TW201837172A - 抑制masp2之表現之核酸 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種具有MASP2之表現抑制活性之核酸、含有該核酸之醫藥組合物以及含有該核酸之APS、SLE等自體免疫疾病以及血液透析時之血栓症之預防或治療藥。
Description
本發明係關於一種用於抑制MASP2(Mannan-binding lectin serine protease 2，聚甘露糖結合凝集素絲胺酸蛋白酶2)之表現之核酸或含有該核酸之醫藥組合物。
聚甘露糖結合凝集素絲胺酸蛋白酶2(MASP2，Mannan-binding lectin serine protease 2)係由686個胺基酸構成之蛋白質，其具有自N末端側起為CUB區-EGF區-CUB區-CCP1-CCP2-絲胺酸蛋白酶區之構成。MASP2係於肝臟中產生之補體蛋白質之1種，且於補體途徑中亦與凝集素途徑之活性化相關(非專利文獻1)。 關於與疾病之關聯性，認為MASP2於IgA腎病或膜性腎病、狼瘡性腎病、C3腎病、血栓性血小板減少性紫癜病、血栓性微血管病變、非典型溶血性尿毒症候群(aHUS，atypical Hemolytic Uremic Syndrome)等與補體相關之自體免疫疾病中係重要之疾病相關蛋白質(非專利文獻2、3)。又，報告有MASP2係於缺血再灌注障礙時導致組織傷害之一原因，根據使用動物模型之研究以及臨床研究，強烈地提示藉由抑制MASP2可減輕缺血時之腎障礙或腦梗塞時之組織傷害(非專利文獻4、5)。藉由特異性地抑制MASP2，可期待能夠預防或治療上述疾病，但迄今尚未報告有關於特異性地抑制MASP2之表現之醫藥品。 作為抑制基因表現本身之方法，例如已知有利用RNA干擾(RNA interference，以下稱為RNAi)之方法等。具體而言，發現藉由導入具有與標的基因相同序列之雙鏈RNA，而特異性地抑制該標的基因之表現，並被命名為短干擾RNA(siRNA，short interfering RNA)(專利文獻1)。又，作為抑制RNA干擾以外之基因表現之方法，已知有反義法(專利文獻2)。但是，尚不知曉顯示出有效地抑制人MASP2基因之siRNA序列。 [先前技術文獻] [專利文獻] 專利文獻1：國際公開第2001/75164號說明書 專利文獻2：國際公開第98/56905號說明書 [非專利文獻] 非專利文獻1：Immunobiology, 205, 455-466 (2002) 非專利文獻2：Nat Rev Nephrol., 12, 383-401 (2016) 非專利文獻3：Nephrol Dial Transplant., 13, 1984-1990 (1998) 非專利文獻4：FASEB J., 28, 3996-4003 (2014) 非專利文獻5：J Neuroinflammation., 13, 213 (2016)
[發明所欲解決之問題] 本發明之目的在於提供一種能夠抑制MASP2之表現之核酸。又，本發明之目的在於提供一種用以預防或治療與MASP2之表現相關之疾病之醫藥組合物。 [解決問題之技術手段] 本發明係關於以下之(1)～(16)。 (1)一種使MASP2基因之表現減少之雙鏈核酸，其係包含正義鏈及反義鏈且含有至少11個鹼基對之雙鏈區域之雙鏈核酸，並且於上述反義鏈中之鏈長為至少17個核苷酸且至多30個核苷酸之寡核苷酸鏈中，與選自表1-1～表1-22所記載之群中之標的MASP2 mRNA序列互補。 (2)如(1)所記載之雙鏈核酸，其中上述雙鏈區域為11～27個鹼基對，且與選自表1-1～表1-22所記載之群中之標的MASP2 mRNA序列互補之上述反義鏈之自5'末端起第2個核苷酸與該標的MASP2 mRNA序列之自3'末端起第2個核糖核苷酸互補。 (3)如(1)或(2)所記載之雙鏈核酸，其中上述正義鏈之3'末端及上述反義鏈之5'末端形成平滑末端。 (4)如(3)所記載之雙鏈核酸，其中上述正義鏈之長度為21個核苷酸，且上述反義鏈之長度為23個核苷酸。 (5)如(1)或(2)所記載之雙鏈核酸，其中上述正義鏈之長度為21個核苷酸，且上述反義鏈之長度為21個核苷酸。 (6)如(5)所記載之雙鏈核酸，其中上述正義鏈之3'末端及上述反義鏈之3'末端具有突出部分。 (7)如(1)至(6)中任一項所記載之雙鏈核酸，其中上述反義鏈含有選自表1-1～表1-22及表2之「反義鏈」所記載之群中之序列。 (8)如(1)至(6)中任一項所記載之雙鏈核酸，其中上述正義鏈含有選自表1-1～表1-22及表2之「正義鏈」所記載之群中之序列。 (9)如(1)至(6)中任一項所記載之雙鏈核酸，其含有選自由表1-1～表1-22及表2所記載之正義鏈/反義鏈所組成之群中之1對正義鏈/反義鏈之序列。 (10)如上述(1)至(9)中任一項所記載之雙鏈核酸，其含有2'-修飾核苷酸。 (11)如上述(10)所記載之雙鏈核酸，其中雙鏈區域內之核苷酸之50～100%為2'-修飾核苷酸。 (12)如(1)至(11)中任一項所記載之雙鏈核酸，其含有配位基。 (13)一種單鏈核酸，其僅包含如(1)至(12)中任一項所記載之雙鏈核酸之反義鏈。 (14)一種醫藥組合物，其含有如(1)至(13)中任一項所記載之核酸。 (15)一種治療由補體凝集素途徑異常所介導之障礙的方法，其包括如下步驟：對需要此種治療之人投予治療上有效量之如(1)至(13)中任一項所記載之核酸或如(14)所記載之醫藥組合物。 (16)如(15)所記載之方法，其中上述障礙為IgA腎病、膜性腎病、狼瘡性腎病、C3腎病、血栓性血小板減少性紫癜病、血栓性微血管病變、非典型溶血性尿毒症候群(aHUS)、或者缺血時之腎障礙或腦梗塞時之組織傷害。 [發明之效果] 藉由投予本發明之核酸、或含有該核酸之醫藥組合物，能夠抑制MASP2之表現。尤其對於與MASP2之表現相關之疾病之治療、預防有用。
作為本發明之核酸之標的MASP2基因(編碼MASP2之基因)，可列舉對應於以基因庫登錄號(Genbank Accession)No.NM_006610.3所登錄之MASP2 cDNA(序列編號2827)的產生MASP2之全長mRNA之基因。 又，人類以外物種之MASP2基因之mRNA亦可成為本發明之核酸之標的基因。例如作為對應於小鼠MASP2基因之全長mRNA的cDNA鹼基序列，可列舉基因庫登錄號No.NM_001003893.2，作為對應於大鼠MASP2基因之全長mRNA的cDNA鹼基序列，可列舉基因庫登錄號No.NM_172043.1，作為對應於食蟹猴CFB(Complement Factor B，補體因子B)基因之全長mRNA的cDNA鹼基序列，可列舉基因庫登錄號No.XM_005544812.2，作為對應於恆河獼猴CFB基因之全長mRNA的cDNA鹼基序列，可列舉基因庫登錄號No.XM_001118827.3等。 1.本發明之核酸 於本發明中，將含有與MASP2 mRNA互補之鹼基序列的核酸稱為反義鏈核酸，將含有與反義鏈核酸之鹼基序列互補之鹼基序列的核酸稱為正義鏈核酸。於本說明書，於稱為「本發明之核酸」之情形時，只要未特別規定，則以包含反義鏈核酸、正義鏈核酸、以及正義鏈及反義鏈核酸成對形成之雙鏈核酸之含義使用。 作為本發明之核酸，只要為由核苷酸或具有與該核苷酸同等功能之分子聚合而成之分子，則可為任意分子，例如可列舉：核糖核苷酸之聚合物即RNA、脫氧核糖核苷酸之聚合物即DNA、包含RNA與DNA之嵌合核酸、及該等核酸中之至少一者之核苷酸被置換為具有與該核苷酸同等功能之分子的核苷酸聚合物。又，於該等核酸內含有至少一個具有與核苷酸同等功能之分子的衍生物亦包括在本發明之核酸中。又，尿嘧啶(U)可以相同含義換稱為胸腺嘧啶(T)。 作為具有與核苷酸同等功能之分子，例如可列舉核苷酸衍生物等。作為核苷酸衍生物，只要為對核苷酸加以修飾而成之分子，則可為任何分子，例如與RNA或DNA相比，為了實現核酸酶耐性之提高或穩定化、提昇與互補鏈核酸之親和力、提昇細胞透過性、或實現可視化，可適宜地使用對核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸加以修飾而成之分子等。 作為對核苷酸加以修飾而成之分子，例如可列舉糖部修飾核苷酸、磷酸二酯鍵修飾核苷酸、鹼基修飾核苷酸、以及糖部、磷酸二酯鍵及鹼基之至少一者經修飾之核苷酸等。 作為糖部修飾核苷酸，只要為對於核苷酸之糖之化學結構之一部分或全部利用任意之取代基進行修飾或取代而成者、或利用任意原子進行取代而成者，則可為任何糖部修飾核苷酸，較佳為使用2'-修飾核苷酸。 作為2'-修飾核苷酸，例如可列舉核糖之2'-OH基被取代為選自由H、OR、R、R'OR、SH、SR、NH2
、NHR、NR2
、N3
、CN、F、Cl、Br及I所組成之群(R為烷基或芳基、較佳為碳數1～6之烷基，R'為伸烷基、較佳為碳數1～6之伸烷基)中之取代基的核苷酸，較佳可列舉2'-OH基被取代為H、F或甲氧基之核苷酸，更佳可列舉2'-OH基被取代為F或甲氧基之核苷酸。又，亦可列舉2'-OH基被取代為選自由2-(甲氧基)乙氧基(2-(methoxy)ethoxy)、3-胺基丙氧基(3-aminopropoxy)、2-[(N,N-二甲基胺基)氧基]乙氧基(2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethoxy)、3-(N,N-二甲基胺基)丙氧基(3-(N,N-dimethylamino)propoxy)、2-[2-(N,N-二甲基胺基)乙氧基]乙氧基(2-[2-(N,N-dimethylamino)ethoxy]ethoxy)、2-(甲基胺基)-2-氧代乙氧基(2-(methylamino)-2-oxoethoxy)、2-(N-甲基胺甲醯基)乙氧基(2-(N-methylcarbamoyl)etoxy)及2-氰基乙氧基(2-cyanoetoxy)所組成之群中之取代基的核苷酸等。 2'-修飾核苷酸之含量相對於雙鏈核酸區域內之核苷酸，較佳為50～100%，更佳為70～100%，進而較佳為90～100%。 作為施加有2'-修飾核苷酸之雙鏈核酸，例如可列舉包含選自由表2所記載之正義鏈/反義鏈所組成之群中之1對正義鏈/反義鏈之序列的雙鏈核酸。再者，表2中，N(M)表示2'-O-甲基-RNA(2'-O-methyl-RNA)，N(F)表示2'-F-RNA。此處，N表示A、C、G或U。 又，作為糖部修飾核苷酸，可列舉藉由在糖部導入橋接結構而具有2個環狀結構之橋接結構型人工核酸(BNA，Bridged Nucleic Acid)，具體而言，亦可列舉2'位之氧原子與4'位之碳原子經由亞甲基橋接而成之鎖式人工核酸(LNA，Locked Nucleic Acid)、伸乙基橋接結構型人工核酸(ENA，Ethylene bridged nucleic acid)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)]、約束乙基(cEt，Constrained Ethyl)[The Journal of Organic Chemistry 75, 1569(2010)]、醯胺基橋接結構型人工核酸(AmNA，Amido-Bridged Nucleic Acid)[Chem Bio Chem 13, 2513(2012)]及2'-O,4'-C-螺環伸丙基橋接結構型人工核酸(scpBNA，2'-O,4'-C-Spirocyclopropylene bridged nucleic acid)[Chem. Commun., 51, 9737(2015)]等，進而亦可列舉肽核酸(PNA，Peptide Nucleic Acid)[Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)]、氧肽核酸(OPNA，Oxy-Peptide Nucleic Acid)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653(2001)]、肽核糖核酸(PRNA，Peptide Ribonucleic Acid)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900(2000)]等。 作為磷酸二酯鍵修飾核苷酸，只要為對於核苷酸之磷酸二酯鍵之化學結構之一部分或全部利用任意之取代基進行修飾或取代而成者、或利用任意原子進行取代而成者，則可為任何磷酸二酯鍵修飾核苷酸，例如可列舉：磷酸二酯鍵被取代為硫代磷酸酯鍵之核苷酸、磷酸二酯鍵被取代為二硫代磷酸酯鍵之核苷酸、磷酸二酯鍵被取代為烷基膦酸酯鍵之核苷酸、磷酸二酯鍵被取代為胺基磷酸酯鍵之核苷酸等。 作為鹼基修飾核苷酸，只要為對於核苷酸之鹼基之化學結構之一部分或全部利用任意之取代基進行修飾或取代而成者、或利用任意原子進行取代而成者，則可為任何鹼基修飾核苷酸，例如可列舉：鹼基內之氧原子被取代為硫原子者，氫原子被取代為碳數1～6之烷基、鹵素等者，甲基被取代為氫、羥基甲基、碳數2～6之烷基等者，胺基被取代為碳數1～6之烷基、碳數1～6之烷醯基、側氧基、羥基等者。再者，使用5-甲基胞嘧啶(5-mC)代替胞嘧啶(C)作為鹼基修飾核苷酸亦為本發明之一較佳形態。 作為核苷酸衍生物，亦可列舉對於核苷酸或糖部、磷酸二酯鍵或鹼基之至少一者經修飾之核苷酸衍生物直接或經由連接基附加配位基而成者，該配位基例如為：膽固醇、脂肪酸、維生素E、類視色素等脂質類、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)等糖類、完全抗體、Fab、scFv、VHH等片段抗體、低密度脂蛋白質(LDL，Low Density Lipoprotein)、人血清白蛋白等蛋白質、RGD、NGR、R9、CPP等肽類、啡、啡啶、蒽醌、葉酸等低分子、合成聚胺基酸等合成聚合物、核酸適體、吖啶、螢光素、玫瑰紅、香豆素等色素、Cy3系列、Alexa系列、Black Hole Quencher等螢光團等其他化學物質。具體而言，可列舉：附加多胺之核苷酸衍生物、附加膽固醇之核苷酸衍生物、附加類固醇之核苷酸衍生物、附加GalNAc之核苷酸衍生物、附加膽汁酸之核苷酸衍生物、附加脂肪酸之核苷酸衍生物、附加維生素之核苷酸衍生物、附加Cy5之核苷酸衍生物、附加Cy3之核苷酸衍生物、附加6-FAM之核苷酸衍生物及附加生物素之核苷酸衍生物等，較佳可列舉附加GalNAc之核苷酸衍生物。該等於進行固相上之伸長反應時可藉由與能夠於固相上反應之修飾劑進行反應，而對5'末端、3'末端及/或序列內部加以修飾。又，亦可藉由預先合成導入有胺基、巰基、疊氮基或三鍵等官能基之核酸並進行純化，使修飾劑作用於其等而獲得。 核苷酸衍生物亦可與核酸內之其他核苷酸或核苷酸衍生物形成伸烷基結構、肽結構、核苷酸結構、醚結構、酯結構、及組合有該等至少一者之結構等橋接結構。 本發明之核酸亦包含核酸分子中之一部分或全部原子被取代為質量數不同之原子(同位素)而成者。 於本說明書中，所謂「互補」係指於2個鹼基間能夠進行鹼基配對之關係，且指如例如腺嘌呤與胸腺嘧啶或尿嘧啶之關係、以及鳥嘌呤與胞嘧啶之關係般經由寬鬆之氫鍵使整個雙鏈區域形成雙螺旋結構者。 於本說明書中，所謂「互補」不僅包括2個核苷酸序列完全互補之情形，而且該核苷酸序列間可具有0～30%、0～20%或0～10%之錯配鹼基，例如與MASP2 mRNA互補之反義鏈意指與該mRNA之部分鹼基序列完全互補之鹼基序列中亦可包含1個或複數個鹼基之置換。具體而言，反義鏈亦可相對於標的基因之標的序列而具有1～8個、較佳為1～6個、1～4個、1～3個、尤其2個或1個錯配鹼基。例如於反義鏈之長度為21個鹼基之情形時，相對於標的基因之標的序列可具有6個、5個、4個、3個、2個或1個錯配鹼基，該錯配位置亦可為各序列之5'末端或3'末端。 又，所謂「互補」包括於一核苷酸序列與另一核苷酸序列完全互補之鹼基序列中附加及/或缺失1個或複數個鹼基而成之序列之情形。例如MASP2 mRNA與本發明之反義鏈核酸亦可藉由反義鏈中之鹼基之附加及/或缺失而於反義鏈及/或標的MASP2 mRNA區域具有1個或2個突起鹼基(bulge base)。 本發明之核酸只要為含有與MASP2 mRNA之一部分鹼基序列互補之鹼基序列之核酸及/或含有與該核酸之鹼基序列互補之鹼基序列之核酸，則亦可由任一核苷酸或其衍生物構成。關於本發明之雙鏈核酸，只要含有與標的MASP2 mRNA序列互補之鹼基序列之核酸、和含有與該核酸之鹼基序列互補之鹼基序列之核酸能夠形成雙鏈，則可為任一長度，能夠形成雙鏈之序列長度通常為11～35個鹼基，較佳為15～30個鹼基，更佳為17～25個鹼基，進而較佳為17～23個鹼基，尤佳為19～23個鹼基。又，亦較佳為包含21～23個鹼基。 作為本發明之反義鏈核酸，可使用含有與標的MASP2 mRNA序列互補之鹼基序列的核酸，亦可使用該核酸中缺失、置換或附加1～3個鹼基、較佳為1～2個鹼基、更佳為1個鹼基而成者。 作為抑制MASP2之表現之核酸，可適宜地使用：單鏈核酸，其含有與標的MASP2 mRNA序列互補之鹼基序列且抑制MASP2之表現；或者雙鏈核酸，其包含含有與標的MASP2 mRNA序列互補之鹼基序列之核酸、及含有與該核酸之鹼基序列互補之鹼基序列之核酸，且抑制MASP2之表現。 於本發明中，雙鏈核酸係指兩條核苷酸鏈配對而具有雙鏈區域之核酸。雙鏈區域係指構成雙鏈核酸之核苷酸或其衍生物構成鹼基對而形成雙鏈之部分。雙鏈區域通常為11～27個鹼基對，較佳為15～25個鹼基對，更佳為15～23個鹼基對，進而較佳為17～21個鹼基對，尤佳為17～19個鹼基對。 構成雙鏈核酸之單鏈核酸通常包含11～30個鹼基，較佳為包含15～29個鹼基，更佳為包含15～27個鹼基，進而較佳為包含15～25個鹼基，尤佳為包含17～23個鹼基，最佳為包含19～23個鹼基。又，亦較佳為包含21～23個鹼基。 於本發明之雙鏈核酸中，於繼雙鏈區域後之3'側或5'側具有未形成雙鏈之追加核苷酸或核苷酸衍生物之情形時，將其稱為突出部(overhang，懸突部)。於具有突出部之情形時，構成突出部之核苷酸亦可為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或該等之衍生物。 作為具有突出部之雙鏈核酸，可使用至少一條鏈之3'末端或5'末端具有包含1～6個鹼基、通常包含1～3個鹼基之突出部者，較佳為使用具有包含2個鹼基之突出部者，例如可列舉具有包含dTdT或UU之突出部者。突出部可僅反義鏈具有，可僅正義鏈具有，亦可反義鏈與正義鏈兩者均具有，於本發明中，較佳為使用於反義鏈與正義鏈兩者具有突出部之雙鏈核酸。再者，反義鏈於包含雙鏈區域及繼該區域後之突出部且包含至少17個核苷酸且至多30個核苷酸之寡核苷酸鏈中，與選自表1-1～表1-22及表2所記載之群中之標的MASP2 mRNA序列充分地互補。進而，作為本發明之雙鏈核酸，例如亦可使用利用切丁酶(Dicer)等核糖核酸酶之作用而生成上述雙鏈核酸之核酸分子(WO2005/089287)、或不具有3'末端或5'末端之突出部而形成平滑末端之雙鏈核酸、僅正義鏈或反義鏈突出之雙鏈核酸(US2012/0040459)等。 作為本發明之雙鏈核酸，可使用包含與標的基因之鹼基序列或其互補鏈之鹼基序列相同之序列的核酸，亦可使用包含該核酸之至少一條鏈之5'末端或3'末端被去除1～4個鹼基之核酸、及含有與該核酸之鹼基序列互補之鹼基序列之核酸的雙鏈核酸。 本發明之雙鏈核酸亦可為RNA彼此形成雙鏈之雙鏈RNA(dsRNA)、DNA彼此形成雙鏈之雙鏈DNA(dsDNA)、或RNA與DNA形成雙鏈之雜交核酸。或者，亦可雙鏈中之一條或兩條鏈為DNA與RNA之嵌合核酸。較佳為雙鏈RNA(dsRNA)。 本發明之反義鏈之自5'末端起第2個核苷酸較佳為與標的MASP2 mRNA序列之自3'末端起第2個核糖核苷酸互補，更佳為反義鏈之自5'末端起第2～7個核苷酸與標的MASP2 mRNA序列之自3'末端起第2～7個核糖核苷酸完全互補，進而較佳為反義鏈之自5'末端起第2～11個核苷酸與標的MASP2 mRNA序列之自3'末端起第2～11個核糖核苷酸完全互補。又，較佳為本發明之核酸中之反義鏈之自5'末端起第11個核苷酸與標的MASP2 mRNA序列之自3'末端起第11個核糖核苷酸互補，更佳為反義鏈之自5'末端起第9～13個核苷酸與標的MASP2 mRNA序列之自3'末端起第9～13個核糖核苷酸完全互補，進而較佳為反義鏈之自5'末端起第7～15個核苷酸與標的MASP2 mRNA序列之自3'末端起第7～15個核糖核苷酸完全互補。 作為製造本發明之核酸之方法並無特別限定，可列舉使用公知之化學合成之方法或酶轉錄法等。作為使用公知之化學合成之方法，可列舉：亞磷醯胺法、硫代磷酸酯法、磷酸三酯法、CEM(2-cyanoethoxymethyl，2-氰基乙氧基甲基)法[Nucleic Acid Research, 35, 3287(2007)]等，例如可利用ABI3900高產量核酸合成機(Applied Biosystems公司製造)進行合成。合成結束後，進行自固相之脫離、保護基之去保護及目標物之純化等。較理想為藉由純化而獲得純度90%以上、較佳為95%以上之核酸。於為雙鏈核酸之情形時，可將經合成及純化之正義鏈、反義鏈以適當之比率、例如相對於反義鏈1當量而正義鏈為0.1～10當量、較佳為0.5～2當量、更佳為0.9～1.1當量、進而較佳為等莫耳量進行混合後，進行退火後再使用，或者亦可省略將混合而成者加以退火之步驟而直接使用。退火只要為可形成雙鏈核酸之條件，則可以任意條件進行，通常藉由將正義鏈、反義鏈以大致等莫耳量進行混合後，於94℃左右之溫度下加熱5分鐘左右，然後緩慢冷卻至室溫而進行。作為製造本發明之核酸之酶轉錄法，可列舉以具有目標鹼基序列之質體或DNA作為模板，並使用噬菌體RNA聚合酶、例如T7、T3、或SP6RNA聚合酶進行轉錄之方法。 本發明之核酸可使用轉染(transfection)用載體、較佳為陽離子性脂質體等陽離子性載體而導入至細胞內。又，亦可藉由磷酸鈣法、電穿孔法或顯微注射法等而直接導入至細胞內。 本發明之核酸之5'末端、3'末端或/及序列內部亦可利用1個以上之配位基或螢光團加以修飾，亦將經配位基或螢光團修飾之核酸稱為複合核酸。於進行固相上之伸長反應時可藉由與能夠於固相上反應之修飾劑進行反應，而對5'末端、3'末端或/及序列內部加以修飾。又，亦可藉由預先合成導入有胺基、巰基、疊氮基或三鍵等官能基之核酸並進行純化，使修飾劑作用於其等而獲得複合核酸。作為配位基，為與生物分子具有親和性之分子即可，例如可列舉：膽固醇、脂肪酸、維生素E、類視色素等脂質類，N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)等糖類，完全抗體、Fab、VHH等抗體，低密度脂蛋白質(LDL)、人血清白蛋白等蛋白質、RGD、NGR、R9、CPP等肽類，葉酸等低分子、合成聚胺基酸等合成聚合物，或核酸適體等，亦可將該等組合而使用。作為螢光團，可列舉Cy3系列、Alexa系列、Black Hole Quencher等。 亦可使用如導入至細胞內並使該等表現之載體來代替本發明之核酸。具體而言，可藉由將編碼本發明之核酸之序列插入至表現載體內之啟動子下游而構建表現載體，並導入至細胞中，而使該核酸等表現。作為表現載體，可列舉：pCDNA6.2-GW/miR(Invitrogen公司製造)、pSilencer 4.1-CMV(Ambion公司製造)、pSINsi-hH1 DNA(TAKARA BIO公司製造)、pSINsi-hU6 DNA(TAKARA BIO公司製造)、pENTR/U6(Invitrogen公司製造)等。 又，亦可使用如下重組病毒載體，該重組病毒載體係將編碼本發明之核酸之序列插入至病毒載體內之啟動子下游，並將該載體導入至包裝細胞(packaging cell)中而生產。作為病毒載體，可列舉反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體等。 2.具有MASP2之表現抑制活性之核酸 本發明之反義鏈及正義鏈例如可基於以基因庫登錄號No.NM_006610.3登錄之人MASP2之全長mRNA之cDNA(正義鏈)之鹼基序列(序列編號2827)而設計。又，亦可藉由將人MASP2之全長mRNA之cDNA之鹼基序列與其他物種之MASP2之全長mRNA之cDNA之鹼基序列進行比較，而於複數個物種間設計抑制MASP2 mRNA表現之反義鏈、正義鏈。 作為具有MASP2之表現抑制活性之核酸，可列舉如下雙鏈核酸，該雙鏈核酸係包含含有與MASP2 mRNA互補之鹼基序列之本發明之反義鏈核酸、及含有與該核酸之鹼基序列互補之鹼基序列之本發明之正義鏈核酸，且具有MASP2之表現抑制活性者。構成該雙鏈核酸之單鏈核酸通常包含11～30個鹼基，較佳為包含15～29個鹼基，更佳為包含15～27個鹼基，進而較佳為包含15～25個鹼基，尤佳為包含17～23個鹼基，最佳為包含19～21個鹼基。亦可包含19～23個鹼基、較佳為21～23鹼基。該雙鏈核酸具有通常包含15～27個鹼基對、較佳為15～25個鹼基對、更佳為15～23個鹼基對、進而較佳為15～21個鹼基對之雙鏈區域。 可藉由將該等雙鏈核酸導入至細胞中，而抑制MASP2之表現。例如本發明之雙鏈核酸可於以數pM～數nM之濃度導入至細胞後培養24小時以上、例如48小時之階段抑制MASP2之mRNA之表現。 又，本發明之雙鏈核酸之MASP2 mRNA之表現抑制活性之評價可藉由如下方式進行，即，使用陽離子性脂質體等將該核酸等轉染至人類細胞株等中，並培養一定時間後，對該人類細胞株中之MASP2之mRNA之表現量進行定量。 作為具有MASP2之表現抑制活性之核酸，除上述雙鏈核酸以外，亦可列舉如下單鏈核酸，該單鏈核酸係包含與MASP2 mRNA之一部分鹼基序列互補之鹼基序列且抑制MASP2之表現者。構成該核酸之單鏈核酸通常包含8～30個鹼基，較佳為包含12～30個鹼基，更佳為包含12～20個鹼基。亦可包含19～23個鹼基、較佳為21～23個鹼基。 可藉由將該等單鏈核酸亦導入至細胞中，而抑制MASP2之表現。例如本發明之單鏈核酸可於以數pM～數nM之濃度導入至細胞後培養24小時以上、例如48小時之階段抑制MASP2之mRNA之表現。 又，本發明之單鏈核酸之MASP2之mRNA之表現抑制活性之評價可藉由如下方式進行，即，使用陽離子性脂質體等將該核酸等轉染至人類細胞株等中，並培養一定時間後，對該人類細胞株中之MASP2之mRNA之表現量進行定量。 3.本發明之醫藥組合物 又，本發明係關於一種含有上述雙鏈核酸、單鏈核酸等核酸作為有效成分之醫藥組合物。本發明之醫藥組合物可用作抗磷脂質抗體症候群(APS，Antiphospholipid Syndrome)、全身性紅斑狼瘡(SLE，Systemic Lupus Erythematosus)等自體免疫疾病及血液透析時之血栓症之治療劑或預防劑。 又，本發明之醫藥組合物可適宜地用於與MASP2之表現相關之疾病、尤其是由補體凝集素途徑異常所介導之障礙之治療或預防用途。於本說明書中，由補體凝集素途徑異常所介導之障礙除上述自體免疫疾病(例如APS、SLE)、血液透析時之血栓症以外，例如亦指IgA腎病、膜性腎病、狼瘡性腎病、C3腎病、血栓性血小板減少性紫癜病、血栓性微血管病變、非典型溶血性尿毒症候群(aHUS)、缺血時之腎障礙或腦梗塞時之組織傷害等。因此，本發明之醫藥組合物可用作IgA腎病、膜性腎病、狼瘡性腎病、C3腎病、血栓性血小板減少性紫癜病、血栓性微血管病變、非典型溶血性尿毒症候群(aHUS)、缺血時之腎障礙或腦梗塞時之組織傷害等之治療劑或預防劑。 該醫藥組合物可進而包含對於使核酸移動至細胞內有效之載體。作為對於使核酸移動至細胞內有效之載體，例如可列舉陽離子性載體。作為陽離子性載體，可列舉陽離子性脂質體及陽離子性聚合物等。又，作為對於使核酸移動至細胞內有效之載體，亦可使用利用病毒包膜之載體。作為陽離子性聚合物，較佳為使用JetSI(Qbiogene公司)、Jet-PEI(聚乙烯亞胺；Qbiogene公司)等。作為利用病毒包膜之載體，較佳為使用GenomeOne(註冊商標)(HVJ-E Liposome；石原產業公司)等。 含有本發明之核酸與上述載體之組合物可藉由從業者已知之方法而製備。例如可將適當濃度之載體分散液與核酸溶液進行混合而製備。於使用陽離子性載體之情形時，核酸通常於水溶液中帶負電，故而可藉由利用常法於水溶液中進行混合而容易地製備。作為用於製備該組合物之水性溶劑，可列舉：注射用水、注射用蒸餾水、生理鹽水等電解質液、葡萄糖液、麥芽糖液等糖液等。又，製備該組合物時之pH值及溫度等條件可由從業者進行適當選擇。該組合物亦可視需要藉由使用超音波分散裝置或高壓乳化裝置等進行分散處理而製成均勻之組合物。最適於製備包含載體與核酸之組合物之方法及條件由於依存於所使用之載體，故而不限於上述方法，從業者可選擇對於所使用之載體而言最佳之方法。 又，作為本發明之醫藥組合物，例如亦可適宜地使用由以核酸與引導粒子作為構成成分之複合粒子及被覆該複合粒子之脂質膜所構成之組合物。作為引導粒子，例如可列舉脂質集合體、脂質體、乳化粒子、高分子、金屬膠體、微粒子製劑等，較佳為使用陽離子性脂質體。本發明中之引導粒子可以將脂質集合體、脂質體、乳化粒子、高分子、金屬膠體、微粒子製劑等中之2種以上組合而成之複合體作為構成成分，亦可以將脂質集合體、脂質體、乳化粒子、高分子、金屬膠體、微粒子製劑等與其他化合物(例如糖、脂質、無機化合物等)組合而成之複合體作為構成成分。 作為被覆該複合粒子之脂質膜，例如可列舉以非陽離子性脂質、阻礙粒子凝集之脂質及陽離子性脂質等作為構成成分之脂質膜。 該組合物例如可根據國際公開公報2006/080118號說明書等中所記載之方法而製備。 關於本發明之醫藥組合物中所含有之核酸與載體之調配比，相對於核酸1重量份，適宜為載體為1～200重量份。較佳為相對於核酸1重量份，載體為2.5～100重量份，進而較佳為載體為7～25重量份。 關於本發明之醫藥組合物之大小，平均粒徑較佳為約10 nm～300 nm，更佳為約30 nm～200 nm，進而較佳為約50 nm～150 nm。 於本發明之醫藥組合物中，除上述載體以外亦可含有醫藥上可容許之載體或稀釋劑等。醫藥上可容許之載體或稀釋劑等本質上為化學惰性且無害之組合物，且為完全不會對本發明之醫藥組合物之生物活性造成影響者。此種載體或稀釋劑之例有鹽溶液、糖溶液、甘油溶液、乙醇等，但並不限定於該等。 本發明之醫藥組合物包含對於疾病之治療或預防而言有效量之該複合體，且以可對患者恰當地進行投予之形態提供。本發明之醫藥組合物之製劑形態例如亦可為注射劑、滴眼劑、吸入用等之液劑、例如軟膏、洗劑等外用劑等。 於液劑之情形時，本發明之醫藥組合物中之有效成分之濃度範圍通常為0.001～25%(w/v)，較佳為0.1～10%(w/v)，更佳為0.5～5%(w/v)。本發明之醫藥組合物亦可含有適當量之醫藥上容許之任意之添加劑、例如乳化輔助劑、穩定劑、等張劑、pH值調節劑等。醫藥上容許之任意之添加劑可於分散該複合體前添加，亦可於分散後在適當步驟中添加。 該液劑之pH值通常調整為約5.0～約8.5，較佳為調整為約6.0～約8.0，較佳為使用薄膜過濾器等進行過濾殺菌等殺菌處理。 本發明之醫藥組合物亦可製備為冷凍乾燥製劑。冷凍乾燥製劑可藉由對核酸及載體分散處理後進行冷凍乾燥處理而製備。冷凍乾燥處理可藉由常法進行。例如可將特定量之上述分散處理後之複合體溶液於無菌狀態下分注至小瓶中，於約-40～-20℃之條件下進行約2小時左右之預乾燥，於約0～10℃下且減壓下進行一次乾燥，繼而於約15～25℃下且減壓下進行二次乾燥，並實施冷凍乾燥。然後，例如可藉由將小瓶內部利用氮氣加以置換並封蓋，而獲得本發明之醫藥組合物之冷凍乾燥製劑。 冷凍乾燥製劑可藉由添加任意之適當溶液進行再溶解而使用。作為此種溶液，可列舉注射用水、生理鹽水等電解質液、葡萄糖液、以及普通之輸液等。該溶液之液量根據用途等而異，並無特別限制，較佳為冷凍乾燥前之液量之0.5～2倍量、或500 ml以下。 本發明之醫藥組合物可對包括人在內之動物進行例如靜脈內投予、動脈內投予、經口投予、組織內投予、經皮投予、經黏膜投予或經直腸投予，較佳為藉由根據患者症狀之適當之方法進行投予。尤佳為使用靜脈內投予、經皮投予、經黏膜投予。又，亦可進行癌內局部投予等局部投予。作為適於該等投予方法之劑型，例如可列舉各種注射劑、經口劑、點滴劑、吸收劑、滴眼劑、軟膏劑、洗劑、栓劑等。 本發明之醫藥組合物之用量較理想為於考慮核酸、劑型、年齡或體重等患者之狀態、投予途徑、疾病性質及程度等之基礎上決定，通常以核酸之質量計，成人每天為0.1 mg～10 g/天，較佳為1 mg～500 mg/天。視情況有時為該等量以下便足夠，另外有時反而需要其以上之用量。又，可每天投予1次～數次，亦可間隔1天～數天而投予。 4.治療方法 本發明進而提供一種治療由補體凝集素途徑異常所介導之障礙之方法(本發明之治療方法)，其包括如下步驟：對需要此種治療之人投予治療上有效量之本發明之核酸或本發明之醫藥組合物。 本發明之治療方法之特徵在於：其係治療較佳為IgA腎病、膜性腎病、狼瘡性腎病、C3腎病、血栓性血小板減少性紫癜病、血栓性微血管病變、非典型溶血性尿毒症候群(aHUS)、缺血時之腎障礙或腦梗塞時之組織傷害等疾病之方法，並且對需要該治療之人投予治療上有效量之本發明之核酸或本發明之醫藥組合物。其他步驟及條件無任何限制。 本發明之治療方法例如可援用上述本發明之醫藥組合物之投予方法、用量、製備方法等。 以下，藉由實施例對本發明進行說明。但本發明並不限定於該等實施例。 實施例1人類細胞內之 MASP2 mRNA 之減弱活性之測定
於96孔之培養盤中以成為10,000細胞/80 μL/孔之方式接種作為人類肝癌細胞株之HepG2/C3A細胞(自ATCC(American type culture collection，美國菌種保存中心)購入，ATCC編號：CRL-10741)。培養基係使用含有10%胎牛血清(FBS)、1 mM丙酮酸鈉(Nacalai Tesque公司製造，目錄編號：06977-34)、1%MEM(Minimum Essential Medium，最低基礎培養基)非必需胺基酸(Non-Essential Amino Acids)(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號：11140-050)之MEM培養基(Nacalai Tesque公司製造，目錄編號：21442-25)。雙鏈核酸係利用Sigma-Aldrich合成表1-1～表1-22中所記載者而利用。具體而言係由使序列編號1～942所示之包含核糖核苷酸之正義鏈、序列編號943～1884所示之包含核糖核苷酸之反義鏈進行退火而獲得之雙鏈核酸所構成(序列編號n(n＝1～942)所示之正義鏈與序列編號[n＋942]所示之反義鏈成對)。將該表1-1～表1-22所記載之雙鏈核酸與RNAiMax轉染試劑(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號：13778-150)利用Opti-MEM培養基(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號：31985-070)進行稀釋，以雙鏈核酸之最終濃度成為10 nM之方式向各96孔之培養盤中添加20 μL之siRNA/RNAiMax混合液，於37℃、5%CO2
條件下培養24小時。其後，將細胞利用PBS(Phosphate buffered saline，磷酸鹽緩衝生理食鹽水)洗淨，使用SuperPrep(註冊商標)Cell Lysis & RT Kit for qPCR(quantitative polymerase chain reaction，定量聚合酶鏈反應)套組(Toyobo公司製造，目錄編號：SCQ-101)，根據製品隨附之說明書中所記載之方法自各培養盤合成cDNA。將該cDNA 4 μL添加至MicroAmp Optical(光學)384孔盤(Applied Biosystems公司製造，目錄編號：4309849)中，進而添加10 μL之TaqMan(註冊商標)Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems公司製造，目錄編號4369016)、4 μL之UltraPure Distilled Water(超純蒸餾水)(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號：10977-015)、1 μL之人(human)MASP2探針(Applied Biosystems公司製造，Hs00198244_m1)、1 μL之人GAPDH(D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶)探針(Applied Biosystems公司製造，Hs02786624_g1)。使用QuantStudio(註冊商標)12K Flex即時PCR系統，進行人MASP2基因及人GAPDH(D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶))基因之即時PCR。GAPDH為構成性表現基因，且作為內部對照進行測定，而修正MASP2表現量。將不添加siRNA而僅利用轉染試劑處理HepG2/C3A細胞時之MASP2 mRNA量設為1.0，算出導入各雙鏈核酸時之MASP2 mRNA相對表現量。將本實驗進行2次或3次，將MASP2 mRNA相對表現量之平均值示於表1-1～表1-22。於表1-1～表1-22中之備註欄中，*標記表示2次實驗之平均值，此外表示3次實驗之平均值。 [表1-1][表1-2][表1-3][表1-4][表1-5][表1-6][表1-7][表1-8][表1-9][表1-10][表1-11][表1-12][表1-13][表1-14][表1-15][表1-16][表1-17][表1-18][表1-19][表1-20][表1-21][表1-22]實施例2修飾 siRNA 之人類細胞內之 MASP2 mRNA 之減弱活性之測定
於96孔之培養盤中以成為10,000細胞/80 μL/孔之方式接種作為人類肝癌細胞株之HepG2/C3A細胞(自ATCC購入，ATCC編號：CRL-10741)。培養基係使用含有10%胎牛血清(FBS)、1 mM丙酮酸鈉(Nacalai Tesque公司製造，目錄編號：06977-34)、1%MEM非必需胺基酸(Non-Essential Amino Acids)(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號：11140-050)之MEM培養基(Nacalai Tesque公司製造，目錄編號：21442-25)。雙鏈核酸係利用Genedesign合成表2中所記載者而利用。具體而言係由將序列編號2828～2899所示之包含核糖核苷酸之正義鏈、序列編號2900～2971所示之包含核糖核苷酸之反義鏈進行退火而獲得之雙鏈核酸所構成(序列編號n(n＝2828～2899)所示之正義鏈與序列編號[n＋72]所示之反義鏈成對)。將該表2所記載之雙鏈核酸與RNAiMax轉染試劑(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號：13778-150)利用Opti-MEM培養基(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號：31985-070)進行稀釋，以雙鏈核酸之最終濃度成為10 nM之方式向各96孔之培養盤中添加20 μL之siRNA/RNAiMax混合液，於37℃、5%CO2
條件下培養24小時。其後，將細胞利用PBS(Phosphate buffered saline)洗淨，使用SuperPrep(註冊商標)Cell Lysis & RT Kit for qPCR套組(Toyobo公司製造，目錄編號：SCQ-101)，根據製品隨附之說明書中所記載之方法自各培養盤合成cDNA。將該cDNA 4 μL添加至MicroAmp Optical 384孔盤(Applied Biosystems公司製造，目錄編號：4309849)中，進而添加10 μL之TaqMan(註冊商標)Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems公司製造，目錄編號4369016)、4 μL之UltraPure Distilled Water(Thermo Fisher Scientific公司製造，目錄編號：10977-015)、1 μL之人MASP2探針(Applied Biosystems公司製造，Hs00198244_m1)、1 μL之人GAPDH探針(Applied Biosystems公司製造，Hs02786624_g1)。使用QuantStudio(註冊商標)12K Flex即時PCR系統，進行人MASP2基因及人GAPDH(D-glyceraldehyde-3-phosphatede dehydrogenase(D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶))基因之即時PCR。GAPDH為構成性表現基因，且作為內部對照進行測定，而修正MASP2表現量。將未添加siRNA而利用轉染試劑處理HepG2/C3A細胞時之MASP2 mRNA量設為1.0，算出導入各雙鏈核酸時之MASP2 mRNA相對表現量。將本實驗進行2次或4次，將MASP2 mRNA相對表現量之平均值示於表2。於表2中之備註欄中，*標記表示4次實驗之平均值，此外表示2次實驗之平均值。 [表2]本申請案係以在日本提出申請之日本專利特願2017-045226(申請日：2017年3月9日)為基礎，藉由此處加以提及，而將其內容全部包括至本說明書。 [產業上之可利用性] 根據本發明，提供具有MASP2之表現抑制活性之核酸、以該核酸作為有效成分之醫藥組合物等。本發明之核酸及醫藥組合物會抑制MASP2之表現，而對於APS、SLE等自體免疫疾病以及血液透析時之血栓症之治療、預防有用。
Claims (16)
- 一種使MASP2基因之表現減少之雙鏈核酸，其係包含正義鏈及反義鏈且含有至少11個鹼基對之雙鏈區域之雙鏈核酸，並且於上述反義鏈中鏈長為至少17個核苷酸且至多30個核苷酸之寡核苷酸鏈中，與選自表1-1～表1-22所記載之群中之標的MASP2 mRNA序列互補。
- 如請求項1之雙鏈核酸，其中上述雙鏈區域為11～27個鹼基對，且與選自表1-1～表1-22所記載之群中之標的MASP2 mRNA序列互補之上述反義鏈之自5'末端起第2個核苷酸與該標的MASP2 mRNA序列之自3'末端起第2個核糖核苷酸互補。
- 如請求項1或2之雙鏈核酸，其中上述正義鏈之3'末端及上述反義鏈之5'末端形成平滑末端。
- 如請求項3之雙鏈核酸，其中上述正義鏈之長度為21個核苷酸，且上述反義鏈之長度為23個核苷酸。
- 如請求項1或2之雙鏈核酸，其中上述正義鏈之長度為21個核苷酸，且上述反義鏈之長度為21個核苷酸。
- 如請求項5之雙鏈核酸，其中上述正義鏈之3'末端及上述反義鏈之3'末端具有突出部分。
- 如請求項1至6中任一項之雙鏈核酸，其中上述反義鏈含有選自表1-1～表1-22及表2之「反義鏈」所記載之群中之序列。
- 如請求項1至6中任一項之雙鏈核酸，其中上述正義鏈含有選自表1-1～表1-22及表2之「正義鏈」所記載之群中之序列。
- 如請求項1至6中任一項之雙鏈核酸，其含有選自由表1-1～表1-22及表2所記載之正義鏈/反義鏈所組成之群中之1對正義鏈/反義鏈之序列。
- 如請求項1至9中任一項之雙鏈核酸，其含有2'-修飾核苷酸。
- 如請求項10之雙鏈核酸，其中雙鏈區域內之核苷酸之50～100%為2'-修飾核苷酸。
- 如請求項1至11中任一項之雙鏈核酸，其含有配位基。
- 一種單鏈核酸，其僅包含如請求項1至12中任一項之雙鏈核酸之反義鏈。
- 一種醫藥組合物，其含有如請求項1至13中任一項之核酸。
- 一種治療由補體凝集素途徑異常所介導之障礙的方法，其包括如下步驟：對需要此種治療之人投予治療上有效量之如請求項1至13中任一項之核酸或如請求項14之醫藥組合物。
- 如請求項15之方法，其中上述障礙為IgA腎病、膜性腎病、狼瘡性腎病、C3腎病、血栓性血小板減少性紫癜病、血栓性微血管病變、非典型溶血性尿毒症候群(aHUS)、或者缺血時之腎障礙或腦梗塞時之組織傷害。
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