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TW201825678A - 用於建立靶向重組及中斷性狀之間之連鎖的方法及組成物 - Google Patents

用於建立靶向重組及中斷性狀之間之連鎖的方法及組成物 Download PDF

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TW201825678A
TW201825678A TW106120356A TW106120356A TW201825678A TW 201825678 A TW201825678 A TW 201825678A TW 106120356 A TW106120356 A TW 106120356A TW 106120356 A TW106120356 A TW 106120356A TW 201825678 A TW201825678 A TW 201825678A
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TW
Taiwan
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locus
traits
plant
trait
recombination
Prior art date
Application number
TW106120356A
Other languages
English (en)
Inventor
山迪普 庫瑪
安德烈 F. 沃登
史蒂芬 諾瓦克
萊恩 M. 李
Original Assignee
陶氏農業科學公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 陶氏農業科學公司 filed Critical 陶氏農業科學公司
Publication of TW201825678A publication Critical patent/TW201825678A/zh

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
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Abstract

本發明係關於藉由植物育種及植物遺傳學改良植物品種之方法及組成物。舉例而言，本發明係關於提高植物內與第二性狀遺傳連鎖之異型接合性狀的重組頻率。另外，本發明係關於中斷第一對偶基因與第二對偶基因之間的遺傳連鎖。

Description

用於建立靶向重組及中斷性狀之間之連鎖的方法及組成物
本發明為關於用於建立靶向重組及中斷性狀之間之連鎖的方法及組成物。
本申請案主張2016年6月20日於美國專利商標局提交之臨時申請案62/352254之優先權，其全部內容係以引用方式併入本文中。
電子遞交之以引用方式併入的資料
以全文引用之方式併入的為與本申請案同時提交且如下標識之電腦可讀核苷酸/胺基酸序列表：創建於2016年6月6日的命名為「78126-US-PSP-20160620-Sequence-Listing-ST25.txt」的一個31.2KB ASCII(文本)文件。
現代植物育種依賴於傳統育種方法來開發及產生植物物種的新品種。通常，植物育種之目標係鑑別及選擇性培育自親本品系傳入子代植物中的性狀(呈單個基因或多個基因形式)。此類方法可能受所需性狀(例如編碼具有農藝優勢之表現型的性狀)與非所需性狀(例如編碼有害或例示農藝缺點之表現型的性狀)之遺傳連鎖限制。
傳統植物育種方法及組成物依賴於分析大型育種群體以鑑別位於特定基因組基因座處之第一性狀與位於特定基因組基因座處之第二性狀之間之連鎖中斷的子代植物。尤其是，在第一性狀及第二性狀在親本植物中緊密連鎖的情況下。通常，位於不同、特定基因組基因座之性狀可經交換事件而分離且於子代中重組，該等事件依賴於染色體之斷裂及重新連接。兩種性狀之間的重組頻率可計算並測定，因為已知大部分交換事件沿染色體之長度隨機發生且重組頻率隨包含一性狀之第一基因組基因座與包含第二性狀之第二基因組基因座之間的距離變化。因此，包含兩種性狀之兩個基因座彼此的物理位置越接近，則包含該兩種性狀之兩個基因座之間越不可能發生交換。結果係不能彼此分離的包含緊密連鎖之性狀的緊密連鎖之基因座一起傳給子代。進一步結合此方法觀測到表徵為基因組位置的一些染色體區域本質上具有低重組水準。包含位於此類基因組位置之性狀的遺傳連鎖之基因組基因座儘管彼此相距較遠，但仍將保持遺傳連鎖，由此一起傳給子代。
允許提高位於不同、獨立基因組基因座處之兩種性狀之間的重組頻率的方法及組成物將允許改善中斷兩種性狀之間之遺傳連鎖的效率。因而，就資金及資源成本而言，可更迅速且以更低成本開發新植物品種。最終，可中斷所需性狀與非所需性狀之緊密連鎖，使得植物育種者能製造出僅含有植物育種者希望基因滲入至子代中之所需性狀的新植物品種或子代，且消除與非所需性狀有關的任何連鎖累贅。
因此，需要允許提高與植物內之基因座連鎖之異型接合性狀的重組頻率，且中斷包含一性狀之第一異型接合基因座與包含一 性狀之第二基因座之間之遺傳連鎖的新穎組成物及方法。
在本發明之具體例中，本發明係關於一種用於提高植物之基因組內與第二基因座遺傳連鎖之第一基因座之間的遺傳重組頻率的方法，其包含：a)向植物之基因組中引入位點特異性核酸酶；b)使用位點特異性核酸酶在兩個同源染色體之一中製造雙股斷裂；c)進行植物基因組內之重組；以及d)修飾植物基因組，其中經修飾之植物基因組包含第一基因座與第二基因座之間的提高的遺傳重組頻率。
在此方法之一個具體例中，基因座中之每一者編碼至少一種性狀。在其他具體例中，重組包含減數分裂重組或有絲分裂重組。在其他具體例中，遺傳重組頻率自1.25倍提高至17.8倍。在其他具體例中，第一基因座至第二基因座的距離為約0.01cM至約500cM。在其他具體例中，第一基因座至第二基因座之距離為約10bp至約10Mbp。作為具體例，第一基因座位於第一染色體上，且第二基因座位於第二染色體上。在另一具體例中，基因組位置中存在之第一基因座至第二基因座具有低水準之重組頻率。舉例而言，在一個具體例中，性狀包含所需性狀或非所需性狀。在此類實例中，所需性狀或非所需性狀為原生性狀或轉殖基因性狀。舉例而言，非所需性狀可為降低之產量、降低之疾病抗性、降低之害蟲抗性、降低之除草劑耐受性的耐受能力、減慢之生長、減小之尺寸、降低之生物質產量、降低之產生種子的量、降低之鹽度抗性、降低之熱應激抗性、降低之冷應激抗性、降低之乾旱應激抗性以及其任何組合。或者，所需性狀可為以下性狀：提高之產量、提高之疾病抗性、提高之害蟲抗性、提高之除草劑耐受性、加快之生長、增加之尺寸、提高之生物質產量、增加之產生種子的量、 提高之鹽度抗性、提高之熱應激抗性、提高之冷應激抗性、提高之乾旱應激抗性以及其任何組合。
在其他具體例中，第一基因座包含多態性標記物且第二基因座包含性狀。在另一具體例中，第一基因座包含多態性標記物且第二基因座包含多晶型標記物。在其他具體例中，植物可為多倍體植物或二倍體植物。
在隨後具體例中，藉由位點特異性核酸酶產生雙股斷裂。舉例而言，位點特異性核酸酶可為鋅指核酸酶、TALEN核酸酶、CRISPR-Cas9核酸酶、大範圍核酸酶以及白胺酸拉鏈核酸酶。在另一具體例中，位點特異性核酸酶藉由基因組內重組或經由直接傳遞而傳遞至細胞。
在其他具體例中，該方法包含：製造包含經修飾之植物基因組的子代植物；子代植物用另一植物雜交或雜交至其本身；以及自子代植物產生種子。在一個具體例中，包含第一性狀之第一基因座為異型接合且位於第一同源染色體上且與包含第二性狀之第二基因座獨立地隔離，由此產生僅包含位於第一同源染色體上的包含第一性狀之第一基因座的子代植物。在另一具體例中，包含第二性狀之第二基因座為異型接合且位於第二同源染色體上且仍遺傳連接至第三基因組基因座，由此產生包含遺傳連接至第三基因組基因座的包含第二性狀之第二基因座之子代植物。
在隨後具體例中，植物係選自雙子葉植物或單子葉植物。舉例而言，植物可為菸草植物、大豆植物、棉花植物、蕓薹屬植物、玉米植物、高樑植物、小麥植物或稻穀植物。
前述及其他特徵將參照附圖，藉由詳細描述下列數個具 體例而變得更清楚。
圖1：此圖顯示含有目標DNA序列之pDAB105855的質體圖譜，其在T-DNA邊界之間包含RB7 MAR序列/eZFN4結合位點V1、OsUbi3啟動子/Phi YFP/ZmPer5 3'UTR v2/eZFN1結合位點/ELP1 HR2 v2、ZmUbi1啟動子v8/Cry34Ab1 v2/StPinII 3' UTR v2、TaPer啟動子v3/Cry35Ab1 v5/StPinII 3' UTR v2、SCBVv2/AAD-1v3/ZmLip 3' UTR v1。
圖2：此圖顯示含有目標DNA序列之pDAB113068的質體圖譜，其在T-DNA邊界之間包含eZFN1結合位點；來自OsUbi3啟動子：：TraP4 DGT-28轉殖基因：：ZmLip 3'UTR之內含子；SBS8196結合位點：：eZFN4結合位點：：SBS19354結合位點：：SBS15590結合位點：：eZFN8結合位點：：SBS18473結合位點：：eZFN1結合位點；ZmUbi1啟動子：：PAT轉殖基因：：ZmLip 3'。
圖3：此圖顯示含有eZFN1位點特異性核酸酶之表現卡匣的pDAB105825的質體圖譜。
圖4：此圖顯示用於例示藉由位點特異性核酸酶(例如鋅指核酸酶)裂解兩個同源染色體中之一者產生的兩個對偶基因之間重組頻率增加的轉形及育種策略。
圖5：此圖顯示用於本發明之構築體的示意圖及eZFN1結合位點之位置。
I.綜述
在涉及選擇性育種方案之作物改良計劃的過程中，常常 需要中斷第一基因組基因座與附近第二基因組基因座的遺傳連鎖。當第二基因座編碼較少所需性狀或甚至編碼不利性狀時，尤其如此。舉例而言，連鎖累贅可描述為兩種性狀(例如一種所需性狀與另一非所需性狀)之間存在遺傳連鎖。由於此遺傳連鎖，包含兩種性狀之兩個基因座一起遺傳。若兩種性狀緊密連鎖，則依賴於天然重組來產生所需重組體是不合適的。令人遺憾的是，使用本技藝中可獲得之方法移除植物中此類所需及非所需性狀之間的遺傳連鎖且獲得僅具有所需性狀之植物變得困難、費時且在許多情形中不可能。若根據本發明之方法在育種程序期間的重組頻率可提高，則兩個包含性狀之基因座之間的重組將以較高頻率出現於子代中，且植物育種者可使用不算貴且更高效方式開發出僅含有所需性狀的新子代植物。
II.定義
在本申請案通篇使用了許多術語。為了對本說明書及申請專利範圍(包括欲給出此類術語之範疇)提供清楚且一致的理解，提供了以下定義。
術語「對偶基因」意謂特定基因座處之基因的一或多個替代形式中之任一者，該等對偶基因全部涉及特異性基因座處之一種性狀或特徵。在生物體之二倍體細胞中，既定基因之對偶基因位於染色體上的一個特定位置或基因座(複數個基因座)。一個對偶基因存在於兩個同源染色體中之每一者上。二倍體植物物種可在同源染色體上的相應基因座處具有不同對偶基因。
術語「回交」係指子代與其親本中之一者或與其親本中之一者遺傳上一致的個體之間的雜交。術語「回交」涵蓋「高代回交」，意謂回交子代與來自上代的近親祖細胞或與來自上代的近親祖細胞遺 傳上一致的個體之間的雜交。術語「回交」或「高代回交」理解為包括配種或輔助授精來產生回交子代。用於輔助授精或繁殖的較佳方法包括(但不限於)選殖、活體外授精或卵胞漿間精子注射(inter-cytoplasmic sperm injection)。輔助授精之方法在此項技術中熟知(Thornton等人，1999；Loutradis等人，2000；Nakagata,2000)美國專利第5,453,366號、第5,541,081號、第5,849,713號)。回交可用於自一個遺傳背景向另一遺傳背景引入一或多個單基因座轉化。
術語「嵌合基因」(或重組基因)係指物種中實際上通常不存在的任何基因，詳言之存在實際上彼此不相關的一或多個核酸序列部分的基因。舉例而言，啟動子實際上與部分或全部經轉錄區域或與另一調控區不相關。術語「嵌合基因」應理解為包括啟動子或轉錄調控序列可操作地連接於一或多個編碼序列或反義(有義股的反向互補序列)或反向重複序列(有義及反義，由此RNA轉錄物在轉錄時形成雙股RNA)的表現構築體。
術語「染色單體」係指在複製之後存在的染色體兩個部分之一，其在複製之前為一個DNA雙螺旋，且在複製之後為在經複製染色體之著絲點處連接的兩個相同DNA雙螺旋，即兩個染色單體的基本組件；染色體內重組通常形成遺傳終點。
術語「染色體」是真核細胞之核內自身複製線型或棒型結構中之一者，其由極端凝聚之染色質組成且含有細胞特定功能之遺傳資訊。
術語「雜交」係指兩個親本植物的配種。
術語「交換(crossing over/crossover)」係指染色體臂之相互交換且可例如在減數分裂前期I之後期階段視為交叉。
術語「所需性狀」係指賦予商業栽培作物優勢或增加值的任何可遺傳性狀，而短語「非所需性狀」係指在商業栽培作物中表現時有害的任何可遺傳性狀。可以設想在一些情況下，候選遺傳性狀可根據性狀應用及植物育種者之意圖分類成「所需性狀」及「非所需性狀」。本文提供此類商業上所需及緩解性狀的特定實例。
術語「二倍體」係指具有兩組(2N)染色體之典型蓖麻植物，其中各組包含20個染色體。如本文所用的二倍體植物與倍增的多倍體植物同基因型，即兩組染色體在全部位置皆基本上含有相同對偶基因。二倍體植物可為天然存在、經遺傳修飾或育種產物。
術語「顯性性狀」係指性狀以異型接合或同型接合狀態表現型顯現之二倍體或其它多倍體生物體，且係指相比另一隱性對偶基因完全顯現其表現型表現之對偶基因。
術語「基因表現」係指可操作地連接於適當調控區域(特定言之啟動子)之DNA區域轉錄成生物活性RNA(即其能夠轉譯成生物活性蛋白質或肽(或活性肽片段)或其本身具有活性(例如在轉錄後基因沉默或RNAi中))的過程。編碼序列較佳在有義方向且編碼所需生物活性蛋白質或肽或活性肽片段。在基因沉默法中，DNA序列較佳以反義DNA或反向重複DNA形式存在，包含反義或有義及反義方向之目標基因的短序列。
術語「倍數變化」為描述自初始值至最終值有多少量變的量度。舉例而言，初始值30及最終值60對應於倍數變化1(或等於變為2倍)，或通常而言，兩倍增加。
術語「基因」意謂包含在細胞中轉錄成RNA分子(例如mRNA)的可操作地連接於適合調控區域(例如啟動子)的區域(經轉錄區 域)的DNA序列。基因因此可包含若干可操作地連接之序列，諸如啟動子、包含例如涉及於轉譯起始中之序列的5'前導序列、(蛋白質)編碼區(cDNA或基因組DNA)及包含例如轉錄終止位點之3'非轉譯序列。
如本文所用之術語「基因組」係關於含有來自生物體之遺傳物質的物質或物質之混合物。如本文所用之術語「基因組DNA」係指自生物體獲得之脫氧核糖核酸。術語「基因組」及「基因組DNA」涵蓋核酸(DNA或RNA)中通常編碼且包括基因及非編碼序列之個體遺傳資訊。視使用情境而定，基因組可以指構成生物體之一個染色體組(單倍體基因組)或生物體之兩個染色體組(二倍體基因組)的核酸。
本文所用之術語「遺傳重組」具有指示DNA裂解/涉及DNA之重新連接的現象的廣泛含義。本發明中所用之術語「遺傳重組」的含義涵蓋同源重組、非同源重組、基因轉化、反轉、不等交換、交換、移位、副本數變化、染色體融合以及突變。另外，術語「重排」係指增加頻率之「遺傳重組」引起現有基因組序列之間的重組，導致基因組序列部分或完全改變的情境。
術語「遺傳連鎖」係指第一基因座與第二基因座隔開既定遺傳距離使得兩個基因座在子代植物中一起遺傳，此類性狀連鎖不平衡且統計學上測得不獨立分配。
術語「異型合子」或「異型接合」意謂二倍體或多倍體個別細胞或植物至少在一個基因座處具有不同對偶基因(既定基因形式)，例如該術語表示不同對偶基因存在於同源染色體上之同一基因座的遺傳條件。
在同源染色體對之情形中，術語「同源」係指長度、基因位置及著絲點位置類似且在減數分裂期間排成行且形成突觸的來自 個體的染色體對。在個體中，同源染色體對的一條染色體來自個體之母親(即「母源」)，而該對之另一染色體來自父親(即「父源」)。在基因之情形中，術語「同源」係指各基因存在於各同源染色體內的相同位置且具有相同功能的基因對。
術語「同源重組」係指在同源染色體之間(諸如在減數分裂期間在同源染色體之非姊妹染色單體之間)的相應位置處相互交換。同源重組亦可在有絲分裂期間在體細胞中出現(體細胞交換)。
術語「同型合子」或「同型接合」意謂個別細胞或植物在一或多個基因座處具有相同對偶基因，例如該術語表示相同對偶基因存在於同源染色體上之同一基因座的遺傳條件。
術語「基因組內傳遞」係指藉由雜交兩個植物使基因表現卡匣(其中基因表現卡匣併入植物基因組內)自一個植物傳遞至第二植物(子代或另一親本)。
術語「基因滲入」係指遺傳基因座之所需對偶基因自一個遺傳背景傳輸至另一遺傳背景。舉例而言，規定基因座處之所需對偶基因的基因滲入可經兩個植物之間的有性雜交進行，其中植物中的至少一者在其基因組內具有所需對偶基因。對偶基因基因滲入至子代中。在另一實例中，對偶基因之傳輸可藉由兩個供體基因組之間的活體外(例如在稠合原生質體中)重組進行，其中供體原生質體中之至少一者在其基因組中具有所需對偶基因。所需對偶基因可為例如標記物或定量性狀基因座的轉殖基因或所選對偶基因。
術語「經分離核酸序列」係指不再處於將其分離出來之天然環境中的核酸序列，例如細菌宿主細胞或植物核或質體基因組中的核酸序列。
術語「連鎖不平衡」係指來自兩個或更多個基因座之對偶基因的非隨機關聯。暗示標記物對偶基因或對偶基因之群已一起遺傳。
術語「連鎖累贅」係指與所需性狀連鎖之(通常非所需)性狀作用基因滲入至子代植物中。由於連鎖累贅，非所需性狀與非所需性狀遺傳連鎖之所需性狀一起遺傳。
術語「基因座」係指例如染色體或基因圖譜上已經遺傳限定之基因位置或任何遺傳位點。基因座可為基因或基因之部分，或具有一些調控作用之DNA序列，且可被不同序列佔據。兩個基因座之間的相對距離可藉由參見摩根單位(Morgan unit)給定，但基因座亦可藉由鄰近基因之性質鑑別。在本發明之方法中，第一及第二基因座是不同的，即若第一基因座位於第一染色體上之一個特定位置處，則第二基因座位於第一染色體上之一個特定位置處，該基因座與第一基因座相距特定距離使得可以測定基因座之間的重組頻率。
術語「減數分裂(meiosis/meiotic)」係指將體細胞染色體數目(2n)減少至一半(n)且後面通常接著配子形成的二階段核分裂過程。在減數分裂之第一階段，染色體數目減少，其中在減數分裂之第二階段，染色體之均等分裂產生四個子核，各自攜帶一個染色單體。
儘管術語「有絲分裂(mitosis/mitotic)」通常與術語「細胞分裂」同義使用，但有絲分裂恰當地係指細胞分裂過程中的僅一個階段：姊妹染色單體在兩個子細胞之間同等分配之過程。在真核細胞中，有絲分裂後面是細胞質分裂，其為細胞的細胞質裂解至兩個不同但遺傳一致子細胞中的過程。
如本文所用之術語「修飾(modify/modified/modifying/modification)」 不受特別限制，包括改變、控制、更改、緩解、轉形或使不同中之一或多者定義的操作。在一個具體例中，術語「修飾(modify/modified/modifying/modification)」包括化學改質及生物學修飾。在另一具體例中，術語「修飾(modify/modified/modifying/modification)」包括改變植物基因組使得基因組由於缺失、取代、添加或其它重排而不含相同初始遺傳物質。
術語「摩根」或「圖譜單位」各自係指用於表現染色體上的基因之間的相對距離的單位。一個摩根單位(cM)指示100%重組頻率。一分摩根(cM)指示1%重組頻率。
術語「核酸序列」(或核酸分子)係指單股或雙股形式之DNA或RNA分子，特定言之編碼根據本發明之蛋白質或蛋白質片段的DNA分子。
術語「原生性狀」係指天然存在的經識別非轉殖基因植物表現型，其可遺傳且可用於至少一個植物物種的若干品種中。或者，原生性狀為人造的且可經植物之突變誘發產生。原生性狀通常藉由育種在所選品種或植物物種中基因滲入。原生性狀之基因滲入可藉助於側接包含所關注之原生性狀的基因座的分子標記物進行。
術語「表現型」意謂個體之遺傳組成(即基因型)與環境之間的相互作用引起的個別細胞、細胞培養物、植物或植物基團的可觀測特徵。
術語「植物」係指整個植物或植物部分，諸如可自植物獲得之細胞、組織或器官(例如花粉、種子、配子、根、葉子、花、花芽、花粉囊、果實等)，以及此等中之任一者的衍生物以及藉由自交或雜交來源於此類植物之子代。「植物細胞」包括分離或在組織、器官或 生物體內之原生質體、配子、懸浮液培養物、小芽孢、花粉粒等。
術語「多倍體」係指具有三組或超過三組染色體(例如3N、4N、5N、6N以及更多)之植物。根據本發明之此態樣之一些具體例，多倍體植物為同源多倍體。
術語「子代」係指特定植物(自花授粉)或植物對(異花授粉)的直接後代，且包含特定指定代產生之全部隨後代的全部植物及種子。後代可為例如F1、F2或任何隨後代。
術語「啟動子」係指用於控制一或多個基因之轉錄的核酸片段，其位於基因之轉錄起始位點之轉錄方向的上游，且藉由針對DNA依賴性RNA聚合酶之結合位點、轉錄起始位點及任何其他DNA序列(包括(但不限於)轉錄因子結合位點、抑制子及活化因子蛋白質結合位點及熟悉本技藝者已知的任何其他核苷酸序列)之存在結構上鑑別以直接或間接調整來自啟動子之轉錄量。「組成性」啟動子為在多數生理學及發育條件下在多數組織中具有活性之啟動子。「誘導型」啟動子為生理學(例如藉由外部施加特定化合物)或以發育方式調控之啟動子。「組織特異性」啟動子僅在特定類型之組織或細胞中具有活性，而「組織較佳」啟動子為較佳(但非排他地)在特定組織或細胞中具有活性。「在植物或植物細胞中具有活性之啟動子」為有能力初始化植物細胞中之轉錄的啟動子。
術語「蛋白質」或「多肽」可互換地使用且係指由胺基酸鏈組成之分子，不涉及特定作用模式、尺寸、3維結構或來源。蛋白質之「片段」或「部分」因此可仍稱為「蛋白質」。「經分離蛋白質」用於指不再處於其天然環境中，例如活體外或在重組細菌或植物宿主細胞中的蛋白質。
術語「隱性性狀」係指性狀在同型接合狀態表現型顯現但在其顯性對偶基因存在下被遮蔽的二倍體或其它多倍體生物體。
如本文所用之術語「重組」意謂某些已重新組合，使得當涉及核酸構築體時，該術語係指分子由接合在一起的核酸序列構成或藉助於分子生物學技術製造。術語「重組(recombinant/recombination)」當涉及遺傳組成物時係指具有親本基因組中未出現之新對偶基因組合之配子或子代。
術語「重組」係指改變基因之連鎖之方法。由於重組方法，子代分子、細胞或生物體中之基因組合的模式與親本分子、細胞或生物體中之基因組合的模式不同。由於兩個染色體之間的DNA序列交換或重組體的新基因關聯，可能發生重組。在本發明之含義中，重組是由於兩個染色體之間藉由交換法引起的DNA序列交換，即藉由對稱斷裂及交叉重組相互交換同源染色體之區段。因此，術語「重組」及「交換」可互換使用。
術語「重組頻率」或「交換頻率」或「遺傳重組頻率」用於表示染色體上的兩個基因座之間發生交換及重組的頻率。重組頻率通常根據所分析個體之總數中具有重新組合之表現型的個體的百分比來計算。在本發明之方法中，其如下文進一步論述根據測試雜交群體(諸如F1子代之花粉或F2子代之植物)中分析的個體總數中顯示報告蛋白表現之個體數目計算。「基礎」重組頻率為在標準條件下生長的尚未誘變或用生物或非生物刺激處理且尚未用除第一及第二及視情況存在之第三及第四表現卡匣轉形以外的表現卡匣轉形之植物中的重組頻率。「誘導」重組頻率為在同源染色體中之一者內含有雙股斷裂，由此影響遺傳連鎖之基因座之間的重組的植物中的重組頻率。
術語「分離」意謂用於部分或完全彼此分離一種或多種組分的一或多種方法，及/或導致一或多種組分不再位於相同位置的一或多種方法。一或多種組分視情況包括(但不限於)一或多種染色體類型，或單個染色體，或一種染色體類型之單個副本。方法包括(但不限於)手動、自動、半自動、遠程控制及/或機械。此類方法之說明性具體例包括(但不限於)螢光活化細胞分選(FACS)。
本文之術語「轉殖基因植物」或「轉形植物」係指已使用嵌合基因轉形之植物或植物細胞。所述嵌合基因可或可不整合至植物的基因中。在一個較佳具體例中，不整合。轉殖基因植物細胞可指分離或在組織培養物中之植物細胞，或植物或分化器官或組織中所含之植物細胞，且兩種可能性皆可特定包括於本文中。因此，說明書或申請專利範圍中提及植物細胞不意欲僅提及培養物中之經分離細胞或原生質體，而是提及位於或處於其可能存在之任何類型之植物組織或器官中的任何植物細胞。
術語「品種」意謂由形式或功能與其它類似個體陣列不同的物種之個體群組成的物種之分部。
III.具體例
儘管本文揭示本發明之多個具體例，但根據熟悉本技藝者之公共常識可作出在本發明之範疇內的許多調整及修飾。此類修飾包括用已知等效物取代本發明之任何態樣以使用實質上相同之方式實現相同結果。數值範圍包括界定該範圍之數字。在本說明書中，措詞「包含(comprising)」用作開放式術語，實質上等效於短語「包括(但不限於)」，且措詞「包含(comprises)」具有相應含義。本文參考文獻之引用不應理解為承認此類參考文件為本發明之先前技術。本說明書中引 用之全部公開案(包括(但不限於)專利及專利申請案)以引用的方式併入本文中，就像每一個個別公開案特定且獨立地指示以引用的方式併入本文中且如同完全在本文中說明。
提供用於提高植物基因組內遺傳連鎖之基因座之間的遺傳重組頻率的方法及組成物，其中基因座編碼性狀，包含對偶基因或包含多態性標記物。進一步提供用於提高植物基因組內遺傳連鎖之基因座之間的隔離量的方法及組成物，其中基因座編碼性狀，包含對偶基因，或包含多態性標記物。亦提供用於提高植物基因組內遺傳連鎖之基因座之間的遺傳連鎖不平衡的方法及組成物，其中基因座編碼性狀，包含對偶基因或包含多態性標記物。一般而言，提供用於降低植物基因組內遺傳連鎖之對偶基因之間的遺傳連鎖的方法及組成物，其中對偶基因編碼性狀，包含基因座或包含多態性標記物
在一個態樣中，本發明係關於提高兩個基因組基因座之間的遺傳重組。染色體基因座之間的距離由基因座所位於之同源染色體之間的重組頻率控制。藉由監測兩個基因座之間的遺傳重組頻率，植物育種者可測定需要多少連續代回交來中斷第一基因座與第二基因座之連鎖，使得僅第一基因座傳代至子代植物。在一個具體例中，兩個遺傳連鎖之基因座之間的遺傳連鎖藉由在兩個同源染色體之一中引入雙股斷裂來破壞，由此導致遺傳重組增加。遺傳重組之增加可如下測定。
在一個態樣中，遺傳重組頻率之提高為大於植物基因組內兩個連鎖之基因座之間天然存在的遺傳重組頻率的任何百分比。植物基因組內兩個連鎖基因座之間天然存在的遺傳重組頻率可根據遺傳重組百分比測定。在一些態樣中，本發明之方法導致此遺傳重組頻率 自1.25倍增加至17.8倍遺傳重組提高。在此態樣之一些具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致1.25倍遺傳重組提高。在此態樣之其他具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致2倍遺傳重組提高。在此態樣之其他具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致2.25倍遺傳重組提高。在此態樣之具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致3.2倍遺傳重組提高。在此態樣之具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致8倍遺傳重組提高。在此態樣之額外具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致8.6倍遺傳重組提高。在此態樣之具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致13倍遺傳重組提高。在此態樣之具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致17.8倍遺傳重組提高。在此態樣之其他具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致超過17.75倍遺傳重組提高。由本發明方法產生的遺傳重組頻率之進一步提高使遺傳重組提高超過1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、2.25倍、2.5倍、2.75倍、3倍、3.25倍、3.5倍、3.75倍、4倍、4.25倍、4.5倍、4.75倍、5倍、5.25倍、5.5倍、5.75倍、6倍、6.25倍、6.75倍、7倍、7.25倍、7.5倍、7.75倍、8倍、8.25倍、8.75倍、9倍、9.25倍、9.5倍、9.75倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍或100倍提高。
在一個態樣中，遺傳重組頻率之提高為大於植物基因組內兩個連鎖之基因座之間天然存在的遺傳重組頻率的任何百分比。植物基因組內兩個連鎖之基因座之間天然存在的遺傳重組頻率可根據遺傳重組百分比測定。遺傳重組頻率之頻率可藉由單獨或非連鎖之僅含 有第一基因座或僅含有第二基因座之重組後代的數目除以所觀測之後代的總數來計算。對於本發明，計算出植物基因組內兩個連鎖基因座之間天然發生的遺傳重組百分比為3.5%，作為例示性遺傳重組頻率。在一些態樣中，本發明之方法導致此遺傳重組頻率自4.4%增加至62.3%遺傳重組。在此態樣之一些具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致4.4%遺傳重組。在此態樣之其他具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致7.1%遺傳重組。在此態樣之進一步具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致7.2%遺傳重組。在此態樣之具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致7.9%遺傳重組。在此態樣之具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致11.5%遺傳重組。在此態樣之額外具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致27.8%遺傳重組。在此態樣之具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致30.2%遺傳重組。在此態樣之具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致45.6%遺傳重組。在此態樣之具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致62.3%遺傳重組。在此態樣之一些具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致超過4.4%遺傳重組提高。在此態樣之其他具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致超過7.1%遺傳重組提高。在此態樣之進一步具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致超過7.2%遺傳重組提高。在此態樣之具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致超過7.9%遺傳重組提高。在此態樣之具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致超過11.5%遺傳重組提高。在此態樣之額外具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致超過27.8%遺傳重組提高。在此態樣之具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致超過30.2%遺傳重組提高。在此態樣之具體例中，提高此遺傳重組頻率之方法導致超過45.6%遺傳重組。在此態樣之具體例中，提高此 遺傳重組頻率之方法導致超過62.0%遺傳重組提高。由本發明之方法導致的遺傳重組頻率的進一步提高使遺傳重組提高超過4.4%、4.5%、4.75%、5%、5.25%、5.5%、5.75%、6%、6.25%、6.75%、7%、7.25%、7.5%、7.75%、8%、8.25%、8.75%、9%、9.25%、9.5%、9.75%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19、20%、21%、22%、23%、24%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在另一態樣中，本發明係關於降低兩個連鎖之基因座之間的遺傳連鎖。在一個具體例中，兩個遺傳連鎖之基因座之間的遺傳連鎖藉由在兩個同源染色體之一中引入雙股斷裂來破壞，由此導致遺傳重組提高及隨後兩個連鎖之基因座之間的遺傳連鎖減少。
在另一態樣中，本發明係關於提高兩個連鎖之基因座之間的隔離。在一個具體例中，兩個遺傳連鎖之基因座隔離成傳輸至子代植物的僅單個基因座的能力藉由在兩個同源染色體之一中引入雙股斷裂來提高，由此導致遺傳重組提高及隨後之隔離提高。
在另一態樣中，本發明係關於提高兩個連鎖基因座之間的遺傳連鎖不平衡。在一個具體例中，兩個遺傳連鎖之基因座保持遺傳連鎖成傳輸至子代植物的僅單個基因座的能力藉由在兩個同源染色體之一中引入雙股斷裂來提高，由此導致遺傳重組提高及隨後之遺傳連鎖不平衡提高。
在另一態樣中，本發明係關於重組發生之細胞分裂階段。在一個具體例中，重組可在減數分裂期間發生。在另一具體例中，重組可在有絲分裂期間發生。減數分裂及減數分裂重組為已在不同生物體中研究至不同程度及不同水準之錯綜複雜的過程。在藉由交換機制 在同源染色體之間進行減數分裂及有絲分裂重組期間，導致同源染色體之間的DNA區段交換。
有絲分裂及減數分裂在許多方面為相對過程。有絲分裂細胞中的DNA重組之主要作用為保持遺傳資訊之保真度且確保其精確複製及傳代至子細胞。相比之下，減數分裂期間之DNA重組用於藉由在配子形成期間促進母系及父系基因組之改組或互混來建立遺傳資訊之新排列，以使能夠產生與任一親本想必具有新基因組的後代。減數分裂對比有絲分裂細胞中的DNA重組之不同目的反映於各細胞類型中之同源重組的極不同角色及機制中。
減數分裂(生殖系)細胞與有絲分裂(無性/體細胞)細胞相比在同源重組的主要過程中存在基本機理區別。在減數分裂細胞中，同源重組主要發生在非姊妹染色單體之間(以改組基因組)，而在有絲分裂細胞中，同源重組主要發生在姊妹染色單體之間(以校正基因組誤差)。姊妹染色單體是特定母系或父系染色體的複製副本。減數分裂細胞中出現的非姊妹染色單體之間(即父系染色單體與母系染色單體之間)的重組與有絲分裂細胞中出現的相比頻繁500-1000倍。非姊妹染色單體交換(NSCE)的減數分裂過程促進來自生物體的兩個親本的遺傳資訊的新重組。相比之下，由重組介導的修復造成的姊妹染色單體交換(SCE)的有絲分裂過程是用於維持整個多細胞生物體中的基因組保真度的主要機制。
在特定具體例中，重組在減數分裂的細胞學階段期間發生。在減數分裂期間，區分了許多細胞學階段，並且對於各階段，已經描述了植物中的許多突變體。在稱為減數分裂前期的初始階段期間，辨別出許多階段。在稱為細線期的初始階段期間，已經複製並且由兩 個姊妹染色單體組成的個別染色體開始凝聚並且變得較短及較厚。同時，核被膜開始崩解且同源染色體開始關聯。下一階段稱為合線期，其中染色體完全凝聚且其中同源染色體對準且開始形成所謂聯會複合體(SC)。芥菜屬(Arabidopsis)之dif1/syn1突變體的SC形成受損(Bhatt,A.M.等人(1999)Plant J.19,463-472；Bai,X.等人(1999)Plant Cell 11,417-430)。DIF1/SYN1基因產物與在聯會及重組中起作用之酵母黏合素REC8/RAD21同源。在粗線期，全部染色體均完成SC之形成。在此階段，發生減數分裂重組，其藉由形成雙股斷裂起始，隨後是同源染色體之間的染色單體交換。形成於非姊妹染色單體之間且在無聯會複合體存在下亦保持均等之物理聯繫稱為交叉。在雙線期及終變期，染色體完全凝聚，核被膜消失且紡錘絲形成。隨後在中期I期間，同源染色體對位於細胞之赤道面中。接著，在分裂後期I期間，各自由可進行許多重組事件且藉由著絲點固持在一起的兩個姊妹染色單體組成之同源染色體朝相對細胞極點移動。在分裂末期I期間，完成極性移動，紡錘體消失且細胞開始分裂。
隨後，此等細胞進入特徵為凝聚之染色體在赤道面上對準之分裂前期II。形成紡錘體複合體。在中期II期間，染色體完全在赤道面對準且完成紡錘體複合體。在稱為分裂後期II的下一階段期間，著絲點分裂且姊妹染色單體朝相對極點移動。在分裂末期II中，完成此移動過程，紡錘體複合體開始消失且開始細胞分裂。隨後，染色體恢復其分裂間期形態，其特徵為位於核被膜內部之染色體解開。
減數分裂II之終產物為一組四個遺傳學上不同的單倍體細胞，其可進行有絲分裂產生配子體。配子體產生配子，配子融合時導致形成接合子，其發育成可生長成下一代孢子體之胚芽。
孢子體中發生之遺傳變異由形成接合子時融合之雌性及雄性配子之基因型決定。因此，此遺傳變異在減數分裂期間的雌性及雄性孢子形成期間產生，此導致初始親本染色體以及染色體區域由於重組事件而發生遺傳學再分類。
在一個態樣中，本發明係關於遺傳連鎖之基因座。一般而言，基因座為以物理方式位於染色體上之任何聚核苷酸序列。作為一個具體例，基因座可涵括長度為1個鹼基對至1,0000,000個鹼基對(即1Mbp)之聚核苷酸鹼基對的任何範圍。在另一具體例中，基因座可包含對偶基因。在另一具體例中，基因座可包含性狀。在另一具體例中，基因座可包含多態性標記物。
在其他具體例中，性狀可包括轉殖基因性狀。適用於本發明所揭示之構築體之轉殖基因性狀包括(但不限於)賦予以下之編碼序列：(1)對害蟲或疾病之抗性；(2)對除草劑之耐受性；(3)增加價值之農藝性狀，諸如產量提高、氮利用效率、水使用效率及營養品質；(4)蛋白質與DNA以位點特異性方式結合；(5)小RNA之表現；以及(6)可篩選標記。根據一個具體例，轉殖基因編碼賦予殺蟲劑抗性、除草劑耐受性、小RNA表現、氮使用效率、水使用效率或營養品質之可篩選標記或基因產物。
1.昆蟲抗性
多種昆蟲抗性編碼序列為轉殖基因性狀之具體例。可操作地連接之序列接著可併入至所選載體中以允許鑑別及選擇經轉形植物(「轉形體」)。例示性昆蟲抗性編碼序列為此項技術中已知的。作為可操作地連接於本發明之調控組件的昆蟲抗性編碼序列的具體例，提供以下性狀。提供例示性鱗翅目昆蟲抗性之編碼序列包括：cry1A； cry1A.105；cry1Ab；cry1Ab(截短型)；cry1Ab-Ac(融合蛋白)；cry1Ac(以Widestrike®進行銷售)；cry1C；cry1F(以Widestrike®進行銷售)；cry1Fa2；cry2Ab2；cry2Ae；cry9C；mocry1F；pinII(蛋白酶抑制蛋白)；vip3A(a)；以及vip3Aa20。提供例示性鞘翅目昆蟲抗性之編碼序列包括：cry34Ab1(以Herculex®進行銷售)；cry35Ab1(以Herculex®進行銷售)；cry3A；cry3Bb1；dvsnf7；以及mcry3A。提供例示性多昆蟲抗性之編碼序列包括ecry31.Ab。以上昆蟲抗性基因清單不意欲是限制性的。任何昆蟲抗性基因均為本發明所涵蓋。
2.除草劑耐受性
多種除草劑耐受性編碼序列為轉殖基因性狀之具體例。例示性除草劑耐受性編碼序列為本技藝中已知的。提供以下性狀作為可操作地連接至本發明之調控組件的除草劑耐受性編碼序列之具體例。草甘膦除草劑含有藉由抑制EPSPS酶(5-烯醇丙酮醯莽草酸-3-磷酸合成酶)之作用模式。此酶涉及於植物生長及發育必需的芳族胺基酸的生物合成中。可用於抑制此酶之各種酶機制為本技藝中已知的。編碼此類酶之基因可操作地連接至本發明之基因調控組件。在一個具體例中，可篩選標記基因包含(但不限於)編碼包含以下草甘膦抗性基因之基因：突變型EPSPS基因，諸如2mEPSPS基因、cp4 EPSPS基因、mEPSPS基因、dgt-28基因；aroA基因；及草甘膦降解基因，諸如草甘膦乙醯轉移酶基因(gat)及草甘膦氧化酶基因(gox)。此等性狀目前以Gly-TolTM、Optimum®、GAT®、Agrisure® GT及Roundup Ready®進行銷售。草銨膦及/或畢拉草(bialaphos)化合物之抗性基因包括dsm-2、bar及pat基因。bar及pat性狀目前以LibertyLink®進行銷售。包括在內的還有提供對2,4-D之抗性的耐受性基因，諸如aad-1基因(應注意aad-1基因對 於芳氧基苯氧基丙酸酯除草劑具有進一步活性)及aad-12基因(應注意aad-12基因對於吡啶氧基乙酸酯合成植物生長素具有進一步活性)。此類性狀以Enlist®作物保護技術進行銷售。ALS抑制劑(磺醯脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基硫代苯甲酸酯及磺醯基胺基-羰基-三唑啉酮)之抗性基因為此項技術中已知的。此等抗性基因最常由ALS編碼基因序列之點突變引起。其他ALS抑制劑抗性基因包括hra基因、csr1-2基因、Sr-HrA基因及surB基因。一些性狀以商標Clearfield®進行銷售。抑制HPPD之除草劑包括吡唑啉酮，諸如苄草唑(pyrazoxyfen)、吡草酮(benzofenap)及苯吡唑草酮(topramezone)；三酮，諸如甲基磺草酮(mesotrione)、磺草酮(sulcotrione)、環磺酮(tembotrione)、苯并雙環酮(benzobicyclon)；及二酮腈，諸如異嗪唑草酮(isoxaflutole)。此等例示性HPPD除草劑可被已知性狀所忍受。HPPD抑制劑之實例包括hppdPF_W336基因(關於對異嗪唑草酮之抗性)及avhppd-03基因(關於對甲基磺草酮之抗性)。苯腈除草劑耐受性狀之實例包含bxn基因，其已顯示出賦予對除草劑/抗生素溴苯腈(bromoxynil)之抗性。汰克草(dicamba)之抗性基因包含如國際PCT公開案第WO 2008/105890號中所揭示之汰克草單氧化酶基因(dmo)。PPO或PROTOX抑制劑類型的除草劑(例如，三氟羧草醚(acifluorfen)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、氟丙草酯(flupropazil)、環戊嗪草酮(pentoxazone)、唑草酮(carfentrazone)、異丙吡草酯(fluazolate)、吡草醚(pyraflufen)、苯草醚(aclonifen)、草芬定(azafenidin)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、氟烯草酸(flumiclorac)、必芬諾(bifenox)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、乳氟禾草靈(lactofen)、氟磺胺草醚(fomesafen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen)及甲磺草胺(sulfentrazone))之抗性基因為此項技術中已知的。賦予對PPO之抗性的 例示性基因包含野生型阿拉伯芥PPO酶之過度表現(Lermontova I與Grimm B,(2000)Overexpression of plastidic protoporphyrinogen IX oxidase leads to resistance to the diphenyl-ether herbicide acifluorfen.Plant Physiol 122：75-83.)、枯草桿菌PPO基因(B.subtilis)PPO基因(Li,X.and Nicholl D.2005.Development of PPO inhibitor-resistant cultures and crops.Pest Manag.Sci.61：277-285 and Choi KW,Han O,Lee HJ,Yun YC,Moon YH,Kim MK,Kuk YI,Han SU and Guh JO,(1998)Generation of resistance to the diphenyl ether herbicide,oxyfluorfen,via expression of the Bacillus subtilis protoporphyrinogen oxidase gene in transgenic tobacco plants.Biosci Biotechnol Biochem 62：558-560.)。吡啶氧基或苯氧基丙酸及環己酮之抗性基因包含ACC酶抑制劑編碼基因(例如Accl-S1、Accl-S2及Accl-S3)。賦予對環己二酮及/或芳氧基苯氧基丙酸之抗性的例示性基因包含精吡氟氯禾靈(haloxyfop)、禾草靈(diclofop)、芬殺草(fenoxyprop)、吡氟禾草靈(fluazifop)及喹禾靈(quizalofop)。最後，可抑制光合作用之除草劑(包括三装或苯甲腈)係藉由psbA基因(對三装之耐受性)、1s+基因(對三装之耐受性)及腈水解酶基因(對苯甲腈之耐受性)而提供耐受性。上列除草劑耐受性基因清單並不意欲為限制性的。任何除草劑耐受性基因係皆為本發明所涵蓋。
3.農藝性狀
多種農藝性狀編碼序列為轉殖基因性狀之具體例。例示性農藝性狀編碼序列為本技藝中已知的。提供以下性狀作為可操作地連接於本發明之調控組件的農藝性狀編碼序列的具體例。如由pg基因提供之延遲果實軟化抑制造成細胞壁中果膠分子斷裂之聚半乳糖醛酸酶的生成，且因此造成果實延遲軟化。再者，acc基因之延遲果實熟化 /老化用於抑制天然acc合成酶基因的正常表現，從而導致乙烯減少生成及果實熟化延遲。然而，accd基因使果實熟化激素乙烯之前驅物代謝，從而導致果實熟化延遲。或者，sam-k基因藉由減少生成乙烯之反應物S-腺苷甲硫胺酸(SAM)而造成熟化延遲。如由cspB基因提供之乾旱壓力耐受性表現型係藉由保留RNA穩定性及轉譯而在水壓力條件下維持正常的細胞功能。另一實例包含催化該賦予水壓力耐受性之滲透保護化合物甘胺酸甜菜鹼產生的EcBetA基因。此外，RmBetA基因催化該賦予水壓力耐受性之滲透保護化合物甘胺酸甜菜鹼的產生。藉由與一或多種內源性轉錄因子相互作用以調控植物之日/夜生理過程的蛋白質之bbx32基因的表現來提供光合作用及產率的提高。可藉由編碼熱穩定α-澱粉酶之amy797E基因的表現來增加乙醇的生成，該酶藉由增加降解澱粉時所用之澱粉酶的熱穩定性而提高生物乙醇的生成。最後，可藉由編碼二氫吡啶二羧酸酯合成酶之cordapA基因的表現來產生經修飾之胺基酸組成物，而該酶增加了胺基酸離胺酸的生成。上列農藝性狀編碼序列列表並不意欲為限制性的。任何農藝性狀編碼序列皆為本發明所涵蓋。
4.DNA結合蛋白
多種DNA結合蛋白編碼序列為轉殖基因性狀之具體例。例示性DNA結合蛋白編碼序列為本技藝中已知的。作為可操作地連接於本發明之調控組件之DNA結合蛋白編碼序列的具體例，可包括以下類型的DNA結合蛋白：鋅指、Talens、CRISPRS及大範圍核酸酶。上列DNA結合蛋白編碼序列列表並不意欲為限制性的。任何DNA結合蛋白編碼序列皆為本發明所涵蓋。
5.小RNA
多種小RNAs為轉殖基因性狀之具體例。例示性小RNA性狀為本技藝中已知的。提供以下性狀作為可操作地連接至本發明之調控組件的小RNA編碼序列的具體例。舉例而言，延遲果實熟化/老化之抗efe小RNA經由編碼乙烯形成酶之ACO基因的沉默來抑制乙烯生成而延遲熟化。改變木質素生成之ccomt小RNA藉由抑制內源性S-腺苷-L-甲硫胺酸：反式咖啡醯基CoA 3-O-甲基轉移酶(CCOMT基因)而減少癒創木基(G)木質素之含量。再者，野生種馬鈴薯(Solanum verrucosum)中之黑斑傷痕耐受性可藉由Ppo5小RNA觸發Ppo5轉錄體降解以阻斷黑斑傷痕出現而減少。包括在內的還有與含有西方玉米根蟲Snf7基因之240bp片段的dsRNA一起抑制西方玉米根蟲之dvsnf7小RNA。修飾澱粉/碳水化合物可由諸如pPhL小RNA(降解PhL轉錄體以限制經由澱粉降解形成還原糖)及pR1小RNA(降解R1轉錄體以限制經由澱粉降解形成還原糖)之小RNA而產生。此外，由觸發Asn1降解以削弱天冬醯胺形成及減少聚丙烯醯胺之asn1小RNA產生諸如丙烯醯胺減少之益處。最後，pgas ppo抑制小RNA之非褐變表現型抑制PPO，從而產生具有非褐變表現型的蘋果。上列小RNA清單並不意欲為限制性的。任何小RNA編碼序列皆為本發明所涵蓋。
6.可篩選標記
亦描述為報告基因之多種可篩選標記為轉殖基因性狀之具體例。有許多方法可用於確認可篩選標記在經轉形植物中的表現，包括(例如)DNA定序及PCR(聚合酶鏈鎖反應)、南方墨點法、RNA墨點法、用於偵測由載體表現之蛋白質的免疫方法。但是，報告基因通常係經由目視觀察在表現時會產生有色產物之蛋白質來進行觀察。例示性報告基因在本技藝中是已知的，其編碼β-葡糖醛酸酶(GUS)、螢光 素酶、綠色螢光蛋白(GFP)、黃色螢光蛋白(YFP、Phi-YFP)、紅色螢光蛋白(DsRFP、RFP等)、β-半乳糖苷酶及其類似物(參見Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Press,N.Y.,2001，其內容係以全文引用的方式併入本文中)。
可篩選標記基因係用於篩選經轉形的細胞或組織。可篩選標記基因包括編碼抗生素抗性之基因，諸如編碼新黴素磷酸轉移酶II(NEO)、大觀黴素/鏈黴素抗性(AAD)及潮黴素磷酸轉移酶(HPT或HGR)之基因以及賦予對除草化合物之抗性的基因。除草劑抗性基因一般編碼對除草劑不敏感的經修飾目標蛋白或在除草劑可起作用之前使其在植物中降解或脫毒之酶。舉例而言，已經藉由使用編碼突變型目標酶5-烯醇丙酮醯莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)之基因而獲得對於草甘膦的抗性。EPSPS之基因及突變體為所熟知的，且進一步描述於下文中。已經藉由使用編碼PAT或DSM-2、腈水解酶、AAD-1或AAD-12(其各自為使其各自的除草劑脫毒之蛋白質的實例)之細菌基因而獲得對於草銨膦、溴苯腈及2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-D)之抗性。
在一個具體例中，除草劑可抑制生長點或分生組織，包括咪唑啉酮或磺醯脲，且此等除草劑之乙醯羥基酸合成酶(AHAS)及乙醯乳酸合成酶(ALS)的抗性/耐受性基因是所熟知的。草甘膦抗性基因分別包括突變的5-烯醇丙酮醯莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP)及dgt-28基因(經由導入重組核酸及/或天然EPSP基因之各種形式的體內突變誘發)、aroA基因及草甘膦乙醯基轉移酶(GAT)基因。其他膦醯基化合物之抗性基因包含來自於鏈黴菌屬(包含吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)及綠色產色鏈黴菌(Streptomyces viridichromogenes))之bar及pat基因，及吡啶氧基或苯氧基丙酸及環己酮(ACC酶抑制劑編 碼基因)。賦予對環己二酮及/或芳氧基苯氧基丙酸(包含精吡氟氯禾靈、禾草靈、芬殺草、吡氟禾草靈、喹禾靈)之抗性的例示性基因包含乙醯輔酶A羧化酶(ACC酶)之基因；Accl-S1、Accl-S2及Accl-S3。在一個具體例中，除草劑可抑制光合作用，包含三装(psbA及1s+基因)或苯甲腈(腈水解酶基因)。再者，此類可篩選標記可包括陽性選擇標記(諸如磷酸甘露糖異構酶(PMI))。
在一個具體例中，可篩選標記基因包括(但不限於)編碼以下之基因：2,4-D；新黴素磷酸轉移酶II；氰胺水合酶；天冬胺酸激酶；二氫吡啶二羧酸酯合成酶；色胺酸脫羧酶；二氫吡啶二羧酸酯合成酶及脫敏的天冬胺酸激酶；bar基因；色胺酸脫羧酶；新黴素磷酸轉移酶(NEO)；潮黴素磷酸轉移酶(HPT或HYG)；二氫葉酸還原酶(DHFR)；草丁膦乙醯轉移酶；2,2-二氯丙酸去鹵酶；乙醯羥基酸合成酶；5-烯醇丙酮醯莽草酸-磷酸合成酶(aroA)；鹵芳基腈水解酶；乙醯輔酶A羧化酶；二氫葉酸合成酶(sul I)；及32kD的光反應系統II多肽(psbA)。具體例亦包括編碼對以下各物之抗性的可篩選標記基因：氯黴素；甲胺喋呤；潮黴素；大觀黴素；溴苯腈；草甘膦；及草丁膦。上列可篩選標記基因列表並不意欲為限制性的。任何報告基因或可篩選標記基因皆為本發明所涵蓋。
在一些具體例中，編碼序列經合成以便在植物中有最佳的表現。例如，在一個具體例中，基因之編碼序列已藉由密碼子優化而經修飾，以增強在植物中的表現。殺蟲劑抗性轉殖基因、除草劑耐受性轉殖基因、氮利用效率轉殖基因、水分使用效率轉殖基因、營養品質轉殖基因、DNA結合轉殖基因或可篩選標記轉殖基因可經優化以在特定植物品種中表現，或替代性地可經修飾以便在雙子葉或單子葉 植物中有最佳的表現。植物較佳密碼子可自所關注的特定植物品種中有最大表現量的蛋白質中所出現頻率最高的密碼子來判定。在一個具體例中，編碼序列、基因或轉殖基因經設計在植物中以更高的程度來表現，從而產生更高的轉形效率。對於植物基因優化的方法是所熟知的。關於合成DNA序列之優化及生成的指導可見於，例如WO2013016546、WO2011146524、WO1997013402、美國專利第6166302號及美國專利第5380831號，其係以引用方式併入本文中。
在其他具體例中，性狀可包括非轉殖基因性狀，諸如原生性狀或內源性性狀。例示性原生性狀可包括產量性狀、疾病抗性性狀、害蟲抗性性狀、除草劑耐受性的耐受能力性狀、生長性狀、尺寸性狀、生物質生產率性狀、產生種子的量的性狀、鹽度抗性性狀、熱應激抗性性狀、冷應激抗性性狀、乾旱應激抗性性狀、雄性不育性狀、蠟狀澱粉性狀、經修飾之脂肪酸代謝性狀、經修飾之植酸代謝性狀、經修飾之碳水化合物代謝性狀、經修飾之蛋白質代謝性狀以及此類性狀之任何組合。
在其他具體例中，例示性原生性狀可包括早期活力、應力耐受性、乾旱耐受性、提高的營養物使用效率、提高之根質量以及提高之水使用效率。額外例示性原生性狀可包括對真菌、細菌及病毒病原體之抗性、植物昆蟲抗性；改良之花尺寸、改良之花數目、改良之花色素沉著及形狀、改良之葉數目、改良之葉色素沉著及形狀、改良之種子數目、改良之葉及花圖案及分佈、改良之節點之間的莖長度、改良之根質量及根發育特徵，以及提高之乾旱、鹽及抗生素耐受性。果實特異性原生性狀包括提高之番茄紅素含量、提高之來源於番茄紅素(包括胡蘿蔔素、花青素苷及葉黃素)之代謝物的含量、提高之維生素 A含量、提高之維生素C含量、提高之維生素E含量、改良之果實色素沉著及形狀、改良之果實熟化特徵、果實對真菌、細菌及病毒病原體之抗性、果實對昆蟲之抗性、改良之果實尺寸以及改良之果實紋理，例如可溶性固體、總固體及細胞壁組分。
在一個態樣中，原生性狀可對特定作物具有特異性。玉米中的例示性原生性狀可包括美國專利第9,288,955號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。大豆中之例示性原生性狀可包括美國專利第9,313,978號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。棉花中的例示性原生性狀可包括美國專利第8,614,375號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。高樑中的例示性原生性狀可包括美國專利第9,080,182號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。小麥中的例示性原生性狀可包括美國專利申請案第2015/0040262號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。小麥中之例示性原生性狀可包括美國專利第8,927,833號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。蕓薹屬植物中之例示性原生性狀可包括美國專利第8,563,810號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。菸草植物中之例示性原生性狀可包括美國專利第9,096,864號中所述之性狀，其以全文引用的方式併入本文中。
在另一態樣中，例示性多態性標記物可包括藉由諸如以下技術獲得之遺傳標記物特徵：限制性片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態DNA(RAPD)、隨機引子聚合酶鏈反應(AP-PCR)、DNA擴增指紋識別(DAF)、序列特徵性擴增區域(SCAR)、擴增片段長度多態性(AFLP)、亦稱為小型隨體之簡單重複序列(SSR)或單核苷酸多態性(SNP)。舉例而言，參見Cregan等人(1999)「An Integrated Genetic Linkage Map of the Soybean Genome」Crop Science 39：1464-1490，及Berry等人(2003)「Assessing Probability of Ancestry Using Simple Sequence Repeat Profiles：Applications to Maize Inbred Lines and Soybean Varieties」Genetics 165：331-342，其各自以全文引用之方式併入本文中。
用多態性標記物限定之遺傳圖譜亦可與所揭示之方法一起使用。此標記物輔助選擇或標記物輔助育種方法涉及藉由測定多態性標記物與性狀/對偶基因的共同遺傳頻率將多態性標記物與所需性狀或對偶基因連鎖。一旦發現與目標性狀一起高頻率遺傳的多態性標記物，則其可用作分子探針來篩選生物體之DNA文庫，以鑑別編碼同源基因或定量性狀基因座之DNA片段。標記物輔助選擇或標記物輔助育種的一個主要困難在於各物種之間且甚至既定物種中基因組的不同區域之間遺傳距離與物理距離之間的關係可變化。因此，分子標記物可顯示與目標性狀基因座之絕對連鎖，但其可與所關注的實際基因物理上相距幾十萬個鹼基。此使得難以鑑別及基因滲入負責性狀之實際基因，因為為了鑑別性狀/對偶基因，可能有成片的DNA需要評估。另外，可以定位超過一個顯示與目標性狀基因座之絕對連鎖的多態性標記物。然而，使用合理種群尺寸，不能鑑別出哪一個標記物與目標基因物理上更接近。因此，儘管一個標記物可與目標基因相距10千鹼基並且其他與目標基因相距400千鹼基，但使用依賴於天然水準之重組頻率的習知方法，可能無法區分兩個標記物中的哪一個應用於最高效地選殖目標基因。因此，基於圖譜之選殖計劃將有益於利用本發明方法來提供升高的重組水準，從而在測定多態性標記物與目標性狀基因座之間的遺傳距離時提高精確度。
使用多態性執行遺傳多態性標記物特徵之方式在本技藝中所熟知。SSR、RFLP、RAPD、AP-PCT、DAF、SCAR、AFLP以及SNP為基於重複核苷酸序列(諸如小型隨體)之多態性的遺傳標記物。多態性可係指基因組內的單個核苷酸交換，或二、三或四核苷酸重複。基因型之間的重複區域長度可能有變化，而側接重複序列之DNA保守使得引子將在複數個基因型中起作用。兩個基因型之間的多態性代表兩個側接保守DNA序列之間不同長度的重複序列。基於SSR、RFLP、RAPD、AP-PCT、DAF、SCAR、AFLP或SNP之標記物系統在相對於可能存在多個對偶基因之其他標記物系統的連鎖分析中可高度提供資訊。此類型之標記物的另一優勢在於藉由使用側接引子，可例如藉由聚合酶鏈鎖反應(PCR)實現多態性標記物的偵測。藉由使用兩個側接多態性之多態性區段隨後是DNA擴增的寡核苷酸引子來進行PCR偵測。此步驟涉及DNA熱變性，隨後在低溫下將引子黏接至其互補序列，且使用DNA聚合酶延長黏接之引子的週期。在擴增之後在瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠上尺寸分離DNA片段包含該方法之主要部分。此類選擇及篩選方法為熟悉本技藝者所熟知。可用於鑑別轉殖基因植物之分子確認方法為熟悉本技藝者已知的。下文進一步描述若干例示性方法。
已針對用於序列偵測(諸如多態性序列、性狀或對偶基因)來描述分子信標。簡言之，設計一個FRET寡核苷酸探針以與側接基因組及插入DNA接合點重疊。FRET探針之獨特結構使其含有保持螢光部分及淬滅部分緊密接近之二級結構。該FRET探針及PCR引子(插入DNA序列中的一個引子及側接基因組序列中的一個引子)在熱穩定聚合酶及dNTP的存在下進行循環。在成功PCR擴增之後，FRET探針與目標序列之雜交導致探針二級結構被移除以及該螢光部分與淬滅 部分之空間分離。螢光信號指示因成功擴增與雜交而存在的側接基因組/轉殖基因插入序列。此類用於以擴增反應形式偵測之分子信標測定為本發明之一具體例。
水解探針分析(或稱為TAQMAN®(Life Technologies,Foster City,Calif.))為一種偵測及定量DNA序列(諸如多態性序列)、性狀或對偶基因之存在的方法。簡言之，FRET寡核苷酸探針設計成在轉殖基因內具有一個寡核苷酸以及在側接基因組序列中具有一個寡核苷酸用於事件特異性偵測。該FRET探針及PCR引子(插入DNA序列中的一個引子及側接基因組序列中的一個引子)在熱穩定聚合酶及dNTP的存在下進行循環。FRET探針的雜交導致FRET探針上之螢光部分裂解及釋放而離開淬滅部分。螢光信號指示出因成功擴增及雜交而存在的側接/轉殖基因插入序列。此類用於以擴增反應形式偵測之水解探針測定為本發明之一個具體例。
KASPar®分析為一種偵測及定量DNA序列(諸如多態性序列)、性狀或對偶基因之存在的方法。簡言之，包含經整合之基因表現卡匣聚核苷酸的基因組DNA樣本使用稱為KASPar®分析系統之基於聚合酶鏈鎖反應(PCR)的分析法來進行篩選。用於實施本發明之KASPar®測定可利用一種含有多個引子之KASPar® PCR測定混合物。用於該PCR測定混合物中的引子可包含至少一個正向引子及至少一個反向引子。該正向引子含有對應於該DNA聚核苷酸的一個特定區域之序列，而該反向引子含有對應於該基因組序列的一個特定區域之序列。另外，用於PCR測定混合物之引子可包含至少一個正向引子及至少一個反向引子。舉例而言，該KASPar® PCR分析混合物可使用對應於兩個不同對偶基因之兩個正向引子以及一個反向引子。該等正向引子中 之一者含有一個對應於該內源性基因組序列之特定區域的序列。第二個正向引子含有一個對應於該DNA聚核苷酸的一個特定區域的序列。該反向引子含有對應於該基因組序列的一個特定區域的序列。此類用於以擴增反應形式偵測之KASPar®測定為本發明之一個具體例。
在一些具體例中，螢光訊號或螢光染料係選自由以下組成之群：HEX螢光染料、FAM螢光染料、JOE螢光染料、TET螢光染料、Cy 3螢光染料、Cy 3.5螢光染料、Cy 5螢光染料、Cy 5.5螢光染料、Cy 7螢光染料及ROX螢光染料。
在其他具體例中，擴增反應使用適合的第二螢光DNA染料進行，該染料能夠以可被流式細胞儀偵測之濃度範圍對細胞的DNA染色，且具有可被即時熱循環儀偵測之螢光發射光譜。本技藝中具有通常知識者應瞭解到其他核酸染料是已知的且不斷被鑑別出來。可採用具有適當激發及發射光譜之任何適宜核酸染料，諸如YO-PRO-1®、SYTOX Green®、SYBR Green I®、SYTO11®、SYTO12®、SYTO13®、BOBO®、YOYO®及TOTO®。
在其他具體例中，次世代定序(NGS)可用於偵測序列(諸如多態性序列)、性狀或對偶基因。如由Brautigma等人於2010年所描述，DNA序列分析可用以測定經分離及擴增的片段之核苷酸序列。經擴增的片段可經分離及再選殖至載體中，且使用鏈終止物方法(亦稱為桑格定序(Sanger sequencing))或染料終止物定序來定序。另外，擴增物可用次世代定序技術來定序。NGS技術不需要再選殖步驟，且可在單一反應中完成多個定序讀序。有三個NGS平台在市場上可以購得，即來自454 Life Sciences/Roche之Genome Sequencer FLXTM、來自Solexa之Illumina Genome AnalyserTM及Applied Biosystems的SOLiDTM (「Sequencing by Oligo Ligation and Detection(以寡核苷酸連接與偵測方式定序)」的縮寫)。另外，有兩種目前正在開發的單分子定序方法。此等方法包括來自Helicos BioscienceTM的true Single Molecule Sequencing(tSMS，真正單一分子定序)及來自Pacific Biosciences的Single Molecule Real TimeTM sequencing(SMRT，單一分子即時DNA定序)。
由454 Life Sciences/Roche進行銷售的Genome Sequencher FLXTM為一種長讀序NGS，其使用乳化PCR及焦磷酸定序以產生定序讀序片段。可使用300-800bp的DNA片段或含有3-20kb片段的基因庫。對於250至400百萬鹼基之總產量而言，該等反應每次運行可產生超過一百萬個約250至400個鹼基的讀序片段。此技術產生最長的讀序片段，但每次運行的總序列輸出與其他NGS技術相比是較低的。
由SolexaTM進行銷售的Illumina Genome AnalyserTM為一種短讀序NGS，其定序是基於固相橋式PCR，藉由使用以螢光染料標記之可逆性終止核苷酸的合成方法來進行。可使用含有長達10kb之DNA片段的雙端定序基因庫構建體。該等反應產生超過一億個長度為35-76個鹼基之短讀序片段。此資料每次運行可產生30-60億鹼基。
由Applied BiosystemsTM進行銷售的Sequencing by Oligo Ligation and Detection(SOLiD)系統為一種短讀序技術。此NGS技術使用了長度達10kb之片斷化雙股DNA。該系統藉由接合經染料標記之寡核苷酸引子以及乳化PCR產生十億個短讀序片段來進行定序，每次運行產生多達300億鹼基之總序列輸出。
Helicos BioscienceTM的tSMS及Pacific BiosciencesTM之 SMRT應用不同的方式，使用單個DNA分子進行序列反應。tSMS HelicosTM系統每次運行產生多達8億個短讀序片段而得到210億鹼基。此等反應使用經螢光染料標記的虛擬終止核苷酸來完成，其被稱為「以合成方式定序」之方法。
由Pacific BiosciencesTM進行銷售的SMRT次世代定序系統係以合成方式進行即時定序。此技術由於不受可逆式終止物的限制，而可產生多達1,000bp長之讀序片段。使用此技術每天可產生相當於二倍體人類基因組之一倍覆蓋度的原始讀取通量。
在其他具體例中，本發明中包括例示性對偶基因。多態性因此稱為對偶基因，因為由於存在多態性，物種的一些成員可具有「標準」序列(即標準「對偶基因」)，而其它成員可具有變異序列(即變異「對偶基因」)。因此，如本文所用，對偶基因為染色體上特定位置處的基因或其它遺傳區域的兩個或更多個替代型式中之一者。在最簡單的情況下，可存在僅一個變異序列，且多態性因此稱為雙對偶基因的。在其他狀況下，物種之種群可含有多個對偶基因，且多態性稱為三對偶基因的等。
編碼性狀或遺傳區域之單個基因可具有多個不同的不相關多態性。舉例而言，其可具有一個位點處之一個雙對偶基因多態性，另一位點處之另一雙對偶基因多態性及另一位點處之多對偶基因多態性。當植物中之染色體基因座處之對偶基因群的全部序列相同時，對偶基因稱為在該基因座處同型接合。當植物中特定基因座處之任何對偶基因的序列不同時，對偶基因之群體稱為在該基因座處異型接合。在一個具體例中，基因座可以異型接合基因座形式存在於植物基因組中。在另一具體例中，基因座可包含以異型接合性狀形式存在於植物 基因組中的性狀。在另一具體例中，基因座可包含以異型接合對偶基因形式存在於植物基因組中的對偶基因在另一具體例中，基因座可包含以異型接合多態性標記物形式存在於植物基因組中的多態性標記物。
在另一態樣中，本發明係關於所需性狀。在一個具體例中，所需性狀可與另一非所需性狀緊密連鎖。植物育種者決定那一性狀為所需的且那一性狀為非所需的。一般而言，植物育種者之目標為產生具有所需性狀且不具有非所需性狀的子代植物。本發明之方法提供克服兩個此類性狀之間的緊密遺傳連鎖(即一種所需性狀與一種非所需性狀遺傳連鎖)之解決方案。所需性狀與非所需性狀之遺傳連鎖導致兩種性狀遺傳至子代植物中，且通常稱為連鎖累贅。在一個具體例中，所需性狀可為原生性狀。在另一具體例中，所需性狀可為轉殖基因性狀。在一個具體例中，非所需性狀可為原生性狀。在另一具體例中，非所需性狀可為轉殖基因性狀。
例示性非所需性狀可包括降低之產量性狀、降低之疾病抗性性狀、降低之害蟲抗性性狀、降低之除草劑耐受性的耐受能力性狀、減慢之生長性狀、降低之尺寸性狀、降低之生物質產量性狀、降低之產生種子的量的性狀、降低之鹽度抗性性狀、降低之熱應激抗性性狀、降低之冷應激抗性性狀、降低之乾旱應激抗性性狀、雄性不育性狀、蠟狀澱粉性狀、經修飾之脂肪酸代謝性狀、經修飾之植酸代謝性狀、經修飾之碳水化合物代謝性狀、經修飾之蛋白質代謝性狀以及此類性狀之任何組合。
例示性所需性狀可包括提高之產量性狀、提高之疾病抗性性狀、提高之害蟲抗性性狀、提高之除草劑耐受性的耐受能力性狀、 加快之生長性狀、提高之尺寸性狀、提高之生物質產量性狀、增加之產生種子的量的性狀、提高之鹽度抗性性狀、提高之熱應激抗性性狀、提高之冷應激抗性性狀、提高之乾旱應激抗性性狀、雄性不育性狀、蠟狀澱粉性狀、經修飾之脂肪酸代謝性狀、經修飾之植酸代謝性狀、經修飾之碳水化合物代謝性狀、經修飾之蛋白質代謝性狀以及此類性狀之任何組合。
在另一態樣中，本發明係關於一種選擇隱性性狀且在子代植物中隔離此等性狀與顯性性狀的方法。在一個具體例中，隱性性狀可以與顯性性狀的異型接合性狀形式存在於植物基因組中。植物育種者可決定產生具有隱性性狀之子代植物。本發明之方法提供將隱性性狀傳代至子代植物中的解決方案。舉例而言，可向顯性性狀中特異性引入雙股斷裂，使得僅隱性性狀傳代至子代植物。在一個具體例中，第一對偶基因可編碼顯性性狀且第二對偶基因可編碼隱性性狀。在其他具體例中，向顯性性狀中引入雙股斷裂之方法導致產生含有隱性性狀之子代植物。
在另一態樣中，本發明係關於一種選擇顯性性狀且在子代植物中隔離此等性狀與隱性性狀的方法。在一個具體例中，顯性性狀可以與隱性性狀的異型接合性狀形式存在於植物基因組中。植物育種者可決定產生具有顯性性狀之子代植物。本發明之方法提供將顯性性狀傳代至子代植物中的解決方案。舉例而言，可向隱性性狀中特異性引入雙股斷裂，使得僅顯性性狀傳代至子代植物。在一個具體例中，第一對偶基因可編碼隱性性狀且第二對偶基因可編碼顯性性狀。在其他具體例中，向隱性性狀中引入雙股斷裂之方法導致產生含有顯性性狀之子代植物。
在其他態樣中，基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)可位於染色體上的特定位置。在一些具體例中，染色體上第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可以隔開，使得第一基因座與第二基因座物理上分離。在一個具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可在0.01cM至500cM範圍內。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少0.01cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少0.05cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少0.1cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少0.2cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少0.3cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少0.4cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少0.5cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記 物)之間的距離可為至少0.6cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少0.7cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少0.8cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少0.9cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少1.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少2.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少3.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少4.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少5.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少6.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少7.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距 離可為至少8.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少9.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少10.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少11.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少12.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少13.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少14.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少15.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少16.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少17.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少18.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性 標記物)之間的距離可為至少19.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少20.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少25.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少30.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少35.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少40.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少45.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少50.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少55.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少60.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少65.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、 性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少70.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少75.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少80.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少85.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少90.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少95.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少100.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少125.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少150.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少175.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少200.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包 括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少225.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少250.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少275.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少300.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少325.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少350.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少375.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少400.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少425.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少450.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少475.0cM。在具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與 第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少499.0cM。
在一個態樣中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可在10bp至10Mbp範圍內。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少10bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少20bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少30bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少40bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少50bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少60bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少70bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少80bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀 及/或多態性標記物)之間的距離可為至少90bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少100bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少200bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少300bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少400bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少500bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少600bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少700bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少800bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少900bp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少1Kbp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或 多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少10Kbp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少100Kbp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少1,000Kbp。在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的距離可為至少1Mbp。
在傳統遺傳學中，兩個不同遺傳基因座之間的重組頻率用作特定染色體上此等基因座之間遺傳距離之量度。任何兩個基因座之間的最大重組頻率為50%，基因在非同源染色體上且獨立混合事將觀測到相同值。當染色體上之基因相隔的距離使得它們之間幾乎始終存在至少一個交換時，重組頻率為50%。在一個態樣中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)與第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)之間的重組頻率可在1%至50%範圍內。在其他具體例中，重組頻率可為至少1%。在其他具體例中，重組頻率可為至少2%。在其他具體例中，重組頻率可為至少3%。在其他具體例中，重組頻率可為至少4%。在其他具體例中，重組頻率可為至少5%。在其他具體例中，重組頻率可為至少6%。在其他具體例中，重組頻率可為至少7%。在其他具體例中，重組頻率可為至少8%。在其他具體例中，重組頻率可為至少9%。在其他具體例中，重組頻率可為至少10%。在其他具體例中，重組頻率可為至少15%。在其他具體例中，重組頻率可為至少20%。在其他具體例中，重組頻率可為至少22.5%。在其 他具體例中，重組頻率可為至少25%。在其他具體例中，重組頻率可為至少27.5%。在其他具體例中，重組頻率可為至少30%。在其他具體例中，重組頻率可為至少32.5%。在其他具體例中，重組頻率可為至少35%。在其他具體例中，重組頻率可為至少37.5%。在其他具體例中，重組頻率可為至少40%。在其他具體例中，重組頻率可為至少42.5%。在其他具體例中，重組頻率可為至少45%。在其他具體例中，重組頻率可為至少47.5%。在其他具體例中，重組頻率可為至少49%。
在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)可位於第一染色體上之特定位置處，且染色體上之第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)可位於與第一染色體非同源之第二染色體上的特定位置處。
在其他具體例中，第一基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)可位於第一同源染色體上之特定位置處，且染色體上之第二基因座(包括對偶基因、性狀及/或多態性標記物)可位於第二同源染色體上之特定位置處。
在一個態樣中，本發明係關於植物基因組。作為本發明之一個具體例，基因組含有同源染色體。在重組期間，即在減數分裂或有絲分裂中，沿同源染色體之不同基因座將重組，由此導致各基因座之間的遺傳隔離。通常，同源染色體上之基因座將視兩個基因座之間的物理距離而獨立地隔離。兩個基因座之間的距離越大，基因座在子代植物中隔離之可能性將越高。相反，若兩個基因座彼此靠近，則基因座在子代植物中將不太可能隔離。此類基因座(即彼此靠近的基因座)在本領域中描述為遺傳連鎖的。植物育種者可能需要藉由在兩個同源染色體中之僅一者中引入雙股斷裂來提高兩個遺傳連鎖之基因座之 間的遺傳重組頻率。在一個具體例中，父系同源染色體用位點特異性核酸酶裂解，在僅父系同源染色體中引入雙股斷裂，而母系同源染色體不使用位點特異性核酸酶裂解。在另一具體例中，母系同源染色體用位點特異性核酸酶裂解，在僅母系同源染色體中引入雙股斷裂，而父系同源染色體不使用位點特異性核酸酶裂解。
在一個態樣中，本發明係關於多倍體植物基因組。許多植物具有含超過兩個同源染色體副本之複雜基因組。舉例而言，玉米、西紅柿、高樑及稻穀通常為二倍體；香蕉及西瓜通常為三倍體；硬粒小麥、棉花及馬鈴薯通常為四倍體；麵包小麥及獼猴桃通常為六倍體；且草莓及甘蔗通常為八倍體。植物育種者可能需要藉由在多倍體植物物種中存在的許多同源染色體中之僅一者中引入雙股斷裂來提高兩個遺傳連鎖之基因座之間的遺傳重組頻率。在一個具體例中，第一染色體用位點特異性核酸酶裂解以在多倍體植物物種中存在的許多同源染色體中之僅一者中引入雙股斷裂，而其他同源染色體不使用位點特異性核酸酶裂解。在一個具體例中，與裂解之同源染色體的雙股斷裂靠近之基因座之間的重組頻率提高，使得兩個連鎖之基因座之間的遺傳重組頻率由於多倍體植物物種中存在的許多同源染色體中之僅一者中產生的雙股斷裂而提高。在另一具體例中，兩個連鎖之基因座之間的遺傳連鎖由於在多倍體植物物種中存在的許多同源染色體中之僅一者中產生的雙股斷裂而中斷。在另一具體例中，兩個連鎖之基因座之間的連鎖由於在多倍體植物物種中存在的許多同源染色體中之僅一者中產生的雙股斷裂而遭到破壞。
在另一態樣中，本發明係關於用於引入雙股DNA斷裂之位點特異性核酸酶。根據一個具體例，位點特異性核酸酶可包括鋅 指核酸酶(ZFN)，其用於在靶向基因組基因座中引入雙股斷裂以促進所關注之核酸插入。可例如根據美國專利6,453,242中揭示之方法實現所選基因組基因座內供鋅指結構域結合之目標位點的選擇，該專利亦揭示用於設計結合於所選序列之鋅指蛋白質(ZFP)的方法。熟悉本技藝者應瞭解，亦可簡單目測核苷酸序列來選擇目標位點。因此，本文所述之方法中可使用任何目標位點選擇方式。
對於ZFP DNA結合域，目標位點一般由複數個相鄰目標亞位點構成。目標亞位點係指核苷酸三聯體或核苷酸四聯體之序列，其可與經個別鋅指結合之相鄰四聯體重疊一個核苷酸。參見例如WO 02/077227，其揭示內容併入本文中。目標位點的長度一般為至少9個核苷酸，且因此經包含至少三個鋅指之鋅指結合域結合。然而，例如4-指結合域與12-核苷酸目標位點、5-指結合域與15-核苷酸目標位點或6-指結合域與18-核苷酸目標位點之結合亦可能。如將顯而易知，較大結合域(例如7-、8-、9-指及更高)與較長目標位點之結合亦符合本發明。
根據一個具體例，目標位點不必為多個三核苷酸。在發生交叉股相互作用之情況中(參見例如美國專利6,453,242及WO 02/077227)，多指結合域之一或多個個別鋅指可結合於重疊四聯體亞位點。因此，三指蛋白質可結合10-核苷酸序列，其中第十核苷酸為經末端指結合之四聯體部分，四指蛋白質可結合13-核苷酸序列，其中第十三核苷酸為經末端指結合之四聯體部分。
多指結合域中之個別鋅指之間的胺基酸連接子序列之長度及性質亦影響與目標序列之結合。舉例而言，多指結合域中之相鄰鋅指之間存在所謂「非典型連接子」、「長連接子」或「結構性連接 子」可允許該等指結合不緊鄰之亞位點。此類連接子之非限制性實例描述於例如美國專利No.6,479,626及WO 01/53480中。因此，鋅指結合域之目標位點中的一或多個亞位點可彼此相隔1、2、3、4、5個或更多個核苷酸。一個非限制性實例將為結合於13-核苷酸目標位點之四指結合域，該目標位點的序列中包含兩個連續3-核苷酸亞位點、一個插入核苷酸及兩個連續三聯體亞位點。
而從自然界中存在之蛋白質鑑別的DNA結合多肽通常結合於不連續核苷酸序列或基元(例如共有識別序列)，本技藝中現有且已知用於修飾許多此類DNA結合多肽以識別不同核苷酸序列或基元之方法。DNA結合多肽包括(例如但不限於)鋅指DNA結合域；白胺酸拉鏈；UPA DNA結合域；GAL4；TAL；LexA；Tet抑制子；LacR；以及類固醇激素受體。
在一些實例中，DNA結合多肽為鋅指。個別鋅指基元可設計成目標且特異性結合於大範圍DNA位點中之任一者。典型Cys2His2(以及非典型Cys3His)鋅指多肽藉由向目標DNA雙螺旋之大溝中插入α-螺旋來結合DNA。鋅指識別DNA為模塊，各指主要接觸目標中的三個連續鹼基對，且多肽中之幾個關鍵殘基介導識別。藉由在靶向核酸內切酶中納入多個鋅指DNA結合域，靶向核酸內切酶之DNA結合特異性可進一步提高(且因此由此帶來的任何基因調節作用的特異性亦可提高)。參見例如Urnov等人(2005)Nature 435：646-51。因此，可工程改造且利用一或多個鋅指DNA結合多肽使得引入至宿主細胞中之靶向核酸內切酶與宿主細胞之基因組內單一DNA序列相互作用。參見例如Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20：135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.19：656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416；美國專利第6,453,242號；第6,534,261號；第6,599,692號；第6,503,717號；第6,689,558號；第7,030,215號；第6,794,136號；第7,067,317號；第7,262,054號；第7,070,934號；第7,361,635號；第7,253,273；以及美國專利公開案第2005/0064474號；第2007/0218528號；第2005/0267061號，其均以全文引用之方式併入本文中。
經工程改造之鋅指結合域與天然存在的鋅指蛋白質相比可具有新穎結合特異性。工程改造方法包括(但不限於)合理設計及多種類型之選擇。合理設計包括例如使用包含三聯體(或四聯體)核苷酸序列及個別鋅指胺基酸序列之資料庫，其中各三聯體或四聯體核苷酸序列與結合特定三聯體或四聯體序列的鋅指的一或多個胺基酸序列關聯。參見例如共同擁有之美國專利6,453,242及6,534,261，其以全文引用的方式併入本文中。
或者，DNA結合域可來源於核酸酶。舉例而言，諸如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII以及I-TevIII之歸巢核酸內切酶及大範圍核酸酶的識別序列為已知的。亦參見美國專利第5,420,032號；美國專利第6,833,252號；Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Dujon等人(1989)Gene 82：115-118；Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble等人(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等人(1998)J.Mol.Biol.280：345-353及New England Biolabs目錄。另外，歸巢核酸內切酶及大範圍核酸酶的DNA結合特異性可經工程改 造以結合非自然目標位點。參見例如Chevalier等人(2002)Molec.Cell 10：895-905；Epinat等人(2003)Nucleic Acids Res.31：2952-2962；Ashworth等人(2006)Nature 441：656-659；Paques等人(2007)Current Gene Therapy 7：49-66；美國專利公開案第20070117128號。
作為另一替代，DNA結合域可來源於白胺酸拉鏈蛋白質。白胺酸拉鏈是許多真核調節蛋白中之蛋白質-蛋白質相互作用中涉及的一類蛋白質，該等真核調節蛋白為與基因表現有關之重要轉錄因子。白胺酸拉鏈係指此等跨越幾個界(包括動物、植物、酵母等)之轉錄因子中共用之通用結構基元。白胺酸拉鏈由兩個多肽(均二聚體或雜二聚體)以白胺酸殘基經α-螺旋均勻間隔使得兩個多肽之白胺酸殘基在螺旋的同一面上結束的方式結合於特異性DNA序列形成。白胺酸拉鏈之DNA結合特異性可用於本文揭示之DNA結合域中。
在一些具體例中，DNA結合域是來源於植物病原體黃單孢菌屬(Xanthomonas)之TAL效應子的經工程改造結構域(參見Miller等人(2011)Nature Biotechnology 29(2)：143-8；Boch等人，(2009)Science 2009年10月29日(10.1126/science.117881)以及Moscou及Bogdanove,(2009)Science 2009年10月29日(10.1126/science.1178817；以及美國專利公開案第20110239315號、第20110145940號以及第20110301073號)。
CRISPR(成簇的、規律間隔的短回文重複序列)CAS(CRISPR相關的)核酸酶系統是基於可用於基因組工程改造的近來經工程改造之細菌系統之核酸酶系統。其部分地基於許多細菌和古細菌之適應性免疫反應。當病毒或質體侵入細菌時，侵入者的DNA區段藉由「免疫」反應轉化成CRISPR RNA(crRNA)。此crRNA接著通過部分 互補的區域與稱為tracrRNA之另一類型的RNA結合，以引導Cas9核酸酶至與目標DNA中之與crRNA同源之稱為「原型間隔子」的區域。Cas9在crRNA轉錄物內所含的20個核苷酸的引導序列所指定的位點處裂解DNA，以在DSB處產生鈍端。Cas9需要crRNA及tracrRNA以用於位點特異性DNA識別及裂解。此系統現已經工程改造以使得crRNA及tracrRNA可組合成一個分子(「單引導RNA」)，且該單引導RNA之crRNA等效部分可經工程改造以引導Cas9核酸酶引導至任何所期望的序列(參見Jinek等人(2012)Science 337，第816頁-第821頁，Jinek等人，(2013),eLife 2：e00471，及David Segal,(2013)eLife 2：e00563)。因此，CRISPR/Cas系統可經工程改造以在基因組中之所期待的目標處形成雙股斷裂(DSB)，且通過修復抑制劑的使用而影響DSB的修復，從而增加容易出錯的修復。其他CRISPR Cas系統為本技藝中已知的且包括CRISPR CasX、CRIXPR CasY、CRISP Cpf1以及其類似作用的酶。
在某些具體例中，Cas蛋白質可以是天然存在的Cas蛋白質的「功能衍生物」。原生序列多肽之「功能衍生物」為具有與原生序列多肽相同之定性生物學特性的化合物。「功能衍生物」包括(但不限於)原生序列之片段及原生序列多肽及其片段之衍生物，限制條件為其具有與相應原生序列多肽相同之生物活性。本文涵蓋之生物活性為功能衍生物將DNA受質水解成片段之能力。術語「衍生物」涵蓋多肽之胺基酸序列變異體、共價修飾及其融合物。Cas多肽或其片段之適合衍生物包括(但不限於)Cas蛋白質或其片段之突變體、融合物、共價修飾。包括Cas蛋白質或其片段以及Cas蛋白質或其片段之衍生物的Cas蛋白質可自細胞獲得或化學合成或藉由組合此等兩個程序獲得。細胞 可為天然產生Cas蛋白質之細胞，或天然產生Cas蛋白質且經基因工程改造以產生較高表現水平之內源性Cas蛋白質或自外源引入之核酸產生Cas蛋白質的細胞，該核酸編碼與內源性Cas相同或不同之Cas。在一些情況中，細胞不會天然產生Cas蛋白質且經基因工程改造產生Cas蛋白質。藉由共同表現Cas核酸酶與引導RNA在哺乳動物細胞中(且假定在植物細胞內)部署Cas蛋白質。如Le Cong,F.，等人，(2013)Science 339(6121)：819-823中所揭示，兩種形式之引導RNA可用於促進Cas介導之基因組裂解。
在其他具體例中，DNA結合域可與裂解(核酸酶)結構域關聯。舉例而言，歸巢核酸內切酶的DNA結合特異性可經修飾，同時保留核酸酶功能。另外，鋅指蛋白質亦可融合至裂解結構域形成鋅指核酸酶(ZFN)。本文所揭示之融合蛋白的裂解結構域部分可自任何核酸內切酶或核酸外切酶獲得。可以衍生出裂解結構域之例示性核酸內切酶包括(但不限於)限制性核酸內切酶及歸巢核酸內切酶。參見例如2002-2003 Catalogue,New England Biolabs,Beverly,MA；及Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388。已知裂解DNA之額外酶(例如S1核酸酶；綠豆核酸酶；胰臟DNase I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸內切酶；亦參見Linn等人(編)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。已知包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII以及I-TevIII之歸巢核酸內切酶及大範圍核酸酶的非限制性實例。亦參見美國專利第5,420,032號；美國專利第6,833,252號；Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Dujon等人(1989)Gene 82：115-118；Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127； Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble等人(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等人(1998)J.Mol.Biol.280：345-353及New England Biolabs目錄。此等酶(或其功能片段)中之一或多者可用作裂解結構域及裂解半結構域之來源。
限制性核酸內切酶(限制酶)存在於許多物種中且能夠序列特異性結合於DNA(在識別位點)，且在結合位點處或結合位點附近裂解DNA。某些限制酶(例如IIS型)在從識別位點移除之位點處裂解DNA且具有可分離結合及裂解結構域。舉例而言，IIS型酶FokI催化DNA之雙股裂解，在一股上距離其識別位點9個核苷酸處且在另一股上距離其識別位點13個核苷酸處。參見例如美國專利5,356,802；5,436,150以及5,487,994；以及Li等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4275-4279；Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2764-2768；Kim等人(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：883-887；Kim等人(1994b)J.Biol.Chem.269：31,978-31,982。因此，在一個具體例中，融合蛋白包含來自至少一種IIS型限制酶之裂解結構域(或裂解半結構域)及一或多個鋅指結合域，其可經或未經工程改造。
裂解結構域可與結合域分離之例示性IIS型限制酶為FokI。此特定酶呈二聚體時有活性。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10,570-10,575。因此，出於本發明之目的，用於所揭示之融合蛋白中的FokI酶部分視為裂解半結構域。因此，對於使用鋅指-FokI融合物的靶向雙股裂解及/或細胞序列靶向置換，可使用各自包含FokI裂解半結構域之兩個融合蛋白來復原催化活性裂解結構域。或者，亦可使用含有鋅指結合域及兩個FokI裂解半結構域之單個多肽分子。使用鋅指-FokI融合物之靶向裂解及靶向序列改變的參數提供於 本發明之別處。
裂解結構域或裂解半結構域可為保留裂解活性或保留多聚(例如二聚)形成功能裂解結構域之能力的任何蛋白質部分。例示性IIS型限制酶描述於國際公開案WO 2007/014275中，其以全文引用之方式併入本文中。
為了提高裂解特異性，裂解結構域亦可經修飾。在某些具體例中，採用裂解半結構域之變異體，此等變異體使裂解半結構域之均二聚降至最低且防止裂解半結構域之均二聚。此類經修飾之裂解半結構域的非限制性實例詳細描述於WO 2007/014275中，其以全文引用之方式併入本文中。在某些具體例中，裂解結構域包含使均二聚降至最低或防止均二聚的經工程改造之裂解半結構域(亦稱為二聚結構域突變體)。此類具體例為熟悉本技藝者已知且描述於例如美國專利公開案第20050064474號；第20060188987號；第20070305346號以及第20080131962號中，其全部揭示內容均以全文引用之方式併入本文中。FokI之位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537及538處的胺基酸殘基為影響FokI裂解半結構域之二聚的全部目標。
形成絕對雜二聚體之FokI的額外經工程改造之裂解半結構域亦可用於本文所述之ZFN中。形成絕對雜二聚體之Fok I之例示性經工程改造之裂解半結構域包括第一裂解半結構域在Fok I之胺基酸殘基位置490及538處包括突變且第二裂解半結構域在胺基酸殘基486及499處包括突變的對。在一個具體例中，490處之突變用Lys(K)置換Glu(E)；538處之突變用Lys(K)置換Iso(I)；486處之突變用Glu(E)置換Gln(Q)；且位置499處之突變用Lys(K)置換Iso(I)。特定言之，本 文所述之經工程改造之裂解半結構域藉由在一個裂解半結構域中使位置490(E→K)及538(I→K)突變以產生命名為「E490K：I538K」的經工程改造之裂解半結構域且藉由在另一裂解半結構域中使位置486(Q→E)及499(I→L)突變以產生命名為「Q486E：I499L」的經工程改造之裂解半結構域來製備。本文所述之經工程改造之裂解半結構域為絕對雜二聚體突變體，其中異常裂解降至最低或消除。參見例如美國專利公開案第2008/0131962號，其揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。在某些具體例中，經工程改造之裂解半結構域在位置486、499及496(相對於野生型FokI編號)處包含突變，例如將位置486處之野生型Gln(Q)殘基置換為Glu(E)殘基，位置499處之野生型Iso(I)殘基置換為Leu(L)殘基且位置496處之野生型Asn(N)殘基置換為Asp(D)或Glu(E)殘基的突變(分別亦稱為「ELD」及「ELE」結構域)。在其他具體例中，經工程改造之裂解半結構域在位置490、538及537(相對於野生型FokI編號)處包含突變，例如將位置490處之野生型Glu(E)殘基置換為Lys(K)殘基，位置538處之野生型Iso(I)殘基置換為Lys(K)殘基且位置537處之野生型His(H)殘基置換為Lys(K)或Arg(R)殘基的突變(分別亦稱為「KKK」及「KKR」結構域)。在其他具體例中，經工程改造之裂解半結構域在位置490及537(相對於野生型FokI編號)處包含突變，例如將位置490處之野生型Glu(E)殘基置換為Lys(K)殘基且位置537處之野生型His(H)殘基置換為Lys(K)或Arg(R)殘基的突變(分別亦稱為「KIK」及「KIR」結構域)。(參見美國專利公開案第20110201055號)。在其他具體例中，經工程改造之裂解半結構域包含「Sharkey」及/或「Sharkey'」突變(參見Guo等人，(2010)J.Mol.Biol.400(1)：96-107)。Biol.10,570-10,575。
本文所述之經工程改造之裂解半結構域可使用任何適合方法製備，例如藉由美國專利公開案第20050064474號；第20080131962號；以及第20110201055號中所述之野生型裂解半結構域(Fok I)之定點突變誘發製備。或者，核酸酶可在核酸目標位點處使用所謂「分裂酶」技術活體內裝配(參見例如美國專利公開案第20090068164號)。此類分裂酶之組分可在各別表現構築體上表現，或可在一個開放閱讀框架中連接，其中個別組分例如藉由自裂解2A肽或IRES序列來分離。組分可為個別鋅指結合域或大範圍核酸酶核酸結合域之結構域。
核酸酶可在使用之前，例如在如WO 2009/042163及20090068164中所述之基於酵母之染色體系統中針對活性進行篩選。核酸酶表現構築體使用本技藝中已知之方法容易設計。參見例如美國專利公開案20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20060063231；以及國際公開案WO 07/014275。核酸酶可在組成性啟動子或誘導型啟動子(例如在棉子糖及/或半乳糖存在下活化(去抑制)且在葡萄糖存在下抑制之半乳糖激酶啟動子)控制下表現。
目標位點之間的距離係指如自彼此最接近的序列的邊緣所量測兩個目標位點之間插入的核苷酸數或核苷酸對數。在裂解取決於兩個鋅指結構域/裂解半結構域融合分子與各別目標位點之結合的某些具體例中，兩個目標位點可在相對DNA股上。在其他具體例中，兩個目標位點皆在同一DNA股上。對於最佳基因組基因座中之靶向整合，一或多個ZFP經工程改造以結合預定裂解位點處或附近之目標位點，且包含經工程改造之DNA結合域及裂解結構域的融合蛋白在細胞 中表現。融合蛋白之鋅指部分與目標位點結合時，DNA在目標位點附近藉由裂解結構域，較佳經雙股斷裂裂解。
在某些具體例中，各自包含DNA結合域及裂解半結構域之兩個融合蛋白在細胞中表現，且結合於目標位點，其以一種方式並列，使得復原功能性裂解結構域且DNA在目標位點附近裂解。在一個具體例中，在兩個DNA結合域之目標位點之間發生裂解。DNA結合域中之一或兩者可經工程改造。亦參見美國專利第7,888,121號；美國專利公開案20050064474及國際專利公開案WO05/084190、WO05/014791及WO 03/080809。
如本文所述之位點特異性核酸酶可以多肽及/或聚核苷酸形式引入。舉例而言，各自包含編碼前述多肽中之一者之序列的兩個聚核苷酸可引入細胞中，且當多肽表現且各自結合於其目標序列時，在目標序列處或附近發生裂解。或者，包含編碼兩個融合多肽之序列的單聚核苷酸引入細胞中。聚核苷酸可為DNA、RNA或任何經修飾之形式或類似物或DNA及/或RNA。在一個態樣中，本發明係關於位點特異性核酸酶之直接傳遞，係傳遞至植物細胞。在另一態樣中，本發明係關於位點特異性核酸酶之基因組內傳遞，係傳遞至植物細胞。
經由諸如此等技術之技術的應用，實際上任何物種之細胞均可穩定轉形。在一些具體例中，將經轉形DNA整合至宿主細胞之基因組中。在多細胞物種之情況下，轉殖基因細胞可再生至轉殖基因生物體中。此等技術中之任一者可用於產生轉殖基因植物，例如在轉殖基因植物之基因組中包含一或多個供體聚核苷酸序列。
在本發明之具體例中，在將DNA、RNA、肽及/或蛋白質或核酸與肽之組合傳遞至植物細胞中之方法中，核酸之基因組內傳 遞或直接傳遞可藉由熟悉本技藝者已知的任何方法引入至植物細胞中，包括例如且不限於：原生質體轉形(參見例如美國專利5,508,184)；乾化/抑制介導之DNA攝入(參見例如，Potrykus等人(1985)Mol.Gen.Genet.199：183-8)；電穿孔(參見例如美國專利5,384,253)；用碳化矽纖維攪拌(參見例如美國專利5,302,523及5,464,765)；土壤桿菌屬介導之轉形(參見例如美國專利5,563,055、5,591,616、5,693,512、5,824,877、5,981,840以及6,384,301)；DNA塗佈之粒子的加速(參見例如美國專利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861以及6,403,865)以及奈米粒子、奈米載體及細胞滲透肽(WO201126644A2；WO2009046384A1；WO2008148223A1)。
最廣泛用於將表現載體引入植物中之方法係基於土壤桿菌屬之天然轉形系統。根癌土壤桿菌及毛根土壤桿菌為使植物細胞基因轉形之植物病原性土壤細菌。根癌土壤桿菌及毛根土壤桿菌之Ti及Ri質體分別攜帶負責植物遺傳轉形之基因。Ti(腫瘤誘發)質體含有稱為T-DNA之大區段，其轉移至經轉形植物中。Ti質體之另一區段vir區域負責T-DNA轉移。T-DNA區域以各自由末端重複核苷酸序列構成之左側及右側邊界為邊界。在一些經修飾之二元載體中，腫瘤誘發基因已缺失，且vir區域之功能用於轉移以T-DNA邊界序列為邊界之外來DNA。T-區域亦可含有例如用於高效回收轉殖基因植物及細胞之可篩選標記，及用於插入序列以轉移諸如編碼本發明之融合蛋白之核酸的多個選殖位點。
因此，在一些具體例中，植物轉形載體來源於根癌土壤桿菌之Ti質體(參見例如美國專利第4,536,475號、第4,693,977號、第4,886,937號以及第5,501,967號；以及歐洲專利EP 0 122 791)或毛根 土壤桿菌之Ri質體。額外植物轉形載體包括例如且不限於Herrera-Estrella等人(1983)Nature 303：209-13；Bevan等人(1983)，上文；Klee等人(1985)Bio/Technol.3：637-42；及歐洲專利EP 0 120 516中所述者，以及自前述任一者衍生者。與植物天然地相互作用之其他細菌(諸如中華根瘤菌、根瘤菌屬以及中生根瘤菌屬)可經修飾以介導基因轉移至許多不同植物。可使此等植物相關之共生細菌勝任藉由卸甲Ti質體與適合二元載體獲取來轉移基因。
另外，一旦位點特異性核酸酶已穩定整合至第一植物之基因組中，則核酸酶可藉由雜交第一及第二親本植物繁殖至子代植物中且用於結合及裂解特異性目標位點(target sight)。在此類實例中，第一親本植物之基因組不含位點特異性核酸酶結合及裂解之目標序列。然而，第二親本植物含有經位於第一親本植物中之位點特異性核酸酶結合及裂解之目標序列。因此，第一及第二親本植物之育種允許第一親本植物之位點特異性核酸酶在子代植物中起作用，該等子代植物遺傳了來自第一親本植物之位點特異性核酸酶及第二親本植物之目標序列。在此類具體例中，位點特異性核酸酶藉由基因組內重組傳遞至植物細胞。
在本發明之一個態樣中，提供之方法適用於製造包含經修飾基因組之子代植物。子代植物之開發通常藉由習知植物育種技術實現。此類育種技術為熟悉本技藝者所熟知。植物育種技術之論述參見Poehlman(1995)Breeding Field Crops.AVI Publication Co.,Westport Conn，第4版，其以全文引用之方式併入本文中。回交法可用於向植物中引入基因。此技術幾十年來用於向植物中引入性狀。熟知的此及其他植物育種方法之描述之實例可見於參考文獻中，諸如Poelman，上 文，及Plant Breeding Methodology,Neal Jensen編，John Wiley & Sons,Inc.(1988)。在典型回交方案中，所關注之初始品種(回交親本)與攜帶待轉移之所關注單個基因的第二品種(非回交親本)雜交。由此雜交獲得之子代接著再次與回交親本雜交且重複該方法直至獲得回交親本的基本上全部所需形態及生理學特徵在轉化植物中恢復(但非回交親本之單個轉移基因除外)的植物。
某些具體例係關於使用本發明之一個具體例之植物作為至少一個親本進行雜交的方法。舉例而言，特定具體例係關於F1雜交植物，其具有本文例示之任何植物作為一個或兩個親本。其他具體例係關於藉由此類F1雜交體產生的種子。其他具體例係關於一種用於藉由雜交例示性植物與不同(例如培植親本)植物製造F1雜交種子且採集所得雜交種子之方法。其他具體例係關於一種例示性植物，其為母本或父本。所得植物之特徵可藉由仔細考慮親本植物來改良。
作為本發明之一個具體例，可藉由首先使第一親本植物與第二親本植物有性雜交，由此產生複數個第一子代植物；接著選擇含有未與第二基因座連鎖之所關注基因座之第一子代植物；使第一子代植物自交，由此產生複數個第二子代植物；接著自第二子代植物選擇含有未與第二基因座連鎖之所關注基因座的植物，從而培育子代植物。此等步驟可進一步包括第一子代植物或第二子代植物與第二親本植物或第三親本植物回交。接著可種植包含特定具體例之種子的作物或其子代。
亦應理解，兩種植物亦可雜交產生含有由於所揭示方法產生的獨立隔離之基因的後代。適當後代的自交可產生對與二個添加之外源基因皆同型接合之植物。亦涵蓋與親本植物回交及與另一植物 異型雜交，如無性繁殖。本技藝中已知通常用於不同性狀及作物之其他育種方法。回交育種已用於將針對簡單遺傳之高度可遺傳性狀之基因轉移至所需同型接合栽培品種或近親品系(其為回交親本)。待轉移之性狀來源稱為供體親本。所得植物預期具有回交親本(例如栽培品種)之屬性及自供體親本轉移之所需性狀。初始雜交之後，選擇具有供體親本之表現型的個體且重複與回交親本雜交(回交)。所得親本預期具有回交親本(例如栽培品種)之屬性及自供體親本轉移之所需性狀。
用於再生植物之方法為一般熟悉本技藝者所已知且可見於例如：Plant Cell and Tissue Culture,1994,Vasil及Thorpe編Kluwer Academic Publishers，及：Plant Cell Culture Protocols(Methods in Molecular Biology 111,1999 Hall Eds Humana Press)中。本文所述之植物可在醱酵培養基中培養或在適合介質(諸如土壤)中生長。在一些具體例中，適於高等植物之生長培養基可包括用於植物之任何生長培養基，包括(但不限於)土壤、砂石、支持根生長之任何其他顆粒培養基(例如蛭石、珍珠岩等)或水耕培養物，以及使高等植物之生長達到最佳的適合光、水及營養補充劑。
藉由任何上述轉形技術產生之經轉形植物細胞可經培養以再生整個植物，其具有經轉形基因型且因此具有所需表現型。此類再生技術依賴於組織培養生長培養基中某些植物激素之操縱，通常依賴於已與所需核苷酸序列一起引入之殺生物劑及/或除草劑標記物。植物自培養之原生質體再生描述於Evans，等人，「Protoplasts Isolation and Culture」in Handbook of Plant Cell Culture，第124頁-第176頁，Macmillian Publishing Company,New York,1983；及Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts，第21頁-第73頁，CRC Press, Boca Raton,1985。亦可自植物癒傷組織、外植體、器官、花粉、胚芽或其部分獲得再生。此類再生技術一般描述於Klee等人(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38：467-486中。
在具體例中，本發明係關於用於組織培養之可再生細胞。組織培養較佳將能夠再生具有前述植物之生理學及形態特徵之植物及能夠再生具有與前述植物實質上相同之基因型的植物。較佳地，此類組織培養物中之可再生細胞將為胚芽、原生質體、分生組織細胞、癒傷組織、花粉、葉子、花粉囊、根、根尖、花、種子、豆莢或莖。再者，本發明之具體例係關於自本發明之具體例的組織培養物再生的植物。
在本發明之一個態樣中，提供之方法可用於多種植物及植物細胞系統。在具體例中，用於工程改造之目標植物及植物細胞包括(但不限於)該等單子葉及雙子葉植物，諸如包括以下之作物：穀類作物(例如小麥、玉米、稻穀、小米、大麥)、果實作物(例如西紅柿、蘋果、梨、草莓、橙)、飼草作物(例如苜蓿)、根用蔬菜作物(例如胡蘿蔔、馬鈴薯、糖用甜菜、山藥)、葉用蔬菜作物(例如萵苣、菠菜)；開花植物(例如矮牽牛、玫瑰、菊花)、針葉樹及松樹(例如冷杉(pine fir)、雲杉)；用於植物修復之植物(例如重金屬積聚植物)；油料作物(例如向日葵、油菜籽)以及用於實驗目的之植物(例如 芥菜屬)。因此，所揭示之方法及組成物可用於大範圍之植物，包括(但不限於)來自蘆筍屬(Asparagus)、燕麥屬(Avena)、蕓薹屬(Brassica)、柑桔屬(Citrus)、西瓜屬(Citrullus)、辣椒屬(Capsicum)、南瓜屬(Cucurbita)、胡蘿蔔屬(Daucus)、飛蓬屬(Erigeron)、大豆屬(Glycine)、棉屬(Gossypium)、大麥屬(Hordeum)、萵苣屬(Lactuca)、黑麥草屬(Lolium)、番茄屬(Lycopersicon)、蘋果屬(Malus)、 木薯屬(Manihot)、菸草屬(Nicotiana)、諸葛菜屬(Orychophragmus)、稻屬(Oryza)、鱷梨屬(Persea)、菜豆屬(Phaseolus)、豌豆屬(Pisum)、梨屬(Pyrus)、李屬(Prunus)、蘿蔔屬(Raphanus)、黑麥屬(Secale)、茄屬(Solanum)、高樑屬(Sorghum)、小麥屬(Triticum)、葡萄屬(Vitis)、豇豆屬(Vigna)及玉蜀黍屬(Zea mays)之種。
提供以下實施例以說明某些特定特徵及/或具體例。實例不應視為將本發明侷限於所例示之特定特徵或具體例。
實施例 實施例1：基因表現構築體之設計
經工程改造之轉殖基因整合平台(ETIP)先前在美國專利申請案第20140090113A1號中描述，其以全文引用之方式併入本文中。ETIP含有經工程改造之著陸墊序列、若干經工程改造之鋅指結合位點(eZFN)以及如二元質體載體pDAB105855中所示之基因表現卡匣(圖1；SEQ ID NO：1)。如美國專利申請案第20140090113A1號中所述，二元質體pDAB105855經轉形且整合至玉蜀黍栽培品種B104中(參見專利申請案第20140090113A1號之實施例8)。經分子分析確認含有pDAB105855T-股插入物之全長簡單插入事件的陽性轉殖基因植物(參見美國專利申請案第20140090113A1號之實施例6)。pDAB105855的土壤桿菌邊緣區域之轉殖基因表現卡匣以全長T-股插入物形式位於玉蜀黍栽培品種B104基因組之染色體內。含有轉殖基因事件之所得轉殖基因植物pDAB105855-#2自花授粉產生同型接合子代植物，其含有來自pDAB105855之T-股插入物的全長副本。此等子代植物藉由分子確認分析法確認為同型接合。
實施例2：基因表現構築體之設計
含有dgt-28轉殖基因及若干eZFN結合位點之第二基因表現構築體經設計及建構。此基因表現構築體標記為pDAB113068(圖2；SEQ ID NO：2)且含有以下基因組件：eZFN1結合位點；驅動與TraP4葉綠體輸送肽(國際專利申請案第2013158766號)融合且經玉蜀黍脂肪酶3'UTR(ZmLip 3'UTR；美國專利第7,179,902號)終止之dgt-28轉殖基因(DGT-28；國際專利申請案第2013116700號)表現之稻泛素3內含子(OsUbi3內含子；Sivamani,E.,Qu,R.,(2006)Plant Molecular Biology 60；225-239)；含有多個位點特異性核酸酶結合位點之連接子區域(SBS8196結合位點：：eZFN4結合位點：：SBS19354結合位點：：SBS15590結合位點：：eZFN8結合位點：：SBS18473結合位點：：eZFN1結合位點)；以及驅動pat轉殖基因(PAT；Wohlleben等人(1988)Gene 70(1)；25-37)表現且經玉蜀黍脂肪酶3'UTR終止之玉蜀黍泛素1啟動子(ZmUbi1啟動子；Christensen等人(1992)Plant Molecular Biology 18；675-689)。此基因表現構築體轉形至pDAB105855-#2事件玉蜀黍植物中，該等植物先前確認含有pDAB105855之同型接合副本。
實施例3：土壤桿菌菌株製造及玉蜀黍轉形
接種根癌土壤桿菌
pDAB113068二元質體經土壤桿菌介導之轉形方案轉形至pDAB105855-#2事件玉蜀黍植物中。將二元表現載體轉形至根癌土壤桿菌菌株EHA105中。選擇細菌菌落，且二元質體DNA經分離且經限制酶分解來確認。土壤桿菌培養物自丙三醇儲備液劃線且培育生長。實驗當天，土壤桿菌之所得培養物用於轉形含有pDAB105855-#2事件之玉蜀黍植物。
玉蜀黍轉形
經未成熟胚芽的經土壤桿菌介導的轉形將實驗構築體轉形至含有pDAB105855-#2事件之玉蜀黍植物中，該未成熟胚芽自含有pDAB105855-#2事件之近親品系玉蜀黍栽培品種B104植物分離。所用方法與Ishida等人(1996)Nature Biotechnol 14：745-750及Frame等人(2006)Plant Cell Rep 25：1024-1034公開之方法類似，但有若干修改及改良以使得該方法能適用於高通量轉形。用於在玉蜀黍中製造許多轉殖基因事件之方法的實例在美國專利申請案第20130157369A1號中給出，其以胚芽感染及共同培養步驟開始。
實施例4：在T0之副本數的分子確認
假定轉殖基因玉蜀黍植物在V2-3葉發育階段取樣，使用pat轉殖基因定量PCR分析法測定轉殖基因存在。全部DNA係使用MagAttract® DNA提取試劑盒(Qiagen)按照製造商說明書自葉沖孔提取。
為了偵測所關注之基因，使用TaqMan®引子/探針組來擴增基因特異性DNA片段，該引子/探針組含有針對pat轉殖基因之FAM標記之螢光探針以及針對內源性參考基因對照的HEX標記之螢光探針。接著，在10μl最終體積之反應物中進行PCR反應，該反應物含有5μl Roche LightCycler® 480 Probes Master Mix(Roche Applied Sciences,Indianapolis,IN)；0.4μl來自10μM儲備液之各引子，達到400nM之最終濃度；0.4μl來自5μM儲備液之各探針，達到200nM之最終濃度、0.1μl 10%聚乙烯吡咯啶酮(PVP)，達到0.1%之最終濃度；2μl 10ng/μl基因組DNA及0.5μl水。DNA在以下條件下在Roche LightCycler® 480系統中擴增：1個循環的95℃ 10分鐘；下列3個步驟運行40個循環：95℃持續10秒；58℃持續35秒及72℃持續1秒， 以及4℃持續10秒之最終循環。藉由比較未知樣品之目標(所關注基因)/參考值(LightCycler® 480之輸出)與pat轉殖基因副本數對照之目標/參考值來測定pat轉殖基因副本數。所得T0植物自交獲得T1種子，對其進行篩選以鑑別同型接合之轉殖基因植物。對T1子代植物完成接合子型式篩選以鑑別對於目標及供體基因事件皆為同型接合之植物。此等子代植物用於額外實驗。
實施例5：事件之染色體位置的圖譜
含有目標pDAB105822-#2事件及供體pDAB113068-#250事件之轉殖基因植物使用次世代定序(NGS)分析以測定兩個轉殖基因之基因組插入位點位置。序列數與來自maizeGDB之玉蜀黍B73參考基因組比對(Andorf等人(2015)MaizeGDB 2015：New tools,data,and interface for the maize model organism database.Nucleic Acids Research doi：10.1093/nar/gkv1007)。發現目標pDAB105822#2及供體pDAB113068-#250事件在同一染色體上插入。目標pDAB105855-#2事件定位至染色體5：188,528,595..188,528,607上，而供體pDAB113068-#250事件定位至染色體5：147,625,397..147,625,455上。
實施例6：ZFN及基因表現構築體之設計
針對eZFN1 DNA序列之在pDAB105855之T-DNA內包含位點特異性裂解位點之鋅指蛋白質(參見圖1)如上文所述設計。參見例如Urnov等人(2005)Nature 435：646-651。例示性識別螺旋此前在美國專利申請案第20140090113A1號(以全文引用的方式併入本文中)中揭示為「識別螺旋區域設計」。鋅指識別及結合之目標序列位點提供於表1中，為SEQ ID NO：3。
將位點特異性核酸酶鋅指設計併入至編碼具有至少一個CCHC結構之指的蛋白質的載體中。參見美國專利申請案第20080182332號。特定言之，每種蛋白質中之最後指具有用於識別螺旋之CCHC主鏈。非典型鋅指編碼序列經四胺基酸ZC連接子及來源於玉蜀黍之opaque-2核位置信號融合至IIS型限制酶FokI之核酸酶結構域(Wah等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10564-10569之序列的胺基酸384-579)，以形成eZFN1特異性鋅指核酸酶(ZFN)。雙順反子表現構築體中利用2A核糖體斷續信號的融合蛋白表現(如Shukla等人(2009)Nature 459：437-441中所述)經相對強組成性玉蜀黍泛素1啟動子驅動。
使用先前所示的基於出芽酵母之系統檢驗最佳鋅指之裂解活性，以鑑別活性核酸酶。參見例如美國專利公開案第20090111119號；Doyon等人(2008)Nat Biotechnol.26：702-708；Geurts等人(2009)Science 325：433。選擇針對多種功能結構域之鋅指用於活體內用途。在設計、製造及測試結合於假定eZFN1聚核苷酸目標位點之許多ZFN中，一對ZFN鑑別為具有高水準之活體內活性，且選擇用於進一步實驗。此等ZFN特徵為能夠高效結合及裂解足底中之位點特異性eZFN1基因組聚核苷酸目標位點。在出芽酵母分析法中測試ZFN對之後，最佳地結合eZFN1結合位點之ZFN對玉蜀黍中之測試較佳。
用於在玉蜀黍中表現之鋅指核酸酶構築體；
含有使用酵母分析法鑑別且上文所述之例示性鋅指核 酸酶之ZFN表現構築體之質體載體使用本技藝中通常已知之技能及技術設計及完成。
隨後，opaque-2核位置信號：：鋅指核酸酶融合序列與互補opaque-2核位置信號：：鋅指核酸酶融合序列配對。因此，各構築體由包含經2A序列與褐翅蛾(Thosea asigna)病毒分離之兩個opaque-2核位置信號：：鋅指核酸酶融合序列的單個開放閱讀框架組成(Mattion等人(1996)J.Virol.70：8124-8127)。ZFN編碼序列之表現由高度表現組成性玉蜀黍泛素1啟動子驅動(Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18(4)：675-89)且經玉蜀黍Per 5 3'聚A未轉譯區域側接(美國專利第6,699,984號)。所得四個質體構築體經限制酶消化及經DNA定序確定。圖3提供pDAB105825之完整質體構築體之圖示。在質體構築體pDAB105825中表現之ZFN含有「Fok-Mono」，其為野生型FokI核酸內切酶。
實施例7：玉蜀黍轉形
所得鋅指核酸酶構築體pDAB105825使用先前在上文實施例3中所述之方法轉形至玉蜀黍栽培品種B104植物中。所得轉殖基因植物自花授粉以產生同型接合子代植物，其含有來自pDAB105825之T-股插入物的全長副本。此等子代植物藉由如上文實施例4中所述之分子確認分析法確認為同型接合。
實施例8：雜交同型接合T1植物用於產生F1群體
針對接合子型式及aad-1轉殖基因之表現篩選T1pDAB105825事件。基於此等結果，選擇來自一個pDAB105825事件之同型接合T1植物與pDAB105855/pDAB113068植物事件雜交以產生F1子代植物。進行相互雜交使得親本既為雄性又為雌性。對植物進行人工雜交；將來自成熟父本之花粉囊的花粉引入至成熟母本之柱頭。自其他植物移除準備好雜交之植物以降低非預期花粉使雌性玉米植物 授精的可能性。藉由去雄將雌性植物去勢(在開裂之前移除花粉囊)。自雄性植物完全移除來自父本之花粉囊，且自花粉囊分離花粉且用於為經去勢之雌性授精。將經分離之花粉摩擦至雌性植物之接收穗絲上，塗佈該等穗絲以減少任何非預期之授粉的機會。自受精植物收集種子且種到土壤中。所得F1群體在標準玉米生長條件下在溫室中生長。
實施例9：F1植物與同科空載植物雜交以產生BC1群體
含有全部三個事件(即pDAB105855/pDAB113068/pDAB105825)之所得F1子代植物生長至成熟期且與同科空載親本植物回交以產生BC1群體。雜交策略在下文中說明且在圖4中圖解。所得BC1群體以分子形式表徵以計算遺傳連鎖之轉殖基因pDAB105855基因與pDAB113068基因之間發生的重組頻率。由於兩個同源染色體之一用鋅指核酸酶裂解，因此假設pDAB105855基因與pDAB113068基因之間的重組頻率由於藉由鋅指核酸酶在eZFN1結合位點處引入雙股斷裂而增加圖5。
實施例10：BC1植物與同科空載植物雜交以產生BC2群體
含有全部三個事件(即pDAB105855/pDAB113068/pDAB105825)之所得BC1子代植物生長至成熟期且與同科空載親本植物回交以產生BC2群體。雜交策略在下文中說明且在圖4中圖解。所得BC2群體以分子形式表徵以計算遺傳連鎖之轉殖基因pDAB105855基因與pDAB113068基因之間發生的重組頻率。由於兩個同源染色體之一用鋅指核酸酶裂解，因此假設pDAB105855基因與pDAB113068基因之間的重組頻率由於藉由鋅指核酸酶在eZFN1結合位點處引入雙股斷裂而增加圖5。
實施例11：計算重組頻率之百分比
計算遺傳連鎖之轉殖基因(例如pDAB105855基因及pDAB113068基因)之間的重組頻率且提供於表2中。基因1及2遺傳 連鎖且因此通常共同隔離。重組頻率之百分比藉由重組後代(含有單獨之基因1或基因2)數目除以所觀測之後代總數來測定。
在植物雜交實驗內不包括鋅指核酸酶引入的對照子代植物導致pDAB105855基因與pDAB113068基因之間存在低百分比之重組，被計算為3.5%。此等對照植物在遺傳連鎖之轉殖基因pDAB105855基因與pDAB113068基因之間不含雙股斷裂且pDAB105855基因與pDAB113068基因之間不存在由於多個細胞週期及植物發育階段期間進行的天然細胞過程引起的任何隔離。
相比之下，實驗子代植物中之重組頻率提高高達62.3%，且重組頻率在4.4%至62.3%範圍內。在植物雜交實驗內包括鋅指核酸酶引入的實驗子代植物導致pDAB105855基因與pDAB113068基因之間計算出較高的重組百分比，比對照植物的3.5%重組頻率高得多。此等實驗植物在遺傳連鎖之轉殖基因pDAB105855基因與pDAB113068基因之間含有雙股斷裂，且pDAB105855基因與pDAB113068基因之間發生的隔離由於引入雙股斷裂而增加。藉由引入ZFN及在位於兩個遺傳連鎖之基因pDAB105855基因與pDAB113068基因之間的結合位點處誘發靶向之雙股斷裂，使重組後代之頻率顯著提高(高達62%)。
儘管上文已討論了許多例示性態樣及具體例，但熟悉本技藝者應認識到其某些修改、置換、添加及子組合。因此，預期以下隨附之申請專利範圍及下文引入之申請專利範圍解釋為包含於其真正精神及範疇內的所有此類修改、置換、添加及子組合。
<110> 陶氏農業科學公司
<120> 用於建立靶向重組及中斷性狀之間之連鎖的方法及組成物
<130> 78126-US-PSP
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15950
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自pDAB105855之基因表現卡匣
<400> 1
<210> 2
<211> 8029
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自pDAB113068之基因表現卡匣
<400> 2
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ZFN結合位點
<400> 3

Claims (25)

  1. 一種用於提高植物基因組內與第二基因座遺傳連鎖之第一基因座之間的遺傳重組頻率的方法，該方法包含以下步驟：a)向該植物之基因組中引入位點特異性核酸酶；b)使用該位點特異性核酸酶在兩個同源染色體之一中製造雙股斷裂；c)在該植物基因組內進行重組；以及d)修飾該植物基因組，其中該經修飾之植物基因組包含該第一基因座與該第二基因座之間提高之遺傳重組頻率。
  2. 如請求項1之方法，其中，該第一基因座及該第二基因座編碼至少一種性狀。
  3. 如請求項1之方法，其中，重組包含減數分裂重組或有絲分裂重組。
  4. 如請求項1之方法，其中，該提高之遺傳重組頻率在1.25至17.8倍範圍內。
  5. 如請求項1之方法，其中，該第一基因座至該第二基因座之距離在約0.01cM至約500cM範圍內。
  6. 如請求項1之方法，其中，該第一基因座至該第二基因座之距離在約10bp至約10Mbp範圍內。
  7. 如請求項1之方法，其中，該第一基因座位於第一染色體上，且該第二基因座位於第二染色體上。
  8. 如請求項1之方法，其中，該第一基因座及該第二基因座以低水準重組頻率存在於基因組位置中。
  9. 如請求項2之方法，其中，該性狀包含所需性狀或非所需性狀。
  10. 如請求項9之方法，其中，該所需性狀或該非所需性狀為原生性狀或轉殖基因性狀。
  11. 如請求項10之方法，其中，該非所需性狀係選自由以下組成之群：降低之產量、降低之疾病抗性、降低之害蟲抗性、降低之除草劑耐受性的耐受能力、減慢之生長、減小之尺寸、降低之生物質產量、降低之產生種子的量、降低之鹽度抗性、降低之熱應激抗性、降低之冷應激抗性、降低之乾旱應激抗性以及其任何組合。
  12. 如請求項10之方法，其中，該所需性狀係選自由以下組成之群：提高之產量、提高之疾病抗性、提高之害蟲抗性、提高之除草劑耐受性、加快之生長、增加之尺寸、提高之生物質產量、增加之產生種子的量、提高之鹽度抗性、提高之熱應激抗性、提高之冷應激抗性、提高之乾旱應激抗性以及其任何組合。
  13. 如請求項1之方法，其中，該第一基因座包含多態性標記物且該第二基因座包含性狀。
  14. 如請求項1之方法，其中，該第一基因座包含多態性標記物且該第二基因座包含多態性標記物。
  15. 如請求項1之方法，其中，該雙股斷裂係由位點特異性核酸酶在兩個同源染色體之一中製造，且未在該第二同源染色體中製造雙股斷裂。
  16. 如請求項1之方法，其中，該位點特異性核酸酶係選自由以下組成之群：鋅指核酸酶、TALEN核酸酶、CRISPR核酸酶、大範圍核酸酶以及白胺酸拉鏈核酸酶。
  17. 如請求項1之方法，其中，該位點特異性核酸酶係藉由基因組內重組或經由直接傳遞而傳遞至細胞。
  18. 如請求項1之方法，其中，該植物之基因組為多倍體。
  19. 如請求項1之方法，該方法進一步包含以下步驟：e)產生包含該經修飾之植物基因組的子代植物；f)使該子代植物與另一植物或其本身雜交；以及g)自該子代植物產生種子。
  20. 如請求項2之方法，其中，包含第一性狀之該第一基因座係位於該第一同源染色體上且包含第二性狀之該第二基因座係位於該第一同源染色體上。
  21. 如請求項20之方法，其中，該所得雙股斷裂在包含該第一性狀之該第一基因座與包含該第二性狀之該第二基因座之間發生，由此產生僅包括包含該第一性狀之該第一基因座的子代植物。
  22. 如請求項2之方法，其中，該第一性狀係隱性或顯性性狀。
  23. 如請求項2之方法，其中，該第一性狀係異型接合或同型接合性狀。
  24. 如請求項1之方法，其中，該植物係選自雙子葉植物或單子葉植物。
  25. 如請求項24之方法，其中，該植物係選自由以下組成之群：菸草植物、大豆植物、棉花植物、蕓薹屬植物、玉米植物、高樑植物、小麥植物以及稻穀植物。
TW106120356A 2016-06-20 2017-06-19 用於建立靶向重組及中斷性狀之間之連鎖的方法及組成物 TW201825678A (zh)

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