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TW201811830A - 特異性結合至ｃｄ３和ｃｄ１２３的雙特異性抗體樣結合蛋白 - Google Patents

特異性結合至ｃｄ３和ｃｄ１２３的雙特異性抗體樣結合蛋白 Download PDF

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TW201811830A TW106123588A TW106123588A TW201811830A TW 201811830 A TW201811830 A TW 201811830A TW 106123588 A TW106123588 A TW 106123588A TW 106123588 A TW106123588 A TW 106123588A TW 201811830 A TW201811830 A TW 201811830A
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Abstract

本發明涉及特異性結合至CD3和CD123的抗體樣結合蛋白。本發明還涉及包含所述抗體樣結合蛋白的醫藥組合物及所述醫藥組合物和抗體樣結合蛋白用於治療癌症的用途。本發明進一步涉及包含編碼所述抗體樣結合蛋白的序列的分離的核酸、載體和宿主細胞。

Description

特異性結合至CD3和CD123的雙特異性抗體樣結合蛋白
本發明涉及特異性結合至CD3和CD123的抗體樣結合蛋白。本發明還涉及包含所述抗體樣結合蛋白的醫藥組合物以及所述醫藥組合物和抗體樣結合蛋白用於治療癌症的用途。本發明還涉及包含編碼所述抗體樣結合蛋白的序列的分離的核酸、載體和宿主細胞。
第一代雙特異性抗體是在20多年前開發的。此後，一些臨床研究已經測試了針對靶向癌細胞表面抗原而設計的雙特異性抗體。這組抗癌融合蛋白含有兩個或更多個功能域，其將靶向的癌細胞附近的免疫效應細胞局部定位以達到抗癌活性。
隨著雙特異性抗體技術的發展，通過僅用柔性接頭(不包括Fc氨基酸片段)連接兩個抗體單鏈可變區(scFv)來產生不同的一類融合蛋白，稱為雙特異性T細胞銜接體(BiTE)，一個scFv結合靶向的細胞，另一個則結合T細胞表面上的CD3。一種具有CD19xCD3雙特異性結合活性的BiTE，博納吐單抗(blinatumomab)在針對具有B系急性淋巴母細胞中的微小殘留病的患者的II期臨床試驗中顯示出有希望的結果。
CD123(白細胞介素-3受體α鏈IL-3Rα)是在多種血液腫瘤中過度表達的 腫瘤抗原。大多數AML細胞表達表面CD123，並且該表達不隨AML的亞型變化。據報道，在診斷時CD123在AML中的較高表達與較差的預後相關。已經報道CD123在白血病幹細胞(LSC)上表達。越來越多的證據表明，AML是由這些白血病幹細胞(LSC)產生的，這些白細胞幹細胞已被證明是靜止的，並且對DNA損傷化學療法是相對抗性的。因此，與造血幹細胞(HSC)相比LSC上的CD123增加的表達提供了AML-LSC的治療性靶向的機會。
已經顯示針對CD123產生的單克隆抗體(MAb)7G3抑制白血病細胞株和原代細胞二者的IL-3介導的增殖和活化(美國專利No.6,177,078)。然而，靶向CD123是否可以在功能上損害AML-LSC仍然不清楚。
如本發明人所示，使用CD123xCD3抗體樣結合蛋白導致腫瘤細胞殺傷。
已經在國際專利申請WO2013/173820中提出幷描述了製備具有CD123xCD3雙特異性結合活性的雙特異性抗體樣結合蛋白的想法。
此外，基於來自MacroGenics的分子的CD123 x CD3雙重親和性重定向(DART)雙特異性抗體在2014年進入I期臨床試驗。
然而，如本發明人所示，例如，在不存在靶細胞的情況下，基於來自MacroGenics的分子的CD123 x CD3雙重親和性重定向(DART)雙特異性抗體具有表達CD4+的T細胞的82%和表達CD8+的T細胞的83%的活化。T細胞不適當的活化可能導致嚴重的副作用，如細胞因數釋放綜合征。細胞因數釋放綜合征是指由活化的T細胞導致的細胞因數釋放，其產生與嚴重感染中發現的那些類似的一類全身性炎症反應，並且特徵為低血壓、發熱和寒顫。已經報道了由於細胞因數釋放綜合征導致的死亡，例如針對抗CD3抗體OKT3所報道的。
抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白描述于專利申請PCT/EP2016/051386中，該專利申請在本專利申請的優先權日之時尚未公佈(根據歐洲專利公約第 54(3)條)。因此，儘管在雙特異性抗體技術方面取得了進步，但是仍然需要另外的癌症治療劑，特別是直接或間接有效靶向和殺死癌細胞的癌症治療劑。此外，需要開發具有期望的生物活性、良好的代謝、藥代動力學和安全性概貌的新的抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白，並且還可以與工業實踐相容地大規模生產。
因此，在本發明的上下文中，發明人成功地開發了包含突變(例如RF突變和節-入-穴(Knob-into-hole)突變)的抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白的幾種變異體，從而降低所述抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白在表達過程中的聚集。通過減少聚集體的量，可以實現表達和純化過程中抗體樣結合蛋白的異二聚體的量的增加，從而提高純化的抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白的產率。
因此，本發明涉及包含導致在表達和/或純化過程中聚集減少的突變的抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白。所述抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白在不存在表達CD123的靶細胞例如THP-1細胞的情況下具有低的T細胞活化能力，但是在存在表達CD123的靶細胞例如THP-1細胞的情況下具有高的T細胞活化能力。
抗CD3抗體
“CD3”表示作為多分子T細胞受體複合物的一部分的T細胞上表達的抗原，所述抗原由至少三種不同的鏈CD3ε，CD3δ和CD3γ組成。CD3δ和CD3γ與人CD3ε具有低序列同一性和/或相似性(相似性和同一性小於20%)。CD3ε和CDR3δ可以一起形成複合物，即所謂的“CD3ε/δ複合物”。CD3ε也與CDR3γ形成複合物，即所謂的“CD3ε/γ複合物”。T細胞上的CD3聚簇(例如通過固定的抗CD3抗體)導致T細胞活化，其類似於T細胞受體參與，但獨立於其克隆典型特異性。“CD3ε”包含三個結構域，胞內結構域、跨膜結構域和胞外結構域。
大多數現有技術的抗CD3抗體識別CD3ε鏈。這種現有技術的抗CD3抗體之一是OKT3。現有技術例如使用抗體分子OKT3來例示了使用抗體分子的 T細胞活化事件。抗CD3抗體及其變異體已經在現有技術(US 4,361,549；US 4,361,549；US 5,885,573；US 5,929,212；和WO 98/52975或US 5,955,358)中有描述。OKT3已被進一步用作臨床移植治療同種異體移植排斥反應的有效免疫抑制劑(Thistlethwaite 1984,Transplantation 38,695-701；Woodle 1991,Transplantation 51,1207-1212；Choi 2001,Eur.J.Immunol.31(1),94-106)。
該療法的主要缺點是由於T細胞與攜帶FcγR的細胞和人抗小鼠抗體(HAMA)反應之間的交聯而在細胞因數釋放中表現出T細胞活化。幾篇出版物已經描述了改變，例如OKT3的人源化，以減少這些副作用：US 5,929,212；US 5,885,573等。另一方面，OKT3或其他抗CD3抗體可用作免疫增強劑以刺激T細胞活化和增殖(US 6,406,696 Bluestone；US 6,143,297 Bluestone；US 6,113,901 Bluestone；Yannelly 1990,J.Immunol.Meth.1,91-100)。抗CD3抗體也被描述為與抗CD28抗體組合用於誘導T細胞增殖的試劑(US 6,352,694)。OKT3本身或作為靶向細胞毒性T細胞到腫瘤細胞或病毒感染細胞的雙特異性抗體的組分進一步使用(Nitta 1990,Lancet 335,368-376；Sanna 1995,Bio/Technology 13,1221-1224；WO 99/54440)。
迄今為止使用抗體作為招募T細胞的藥物的方法受到若干發現的阻礙。首先，對T細胞具有高結合親和力的天然或工程化抗體通常不會啟動它們所結合的T細胞。第二，與T細胞結合親和力低的天然或工程化抗體在引發T細胞介導的細胞裂解的能力方面往往是無效的。
包括信號肽的全長人CD3ε蛋白的參考序列可從Uniprot數據庫獲得，登錄號為P07766(2014年12月12日可獲得)，在此包含在SEQ ID NO：1中。
包括信號肽的全長食蟹猴(Macaca fascicularis)CD3ε蛋白的參考序列可從Uniprot數據庫獲得，登錄號為Q95LI5(2014年12月12日可獲得)，在此包含在SEQ ID NO：2中。
由發明人從基因組DNA克隆的成熟人CD3ε His標記的Fc融合蛋白的序列公開在SEQ ID NO：3中。所述成熟人CD3ε His標記的Fc融合蛋白包含全長 人CD3ε蛋白的氨基酸23至126，因此包含人CD3ε的胞外結構域。
由發明人從基因組DNA克隆的成熟食蟹猴CD3ε Fc融合蛋白的序列公開在SEQ ID NO：4中。所述成熟的食蟹猴CD3ε Fc融合蛋白包含全長食蟹猴CD3ε蛋白的氨基酸23至117並且因此包含人或食蟹猴CD3ε的胞外結構域，其與野生型序列的氨基酸位置57相比，在氨基酸位置35處含有一個由丙氨酸至纈氨酸的交換。
人和食蟹猴CD3ε的結構域組織如下(基於Uniprot P07766序列(人)和Uniprot Q95LI5序列(食蟹猴))：
因此，人CD3ε的胞外結構域由SEQ ID NO：1的位置23-126的氨基酸組成，食蟹猴的胞外結構域由ε-SEQ ID NO：2的位置22-117的氨基酸組成。
在“hz20G6Xhz7G3”抗體樣結合蛋白的上下文中使用其重鏈和輕鏈可變域的序列的人源化抗CD3抗體“hz20G6”包含- 由如下序列組成的重鏈可變域
包含序列SEQ ID NO：5的CDR1-H，序列SEQ ID NO：6的CDR2-H和序列SEQ ID NO：7的CDR3-H的(SEQ ID NO：9，CDR以粗體字表示)，和- 由如下序列組成的輕鏈可變域DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSP
包含序列SEQ ID NO：11的CDR1-H，序列“KVS”的CDR2-H和序列SEQ ID NO：8的CDR3-H的(SEQ ID NO：10，CDR以粗體字表示)。
在本發明的上下文中使用的人源化抗CD3抗體“hz20G6”顯示出對人和食蟹猴CD3蛋白二者的高親和性，但是在不存在靶細胞的情況下具有低T細胞活化。
抗CD3抗體“hz20G6”特定結合人CD3或人和食蟹猴CD3的胞外結構域。更具體地，所述抗體結合CD3ε。更具體地，抗CD3抗體結合人和食蟹猴的CD3ε的胞外結構域。當以複合物如CD3ε/δ複合物的形式存在時，或當作為單一蛋白存在時，抗CD3抗體與CD3ε結合，無論是否以分離形式表達或存在於可溶性胞外結構域或全長膜-錨定的CD3ε中(如例如存在於T細胞中)，都是無差別的。
本發明上下文中使用的抗CD3抗體“hz20G6”特異性針對表面人CD3蛋白，或人和食蟹猴CD3蛋白特別是CD3ε。具體地，抗體不與上述人和食蟹猴CD3γ和/或CD3δ蛋白的胞外結構域結合或不顯著交叉反應。
本發明上下文中使用的抗CD3抗體“hz20G6”是抗CD3抗體“20G6”的人源化形式。抗CD3抗體“20G6”與人CD3ε/δ複合物的ka值為3,5*104(1/Ms)，kd為2,7*10-4(1/s)，導致KD為7,7*10-9(M)，與食蟹猴CD3ε/δ複合物的ka為2,7*104(1/Ms)，kd為2,2*10-4(1/s)，導致KD為8,2*10-9(M)，均由Biacore測量(數據未顯示)。因此抗CD3抗體“20G6”對食蟹猴CD3的親和力對人CD3(KD(食蟹猴)/KD(人))的親和力之比為1。因此，抗CD3抗體“20G6”和從其衍生的抗體樣結合蛋白可以用於在猴子中進行的毒理學研究中，用在猴中觀察到的相關毒性概貌來預期人中潛在的不良反應。
因此，本抗體樣結合蛋白的上下文中使用的抗CD3抗體“20G6”對於人CD3或食蟹猴CD3或兩者均具有10nM的親和力(KD)。
抗CD123抗體
“CD123”(分化簇123)也稱為“白細胞介素3受體，α(IL3RA)”或“IL3R”，“IL3RX”，“IL3RY”，“IL3RAY”，“hIL-3Ra”，且表示異二聚體細胞因數受體的白細胞介素3特異性亞基。功能性白介素3受體是包含與粒細胞巨噬細胞集落刺激因數(GM-CSF)和白細胞介素5(IL-5)的受體共有的特異性α鏈(IL-3A；CD123)和IL-3受體β鏈(β0；CD131)的異二聚體。CD123是一種I型整合的跨膜蛋白，其推導的分子量約43kDa，其含有參與IL-3結合的胞外結構域，跨膜結構域和約50個氨基酸的短胞質尾部。胞外結構域由兩個區域組成：約100個氨基酸的N-末端區域，其序列顯示與GM-CSF和IL-5受體α鏈的等同區域的相似性；以及接近跨膜結構域的區域，其包含四個保守的半胱氨酸殘基和WSXWS基序，其是與該細胞因數受體家族的其他成員共有的。IL-3結合域包含由兩個Ig樣折疊結構域組成的約200個氨基酸殘基的細胞因數受體基序(CRM)。CD123的細胞外結構域是高度糖基化的，N-糖基化對於配體結合和受體信號傳導均是必需的。蛋白質家族聚集了三個成員：IL3RA(CD123A)，CSF2RA和IL5RA。三個成員之間的總體結構在是充分保守的，但序列同源性非常低。迄今為止已經發現了CD123的一個300個氨基酸長的同種型，但僅處於RNA水準，其Getentry數據庫中可以登錄號ACM24116.1訪問。
包括信號肽的全長人CD123蛋白的參考序列可從NCBI數據庫以登錄號NP_002174.1和Uniprot登錄號P26951獲得，並且在本文公開於SEQ ID NO：12(於2014年12月14日可獲得)中。
包括信號肽的全長食蟹猴CD123蛋白的參考序列可從GenBank數據庫以登錄號EHH61867.1和Uniprot登錄號G8F3K3獲得，並且在本文公開於SEQ ID NO：13(於2014年12月14日可獲得)中。
由發明人從基因組DNA克隆的成熟人CD123 His-II標記的Fc-融合蛋白的序列公開在SEQ ID NO：14中。所述成熟人CD123 Fc融合蛋白包含全長人CD123蛋白的氨基酸19至305，因此包含人CD123的胞外結構域。
SEQ ID NO：15中公開了由發明人克隆的成熟食蟹猴CD123 His-II標記的Fc融合蛋白的序列。所述成熟食蟹猴CD123 Fc融合蛋白包含全長食蟹猴CD123蛋白的氨基酸19至305，因此包含食蟹猴CD123的胞外結構域。
人和食蟹猴CD123的結構域組織如下(基於在NCBI數據庫中可以登錄號NP_002174.1訪問的人CD123序列(SEQ ID NO：12)，以及基於可以在Uniprot數據庫中以登錄號G8F3K3訪問的食蟹猴CD123序列，SEQ ID NO：13)：
因此，人CD123的胞外結構域由SEQ ID NO：12的位置19-305的氨基酸組成。
CD123(白細胞介素-3受體α鏈IL-3Rα)是在各種血液腫瘤中過表達的腫瘤抗原。大多數AML原始細胞(blasts)表達CD123，並且該表達不隨AML的亞型變化。據報道，CD123在AML診斷中的較高表達與較差的預後相關。CD123表達已在其他血液惡性腫瘤中被報道，包括骨髓增生異常、全身性肥大細胞增多症、胚芽狀(blastic)漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤(BPDCN)、ALL和毛細胞白血病。
CD123在AML白血病幹細胞上表達，並且生長證據表明AML來自這些LSC，其已被證明是靜止的，並且對DNA損傷型化療是相對抗性的。假設LSC的持續性加強了初次緩解後的復發，因此根除LSC可被認為是治癒的要求，也是重要的治療目標。
已顯示針對CD123產生的單克隆抗體(MAb)7G3抑制IL-3介導的白血病細胞株和原代細胞的增殖和活化(美國專利No.6,177,078)。具體地，美國專利號6,177,078公開了抗IL-3受體α鏈(IL-3Rα，CD123)單克隆抗體7G3，和7G3 與IL-3Rα的N-末端結構域(特別是氨基酸殘基19-49)結合的能力。美國專利No.6,733,743公開了通過如下步驟來損害表達CD123但不顯著表達CD131的血液癌祖細胞的方法：使細胞與抗體和細胞毒性劑(選自化療劑、毒素或α發射放射性同位素)的組合物接觸，由此組合物以有效引起細胞死亡的量選擇性地結合CD123。然而，靶向CD123是否可以在功能上損害AML-LSC尚未明確。
“hz20G6Xhz7G3”抗體樣結合蛋白的上下文中使用了其重鏈和輕鏈可變域的序列的人源化抗CD123抗體“hz7G3”包含- 包含如下序列的重鏈可變域
包含序列SEQ ID NO：50的CDR1-H，序列SEQ ID NO：53的CDR2-H和序列SEQ ID NO：51的(CDR3-H的SEQ ID NO：52，其CDR以粗體字表示)，和- 包含如下序列的輕鏈可變域
包含序列SEQ ID NO：48的CDR1-L，序列“WAS”的CDR2-L和序列SEQ ID NO：49的CDR3-L的(SEQ ID NO：54，其CDR以粗體字表示)。
人源化抗CD123抗體“hz7G3”在SEQ ID NO：52的位置55處含有N到S的突變，以避免存在潛在的脫醯胺化。如本領域技術人員已知的，已知抗體中脫醯胺位點的存在導致抗體樣品的異質性，因此優選為避免的。
定義
在整個即時應用中，術語“和/或”是語法連接詞，其解釋為涵蓋其連接的一個或多個情況可能發生。例如，術語“這樣的天然序列蛋白可以使用標準 重組和/或合成方法製備”表示天然序列蛋白質可以使用標準重組和合成方法製備，或天然序列蛋白可以使用標準重組方法製備或天然序列蛋白可以使用合成方法製備。
此外，在整個本申請中，術語“包含/包括(comprising)”解釋為涵蓋所有具體提到的特徵以及任選的、額外的、未指定的特徵。如本文所使用的，術語“包含/包括”的使用還公開了其中不存在除具體提及的特徵之外的特徵(即“由...組成”)的實施例。此外，不定冠詞“a”或“an”不排除多個。在相互不同的從屬權利要求中僅記載某些措施的情形幷不表示不能採用這些措施的組合。
“抗體”，也稱為“免疫球蛋白”，可以是天然的或常規的抗體，其中兩個重鏈通過二硫鍵彼此連接，並且每個重鏈通過二硫鍵連接到輕鏈。存在兩種類型的輕鏈，λ(1)和κ(k)。存在五種主要的重鏈類型(或同種型)：IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其絕對抗體分子的功能活性。每條鏈含有不同的序列結構域。輕鏈包括兩個域或區，可變域(VL)和恒定域(CL)。重鏈包括四個結構域，一個可變域(VH)和三個恒定域(CH1，CH2和CH3，統稱為CH)。輕鏈(VL)和重鏈(VH)二者的可變區決定了對抗原的結合識別和特異性。輕鏈(CL)和重鏈(CH)二者的恒定區域賦予重要的生物學特性，例如抗體鏈締合、分泌、跨胎盤遷移、補體結合和與Fc受體(FcR)的結合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N末端部分，由一個輕鏈和一個重鏈的可變部分組成。抗體的特異性在於抗體結合位點與抗原決定簇之間的結構互補性。抗體組合位點由主要來自高變區或互補決定區(CDR)的殘基組成。有時，非高變區或框架區(FR)的殘基影響整個結構域結構，從而影響結合位點。互補決定區或CDR是指共同定義天然免疫球蛋白結合位點的天然Fv區的結合親和力和特異性的氨基酸序列。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各自具有三個CDR，分別稱為CDR1-L，CDR2-L，CDR3-L和CDR1-H，CDR2-H，CDR3-H。因此，常規的抗體抗原結合位點包括六個CDR，其包含來自重鏈和輕鏈V區各自的CDR組。
在本發明的上下文中，抗體或免疫球蛋白是IgM，IgD，IgG，IgA和IgE。
“框架區”(FR)是指介於CDR之間的氨基酸序列，即在單一物種中不同免疫球蛋白之間相對保守的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區的那些部分。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈分別具有四個FR，分別命名為FR1-L，FR2-L，FR3-L，FR4-L和FR1-H，FR2-H，FR3-H，FR4-H。因此，輕鏈可變域可以命名為(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)，而重鏈可變域可以命名為(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。
瞭解本領域技術人員的氨基酸序列可以容易地確定框架區FR1-L，FR2-L，FR3-L，FR4-L和/或FR1-H，FR2-H，FR3-H，FR4-H。
如本文所用，“人框架區”是與天然形成的人抗體的框架區域基本相同(約85%或更多，特別是90%，95%，97%，99%或100%)的框架區。
在本發明的上下文中，基於IMGT定義來確定免疫球蛋白輕鏈或重鏈中的CDR/FR定義(Lefranc等Dev.Comp.Immunol.,2003,27(1)：55-77；www.imgt.org)。
如本文所用，術語“抗體”表示常規抗體及其片段，以及單域抗體及其片段，特別是單域抗體的可變重鏈，以及嵌合抗體，人源化抗體，雙特異性抗體或多特異性抗體。
術語“人源化抗體”是指全部或部分為非人來源的抗體，其被修飾以置換某些氨基酸，特別是在重鏈和輕鏈的框架區中，以避免或最小化人的免疫反應。人源化抗體的恒定域大部分是人CH和CL域。
用於人源化抗體序列的許多方法是本領域已知的；參見例如Almagro & Fransson(2008)Front Biosci.13：1619-1633的綜述。一種常用的方法是CDR移植或抗體整形，其涉及將供體抗體(通常為小鼠抗體)的CDR序列移植到不同特異性的人抗體的框架骨架中。由於CDR移植可以降低移植了CDR的非人抗體 的結合特異性和親和力，幷因此降低其生物學活性，所以可以在移植有CDR的抗體的選定位置引入回復突變，以便保持親本抗體的結合特異性和親和力。使用文獻和抗體數據庫中可獲得的資訊來確定可能的回復突變的位置。作為回復突變的候選物的氨基酸殘基通常是位於抗體分子表面的氨基酸殘基，而被掩埋或具有低表面暴露程度的殘基通常不會改變。CDR移植和回復突變的可供選擇的人源化技術是表面重塑(resurfacing)，其中保留了非人來源的非表面暴露殘基，而表面殘基被改變為人殘基。另一種可供選擇的技術被稱為“引導選擇”(Jespers等(1994)Biotechnology 12,899)，並且可用於從例如鼠或大鼠抗體衍生出完全人抗體，其保有親本抗體的抗原決定基和結合特徵。人源化的另一種方法是所謂4D人源化。在專利申請US20110027266 A1(WO2009032661A1)中描述了4D人源化方案，並且在以下將4D人源化應用於將大鼠抗體可變輕鏈(VL)和重鏈(VH)結構域人源化的示例中進行了示例。在一個實例中，使用PDB結構(Berman等，Nucleic Acids Research,2000,28：235-242)，通常使用MOE軟件(v.2011.10-Chemical Computing Group,Quebec,Canada)進行大鼠抗體同源性模型作為範本，隨後使用MOE中實施的標準程式進行能量最小化。然後對大鼠抗體的最小化的3D同源性模型(用MOE軟件進行)進行分子動力學(MD)模擬，幷與例如由LGCR/SDI設計並且在MOE內可用的來源於七種代表性輕鏈(vk1，vk2，vk3，vk4，vλ1，vλ2，vλ3)和七種代表性重鏈(vh1a，vh1b，vh2，vh3，vh4，vh5，vh6)的49種人模型相比。例如，對於“4D人源化”，已經選擇了具有最佳疏水性，靜電組分和CDR之外的序列同一性的一個鏈對(Vkx-Vhx)模型。對於大鼠抗體可變域和所選模型之間的成對關聯，通常基於相應同源性模型的α碳的最佳3D疊加來對序列進行比對。然後考慮幷突變不想要的基序。最後，將所得到的人源化序列與例如IEDB數據庫(http：//www.immuneepitope.org；版本2012/01/30本地可獲取)進行序列相似性的blast比對，以確保沒有一個序列含有任何已知的列出的B細胞或T細胞抗原決定基。
對於嵌合抗體，人源化通常涉及可變區序列的框架區的修飾。
作為CDR的一部分的氨基酸殘基通常不會與人源化相關地改變，儘管在某些情況下可能需要改變單個CDR氨基酸殘基，例如去除糖基化位點，脫醯胺位元點或不需要的半胱氨酸殘基。通過將寡糖鏈連接到三肽序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr中的天冬醯胺殘基而發生N-連接的糖基化，其中X可以是Pro以外的任何氨基酸。通過將Asn或Ser/Thr殘基突變成不同的殘基，特別是通過保守取代，來實現N-糖基化位點的去除。天冬醯胺和穀氨醯胺殘基的脫醯胺可以根據pH和表面暴露等因素而發生。天冬醯胺殘基特別易於脫醯胺化，其主要是當存在於Asn-Gly序列中時，以及在較小程度上存在於其它二肽序列如Asn-Ala中時。因此當這樣的脫醯氨基化位點(特別是Asn-Gly)存在於CDR序列中時，去除該位點是合意的，其通常通過保守取代進行，以去除涉及的殘基之一。在CDR序列中進行取代以去除涉及的殘基之一也意在涵蓋於本發明中。
(常規)抗體的“片段”包含完整抗體的一部分，特別是完整抗體的抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括由抗體片段形成的Fv，Fab，F(ab')2，Fab'，dsFv，(dsFv)2，scFv，sc(Fv)2，雙抗體，雙特異性和多特異性抗體。常規抗體的片段也可以是單域抗體，例如重鏈抗體或VHH。
術語“Fab”表示具有50,000的分子量和抗原結合活性的抗體片段，其中約一半的H鏈和整個L鏈的N-末端側(連同用木瓜蛋白酶處理IgG得到的其他片段)通過二硫鍵結合在一起。
本發明上下文中使用的術語“Fc域”包括天然的Fc和Fc變異體以及如上定義的序列。與Fc變異體和天然Fc分子一樣，術語“Fc域”包括單體或多聚體形式的分子，無論其是從完全抗體消化還是通過其他方式產生。
本文所用的術語“天然F c ”是指包含由抗體消化或由其他方式產生的非抗原結合片段的序列的分子，無論其是單體形式還是多聚體形式，並且可包含鉸鏈區。天然Fc的原始免疫球蛋白來源是特別是人源，並且可以是任何免疫球 蛋白，儘管IgG1和IgG2是優選的。天然Fc分子由可通過共價(即二硫鍵)和非共價締合連接成二聚或多聚體形式的單體多肽組成。天然Fc分子的單體亞基之間的分子間二硫鍵的數目根據類別(例如IgG，IgA和IgE)或亞類(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgA1和IgGA2)其範圍為1至4。天然Fc的一個實例是由IgG的木瓜蛋白酶消化產生的二硫鍵連接的二聚體。本文所用的術語“天然Fc”是單體，二聚和多聚體形式的通稱。
本文所用的術語“Fc變異體”是指從天然Fc修飾但仍包含補救受體FcRn(新生兒Fc受體)的結合位點的分子或序列。示例性Fc變異體及其與補救受體的相互作用是本領域已知的。因此，術語“Fc變異體”可以包含從非人天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以被去除的區域，因為所述區域提供本發明的抗體樣結合蛋白所不需要的結構特徵或生物學活性。因此，術語“Fc變異體”缺乏影響或涉及如下的一個或多個天然Fc位點或殘基的分子或序列，或其中影響或涉及如下的一個或多個Fc位點或殘基被修飾的分子或序列：(1)二硫鍵形成，(2)與所選擇的宿主細胞不相容性，(3)在選擇的宿主細胞中表達時的N端異質性，(4)糖基化，(5)與補體的相互作用，(6)與除補救受體外的Fc受體的結合，或(7)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
術語“雙特異性抗體”或“BsAb”通常表示在單個分子內組合了兩種抗體的抗原結合位點的抗體。因此，BsAb能夠同時結合兩種不同的抗原。遺傳工程以增加的頻率被用於設計，修飾和產生抗體或抗體衍生物，所述抗體或抗體衍生物具有例如EP 2 050 764 A1中所述的結合性質和效應功能的所需集合。
本文中的術語“抗體樣結合蛋白”是指能夠同時結合兩種不同抗原的多肽或結合蛋白(如雙特異性抗體)。然而，與本文定義的常規抗體不同，抗體樣結合蛋白包含多於6個CDR。本發明的抗體樣結合蛋白為本文下文定義的CODV形式，如下文“抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白”一節中所進一步定義的。
本發明上下文中的“CODV形式”是指雙特異性抗體或多特異性抗體的 交叉雙重可變(CODV)構型。CODV形式允許可變域的互換性幷保留折疊和最終結合親和力。
CODV形式已描述於此前在國際專利申請WO2012/135345和Steinmetz等中(MAbs.2016 Jul；8(5)：867-78)。
本文所用的術語“接頭”是指插入免疫球蛋白結構域之間的一個或多個氨基酸殘基，其為輕鏈和重鏈的結構域提供足夠的機動性以折疊成交叉雙重可變區免疫球蛋白。在一些實施例中，接頭由0個氨基酸組成，意指不存在接頭。接頭在序列水準上插入到可變域之間的過渡處或分別插入可變域與恒定域之間的過渡處。可以鑒定結構域之間的過渡，因為充分理解免疫球蛋白結構域的近似大小。可以通過定位不形成次級結構元件如β-折疊或α-螺旋的肽段來確定結構域過渡的精確位置，如通過實驗數據所證明的，或者可以通過建模或二級結構預測技術來假設。在本發明的上下文中描述的接頭是接頭L1，L2，L3，L4和L5。L1位於N端VD1域和VD2域之間；L2位於VD2和C端CL域之間。接頭L3和L4位於根據抗體樣蛋白的[III]式定義的多肽上。更準確地說，L3位於N端VD3和VD4域之間，L4位於VD4和C端CH1-Fc域之間。L5位於CL和N末端Fc2之間。接頭L1，L2，L3，L4和L5是獨立的，但在一些實施例中，它們具有相同的序列和/或長度。接頭L1，L2，L3，L4和L5如上文在本發明的抗體樣結合蛋白的上下文中所定義。在本發明的抗體樣結合蛋白的變異體中可能出現的可選接頭進一步描述於“抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白的變異體”一節中。
“RF突變”通常是指在Fc域的CH3域中的氨基酸HY變為RF的突變，例如由Jendeberg,L.等描述的CH3域中的突變H435R和Y436F(1997,J.Immunological Meth.,201：25-34)，並且被描述為利於純化目的，因為其消除與蛋白A的結合。
在本發明的上下文中，RF突變例如指的是SEQ ID NO：67，68，71或70的位置X6和X7，其中當X6是氨基酸R而X7是氨基F時存在RF突變。在一個實例中，RF突變是指SEQ ID NO：69的Fc段(Fc3)中的位置215-216處的氨 基酸HY被取代為RF(抗體樣結合蛋白CODV-Fab-OL1-節x穴-RF的Fc3)或在序列SEQ ID NO：79的Fc區220-221位的HY突變為RF(抗體樣結合蛋白CODV-Fab-TL1-節x穴-RF的Fc區)，如下文“抗體樣結合蛋白”一節中進一步描述的。
“節-入-穴”或稱為“節-入-穴”技術是指在CH3-CH3介面中的突變Y349C，T366S，L368A和Y407V(穴)和S354C和T366W(節)，以促進異多聚體形成，這已經描述於專利US5731168和US8216805中，具體地，其通過提述幷入本文。
在本發明的上下文中，“節”突變例如指的是例如SEQ ID NO：66或62的位置X2和X3的突變，其中當X2為C且X3為W時存在節突變。在一個實例中，節突變是指SEQ ID NO：66的Fc(抗體樣結合蛋白CODV-Fab-OL1a“hz20G6xhz7G3”和CODV-Fab-OL1-節x穴-RF的Fc)中的取代S139C和T151W。在本發明的上下文中，“穴”突變指的是例如SEQ ID NO：75的X1，X3，X4和X5的突變，其中當X1為C，X3為S，X4為A，X5為V時存在“穴”突變。在一個實例中，穴突變是指SEQ ID NO：75的Fc(抗體樣結合蛋白CODV-Fab-TL1-節-RFx穴和CODV-Fab-TL1-節x穴的Fc)中的取代Y134C，T151S，L153A，Y192V。
“LALA突變”是指消除Fc效應功能的雙突變L234A和L235A。Fc雙突變異體L234A和L235A不結合FcγR或C1q，且IgG1亞類的Fc域的ADCC和CDC功能二者都被消除(Hezareh,M.等，J Virol.2001 Dec；75(24)：12161-12168)。
然而，在本發明的上下文中，當提及雙突變L234A和L235A時，如本文所定義的Fc域中的對應位置可能不同。然而，本領域技術人員可以容易地鑒定Fc域中的對應位置(即式[III]中的Fc，式[IV]中的Fc2和/或Fc3)。在一個實例中，雙突變L234A和L235A對應於序列SEQ ID NO：60的Fc的雙突變L19A和L20A，或者換言之對應於SEQ ID NO：59的CODV-Fab-TL1-RF的式[IV] 的多肽中的突變L359A和L358A。
“純化的”和“分離的”是指當提及多肽(即本發明的抗體)或核苷酸序列時，所指的分子在基本上不存在相同類型的其它生物大分子的情況下存在。本文所用的術語“純化”具體是指存在相同類型的生物大分子的至少75%，85%，95%或98%的重量。編碼特定多肽的“分離的”核酸分子是指基本上不含不編碼主題多肽的其它核酸分子的核酸分子；然而，分子可以包括一些額外的堿基或部分，其不會有害地影響組合物的基本特徵。
本文所用的術語“抗原”或“靶抗原”是指能夠被抗體或抗體樣結合蛋白結合的分子或分子的一部分。該術語還指能夠用於動物以產生能夠結合該抗原抗原決定基的抗體的分子或一部分分子。靶抗原可以具有一個或多個抗原決定基。關於由抗體或由抗體樣結合蛋白識別的每個靶抗原，抗體樣結合蛋白能夠與識別靶抗原的完整抗體競爭。
“親和力”在理論上被定義為完全抗體與抗原之間的平衡締合。親和力可以例如表示為半最大有效濃度(EC50)或平衡解離常數(KD)。
“半最大有效濃度”也稱為“EC 50 ”是指在指定的暴露時間後，引起基綫和最大值之間中點響應的藥物、抗體或毒物的濃度。EC50與親和力是負相關的，EC50值越低抗體的親和力越高。
“K D ”是平衡解離常數，是抗體與其抗原之間的koff/kon之比。KD和親和力是負相關的。KD值與抗體的濃度有關，KD值越低，抗體的親和力越高。親和力可以通過各種已知方法進行實驗評估，例如在免疫化學測定(ELISA，流式細胞術)中測量表面等離子體共振或測量EC50的締合和解離速率。酶聯免疫吸附測定(ELISA)是一種生物化學測定法，其使用固相酶免疫分析法偵測液體樣品或濕樣品中物質(通常為抗原)的存在。來自樣品的抗原附著於表面。然後，在表面上塗覆另外的特異性抗體，使其能夠結合抗原。將該抗體與酶連接，並且在最終步驟中加入含有酶底物的物質。隨後的反應產生可偵測的信號，最常見的是底物中的顏色變化。流式細胞術提供了一種基於特定的光散射和熒光特 徵或每個細胞的特定熒光標記分析單細胞水準上的生物細胞的異質混合物的方法。在這些測定中，EC50是在一定濃度的通過ELISA(酶聯免疫吸附測定)的抗原或通過流式細胞術的表達抗原的細胞上一定的特定的暴露時間後誘導基綫和最大值之間中點響應的抗體的濃度。表面等離子體共振是一種無標記的方法，其中直接測量可溶性相中的分子(“分析物”)的結合到固定在傳感器表面上的“配體”分子。在傳感器裝置中，通過稱為表面等離子體的光學現象監測配體的結合。具體而言，當“分析物”分子從“配體”分子解離時，觀察到SPR信號的降低(以共振單位RU表示)。從締合和解離期間獲得的信號獲得締合('開啟速率'，k a)和解離速率('脫離速率'，k d)，並且可以從其計算平衡解離常數('結合常數'，K D)。以共振單位(RU)給出的信號取決於分析物中存在的配體的大小，然而在實驗條件相同的情況下，即在相同條件下配體是相同的分子，所獲得的RU可表示親和力，其中RU中獲得的信號越高，結合越高。
當兩個抗原的EC50在相似範圍內時，與抗原1(Ag1)結合的單克隆抗體與抗原2(Ag2)“交叉反應”。在本申請中，當Ag2的親和力與Ag1的親和力的比例等於或小於10(特別是5，2，1或0.5)時，與Ag1結合的單克隆抗體與Ag2交叉反應，對於兩種抗原其親和力用相同的方法測量。
當兩種抗原的親和力非常不同時，與Ag1結合的單克隆抗體與Ag2“不顯著交叉反應”。如果結合反應太低，Ag2的親和力可能無法測量。在本申請中，在相同實驗條件下和相同抗體濃度處，當單克隆抗體對Ag2的結合反應低於同一單克隆抗體對Ag1的結合反應的5%時，則結合Ag1的單克隆抗體與Ag2不顯著交叉反應。實際上，使用的抗體濃度可以是達到用Ag1獲得的飽和穩定水準所需的EC50或濃度。
如本文所用，“特異性”表示抗體區分其結合的靶肽序列(“抗原決定基”)與密切相關的高度同源的肽序列的能力。
當不與Ag2顯著交叉反應時，單克隆抗體“特異性地”結合Ag1。
術語“T細胞的活化”或“T細胞活化”是指引發涉及細胞毒性顆粒融合、瞬 時細胞因數釋放和增殖的CD3信號傳輸。本發明的抗體樣結合蛋白靶向CD3ε幷在靶細胞存在下活化T細胞；該活性也稱為“T細胞接合效應”。T細胞接合效應誘導靶細胞中的細胞毒性。
如本領域技術人員已知的，T細胞的啟動誘導表面標志物如CD69和CD25的表達。因此，可以通過偵測和測量CD4+/CD25+，CD4+/CD69+，CD8+/CD25+，或CD8+/CD69+ T細胞的表達來測量T細胞的活化。測量T細胞活化的方法是本領域技術人員已知的。
在實施例部分(實施例2.9)中進一步公開了測量T細胞活化的方法。因此，在本發明的上下文中，T細胞活化以如下測量：總細胞數%中表達CD69的細胞的百分數，或總細胞數%中表達CD4和CD69的細胞的百分數，或總細胞數%中表達CD8和CD69的細胞的百分數。
本發明的抗體樣結合蛋白的上下文中的“低T細胞活化”是指小於20%，小於18%，小於16%，小於14%，小於12%，小於10%的T細胞活化。
本文中的“靶細胞”是指表達第二抗原的細胞，在一個實例中，本文中的靶細胞是指表達CD123的細胞例如THP-1細胞。
“高T細胞活化”是指高於50%，高於55%，高於60%，高於62%，高於64%，高於66%，高於68%，高於70%的T細胞活化。本文中的“細胞毒性”是指化合物(如本發明的抗體樣結合蛋白)對細胞有毒性的性質。可以通過不同的作用機制誘導細胞毒性，因此可以分為細胞介導的細胞毒性，雕亡，抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)。
“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”是指細胞介導的免疫防禦的機制，其中免疫系統的效應細胞主動地裂解靶細胞，所述靶細胞的膜表面抗原已被特異性抗體或本發明的抗體樣結合蛋白結合。
在本發明的上下文中，“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”是指在補體系統蛋白存在下對靶細胞的裂解。
“細胞介導的細胞毒性”是指效應淋巴細胞如細胞毒性T淋巴細胞或天 然殺傷細胞對靶細胞的細胞裂解，因此可以區分為T細胞介導的細胞毒性和NK細胞細胞毒性。
“結構域”可以是蛋白質的任何區域，通常基於序列同源性定義並且通常與特定結構或功能實體有關。
“重組”分子是通過重組方法製備，表達，產生或分離的分子。
術語“基因”是指編碼或對應於包含一種或多種蛋白質或酶的全部或部分的具體氨基酸序列的DNA序列，並且可以包括或可以不包括調節性DNA序列，例如啟動子序列，其決定例如基因表達的條件。一些不是結構基因的基因可能從DNA轉錄成RNA，但不能翻譯成氨基酸序列。其他基因可以作為結構基因的調節元件或作為DNA轉錄的調節元件發揮作用。具體地，術語“基因”可以用於指編碼蛋白質的基因組序列，即包含調節元件，啟動子，內含子和外顯子序列的序列。
“與參考序列至少85%相同的”序列是其全長與參考序列全長具有85%或更多，特別是90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的序列。
在本申請的上下文中，使用全域配對比對(即兩個序列在其全長上進行比較)來計算“同一性百分比”。用於比較兩個或多個序列的同一性的方法是本領域公知的。可以例如使用“針(needle)”程式，其使用Needleman-Wunsch全域比對演算法(Needleman和Wunsch，1970 J.Mol.Biol.48：443-453)以在考慮兩個序列的全長時找到它們的最佳比對(包括缺口)。針程式例如可以在萬維網ebi.ac.uk上找到。根據本發明，兩個多肽之間的同一性的百分比使用EMBOSS：針(全域)程式和Blosum62矩陣計算，其中“缺口開放”參數等於10.0，“缺口延伸”參數等於0.5。
與參考序列相比，由與參考序列至少80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%或99%相同的“氨基酸序列”組成的蛋白可能包含突變，如缺失，插入和/或取代。在取代的情況下，由與參考序列的至少80%，85%，90%， 95%，96%，97%，98%或99%相同的氨基酸序列組成的蛋白可以對應于來源於與參考序列不同的另一個物種的同源序列。
“氨基酸取代”可以是保守的或非保守的。優選地，取代是保守取代，其中一個氨基酸被具有相似結構和/或化學性質的另一氨基酸取代。取代優選地對應於如下表所示的保守取代。
術語“載體”、“克隆載體”和“表達載體”是指將DNA或RNA序列(例如外來基因)引入宿主細胞的載體，以便轉化宿主幷促進引入序列的表達(例如轉錄和翻譯)。
術語“轉化”是指向宿主細胞引入“外源”(即外源性)基因，DNA或RNA序列，使得宿主細胞表達引入的基因或序列以產生所需物質，通常為由引入的基因或序列編碼的蛋白質或酶。接收幷表達引入的DNA或RNA的宿主細胞被“轉化”。
術語“表達系統”是指在合適條件下的宿主細胞和相容的載體，例如用於表達由載體攜帶幷引入宿主細胞的外源DNA編碼的蛋白。
本文所用的術語“醫藥組合物”或“治療組合物”是指在適當投予于患者時能夠誘導所需治療效果的化合物或組合物。
“藥學上的”或“醫藥上可接受之”是指在適當地投予於哺乳動物(特別是人)時不產生不利的、過敏的或其他不良反應的分子實體和組合物。“醫藥上可接受之載劑”或賦形劑是指任何類型的無毒固體，半固體或液體填充劑，稀釋劑，包封材料或製劑助劑。
如本文所用，術語“受試者”表示哺乳動物，例如嚙齒動物，貓科動物，犬科動物和靈長類動物。具體地，根據本發明的受試者是人。
術語“受試者”或“個體”可互換使用，並且可以是例如人或非人哺乳動物。例如，受試者是蝙蝠；白鼬；兔子；貓科動物(貓)；犬科動物(狗)；靈長類動物(猴)，馬科動物(馬)；人，包括男人，女人和兒童。
在本發明的上下文中，術語“治療”或“治療”是指治療用途(即針對具有給定疾病的受試者)，並且意指逆轉，減輕，抑制此類病症或病狀的一種或多種症狀的進展。因此，治療不僅指導致疾病完全治癒的治療，而且還涉及減緩疾病進展和/或延長受試者存活的治療。
“預防”是指預防用途(即針對易於患上給定疾病的受試者)。
術語“需要治療”是指已經患有疾病的受試者以及要預防疾病的受試者。
術語“治療有效量”的抗體樣結合蛋白或其醫藥組合物是指以適用於任何醫學治療的合理利益/風險比治療所述癌症的足夠的抗體樣結合蛋白的量。然而，應當理解，本發明的多肽和組合物的總日用量將由主治醫師在合理的醫學判斷範圍內決定。任何特定患者的具體治療有效劑量水準取決於多種因素，包括所治療的病症和病症的嚴重程度；所用的特異性多肽的活性；使用的具體組合物，患者的年齡，體重，一般健康狀況，性別和飲食；投予時間，投予途徑和所用具體多肽的排出速率；治療的持續時間；與所使用的具體多肽組合使用的藥物或同時使用的藥物；以及醫學領域衆所周知的因素。例如，本領域技術人員衆所周知的是以低於實現所需治療效果所需的水準開始化合物的給藥，幷逐漸增加劑量直到達到期望的效果。
“復發”定義為完全緩解後AML復發。
“完全緩解”或“CR”定義如下：正常值的嗜中性粒細胞(>1.0*109/L)，血紅蛋白水準為10g/dL和血小板計數(>100*109/L)且不需要紅細胞輸血；胚細胞少於5%，無胚細胞聚簇或聚集，並且在骨髓檢查中不存在Auer杆(rods)； 和血細胞正常成熟(形態學，骨髓瘤)和無髓外白血病。
“白血病幹細胞(LSC)”是具有與正常幹細胞相關的特徵的癌細胞，即自我更新的性質和發展多種譜系的能力。提出這樣的細胞在血液學癌症例如AML中以不同群體持續存在。AML患者的LCS被稱為“AML-LCS”。
“急性骨髓性白血病(AML)”是一種臨床表現為異種和未分化骨髓成髓細胞增殖增加的克隆性疾病。白血病分層(hierarchy)由少量的LSC(AML-LCS)維持，其具有獨立的自我更新能力，並且能夠分化為白血病祖細胞。這些祖細胞在診斷和復發的患者中產生大量易發現的白血病細胞(leukemic blasts)，最終導致死亡。通常將AML-LSC報告為靜止細胞，與快速分裂的克隆形成型祖細胞相反。AML-LSC的這一特性使靶向增殖細胞的常規化學治療藥物效果較差，這潛在解釋了當前經驗，即高比例的AML患者進入完全緩解，但幾乎總是復發，而<30%的成年人存活超過4年。此外，微小殘留病的發生和生存率差歸因于AML患者在診斷時的LSC頻率高。因此，長期管理AML(類似地以及其他上述血液癌症病症)，必須開發出新的治療方案來專門消除LSC。已經報道CD123對於AML母細胞和對於CD34+/CD38 AML-LSC相對于正常造血細胞的過表達。
抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白
出於簡要目的，在本申請全文中，“抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白”或“本發明的抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白”可以稱為“抗體樣結合蛋白”或“本發明的抗體樣結合蛋白”。
這些抗體樣結合蛋白具有CODV設計。
因此，在一個實施例中，本發明的抗體樣結合蛋白呈CODV形式，如此前在國際專利申請WO2012/135345中描述的那樣，其通過提述幷入本文。
在一個實施例中，本發明的抗體樣結合蛋白是如此前在國際專利申請WO2012/135345中所述的CODV形式，其中輕鏈用另外的Fc域延長。每條輕鏈和重鏈都包含一個Fc域。本發明的抗體樣結合蛋白是CODV-Fab-TL1 “hz20G6Xhz7G3”抗體樣結合蛋白。
在一個實施例中，本發明的抗體樣結合蛋白是如此前在國際專利申請WO2012/135345中所述的CODV形式，其中存在額外的Fc域。重鏈包含Fc域，但輕鏈不包含。本發明的抗體樣結合蛋白是CODV-Fab-OL1“hz20G6Xhz7G3”抗體樣結合蛋白。
在一個實施例中，本發明涉及特異性結合人CD3ε和人CD123的抗體樣結合蛋白，其包含形成兩個抗原結合位點的兩條多肽鏈，其中一條多肽鏈具有如式[I]所示的結構：VD1-L1-VD2-L2-CL [I]而一條多肽鏈具有如式[III]所示的結構：VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [III]其中：a)一個式[I]的多肽由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：55，其包含序列SEQ ID NO：54的VD1，序列SEQ ID NO：56的L1，序列SEQ ID NO：10的VD2，序列SEQ ID NO：56的L2，序列SEQ ID NO：18的CL，或與SEQ ID NO：55至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的VD1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：10的VD2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR是不變的；且b)一個式[III]的多肽由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：67，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，由0個氨基酸組成的L3，序列SEQ ID NO：52的VD4，由0個氨基酸組成的L4，序列SEQ ID NO：19的CH1，和序列SEQ ID NO：68的Fc，其中X1是Y或C，X2是S或C，X3是T，S或W，X4是A或L，X5是V或Y，X6是H或R，且X7是Y或F，或 與SEQ ID NO：67至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的VD4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：9的VD3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR是不變的，且SEQ ID NO：67的氨基酸X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上文中定義，且其中式[I]的多肽和式[III]的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在一個實施例中，本文如上定義的抗體樣結合蛋白不包括這樣的抗體樣結合蛋白，其中式[III]的多肽由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：67，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，由0個氨基酸組成的L3，序列SEQ ID NO：52的VD4，由0個氨基酸組成的L4，序列SEQ ID NO：19的CH1，和序列SEQ ID NO：68的Fc，其中X1是Y，X2是S，X3是T，X4是L，X5是Y，X6是H，且X7是Y，和/或 本文如上定義的抗體樣結合蛋白不包括這樣的抗體樣結合蛋白，其中式[III]的多肽由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：67，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，由0個氨基酸組成的L3，序列SEQ ID NO：52的VD4，由0個氨基酸組成的L4，序列SEQ ID NO：19的CH1，和序列SEQ ID NO：68的Fc，其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y，X6是H且X7是Y，或X6是R且X7是F。
因此，在一個實施例中，本文如上定義的抗體樣結合蛋白不包括這樣的抗體樣結合蛋白，其中式[III]的多肽由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：59，和/或本文如上定義的抗體樣結合蛋白不包括這樣的抗體樣結合蛋白，其中式[III]的多肽由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：65。在一個實施例中，本發明的抗體樣結合蛋白不包含：a)一個式[IV]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：57組成；和一個式[III]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：59組成；和/或 b)一個式[I]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：55組成；和一個式[III]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：61，以及SEQ ID NO：63的多肽Fc段(Fc3)組成；和/或c)一個式[I]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：55組成；和一個式[III]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：65，以及SEQ ID NO：64的多肽Fc段(Fc3)組成。
抗體樣結合蛋白被稱為“hz20G6Xhz7G3”抗體樣結合蛋白，因為多肽[I]包含分別為人源化抗CD123抗體“7G3”(也稱為“hz7G3”)和人源化抗CD3抗體“20G6”(也稱為“hz20G6”)的輕鏈的可變域的VD1和VD2，多肽[III]包含分別為人源化抗CD3抗體“20G6”(也稱為“hz20G6”)和人源化抗CD123抗體“7G3”(也稱為“hz7G3”)的重鏈可變域的VD3和VD4。
更具體地，抗體樣結合蛋白被稱為“hz20G6Xhz7G3”抗體樣結合蛋白，因為具有由式[I]表示的結構的多肽鏈包含序列SEQ ID NO：54的VD1，其為人源化抗CD123抗體“7G3”(也稱為“hz7G3”)的輕鏈可變域，和序列SEQ ID NO：10的VD2，其是人源化抗CD3抗體“20G6”的輕鏈可變域氨基酸序列VL1c，而具有由式[III]表示的結構的多肽鏈包含序列SEQ ID NO：9的VD3，其是人源化抗CD3抗體“20G6”的重鏈可變域變異體，以及序列SEQ ID NO：52的VD4，其是人源化抗CD123抗體“7G3”(也稱為“hz7G3”)的變異體重鏈可變域。
如上文定義的，具有如式[III]所示結構的多肽鏈包含序列SEQ ID NO：68的Fc，其中X1是Y或C，X2是S或C，X3是T，S或W，X4是A或L，X5是V或Y，X6是H或R且X7是Y或F。
本領域技術人員會理解，SEQ ID NO：68的Fc序列
- 其中X1是Y，X2是S，X3是T，X4是L，X5是Y且X6是H且X7是Y是SEQ ID NO：60的所謂的野生型Fc序列，且- 其中X1是Y，X2是S，X3是T，X4是L，X5是Y且X6是R且X7是F 是包含RF突變的Fc序列，且- 其中X1是C，X2是S，X3是S，X4是A，X5是V且X6是H且X7是Y是包含如本文上文“定義”一節所定義的穴突變的Fc序列且產生SEQ ID NO：75的Fc域，且- 其中X1是C，X2是S，X3是S，X4是A，X5是V且X6是R且X7是F是包含穴突變和RF突變的Fc序列，如本文上文所定義的，且產生SEQ ID NO：79的Fc域，且- 其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y且X6是H且X7是Y是包含節突變的Fc序列，如本文上文“定義”一節所定義的，且產生SEQ ID NO：66的Fc域，且- 其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y且X6是R且X7是F是包含節突變和RF突變的Fc序列，如本文上文“定義”一節所定義的，且產生SEQ ID NO：62的Fc域。
進一步理解的是，根據一般定義在任何Fc域(即SEQ ID NO：68的Fc和SEQ ID NO：70的Fc和Fc2域(SEQ ID NO：70的Fc2域在下文進行介紹))中X1是Y或C，X2是S或C，X3是T,S或W，X4是A或L，X5是V或Y，X6是H或R且X7是Y或F，該一般定義在所有實施例中可以用另一定義替換，其中X1是Y或C，X2是S或C，X3是T，S或W，X4是A或L，X5是V或Y，X6是H或R且X7是Y或F，根據所述另一定義：- X1是Y，X2是S，X3是T，X4是L，X5是Y(對應於野生型)，或- X1是C，X2是S，X3是S，X4是A，X5是V(對應於“穴”突變)，或- X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y(對應於“節”突變)，且- X6是H且X7是Y(對應於野生型)，或- X6是R且X7是F(對應於“RF”突變)。
因此，為了進一步例示，在一個實施例中，本發明是指特異性結合至人CD3ε和CD123的人抗體樣結合蛋白，其包含形成2個抗原結合位點的2條多 肽鏈，其中一條多肽鏈具有如式[I]所示的結構：VD1-L1-VD2-L2-CL [I]而一條多肽鏈具有如式[III]所示的結構：VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [III]其中a)一個式[I]的多肽由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：55，其包含序列SEQ ID NO：54的VD1，序列SEQ ID NO：56的L1，序列SEQ ID NO：10的VD2，序列SEQ ID NO：56的L2，序列SEQ ID NO：18的CL，或與SEQ ID NO：55至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的VD1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：10的VD2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR是不變的；且b)一個式[III]的多肽由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：67，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，由0個氨基酸組成的L3，序列SEQ ID NO：52的VD4，由0個氨基酸組成的L4，序列SEQ ID NO：19的CH1，和序列SEQ ID NO：68的Fc，其中X1是Y，X2是S，X3是T，X4是L，X5是Y，或X1是C，X2是S，X3是S，X4是A，X5是V，或X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y，且X6是H且X7是Y，或X6是R且X7是F，或與SEQ ID NO：67至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的VD4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：9的VD3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR是不變的，且SEQ ID NO：67的氨基酸X1、X2、X3、X4、 X5、X6和X7如上文中定義，且其中式[I]的多肽和式[III]的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在進一步的實施例中，向所述抗體樣結合蛋白CODV-Fab的式[I]的多肽添加第二Fc域(稱為Fc2)。
因此，在一個實施例中，式[I]的多肽進一步包含Fc域(Fc2)。在相同的實施例中，在式[I]的多肽鏈的Fc2域和CL之間存在接頭L5，產生式[IV]的多肽鏈。
在一個具體實施例中，式[I]的多肽進一步包含SEQ ID NO：70的Fc2域，其中X1是Y或C，X2是S或C，X3是T，S或W，X4是A或L，X5是V或Y，X6是H或R且X7是Y或F。
因此，本發明進一步是指抗體樣結合蛋白，其包含形成2個抗原結合位點的2條多肽鏈，其中一條多肽鏈具有如式[IV]所示的結構：VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2 [IV]且一條多肽鏈具有如式[III]所示的結構：VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [III]其中：a)一個式[IV]的多肽由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：71，其包含如上文針對式[I]所示多肽所定義的VD1，L1，VD2，L2，CL，以及由0個氨基酸組成的L5，和由序列SEQ ID NO：70組成的Fc2，其中X1是Y或C，X2是S或C，X3是T，S或W，X4是A或L，X5是V或Y，X6是H或R且X7是Y或F，或與SEQ ID NO：71至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的VD1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：10的VD2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR是不變的，且所述如式[IV]所示的多肽鏈中的所述SEQ ID NO：71中的氨基酸X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上文所定義； b)一個式[III]的多肽由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：67，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，由0個氨基酸組成的L3，序列SEQ ID NO：52的VD4，由0個氨基酸組成的L4，序列SEQ ID NO：19的CH1，和序列SEQ ID NO：68的Fc，其中X1是Y或C，X2是S或C，X3是T，S或W，X4是A或L，X5是V或Y，X6是H或R，且X7是Y或F，或與SEQ ID NO：67至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的VD4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：9的VD3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR是不變的，且所述SEQ ID NO：67的氨基酸X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上文所定義，且其中式[IV]的多肽和式[III]的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
由式[III]和[IV]表示的多肽鏈通過它們各自的Fc2和Fc區進行二聚化的這種CODV格式在本文中稱為CODV-Fab-TL。
在相關的實施例中，本文如上定義的抗體樣結合蛋白不包含抗體樣結合蛋白，其中a)式[IV]的多肽由氨基酸序列SEQ ID NO：71組成，其包含如上文針對式[I]所示的多肽鏈定義的VD1，L1，VD2，L2和CL，以及由0個氨基酸組成的L5，和序列SEQ ID NO：70的Fc2，其中X1是Y，X2是S，X3是T，X4是L，X5是Y，X6是R且X7是F，且b)式[III]的多肽由氨基酸序列SEQ ID NO：67組成，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，由0個氨基酸組成的L3，序列SEQ ID NO：52的VD4，由0個氨基酸組成的L4，序列SEQ ID NO：19的CH1，和序列SEQ ID NO：68的Fc，其中X1是Y，X2是S，X3是T，X4是L，X5是Y，X6是H，且X7是Y。
因此，在一個實施例中，本文如上定義的抗體樣結合蛋白不包括這樣的抗體樣結合蛋白，其中a)式[IV]的多肽由氨基酸序列SEQ ID NO：57組成，且 b)式[III]的多肽由氨基酸序列EQ ID NO：59組成。
在進一步的相關實施例中，本發明涉及特異性結合人CD3ε和人CD123的抗體樣結合蛋白，其包含形成兩個抗原結合位點的兩條多肽鏈，其中一條多肽鏈具有如式[VI]所示的結構：VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2 [IV]而一條多肽鏈具有如式[III]所示的結構：VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [III]其中：a)所述式[IV]的多肽由如下組成：(i)氨基酸序列SEQ ID NO：71，其包含：˙序列SEQ ID NO：54的VD1，˙序列SEQ ID NO：56的L1，˙序列SEQ ID NO：10的VD2，˙序列SEQ ID NO：56的L2，˙序列SEQ ID NO：18的CL，˙L5由0個氨基酸組成，且˙Fc2由序列SEQ ID NO：70組成˙其中X1是Y，X2是S，X3是T，X4是L，X5是Y且X6是H且X7是Y，或˙其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y且X6是H且X7是Y，或˙其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y且X6是R且X7是F，或(ii)與SEQ ID NO：71至少85%相同的序列，其中 ˙序列SEQ ID NO：54的VD1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR是不變的，且˙序列SEQ ID NO：10的VD2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR是不變的，且˙SEQ ID NO：71中的氨基酸X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上述a)(i)中定義；b)所述式[III]的多肽由如下組成：(i)氨基酸序列SEQ ID NO：67，其包含：˙序列SEQ ID NO：9的VD3，˙由0個氨基酸組成的L3，˙序列SEQ ID NO：52的VD4，˙由0個氨基酸組成的L4，˙序列SEQ ID NO：19的CH1，和˙由序列SEQ ID NO：68組成的Fc，其中X1是Y或C，X2是S或C，X3是T，S或W，X4是A或L，X5是V或Y，X6是H或R，且X7是Y或F，或(ii)與SEQ ID NO：67至少85%相同的序列，其中˙序列SEQ ID NO：52的VD4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR是不變的，且˙序列SEQ ID NO：9的VD3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR是不變的，且˙SEQ ID NO：67的氨基酸X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上述b)(i)中定義，且其中式[IV]的多肽和式[III]的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在進一步的相關實施例中，本發明涉及抗體樣結合蛋白，其包含形成兩 個抗原結合位點的兩條多肽鏈，其中一條多肽鏈具有如式[VI]所示的結構：VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2 [IV]而一條多肽鏈具有如式[III]所示的結構：VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [III]其中：a)一個式[IV]的多肽由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：71，其包含如上文針對式[I]所示多肽所定義的VD1，L1，VD2，L2，和CL，以及由0個氨基酸組成的L5，和序列SEQ ID NO：70的Fc2，其中其中X1是Y，X2是S，X3是T，X4是L，X5是Y且X6是H且X7是Y，或其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y且X6是H且X7是Y，或其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y且X6是R且X7是F，與SEQ ID NO：71至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的VD1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：10的VD2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR是不變的，且所述如式[IV]所示的多肽鏈中的所述SEQ ID NO：71中的氨基酸X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上文所定義；b)一個式[III]的多肽由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：67，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，由0個氨基酸組成的L3，序列SEQ ID NO：52的VD4，由0個氨基酸組成的L4，序列SEQ ID NO：19的CH1，和序列SEQ ID NO：68的Fc，其中X1是Y或C，X2是S或C，X3是T，S或W，X4是A或L，X5是V或Y，X6是H或R，且X7是Y或F，或與SEQ ID NO：67至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的VD4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，以及 序列SEQ ID NO：9的VD3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR是不變的，且所述SEQ ID NO：67的氨基酸X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上文所定義，且其中式[IV]的多肽和式[III]的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
本領域技術人員會理解，當一個Fc域為野生型序列或攜帶節突變時，其他Fc域是野生型的或是攜帶穴突變的。
因此，在一個進一步地相關實施例中，本發明的抗體樣結合蛋白包含a)一個式[IV]的多肽，其由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：71，其包含如上文定義的VD1，L1，VD2，L2，和CL，以及由0個氨基酸組成的L5，和序列SEQ ID NO：70的Fc2，其中其中X1是Y，X2是S，X3是T，X4是L，X5是Y且X6是H且X7是Y，或其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y且X6是H且X7是Y，或其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y且X6是R且X7是F，和b)一個式[III]的多肽，其由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：67，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，由0個氨基酸組成的L3，序列SEQ ID NO：52的VD4，由0個氨基酸組成的L4，序列SEQ ID NO：19的CH1，和序列SEQ ID NO：68的Fc，其中X1是Y，X2是S，X3是T，X4是L，X5是Y，或X1是C，X2是S，X3是S，X4是A，X5是V，且X6是H且X7是Y，或X6是R且X7是F。
因此，在一個具體實施例中，本發明進一步涉及抗體樣結合蛋白，其包含形成兩個抗原結合位點的兩條多肽鏈，其中一條多肽鏈具有如式[VI]所示的 結構：VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2 [IV]而一條多肽鏈具有如式[III]所示的結構：VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [III]其中：a)一個式[IV]的多肽，其由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：71，其包含如上文定義的VD1，L1，VD2，L2，和CL，以及由0個氨基酸組成的L5，和序列SEQ ID NO：70的Fc2，其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y，且X6是H且X7是Y，或X6是R且X7是F，或與SEQ ID NO：71至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的VD1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：10的VD2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR是不變的，且所述如式[IV]所示的多肽鏈中的所述SEQ ID NO：71中的氨基酸X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上文所定義；b)一個式[III]的多肽由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：67，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，由0個氨基酸組成的L3，序列SEQ ID NO：52的VD4，由0個氨基酸組成的L4，序列SEQ ID NO：19的CH1，和序列SEQ ID NO：68的Fc，其中X1是C，X2是S，X3是S，X4是A，X5是V，且X6是H且X7是Y，或X6是R且X7是F，或與SEQ ID NO：67至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的VD4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：9的VD3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR是不變的，且所述SEQ ID NO：67的氨基酸X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上文所定義，且 其中式[IV]的多肽和式[III]的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
因此，在一個實施例中，抗體樣結合蛋白包含：a)式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：81的Fc域(Fc2)或與SEQ ID NO：81至少85%相同的序列的Fc域(Fc2)，且式[III]的多肽包含SEQ ID NO：60的Fc域或與SEQ ID NO：60至少85%相同的序列的Fc域，或b)式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：73的Fc域(Fc2)或與SEQ ID NO：73至少85%相同的序列的Fc域(Fc2)，且式[III]的多肽包含SEQ ID NO：75的Fc域或與SEQ ID NO：75至少85%相同的序列的Fc域，或c)式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：77的Fc域(Fc2)或與SEQ ID NO：77至少85%相同的序列的Fc域(Fc2)，且式[III]的多肽包含SEQ ID NO：75的Fc域或與SEQ ID NO：75至少85%相同的序列的Fc域，或d)式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：77的Fc域(Fc2)或與SEQ ID NO：77至少85%相同的序列的Fc域(Fc2)，且式[III]的多肽包含SEQ ID NO：79的Fc域或與SEQ ID NO：79至少85%相同的序列的Fc域。
因此，在一個進一步的實施例中，抗體樣結合蛋白包含：i)式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：73的Fc域(Fc2)或與SEQ ID NO：73至少85%相同的序列的Fc域(Fc2)，且式[III]的多肽包含SEQ ID NO：75的Fc域或與SEQ ID NO：75至少85%相同的序列的Fc域，或ii)式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：77的Fc域(Fc2)或與SEQ ID NO：77至少85%相同的序列的Fc域(Fc2)，且式[III]的多肽包含SEQ ID NO：79的Fc域或與SEQ ID NO：79至少85%相 同的序列的Fc域。
在進一步的實施例中，本發明的抗體樣結合蛋白選自由下列組成之群組的抗體樣結合蛋白，其中：a)式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：81的Fc域(Fc2)，且式[III]的多肽包含SEQ ID NO：60的Fc域，或b)式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：73的Fc域，且式[III]的多肽包含SEQ ID NO：75的Fc域，或c)式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：77的Fc域，且式[III]的多肽包含SEQ ID NO：75的Fc域，或d)式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：77的Fc域，且式[III]的多肽包含SEQ ID NO：79的Fc域。
在進一步的實施例中，本發明的抗體樣結合蛋白選自由下列組成之群組的抗體樣結合蛋白，其中：i)式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：73的Fc域，且式[III]的多肽包含SEQ ID NO：75的Fc域，或ii)式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：77的Fc域，且式[III]的多肽包含SEQ ID NO：79的Fc域。
在進一步的實施例中，抗體樣結合分子包含：a)一個式[IV]的多肽，其由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：80，或與SEQ ID NO：80至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的VD1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：10的VD2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR及SEQ ID NO：80的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不變的；和一個式[III]的多肽，其由如下氨基酸序列組成： SEQ ID NO：59，或與SEQ ID NO：59至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的VD4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：9的VD3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR及SEQ ID NO：59的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不變的；或b)一個式[IV]的多肽，其由如下氨基酸序列組成：氨基酸序列SEQ ID NO：72，或與SEQ ID NO：72至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的VD1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：10的VD2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR及SEQ ID NO：72的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不變的；和一個式[III]的多肽，其由如下氨基酸序列組成：SEQ ID NO：74，或與SEQ ID NO：74至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的VD4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：9的VD3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR及SEQ ID NO：74的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不變的；或c)一個式[IV]的多肽，其由如下氨基酸序列組成：氨基酸序列SEQ ID NO：76，或與SEQ ID NO：76至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的VD1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：10的VD2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR及SEQ ID NO：76的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不變 的；和一個式[III]的多肽，其由如下氨基酸序列組成：SEQ ID NO：74，或與SEQ ID NO：74至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的VD4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：9的VD3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR及SEQ ID NO：74的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不變的；或d)一個式[IV]的多肽，其由如下氨基酸序列組成：氨基酸序列SEQ ID NO：76，或與SEQ ID NO：76至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的VD1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：10的VD2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR及SEQ ID NO：76的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不變的；和一個式[III]的多肽，其由如下氨基酸序列組成：SEQ ID NO：78，或與SEQ ID NO：78至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的VD4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：9的VD3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR及SEQ ID NO：78的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不變的。
在進一步的實施例中，抗體樣結合蛋白包含：i)一個式[IV]的多肽，其由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：72，氨基酸序列SEQ ID NO：72，或 與SEQ ID NO：72至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的VD1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：10的VD2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR及SEQ ID NO：72的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不變的；和一個式[III]的多肽，其由如下氨基酸序列組成：SEQ ID NO：74，或與SEQ ID NO：74至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的VD4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：9的VD3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR及SEQ ID NO：74的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不變的；或ii)一個式[IV]的多肽，其由如下氨基酸序列組成：氨基酸序列SEQ ID NO：76，或與SEQ ID NO：76至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的VD1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：10的VD2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR及SEQ ID NO：76的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不變的；和一個式[III]的多肽，其由如下氨基酸序列組成：SEQ ID NO：78，或與SEQ ID NO：78至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的VD4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：9的VD3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR及SEQ ID NO：78的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不變的。
在進一步的實施例中，抗體樣結合蛋白包含：i)一個式[IV]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：80組成；和一個式[III]的多肽，其由如下氨基酸序列SEQ ID NO：59組成；ii)一個式[IV]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：72組成；和一個式[III]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：74組成；iii)一個式[IV]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：76組成；和一個式[III]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：74組成；和iv)一個式[IV]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：76組成；和一個式[III]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：78組成。
在進一步的實施例中，抗體樣結合蛋白包含：a)一個式[IV]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：72組成；和一個式[III]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：74組成；b)一個式[IV]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：76組成；和一個式[III]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：78組成。
在一個實施例中，如上文所定義的包含具有由式[I]表示的結構的一個多肽鏈和具有式[III]所示結構的一個多肽鏈的抗體樣結合蛋白還包含第三多肽鏈，其包含Fc域(稱為Fc3)。
本領域技術人員會理解，所述FC3域可被稱為第二Fc域，因為具有由式[III]表示的結構的第二多肽包含第一Fc域。
因此，在一個實施例中，本發明涉及特異性結合人CD3ε和人CD123的抗體樣結合蛋白，其包含形成2個抗原結合位點的3條多肽鏈，其中第一多肽鏈具有如式[I]所示的結構VD1-L1-VD2-L2-CL [I]且第二多肽鏈具有如式[III]所示的結構：VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [III]且第三多肽鏈是免疫球蛋白鉸鏈區及免疫球蛋白的CH2，CH3免疫球蛋白 重鏈恒定區；其中a)所述式[I]的多肽由如下組成：(i)氨基酸序列SEQ ID NO：55，其包含˙序列SEQ ID NO：54的VD1，˙序列SEQ ID NO：56的L1，˙序列SEQ ID NO：10的VD2，˙序列SEQ ID NO：56的L2，˙序列SEQ ID NO：18的CL，或(ii)與SEQ ID NO：55至少85%相同的序列，其中˙序列SEQ ID NO：54的VD1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR是不變的，且˙序列SEQ ID NO：10的VD2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR是不變的；b)所述式[III]的多肽由如下組成：(i)氨基酸序列SEQ ID NO：67，其包含˙序列SEQ ID NO：9的VD3，˙由0個氨基酸組成的L3，˙序列SEQ ID NO：52的VD4，˙由0個氨基酸組成的L4，˙序列SEQ ID NO：19的CH1，和˙序列SEQ ID NO：68的Fc，其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y，且X6是H且X7是Y，或X6是R且X7是F，或(ii)與SEQ ID NO：67至少85%相同的序列，其中 ˙序列SEQ ID NO：52的VD4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR是不變的，且˙序列SEQ ID NO：9的VD3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR是不變的，且˙氨基酸X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上述b)(i)中定義，且其中- 式[I]的多肽和式[III]的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對，- 式[III]的多肽與第三多肽經由其Fc域形成異二聚體- 所述第三多肽Fc3由SEQ ID NO：69組成或由SEQ ID NO：69至少85%相同的序列組成，其中SEQ ID NO：69的氨基酸位置129、146、148、187、215、216是不變的。
因此，在一個實施例中，本發明涉及抗體樣結合蛋白，其包含形成2個抗原結合位點的3條多肽鏈，其中第一多肽鏈具有如式[I]所示的結構VD1-L1-VD2-L2-CL [I]且第二多肽鏈具有如式[III]所示的結構：VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [III]且第三多肽Fc3(也稱為“Fc段”)是免疫球蛋白鉸鏈區及免疫球蛋白的CH2，CH3免疫球蛋白重鏈恒定區；其中a)所述式[I]的多肽由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：55，其包含序列SEQ ID NO：54的VD1，序列SEQ ID NO：56的L1，序列SEQ ID NO：10的VD2，序列SEQ ID NO：56的L2，序列SEQ ID NO：18的CL，或與SEQ ID NO：55至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的VD1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：10的VD2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR 是不變的；且b)一個式[III]的多肽由如下組成：氨基酸序列SEQ ID NO：67，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，由0個氨基酸組成的L3，序列SEQ ID NO：52的VD4，由0個氨基酸組成的L4，序列SEQ ID NO：19的CH1，和序列SEQ ID NO：68的Fc，其中X1是Y，X2是C，X3是W，X4是L，X5是Y，X6是H且X7是Y，或X6是R且X7是F，或與SEQ ID NO：67至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的VD4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：9的VD3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR是不變的，且所述氨基酸X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上文中定義，且其中式[I]的多肽和式[III]的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對，且其中式[III]的多肽與第三多肽經由其Fc域形成異二聚體。
因此，在所述實施例中，所謂的“Fc段”(Fc3)與式[III]的多肽的Fc區異二聚化。該CODV形式在此稱為CODV-Fab-OL。該構造避免了CODV-Fab形成聚集體。
因此，在一個具體實施例中，如上定義的抗體樣結合蛋白的Fc3域由SEQ ID NO：69組成。
在相關實施例中，根據本發明的抗體樣結合蛋白包含- 式[I]的多肽，其由如下組成：SEQ ID NO：55，或與SEQ ID NO：55至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的VD1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：10的VD2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR是不變的；和 式[III]的多肽，其包含序列SEQ ID NO：66的Fc域，或與SEQ ID NO：59至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的VD4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：9的VD3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR及SEQ ID NO：66的氨基酸位置473、492、531、539、560、478、490是不變的；和- Fc段(Fc3)，其由如下組成：SEQ ID NO：69，或與SEQ ID NO：69至少85%相同的序列，其中SEQ ID NO：69的氨基酸位置129、146、148、187、215、216是不變的。
在進一步的相關實施例中，抗體樣結合蛋白包含- 一個由SEQ ID NO：55組成的式[I]的多肽，- 一個由SEQ ID NO：65組成的式[III]的多肽，和- Fc段(Fc3)，其由如下組成：SEQ ID NO：69，或與SEQ ID NO：69至少85%相同的序列，其中SEQ ID NO：69的氨基酸位置129、146、148、187、215、216是不變的。
在進一步的相關實施例中，抗體樣結合蛋白包含- 一個由SEQ ID NO：55組成的式[I]的多肽，- 一個由SEQ ID NO：65組成的式[III]的多肽，和- Fc段(Fc3)，其由SEQ ID NO：69或與SEQ ID NO：69至少85%相同的序列組成。
在一些實施例中，當抗體樣結合蛋白含有兩個Fc域時，即在CODV-Fab-TL1抗體樣結合蛋白(Fc和Fc2)，以及CODV-Fab-OL1抗體樣結合蛋白(Fc和Fc3)中時，兩個Fc域屬□相同的免疫球蛋白同種型或同種型亞型。因此，在一些實施例中，CODV-Fab-TL1的Fc和Fc2二者，或CODV-Fab-OL1的Fc和Fc3二者均是IgG1亞類，或IgG2亞類，或IgG3亞類，或IgG4亞類。
在CODV-Fab-TL1“hz20G6x7G3”抗體樣結合蛋白中，Fc序列和Fc2序列 來自IgG1主鏈。那些CODV-Fab-TL1變異體包含一個式[IV]的多肽和一個式[III]的多肽或由其組成。如本文所述的所有抗體樣結合蛋白都沒有效應功能。這意味著當抗體樣結合蛋白含有IgG1亞類的一個或多個Fc域(即式[III]中的Fc，式[IV]中的Fc2時，和/或Fc3)時，所述IgG1主鏈的一個或多個Fc域含有雙重突變L234A和L235A(所謂的“LALA突變”)，其消除Fc效應功能。
如上所述，本發明的抗體樣蛋白的所有Fc域均含有雙重突變L234A和L235A，因此所述突變在本發明的抗體樣蛋白的上下文中未被進一步提及，也未在本發明的抗體樣蛋白的序列中進一步示出。
在一些實施例中，Fc區還包含如上文所定義的RF和/或“節-入-穴”突變。
根據本發明的一個實施例，式[I]的多肽或式[IV]的VD1和VD2都是輕鏈的可變域，或重鏈的可變域，並且多肽[III]的VD3和VD4都是重鏈的可變域或輕鏈的可變域。這種可互換性也稱為“可交換性”，因此確定了本發明的抗體樣結合蛋白的交叉雙重變量(CODV)構型。根據上述定義，VD1和VD4是第一免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的可變域，VD2和VD3是第二免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的可變域，因此VD1和VD4被認為是同類結構域，VD2和VD3亦然。
因此，術語“交叉”涉及式[I]或式[IV]的多肽的VD1或VD2相對於式[III]的多肽的同類可變域VD4或VD3的交換排列。在一個具體實施例中，VD1和VD2是輕鏈可變域，而VD3和VD4是重鏈可變域。
在本發明的上下文中，已經產生了幾種抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白，所謂的“hz20G6Xhz7G3”抗體樣結合蛋白，具體是：CODV-Fab-TL1-節-RFx穴，CODV-Fab-TL1-節x穴-RF,CODV-Fab-TL1,CODV-Fab-TL1-節x穴，CODV-Fab-OL1-節x穴-RF無GS。
在一個具體實施例中，本發明涉及CODV-Fab-TL1抗體樣結合蛋白CODV-Fab-TL1-節-RFx穴，CODV-Fab-TL1-節x穴-RF和CODV-Fab-TL1-節x穴，更具體地涉及CODV-Fab-TL1-節-RFx穴，CODV-Fab-TL1-節x穴-RF。那些抗體樣結合蛋白都包含節-入-穴突變，其中節突變位於輕鏈的Fc區，即多肽IV，而穴突變位於重鏈上，即在多肽III上。所述抗體樣結合蛋白可進一步包含RF突變。如上所述，節-入-穴突變增加了抗體樣結合蛋白的異源二聚體的量。
所謂CODV-Fab-TL1-節-RFx穴“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白包含：- 一個式[IV]的多肽，其氨基酸序列如下
(SEQ ID NO：72，接頭以粗體和下劃綫表示)，其包含序列SEQ ID NO：54的VD1，序列SEQ ID NO：56的L1，序列SEQ ID NO：10的VD2，序列SEQ ID NO：56的L2，序列SEQ ID NO：18的CL，含有0個氨基酸的L5，和序列SEQ ID NO：73的Fc2(帶下劃綫)，及- 一個式[III]的多肽，其氨基酸序列如下
(SEQ ID NO：74)其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，L3為0個氨基酸，序列SEQ ID NO：52的VD4(以斜體表示)，L4為0個氨基酸，序列SEQ ID NO：19的CH1，和序列SEQ ID NO：75的Fc(帶下劃綫)。
所述抗體樣結合蛋白呈CODV-Fab-TL形式，即其含有一個式[IV]的多肽和一個式[III]的多肽或由其組成。
序列SEQ ID NO：58的所述式[IV]的多肽的Fc2序列在氨基酸位置116和117處含有RF突變(上文以粗體表示)。
此外，其Fc和Fc2序列已經根據“節-入-穴”技術工程化，並且Fc2域還包含SEQ ID NO：73中的S134C和T146W突變(如粗體所示)，其先前描述為節突變，而Fc進一步含有SEQ ID NO：75中的Y134C，T151S，L153A，Y192V，其先前描述為穴突變。
所謂的CODV-Fab-TL1-節x穴-RF“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白包含- 一個式[IV]的多肽，其氨基酸序列如下
(SEQ ID NO：76，接頭以粗體和下劃綫表示)，其包含序列SEQ ID NO：54的VD1，序列SEQ ID NO：56的L1，序列SEQ ID NO：10的VD2，序列SEQ ID NO：56的L2，序列SEQ ID NO：18的CL，含有0個氨基酸的L5，和序列SEQ ID NO：77的Fc2(帶下劃綫)；及- 一個式[III]的多肽，其氨基酸序列如下
(SEQ ID NO：78)，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，L3為0個氨基酸，序列SEQ ID NO：52的VD4(以斜體顯示)，L4為0個氨基酸，序列SEQ ID NO：19的CH1，和序列SEQ ID NO：79的Fc(帶下劃綫)。
式[IV]的多肽的Fc2序列在其序列SEQ ID NO：77中包含S134C和T146W突變。式[III]的多肽的Fc序列在其序列SEQ ID NO：79中包含突變Y134C，T151S，L153A，Y192V(穴突變)和RF突變。
所謂的CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白包含：- 一個式[IV]的多肽，其氨基酸序列如下
(SEQ ID NO：80，接頭以粗體和下劃綫表示)，其包含序列SEQ ID NO：54的VD1，序列SEQ ID NO：56的L1，序列SEQ ID NO：10的VD2，序列SEQ ID NO：56的L2，序列SEQ ID NO：18的CL，含有0個氨基酸的L5，和序列SEQ ID NO：81的Fc2(帶下劃綫)；及- 一個式[III]的多肽，其氨基酸序列如下QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLE
(SEQ ID NO：59)，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，L3為0個氨基酸，序列SEQ ID NO：52(以斜體顯示)的VD4，L4為0個氨基酸，序列SEQ ID NO：19的CH1，和序列SEQ ID NO：60的Fc(帶下劃綫)。
所謂的CODV-Fab-TL1-節x穴“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白包含：- 一個式[IV]的多肽，其氨基酸序列如下 LSPG
(SEQ ID NO：76，接頭以粗體和下劃綫表示)，其包含序列SEQ ID NO：54的VD1，序列SEQ ID NO：56的L1，序列SEQ ID NO：10的VD2，序列SEQ ID NO：56的L2，序列SEQ ID NO：18的CL，含有0個氨基酸的L5，和序列SEQ ID NO：77的Fc2(帶下劃綫)；及- 一個式[III]的多肽，其氨基酸序列如下
(SEQ ID NO：74)，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，L3為0個氨基酸，序列SEQ ID NO：52(以斜體顯示)的VD4，L4為0個氨基酸，序列SEQ ID NO：19的CH1，和序列SEQ ID NO：75的Fc(帶下劃綫)。
式[IV]的多肽的Fc2序列在其序列SEQ ID NO：77中含有S134C和T146W突變。多肽III的Fc域在SEQ ID NO：75中含有的穴突變Y134C，T151S，L153A，Y192V。
與CODV-Fab-OL1a相比，新開發的不含GS(woGS)的分子CODV-Fab-OL1-節x穴-RF不包含位於Fc段(Fc3)的N末端的氨基酸“GS”。
不含GS(woGS)的蛋白CODV-Fab-OL1-節x穴-RF易於純化，並且在蛋 白A純化後具有高量的異源二聚體(即圖4中所示的88%異源二聚體)。
所謂的沒有GS的CODV-Fab-OL1-節x穴-RF“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白包含：- 一個式[I]的多肽，其氨基酸序列如下
(SEQ ID NO：55)，其包含序列SEQ ID NO：54的VD1，序列SEQ ID NO：56的L1，序列SEQ ID NO：10的VD2，序列SEQ ID NO：56的L2，和序列SEQ ID NO：18的CL；- 一個式[III]的多肽，其氨基酸序列如下：
(SEQ ID NO：65)，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，L3為0個氨基酸，序列SEQ ID NO：52的VD4(以斜體和下劃綫顯示)，L4為0個氨基酸，CH1 of序列SEQ ID NO：19，和序列SEQ ID NO：66的Fc(帶下劃綫)；- 且其中所謂的沒有GS的CODV-Fab-OL1-節x穴-RF“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白進一步包含氨基酸序列如下的Fc段(Fc3)： (SEQ ID NO：69)，其與式[III]的多肽的Fc區異二聚化。
序列SEQ ID NO：66的Fc包含位置220-221處的HY殘基(上文粗體部分)和節突變S139C和T151W，而序列SEQ ID NO：69的Fc段包含位置217-218處的RF殘基(上文粗體部分)和穴突變Y131C，T148S，L150A和Y189V。
抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白，所謂的“hz20G6Xhz7G3“抗體樣結合蛋白：CODV-Fab-TL1-RF,CODV-Fab-OL1和CODV-Fab-OL1a
描述于專利申請PCT/EP2016/051386中，該專利申請在本專利申請的優先權日之時尚未公開(根據歐洲專利公約的第54(3)條)。
所謂的CODV-Fab-TL1-RF“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白此前在專利申請PCT/EP2016/051386中以名稱CODV-Fab-TL1描述，其在本專利申請的優先權日之時尚未公開(根據歐洲專利公約的第54(3)條)。
- 一個式[IV]的多肽，其氨基酸序列如下DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQP
(SEQ ID NO：57，接頭以粗體和下劃綫表示)，其包含序列SEQ ID NO：54的VD1，序列SEQ ID NO：56的L1，序列SEQ ID NO：10的VD2，序列SEQ ID NO：56的L2，序列SEQ ID NO：18的CL，含有0個氨基酸的L5，和序列SEQ ID NO：58的Fc2(帶下劃綫)；和
- 一個式[III]的多肽，其氨基酸序列如下 GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
(SEQ ID NO：59)，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，L3為0個氨基酸，序列SEQ ID NO：52的VD4(以斜體顯示)，L4為0個氨基酸，序列SEQ ID NO：19的CH1，以及序列SEQ ID NO：60的Fc(帶下劃綫)。
所述抗體樣結合蛋白是CODV-Fab-TL形式，即它包含一個式[IV]的多肽和一個式[III]的多肽或由其組成。序列SEQ ID NO：58的所述式[IV]的多肽的Fc2序列已被進一步設計為在位置116和117(上文粗體部分)含有RF殘基，而不是HY殘基，否則其會存在於Fc區的這些位置。HY>RF突變(即如Jendeberg,L等.1997,J.Immunological Meth.,201：25-34所述的CH3域中的H435R和Y436F)對於純化目的是有利的，因為它消除了與蛋白A的結合。
所述的CODV-Fab-OL1“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白此前已描述于專利申請PCT/EP2016/051386中，其在本專利申請的優先權日之時尚未公開(根據歐洲專利公約的第54(3)條)，且包含：- 一個式[I]的多肽，其氨基酸序列如下
(SEQ ID NO：55，接頭以粗體和下劃綫表示)，其包含序列SEQ ID NO：54的VD1，序列SEQ ID NO：56的L1，序列SEQ ID NO：10的VD2，序列SEQ ID NO：56的L2，和序列SEQ ID NO：18的CL；及- 一個式[III]的多肽，其氨基酸序列如下QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLE
(SEQ ID NO：61)，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，L3為0個氨基酸，序列SEQ ID NO：52的VD4(以斜體和下劃綫顯示)，L4為0個氨基酸，CH1 of序列SEQ ID NO：19，和序列SEQ ID NO：62的Fc(帶下劃綫)；
且其中所謂的CODV-Fab-OL1“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白進一步包含Fc段(Fc3)，所述Fc段氨基酸序列如下： (SEQ ID NO：63)且其與式[III]的多肽的Fc去異二聚化。
所述抗體樣結合蛋白是CODV-Fab-OL形式，即它包含一個[I]的多肽，一個式[III]的多肽和一個Fc段或由其組成。其Fc和Fc3序列已經根據“節-入-穴”技術進行了工程改造，Fc域還包含SEQ ID NO：62中的S139C和T151W突變(粗體顯示)，前述為節突變，Fc3進一步含有先前描述為穴突變的SEQ ID NO：63中的Y131C，T148S，L150A和Y189V。序列SEQ ID NO：62的Fc序 列已被進一步設計為在220-221位置含有RF突變(上文粗體部分)。
所謂的CODV-Fab-OL1a“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白前已描述于專利申請PCT/EP2016/051386中，其在本專利申請的優先權日之時尚未公開(根據歐洲專利公約的第54(3)條)，且包含：- 一個式[I]的多肽，其氨基酸序列如下
(SEQ ID NO：55)，其包含序列SEQ ID NO：54的VD1，序列SEQ ID NO：56的L1，序列SEQ ID NO：10的VD2，序列SEQ ID NO：56的L2，和序列SEQ ID NO：310的CL；- 一個式[III]的多肽，其氨基酸序列如下： DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
(SEQ ID NO：65)，其包含序列SEQ ID NO：9的VD3，L3為0個氨基酸，序列SEQ ID NO：52的VD4(以斜體和下劃綫顯示)，L4為0個氨基酸，序列SEQ ID NO：19的CH1，和序列SEQ ID NO：66的Fc(帶下劃綫)；- 且其中所謂的CODV-Fab-OL1a“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白還包含Fc段(Fc3)，所述Fc段氨基酸序列如下： (SEQ ID NO：64)，其與式[III]的多肽的Fc區異二聚化。
序列SEQ ID NO：66的Fc包含在位置220-221的HY殘基(上文粗體部分)和節突變S139C和T151W(而序列SEQ ID NO：64的Fc段包含在位置217-218的RF殘基(上文粗體部分)和穴突變Y131C，T148S，L150A和Y189V。
本發明開發了抗體樣結合蛋白CODV-Fab-TL1-RF的一些替代的分子，如CODV-Fab-TL1-節-RFx穴，CODV-Fab-TL1-節x穴-RF，CODV-Fab-TL1和CODV-Fab-TL1-節x穴。此外，發明人開發了抗體樣結合蛋白CODV-Fab-OL1-節x穴-RF作為抗體樣結合蛋白CODV-Fab-OL1和CODV-Fab-OL1a的替代。
這些CODV-Fab-TL1變異體含有節-入-穴突變和/或RF突變，以便簡化純化過程、減少聚集從而增加本發明的抗體樣結合蛋白的異二聚體的產率。蛋白A純化後獲得的抗體樣結合蛋白含有例如52%的異二聚體(對於CODV-Fab-TL1-RF)，72-85%的異二聚體(對於CODV-Fab-TL1-節-RFx穴)，55%的異二聚體(對於CODV-Fab-TL1-節x穴-RF)，和88%的異二聚體(對於CODV-Fab-OL1-節x穴-RF)。進一步地，發現抗體樣結合蛋白的熔點在56-57℃處非常相似(實 施例2.7.1)。
如上所述，本發明的抗體樣結合蛋白結合CD3和CD123。
因此，在本發明的一個態樣，本發明的抗體樣結合蛋白與人CD3結合。在另一個實施例中，本發明的抗體樣結合蛋白還與食蟹猴CD3結合。具體地，本發明的抗體樣結合蛋白結合人CD3的胞外結構域或人與食蟹猴CD3的胞外結構域。更具體地，抗體結合CD3ε。更具體地，抗體樣結合蛋白結合人或人與食蟹猴細胞的CD3ε外結構域。當以複合物如CD3ε/δ複合物的形式存在時，或當作為單一蛋白存在時，抗CD3抗體與CD3ε結合，無論是否以分離形式表達或存在於可溶性胞外結構域或全長膜-錨定的CD3ε中(如例如存在於T細胞中)，都是無差別的。根據本發明的抗體樣結合蛋白特異性針對表面人CD3蛋白或人與食蟹猴CD3蛋白(特別是CD3ε)。
根據本發明的抗體樣結合蛋白對食蟹猴CD3的親和性比對人CD3的親和性的比率(KD(食蟹猴)/KD(人)為10，具體為6，5，4，3，2，1或0.5。因此，根據本發明的抗體樣結合蛋白可用於在猴中進行的毒性研究，猴中觀察到的相關毒性概貌預期人中的潛在不良反應。
此外，根據本發明的抗體樣結合蛋白對人CD3或食蟹猴CD3或二者具有親和力(KD)，所述親和力為50nM，40nM，或30nM，例如20nM例如親和力為0.1nM至30nM，具體為0.4nM至25nM，或是10nM至25nM。
在本發明的另一態樣，抗體樣結合蛋白與人CD123結合。在另一個實施例中，抗體樣結合蛋白還與食蟹猴CD123結合。具體地，本發明的抗體樣結合蛋白結合人CD123或人和食蟹猴CD123兩者的胞外結構域。更具體地，抗體樣結合蛋白結合CD123的遠端部分，例如結合氨基酸序列SEQ ID NO：12的人CD123的位置19至49的氨基酸。抗體樣結合蛋白結合CD123，無論是以分離形式表達，還是存在於可溶性胞外結構域或全長膜錨定CD123中(其存在於表達CD123的細胞如AML細胞或轉染了CD123細胞中)，都是無差別的。根據本發明的抗體樣結合蛋白特異性針對在其表面上表達人或人與食蟹猴CD123 蛋白的細胞，例如表達CD123的癌細胞。
因此，根據本發明的抗體樣結合蛋白對人CD123或食蟹猴CD123或二者具有親和力(KD)，所述親和力為20nM，15nM，或10nM，例如5nM，例如親和力為0.01nM至5nM，具體為0.01nM至2nM，更具體為0.05nM至2nM。
在一個實施例中，抗體樣結合蛋白能夠意指CD123的功能。
在一個實施例中，本發明的抗體樣結合蛋白的熱變性溫度為50至70℃，優選為50至65℃，更優選為55至60℃。測量熱變性溫度的方法是本領域技術人員已知的，並且包括差示掃描熒光測定法(DSF)。如本領域技術人員所知，用於那些實驗的實驗條件，例如使用的緩衝液，蛋白質的濃度，可以強烈影響結果。因此，在一個實例中，50-70℃，優選50-65℃，更優選55-60℃的變性溫度是指抗體樣結合蛋白通常稀釋於D-PBS緩衝液(Invitrogen)中至例如為0.2μg/μl的終濃度，通常包括SYPRO-Orange染料的4x濃縮溶液(Invitrogen，5000x儲液於DMSO中)在D-PBS中，例如白色半裙邊(semi-skirt)96孔板(BIORAD)，如實施例中例示的(實施例2.7.1)。
在一個實施例中，本發明的抗體樣結合蛋白在不存在靶細胞的情況下具有小於20%，小於18%，小於16%，小於14%，小於12%，小於10%的T細胞活化。
在一個實施例中，本發明的抗體樣結合蛋白在存在靶細胞的情況下具有高於55%，高於60%，高於62%，高於64%，高於66%，高於68%，高於70%的T細胞活化。
本發明的抗體樣結合蛋白具有T細胞接合作用。這種T細胞接合作用在表達CD123的靶細胞中誘導細胞毒性。
本發明的靶細胞抗體樣結合蛋白是表達CD123的細胞，例如表達CD123的癌細胞，例如THP-1或TF-1。
因此，在一個實施例中，根據本發明的抗體樣結合蛋白能夠在體外接合 原代T細胞幷裂解靶細胞，其中(EC50)40pM，35pM，20pM，10pM，5pM，例如2pM。
在一個實施例中，本文的細胞毒性是指細胞介導的細胞毒性，例如T細胞介導的細胞毒性。
此外，在一個實施例中，細胞介導的細胞毒性是指細胞介導的T細胞的細胞毒性。
因此，本發明的抗體樣結合蛋白在由T細胞介導的表達CD123的靶細胞中誘導細胞介導的細胞毒性。
測量細胞毒性的方法是本領域技術人員已知的，並且包括使用51-鉻(Cr)釋放測定法，靶細胞的活/死細胞染色，包括碘化丙啶，7-AAD和本領域技術人員已知的其它染色，通過流式細胞術或ELISA偵測由T細胞釋放的溶胞分子，包括顆粒酶和穿孔素，偵測從受損細胞釋放到培養基中的乳酸脫氫酶(LDH)，作為細胞毒性和細胞溶解的生物標志物，偵測細胞表面動員CD107a，膜聯蛋白V(鈣依賴性磷脂結合蛋白)染色雕亡靶細胞，例如偵測活化的胱天蛋白酶-3(CASP3)。此外，本領域技術人員可以基於所選擇的測試幷基於實驗設置來區分不同的細胞毒性機制。
在一個實例中，細胞介導的細胞毒性可以例如使用CFSE測量以標記靶細胞和用7-AAD測量以標記死細胞，如例如實施例1.8中所述。
抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白的變異體
本文所述的抗體樣結合蛋白的變異體涵蓋在內且明確的痛過使用如上文定義的抗體樣結合蛋白的定義中所採取的措詞“與參考序列至少85%相同”的術語來提及。如本領域技術人員會認識到的，參考序列是式[I]，[III]或[IV]的多肽，並且具有“與參考序列至少85%相同”的變異體以如下方式定義：抗體“hz20G6”和“hz7G3”的CDR以及對應於不同Fc區中的RF突變、節突變和穴突變和基酸位置是不變的。
本領域技術人員會進一步理解，與參考序列相比，相應的缺失，插入和/ 或替代可以引入框架區(FR)、CL和CH1和Fc中的環區域L1，L2，L3，L4和任選的L5。框架區域(FR)如上文“定義”一節中所定義，並且是指介於CDR之間的氨基酸序列。由於定義了CDR，本領域技術人員可以容易地定位框架區域。
本發明的抗體樣結合蛋白的CH域可以是屬□人免疫球蛋白重鏈的任何CH區，但IgG類的CH區是合適的，並且還可以使用屬□IgG類的任何一類，如IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。同樣，本發明的抗體樣結合蛋白的CL可以是屬□人免疫球蛋白輕鏈的任何區域，可以使用κ類或λ類的任何區域。
本領域技術人員會理解，如上文所定義的CH或CL區可以被另一亞類的免疫球蛋白的CH或CL域取代。
為了進一步指導產生如本文定義的變異體，給出了接頭區L1，L2，L3，L4和L5的一些實例。
在一個實例中，L3的長度至少是L1長度的兩倍。在另一實例中，L4的長度是L2的長度的至少兩倍。在一些實例中，L1的長度是L3的長度的至少兩倍。在其他實例中，L2的長度是L4長度的至少兩倍。
在一個實例中，接頭L1，L2，L3，L4包含0-20個氨基酸。包含在一個實施例中，L5包含0-10個氨基酸。
在一些實例中，L1是3至12個氨基酸殘基的長度，L2是3至14個氨基酸殘基的長度，L3是1至8個氨基酸殘基的長度，且L4是1至3個氨基酸殘基的長度。在其他實例中，L1是5至10個氨基酸殘基的長度，L2是5至8個氨基酸殘基的長度，L3是1至5個氨基酸殘基的長度，且L4是1至2個氨基酸殘基的長度。在進一步的實例中，L1是7個氨基酸殘基的長度，L2是5個氨基酸殘基的長度，L3是1個氨基酸殘基的長度，且L4是2個氨基酸殘基的長度。
在一些實例中，L1是1至3個氨基酸殘基的長度，L2是1至4個氨基酸殘基的長度，L3是2至15個氨基酸殘基的長度，且L4是2至15個氨基酸殘基的長度。在其他實例中，L1是1至2個氨基酸殘基的長度，L2是1至2個氨基酸殘基的長度，L3是4至12個氨基酸殘基的長度，且L4是2至12個氨基 酸殘基的長度。在優選的實例中，L1是1個氨基酸殘基的長度，L2是2個氨基酸殘基的長度，L3是7個氨基酸殘基的長度，且L4是5個氨基酸殘基的長度。
在一些實例中，L1，L3，或L4可以等於0。然而，在抗體樣結合蛋白中，其中L3，或L4等於0，可變區和恒定區之間或其他鏈上雙重可變域之間的對應過渡接頭可以是0。在一些實例中，L1等於0且L3是2或更多個氨基酸殘基，L3等於0且L1等於1或更多個氨基酸殘基，或L4等於0且L2是3或更多個氨基酸殘基。
在一些實例中，選自由下列組成之群組的接頭的至少一個含有至少一個半胱氨酸殘基：L2，L3，和L4。
可用於本發明的抗體樣結合蛋白的變異體的合適接頭的實例包括單個甘氨酸，蘇氨酸或絲氨酸殘基；二肽如二甘氨肽，組氨酸-蘇氨酸肽或甘氨酸-絲氨酸二肽；具有三個甘氨酸的三肽，三肽Thr-His-Thr，三肽Gly-Gly-Ser；具有四個甘氨酸殘基的肽；具有5個甘氨酸殘基的肽；具有六個甘氨酸殘基的肽；具有七個甘氨酸殘基的肽；具有八個甘氨酸殘基的肽。可以使用氨基酸殘基的其他組合，例如肽Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：27)，肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：20)，肽Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：28)，肽Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：29)，肽Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：30)，肽Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：31)，和肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：21)。其他合適的接頭包括單個Ser，和Val殘基；二肽Arg-Thr，Gin-Pro，Ser-Ser，Thr-Lys，和Ser-Leu；Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：32)；Lys-Thr-His-Thr-Ser(SEQ ID NO：33)；Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser(SEQ ID NO：34)；Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro(SEQ ID NO：35)；Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro(SEQ ID NO：36)；Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro(SEQ ID NO：37)；Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：38)；Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO：39)；Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro(SEQ ID NO：40)；Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro(SEQ ID NO：41)；Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly(SEQ ID NO：42)；Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly(SEQ ID NO：43)；Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly(SEQ ID NO：44)；Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly(SEQ ID NO：45)；Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：46)；Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：47)；Thr-Val-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：22)，Gln-Pro-Lys-Ala-Ala(SEQ ID NO：23)，Gln-Arg-Ile-Glu-Gly(SEQ ID NO：24)；Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO：25)，Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser(SEQ ID NO：26)，Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：16)，Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO：17)，His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys(SEQ ID NO：351)，和Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：56)。上述實施例不以任何方式限制本發明的範圍，並且包含選自纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，賴氨酸，精氨酸，組氨酸，天冬氨酸，谷氨酸的隨機選擇的氨基酸的接頭，天冬醯胺，穀氨醯胺，甘氨酸和脯氨酸已被證明適用於本發明的抗體樣結合蛋白。
接頭中氨基酸殘基的身份和序列可以根據在接頭中實現所必需的二級結構元件的類型而變化。例如，甘氨酸，絲氨酸和丙氨酸對於具有最大靈活性的接頭是最好的。甘氨酸，脯氨酸，蘇氨酸和絲氨酸的某些組合如果需要更剛性和延伸的接頭是有用的。任何氨基酸殘基可以被認為是與其它氨基酸殘基組合的接頭，以根據所需的性質根據需要構建更大的肽接頭。
在一個實例中，接頭L1序列為Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：16)，接頭L2序列為Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO：17)，接頭L3序列為‘S’，接頭L4序列為‘RT’。
在另一個實例中，接頭L1，L2，L3，和L4的序列選自蘇氨酸；二肽如組氨酸-蘇氨酸肽；三肽Thr-His-Thr,Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：32)；Lys-Thr-His-Thr-Ser(SEQ ID NO：33)；Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser(SEQ ID NO：34)；Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro(SEQ ID NO：35)；Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro(SEQ ID NO：36)；Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro(SEQ ID NO：37)；Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：38)；Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：39)；Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro(SEQ ID NO：40)；Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro(SEQ ID NO：41)；Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly(SEQ ID NO：42)；Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly(SEQ ID NO：43)；Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly(SEQ ID NO：44)；Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly(SEQ ID NO：45)；Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：46)和Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：47)。在一個實例中，接頭L5的序列選自由下列組成之群組：單絲氨酸殘基，二肽如甘氨酸-絲氨酸二肽；三肽Gly-Gly-Ser，肽Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：27)，肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：20)，肽Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：28)，肽Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：29)，肽Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：30)，肽Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：31)，肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：21)，和肽Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：56)。
可應用於抗體樣結合蛋白以產生“與參考序列至少85%相同的”序列的其它修飾描述於下文“本發明的抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白的修飾”中。
本發明的抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白的修飾
考慮本文所述的抗體樣結合蛋白的氨基酸序列修飾。例如，可能希望提高抗體樣結合蛋白的結合親和力和/或其他生物學性質。例如，已知當通過在人抗體的VH和VL的FR中簡單地僅移接來源於非人動物的抗體的VH和VL中的CDR而產生人源化抗體時，抗原結合活性可以與來自非人動物的原始抗體相比是降低的。認為非人抗體的VH和VL的幾個氨基酸殘基不僅在CDR中而且在FR中可以與抗原結合活性直接或間接相關。因此，用來源於人抗體的VH和VL的FR的不同氨基酸殘基取代這些氨基酸殘基會降低結合活性。為了解決這個問題，在用非人CDR移植的人抗體中，必須嘗試在人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列之間鑒定直接與抗體結合相關的氨基酸殘基，或與CDR的氨基酸殘基相互作用的氨基酸殘基，或維持抗體的三維結構的氨基酸殘基和與抗原結合直接相關的氨基酸殘基。可以通過用來自非人動物的原始抗體的氨基酸殘基替換鑒定的氨基酸來增加降低的抗原結合活性。本發明的抗體樣結合蛋白包含人源化抗體“20G6”的可變區和人源化抗體“7G3”的可變區，因此本文提及的同等同樣適用於本發明的抗體樣結合蛋白。
可以在本發明的抗體樣結合蛋白的結構和編碼它們的DNA序列中進行修飾和改變，並且仍然產生具有所需特徵的功能性抗體樣結合蛋白或多肽。
在進行多肽的氨基序列變化時，可以考慮氨基酸的親水指數。親水性氨基酸指數在賦予蛋白質相互作用的生物學功能中的重要性在本領域中是普遍理解的。人們認為，氨基酸的相對親水特性有助於所得蛋白質的二級結構，其又限定了蛋白質與其他分子例如酶，底物，受體，DNA，抗體，抗原的相互作用，等等。基於它們的疏水性和電荷特性，每個氨基酸被指定為親水指數：這些是：異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；穀氨醯胺(-3.5)；天冬氨酸-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本發明的另一個目的還包括本發明的抗體樣結合蛋白的多肽的功能保守變異體。
例如，某些氨基酸可被蛋白質結構中的其它氨基酸取代而沒有明顯的活性喪失。由於蛋白質的相互作用能力和性質限定了其生物功能活性，因此可以在蛋白質序列中進行某些氨基酸取代，當然也可以在其DNA編碼序列中進行某些氨基酸置換，同時獲得具有相似性質的蛋白質。因此，預期可以在本發明的抗體序列或編碼所述多肽的相應DNA序列中進行各種改變，而不會明顯喪失其生物學活性。
本領域已知某些氨基酸可以被具有相似親水指數或分數的其它氨基酸取代，並且仍然產生具有相似生物活性的蛋白質，即仍然獲得生物功能等同的蛋白質。還可以使用諸如丙氨酸掃描方法等已知技術在本發明的抗體樣結合蛋白中鑒定可以被取代而不顯著喪失與抗原結合的所有氨基酸。這樣的殘基可以被認定為中性的，因為它們不參與抗原結合或維持抗體的結構。這些中性位置中的一個或多個可以被丙氨酸或另一個氨基酸取代，而不改變本發明的抗體樣結合蛋白的主要特徵。
如上所述，氨基酸取代通常因此基於氨基酸側鏈取代基的相對相似性，例如其疏水性，親水性，電荷，大小等。考慮到各種前述特徵的示例性取代是本領域技術人員公知的，包括：精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；穀氨醯胺和天冬醯胺；和纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸。
針對效應功能修飾本發明的抗體樣結合蛋白也是期望的，例如以增強或減少抗體的抗原依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。這可以通過在抗體的Fc區中引入一個或多個氨基酸取代來實現，在本文中也稱為Fc變異體，其與本發明的抗體樣結合蛋白相關。或者或另外，可以將半胱氨酸殘基引入Fc區，從而允許在該區域中形成鏈間二硫鍵。由此產生的同二聚抗體可能具有改善或降低的內化能力和/或增加的補體介導的細胞殺傷和/或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)(Caron PC等1992；和Shopes B.1992)。
本發明的抗體樣結合蛋白的另一種類型的氨基酸修飾可用於改變抗體樣結合蛋白的原始糖基化模式，即通過刪除在抗體樣結合蛋白中發現的一個或多個碳水化合物部分和/或在抗體樣結合蛋白中加入一個或多個不存在的糖基化位點來加以改變。三肽序列天冬醯胺-X-絲氨酸和天冬醯胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)的存在，產生潛在的糖基化位點。通過改變氨基酸序列使得其含有一個或多個上述三肽序列(用於N-連接的糖基化位點)，可方便地實現對抗體樣結合蛋白的糖基化位點的添加或缺失。
另一種類型的修飾涉及以計算機或實驗方式去除鑒定的序列，因為可能導致抗體樣結合蛋白製備物的降解產物或異質性。作為實例，天冬醯胺和穀氨醯胺殘基的脫醯胺可以根據諸如pH和表面暴露等因素而發生。天門冬醯胺殘基特別易於脫醯胺化，主要是存在於Asn-Gly序列中，而在其它二肽序列如Asn-Ala中則較少。當這樣的脫醯胺位點，特別是Asn-Gly存在於本發明的抗體樣結合蛋白中時，通常可以通過保守取代來去除位點，從而去除位點，以去除一個涉及殘基。序列中用於去除一個或多個涉及殘基的這種取代也意在被本發明涵蓋。
另一種類型的共價修飾涉及將糖苷化學或酶促偶聯至抗體樣結合蛋白。這些方法的優點在於它們不需要在具有N-或O-連接糖基化的糖基化能力的宿主細胞中產生抗體樣結合蛋白。根據所使用的偶聯方式，可以將糖連接到(a)精氨酸和組氨酸，(b)遊離羧基，(c)遊離巰基如半胱氨酸的那些，(d)遊離羥基如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的那些，(e)苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香殘基，或(f)穀氨醯胺的醯胺基。例如，WO87/05330中描述了這些方法。
存在於抗體樣結合蛋白上的任何糖類部分的去除可以化學或酶學地完成。化學脫糖基化需要將抗體樣結合蛋白暴露於化合物三氟甲磺酸或等價化合物。除了連接糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)之外，該處理導致大部分或全部糖的切割，同時使抗體保持完整。Sojahr H等(1987)和Edge等(1981)描述了化學脫糖基化。抗體上糖類部分的酶切割可以通過使用如Thotakura,NR等， (1987)所述的各種內切和外切糖苷酶實現。
抗體樣結合蛋白的另一種類型的共價修飾包括將抗體連接到多種非蛋白質聚合物之一，例如聚乙二醇，聚丙二醇或聚氧乙烯，以美國專利號4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述方式進行。
核酸、載體和重組宿主細胞
本發明的另一個目的涉及包含編碼如上所定義的抗體樣結合合蛋白的序列或由其組成的核酸序列。
通常，所述核酸是DNA或RNA分子，其可以包括在任何合適的載體中，例如質粒，粘粒，附加體，人工染色體，噬菌體或病毒載體。
因此，本發明的另一個目的涉及包含本發明的核酸的載體。
這樣的載體可以包含調節元件，例如啟動子，增強子，終止子等，以在投予於受試者時引起或指導所述多肽的表達。在動物細胞表達載體中使用的啟動子和增強子的實例包括SV40(Mizukami T.等，1987)的早期啟動子和增強子，Moloney小鼠白血病病毒的LTR啟動子和增強子(Kuwana Y等，1987)，免疫球蛋白H鏈的啟動子(Mason JO等，1985)和增強子(Gillies SD等，1983)等。
可以使用動物細胞的任何表達載體，只要編碼人抗體C區的基因能被插入幷表達即可。合適的載體的實例包括pAGE107(Miyaji H等，1990)，pAGE103(Mizukami T等1987)，pHSG274(Brady G等，1984)，pKCR(O'Hare K等，1981)，pSG1βd d2-4-(Miyaji H等，1990)等。質粒的其他實例包括包含複製起點的複製質粒或整合質粒，例如pUC，pcDNA，pBR等。
病毒載體的其他實例包括腺病毒，逆轉錄病毒，皰疹病毒和AAV載體。這樣的重組病毒可以通過本領域已知的技術產生，例如通過轉染包裝細胞或通過用輔助質粒或病毒的瞬時轉染來產生。病毒包裝細胞的典型實例包括PA317細胞，PsiCRIP細胞，GPenv+細胞，293細胞等。用於產生這種複製缺陷型重組病毒的詳細方案可以在例如WO 95/14785，WO 96/22378，US 5,882,877，US 6,013,516，US 4,861,719，US 5,278,056和WO 94/19478。
本發明的另一個目的涉及已經被根據本發明的核酸和/或載體轉染，感染或轉化的細胞。
本發明的核酸可用於在合適的表達系統中產生本發明的重組抗體。
常見的表達系統包括大腸桿菌(E.coli)宿主細胞和質粒載體，昆蟲宿主細胞和杆狀病毒載體以及哺乳動物宿主細胞和載體。宿主細胞的其它實例包括但不限於原核細胞(例如細菌)和真核細胞(例如酵母細胞，哺乳動物細胞，昆蟲細胞，植物細胞等)。具體實例包括大腸桿菌，克魯維酵母屬(Kluyveromyces)或酵母屬(Saccharomyces)酵母，哺乳動物細胞株(例如Vero細胞，CHO細胞，3T3細胞，COS細胞等)以及原代或已建系的哺乳動物細胞培養物(例如由淋巴母細胞，成纖維細胞，胚胎細胞，上皮細胞，神經細胞，脂肪細胞等產生)。實例還包括小鼠SP2/0-Ag14細胞(ATCC CRL1581)，小鼠P3X63-Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)，其中二氫葉酸還原酶基因(以下稱為“DHFR基因”)缺陷的CHO細胞(Urlaub G等；1980)，大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC CRL1662，以下稱為“YB2/0細胞”)等。YB2/0細胞是優選的，因為當在該細胞中表達時，嵌合或人源化抗體的ADCC活性增強。
具體是，為了表達本發明的抗體樣結合蛋白，表達載體可以是其中編碼抗體重鏈的基因和編碼抗體輕鏈的基因存在於分開的載體上的類型或其中兩個基因都存在於相同的載體(串聯型)上的類型。關於構建抗體樣結合蛋白表達載體的容易性，引入動物細胞的容易性以及動物細胞中抗體H和L鏈的表達水準之間的平衡，串聯型的人源化抗體表達載體是優選的(Shitara K等J Immunol Methods.1994 Jan.3；167(1-2)：271-8)。串聯型人源化抗體表達載體的實例包括pKANTEX93(WO 97/10354)，pEE18等。
本發明還涉及根據本發明的產生表達抗體樣結合蛋白的重組宿主細胞的方法，所述方法包括以下步驟：(i)如上文所述體外或體外將重組核酸或載體引入能勝任的宿主細胞中，(ii)體外或離體培養獲得的重組宿主細胞，(iii)任選地選擇表達和/或分泌所述抗體的細胞。
這樣的重組宿主細胞可用於生產本發明的至少一種抗體樣結合蛋白。
本發明的生產抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白的方法
本發明的一個實施例提供了生產“抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白”一節中的本文如上定義的抗體樣結合蛋白的方法。
本發明的抗體樣結合蛋白可以通過本領域已知的任何技術製備，例如但不限於任何單獨或組合的化學，生物，遺傳或酶技術。
瞭解所需序列的氨基酸序列，本領域技術人員可以通過生產多肽的標準技術容易地產生所述抗體或免疫球蛋白鏈。例如，它們可以使用公知的固相方法，特別是使用市售的肽合成裝置(例如由Applied Biosystems，Foster City，California製造)幷按照製造商的說明書合成。或者，本發明的抗體、免疫球蛋白鏈和抗體樣結合蛋白可以通過本領域衆所周知的重組DNA技術合成。例如，這些片段可以通過如下步驟作為DNA表達產物獲得：在將編碼期望的(多)肽的DNA序列摻入表達載體之後，將這些載體引入到將表達所需多肽的合適的真核或原核宿主中，它們隨後可以從所述宿主使用公知的技術加以分離。
具體地，本發明還涉及本發明的抗體樣結合蛋白的生產方法，該方法包括以下步驟：(i)根據本發明培養轉化的宿主細胞；(ii)表達所述抗體樣結合蛋白或相應的多肽；和(iii)回收表達的抗體樣結合蛋白或多肽。
通過常規的免疫球蛋白純化方法，例如蛋白質A-瓊脂糖凝膠，羥基磷灰石層析，凝膠電泳，透析或親和層析，適當地將本發明的抗體樣結合蛋白與培養基分離。
在一個實施例中，回收表達的抗體樣結合蛋白或本文中的多肽是指進行蛋白A層析，K選擇層析法和/或尺寸排阻層析法，優選為蛋白A層析法和/或尺寸排阻層析法，更優選為蛋白A層析和尺寸排阻層析。
本發明的抗體樣結合蛋白的製備方法涉及常規的重組DNA和基因轉染技術是本領域公知的(參見Morrison SL等(1984)和專利文獻US5,202,238；以及US5,204,244)。
基於常規重組DNA和基因轉染技術生產人源化抗體的方法是本領域公知的(參見例如，Riechmann L.等1988；Neuberger MS等，1985)，並且可以以類似於抗體樣結合蛋白的生產那樣轉移。
在一個實例中，如下文第2.5節所述，通常以等比例的輕鏈和重鏈質粒轉染生長在例如F17血清遊離懸浮培養基(Invitrogen)中的FreeStyle HEK293細胞，其中CODV-Fab-TL1抗體樣結合蛋白的抗體資訊通常編碼在一條輕鏈和一條重鏈上，而對於CODV-Fab-OL1抗體樣結合蛋白如CODV-Fab-OL1-節x穴-RF無GS，用例如製造商所述的聚乙烯雌二醇轉染試劑轉染一條輕鏈和兩條重鏈質粒。
細胞通常在37℃處在Kuhner ISF1-X振蕩培養箱中以8%CO2以110rpm培養。例如，培養7天后通過離心除去細胞，通常加入10% Vol/Vol 1M Tris HCl pH8.0，幷通過例如0.2μM的瓶頂過濾器過濾上清液以除去粒子。通過在典型的蛋白A柱(HiTrap蛋白A HP柱，GE Life Sciences)上的親和層析純化CODV-Fab-TL1抗體樣結合蛋白以及CODV-Fab-OL1抗體樣結合蛋白。在用例如0.1M檸檬酸鹽(Citrat)，pH3.0從柱洗脫後，CODV-Fab構建體通常使用例如配製在典型的PBS(Gibco 14190-136)中的HiPrep 26/10脫鹽柱脫鹽。
為了將單體從聚合物以通常高解析度分級分離步驟分離，例如在兩種構建體的PBS(Gibco 14190-136)中，CODV-Fab-TL1抗體樣結合蛋白和CODV-Fab-OL1抗體樣結合蛋白通常使用HiLoad Superdex 200 26/60 320ml柱(GE Healthcare目錄號：29-9893-36)。合幷單體級分幷使用Vivaspin 20離心柱(VS2002 Sartorius Stedim biotech)將其濃縮至例如1mg/ml，幷使用通常為0.22μm的膜(Millex® Syringe Filters SLGV033RS)過濾。
醫藥組合物
本發明的抗體樣結合蛋白可以與醫藥上可接受之賦形劑和任選的緩釋基質例如可生物降解的聚合物組合以形成治療組合物。
因此，本發明的另一個目的涉及包含本發明的抗體樣結合蛋白和醫藥上 可接受之載劑的醫藥組合物。
本發明還涉及用作藥物的根據本發明的抗體樣結合蛋白。本發明還涉及用作藥物的本發明的醫藥組合物。
這種治療劑或醫藥組合物可以包含治療有效量的抗體樣結合蛋白或其藥物偶聯物，其與選擇用於與投予模式適合的藥學或生理上可接受的製劑劑混合。
如本文所用，醫藥上可接受之載體包括生理上相容的任何和所有溶劑，分散介質，包衣，抗菌和抗真菌劑等。合適的載體，稀釋劑和/或賦形劑的實例包括水，氨基酸，鹽水，磷酸鹽緩衝鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇等中的一種或多種，以及它們的組合。在許多情況下，優選在組合物中包含等滲劑，例如糖，多元醇或氯化鈉，並且製劑還可以含有抗氧化劑，例如色胺和穩定劑如Tween 20。
醫藥組合物的形式，投予途徑，劑量和方案自然取決於待治療的病情，疾病的嚴重程度，患者的年齡，體重和性別等。
本發明的醫藥組合物可以配製用於局部，口服，腸胃外，鼻內，靜脈內，肌內，皮下或眼內給藥等。
具體地，醫藥組合物含有能夠被注射的製劑醫藥上可接受之載體。這些可以是特別是等張，無菌，鹽水溶液(磷酸二氫鈉或磷酸鈉，鈉，鉀，鈣或氯化鎂等或這些鹽的混合物)，或乾燥的，特別是冷凍乾燥的組合物，其在加入無菌水或生理鹽水時(取決於情況)允許構成可注射溶液。
用於投予的劑量可以作為各種參數的函數，特別是作為所用的投予模式的函數，相關病理學的函數或可選的所需治療持續時間的函數。
為了製備醫藥組合物，可以將有效量的本發明的抗體或免疫綴合物溶解或分散在醫藥上可接受之載體或水性介質中。
適用於可注射用途的藥物形式包括無菌水溶液或分散體；製劑包括芝麻油，花生油或丙二醇水溶液；以及用於臨時製備無菌注射溶液或分散體的無菌 粉末。在所有情況下，該形式必須是無菌的，並且必須是流體性的，以至於存在易於注射的程度。在製造和儲存條件下必須是穩定的，並且必須防止微生物如細菌和真菌的污染作用而保存。
作為遊離堿或藥理學上可接受的鹽的活性化合物的溶液可以在與表面活性劑如羥丙基纖維素適當混合的水中製備。分散體也可以在甘油，液體聚乙二醇及其混合物和油中製備。在通常的儲存和使用條件下，這些製劑含有防腐劑以防止微生物的生長。
本發明的抗體樣結合蛋白可以配製成中性或鹽形式的組合物。醫藥上可接受之鹽包括酸加成鹽(與蛋白質的游離氨基形成)，幷與無機酸形成，例如鹽酸或磷酸，或有機酸如乙酸，草酸，酒石酸，扁桃酸，等等。由游離羧基形成的鹽也可以衍生自無機堿，例如鈉，鉀，銨，鈣或氫氧化鐵，以及有機堿諸如異丙胺，三甲胺，甘氨酸，組氨酸，普魯卡因等。
載體也可以是含有例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和液體聚乙二醇等)，其合適的混合物和蔬菜油的溶劑或分散介質。通過在分散體的情況下維持所需的粒徑和通過使用表面活性劑，可以維持適當的流動性，例如通過使用包衣如卵磷脂。可以通過各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等來預防微生物的作用。在許多情況下，優選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可注射組合物的延長吸收可以通過在組合物中使用延遲吸收的試劑來實現，例如單硬脂酸鋁和明膠。
無菌可注射溶液是通過將所需量的活性化合物在合適的溶劑中加入根據需要的上述各種其它成分，然後過濾滅菌來製備的。通常，通過將各種滅菌的活性成分幷入無菌載體中製備分散體，所述無菌載體含有鹼性分散介質和上述列舉的所需的其它成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥技術，其從先前無菌過濾的溶液中產生活性成分的粉末和任何另外的所需成分。
還考慮製備用於直接注射的更多或高度濃縮的溶液，其中使用DMSO作 為溶劑來預期導致極快的滲透，將高濃度的活性劑遞送到小的腫瘤區域。
配製後，溶液以與劑量製劑相適應的方式並且以治療有效的量投予。製劑容易以各種劑型投予，例如上述可注射溶液的類型，但也可以使用藥物釋放膠囊等。
對於在水溶液中腸胃外投予，例如，如果需要，溶液應適當緩衝，並且液體稀釋劑首先用足夠的鹽水或葡萄糖等滲。這些特定的水溶液特別適用於靜脈內，肌肉內，皮下和腹膜內給藥。就此而言，根據本公開內容，可以使用的無菌水性介質將是本領域技術人員已知的。例如，一個劑量可以溶解在1ml等滲NaCl溶液中，幷加入到1000ml的皮下溶解液中或在建議的輸注部位注射(參見例如“Remington's Pharmaceutical Sciences”第15版，第1035-1038頁和1570-1580)。劑量的一些變化必然會根據所治療的受試者的狀況而發生。在任何情況下，負責投予者將決定個體受試者的適當劑量。
在一個實施例中，將本發明的抗體樣結合蛋白配製在治療性混合物中，每劑左右包含約0.01至100毫克。
另外，用於腸胃外給藥(如靜脈內或肌內注射)的其它醫藥上可接受之形式的抗體樣結合蛋白包括例如片劑或其他固體用於口服給藥；延時釋放膠囊；以及當前使用的任何其他形式。
在某些實施例中，預期將脂多糖和/或納米顆粒的使用引入宿主細胞中的多肽例如抗CD3抗體，抗CD123抗體或抗體樣結合蛋白。脂質體和/或納米顆粒的形成和使用是本領域技術人員已知的。
納米膠囊通常可以穩定和可再現的方式捕獲化合物。為了避免由於細胞內聚合物過載引起的副作用，通常使用能夠在體內降解的聚合物來設計這樣的超細顆粒(尺寸大約為0.1μm)。滿足這些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯納米顆粒被考慮用於本發明，並且這樣的顆粒可以容易地製備。
脂質體由分散在水性介質中幷自發形成多層同心雙層囊泡(也稱為多層囊泡(MLV))的磷脂形成。MLV通常具有25nm至4μm的直徑。MLV的超聲處 理導致直徑在200至500Å範圍內的小單層囊泡(SUV)的形成，其含有核心中的水溶液。脂質體的物理特性取決於pH，離子強度和二價陽離子的存在。
一旦醫藥組合物已經配製，其可以作為溶液，懸浮液，凝膠，乳液，固體或作為脫水或凍幹粉末儲存在無菌小瓶中。這樣的製劑可以以即用形式或以投予前需要重建的形式(例如凍幹)儲存。
治療方法與用途
本發明人已經在體內顯示了本發明的幾種雙特異性化合物(如hCD20G6xhz7G3 CODV-Fab-TL1和hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-OL1)的T細胞介導的對CD123陽性腫瘤細胞株模型的細胞毒性。此外，本發明人證明瞭本發明的幾種雙特異性化合物在靶細胞存在下啟動T細胞的能力，其導致腫瘤細胞的細胞毒性。本發明人進一步證明瞭在沒有靶細胞的情況下，在不存在T細胞活化的情況下，T細胞的活化低。
因此，在一個實施例中，本發明提供了治療或預防疾病或病症的方法，包括對其向有需要的受試者投予治療有效量的抗體樣結合蛋白或如上文“醫藥組合物”一節中所定義的醫藥組合物。
本發明還涉及抗體樣結合蛋白或本發明的醫藥組合物在製備用於治療或預防受試者的疾病或病症的藥物中的用途。在一個實施例中，本發明涉及使用抗體樣結合蛋白或醫藥組合物來治療或預防受試者的疾病或病症。
在一個實施例中，“受試者”是指人。
在一個實施例中，“疾病”或“病症”是從本發明的抗體樣結合蛋白治療中獲益的任何病症。在一個實施例中，這包括慢性和急性疾病或疾病，包括易受到所討論疾病影響的病理狀況。
在另一個實施例中，疾病是指癌症。
在進一步的實施例中，癌症涉及血液癌症，特別是與CD123表達相關的血液癌症。
在一個實施例中，例如通過使用抗CD123抗體容易地測定癌細胞CD123 的表達。使用抗CD123抗體鑒定表達CD123的癌症的方法是本領域技術人員已知的。
“與CD123表達相關的血液學癌症”包括白血病(如急性骨髓性白血病，慢性骨髓性白血病，急性淋巴細胞性白血病，慢性淋巴細胞白血病，毛細胞白血病和骨髓增生異常綜合征)和惡性淋巴細胞增生症，乳頭狀漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤(BPDCN)系統性肥大細胞增多症，包括淋巴瘤(如多發性骨髓瘤，非霍奇金氏(non-Hodgkin's)淋巴瘤，伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤和小細胞和大細胞濾泡性淋巴瘤)。
如上文“定義”部分所述，LSCs表達CD123。
因此，在相關實施例中，癌症是指與白血病幹細胞相關的血液癌症。
與根據本發明治療的白血病幹細胞(LSC)相關的血液學癌症病症包括白血病(例如急性骨髓性白血病，慢性骨髓性白血病，急性淋巴細胞白血病，慢性淋巴細胞白血病和骨髓增生異常綜合征)和惡性淋巴組織增生性疾病，包括淋巴瘤(如多發性骨髓瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，伯基特氏淋巴瘤，小細胞和大細胞濾泡性淋巴瘤)。
在本發明的一個態樣，血液癌是急性骨髓性白血病(AML)。
在一個實施例中，該被試被診斷為罹患AML。
在進一步的實施例中，已經接受化療治療，直到完全緩解但復發。
在一個實施例中，本發明的抗體樣結合蛋白單獨使用或與任何合適的生長抑制劑組合使用。
在一個實施例中，本發明的抗體樣結合蛋白的治療效果在體內容易地測定，例如在小鼠的癌症模型中，並且通過測量例如治療組和對照組之間的腫瘤體積的變化來測定。
套組
最後，本發明還提供了包含本發明的至少一種抗體樣結合蛋白的套組。
在一個實施例中，套組包含 a)至少一種如上文“抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白”一節中所定義的本發明的抗體樣結合蛋白，b)任選的包裝材料，和c)任選的包含在所述包裝材料中的標簽或包裝插頁，指示所述抗體樣結合蛋白用於有效治療癌症或用於治療癌症。
在相關實施例中，本發明的至少一種抗體樣結合蛋白包含在單個和/或多室預填充注射器(例如液體注射器和lyo注射器(lyosyringe))中。
在一個實施例中，本發明包括用於生產單劑量投予單位的套件。
因此，在一個實施例中，本發明的套組的a)所示的本發明的至少一種抗體樣結合蛋白是包含在第一容器中的本發明的乾燥抗體樣結合蛋白。然後套組還含有具有水性製劑的第二容器。
因此，在一個實施例中，套組包含a)第一容器，其包含如上文“CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白”一節中所定義的本發明的至少一種乾燥的抗體樣結合蛋白，b)包含水性製劑的第二容器；c)任選的包裝材料，和d)任選的包含在所述包裝材料內的標簽或包裝插頁，其指示所述抗體樣結合蛋白用於有效治療癌症或用於治療癌症。
含水製劑通常是包含如上文“醫藥組合物”部分中所定義的醫藥上可接受之載劑的水溶液。
在相關實施例中，“第一容器”和“第二”容器是指多室預填充注射器(例如lyo注射器)的腔室。
現在將參考以下附圖和實施例更詳細地描述本發明。本文引用的所有文獻和專利文獻通過引用幷入本文。儘管在前面的描述中已經對本發明進行了詳細的說明和描述，但是這些示例被認為是說明性的或示例性的而不是限制性的。
【序列簡述】
SEQ ID NO：1顯示蛋白的全長人CD3ε的氨基酸序列，包括信號肽，如可以登錄號P07766獲取自Uniprot數據庫。
SEQ ID NO：2顯示了全長食蟹猴CD3ε的氨基酸序列，包括信號肽，如可以登錄號Q95LI5獲取自Uniprot數據庫。
SEQ ID NO：3顯示了成熟人CD3 ε His標記的Fc融合體的氨基酸序列，其包含全長野生型人CD3 ε蛋白的氨基酸23至126。
SEQ ID NO：4顯示了成熟食蟹猴CD3 ε Fc-融合序列的氨基酸序列，其包含全長野生型食蟹猴CD3 ε蛋白(SEQ ID NO：2)的氨基酸23至117，其在氨基酸位置35與野生型序列的氨基酸位置57相比含有一個Ala至Val交換。
SEQ ID NO：5，6和7顯示了所謂“hz20G6”抗體的CDR1-H，CDR2-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8顯示了所謂“hz20G6”抗體的CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9顯示了人源化“20G6”抗CD3抗體的VH變異體氨基酸序列VH1d。
SEQ ID NO：10顯示了人源化“20G6”抗CD3抗體的VL變異體氨基酸序列VL1c。
SEQ ID NO：11顯示了SEQ ID NO：10的人源化“20G6”抗CD3抗體的VL1c變異體的CDR1-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12顯示了全長人CD123蛋白的氨基酸序列，包括信號肽，可以NP_002174.1從NCBI數據庫獲得和以P26951從Uniprot數據庫獲得。
SEQ ID NO：13顯示了全長食蟹猴CD123蛋白的氨基酸序列，包括信號肽，可從EHH61867.1從GenBank數據庫獲得和以G8F3K3從Uniprot數據庫獲得。
SEQ ID NO：14顯示了包含全長人CD123蛋白(SEQ ID NO：12)的氨基酸 22至305的成熟人CD123 His-II標記的Fc-融合物的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15顯示了成熟食蟹猴CD123 His-II標記的Fc融合物的氨基酸序列，其包含全長食蟹猴CD123蛋白(SEQ ID NO：13)的氨基酸22至305。
SEQ ID NO：16顯示了所謂的CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的接頭L1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17顯示了所謂CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的接頭L2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18顯示了所謂的CODV-Fab“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的氨基酸序列CL。
SEQ ID NO：19顯示了所謂的CODV-Fab“hz20G6xhz7G3“抗體樣結合蛋白地氨基酸序列CH1。
SEQ ID NO：20顯示了接頭序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21顯示了接頭序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22顯示了接頭序列(Thr-Val-Ala-Ala-Pro)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23顯示了接頭序列(Gln-Pro-Lys-Ala-Ala)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：24顯示了接頭序列(Gln-Arg-Ile-Glu-Gly)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25顯示了接頭序列(Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：26顯示了接頭序列(Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：27顯示了接頭序列(Gly-Gly-Gly-Ser)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：28顯示了接頭序列(Ser-Gly-Gly-Gly-Ser)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：29顯示了接頭序列(Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：30顯示了接頭序列(Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)的氨基 酸序列。
SEQ ID NO：31顯示了接頭序列(Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：32顯示了接頭序列(Lys-Thr-His-Thr)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：33顯示了接頭序列(Lys-Thr-His-Thr-Ser)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：34顯示了接頭序列(Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：35顯示了接頭序列(Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：36顯示了接頭序列(Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：37顯示了接頭序列(Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：38顯示了接頭序列(Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：39顯示了接頭序列(Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：40顯示了接頭序列(Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41顯示了接頭序列(Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：42顯示了接頭序列(Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：43顯示了接頭序列(Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：44顯示了接頭序列(Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：45顯示了接頭序列(Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：46顯示了接頭序列(Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：47顯示了接頭序列(Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：48和49顯示了所謂的“hz7G3”抗體的CDR1-L和CDR3-L的氨基酸序列。
SEQ ID NO：50和51顯示SEQ ID NO：52的所謂的人源化“7G3”抗體的CDR1-H和CDR3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO：52顯示了所謂的人源化“7G3”抗體的重鏈可變域的進一步變異體的氨基酸序列。
SEQ ID NO：53顯示SEQ ID NO：52的所謂的人源化“7G3”抗體之一的CDR2-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO：54顯示了所謂的人源化“7G3”抗體的輕鏈可變域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：55顯示了所謂的CODV-Fab-OL1和CODV-Fab-OL1a的式[I]的多肽和CODV-Fab-OL1-節x穴-RF無GS(woGS)“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：56顯示了接頭序列(Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：57顯示了所謂的CODV-Fab-TL1-RF“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的所述式[IV]的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：58顯示了所謂的CODV-Fab-TL1-RF“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的Fc2區的氨基酸序列。
SEQ ID NO：59顯示了所謂的CODV-Fab-TL1-RF和CODV-Fab-TL1 “hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的式[III]的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：60顯示了所謂的CODV-Fab-TL1-RF和CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”的式[III]的多肽的Fc區的氨基酸序列。
SEQ ID NO：61顯示了所謂的CODV-Fab-OL1“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的式[III]的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：62顯示了所謂的CODV-Fab-OL1“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的Fc區的氨基酸序列。
SEQ ID NO：63顯示了所謂的CODV-Fab-OL1“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的Fc段(Fc3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：64顯示了所謂的CODV-Fab-OL1a“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的Fc段(Fc3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：65顯示了所謂的CODV-Fab-OL1a和不含GS的CODV-Fab-OL1-節x穴-RF“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的式[III]的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：66顯示了所謂的CODV-Fab-OL1a和CODV-Fab-OL1-節x穴-RFwoGS“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的式[III]多肽的Fc域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：67顯示了本發明的所謂的抗體樣結合蛋白的式[III]的多肽的廣義氨基酸序列(即CODV-Fab-TL1-節-RFx穴，CODV-Fab-TL1-節x穴-RF，CODV-Fab-TL1，CODV-Fab-TL1-節x穴，CODV-Fab-OL1-節x穴-RF)無GS(woGS)。
SEQ ID NO：68顯示了本發明的所謂的抗體樣結合蛋白的式[III]的多肽的Fc域的廣義氨基酸序列(即CODV-Fab-TL1-節-RFx穴，CODV-Fab-TL1-節x穴-RF，CODV-Fab-TL1，CODV-Fab-TL1-節x穴，無GS(woGS)的CODV-Fab-OL1-節x穴-RF)。
SEQ ID NO：69顯示了所謂的CODV-Fab-OL1-節x穴-RF無GS(woGS) “hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的Fc段(Fc3)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：70顯示了所謂的抗體樣結合蛋白的化學式[IV]的多肽的Fc域(Fc2)的廣義氨基酸序列，CODV-Fab-TL1-節-RFx穴，CODV-Fab-TL1-節x穴-RF，CODV-Fab-TL1，CODV-Fab-TL1-節x穴。
SEQ ID NO：71顯示了所謂的抗體樣結合蛋白(CODV-Fab-TL1-節-RFx穴，CODV-Fab-TL1-節x穴-RC，CODV-Fab-TL1，CODV-Fab-TL1-節x穴)的式[IV]的多肽的廣義氨基酸序列。
SEQ ID NO：72顯示了所謂的CODV-Fab-TL1-節-RFx穴“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的所述式[IV]的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：73顯示了所謂的CODV-Fab-TL1-節-RFx穴“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的所述式[IV]的多肽的氨基酸序列
SEQ ID NO：74顯示了所謂的CODV-Fab-TL1-節-RFx穴和CODV-Fab-TL1-節-x穴“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的式[III]的多肽的氨基酸序列
SEQ ID NO：75顯示了所謂的CODV-Fab-TL1-節-RFx穴和CODV-Fab-TL1-節-x穴“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的式[III]的多肽的Fc的氨基酸序列
SEQ ID NO：76顯示了所謂的CODV-Fab-TL1-節x穴-RF和CODV-Fab-TL1-節-x穴“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的所述式[IV]的多肽的氨基酸序列
SEQ ID NO：77顯示了所謂的CODV-Fab-TL1-節x穴-RF和CODV-Fab-TL1-節x穴“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的式[IV]的多肽的Fc2域的氨基酸序列
SEQ ID NO：78顯示了所謂的CODV-Fab-TL1-節x穴-RF“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的式[III]的多肽的氨基酸序列
SEQ ID NO：79顯示了所謂的CODV-Fab-TL1-節x穴-RF“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的式[III]的多肽的氨基酸序列
SEQ ID NO：80顯示了所謂的CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的所述式[IV]的多肽的氨基酸序列
SEQ ID NO：81顯示了所謂的CODV-Fab-TL1“hz20G6xhz7G3”抗體樣結合蛋白的式[IV]的多肽的Fc2域的氨基酸序列
SEQ ID NO：82顯示了如WO2015026892中所示的氨基酸序列SEQ ID NO：1。
SEQ ID NO：83顯示了如WO2015026892中所示的氨基酸序列SEQ ID NO：3。
SEQ ID NO：84顯示了Strep Tag的氨基酸序列。
SEQ ID NO：85顯示了His Tag的氨基酸序列。
圖1：A)CODV-Fab-TL1-RF的示意圖B)SDS-凝膠C)SEC譜(峰值在178，17mL表示異二聚體級分，蛋白A後的產率=12mg/L，52%異二聚體。
圖2：A)CODV-Fab-TL1-節-RFx穴的示意圖B)SDS-Gel C)SEC譜(峰值在177，90mL表示異二聚體級分，蛋白A後的產率=20mg/L，85%異二聚體。
圖3：A)CODV-Fab-TL1-節x穴-RF的示意圖B)SDS-Gel C)SEC譜(峰值在180，54mL的峰表示異源二聚體級分，蛋白A後的產率=9mg/L，55%異二聚體。
圖4：CODV-Fab-OL1-節x穴-RF_woGS(不含GS)的示意圖B)SDS-凝膠C)SEC譜(峰值在180，59mL表示異二聚體級分，蛋白A後的產率=5mg/L，88%異二聚體。
圖5：證明本發明的抗體結合蛋白的穩定性的圖。加速應激條件(2周，40℃)後的聚集傾向通過SEC進行評估。相比之下，在-80℃或4℃儲存的相同蛋白的SEC譜。
A)CODV-Fab-TL1-RF
B)CODV-Fab-TL1-節-RFx穴
C)CODV-Fab-TL1-節x穴-RF
D)CODV-Fab-OL1-節x穴-RF wo GS
圖6和8：在人T細胞存在下，完全人CODV-Fab-TL1-RF“hz20G6xhz7G3”IV Q3d在所有測試的劑量處抑制全身的Molm13腫瘤生長。
圖7和9：人T細胞存在下的完全人CODV-Fab-TL1-RF“hz20G6xhz7G3”IV Q3d與所有測試劑量的長骨中的腫瘤消退有關。
圖10：CODV-Fab-TL和CODV-Fab-OL(進一步顯示LALA突變(當使用IgG1主鏈的Fc時)和節-入穴突變)的結構的示意圖。
圖11：抗體樣結合蛋白CODV-Fab-TL1-節-RFx穴，CODV-Fab-TL1-節x穴-RF，CODV-Fab-TL1，CODV-Fab-TL1-RF，CODV-Fab-TL1-節x穴和代表其廣義氨基酸序列的SEQ ID NO：70的式[IV]的多肽的Fc域(Fc2)的序列比對。抗體樣結合蛋白CODV-Fab-TL1-RF已在PCT/EP2016/051386中描述。從這個比對可以看出，CODV-Fab-TL1-節-RFx穴，CODV-Fab-TL1-節x穴-RF,CODV-Fab-TL1-節x穴的式[IV]的多肽的Fc域(Fc2)與抗體樣結合蛋白CODV-Fab-TL1-RF的所有式[IV]的多肽的Fc域(Fc2)的區別在於存在“節”突變，且式[IV]的多肽的式[IV]的多肽的Fc域(Fc2)與抗體樣結合蛋白CODV-Fab-TL1-RF的式[IV]的多肽的Fc域(Fc2)不同在於缺乏RF突變。
圖12：抗體樣結合蛋白CODV-Fab-TL1-節-RFx穴，CODV-Fab-TL1-節x穴-RF,CODV-Fab-TL1,CODV-Fab-TL1-RF,CODV-Fab-TL1-節x穴和代表其廣義氨基酸序列的SEQ ID NO：68的式[III]的多肽的Fc域的序列比對。從這種比對可以看出，CODV-Fab-TL1-節-RFx穴，CODV-Fab-TL1-節x穴-RF,CODV-Fab-TL1-節x穴的式[III]的多肽的the Fc域與抗體樣結合蛋白CODV-Fab-TL1-RF的區別在於存在“穴”突變。
圖13：抗體樣結合蛋白CODV-Fab-OL1,CODV-Fab-OL1a,CODV-Fab- OL1-節x穴-RF woGS的式[III]的Fc域的序列比對。
圖14：抗體樣結合蛋白CODV-Fab-OL1，CODV-Fab-OL1a，CODV-Fab-OL1-節x穴-RFwoGS的式[III]的多肽的Fc3域的序列比對。抗體樣結合蛋白CODV-Fab-OL1和CODV-Fab-OL1a已經在PCT/EP2016/051386中有描述。從這種比對可以看出，CODV-Fab-OL1-節x穴-RF woGS的式[III]的多肽的Fc3域與抗體樣結合蛋白CODV-Fab-OL1和CODV-Fab-OL1a區別在於缺乏氨基酸GS。
圖15：在人T細胞存在下，完全人CODV-Fab-TL1-節x穴-RF“hz20G6xhz7G3”IV Q3d在所有測試劑量處抑制全身的Molm13腫瘤生長。
圖16：在人T細胞存在下，完全人CODV-Fab-TL1-節x穴-RF“hz20G6xhz7G3”IV Q3d與所有測試劑量的長骨中的腫瘤消退相關。
如以下實施例所示，這些抗CD3/抗CD123抗體樣結合蛋白包括導致簡化純化幷在表達和純化期間減少聚集從而導致異二聚體的量增加的突變，同時在不存在表達CD123的靶細胞(例如THP-1細胞)的情況下具有低T細胞活化，但在表達CD123的靶細胞(例如THP-1細胞)的情況下具有T細胞的高活化。
實施例1：hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-TL1-RF,hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-OL1和DART
1.1 T CD123xCD3 CODV或DART的細胞啟動效果
如2.9所述，通過基於流式細胞術偵測原代人T細胞表面的活化標志物CD25和CD69的表達來分析抗體樣結合蛋白對T細胞活化狀態的影響。比較包括在WO2015026892中描述的DART形式的單鏈CD123×CD3雙特異性雙抗體(以下稱為“MGD006”)，其包含序列SEQ ID NO：82的第一多肽鏈(其為SEQ ID NO：1為WO2015026892所示)和序列SEQ ID NO：83(其是WO2015026892中所示的SEQ ID NO：3)的第二多肽鏈通過二硫鍵彼此共價鍵 合。當CODV與分離的T細胞單獨溫育時，CD4陽性和CD8陽性T細胞表面上可偵測到晚期活化標志物CD25的表達顯著增加(數據未顯示)。同樣地，兩個T細胞亞群的早期活化標志物CD69的表達水準沒有濃度依賴性增加(表1)。因此，該結構被評估為不活躍(NA)。相比之下，當添加THP-1靶細胞時，可以測量兩種標記物的表達水準的巨大增加(CD25數據未顯示，CD69數據表2)。
表1中顯示的結果表明，在所測試的條件下，單鏈抗體(DART)在沒有靶細胞的情況下導致明顯更多的T細胞活化。
表2：在基於流式細胞術的測定中，通過CD69表達水準偵測到的含有CODV分子和單鏈DART的雙特異性完全人源化7G3對T細胞活化狀態的影響。顯示活化的CD8和CD4T細胞的代表性測試的EC50值。通過THP-1靶細胞和原代T細胞的共培養進行測定。
評估了CODV-Fab-TL1-RF“hz20G6xhz7G3”，CODV-Fab-OL1“hz20G6xhz7G3”和單鏈DART MGD006的細胞毒性作用。通過Biacore測量每個雙特異性構建體對CD3ε/δ-複合物和CD123的親和力。此外，如2.8(表3)中所述進行細胞毒性測定。
為了評估分子在存在(需要的)和不存在(不需要的)靶細胞的情況下觸發T細胞活化的潛力，實施了新的測定。將NFAT-RE-luc2 Jurkat細胞(Promega # CS176401)與THP-1靶細胞在37℃和RPMI1640中的5%CO2中以1：3的效應物與靶標比例溫育，與2g/L(11mM)葡萄糖，與GlutaMAX，與384孔板中加 入的25mM HEPES。5小時後，停止溫育幷使用Bio-Glo熒光素酶測定系統(Promega # G7940)在發光微量板讀數器中測量發光。
表4中顯示的結果表明，所有抗體樣結合蛋白在靶細胞存在下誘導報告細胞活化，其EC50值低於nM。對于T細胞接合方法，T細胞活化應限於靶細胞的存在。這對于CODV分子而言觀察到了，因為在沒有靶細胞的情況下沒有明顯的發光信號。相比之下，單鏈DART分子在沒有靶細胞的情況下誘導更高的報道細胞株活化。這些結果與用原代T細胞獲得的結果一致。
1.2 CD123xCD3雙特異性CODV-Fab-TL1-RF和CD123xCD3雙特異性DART的體內抗腫瘤活性
材料和方法
從全血分離人PBMC和T細胞
通過Ficoll梯度離心從人體健康供體的全血分離PBMC。全血在無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中以1：1稀釋。然後，在15mL Ficoll-Paque存在下，將2體積的35mL的稀釋的血液加入兩個50mL的Falcon管中。將管在室溫以200g離心40分鐘，無需制動(brake)。回收兩個血沉棕黃層，幷加入6個50mL Falcon管中，加入45mL無菌PBS，在10分鐘內以100g無制動在室溫離心3次(在每次離心之間棄去上清液，加入45mL PBS)。最後一次離心後，將兩個沉澱放在一起，最終體積為50mL，所述最終體積用PBS在50mL Falcon管中完成。總體的活PBMC數量由Vicell計數定義。然後在來自Myltenyi Biotech(130-091-221)的Automacs運行緩衝液中回收沉澱物，幷使用來自Miltenyi Biotech(130-091-156)的陰性選擇套組和Automacs根據製造商說明書從PBMC中分離T細胞。回收純化的T細胞，幷以2.5 x10E+6個細胞/mL的濃度在Xvivo-15 5%HIS+peni-strepto1X培養基中培養。
人T細胞擴增
使用來自Miltenyi Biotech(130-091-441)的T細胞活化/擴增套組，在14天內使人富集的T細胞群在體外活化和擴增，
用於體內投予的人T細胞製備物
將細胞和細胞培養基在400g離心10分鐘。以無菌PBS中2x10E+7細胞/ml的濃度回收沉澱。根據製造商的說明書，使用來自Myltenyi Biotech(130-092-168)的MACsiMAG分離器，從擴增的T細胞除去活化珠。通過Vicell計數富集的T細胞群，幷回收于50mL Falcon管中的25mL無菌PBS中。在室溫10分鐘內以400g離心的步驟後，回收細胞沉澱於足夠體積的無菌PBS中，以得到5x10E+7個細胞/mL的終濃度。
腫瘤模型
表達CD123的Molm-13人急性骨髓性白血病細胞獲取自微生物和細胞培養物的Leibniz-institut DSMZ-German收集(DSMZ Braunshweig,Germany)。細胞在RPMI1640 Glutamax培養基(用胎牛血清20%完成)中的培養物(37℃，5%CO2，95%濕度)中生長。通過非複製型慢病毒攜帶的熒光素酶載體(SV40-PGL4-Puro-即由連接到螢光素酶2的猿猴病毒40啟動子和嘌呤黴素抗性盒序列組成的螢光素酶載體)感染Molm-13細胞。
在NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1WjI/SzJ NSG小鼠中靜脈內(IV)注射 Molm13-luc+腫瘤細胞(每只動物10E+6個細胞在200μlPBS懸浮液中)。24小時後，在0.2mL無菌PBS的體積下，將10E+7個人T細胞腹膜內(IP)投予於相同的小鼠。
使用Living Image 3.2採集軟件(Perkin-Elmer,Waltham,M,USA)，使用IVIS100成像儀(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)進行腫瘤植入後第三天的基綫生物發光成像。在成像前15分鐘，對動物IP注射甲基熒光素鉀鹽(批次316019,Promega,Lyon,France)120mg/kg溶液。在成像前5分鐘，用氯胺酮/Xylazine®(120mg/kg；6mg/kg IM，5ml/kg)麻醉小鼠。
通過靜脈內途徑(IV)的CODV-Fab-TL1-RF“hz20G6xhz7G3”和CD123xCD3雙特異性DART競爭劑(單鏈抗體DART形式MGD006或稱為“DART工具”的密切類似物)或PBS處理在骨胳中已經偵測到的已建立的腫瘤植入後第四天開始，如表5所示。
數據收集和功效標準
從第3天到測定結束時監測動物體重，以便遵循治療的影響。連續3天產生20%體重減輕或15%體重減輕或10%或更多藥物相關死亡的劑量被認為是 過度毒性的劑量。動物體重包括腫瘤重量。
腫瘤負載之後是非侵入性生物發光成像(BLI)。基綫BLI在腫瘤植入後第三天、治療開始前24小時進行。基於全身生物發光信號，將動物分在不同的組中。通過在腫瘤植入後第7、10和14天的BLI信號測量，在後腿中的全身和長骨中隨後是腫瘤生長。通過分割來測量長骨信號，並且可能受到附近局部區域信號(例如在後期時間點的軟組織中的殘留信號)的影響。將治療組與攜帶Molm13-luc+彌散性腫瘤和人T細胞的對照動物進行比較。
主要功效終點是治療組和對照組(dT/dC)的腫瘤信號自基綫變化的比例，部分腫瘤消退數(PR)和完全腫瘤消退數(CR)。
對每個治療組的每只動物監測基於生物發光信號曲綫(以Phot/sec表示)的腫瘤生長，幷以所有身體和骨分割信號的中值曲綫±MAD表示。對於每個對照(C)或處理的(T)動物，並且通過在指定觀察日從腫瘤信號減去第一次處理當天(分期日)的腫瘤信號，計算腫瘤生物發光信號的變化。對於治療組計算中值T，幷計算對照組的中值C。
然後計算比率T/C幷以百分比表示：dT/dC=[(中值T天obs-中值T天3)/(中值C天obs-中值C天3)]×100
當dT/dC低於10%時，dT/dC在實驗結束時(第14天)低於42%時，該劑量被認為具有治療活性。
百分比的腫瘤消退定義為治療組在指定觀察日的腫瘤信號與其治療第一天的信號相比的減少百分比。在特定的時間點和對於每個動物，%消退計算為：
鑒於由於熒光素動力學和可能的IP缺失注射引起的信號變異性的風險，僅當至少在兩個連續時間點觀察時，將動物的信號消退視為真正的腫瘤消退。
部分消退(PR)：如果腫瘤信號在兩個連續時間點下降到低於治療開始的信號，一個優於基綫信號的50%，則消退定義為部分的。
完全消退(CR)：如果腫瘤信號在連續兩個時間點下降超過50%低於在治療開始時的信號，則消退定義為完整的。
統計分析
統計分析
IV途徑化合物評價
將每組治療的個體生物發光信號與其他治療組相比，使用Bonferroni-Holm調整用於多樣性成對比較，然後是具有按天數重複測量的雙因數方差分析：p>0.05：NS,0.05>p>0.01：*,p<0.01：**。對全身生物發光信號和長骨生物發光信號進行統計分析
結果
CD123xCD3雙特異性CODV-Fab-TL1-RF“hz20G6xhz7G3”IV
在人T細胞存在下，在全血中完全人CODV-Fab-TL1-RF“hz20G6xhz7G3”IV Q3d在所有測試劑量(1.3，0.13和0.013nmol/Kg Q3d)處抑制Molm13腫瘤生長，dT/dC分別為20%，14%和38%(圖6和8)，且分別與具有4/7 CR，6/8 CR和2/6 CR的在所有測試劑量處的長骨中腫瘤消退相關(圖7和9)。
在全身和骨骼中以0.13nmol/kg Q3d獲得完全人CODV-Fab-TL1-RF“hz20G6xhz7G3”最大反應。在該劑量處，活性與DART 1.3nmol/kg IV Qd(全血dT/dC 29%具有1/7CR而長骨中為1/7PR)沒有統計學差異。數據通過終末組織病理學分析確認(未顯示)。
在全身和長骨之間觀察到的差異與IV注射後的髓外腫瘤擴散後緊接發生的卵巢和腹部脂肪中的殘餘腫瘤生長有關。
1.3 CD123xCD3雙特異性CODV-Fab-TL1-RF和CD123xCD3雙特異性CODV-Fab-TL1-節x穴-RF
材料與方法
第1.2段描述了人T細胞的分離和擴增。
腫瘤模型
腫瘤模型如第1.2段所述。通過靜脈內途徑(IV)的CODV-Fab-TL1-RF“hz20G6xhz7G3”和CODV-Fab-TL1-節x穴-RF“hz20G6xhz7G3”或PBS處理在骨胳中已經偵測到的已建立的腫瘤植入後第四天開始，如表6所示。
統計分析
IV途徑化合物評價如第1.2段所述。
結果
CD123xCD3雙特異性CODV-Fab-TL1-節x穴-RF“hz20G6xhz7G3”IV
在人T細胞存在的情況下，完全人CODV-Fab-TL1-節x穴-RF“hz20G6xhz7G3”IV Q3d在所有測試劑量(1.3，0.13和0.013nmol/Kg Q3d)處 抑制Molm13腫瘤生長，全身中T/C分別為7%，5%和15%，分別與在所有測試劑量處5/8 CR，8/8 CR和4/6 CR的長骨腫瘤消退相關(圖15和16)。
在全身和骨骼中在0.13nmol/kg Q3d處獲得完全人CODV-Fab-TL1-節x穴-RF“hz20G6xhz7G3”最大反應。
CD123xCD3雙特異性CODV-Fab-TL1-RF“hz20G6xhz7G3”IV
在人T細胞存在下，完全人CODV-Fab-TL1-RF“hz20G6xhz7G3”IV Q3d在所有測試劑量(1.3，0.13和0.013nmol/Kg Q3d)處抑制Molm13腫瘤生長，全血中T/C分別為12%，6%和4%，分別與在所有測試劑量處5/8 CR，5/7 CR和7/7 CR的長骨腫瘤消退相關(圖15和16)。
在所有測試的劑量處，CD123xCD3雙特異性CODV-Fab-TL1-節x穴-RF“hz20G6xhz7G3”活性與CODV-Fab-TL1-RF“hz20G6xhz7G3”沒有統計學差異。數據通過終末組織病理學分析確認。
在全身和長骨之間觀察到的差異與IV注射後的髓外腫瘤擴散後緊接發生的卵巢和腹部脂肪中的殘餘腫瘤生長有關。
實施例2：hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-TL1，hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-OL1的變異體
2.1 hCD3ε/δ-hFc融合表達質粒(CD3ed-Fc)的構建
使用含有質粒的cDNA作為範本，如下文詳細描述的，產生了人和食蟹猴CD3ε和CDδ融合蛋白，其在閱讀框中具有包含人免疫球蛋白IgG的鉸鏈區，CH2和CH3結構域的重鏈恒定區，所述IgG攜帶8x His或Strep-II標簽用於可選的串聯純化。
使用人基因組DNA作為範本，擴增人CD3ε和人CDδ亞基胞外結構域，包括信號序列。通過連接PCR合幷得到的擴增切割和純化的PCR產物，幷使用NheI和HindIII位點通過InFusion方法連接到哺乳動物表達載體pXL中。將每個亞基克隆在一個質粒上。所得到的成熟人CD3εHis標記的Fc融合蛋白的 序列在本文公開於SEQ ID NO：3。SEQ ID NO：3的氨基酸1至104對應于野生型全長人CD3ε(本文公開為SEQ ID NO：1，在Uniprot數據庫中可以登錄號P07766獲得)的氨基酸23至126，因此為人CD3ε的胞外結構域。
以食蟹猴基因組DNA為範本，擴增食蟹猴CD3ε和CD3δ胞外結構域，包括信號序列。通過連接PCR合幷得到的擴增切割和純化的PCR產物，使用NheI和HindIII通過InFusion方法連接到哺乳動物表達載體pXL中。將每個亞基克隆在一個質粒上。成熟食蟹猴CD3εFc融合蛋白的所得序列在SEQ ID NO：4中公開。SEQ ID NO：3的氨基酸1至95對應于全長食蟹猴CD3ε蛋白的氨基酸23至117，因此包含野生型全長食蟹猴CD3ε的胞外結構域(本文公開於SEQ ID NO：2，在Uniprot數據庫中可以登錄號Q95LI5獲得)。與野生型序列的氨基酸位置57相比，克隆的融合蛋白在氨基酸位置35處進一步含有一個丙氨酸-纈氨酸交換。
2.2 人和食蟹猴CD3ε/δ-Fc的表達和純化
用表達質粒瞬時轉染在F17無血清懸浮培養(Life)中生長的自由式HEK293細胞。使用Cellfectin轉染試劑(Life)進行代表CD3ε和CD3δ胞外結構域(ECD)亞基的兩種質粒的共轉染。細胞在37℃培養7天。通過離心收穫含有重組蛋白的培養上清液，幷通過過濾(0.22μm)澄清。
為了純化，將Fc融合蛋白變異體捕獲在蛋白A基質(GE)上，幷通過pH漂移進行洗脫。通過尺寸排阻層析法(SEC)使用Superdex 200(GE)和最終超濾濃縮步驟對蛋白質進行提純(polishing)後，將該蛋白質用於進一步測定。
在蛋白A上捕獲後，將人異二聚體另外應用於His-Trap柱(GE)幷脫鹽。將洗脫的蛋白質應用於鏈黴親和素柱(GE)，幷用d-脫硫生物素進行洗脫，然後使用Superdex 200(GE)通過SEC進行最終提純。該策略用於從同二聚體分離異二聚體。
2.3 CD123(IL3RA)-hFc融合表達質粒(CD123-Fc-His)的構建
使用含有質粒的cDNA作為範本，在具有免疫球蛋白IgG的重鏈恒定 區，人鉸鏈區，CH2和CH3域且另外攜帶六組氨酸標簽的閱讀框中產生人CD123融合蛋白。
使用人基因組DNA作為範本，擴增人CD123(IL3RA)胞外結構域，包括信號序列。通過連接PCR組合得到的擴增的切割和純化的PCR產物，幷使用NheI和HindIII位點通過InFusion方法連接到哺乳動物表達載體pXL中。得到的成熟人CD123 His-II標記的Fc融合蛋白的序列以SEQ ID NO：14公開。氨基酸1至284對應于全長野生型人CD123蛋白的氨基酸22至305(本文以SEQ ID NO：12公開，可從NCBI數據庫以登錄號NP_002174.1獲得)，因此是人CD123的胞外結構域。
2.4 人CD123-Fc-His的表達和純化
用表達質粒瞬時轉染在F17無血清懸浮培養(Life)中生長的自由式HEK293細胞。使用Cellfectin轉染試劑(Life)進行轉染。細胞在37℃培養7天。通過離心收穫含有重組蛋白的培養上清液，幷通過過濾(0.22μm)澄清。
為了純化，將Fc融合蛋白變異體捕獲在蛋白A基質(GE)上，幷通過pH漂移進行洗脫。在PBS中通過SEC使用Superdex 200(GE)和最終超濾濃縮步驟提純蛋白質之後，將蛋白質用於進一步測定。
本發明的每種多肽，例如第2.1至2.4節所述的多肽可以包含標簽，如His標簽或Strep標簽，因為此類標簽可能例如使得純化更容易。標簽可能例如對應於His標簽(HHHHHH，也稱SEQ ID NO：85)或Strep-II標簽(WSHPQFEK，也稱SEQ ID NO：84)，並且這兩個標簽可以彼此替代。或者，本發明的多肽沒有任何標簽。本文所述的任何多肽的不帶標簽和帶標簽形式都包括在本發明的範圍內。在一個實施例中，本發明的多肽包含信號肽和/或前肽，使其分泌更容易和/或更有效。或者，本發明的多肽對應於成熟多肽，即對應於沒有信號肽和前肽的多肽。本文所述的任何多肽的成熟和全長形式均包括在本發明的範圍內。
2.5 CODV抗體樣結合蛋白的表達和純化
對使用單克隆抗體“hz20G6”和“hz7G3”的序列的雙特異性CD3xCD123 CODV抗體樣結合蛋白進行表達和純化。
用輕鏈和重鏈質粒以等比例轉染在F17血清遊離懸浮培養基(Invitrogen)中生長的自由式HEK293細胞。對於CODV-Fab-TL1抗體樣結合蛋白，抗體信息編碼在一條輕鏈和一條重鏈上(圖1-3)，而對於CODV-Fab-OL1抗體樣結合蛋白如CODV-Fab-OL1-節x穴-RF無GS(圖4)，如製造商所述，使用聚乙烯雌二醇轉染試劑轉染一條輕鏈和兩條重鏈質粒。於37℃在Kuhner ISF1-X振蕩培養箱中以8%CO2以110rpm培養細胞。培養7天后，通過離心除去細胞，加入10% Vol/Vol 1M Tris HCl pH8.0，幷通過0,2μM的瓶頂過濾器過濾上清液以除去顆粒。所有CODV分子，CODV-Fab-TL1抗體樣結合蛋白以及CODV-Fab-OL1抗體樣結合蛋白通過蛋白A上的親和層析柱(HiTrap蛋白A HP柱，GE Life Sciences)純化。在用0.1M Citrat，pH3.0從柱洗脫後，使用配製在PBS(Gibco 14190-136)中的HiPrep 26/10脫鹽柱將CODV構建體脫鹽。
為了從聚集體分離單體，使用HiLoad Superdex 200 26/60 320ml柱(GE Healthcare目錄號：29-9893-36)，在PBS(Gibco 14190-136)中對兩種構建體(CODV-Fab-TL1抗體樣結合蛋白和CODV-Fab-OL1抗體樣結合蛋白)進行了高解析度分級步驟。合幷單體級分，使用Vivaspin 20離心柱(VS2002 Sartorius Stedim biotech)濃縮至1mg/ml，幷使用0.22μm膜(Millex® Syringe Filters SLGV033RS)過濾。
通過測量280nm處的吸光度來測定蛋白濃度。在還原和非還原條件下通過SDS-PAGE分析每批次，以確定每個亞基和單體的純度和分子量。
使用來自Charles River的Endosafe-PTS系統進行定量LAL測定，以確保無內毒素樣品。
與CODV-Fab-TL1-RF相比，CODV-Fab-TL1-節-RFx穴的表達導致更高的產量和更高量的正確異二聚體級分。令人驚訝的是，RF突變定位的變化扭轉了這一積極作用，如CODV-Fab-TL1-節x穴-RF所觀察到的。CODV-Fab-OL1-節x穴-RFwoGS構型積極影響異二聚體級分的量，而不影響產量(表6)。
2.6 用SPR對CD3xCD123 CODV抗體樣結合蛋白對人CD3ε/δ和人CD123的親和力評估
使用具有HBS-EP(GE Healthcare)作為測定緩衝液的Biacore3000或Biacore T200儀器(GE Healthcare)，通過表面等離子體共振(SPR)測量CODV抗體樣結合蛋白對人CD3ε/δ和人CD123的結合親和力。使用His捕獲套組(GE Healthcare)實現對CD3ε/δ-Fc或CD123-Fc-His融合蛋白的捕獲。使用胺偶聯套組(BR-100-50，GE Healthcare)將捕獲抗體偶聯至CM5晶片(GE Healthcare)至約12.000RU。以10μl/min捕獲CD3εδ-Fc或CD123-Fc-His融合蛋白，以得到30RU的Rmax值。與CODV抗體樣結合蛋白的結合動力學測定為30μl/min。使用測定緩衝液中的3-200nM的CODV抗體樣結合蛋白的兩倍稀釋度。所有Fab濃度與雙重緩衝空白液一起重複運行進行雙重參考。以30μl/min的1min注射10mM甘氨酸pH1.5進行捕獲表面的再生。使用BIA評估軟件(GE Healthcare)進行數據分析。使用具有質量傳遞的1：1 Langmuir模型全域擬合數據。
對於不同的CD3xCD123 CODV(稱為CODV-Fab-TL1-節-RFx穴，CODV-Fab-TL1-節x穴-RF“,CODV-FabOL1-節x穴-RF wo GS)獲得的對huCD3εδ和huCD123的結合動力學對所有測試構建體而言是相似的。
2.7 CD3xCD123 CODV抗體樣結合蛋白的穩定性評估
2.7.1通過差示掃描熒光測定法(DSF)測量的熱穩定性
使用差示掃描熒光測定法(DSF)測定熔點Tm。將樣品在D-PBS緩衝液(Invitrogen)中稀釋至0.2μg/μl的終濃度為，包括白色半裙邊96孔板(BIORAD)中的D-PBS中的SYPRO-Orange染料(Invitrogen，DMSO中的5000x儲液)的4x濃縮溶液。所有測量使用MyiQ2實時PCR儀(BIORAD)一式兩份進行。在iQ5軟件v2.1(BIORAD)中生成瞭解曲綫的負一階導數曲綫(-d(RFU)/dT)。然後將數據導出到Excel中，以確定Tm和數據的圖形顯示。發現所有測試的CODV構建體的熔點(表8)在56-57℃非常相似。
2.7.2加速溫度應激時的穩定性
為了評估加速溫度應激條件下CODV構建體的穩定性，在40℃將蛋白質在0.5mL安全鎖管(Eppendorf BIOPUR)中的D-PBS緩衝液中以1mg/ml溫育2周。將對照樣品在-80℃和4℃保持相同的時間段。應激處理後，用 BioSECcurity HPLC系統(PSS Polymer)通過分析尺寸排阻層析(SEC)分析樣品的聚集物含量。使用TSKgel SuperSW3000柱(4μm，4,6x300mm，Tosoh Bioscience)上的5μl蛋白溶液，用具有250mM NaCl，100mM磷酸鈉pH 6.7作為運行緩衝液的TSKgel SW型保護柱(4μm，4,6x35mm，Tosoh Bioscience)以0.25ml/min來進行層析。採用WinGPC軟件(PSS Polymer)分析數據。加速溫度應激後分析的所有CODV結構與對照樣品相比，其聚合物含量增加(圖5)。CODV-Fab-TL1-RF(PB05126)應激後的聚合物含量為6%，CODV-Fab-TL1-節-RFx穴為4.1%，CODV-Fab-TL1-節x穴-RF為6.6%且CODV-Fab-OL1-節x穴-RF wo GS為3.4%。
2.8 CODV CD123 x CD3介導的THP-1細胞的細胞毒性作用
通過基於流式細胞術的細胞毒性測定分析CODV CD123×CD3的T細胞接合作用。
效應細胞是從健康供體全血中分離的原代T細胞。THP-1細胞用作表達CD123的靶細胞。通過Ficoll密度離心從EDTA處理的健康供體的200ml外周血中分離外周血單核細胞(PBMC)。將15ml Histopaque(Sigma-Aldrich)預載在50ml的Leucosep-管(Greiner bio-one)上。用autoMACS Rinsing緩衝液+1% BSA(Miltenyi Biotec)稀釋血液，幷加載到總共十個製備的管的膜上。將管以1000xg離心分離10分鐘。收集PBMC幷用autoMACS Rinsing緩衝液+1% BSA洗滌3次。最後，根據製造商的說明書，使用Pan T細胞分離套組(Miltenyi Biotec)，通過autoMACSpro技術將PBMC重懸於autoMACS運行緩衝液(Miltenyi Biotec)中以分離T淋巴細胞。使用人7色免疫分型套組(Miltenyi Biotec)通過MACSQuant流式細胞術分析分離的T細胞的純度。
靶細胞(即THP-1細胞株)在37下用1ml RPMI+GlutaMAX I+10%FCS(Invitrogen)中的1μM CFSE染色15分鐘。將2.5E4靶細胞接種在96孔U底懸浮培養板(Greiner bio-one)中，每孔50μl。
將分離的原代人T淋巴細胞重懸於RPMI+GlutaMAX I+10%FCS中，幷 以指定的效應物-靶標比例以50μl/孔添加至靶細胞(通常E：T=10：1)。
在1ml RPMI+GlutaMAX I+10%FCS(Invitrogen)或PBS中將Bispecific抗體樣結合蛋白以1：3的比例連續稀釋，幷將各自添加5μl至細胞，終濃度高達3000ng/ml。將測定在37℃，5% CO2中溫育20小時。
為了偵測死亡的靶細胞，將所有細胞用7-AAD染色。因此，在每個孔中加入稀釋於具有FBS的染色緩衝液(BD Pharmingen)中的5μg/ml 7-AAD，幷在4℃於黑暗中溫育30分鐘。分別使用MACSQuant(Miltenyi Biotec)或LSRII或Verse(兩者均為BD)流式細胞儀測量細胞。使用FlowJo軟件(Tree Star，Inc.)進行進一步的數據分析。讀出是CFSE和7-AAD雙陽性細胞的百分比。通過XLfit(演算法205)計算曲綫。
如表9所示，雙特異性抗體樣結合蛋白能夠在體外接合原代T細胞幷裂解THP-1靶細胞。在20小時共培養後，可以偵測死亡靶細胞的抗體濃度依賴性增加。對於這裏所示的抗體樣結合蛋白，計算範圍在0.8至1.2pM的EC 50值。
與CODV-Fab-TL1-RF相比，CODV-Fab-TL1-節x穴-RF或CODV-Fab-TL1-節-RFx穴中引入骨架突變不改變這些分子的功能參數，表明這些CODV修飾不會導致T細胞接合活性的任何喪失。
2.9 CD123xCD3 CODV抗體樣結合蛋白對存在(活性讀出)和不存在(安全性讀出)靶細胞情況下的T細胞活化的影響
通過流式細胞術偵測雙特異性抗體樣結合蛋白對作為活性或安全性讀出的T細胞活化狀態的影響，其基於偵測在存在(條件見2.8.)或不存在靶細胞情況下原代人T細胞表面活化標記物CD25和CD69的表達。將分離的原代人T淋巴細胞重懸於RPMI+GlutaMAX I(Gibco)+10%FCS(Invitrogen)中，2.5E5細胞以每孔50μl接種在96孔U-底懸浮培養板(Greiner bio-one)中。
僅測試T細胞，幷用50μlRPMI+GlutaMAX I+10%FCS填充孔，或者以每孔2.5E4細胞在50μlRPMI+GlutaMAX I中加入靶細胞(即THP-1細胞株)+10%FCS。
將雙特異性抗體樣結合蛋白以1：3或1：10連續稀釋於RPMI+GlutaMAX I+10%FCS或PBS中，幷以高達300000ng/ml的最終濃度每種加入5μl至細胞。將測定在37℃，5% CO2中溫育20小時。
溫育後，將細胞旋轉幷在4℃在100μl含有FBS(BD Pharmingen)的染色緩衝液中用如下標記的抗體染色15分鐘：CD4-PE，CD8-APC-Cy7，CD25-APC，CD69-PE-Cy7
如上所述染色Fluorescence Minus One(FMO)對照活化的T細胞，但在一個管中將CD25替換為同種型同種型(同種型APC-IG1k)，幷在第二管中將CD69替換為同種型(同種型PE-Cy7-IG1k)。
染色後將細胞洗滌兩次，用FBS重懸於150μl染色緩衝液中，用LSRII(BD)流式細胞儀測定10000個細胞。使用FlowJo軟件(Tree Star，Inc.)進行進一步的數據分析。讀出是CD4posCD25pos，CD4posCD69pos，CD8posCD25pos和CD8posCD69pos T細胞的百分比。門限根據FMO對照設置。
表10顯示T細胞活化導致靶細胞的存在(活性讀出)。靶細胞表達的EC 50值與細胞毒性測定中觀察到的EC50值非常相似。與CODV-Fab-TL1-RF相比，CODV-Fab-TL1-節-RFx穴或CODV-Fab-TL1-節x穴-RF中引入的骨架突變不改變該分子的功能參數，表明這些CODV-Fab修飾與目標方法相容。
表10：用THP-1靶細胞的T細胞活化(EC50)
表10和表11顯示了在高濃度(100nM，高於EC50 5log)的針對CD4+(表11)和CD8+(表12)T細胞的雙特異性的靶細胞的不存在(安全性讀出)和存在(活性讀出)情況下的T細胞活化結果(基於CD69表達)。在沒有靶細胞的情況下，只有少部分T細胞成為CD69陽性，分子之間或CD4+和CD8+ T細胞之間沒有主要差異。如表10所示，所有CODV在靶細胞存在下都誘導CD4+和CD8+ T細胞的活化。因此，在沒有靶細胞的情況下，CODV分子中引入的骨架突變不會引起關於T細胞活化的不期望的作用。
<110> 賽諾菲(SANOFI)
<120> 特異性結合至CD3和CD123的雙特異性抗體樣結合蛋白
<130> FR2016/016
<160> 85
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 207
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
<211> 198
<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400> 2
<210> 3
<211> 340
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(104)
<223> 人CD3 ε的胞外結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (105)..(340)
<223> 帶His標籤的FC-融合物
<400> 3
<210> 4
<211> 333
<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<220>
<221> Domain
<222> (1)..(95)
<223> 食蟹猴CD3 ε蛋白的胞外結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (96)..(333)
<223> Fc融合物
<400> 4
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的〞hz20G6〞抗CD3抗體的CDR1-H
<400> 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的〞hz20G6〞抗CD3抗體的CDR2-H
<400> 6
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的〞hz20G6〞抗CD3抗體的CDR3-H
<400> 7
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的〞hz20G6〞抗CD3抗體的CDR3-L
<400> 8
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的〞20G6〞抗CD3抗體的VH1d
<400> 9
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的〞20G6〞抗CD3抗體的VL1c
<400> 10
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的〞20G6〞抗CD3抗體的VL1c變體的CDR1-L
<400> 11
<210> 12
<211> 378
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 12
<210> 13
<211> 378
<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400> 13
<210> 14
<211> 519
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(284)
<223> 人CD123的胞外結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (285)..(519)
<223> 帶His標籤的Fc融合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (514)..(519)
<223> His標籤
<400> 14
<210> 15
<211> 525
<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(284)
<223> 食蟹猴CD123的胞外結構域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (285)..(525)
<223> 帶His標籤的Fc融合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (520)..(525)
<223> His標籤
<400> 15
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab〞hz20G6xhz7G3〞抗體樣結合蛋白的L1
<400> 16
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab〞hz20G6xhz7G3〞抗體樣結合蛋白的L2
<400> 17
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab〞hz20G6xhz7G3〞抗體樣結合蛋白的CL
<400> 18
<210> 19
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab〞hz20G6xhz7G3〞抗體樣結合蛋白的CH1
<400> 19
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 20
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 21
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 22
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 23
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 24
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 25
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 26
<210> 27
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 27
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 顯示接頭序列的氨基酸序列
<400> 28
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 29
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 30
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 31
<210> 32
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 32
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 33
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 34
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 35
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 36
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 37
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 38
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 39
<210> 40
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 40
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 41
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 42
<210> 43
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 43
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 44
<210> 45
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 45
<210> 46
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 46
<210> 47
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭序列的氨基酸序列
<400> 47
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的〞hz7G3〞抗體的CDR1-L
<400> 48
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的〞hz7G3〞抗體的CDR3-L
<400> 49
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的人源化的〞7G3〞抗體的CDR1-H
<400> 50
<210> 51
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的人源化的〞7G3〞抗體的CDR3-H
<400> 51
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的人源化的〞7G3〞抗體的VH變體
<400> 52
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的人源化的〞7G3〞抗體之-的CDR2-H
<400> 53
<210> 54
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的人源化的〞7G3〞抗體的VL變體
<400> 54
<210> 55
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-OL1〞hz20G6xhz7G3〞和CODV-Fab-OL1a〞hz20G6xhz7G3〞的多肽I
<400> 55
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接頭
<400> 56
<210> 57
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-TL1-RF〞hz20G6xhz7G3〞的根據式[IV]的多肽的氨基酸序列
<400> 57
<210> 58
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fc-TL1〞hz7G3xhz20G6〞抗體樣結合蛋白的Fc2
<400> 58
<210> 59
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-TL1-RF和CODV-Fab-TL1〞hz20G6xhz7G3〞的根據式[III]的多肽的氨基酸序列
<400> 59
<210> 60
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-TL1-RF和CODV-Fab-TL1〞hz20G6xhz7G3〞的式[III]的多肽的Fc區的氨基酸序列
<400> 60
<210> 61
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-OL1〞hz20G6xhz7G3〞的根據式[III]的多肽的氨基酸序列
<400> 61
<210> 62
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-OL1〞hz7G3xhz20G6〞抗體樣結合蛋白的Fc區
<400> 62
<210> 63
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-OL1〞hz7G3xhz20G6〞抗體樣結合蛋白的Fc段
<400> 63
<210> 64
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-OL1a〞hz7G3xhz20G6〞的Fc段
<400> 64
<210> 65
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-OL1a和無GS的CODV-Fab-OL1-節x穴-RF〞hz20G6xhz7G3〞的根據式[III]的多肽 的氨基酸序列
<400> 65
<210> 66
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-OL1a和CODV-Fab-OL1-節X穴節x穴-RFwoGS〞hz20G6xhz7G3〞的式[III]的多肽 的Fc域
<400> 66
<210> 67
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CODV-Fab-TL1-節-RFx穴,CODV-Fab-TL1-節x穴-RF,CODV-Fab-TL1,CODV-Fab-TL1-節x穴,無 GS(woGS)的CODV-Fab-OL1-節x穴-RF的根據式[III]的多肽的廣義的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (473)..(473)
<223> X1是Y或C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (478)..(478)
<223> X2是S或C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (490)..(490)
<223> X3是T,S或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (492)..(492)
<223> X4是A或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (531)..(531)
<223> X5是V或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (559)..(559)
<223> X6是H或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (560)..(560)
<223> X7是Y或F
<400> 67
<210> 68
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CODV-Fab-TL1-節-RFx穴,CODV-Fab-TL1-節x穴-RF,CODV-Fab-TL1,CODV-Fab-TL1-節x穴,無 GS(woGS)的CODV-Fab-OL1-節x穴-RF的根據式[III]的多肽的Fc域的廣義的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (134)..(134)
<223> X1是Y或C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (139)..(139)
<223> X2是S或C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (151)..(151)
<223> X3是T,S或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (153)..(153)
<223> X4是A或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (192)..(192)
<223> X5是V或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (220)..(220)
<223> X6是H或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (221)..(221)
<223> X7是Y或F
<400> 68
<210> 69
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的無GS(woGS)的CODV-Fab-OL1-節x穴-RF〞hz20G6xhz7G3〞的Fc段(Fc3)
<400> 69
<210> 70
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CODV-Fab-TL1-節-RFx穴,CODV-Fab-TL1-節x穴-RF,CODV-Fab-TL1,CODV-Fab-TL1-節x穴的式 [IV]的多肽的Fc域(Fc2)的廣義的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (129)..(129)
<223> X1是Y或C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (134)..(134)
<223> X2是S或C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (146)..(146)
<223> X3是T,S或W,
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (148)..(148)
<223> X4是A或L,
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (187)..(187)
<223> X5是V或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (215)..(215)
<223> X6是H或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (216)..(216)
<223> X7是Y或F,或
<400> 70
<210> 71
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的抗體樣結合蛋白CODV-Fab-TL1-節-RFx穴,CODV-Fab-TL1-節x穴-RF,CODV-Fab-TL1, CODV-Fab-TL1-節x穴的式[IV]的多肽的廣義的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (481)..(481)
<223> X1是Y或C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (486)..(486)
<223> X2是S或C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (498)..(498)
<223> X3是T,S或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (500)..(500)
<223> X4是A或L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (539)..(539)
<223> X5是V或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (567)..(567)
<223> X6是H或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (568)..(568)
<223> X7是Y或F
<400> 71
<210> 72
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的ODV-Fab-TL1-節-RFx穴〞hz20G6xhz7G3〞的式[IV]的多肽的氨基酸序列
<400> 72
<210> 73
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-TL1-節-RFx穴〞hz20G6xhz7G3〞的式[IV]的多肽的Fc2的氨基酸序列
<400> 73
<210> 74
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的ODV-Fab-TL1-節-RFx穴和CODV-Fab-TL1-節-x穴〞hz20G6xhz7G3〞的式[III]的多肽的氨基 酸序列
<400> 74
<210> 75
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-TL1-節-RFx穴和CODV-Fab-TL1-節-x穴〞hz20G6xhz7G3〞的式[III]的多肽的氨基 酸序列
<400> 75
<210> 76
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-TL1-節x穴-RF和CODV-Fab-TL1-節-x穴〞hz20G6xhz7G3〞的式[IV]的多肽的氨基 酸序列
<400> 76
<210> 77
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-TL1-節x穴-RF和CODV-Fab-TL1-節x穴〞hz20G6xhz7G3〞的式[IV]的多肽的Fc2 域的氨基酸序列
<400> 77
<210> 78
<211> 570
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-TL1-節x穴-RF〞hz20G6xhz7G3〞的式[III]的多肽的氨基酸序列
<400> 78
<210> 79
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-TL1-節x穴-RF〞hz20G6xhz7G3〞的式[III]的多肽的Fc的氨基酸序列
<400> 79
<210> 80
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-TL1〞hz20G6xhz7G3〞的式[IV]的多肽的氨基酸序列
<400> 80
<210> 81
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 所謂的CODV-Fab-TL1〞hz20G6xhz7G3〞的式[IV]的多肽的Fc2域的氨基酸序列
<400> 81
<210> 82
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART形式的單鏈CD123 x CD3栓特異性雙抗體的第一多肽鏈氨基酸序列
<400> 82
<210> 83
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DART形式的單鏈CD123 x CD3栓特異性雙抗體的第二多肽鏈氨基酸序列
<400> 83
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Strep-II標籤
<400> 84
<210> 85
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His標籤
<400> 85

Claims (15)

  1. 一種抗體樣結合蛋白，其特異性結合人CD3ε和人CD123，其包含形成2個抗原結合位點的2條多肽鏈，其中一條多肽鏈具有如式[IV]所示的結構：V D1-L 1-V D2-L 2-C L-L 5-F c2 [IV]且一條多肽鏈具有如式[III]所示的結構：V D3-L 3-V D4-L 4-C H1-F c [III]其中：a)所述式[IV]的多肽由如下組成：(i)氨基酸序列SEQ ID NO：71，其包含如下：˙序列SEQ ID NO：54的V D1，˙序列SEQ ID NO：56的L 1，˙序列SEQ ID NO：10的V D2，˙序列SEQ ID NO：56的L 2，˙序列SEQ ID NO：18的C L，˙L 5由0個氨基酸組成，且˙F c2由序列SEQ ID NO：70組成˙其中X 1是Y，X 2是S，X 3是T，X 4是L，X 5是Y且X 6是H且X 7是Y，或˙其中X 1是Y，X 2是C，X 3是W，X 4是L，X 5是Y且X 6是H且X 7是Y，或˙其中X 1是Y，X 2是C，X 3是W，X 4是L，X 5是Y且X 6是R且X 7是F，或(iii)與SEQ ID NO：71至少85%相同的序列，其中 ˙序列SEQ ID NO：54的V D1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR是不變的，且˙序列SEQ ID NO：10的V D2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR是不變的，且˙SEQ ID NO：71中的氨基酸X 1、X 2、X 3、X 4、X 5、X 6和X 7如上述a)(i)中定義；b)所述式[III]的多肽由如下組成：(i)氨基酸序列SEQ ID NO：67，其包含：˙序列SEQ ID NO：9的V D3，˙由0個氨基酸組成的L 3，˙序列SEQ ID NO：52的V D4，˙由0個氨基酸組成的L 4，˙序列SEQ ID NO：19的C H1，和˙由序列SEQ ID NO：68組成的F c，其中X 1是Y或C，X 2是S或C，X 3是T，S或W，X 4是A或L，X 5是V或Y，X 6是H或R，且X 7是Y或F，或(iii)與SEQ ID NO：67至少85%相同的序列，其中˙序列SEQ ID NO：52的V D4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR是不變的，且˙序列SEQ ID NO：9的V D3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR是不變的，且˙SEQ ID NO：67的氨基酸X 1、X 2、X 3、X 4、X 5、X 6和X 7如上述b)(i)中定義，且其中式[IV]的多肽和式[III]的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
  2. 請求項1的抗體樣結合蛋白，其中所述式[III]的多肽包含序列SEQ ID NO：68的F c，其中 X 1是Y，X 2是S，X 3是T，X 4是L，X 5是Y，或X 1是C，X 2是S，X 3是S，X 4是A，X 5是V，且X 6是H且X 7是Y，或X 6是R且X 7是F。
  3. 請求項1或2的抗體樣結合蛋白，其中a)所述式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：81的F c域(F c2)或與SEQ ID NO：81至少85%相同的序列，且所述式[III]的多肽包含SEQ ID NO：60的F c域或與SEQ ID NO：60至少85%相同的序列，或b)所述式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：73的F c域(F c2)或與SEQ ID NO：73至少85%相同的序列，且所述式[III]的多肽包含SEQ ID NO：75的F c域或與SEQ ID NO：75至少85%相同的序列，或c)所述式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：77的F c域(F c2)或與SEQ ID NO：77至少85%相同的序列，且所述式[III]的多肽包含SEQ ID NO：75的F c域或與SEQ ID NO：75至少85%相同的序列，或d)所述式[IV]的多肽包含SEQ ID NO：77的F c域(F c2)或與SEQ ID NO：77至少85%相同的序列，且所述式[III]的多肽包含SEQ ID NO：79的F c域或與SEQ ID NO：79至少85%相同的序列。
  4. 請求項1或2的抗體樣結合蛋白，其中a)一個式[IV]的多肽由如下氨基酸序列組成：SEQ ID NO：80，或與SEQ ID NO：80至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的V D1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，和序列SEQ ID NO：10的V D2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR及SEQ ID NO：80的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不變的；且一個式[III]的多肽由如下氨基酸序列組成：SEQ ID NO：59，或與SEQ ID NO：59至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的V D4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，和序列SEQ ID NO：9的V D3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR及SEQ ID NO：59的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不變的；或b)一個式[IV]的多肽由如下氨基酸序列組成：氨基酸序列SEQ ID NO：72，或與SEQ ID NO：72至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的V D1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，和序列SEQ ID NO：10的V D2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR及SEQ ID NO：72的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不變的；且一個式[III]的多肽由如下氨基酸序列組成：SEQ ID NO：74，或與SEQ ID NO：74至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的V D4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，和序列SEQ ID NO：9的V D3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR及SEQ ID NO：74的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不變的；或c)一個式[IV]的多肽由如下氨基酸序列組成：氨基酸序列SEQ ID NO：76，或 與SEQ ID NO：76至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的V D1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，和序列SEQ ID NO：10的V D2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR及SEQ ID NO：76的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不變的；且一個式[III]的多肽由如下氨基酸序列組成：SEQ ID NO：74，或與SEQ ID NO：74至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的V D4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，和序列SEQ ID NO：9的V D3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR及SEQ ID NO：74的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不變的；或d)一個式[IV]的多肽由如下氨基酸序列組成：氨基酸序列SEQ ID NO：76，或與SEQ ID NO：76至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：54的V D1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：10的V D2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR及SEQ ID NO：76的氨基酸位置481、486、498、500、539、567、568是不變的；且一個式[III]的多肽由如下氨基酸序列組成：SEQ ID NO：78，或與SEQ ID NO：78至少85%相同的序列，其中序列SEQ ID NO：52的V D4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR，以及序列SEQ ID NO：9的V D3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR及SEQ ID NO：78的氨基酸位置473、492、531、559、560、478、490是不變的。
  5. 請求項1或2的抗體樣結合蛋白，其包含：i)一個式[IV]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：80組成；和一個式[III]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：59組成，ii)一個式[IV]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：72組成，和一個式[III]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：74組成，iii)一個式[IV]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：76組成；和一個式[III]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：74組成，或vi)一個式[IV]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：76組成；和一個式[III]的多肽，其由氨基酸序列SEQ ID NO：78組成。
  6. 一種抗體樣結合蛋白，其特異性結合人CD3ε和人CD123，其包含形成2個抗原結合位點的3條多肽鏈，其中第一多肽具有如式[I]所示的結構：V D1-L 1-V D2-L 2-C L [I]且第二多肽鏈具有如式[III]所示的結構：V D3-L 3-V D4-L 4-C H1-F c [III]以及第三多肽F c3，其為免疫球蛋白鉸鏈區及免疫球蛋白的C H2，C H3免疫球蛋白重鏈恒定域；其中c)所述式[I]的多肽由如下組成：(iii)氨基酸序列SEQ ID NO：55，其包含˙序列SEQ ID NO：54的V D1，˙序列SEQ ID NO：56的L 1，˙序列SEQ ID NO：10的V D2，˙序列SEQ ID NO：56的L 2，˙序列SEQ ID NO：18的C L，或 (iv)與SEQ ID NO：55至少85%相同的序列，其中˙序列SEQ ID NO：54的V D1的序列SEQ ID NO：48，‘WAS’和SEQ ID NO：49的3個CDR是不變的，且˙序列SEQ ID NO：10的V D2的序列SEQ ID NO：11，‘KVS’和SEQ ID NO：8的3個CDR是不變的；d)所述式[III]的多肽由如下組成：(iii)氨基酸序列SEQ ID NO：67，其包含˙序列SEQ ID NO：9的V D3，˙由0個氨基酸組成的L 3，˙序列SEQ ID NO：52的V D4，˙由0個氨基酸組成的L 4，˙序列SEQ ID NO：19的C H1，和˙序列SEQ ID NO：68的F c，其中X 1是Y，X 2是C，X 3是W，X 4是L，X 5是Y，且X 6是H且X 7是Y，或X 6是R且X 7是F，或(iv)與SEQ ID NO：67至少85%相同的序列，其中˙序列SEQ ID NO：52的V D4的序列SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：53，和SEQ ID NO：51的3個CDR是不變的，且˙序列SEQ ID NO：9的V D3的序列SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：7的3個CDR是不變的，且˙氨基酸X 1、X 2、X 3、X 4、X 5、X 6和X 7如上述b)(i)中定義，且其中- 式[I]的多肽和式[III]的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對，- 式[III]的多肽與第三多肽經由其F c域形成異二聚體- 所述第三多肽F c3由SEQ ID NO：69組成或由SEQ ID NO：69至少85%相同的序列組成，其中SEQ ID NO：69的氨基酸位置129、146、148、187、 215、216是不變的。
  7. 請求項6的抗體樣結合蛋白，其包含- 一個式[I]的多肽，其由SEQ ID NO：55組成，- 一個式[III]的多肽，其由SEQ ID NO：65組成，和-F c3，其由SEQ ID NO：69組成。
  8. 一種醫藥組合物，其包含請求項1-7任一項的抗體樣結合蛋白及醫藥上可接受之載劑。
  9. 請求項1、2、6或7任一項的抗體樣結合蛋白，其用作藥物。
  10. 請求項8的醫藥組合物，其用作藥物。
  11. 請求項1-7任一項的抗體樣結合蛋白或請求項8的醫藥組合物在製備用於治療癌症的藥物中的用途。
  12. 請求項11的用途，其中所述癌症是血液學的癌症。
  13. 一種分離的核酸，其包含編碼請求項1-7任一項的抗體樣結合蛋白的序列。
  14. 一種宿主細胞，其通過請求項13所述的核酸轉化。
  15. 一種套組，其包含a)至少一種如請求項1-7任一項所定義的抗體樣結合蛋白，b)任選的包裝材料，和c)任選的標簽或包裝插頁，其含于所述包裝材料中，指示所述抗體樣結合蛋白對於治療癌症有效或用於治療癌症的用途。
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