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TW201812300A - 心肌肌鈣蛋白之測定方法及測定試藥 - Google Patents

心肌肌鈣蛋白之測定方法及測定試藥 Download PDF

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TW201812300A
TW201812300A TW106131254A TW106131254A TW201812300A TW 201812300 A TW201812300 A TW 201812300A TW 106131254 A TW106131254 A TW 106131254A TW 106131254 A TW106131254 A TW 106131254A TW 201812300 A TW201812300 A TW 201812300A
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cardiac troponin
antibody
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surfactant
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TW106131254A
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English (en)
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榊瑞步
北村由之
八木慎太郎
青柳克己
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日商富士麗比歐股份有限公司
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Abstract

本發明揭示一種不論樣本之種類或有無其他成分，均可更準確地測定樣本中所含之心肌肌鈣蛋白量的心肌肌鈣蛋白之測定方法及測定試藥。心肌肌鈣蛋白之測定方法包括將自活體分離之樣本、與包含界面活性劑及酸化劑之任一者或兩者之前處理液進行混合之前處理步驟，且藉由免疫分析而測定自活體分離之樣本中之心肌肌鈣蛋白。心肌肌鈣蛋白之免疫分析用試藥具備包含界面活性劑及酸化劑之任一者或兩者之前處理液。

Description

心肌肌鈣蛋白之測定方法及測定試藥
本發明係關於一種心肌肌鈣蛋白之測定方法及測定試藥。
心肌肌鈣蛋白係與心肌收縮之調節相關，其係以包含心肌肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白C、心肌肌鈣蛋白T之3種次單元之複合體之形式存在。心肌肌鈣蛋白I與心肌肌鈣蛋白T均特異性地(specifically)表現於心臟，若心肌細胞受損則會釋出至血中，故而於診斷心肌梗塞、監控心臟疾病方面作為血中標記利用。
作為與心肌肌鈣蛋白之測定相關之技術，報導有以下情況。專利文獻1中記載有，藉由利用包含特定之陰離子性界面活性劑(具有1個磺酸根基之烷基)之基質，可使標準液中之心肌肌鈣蛋白穩定化。專利文獻2中記載有，可於心肌肌鈣蛋白之免疫學測定中利用二價陽離子。
[先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：國際公開第2006/116005號
專利文獻2：日本專利第5864530號
血中之心肌肌鈣蛋白被廣泛地用作心肌梗塞之診斷標記，但其於血中係以包含心肌肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白C及心肌肌鈣蛋白T之複合體之形式存在，且與血中成分形成複合體。尤其是心肌肌鈣蛋白I，其性狀容易根據其他成分等之狀態而發生變化，例如於肝素存在下與肝素顯示出交互作用、容易被血中蛋白酶分解等，於使用抗肌鈣蛋白抗體之免疫測定中無法顯示穩定之值，因此被視為不穩定之蛋白質。例如，使用血清作為血液樣本之情形時之心肌肌鈣蛋白I之測定值及使用血漿作為血液樣本之情形時之心肌肌鈣蛋白I之測定值有時未必顯示相同值。於醫療現場，包含各種抗凝固劑(例如肝素、EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸)、檸檬酸)之採血管係用於製備血漿，但血漿中之心肌肌鈣蛋白I之測定值有時會因製備血漿時所使用之抗凝固劑之種類而顯示出不同值。又，於將不同抗體用於檢測之測定試藥間，可見肌鈣蛋白測定值之背離。因此存在如下課題：於測定心肌肌鈣蛋白I量之心肌梗塞之診斷中，難以於免疫分析中界定心肌肌鈣蛋白I之真實值，因而難以設定不受樣本之種類或其他成分之影響的一定之正常人值。心肌肌鈣蛋白T測定由於僅使用單一測定法，故而如肌鈣蛋白I般之測定值背離之問題相對較小，但於報導有數種測定法之情形時，有可能產生與心肌肌鈣蛋白I相同之課題。
本發明之目的在於提供一種不論樣本之種類或有無其他成分，均可更準確地測定樣本中所含之心肌肌鈣蛋白量之心肌肌鈣蛋白之測定方法及測定試藥。
本發明者等人為了達成上述目的而進行努力研究，結果發現：於使用對活體樣本中之心肌肌鈣蛋白I進行免疫測定之方法時，在將上述活體樣本供於免疫反應之前，藉由經與包含界面活性劑及酸化劑之任一者或兩者之前處理液進行混合之前處理步驟，可獲得不論活體樣本之種類或有無其他成分，均再現性良好之心肌肌鈣蛋白測定值，從而完成本發明。
本發明之構成如下所述。
(1)一種藉由免疫分析而測定自活體分離之樣本中之心肌肌鈣蛋白的方法，其包括將自活體分離之樣本、與包含界面活性劑及酸化劑之任一者或兩者之前處理液進行混合之前處理步驟。
(2)如(1)所記載之方法，其中，上述前處理液進而包含還原劑。
(3)如(1)或(2)所記載之方法，其中，上述前處理液包含界面活性劑，該界面活性劑為選自由陰離子性界面活性劑、陽離子性界面活性劑、兩性離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑所構成之群中之1種以上之界面活性劑。
(4)如(3)所記載之方法，其中，上述界面活性劑為陰離子性界面活性劑。
(5)如(3)所記載之方法，其中，上述前處理步驟係於加熱條件下進行。
(6)如(1)所記載之方法，其中，上述前處理液包含酸化劑，且前處理步驟中之酸化劑之最終濃度係超過0.05N且0.5N以下。
(7)如(1)至(6)中任一項所記載之方法，其中，上述心肌肌鈣蛋白為心肌肌鈣蛋白I。
(8)一種心肌肌鈣蛋白之免疫分析用試藥，其具備包含界面活性 劑及酸化劑之任一者或兩者之前處理液。
根據本發明，可提供一種藉由使心肌肌鈣蛋白自其他成分游離，降低交互作用之影響，而不論樣本之種類或有無其他成分，均可更準確地測定樣本中所含之心肌肌鈣蛋白量之心肌肌鈣蛋白之測定方法及測定試藥。又，根據本發明，可提供一種藉由使心肌肌鈣蛋白之性狀均一化，而可穩定且高感度地測定心肌肌鈣蛋白之心肌肌鈣蛋白之測定方法及測定試藥。
圖1係表示利用市售測定試藥所測得之血清中之心肌肌鈣蛋白I測定值、與藉由伴隨酸性化前處理之本發明之測定方法所獲得之血清中之心肌肌鈣蛋白I測定值之關聯性的圖。
圖2係表示於伴隨酸性化前處理之本發明之測定方法中顯示出高值之檢體之凝膠過濾層析法之各組分對心肌肌鈣蛋白I之檢測所產生之影響的圖。
圖3係表示伴隨酸性化前處理之本發明之測定方法中之前處理液之酸濃度與測定值之關係的圖。
<心肌肌鈣蛋白之測定方法>
藉由本發明之方法進行測定之心肌肌鈣蛋白可為心肌肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白C及心肌肌鈣蛋白T之任一者，較佳為心肌肌鈣蛋白I。心肌肌鈣蛋白I(cTnI)係構成與心肌收縮之調節相關之心肌肌鈣 蛋白複合體的3種次單元(肌鈣蛋白I、C及T)之一。本發明中所測定之心肌肌鈣蛋白為來自任意動物之心肌肌鈣蛋白，較佳為來自哺乳動物(例如人類、猿猴、黑猩猩等靈長類；小鼠、大鼠、兔等嚙齒類；狗、貓等寵物；豬、牛等家畜；馬、綿羊等役畜)之心肌肌鈣蛋白，更佳為來自靈長類之心肌肌鈣蛋白，尤佳為來自人類之心肌肌鈣蛋白。關於來自人類之心肌肌鈣蛋白I之胺基酸序列，例如參照GenBank：CAA62301.1。當然，來自人類之心肌肌鈣蛋白I並不限於包含根據上述編號所參照之胺基酸序列者，亦可為其變異體(例如自然產生之變異體)。又，本發明中所測定之心肌肌鈣蛋白I亦可以於活體樣本中為游離型、與肌鈣蛋白C及/或肌鈣蛋白T之複合體之形態及與自體抗體等其他分子之複合體之形態存在。關於來自人類之肌鈣蛋白C之胺基酸序列，例如參照GenBank：AAA36772.1。關於來自人類之心肌肌鈣蛋白T之胺基酸序列，例如參照GenBank：CAA52818.1。
1.前處理步驟
本發明之方法係藉由使活體樣本與抗體進行反應之免疫反應，而測定活體樣本中所存在之心肌肌鈣蛋白I者，其特徵在於：於免疫反應(反應步驟)前，包括將活體樣本與前處理液進行混合之前處理步驟。藉由前處理步驟，可使心肌肌鈣蛋白I成為游離狀態，而降低與其他蛋白質等成分之交互作用之影響。前處理液可包含界面活性劑及酸化劑之任一者，亦可包含兩者。較佳為前處理液包含界面活性劑或酸化劑之任一者。
於上述前處理步驟中所混合之活體樣本與前處理液 之體積比較佳為設為1：10~10：1，尤佳為1：5~5：1，進而較佳為1：3~3：1。本發明中所使用之活體樣本只要為能夠含有心肌肌鈣蛋白I之樣本則無特別限定，例如可列舉：血清、血漿、全血、尿液、糞便、口腔黏膜、咽喉黏膜、腸道黏膜及活檢樣本(例如腸道樣本、肝臟樣本)。較佳為活體樣本為血清或血漿。
作為上述前處理液中所含之界面活性劑，可使用陰離子性界面活性劑、陽離子性界面活性劑、兩性離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑之任一者，尤佳為陰離子性界面活性劑。作為陰離子性界面活性劑，可適宜地使用十二烷基硫酸鈉(SDS)、N-月桂醯肌胺酸鈉(NLS)、十二烷基硫酸鋰、十二烷基苯磺酸鈉、去氧膽酸等，尤其可適宜地使用SDS、NLS。作為陽離子界面活性劑，例如可使用：十六烷基三甲基氯化銨(C16TAC)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)等。作為兩性離子性界面活性劑，例如可使用CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate，3-[(3-膽醯胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸內鹽)等。作為非離子性界面活性劑，例如可使用Tween20、Triton X-100等。界面活性劑之濃度需為對於使心肌肌鈣蛋白I自其他蛋白質等游離而言充分之濃度，作為與活體樣本混合之混合溶液之前處理時之濃度，較佳為設為0.1~12.5%，尤佳為0.25~10%，進而較佳為0.5~7.5%。藉由將界面活性劑濃度設為0.1~12.5%，而發揮出使心肌肌鈣蛋白I充分地游離，並且不易發生析出等之效果。
作為上述前處理液中所含之酸化劑，可適宜地使用鹽酸、硫酸、乙酸等。前處理液之酸之當量濃度，較佳為設為超過0N且為0.5N以下，尤佳為0.03N以上且0.125N以下作為前處理時 之濃度。於前處理中使用酸化劑之情形時，較佳為添加陽離子性界面活性劑，俾於與活體樣本混合時不產生沈澱。作為陽離子界面活性劑，尤佳為於同一分子中具有碳數10個以上之單鏈烷基、與三級胺或四級銨鹽之陽離子性界面活性劑。作為此種界面活性劑之例，可列舉：癸基三甲基氯化銨、十二烷基三甲基氯化銨、十四烷基三甲基氯化銨、十六烷基三甲基氯化銨(C16TAC)、癸基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、氯化月桂基吡啶鎓、氯化十四烷基吡啶鎓、氯化十六烷基吡啶鎓等。陽離子界面活性劑之添加量以與檢體之混合時之濃度計較佳為0.01%以上且15%以下，進而較佳為0.05%~10%。
於前處理液中，較佳為進而使用還原劑。作為還原劑，可使用2-(二乙基胺基)乙硫醇鹽酸鹽(DEAET)、三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇、硫甘油、亞硫酸鈉、硼氫化物等現有還原劑之任一者，基於溶液中之穩定性之理由，可尤其適宜地使用DEAET、TCEP。作為還原劑之濃度，以前處理時之濃度計較佳為0.1~200mM，尤佳為0.5~100mM，進而較佳為1.0~40.0mM。
前處理液中視需要亦可含有脲、硫脲等其他蛋白質改質劑。改質劑之濃度以處理時濃度計較佳為0.1M以上，進而較佳為0.5M以上且未滿4M。又，對於前處理液，為了增強處理效果，亦可添加單醣類、雙醣類之任一者，或將該等組合而添加。進而，前處理液中亦可含有螯合劑。已知心肌肌鈣蛋白I於鈣離子等二價陽離子之存在下容易產生與肌鈣蛋白C等之交互作用。藉由使用螯 合劑，可避免鈣離子等之影響，使心肌肌鈣蛋白I容易游離。作為螯合劑，可使用EDTA、檸檬酸、EGTA(Ethylene Glycol Tetraacetic Acid，乙二醇四乙酸)、植酸等之任一者，尤佳為使用EDTA。
前處理步驟較佳為於將活體樣本與前處理液混合後進而加熱。尤其於前處理液中使用界面活性劑之情形時，為了提高其效果，較佳為進行加熱。加熱溫度較佳為設為35~95℃，尤佳為50~90℃，進而較佳為70~85℃。又，加熱時間較佳為設為1分鐘以上，尤佳為3分鐘以上，進而較佳為5分鐘以上。加熱時間並不特別存在上限，通常宜為60分鐘以下，尤其是30分鐘以下之加熱時間。
前處理步驟亦可於活體樣本與前處理液之混合後，進而具備添加中和溶液並進行混合之中和處理。尤其是於前處理液中使用酸化劑之情形時，對於為了在其後之反應步驟(抗原抗體反應)之前，將混合溶液之pH調整為適合於反應之狀態而言有用。作為中和溶液，可適宜地使用包含氫氧化鈉、氫氧化鉀等鹼性化劑及二羥乙甘胺酸(Bicine)、三(羥甲基)甲基甘胺酸(Tricine)等pH值緩衝劑的溶液。中和溶液中亦可進而包含SDS、NLS等界面活性劑。
2.反應步驟
本發明之方法之上述前處理步驟中所獲得之活體樣本混合溶液，係繼而供於免疫分析之反應步驟。於反應步驟中，使活體樣本混合溶液與緩衝液混合，而使混合溶液中之抗原與針對心肌肌鈣蛋白之抗體進行反應。
作為上述緩衝液，例如可列舉以 MES(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic，2-(N-嗎啉基)乙磺酸)緩衝液、磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、Tris緩衝液、碳酸緩衝液作為基液者，尤其可適宜地使用以磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液作為基液者。又，為了使前處理之效果得以持續，緩衝液亦可含有EDTA等螯合劑。於使用含有界面活性劑者作為前處理液之情形時，例如較佳為使用：以與前處理後之混合溶液混合時之最終濃度計含有0.01~10%、尤其是0.05~5.0%左右之BSA(Benzenesulfonamide，苯磺醯胺)、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚葡糖(dextran)硫酸鈉等水溶性高分子的緩衝液。又，於使用含有酸化劑者作為前處理液之情形時，較佳為包含鹼劑，或使用具有能夠緩和前處理液之酸之影響的緩衝能力之緩衝液。前處理步驟之混合溶液與緩衝液之混合以體積比計較佳為設為1：10~10：1，尤佳為1：5~5：1，進而較佳為1：3~3：1。
本發明之方法中所使用之針對心肌肌鈣蛋白之抗體係將心肌肌鈣蛋白之胺基酸序列之至少一部分辨識為表位(epifope)者。作為由針對心肌肌鈣蛋白I之抗體所辨識之表位，已知有以特異性表位為首之各種表位(例如Filatov vl et al.,Biochem.Mol.Biol.Int.1998,45(6)：1179-1187；國際公開第2012/115221號)。因此，針對心肌肌鈣蛋白I之抗體無特別限定，亦可為此種辨識各種表位之抗體，可適宜地使用具有辨識游離之心肌肌鈣蛋白I之性質的抗體。尤其與形成複合體之心肌肌鈣蛋白相比，較佳為針對游離(單體)之心肌肌鈣蛋白I之反應性較高之抗體。作為此種抗體之表位，例如可列舉與和肌鈣蛋白C之結合部位重複之區域(第43個~第65個胺基酸殘基)或其一部分區域。又，例如可列舉與和心肌肌鈣蛋 白T之結合部位重複之區域(第66個~第89個)或其一部分區域。此種表位區域由於在通常之檢體中存在於複合體之內部，故而不易受到分解，能夠穩定地存在。再者，本說明書中之心肌肌鈣蛋白I蛋白質之胺基酸編號係以GenBank：CAA62301.1中所記載之胺基酸序列(序列編號1)為基準者。
針對心肌肌鈣蛋白I之抗體亦可為容易獲得之市售抗體。於來自人類之心肌肌鈣蛋白I之胺基酸序列中，例如可列舉：包含第20個~第60個胺基酸殘基之肽部分中所發現之表位(例如包含第24個~第40個、或第41個~第49個胺基酸殘基之肽)、包含第61個~第120個胺基酸殘基之肽部分中所發現之表位(例如包含第86個~第90個胺基酸殘基之肽)、包含第130個~第150個胺基酸殘基之肽部分中所發現之表位及包含第160個~第209個胺基酸殘基之肽部分中所發現之表位。較佳為針對心肌肌鈣蛋白I之抗體為辨識心肌肌鈣蛋白I特異性表位(尤其是人類心肌肌鈣蛋白I特異性表位)之抗體。
針對心肌肌鈣蛋白之抗體可為多株抗體或單株抗體之任一者。針對心肌肌鈣蛋白之抗體可為免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY)之任一同型(isotype)。針對心肌肌鈣蛋白之抗體亦可為全長抗體。所謂全長抗體意指含有各自包含可變區及恆定區之重鏈及輕鏈的抗體(例如包含2個Fab部分及Fc部分之抗體)。針對心肌肌鈣蛋白之抗體亦可為來自此種全長抗體之抗體片段。抗體片段係全長抗體之一部分，例如可列舉恆定區缺失抗體(例如F(ab')2、Fab'、Fab、Fv)。針對心肌肌鈣蛋白之抗體亦可為單鏈抗體等改型抗體。
針對心肌肌鈣蛋白之抗體可藉由先前公知之方法而製作。例如，針對心肌肌鈣蛋白之抗體可使用上述表位作為抗原而製作。又，上述辨識表位之針對心肌肌鈣蛋白之多數抗體均有市售，因此亦可使用此種市售品。
針對心肌肌鈣蛋白之抗體亦可固定於固相。於本說明書中，有時將固定於固相之抗體簡稱為固相化抗體。作為固相，例如可列舉：能夠收容或搭載液相之固相(例如板、膜片、試管等支持體及孔板、微流路、玻璃毛細管、奈米柱、棒狀管柱(monolith column)等容器)及能夠懸濁或分散於液相中之固相(例如粒子等固相載體)。作為固相之材料，例如可列舉：玻璃、塑膠、金屬及碳。作為固相之材料，亦可使用非磁性材料、或磁性材料，就操作之簡便性等觀點而言，較佳為磁性材料。固相較佳為固相載體，更佳為磁性固相載體，進而更佳為磁性粒子。作為抗體之固相化方法，可利用先前公知之方法。作為此種方法，例如可列舉：物理吸附法、共價鍵結法、利用親和性物質(例如生物素、抗生蛋白鏈菌素)之方法及離子鍵結法。於特定之實施形態中，針對心肌肌鈣蛋白之抗體為固相化於固相之抗體，較佳為固相化於磁性固相之抗體，更佳為固相化於磁性粒子之抗體。
反應步驟可於將前處理步驟之混合溶液與緩衝液進行混合後，使之與經固相化之抗體接觸，又，亦可於緩衝液中預先放入例如固相化於粒子上之抗體而製成粒子液，並將上述混合溶液與粒子液進行混合。關於反應步驟，例如可如免疫凝集法或競爭法般僅以初次反應步驟實施，亦可設置二次反應步驟。再者，於設置二次反應步驟之情形時，亦可於初次反應步驟與二次反應步驟之間 設置用以將未反應成分去除之清洗步驟。
針對心肌肌鈣蛋白之抗體亦可利用標記物質進行標記化。於本說明書中，有時將利用標記物質進行標記化之抗體簡稱為標記化抗體。作為標記物質，例如可列舉：酵素(例如過氧化酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、β-半乳糖苷酶)、親和性物質(例如抗生蛋白鏈菌素、生物素)、螢光物質或蛋白質(例如螢光色素、螢光異硫氰酸鹽、玫瑰紅、綠色螢光蛋白質、紅色螢光蛋白質)、發光或吸光物質(例如螢光素、水母發光蛋白(Aequorin)、吖啶鎓、釕)、放射性物質(例如3H、14C、32P、35S、125I)。又，於本發明之方法中，於設置二次反應之情形時，作為用於二次反應之抗體，亦可利用此種標記物質進行標記化。
於特定之實施形態中，本發明之方法包含辨識與針對心肌肌鈣蛋白之抗體不同表位之，針對心肌肌鈣蛋白之其他抗體作為用於二次反應之抗體。此種其他抗體所辨識之表位之詳細情況與上述對針對心肌肌鈣蛋白之抗體進行詳細說明之表位相同(其中於併用之情形時，表位之種類不同)。由針對心肌肌鈣蛋白之抗體所辨識之表位、與由針對心肌肌鈣蛋白之其他抗體所辨識之表位的組合無特別限定。例如，於使用辨識包含第20個~第60個胺基酸殘基之肽部分中所發現之特定之表位(例如包含第24個~第40個、或第41個~第49個胺基酸殘基之肽)的抗體作為針對心肌肌鈣蛋白I之抗體之情形時，可使用辨識該特定之表位以外之表位、即如下表位之抗體作為針對心肌肌鈣蛋白I之其他抗體：例如包含第20個~第60個胺基酸殘基之肽部分中所發現之其他表位(例如包含第24個~第40個、或第41~第49個胺基酸殘基之肽)、包含第61 個~第120個胺基酸殘基之肽部分中所發現之表位(例如包含第86個~第90個胺基酸殘基之肽)、包含第130個~第150個胺基酸殘基之肽部分中所發現之表位、或包含第160個~第209個胺基酸殘基之肽部分中所發現之表位。此種其他抗體之使用，例如於利用三明治法之情形時較佳。
3.檢測步驟
於初級抗體或二級抗體中使用標記之情形時，藉由適合於所使用之標記之方法進行檢測，例如於使用酵素標記之情形時添加酵素之基質。例如於使用鹼性磷酸酶(ALP)作為標記抗體之情形時，可採用如下之化學發光酵素免疫分析法(CLEIA)之系統，該分析法係使用3-(2'-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3'-磷醯氧基)苯基-1,2-二氧雜環丁烷‧二鈉鹽(AMPPD)作為酵素基質。
本發明之方法係使用針對心肌肌鈣蛋白之抗體之免疫分析。作為此種免疫分析，例如可列舉：直接競爭法、間接競爭法及三明治法。又，作為此種免疫分析，可列舉：化學發光酵素免疫分析法(CLEIA)、化學發光免疫分析(CLIA)、免疫比濁法(TIA)、酵素免疫分析法(EIA)(例如直接競爭ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酵素聯免疫吸附分析法)、間接競爭ELISA及三明治ELISA)、放射免疫分析(RIA)、乳膠凝集反應法、螢光免疫分析(FIA)及免疫層析法。該等免疫分析本身為眾所周知，本無需在此詳細說明，但仍分別加以簡單說明。
直接競爭法係於將針對欲測定之靶抗原(本發明中為心肌肌鈣蛋白I)之抗體固相化於固相(關於固相及固相化如上所 述)，並進行用以防止非特異吸附之阻斷處理(利用血清白蛋白等蛋白質溶液對固相進行處理)後，使該抗體、包含上述靶抗原之受檢樣本(本發明中為如上所述進行過前處理步驟之活體樣本)及一定量之經標記之抗原(標記如上所述)進行反應，並清洗後，對結合於固相之標記進行定量之方法。由於受檢樣本中之抗原與標記抗原會競爭性地與抗體結合，故而受檢樣本中之抗原量越多，結合於固相之標記之量越變少。製作各種已知濃度之抗原標準液，分別固定化於固相並測定標記量(根據標記之性質而測定吸光度、發光強度、螢光強度等，以下相同)，而製作以抗原濃度為橫軸、以標記量為縱軸之檢量線。針對未知之受檢樣本，測定標記量，並將所測得之標記量帶入檢量線，藉此可測定出未知之受檢樣本中之抗原量。直接競爭法本身於該領域中為眾所周知，例如記載於US 20150166678 A1中。
於間接競爭法中，將靶抗原(本發明中為心肌肌鈣蛋白I）固相化於固相(關於固相及固相化如上所述)。繼而，於固相之阻斷處理後，將包含靶抗原之受檢樣本(本發明中為如上所述進行過前處理步驟之活體樣本)、與一定量之抗靶抗原抗體進行混合，並使之與上述固相化抗原進行反應。於清洗後，對結合於固相之上述抗靶抗原抗體進行定量。其可藉由在使針對上述抗靶抗原抗體之經標記之二級抗體(標記如上所述)進行反應，並進行清洗後測定標記量而進行。製作各種已知濃度之抗原標準液，分別固定化於固相並測定標記量，而製作檢量線。針對未知之受檢樣本，測定標記量，將所測得之標記量帶入檢量線，藉此可測定出未知之受檢樣本中之抗原量。再者，亦可不使用標記二級抗體而使用經標記之初級抗 體。間接競爭法本身於該領域中為眾所周知，例如記載於上述US 20150166678 A1中。
三明治法係於將抗靶抗原抗體固相化於固相(關於固相及固相化如上所述)，並進行阻斷處理後，使包含靶抗原之受檢樣本(於本發明中為如上所述進行過前處理步驟之活體樣本)進行反應，並進行清洗後，使之與針對靶抗原之經標記之二級抗體(標記如上所述)進行反應，並清洗後，對結合於固相之標記進行定量之方法。製作各種已知濃度之抗原標準液，分別固定化於固相並測定標記量，而製作檢量線。針對未知之受檢樣本，測定標記量，將所測得之標記量帶入檢量線，藉此可測定出未知之受檢樣本中之抗原量。三明治法本身於該領域中為眾所周知，例如記載於US 20150309016 A1中。
上述各種免疫分析中，化學發光酵素免疫分析法(CLEIA)、化學發光免疫分析(CLIA)、酵素免疫分析法(EIA)、放射免疫分析(RIA)、螢光免疫分析(FIA)係基於進行上述直接競爭法、間接競爭法、三明治法等時所使用之標記之種類而進行分類之免疫分析。化學發光酵素免疫分析法(CLEIA)係使用酵素(例如上述鹼性磷酸酶)作為標記，使用產生化學發光性化合物之基質(例如上述AMPPD)作為基質之免疫分析。酵素免疫分析法(EIA)係使用酵素(例如上述之過氧化酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、β-半乳糖苷酶等)作為標記之免疫分析。作為各酵素之基質，使用能夠藉由吸光度測定等進行定量之化合物。例如於為過氧化酶之情形時使用1,2-苯二胺(OPD)或3,3'5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)等，於為鹼性磷酸酶之情形時使用對硝基苯基磷酸鹽(pNPP)等，於為β-半乳糖苷酶之情形時使 用MG：4-甲基傘形酮半乳糖苷、NG：硝基苯基半乳糖苷等，於為螢光素酶之情形時使用螢光素等。放射免疫分析(RIA)係使用放射性物質作為標記之方法，作為放射性物質，如上所述可列舉：3H、14C、32P、35S、125I等放射性元素。螢光免疫分析(FIA)係使用螢光物質或螢光蛋白質作為標記之方法，作為螢光物質或螢光蛋白質，如上所述可列舉：螢光色素、螢光異硫氰酸鹽、玫瑰紅、綠色螢光蛋白質、紅色螢光蛋白質等。使用該等標記之免疫分析本身於該領域中為眾所周知，例如記載於US 8039223 B或US 20150309016 A1中。
免疫比濁法(TIA)係利用如下現象之免疫分析，該現象係因藉由欲測定之靶抗原(本發明中為心肌肌鈣蛋白I)、與針對該抗原之抗體之間的抗原抗體反應所生成之抗原抗體複合物而使濁度增大。向抗靶抗原抗體溶液中添加各種已知濃度之抗原，分別測定濁度，而製作檢量線。針對未知之受檢樣本，同樣地測定濁度，將所測得之濁度帶入檢量線，藉此可測定出未知之受檢樣本中之抗原量。免疫比濁法本身為眾所周知，例如記載於US 20140186238 A1中。乳膠凝集法係與免疫比濁法類似，係使用表面固定化有抗靶抗原抗體之乳膠粒子之浮游液代替免疫比濁法中之抗體溶液的方法。免疫比濁法及乳膠凝集法本身於該領域中為眾所周知，例如記載於US 820,398 B中。
免疫層析法係於由濾紙、纖維素薄膜、玻璃纖維、不織布等多孔性材料所形成之基體(亦稱為基質或帶)上進行上述三明治法或競爭法之方法。例如於為藉由三明治法所進行之免疫層析法之情形時，將固定化有抗靶抗原抗體之檢測區域設置於上述基體 上，將包含靶抗原之受檢樣本(本發明中為如上所述進行過前處理步驟之活體樣本)添加至基體，自上游側流下展開液而使靶抗原移動至檢測區域，並固定化於檢測區域。將經固定化之靶抗原利用經標記之二級抗體進行夾層，而檢測固定化於檢測區域之標記，藉此檢測受檢樣本中之靶抗原。藉由自檢測區域向上游側預先形成包含標記二級抗體之標記區域，而使靶抗原與標記二級抗體之結合體固定化於檢測區域。於標記為酵素之情形時，包含酵素之基質之基質區域亦設置於檢測區域之更上游側。於為競爭法之情形時，例如可將靶抗原預先固定化於檢測區域，使受檢樣本中之靶抗原、與固定化於檢測區域之靶抗原進行競爭。自檢測區域向上游側預先設置標記抗體區域，使受檢樣本中之靶抗原與標記抗體進行反應，將未反應之標記抗體固定化於檢測區域，並對標記進行檢測或定量，藉此可對受檢樣本中之靶抗原進行檢測或定量。免疫層析法本身於該領域中為眾所周知，例如記載於US 6210898 B中。
<心肌肌鈣蛋白I之測定試藥>
本發明之心肌肌鈣蛋白之測定試藥係能夠實現上述心肌肌鈣蛋白之測定方法的測定試藥。本發明之測定試藥之特徵在於：除含有普通之免疫分析中所使用之構成以外，亦含有包含界面活性劑及酸化劑之任一者或兩者之前處理液作為構成成分。
本發明之試藥於相互隔離之形態或組成物之形態下包含各構成成分。具體而言，各構成成分可以分別收容於不同之容器(例如管、板)中之形態提供，一部分構成成分亦可以組成物之形態(例如同一溶液中)提供。或者，本發明之試藥亦可以器件之形態 提供。具體而言，可以將全部構成成分收容於器件中之形態提供。或者，亦可以將一部分構成成分收容於器件中之形態提供，亦可以未將殘留物收容於器件中之形態(例如收容於不同之容器中之形態)提供。於該情形時，未收容於器件中之構成成分亦可於靶物質之測定時藉由注入至器件中而使用。
於較佳之實施形態中，本發明之試藥亦可具有根據欲採用之免疫分析之種類而定之構成。例如於採用三明治法之情形時，本發明之試藥可包含作為必須構成成分之i)前處理液、ii)針對心肌肌鈣蛋白I之抗體、iii)緩衝液、以及作為任意構成成分之iv)針對心肌肌鈣蛋白I之其他抗體、v)標記物質、vi)稀釋液及視需要之vii)與標記物質反應之基質。ii)及iii)構成成分亦可包含於同一溶液中。iv)構成成分亦可利用v)標記物質進行標記化。較佳為針對心肌肌鈣蛋白之抗體亦可固相化於磁性粒子。
[實施例] <實施例1 SDS前處理之效果確認試驗(1)> (1)抗心肌肌鈣蛋白I(cTnI)抗體板之製作
向聚苯乙烯製96孔微孔板(Nunc公司製造)以100μL/孔分注包含2μg/mL之抗cTnI抗體19C7(Hytest公司製造)的抗體稀釋液(0.1M碳酸氫鈉，pH值9.6)，並於4℃下培養一夜。利用PBS(phosphate buffered solution，磷酸鹽緩衝液)清洗微孔板3次，繼而以350μL/孔分注阻斷液(含有0.5%酪蛋白鈉、2%蔗糖、0.05%ProClin(註冊商標)300之PBS)，並於室溫下培養2小時以上。於去除阻斷液後，使板乾燥，而製成抗cTnI抗體板。
(2)檢體前處理
製備表1所示之前處理液1~3。針對cTnI濃度已知之2個血清檢體與空白組(健康人血清)，以成為前處理液：血清檢體=1：2(體積比，以下同樣)之方式與前處理液1~3進行混合，並於1000rpm之振盪條件下以80℃加熱5分鐘，而製成處理完成檢體。總之，以成為PBS：血清檢體=1：2之方式將PBS與各血清檢體進行混合，而製成未處理檢體(無加熱)。血清檢體之cTnI濃度係預先使用Siemens公司之Centaur進行測定。
(3)檢體中之cTnI測定
以成為處理完成檢體：緩衝液=1：2之方式將處理完成檢體與緩衝液(24mM磷酸二氫鉀、76mM磷酸氫二鉀、1.0%BSA、1.0%PVP、0.05%酪蛋白鈉、0.05%Tween20(商品名)、0.05%氯化鈉、0.10%ProClin(註冊商標)300)進行混合，並以100μL/孔添加至抗cTnI抗體板(初次反應)。於振盪條件下以室溫使之反應2小時後，利用清洗液(0.05%Tween20(商品名)/PBS)清洗5次。以100μL/孔分注包含1μg/mL之生物素化抗cTnI抗體16A11(Hytest公司)之緩衝液，並於振盪條件下以室溫使之反應1小時(二次反應)。於利用清洗液清洗5次後，以100μ/孔分注將HRP標記抗生蛋白鏈菌素(Roche公司製造)用緩衝液稀釋10000倍而成之標記抗體液，並於振盪條件下以室溫使之反應30分鐘。於利用清洗液清洗5次後，以100μL/孔分注OPD基質液(Wako公司製造)，並於室溫下於暗處靜置15分鐘。以100μL/孔分注2N硫酸使反應停止，並測定各孔 之490nm/630nm之吸光度。
(4)結果
將各前處理條件下之cTnI測定結果示於表1。得知藉由進行前處理，陽性檢體之訊號強度(吸光度)上升。尤其於以前處理液2、3之條件進行前處理之情形時，得知與未處理之測定條件相比訊號強度、S/N比均提高。
<實施例2 SDS前處理之效果確認試驗(2)>
針對cTnI濃度已知之血清檢體7例，將前處理液設為表2中之前處理液4，除此以外，藉由與實施例1相同之方法進行測定。將測定結果示於表2。
<實施例3 SDS前處理‧測定系統之特異性確認>
針對濃度已知之血清檢體4例，向初次反應系統添加20μg/mL之抗cTnI抗體19C7(Hytest公司)，並向二次反應系統添加10μg/mL之未標記抗cTnI抗體16A11，除此以外，進行與實施例2相同之試驗(抑制試驗)。將各條件下之測定結果及與實施例2之結果之比較示於表3。確認到於抑制試驗中，即便於所有檢體中實施前處理亦有超過95%之抑制，確認為具有特異性之測定系統。
<實施例4 酸性化前處理之效果確認‧ELISA> (1)抗cTnI抗體板之作成
向聚苯乙烯製96孔微孔板(Nunc公司製造)中以100μL/孔分注包含2μg/mL之抗cTnI抗體24F9(富士麗比歐公司製造，辨識cTnI之第37個~第60個胺基酸殘基)之抗體稀釋液(0.1M碳酸氫鈉，pH值9.6)，並於4℃下培養一夜。利用PBS清洗微孔板3次，繼而以350μL/孔分注阻斷液(包含0.5%酪蛋白鈉、2%蔗糖、0.05%ProClin(註冊商標)300之PBS)，並於室溫下培養2小時以上。於去除阻斷液後，使板乾燥，而製成抗cTnI抗體板。
(2)cTnI之測定
針對cTnI濃度已知之3個血清檢體與空白組(健康人血清)，將各70μL與前處理液5(0.83M脲、0.14N鹽酸、0.25%TritonX-100(商品名)、0.07%C18TAB、0.17%C16APS、0.02%CHAPS、83.3mM咪唑、20mM DEAET)70μL進行混合，並於37℃下加溫5分鐘，而製備酸性化前處理樣本。針對同一檢體，另外將各70μL與70μL 之PBS進行混合，並同樣地進行加溫，將由此而得者作為未處理樣本。血清檢體之cTnI濃度係預先利用Siemens公司之Centaur進行測定。
向抗cTnI微孔板中分注25μL之緩衝液(0.6M Bicine、2%蔗糖、10mM EDTA 2Na、2%BSA、ProClin(註冊商標)300、NaOH(~pH值9.2))，繼而以添加樣本(酸性化前處理，未處理)各75μL進行混合。針對未處理檢體，使用pH值7.0之緩衝液。於振盪條件下以37℃培養1小時，利用清洗液(0.05%Tween20(商品名)/PBS)清洗5次。以100μL/孔分注包含1μg/mL之生物素化抗cTnI抗體16A11(Hytest公司)之緩衝液，並於振盪條件下以37℃使之反應1小時(二次反應)。於利用清洗液清洗5次後，以100μL/孔分注將HRP標記抗生蛋白鏈菌素(Roche公司製造)用緩衝液稀釋10000倍而成之標記抗體液，並於振盪條件下以室溫使之反應30分鐘。於利用清洗液清洗5次後，以100μL/孔分注OPD基質液(Sigma公司製造)，並於室溫下於暗處靜置15分鐘。以100μL/孔分注2N硫酸使反應停止，測定各孔之490nm/630nm之吸光度。
將各樣本之cTnI測定結果示於表4。得知藉由進行酸性化前處理，陽性檢體之訊號強度(吸光度)上升。
<實施例5 酸性化前處理之效果確認‧CLEIA> cTnI測定試藥之製備
抗體結合粒子溶液(固相化抗體溶液)：將於羧基化磁性粒子(富士麗比歐製造)上結合有抗cTnI抗體24F9之抗體結合磁性粒子以成為0.025%(w/v)之濃度之方式懸濁於緩衝液(36mM磷酸二氫鉀、114mM磷酸氫二鉀、2.5%BSA、0.05%酪蛋白鈉、1.5%TritonX-100(商品名)、0.1M氯化鈉、20mM EDTA2Na、0.1%ProClin(註冊商標)300，pH值7.0)中，而製備抗體結合粒子溶液。
標記化抗體溶液：對於利用鹼性磷酸酶(高活性，糖減少之重組體，Roche製造)對抗cTnI抗體16A11(Hytest公司)進行標記而成之標記化抗體，利用標記體稀釋液(50mM MES、2.5%(w/v)BSA、100mM NaCl、0.3mM ZnCL2及1.0mM MgCl2，pH值6.8)以成為0.5μg/mL之方式加以稀釋，而製備標記化抗體溶液。
將該等溶液填充至自動免疫測定裝置Lumipulse Presto(富士麗比歐公司製造)之專用試藥瓶中，並設置於特定之位 置。
(2)檢體之酸性化前處理
針對16個血清檢體，將各67μL與前處理液6(0.83M脲、0.14N鹽酸、0.25%TritonX-100(商品名)、0.07%C18TAB、0.17%C16APS、0.02%CHAPS、83.3mM咪唑、20mM DEAET)134μL進行混合，並於37℃下加溫5分鐘。其後，添加101μL之中和溶液(0.6M之二羥乙甘胺酸、2%蔗糖、10mM EDTA 2Na、2%BSA、200mM NLS、ProClin(註冊商標)300、1N NaOH(~pH值9.2))進行混合，而製備酸性化前處理樣本。
(3)cTnI量測定
利用自動免疫測定裝置(Lumipulse Presto，富士麗比歐公司製造)根據以下順序而測定酸性化前處理樣本之cTnI量。
向反應用比色管中分注抗體結合粒子溶液50μL與酸性化前處理樣本100μL，而製備第1反應液。針對第1反應液，於攪拌後以37℃培養8分鐘，而形成結合於磁性粒子上之抗cTnI抗體與樣本中所含之cTnI抗原之免疫複合體。
於培養後，將磁性粒子利用磁鐵聚集於管壁，而去除未結合於磁性粒子上之物質。其後，反覆進行清洗液(Lumipulse(註冊商標)清洗液，富士麗比歐公司製造)之注入及清洗液之去除，而清洗磁性粒子。
於清洗後，將標記化抗體溶液50μL及磁性粒子進行混合，而製備第2反應液。針對第2反應液，於37℃下培養8分鐘， 而形成包含固相化於磁性粒子上之抗cTnI抗體-cTnI抗原-標記抗體之免疫複合體。
於培養後，將磁性粒子再次利用磁鐵聚集於管壁，而去除未結合於磁性粒子之物質。其後，反覆進行清洗液之注入及清洗液之去除，而清洗磁性粒子。
對磁性粒子添加包含AMPPD(3-(2'-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3'-磷醯氧基)苯基-1,2-二氧雜環丁烷‧二鈉鹽)之基質液(Lumipulse(註冊商標)基質液，富士麗比歐公司製造)200μL，並進行攪拌後，於37℃下培養4分鐘。基質液中所含之AMPPD因間接性地結合於磁性粒子之鹼性磷酸酶之觸媒作用而發生分解，於波長477nm發出具有極大發光之光。由於發光強度反映出結合於磁性粒子之cTnI量，故而可藉由測定波長477nm之發光強度(計數)而測定cTnI量。
(4)與市售試藥之測定值之比較
針對藉由上述方法而測定之16個血清檢體，另外使用市售試藥，依據隨附說明書之記載而測定cTnI。將各檢體之市售試藥之測定值、與藉由上述(1)~(3)所示之方法而獲得之測定值(計數)示於表5及圖1。本發明之方法與市售試藥之cTnI測定值於大多數之檢體顯示良好之關聯，但藉由本發明之方法而測定值顯著變高之檢體有2個檢體(No.15、16)。
<實施例6 背離檢體之藉由凝膠過濾層析法所進行之解析> (1)背離檢體之凝膠過濾層析法
於實施例5中，針對酸化劑前處理樣本之測定值自與市售試藥之關聯曲線向高值側背離之檢體No.16，為了明確高值化之原因，而利用凝膠過濾層析法進行解析。
將過濾完畢之凝膠過濾緩衝液(50mM PB、0.05%Tween20、0.08%CHAPS、300mM NaCl、1mM EDTA，pH值6.0)50μL與過濾完畢之檢體150μL進行混合，進而添加過濾完畢之蛋白酶抑制劑14μL，而製備凝膠過濾樣本。將樣本全量導入至凝膠過濾管柱，於下述條件下進行分離。
(分離條件)
管柱：Superdex 200 10/30
分離緩衝液：50mM PB、0.05%Tween20、0.08%CHAPS、300mM NaCL、1mM EDTA，pH值6.0
流速：0.5mL/分鐘
回收範圍：6~23mL Total 34 fr.(0.5mL/組分)
(2)已知濃度TnI溶液之回收試驗
向已回收之各組分100μL添加80μL之1.125ng/mL天然肌鈣蛋白I(TnI)溶液，而製備回收率測定用樣本。除了將固相化於磁性粒子之抗體自24F9變更為19C7以外，藉由與實施例5相同之方法而製備抗體結合粒子溶液、標記化抗體溶液，針對各組分之回收率測定用樣本，利用Lumipulse Presto於與實施例5相同之條件下進行cTnI之測定。將各組分之測定結果(發光強度(計數))示於圖2。關於未處理之檢體No.16，表示於11.5mL附近之溶出組分中存在顯著地抑制天然TnI與19C7抗體之反應的物質。根據溶出容量及與抗人IgG抗體之反應性等，而提示該抑制物質為人抗cTnI抗體(自體抗體)。
於實施例5中作為比較用而實施之利用市售試藥之cTnI測定法係不包括檢體之前處理等步驟的對天然TnI進行測定之系統，但於檢體No.16之測定時，有可能受到上述抑制物質之影響而成為低於實際之cTnI量之低值。另一方面，於本發明之方法中，藉由利用檢體之前處理使cTnI成為單體，可避免對與天然TnI之反應進行特異性抑制之物質(推測為自體抗體)之影響，故而推測cTnI測定值變高，自與市售試藥之關聯曲線向高值側背離。
<實施例7 酸化劑之最佳濃度>
對酸性化前處理中所使用之酸化劑之最佳濃度進行研究。除了將鹽酸濃度設為0.03、0.05、0.06、0.125、0.25、0.28、0.5N之任一者以外，藉由與實施例5相同之方法而製備7種前處理劑。針對與各前處理劑對應之中和溶液，除了以與前處理液之混合後之pH值成為7.5±0.2之方式調整pH值以外，藉由與實施例5相同之方法進行製備。
針對天然TnI、cTnI濃度已知之2個血清檢體(No.17、18)，以cTnI濃度成為2250pg/mL之方式利用PBS加以稀釋。繼而，使用上述7種前處理液及所對應之中和溶液，藉由與實施例5相同之方法分別進行酸性化前處理。針對各酸性化前處理樣本，藉由與實施例5相同之方法並利用Lumipulse Presto而測定與cTnI量對應之發光強度(計數)。利用PBS代替上述天然TnI及檢體亦進行相同之處理及測定，設為空白組。於用各樣本之計數值除以所對應之空白組之計數值而算出S/N比之表6及圖3中表示各酸處理條件下之S/N比。
於本實施例中，酸性化前處理發揮出於酸濃度超過0N且為0.5N以下之條件下使S/N比上升之效果。確認到尤其於酸濃度為0.03N~0.125N時S/N比上升。
針對本實施例中所使用之抗cTnI抗體24F9，發明者等人確認到其與天然TnI相比，更強烈地與cTnI單體進行反應(未揭示資料)。另一方面，確認到市售之抗cTnI抗體19C7雖然亦與cTnI單體反應，但更強烈地與天然TnI反應(未揭示資料)。於使用19C7之類的抗體之情形時，雖然藉由酸性化前處理可獲得避免抑制物質之影響的效果，但該效果有可能被cTnI之單體化所抵消。於使用24F9之類的抗體之情形時，藉由酸性化前處理，除了具有避免抑制物質之影響的效果以外，cTnI之單體化亦進一步正向地發揮作用，因此推測即便為較低之酸濃度亦使測定值顯著上升。
<110> 富士麗比歐股份有限公司(FUJIREBIO,INC.)
<120> 心肌肌鈣蛋白之測定方法及測定試藥
<130> PF598-PCT
<160> 1
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 210
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1

Claims (8)

  1. 一種藉由免疫分析而測定自活體分離之樣本中之心肌肌鈣蛋白的方法，其包括將自活體分離之樣本、與包含界面活性劑及酸化劑之任一者或兩者之前處理液進行混合之前處理步驟。
  2. 如請求項1之方法，其中，上述前處理液進而包含還原劑。
  3. 如請求項1或2之方法，其中，上述前處理液包含界面活性劑，該界面活性劑為選自由陰離子性界面活性劑、陽離子性界面活性劑、兩性離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑所構成之群中之1種以上之界面活性劑。
  4. 如請求項3之方法，其中，上述界面活性劑為陰離子性界面活性劑。
  5. 如請求項3之方法，其中，上述前處理步驟係於加熱條件下進行。
  6. 如請求項1之方法，其中，上述前處理液包含酸化劑，且前處理步驟中之酸化劑之最終濃度超過0.05N且為0.5N以下。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中，上述心肌肌鈣蛋白為心肌肌鈣蛋白I。
  8. 一種心肌肌鈣蛋白之免疫分析用試藥，其具備包含界面活性劑及酸化劑之任一者或兩者之前處理液。
TW106131254A 2016-09-13 2017-09-12 心肌肌鈣蛋白之測定方法及測定試藥 TW201812300A (zh)

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