體質體、請求項18所述的shRNA、請求項21或22所述的病毒顆粒或請求項23或24所述的經分離並改造的細胞在製備預防和治療乙型肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征、治療Duchenne型肌營養不良症(DMD)、治療高膽固醇血症的藥物中的應用。
  28. 一種包裝請求項15-17所述的重組載體質體的載體製備系統，其為常規AAV載體製備系統，包括兩質體包裝系統、三質體包裝系統、桿狀病毒包裝系統和以Ad或HSV為輔助病毒的AAV包裝系統等。
  29. 如請求項28所述的製備系統，其中，所述三質體包裝系統包括質體pscAAV-H1-shRNA-Stuffer、質體pHelper和質體pAAV-R2CX；其中，所述質體pHelper提供腺病毒的E2A、E4和VA區域；所述質體pAAV-R2CX提供含rep和cap基因序列；所述質體pscAAV-H1-shRNA-Stuffer含有請求項11-14中任一項所述的多核苷酸序列；其中，X指代構成pAAV-R2CX重組載體質體的cap基因來源所對應的AAV血清型。
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