TW201834662A

TW201834662A - 對抗非人類動物中由革蘭氏陽性及革蘭氏陰性菌所引起之疾病之溶桿菌素(lysobactin)及胺基糖苷之組合

Info

Publication number: TW201834662A
Application number: TW107104733A
Authority: TW
Inventors: 奇多施佛; 史黛芬佛克; 吉特道博; 沃夫岡威爾; 喬漢納斯寇柏林
Original assignee: 德商拜耳動物保健有限公司
Priority date: 2017-02-17
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2018-10-01
Also published as: AU2018222615A1; US20200230204A1; EP3548059A1; CN110234338A; JP2020508299A; US20220000969A1; RU2760008C2; RU2019129026A3; JP6655771B1; BR112019017010A2; CA3053608A1; MX380684B; UY37607A; EP3363452A1; AU2018222615B2; RU2019129026A; CA3053608C; AR111569A1; NZ755710A; TWI783969B

Abstract

本發明係關於用於治療非人類動物中由革蘭氏陽性及革蘭氏陰性菌所引起之疾病之溶桿菌素與胺基糖苷抗生素之組合。本發明經證實尤其適用於涉及治療在非人類動物中之乳腺炎。尤其牛乳腺炎可由本發明良好地解決。

Description

對抗非人類動物中由革蘭氏陽性及革蘭氏陰性菌所引起之疾病之溶桿菌素(LYSOBACTIN)及胺基糖苷之組合

本發明係關於用於治療非人類動物中由革蘭氏陽性及革蘭氏陰性菌所引起之疾病之溶桿菌素與胺基糖苷抗生素之組合。本發明證明尤其適用於涉及治療在非人類動物中之乳腺炎。尤其牛乳腺炎可由本發明很好解決。

乳腺炎係乳房組織之炎症且持續為最頻繁及昂貴的乳牛疾病。歸因於乳腺炎之財務損失存在於疾病亞臨床階段及臨床階段。由亞臨床乳腺炎所引起之損失文檔完備。體細胞計數(SCC)每倍增超過50,000個細胞/毫升導致在初次泌乳之母牛及老年母牛中每日分別損失0.4 kg及0.6 kg牛乳(Hortet P, H. Seegers. 1998. Calculated milk production losses associated with elevated somatic cell counts in dairy cows: review and critical discussion. Vet Res. 29(6):497-510)。由臨床乳腺炎所引起之損失包括棄去的牛乳、牛乳產量暫時降低及過早剔除。只要可能，治療乳腺炎應靶向致病細菌。 Pyörälä S在Irish Veterinary Journal, Volume 62 Supplement 40-44 2009中具有用於對歸因於不同病原體之臨床乳腺炎進行抗微生物治療的以下建議：一種最近的用於治療乳牛中乳腺炎之醫藥組合物係Ubrolexin®，其為對抗引起乳腺炎之革蘭氏陽性及革蘭氏陰性菌的廣譜抗生素。Ubrolexin®係頭孢胺苄(cefalexin)與康黴素(kanamycin)之組合且指定用於治療歸因於金黃色葡萄球菌、異乳鏈球菌、乳房鏈球菌及大腸桿菌之臨床乳腺炎。頭孢菌素類物質之抗生素頭孢胺苄之作用模式為與D-丙胺酸轉肽酶不可逆結合，其干擾細菌細胞壁合成。胺基糖苷抗生素康黴素藉由附接至與膜締合之核糖體之30S次單位起作用，且抑制或干擾細菌蛋白質合成。因此抗生素之組合，且詳言之胺基糖苷與其他抗生素物質之組合本身係已知的。在先前技術中抗生素重複出現的問題係病原體可產生對在其引起之疾病之治療中採用之藥物的抗藥性。因此，不斷地尋求新的活性藥學成分。當組合使用由並不協同作用，而是僅靶向不同病原體之抗生素物質所組成時產生抗性的問題甚至惡化。在彼等病例中不為第一抗生素主要靶向物之病原體可對此類第一抗生素逐步產生完全抗性。溶桿菌素最初分離自溶桿菌屬sp. SC-14076(Lysobactersp. SC-14076)(ATCC 53042)醱酵液。獨立地，科學家從與噬細胞菌屬(Cytophaga)相關之土細菌(生產者菌株PBJ-5356)中發現katanosin A及katanosin B。Katanosin B證明與溶桿菌素相同。細菌細胞壁生物合成係此等抗生素之主要目標；然而，作用機制不同於萬古黴素(vancomycin)。溶桿菌素係環狀含有數種非蛋白型D-胺基酸及L-胺基酸之縮肽(depsipetides)。在US 4,754,018中將天然產物溶桿菌素及一些衍生物描述為具有抗菌活性。溶桿菌素之分離及抗菌活性亦描述於EP 196 042 A1及JP 01-132600中。溶桿菌素及katanosin A之抗菌活性此外描述於O'Sullivan, J.等人, J. Antibiot. (1988) 41 :1740-1744, Bonner, D. P.等人, J. Antibiot. (1988) 41:1745-1751, Shoji, J.等人, J. Antibiot. (1988) 41:713-718及Tymiak, A. A.等人, J. Org. Chem. (1989) 54:1149-1157中。與頭孢胺苄及康黴素作用模式相比，已提出溶桿菌素與細菌細胞壁先質脂質II直接相互作用(Lee, W.等人, Am. Chem. Soc. (2016) 138(1):100-113及Breukink E.與de Kruijff B., Nat. Rev. Drug Disc. (2006) 5:321-323)。溶桿菌素衍生物係專利申請案WO 2004/099239 A1、WO 2006/042653 A1、WO 2006/042654 A1、WO 2006/042655 A1、WO 2006/048139 A1、WO 2006/048140 A1、WO 2006/048156 A1、WO 2007/085456 A1、WO 2007/118691 A1及WO 2007/118693 A1之主題。所列先前技術中無一者涉及使用溶桿菌素治療牛乳腺炎。特定言之，不存在關於溶桿菌素與其他抗生素物質組合使用以治療乳腺炎之先前技術。特別地，牛乳腺炎為商業養殖損失之主要原因，其治療在此項技術中缺乏合適選項。儘管最近在國際專利申請案PCT/EP2016/069380號中發現單獨使用溶桿菌素出人意料地在治療主要由革蘭氏陽性病原體，尤其葡萄球菌屬細菌、鏈球菌屬細菌、隱秘桿菌屬(Trueperella )細菌及/或棒狀桿菌屬(Corynebacterium )細菌所引起牛乳腺炎中高度有益，此係因為其破壞抗性之特性，但繼續存在溶桿菌素作為對抗革蘭氏陰性病原體之潛在試劑的有效性及與其他抗生素之潛在協同的不確定性。

因此，在此項技術中仍需要不會遭受對活性成分的細菌抗性且可協同處理革蘭氏陽性及革蘭氏陰性病原體之用於(尤其牛)乳腺炎的治療。本發明目標為提供其解決方案。因此，本發明尤其關於用於治療乳腺炎之溶桿菌素與至少一種胺基糖苷抗生素之組合。本發明尤其靶向治療牛乳腺炎，其作為商業上最相關的此類型疾病。已出人意料地發現，溶桿菌素與胺基糖苷抗生素組合協同作用以引起在非人類動物中對革蘭氏陽性及革蘭氏陰性病原體與彼等病原體引起之疾病擴展的抗菌特性。在罹患由此類病原體所引起之乳腺炎的雌性動物中此類協同效應尤其明顯，而牛乳腺炎證明為本文所描述之發明商業上最相關的應用。

在本發明之上下文中，術語「溶桿菌素」係指具有CAS號118374-47-3之物質及其生理學上可接受之鹽。溶桿菌素具有以下結構：待解決之牛乳腺炎尤其為乳牛乳腺炎。溶桿菌素之生理學上可接受之鹽包括無機酸、羧酸及磺酸之酸加成鹽，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸及苯甲酸之鹽。溶桿菌素之生理學上可接受之鹽亦包括習知鹼之鹽，諸如作為實例且較佳地鹼金屬鹽(例如鈉及鉀鹽)、鹼土金屬鹽(例如鈣及鎂鹽)以及來源於氨或具有1至16個C原子之有機胺之銨鹽，作為實例且較佳地乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二異丙胺、單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二環己胺、二甲基胺基乙醇、普魯卡因(procaine)、二苯甲基胺、N-甲基嗎啉、精胺酸、離胺酸、乙二胺及N-甲基哌啶。在本發明之上下文中，術語「胺基糖苷抗生素」或「胺基糖苷」係指由環己烷-糖基及胺基-糖基組成且在功能上具有附接至與膜相關聯之核糖體之30S次單位從而干擾(尤其)細菌細胞之蛋白質生物合成特徵之寡醣物質。依照本發明之胺基糖苷之群的非限制性及非窮盡性的成員為選自由以下組成之清單之彼等：氨丁卡黴素(Amikacin)、安普黴素(Apramycin)、新黴素B(Framycetin)、遺傳黴素(Geneticin)(G418)、建它黴素(Gentamicin)、康黴素、奈替黴素(Netilmicin)、新黴素、巴龍黴素(Paromomycin)、西梭黴素(Sisomycin)、觀黴素(Spectinomycin)、鏈黴素(Streptomycin)及托普黴素(Tobramycin)。如同溶桿菌素，「胺基糖苷抗生素」或「胺基糖苷」亦涵蓋其生理學上可接受之鹽。因此胺基糖苷之生理學上可接受之鹽包括礦物酸、羧酸及磺酸之酸加成鹽以及如在本發明之上下文中溶桿菌素中所列之習知鹼之鹽。溶桿菌素及胺基糖苷可全身性及/或局部作用。出於此目的，其可以適合方式投與，諸如(例如)藉由經口、非經腸、經肺、經鼻、舌下、經舌、經頰、經直腸、經皮(dermal)、經皮(transdermal)，或作為植入物或血管內支架。溶桿菌素及胺基糖苷可以適於此等投與途徑之投與形式來投與。適於經口投與之投與形式為根據先前技術作用且快速及/或以經調節方式傳遞溶桿菌素及胺基糖苷且含有呈結晶及/或非晶化及/或溶解形式之溶桿菌素及胺基糖苷的形式，諸如(例如)錠劑(未包衣或包衣錠劑，例如具有不溶或延遲溶解且控制溶桿菌素釋放之腸溶衣或包衣)、在口腔中快速崩解之錠劑、膜/粉片、膜/凍乾物、膠囊(例如硬明膠膠囊或軟明膠膠囊)、糖包衣錠劑、顆粒劑、丸劑、散劑、乳液、懸浮液、氣溶膠或溶液。非經腸投與可在避免吸收步驟之情況下(例如乳房內、靜脈內、動脈內、心內、脊椎內或腰內)或在包括吸收之情況下(例如肌肉內、皮下、皮內、經皮或腹膜內)進行。適用於非經腸投與之投與形式尤其為供注射及輸注用之製劑，其呈溶液、懸浮液、乳液、凍乾物或無菌散劑形式。適於其他投與途徑為例如醫藥形式的水性懸浮液(乳液、振盪混合物)、親脂性懸浮液、軟膏、乳膏、經皮治療系統(諸如(例如)貼劑)、乳狀物、糊劑、泡沫劑、敷粉、植入物或血管內支架。溶桿菌素及胺基糖苷可轉換為所陳述之投與形式。此可以本身已知之方式藉由與惰性、無毒、醫藥學上適合之賦形劑混合而發生。此等賦形劑尤其包括載劑(例如微晶纖維素、乳糖、甘露醇)、溶劑(例如液態聚乙二醇)、乳化劑及分散劑或濕潤劑(例如十二烷基硫酸鈉、聚氧脫水山梨糖醇油酸鹽)、黏合劑(例如聚乙烯吡咯啶酮)、合成及天然聚合物(例如白蛋白)、穩定劑(例如抗氧化劑，諸如(例如)抗壞血酸)、顏色(例如無機顏料，如氧化鐵)及風味及/或氣味掩蔽劑。將參見以下態樣及實施例進一步描述本發明。除非上下文明確指示，否則其可自由組合。一實施例係關於用於治療乳腺炎之溶桿菌素與至少一種胺基糖苷抗生素之組合，其中溶桿菌素及至少一種胺基糖苷抗生素乳房內投與。胺基糖苷抗生素較佳為新黴素或康黴素。乳腺炎更佳為牛乳腺炎。另一實施例係關於用於治療乳腺炎之溶桿菌素與至少一種胺基糖苷抗生素之組合，其中乳腺炎為臨床表現乳腺炎。胺基糖苷抗生素較佳為新黴素或康黴素。乳腺炎更佳為牛乳腺炎。另一實施例係關於用於治療乳腺炎之溶桿菌素與至少一種胺基糖苷抗生素之組合，其中乳腺炎為亞臨床牛乳腺炎。胺基糖苷抗生素較佳為新黴素或康黴素。乳腺炎更佳為牛乳腺炎。另一實施例係關於用於治療乳腺炎之溶桿菌素與至少一種胺基糖苷抗生素之組合，其中溶桿菌素以每乳房區域25至1000 mg之劑量、較佳以每乳房區域50至500 mg之劑量且更佳以每乳房區域100至300 mg之劑量提供。乳腺炎最佳為牛乳腺炎。在此實施例之較佳實施例中溶桿菌素與新黴素或康黴素組合，偏好新黴素。亦可需要在適當時背離陳述之量，特定言之隨體重、投與途徑、個體對活性成分之反應、製劑性質及投與發生之時間或時間間隔而變。因此，在某些情況下，使用低於前述最小量可為足夠的，而在其他情況下必須超過所述之上限。在較大量之投藥之情況下，將此等較大量分成一日中之多個個別劑量可取。取決於依照本發明實際上所使用之實際胺基糖苷抗生素，以上其參考劑量可變化且因此溶桿菌素與其之比可變化。得到對革蘭氏陰性以及革蘭氏陽性病原體非常積極的結果，且因此若溶桿菌素與胺基糖苷抗生素之比至少為0.1則較佳。至少0.2之比提供甚至更好的結果，而更佳具有至少1:1之比之且甚至更佳至少2:1之比。最佳為至少4:1之比。另一實施例係關於用於治療乳腺炎之溶桿菌素與至少一種胺基糖苷抗生素之組合，其中乳腺炎由革蘭氏陽性及革蘭氏陰性菌所引起。乳腺炎較佳為牛乳腺炎。更佳地，此係關於用於治療牛乳腺炎之溶桿菌素與至少一種胺基糖苷抗生素之組合，其中牛乳腺炎由葡萄球菌屬細菌、鏈球菌屬細菌、隱秘桿菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌及/或艾氏菌屬(Escherichia )細菌所引起。詳言之，牛乳腺炎可由金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌、異乳鏈球菌、無乳鏈球菌及/或大腸桿菌所引起。此外，牛乳腺炎可由化膿隱秘桿菌(Trueperella pyogenes )及/或大腸桿菌所引起。此外，牛乳腺炎可由牛棒狀桿菌(Corynebacterium bovis )及/或大腸桿菌所引起。金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌、異乳鏈球菌、無乳鏈球菌、化膿隱秘桿菌及牛棒狀桿菌係在牛乳腺炎之病例中發現的最常見病原體，而重複感染艾氏菌屬同樣常見且其共同地被認為尤其對使用根據本發明之溶桿菌素與至少一種胺基糖苷抗生素之組合治療敏感。乳腺炎亦可單獨藉由艾氏菌屬細菌之存在變為臨床上相關。本發明之另一態樣係經配製用於乳房內投與至乳房中之醫藥組合物，其中該組合物包含溶桿菌素至少一種胺基糖苷抗生素。組合物較佳經配製以投與至牛乳房。更佳地，組合物進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑且詳言之醫藥學上可接受之載劑。此等賦形劑尤其包括載劑(例如微晶纖維素、乳糖、甘露醇)、溶劑(例如液態聚乙二醇)、乳化劑及分散劑或濕潤劑(例如十二烷基硫酸鈉、聚氧脫水山梨糖醇油酸鹽)、黏合劑(例如聚乙烯吡咯啶酮)、合成及天然聚合物(例如白蛋白)、穩定劑(例如抗氧化劑，諸如(例如)抗壞血酸)、顏色(例如無機顏料，如氧化鐵)及風味及/或氣味掩蔽劑。本發明之另一態樣係溶桿菌素及至少一種胺基糖苷抗生素之用途，其用於製備用於治療乳腺炎之藥劑。製備用於治療牛乳腺炎之藥劑之用途係較佳的。在本發明之用途之一個實施例中，牛乳腺炎為臨床表現牛乳腺炎。在本發明之用途之另一個實施例中，牛乳腺炎為亞臨床牛乳腺炎。在本發明之用途之另一個實施例中，牛乳腺炎係由葡萄球菌屬細菌、鏈球菌屬細菌、隱秘桿菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌及/或艾氏菌屬細菌所引起。詳言之，牛乳腺炎可由金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌、異乳鏈球菌、無乳鏈球菌及/或大腸桿菌所引起。此外，牛乳腺炎可由化膿隱秘桿菌及/或大腸桿菌所引起。此外，牛乳腺炎可由牛棒狀桿菌及/或大腸桿菌所引起。本發明進一步係關於一種治療乳腺炎之方法，該方法包含以下步驟：向具有乳房且有需要之雌性非人類動物投與治療有效量之溶桿菌素及至少一種胺基糖苷抗生素。具有乳房之雌性非人類動物較佳為母牛。最後，儘管本發明之主要態樣係關於出於商業適用性原因治療(尤其牛)乳腺炎，但在本文中出人意料地發現之協同作用不可被認為限於特定治療(尤其牛)乳房。本文所提供之實驗數據顯示以上提及的協同作用適用於罹患由革蘭氏陰性及革蘭氏陽性菌所引起之任何疾病之非人類動物之任何治療。因此本發明之首要實施例大體上係關於用於治療由革蘭氏陰性及革蘭氏陽性菌所引起疾病之非人類哺乳動物之溶桿菌素與至少一種胺基糖苷抗生素組合。實例：實例 1 ： 單獨的溶桿菌素對乳腺炎病原體之體外抗菌活性 溶桿菌素對常見乳腺炎病原體諸如金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌、異乳鏈球菌、無乳鏈球菌、化膿隱秘桿菌、大腸桿菌或肺炎克留氏菌(Klebsiella pneumoniae )之體外抗菌活性藉由如臨床及實驗室標準學會(Clinical and Laboratory Standards Institute；CLSI)所描述之微量肉湯(microbroth)稀釋MIC方法評定，以獲得最低抑制濃度(MIC)，其定義為防止細菌之可見生長之物質最低濃度。下表概述表示為MIC₉₀ 之結果，其中MIC₉₀ 定義為給定物種至少90%之菌株的生長被抑制之濃度。實例 2 ： 單獨的溶桿菌素對於乳腺炎病原體之體外殺滅動力學 為了評定溶桿菌素在牛乳中殺滅細菌之能力，對含有含不同濃度溶桿菌素之商店購買全脂牛乳的燒瓶接種1-2×10⁶ 菌落形成單位/毫升金黃色葡萄球菌或乳房鏈球菌之代表性菌株。將燒瓶在振動水浴中在35 +/- 2℃下培育24-48小時，且在數個時間點藉由稀釋且在瓊脂板上平板接種樣品來測定各燒瓶中活菌計數。在初始接種體中之活菌數目減少至少99.9%定義為殺菌活性。在牛乳中對4、8、16、32及64 μg/mL的溶桿菌素濃度測定溶桿菌素對抗金黃色葡萄球菌ATCC 29740及乳房鏈球菌ATCC 27958之殺滅動力學。結果描繪於圖1中(CFU：菌落形成單位)。可對於金黃色葡萄球菌及乳房鏈球菌分別假定在24 h及48 h時殺滅。實例 3 ： 對單獨的溶桿菌素產生之自發抗性之體外評定 ：藉由在含有4×或8×MIC溶桿菌素之瓊脂板上平板接種至少1×10⁹ 菌落形成單位之對應菌株且將板在35 +/- 2℃下培育來評定自發抗性產生頻率。在48 h之後，用已在溶桿菌素濃度高於MIC之板上生長之菌落的數目除以起初接種之細菌的數目。所得數定義為自發抗性頻率，且其為在感染期間出現抗性分離株之或然性之指示。作為結論，4倍及8倍MIC之溶桿菌素呈現極好抗性分佈：無抗性分離株可偵測。結果概述於下表中：金黃色葡萄球菌ATCC 29740：乳房鏈球菌ATCC 27958：實例4：在連續傳代期間對單獨的溶桿菌素 產生抗性之體外評定藉由連續傳代實驗評定將細菌恆定曝露於溶桿菌素亞MIC濃度期間MIC形態之變化。在第一日金黃色葡萄球菌及乳房鏈球菌之MIC藉由如臨床及實驗室標準學會(CLSI)所述之微量肉湯稀釋MIC方法評定。對於後續33個連續日之每日，收集來自含有允許完全生長之最高濃度之孔中之細菌且用於接種新96孔板且評定在恆定曝露於溶桿菌素期間之MIC。每日所得之MIC隨時間繪製。結果展示於圖2中。已知引起快速變化之立複黴素(Rifampicin)用作陽性對照物。結果表明在恆定曝露期間產生抗性之溶桿菌素極好分佈，因為金黃色葡萄球菌及乳房鏈球菌之MIC在33日期間內保持恆定。實例 5 ： 在具有金黃色葡萄球菌之急性小鼠乳腺炎模型中單獨的溶桿菌素功效 在金黃色葡萄球菌急性小鼠乳腺炎模型中測試溶桿菌素(在pH 4.7之水凝膠中配製)之功效，該模型建立於加拿大謝布克大學(University of Sherbrooke, Canada)(Brouillette等人，Vet. Microbiol. (2004) 4:253-262)，其以引用之方式併入本文中。哺乳期CD-1小鼠兩個腹部乳腺(L4及R4)乳房內感染100 CFU(菌落形成單位)金黃色葡萄球菌。在感染之後四小時使用溶桿菌素乳房內治療小鼠。各治療組含有至少3小鼠(6乳區)，14小時後(接種之後18小時)殺死小鼠，收集乳腺且藉由平板接種乳腺勻漿10倍連續稀釋液評估CFU含量。CFU含量表示為log₁₀ 計數。偵測極限為每克腺體200 CFU。具有小於200 CFU/g之腺體被視為已清除。結果在圖3中展示。乳房內滴入50 µg溶桿菌素降低CFU含量中位數約4 log₁₀ 。400 µg溶桿菌素從所有感染腺體中消除感染。實例 6 ：在具有乳房鏈球菌之急性小鼠乳腺炎模型中單獨的溶桿菌素之功效 在乳房鏈球菌攻擊之小鼠乳腺炎模型中測試溶桿菌素(在pH 4.7水凝膠中配製)之功效。結果展示於圖4中。二十個哺乳期小鼠在後代出生約12-15日之後以實驗方式在第四對乳腺上使用乳房鏈球菌感染。在四小時之後接種，四隻小鼠之組使用100、200、400或800微克/腺體配製為水凝膠之溶桿菌素治療相同腺體。第五組單獨使用水凝膠媒劑治療作為陰性對照物。在感染十八小時之後動物安樂死，移除腺體，均勻化，且由確立的微生物學方法測定細菌菌落形成單位(CFU)。隨後計算每毫升勻漿之菌落形成單位以及每克腺體之CFU。偵測極限為大約每克腺體100 CFU。溶桿菌素對乳房鏈球菌之抗微生物活性由比較不同劑量組及陰性對照組之CFU/腺體平均值判定。在感染之後18小時所有對照組之動物之腺體顯示最優感染率(每克腺體≥10⁷ CFU)。除在最高劑量組中之一個異常，所有溶桿菌素治療之組具有偵測極限(10² CFU/g)以下之細菌計數。可推斷在100微克/腺體與800微克/腺體之間之乳房內劑量之配製為水凝膠之溶桿菌素對乳房鏈球菌具有突出的抗菌功效。實例 7 ： 牛活體內單獨的溶桿菌素數據 - 在哺乳期荷斯坦乳牛中之牛乳藥代動力學研究 研究經設計為適於研究在單腦池內應用至哺乳期乳牛之後溶桿菌素活性物質之牛乳藥代動力學的非關鍵研究。活性物質提供於在10 g油性懸浮液中含有150 mg溶桿菌素之適於腦池內應用之石蠟基服務調配物中。測試物品以150 mg溶桿菌素之劑量率以單腦池內治療形式向四個哺乳期乳牛之各者之單個後乳區投與。研究的乳牛(荷斯坦乳牛)在年齡、泌乳量、泌乳階段、乳產量及品種方面代表目標群體。動物在緊密畜棚中停頓且以由穀粒及牧草青貯及泌乳效能飼料組成之乳牛標準飼料餵食。使用桶型擠奶設備以12小時間隔每日擠奶兩次。在治療之前(0 h)且治療後經168 h之時段(0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、84、96、120、144及168 h)藉由手動擠乾對應的乳區進行治療乳區及對應的對照乳區之頻繁牛乳取樣。在擠奶之前在例行擠奶時間收集牛乳樣品。在牛乳中溶桿菌素活性物質之濃度藉由具有藉由串聯質譜偵測之HPLC分析。定量之限制為0.05 mg/L。牛乳濃度數據之藥代動力學評估基於非間隔方法且包含PK參數以充分描述在牛乳中活性物質之吸收、分佈及消除特徵。來源於經治療乳區之概述結果展示於下表。在對照樣品(未治療乳區)中未偵測到溶桿菌素。溶桿菌素之濃度時間曲線描繪於圖5中。實例 8 ： 牛活體內單獨的溶桿菌素數據 - 乳牛乳房金黃色葡萄球菌感染模型 十五個健康哺乳期乳牛以實驗方式在所有四個乳區上感染乳腺炎病原體金黃色葡萄球菌。一旦乳區顯示乳腺炎之臨床症狀，諸如腫脹、疼痛、牛乳稠度異常時，就使用兩個不同濃度之溶桿菌素石蠟基軟膏或Ubrolexin^® (頭孢力欣(Cephalexin)+康黴素，Boehringer Ingelheim)或生理食鹽水溶液作為陰性對照物來治療。療法隨機分配給全部42個乳區，每乳區50 mg溶桿菌素(在11個乳區中)，或150 mg溶桿菌素(在11個乳區中)，或Ubrolexin^® (在9個乳區中)，或生理食鹽水溶液(在11個乳區中)。只有對於緊接著治療(n=42)攻擊生物體細菌生物學陽性之乳區適合用於評定微生物學及臨床治癒。以24小時之間隔使用此等乳房內調配物治療患病乳區兩次。在治療之前及此後若干次直至第二次投與之後三週臨床檢查乳房且取得牛乳樣品。以肉眼檢驗牛乳稠度偏差且評估樣品攻擊生物體之存在及體細胞計數以確認診斷乳腺炎。當在治療不久之前在牛乳樣品中發現之金黃色葡萄球菌不可自在第二次治療之後第三日與第二十一日之間的時段內取得之任何牛乳樣本分離時，患病乳區視為微生物學治癒。當在上述期間乳腺炎局部症狀完全消失，且作為乳房炎症參數之體細胞計數(SCC)恢復達到所有計數保持在每毫升牛乳500.000個細胞以下時，實現臨床治癒。在第二次治療之後第3日及第21日微生物學治癒率分別為溶桿菌素50 mg 73%及27%，溶桿菌素150 mg 73%及45%，Ubrolexin^® 78%及44%及生理食鹽水溶液0%及0%。在第二次治療之後第3日及第21日局部臨床治癒率分別為溶桿菌素50 mg 45%及73%，溶桿菌素150 mg 37%及82%，Ubrolexin^® 33%及67%及生理食鹽水溶液55%及73%。在第二次治療之後第3日及第21日SCC恢復率分別為溶桿菌素50 mg 36%及45%，溶桿菌素150 mg 36%及91%，Ubrolexin^® 56%及67%及生理食鹽水溶液36%及27%。可推斷在參數微生物學及臨床治癒及SCC恢復率方面溶桿菌素150 mg顯示相比於陽性對照產品Ubrolexin^® 類似或甚至更好功效及對溶桿菌素50 mg及生理食鹽水溶液之優越性。實例 9 ： 牛活體內單獨的溶桿菌素數據 - 乳牛乳房感染乳房鏈球菌模型 使七十二隻健康哺乳期乳牛在每隻母牛之兩個乳區上以實驗方式感染乳腺炎病原體乳房鏈球菌。一旦乳區顯示乳腺炎之臨床症狀(例如發熱、腫脹、發紅、疼痛、異常牛乳稠度)，就使用兩個不同濃度之溶桿菌素石蠟基軟膏或Ubrolexin^® (頭孢力欣+康黴素，Boehringer Ingelheim)進行治療。治療隨機分配至全部41個(臨床)或37個(微生物學)乳區，每乳區50 mg溶桿菌素(在15/13個乳區中)，或150 mg溶桿菌素(在15/14個乳區中)，或Ubrolexin^® (在11/10個乳區中)作為陽性對照物。以24小時之間隔使用此等乳房內調配物治療患病乳區兩次。在治療之前及此後若干次直至第二次投與之後三週臨床檢查乳房且取得牛乳樣品。以肉眼檢驗牛乳之稠度偏差且評估樣品攻擊生物體之存在以確診乳腺炎。當在治療之前不久在牛乳樣品中發現之乳房鏈球菌不可自在第二次治療之後第七日與第二十一日之間的時段內取得之任何牛乳樣本分離時，將患病乳區視為微生物學治癒。當乳腺炎之局部症狀完全消失或至多處於極輕微性質時實現臨床治癒。在第二次治療之後第7日及第21日微生物學治癒率分別為溶桿菌素50 mg 84.6%及92.31%，溶桿菌素150 mg 71.4%及85.71%及Ubrolexin^® 30%及30%。在第二次治療之後第7日局部臨床治癒率分別為溶桿菌素50 mg及溶桿菌素150 mg 86.7%及Ubrolexin^® 36.4%。可推斷與陽性對照產品Ubrolexin^® 相比，溶桿菌素50 mg及150 mg在關鍵參數微生物學治癒及臨床治癒方面顯然更有效。實例 10 ： 溶桿菌素與新黴素之組合對乳腺炎病原體之體外殺滅動力學 為了評定溶桿菌素與新黴素在商店購買的全脂牛乳體外中之協同活性，將含有不同濃度之單獨或呈組合形式之溶桿菌素及新黴素之燒瓶接種1-2×10⁶ 菌落形成單位/毫升金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌或大腸桿菌之代表性菌株。將燒瓶在振動水浴中在35 +/- 2℃下培育24-48小時，且在數個時間點藉由稀釋且在瓊脂板上平板接種樣品來測定各燒瓶中活菌計數。在24 h之後與活性最強之單一化合物相比由組合實現之活菌數目減少至少99%定義為協同活性(NCCLS/CLSI M26-A Vol.19, No.18)。以1:1(各自2 µg/ml)及2:1(2 µg/ml溶桿菌素及1 µg/ml新黴素)之濃度比測定單獨或組合形式之溶桿菌素及新黴素對牛乳中之金黃色葡萄球菌ATCC 29740之殺滅動力學。結果描繪於圖6中。在24 h之後可觀測溶桿菌素:新黴素組合之協同活性。在至少2:1之比率，尤其1:1之比率協同作用極可見。以1:1(各自16 µg/ml)及2:1(16 µg/ml溶桿菌素及8 µg/ml新黴素)之溶桿菌素:新黴素濃度比測定單獨或組合形式之溶桿菌素及新黴素對牛乳中之乳房鏈球菌ATCC 27958之殺滅動力學。結果亦描繪於圖6中。在24 h之後可觀測兩個比率之溶桿菌素:新黴素組合之協同活性。以1:5(分別為1 µg/ml溶桿菌素外加5 µg/ml新黴素及1.5 µg/ml溶桿菌素外加7.5 µg/ml新黴素)之溶桿菌素:新黴素濃度比測定單獨或組合形式之溶桿菌素及新黴素對牛乳中之金黃色葡萄球菌ATCC 29740之殺滅動力學。結果描繪於圖7中。在24 h之後可觀測協同活性。在至少1:5(亦即0.2)之溶桿菌素:新黴素比率協同作用已極可見。如由圖7證明，該協同作用並非取決於所使用之溶桿菌素及新黴素之絕對量。以1:10(分別為1 µg/ml溶桿菌素外加10 µg/ml新黴素及2 µg/ml溶桿菌素外加20 µg/ml新黴素)之溶桿菌素:新黴素濃度比測定單獨或組合形式之溶桿菌素及新黴素對牛乳中之乳房鏈球菌ATCC 27958之殺滅動力學。結果亦描繪於圖7中。在24 h之後可觀測協同活性。在溶桿菌素:新黴素之比1:10(0.1)處不管溶桿菌素及新黴素之絕對量協同作用高度可見。綜合而言，可展示溶桿菌素:新黴素組合之協同活性。對金黃色葡萄球菌ATCC 29740及乳房鏈球菌ATCC 27958在比率分別在2:1至1:5(0.2)及2:1至1:10(0.1)之範圍內該協同活性極可見。以4:1(256 µg/ml溶桿菌素及32 µg/ml新黴素)之溶桿菌素:新黴素濃度比測定單獨或組合形式之溶桿菌素及新黴素對牛乳中之大腸桿菌P4:O32之殺滅動力學。結果描繪於圖8中。儘管在8 h之後新黴素以及溶桿菌素:新黴素組合能夠減少細菌細胞計數至偵測極限以下，組合顯示殺滅較快發動。此外組合大體上避免細菌在24 h之後再生，其不可藉由各個單獨的活性劑來達成。因此，對於革蘭氏陰性大腸桿菌同樣在此觀測到協同活性。實例 11 ： 溶桿菌素與新黴素或康黴素中之任一者之組合對 金黃色葡萄球菌ATCC 29740之體外殺滅動力學為了研究以上提及的協同作用是否確實適用於除與溶桿菌素組合之新黴素的更多種胺基糖苷抗生素，同樣測試康黴素作為組合搭配物之殺滅動力學。如實例10中所描述進行殺滅動力學。以1:4(分別為0.5 µg/ml溶桿菌素外加2 µg/ml新黴素或康黴素；1 µg/ml溶桿菌素外加4 µg/ml新黴素或康黴素及2 µg/ml溶桿菌素外加8 µg/ml新黴素或康黴素)之溶桿菌素:新黴素或溶桿菌素:康黴素濃度比測定溶桿菌素與新黴素或康黴素中之任一者對牛乳中之金黃色葡萄球菌ATCC 29740之殺滅動力學。結果描繪於圖9中。對於所有評估之濃度溶桿菌素:康黴素組合顯示與溶桿菌素:新黴素組合相比類似之活性。由其可推斷溶桿菌素與胺基糖苷抗生素之組合本身傳送出人意料的協同作用。比較實例 12 ： 溶桿菌素與氟苯尼考之組合對 金黃色葡萄球菌ATCC 29740及乳房鏈球菌ATCC 27958之體外殺滅動力學兩種不同抗生素試劑之協同活性並非可靠地可預測，如以下所示。舉例而言，在受圖10中描繪之條件測試之牛乳中溶桿菌素與氟苯尼考之組合既未展現對金黃色葡萄球菌ATCC 29740之協同活性亦未展現對乳房鏈球菌ATCC 27958之協同活性。實例 13 ： 在具有金黃色葡萄球菌之急性小鼠乳腺炎模型中溶桿菌素與三硫酸新黴素之組合之功效 在建立於加拿大謝布克大學之金黃色葡萄球菌急性小鼠乳腺炎模型(Brouillette等人，Vet. Microbiol. (2004) 4:253-262)中測試單獨或組合形式之溶桿菌素及三硫酸新黴素之功效，如實例5中所描述。在石蠟中配製樣品。結果展示於圖11中。乳房內滴入50 µg溶桿菌素、1600 µg三硫酸新黴素及經組合之50 µg溶桿菌素外加1600 µg三硫酸新黴素分別降低CFU含量中位數約2.7、2.5及5.9 log₁₀ 。實例 14 ： 在具有乳房鏈球菌之急性小鼠乳腺炎模型中溶桿菌素與三硫酸新黴素之組合之功效 二十三個哺乳期CD-1小鼠在後代出生之後10-15日在左側及右側第四乳腺上以實驗方式感染乳腺炎病原體乳房鏈球菌(ATCC 27958)。在感染之後四小時使用測試項目乳房內治療動物。研究包含四個各自具有四隻小鼠之治療組及具有七隻小鼠之對照組。治療組之小鼠接受15 微克/腺體溶桿菌素或1600微克/腺體三硫酸新黴素或每腺體15 µg溶桿菌素外加800 µg或1600 µg三硫酸新黴素之兩種組合之石蠟調配物。在感染之後十八小時殺滅小鼠且移除乳腺且在微生物學上評估細菌CFU。結果展示於圖12中。接受石蠟作為安慰劑之對照組在每克組織CFU約7 log₁₀ 之期望範圍內。乳房內滴入15 µg溶桿菌素、1600 µg三硫酸新黴素及經組合之15 µg溶桿菌素外加1600 µg三硫酸新黴素分別降低CFU含量平均值約2.6、1.5及3.8 log₁₀ 。可推斷以15/1600微克/腺體投與之溶桿菌素/三硫酸新黴素組合與其相同劑量單組分相比對乳房鏈球菌ATCC27958功效優良。實例 15 ： 牛活體內溶桿菌素及三硫酸新黴素數據 - 乳牛乳房感染金黃色葡萄球菌模型 十五個健康哺乳期乳牛以實驗方式在所有四個乳區上感染乳腺炎病原體金黃色葡萄球菌。一旦乳區顯示乳腺炎之臨床症狀，諸如腫脹、疼痛、異常牛乳稠度，就使用50 mg劑量之溶桿菌素三甘油酯基懸浮液或400 mg劑量之三硫酸新黴素三甘油酯基懸浮液或兩者之組合，亦即50 mg溶桿菌素及400 mg三硫酸新黴素治療。此外第四組乳區接受三甘油酯作為陰性對照物。治療隨機分配至全部60個乳區。只有對於緊接著治療(n=49)攻擊生物體細菌生物學陽性之乳區適合用於評定微生物學及臨床治癒。以24小時之間隔使用此等乳房內調配物治療患病乳區兩次。在治療之前及此後若干次直至第二次投與之後三週臨床由對治療不知情之研究人員檢查乳房且取得牛乳樣品。以肉眼檢驗牛乳稠度偏差且評估樣品攻擊生物體之存在及體細胞計數以確認診斷乳腺炎。當在治療不久之前在牛乳樣品中發現之金黃色葡萄球菌不可自在第二次治療之後第三日與第二十一日之間的時段內取得之任何牛乳樣本分離時，患病乳區視為微生物學治癒。當在上述期間乳腺炎局部症狀完全消失，且作為乳房炎症參數之體細胞計數(SCC)恢復達到所有計數保持在每毫升牛乳200.000個細胞以下時，實現臨床治癒。在第二次治療之後第3日及第21日微生物學治癒率分別為溶桿菌素50 mg 71%及14%，三硫酸新黴素400 mg 100%及42%，溶桿菌素50 mg外加三硫酸新黴素400 mg之組合69%及54%及陰性對照三甘油酯10%及30%。在第二次治療之後第3日及第21日局部臨床治癒率分別為溶桿菌素50 mg 71%及71%，三硫酸新黴素400 mg 67%及100%，溶桿菌素50 mg外加三硫酸新黴素400 mg之組合77%及85%及陰性對照三甘油酯80%及70%。在第二次治療之後第3日及第21日SCC恢復率分別為溶桿菌素50 mg 35%及36%，三硫酸新黴素400 mg 17%及50%，溶桿菌素50 mg外加三硫酸新黴素400 mg之組合46%及69%及陰性對照三甘油酯30%及30%。

本發明將參見以下實例及圖式進一步闡明，但不受其限制。圖1顯示溶桿菌素對金黃色葡萄球菌及乳房鏈球菌之殺滅動力學(實例2) 圖2顯示在連續傳代期間溶桿菌素對金黃色葡萄球菌及乳房鏈球菌之MIC變化(實例4) 圖3顯示在金黃色葡萄球菌急性小鼠乳腺炎模型中溶桿菌素之功效(實例5) 圖4顯示在乳房鏈球菌攻擊之小鼠乳腺炎模型中溶桿菌素之功效(實例6) 圖5顯示在哺乳期荷斯坦乳牛乳房內(IMAM)應用之後在牛乳中溶桿菌素之濃度-時間特徵曲線(實例7) 圖6顯示在牛乳中以1:1及2:1劑量比單獨或組合形式之溶桿菌素與新黴素(neomycin)對金黃色葡萄球菌及乳房鏈球菌之殺滅動力學(實例10) 圖7顯示在牛乳中以1:5及1:10劑量比單獨或組合形式之溶桿菌素與新黴素對金黃色葡萄球菌及乳房鏈球菌之殺滅動力學(實例10) 圖8顯示在牛乳中單獨或組合形式之溶桿菌素及新黴素對大腸桿菌之殺滅動力學(實例10) 圖9顯示溶桿菌素與新黴素或康黴素中任一者之組合對金黃色葡萄球菌之殺滅動力學(實例11) 圖10顯示溶桿菌素與氟苯尼考(florfenicol)之組合對金黃色葡萄球菌及乳房鏈球菌之殺滅動力學(實例12) 圖11顯示在金黃色葡萄球菌急性小鼠乳腺炎模型中組合或單獨形式之溶桿菌素及新黴素之功效(實例13) 圖12顯示在乳房鏈球菌急性小鼠乳腺炎模型中組合或單獨形式之溶桿菌素及新黴素之功效(實例14)

Claims

一種用於治療非人類哺乳動物由革蘭氏陰性及/或革蘭氏陽性菌所引起之疾病的溶桿菌素(lysobactin)與至少一種胺基糖苷抗生素之組合。
如請求項1之用於治療之組合，其中該非人類哺乳動物為具有乳房之雌性動物。
如請求項2之用於治療之組合，其中該具有乳房之非人類雌性哺乳動物為母牛且該疾病為牛乳腺炎。
如請求項2或3之用於治療之組合，其中該組合係經乳房內投與。
如請求項3或4之用於治療之組合，其中該牛乳腺炎為臨床表現牛乳腺炎。
如請求項3或4之用於治療之組合，其中該牛乳腺炎為亞臨床牛乳腺炎。
如請求項4至6中任一項之用於治療之組合，其中該溶桿菌素係以每乳區25至1000 mg之劑量提供。
如請求項1至7中任一項之用於治療之組合，其中該至少一種胺基糖苷抗生素為康黴素(kanamycin)或新黴素(neomycin)，該至少一種胺基糖苷抗生素較佳為新黴素。
如請求項3至8中任一項之用於治療之組合，其中該牛乳腺炎係由葡萄球菌屬(Staphylococcus )細菌、鏈球菌屬(Streptococcus )細菌、隱秘桿菌屬(Trueperella )細菌、棒狀桿菌屬(Corynebacterium )細菌及/或艾氏菌屬(Escherichia )細菌所引起。
如請求項9之用於治療之組合，其中該牛乳腺炎係由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase-negative staphylococci)、乳房鏈球菌(Streptococcus uberis )、異乳鏈球菌(Streptococcus dysgalacticae )、無乳鏈球菌(Streptococcus agalacticae )及/或大腸桿菌(E. coli )所引起。
如請求項9之用於治療之組合，其中該牛乳腺炎係由化膿隱秘桿菌(Trueperella pyogenes )及/或大腸桿菌所引起。
如請求項9之用於治療之組合，其中該牛乳腺炎係由牛棒狀桿菌(Corynebacterium bovis )及/或大腸桿菌所引起。
一種經配製以用於乳房內投與至牛乳房之醫藥組合物，其特徵在於該組合物包含溶桿菌素及至少一種胺基糖苷抗生素，同時該至少一種胺基糖苷抗生素較佳為康黴素或新黴素。
一種溶桿菌素及至少一種胺基糖苷抗生素之用途，其用於製備用於治療非人類動物之乳腺炎之藥劑。
一種治療乳腺炎之方法，該方法包含以下步驟：向有需要之雌性非人類動物投與治療有效量之溶桿菌素及至少一種胺基糖苷抗生素。