TW201835100A

TW201835100A - 新穎ｔ細胞受體

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Publication number: TW201835100A
Application number: TW107103987A
Authority: TW
Inventors: 中面哲也; 吉川聡明; 植村靖史; 福田恭子; 金子新; 南川淳; 葛西義明; 松田淳志
Original assignee: 國立研究開發法人國立癌症研究中心; 國立大學法人京都大學; 日商武田藥品工業股份有限公司
Priority date: 2017-02-06
Filing date: 2018-02-05
Publication date: 2018-10-01
Also published as: US11603519B2; EP3578650A1; JP7131775B2; EP3578650A4; JPWO2018143454A1; WO2018143454A1; US20200010804A1; US20230257708A1

Abstract

本發明提供一種T細胞受體，其為能與具有序列編號27所示之胺基酸序列的胜肽或該胜肽與HLA-A24之複合體結合的T細胞受體，該T細胞受體包含作為α鏈之互補性決定區域之以序列編號1至3分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列、或以序列編號4至6分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列，且該T細胞受體包含作為β鏈之互補性決定區域之以序列編號7至9分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列、或以序列編號10至12分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列。又，本發明提供一種T細胞受體，其為能與具有序列編號28所示之胺基酸序列的胜肽或該胜肽與HLA-A02之複合體結合的T細胞受體，該T細胞受體包含作為α鏈之互補性決定區域之以序列編號13至15分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列，且包含作為β鏈之互補性決定區域之以序列編號16至18分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列。

Description

新穎T細胞受體

本發明係關於對磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3)具特異性之新穎T細胞受體。

原發性肝癌主要為肝細胞癌(HCC)，在日本為第5常見之癌，然而預後非常差，死亡率非常高。就其預後不良之主要原因之一而言，可列舉對進行性HCC之治療的選項有限。進行性HCC之患者，只有局部切除或多種激酶阻礙劑如索拉非尼(sorafenib)之投與等症狀治療法，尤其對於高齡者，索拉非尼之回應率(response rate)低，副作用之發生率高。因此，尋求開發將副作用之風險縮至最小，並使進行性HCC患者之生存率提高之新治療法。

免疫療法被研判為對HCC的有力治療法之一。例如，磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3)(GPC3)，由於在HCC中特別過度表現，亦與預後不良相關連，為對HCC之癌免疫療法的理想標的。於是，就對HCC之免疫治療法而言，已報導使用GPC3特異性抗體或以GPC3作為標的之人類嵌合抗原受體(CAR)的治療法(專利文獻1)。又，亦報導關於對HLA-A02-限制性GPC3_367-375胜肽具特異性的T細胞受體(TCR)(專利文獻2)。

TCR意指T細胞識別抗原時所使用之受體，TCR係由α鏈及β鏈、或γ鏈及δ鏈之二聚體構成。TCR在T細胞表面上與CD3分子群形成複合體，可識別抗原並對T細胞傳達刺激信號。各個TCR鏈具有可變區域及恆定區域，恆定區域具有貫通細胞膜之短細胞質部分，可變區域存在於細胞外，與抗原-HLA(MHC)複合體結合。可變區域中，存在3個稱為互補性決定區域(CDR)的區域，該等區域與抗原-HLA(MHC)複合體結合。3個CDR分別稱為CDR1、CDR2、CDR3。

本發明人等，從由以HLA-A02限制性GPC3_144-152胜肽進行疫苗接種之患者而來的末梢血單核細胞(PBMC)，建立表現各種GPC3_144-152胜肽特異性TCR之細胞傷害性T細胞(CTL)純系(非專利文獻1)。然而，在非專利文獻1中，並未揭示關於此等CTL純系之TCR序列。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2013/070468號

[專利文獻2]國際公開第2015/173112號

[非專利文獻]

[非專利文獻1] Yoshikawa T., et al., Cancer Sci 2011 (102): 918-925

本發明之課題，為提供特異性地識別磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的新穎之T細胞受體(TCR)。又，課題為提供使用前述TCR之(例如，使用含前述TCR之細胞傷害性T細胞)用於表現GPC3之癌或腫瘤之預防或治療的醫藥。

本發明人等從由接種GPC3胜肽(HLA-A24-限制性GPC3_298-306胜肽或HLA-A02-限制性GPC3_144-152胜肽)之患者而來的末梢血單核細胞(PBMC)建立CTL純系，並從其中解讀特定之CTL純系的TCR序列。基於該TCR序列專心研究之結果，發現此等TCR對表現GPC3之癌細胞具有應答性，藉由將對TCR之恆定區域施行規定的改變的TCR對細胞進行基因導入，可有效地表現功能型TCR，於是完成本發明。

亦即，本發明提供以下項目。

[1]一種T細胞受體(TCR)，其能與具有序列編號27所示之胺基酸序列的胜肽或該胜肽與HLA-A24之複合體結合，該T細胞受體包含作為α鏈之互補性決定區域之序列編號1所示之胺基酸序列、序列編號2所示之胺基酸序列、及序列編號3所示之胺基酸序列，或序列編號4所示之胺基酸序列、序列編號5所示之胺基酸序列、及序列編號6所示之胺基酸序列；且該T細胞受體包含作為β鏈之互補性決定區域之序列編號7所示之胺基酸序列、序列編號8所示之胺基酸序列、及序列編號9所示之胺基酸序列，或序列編號10所示之胺基酸序列、序列編號11所示之胺基酸序列、及序列編號12所示之胺基酸序列。

[2]一種T細胞受體(TCR)，其能與具有序列編號28所示之胺基酸序列的胜肽或該胜肽與HLA-A02之複合體結合，該T細胞受體包含作為α鏈之互補性決定區域之序列編號13所示之胺基酸序列、序列編號14所示之胺基酸序列、及序列編號15所示之胺基酸序列；且該T細胞受體包含作為β鏈之互補性決定區域之序列編號16所示之胺基酸序列、序列編號17所示之胺基酸序列、及序列編號18所示之胺基酸序列。

[3]一種T細胞受體(TCR)，其能與具有序列編號27所示之胺基酸序列的胜肽或該胜肽與HLA-A24之複合體結合，該T細胞受體包含作為α鏈之可變區域之序列編號19所示之胺基酸序列、序列編號19所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號19所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列，或者序列編號20所示之胺基酸序列、序列編號20所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號20所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列；且該T細胞受體包含作為β鏈之可變區域之序列編號21所示之胺基酸序列、序列編號21所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號21所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列，或者序列編號22所示之胺基酸序列、序列編號22所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號22所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列。

[4]一種T細胞受體(TCR)，其能與具有序列編號28所示之胺基酸序列的胜肽或該胜肽與HLA-A02之複合體結合，該T細胞受體包含作為α鏈之可變區域之序列編號23所示之胺基酸序列、序列編號23所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號23所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列；且該T細胞受體包含作為β鏈之可變區域之序列編號24所示之胺基酸序列、序列編號24所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號24所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列。

[5]在[1]至[4]之任一項中所記載之T細胞受體，該T細胞受體更包含作為α鏈之恆定區域之序列編號25所示之胺基酸序列、序列編號25所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號25所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列；且該T細胞受體更包含作為β鏈之恆定區域之序列編號26所示之胺基酸序列、序列編號26所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號26所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列。

[6]一種核酸，其編碼在[1]至[5]之任一項中所記載之T細胞受體。

[7]一種表現載體，其包含在[6]中所記載之核酸。

[8]一種細胞，其包含在[6]中所記載之核酸或在[7]中記載之表現載體。

[9]在[8]中所記載之細胞，其中該細胞為淋巴球或多能性幹細胞。

[10]在[8]中記載之細胞，其中該細胞為細胞傷害性T細胞。

[10-1]一種細胞，其包含編碼在[1]至[5]之任一項中所記載之T細胞受體的外因性核酸。

[10-2]一種多能性幹細胞，其包含編碼在[1]至[5]之任一項中所記載之T細胞受體的外因性核酸。

[10-3]一種造血前驅細胞，其包含編碼在[1]至[5]之任一項中所記載之T細胞受體的外因性核酸。

[10-4]一種T細胞，其包含編碼在[1]至[5]之任一項中所記載之T細胞受體的外因性核酸。

[11]一種製造在[8]中記載之細胞的方法，其包含將在[6]中記載之核酸或在[7]中記載之表現載體導入細胞的步驟。

[12]一種從多能性幹細胞誘導之T細胞，其包含在[6]中記載之核酸或在[7]中記載之表現載體。

[13]一種T細胞之製造方法，其包含下列步驟：(1)使包含在[6]中記載之核酸或在[7]中記載之表現載體的多能性幹細胞分化為造血前驅細胞的步驟；及(2)使該造血前驅細胞分化為T細胞之步驟；以及可任意選擇之(3)使該T細胞增殖之步驟。

[14]如在[13]中記載之製造方法，其中該T細胞為細胞傷害性T細胞，尤其是CD8陽性細胞傷害性T細胞。

[15]一種醫藥，其含有在[8]至[10]及[12]中任一項記載之細胞。

[16]在[15]中記載之醫藥，其係使用於癌之預防或治療。

[17]一種表現磷脂醯肌醇蛋白聚糖3之細胞的殺傷劑，其含有在[8]至[10]及[12]中任一項所述之細胞。

[18]一種預防或治療哺乳動物之癌之方法，其特徵為將在[8]至[10]及[12]之任一項中記載之細胞的有效量投與至該哺乳動物。

[19]在[8]至[10]及[12]之任一項中記載之細胞，其係使用於癌之預防或治療。

[20]一種[8]至[10]及[12]之任一項中記載之細胞之使用，其係用於製造癌之預防劑或治療劑。

本發明之T細胞受體具有對GPC3胜肽(HLA-A24-限制性GPC3_298-306胜肽或HLA-A02-限制性GPC3_144-152胜肽)或該胜肽與HLA-A分子(HLA-A24或HLA-A02)之複合體之結合能力。又，編碼前述T細胞受體之核酸，由於可將對呈現HLA-A分子及GPC3胜肽之細胞的細胞傷害活性賦予T細胞，在預防或治療表現GPC3之癌或腫瘤為有用者。

第1圖展示對干擾素-γ進行ELISPOT檢定的結果，該檢定係用於測定抗原特異性CTL反應。

第2圖展示胜肽滴定檢定的結果，該檢定係用於測定各CTL純系對GPC3胜肽與HLA-A分子之複合體的識別效率。

第3圖展示導入本發明之TCR之轉形PBMC之Dextramer染色及流式細胞術的結果。

第4圖展示從導入TCR1-1’基因之Ff-l01s04細胞、或未導入基因之Ff-I01s04細胞而來的分化T細胞中T細胞標記的表現。圖中，上段(A,B及C)展示從未導入基因之Ff-I01s04細胞而來的分化T細胞之T細胞標記的表現，下段(D,E及F)展示從導入基因之Ff-l01s04細胞、或未導入基因之Ff-I01s04細胞而來的分化T細胞之標記的表現。

第5圖展示從表現TCR1-1’之iPS細胞而來的T細胞，對於添加或未添加GPC3抗原胜肽之HLA-A24陽性或HLA-A24陰性淋巴母球細胞系(LCL)的細胞傷害活性試驗之結果。

第6圖展示從表現TCR1-1’之iPS細胞而來的T細胞，對於GPC3陽性HLA-A*24：01陽性之人類肝癌細胞株的細胞傷害活性試驗之結果。

1.T細胞受體

本發明提供可與GPC3_298-306胜肽或該胜肽與HLA-A24之複合體結合的T細胞受體(亦稱為T-cell receptor或TCR)(以下簡稱為「本發明之TCR1」)。又，本發明提供能與GPC3_144-152胜肽或該胜肽與HLA-A02之複合體結合的T細胞受體(以下簡稱為「本發明之TCR2」)。以下，有時將「本發明之TCR1」及「本發明之TCR2」總稱為「本發明之TCR」。本發明之TCR亦可為經單離者。

在本發明中，「T細胞受體(TCR)」意指由TCR鏈(α鏈、β鏈)之二聚體構成，可識別抗原或該抗原-HLA(人類白血球型抗原)(MHC：主要組織相容性基因複合體)複合體，並可對T細胞傳達刺激信號的受體。各個TCR鏈由可變區域及恆定區域構成，在可變區域中，存在3個互補性決定區域(CDR1、CDR2、CDR3)。又，本發明之TCR中，TCR之α鏈及β鏈不僅包含構成異源二聚體者，亦包含構成同源二聚體者。再者，在本發明之TCR中，亦包含缺損恆定區域之一部分或全部者、將胺基酸序列重組者、製成可溶性TCR(soluble TCR)者等。

在本發明中，「可溶性TCR」意指藉由TCR之化學修飾、與Fc受體之結合或細胞膜貫通結構域之除去等而可溶化之TCR，可溶性意指例如，在磷酸緩衝化生理食鹽水(PBS)(KCl 2.7mM、KH₂PO₄ 1.5mM、NaCl 137mM 及Na₂PO₄ 8mM、pH 7.1至7.5)中單分散而以異源二聚體存在，且該TCR之90%以上於25℃培育1小時後可單分散而以異源二聚體殘存的性質。可溶性TCR，為了提高安定性，可在各鏈之恆定區域間導入新的人造雙硫鍵。此種可溶性TCR，可依照例如國際公開第2004/074322號、Boulter et al.,Clin Exp Immunol,2005,142(3)：454-460等記載之方法製成。在使用可溶性TCR之情況，只要該TCR能與抗原或該抗原-HLA複合體結合，其濃度無特別限制，例如在使用於試管內(in vitro)之試驗的情況，以40μg/ml以上為較佳。

在本發明中，「GPC3_298-306胜肽」或「HLA-A24-限制性GPC3_298-306胜肽」，意指由序列編號27所示之胺基酸序列所構成之磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的胜肽片段。在較佳之實施態樣中，本發明之TCR1能特異性地識別GPC3_298-306胜肽與HLA-A24之複合體並與之結合。同樣地，在本發明中，「GPC3_144-152胜肽」或「HLA-A02-限制性GPC3_144-152胜肽」意指由序列表之序列編號28所示之胺基酸序列所構成之GPC3的胜肽片段。在較佳之實施態樣中，本發明之TCR2能特異性地識別GPC3_144-152胜肽與HLA-A02之複合體並與之結合。以下，有時將「GPC3_298-306胜肽」及「GPC3_144-152胜肽」總稱為「GPC3胜肽」。

本發明之TCR能特異性地識別上述複合體並與之結合，可藉由周知之方法確認，就適當之方法而言，可列舉例如使用HLA-A24分子或HLA-A02分子及GPC3胜肽之Dextramer檢定或ELISPOT檢定等。藉由進行ELISPOT檢定，可確認於細胞表面表現該TCR之T細胞藉由TCR識別標的細胞，並將其信號傳達至細胞內。

本說明書中所用之「能結合(capable of binding)」的術語，意指「具有結合能力(having an ability to bind)」，係指與1個或其以上之其他分子形成非共價鍵結複合體的能力。就本發明之複合體之例而言，可列舉GPC3胜肽與HLA分子(例：HLA-A24或HLA-A02)之複合體、或GPC3胜肽與TCR之複合體。就本發明之複合體之其他例而言，可列舉TCR與GPC3胜肽的複合體，其中該GPC3胜肽與其自體HLA形成複合體。用於決定結合能力之各種方法及檢定，為該技術領域所周知。結合通常為具有高親和性之結合，以KD值測定之親和性，較佳為小於1μM，更佳為小於100nM，進一步更佳為小於10nM，進一步更佳為小於1nM，進一步更佳為小於100pM，進一步更佳為小於10pM，進一步更佳為小於1pM。「KD」或「KD值」之術語，與該技術領域所周知之平衡解離常數相關。在本發明之上下文中，此等術語與TCR對目的特定抗原(例：本說明書中所定義的GPC3之胜肽、或胜肽與HLA之各複合體)之平衡解離常數有關。平衡解離常數為複合體(例：TCR-胜肽-HLA複合體)可逆性解離成其成分(例：TCR及胜肽-HLA複合體)之傾向的尺度。決定KD值之方法為該技術領域中所周知，例如，可例示表面等離子共振。

在本發明中，「經單離」意指特定之成分(例：TCR)從其天然環境之成分中被鑑定出、分離、或回收的狀態。

在本發明中，「1或數個胺基酸」意指例如，1,2,3,4或5個胺基酸(例：1至4個胺基酸、1至3個胺基酸或1至2個胺基酸)。例如，在TCR CDR區域之上下文中，1或數個意指較佳為1、2或3個胺基酸。在TCR可變區域或TCR之上下文中，1或數個意指較佳為1至5、1至4或1至3個，特佳為1、2或3個胺基酸。

在本發明中，「相同性%(百分率)」意指例如90%以上之(例：91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高)相同性。胺基酸序列之相同性，可於以下之條件下(expectancy=10；gap allowed；matrix=BLOSUM62；filtering=OFF)，使用同源性計算演算法之NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)計算。要決定相同性百分率，應理解為將涵蓋全長之本發明之序列與其他序列比較。易言之，本發明中之相同性百分率，排除將本發明之序列之短片段(例如1至3胺基酸)與其他序列比較，或將本發明之序列與其他序列之短片段比較。

在本發明之一實施態樣中，就本發明之TCR1之α鏈的互補性決定區域而言，包含以序列編號1至3分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列、或以序列編號4至6分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列，就TCR1之β鏈之互補性決定區域而言，包含以序列編號7至9分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列、或以序列編號10至12分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列。上述胺基酸序列，只要包含前述CDR1至CDR3之胺基酸序列的TCR具有對GPC3_298-306胜肽或該胜肽與HLA-A24之複合體的結合能力，可將1個至數個(例如，2個、3個)胺基酸刪除、置換或附加。在較佳之實施態樣中，本發明之TCR1包含：含有以序列編號1至3分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列的TCRα鏈，及含有以序列編號7至9分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列的TCRβ鏈，該TCR之α鏈及β鏈形成異源二聚體。在其他較佳之實施態樣中，本發明之TCR1包含：含有以序列編號4至6分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列的TCRα鏈，及含有以序列編號10至12分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列的TCRβ鏈，該TCR之α鏈及β鏈形成異源二聚體。

在本發明之其他實施態樣中，本發明之TCR1包含：含有以序列編號6表示之CDR3的TCRα鏈，及含有以序列編號12表示之CDR3的TCRβ鏈，該TCR之α鏈及β鏈形成異源二聚體。較佳之該異源二聚體具有對GPC3_298-306胜肽或該胜肽與HLA-A24之複合體的結合能力。

在本發明之再一其他實施態樣中，就本發明之TCR2之α鏈的互補性決定區域而言，包含以序列編號13至15分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列，就本發明之TCR2之β鏈的互補性決定區域而言，包含以序列編號16至18分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列。上述胺基酸序列，只要包含前述CDR1至CDR3之胺基酸序列的TCR具有對GPC3_144-152胜肽或該胜肽與HLA-A02之複合體的結合能力，可將1個至數個(例如，2個、3個)胺基酸刪除、置換或附加。在較佳之實施態樣中，本發明之TCR2包含：含有以序列編號13至15分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列的TCRα鏈、及含有以序列編號16至18分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列的TCRβ鏈，該TCR之α鏈及β鏈形成異源二聚體。

在本發明之再一其他實施態樣中，本發明之TCR2包含：含有以序列編號15表示之CDR3的TCRα鏈、及含有以序列編號18表示之CDR3的TCRβ鏈，該TCR之α鏈及β鏈形成異源二聚體。較佳為前述異源二聚體具有對GPC3_144-152胜肽或該胜肽與HLA-A02之複合體的結合能力。

在本發明之再一其他實施態樣中，本發明之TCR1之α鏈，較佳以含有α鏈之前述可變區域的TCR能結合於GPC3_298-306胜肽或該胜肽與HLA-A24之複合體作為條件，包含下列胺基酸序列所表示之α鏈的可變區域：序列編號19所示之胺基酸序列；序列編號19所示之胺基酸序列中，1或數個(例如，2個、3個、4個、5個)胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列；或與序列編號19所示之胺基酸序列具有90%以上(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上)之相同性的胺基酸序列。或者，本發明之TCR1之α鏈，較佳以含有α鏈之前述可變區域的TCR能結合於GPC3_298-306胜肽或該胜肽與HLA-A24之複合體作為條件，包含下列胺基酸序列所表示之α鏈的可變區域：序列編號20所示之胺基酸序列；序列編號20所示之胺基酸序列中，1或數個(例如，2個、3個、4個、5個)胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列；或與序列編號20所示之胺基酸序列具有90%以上(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上)之相同性的胺基酸序列。該可變區域較佳包含以序列編號1至3分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列、或以序列編號4至6分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列。再者，胺基酸序列之相同性可藉由上述所記載之方式計算。關於下述之胺基酸序列之相同性，亦能以同樣方式計算。

又，本發明之TCR1之β鏈，較佳以含有β鏈之前述可變區域的TCR能結合於GPC3_298-306胜肽或該胜肽與HLA-A24之複合體作為條件，包含下列胺基酸序列所表示之β鏈的可變區域：序列編號21所示之胺基酸序列；序列編號21所示之胺基酸序列中，1或數個(例如，2個、3個、4個、5個)胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列；或與序列編號21所示之胺基酸序列具有90%以上(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%以上)之相同性的胺基酸序列。或者，本發明之TCR1之β鏈，較佳以含有β鏈之前述可變區域的TCR能結合於GPC3_298-306胜肽或該胜肽與HLA-A24之複合體作為條件，包含下列胺基酸序列之任一者所表示之β鏈的可變區域：序列編號22所示之胺基酸序列；序列編號22所示之胺基酸序列中，1或數個(例如，2個、3個、4個、5個)胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列；或與序列編號22所示之胺基酸序列具有90%以上(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上)之相同性的胺基酸序列。該可變區域較佳包含以序列編號7至9分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列、或以序列編號10至12分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列。

在較佳之實施態樣中，本發明之TCR1包含：含有序列編號19所示之胺基酸序列的TCRα鏈、及含有序列編號21所示之胺基酸序列的TCRβ鏈，該TCR之α鏈及β鏈形成異源二聚體。在其他較佳之實施態樣中，本發明之TCR1包含含有序列編號20所示之胺基酸序列的TCRα鏈、及含有序列編號22所示之胺基酸序列的TCRβ鏈，該TCR之α鏈及β鏈形成異源二聚體。

在本發明之其他實施態樣中，本發明之TCR2之α鏈，較佳以含有α鏈之前述可變區域的TCR能結合於GPC3_144-152胜肽或該胜肽與HLA-A02之複合體作為條件，包含下列胺基酸序列所表示之α鏈的可變區域：序列編號23所示之胺基酸序列；序列編號23所示之胺基酸序列中，1或數個(例如，2個、3個、4個、5個)胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列；或與序列編號23所示之胺基酸序列具有90%以上(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上)之相同性的胺基酸序列。該可變區域較佳包含以序列編號13至15分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列。

又，本發明之TCR2之β鏈，較佳以含有β鏈之前述可變區域的TCR能結合於GPC3_144-152胜肽或該胜肽與HLA-A02之複合體作為條件，包含下列胺基酸序列所表示之β鏈的可變區域：序列編號24所示之胺基酸序列；序列編號24所示之胺基酸序列中，1或數個(例如，2個、3個、4個、5個)胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列；或與序列編號24所示之胺基酸序列具有90%以上(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上)之相同性的胺基酸序列。該可變區域較佳包含以序列編號16至18分別表示之CDR1至CDR3之各胺基酸序列。

在較佳之實施態樣中，本發明之TCR2包含：含有序列編號23所示之胺基酸序列的TCRα鏈、及含有序列編號24所示之胺基酸序列的TCRβ鏈，該TCR之α鏈及β鏈可形成異源二聚體。

再者，本發明之TCR之α鏈，較佳以含有α鏈之前述恆定區域的TCR能將刺激信號傳達至T細胞作為條件，包含下列胺基酸序列所表示之α鏈的恆定區域：序列編號25所示之胺基酸序列中，1或數個(例如，2個、3個、4個、5個)胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列；或與序列編號25所示之胺基酸序列具有90%以上(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上)之相同性的胺基酸序列。在本發明之特定實施態樣中，α鏈之恆定區域包含序列編號25所示之胺基酸序列。又，本發明之TCR的β鏈，較佳以含有β鏈之前述恆定區域的TCR能將刺激信號傳達至T細胞作為條件，包含下列胺基酸序列所表示之β鏈的恆定區域：序列編號26所示之胺基酸序列中，1或數個(例如，2個、3個、4個、5個)胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列；或與序列編號26所示之胺基酸序列具有90%以上(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上)之相同性的胺基酸序列。在本發明之特定實施態樣中，β鏈之恆定區域包含序列編號26所示之胺基酸序列。

又，本發明之TCR之α鏈或β鏈之恆定區域，以在為其來源之CTL純系之TCR的α鏈或β鏈之恆定區域中，施行設定之改變為較佳。就該改變而言，例如，可列舉藉著將CTL純系之TCR之恆定區域的特定胺基酸殘基置換成半胱胺酸殘基(例：將TCRα鏈之恆定區域之48號的蘇胺酸置換成半胱胺酸(亦即將TCRα鏈之恆定區域置換成序列編號53)、將CTL純系之TCRβ鏈之恆定區域之57號之絲胺酸置換成半胱胺酸(亦即將TCRβ鏈之恆定區域置換成序列編號54))，使藉由α鏈與β鏈間之雙硫鍵而形成的二聚體表現效率亢進等，然而不以此等為限定。

就上述之具有可變區域及恆定區域的本發明TCR1之α鏈而言，例如，可列舉序列編號29、30、47或48所示之胺基酸序列所構成之多肽等，然而不以此等為限。又，上述具有可變區域及恆定區域的本發明TCR1之β鏈而言，例如，可列舉序列編號31、32、49或50所示之胺基酸序列所構成之多肽等，然而不以此等為限。再者，在此等多肽之胺基酸序列中，較佳以含有前述α鏈或β鏈的TCR能結合於GPC3_298-306胜肽或該胜肽與HLA-A24之複合體作為條件，下述胺基酸序列之任一者所表示之TCR的α鏈或β鏈亦可適用於本發明：1或數個(例如，2個、3個、4個、5個)胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列；或與該多肽之胺基酸序列具有90%以上(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上)之相同性的胺基酸序列。就本發明之TCR1而言，以由序列編號29所表示之α鏈及序列編號31所表示之β鏈所構成的異源二聚體(本說明書中，將上述異源二聚體稱為TCR1-1)、由序列編號47所表示之α鏈及序列編號49所表示之β鏈所構成的異源二聚體(本說明書中，將上述異源二聚體稱為TCR1-1’)、由序列編號30所表示之α鏈及序列編號32所表示之β鏈所構成的異源二聚體(本說明書中，將上述異源二聚體稱為TCR1-2)、或由序列編號48所表示之α鏈及序列編號50所表示之β鏈所構成的異源二聚體(本說明書中，將上述異源二聚體稱為TCR1-2’)為較佳。

就上述具有可變區域及恆定區域的本發明之TCR2之α鏈而言，例如，可列舉由序列編號33或51所示之胺基酸序列所構成之多肽等，然而不以此為限。又，就上述具有可變區域及恆定區域的本發明之TCR2之β鏈而言，例如，可列舉序列編號34或52所示之胺基酸序列所構成之多肽等，然而不以此為限。再者，在此等多肽之胺基酸序列中，較佳以含有前述α鏈或β鏈之TCR能結合於GPC3_144-152胜肽或該胜肽與HLA-A02之複合體作為條件，下列胺基酸序列之任一者所表示的TCR之α鏈或β鏈亦可適用於本發明：1或數個(例如，2個、3個、4個、5個)胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與該多肽之胺基酸序列具有90%以上(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上)之相同性的胺基酸序列。就本發明之TCR2而言，以由序列編號33所表示之α鏈及序列編號34所表示之β鏈所構成的異源二聚體(本說明書中，將上述異源二聚體稱為TCR2-1)、或由序列編號51所表示之α鏈及序列編號52所表示之β鏈所構成的異源二聚體(本說明書中，將上述異源二聚體稱為TCR2-1’)為較佳。

本發明之TCR，可使用後述之本發明之核酸或載體，以基因工程方式生產。例如，可藉由將編碼本發明之TCR之α鏈的核酸及編碼β鏈的核酸兩者導入細胞中，使TCR之α鏈、β鏈多肽表現等，於該細胞中使本發明之TCR表現，並藉由本身周知之方法單離。

2.本發明之核酸

本發明提供上述編碼本發明之TCR的核酸(以下簡稱為「本發明之核酸」)。本發明之核酸可為經單離者。

就本發明之核酸而言，可為編碼TCR之α鏈的核酸、編碼TCR之β鏈的核酸、及編碼TCR之α鏈及β鏈兩者的核酸之任一種。

本發明又係關於編碼本說明書記載之任一種或複數種CDR、可變區域及/或恆定區域的核酸。

本發明又包含在嚴苛條件下，能與本說明書所定義之任一種核酸之互補體雜交的核酸。在較佳之實施態樣中，能雜交之核酸，編碼具有本說明書記載之功能的CDR、可變區域或恆定區域之胺基酸序列。具體而言，能雜交之核酸，編碼如含前述胺基酸序列之TCR那樣具有下述a)或b)之能力的胺基酸序列，a)與GPC3_298-306胜肽或該胜肽與HLA-A24之複合體結合的能力、或b)與GPC3_144-152胜肽或該胜肽與HLA-A02之複合體結合的能力。

就編碼本發明之TCR1之α鏈的核酸而言，只要為上述所定義之編碼TCR1之α鏈的核酸，任一者皆可，例如，可列舉編碼序列編號29、30、47或48所表示之多肽的核酸等。又，就編碼本發明之TCR1之β鏈的核酸而言，只要為上述所定義之編碼TCR1之β鏈的核酸，任一者皆可，例如，可列舉編碼序列編號31、32、49或50所表示之多肽的核酸等。

就編碼本發明之TCR2之α鏈的核酸而言，只要為上述所定義之編碼TCR2之α鏈的核酸，任一者皆可，例如，可列舉編碼序列編號33或51所表示之多肽的核酸等。又，就編碼本發明之TCR2之β鏈的核酸而言，只要為編碼上述所定義之TCR2之β鏈的核酸，任一者皆可，例如，可列舉編碼序列編號34或52所表示之多肽的核酸等。

本發明之核酸可為DNA，亦可為RNA，或可為DNA/RNA嵌合體，然而較佳為DNA。又，該核酸可為雙股，亦可為單股。在雙股之情況，可為雙股DNA、雙股RNA或DNA：RNA之雜交物。在核酸為RNA之情況，關於RNA之序列，將序列表中之T改讀為U。又，本發明之核酸只要能在試管中或細胞中表現多肽，可包含天然核苷酸、修飾核苷酸、核苷酸類似物、或此等之混合物。

本發明之核酸可藉由本身周知之方法構築。例如，基於序列表中記載的TCR之胺基酸序列或核酸序列，以化學方式合成DNA鏈，或將合成之一部分重疊之寡DNA短鏈，藉由利用PCR法或Gibson Assembly法進行接續，可構築編碼本發明之TCR之全長或一部分的DNA。

3.含本發明之核酸的表現載體

本發明之核酸可組入表現載體。因此，本發明提供含上述任一種本發明之核酸的表現載體(以下簡稱為「本發明之載體」)。

本發明之載體可為不組入標的細胞之基因組的載體。在一實施態樣中，不組入基因組之載體，可於標的細胞之基因組之外側複製。載體可在標的細胞之基因組之外側以複數個複本存。在本發明之再一實施態樣中，載體係組入標的細胞之基因組。在較佳之實施態樣中，載體係組入標的細胞之基因組之預定位置。

就本發明之載體所使用的啟動子而言，例如，可使用EF1α啟動子、CAG啟動子、SRα啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CMV(巨細胞病毒)啟動子、RSV(勞斯肉瘤病毒)啟動子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(單純疱疹病毒胸苷激酶)啟動子、TCR V α基因啟動子、TCR Vβ基因啟動子等。其中，以EF1α啟動子、CAG啟動子、MoMuLV LTR、CMV啟動子、SRα啟動子等為較佳。

本發明之載體，除上述啟動子之外，視需要亦可含有轉錄及轉譯調節序列、核糖體結合部位、增強子、複製起點、多A附加信號、選擇標記基因等。就選擇標記基因而言，例如，可列舉二氫葉酸還原酵素基因、新黴素耐性基因、嘌呤黴素耐性基因等。

在本發明之一實施態樣中，將包含上述本發明之編碼TCR之α鏈的核酸、及編碼β鏈之核酸的表現載體導入標的細胞內，可於標的細胞內或細胞表面構成TCR之α鏈及β鏈之異源二聚體。在此情況中，可將編碼TCR之α鏈之核酸及編碼β鏈之核酸組入個別之表現載體，亦可組入1種表現載體。在組入1種表現載體之情況，此2種核酸以經由能進行多順反子(polycistronic)表現之序列組入為較佳。藉由使用能進行多順反子表現之序列，可將組入1種表現載體之複數個基因更有效地表現。就可進行多順反子表現之序列而言，例如，可列舉口蹄疫病毒之T2A序列(PLoS ONE3,e2532,2008、Stem Cells 25,1707,2007)、內部核糖體進入部位(IRES)(美國專利第4,937,190號)等，然而從均勻表現量之觀點而言，以T2A序列為較佳。

可使用於本發明之表現載體，在被導入細胞之情況，只要在疾患之預防或治療期間充分表現TCR，將無特別限定，可列舉病毒載體或質體載體等。就病毒載體而言，可列舉逆轉錄病毒載體(包含慢病毒載體或假型載體)、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、疱疹病毒載體、仙台病毒、游離型載體等。又，亦可使用跳躍子表現系統(PiggyBac系統)。就質體載體而言，可列舉動物細胞表現質體(例如，pa1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。

4.包含本發明之核酸或載體的細胞

將本發明之核酸或載體導入細胞，且TCR1存在於細胞表面時，該細胞可具有對標的細胞的HLA-A24限制性之GPC3_298-306特異性細胞傷害活性。同樣地，將本發明之核酸或載體導入細胞，且本發明之TCR2存在於細胞表面時，該細胞可具有對標的細胞的HLA-A02限制性之GPC3_144-152特異性細胞傷害活性。因此，本發明提供含有本發明之核酸或載體的細胞(換句話說，具有本發明之核酸或載體的細胞)(以下簡稱為「本發明之細胞」)。其中，本發明之核酸以藉由本發明之載體形式導入期望之細胞為較佳。本發明又包含藉由基因組編集(例如，CRISPR系統、TALEN系統等)將本發明之核酸導入宿主基因組。就本發明之細胞之較佳態樣而言，可列舉導入編碼TCRα鏈之核酸，及編碼TCRβ鏈之核酸兩者的細胞，然而不限定於此態樣。本發明之細胞具有細胞傷害活性之確認，依照周知之方法進行即可，就較佳之方法而言，可列舉例如鉻釋放檢定等對HLA-A24或HLA-A02陽性標的細胞之細胞傷害活性的測定。在較佳之實施態樣中，本發明之細胞為人類細胞。

就導入本發明之核酸或表現載體的細胞而言，例如，可列舉淋巴球或含多能性幹細胞之淋巴球之前驅細胞。在本發明中，「淋巴球」意指脊椎動物之免疫系統中白血球的亞型之一，就淋巴球而言，可列舉T細胞、B細胞、自然殺手細胞(NK細胞)。由於T細胞受體在T細胞之抗原識別上扮演重要角色，故以T細胞作為導入本發明之核酸或載體的細胞為較佳。在本發明中，「T細胞」為在淋巴器官或末梢血液等中可見到的白血球之一種，意指主要於胸腺中分化成熟且以表現T細胞受體(TCR)為特徵的淋巴球之一分類。就本發明可使用之T細胞而言，例如，可列舉為CD8陽性細胞之細胞傷害性T細胞(CTL)、為CD4陽性細胞之助手T細胞、控制性T細胞、效應性T細胞等，較佳為細胞傷害性T細胞。又，CD4/CD8雙陽性細胞亦包含於T細胞中。表現本發明之TCR的T細胞，可藉由將本發明之核酸或載體導入從活體採取之T細胞中，而得到表現本發明之TCR的T細胞。或者，藉由從導入本發明之核酸或載體的淋巴球之前驅細胞(例：多能性幹細胞)誘導，可得到表現本發明之TCR的T細胞(亦即，來自該前驅細胞之T細胞)。

本發明之細胞(例：細胞傷害性T細胞)除該細胞原本具有的TCR基因之外，亦具有來自本發明之核酸或載體的外因性TCR基因。本發明之細胞與從活體中採取的細胞在此點相異。

前述淋巴球可從人類或非人類哺乳動物之例如末梢血、骨髓及臍帶血採取。在將本發明之TCR基因導入細胞並用於癌等疾患之治療的情況，該細胞集團以從治療對象本人、或與治療對象之HLA類型一致的提供者採取為較佳。較佳之對象或提供者為人類。

就含多能性幹細胞的淋巴球之前驅細胞而言，例如，可列舉胚性幹細胞(embryonic stem cell：ES細胞)、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell：iPS 細胞)、胚性腫瘤細胞(EC細胞)、胚性生殖幹細胞(EG細胞)、含造血幹細胞之造血前驅細胞、失去自己複製能力之多能性前驅細胞(multipotent progenitor：MMP)、骨髓淋巴共通前驅細胞(MLP)、骨髓系前驅細胞(MP)、顆粒球單核前驅細胞(GMP)、巨噬細胞-樹狀細胞前驅細胞(MDP)、樹狀細胞前驅細胞(DCP)等。來自人類胚胎，尤其ES細胞之任何細胞，可為破壞胚胎而製作之細胞，亦可為不破壞胚胎而製作之細胞。從倫理之觀點而言，以iPS細胞、EC細胞、EG細胞、造血前驅細胞、MMP、MLP、MP、GMP、MDP、DCP、不破壞胚胎而製作之ES細胞為較佳。

iPS細胞為藉由將特定之初期化因子以DNA或蛋白質之形式導入體細胞而製造的來自體細胞之人工幹細胞，其具有與ES細胞約略同等之特性，例如分化多能性及藉由自行複製之增殖能力(例如，Takahashi K.及Yamanaka S.(2006)Cell,126；663-676：Takahashi K.et al.(2007)Cell,131；861-872：Yu J.et al.(2007)Science，318；1917-1920：Nakagawa M.et al.(2008)Nat.Biotechnol.26；101-106)。在使用iPS細胞之情況，該iPS細胞可藉由本身周知之方法從體細胞製作，亦可使用已經建立的庫存iPS細胞。本發明中所用之為iPS細胞來源的體細胞無限制，而較佳為來自末梢血之細胞或來自臍帶血之細胞。為多能性幹細胞之來源的動物無限制，例如，可列舉小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、犬、猴、猩猩、黑猩猩、人類等哺乳動物，較佳為人類。

在本發明中，「造血前驅細胞」意指CD34陽性細胞，較佳為CD34/CD43雙陽性(DP)細胞。本發明所用之造血前驅細胞的來源無限制，例如，可為依照下述之方法，藉由將多能性幹細胞分化誘導而得到之造血前驅細胞，又，亦可為藉由周知之手法從活體組織單離的造血前驅細胞。

將本發明之核酸或載體導入細胞的方法無特別限定，可使用周知之方法。在導入核酸或質體載體之情況，例如，可藉由磷酸鈣共沉澱法、PEG法、電穿孔法、微注射法、脂質體轉染法等而進行。例如，可使用細胞工學別冊8新細胞工學實驗規程，263-267(1995)(秀潤社發行)、病毒學(Virology)，52卷，456(1973)、日藥理誌(Folia Pharmacol.Jpn.)，第119卷(第6號)，345-351(2002)等記載之方法。在使用病毒載體之情況，將本發明之核酸導入適當之組裝細胞(例如Plat-E細胞)或互補細胞株(例如293細胞)，回收培養上清液中產生之病毒載體，藉由因應各病毒載體之適當方法，可使該載體感染細胞而導入細胞中。例如，使用逆轉錄病毒載體作為載體的具體手段如國際公開第2007/69666號、Cell,126,663-676(2006)及Cell,131,861-872(2007)等所揭示。尤其，在使用逆轉錄病毒載體之情況，藉由使用為重組纖連蛋白(fibronectin)片段之CH-296(Takara Bio公司製)，可將基因高效率導入各種細胞中。

本發明之核酸又能以RNA之形式直接導入細胞，並於細胞內表現TCR而使用。就RNA之導入方法而言，可使用周知之方法，例如，可適合使用脂質體轉染法或電穿孔法等。

在將本發明之核酸導入T細胞的情況，從本發明之TCR之表現上升、錯配TCR出現之抑制、或非自體反應性之抑制的觀點而言，該T細胞可藉由siRNA抑制原本表現的內在性TCRα鏈及TCRβ鏈的表現。在將前述之核酸適當使用於該方法的情況，為避免siRNA對本發明之TCR之效果，以使編碼該TCR之核酸之鹼基序列成為與抑制內在性之TCRα鏈及TCRβ鏈之表現的siRNA所作用之RNA對應的鹼基序列相異的序列(密碼子變換型序列)為較佳。此等方法記載於例如國際公開第2008/153029號。前述之鹼基序列，可藉由將靜默變異導入從天然取得之編碼TCR之核酸，或將人為設計之核酸以化學方式合成而製作。或者，為了避免與內在性TCR鏈之錯配，可將編碼本發明之TCR的核酸之恆定區域之一部分或全部置換成來自人類以外之動物，例如小鼠之恆定區域。

5.本發明之細胞之製造方法

又，本發明提供本發明之細胞之製造方法(以下簡稱為「本發明之製法」)，其包含將本發明之核酸或載體導入細胞之步驟的。導入本發明之核酸或載體之細胞、導入方法等如在4中之記載。

在本發明之製法之一態樣中，提供一種T細胞之製法，其包含(1)將導入本發明之核酸或載體之多能性幹細胞分化為造血前驅細胞的步驟，及(2)將該造血前驅細胞分化為T細胞的步驟。

(1)使多能性幹細胞分化為造血前驅細胞之步驟(步驟(1))

就從多能性幹細胞成為造血前驅細胞之分化方法而言，只要能分化成造血前驅細胞即可，無特別限制，例如，如在國際公開第2013/075222號、國際公開第2016/076415號及Liu S.et al.,Cytotherapy,17(2015)；344-358等中所記載，在誘導成為造血前驅細胞之培養基中培養多能性幹細胞的方法。

在本發明中，誘導成為造血前驅細胞之培養基，無特別限定，不過可將培養動物細胞所用的培養基，作為基礎培養基而進行調製。就基礎培養基而言，可列舉例如Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)培養基、Medium 199培養基、Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)培養基、αMEM培養基、Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)培養基、Ham's F12培養基、RPMI 1640培養基、Fischer's培養基、Neurobasal Medium(Life Technologies)、此等之混合培養基等。培養基可含有血清，亦可使用無血清者。視需要基礎培養基中，例如，可含有維生素C類(例：抗壞血酸)、白蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巰基乙醇、硫醇甘油、脂質、胺基酸、L-麩醯胺酸、非必需胺基酸、維生素、增殖因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類、細胞激素等。

在本發明中，維生素C類意指L-抗壞血酸及其衍生物，L-抗壞血酸衍生物意指活體內藉由酵素反應形成維生素C者。就本發明中所用的抗壞血酸之衍生物而言，可例示磷酸維生素C、抗壞血酸葡糖苷、抗壞血酸乙酯、維生素C酯、四己基癸酸抗壞血酯、硬脂酸抗壞血酯及抗壞血酸-2磷酸-6棕櫚酸。較佳為磷酸維生素C，例如，可列舉磷酸-L-抗壞血酸鈉或磷酸-L-抗壞血酸鎂等磷酸-L-抗壞血酸鹽。

步驟(1)中所用之較佳基礎培養基為含有血清、胰島素、轉鐵蛋白、絲胺酸、硫醇甘油、L-麩醯胺酸、抗壞血酸之IMDM培養基。

步驟(1)中所用之培養液，可進一步添加選自BMP4(骨塑型蛋白4)、VEGF(血管內皮生長因子)、SCF(幹細胞因子)及FLT-3L(Flt3配體)所構成之群組中的至少1種細胞激素。更佳為添加VEGF、SCF及FLT-3L之培養液。

在步驟(1)中使用維生素C類之情況，維生素C類以每4日、每3日、每2日、或每1日另行添加(補充)為較佳，以每1日添加為更佳。該維生素C類在培養液中，以相當於5ng/ml至500ng/ml之量(例：相當於5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml之量)添加為較佳。

在步驟(1)中使用BMP4之情況，培養液中之BMP4的濃度，無特別限制，以10ng/ml至100ng/ml(例：10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml)為較佳，以20ng/ml至40ng/ml為更佳。

在步驟(1)中使用VEGF之情況，培養液中之VEGF的濃度無特別限制，然而以10ng/ml至100ng/ml(例：10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml)為較佳，其中以20ng/ml為更佳。

在步驟(1)中使用SCF之情況，培養液中之SCF的濃度無特別限制，然而以10ng/ml至100ng/ml(例：10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml)為較佳，其中，以30ng/ml為更佳。

在步驟(1)中使用FLT-3L之情況，培養液中之FLT-3L的濃度無特別限制，然而以1ng/ml至100ng/ml(例：1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)為較佳，其中，以10ng/ml為更佳。

在步驟(1)中，多能性幹細胞之培養可為貼附培養或浮游培養，在貼附培養之情況，可使用塗布被覆劑之培養容器進行，又，亦可與其他細胞共培養。就共培養之其他細胞而言，可例示C3H10T1/2(Takayama N.,et al.J Exp Med.2817-2830,2010)、來自異種之基質細胞(Niwa A et al.J Cell Physiol.2009 Nov；221(2)：367-77.)。就被覆劑而言，可例示Matrigel(Niwa A,et al.PLoS One.6(7)：e22261,2011)。浮游培養可例示在Chadwick et al.Blood 2003,102：906-15、Vijayaragavan et al.Cell Stem Cell 2009,4：248-62、及Saeki et al.Stem Cells 2009,27：59-67中記載之方法。

在步驟(1)中，培養溫度之條件無特別限制，例如，約37℃至42℃，而以約37至39℃為較佳。又，關於培養期間，若為本領域技術人士，可在監測造血前驅細胞之數目等下，適當地決定。只要能得到造血前驅細胞，日數無特別限定，例如，為至少6日以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上，較佳為14日。至於培養期間長，在造血前驅細胞之製造中通常不會成為問題，然而以例如35日以下為較佳，以21日以下為更佳。又，可在低氧條件下培養，在本發明中，關於低氧條件，可例示15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%或彼等以下之氧濃度。

(2)使造血前驅細胞分化為T細胞之步驟(步驟(2))

就從造血前驅細胞分化為T細胞之分化方法而言，只要能將造血前驅細胞分化為T細胞，無特別限制，例如，可列舉如在國際公開第2016/076415號等中記載的方法，其包含(2-1)從造血前驅細胞誘導CD4CD8雙陽性T細胞之步驟、及(2-2)從CD4CD8雙陽性T細胞誘導CD8陽性T 細胞之步驟。造血前驅體，以使用造血前驅細胞之標記，從由步驟(1)所得到之細胞集團中預先單離者為較佳。就該標記而言，可列舉選自CD43、CD34、CD31及CD144所構成之群組中的至少1種。

(2-1)從造血前驅細胞誘導CD4CD8雙陽性T細胞之步驟(步驟(2-1))

在本發明中，就分化成CD4CD8雙陽性T細胞之方法而言，例如，可列舉在誘導成為CD4CD8雙陽性T細胞之培養基中培養造血前驅細胞的方法。

在本發明中，就誘導分化成CD4CD8雙陽性T細胞之培養基而言，無特別限制，可調製動物細胞之培養所用的培養基，作為基礎培養基。基礎培養基方面，可列舉與上述步驟(1)中所用者相同者。培養基中，可含有血清，或使用無血清者。視需要，在基礎培養基中可含有例如，維生素C類、白蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巰基乙醇、硫醇甘油、脂質、胺基酸、L-麩醯胺酸、非必需胺基酸、維生素、增殖因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類、細胞激素等。

步驟(2-1)中所用之較佳基礎培養基，為包含血清、轉鐵蛋白、絲胺酸、及L-麩醯胺酸之αMEM培養基。在對基礎培養基添加維生素C類之情況，維生素C類與步驟(1)之情況相同。

步驟(2-1)中所用之培養液可進一步含有為細胞激素之FLT-3L及/或IL-7，更佳為添加FLT-3L及IL-7之培養液。

在步驟(2-1)中使用IL-7之情況、培養液中之IL-7的濃度，以1ng/ml至50ng/ml(例：1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml)為較佳，其中，以5ng/ml為更佳。

在步驟(2-1)中使用FLT-3L之情況，FLT-3L可能以與上述步驟(1)同樣方式使用。

在步驟(2-1)中，可將造血前驅細胞進行貼附培養或浮游培養，在貼附培養之情況，可塗覆培養容器而使用，又，亦可與飼養細胞等共同培養。就共同培養之飼養細胞而言，可例示骨髓間質細胞株OP9細胞(可從理研BioResource Center取得)。該OP9細胞較佳為恆常地表現Dll1之OP-DL1細胞(Holmes R1 and Zuniga-Pflucker JC.Cold Spring Harb Protoc.2009(2))。在本發明中，使用OP9細胞作為飼養細胞的情況，亦可藉由將另行準備之Dll1或Dll1與Fc等之融合蛋白質添加於適宜培養液而進行。在本發明中，Dll1包含：具有在NCBI之讀取編號NM#005618(於人類的情況)或NM#007865(於小鼠的情況)中所記載之核苷酸序列的基因所編碼的蛋白質，以及與此等具有高序列相同性(例如90%以上)且具有同等功能之天然存在的變異體。在製造CD4CD8雙陽性T細胞時使用飼養細胞之情況，以在適宜交換該飼養細胞下進行培養為較佳。飼養細胞之交換，可藉由將培養中之對象細胞移至預先播種之飼養細胞上而進行。該交換可每5日、每4日、每3日、或每2日進行。

在步驟(2-1)中，培養溫度之條件無特別限制，例如，為約37℃至42℃，以約37至39℃為較佳。又，關於培養期間，若為本領域技術人士，可在監測CD4CD8雙陽性T細胞之數目等下，適宜地決定。只要能得到造血前驅細胞，日數無特別限定，例如，為至少10日以上、12日以上、14日以上、16日以上、18日以上、20日以上、22日以上、23日以上，較佳為23日。又，以90日以下為較佳，以42日以下為更佳。

(2-2)從CD4CD8兩陽性(DP)T細胞誘導CD8陽性T細胞之步驟(步驟(2-2))

藉由將從步驟(2-1)所得到之CD4/CD8DP細胞，付諸於分化誘導成CD8單陽性(SP)細胞的步驟，可分化誘導成CD8單陽性(SP)細胞。

就步驟(2-2)中所用之基礎培養基及培養基而言，可列舉與步驟(1)中記載之基礎培養基及培養基相同者。

前述培養基可含有副腎皮質荷爾蒙劑。就副腎皮質荷爾蒙劑而言，例如，可列舉糖質類皮質激素及其衍生物等，就該糖質類皮質激素而言，例如，可列舉醋酸可體松、氫可體松、醋酸氟可體松、潑尼松龍(prednisolone)、曲安西龍(triamcinolone)、甲基潑尼松龍、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、丙酸倍氯米松。其中，以地塞米松為較佳。

就副腎皮質荷爾蒙劑而言，在使用地塞米松之情況，培養液中之地塞米松的濃度，以1nM至100nM(例：1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM)為較佳，其中，以10nM為更佳。

前述培養基可含有抗體(例：抗CD3抗體、抗CD28抗體、抗CD2抗體)、細胞激素(例：IL-7、IL-2、IL-15)等。

在步驟(2-2)中使用抗CD3抗體之情況，就該抗CD3抗體而言，只要為特異性地識別CD3之抗體，無特別限定，例如，可列舉從OKT3純系產生之抗體。抗CD3抗體可為與磁性珠粒等結合者，又，亦可不將前述抗CD3抗體添加於培養基中，而代之以將該T淋巴球在表面結合有抗CD3抗體之培養容器上培養一定期間，賦予刺激。抗CD3抗體在培養基中的濃度，以10ng/ml至1000ng/ml(例：10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、1000ng/ml)為較佳，其中，以500ng/ml為更佳。至於其他抗體之濃度，本領域技術人士亦可根據培養條件等而適宜決定。

在步驟(2-2)中使用IL-2之情況，培養基中之IL-2的濃度，以10U/ml至1000U/ml(例：10U/ml、20U/ml、30U/ml、40U/ml、50U/ml、60U/ml、70U/ml、80U/ml、90U/ml、100U/ml、200U/ml、500U/ml、1000U/ml)為較佳，其中，以100U/ml為更佳。步驟(2-2)中所用之IL-7或IL15於培養基中的濃度，以1ng/ml至100ng/ml(例：1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml)為較佳，其中，以10ng/ml為更佳。

在步驟(2-2)中，培養溫度之條件無特別限制，而以約37℃至42℃為較佳，以約37至39℃為更佳。又，在培養期間，若為本領域技術人士，可在監測CD8陽性T細胞之數目等下適宜地決定。只要能得到CD8陽性T細胞，日數無特別限定，以1日以上、3日以上、7日以上為較佳，以60日以下為較佳，以35日以下為更佳。

6.含有本發明之核酸、載體或細胞的醫藥

本發明提供含有本發明之核酸、載體或細胞作為有效成分的醫藥(以下簡稱為「本發明之醫藥」)。含本發明之核酸的細胞，對於呈現HLA-A24分子及GPC3_298-306胜肽、或HLA-A02分子及GPC3_144-152胜肽之細胞，可顯示細胞傷害活性。因此，含有本發明之核酸、載體或細胞的醫藥，可用於預防或治療表現GPC3之疾病，例如可投與至哺乳動物(例：小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、犬、牛、綿羊、猴、人類)，較佳投與至人類。就表現GPC3之疾病而言，無特別限定，可列舉如表現GPC3之癌或腫瘤等。因此，在本發明之較佳之實施態樣中，提供一種用於預防或治療表現GPC3之癌或腫瘤的抗癌劑。

該表現GPC3之癌或腫瘤，例如，記載在“Daniel Baumhoer et al.,Am J.Clin Pathol,2008,129,899-906”等中。具體而言，可列舉肝癌(例：肝細胞癌)、卵巢癌(例：卵巢透明細胞腺癌)、小兒癌、肺癌(例：扁平上皮癌、肺小細胞癌)、睪丸癌(例：非精原細胞瘤(seminoma)胚細胞腫瘤)、軟腫瘤(例：脂肪肉瘤、惡性纖維性組織球瘤)、子宮癌(例：子宮頸部上皮內腫瘤、子宮頸部扁平上皮癌)、黑色素瘤、副腎腫瘤(例：副腎之腺瘤)、神經性腫瘤(例：神經鞘瘤)、胃癌(例：胃之腺癌)、腎臟癌(例：格雷維茨腫瘤)、乳癌(例：浸潤性小葉性癌、黏液性癌)、甲狀腺癌(例：髓樣癌)、喉頭癌(例：扁平上皮癌)、膀胱癌(例：浸潤性移行上皮癌)等，然而不以此等為限。其中，從GPC3之表現量的觀點，以肝癌、卵巢癌、小兒癌、肺癌為較佳，其中以肝癌為更佳，以肝細胞癌為特佳。

就本發明之醫藥的有效成分而言，在使用核酸或載體之情況，以與周知之藥學上可容許之載劑(包含賦形劑、稀釋劑、增量劑、黏合劑、潤滑劑、流動助劑、崩散劑、界面活性劑等)或慣用之添加劑等混合，調製成醫藥組成物為較佳。賦形劑為本領域技術人士所熟知，例如，可列舉磷酸緩衝生理食鹽水(例如，0.01M磷酸鹽、0.138M NaCl、0.0027M KCl、pH7.4)、含鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等礦酸鹽之水溶液、生理食鹽液、二醇或乙醇等之溶液及醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸酸鹽等有機酸之鹽等。又，亦可使用濕潤劑或乳化劑等輔助劑、及pH緩衝劑。再者，亦可使用懸浮化劑、保存劑、安定化劑及分散劑等製劑輔助劑等。又，上述醫藥組成物亦可為於使用前藉由適當無菌液體再構成用之乾燥形式。該醫藥組成物依據所調製之形式(錠劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、懸浮液等經口投與劑；注射劑、點滴劑、外用劑、栓劑等非經口投與劑)等，可進行全身性或局部性之經口投與或非經口投與。在非經口投與之情況，可進行靜脈投與、皮內投與、皮下投與、直腸投與、經皮投與等。又，在注射劑型中使用之情況，亦能添加可容許之緩衝劑、溶解輔助劑、等張劑等。

就有效成分為核酸之情況的投與量而言，例如，該核酸以每次每1公斤體重0.001mg至10mg之範圍投與。例如，在投與至人類患者之情況，對於體重60kg之患者，以0.001至50mg之範圍投與。在有效成分為病毒載體粒子之情況的投與量，對於體重60kg之對象，每次以例如病毒之力價在約1×10³pfu至1×10¹⁵pfu之範圍投與。上述之投與量為例示，可依據所用之核酸、載體之種類、投與路徑、投與對象或患者之年齡、體重、症狀等而適宜選擇投與量。

就本發明之醫藥的有效成分而言，在使用本發明之細胞的情況，該細胞可在投與至對象前使用適當之培養基及/或刺激分子進行培養及/或刺激。就刺激分子而言，可列舉細胞激素類、適當的蛋白質、其他成分等，然而不以此等為限。就細胞激素類而言，可例示例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IFN-γ等，較佳可使用IL-2。就IL-2在培養基中的濃度而言，無特別限定，例如，較佳為0.01至1×10⁵U/mL，更佳為1至1×10⁴U/mL。又，就適當之蛋白質而言，可例示例如CD3配體、CD28配體、抗IL-4抗體。又，此外，亦可添加凝集素等淋巴球刺激因子。再者，亦可在培養基中添加血清或血漿。此等於培養基中之添加量無特別限定，可例示0體積%至20體積%，又，可依據培養階段而變更所使用的血清或血漿之量。例如，可將血清或血漿濃度以階段方式遞減而使用。就血清或血漿之來源而言，可為自體或非自體之任一種，然而從安全性之觀點，以從自體而來者為較佳。

在本發明中，以本發明之細胞作為有效成分的醫藥，以非經口方式投與至對象而使用為較佳。就非經口之投與方法而言，可列舉靜脈內、動脈內、肌肉內、腹腔內、及皮下投與等方法。投與量可依據對象之狀態、體重、年齡等而適宜選擇，然而通常就細胞數而言，對於體重60kg之對象，每1次通常以成為1×10⁶至1×10¹⁰個，較佳為1×10⁷至1×10⁹個，更佳為5×10⁷至5×10⁸個之方式投與。又，可1次投與，亦可分為複數次投與。本發明之醫藥可成為適合非經口投與的周知形式，例如，形成注射或注入劑。本發明之醫藥可含有適當的藥理學上可容許之賦形劑。就藥理學上可容許之賦形劑而言，可列舉上文所記載者。本發明之醫藥為了安定地維持細胞，可含有生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)、培養基等。就培養基而言，無特別限定，可列舉RPMI、AIM-V、X-VIVO10等培養基，然而不以此等為限。又，該醫藥中亦可為了安定化之目的而添加醫藥上可容許的載劑(例：人類血清白蛋白)、保存劑等。

再者，本發明之細胞由於能殺傷表現GPC3之細胞，可使用作為表現GPC3之細胞的殺傷劑。該殺傷劑能以與前述醫藥同樣之方式製作、使用。

又，本發明之TCR，亦可例如將TCR製成與抗CD3抗體之單股抗體片段(scFv)(或結合於T細胞且可活化T細胞回應之類似抗體片段)組合而成的融合蛋白質而使用。該融合蛋白質由於形成安定、可溶性之高親和性TCR，所以可在2個TCR鏈之多肽的各恆定區域間，導入新的人造雙硫鍵。又，融合蛋白質之scFv，以與TCR之β鏈之恆定區域融合為較佳。關於此種融合蛋白質，例如，記載於美國專利第7,569,664號、Liddy et al.,Nat.Med.18：908-7(2012)、Oates and Jakobsen,OncoImmunology 2：e22891(2013)等中。

該融合蛋白質在導入活體內之情況，經由TCR之特異性識別，與表現GPC3之細胞結合，藉由scFv與存在於細胞傷害性T細胞之細胞表面的CD3結合，可傷害表現GPC3之細胞。因此，含有前述融合蛋白質或編碼該蛋白質之核酸的醫藥，亦與含有本發明之核酸或細胞的醫藥同樣地，可用於預防或治療表現GPC3之疾病。在作為醫藥使用之情況，可與前文之記載同樣之方式調製等。

本案說明書之序列表的序列編號表示以下之序列。

(序列編號：1)TCR1-1α鏈之CDR1之胺基酸序列

(序列編號：2)TCR1-1α鏈之CDR2之胺基酸序列

(序列編號：3)TCR1-1α鏈之CDR3之胺基酸序列

(序列編號：4)TCR1-2α鏈之CDR1之胺基酸序列

(序列編號：5)TCR1-2α鏈之CDR2之胺基酸序列

(序列編號：6)TCR1-2α鏈之CDR3之胺基酸序列

(序列編號：7)TCR1-1β鏈之CDR1之胺基酸序列

(序列編號：8)TCR1-1β鏈之CDR2之胺基酸序列

(序列編號：9)TCR1-1β鏈之CDR3之胺基酸序列

(序列編號：10)TCR1-2β鏈之CDR1之胺基酸序列

(序列編號：11)TCR1-2β鏈之CDR2之胺基酸序列

(序列編號：12)TCR1-2β鏈之CDR3之胺基酸序列

(序列編號：13)TCR2-1α鏈之CDR1之胺基酸序列

(序列編號：14)TCR2-1α鏈之CDR2之胺基酸序列

(序列編號：15)TCR2-1α鏈之CDR3之胺基酸序列

(序列編號：16)TCR2-1β鏈之CDR1之胺基酸序列

(序列編號：17)TCR2-1β鏈之CDR2之胺基酸序列

(序列編號：18)TCR2-1β鏈之CDR3之胺基酸序列

(序列編號：19)TCR1-1α鏈之可變區域之胺基酸序列

(序列編號：20)TCR1-2α鏈之可變區域之胺基酸序列

(序列編號：21)TCR1-1β鏈之可變區域之胺基酸序列

(序列編號：22)TCR1-2β鏈之可變區域之胺基酸序列

(序列編號：23)TCR2-1α鏈之可變區域之胺基酸序列

(序列編號：24)TCR2-1β鏈之可變區域之胺基酸序列

(序列編號：25)TCRα鏈之恆定區域之胺基酸序列

(序列編號：26)TCRβ鏈之恆定區域之胺基酸序列

(序列編號：27)GPC3_298-306胜肽之胺基酸序列

(序列編號：28)GPC3_144-152胜肽之胺基酸序列

(序列編號：29)TCR1-1α鏈全長之胺基酸序列

(序列編號：30)TCR1-2α鏈全長之胺基酸序列

(序列編號：31)TCR1-1β鏈全長之胺基酸序列

(序列編號：32)TCR1-2β鏈全長之胺基酸序列

(序列編號：33)TCR2-1α鏈全長之胺基酸序列

(序列編號：34)TCR2-1β鏈全長之胺基酸序列

(序列編號：35)TCR1-2α鏈PCR擴增用前置引子

(序列編號：36)TCR1-2α鏈PCR擴增用反置引子

(序列編號：37)TCR1-2β鏈PCR擴增用前置引子

(序列編號：38)TCR1-2β鏈PCR擴增用反置引子

(序列編號：39)TCR1-2α鏈定序用前置引子

(序列編號：40)TCR1-2α鏈定序用反置引子

(序列編號：41)TCR1-2α鏈定序用反置引子

(序列編號：42)TCR1-2α鏈定序用反置引子

(序列編號：43)TCR1-2β鏈定序用前置引子

(序列編號：44)TCR1-2β鏈定序用前置引子

(序列編號：45)TCR1-2β鏈定序用反置引子

(序列編號：46)TCR1-2β鏈定序用反置引子

(序列編號：47)TCR1-1’α鏈全長之胺基酸序列

(序列編號：48)TCR1-2’α鏈全長之胺基酸序列

(序列編號：49)TCR1-1’β鏈全長之胺基酸序列

(序列編號：50)TCR1-2’β鏈全長之胺基酸序列

(序列編號：51)TCR2-1’α鏈全長之胺基酸序列

(序列編號：52)TCR2-1’β鏈全長之胺基酸序列

(序列編號：53)TCRα鏈之恆定區域之改變胺基酸序列

(序列編號：54)TCRβ鏈之恆定區域之改變胺基酸序列

以下，列舉實施例，進一步具體地說明本發明，此等僅單純作為例示，本發明不為其所限。

實施例中之簡稱，為依據本技術領域現今通常所用之慣例，例如，以下之意義。

HLA：人類白血球抗原(Human Leukocyte Antigen)

HIV：人類免疫不全病毒(human immunodeficiency virus)

ELISPOT：酶連免疫斑點檢定(Enzyme-Linked ImmunoSpot)

TAP：與抗原相關的轉運蛋白(Transporter associated with Antigen Processing)

[實施例] 實施例1

對於進行性之肝細胞癌患者，將依照良好製造規範(Good Manufacturing Practice)之指引所合成的抗原(HLA-A*24：02-限制性GPC3_298-306胜肽(以下簡稱為「GPC3_298-306胜肽」)(序列編號27：EYILSLEEL；美利堅胜肽公司)或HLA-A*02：01-限制性GPC3_144-152胜肽(以下簡稱為「GPC3_144-152胜肽」)(序列編號28：FVGEFFTDV；美利堅胜肽公司))及弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant(IFA)；Montanide ISA-51VG；SEPPIC公司)混合而乳劑化之疫苗進行皮內投與，從投與後所得到之末梢血單核細胞(PBMC)或肝腫瘤生檢組織檢體建立CTL純系。

以下記載關於CTL純系建立之具體方法。

(1)抗原投與

以進行性之肝細胞癌(HCC)患者為對象，在非無規、非盲檢的階段1治療試驗(試驗名：以進行肝細胞癌患者為對象之來自HLA-A24及A2結合性磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(GPC3)之胜肽疫苗的臨床第I相試驗，UMIN試驗ID：UMIN000001395)中，於伴隨磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(GPC3)胜肽之用量漸增下，將GPC3_144-152胜肽與弗氏不完全佐劑混合並乳劑化而得之疫苗，於第1、15、29日藉由皮內注射(30mg胜肽/個體)投與至HLA-A2陽性患者。從第3次投與疫苗算起2週後採取末梢血，如後述單離PBMC後，供CTL純系(具體而言，CTL1-2)之建立。

又，在其他臨床試驗(試驗名：以進行性肝細胞癌患者為對象評價胜肽疫苗療法之免疫學有效性的臨床試驗，其中胜肽疫苗係來自HLA-A24及A2結合性磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(GPC3)；UMIN試驗ID：UMIN000005093)中，將GPC3_298-306胜肽及弗氏不完全佐劑混合並乳劑化而得之疫苗，每2週藉由皮內注射(3mg胜肽/個體)投與至HLA-A24陽性患者。投與第6次之疫苗後進行肝腫瘤生檢，將所得到之組織供建立後述之CTL純系(具體而言，CTL1-1)。又，從投與第3次之疫苗投算起2週後採取末梢血，以如後述方式將PBMC單離後，供CTL純系(具體而言，CTL1-2)之建立。

(2)PBMC之單離及CTL塊體之建立

使用菲可帕克梯度(Ficoll-Paque gradient)離心前述末梢血(30mL)，而將PBMC單離。

將單離之PBMC(2 x 10⁶個)，在添加有10μg/mL之GPC3胜肽(GPC3_298-306胜肽或GPC3_144-152胜肽)、10%人類AB血清、50IU/ml之重組人類介白素-2、10ng/ml之重組人類介白素-15的AIM-V培養基中，培養14日，建立CTL塊體。

(3)CTL純系之建立

從上述(2)中所得到之PBMC及GPC3胜肽反應性CD8+CTL塊，將CD8陽性且GPC3Dextramer陽性細胞、或CD8陽性且CD107a陽性細胞，使用FACSAria細胞分選機單離。又，從上述(1)之生檢腫瘤組織將CD8陽性且 GPC3Dextramer陽性細胞使用FACSAria細胞分選機單離。再者，單離時所使用之CD8特異性抗體係從ProImmune公司購入，CD107a特異性抗體係從BD Bioscience公司購入，GPC3_298-306/HLA-A*24：02-Dextramer及GPC3_144-152/HLA-A*02：01Dextramer係從Immudex公司購入。

將藉由上述單離所得到之各細胞播種於96孔培養盤(1細胞/孔)中，於添加有10%人類AB血清、IL-2(200U/mL)及植物血凝素-P(PHA)(5μg/mL)之AIM-V培養液中，藉由使用經放射線照射(100Gy)之非來自本身之PBMC(每1孔8 x 10⁴個)作為飼養細胞，並刺激14至21日，建立CTL純系。在本說明書中，將從HLA-A2陽性患者建立之CTL純系稱為CTL2-1，將從HLA-A24陽性患者建立之CTL純系稱為CTL1-1(來自生檢腫瘤組織)、CTL1-2(來自PBMC)。

試驗例1 ELISPOT檢定

為了測定抗原特異性CTL反應，進行ELISPOT檢定。

將CTL2-1(每1孔1 x 10⁴個)、CTL1-1(每1孔1 x 10⁵個)及CTL1-2(每1孔1 x 10⁵個)於37℃、5%CO₂存在下，與強制表現GPC3之癌細胞株(SK-Hep-1/hGPC3)或該Mock對照癌細胞株(SK-Hep-1/vec)一起培養20小時。將其結果示於第1圖(A)及(B)。

結果，判定適用於本試驗之各CTL，具有回應表現GPC3之癌細胞而產生干擾素-γ之能力。

試驗例2 胜肽滴定檢定(Peptide titration assay)

將在實施例1中建立之各CTL純系(CTL2-1、CTL1-1及CTL1-2)及分別與其對應之T2標的細胞，以成為10：1(效應細胞/標的細胞(effector/target(E/T))=10)之方式混合，並進行4小時共培養。就對應於CTL2-1之T2標的細胞而言，使用將GPC3_144-152胜肽對著以鈣黃綠素AM標識之T2細胞(HLA-A*02：01陽性，TAP陰性)脈衝而得者，就對應於CTL1-1及CTL1-2之T2標的細胞而言，使用將GPC3_298-306胜肽對著以鈣黃綠AM標識之HLA-A*24：02強制表現T2細胞(HLA-A*02：01/A*24：02陽性，TAP陰性)脈衝而得者。在為陰性對照之情況，使用將HIV胜肽對著各細胞脈衝而得者。

關於各CTL純系，將細胞傷害率(%)(使用下述計算式算出)對胜肽濃度作圖(第2圖(A)及(B))。

細胞傷害率(%)={1-[(樣本孔之平均螢光值-最大游離對照孔之平均螢光值)/(最小游離對照孔之平均螢光值-最大游離對照孔之平均螢光值)]}×100%

在將50%細胞傷害活性與曲線交叉之胜肽濃度作為該純系之識別效率的情況，CTL2-1之識別效率為約10^-10M，CTL1-1之識別效率為約10^-9M。

此結果，顯示CTL2-1對具有GPC3_144-152-HLA-A*02：01複合體之細胞具有細胞傷害性，CTL1-1及CTL1-2對具有GPC3_298-306-HLA-A* 24：02複合體之細胞具有細胞傷害性。

實施例2 CTL TCR序列之解讀 1.序列解讀

CTL1-1之TCR(亦即TCR1-1)及CTL2-1之TCR(亦即TCR2-1)之各序列係藉由以下之方法分析。

亦即，T細胞之總RNA使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)萃取。使用Omniscript RT Kit(QIAGEN)及寡dT引子(oligo dT primer：Invitrogen)，合成第一股(First-Strand)cDNA，並將cDNA藉由PCR擴增。就PCR之引子而言，使用記載於Uemura Y.et al.,J Immunol,2003,170：947-960或Misko et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1999,96：2279-2284中之下列引子：由再構成之T細胞受體(TCR)α鏈用之TCRAV家族特異性寡核苷酸所構成的前置引子及TCRAC(Cα)恆定區域的反置引子；及由再編成之TCRβ鏈用之TCRBV家族特異性寡核苷酸所構成的前置引子及TCRBC(Cβ)恆定區域的反置引子。將α鏈及β鏈之經擴增PCR產物選殖入pGEM-T質體載體(Promega)中，解讀序列。將所得到之序列使用IMGT(ImMunoGeneTics)數據庫進行分析。

CTL1-2之TCR(亦即TCR1-2)序列分析係藉由以下之方法實施。

亦即，將T細胞之總RNA使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)萃取。使用SuperScriptIII逆轉錄酵素(ThermoFisher Scientific)及寡dT引子(oligo dT primer：Invitrogen)，合成第一股(First-Strand)cDNA，並將cDNA藉由PCR擴增。將其使用新一代測序儀(MiSeq，Illumina)，進行全套解析，進行預備性序列解析。然後，藉由全套解析結果之部分序列數據於V區域(5’非轉譯區域)、C區域(3’非轉譯區域之多A附加信號前)設計引子(TCR1-2α鏈用前置引子：AAGCACTCTTCTAGCCCAGAGAA(序列編號：35)、TCR1-2α鏈用反置引子：TAGCAGGGCCTCGATAATGA(序列編號：36)、TCR1-2β鏈用前置引子：AGAATGCTTACTACAGAGACACCA(序列編號：37)、TCR1-2β鏈用反置引子：GTTTAGCCTATTTCGTACTTGG(序列編號：38))，並藉由PCR擴增。PCR擴增片段以管柱精製後，使用以下之測序引子，藉由BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit(ThermoFisher Scientific)反應。所使用之測序引子如以下所述：TCR1-2α鏈用前置引子：ACGCCTTCAACAACAGCATTA(序列編號：39)；TCR1-2α鏈用反置引子：CAGACTTGTCACTGGATTTAGAG(反置編號：40)、GGAGCACAGGCTGTCTTACAA(序列編號：41)、ATAGCAGGGCCTCGATAATGA(序列編號：42)；TCR1-2β鏈用前置引子：AGAATGCTTACTACAGAGACACCA(序列編號：43)、GCTGTGTTTGAGCCATCAGAA(序列編號：44)；TCR1-2β鏈用反置引子： AGGCAGTATCTGGAGTCATTGAG(序列編號：45)、GTTTAGCCTATTTCGTACTTGG(序列編號：46)。

管柱精製後，藉由ABI毛細管測序儀進行序列決定。

試驗例3 使用導入TCR之PBMC的Dextramer染色及流式細胞術分析 1.表現TCR之逆轉錄病毒載體之構築

以上述之方法所鑑定的TCRβ鏈之基因序列及TCRα鏈之基因序列為基礎，設計組入半胱胺酸置換(具體而言，將TCRα鏈之恆定區域之48號之蘇胺酸置換為半胱胺酸，將CTL純系之TCRβ鏈之恆定區域之57號之絲胺酸置換為半胱胺酸)的胺基酸序列(具體而言，序列編號47：從TCR1-1α鏈設計之TCR1-1’α鏈、序列編號48：從TCR1-1β鏈設計之TCR1-1’β鏈、序列編號49：從TCR1-2α鏈設計之TCR1-2’α鏈、序列編號50：從TCR1-2β鏈設計之TCR1-2’β鏈、序列編號51：從TCR2-1α鏈設計之TCR2-1’α鏈、序列編號52：從TCR2-1β鏈設計之TCR2-1’β鏈)。設計編碼TCR1-1’及TCR2-1’之各α鏈及β鏈之胺基酸的鹼基序列，人工合成藉由雙順反子表現用序列T2A連接所設計之鹼基序列而得的寡DNA(GenScript)，插入逆轉錄病毒載體質體pDON-AI-2(Takara Bio公司)之多選殖位點(multicloning site)(Bgl II-Hpa I位點)。

2.TCR基因導入

將上述1.所得到之病毒載體質體導入G3T-hi細胞(Takara Bio公司)中，得到短暫性之逆轉錄病毒載體。將其導入PG13細胞，得到可產生逆轉錄病毒載體之細胞。

將藉由與實施例1(2)同樣之方法從HLA-A*24：02或HLA-A*02：01陽性之健康提供者單離的PBMC，於5%人類血漿X-VIVO20中，使用抗CD3抗體(純系HIT3a)進行刺激、培育。3日後，使用以RetroNectin(Takara Bio公司)塗覆之24孔培養盤，藉由從上述可產生逆轉錄病毒載體之細胞所得到之逆轉錄病毒載體，轉導GPC3(GPC3_298-306胜肽或GPC3_144-152胜肽)特異性TCR(具體而言，TCR1-1’或TCR2-1')，次日再度進行轉導。

3.Dextramer(Dextramer)染色及流式細胞術分析

將2.所製作之轉形PBMC，藉由HLA-A*02：01 Dextramer-RPE(GPC3_144-152(FVGEFFTDV)、HIV_19-27(TLNAWVKVV)；Imdex公司)或HLA-A*24：02 Dextramer-RPE(GPC3_298-306(EYILSLEEL)、HIV_583-591(RYLKDQQLL)；Imdex公司)，於室溫染色30分鐘，繼而與抗CD8-FITC(Proimune公司)一起於4℃染色20分鐘。流式細胞術如已知報告(Ueda N and Zhang R,et al.,Cellular & Molecular Immunol.13：1-12,2016)記載，係使用FACSAccuri流式細胞儀(BD Bioscience公司)進行。將關於TCR1-1’之檢討結果示於第3A圖，將關於TCR2-1'之檢討結果示於第3B圖。

在此結果中，由於CD8陽性之細胞集團中可見Dextramer陽性之細胞集團，判定導入各個TCR之PBMC中，功能型TCR有效地於細胞表面表現。

實施例3

組入編碼本發明之TCR之基因的表現載體之製作，及表現上述TCR之來自iPS細胞的T細胞之製作

1.組入編碼本發明之TCR之基因的表現載體之製作 1)組入TCR1-1’之慢病毒載體之製作

使用由日本理化學研究所三好浩之博士所提供之CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1載體，藉由組入TCR1-1’之Gateway Entry載體與LR選殖酶(LR Clonase(Life Technologies))進行反應，製作導入TCR1-2’之CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1/TCR1-1’質體。

2)組入TCR1-1’之慢病毒上清液之製作

將CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1/TCR1-1’導入組裝細胞LentiX-293T中，回收含慢病毒之培養上清液。進行超離心，進行病毒之濃縮。

3)以TCR1-1’轉導之iPS細胞之建立

使於iMatrix(Nippi)上培養之iPS細胞(Ff-l01s04株)感染CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1/TCR1-1’病毒液。

4)TCR1-2’/iPS細胞之T細胞分化

在感染4日後，將感染iPS細胞從Dish剝下，不染色而將hKO1表現細胞使用FACS Aria III進行選別(sorting) (本說明書中，將選別後之細胞稱為「導入TCR1-1’基因之Ff-l01s04細胞」)。關於選別為hKO1陽性之細胞，依據國際公開第2017/221975號記載之方法進行朝T細胞方向之分化，使用FACS Aria III檢討分化後之細胞中之各種標記的表現。

將上述檢討之結果示於第4圖。如第4圖下段所示，藉由將導入TCR1-1’基因之Ff-l01s04細胞付諸於上述分化操作，明顯地可誘導TCR1-1’α鏈及TCR1-1’β鏈之複合體在細胞膜表面表現的T細胞。

試驗例4

從本發明之表現TCR之iPS細胞而來之T細胞的細胞傷害性試驗

藉由鉻釋出檢定測定從表現TCR1-1’之iPS細胞而來之T細胞的細胞傷害性。具體而言，在添加或不添加GPC3抗原胜肽的HLA-*24：02陽性或HLA-A*24：02陰性之淋巴母球細胞系(LCL)中，添加Na₂ ⁵¹CrO₄水溶液(3.7MBq)，於37℃進行1小時標識，以其作為標的細胞。在標的細胞中以第5圖所示之比率添加效應細胞，並於37℃反應4小時。根據以下之公式，從反應後之上清液中游離的⁵¹Cr量算出細胞傷害活性(裂解%)。

裂解%=(測定值-最小釋放值之平均值)/(最大釋放值之平均值/最小釋放值之平均值)×100%

再者，在上式中，所謂最小釋放值為在未加效應細胞的孔中的⁵¹Cr游離量，表示⁵¹Cr從標的細胞的自然游離量。又，所謂最大釋放值表示加入1% Triton X-100而破壞標的細胞時的⁵¹Cr游離量。

將本試驗之結果示於第5圖中。從第5圖，顯示從表現TCR1-1’之iPS細胞而來的T細胞，只對添加GPC3胜肽之HLA-A24陽性LCL具有細胞傷害活性。

試驗例5

從本發明之表現TCR之iPS細胞而來之T細胞的細胞傷害性試驗(2)

藉由CyteCell Imaging System測定從表現TCR1-1’之iPS細胞而來的T細胞之細胞傷害性。具體而言，在標的細胞(JHH7株、HepG2株、或SK-Hep-1株(任一種均為人類肝癌細胞株))中添加鈣黃綠素(Calcein)-AM(Dojindo)溶液，並於37℃標識30分鐘。然後，添加Hoechst33342(ThermoFisher)溶液，並於37℃標識20分鐘。在標的細胞中，以第5圖所示之比率添加效應細胞，並於37℃反應4小時。計測綠色螢光陽性及藍色螢光陽性之細胞，做為生存細胞(viable target cell count(VTCC))，將上述T細胞之細胞傷害活性(裂解%)依照以下之式算出。

裂解%=1-[(實測VTCC之平均值-最大釋放VTCC之平均值)/(未添加效應細胞之孔中VTCC之平均值-最大釋放VTCC之平均值)]×100%

再者，在上式中，最大釋放VTCC表示添加1% Triton X-100而將標的細胞破壞時之VTCC。

將本試驗之結果示於第6圖中。從第6圖，顯示從表現TCR1-1’之iPS細胞而來的T細胞，對HLA-A24陽性且GPC3陽性之肝癌細胞(JHH7株及HepG2株)具有細胞傷害性。

本申請案係以於日本申請之特願2017-019883(申請日：2017年2月6日)做為基礎，其中所言及者，其內容全部包含於本說明書中。

[產業上之可利用性]

藉由本發明，可提供對GPC3胜肽(HLA-A24-限制性GPC3_298-306胜肽及HLA-A02-限制性GPC3_144-152胜肽)或該胜肽與HLA-A分子(HLA-A24或HLA-A02)之複合體具有結合能力之T細胞受體及編碼彼等之核酸。編碼前述T細胞受體之核酸，由於可賦予T細胞對呈現HLA-A分子及GPC3胜肽之細胞的細胞傷害活性，在表現GPC3之疾病的預防或治療上有用。

<110> 國立研究開發法人國立癌症研究中心國立大學法人京都大學日商武田藥品工業股份有限公司

<120> 新穎T細胞受體

<130> 092683

<150> JP 2017-019883

<151> 2017-02-06

<160> 54

<170> PatentIn version 3.5

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 用於PCR擴增的前置引子(TCR1-2 β鏈)

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 用於PCR擴增的反置引子(TCR1-2 β鏈)

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<212> DNA

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<223> 用於定序的前置引子(TCR1-2 α鏈)

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 用於定序的反置引子1(TCR1-2 α鏈)

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 用於定序的反置引子2(TCR1-2 α鏈)

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 用於定序的反置引子3(TCR1-2 α鏈)

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於定序的前置引子1(TCR1-2 β鏈)

<400> 43

<210> 44

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 用於定序的前置引子2(TCR1-2 β鏈)

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 用於定序的反置引子1(TCR1-2 β鏈)

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 用於定序的反置引子2(TCR1-2 β鏈)

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Claims

一種T細胞受體(TCR)，其能與具有序列編號27所示之胺基酸序列的胜肽或該胜肽與HLA-A24之複合體結合，該T細胞受體包含作為α鏈之互補性決定區域之序列編號1所示之胺基酸序列、序列編號2所示之胺基酸序列、及序列編號3所示之胺基酸序列，或序列編號4所示之胺基酸序列、序列編號5所示之胺基酸序列、及序列編號6所示之胺基酸序列；且該T細胞受體包含作為β鏈之互補性決定區域之序列編號7所示之胺基酸序列、序列編號8所示之胺基酸序列、及序列編號9所示之胺基酸序列，或序列編號10所示之胺基酸序列、序列編號11所示之胺基酸序列、及序列編號12所示之胺基酸序列。
一種T細胞受體(TCR)，其能與具有序列編號28所示之胺基酸序列的胜肽或該胜肽與HLA-A02之複合體結合，該T細胞受體包含作為α鏈之互補性決定區域之序列編號13所示之胺基酸序列、序列編號14所示之胺基酸序列、及序列編號15所示之胺基酸序列；且該T細胞受體包含作為β鏈之互補性決定區域之序列編號16所示之胺基酸序列、序列編號17所示之胺基酸序列、及序列編號18所示之胺基酸序列。
一種T細胞受體(TCR)，其能與具有序列編號27所示之胺基酸序列的胜肽或該胜肽與HLA-A24之複合體結合，該T細胞受體包含作為α鏈之可變區域之序列編號19所示之胺基酸序列、序列編號19所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號19所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列，或者序列編號20所示之胺基酸序列、序列編號20所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號20所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列；且該T細胞受體包含作為β鏈之可變區域之序列編號21所示之胺基酸序列、序列編號21所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號21所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列，或者序列編號22所示之胺基酸序列、序列編號22所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號22所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列。
一種T細胞受體(TCR)，其能與具有序列編號28所示之胺基酸序列的胜肽或該胜肽與HLA-A02之複合體結合，該T細胞受體包含作為α鏈之可變區域之序列編號23所示之胺基酸序列、序列編號23所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號23所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列；且該T細胞受體包含作為β鏈之可變區域之序列編號24所示之胺基酸序列、序列編號24所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號24所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列。
如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之T細胞受體，該T細胞受體更包含作為α鏈之恆定區域之序列編號25所示之胺基酸序列、序列編號25所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號25所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列；且該T細胞受體更包含作為β鏈之恆定區域之序列編號26所示之胺基酸序列、序列編號26所示之胺基酸序列中，1或數個胺基酸被刪除、置換或附加而成之胺基酸序列、或與序列編號26所示之胺基酸序列具有90%以上之相同性的胺基酸序列。
一種核酸，其編碼如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之T細胞受體。
一種表現載體，其包含如申請專利範圍第6項所述之核酸。
一種細胞，其包含如申請專利範圍第6項所述之核酸或如申請專利範圍第7項所述之表現載體。
如申請專利範圍第8項所述之細胞，其中該細胞為淋巴球或多能性幹細胞。
如申請專利範圍第8項所述之細胞，其中該細胞為細胞傷害性T細胞。
一種製造如申請專利範圍第8項所述之細胞的方法，其包含將如申請專利範圍第6項所述之核酸或如申請專利範圍第7項所述之表現載體導入細胞的步驟。
一種從多能性幹細胞誘導之T細胞，其包含如申請專利範圍第6項所述之核酸或如申請專利範圍第7項所述之表現載體。
一種T細胞之製造方法，其包含下列步驟：(1)使包含如申請專利範圍第6項所述之核酸或如申請專利範圍第7項所述之表現載體的多能性幹細胞分化為造血前驅細胞的步驟；及(2)使該造血前驅細胞分化為T細胞之步驟；以及可任意選擇之(3)使該T細胞增殖之步驟。
如申請專利範圍第13項所述之製造方法，其中該T細胞為細胞傷害性T細胞，尤其是CD8陽性細胞傷害性T細胞。
一種醫藥，其含有如申請專利範圍第8至10項及第12項中任一項所述之細胞。
如申請專利範圍第15項所述之醫藥，其係使用於癌之預防或治療。
一種表現磷脂醯肌醇蛋白聚糖3之細胞的殺傷劑，其含有如申請專利範圍第8至10項及第12項中任一項所述之細胞。
一種預防或治療哺乳動物之癌之方法，其特徵為將如申請專利範圍第8至10項及第12項中任一項所述之細胞的有效量投與至該哺乳動物。
如申請專利範圍第8至10項及第12項中任一項所述之細胞，其係使用於癌之預防或治療。
一種申請專利範圍第8至10項及第12項中任一項所述之細胞之使用，其係用於製造癌之預防劑或治療劑。