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TW201829449A - Hla-限制性vcx/y肽及t細胞受體以及其用途 - Google Patents

Hla-限制性vcx/y肽及t細胞受體以及其用途 Download PDF

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TW201829449A
TW201829449A TW106146607A TW106146607A TW201829449A TW 201829449 A TW201829449 A TW 201829449A TW 106146607 A TW106146607 A TW 106146607A TW 106146607 A TW106146607 A TW 106146607A TW 201829449 A TW201829449 A TW 201829449A
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peptide
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嘉誠 余
潘科
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美國德州系統大學評議委員會
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Abstract

本發明提供腫瘤抗原VCX/Y特異性肽及經工程改造之VCX/Y特異性T細胞受體。本發明亦提供產生VCX/Y特異性免疫細胞之方法及其用於治療癌症之用途。另外，VCX/Y特異性肽可用作疫苗。

Description

HLA-限制性VCX/Y肽及T細胞受體以及其用途
本發明大體上係關於免疫學及醫學領域。更具體而言，本發明係關於腫瘤抗原肽及其用於治療癌症之用途。
基於T細胞之療法已展示作為治療許多癌症之方法之光明前景；不幸地，此方法亦已受常見癌症之極小量免疫原性抗原標靶及非癌性組織之潛在毒性阻礙。此等基於T細胞之療法包括授受細胞轉移(adoptive cell transfer，ACT)及疫苗接種方法。ACT一般涉及將大量自體活化腫瘤特異性T細胞灌入患者中，例如以治療癌症。ACT已引起黑素瘤患者之治療性臨床反應(Yee 2002；Dudley 2002；Yee 2014)。一般而言，為產生有效的抗腫瘤T細胞反應，通常需要以下三個步驟：啟始及活化抗原特異性T細胞，將經活化之T細胞遷移至腫瘤位點，且藉由抗原特異性T細胞識別及殺滅腫瘤。標靶抗原之選擇對於有效抗原特異性T細胞之誘導至關重要。 雖然已鑑別出若干腫瘤相關抗原用於黑素瘤及少數其他實體腫瘤惡性疾病，但極少免疫性標靶係針對胰臟癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、乳房癌及頭頸癌。鑑別並驗證此等常見及難以治療之惡性疾病之新穎表位及靶抗原是有必要的。
本發明在一些實施例中提供可用於授受性T細胞療法中之VCX/Y (例如VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B及VCY)肽。在一些實施例中，肽可用於活體外擴增VCX/Y特異性T細胞，該等細胞可投與諸如人類患者之哺乳動物個體以治療疾病(例如癌症)。在其他實施例中，該等T細胞經基因工程改造以表現具有針對VCX/Y之抗原特異性之T細胞受體(TCR)。在其他實施例中，該等肽可投與哺乳動物個體以誘導個體對抗該肽之免疫反應或使個體實施預防接種對抗該肽，且此類免疫反應可用於治療或降低獲得諸如癌症之疾病或諸如癌症之疾病復發的機率。 在一個實施例中，本發明提供長度為35個胺基酸或更少的經分離VCX/Y肽，其包含與SEQ ID NO: 1 (GAATKMAAV)、SEQ ID NO: 8 (KVAKKGKAV)、SEQ ID NO: 9 (SEMEELPSV)、SEQ ID NO: 12 (KVAEKGEAV)、SEQ ID NO: 13 (KMAAVEAPEA)或SEQ ID NO: 14 (MAAVEAPEA)具有至少90%序列一致性之胺基酸序列，其中肽選擇性結合HLA-A2。在一些態樣中，肽包含與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14具有至少91、92、93、94、95、96、97、98、99或100序列一致性百分比之胺基酸序列。在特定態樣中，人類I類HLA-A2蛋白質是HLA-A*0201。 在某些態樣中，肽的長度為30個胺基酸或更少，諸如長度為29個、28個、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個或10個胺基酸。 在另一實施例中，提供包含實施例之經分離VCX/Y肽及醫藥載劑之醫藥組合物。在一些態樣中，醫藥組合物經調配用於非經腸投藥、靜脈內注射、肌肉內注射、吸入或皮下注射。在某些態樣中，肽包含於脂質體、奈米粒子(例如含脂質奈米粒子)中或基於脂質之載劑中。在一些態樣中，醫藥製劑經調配用於注射或作為鼻用噴霧吸入。 另一實施例提供編碼實施例之VCX/Y肽之經分離核酸。本文亦提供包含由編碼VCX/Y肽之核酸組成之連續序列的載體。 在又一實施例中，提供促進個體中免疫反應之方法，其包含向個體投與有效量之實施例之VCX/Y肽，其中肽誘導個體中抗原特異性T細胞。在一些態樣中，個體經診斷患有癌症。在某些態樣中，癌症係胰臟癌、卵巢癌、胃癌或乳癌。在特定態樣中，個體為人類。 在額外態樣中，方法進一步包含投與至少第二抗癌療法。在一些態樣中，第二抗癌療法選自由化學療法、放射線療法、免疫療法或手術組成之群。在特定態樣中，免疫療法係免疫檢查點抑制劑。在一個具體態樣中，免疫檢查點抑制劑係抗PD1單株抗體。 另一實施例提供製備VCX/Y特異性T細胞之方法，其包含獲得T細胞之起始群體，及使T細胞之起始群體與實施例之VCX/Y肽接觸，進而產生VCX/Y特異性T細胞。在一些態樣中，接觸進一步定義為共同培養T細胞之起始群體與抗原呈現細胞(APC)，其中APC將實施例之VCX/Y肽呈現在其表面上。在特定態樣中，APC係樹突狀細胞。在一些態樣中，T細胞之起始群體係CD8+ T細胞。在某些態樣中，T細胞係細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。在一些態樣中，獲得包含自外周血液單核細胞(PBMC)分離T細胞之起始群體。本文亦提供包含藉由本文中之方法產生之VCX/Y特異性T細胞的醫藥組合物。 甚至另一實施例提供具有針對VCX/Y之抗原受體，諸如T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)。另一實施例提供經工程改造以表現VCX/Y特異性TCR或CAR之T細胞。在某些態樣中，TCR結合HLA-A2，諸如HLA-A*0201。在一些態樣中，TCR包含具有與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:19之胺基酸序列至少95% (例如96%、97%、98%、99%或100%)一致性之α鏈CDR3及/或具有與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:20之胺基酸序列至少95%(例如96%、97%、98%、99%或100%)一致性之β鏈CDR3。在一些態樣中，TCR包含具有與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之α鏈及/或具有與SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18之胺基酸序列至少90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之β鏈。在特定態樣中，TCR包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:16之α鏈及/或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18之β鏈。 在一些態樣中，VCX/Y特異性抗原受體包含胞內信號傳導結構域、跨膜結構域及/或細胞外結構域。在某些態樣中，編碼TCR或CAR之DNA整合於細胞之基因組中。在一些態樣中，TCR或CAR之細胞外結構域包含VCX/Y結合區。舉例而言，VCX/Y結合區可為F(ab')2、Fab'、Fab、Fv或scFv。在某些態樣中，胞內信號傳導結構域係T淋巴細胞活化結構域。舉例而言，TCR之胞內信號傳導結構域可包含CD3ξ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD8、CD27、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、GITR/CD357、FcεRIγ、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP分子、CD70、細胞介素受體、CD40或其組合。在某些態樣中，TCR之跨膜結構域包含CD28跨膜結構域、ICOS跨膜結構域、NKG2D跨膜結構域、DAP分子跨膜結構域、IgG4Fc鉸鏈、Fc區、CD4跨膜結構域、CD3ξ跨膜結構域、半胱胺酸突變型人類CD3ξ結構域、CD16跨膜結構域、CD8跨膜結構域、或紅血球生成素受體跨膜結構域。 在一些實施例中，本發明提供可溶性TCR，諸如本文所提供之VCX/Y TCR。在一些態樣中，TCR係可偵測標記或治療劑之共軛物。在一些態樣中，可溶性TCR用於將治療劑，例如細胞毒性化合物或免疫刺激化合物遞送至呈現特定抗原之細胞。在一些態樣中，TCR連接至將細胞傳遞接近腫瘤之另一分子。在某些態樣中，TCR傳遞毒素、細胞介素、共刺激配位體或抑制劑配位體，以便將分子、細胞或化合物引導至表現肽-MHC之靶細胞。在特定態樣中，TCR共軛至抗CD3。 另一實施例提供多價TCR複合物，其包含複數種上文實施例之VCX/Y抗原受體，諸如VCX/Y TCR。在一些態樣中，多價TCR包含彼此關聯之2種、3種、4種或更多種TCR。在某些態樣中，多價TCR存在於脂質雙層中或附著至粒子。 在又一實施例中，提供編碼實施例之TCR之多肽。進一步提供編碼該多肽之聚核苷酸及包含聚核苷酸之表現載體(例如病毒載體，諸如逆轉錄病毒載體)。在一些態樣中，載體進一步包含連接子結構域。在某些態樣中，連接子結構域包含一或多個裂解位點。在一些態樣中，一或多個裂解位點係可由間隔子(例如SGSG或GSG)隔離之弗林裂解位點及/或P2A裂解位點。 在另一實施例中，提供經工程改造以表現實施例之TCR之宿主細胞。在一些態樣中，細胞為免疫細胞。在某些態樣中，細胞係NK細胞、恆定NK細胞、NKT細胞、間葉細胞幹細胞(MSC)或誘導多能幹(iPS)細胞。在一些態樣中，細胞自臍帶分離。在某些態樣中，免疫細胞係T細胞或外周血液淋巴細胞。在特定態樣中，T細胞係CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或γδ T細胞。在一些態樣中，T細胞係調節T細胞(Treg)。在一些態樣中，細胞係同種異體或自體細胞。 在另一實施例中，提供用於工程改造實施例之免疫細胞之方法，其包含使該免疫細胞與實施例之TCR或編碼該TCR之表現載體接觸。在一些態樣中，免疫細胞係T細胞或外周血液淋巴細胞。在某些態樣中，接觸進一步定義為轉染或轉導。在一些態樣中，轉染包含將編碼實施例之TCR之RNA電穿孔至免疫細胞中。在一些態樣中，方法進一步包含在轉導免疫細胞之前自實施例之表現載體產生病毒上清液。在一些態樣中，免疫細胞係經刺激淋巴細胞。在某些態樣中，經刺激淋巴細胞係人類淋巴細胞。在一些態樣中，刺激包含OKT3及/或IL-2。在某些態樣中，方法進一步包含分選免疫細胞以分離經TCR工程改造之T細胞。在一些態樣中，方法進一步包含藉由連續稀釋進行T細胞選殖。在某些態樣中，方法進一步包含藉由快速擴增方案擴增T細胞純系。 另一實施例提供治療個體中之癌症之方法，其包含向個體投與有效量之實施例的VCX/Y特異性T細胞或經TCR工程改造之宿主細胞。本文亦提供組合物，其包含用於治療個體中之癌症之有效量的實施例之VCX/Y特異性T細胞或經TCR工程改造之宿主細胞。在一些態樣中，癌症係胸腺瘤、膀胱癌、子宮癌、黑素瘤、肉瘤、子宮頸癌或頭頸癌。在特定態樣中，個體為人類。在一些態樣中，細胞為自體或同種異體細胞。在一些態樣中，確定個體具有表現VCX/Y之癌細胞。在特定態樣中，鑑別個體具有HLA-A*0201對偶基因。 在一些態樣中，宿主細胞係T細胞、外周血液淋巴細胞、NK細胞、恆定NK細胞、NKT細胞、間葉細胞幹細胞(MSC)或誘導多能幹(iPS)細胞。在某些態樣中，宿主細胞自臍帶分離。在一些態樣中，宿主細胞係自體或同種異體細胞。在某些態樣中，T細胞係CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或γδ T細胞。 在某些態樣中，方法進一步包含在抗原特異性T細胞之投藥之前使個體淋巴細胞耗盡。在一些態樣中，淋巴細胞耗盡包含投與環磷醯胺及/或氟達拉賓(fludarabine)。 在一些態樣中，方法進一步包含投與至少第二治療劑。在某些態樣中，至少第二治療劑包含化學療法、免疫療法、手術、放射線療法或生物療法。在特定態樣中，免疫療法係免疫檢查點抑制劑。在一個具體態樣中，免疫檢查點抑制劑係抗PD1單株抗體。 在某些態樣中，VCX/Y特異性T細胞及/或至少第二治療劑經靜脈內、腹膜內、氣管內、瘤內、肌肉內、 內窺鏡、病灶內、經皮、皮下、局部投與或藉由直接注射或灌注投與。 在一些態樣中，確定個體具有表現VCX/Y家族之蛋白質之癌細胞。在特定態樣中，蛋白質係VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B或VCY。 本發明之其他目的、特徵及優勢將自以下實施方式而變得顯而易知。應理解，然而，由於在本發明之精神及範疇內的各種改變及修改將自此實施方式對一般熟習此項技術者變得顯而易見，所以指示本發明之較佳實施例的實施方式及特定實例僅以說明方式給與。
本申請案主張2016年12月29申請之美國臨時申請案第62/440,233號及2017年12月6日申請之第62/595,422號之優先權，各申請案之全部內容以引用之方式併入本文中。序列表之合併 包含於檔案中之序列表名為「UTFCP1310WO_ST25.txt」，其為19 KB (如在Microsoft Windows®中量測)且創建於2017年12月27日，藉由電子呈現在此提交且以引用之方式併入本文中。 對於患有許多不同癌症類型之患者而言，基於T細胞之免疫療法代表具有經證實效果之有前景的方法。然而，用於大多數癌症類型之抗原特異性T細胞療法由於缺乏目前已知之腫瘤相關抗原而為不可實行的，其已停止其臨床進展。本發明中之研究鑑別新穎VCX/Y家族衍生之HLA-A2限制性肽表位，其發現於所有VCX/Y家庭成員，包括VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B及VCY。使用肽表位，抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)由識別HLA匹配之同種異體腫瘤細胞株上之內源性呈現抗原之患者外周血液單核細胞(PBMC)產生，從而導致腫瘤細胞殺滅。因此，此等抗原特異性CTL可用於靶向固體癌症(例如胰臟癌、卵巢癌、胃癌及乳癌)。 因此，本發明提供腫瘤抗原特異性肽，以便腫瘤抗原VCX/Y用作用於治療癌症之免疫療法。本文中揭示例示性VCX/Y肽VCX54 (例如包含SEQ ID NO:1)，其序列與包括VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B及VCY之所有VCX/Y家庭成員共用。其他VCX/Y肽包括VCX-37 (SEQ ID NO:8)、VCX-178 (SEQ ID NO:9)、VCY-37 (SEQ ID NO:12)、VCX-58 (SEQ ID NO:13)及VCX-59 (SEQ ID NO:14)。舉例而言，腫瘤抗原特異性肽可與T細胞群體接觸或用於刺激T細胞群體以誘導識別或結合腫瘤抗原特異性肽之T細胞之增殖。在其他實施例中，可向諸如人類患者之個體投與本發明之VCX/Y特異性肽以促進個體對癌症之免疫反應。 VCX/Y特異性肽可包括於活性免疫療法(例如癌症疫苗)或被動免疫療法(例如授受性免疫療法)中。活性免疫療法包括使用經純化之腫瘤抗原或免疫顯性VCX/Y特異性肽(天然或經修飾)使個體免疫；可替代地，可向個體投與用VCX/Y特異性肽(或用編碼腫瘤抗原之基因轉染)脈衝之抗原呈現細胞。VCX/Y特異性肽可經修飾或含有一或多種突變，諸如取代突變。被動免疫療法包括授受性免疫療法。授受性免疫療法一般涉及向個體投與細胞，其中細胞(例如細胞毒性T細胞)已針對VCX/Y特異性肽活體外致敏(參見例如US 7910109)。 詳言之，患者之自身VCX/Y特異性T細胞可在短時段(諸如6至8週)內離體產生以用於有效的基於免疫之療法。T細胞可諸如用四聚體引導分選及快速擴增方案(REP)自自體或同種異體T細胞(例如CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、γδ T細胞及Treg)分離及擴增，該等自體或同種異體T細胞自外周血液分離。接著，肽或對應的經編碼聚核苷酸可裝載至HLA-A2陽性樹突狀細胞、LCL、PBMC或人工抗原呈現細胞(aAPC)，且隨後藉由若干輪刺激與T細胞共同培養以產生抗原特異性CTL細胞株或純系。此外，利用免疫調節參數之操作，可促進此等擴增抗原特異性T細胞之效應功能及活體內長期持續。此等自體CTL細胞可用於針對VCX/Y及HLA-A2陽性癌症患者之授受性免疫療法。另外，可由本發明產生之其他VCX/Y特異性細胞包括自體或同種異體NK細胞、恆定NK細胞、NKT細胞、間葉細胞幹細胞(MSC)及誘導多能幹(iPS)細胞。此等細胞可自血液或臍帶分離。 在另一方法中，可藉由使用本文所提供之VCX54 TCR (例如SEQ ID NO:2-7)或本文所提供之VCY37 TCR (例如SEQ ID NO:15-20)產生抗原特異性細胞。在此方法中，TCR序列插入至引入宿主細胞之載體(例如逆轉錄病毒或豆狀病毒載體)中以產生可用於針對癌症患者之授受細胞療法之抗原特異性細胞，該等宿主細胞諸如T細胞(例如CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、γδ T細胞及Treg)、NK細胞、恆定NK細胞、NKT細胞、間葉細胞幹細胞(MSC)、誘導多能幹(iPS)細胞及PBMC。 另外，本發明提供可用於直接治療HLA-A2陽性癌症患者之可溶性TCR。可溶性雙特異性T細胞接合分子藉由將VCX54 TCR或VCY37 TCR連結至CD3特異性Fab片段產生。T細胞接合TCR可藉由呈現各別肽/MHC複合體來結合腫瘤細胞表面且Fab片段隨後交聯經歷抗原之CD8+ T細胞之表面上之TCR，從而導致靶細胞之細胞活化及排除。因此，此可溶性雙特異性TCR構築體可用於直接治療癌症患者。 最後，可溶性TCR可用作用於腫瘤細胞中之肽/MHC之診斷評估的探針或將治療性分子引導至腫瘤位點。此可溶性TCR分子亦可用諸如螢光探針或放射性探針之示蹤劑標記，且隨後用於診斷評估腫瘤細胞中之肽/MHC之呈現。此外，此可溶性TCR分子可與諸如毒素之治療性分子連結，且隨後將此等治療性分子引導至腫瘤位點以用於治療癌症患者。I. 定義 如本文所用，關於指定組分「基本上游離」在本文中用於意謂指定組分中無一者有目的地調配入組合物中及/或僅作為污染物或以痕量存在。由組合物之任何非預期污染產生的指定組分總量因此遠低於0.05%，較佳低於0.01%。最佳為用標準分析方法未偵測到指定組分之量的組合物。 如本說明書中所用，「一(a/an)」可意謂一或多個。如本文申請專利範圍中所用，當與詞語「包含」結合使用時，詞語「一(a/an)」可意謂一個或多於一個。 除非明確顯示「或」係指唯一替代方案或該等替代方案不同時存在，否則申請專利範圍中所使用術語「或」係意謂「及/或」，雖然本發明支持唯一替代方案及「及/或」之定義。如本文所用，「另一」可意謂至少第二個或更多個。 在本申請案通篇，術語「約」用於指示值包括裝置、用以測定該值之方法之誤差的固有偏差或研究個體當中存在的偏差。 「治療(Treatment)及(treating)」係指出於獲得疾病之治療益處或健康相關之條件的目的，向個體投與或應用治療劑或對個體進行程序或儀器治療。舉例而言，治療可包括投與T細胞療法。 「個體」及「患者」係指人類或非人類，諸如靈長類、哺乳動物及脊椎動物。在特定實施例中，個體為人類。 如本申請案通篇使用之術語「治療益處」或「治療有效」係指關於此病狀之醫藥治療促進或提高個體之幸福的任何事物。此包括但不限於疾病徵象或症狀之頻率或嚴重程度之狀態。舉例而言，癌症治療可涉及例如腫瘤尺寸之減小、腫瘤侵襲性之降低、癌症增長率之降低或癌轉移預防。癌症治療亦可指患有癌症之個體之延長存活。 「抗癌」試劑能夠不利地影響個體中之癌細胞/腫瘤，例如藉由促進癌細胞殺滅、誘導癌細胞之細胞凋亡、降低癌細胞增長率、降低轉移瘤之發生率或數目、降低腫瘤尺寸、抑制腫瘤生長、減少對腫瘤或癌症細胞之供應、促進對癌細胞或腫瘤之免疫反應、預防或抑制癌症進展、或提高患有癌症之個體的壽命。 術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且特定言之涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及只要展現所要生物活性之抗體片段。 片語「醫藥上或藥理學上可接受」係指分子實體及組合物在按需要投與諸如人類之動物時不會產生不利、過敏或其他不適當反應。包含抗體或其他活性成分之醫藥組合物之製備鑒於本發明將為熟習此項技術者已知。此外，對於動物(例如人類)投與，應理解製劑應滿足如FDA生物標準辦公室(FDA Office of Biological Standards)所要求的無菌、發熱性、一般安全性及純度標準物。 如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有水溶劑(例如水、醇/水溶液、鹽水溶液、非經腸媒劑，諸如氯化鈉、林格氏溶液(Ringer's dextrose)右旋糖等)、非水溶劑(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油及諸如油酸乙酯之可注射有機酯)、分散介質、包衣、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌或抗真菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、藥物、藥物穩定劑、凝膠、結合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料、流體及營養補充劑，諸如物質以及其組合，如一般熟習此項技術者將已知。根據熟知參數調節醫藥組合物中之各種組分之pH值及精確濃度。 術語「單位劑量」或「劑量」係指適用於個體之物理離散單位，每一單位含有經計算以產生與其投與(亦即合適途徑及治療方案)相關聯之在上文中論述之所需反應的預定數量之治療性組合物。根據治療數目及單位劑量兩者待投與之數量視所需之效應而定。向患者或個體投與之本發明實施例之組合物的實際劑量可藉由物理及生理學因素確定，該等因素諸如個體之體重、年齡、健康及性別、所治療之疾病類型、疾病滲透程度、先前或同時治療性干預、患者特發病、投藥途徑及特定治療物質之效能、穩定性及毒性。舉例而言，劑量亦可包含每次投與約1 µg/kg/體重至約1000 mg/kg/體重(此此類範圍包括介入劑量)或更多，以及其中可導出之任何範圍。在來自本文中列出之數值之可導出範圍的非限制性實例中，可投與約5 µg/kg/體重至約100 mg/kg/體重、約5 µg/kg/體重至約500 mg/kg/體重等之範圍。負責投藥的從業者將在任何情況下確定組合物中活性成分之濃度及適用於單獨個體的劑量。在一些實施例中，抗原特異性T細胞灌注之劑量可包含約1億至約300億細胞，諸如100億、150億或200億細胞。 術語「免疫檢查點」係指將信號提供至其組分以便平衡免疫反應之免疫系統中之諸如蛋白質的分子。已知的免疫檢查點蛋白質包含CTLA-4、PD1及其配位體PD-Ll及PD-L2以及另外LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR。此項技術中識別涉及LAG3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3及KIR之路徑以構成類似於CTLA-4及PD-1依賴性路徑之免疫檢查點路徑(參見例如Pardoll, 2012；Mellman等人, 2011)。 「免疫檢查點抑制劑」係指抑制免疫檢查點蛋白質之功能之任何化合物。抑制包括降低功能及完全阻斷。詳言之，免疫檢查點蛋白質係人類免疫檢查點蛋白質。因此，免疫檢查點蛋白質抑制劑尤其係人類免疫檢查點蛋白質之抑制劑。 如本文所用，「保護性免疫反應」係指藉由哺乳動物主體之免疫系統對癌症之反應。保護性免疫反應可提供用於治療癌症之治療效果，例如降低腫瘤尺寸或提高存活率。 如本文所用，術語「抗原」係能夠與抗體或T細胞受體結合之分子。抗原一般可用於誘導導致產生B及/或T淋巴細胞之體液性免疫反應及/或細胞免疫反應。 術語「腫瘤相關抗原」、「腫瘤抗原」及「癌細胞抗原」在本文中可互換地使用。在各種情況下，該等術語係指由癌細胞特異性或優先性表現之蛋白質、醣蛋白或碳水化合物。 如本文所用之術語「嵌合抗原受體(CAR)」係指例如人工T細胞受體、嵌合T細胞受體或嵌合免疫受體且涵蓋在特定免疫效應細胞上接枝人工特異性之經工程改造受體。可採用在T細胞上賦予單株抗體之特異性之CAR，進而允許產生大量特異性T細胞，例如用於授受性細胞療法。在具體實施例中，例如CAR將細胞之特異性引導至腫瘤相關抗原。在一些實施例中，CAR包含胞內活化結構域、跨膜結構域及包含腫瘤相關抗原結合區之細胞外結構域。在特定態樣中，CAR包含衍生自單株抗體，將跨膜結構域及胞內域融合至CD3-ζ之單鏈可變片段(scFv)之融合體。其他CAR設計之特異性可衍生自受體(例如肽)之配位體或衍生自圖案識別受體，諸如Dectin。在某些情況下，抗原識別結構域之間距可經修飾以降低活化誘導之細胞死亡。在某些情況下，CAR包含用於其他共刺激信號傳導之結構域，諸如CD3ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10及/或OX40。在某些情況下，分子可與CAR共表現，該等分子包括共刺激分子、用於成像(例如用於正電子發射斷層攝影術)之報導基因、在添加前藥時條件性地剝蝕T細胞之基因產物、歸巢受體、趨化激素、趨化細胞素受體、細胞介素及細胞介素受體。 聚核苷酸或聚核苷酸區(或多肽或多肽區)具有與另一序列之一定百分比(例如80%、85%、90%或95%)之「序列一致性」或「同源性」意謂當對準時，在比較兩個序列時彼鹼基(或胺基酸)之百分比相同。此對準及百分比同源性或序列一致性可使用此項技術中已知之軟體程式確定，例如 此對準及百分比同源性或序列一致性可使用此項技術中已知之軟體程式確定，例如CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel等人, 編, 1987) 增刊30, 第7.7.18部分, 表7.7.1中所描述之彼等軟體程式。較佳地，默認參數用於對準。較佳的對準程序係BLAST，使用默認參數。詳言之，較佳的程式係BLASTN及BLASTP，使用以下默認參數：基因密碼=標準；過濾器=無；鏈=兩種；截止值=60；期望值=10；基質=BLOSUM62；描述=50個序列；按分類=HIGH SCORE；資料庫=不冗餘，基因銀行+EMBL+DDBJ+PDB+基因銀行CD翻譯+Swissprotein+SPupdate+PIR。 II. VCX/Y肽 本發明之實施例係關於諸如對於VCX/Y腫瘤抗原之腫瘤抗原特異性肽。在特定實施例中，腫瘤抗原特異性肽具有VCX/Y肽之胺基酸序列(GAATKMAAV: SEQ ID NO:1；或SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14)。腫瘤抗原特異性肽可具有與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14之肽序列具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100序列一致性百分比之胺基酸序列。 如本文所用，術語「肽」涵蓋胺基酸鏈，該胺基酸鏈包含7-35個胺基酸、較佳8-35個胺基酸殘基及甚至更佳8-25個胺基酸，或長度為7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個或35個胺基酸，或在其中可導出之任何範圍。舉例而言，本發明之VCX/Y肽在一些實施例中可包含SEQ ID NO:1之VCX54肽或SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14之肽或由其組成。如本文所用，「抗原肽」係引入脊椎動物中時可刺激脊椎動物中之抗體產生，亦即為抗原的，且其中抗體可選擇性識別及/或結合抗原肽之肽。抗原肽可包含免疫反應性VCX/Y肽，且可包含其他序列。其他序列可衍生自天然抗原且可為異源的，且此類序列可但不必具有免疫原性。在一些實施例中，腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)可選擇性與HLA-A2，尤其HLA-A*0201結合。在某些實施例中，VCX/Y肽之長度為8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個或35個胺基酸，或在其中可導出之任何範圍。較佳地，腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)之長度為8至35個胺基酸。在一些實施例中，腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)之長度為8至10個胺基酸。 如熟習此項技術者將瞭解，MHC分子可結合不同尺寸之肽，但通常並非全長蛋白質。儘管已傳統地描述MHC I類分子結合於8-11個胺基酸長之肽，但已展示15個胺基酸長之肽可藉由在結合位點之中間膨脹或延伸出MHC I類結合溝結合於MHC I類分子(Guo等人, 1992；Burrows等人, 2006；Samino等人, 2006；Stryhn等人, 2000；Collins等人, 1994；Blanchard及Shastri, 2008)。另外，近期研究亦表明較長肽可藉由抗原呈遞細胞更加有效地內吞、處理及呈現(Zwaveling等人, 2002；Bijker等人, 2007；Melief及van der Burg, 2008；Quintarelli等人, 2011)。如Zwaveling等人 (2002)中所表明，達至35個胺基酸長之肽可用於選擇性結合II類 MHC且為有效的。如熟悉此項技術者將立即瞭解，諸如VCX/Y之天然產生之全長腫瘤抗原將並不適用於選擇性結合II類MHC，使得其將內吞及產生T細胞增殖。一般而言，天然產生之全長腫瘤抗原蛋白質並不顯示此等特性且將因此不適用於此等免疫療法目的。 在某些實施例中，腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)為免疫原性的或抗原的。如以下實例中所示，本發明之各種腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)可促進T細胞增殖。預期此類肽可用於誘導一定程度之保護性免疫。 腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)可為重組肽、合成肽、純化肽、固定肽、可偵測地標記之肽、囊封肽或載體表現肽(例如由載體中之核酸編碼之肽，其包含可操作地連接於核酸之異源啟動子)。在一些實施例中，可向諸如人類患者之個體投與合成腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)以誘導個體中之免疫反應。合成肽相比於以重組方式表現之肽可顯示某些優勢，諸如降低細菌污染風險。腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)亦可包含於諸如疫苗組合物之醫藥組合物中，該醫藥組合物經調配以用於投與哺乳動物或人類個體。A. 細胞穿透肽 在一些實施例中，免疫療法可利用與細胞穿透體(諸如脂質體或細胞穿透肽(CPP))關聯之本發明之腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)。利用肽脈衝之抗原呈現細胞(諸如樹突狀細胞)可用於促進抗腫瘤免疫(Celluzzi等人, 1996；Young等人, 1996)。以下更詳細地描述脂質體及CPP。在一些實施例中，免疫療法可利用編碼本發明之腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)之核酸，其中核酸遞送於例如病毒載體或非病毒載體中。 腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)亦可與細胞穿透肽(CPP)關聯或共價鍵結至細胞穿透肽(CPP)。可共價鍵結至腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)之細胞穿透肽包括例如HIV Tat、疱疹病毒VP22、果蠅(Drosophila )觸角足突變同源盒基因產物、信號序列、融合序列或定點誘變抗菌肽I。將肽共價鍵結至CPP可藉由樹突狀細胞延長肽之呈現，因此增強抗腫瘤免疫(Wang及Wang, 2002)。在一些實施例中，本發明之腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)(例如包含在肽或多表位串內)可共價鍵結(例如經由肽鍵)至CPP以產生融合蛋白。在其他實施例中，腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)或編碼腫瘤抗原特異性肽之核酸可囊封在脂質體內或與脂質體關聯，該脂質體諸如多層、囊泡或多囊脂質體、細胞外囊泡或外來體。 如本文所用，「締合」意謂物理性締合、化學締合或兩者。舉例而言，締合可涉及共價結合、疏水相互作用、囊封、表面吸附或類似者。 如本文所用，「細胞穿透體」係指促進將肽/多表位串胞內遞送至抗原呈現細胞之組合物或化合物。舉例而言，細胞穿透體可為與肽關聯時促進其穿過質膜之能力的脂質。可替代地，細胞穿透體可為肽。細胞穿透肽(CPP)為此項技術中已知的，且包括例如HIV之Tat蛋白質(Frankel及Pabo, 1988)、HSV之VP22蛋白質(Elliott及O'Hare, 1997)及纖維母細胞生長因子(Lin等人, 1995)。 已自果蠅觸角足突變同源盒基因(Antp)、HIV Tat及疱疹病毒VP22之第三螺旋鑑別細胞穿透肽(或「蛋白質轉導結構域」)，其皆含有富含精胺酸及賴胺酸殘基之帶正電結構域(Schwarze等人, 2000；Schwarze等人, 1999)。此外，衍生自信號序列之疏水性肽已鑑別為細胞穿透肽。(Rojas等人, 1996；Rojas等人, 1998；Du等人, 1998). 將此等肽連接至諸如β-半乳糖之標記蛋白已展示賦予標記蛋白至細胞內之有效內化，卻含有此等肽之嵌合框內融合蛋白已用於將蛋白質遞送至活體外及活體內兩者一系列細胞類型(Drin等人, 2002)。此等細胞穿透肽至根據本發明之腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)之融合可促進多肽之細胞攝取。 在一些實施例中，藉由諸如硬脂酸酯或豆蔻酸酯之脂質附著至多肽促進細胞攝取。脂質化已展示促進肽傳遞至細胞中。脂質部分之附著係本發明提高細胞之多肽攝取之另一方式。下文進一步論述細胞攝取。 本發明之腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)可包括於脂質疫苗組合物中。舉例而言，脂質組合物可為或包含脂蛋白體組合物。例如在Neelapu等人 (2007)及Popescu等人 (2007)中描述可用於本發明之用於製備脂蛋白體組合物之方法。在一些實施例中，脂蛋白體組合物可用於治療黑素瘤。 藉由促進腫瘤抗原特異性多肽之攝取，有可能降低治療所需之蛋白質或肽之量。此繼而可顯著降低治療成本且增加治療劑供應。較低之劑量亦可將肽之潛在免疫原性降到最低且限制有毒副作用。 在一些實施例中，腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)可與奈米粒子相關聯以形成奈米粒子-多肽複合物。在一些實施例中，奈米粒子係脂質體或其他基於脂質之奈米粒子，諸如基於脂質之囊泡(例如DOTAP:膽固醇囊泡)。在其他實施例中，奈米粒子係基於氧化鐵之超順磁奈米粒子。直徑在約10至100 nm之超順磁奈米粒子小至足以避免由脾螯合，但大至足以避免由肝臟清除。粒子此尺寸可穿透極小毛細管且可有效分佈於身體組織中。超順磁奈米粒子-多肽複合物可用作MRI對比劑以鑑別及追蹤吸收腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)之彼等細胞。在一些實施例中，奈米粒子係半導體奈米結晶或半導體量子點，其兩者均可用於光學成像。在其他實施例中，奈米粒子可為奈米殼，其包含二氧化矽芯上方之金層。奈米殼層之一個優勢在於可使用標準化學物質將多肽共軛至金層。在其他實施例中，奈米粒子可為富勒烯或毫微電子管(Gupta等人, 2005)。 肽由腎自循環快速移除且易於由血清中之蛋白酶降解。藉由使腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)與奈米粒子關聯，本發明之奈米粒子-多肽複合物可保護免受降解及/或降低腎之清除。此可增加多肽之血清半衰期，進而降低有效療法所需之多肽劑量。另外，此可降低治療成本，且使療法之免疫問題及有毒反應降至最低。B. 多表位串 在一些實施例中，腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)包括或包含於多抗原決定基串中。多表位串係含有複數個來自連接在一起之一或多個抗原之抗原表位的肽或多肽。多表位串可用於誘導諸如人類個體之個體中之免疫反應。多表位串先前已用於靶向瘧疾及其他病原體(Baraldo等人, 2005；Moorthy等人, 2004；Baird等人, 2004)。多表位串可指代核酸(例如編碼包括VCX/Y肽之複數種抗原之核酸)或肽或多肽(例如含有複數種包括VCX/Y肽之抗原)。多表位串可包括於癌症疫苗組合物中。C. 生物功能等效物 本發明之腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)可經修飾成具有胺基酸取代、插入及/或缺失，此等修飾不會改變其與諸如HLA-A*0101之HLA種類蛋白、結合區之各別相互作用。腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)之此類生物學上功能等效物可為具有類似或其他期望特徵，例如結合HLA-A*0201之分子。作為非限制性實例，某些胺基酸可經本文中揭示之腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)中之其他胺基酸取代，而無相互作用能力之顯著損失，一如以結合於HLA-A*0201之可偵測的未經改變的肽所顯示。在一些實施例中，腫瘤抗原特異性肽在錨定駐存處具有取代突變，諸如在一個、兩個或所有位置處之取代突變：1 (P1)、2 (P2)及/或9 (P9)。因此考慮本文中揭示之腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)(或編碼此類肽之核酸)，其經依序及/或結構內修飾，但其生物效用未改變或活性保持在本文揭示之組合物及方法之範疇內。 熟練技術人員亦充分瞭解，生物學上功能等效肽之定義中所固有的在於以下概念：所界定分子之部分內可進行之變化數目係有限制性，雖然仍維持可接受水準之等效生物活性。因此，生物學上功能等效肽在本文中定義為其中某些、並非大多數或所有胺基酸可經取代之彼等肽。當然，可根據本發明輕易地製造及使用具有不同取代之複數種不同肽。 熟練技術人員亦認識到，在某些殘基展示為對肽之生物或結構特性尤其重要時，例如特異性表位中之殘基，此類殘基一般可能不會更換。此可能為本發明中之情況，本文揭示之腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)中之突變可能導致物種特異性之損失且繼而降低用於本發明方法之所得肽的效用。因此，具有抗原性的(例如特異性結合HLA-A*0201)且包含保守胺基酸取代之肽應理解為包括於本發明中。保守取代係最不可能顯著改變蛋白質之活性。「保守性胺基酸取代」係指用化學性上類似胺基酸置換胺基酸，亦即用其他非極性胺基酸置換非極性胺基酸；用其他極性胺基酸取代極性胺基酸，用其他酸性胺基酸取代酸性殘基等。 胺基酸取代，諸如可用於修飾本文中揭示之腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)之彼等胺基酸取代一般係基於胺基酸側鏈取代基之相對相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、尺寸及類似者。胺基酸側鏈取代基之尺寸、形狀及類型之分析顯示精胺酸、離胺酸及組胺酸均係帶正電殘基；丙胺酸、甘胺酸及絲胺酸均為類似尺寸；且苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸均具有一般類似形狀。因此，基於此等考慮，精胺酸、離胺酸及組胺酸；丙胺酸、甘胺酸及絲胺酸；以及苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸在本文中定義為生物學上功能等效物。在一些實施例中，突變可促進TCR-pMHC相互作用及/或肽-MHC結合。 本發明亦涵蓋本文中揭示之腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)之同功異型物。同功異構物含有相同數目及類型之胺基酸作為本發明之肽，但同功異構物具有不同分子結構。本發明所涵蓋之同功異型物係具有與如本文所述之本發明之肽相同特性之彼等物。 非標準胺基酸可藉由化學修飾現有胺基酸或藉由從頭合成本文中揭示之肽併入蛋白質中。非標準胺基酸係指化學結構與由基因密碼編碼之二十種標準胺基酸不同之胺基酸。 在選擇實施例中，本發明涵蓋本文中揭示之腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)之化學衍生物。「化學衍生物」係指具有一或多個藉由功能側基之反應化學衍生且保持生物活性及效用之殘基。此類衍生肽包括例如其中游離胺基已衍生以形成特異性鹽或藉由烷基化及/或醯化衍生對甲苯磺醯基、苄氧羰基、第三丁氧基羥基、氯乙醯基、甲醯基或乙醯基以及其他的彼等肽。游離羧基可衍生以形成有機或無機鹽、甲酯及乙酯或其他類型之酯或醯肼及較佳醯胺(一級或二級)。化學衍生物可包括包含一或多個天然產生之二十種標準胺基酸之胺基酸衍生物的彼等肽。舉例而言，4-羥脯胺酸可經絲胺酸取代；且鳥胺酸可經離胺酸取代。 應注意，本文中藉由式表示之所有胺基酸殘基序列，其左及右之取向在胺基端至羧基端之習知方向上。此外，應注意胺基酸殘基序列之開端或末端處之破折號表明至一或多個胺基酸殘基之另一序列之肽鍵。本文中描述之胺基酸較佳呈「L」異構形式。然而，呈「D」異構形式之殘基可經任何L-胺基酸殘基取代，只要本文所闡述之所需功能特性由蛋白質保留。 較佳的腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)或其類似物較佳特異地或較佳地結合HLA-A*0201。測定特定腫瘤抗原特異性肽或標記肽或其類似物是否可結合HLA-A*0201或結合HLA-A*0201之程度且可使用活體外分析評估，諸如酶聯結免疫吸附分析法(ELISA)、免疫墨點法、免疫沈澱、放射免疫分析(RIA)、免疫染色、膠乳膠合、間接血球凝集分析(IHA)、補體結合、間接免疫螢光分析(FA)、濁度測定法、流式細胞量測術分析、化學發光分析、側流免疫檢定、u捕獲分析、質譜分析、基於粒子之分析、抑制分析及/或親合力分析。D. 編碼腫瘤抗原特異性肽之核酸 在一態樣中，本發明提供一種核酸，該核酸編碼包含與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列之分離抗原特異性肽或相比於SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14可具有1個、2個、3個或4個點突變(例如取代型突變)之肽的核酸。如上文所陳述，此類腫瘤抗原特異性肽之可例如為8至35個胺基酸，或在其中可導出之任何範圍。在一些實施例中，腫瘤抗原特異性肽對應於腫瘤抗原蛋白質之部分，諸如VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B或VCY (例如VCX3A；基因銀行寄存編號：AAI26903.1)。術語「核酸」意欲包括DNA及RNA且可為雙鏈或單鏈。 本發明之一些實施例提供可特異性結合HLA-A*0201之以重組方式產生之腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)。因此，編碼腫瘤抗原特異性肽之核酸可可操作地連接於表現載體及使用分子生物技術中所熟知之方法在合適表現系統中產生之肽。編碼本文中揭示之腫瘤抗原特異性肽之核酸可併入確保肽之良好表現之任何表現載體中。可能的表現載體包括但不限於黏質體、質粒或經修改之病毒(例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)，只要載體適用於宿主細胞之轉化。 「適用於宿主細胞轉化」之重組表現載體意謂表現載體含有本發明之核酸分子及基於待用於表現之宿主細胞所選擇之調節序列，該表現載體以操作方式連接至核酸分子。術語「以操作方式連接」或「可操作地連接」可互換使用，且欲意謂核酸以允許核酸表現之方式連接至調節序列。 因此，本發明提供包含編碼腫瘤抗原特異性肽之核酸及用於轉錄及翻譯插入蛋白質-序列之必要調節序列的重組表現載體。合適之調節序列可衍生自多種來源，包括細菌、真菌或病毒基因(例如參見Goeddel(1990)中所描述之調節序列)。 合適調節序列之選擇一般視所選擇之宿主細胞而定，且可由一般熟習此項技術者容易地實現。此類調節序列之實例包括：轉錄啟動子及增強子或RNA聚合酶結合序列、核糖體結合序列，包括翻譯起始信號。另外，視所選擇之宿主細胞及所採用之載體而定，諸如複製起點之其他序列、其他DNA限制位點、增強劑及賦予轉錄可誘導性之序列可併入表現載體中。亦應瞭解，必要調節序列可由天然蛋白質及/或其側翼區供應。 重組表現載體亦可含有可選標記基因，該可選標記基因促進用本文中揭示之重組腫瘤抗原特異性肽(例如VCX/Y肽)轉換或轉染之宿主細胞的選擇。可選標記基因之實例係編碼蛋白質諸如G418及潮黴素之基因，其賦予對某些藥物、β-半乳糖、氯黴素、乙醯基轉移酶或螢火蟲螢光素酶之抗性。可選標記基因之轉錄藉由可選標記蛋白質，諸如β-半乳糖、氯黴素乙醯基轉移酶或螢火蟲螢光素酶之濃度變化監測。若可選標記基因編碼賦予諸如新黴素抗性之抗生素抗性之蛋白質，則可選擇具有G418之轉移體。已併入可選標記基因之細胞將存活，而其他細胞死亡。此使得有可能觀察及分析重組表現載體之表現，且尤其判定突變對表現及表型之影響。應瞭解，可選標記可引入來自所關注之核酸之分離載體上。 可將重組表現載體引入宿主細胞中以製備轉化體宿主細胞。術語「轉化體宿主細胞」意欲包括已用本發明之重組表現載體轉換或轉染之原核及真核細胞。術語「用……轉換」、「用……轉染」、「轉化」及「轉染」意欲涵蓋藉由此項技術中已知之許多可能技術中之一者將核酸(例如載體)引入細胞中。合適之宿主細胞包括各種原核及真核宿主細胞。舉例而言，本發明之蛋白質可在諸如大腸桿菌(E . coli )之細菌細胞、昆蟲細胞(使用桿狀病毒)、酵母細胞或哺乳動物細胞中表現。 本發明之核酸分子亦可使用標準技術化學合成。化學合成聚去氧核苷酸之各種方法為已知的，其包括類似肽合成，已在市售DNA合成器中完全自動化之固相合成(參見例如美國專利第4,598,049號；第4,458,066號；第4,401,796號；以及第4,373,071號)。III. 抗原特異性細胞療法 本發明之實施例係關於獲得且向個體投與抗原特異性細胞(例如自體或同種異體T細胞(例如調節T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或γ-δ T細胞)、NK細胞、恆定NK細胞、NKT細胞、間葉細胞幹細胞(MSC)、或誘導多能幹(iPS)細胞)作為免疫療法以靶向癌細胞。詳言之，細胞係抗原特異性T細胞(例如VCX/Y特異性T細胞)。過去二十年已描述用於衍生、活化及擴增功能抗腫瘤效應細胞之若干基本方法。此等包括：自體細胞，諸如腫瘤-浸潤淋巴球(TIL)；使用自體DC、淋巴球、人工抗原呈現細胞(APC)或包覆有T細胞配位體及活化抗體之珠粒離體活化之T細胞、或藉助於捕集靶細胞膜分離之細胞；自然表現抗宿主腫瘤T細胞受體(TCR)之同種異體細胞；以及基因再程式化或「重新導向」以表現呈現稱為「T-本體」之抗體樣腫瘤識別能力之腫瘤反應性TCR或嵌合TCR分子的非腫瘤特異性自體或同種異體細胞。此等方法已引起用於可用於本文所描述之方法之T細胞製備及免疫接種的許多方案。A. T 細胞製備 在一些實施例中，T細胞衍生自血液、骨髓、淋巴、臍帶或淋巴器官。在一些態樣中，細胞係人類細胞。細胞通常為初級細胞，諸如直接自個體分離及/或自個體分離且冷凍之彼等細胞。在一些實施例中，細胞包括T細胞或其他細胞類型之一或多個亞群，諸如完整T細胞群體、CD4+ 細胞、CD8+ 細胞及其亞群，諸如根據以下定義之彼等細胞：功能、活化狀態、成熟度、分化潛能、擴增、再循環、位置及/或持久能力、抗原特異性、抗原受體類型、特定器官或區室中之存在、標記或細胞介素分泌概況及/或分化程度。提及所治療之個體時，細胞可為同種異體及/或自體細胞。在一些態樣中，諸如在現成技術中，細胞為多能及/或多潛能細胞，諸如幹細胞，諸如經誘導之多能幹細胞(iPSC)。在一些實施例中，方法包括如本文所述自個體分離出細胞、對其進行製備、處理、培養及/或工程改造，及低溫保存之前或之後將其再引入同一患者中。 T細胞(例如CD4+ 及/或CD8+ T細胞)之亞型及亞群為未處理T (TN )細胞、效應子T細胞(TEFF )、記憶T細胞及其亞型，諸如幹細胞記憶T (TSCM )、中樞記憶T (TCM )、效應子記憶T (TEM )或末期分化效應子記憶T細胞；腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)、不成熟T細胞、成熟T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細胞、黏膜相關恆定T (MAIT)細胞、天然存在及適應性調節T (Treg)細胞、輔助T細胞，諸如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡性輔助T細胞；α/β T細胞及δ/γ T細胞。 在一些實施例中，T細胞群體中之一或多者富含或耗盡對特異性標記，諸如表面標記顯陽性或對特異性標記顯陰性之細胞。在一些情況下，此類標記係在T細胞(例如非記憶細胞)之某些群體上不存在或以相對較低程度表現但在T細胞(例如記憶細胞)之某些其他群體上存在或以相對較高程度表現之彼等物。 在一些實施例中，T細胞藉由陰性選擇非T細胞(諸如B細胞、單核球或其他白血球)上所表現之標記(諸如CD14)而與PBMC樣品分離。在一些態樣中，使用CD4+ 或CD8+ 選擇步驟分離CD4+ 輔助細胞與CD8+ 細胞毒性T細胞。此類CD4+ 及CD8+ 群體可藉由對一或多種未處理、記憶及/或效應子T細胞亞群上所表現或表現至相對較高程度的標記物進行正向或負向選擇而進一步分選成亞群。 在一些實施例中，CD8+ 細胞諸如藉由基於與各別亞群相關聯之表面抗原的陽性或陰性選擇而相對於未處理、中樞記憶、效應子記憶及/或中樞記憶幹細胞進一步富集或耗盡。在一些實施例中，針對中樞記憶T (TCM )細胞進行富集以提高功效，諸如在投藥之後改良長期存活率、擴增及/或移植，在一些態樣中，功效在此類亞群中特別穩定。參見Terakura等人 2012；Wang等人, 2012。 在一些實施例中，T細胞為自體T細胞。在此方法中，腫瘤樣品獲自患者且獲得單細胞懸浮液。單細胞懸浮液可以任何適合方式獲得，例如以機械方式(使用例如gentleMACS™解離劑、Miltenyi Biotec、Auburn, Calif.解聚腫瘤)或以酶方式(例如膠原蛋白酶或DNA酶)。在白介素-2 (IL-2)中培養腫瘤酶分解物之單細胞懸浮液。培養例如約5至約21天、較佳約10至約14天直至細胞匯合(例如約2×106 個淋巴球)。 經培養之T細胞可經彙集且快速擴增。快速擴增經約10至約14天之時段提供抗原特異性T細胞之數目至少約50倍(例如50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍)之增加。更佳地，快速擴增經約10至約14天之時段提供至少約200倍(例如200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍或更多倍)之增加。 擴增可藉由如此項技術中已知之多種方法中之任一者實現。舉例而言，T細胞可在餵養淋巴球及白介素-2 (IL-2)或白介素-15 (IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激快速擴增，其中IL-2為較佳的。非特異性T細胞受體刺激物可包括約30 ng/ml OKT3，小鼠單克隆抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil®, Raritan, N.J.)。可替代地，T細胞可在T細胞生長因子，諸如300 IU/ml IL-2或IL-15 (其中IL-2是較佳的)存在下，利用癌症之一或多種抗原(包括其抗原部分，諸如表位或細胞)(該等抗原可自載體，諸如人類白細胞抗原A2 (HLA-A2)結合肽任選地表現)藉由活體外刺激PBMC快速擴增。活體外誘導之T細胞利用在HLA-A2表現抗原呈現細胞上脈衝之相同癌症抗原藉由再刺激快速擴增。可替代地，T細胞可利用例如經輻射自體淋巴球或利用經輻射HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2再刺激。 自體T細胞可經修飾以表現促進生長且活化自體T細胞之T細胞生長因子。合適之T細胞生長因子包括例如IL-2、IL-7、IL-15及IL-12。合適之修飾方法為此項技術中已知。參見例如Sambrook等人, 2001；及Ausubel等人, 1994。在特定態樣中，經修飾之自體T細胞以高程度表現T細胞生長因子。T細胞生長因子編碼序列，諸如IL-12之T細胞生長因子編碼序列在此項技術中可容易地用作啟動子，其可操作地連接於T細胞生長因子編碼序列促進高程度表現。B. 經 基因工程改造之抗原受體 本發明之細胞(例如自體或同種異體T細胞(例如調節T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、或γ-δ T細胞)、NK細胞、恆定NK細胞、NKT細胞、間葉細胞幹細胞(MSC)或誘導多能幹細胞)可經基因工程改造以表現抗原受體，諸如經工程改造之TCR及/或CAR。舉例而言，宿主細胞(例如自體或同種異體T細胞)經修飾以表現具有針對癌症抗原之抗原特異性之TCR。在特定實施例中，抗原受體具有針對VCX/Y，諸如VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B及VCY，尤其VCX54肽之抗原特異性。在某些實施例中，經工程改造之TCR具有：與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:19具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%序列一致性之α鏈CDR3及/或與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:20具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%序列一致性之β鏈CDR3。在一些實施例中，TCR具有：與SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%序列一致性之α鏈及/或與SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%序列一致性之β鏈。參見例如見上文Sambrook及Ausubel。舉例而言，細胞可使用Heemskerk等人, 2008及Johnson等人, 2009中所描述之轉導技術轉導以表現具有針對癌症抗原之抗原特異性之TCR。 在一些實施例中，細胞包含編碼一或多種抗原受體之一或多種經由基因工程改造引入之核酸，及此類核酸之經基因工程改造之產物。在一些實施例中，核酸為異源核酸，亦即通常不存在於細胞或自該細胞獲得之樣品中的核酸，諸如自另一生物體或細胞獲得之核酸，此類核酸例如在經工程改造之細胞及/或此類細胞所來源之生物體中通常未發現。在一些實施例中，核酸並非天然產生，諸如未在自然界中發現之核酸(例如嵌合)。 在一些實施例中，CAR含有特異性結合於抗原之細胞外抗原識別結構域。在一些實施例中，抗原係於細胞之表面上表現之蛋白質。在一些實施例中，CAR係TCR樣CAR且抗原係經處理之肽抗原，諸如胞內蛋白質之肽抗原，其類似TCR，在主要組織相容複合體(MHC)分子之情形下在細胞表面上識別。 包括CAR及重組TCR之例示性抗原受體以及用於工程改造且將受體引入細胞內之方法包括描述於例如以下中彼等：國際專利申請公開案第WO200014257號、第WO2013126726號、第WO2012/129514號、第WO2014031687號、第WO2013/166321號、第WO2013/071154號、第WO2013/123061號、美國專利申請公開案第US2002131960號、第US2013287748號、第US20130149337號、美國專利第6,451,995號、第7,446,190號、第8,252,592號、第8,339,645號、第8,398,282號、第7,446,179號、第6,410,319號、第7,070,995號、第7,265,209號、第7,354,762號、第7,446,191號、第8,324,353號及第8,479,118號以及歐洲專利申請案第EP2537416號，及/或Sadelain等人, 2013；Davila等人, 2013；Turtle等人, 2012；Wu等人, 2012所描述之彼等者。在一些態樣中，經基因工程改造之抗原受體包括如美國專利第7,446,190號所描述之CAR，及國際專利申請公開案第WO/2014055668 Al號中所描述之彼等者。1. 嵌合抗原受體 在一些實施例中，經工程改造之抗原受體包括CAR，該等CAR包括活化或刺激CAR、共刺激CAR (參見WO2014/055668)及/或抑制性CAR(iCAR，參見Fedorov等人, 2013)。CAR一般包括在一些態樣中經由連接子及/或(一或多個)跨膜結構域連接至一或多種胞內信號傳導組分之細胞外抗原(或配位體)結合結構域。此類分子通常模仿或接近穿過天然抗原受體之信號、穿過此類受體與共刺激受體組合之信號及/或單獨穿過共刺激受體之信號。 在一些實施例中，CAR經構建具有針對特定抗原(或標記物或配位體)之特異性，諸如在授受性療法待靶向之特定細胞類型中表現之抗原，例如癌症標記物；及/或意欲誘導抑制反應之抗原，諸如在正常或非病變細胞類型上表現之抗原。因此，CAR在其細胞外部分中通常包括一或多種抗原結合分子，諸如一或多種抗原結合片段、結構域、或部分、或一或多種抗體可變域及/或抗體分子。在一些實施例中，CAR包括一或多個抗體分子之抗原結合部分，諸如衍生自單株抗體之可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)之單鏈抗體片段(scFv)。 在一些態樣中，抗原特異性結合或識別組分連接至一或多個跨膜及細胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，CAR包括融合至CAR之細胞外結構域之跨膜結構域。在一個實施例中，使用與CAR中之一個結構域天然相關之跨膜結構域。在一些情況下，跨膜結構域可經選擇或藉由胺基酸取代修飾以避免此類結構域結合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜結構域，以使與受體複合物之其他成員的相互作用降至最低。 在一些實施例中，跨膜結構域衍生自天然或合成來源。在天然來源的情況下，在一些態樣中，結構域衍生自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。跨膜區包括衍生自以下各者之彼等跨膜區(亦即包含至少以下各者之一或多個跨膜區)：T細胞受體之α鏈、β鏈或ζ鏈、CD28、CD3 ζ、CD3 ε、CD3 γ、CD3 δ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD154、ICOS/CD278、GITR/CD357、NKG2D及DAP分子。可替代地，在一些實施例中，跨膜結構域為合成的。在一些態樣中，合成性跨膜結構域主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。在一些態樣中，將在合成性跨膜結構域之各端處發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。 CAR一般包括至少一種胞內信號傳導組分。在一些實施例中，CAR包括TCR複合物之細胞內組分，諸如介導T細胞活化及細胞毒性之TCR CD3+ 鏈，例如CD3 ξ鏈。因此，在一些態樣中，抗原結合分子連接至一或多個細胞信號傳導模組。在一些實施例中，細胞信號傳導模組包括CD3跨膜域、CD3細胞內信號傳導域及/或其他CD跨膜域。在一些實施例中，CAR進一步包括諸如Fc受體γ、CD8、CD4、CD25或CD16之一或多種其他分子之部分。舉例而言，在一些態樣中，CAR包括CD3-ζ (CD3-ζ)或Fc受體γ與CD8、CD4、CD25或CD16之間的嵌合分子。2. T 細胞受體 ( TCR ) 在一些實施例中，經基因工程改造之抗原受體包括重組TCR及/或選殖於天然產生之T細胞之TCR。「T細胞受體」或「TCR」係指含有可變α及β鏈(亦分別稱為TCRα及TCRβ)或可變γ及δ鏈(亦分別稱為TCRγ及TCRδ)且能夠特異性結合於與MHC受體結合之抗原肽的分子。在一些實施例中，TCR呈αβ形式。在某些實施例中經工程改造之TCR具有SEQ ID NO:2之α鏈CDR3及/或SEQ ID NO:3之β鏈CDR3。在一些實施例中，TCR具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16之α鏈及/或SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18之β鏈。 通常，呈αβ及γδ形式存在之TCR一般結構上類似，但表現其之T細胞可具有不同結構位置或功能。TCR可發現於細胞表面上或呈可溶性形式。一般而言，TCR發現於一般負責識別結合於主要組織相容複合體(MHC)分子之抗原之T細胞(或T淋巴細胞)的表面上。在一些實施例中，TCR亦可含有恆定域、跨膜結構域及/或短胞質尾區(參見例如Janeway等人, 1997)。舉例而言，在一些態樣中，TCR之各鏈可具有一個N端免疫球蛋白可變域、一個免疫球蛋白恆定域、跨膜區及C端末端處之短胞質尾區。在一些實施例中，TCR與涉及調節信號轉導之CD3複合物之恆定蛋白相關。除非另外說明，否則術語「TCR」應理解為涵蓋其功能TCR片段。術語亦涵蓋完整或全長TCR，包括呈αβ形式或γδ形式之TCR。 因此，出於本文之目的，TCR之係指包括任何TCR或功能片段，諸如結合於在MHC分子，亦即MHC-肽複合物中結合之特異性抗原肽之TCR的抗原結合部分。可互換使用之TCR之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」係指含有TCR之結構結構域之部分但結合完全TCR所結合之抗原(例如MHC-肽複合物)的分子。在某些情況下，抗原結合部分含有足以形成用於結合於特異性MHC-肽複合物之結合位點(諸如一般各鏈含有三個互補決定區之位置)之TCR的可變域，諸如TCR之可變α鏈及可變β鏈。 在一些實施例中，TCR鏈之可變域締合以形成環或類似於免疫球蛋白之互補決定區(CDR)，其藉由形成TCR分子之結合位點賦予抗原識別且測定肽特異性且測定肽特異性。通常，如免疫球蛋白，CDR由框架區(FR)分離(參見例如Jores等人1990；Chothia等人, 1988；Lefranc等人, 2003)。在一些實施例中，CDR3係負責識別經處理抗原之主要CDR，儘管α鏈之CDR1亦已展示與抗原肽之N端部分相互作用，而β鏈之CDR1與肽之C端部分相互作用。認為CDR2識別MHC分子。在一些實施例中，β鏈之可變區可含有另一高變(HV4)區。 在一些實施例中，TCR鏈含有恆定域。舉例而言，如免疫球蛋白，TCR鏈(例如α鏈、β鏈)之細胞外部分可含有兩個免疫球蛋白結構域、N端處之一個可變域(例如Va 或Vp；通常基於Kabat編號胺基酸1至116 Kabat等人, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest, 美國衛生福利部(US Dept. Health and Human Services), 公共衛生局國立衛生研究院(Public Health Service National Institutes of Health), 1991, 第5次編」，及鄰接於細胞膜之一個恆定域(例如α鏈恆定域或Ca ，基於Kabat通常胺基酸117至259；β鏈恆定域或Cp，基於Kabat通常胺基酸117至295)。舉例而言，在某些情況下，藉由兩個鏈形成之TCR之細胞外部分含有兩個近膜恆定結構域及兩個含有CDR之遠膜可變域。TCR結構域之恆定域含有短連接序列，其中半胱胺酸殘基形成二硫鍵，在兩個鏈之間產生連接。在一些實施例中，TCR在α及β鏈中之每一者中可具有其他半胱胺酸殘基，使得TCR在恆定結構域中含有兩個二硫鍵。 在一些實施例中，TCR鏈可含有跨膜結構域。在一些實施例中，跨膜結構域帶正電。在某些情況下，TCR鏈含有胞質尾區。在某些情況下，結構使得TCR與如CD3之其他分子締合。舉例而言，含有具有跨膜區之恆定結構域之TCR可將蛋白質錨定在細胞膜中且與CD3信號傳遞設備或複合物之恆定亞基締合。 一般而言，CD3係可具有哺乳動物中之三個不同鏈(γ、δ及ε)及ζ鏈之多蛋白質複合物。舉例而言，在哺乳動物中，複合物可含有CD3γ鏈、CD3δ鏈、兩個CD3ε鏈及CD3ζ鏈之均二聚體。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈係含有單一免疫球蛋白結構域之免疫球蛋白總科之高度相關細胞表面蛋白質。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈之跨膜區帶負電，其特徵在於使此等鏈與帶正電T細胞受體鏈關聯。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈之細胞內尾各含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM之單一保守基元，而各CD3ζ鏈具有三個。一般而言，ITAM涉及TCR複合物之信號傳導能力。此等輔助分子具有帶負電跨膜區且在將信號自TCR傳播至細胞中起作用。CD3鏈及ζ鏈與TCR一起形成為T細胞受體複合物。 在一些實施例中，TCR可為兩個鏈α及β (或視情況γ及δ)之雜二聚體或其可為單鏈TCR構築體。在一些實施例中，TCR係含有諸如藉由一或多個二硫鍵連接之兩個獨立鏈(α及β鏈或γ及δ鏈)之雜二聚體。在一些實施例中，鑑別且將標靶抗原(例如癌症抗原)之TCR引入細胞中。在一些實施例中，編碼TCR之核酸可諸如藉由公開可用之TCR DNA序列之聚合酶鏈反應(PCR)擴增獲自各種來源。在一些實施例中，TCR獲自生物來源，諸如來自細胞，諸如來自T細胞(例如細胞毒性T細胞)、T細胞雜交瘤或其他公開可用之來源。在一些實施例中，T細胞可獲自活體內分離之細胞。在一些實施例中，可自患者分離高親和力T細胞純系，且分離TCR。在一些實施例中，T細胞可為經培養T細胞融合瘤或純系。在一些實施例中，標靶抗原之TCR純系已在用人類免疫系統基因(例如人類白細胞抗原系統或HLA)工程改造之轉殖基因小鼠中產生。參見例如腫瘤抗原(參見例如Parkhurst等人, 2009及Cohen等人, 2005)。在一些實施例中，噬菌體呈現用於相對於標靶抗原分離TCR (參見例如Varela-Rohena等人, 2008及Li, 2005)。在一些實施例中，TCR或其抗原結合部分可由TCR序列之瞭解合成產生。3. 抗原呈現細胞 抗原呈現細胞包括巨噬細胞、B淋巴球及樹突狀細胞，其藉由其特定MHC分子之表現區分。APC內化抗原且與其外部細胞膜上之MHC分子一起再表現彼抗原之部分。主要組織相容複合體(MHC)係具有多個基因座之大基因複合物。MHC基因座編碼兩個主要類別之MHC膜分子，稱為I類及II類。T輔助淋巴球一般識別與MHC II類分子關聯之抗原，且T細胞毒性淋巴球識別與MHC I類分子關聯之抗原。在人類中，MHC稱為HLA複合物且在小鼠中稱為H-2複合物。 在某些情況下aAPC適用於製備實施例之治療組合物及細胞療法產物。對於關於製備及使用抗原呈現系統之一般指導而言，參見例如美國專利第6,225,042號、第6,355,479號、第6,362,001號及第6,790,662號；美國專利申請公開案第2009/0017000號及第2009/0004142號；以及國際公開案第WO2007/103009號。 aAPC系統可包含至少一種外源性輔助分子。可採用任何適合之輔助分子之數目及組合。輔助分子可選自諸如共刺激分子及黏附分子之輔助分子。例示性共刺激分子包括CD86、CD64 (FcγRI)、41BB配位體及IL-21。黏附分子可包括諸如選擇素之碳水化合物結合糖蛋白、諸如整合素之跨膜結合糖蛋白、諸如鈣黏素之鈣依賴性蛋白，及諸如細胞間黏附分子(ICAM)之單程跨膜免疫球蛋白(Ig)總科蛋白，其促進例如單元至單元或細胞至基質接觸。例示性黏附分子包括LFA-3及ICAM，諸如ICAM-1。在例如美國專利第6,225,042號、第6,355,479號及第6,362,001號中例示適用於選擇、選殖、製備及表現包括共刺激分子及黏附分子之例示性輔助分子之技術、方法及試劑。IV. 可溶性 TCR 在一些實施例中，本發明提供可溶性TCR，諸如本文所提供之VCX/Y TCR。可溶性TCR不僅出於研究特異性TCR-pMHC相互作用之目的為有用的，而且可能適用作偵測感染，或偵測自體免疫疾病標記物之診斷工具。可溶性TCR亦適用於染色，例如將細胞染色以確定在MHC之情形下呈現之特定肽抗原之存在。類似地，可溶性TCR用於將治療劑，例如細胞毒性化合物或免疫刺激化合物遞送至呈現特定抗原之細胞。可溶性TCR亦可用於抑制T細胞，例如與自體免疫肽抗原反應之T細胞。在一些態樣中，TCR連接至將細胞傳遞接近腫瘤之另一分子。在其他態樣中，TCR傳遞毒素、細胞介素、共刺激配位體或抑制劑配位體且將分子、細胞或化合物引導至表現肽-MHC之靶細胞。 在本申請案之情形下，「溶解度」定義為在1 mg/ml之濃度下在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(KCL 2.7 Mm、KH2 PO4 1.5 Mm、NaCl 137 Mm及Na2 PO4 8 Mm， pH 7.1-7.5。Life Technologies, Gibco BRL)中將TCR純化為單分散雜二聚體且在25℃下培育1小時之後該TCR之超過90%仍保持為單分散雜二聚體之能力。 在一些態樣中，本發明提供可溶性T細胞受體(sTCR)，其包含(i)除其跨膜結構域以外之所有或一部分TCR α鏈(例如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16)及(ii)除其跨膜結構域以外之所有或一部分TCR β鏈(例如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18)，其中(i)及(ii)各自包含TCR鏈之功能可變域及恆定域之至少一部分，且藉由不存在於天然TCR中之恆定域殘基之間的二硫鍵連接。 在一些態樣中，可溶性TCR包含藉助於一對C端二聚肽，諸如白胺酸拉鏈分別二聚為TCR β或δ鏈細胞外結構域之TCR α或γ鏈細胞外結構域(國際專利公開案第WO 99/60120號；美國專利第7,666,604號)。 本發明之可溶性TCR (較佳為人類)可呈基本上純化形式提供，或提供為經純化或分離之製劑。舉例而言，其可呈基本上不含其他蛋白質之形式提供。 本發明之複數種可溶性TCR可呈多價複合物形式提供。因此，在一個態樣中，本發明提供多價T細胞受體(TCR)複合物，其包含複數種如本文所述之可溶性T細胞受體。該複數種可溶性TCR中之每一者較佳為相同的。 在其最簡單形式中，根據本發明之多價TCR複合物包含較佳經由連接分子彼此(例如共價或以其他方式連接)關聯之兩種或三種或四種或更多種T細胞受體分子之多聚體。合適之連接分子包括但不限於多價附著分子，諸如抗生素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、中性抗生物素蛋白及外親和素，其各者具有針對生物素之四個結合位點。因此，生物素標記之TCR分子可形成為具有複數個TCR結合位點之T細胞受體之多聚體。多聚體中之TCR分子之數目將視相對於用於製造多聚體之連接分子之數量的TCR之數量，以及任何其他生物素標記分子是否存在而定。較佳的多聚體係二聚、三聚或四聚TCR複合物。 用於本發明方法之合適結構包括諸如脂質體之膜結構及較佳為諸如珠粒、例如膠乳珠粒之粒子之固體結構。可外部包覆有T細胞受體分子之其他結構亦為合適的。較佳地，結構包覆有T細胞受體多聚體而非單獨的T細胞受體分子。 就脂質體而言，T細胞受體分子或其多聚體可附著至膜或以其他方式與膜關聯。針對此之技術為熟習此項技術者所熟知。 標記或諸如有毒或治療部分之其他部分可包括於本發明之多價TCR複合物中。 舉例而言，標記或其他部分可包括於混合分子多聚體中。此類多聚分子之實例係含有三個TCR分子及一個過氧化酶分子之四聚體。此可藉由以下來達成：以3:1之莫耳比混合TCR與酶以產生四聚複合物，且自任何不含正確分子比值之複合物分離所需複合物。此等混合分子可含有任何分子組合，其限制條件為位阻不損害或不顯著損害所需分子功能。抗生蛋白鏈菌素分子上之結合位點之安置適用於混合四聚體，此係因為不可能發生位阻。 本發明之TCR (或其多價複合物)可可替代地或另外與治療劑相關聯(例如共價或以其他方式連接)，該治療劑可為例如用於細胞殺滅之有毒部分，或諸如白介素或細胞介素之免疫刺激劑。本發明之多價TCR複合物相比於非多聚T細胞受體雜二聚體可具有針對TCR配位體提高之結合能力。因此，根據本發明之多價TCR複合物尤其適用於追蹤或靶向活體外或活體內呈現特定抗原之細胞，且亦適用作用於產生具有此類用途之其他多價TCR複合物。TCR或多價TCR複合物可因此提供於用於活體內之醫藥學上可接受之調配物中。 本發明亦提供用於將治療劑遞送至靶細胞之方法，該方法包含使潛在靶細胞與根據本發明之TCR或多價TCR複合物在使TCR或多價TCR複合物附著至靶細胞之條件下接觸，該TCR或多價TCR複合物對TCR配位體具有特異性且具有與此相關之治療劑。 詳言之，可溶性TCR或多價TCR複合物可用於將治療劑遞送至呈現特定抗原之細胞之位置。此將適用於許多情況且尤其針對腫瘤。可遞送治療劑使得其將局部發揮其效果但不僅作用於其所結合之細胞。因此，一個特定策略設想連接至對腫瘤抗原具有特異性之T細胞受體或多價TCR複合物之抗腫瘤分子。 許多治療劑可用於此用途，例如放射性化合物、酶(例如穿孔素)或化學治療劑(例如順鉑)。為確保在所需位置發揮有毒作用，毒素可位於連接至抗生蛋白鏈菌素之脂質體內部，使得緩慢釋放化合物。此將在體內傳輸期間防止損害作用且確保毒素在TCR結合至相關抗原呈現細胞之後具有最大效果。 其他合適治療劑包括： · 小分子細胞毒素劑，亦即能夠殺滅分子量低於700道爾頓之哺乳動物細胞之化合物。此類化合物亦可含有能夠具有細胞毒性效果之有毒金屬。此外，應瞭解此等小分子細胞毒素劑亦包括前藥，亦即衰減或在生理學條件下轉化以釋放細胞毒素劑之化合物。此類試劑之實例包括順鉑、美登素(maytansine)衍生物、雷查黴素(rachelmycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、多西他賽(docetaxel)、依託泊苷(etoposide)、吉西他濱(gemcitabine)、異環磷醯胺、伊立替康(irinotecan)、美法侖(melphalan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、卟吩姆鈉 (porfimer sodium)(Photofrin II)、替莫唑胺(temozolomide)、拓朴替康(topotecan)、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreate glucuronate)、奧瑞斯他汀E (auristatin E)長春新鹼及小紅莓； · 肽細胞毒素，亦即能夠殺滅哺乳動物細胞之蛋白質或其片段。實例包括蓖麻毒素、白喉毒素、假單胞菌細菌外毒素A、DNA酶及RNA酶； · 放射性核素，亦即衰減同時發射α或β粒子或γ射線中之一或多者之元素之不穩定同位素。實例包括碘131、錸186、銦111、釔90、鉍210及213、錒225及砹213； · 前藥，諸如引導酶前藥之抗體；以及 · 免疫刺激劑，亦即刺激免疫反應之部分。實例包括諸如IL-2之細胞介素、諸如IL-8之趨化激素、血小板因子4、黑素瘤生長刺激蛋白質等、諸如抗CD3抗體或其片段之抗體或其片段、補體激活劑、異種蛋白質結構域、同種異體蛋白質結構域、病毒/細菌蛋白質結構域及病毒/細菌肽。 本發明之可溶性TCR可用於藉由結合於特異性TCR配位體且藉此抑制T細胞活化來調節T細胞活化。涉及T細胞介導之發炎及/或組織損壞之自身免疫疾病將適合於此方法，例如I型糖尿病。此用途需要相關pMHC呈現之特異性肽表位之瞭解。 亦設想在製備用於治療癌症或自體免疫疾病之組合物中使用本發明之可溶性TCR及/或多價TCR複合物。 亦提供癌症或自體免疫疾病之治療方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明之可溶性TCR及/或多價TCR複合物。 如抗癌及自身免疫療法中所常見，本發明之sTCR可用於與其他試劑組合以用於治療癌症及自體免疫疾病，以及類似患者群組中所發現之相關病狀。V. 治療方法 本文中提供用於治療個體中之癌症或延遲癌症進展之方法，其包含向個體投與有效量抗原特異性細胞療法，諸如VCX/Y特異性T細胞療法。本文亦提供具有經基因工程改造之TCR轉導之T細胞(將TCR共軛至其他生物反應性蛋白(例如抗CD3))的授受性T細胞療法。在其他實施例中，提供用於治療癌症之方法，其包含用經純化之腫瘤抗原或免疫顯性腫瘤抗原特異性肽使個體免疫。 本文所提供之VCX/Y肽可用以產生癌症疫苗或免疫原(例如肽或與佐劑之經修飾肽混合物，編碼聚核苷酸及對應表現產物，諸如非活性病毒或其他微生物疫苗)。此等肽特異性疫苗或免疫原可用於使癌症患者免疫以直接誘導活體內抗腫瘤免疫反應，或用於使用肽或負載APC刺激之經編碼聚核苷酸活體外擴增抗原特異性T細胞。此等大量T細胞可授受性轉移至患者以誘導腫瘤消退。 治療所涵蓋之癌症實例包括肺癌、頭頸癌、乳癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睾丸癌、宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、肺中之前贅生性病變、結腸癌、黑素瘤及膀胱癌。 在一些實施例中，T細胞係自體細胞。然而，細胞可為同種異體細胞。在一些實施例中，T細胞自患者自身分離，使得細胞係自體性的。若T細胞係同種異體細胞，則T細胞可自若干供體彙集。向所關注之個體投與足以控制、降低或消除所治療疾病之症狀及徵象之量的細胞。 在一些實施例中，可在T細胞療法之前向個體投與非清髓性淋巴細胞耗盡化學療法。非清髓性淋巴細胞耗盡化學療法可為任何適合之此類療法，其可藉由任何適合之途徑投與。非清髓性淋巴細胞耗盡化學療法可包含例如投與環磷醯胺及氟達拉賓，尤其若癌症係可為轉移性之黑素瘤時。投與環磷醯胺及氟達拉賓之例示性途徑係靜脈內。同樣地，可投與任何適合劑量之環磷醯胺及氟達拉賓。在特定態樣中，持續兩天投與約60 mg/kg環磷醯胺，其後持續五天投與約25 mg/m2 氟達拉賓。 在某些實施例中，向個體同時投與促進自體T細胞生長及活化之T細胞生長因子與自體T細胞或在投與自體T細胞之後投與T細胞生長因子。T細胞生長因子可為促進自體T細胞生長及活化之任何適合之生長因子。適合T細胞生長因子之實例包括IL-2、IL-7、IL-15及IL-12，其可單獨使用或以各種組合使用，諸如IL-2與IL-7、IL-2與IL-15、IL-7與IL-15、IL-2、IL-7與IL-15、IL-12與IL-7、IL-12與IL-15或IL-12與IL2。IL-12為較佳的T細胞生長因子。 T細胞可靜脈內、肌肉內、皮下、局部、經口、經皮、腹膜內、眶內、藉由植入、藉由吸入、鞘內、腦室內或鼻內投與。可基於待治療之疾病類型、疾病之嚴重程度及過程、個體之臨床病症、個體之臨床病史及治療反應以及主治醫師之判斷而判定T細胞療法之合適劑量。 瘤內注射或注射至腫瘤脈管內特別適合離散性固體可接近腫瘤。局部、區域或全身投藥亦可為合適的。對於＞4 cm之腫瘤，待投與之體積將為約4-10 ml (詳言之10 ml)，而對於＜4 cm之腫瘤，將使用約1-3 ml之體積(詳言之3 ml)。作為單次劑量遞送之多次注射包含約0.1至約0.5 ml體積。A. 醫藥組合物 本文亦提供包含抗原特異性免疫細胞(例如T細胞)或受體(例如TCR)及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物及調配物。用於個體中之醫藥用途之疫苗組合物可包含本文中所揭示之腫瘤抗原肽(例如VCX/Y)及醫藥學上可接受之載劑。 如本文所述之醫藥組合物及調配物可藉由以下製備：混合具有所需純度之活性成分(諸如抗體或多肽)與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences 第22版, 2012)，呈凍乾調配物或水溶液形式。醫藥學上可接受之載劑以所採用之劑量及濃度一般對受體無毒，且包括但不限於：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；以及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙糖及包括葡萄糖、甘露糖或糊精之其他碳水化合物；諸如EDTA之螯合劑；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；諸如鈉之成鹽抗衡離子；金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物)；及/或諸如聚乙二醇(PEG)之非離子型界面活性劑。本文中之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX® , Baxter International, Inc.)。某些示例性sHASEGP及使用方法，包括rHuPH20，描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種其他葡萄糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。B. 組合療法 在某些實施例中，本發明實施例之組合物及方法涉及抗原特異性免疫細胞群體或TCR與至少一種其他療法組合。其他療法可為放射療法、手術(例如乳房腫瘤切除術及乳房切除術)、化學療法、基因療法、DNA療法、病毒療法、RNA療法、免疫療法、骨髓移植、奈米療法、單株抗體療法或前述各者之組合。其他療法可呈輔助或新輔助療法形式。 在一些實施例中，其他療法為投與小分子酶抑制劑或抗轉移性藥劑。在一些實施例中，其他療法為投與副作用限制性試劑(例如意欲減少治療之副作用出現及/或嚴重程度的試劑，諸如抗噁心劑等)。在一些實施例中，其他療法為放射療法。在一些實施例中，其他療法為手術。在一些實施例中，其他療法為放射療法與手術之組合。在一些實施例中，其他療法為γ輻射。在一些實施例中，其他療法係靶向PBK/AKT/mTOR路徑、HSP90抑制劑、微管蛋白抑制劑、細胞凋亡抑制劑及/或化學預防劑之療法。其他療法可為此項技術中已知之化學治療劑中之一或多者。 免疫細胞療法相對於其他癌症療法，諸如免疫檢查點療法可在其之前、期間、之後或以各種組合投與。投藥可呈在同時至數分鐘至數天至數週範圍內之間隔。在其中免疫細胞療法與另一種治療劑分別提供於患者之實施例中，一般將保證在每一次遞送之時間段之間未停用大量時間，使得兩種化合物將仍能夠對患者發揮有利的組合效果。在此類情況下，預期吾人可向患者提供彼此約12至24或72 h內及更尤其彼此約6-12 h內之抗體療法及抗癌療法。在某些情況下，可能需要延長時段以進行顯著治療，其中在各別投藥之間會流逝若干天(2、3、4、5、6或7)至若干週(1、2、3、4、5、6、7或8)。 可採用各種組合。對於以下實例而言，抗原特異性免疫細胞療法、肽或TCR係「A」且抗癌療法係「B」：向患者投與本發明實施例之任何化合物或療法將遵循用於投與此類化合物之一般方案，考慮試劑之毒性(若存在)。因此，在一些實施例中，存在監測由於組合療法而引起之毒性。1. 化學療法 各種化學治療劑可用於本發明實施例。術語「化學療法」係指使用藥物治療癌症。「化學治療劑」用於意味著在治療癌症中投與之化合物或組合物。此等試劑或藥物藉由其在細胞內之活性模式分類，例如其是否且在哪一階段影響細胞週期。可替代地，一種藥劑可基於其直接與DNA交聯、嵌入DNA中或藉由影響核酸合成來誘導染色體及有絲分裂失常之能力表徵。 化學治療劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替派及環磷醯胺；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三甲基三聚氰胺；多聚乙醯(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(包括合成模擬拓朴替康(topotecan))；苔蘚蟲素；海洋抑素；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素(尤其克瑞托欣1 (cryptophycin 1)及克瑞托欣8 (cryptophycin 8))；海兔毒素；倍癌黴素(包括合成類似物，KW-2189及CB1 TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；盤克斯塔叮(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇；海綿抑素；氮芥，諸如氯芥苯丁酸、萘氮芥、氯磷醯胺、雌氮芥、異環磷醯胺、氮芥、氮芥氧化物氫氯化物、美法侖、新氮芥、苯芥膽甾醇、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺及尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γII及卡奇黴素φI1)；達米辛(dynemicin)，包括達米辛A；雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素(aclacinomysins)、放射菌素、奧納黴素(authrarnycin)、偶氮絲胺酸、博萊黴素(bleomycins)、放線菌素C、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素、嗜癌菌素、色黴素、放線菌素d、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(包括嗎啉基-小紅莓、氰基-N-嗎啉基-小紅莓、2-吡咯啉基-小紅莓及去氧小紅莓)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸、諾加黴素(nogalarnycin)、橄欖黴素、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素、奎那黴素(奎那黴素)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素、鏈脲菌素、殺結核菌素、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)及左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、蝶羅呤及曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤及硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、雙去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)及氟尿苷；雄激素，諸如卡魯睾酮、屈他雄酮丙酸酯、環硫雄醇、美雄烷及睾內酯；抗腎上腺素，諸如米托坦(mitotane)及曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；醋葡醛內酯；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；貝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌；艾福米辛(elformithine)；依利醋銨；埃坡黴素；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基尿素；磨菇多糖；氯尼達明(lonidainine)；類美登素(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素；丙脒腙；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比達摩(mopidanmol)；二胺硝吖啶；噴司他丁(pentostatin)；苯來美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基醯肼；丙卡巴肼；PSK多糖複合物；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2',2''-三氯三乙胺；單端孢黴烯(尤其T-2毒素、弗納庫林A (verracurin A)、桿孢菌素A及胺癸叮)；尿烷；長春地辛；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(「Ara-C」)；環磷醯胺；類紫杉醇，例如太平洋紫杉醇及多西他賽吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑協調複合物，諸如順鉑、奧沙利鉑(oxaliplatin)及卡鉑；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱(vinorelbine)；米托蒽醌；替尼泊甙(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅黴素；胺基喋呤；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽；伊立替康(irinotecan)(例如CPT-11)；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視黃素，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；卡鉑、丙卡巴肼、光輝黴素、吉西他濱(gemcitabien)、溫諾平(navelbine)、法呢基-蛋白質轉移酶抑制劑、反鉑及以上各者中之任一者的醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。2. 放射療法 會造成DNA損傷且已廣泛使用之其他因素包括通常稱為γ-射線、X射線及/或將放射性同位素定向遞送至腫瘤細胞之彼等。DNA損傷因素之其他形式亦涵蓋諸如微波、質子束輻射(美國專利5,760,395及4,870,287)及UV輻射。最可能之情形為，所有此等因素對DNA、DNA之前驅物、DNA之複製及修復，及染色體之組裝及維持造成多種破壞。X射線之劑量範圍在50至200倫琴日劑量持續較長時段(3至4週)到2000至6000倫琴之單次劑量範圍內。放射性同位素之劑量範圍變化極大，且視同位素之半衰期、所發出之輻射強度及類型，及贅生性細胞之吸收情況而定。3. 免疫療法 熟練技術人員應瞭解，其他免疫療法可與實施例之方法組合或結合使用。在癌症治療之情形下，免疫治療劑一般依賴於使用免疫效應細胞及分子靶向及摧毀癌細胞。利妥昔單抗(Rituximab)(RITUXAN®)係此類實例。免疫效應子可為例如對腫瘤細胞表面上之一些標記物具有特異性之抗體。單獨的抗體可充當療法之效應子或其可募集其他細胞以實際上影響細胞殺滅。抗體亦可共軛至藥物或毒素(化學治療劑、放射性核種、蓖麻毒素A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)且用作靶向劑。可替代地，效應子可為攜帶直接或間接與腫瘤細胞標靶相互作用之表面分子的淋巴細胞。各種效應細胞包括細胞毒性T細胞及NK細胞。 抗體-藥物結合物已出現作為研究癌症療法之突破方法。癌症係世界上導致死亡原因中之一者。抗體-藥物結合物(ADC)包含共價連接至細胞殺滅藥物之單株抗體(MAb)。此方法組合MAb對其抗原標靶之高特異性與高度有效之細胞毒性藥物，導致將有效負載物(藥物)遞送至具有富集含量之抗原之腫瘤細胞的「武裝」MAb。藥物之靶向遞送亦將其在正常組織中之暴露量減到最少，其導致毒性降低且提高治療指數。FDA對兩種ADC藥物，2011年之ADCETRIS® (貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin))及2013年之KADCYLA® (曲妥珠單抗恩他新(trastuzumab emtansine)或T-DM1)的批准證實方法。目前在用於癌症治療之臨床試驗之各階段存在超過30種ADC候選藥物((Leal等人, 2014)。隨著抗體工程改造及連接子-有效負載物優化變得愈來愈成熟，新的ADC之發現及研發日益視適合於此方法之新的標靶之鑑別及驗證以及靶向MAb之產生而定。ADC標靶之兩個準則係腫瘤細胞中之上調/高程度表現及穩固內化。 在免疫療法之一個態樣中，腫瘤細胞必須攜帶一些適合於靶向，亦即大多數其他細胞上不存在之標記物。存在許多腫瘤標記物且此等標記物中之任一者可適用於在本發明實施例之情形下靶向。常見腫瘤標記物包括CD20、癌胚抗原、酪胺酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、Sialyl Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、層黏連蛋白受體、erb B及p155。免疫療法之替代態樣為組合抗癌作用與免疫刺激作用。亦存在免疫刺激分子，包括：細胞介素，諸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN；趨化激素，諸如MIP-1、MCP-1、IL-8及生長因子，諸如FLT3配位體。 目前所研究或在使用中之免疫療法之實例係免疫佐劑，例如牛分支桿菌(Mycobacterium bovis)、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯及芳族化合物(美國專利5,801,005及5,739,169；Hui及Hashimoto, 1998；Christodoulides等人, 1998)；細胞介素療法，例如干擾素α、β及γ、IL-1、GM-CSF及TNF (Bukowski等人, 1998；Davidson等人, 1998；Hellstrand等人, 1998)；基因療法，例如TNF、IL-1、IL-2及p53 (Qin等人, 1998；Austin-Ward及Villaseca, 1998；美國專利5,830,880及5,846,945)；以及單株抗體，例如抗CD20、抗神經節苷脂GM2及抗p185 (Hollander, 2012；Hanibuchi等人, 1998；美國專利5,824,311)。預期一或多種抗癌療法可採用本文所描述之抗體療法。 在一些實施例中，免疫療法可為免疫檢查點抑制劑。免疫檢查點增強信號(例如共刺激分子)或減弱信號。可由免疫檢查點阻斷靶向之抑制性免疫檢查點包括腺苷A2A受體(A2AR)、B7-H3 (亦稱為CD276)、B及T淋巴細胞弱化子(BTLA)、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白質4 (CTLA-4，亦稱為CD152)、吲哚胺2,3-二氧酶(IDO)、殺手細胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴細胞活化基因-3 (LAG3)、程式化死亡1 (PD-1)、T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3 (TIM-3)及T細胞活化之V結構域Ig抑制因子(VISTA)。詳言之，免疫檢查點抑制劑靶向PD-1軸及/或CTLA-4。 免疫檢查點抑制劑可為諸如小分子之藥物、配位體或受體之重組形式，或詳言之抗體，諸如人類抗體(例如國際專利公開案WO2015016718；Pardoll,Nat Rev Cancer , 12(4): 252-64, 2012；二者均以引用之方式併入本文中)。可使用免疫檢查點蛋白或其類似物之已知抑制劑，尤其可使用抗體之嵌合、人類化或人類形式。如熟練人員將知曉，替代及/或等效名稱可用於在本發明中提及之某些抗體。此類替代及/或等效名稱在本案揭示內容之情形下可互換。舉例而言，已知拉立珠單抗(lambrolizumab)亦以替代及等效名稱MK-3475及派立珠單抗(pembrolizumab)已知。 在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抑制PD-1與其配位體結合搭配物結合之分子。在一具體態樣中，PD-1配位體結合搭配物為PDL1及/或PDL2。在另一實施例中，PDL1結合拮抗劑為抑制PDL1與其結合搭配物結合之分子。在一具體態樣中，PDL1結合搭配物為PD-1及/或B7-1。在另一實施例中，PDL2結合拮抗劑為抑制PDL2與其結合搭配物結合之分子。在一具體態樣中，PDL2結合搭配物為PD-1。拮抗劑可為抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。例示性抗體描述於美國專利第US8735553號、第US8354509號及第US8008449號中，其皆以引用之方式併入本文中。用於本文所提供之方法之其他PD-1軸拮抗劑為此項技術中已知，諸如描述於美國專利申請案第US20140294898號、第US2014022021號及第US20110008369號中，其皆以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抗PD-1抗體(例如人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)。在一些實施例中，抗PD-1抗體選自由納武單抗(nivolumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)及CT-011組成之群。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為免疫黏附素(例如包含PDL1或PDL2之融合至恆定區(例如免疫球蛋白序列之Fc區)的細胞外或PD-1結合部分的免疫黏附素)。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為AMP-224。納武單抗，亦稱為MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558及OPDIVO® ，為WO2006/121168中描述之抗PD-1抗體。派立珠單抗亦稱為MK-3475、Merck 3475、拉立珠單抗、KEYTRUDA® 及SCH-900475，為WO2009/114335中所描述之抗PD-1抗體。CT-011亦稱為hBAT或hBAT-1，為WO2009/101611中所描述之抗PD-1抗體。AMP-224，亦稱為B7-DCIg，為WO2010/027827及WO2011/066342中描述之PDL2-Fc融合可溶受體。 可在本文中提供之方法中靶向之其他免疫檢查點係細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA-4)，亦稱為CD152。人類CTLA-4之完整cDNA序列具有基因銀行寄存編號L15006。CTLA-4發現於T細胞之表面上且結合於抗原呈現細胞之表面上之CD80或CD86時充當「閉合」開關。CTLA4係表現於輔助T細胞之表面上之免疫球蛋白總科的成員且將抑制信號傳輸至T細胞。CTLA4類似於T細胞共刺激蛋白質CD28，且兩種分子均結合於抗原呈現細胞上之亦分別稱為B7-1及B7-2的CD80及CD86。CTLA4將抑制信號傳輸至T細胞，而CD28傳輸刺激信號。胞內CTLA4亦發現於調節T細胞中且對其功能可為重要的。經由T細胞受體及CD28之T細胞活化導致B7分子之抑制性受體CTLA-4之表現提高。 在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗CTLA-4抗體(例如人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。 適用於本發明方法之抗人類-CTLA-4抗體(或自其衍生之VH及/或VL結構域)可使用此項技術中熟知之方法產生。可替代地，可使用此項技術公認之抗CTLA-4抗體。舉例而言，以下各者中所揭示之抗CTLA-4抗體可用於本文所揭示之方法：US 8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504 (CP675,206，亦稱為曲美單抗(tremelimumab)；以前替西單抗(ticilimumab))、美國專利第6,207,156號；Hurwitz等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071；Hurwitz等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071；以及Mokyr等人(1998)Cancer Res 58:5301-5304。前述公開案中之每一者之教示內容以引用之方式併入本文中。亦可使用與用於結合於CTLA-4之此等此項技術中公認之抗體中的任一者競爭之抗體。舉例而言，人類化CTLA-4抗體描述於國際專利申請案第WO2001014424號、第WO2000037504號及美國專利第8,017,114號中；其皆以引用之方式併入本文中。 例示性抗CTLA-4抗體係易普利姆瑪(ipilimumab)(亦稱為10D1、MDX-010、MDX-101及Yervoy® )或其抗原結合片段及變體(參見例如WO 01/14424)。在其他實施例中，抗體包含易普利姆瑪之重鏈及輕鏈CDR或VR。因此，在一個實施例中，抗體包含易普利姆瑪之VH區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，及易普利姆瑪之VL區之CDR1、CDR2及CDR3結構域。在另一實施例中，抗體競爭與與上文所提及之抗體相同之CTLA-4上的表位結合及/或結合於與上文所提及之抗體相同之CTLA-4上的表位。在另一實施例中，抗體與上文所提及之抗體具有至少約90%可變區胺基酸序列一致性(例如與易普利姆瑪至少約90%、95%或99%可變區一致性)。 用於調節CTLA-4之其他分子包括諸如描述於美國專利第號US5844905、第US5885796號及國際專利申請案第WO1995001994號及第WO1998042752號中之CTLA-4配位體及受體；其皆以引用之方式併入本文中，及諸如描述於美國專利第US8329867號中之免疫黏附素，其以引用之方式併入本文中。4. 手術 約60%患有癌症的人將經歷一些類型之手術，其包括預防性、診斷或分期、治癒性及姑息性手術。治癒性手術包括切除，其中所有或一部分癌症組織經物理移除、切除及/或破壞，且可與其他療法結合使用，諸如本發明實施例之治療、化學療法、放射線療法、激素療法、基因療法、免疫療法及/或替代療法。腫瘤切除係指物理移除腫瘤之至少一部分。除腫瘤切除以外，手術治療包括雷射手術、冷凍手術、電手術及顯微鏡控制手術(莫氏手術(Mohs' surgery))。 在切除一部分或所有癌細胞、組織或腫瘤後，可在體內形成空腔。治療可藉由用額外抗癌療法對該區域灌注、直接注射或局部施用而實現。可例如每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天、或每1週、2週、3週、4週及5週或每1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、或12個月重複此類治療。此等治療亦可具有不同劑量。5. 其他試劑 預期其他試劑可與本發明實施例之某些態樣組合使用以改善治療之治療功效。此等其他試劑包括影響細胞表面受體及GAP連接之上調之試劑、細胞生長抑制劑及分化劑、細胞黏附抑制劑、提高過度增殖細胞對細胞凋亡誘導物之靈敏度之試劑或其他生物試劑。藉由升高GAP連接之數目增加細胞間信號傳導將增加對相鄰過度增殖性細胞群體之抗過度增殖性效應。在其他實施例中，細胞生長抑制劑或分化劑可與本發明實施例之某些態樣組合使用以改善治療之抗過度增殖性功效。涵蓋細胞黏附抑制劑以改善本發明實施例之功效。細胞黏附抑制劑之實例為局部黏著斑激酶(FAK)抑制劑及洛伐他汀(Lovastatin)。另外預期增加過度增殖性細胞對細胞凋亡之敏感度的其他試劑，諸如抗體c225可與本發明實施例之某些態樣組合使用以改善治療功效。VI. 製品或套組 本文中亦提供包含抗原特異性免疫細胞、TCR或抗原肽(例如VCX/Y肽)之製品或套組。製品或套組可進一步包含藥品說明書，該藥品說明書包含使用抗原特異性免疫細胞治療個體中之癌症或延遲癌症進展或提高具有癌症之個體之免疫功能的說明。本文中描述之抗原特異性免疫細胞中之任一者可包括於製品或套組中。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、袋及注射器。容器可由多種材料形成，諸如玻璃、塑膠(諸如聚氯乙烯或聚烯烴)或金屬合金(諸如不鏽鋼或赫史特合金(hastelloy))。在一些實施例中，容器裝有調配物，及容器上或與容器系連之標籤可指示使用說明。製品或套組可進一步包括自商業及使用者觀點來看所需之其他材料，包括具有使用說明書之其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器及封裝插件。在一些實施例中，製品進一步包括一或多種另一試劑(例如化學治療劑及抗贅生性試劑)。用於一或多種試劑之適合容器包括例如瓶、小瓶、袋及注射器。VII. 實例 包括以下實例以表明本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術代表本發明人發現在本發明之實踐中運行良好之技術，且因此可視為構成其實踐之較佳模式。然而，根據本發明，熟習此項技術者應瞭解，在不背離本發明之精神及範疇的情況下可對所揭示之特定實施例作出許多改變且仍獲得相同或類似結果。實例 1 - 腫瘤抗原特異性肽之鑑別及特徵 包括BIMAS、SYFPEITHI及NetMHC分析之表位預測工具用於預測針對VCX3A抗原之HLA限制性肽表位。VCX3A結合及親和力預測結果描繪於表1中。 表1：VCX3A之HLA-A*0201肽結合及親和力預測。 預測肽經合成且用一系列稀釋濃度與T2細胞共同培養。無肽或具有陰性結合於HLA-A2肽之相同濃度之DMSO用作對照。在培育18小時之後，藉由流式細胞儀偵測HLA-A2表現。螢光指數(FI)計算如下：FI=(在給定肽下之平均螢光-無肽下之平均螢光)/(無肽下之平均螢光)。自結合分析發現，VCX54肽在3種預測肽之間展示對HLA-A2對偶基因之最強結合(圖1A)。VCX54表位發現於VCX/Y家族之所有成員中，該VCX/Y家族包括在各種肺癌細胞中表現之VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B或VCY(圖1B)。 接著，VCX54特異性T細胞純系由HLA-A*0201健康供體產生。在使用VCX3A mRNA脈衝之樹突狀細胞刺激2次後，觀測CD8+ 及VCX54四聚物+ T細胞群體(圖2A)。在四聚體引導之分選之後，使用快速擴增方案(REP)擴增細胞。利用限制稀釋法產生T細胞純系且其經歷2次擴增。觀測超過99%細胞為CD8+ 及四聚物+ (圖2B)。 測試VCX54特異性T細胞之功能親合力。以20:1之效應子與標靶(E:T)共同培養VCX54 CTL純系與利用各種濃度之VCX54肽脈衝之T2細胞。使用標準51 Cr釋放分析(CRA)(圖3)偵測細胞毒性溶解。以各種E:T比值共同培養VCX54 CTL純系(C7)與VCX1陽性表現人類肺癌細胞株H2023 (HLA-A*0201+ )或原生支氣管上皮細胞NHBE (HLA-A*0201+ )。使用標準51 Cr釋放分析(CRA)偵測細胞毒性溶解。 為判定特異性T細胞對內源性呈現之VCX54肽之識別，測試一組HLA-A2陽性肺癌細胞株。以各種E:T比值共同培養VCX54 CTL純系與表現VCY、VCX3A或VCX1之HLA-A2+肺癌細胞株組。HLA-A2陽性原生支氣管上皮NHBE細胞用於偵測正常肺組織上之CTL純系之細胞毒性。使用標準51 Cr釋放分析(CRA)偵測特異性細胞毒性溶解。在肺癌細胞中而非在原生支氣管上皮NHBE細胞中觀測到高含量VCX54 CTL純系之細胞毒性(圖4)。因此，VCX54 CTL純系對表現VCX抗原之癌細胞具有選擇性細胞毒性。 接著，進行VCX/Y特異性T細胞之HLA對偶基因限制分析。使用CRA分析分析若干HLA-A0201陰性肺癌細胞株以偵測VCX54 CTL純系之HLA限制。PC-9細胞株係HLA-A0206/A2402陽性，且H650細胞株係HLA-A2402陽性。此等兩種細胞株中之HLA-A0201對偶基因之強制表現顯著提高CTL純系之細胞毒性溶解水準(圖5)。H1573係HLA-A0201及HLA-A2402陰性細胞株。HLA-A0201對偶基因之強制表現提高細胞毒性溶解但不以高水準提高。發現HLA-A0201對偶基因及VCX3A基因之共轉染顯著提高CTL純系之細胞毒性溶解水準。 另外，確認VCX特異性T細胞對肺癌細胞之特異性細胞毒性。利用未標靶抑制分析偵測VCX54 CTL純系之內源性呈現的肽特異性識別。熱靶係肺癌細胞(HLA-A2陽性或強制表現)。冷標靶係用VCX54肽(10 μg/ml)脈衝之T2細胞。無任何肽或用M26肽(10 μg/ml)脈衝之T2細胞用作陰性對照。E:T比值為10:1。冷靶:熱靶比值為10:1或20:1。以20:1之冷靶:熱靶比值用VCX54肽脈衝T2細胞時觀測到顯著抑制(圖6)。實例 2 - VCX54 特異性 T 細胞受體之產生及評估 實例1之VCX54純系C7之T細胞受體經受使用及序列分析。使用PCR鑑別及流式細胞量測術，分析TCR α鏈(TRAV) TRAV-14及TCR β鏈(TRBV) TRBV-13 (圖7)。TRAV-14 CDR3胺基酸序列確定為CAMITSGNTGKLIF (SEQ ID NO:2)且TRBV-13 CDR3胺基酸序列確定為CASSPPGGGRTEAFF (SEQ ID NO:3)(圖8)。 來自VCX54 CTL C7純系之TCR構建為逆轉錄病毒表現載體pMSGV1。連接子碎片含有弗林裂解位點、SGSG連接子及P2A裂解位點，插入在TCR-β鏈與TCR-α鏈之間以保證兩種鏈在MSCV啟動子下表現相等程度(圖9)。包含來自VCX54 CTL純系之TCR序列之逆轉錄病毒表現載體pMSGV1及包膜載體RD114經共轉染至包裝細胞株GP2-293。轉染之後兩至三天，含有逆轉錄病毒之上清液用於感染PBMC，該等PBMC用50 ng/mg OKT3及300 U/ml IL-2刺激活化兩天。在第一次感染一天之後，再進行一次感染。5天之後，藉由流式細胞量測術偵測到清澈CD8+ 四聚體+ 群體(圖10)。 在感染之後，使用限制稀釋法產生T細胞純系。使用VCX1+ /HLA-A0201+ 肺癌細胞株H2023及HLA-A0201+ 不朽化正常人類小呼吸道上皮細胞株HSAEC2-KT作為對照利用標準51 Cr釋放分析(CRA)篩檢450株純系。圖11中僅展示對H2023細胞株展示超過百分之二十細胞毒性之純系。選擇C13及C119純系以進行進一步表徵。 使用快速擴增方案擴增經TCR基因修飾之T細胞純系C13及C119。再次使用CRA偵測CTL純系對H2023及HSAEC2-KT之細胞毒性。C119 CTL純系相比於C13純系展示對H2023肺癌細胞株較高之細胞毒性。對於正常肺細胞株HSAEC2-KT而言，C119 CTL純系展示極低細胞毒性(圖12)。此外，C119純系對原生支氣管上皮細胞株NHBE (HLA-A0201+ )展示無細胞毒性。 因此，藉由四聚體染色及四聚體解離分析分析C119純系。觀測到親本VCX54 CTL純系與經TCR基因修飾之T細胞純系C119之四聚體染色類似(圖13A)。四聚體解離分析展示C119純系之半最大結合之時間(T1 / 2 )高於親本VCX54 CTL純系(圖13B)。 針對經TCR基因修飾之T細胞純系C119之特異性響應偵測進行肽滴定分析。以10:1之效應子與標靶(E:T)比值共同培養親本VCX54 CTL純系或經TCR基因修飾之T細胞純系C119與用連續稀釋濃度之VCX54肽脈衝之T2細胞隔夜。使用ELISA偵測IFN-γ釋放(圖14)。在高濃度肽脈衝下，VCX54 CTL純系或經TCR基因修飾之T細胞純系C119之特異性反應相當。在低濃度肽脈衝下，VCX54 CTL純系具有高於經TCR基因修飾之T細胞純系C119之非特異性背景。 進行胞內染色分析以評估經TCR基因修飾之純系C119之特異性反應。以10:1之效應子與標靶(E:T)比值共同培養VCX54 CTL純系或經TCR基因修飾之T細胞純系C119與HLA-A2+ /VCX1+ 肺癌細胞株H2023或HLA-A0201+ 不朽化正常人類小呼吸道上皮細胞株HSAEC2-KT或用10 μg/ml VCX54肽或對照肽M26脈衝之T2細胞隔夜。用流式細胞量測術偵測TNF-α、CD137、IFN-γ及IL-2胞內含量。當與腫瘤細胞共同培養時，親本CTL純系相比於經TCR基因修飾之T細胞純系C119展示較高TNF-α、CD137、IFN-γ及IL-2含量，而且與正常肺細胞共同培養時展示較高背景(圖15)。當與T2脈衝之肽共同培養時，經TCR基因修飾之T細胞純系C119展示與親本CTL純系相當之TNF-α及IFN-γ含量。 比較親本CTL純系之細胞毒性與經TCR基因修飾之T細胞純系C119。使用肺癌細胞株H2023、正常肺細胞株HSAEC2-KT以及原生肺細胞NHBE以進行分析。共同培養親本CTL純系與C119純系且使用標準51 Cr釋放分析偵測細胞毒性(圖16)。親本CTL純系對腫瘤細胞展示較高細胞毒性，而且對正常肺細胞具有低含量細胞毒性。經TCR基因修飾之T細胞純系C119相比於親本CTL純系對腫瘤細胞展示略微較低之細胞毒性，但對正常肺細胞不具有任何細胞毒性。因此，C119純系相對於正常細胞對腫瘤細胞具有較高選擇性細胞毒性。 總體而言，此等結果表明，相關腫瘤相關抗原表位經鑑別，且具有足夠免疫原性以自PBMC引發抗原特異性T細胞。因此，經鑑別之抗原特異性VCX54肽可用於產生抗原特異性T細胞以在治療固體癌症中進行授受性T細胞轉移。實例 3 - 材料及方法 VCX54 特異性 CD8T 細胞之產生及擴增： 以先前所描述之方式產生腫瘤抗原特異性CTL(Li 2005)。藉由使用腫瘤抗原肽脈衝之自體DC刺激對HLA-A*0201顯陽性之白細胞去除術PBMC。為誘導樹突狀細胞，在AIM-V培養基(Invitrogen Life Technologies)中用GM-CSF及IL-4培養附著PBMC 6天且隨後添加IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE2以成熟化。1天之後，在室溫下歷經4 hr在3 µg/ml β微球蛋白存在下在2×106 個細胞/毫升1%人類血清白蛋白(HSA)/PBS下用40 µg/ml肽脈衝成熟DC。在用1% HSA/PBS洗滌之後，在48孔盤中以1.5×106 個細胞/毫升/孔將DC與PBMC混合。最初添加IL-21 (30 ng/ml)且在3至4之後培養。在第二次刺激1天之後添加IL-2及IL-7以擴增經活化抗原特異性T細胞。 在第二次刺激6天之後，用VCX/Y肽/MHC-PE-共軛四聚體及CD8-APC抗體染色細胞，且隨後藉由ARIA II分類CD8及四聚體-陽性細胞。在IL-21下使用PBL及LCL之餵養細胞藉由快速擴增方案(REP)擴增經分類VCX/Y特異性CD8 T細胞。肽 - MHC 四聚體染色 ： 藉由用HLA A*0201之VCX54肽/MHC複合物之四聚體染色確認VCX54-特異性CD8 T細胞。CD8 T細胞與PE-共軛之四聚體一起培育20分鐘，洗滌且隨後在室溫中用APC-共軛之CD8抗體染色15分鐘。在洗滌之後，藉由流式細胞量測術(LSRFortessa X-20分析儀)分析細胞。產生 T 細胞純系 ： 全長VCX3A RNA經轉染至成熟樹突狀細胞(DC)。在IL-21存在下以DC: T = 1: 10之比值共同培養經RNA轉染之DC與自生未處理T細胞。在一週之後，再次使用經RNA轉染之DC刺激T細胞。在兩輪刺激之後，將CD8+及四聚物+雙陽性T細胞群體分類且用快速擴增方案擴增。使用限制稀釋法產生T細胞純系。經由腫瘤細胞殺滅分析篩檢高活性CTL純系。TCR 選殖及逆轉錄病毒表現載體構建 ： 根據套組手冊(ClonTech Laboratories)使用5'-RACE方法克隆TCR (包括α鏈及β鏈)。使用IMGT/V-QUEST標註工具鑑別TCR V-α及TCR V-β使用率。此外，亦使用TCR Vβ基因譜套組利用流動偵測鑑別TCR V-β使用率。使用一組黏著至不同TCR V-α之5'末端之特定引子利用PCR鑑別TCR V-α使用率。為了TCR表現逆轉錄病毒載體構建，根據TCR V-α或β使用率設計正向引子。根據TCR α或β恆定區之序列設計逆引子。產生由P2A連接肽分離之含有α-TCR及β-TCR鏈之表現卡匣且將PCR產物之全長選殖至逆轉錄病毒載體pMSGV1中。用排序檢驗經選殖DNA序列。 確定VCX-54 CTL TCR具有以下序列。信號肽為帶下劃線的，CDR係粗體，且可變區係斜體。 VCX-37 CTL TCR (SEQ ID NO:4)VCX-37 TL TCR α鏈 (SEQ ID NO:5)VCX-37 CTL TCR β鏈 (SEQ ID NO:6) VCX-37 CTL TCR β鏈 (SEQ ID NO:7) 逆轉錄病毒產生及感染人類外周血液淋巴球 ( PBL ) ： 含有TCR 之pMSGV1載體與包封載體RD114共轉染至封裝細胞株GP2-293。在轉染6-8小時之後，更新培養基。24小時之後收集上清液且添加至已塗佈有20 mg/mL RetroNectin之6孔盤，接著在32℃下離心(2000×g) 2小時。隨後移除上清液且將用50ng/ml OKT3及300U/ml IL-2活化兩天之PBL添加至逆轉錄病毒負載盤，接著在32℃下離心(1000×g)10分鐘。隨後在32℃下將細胞培育隔夜，且第二天重複程序(總計兩次轉染)。此後，在5% CO2培育箱中在37℃下擴增細胞且視需要裂解。經 TCR 工程改造之 T 細胞純系產生 ：在感染之後，將CD8+及四聚物+ T細胞群體分類且用限制稀釋法產生T細胞純系。經由腫瘤細胞殺滅分析篩檢高活性CTL純系。用REP進一步擴增高腫瘤殺滅活性T細胞純系。 51 Cr 釋放分析 ： 使用標準51 Cr釋放分析來量測經TCR工程改造之T細胞或CTL純系對溶解HLA-A2腫瘤標靶之殺滅能力。在37℃下用200 μCi51 Cr標記腫瘤細胞或正常細胞2小時。洗滌經標記之靶細胞且在0.2 ml完全培養基中在37℃下以不同比率與效應細胞一起培育4小時。使用自動γ計數器計數收集之上清液。藉由在37℃下在錐蟲溶解緩衝液或培養基中將經標記靶細胞培育4小時來確定最大及自發性51 Cr釋放。測定各資料點為一式四份孔的平均值。百分比比溶胞率計算如下：% 殺滅= ((特異性釋放-自發性釋放)/(總釋放-自發性釋放))×100。IFN - γ 釋放分析： 使用ELISA方法偵測來自T細胞之IFN-γ釋放。在37℃下在具有0.2 ml培養基之96孔盤中以10:1比率將T細胞與靶細胞一起培育。在共同培養隔夜之後，收集上清液且根據套組手冊(Invitrogen Life Technologies)使用ELISA偵測IFN-γ濃度。胞內細胞介素染色 ( IC ) 分析 ： 在37℃下在佈雷菲爾德菌素A (brefeldin A)(BFA)存在下以10:1比率將T細胞與靶細胞一起培育隔夜。在共同培養之後，收集且洗滌T細胞。首先使用流動抗體抗表面標記物染色細胞。此後，用固定緩衝液洗滌且固定細胞且隨後使用透化溶液(eBioscience)滲透。隨後用胞內細胞介素流動抗體染色經滲透細胞。最後，使用FACS分析在細胞中產生之細胞介素含量。統計學分析 ： 使用GraphPad prism 6.0e版進行資料分析。使用參數測試(變方分析或未配對t試驗)分析常規分佈之資料。若p值＜0.05，則考慮統計學試驗差異顯著。實例 4 - 其他 VCX / Y 家族肽 進行其他研究以鑑別VCX/Y家族候選HLA-A2限制性肽。研究結果顯示於表2中。 表2：來自VCX/Y家族之候選HLA-A2限制性肽。 合成肽且使用具有一系列稀釋濃度之T2細胞脈衝18小時。在培育之後，藉由流式細胞量測術偵測T2之HLA-A2表現程度且計算FI指數。將M27肽用作弱結合肽對照且M26肽用作強結合肽對照。自結合分析發現，VCX-54肽展示對HLA-A2對偶基因之最強結合(圖17A)。VCX-58及VCY-37肽亦展示對HLA-A2對偶基因之強結合能力。 接著，用VCY完整長度RNA脈衝樹突狀細胞且刺激HLA-A2+細胞。在2輪刺激之後，用VCY-37四聚體及抗CD8抗體染色T細胞。將四聚體+ CD8+ 群體分類且經歷快速擴增。在快速擴增之後，用VCY-37四聚體及抗CD8抗體將CTL再染色。發現超過90%細胞群為四聚體+ CD8+ (圖17B)。 另外，以各種E:T比率共同培養VCY-37 CTL細胞株與VCX1陽性表現人類肺癌細胞株H2023 (HLA-A*0201+ )或不朽化正常小空氣上皮細胞株HSAEC2-KT (HLA-A*0201+ )。使用標準51Cr釋放分析(CRA)偵測細胞毒性溶解(圖17C)。此外，將若干HLA-A0201+ 肺癌細胞株用作標靶以測試VCY-37 CTL殺滅能力。資料展示在肺癌細胞H2023中觀測到高水準細胞毒性但在正常肺細胞HSAEC2-KT中未觀測到。此在其他肺癌細胞株中證實。 將VCY-37細胞之TCR定序且發現具有以下序列。信號肽係帶下劃線的，CDR係粗體且可變區係斜體。 VCY-37 α鏈 (SEQ ID NO:15)VCY-37 α鏈 (SEQ ID NO:16)VCY-37 TCR β鏈 (SEQ ID NO:17) VCY-37 TCR β鏈 (SEQ ID NO:18)* * * 本文中所揭示及主張之所有方法可在無根據本發明不當之實驗的情況下進行及執行。雖然已根據較佳實施例描述本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者應清楚變化可在不背離本發明之概念、精神及範疇的情況下應用於本文所述之方法中及方法之步驟或步驟順序中。更特定言之，顯而易知在化學上及生理上相關之某些藥劑可取代本文所描述之藥劑，同時獲得相同或類似結果。對熟習此項技術者顯而易見的所有此類類似取代及修改視為在由隨附申請專利範圍所定義之本發明之精神、範疇及概念內。參考文獻 以下參考文獻特定地以引用之方式併入本文中，以致其對本文所闡述之彼等提供例示性程序或其他細節補充。 Austin-Ward and Villaseca,Revista Medica de Chile , 126(7):838-845, 1998. 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以下圖式形成本說明書之一部分且包括在此以進一步表明本發明之某些態樣。參照此等圖式中之一或多者，結合本文中呈現之特定實施例之詳細描述，可更好地理解本發明。圖 1A - 1B ： HLA - A2 使 T2 細胞之表現分析穩定。 ( A ) 與T2細胞一起培育18 hr之後預測肽之結合分析以螢光指數展示HLA-A2表現。( B ) 肺癌細胞株中之VCX成員VCX1、VCX3A及VCY之表現之西方墨點法偵測。H522、H2023、H1395、H82、H1355、H1755及DFC1032表現HLA-A0201；H647表現HLA-A1101；PC-9表現HLA-A0206及HLA-A2402。圖 2A - 2B ： 來自 HLA - A * 0201 健康供體之 VCX54 特異性 T 細胞純系之產生。 (A )用VCX3A抗原脈衝樹突狀細胞進行兩次刺激之後T細胞之CD8及VCX54四聚體表現。(B )使用快速擴增方案(REP)擴增之後T細胞之CD8及VCX54四聚體表現。圖 3A - 3B ： VCX54 特異性 T 細胞之功能親合力。 (A )以20:1之效應子與標靶(E:T)比值與利用各種濃度之VCX54肽脈衝之T2細胞共同培養之VCX54 CTL純系之細胞毒性溶解。(B )以各種E:T比值與VCX1陽性表現人類肺癌細胞株H2023 (HLA-A0201+)或原生支氣管上皮細胞NHBE (HLA-A0201+)共同培養之VCX54 CTL純系(C7)之細胞毒性溶解。圖 4 ： 識別特異性 T 細胞之內源性呈現之 VCX54 肽。 以各種E:T比值與一組表現VCX3A或VCX1之HLA-A2+肺癌細胞株共同培養之VCX54 CTL純系的細胞毒性溶解。圖 5 ： VCX 特異性 T 細胞之 HLA 對偶基因限制分析。 HLA-A0201陰性肺癌細胞株上之若干VCX54 CTL純系之細胞毒性。圖 6 ： VCX 特異性 T 細胞對肺癌細胞之特異性細胞毒性證實。 利用未標靶抑制分析偵測之VCX54 CTL純系之內源性呈現的肽特異性識別。圖 7A - 7B ： VCX54 CTL 純系 ( C7 ) TCR 用法分析。 (A ) TCR α鏈(TRAV)用法PCR鑑別。TRAV用法係TRAV-13.1或TRAV-14。(B ) TCR β鏈(TRBV)用法流式細胞儀偵測。TRBV用法係TRBV-13。圖 8 ： VCX54 CTL 純系 ( C7 ) TCR α 鏈及 β 鏈分析。 來自IMGT資料庫之序列分析展示VCX54 CTL純系(C7) TCR用法為TRAV-14及TRBV-13。指定TCR-α及TCR-β之對應CDR3胺基酸序列。圖 9 ：來自VCX54 CTL純系之TCR構建為逆轉錄病毒表現載體pMSGV1。連接子碎片含有弗林裂解位點、SGSG連接子及P2A裂解位點，插入在TCR-β鏈與TCR-α鏈之間以保證兩種鏈在MSCV啟動子下表現相等程度。圖 10 ：包含來自VCX54 CTL純系之TCR序列之逆轉錄病毒表現載體pMSGV1及包膜載體RD114經共轉染至包裝細胞株GP2-293。藉由流式細胞量測術展示CD8及四聚體表現。圖 11 ： 使用VCX1+/HLA-A0201陽性肺癌細胞株H2023及HLA-A0201陽性不朽化正常人類小呼吸道上皮HSAEC2-KT細胞株利用標準51 Cr釋放分析(CRA)篩檢450純系。展示超過20%僅靶向H2023之細胞毒性之純系。圖 12 ： 使用快速擴增方案(REP)擴增之經TCR基因修飾之T細胞純系C13及C119的細胞毒性。圖 13A - 13B ： 經TCR基因修飾之T細胞純系C119之四聚體染色及四聚體解離分析。(A )親本VCX54 CTL純系及經TCR基因修飾之T細胞純系C119之四聚體染色。比較C119之四聚體染色與親本CTL純系之密度。(B )四聚體解離偵測。C119純系之半最大結合(T1 / 2 )之時間高於親本VCX54 CTL純系。圖 14 ：經TCR基因修飾之T細胞純系C119之特異性反應偵測的肽滴定分析。圖 15A - 15B ：用於評估經TCR基因修飾之純系C119之特異性反應的胞內染色分析。以10:1之效應子與標靶(E:T)比值共同培養VCX54親本CTL純系或經TCR基因修飾之T細胞純系C119與(A )HLA-A2+/VCX1+肺癌細胞株H2023或HLA-A0201+不朽化正常人類小呼吸道上皮細胞株HSAEC2-KT或(B )用10 μg/ml VCX54肽或對照肽M26脈衝之T2細胞。用流式細胞量測術偵測胞內TNF-α、CD137、IFN-γ及IL-2含量。圖 16 ： 親本CTL純系及經TCR基因修飾之T細胞純系C119對肺癌細胞株H2023、不朽化正常人類小呼吸道上皮細胞株HSAEC2-KT及原生人類支氣管上皮細胞NHBE之細胞毒性。圖 17A - 17C ：來自VCX/Y家族之HLA-A2限制性肽。( A ) 肽之HLA結合分析(HLA-A2穩定偵測)。( B ) CTL之VCY-37四聚體偵測。( C ) VCY-37 CTL對肺腫瘤或正常肺細胞株之鉻釋放分析。

Claims (91)

  1. 一種長度為35個胺基酸或更少之經分離VCX/Y肽，其包含與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14具有至少90%序列一致性之胺基酸序列，其中該肽能夠誘導細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte；CTL)且選擇性結合於HLA-A2。
  2. 如請求項1之肽，其中該HLA-A2係HLA-A*0201。
  3. 如請求項1之肽，其中該肽包含與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
  4. 如請求項1之肽，其中該肽之長度為30個胺基酸或更少。
  5. 如請求項3之肽，其中該肽之長度為25個胺基酸或更少。
  6. 如請求項5之肽，其中該肽之長度為20個胺基酸或更少。
  7. 如請求項4之肽，其中該肽之長度為15個胺基酸或更少。
  8. 如請求項1之肽，其中該肽由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14組成。
  9. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至8中任一項之經分離肽，及醫藥載劑。
  10. 如請求項9之組合物，其中該醫藥組合物經調配用於非經腸投藥、靜脈內注射、肌肉內注射、吸入或皮下注射。
  11. 如請求項9之組合物，其中該肽包含於脂質體、含脂質奈米粒子或基於脂質之載劑中。
  12. 如請求項9之組合物，其中該醫藥製劑經調配用於注射或作為鼻用噴霧吸入。
  13. 一種經分離核酸，其編碼如請求項1至8中任一項之VCX/Y肽。
  14. 一種載體，其包含由如請求項13之核酸組成之連續序列。
  15. 一種促進個體中免疫反應之方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項1至8中任一項之肽，其中該肽誘導該個體中之VCX/Y特異性T細胞。
  16. 如請求項15之方法，其中該個體經診斷患有癌症。
  17. 如請求項16之方法，其中該癌症係胸腺瘤、膀胱癌、子宮癌、黑素瘤、肉瘤、子宮頸癌或頭頸癌。
  18. 如請求項15之方法，其中該個體係人類。
  19. 如請求項15之方法，其進一步包含投與至少第二抗癌療法。
  20. 如請求項19之方法，其中該第二抗癌療法選自由化學療法、放射線療法、免疫療法或手術組成之群。
  21. 如請求項20之方法，其中該免疫療法係免疫檢查點抑制劑。
  22. 如請求項21之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係抗PD1單株抗體。
  23. 一種製備VCX/Y特異性T細胞之方法，其包含： (a) 獲得T細胞之起始群體；以及 (b) 使該T細胞之起始群體與如請求項1之VCX/Y肽接觸，進而產生VCX/Y特異性T細胞。
  24. 如請求項23之方法，其中接觸進一步定義為共同培養該T細胞之起始群體與抗原呈現細胞(antigen presenting cell；APC)，其中該等APC在其表面上呈現如請求項1之VCX/Y肽。
  25. 如請求項24之方法，其中該等APC係樹突狀細胞。
  26. 如請求項23之方法，其中該T細胞之起始群體係CD8+ T細胞或CD4+ T細胞。
  27. 如請求項23之方法，其中該等T細胞係細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte；CTL)。
  28. 如請求項23之方法，其中獲得T細胞之起始群體係包含自外周血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell；PBMC)分離該T細胞之起始群體。
  29. 一種如請求項23至28中任一項產生之VCX/Y特異性T細胞。
  30. 一種醫藥組合物，其包含如請求項23至28中任一項產生之VCX/Y特異性T細胞。
  31. 一種工程改造T細胞受體(TCR)，其包含SEQ ID NO: 2之α鏈CDR3及SEQ ID NO: 3之β鏈CDR3或SEQ ID NO: 19之α鏈CDR3及SEQ ID NO: 20之β鏈CDR3。
  32. 如請求項31之TCR，其中該經工程改造TCR結合HLA-A2。
  33. 如請求項31之TCR，其中該經工程改造TCR結合HLA-A*0201。
  34. 如請求項31之TCR，其中該TCR包含具有與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少90%一致性之α鏈及/或與SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 18至少90%一致性之β鏈。
  35. 如請求項31之TCR，其中該TCR包含具有與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少95%一致性之α鏈及/或與SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 18至少95%一致性之β鏈。
  36. 如請求項31之TCR，其中該TCR包含具有與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少99%一致性之α鏈及/或與SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 18至少99%一致性之β鏈。
  37. 如請求項31之TCR，其中該TCR包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 16之α鏈及/或SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 18之β鏈。
  38. 如請求項31之TCR，其中該TCR進一步界定為可溶性TCR，其中該可溶性TCR不包含跨膜結構域。
  39. 如請求項31至38中任一項之TCR，其進一步包含可偵測標記。
  40. 如請求項31至38中任一項之TCR，其進一步包含治療劑。
  41. 一種多價TCR複合物，其包含複數種如請求項31至38中任一項之TCR。
  42. 如請求項41之複合物，其中該多價TCR包含2種、3種、4種或更多種彼此關聯之TCR。
  43. 如請求項42之複合物，其中該多價TCR存在於脂質雙層中或附著至粒子。
  44. 如請求項42之複合物，其中該等TCR經由連接分子彼此關聯。
  45. 一種編碼如請求項31至38中任一項之TCR之多肽。
  46. 一種編碼如請求項45之多肽之聚核苷酸。
  47. 一種包含如請求項31至38中任一項之TCR之表現載體。
  48. 如請求項47之表現載體，其中該表現載體係病毒載體。
  49. 如請求項48之表現載體，其中該病毒載體係逆轉錄病毒載體。
  50. 如請求項47之表現載體，其進一步包含連接子結構域。
  51. 如請求項50之表現載體，其中該連接子結構域在該α鏈與β鏈之間。
  52. 如請求項50之表現載體，其中該連接子結構域包含一或多個裂解位點。
  53. 如請求項52之表現載體，其中該一或多個裂解位點係弗林裂解位點(Furin cleavage site)及/或P2A裂解位點。
  54. 如請求項50之表現載體，其中該一或多個裂解位點由間隔子隔開。
  55. 如請求項54之表現載體，其中該間隔子係SGSG或GSG。
  56. 一種經工程改造以表現如請求項31至38中任一項之TCR之宿主細胞。
  57. 如請求項56之宿主細胞，其中該細胞係免疫細胞。
  58. 如請求項56之宿主細胞，其中該細胞係NK細胞、恆定NK細胞、NKT細胞、間葉細胞幹細胞(mesenchymal stem cell；MSC)或經誘導多能幹(iPS)細胞。
  59. 如請求項56之宿主細胞，其中該細胞自臍帶分離。
  60. 如請求項56之宿主細胞，其中該免疫細胞係T細胞或外周血液淋巴細胞。
  61. 如請求項60之宿主細胞，其中該T細胞係CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或γδ T細胞。
  62. 如請求項60之宿主細胞，其中該T細胞係調節T細胞(Treg)。
  63. 如請求項56之宿主細胞，其中該細胞係同種異體性的或自體性的。
  64. 一種用於工程改造如請求項56之免疫細胞之方法，其包含使該免疫細胞與如請求項31之TCR或如請求項47之表現載體接觸。
  65. 如請求項64之方法，其中該免疫細胞係T細胞或外周血液淋巴細胞。
  66. 如請求項64之方法，其中接觸進一步界定為轉染或轉導。
  67. 如請求項66之方法，其中轉染包含將編碼如請求項31之TCR之RNA電穿孔至該免疫細胞內。
  68. 如請求項66之方法，其進一步包含在轉導該免疫細胞之前，自如請求項47之表現載體產生病毒上清液。
  69. 如請求項67或請求項68之方法，其中該免疫細胞係經刺激淋巴細胞。
  70. 如請求項69之方法，其中該經刺激淋巴細胞係人類淋巴細胞。
  71. 如請求項69之方法，其中刺激包含OKT3及/或IL-2。
  72. 如請求項64之方法，其進一步包含分選該等免疫細胞以分離經TCR工程改造之T細胞。
  73. 如請求項72之方法，其進一步包含藉由連續稀釋進行T細胞選殖。
  74. 如請求項73之方法，其進一步包含藉由快速擴增方案擴增T細胞純系。
  75. 一種治療個體中癌症之方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項29之VCX/Y特異性T細胞或如請求項56之經TCR工程改造之宿主細胞。
  76. 一種組合物，其包含有效量之如請求項29之VCX/Y特異性T細胞或如請求項56之經TCR工程改造之宿主細胞以用於治療個體中之癌症。
  77. 如請求項75之方法，其中該個體經鑑別具有HLA-A*0201對偶基因。
  78. 如請求項75之方法，其中該宿主細胞係T細胞、外周血液淋巴細胞、NK細胞、恆定NK細胞、NKT細胞、間葉細胞幹細胞(MSC)或誘導多能幹(iPS)細胞。
  79. 如請求項75之宿主細胞，其中該宿主細胞自臍帶分離。
  80. 如請求項75之方法，其中該宿主細胞係自體性的或同種異體性的。
  81. 如請求項75之方法，其中該T細胞係CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或γδ T細胞。
  82. 如請求項75之方法，其中該癌症係胸腺瘤、膀胱癌、子宮癌、黑素瘤、肉瘤、子宮頸癌或頭頸癌。
  83. 如請求項75之方法，其中該個體係人類。
  84. 如請求項75之方法，其中該VCX/Y特異性T細胞係自體性的或同種異體性的。
  85. 如請求項75之方法，其進一步包含在投與該VCX/Y特異性T細胞之前，使該個體淋巴細胞耗盡。
  86. 如請求項85之方法，其中淋巴細胞耗盡包含投與環磷醯胺及/或氟達拉賓(fludarabine)。
  87. 如請求項75之方法，其進一步包含投與至少第二治療劑。
  88. 如請求項87之方法，其中該至少第二治療劑包含化學療法、免疫療法、手術、放射線療法或生物療法。
  89. 如請求項87之方法，其中該等VCX/Y特異性T細胞、該等經TCR工程改造之免疫細胞及/或該至少第二治療劑係經靜脈內、腹膜內、氣管內、瘤內、肌肉內、內窺鏡、病灶內、經皮、皮下、局部投與或藉由直接注射或灌注投與。
  90. 如請求項75之方法，其中該個體經確定具有表現VCX/Y家族之蛋白質之癌細胞。
  91. 如請求項90之方法，其中該蛋白質係VCX1、VCX2、VCX3A、VCX3B或VCY。
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