TW201811827A - 抗ＴＧＦ－β１抗體及使用方法 - Google Patents

Abstract

發明人已勤奮地進行了許多研究，因此創造出抑制蛋白酶介導的TGF-beta 1的活化的抗TGF-beta 1抗體。已有報導，蛋白酶將潛伏性TGF-beta裂解，以釋放活性TGF-beta。然而，驚訝的是，發明人發現抗TGF-beta 1抗體抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化，但不會抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區的裂解，且也具有活體內抗纖維化的效果。

Description

抗TGF-β1抗體及使用方法

本發明係關於抗TGF-beta 1抗體及其使用方法。

轉形生長因子beta(transforming growth factor beta，TGF-beta(TGF-β))是細胞介質中TGF-beta超家族的成員，其由TGF-beta、活化素(activin)、抑制素(inhibin)、結節細胞(Nodal)、成骨蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、抗密拉氏荷爾蒙(anti-Mullerian hormone，AMH)和生長分化因子(growth and differentiation factor，GDF)組成。此超家族的成員為具有保守結構的二聚體蛋白質，且在活體外(in vitro)和在活體內(in vivo)具有多型性(pleiotropic)功能(非專利文獻1、2)。轉形生長因子beta參與許多細胞過程，其包含生長抑制、細胞遷移、入侵、上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、細胞外間質(extracellular matrix，ECM)再修飾以及免疫抑制(非專利文獻3)。然而，雖然TGF-beta一般受到動態地調控且參與維持組織恆定，但於疾病狀態中，包含癌症、纖維化(fibrosis)和發炎，TGF-beta時常長期地過度表現，且TGF-beta的過度產生，透過調節細胞生長、遷移或表現型，以促進疾病的發展。

在哺乳動物中，已鑒定出三種不同的TGF-beta同型異構物(isoform)(TGF-beta 1、TGF-beta 2和TGF-beta 3)，且在胺基酸層次上，具有70-82%的同源性(homology)(非專利文獻4)。三種TGF-beta同型異構物皆以同質二聚體(homodimer)(其活化型)，結合至第二型TGF-beta受體(TGF-beta receptor type 2，TGFR2)。接著，第二型TGF-beta受體吸引並活化第一型TGF-beta受體(TGFR1)，以活化受體的訊號傳遞(signaling)(非專利文獻5)。然而，根據組織的不同，這三種同型異構物的表現量也不同(非專利文獻6)，且它們的功能相異，如基因剔除小鼠的表現型所示(非專利文獻7-11)。

如同TGF-beta超家族的其它成員，TGF-beta合成為前驅蛋白質，其形成同質二聚體，並與其潛伏性相關胜肽(latency-associated peptide，LAP)及潛伏性TGF-beta結合蛋白(latent TGF-beta-binding protein，LTBP)交互作用，以形成較大的複合體，稱為大潛伏性複合體(large latent complex，LLC)。TGF-beta的基因編碼前原蛋白質(preproprotein)序列，其由訊號胜肽(signal peptide)、以原蛋白質轉化酶(proprotein convertase，PPC)裂解位為端點的原胜肽(propeptide)和成熟TGF-beta序列組成。弗林(Furin)水解PPC裂解位，產生分開的TGF-beta及衍生自原胜肽的同質二聚體。這兩個同質二聚體維持非共價結合且被分泌。此潛伏性複合體使TGF-beta處於非活性型，其無法結合至其受體(非專利文獻12、13)。TGF-beta的活化過程包含從ECM釋放LLC，接著進一步蛋白質裂解LAP，以釋放活性TGF-beta至其受體(非專利文獻3)。 潛伏性TGF-beta被廣泛的蛋白酶及血小板反應素1(thrombospondin 1，TSP-1)裂解以釋放活性TGF-beta，上述蛋白酶包含血纖維蛋白溶酶(plasmin，PLN)、血漿激肽釋放酶(plasma kallikrein，PLK)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2和MMP9(非專利文獻14)(非專利文獻15)。不希望被任何理論侷限，MMP2，還有MMP9，將潛伏性TGF-beta 1蛋白質裂解，並從潛伏型中釋放成熟TGF-beta 1。MMP2和MMP9皆合成為非活性原MMP(pro-MMP)。原MMP2被第一膜型基質金屬蛋白酶(membrane type 1 MMP，MT1-MMP/MMP14)和金屬蛋白酶2的組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP-2)的複合體活化。原基質金屬蛋白酶9的活化是透過涉及血纖維蛋白溶酶和基質溶素1(stromelysin 1)(亦即是MMP-3)的交互作用的蛋白酶梯瀑效應(cascade)。血纖維蛋白溶酶從其酶原(zymogen)產生活性MMP3。活性MMP3裂解來自92-kDa的原MMP9的原胜肽，產生具有酵素活性的82-kDa的酵素。MMP的裂解位未具體確定。然而，據報導，MMP3特異性裂解潛伏性TGF-beta的79號丙胺酸和80號白胺酸之間的位置，以活化TGF-beta(WO 2005/023870)。或者，經機械伸展(mechanical stretch)，整合素(integrin)可藉由結合至存在於LAP的精甘天冬胺酸基序(Arg-Gly-Asp motif，RGD motif)，活化TGF-beta，以誘導成熟TGF-beta從其潛伏性複合體釋放(非專利文獻16、17)。

活化之後，二聚體的TGF-beta配位體結合至第一型和第二型受體的胞外域，並誘使其緊密相鄰，使受體的胞內 絲胺酸/蘇胺酸激酶(serine/threonine kinase)域處於能促進磷酸化以及後續第一型受體的活化的構形。第一型受體的活化導致訊號藉由至少兩個看似獨立的路徑傳遞：SMAD依賴性標準路徑(SMAD-dependent canonical pathway)和SMAD非依賴性(SMAD-independent)或非標準(non-canonical)路徑。在SMAD依賴性路徑中，TGFR1(亦稱為ALK5)的活化導致SMAD蛋白的磷酸化。SMAD 2和SMAD 3為TGFR1的基質。一被受體磷酸化，SMAD和共同中介者(mediator)SMAD 4轉位至細胞核，在此其與其它轉錄因子交互作用，以調控轉錄反應(非專利文獻18)。在非標準路徑中，活化的TGF-beta受體複合體透過其它因子傳送訊號，例如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)受體相關因子4(tumor necrosis factor receptor-associated factor 4，TRAF4)、TRAF6、TGF-beta活化的激酶1(TGF-beta-activated kinase 1，TAK1，亦稱為MAP3K7)、p38有絲分裂劑活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)、RHO、磷脂肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)、AKT(亦稱為蛋白質激酶B(protein kinase B))、胞外訊號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、Jun胺基末端激酶(JUN N-terminal kinase，JNK)或細胞核因子kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-kappa B)。因此，對TGF-beta訊號傳遞的細胞反應源自於標準和非標準的訊號傳遞梯瀑效應的動態結合。

纖維化，或組成癒傷組織(scar tissue)的ECM分子的累積，是慢性組織傷害的常見特徵。肺纖維化(pulmonary fibrosis)、腎纖維化(renal fibrosis)、肝硬化(hepatic cirrhosis)屬於較常見的纖維化疾病，這些總合起來意味著許多尚未滿足的臨床需求。TGF-beta強烈地促進間質細胞產生胞外基質，同時抑制表皮細胞的生長，這導致硬化疾病發生。在基因轉殖小鼠的肝中，過度表現活性TGF-beta 1足以誘發許多器官的纖維化疾病(非專利文獻19)。另一方面，TGF-beta也在維持我們的健康上扮演重要角色。例如，TGF-beta抑制肺臟產生過多蛋白酶，且預防肺組織的破壞，其導致肺氣腫(emphysema)。此外，剔除TGF-beta 1的小鼠顯示產前死亡(交配後10.5天，約50%)，或其子代出生後不久就死亡，且大規模的發炎病變(inflammatory lesion)出現於許多器官中，包含肺((血管炎vasculitis)、圍管現象(perivascular cuffing)、間質性肺炎(interstitial pneumonia))和心臟(心內膜炎(endocarditis)和心肌炎(myocarditis))，這顯示TGF-beta 1在維持免疫恆定中扮演重要角色(非專利文獻7)。

使用針對TGF-beta的中和抗體和動物模型的研究結果顯示，可藉由抑制TGF-beta的作用，預防或治癒硬化疾病。由於TGF-beta作為前驅蛋白產生，已有許多預防潛伏型活化的方法被報導。預防潛伏型活化的另一方法為使用抑制物或抗體，其結合至潛伏性TGF-beta，以阻擋蛋白酶進行裂解，例如血漿激肽釋放酶和血纖維蛋白溶酶。許多使用此抑制TGF-beta活化的方法的抗體被報導為可預防或治療肝纖維化/硬化(專利文獻1)。

【引用列表】 【專利文獻】

【專利文獻1】WO2011102483

【非專利文獻1】McCartney-Francis, N. L.等人Int. Rev. Immunol. 16, 553-580 (1998)

【非專利文獻2】Massague, J. Annu. Rev. Biochem. 67, 753-791 (1998)

【非專利文獻3】Derynck, R. & Miyazono, K. Cold Spring Harbor Press (2008)

【非專利文獻4】Yu, L.等人Kidney Int. 64, 844-856 (2003).

【非專利文獻5】Xu, P., Liu, J. & Derynck, R.等人FEBS Lett. 586, 1871-1884 (2012)

【非專利文獻6】Millan, F. A.等人Development 111, 131-143 (1991)

【非專利文獻7】Kulkarni, A. B.等人Proc. Natl Acad. Sci. USA 90, 770-774 (1993)

【非專利文獻8】Shull, M. M.等人Nature 359, 693-699 (1992)

【非專利文獻9】Dickson, M. C.等人Development 121, 1845-1854 (1995)

【非專利文獻10】Sanford, L. P.等人Development 124, 2659-2670 (1997)

【非專利文獻11】Proetzel, G.等人Nature Genet. 11, 409-414 (1995)

【非專利文獻12】Dubois, C. M.等人J. Biol. Chem. 270, 10618-10624 (1995)

【非專利文獻13】Nunes, I.等人J. Am. Optom. Assoc. 69, 643-648 (1998)

【非專利文獻14】Annes, J.等人J. Cell Sci. 116, 217-224 (2003)

【非專利文獻15】Schultz-Cherry, S.等人J. Biol. Chem. 269, 26775-26782 (1994)

【非專利文獻16】Munger, J. S.等人Cell 96, 319-328 (1999)

【非專利文獻17】Shi, M.等人Nature 474, 343-349 (2011).

【非專利文獻18】Shi, Y. & Massague等人Cell 113, 685-700 (2003)

【非專利文獻19】Sanderson, N.等人Proc. Natl Acad. Sci.USA 92, 2572-2576 (1995)

本發明的目的之一為提供抗TGF-beta 1抗體，其抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化，且具有活體內的抗纖維化功效。

如前文所述，本發明人已辛勤地進行許多研究，且因此，創造出抗TGF-beta 1抗體，其抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化。已有報導透過蛋白酶，將潛伏性 TGF-beta裂解，以釋放活性TGF-beta。然而，令人驚訝的是，本發明人發現，抗TGF-beta 1抗體抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化，而不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區的裂解，且也具有活體內的抗纖維化功效。

本發明提供：

[1]一種抗TGF-beta 1抗體，其結合至潛伏性TGF-beta 1，其中抗體抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化，而不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區的裂解。

[2]一種抗TGF-beta 1抗體，其結合至潛伏性TGF-beta 1，其中抗體抑制蛋白酶介導的成熟TGF-beta 1自潛伏性TGF-beta 1的釋放，而不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區的裂解。

[3]如[1]或[2]所述之抗TGF-beta 1抗體，其中抗體結合至潛伏性TGF-beta 1的LAP區。

[4]如[1]至[3]中任一所述之抗TGF-beta 1抗體，其中蛋白酶係選自由血纖維蛋白溶酶(PLN)、血漿激肽釋放酶(PLK)、基質金屬蛋白酶2(MMP2)和基質金屬蛋白酶9(MMP9)所組成的群組。

[5]如[1]至[4]中任一所述之抗TGF-beta 1抗體，其中抗體不抑制整合素介導的潛伏性TGF-beta 1的活化。

[6]如[1]至[5]中任一所述之抗TGF-beta 1抗體，其中抗體不結合至成熟TGF-beta 1。

[6-2]如[1]至[6]中任一所述之抗TGF-beta 1抗體，其中抗體結合至細胞表面的潛伏性抗TGF-beta 1。

[7]一種抗TGF-beta 1抗體，其與TBS139或TBS182競爭結合至小鼠TGF-beta 1。

[8]一種抗TGF-beta 1抗體，其結合至小鼠TGF-beta 1上的抗原決定基，且抗原決定基被TBS139或TBS182結合。

[9]一種抗TGF-beta 1抗體，其結合至人類TGF-beta 1上的抗原決定基，其中抗原決定基對應小鼠TGF-beta 1上與TBS139或TBS182結合的抗原決定基。

[9-2]一種抗TGF-beta 1抗體，其與TBS1277、TBA1300或TBA1314競爭結合至人類TGF-beta 1。

[9-3]一種抗TGF-beta 1抗體，其結合至人類TGF-beta 1上的抗原決定基，且人類TGF-beta 1被TBS1277、TBA1300或TBA1314結合。

[10]如[1]至[9-3]中任一所述之抗TGF-beta 1抗體，其中抗體為人類、人源化或嵌合抗體。

本發明亦提供：

[11]一種醫藥組合物，包括如[1]至[10]中任一所述之抗TGF-beta 1抗體以及醫藥上可接受的載體。

[12]一種抗TGF-beta 1抗體的篩選方法，包含：(a)將生物樣品與測試抗體接觸，生物樣品包含潛伏性TGF-beta 1以及蛋白酶；(b)測量(i)未裂解的潛伏性TGF-beta 1的量和(ii)成熟TGF-beta 1的量；以及(c)相較於測試抗體不存在的情況下，若未裂解的潛伏性TGF-beta 1的量未顯著增加且成熟TGF-beta 1的量減少，選擇 抑制蛋白酶介導的成熟TGF-beta 1自潛伏性TGF-beta 1釋放而不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區裂解的測試抗體。

[13]一種抗TGF-beta 1抗體的生產方法，包括：

(a)將生物樣品與測試抗體接觸，生物樣品包含潛伏性TGF-beta 1以及蛋白酶；

(b)測量(i)未裂解的潛伏性TGF-beta 1的量和(ii)成熟TGF-beta 1的量；

(c)相較於測試抗體不存在的情況下，若未裂解的潛伏性TGF-beta 1的量未顯著增加且成熟TGF-beta 1的量減少，選擇抑制蛋白酶介導的成熟TGF-beta 1自潛伏性TGF-beta 1釋放而不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區裂解的測試抗體。

(d)獲得於步驟(c)中選擇的該抗TGF-beta 1抗體的胺基酸序列資訊；以及

(e)將編碼抗TGF-beta 1抗體的基因引入宿主細胞。

[14]一種具有纖維化的受試者的治療方法，包含對受試者投予有效量的如[1]至[10]中任一所述之抗TGF-beta 1抗體。

[15]一種在生物樣品中，抑制成熟TGF-beta 1從潛伏性TGF-beta 1釋放，卻不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區的裂解的方法，包含在容許抗體結合至潛伏性TGF-beta 1的情況下，將包含TGF-beta 1的生物樣品與[1]至[10]中任一所述之抗體接觸。

[16]一種潛伏性TGF-beta 1的存在的偵測方法，包含： (a)在容許抗體結合至潛伏性TGF-beta 1的情況下，將生物樣品與如[1]至[10]中任一所述之抗體接觸；以及(b)偵測抗體和潛伏性TGF-beta 1之間是否形成複合物。

本發明還提供：

[17]一種抗TGF-beta 1抗體，其結合至潛伏性TGF-beta 1，其中抗體穩定潛伏性TGF-beta 1的LAP區的結構，而不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區的裂解。

[18]一種抗TGF-beta 1抗體，其結合至潛伏性TGF-beta 1的LAP區，其中抗體穩定潛伏性TGF-beta 1中，已被蛋白酶裂解之LAP區的結構。

[19]一種抗TGF-beta 1抗體，其結合至潛伏性TGF-beta 1的LAP區，其中抗體(a)抑制蛋白酶介導的成熟TGF-beta 1從潛伏性TGF-beta 1的釋放；以及(b)允許蛋白酶將LAP區裂解，當抗TGF-beta 1抗體結合至潛伏性TGF-beta 1的LAP區時。

[20]一種抗TGF-beta 1抗體的篩選方法，包含：(a)將生物樣品與測試抗體接觸，生物樣品包含潛伏性TGF-beta 1以及蛋白酶；(b)測量(i)潛伏性TGF-beta 1的裂解產物的量和(ii)成熟TGF-beta 1的活性程度；以及(c)相較於測試抗體不存在的情況下，若裂解的產物量未顯著增加且成熟TGF-beta 1的活性程度降低，選擇抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化，而不抑制蛋白酶介導的潛伏 性TGF-beta 1的LAP區裂解的測試抗體。

[21]如[12]、[13]、[15]和[20]任一項所述之方法，其中蛋白酶係選自由PLN、PLK、MMP2和MMP9組成的群組。

[第1圖]

第1圖顯示對(A)PLK和(B)PLN介導的潛伏性TGF-beta 1的活化之抗體活性的結果。

[第2圖]

第2圖顯示對潛伏性TGF-beta 1的自發性活化之抗體活性的結果。

[第3圖]

第3圖顯示對血纖維蛋白溶酶介導的潛伏性TGF-beta 1的裂解之抗體活性的結果。被血纖維蛋白溶酶裂解的潛伏性TGF-beta 1只被TBA865和TBA873抑制，但不被TBS139和TBS182抑制。Cam代表卡莫司他(camostat)，其為蛋白酶抑制劑，且IC17代表抗鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)抗體(IC17)，其作為負控制抗體。

[第4圖]

第4圖顯示於小鼠周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中，對潛伏性TGF-beta 1的活化之抗體活性的結果。IC17代表抗KLH抗體(IC17)，其作為負控制抗體，且GC代表抗成熟TGF-beta 1抗體GC1008。

[第5圖]

第5圖顯示以串聯阻斷分析(tandem blocking assay)進行的Biacore結果。在時間為0時，注射飽和結合濃度的(A)TBS139或(B)TBS182。接著，在第300秒時，於潛伏性TGF-beta 1感測表面上，注射競爭抗體(TBS139、TBS182、TBA865或TBA873)。

[第6圖]

第6圖顯示第一型膠原蛋白alpha 1的mRNA在肝臟的表現量。在以缺乏膽鹼、限定L胺基酸和高脂的飲食(choline-deficient,L-amino acid-defined,high-fat diet，CDAHFD)誘發的非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)/肝纖維化的小鼠模型中，評估單株抗體。CE-2為市售的標準飲食。IC17代表抗KLH抗體(IC17)，其作為負控制組。GC1008代表抗成熟TGF-beta抗體(GC1008)，其作為正控制組。

[第7圖]

第7圖顯示第一型膠原蛋白alpha 1的mRNA在腎臟的表現量。在以單側輸尿管阻塞(Unilateral Ureteral Obstruction，UUO)誘發腎臟纖維化的小鼠模型中，評估單株抗體。假手術(sham-operated)組作為無疾病的控制組。IC17代表抗KLH抗體(IC17)，其作為負控制。GC1008代表抗成熟TGF-beta抗體(GC1008)，其作為正控制。

[第8圖]

第8圖顯示在用抗潛伏性TGF-beta 1之單株抗體(A)TBS139和(B)TBS182處理後，腎臟的羥脯胺酸 (hydroxyproline)含量。在以單側輸尿管阻塞誘發腎臟纖維化的小鼠模型中，評估抗體。假手術組作為無疾病的控制組。IC17代表抗KLH抗體(IC17)，其作為負控制組。GC1008代表抗成熟TGF-beta抗體(GC1008)，其作為正控制組。

[第9圖]

第9圖顯示在用抗潛伏性TGF-beta 1之單株抗體(A)TBS139和(B)TBS182處理後，肺臟的serpine 1的mRNA表現量。在以博來黴素(BLM)誘發肺纖維化的小鼠模型中，評估抗體。從氣管內灌入BLM和食鹽水。投予食鹽水的組作為無疾病控制組。IC17代表抗KLH抗體(IC17)，其作為負控制組。GC1008代表抗成熟TGF-beta抗體(GC1008)，其作為正控制組。

[第10圖]

第10圖顯示在用抗潛伏性TGF-beta 1之單株抗體(A)TBS139和(B)TBS182處理後，肺臟的單核球化學趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1，亦稱為CCL2)的mRNA表現量。在以BLM誘發肺纖維化的小鼠模型中，評估單株抗體。從氣管內灌入BLM和食鹽水。投予食鹽水的組作為無疾病控制組。IC17代表抗KLH抗體(IC17)，其作為負控制。GC1008代表抗成熟TGF-beta抗體(GC1008)，其作為正控制。

[第11圖]

第11圖顯示對蛋白酶介導的小鼠潛伏性TGF-beta 1的活化之抗體活性的結果。小鼠MMP2和MMP9介導的小鼠 TGF-beta 1的活化被抗潛伏性TGF-beta 1抗體抑制。

[第12圖]

第12圖顯示對蛋白酶介導的人類潛伏性TGF-beta 1的活化之抗體活性的結果。血漿激肽釋放酶原(PLK)和血纖維蛋白溶酶(PLN)介導的人類潛伏性TGF-beta 1的活化被抗潛伏性TGF-beta 1抗體抑制。SLC代表潛伏性TGF-beta 1。

[第13圖]

第13圖顯示對血纖維蛋白溶酶介導的人類潛伏性TGF-beta 1的裂解之抗體活性的結果。被血纖維蛋白溶酶裂解的人類潛伏性TGF-beta 1只被TBA873抑制，但不被TBA1300、TBA1314和TBA1277抑制。Cam代表卡莫司他，其為蛋白酶抑制劑，且IC17代表抗KLH抗體，其作為負控制。

[第14圖]

第14圖顯示抗體結合至細胞表面的潛伏性TGF-beta 1的結果，藉由螢光流式細胞分選儀(fluorescence-activated cell sorter，FACS)，其使用Ba/F3細胞或Free Style 293-F細胞。A)TBS139和TBS182結合至細胞表面的小鼠潛伏性TGF-beta 1。然而，TBA865和TBA873不會與其結合。B)TBA1277、TBA1300和TBA1314結合至細胞表面的人類潛伏性TGF-beta 1。然而，TBA865和TBA873不會與其結合。IC17代表抗KLH抗體，其作為負控制。

[第15圖]

第15A圖顯示對MMP2介導的小鼠潛伏性TGF-beta 1的裂解之抗體活性的結果。被MMP2裂解的小鼠潛伏性TGF-beta 1只被TBS139和TBS182抑制，但不被TBA865和TBA873抑制。GM代表GM6001，其為MMP的抑制劑。IC17代表抗KLH抗體，其作為負控制。第15B圖顯示對MMP9介導的小鼠潛伏性TGF-beta 1的裂解之抗體活性的結果。被MMP9裂解的小鼠潛伏性TGF-beta 1只被TBS139和TBS182抑制，但不被TBA865和TBA873抑制。GM代表GM6001，其為MMP的抑制劑。IC17代表抗KLH抗體，其作為負控制。

[第16圖]

第16圖顯示對蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化之抗體活性的結果。小鼠MMP2和MMP9介導的人類潛伏性TGF-beta 1的活化被抗潛伏性TGF-beta 1之抗體抑制(TBA865、TBA873、TBA1300和TBA1277)。GM6001為MMP的抑制劑。IC17代表抗KLH抗體，其作為負控制。在此圖示中，長條狀下方的「-」代表無添加抗體。

I.定義

用於本文目的之“受體人類框架”是包含衍生自下文定義的人類免疫球蛋白框架或人類共有框架的輕鏈可變域(VL)框架或重鏈可變域(VH)框架的胺基酸序列之框架。“衍生自”人類免疫球蛋白框架或人類共有框架的受體人類框架可包括其相同的胺基酸序列，或者它可包含胺基酸序列改變。在一些實施例中，胺基酸改變的數目是10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少、或2個或更少。在一些實施例中，VL受體人類框 架在序列上與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列相同。

“親和性”指分子(例如，抗體)的單一結合部位與其結合配偶體(例如，抗原)之間非共價相互作用的總計強度。除非另有說明，在本文所使用的“結合親和性”指內在的結合親和性，其反映結合對(例如，抗體及抗原)的成員之間的1：1相互作用。分子X對其配偶體Y的親和性一般可藉由解離常數(dissociation constant,Kd)來表示。親和性可藉由本領域公知的方法來測量，包含本文中描述的那些。用於測量結合親和性之具體說明及示例性的實施例將於下文中描述。

“親和性成熟”抗體指與不具有這類改變的親本抗體(parent antibody)相比，在一個或多個高變異區域(hypervariable region,HVR)中具有一個或多個改變的抗體，這類改變導致抗體對抗原的親和性的改善。

術語“抗TGF-beta 1抗體”及“結合至TGF-beta 1的抗體”指一抗體，其能夠以足夠的親和性結合TGF-beta 1使得抗體可以在標靶TGF-beta 1中用作為診斷及/或治療劑。在一實施例中，“結合至TGF-beta 1的抗體”為特異性結合至TGF-beta 1的抗體。在一實施例中，例如藉由放射免疫分析(RIA)測量，抗TGF-beta 1抗體與不相關的非TGF-beta 1蛋白結合的程度小於該抗體與TGF-beta 1的結合的約10%。在特定實施例中，結合至TGF-beta 1的抗體具有1micro M或更小、100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、0.1nM或更小、0.01nM或更小、或0.001nM或更小(例如10^-8M或更小、例 如由10^-8M至10^-13M、例如由10^-9M至10^-13M)之解離常數(Kd)。在特定實施例中，抗TGF-beta 1抗體結合至TGF-beta 1的抗原決定基，其與來自不同物種的TGF-beta 1之間為保守的(conserved)。

術語“抗體”在本文中以最廣泛的含義使用並涵蓋多種抗體結構，包含但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要它們展現所希望的抗原結合活性。術語“抗體”亦包含任何抗原結合分子，其包含免疫球蛋白(immunoglobulin)的可變異重鏈(variable heavy chain)和/或可變異輕鏈(variable light chain)結構。

“抗體片段”指除完整抗體以外之包括完整抗體的部分的分子，其結合該完整抗體所結合的抗原。抗體片段的實例包含但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂；雙抗體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv)；以及從抗體片段形成之多特異性抗體。

“結合相同抗原決定基的抗體”作為參考抗體是指在競爭分析(competition assay)中，阻斷參考抗體與其抗原的結合達到50%或更多之抗體，及相反地，參考抗體在競爭分析中，阻斷抗體與其抗原的結合達到50%或更多。本文提供示例性競爭分析。

術語“嵌合(chimeric)”抗體指一抗體其中部分的重鏈及/或輕鏈來自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分則來自不同的來源或物種。

抗體的“種類(class)”指其重鏈所具有的恆定域 (constant domain)或恆定區(constant region)的類型。存在五個主要種類的抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，這些種類中的數種可進一步劃分為亞型(subgroup)(同型(isotype))，例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂。對應於不同種類的免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為alpha、delta、epsilon、gamma及mu。

本文所使用的術語“細胞毒劑(cytotoxic agent)”指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒劑包含但不限於放射性同位素(例如，²¹¹At、¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi、³²P、²¹²Pb以及Lu的放射性同位素)；化療劑或藥物(例如，甲氨喋呤、阿黴素(adriamicin)、長春花屬生物鹼(長春新生物鹼(vincristine)、長春花生物鹼(vinblastine)、依妥普賽(etoposide))、艾黴素(doxorubicin)、氮芥苯丙胺酸(melphalan)、絲裂黴素C、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，例如核溶解酶；抗生素；毒素，例如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，包含其片段及/或變異體；及下文揭露的多種抗腫瘤或抗癌劑。

“效應物功能”指可歸因於抗體的Fc區域的那些生物活性，其隨抗體同型(isotype)而不同。抗體效應物功能的例子包含：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity,CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞調節細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)的負調控； 及B細胞活化。

試劑，例如醫藥配方，的“有效量”指在劑量及所需的時間內，可有效達成希望的治療或預防結果的量。

本文的術語“Fc區域”是用來定義免疫球蛋白重鏈的C末端區域，其包含至少一部分的恆定區。此術語包含自然序列Fc區域和變異體Fc區域。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區域自Cys226或自Pro230延伸至重鏈的羧基末端。然而，Fc區域的C末端賴胺酸(Lys447)或甘胺酸-賴胺酸胺酸(殘基446-447)可存在或不存在。除非本文另有說明，Fc區域或恆定區中的胺基酸殘基的編號是按照EU編號系統，亦稱為EU指數，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。

“框架”或“FR”指高變異區(HVR)殘基以外的可變域殘基。可變域的FR一般由四個FR域所組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR和FR序列一般按以下順序出現在VH(或VL)中：FR1-H1(LI)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

術語“全長抗體”、“完整抗體”及“全抗體”在本文中可互換使用，指具有實質上(substantially)相似於自然抗體結構的結構或具有包含本文定義之Fc區域的重鏈的抗體。

術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和"宿主細胞培養物"可互換使用，指已將外源核酸引入其中的細胞，包含這類細胞的子代。宿主細胞包含“轉化體”及“轉化細胞”，其包含最初轉化的細胞及從其衍生的子代，並不考慮傳代數。 子代的核酸含量可以不與親本細胞完全相同，而可包含突變。本文包含具有與在最初轉化的細胞中篩選或選擇之相同功能或生物活性之突變體後代。

“人類抗體”是具有對應於由人類或人類細胞產生的抗體或衍生自非人類來源的胺基酸序列者，上述非人類來源的胺基酸序列利用人類抗體庫或其它人類抗體編碼序列。人類抗體的此定義具體排除了包括非人類抗原結合殘基的人源化抗體。

“人類共有框架”是代表人類免疫球蛋白VL或VH框架序列的選擇中最常出現之胺基酸殘基的框架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列的選擇來自可變域序列的亞型。通常，序列的亞型是Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),vols.1-3中的亞型。在一實施例中，對於VL，亞型是如Kabat等人，supra中的亞型kappa I。在一實施例中，對於VH，亞型是如Kabat等人，supra中的亞型III。

“人源化(humanized)”抗體指包括來自非人類HVR的胺基酸殘基以及來自人類FR的胺基酸殘基的嵌合抗體。在特定實施例中，人源化抗體將包括實質上全部之至少一個且通常為兩個的可變域，其中全部或實質上全部之HVR(例如，CDRs)對應於非人類抗體的那些，而全部或實質上全部之FR對應於人類抗體的那些。人源化抗體可選擇地包括源自人類抗體的抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)的" 人源化形式"指已進行人源化之抗體。

本文所用的術語“高變異區”或“HVR”指抗體可變域在序列上高變異(“互補決定區”或“CDR”)、及/或形成結構上定義的環(“高變異環”)、及/或包含抗原接觸殘基(“抗原接觸”)的每一區域。一般而言，抗體包括六個HVR：三個在VH中(H1、H2、H3)，三個在VL中(L1、L2、L3)。本文中示例性HVR包含：(a)出現於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)以及96-101(H3)(Chothia，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))的高變異環；(b)出現於胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)以及95-102(H3)(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))的CDR；(c)出現於胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)以及93-101(H3)(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))的抗原接觸；以及(d)(a)、(b)及/或(c)之組合，包含HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)以及94-102(H3)。除非另有說明，本文中HVR殘基及在可變域中的其它殘基(例如，FR殘基)依照Kabat等人，supra編號。

“免疫偶聯物”是與一或多種異源(heterogeneous)分子(包含但不限於細胞毒劑)偶聯的抗體。

“個體(individual)”或“對象(subject)”是哺乳 動物。哺乳動物包含但不限於飼養的動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類(例如人類及非人類靈長類，如猴子)、兔及齧齒類(例如小鼠和大鼠)。在特定實施例中，個體或對象為人類。

“分離的”抗體是已從其自然環境的成分分離的抗體。在一些實施例中，抗體被純化至大於95%或99%的純度，其藉由例如，電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或反相HPLC)方法進行測定。評估抗體純度的方法的綜述可參照，例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。

“分離的”核酸指已從其自然環境的成分分離的核酸分子。分離的核酸包括包含在通常含有該核酸分子的細胞中的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或在不同於其自然染色體位置的染色體位置上。

“編碼抗TGF-beta 1抗體的分離的核酸”指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)的一或多個核酸分子，包含於單一載體或分開的載體中的此種核酸分子，以及存在於宿主細胞中的一或多個位置的此種核酸分子。

本文所用的術語“單株抗體”指獲得自實質上同源的(homogeneous)抗體族群的抗體，即，組成相同的族群及/或結合至相同抗原決定基的單獨抗體，除了例如：包含自然存在的突變或在產生單株抗體製備期間出現之可能的變異體抗體(這類變異體通常以較小量存在)以外。不同於通常包含針對不同決定位(抗原決定基)的不同抗體之多株抗體的製備，單株抗體製備的每一單株抗體是針對抗原上的單一決定位。因此， 修飾詞“單株”指獲取自實質上同源的抗體族群的抗體特徵，而不解釋為需要藉由任何具體方法以生產抗體。例如，將根據本發明被使用的單株抗體可藉由多種技術加以製備，其包含但不限於融合瘤技術、重組DNA法、噬菌體展示法以及利用含有全部或部分人類免疫球蛋白基因座(loci)的轉殖基因動物的方法，這類方法及其它用以製造單株抗體的示例性方法將於文中描述。

“裸抗體”指未與異源部分(例如細胞毒性部分)或放射標記偶聯的抗體。裸抗體可存在於醫藥配方中。

“自然抗體”指具有不同結構之自然存在的免疫球蛋白分子。例如，自然IgG抗體為約150,000道爾頓(dalton)的異源四聚體醣蛋白，由雙硫鍵結的兩個相同輕鏈及兩個相同重鏈所組成。從N至C末端，每一重鏈具有可變區(VH)，也稱為可變重鏈域或重鏈可變域，隨後是三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。相似地，從N至C末端，每一輕鏈具有可變區(VL)，也稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，隨後是恆定輕鏈(CL)域。根據其恆定域的胺基酸序列，抗體的輕鏈可歸類於兩種類型之一，稱為kappa及lambda。

術語“藥品仿單(package insert)”用來指通常包含在治療產品的商業包裝中的說明，其包含關於適應症、用法、劑量、施用、結合療法、禁忌症的資訊及/或有關這類治療產品的使用之警告。

相對於參考多肽序列的“百分比(%)胺基酸序列相同性”定義為在比對序列及在必要時引入缺口(gap)以達到 最大的百分比序列相同性之後，且不將任何保守取代視為序列相同性的部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比。可以以本技術領域之內的各種方式以達到以測定百分比胺基酸序列相同性為目的之比對，例如，使用公開可取得的電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或GENETYX(註冊商標)(Genetyx Co.,Ltd.)軟體。本技術領域具有通常知識者可以決定用於比對序列的適當參數，包含在所比較的序列的全長內達到最大比對所需的任一演算法。

ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.編寫，且原始程式碼已隨用戶文件提交美國版權辦公室，Washington D.C.,20559，它在美國版權辦公室註冊在美國版權註冊號TXU510087之下。ALIGN-2程式可公開取得於Genentech,Inc.,South San Francisco,California，或者可從原始程式碼編譯。ALIGN-2程式應編譯用在UNIX作業系統上，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且不變動。在利用ALIGN-2以進行胺基酸序列比較的情況下，給定的胺基酸序列A比上、以及或相對給定的胺基酸序列B的%胺基酸序列相同性(或者其可表達為給定的胺基酸序列A，其具有或包括特定%胺基酸序列相同性比上、以及或相對給定的胺基酸序列B)以下列計算：100乘以分數X/Y，其中X是在該程式的A及B比對中藉由序列比對程式ALIGN-2評分為相同匹配(match)的胺基酸殘基數目，以及其 中Y是B中的胺基酸殘基的總數。應理解的是，在胺基酸序列A的長度不等於胺基酸序列B的長度時，A比上B的%胺基酸序列相同性將不等於B比上A的%胺基酸序列相同性。除非明確地另有說明，本文中使用的所有%胺基酸序列相同性值均是如前面段落中所述利用ALIGN-2電腦程式所得。

術語“醫藥配方”指一製備物，其處於允許包含在其中的活性成分的生物活性有效的此種形式，且其不包含對將要施用該配方的對象具有不可接受的毒性之附加成分。

“醫藥上可接受之載體”指醫藥配方中除了活性成分以外的一成分，其對對象無毒性。醫藥上可接受之載體包含但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

本文所用的術語“TGF-beta 1”指來自任一脊椎動物源的任一自然TGF-beta 1，包含哺乳動物，例如靈長類(例如，人類)以及齧齒類(例如，小鼠及大鼠)，除非另有說明。此術語涵蓋“全長”未經處理的TGF-beta 1以及由細胞內加工產生的任一形式之TGF-beta 1”。此術語亦涵蓋TGF-beta 1之自然存在的變異體，例如，剪接(splice)變異體或等位基因(allelic)變異體。示例性人類TGF-beta 1前原蛋白(preproprotein)的胺基酸序列如序列辨識號：1(NCBI RefSeq：NP_000651.3)所示，且編碼示例性人類TGF-beta 1的核酸序列如序列辨識號：2(NCBI RefSeq：NM_000660.6)所示。示例性小鼠TGF-beta 1前原蛋白的胺基酸序列如序列辨識號：3(NCBI RefSeq：NP_035707.1)所示，且編碼示例性小鼠TGF-beta 1的核酸序列如序列辨識號：4(NCBI RefSeq： NM_011577.2)所示。術語“TGF-beta 1”包含潛伏性TGF-beta 1和成熟TGF-beta 1。

本文所用的術語“潛伏性TGF-beta 1”指的是形成潛伏性TGF-beta 1複合體(大潛伏性複合體或小潛伏性複合體)和/或無法結合至其受體的任何TGF-beta 1。轉形生長因子beta 1(TGF-beta 1)為TGF-beta的成員之一，其為TGF-beta超家族的成員之一。如其他TGF-beta超家族的成員，TGF-beta合成為前驅蛋白，其形成同質二聚體，同質二聚體與潛伏性相關胜肽(LAP)和潛伏性TGF-beta結合蛋白(LTBP)交互作用，形成更大的複合體，稱為大潛伏性複合體(LLC)。示例性潛伏性人類TGF-beta 1(TGF-beta同質二聚體和其LAP)的胺基酸序列為序列辨識號：1的胺基酸30至390。示例性小鼠潛伏性TGF-beta 1(TGF-beta同質二聚體和其LAP)的胺基酸序列為序列辨識號：3的胺基酸30至390。由TGF-beta同質二聚體和其LAP形成的複合體稱為小潛伏性複合體(SLC)。此潛伏性複合體使TGF-beta處於非活性型，其無法結合至其受體。

本文所用的術語“活性TGF-beta 1”、“成熟TGF-beta 1”或“活性成熟TGF-beta 1”指的是不形成潛伏性TGF-beta 1複合體(LLC或SLC)，且能結合至其受體的任何TGF-beta 1同質二聚體。TGF-beta 1的活化過程涉及自ECM釋放LLC，接著進一步蛋白質裂解LAP，以釋放活性TGF-beta 1至其受體。已知廣大的蛋白酶，包含血纖維蛋白溶酶(PLN)、血漿激肽釋放酶(PLK)、基質金屬蛋白酶2(MMP2)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、基質金屬蛋白酶13(MMP13)、基質金屬蛋 白酶14(MMP14)、凝血酶(Thrombin)、中性蛋白酶(Tryptase)和鈣離子蛋白(Calpain)，能裂解潛伏性TGF-beta，並釋放活性TGF-beta。這些蛋白酶可統稱為“(潛伏性)TGF-beta裂解蛋白酶((latent)TGF-beta-cleaving protease)”或於本發明的背景中稱為“(潛伏性)TGF-beta 1裂解蛋白酶((latent)TGF-beta 1-cleaving protease)”。除了蛋白酶以外，血小板反應素(thrombospondin 1，TSP-1)、神經纖毛蛋白(Neuropilin-1，Nrp 1)、ADAMSTS1和F-spondin也能活化潛伏性TGF-beta。或者，一經機械伸展(mechanical stretch)後，整合素可藉由結合至存在LAP中的RGD基序(motif)和誘導成熟TGF-beta從潛伏性複合體中釋放，以活化TGF-beta。

本文所使用的“治療(treatment)”(及其語法的變形)指試圖改變受治療的個體的自然病程之臨床干預，且可以為了預防而進行或在臨床病理的過程中進行。希望得到的治療作用包含但不限於防止疾病的發生或復發、減輕症狀、減少疾病的任一直接或間接的病理結果、防止轉移、降低疾病進展的速率、改善或緩和疾病狀態以及緩減或改善的預後。在一些實施例中，本發明的抗體用以延遲疾病的發展或減慢疾病的進展。

術語“可變區”或“可變域”指涉及結合抗體至抗原的抗體重鏈或輕鏈的域。自然抗體的重鏈及輕鏈的可變域(分別為VH和VL)通常具有相似的結構，每一域包括四個保守的框架區(FR)及三個高變異區(HVR)(請參照，例如Kindt等人，Kuby Immunology,6^th ed.,W.H.Freeman and Co.，第91 頁(2007))。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合的特異性。此外，結合至特定抗原的抗體，可使用來自結合該抗原之抗體的VH或VL域以分別篩選互補的VL或VH域資料庫加以分離。請參照，例如Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。

本文使用的術語“載體”指一核酸分子，其能夠繁殖與它連接的另一核酸。此術語包含作為自主複製核酸結構的載體，以及併入它已引入的宿主細胞之基因組中的載體。特定載體能夠指示與它們有效連接的核酸之表現。這類載體在本文中稱為“表現載體”。

II.組成及方法

在一態樣中，發明是，部分地，以抗TGF-beta 1抗體及其使用為基礎。在特定實施例中，提供結合至TGF-beta 1的抗體。本發明的抗體有益於，例如，纖維化的診斷及治療，較佳為心肌纖維化、肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化，皮膚纖維化、眼纖維化和骨髓纖維變性(myelofibrosis)。本發明的抗體亦有益於，例如，癌症的診斷及治療。在一些實施例中，本發明的抗體可與免疫檢查哨抑制劑(immune checkpoint inhibitor)結合使用，例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD160、CD57、CD244、LAG-3、CD272、KLRG1、CD26、CD39、CD73、CD305、TIGIT、TIM-3或VISTA。

A.示例性抗TGF-beta 1抗體

在一態樣中，本發明提供結合至TGF-beta 1的分離的抗體。在一些特定實施例中，抗TGF-beta 1抗體結合至潛伏性 TGF-beta 1。在又一些實施例中，抗TGF-beta 1抗體結合至潛伏性TGF-beta 1的潛伏性相關蛋白(latent associated protein，LAP)區。LAP區的例子包含人類TGF-beta 1前驅原蛋白(序列辨識號：1)的胺基酸30至278。如前文所述，LAP為潛伏性TGF-beta 1的成分之一。在一些實施例中，抗TGF-beta 1抗體以10^-8nM或更小、10^-9nM或更小、或10^-10nM或更小的親和性，結合至潛伏性TGF-beta 1。

在一態樣中，抗TGF-beta 1抗體結合至潛伏性TGF-beta 1，其中潛伏性TGF-beta 1的LAP區共價連接至額外的蛋白，潛伏性TGF-beta結合蛋白(LTBP)，形成大潛伏性複合體(LLC)。在一些特定實施例中，LLC透過潛伏性TGF-beta結合蛋白的N末端，與細胞外間質(ECM)共價結合(見，例如Saharinen等人，Cytokine Growth Factor Rev.1999 Jun；10(2)：99-117)。與細胞外間質結合的大潛伏性複合體可稱為“細胞表面潛伏性TGF-beta 1”。在另一態樣中，抗TGF-beta 1抗體結合至潛伏性TGF-beta 1，其中潛伏性TGF-beta 1的LAP區不連接至潛伏性TGF-beta結合蛋白，形成小潛伏性複合體(SLC)。在一些特定實施例中，SLC以可溶型存在。在一些實施例中，抗TGF-beta 1抗體以10^-8nM或更小、10^-9nM或更小、或10^-10nM或更小的親和性結合至潛伏性TGF-beta 1，形成LLC或SLC。

在一態樣中，抗TGF-beta 1抗體抑制潛伏性TGF-beta 1的活化。如本文所使用的術語，潛伏性TGF-beta 1的“活化”指的是成熟TGF-beta 1從LAP中釋放的任何過 程，且LAP為潛伏性TGF-beta 1的成分之一。例如，可藉由使用各種習知或本文所述的技術，量測成熟TGF-beta 1和/或量測成熟TGF-beta 1的活性，以偵測潛伏性TGF-beta 1的活化。在一些實施例中，抗TGF-beta 1抗體抑制成熟TGF-beta 1從潛伏性TGF-beta 1釋放。如前文所述，已有報導，成熟TGF-beta 1透過活化劑，例如蛋白酶、整合素和其它非蛋白酶的活化劑，從潛伏性TGF-beta 1釋放。活化潛伏性TGF-beta 1的非限定的蛋白酶例子包含血纖維蛋白溶酶(PLN)、血漿激肽釋放酶(PLK)、基質金屬蛋白酶(MMP)2和MMP9。在一些實施例中，抗TGF-beta 1抗體抑制蛋白酶介導和/或整合素介導成熟TGF-beta 1從潛伏性TGF-beta 1釋放。如前文所述，蛋白酶裂解潛伏性TGF-beta 1的LAP區，導致成熟TGF-beta 1釋放。在一些實施例中，PLN或PLK的裂解位位於由LAP多肽的胺基酸56至59所組成的片段內。

在一態樣中，抗TGF-beta 1抗體抑制蛋白酶介導成熟TGF-beta 1從潛伏性TGF-beta 1釋放，但不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP部的裂解。在一些實施例中，當抗TGF-beta 1抗體結合至潛伏性TGF-beta 1的LAP區時，抗TGF-beta 1抗體抑制蛋白酶介導成熟TGF-beta 1從潛伏性TGF-beta 1釋放，且允許蛋白酶裂解LAP區。在一些實施例中，抗TGF-beta 1抗體不會阻擋蛋白酶接近潛伏性TGF-beta 1，尤其是接近PLN和/或PLK的裂解位。在另一些實施例中，抗TGF-beta 1抗體不會結合至潛伏性TGF-beta 1的LAP部的蛋白酶裂解位，尤其是PLN和/或PLK的裂解位。

在一些實施例中，抑制蛋白酶介導成熟TGF-beta 1從潛伏性TGF-beta 1釋放的抗TGF-beta 1抗體為(i)抑制一或更多蛋白酶介導的LAP區的裂解，但(ii)不會抑制其它蛋白酶介導的LAP區的裂解的抗體。例如，抗TGF-beta 1抗體(i)藉由抑制MMP2和/或MMP9介導的潛伏性TGF-beta 1的潛伏性相關胜肽部的裂解，抑制MMP2和/或MMP9介導的成熟TGF-beta 1的釋放，以及(ii)抑制PLN和/或PLK介導的成熟TGF-beta 1的釋放，但不抑制PLN和/或PLK介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP部的裂解。或者，抗TGF-beta 1抗體(i)藉由抑制PLN和/或PLK介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP部的裂解，抑制PLN和/或PLK介導的成熟TGF-beta 1的釋放，以及(ii)抑制MMP2和/或MMP9介導的成熟TGF-beta 1的釋放，但不抑制MMP2和/或MMP9介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP部的裂解。

在一些實施例中，“抑制潛伏性TGF-beta 1的活化”的抗體包含導致TGF-beta 1的活化降低至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%或更多的抗體。在另一些實施例中，“抑制蛋白酶介導成熟TGF-beta 1從潛伏性TGF-beta 1釋放”的抗體，包含導致蛋白酶介導的成熟TGF-beta 1從潛伏性TGF-beta 1的釋放減少至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%或更多的抗體。在又一些實施例中，抑制蛋白酶介導成熟TGF-beta 1從潛伏性TGF-beta 1釋放，“但不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區的裂解”的抗體，包含導致蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1 的LAP區的裂解減少50%或更少、45%或更少、40%或更少、35%或更少、30%或更少、25%或更少、20%或更少、15%或更少、10%或更少、5%或更少的抗體。

在一些實施例中，抗TGF-beta 1抗體穩定潛伏性TGF-beta 1的LAP區的結構，但不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區的裂解。當抗TGF-beta 1抗體“穩定”LAP區的結構時，如本文所使用的，與抗TGF-beta 1抗體結合的LAP區處於特定結構，且成熟TGF-beta 1無法從此特定結構中釋放。在另一些實施例中，被抗TGF-beta 1抗體穩定的潛伏性TGF-beta 1可被整合素活化。在一些特定實施例中，被抗TGF-beta 1抗體穩定的LAP區已被蛋白酶裂解或是未被蛋白酶裂解。在一些實施例中，當抗TGF-beta 1抗體結合至潛伏性TGF-beta 1的LAP區時，抗TGF-beta 1抗體穩定潛伏性TGF-beta 1的LAP區的結構，且允許蛋白酶裂解LAP區。在一些實施例中，抗TGF-beta 1抗體穩定潛伏性TGF-beta 1的LAP區的結構，但不阻擋蛋白酶接近潛伏性TGF-beta 1，尤其是接近PLN和/或PLK的裂解位。在另一些實施例中，抗TGF-beta 1抗體穩定潛伏性TGF-beta 1的LAP區的結構，但不阻擋蛋白酶接近潛伏性TGF-beta 1，尤其是接近MMP2和/或MMP9的裂解位。

在一態樣中，抗TGF-beta 1抗體不會結合至成熟TGF-beta 1。在一些實施例中，抗TGF-beta 1抗體以大於結合至成熟TGF-beta 1的親和力，結合至潛伏性TGF-beta 1。在一些特定實施例中，本發明的抗體以大於結合至成熟TGF-beta 1 至少2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍之親和性結合至潛伏性TGF-beta 1。

在一態樣中，抗TGF-beta 1抗體不會或部分抑制整合素介導的TGF-beta 1的活化，亦即是，整合素介導TGF-beta 1從潛伏性TGF-beta 1中釋放。在一些實施例中，“不會或部分抑制整合素介導的TGF-beta 1的活化”的抗體，包含導致整合素介導的TGF-beta 1的活化，亦即是，整合素介導TGF-beta 1從潛伏性TGF-beta 1的釋放，減少50%或更少、45%或更少、40%或更少、35%或更少、30%或更少、25%或更少、20%或更少、15%或更少、10%或更少、5%或更少的抗體。

在一些實施例中，本發明的抗TGF-beta 1抗體：結合至潛伏性TGF-beta 1的LAP區；以10^-8nM或更小、10^-9nM或更小、或10^-10nM或更小的親和性，結合至潛伏性TGF-beta 1；抑制蛋白酶介導成熟TGF-beta 1從潛伏性TGF-beta 1釋放；不會抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區的裂解；以及/或不會或部分抑制整合素介導TGF-beta 1從潛伏性TGF-beta 1釋放。

在另一些實施例中，本發明的抗TGF-beta 1抗體為：單株抗體；人類、人源化或嵌合抗體； 全長IgG抗體；和/或抗體片段。

在一態樣中，本發明提供抗TGF-beta 1抗體，包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個高變異區(HVR)，其擇自於(a)包含序列辨識號：5之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含序列辨識號：6之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含序列辨識號：7之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含序列辨識號：8之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含序列辨識號：9之胺基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含序列辨識號：10之胺基酸序列的HVR-L3。

在一態樣中，本發明提供抗TGF-beta 1抗體，包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個高變異區(HVR)，其擇自於(a)包括序列辨識號：11之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：12之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：13之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：14之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：15之胺基酸序列的HVR-L2；以及(f)包括序列辨識號：16之胺基酸序列的HVR-L3。

在一態樣中，發明提供抗TGF-beta 1抗體，包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR，其擇自於(a)包括序列辨識號：17之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：18之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：19之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：20之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：21之胺基酸序列的 HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：22之胺基酸序列的HVR-L3。

在一態樣中，發明提供抗TGF-beta 1抗體，包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR，其擇自於(a)包括序列辨識號：23之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：24之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：25之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：26之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：27之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：28之胺基酸序列的HVR-L3。

在一態樣中，發明提供抗TGF-beta 1抗體，包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR，其擇自於(a)包括序列辨識號：29之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：30之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：31之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：32之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：33之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：34之胺基酸序列的HVR-L3。

在上述之任一實施例中，抗TGF-beta 1抗體為人源化(humanized)的。在一實施例中，抗TGF-beta 1抗體包括如上述之任一實施例中的HVR，且更包括受體人類框架，例如，人類免疫球蛋白框架或人類共有框架。

在另一態樣中，提供抗TGF-beta 1抗體，其中抗體包括如上述之任一實施例中的VH或VL。在一實施例中，抗體分別包括序列辨識號：35的VH序列和序列辨識號：36的VL序列，其包含那些序列的轉譯後修飾。轉譯後修飾包含，但不限於，藉由焦麩胺酸化(pyroglutamylation)，將在重鏈或 輕鏈之N末端的穀氨醯胺和穀胺酸鹽修飾為焦麩胺酸(pyroglutamic acid)。

在另一態樣中，提供抗TGF-beta 1抗體，其中抗體包含如上述之任一實施例中的VH和VL。在一實施例中，抗體分別包含序列辨號識號：37的VH序列和序列辨識號：38的VL序列，其包含那些序列的轉譯後修飾。轉譯後修飾包含，但不限於，藉由焦麩胺酸化，將在重鏈或輕鏈之N末端的穀氨醯胺和穀胺酸鹽修飾為焦麩胺酸。

在另一態樣中，提供抗TGF-beta 1抗體，其中抗體包括如以上提供之任一實施例中的VH和VL。在一實施例中，抗體分別包括序列辨識號：39的VH序列和序列辨識號：40的VL序列，其包含那些序列的轉譯後修飾。轉譯後修飾包含，但不限於，藉由焦麩胺酸化，將在重鏈或輕鏈之N末端的穀氨醯胺和穀胺酸鹽修飾為焦麩胺酸。

在另一態樣中，提供抗TGF-beta 1抗體，其中抗體包括如以上提供之任一實施例中的VH和VL。在一實施例中，抗體分別包括序列辨識號：41的VH序列和序列辨識號：42的VL序列，其包含那些序列的轉譯後修飾。轉譯後修飾。包含，但不限於，藉由焦麩胺酸化，將在重鏈或輕鏈之N末端的穀氨醯胺和穀胺酸鹽修飾為焦麩胺酸。

在另一態樣中，提供抗TGF-beta 1抗體，其中抗體包括如以上提供之任一實施例中的VH和VL。在一實施例中，抗體分別包含序列辨識號：43的VH序列以及序列辨識號：44的VL序列，其包含那些序列的轉譯後修飾。轉譯後修飾。 包含，但不限於，藉由焦麩胺酸化，將在重鏈或輕鏈之N端的穀氨醯胺和穀胺酸鹽修飾為焦麩胺酸。

在又一態樣中，發明提供抗體，其與本文提供之抗TGF-beta 1抗體結合至相同的抗原決定基。在一實施例中，發明提供抗體，其與本文提供之抗TGF-beta 1抗體結合至小鼠TGF-beta 1上相同的抗原決定基。例如，在一些特定實施例中，提供抗體，其與下列抗體結合至相同的抗原決定基：(1)抗TGF-beta 1抗體，其包括(a)包含序列辨識號：5之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含序列辨識號：6之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含序列辨識號：7之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含序列辨識號：8之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含序列辨識號：9之胺基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含序列辨識號：10之胺基酸序列的HVR-L3；(2)抗TGF-beta 1抗體，其包括(a)包含序列辨識號：11之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含序列辨識號：12之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含序列辨識號：13之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含序列辨識號：14之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含序列辨識號：15之胺基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含序列辨識號：16之胺基酸序列的HVR-L3；(3)抗TGF-beta 1抗體，其包括(a)包含序列辨識號：17之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含序列辨識號：18之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含序列辨識號：19之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含序列辨識號：20之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含序列辨識號：21之胺基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含序列辨識 號：22之胺基酸序列的HVR-L3；(4)抗TGF-beta 1抗體，其包括(a)包含序列辨識號：23之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含序列辨識號：24之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含序列辨識號：25之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含序列辨識號：26之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含序列辨識號：27之胺基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含序列辨識號：28之胺基酸序列的HVR-L3；和/或(5)抗TGF-beta 1抗體，其包括(a)包含序列辨識號：29之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含序列辨識號：30之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含序列辨識號：31之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含序列辨識號：32之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含序列辨識號：33之胺基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含序列辨識號：34之胺基酸序列的HVR-L3。

在又一態樣中，本發明提供抗體，其結合至人類TGF-beta 1上的抗原決定基，其中此抗原決定基對應於小鼠TGF-beta 1上的抗原決定基，且本文提供的抗TGF-beta 1抗體結合至上述小鼠TGF-beta 1上的抗原決定基。例如，在一些特定實施例中，對應於小鼠TGF-beta 1上的抗原決定基的人類TGF-beta 1上的抗原決定基，係以下抗TGF-beta 1抗體所結合的抗原決定基，抗TGF-beta 1抗體包括(a)包含序列辨識號：5之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含序列辨識號：6之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含序列辨識號：7之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含序列辨識號：8之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含序列辨識號：9之胺基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含序 列辨識號：10之胺基酸序列的HVR-L3；和/或以下抗TGF-beta 1抗體所結合的抗原決定基，抗TGF-beta 1抗體包括(a)包含序列辨識號：11之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含序列辨識號：12之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含序列辨識號：13之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含序列辨識號：14之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含序列辨識號：15之胺基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含序列辨識號：16之胺基酸序列的HVR-L3。

在一些特定實施例中，“對應於”小鼠TGF-beta 1上的抗原決定基的人類TGF-beta 1上的抗原決定基，係包含來自人類TGF-beta 1的胺基酸序列，且此胺基酸序列與小鼠TGF-beta 1的類似或相同。如果人類TGF-beta 1上的抗原決定基對應於小鼠TGF-beta 1上的抗原決定基，抗原決定基的胺基酸序列的長度較佳為相同，但不限於此。如果抗原決定基為構型抗原決定基，則“對應的”抗原決定基可為人類或小鼠TGF-beta 1之胺基酸序列的不連續片段。在又一實施例中，人類TGF-beta 1上的抗原決定基，其對應於小鼠TGF-beta 1上的抗原決定基，對於小鼠TGF-beta 1上的抗原決定基的胺基酸序列，具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，較佳為90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相同性。

在又一態樣中，發明提供抗體，其與本文提供之抗TGF-beta 1抗體競爭結合至TGF-beta 1。在一實施例中，發 明提供抗體，其與本文提供之抗TGF-beta 1抗體競爭結合至小鼠TGF-beta 1。例如，在一些特定實施例中，提供抗體，其與以下抗TGF-beta 1抗體競爭結合至TGF-beta 1：(1)抗TGF-beta 1抗體，其包括(a)包含序列辨識號：5之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含序列辨識號：6之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含序列辨識號：7之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含序列辨識號：8之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含序列辨識號：9之胺基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含序列辨識號：10之胺基酸序列的HVR-L3；(2)抗TGF-beta 1抗體，其包括(a)包含序列辨識號：11之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含序列辨識號：12之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含序列辨識號：13之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含序列辨識號：14之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含序列辨識號：15之胺基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含序列辨識號：16之胺基酸序列的HVR-L3；(3)抗TGF-beta 1抗體，其包括(a)包含序列辨識號：17之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含序列辨識號：18之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含序列辨識號：19之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含序列辨識號：20之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含序列辨識號：21之胺基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含序列辨識號：22之胺基酸序列的HVR-L3；(4)抗TGF-beta 1抗體，其包括(a)包含序列辨識號：23之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含序列辨識號：24之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含序列辨識號：25之胺基酸序列的HVR-H3； (d)包含序列辨識號：26之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含序列辨識號：27之胺基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含序列辨識號：28之胺基酸序列的HVR-L3；和/或(5)抗TGF-beta 1抗體，其包括(a)包含序列辨識號：29之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含序列辨識號：30之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含序列辨識號：31之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含序列辨識號：32之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含序列辨識號：33之胺基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含序列辨識號：34之胺基酸序列的HVR-L3。

在本發明的又一態樣中，根據以上任一之實施例的抗TGF-beta 1抗體為單株抗體，包含嵌合、人源化或人類抗體。在一實施例中，抗TGF-beta 1抗體為抗體片段，例如，Fv、Fab、Fab'、scFv、雙抗體(diabody)、或F(ab')₂片段。在另一實施例中，抗體為全長抗體，例如，完整的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體或如本文所定義之其它抗體種類或同型(isotype)。在又一態樣中，抗TGF-beta 1抗體亦包含任何抗原結合分子，其包含免疫球蛋白的可變重鏈和/或可變輕鏈結構。

在又一態樣中，根據以上任一實施例的抗TGF-beta 1抗體可單一地或組合地合併任一特徵，如以下章節1-7所述。

1.抗體親和性

在一些特定實施例中，本文提供之抗體具有1micro M或更小、100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、0.1nM或更小、0.01nM或更小、或0.001nM或更小(例如10^-8M或 更小、例如由10^-8M至10^-13M、例如由10^-9M至10^-13M)之解離常數(dissociation constant，Kd)。

在一實施例中，Kd藉由放射性標記抗原結合分析法(radiolabeled antigen binding assay，RIA)進行測量。在一實施例中，RIA是以感興趣的抗體及其抗原的Fab形式實行。例如，藉由在存在未標記抗原的滴定系列的條件下，用最小濃度的(¹²⁵I)-標記抗原平衡Fab，然後以抗Fab抗體被覆的盤捕捉結合的抗原，以測量Fab對抗原的溶液結合親和性(請參照，例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為了確立測定的條件，以於50mM碳酸鈉(pH 9.6)中的5micro g/ml捕捉用抗Fab抗體(Cappel Labs)被覆MICROTITER(註冊商標)多孔盤(Thermo Scientific)過夜，接著以於PBS中的2%(w/v)牛血清蛋白在室溫(約23度C)進行阻斷2至5小時。在非吸附盤(Nunc#269620)中，將100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原與連續稀釋的感興趣的Fab(例如，與Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中抗VEGF抗體，Fab-12的評估一致)混合。接著將感興趣的Fab培養過夜；然而，培養可持續更長的時間(例如，約65小時)以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉盤於室溫下培養(例如，1小時)。接著移除溶液並以含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20(註冊商標))的PBS清洗盤8次。當盤已乾燥，加入150micro 1/孔的閃爍液(MICROSCINT-20 ^TM；Packard)，且於TOPCOUNT ^TM伽馬計數器(Packard)上對盤計數10分鐘。選擇各Fab給出小於或等於最大結合之20%的濃度，用於競爭性結合分析法。

依照另一實施例，Kd是利用BIACORE(註冊商標)表面電漿共振測定法進行測量。例如，使用BIACORE(註冊商標)-2000或BIACORE(註冊商標)-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的測定法在25度C以固定化抗原CM5晶片在約10個回應單位(RU)下實行。在一實施例中，根據供應商的說明書，以N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片(CM5,BIACORE(註冊商標)，Inc.)。在以5micro 1/min的流速注入以獲得約10個回應單位(RU)的偶聯蛋白質之前，以10mM乙酸鈉，pH4.8，將抗原稀釋至5micro g/ml(約0.2micro M)。在抗原的注入後，注入1M乙醇胺以阻斷未反應基團。為了進行動力學測量，將兩倍連續稀釋的Fab(0.78nM至500nM)在25度C以約25micro 1/min的流速注入於含0.05聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)介面活性劑的PBS(PBST)中。使用簡單一對一Langmuir結合模型(BIACORE(註冊商標)Evaluation Software version 3.2)藉由同時擬合結合及解離傳感圖計算結合速率(k_on)及解離速率(k_off)。平衡解離常數(Kd)以比例k_off/k_on計算。請請參照，例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若根據上述表面電漿共振測定法，結合速率超過10⁶M^-1s^-1，那麼結合速率利用螢光淬滅技術加以測定，其在25度C下測量於PBS，pH7.2，中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)的螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)的增加或減少，在分光計，例如配備了斷流(stop-flow)裝置的分光光度計(Aviv Instruments)或具攪拌比色管之8000系列 SLM-AMINCO ^TM分光光度計(ThermoSpectronic)，測量抗原的濃度增加的存在下。

可藉由，例如放大發光鄰近同質性分析(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay，ALPHA)篩選、使用表面電漿共振(surface plasmon resonance，SPR)現象的BIOCORE(註冊商標)法，或類似方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)，4005-4010)，確認本發明的抗TGF-beta 1抗體結合至TGF-beta 1的“結合活性”

抗體結合至TGF-beta 1的“結合活性”可以抗體的KD表示。抗體的KD指的是抗體-抗原交互作用的平衡解離常數。抗體結合至其抗原的KD越高，其對此特定的抗原的結合活性越低。就本揭露的目的而言，術語“結合活性”可與術語“親和性”或“結合親和性”交換使用。在一些特定實施例中，結合至TGF-beta 1的抗體具有1micro M或更小、100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、0.1nM或更小、0.01nM或更小、或0.001nM或更小(例如10^-8M或更小、例如由10^-8M至10^-13M、例如由10^-9M至10^-13M、例如由10^-10M至10^-14M、例如由10^-11M至10^-15M)之KD。在一些特定實施例中，抗TGF-beta 1抗體結合至TGF-beta 1的抗原決定基，所述抗原決定基在不同物種的TGF-beta 1中為保守的。

關於表面電漿共振(SPR)，用於觀察其交互作用的物質中的一個被固定為配位體，於感應晶片的薄金層上。當光照射在感應晶片的後表面，如此，在薄金層和玻璃之間的界面發生總反射，反射光的強度在特定位置(SPR訊號)被部分減 弱。用於觀察其交互作用的另一物質作為分析物，注射於感應晶片的表面。當分析物結合至配位體時，固定的配位體分子的質量增加。這改變感應晶片的表面上的溶劑的折射系數。此折射系數的改變導致SPR訊號的位置偏移(相反地，解離會將訊號移回至原位)。在BIOCORE(註冊商標)系統中，前文所述之偏移的量作圖於垂直座標，並因此質量隨著時間的變化以量測的數據(sensorgram)顯示。從sensorgram的曲線測定動力學參數(結合速率常數(association rate constant，ka)和解離速率常數(dissociation rate constant，kd)。從這兩個常數之間的比值，測定結合活性(KD)。在BIOCORE(註冊商標)方法中，較佳使用抑制分析。在Pro.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)，4005-4010中，描述這樣的抑制分析的例子。

使用1：1結合模型，從結合速率常數(ka)和解離速率常數(kd)測定結合活性(KD)。對本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言很明確的是，量測步驟會影響內含分子的固有結合活性，例如被一分子的生物感應器上的塗層相關的人工產物所影響。此外，如果一分子對另一分子含有超過一個辨認位，量測的結合活性可能受到這兩個分子的交互作用的強結合性(avidity)影響。

可使用表面電漿共振為基礎的生物感應器，量測KD值和kd值，如本文所表示(見，例如本文的實施例3-5和實施例10-7)。可在例如25℃或37℃下，測定結合活性的值和解離速率常數的值。

2.抗體片段

在一些特定實施例中，本文提供之抗體為抗體片段。抗體片段包含但不限於，Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、Fv、及scFv片段，及如下述之其它片段。對於特定抗體片段的綜述，請參照Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。對於特定scFv片段的綜述，請參照，例如Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg及Moore編輯，(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)；亦參照WO 93/16185；以及美國專利號5,571,894及5,587,458。關於包括補救(salvage)受體結合抗原決定基殘基且具有增加的體內(in vivo)半生期之Fab及F(ab')₂片段的討論，請參照美國專利號5,869,046。

雙抗體(diobody)是具有兩個抗原結合位的抗體片段，其可為二價的或雙特異性的，請參照，例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗體及四抗體也記載於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。

單域抗體是包括抗體的所有或部分的重鏈可變域或全部或部分的輕鏈可變域之抗體片段。在一些特定實施例中，單域抗體是人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；請參照，例如美國專利號6,248,516 B1)。

可藉由多種技術形成抗體片段，包含但不限於完整抗體的蛋白質水解消化，以及藉由重組宿主細胞(例如，E.coli或噬菌體)的產生，如本文中所述。

本發明亦有關於結合至抗TGF-beta 1的抗原結合分子，包含，但不限於，例如小分子抗體(minibody)(低分子重量的抗體)和支架蛋白(scaffold protein)。在本發明中，任一支架蛋白都為可接受的，只要是具有穩定的三維結構且能結合至至少一抗原的胜肽。這樣的胜肽包含，例如抗體可變區的片段、纖維黏連蛋白(fibronectin)、蛋白質A域(protein A domain)、低密度脂蛋白受體A域(LDL receptor A domain)、載脂蛋白(lipocalin)以及如Nygren等人(Current Opinion in Structural Biology,(1997)7：463-469；Journal of Immunol Methods,(2004)290：3-28)、Binz等人(Nature Biotech.(2005)23：1257-1266)和Hosse等人(Protein Science,(2006)15：14-27)所述的其它分子。當指的是這樣的抗體時，在本說明書的背景中，例如“抗TGF-beta 1抗體”應被取代為“抗TGF-beta 1抗原結合分子”。

3.嵌合及人源化抗體

在一些特定實施例中，本文提供之抗體為嵌合抗體。特定嵌合抗體記載於，例如，美國專利號4,816,567；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。在一例子中，嵌合抗體包括非人類可變區(例如，源自小鼠、大鼠、齧齒類、兔或非人類靈長類，像是猴的可變區)以及人類恆定區。在又一例子中，嵌合抗體為“類別交換的(class switched)”抗體，其中類別或亞類(subclass)已自親本抗體的類別或亞類改變。嵌合抗體包含其抗原結合片段。

在一些特定實施例中，嵌合抗體為人源化抗體。 通常，非人類抗體經人源化以降低對人類的免疫原性，同時保有親本非人類抗體的特異性及親和性。一般而言，人源化的抗體包括一或多個可變域，其中HVR，例如，CDR(或其部分)源自非人類抗體，以及FR(或其部分)源自人類抗體序列。人源化抗體可選地也包括人類恆定區的至少一部分。在一些實施例中，人源化的抗體中的一些FR殘基被來自非人類抗體(例如，HVR殘基源自的抗體)對應之殘基取代，例如，以恢復或提高抗體特異性或親和性。

人源化抗體及製備其的方法綜述於，例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，以及進一步描述於，例如Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利號5,821,337、7,527,791、6,982,321及7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述特異性決定區(SDR)移)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述“表面重修”)；Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述“FR改組”)；以及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)以及Klimka等人，Br.J.Cancer 83：252-260(2000)(描述FR改組的“導向選擇”方法)。

可用於人源化的人類框架區包含但不限於：使用“最適”方法選擇的框架區(請參照，例如，Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993)；源自特定的亞型的輕鏈或重鏈可變區的人類抗體的共有序列之框架區(請參照，例如，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；及Presta等人， J.Immunol.151：2623(1993)；人類成熟(體細胞突變的)框架區或人類種系框架區(請參照，例如，Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；以及源自篩選FR資料庫的框架區(請參照，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)以及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。

4.人類抗體

在一些特定實施例中，本文提供之抗體為人類抗體。人類抗體可利用各種習知的技術加以製造。人類抗體大致的描述於van Dijk及van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)。

人類抗體可藉由向已經過修飾因而因應抗原攻擊產生完整人類抗體或具有人類可變區的完整抗體之基因轉殖動物施用免疫原，來製備人抗體。這類動物通常包含全部或部分的人類免疫球蛋白基因座，其取代了內源免疫球蛋白基因座，或其存在於染色體外或隨機整合於動物的染色體內。在這類基因轉殖小鼠中，內源免疫球蛋白基因座一般已不活化。關於自基因轉殖動物獲取人類抗體的方法之綜述，請參照Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。請亦參照，例如美國專利號6,075,181及6,150,584，其描述XENOMOUSE^TM技術；美國專利號5,770,429，其描述HUMAB(註冊商標)技術；美國專利號7,041,870，其描述K-M MOUSE(註冊商標)技術，以及美國專利公開號US 2007/0061900，其描述VELOCIMOUSE(註冊商標)技術)。藉由這類動物產生的完整抗 體的人類可變區可進一步修飾，例如，藉由與不同人類恆定區組合。

人類抗體也可藉由基於融合瘤的方法形成。用於產生人類單株抗體的人類骨髓瘤及小鼠-人融合骨髓瘤細胞系已經描述。(請參照，例如Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人，J.Immunol.147：86(1991)。藉由人類B細胞融合瘤技術產生的人抗體也在Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：3557-3562(2006)中描述。其它方法包含那些描述於，例如，美國專利號7,189,826(描述由融合瘤細胞系產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue 26(4)：265-268(2006)(描述人-人融合瘤)的方法。人融合瘤技術(Trioma技術)也描述於Vollmers及Brandlein，Histology and Histopathology 20(3)：927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3)：185-91(2005)。

亦可藉由分離選自源自人類噬菌體展示資料庫的Fv株可變域序列產生人類抗體。接著可將這類可變域序列與所需人類恆定域組合。下文描述自抗體資料庫選擇人類抗體的技術。

5.源自資料庫的抗體

可藉由在組合資料庫中篩選具有所需活性的抗體以分離本發明的抗體。例如，本領域中已知多種用於產生噬菌體展示 資料庫並且在這類資料庫中篩選具有所需結合特徵的抗體的方法。這類方法綜述於，例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37；O'Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,2001，且進一步於，例如McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)中描述。

在特定的噬菌體展示方法中，VH及VL基因的庫(repertoire)是藉由聚合酶連鎖反應(PCR)分別選殖並隨機地重組於噬菌體資料庫中，之後可藉由如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.12：433-455(1994)所述在其中篩選抗原結合噬菌體。噬菌體通常呈現單鏈Fv(ScFv)片段或Fab片段形式的抗體片段。來自免疫來源的資料庫無需建構融合瘤，即可提供免疫原的高親和性抗體。或者，天然庫可被轉殖(cloned)(例如，自人類)以在無任何免疫的情況下，提供針對廣泛範圍的非自體抗原以及自體抗原的抗體單一來源，如Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所述。最後，也可藉由從幹細胞轉殖未重排的V基因片段，並使用含有隨機序列的PCR引子來編碼高度變異CDR3區，以及實現體外(in vitro)重排以合成地產生天 然資料庫，如Hoogenboom及Winter，J.Mol.Biol.227：381-388(1992)所述。描述人類抗體噬菌體資料庫的專利公開物包含，例如：美國專利號5,750,373，以及美國專利公開號2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936及2009/0002360。

自人類抗體資料庫分離的抗體或抗體片段被視為本文的人類抗體或人類抗體片段。

6.多特異性抗體

在一些特定實施例中，本為提供之抗體為多特異性抗體，例如，雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同位置具有結合特異性的單株抗體。在一些特定實施例中，結合特異性的其中之一是針對TGF-beta 1而另一種是針對任一其它抗原。在一些特定實施例中，雙特異性抗體可結合至TGF-beta 1的兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體也可用以將細胞毒性劑定位於表現TGF-beta 1的細胞。雙特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。

製造多特異性抗體的技術包含但不限於，具有不同特異性的兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表達(co-expression)(請參照Milstein及Cuello，Nature 305：537(1983))、WO 93/08829、以及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))，及“knob-in-hole”工程改造(請參照，例如美國專利號5,731,168)。也可藉由以下方法製得多特異性抗體：工程改造用於製備抗體Fc-異二聚分子的靜電導引作用(WO 2009/089004A1)；將兩種或兩種以上抗體或片段交聯(請參照， 例如美國專利號4,676,980，以及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鍊以產生雙特異性抗體(請參照，例如Kostelny等人，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992))；利用“雙抗體”技術來產生雙特異性抗體片段(請參照，例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))；及利用單鏈Fv(scFv)雙體(請參照，例如Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994))；以及製備三特異性抗體，如，例如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所述。

本文中也包含具有三個或三個以上的功能性抗原結合位置的工程改造抗體，其包含“章魚抗體(Octopus antibodies)”(請參照，例如US 2006/0025576A1)。

本文中的抗體或片段亦包含“雙重作用Fab”或“DAF”，其包括結合至TGF-beta 1以及另一不同抗原的抗原結合位置(請參照，例如，US 2008/0069820)。

7.抗體變異體

在一些特定實施例中，本文提供之抗體的胺基酸序列變異體為經設想的。例如，提高抗體的結合親和性及/或其它生物性質可為理想的。可藉由引入適當的修飾至編碼抗體的核苷酸序列、或藉由肽合成，製備抗體的胺基酸序列變異體。此類修飾包含，例如，在抗體的胺基酸序列內刪除、及/或插入及/或取代殘基。可以使得刪除、插入及取代的任何組合達到最終的構建體中，前提為最終構建體具有期望的特徵，例如，抗原結合。

如前文所述，TGF-beta為細胞介質的TGF-beta超 家族的成員，包含肌抑素(myostatin)和各別的TGF-beta的同型異構物，例如TGF-beta 1、TGF-beta 2和TGF-beta 3。因此，本發明亦有關於結合至TGF-beta 2或TGF-beta 3，或TGF-beta超家族的成員例如肌抑素的抗體。當指的是這樣的抗體時，在本說明書的背景中，例如“抗TGF-beta 1抗體”應被取代為“抗肌抑素抗體”“抗TGF-beta 2抗體”、“抗TGF-beta 3抗體”或“抗TGF-beta超家族的成員抗體”。

a)取代、插入及刪除變異體

在一些特定實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代的抗體變異體。取代誘變(mutagenesis)的感興趣的位置包含HVR及FR。表1中的標題“優選取代”下顯示保守取代。表1中的標題“示例性取代”下提供更實質的改變，並參考胺基酸側鏈類別在下文進一步描述。可將胺基酸取代引入至感興趣的抗體及篩選到期望的活性之產物中，例如，保留的/改善的抗體結合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。

表1

可根據共同的側鏈特性將胺基酸分類為：(1)疏水的：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的：Asp、Glu；(4)鹼性的：His、Lys、Arg；(5)影響鏈方位的殘基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守取代將使得這些型的其中之一的成員與另一個交換。

取代變異體的一類涉及取代親本抗體(例如，人源化的或人類抗體)的一或多個高度變異區殘基。一般而言，選擇用於進一步研究的產生之變異體將在特定生物性質(例如，增加的親和性、降低的免疫原性)中相對於親本抗體具有修飾 (例如改善)及/或將具有實質上保留的親本抗體的特定生物性質。示例性的取代變異體是親和性成熟的抗體，其可方便地被產生，例如，使用像是那些本文所述基於噬菌體展示的親和性成熟技術。簡言之，突變一或多個HVR殘基並且在噬菌體上展示變異體抗體，以及就特別的生物活性(例如，結合親和性)進行篩選。

可以在HVR中形成修改(alteration)(例如，取代)，例如，以改善抗體親和性。此類修改可形成在HVR“熱點”中，即由在體細胞成熟過程中以高頻率經歷突變的密碼子所編碼的殘基(請參照，例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008)，及/或接觸抗原的殘基，且測試獲得的變異體VH或VL之結合親和性。藉由建構以及從第二資料庫重新選擇的親和性成熟已在，例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,(2001)中描述。在親和性成熟的一些實施例中，藉由多種方法中的任一種(例如，易錯PCR、鏈改組、或寡核苷酸定向誘變)將多樣性引入至選擇用於成熟的可變基因中。接著產生第二資料庫。然後篩選資料庫以辨識具有期望的親和性的任一抗體變異體。引入多樣性的另一種方法涉及HVR定向方法，其中隨機化數個HVR殘基(例如，一次4至6個殘基)。涉及抗原結合的HVR殘基可特異地被辨識，例如使用丙胺酸掃描誘變或建立模型。CDR-H3及CDR-L3特別常被標靶。

在一些特定的實施例中，取代、插入或刪除可發生在一或多個HVR內，只要此類修改未實質地降低抗體結合 抗原的能力。例如，可在HVR中形成未實質地降低結合親和性的保守修改(例如，如本文提供的保守取代)。此類修改可，例如，在HVR中的抗原接觸殘基之外。在以上提供的變異體VH和VL序列的特定實施例中，每一HVR或未被修改，或含有不多於一個、兩個或三個胺基酸取代。

一種可用於辨識可被標靶用於誘變的抗體的殘基或區域的方法稱為“丙胺酸掃描誘變”，如Cunningham及Wells(1989)，Science 244：1081-1085所述。在此方法中，殘基或一群殘基(例如，帶電的殘基，像是arg、asp、his、lys及glu)可被辨識並被中性或帶負電的胺基酸(例如，丙胺酸或多聚丙胺酸)取代，以測定是否影響抗體與抗原的相互作用。可在顯示對於初始取代的功能性敏感的胺基酸位置引入更多的取代。替代地、或額外地，可分析抗原抗體複合物的晶體結構，以辨識抗體及抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及相鄰的殘基可被標靶或消除，作為作為取代的候選對象。變異體可被篩選以測定它們是否包含期望的性質。

胺基酸序列插入物包含長度範圍從一個殘基至包含100個或更多殘基的多肽之胺基-及/或羧基-末端融合物，以及單一或多個胺基酸殘基的序列內插入物。末端插入物的例子包含具有N末端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子的其它插入變異體包含在抗體的N或C末端的酶(例如，ADEPT)或多肽的融合，其增加抗體的血漿半生期。

b)糖化變異體

在一些特定的實施例中，本文提供的抗體被修改以增加或 減少抗體被糖化的程度。可藉由修改胺基酸序列使得一或多個糖化位置被製造或移除，以方便地完成對抗體的糖化位置之添加或刪除。

當抗體包括Fc區域時，可以修改附著於其的糖。由哺乳動物細胞產生的自然抗體通常包括分支的、二天線(biantennary)的寡糖，其一般藉由N連接附著至Fc區域的CH2域的Asn297，請參照，例如，Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可包含多種糖，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及附著至二天線寡糖結構的“主幹”中的GIcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可在本發明的抗體中的寡糖形成修飾，以產生具有特定改善性質的抗體變異體。

在一實施例中，提供的抗體變異體具有糖結構，其缺少附著(直接或間接)至Fc區域的岩藻糖。例如，此類抗體中岩藻糖的量可為從1%至80%、從1%至65%、從5%至65%或從20%至40%。岩藻糖的量是藉由計算糖鏈內在Asn297處的平均岩藻糖的量，相對於如藉由MALDI-TOF質譜分析測量之附著於Asn297的所有糖基結構的總和(例如，複合物、雜合物及高甘露糖結構)加以測定，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297指位於Fc區域中約在位置297(Fc區域殘基的EU編號)的天冬醯胺殘基；然而，由於抗體中微小的序列變異，Asn297也可位於位置297的約+/-3個胺基酸上游或下游，即位置294及300之間。此類岩藻糖化變異體可具有改善的ADCC功能，請參照，例如，美國專利公開號2003/0157108(Presta, L.)；2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“去岩藻糖化的”或“岩藻糖缺乏的”抗體變異體的公開刊物的例子包含：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠生產去岩藻糖化的抗體的細胞系的例子包含蛋白岩藻糖化缺乏的Lecl3 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利公開號2003/0157108 A1，Presta,L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，特別是在實施例11)，以及敲除(knockout)細胞系，像是α-1,6-岩藻糖轉移酶基因、FUT8、敲除CHO細胞(請參照，例如，Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。

更提供具有等分(bisected)寡糖的抗體變異體，例如，其中附著至抗體Fc區域的二天線寡糖被GIcNAc等分。此類抗體變異體可具有降低的岩藻糖化及/或改善的ADCC功能。此類抗體變異體的例子描述於，例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美國專利號6,602,684(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)。也提供了在附著至Fc區域的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變異體。此類 抗體變異體可具有改善的CDC功能。此類抗體變異體描述於，例如WO 1997/30087(Patel等人)；W0 1998/58964(Raju,S)；及WO 1999/22764(Raju,S)。

c)Fc區域變異體

在一些特定的實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入至本文提供的抗體的Fc區域中，從而產生Fc區域變異體。Fc區域變異體可包括人類Fc區域序列(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區域)，其在一或多個胺基酸位置包括胺基酸修飾(例如，取代)。

在一些特定的實施例中，本發明設想具有一些但並非全部效應物(effector)功能的抗體變異體，這使得其為應用的理想的候選者，所述應用中抗體的體內半生期是重要的，然而特定效應物功能(像是補體及ADCC)為不必要或有害的。可進行體外及/或體內細胞毒性測定法以確認CDC及/或ADCC活性的降低/耗盡。例如，可進行Fc受體(FcR)結合分析法以確保抗體缺少Fc gamma R結合(因此可能缺少ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。調節ADCC的主要細胞，NK細胞，僅表達Fc gamma RIII，然而單核細胞表Fc gamma RI、Fc gamma RII及Fc gamma RIII。造血細胞上的FcR表達總結於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)的464頁上的表3中。用於評估感興趣的分子的ADCC活性的體外測定的非限制性例子描述於美國專利號5,500,362(請參照，例如Hellstrom,I.等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82：1499-1502 (1985)；美國專利號5,821,337(請參照，Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中。備或者，可採用非放射性測定法(請參照，例如，流式細胞術的ACT1^TM非放射性細胞毒性測定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；及CytoTox 96(註冊商標)非放射性細胞毒性測定法(Promega,Madison,WI))。用於此類測定法之有用的效應物細胞包含周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。替代地、或額外地，感興趣的分子的ADCC活性可在體內評估，例如在動物模型中，像是Clynes等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所公開。也可進行C1q結合分析法以確定抗體不能結合C1q並因此缺少CDC活性。請參照，例如，WO 2006/029879及WO 2005/100402中的C1q及C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可進行CDC測定法(請參照，例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.and M.J.Glennie，Blood 103：2738-2743(2004))。FcRn結合及體內清除/半生期測定也可使用本領域已知的方法進行(請參照，例如，Petkova,S.B.等人，Int'l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。

具有降低的效應物功能的抗體包含在Fc區域殘基238、265、269、270、297、327及329中的一或多個具有取代的那些抗體(美國專利號6,737,056)。此類Fc突變體包含在胺基酸位置265、269、270、297及327中的兩個或多個具有取代的Fc突變體，包含具有殘基265及297取代為丙胺酸的所謂的“DANA”Fc突變體(美國專利號7,332,581)。

對FcR具有增加或減少的結合之特定抗體變異體已被描述(請參照，例如美國專利號6,737,056；WO 2004/056312；及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。

在特定的一些實施例中，抗體變異體包括具有提高ADCC的一個或多個胺基酸取代的Fc區域，例如，在Fc區域的位置298、333及/或334(殘基的EU編號)的取代。

在一些實施例中，在Fc區域中形成改變，其導致改變的(即增加或減少的)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如美國專利號6,194,551、WO 99/51642，及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。

對新生兒Fc受體(FcRn)具有增加的半生期及增加的結合之抗體描述於US2005/0014934 A1(Hinton等人)中，所述新生兒Fc受體負責將母體IgG傳送至胎兒(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。那些抗體包括具有一個或多個取代於其中的Fc區域，其增加Fc區域對FcRn的結合。此類Fc變異體包含在Fc區域殘基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434的一或多個具有取代的那些，例如Fc區域殘基434的取代(美國專利號7,371,826)。

關於Fc區域變異體的其它例子，請亦參照Duncan和Winter，Nature 322：738-40(1988)；美國專利號US 5,648,260及US 5,624,821；及WO 94/29351。

d)半胱胺酸改造的抗體變異體

在一些特定的實施例中，產生半胱胺酸改造的抗體是理想的，例如，“thioMAb”，於其中抗體的一或多個殘基被半胱胺酸殘基所取代。在特別的實施例中，被取代的殘基存在於抗體的易接近位置。藉由以半胱胺酸取代那些殘基，從而將反應性硫醇基團放置於抗體的易接近位置並可用於偶聯抗體至其它部分，像是藥物部分或連接藥物部分，以創造免疫偶聯物，如本文中進一步所述。在一些特定的實施例中，下列殘基的任一或多個可被半胱胺酸取代：輕鏈的V205(Kabat編號)；重鏈的A118(EU編號)；及重鏈Fc區域的S400(EU編號)。半胱胺酸改造的抗體可以，例如美國專利號7,521,541，所述加以產生。

e)抗體衍生物

在一些特定的實施例中，本文提供的抗體可進一步被修飾，以包含本領域已知且容易獲得的額外的非蛋白質部分(moiety)。適於抗體的衍生化的部分包含，但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包含但不限於，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三(poly-1,3,6-trioxane)、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(同聚物或隨機共聚物)，及聚葡萄糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇同聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烷化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇、及其混合物。聚乙二醇丙醛可在生產中具有優勢由於其在水中的穩定性。多聚物可具有任一分子量，且可為分支或無分支的。附著於抗體的多 聚物的數目可不同，且如果附著多於一個多聚物，它們可以是相同或不同的分子。一般而言，用於衍生化的多聚物的數量及/或類型可根據，包含但不限於，考慮待改善的抗體的特別的性質或功能、抗體衍生物是否將在定義的條件下用於療法中等加以決定。

在另一實施例中，提供一抗體及可藉由暴露於輻射選擇性地被加熱的非蛋白質部分的偶聯物。在一實施例中，非蛋白質部分是碳納米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。輻射可具有任何波長，且包含但不限於，不傷害普通細胞的波長，但其加熱非蛋白質部分至接近抗體-非蛋白質部分的細胞被殺死之溫度。

f)pH依賴性抗體

在又一態樣中，本發明提供抗TGF-beta 1抗體，其表現pH依賴性結合特性。如本文所使用的，以“pH依賴性結合”表示的意思是“相較於在中性pH，在酸性pH減少對TGF-beta 1的結合”的抗體(對本揭露的目的而言，兩種表示可互換使用)。例如，“具有pH依賴性結合特性”的抗體包含在中性pH，以高於在酸性pH的親和性結合至TGF-beta 1的抗體。在特定的一些實施例中，本發明的抗體在中性pH，以至少高於在酸性pH達2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍之親和性結合至TGF-beta 1。在一些實施例中，此抗體結合至TGF-beta 1(例如，在pH7.4，以高於在pH5.8的親和性結合至潛伏性TGF-beta 1。在又一實施例中， 抗體在pH7.4，以至少高於在酸性pH5.8達2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍之親和性結合至TGF-beta 1)。

當抗原為可溶蛋白質時，抗體對抗原的結合可導致抗原在血漿中半生期的延長(即，減少抗原從血漿的清除)，因為抗體比抗原本身在血漿中可具有較長的半生期，且可作為抗原的載具。這起因於抗原-抗體複合物藉由FcRn透過細胞中胞內體路徑的回收利用(Roopenian，Nat.Rev.Immunol.7(9)：715-725(2007))。然而，具有pH依賴性結合特性的抗體，其在中性的細胞外環境中結合至它的抗原，而隨著其進入細胞中，釋放抗原至酸性的胞內體腔室中，上述具有pH依賴性結合特性的抗體被預期在抗原中和及清除的項目具有較優越的性能，相對於它以pH非依賴性方式結合的對應抗體(Igawa等人，Nature Biotechnol.28(11)：1203-1207(2010)；Devanaboyina等人，mAbs 5(6)：851-859(2013)；WO 2009/125825)。

抗體對TGF-beta 1的“親和性”，對本揭露之目的而言，以抗體的Kd表示。抗體結合至其抗原的Kd越高，其對此特定的抗原的結合活性越低。因此，如本文所使用，“在中性pH之親和性高於酸性pH”的表達(或者，同等的表達“pH依賴性結合”)指的是，抗體在酸性pH時，結合至TGF-beta 1的Kd大於抗體在中性pH時，結合至TGF-beta 1的Kd。例如，在本發明的背景中，認為抗體在中性pH，以高於酸性pH之親和性結合至TGF-beta 1，如果抗體在酸性pH時，結合至 TGF-beta 1的Kd至少大於抗體在中性pH時，結合至TGF-beta 1的Kd兩倍。因此，本發明包含抗體，此抗體在酸性pH時，以至少高於在中性pH時達2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍之Kd結合至TGF-beta 1。在另一實施例中，抗體在中性pH的Kd值可為10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或更小。在另一實施例中，抗體在酸性pH的Kd值可為10^-9M、10^-8M、10^-7M、10^-6M或更大。

B.重組方法及組合物

可使用重組方法及組合物產生抗體，例如，如美國專利號4,816,567中所述。在一實施例中，提供編碼本文所述的抗TGF-beta 1抗體的分離的核酸。此類核酸可編碼包括抗體的VL的胺基酸序列及/或包括抗體的VH的胺基酸序列(例如，抗體的輕及/或重鏈)。在又一實施例中，提供包括此類核酸的一或多個載體(例如，表達載體)。在又一實施例中，提供包括此類核酸的宿主細胞。在一此類實施例中，宿主細胞包括(例如已經轉化具有)：(1)載體，包括核酸，其編碼包括抗體的VL的胺基酸序列和包括抗體的VH的胺基酸序列，或(2)第一載體，包括核酸，其編碼包括抗體的VL的胺基酸序列，及第二載體，包括核酸，其編碼包括抗體的VH的胺基酸序列。在一實施例中，宿主細胞為真核生物，例如，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴球細胞(例如，Y0、NS0及Sp2/0細胞)。在一實施例中，提供製備抗TGF-beta 1抗體的方法，其中所述方法包括 在適於抗體的表達的條件下培養如上文提供之包括編碼抗體的核酸的宿主細胞，及可選地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。

為了抗TGF-beta 1抗體的重組生產，例如，如上文所述之編碼抗體的核酸，被分離並插入至一或多個載體中用於進一步選殖及/或在宿主細胞中表達。使用常規流程可容易地分離及定序此類核酸(例如，藉由使用寡核苷酸探針，其能夠特異性地結合至編碼抗體的重鏈及輕鏈的基因)。

用於編碼抗體的載體的選殖或表達的合適的宿主細胞包含本文所述的原核或真核細胞。例如，可在細菌中生產抗體，特別是當不需糖化及Fc效應物功能時。對於在細菌中表達抗體片段及多肽，請參照，例如，美國專利號5,648,237、美國專利號5,789,199及美國專利號5,840,523。(請亦參照，Charlton，Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254，其描述在大腸桿菌中抗體片段的表達)。在表達後，抗體可從可溶級分的細菌細胞糊中分離並可進一步純化。

除了原核生物，真核微生物像是絲狀真菌或酵母，是編碼抗體的載體的合適的選殖或表達宿主，包含真菌及酵母菌株，其糖化途徑已經“人源化”，導致具有部分或全部人類糖化模式的抗體之產生。請參照Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。

適於糖化抗體的表達之宿主細胞亦源自多細胞生 物(無脊椎生物及脊椎生物)。無脊椎生物細胞的例子包含植物及昆蟲細胞。已鑒定多種桿狀病毒株，其可與昆蟲細胞共同使用，特別地用於草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞的轉染(transfection)。

植物細胞培養物也可用作宿主。請參照，例如美國專利號5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978及6,417,429(描述用於在基因轉殖植物中產生抗體的PLANTIB0DIES^TM技術)。

脊椎動物細胞也可用作宿主。例如，可使用適應於懸浮液中生長的哺乳動物細胞系。有用的哺乳動物宿主細胞系的其它例子為經SV40轉化的猴腎臟CV1細胞系(COS-7)；人類胚胎腎臟細胞系(293或如，例如，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述之293細胞)；幼倉鼠腎臟細胞(BHK)；小鼠支持細胞(如，例如Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述的TM4細胞)；猴腎臟細胞(CV1)；非洲綠猴腎臟細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎臟細胞(MDCK；水牛鼠肝臟細胞(BRL 3A)；人類肺臟細胞(W138)；人類肝臟細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；如，例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述的TRI細胞；MRC 5細胞；及FS4細胞。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包含中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，其包含DHFR^-CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞系，像是Y0、NS0及Sp2/0。適合用於抗體產生的特定哺乳動物宿主細胞系的綜 述請參照，例如Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。

C.分析

可藉由本領域習知的各種分析法，辨識、篩選或表徵本文提供之抗TGF-beta 1抗體的物理/化學性質及/或生物活性。

1.結合分析及其它分析

在一態樣中，藉由習知方法，像是ELISA、西方點墨、表面電漿共振(surface plasmon resonance)(例如BIACORE(註冊商標))或類似的技術(例如KinExa或OCTET(註冊商標))等，測試本發明的抗體的抗原結合活性。

在另一態樣中，可使用競爭分析以辨識與本文所述的抗TGF-beta 1抗體，較佳為TBS139、TBS182、TBA1277、TBA1300和TBA1314，競爭結合至TGF-beta 1的抗體。在一些特定的實施例中，這類競爭抗體結合的抗原決定基(例如，線性或構象抗原決定基)與本文所述的抗TGF-beta 1抗體，較佳為TBS139、TBS182、TBA1277、TBA1300和TBA1314，結合的抗原決定基相同。用於定位抗體結合的抗原決定基之詳細示例性方法在Morris，(1996)“Epitope Mapping Protocols,”in Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。

在一些特定的實施例中，當這類競爭抗體存在過多時，其阻礙(例如降低)參考抗體對TGF-beta 1的結合至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%或更多。在一些例子中，抑制結合至少80%、85%、90%、95%或更多。在一些特定的實施例中，這類競爭抗體結合的抗原決定基(例如，線性或構型抗原決定基)與本文所述的抗TGF-beta 1抗體結合的抗原決定基相同。在又一態樣中，參考抗體為TBS139或TBS182。在又另一態樣中，參考抗體為TBA1277、TBA1300或TBA1314。

在示例性競爭分析中，固定的TGF-beta 1培養於溶液中，其包含結合至TGF-beta 1(例如TBS139、TBS182、TBA1277、TBA1300或TBA1314)的第一標記之抗體(參考抗體)以及測試其與第一抗體競爭結合至TGF-beta 1的能力的第二未標記之抗體。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為控制組，固定的TGF-beta 1培養於包括第一標記之抗體但不包括第二標記之抗體的溶液中。在允許第一抗體結合至TGF-beta 1的條件下培養後，移除過量未結合的抗體，以及測量與固定的TGF-beta 1結合的標記量。若相對於控制組樣品，在測試樣品中與固定的TGF-beta 1結合的標記量實質上減少，那麼其表示第二抗體與第一抗體競爭結合至TGF-beta 1。請參照，Harlow及Lane，(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。

在一些特定的實施例中，可藉由習知的方法，例如ELISA、西方點墨、BIAcore等，測試抗TGF-beta 1結合至細胞表面的潛伏性TGF-beta 1。例如，表現潛伏性TGF-beta 1的細胞可接觸與PE或APC偶聯的抗TGF-beta 1抗體，或接觸無偶聯的抗TGF-beta 1抗體，接著使用與PE或APC偶聯的二 級抗體，然後可偵測到細胞表面的潛伏性TGF-beta 1的染色。見，例如Oida等人，PloS One.2010 Nov 24；5(11)：e15523；Su等人，Hum Mol Genet.2015 Jul 15；24(14)：4024-36。

2.活性分析

在一態樣中，提供測定以辨識前述之抗TGF-beta 1抗體具有的生物活性。生物活性可包含，例如，抑制TGF-beta 1的活化、抑制成熟TGF-beta 1自潛伏性TGF-beta 1釋放、抑制蛋白酶介導成熟TGF-beta 1自潛伏性TGF-beta 1的釋放，但不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區的裂解、抑制蛋白酶介導成熟TGF-beta 1自潛伏性TGF-beta 1的釋放，但不阻礙蛋白酶接近潛伏性TGF-beta 1、抑制蛋白酶介導成熟TGF-beta 1自潛伏性TGF-beta 1的釋放，而允許蛋白酶裂解潛伏性TGF-beta 1的LAP區、抑制蛋白酶介導成熟TGF-beta 1自潛伏性TGF-beta 1的釋放，但不抑制或部分抑制整合素介導的TGF-beta 1的活化等。亦提供於體內及/或體外具有這類生物活性的抗體。

在一些特定的實施例中，測試發明的抗體的這類生物活性。

在一些實施例中，測試抗體是否抑制潛伏性TGF-beta 1的活化，換句話說，抑制成熟TGF-beta 1自潛伏性TGF-beta 1釋放，是藉由在測試抗體存在或不存在下，於潛伏性TGF-beta 1的活化劑(例如蛋白酶、整合素，其它非蛋白酶的活化劑等)與潛伏性TGF-beta 1接觸之後，利用所屬技術領域習知的方法，如電泳、層析、免疫點墨分析、酶連接免疫吸 附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)或質譜分析偵測成熟TGF-beta 1加以判定。也已知的是，在活化劑不存在下，也發生潛伏性TGF-beta 1的活化(潛伏性TGF-beta 1的自發性活化)，亦即是，成熟TGF-beta 1自潛伏性TGF-beta 1釋放。在一些實施例中，測試是否抑制潛伏性TGF-beta 1的自發性活化，是藉由在潛伏性TGF-beta 1與測試抗體培養或不與測試抗體培養之後，利用前文所述的方法偵測成熟TGF-beta 1加以判定。在一些實施例中，在測試抗體存在(或接著接觸測試抗體)的情況下，相較於測試抗體不存在下所偵測到的量，若偵測到成熟TGF-beta 1的量減少，則該測試抗體被認定為可抑制潛伏性TGF-beta 1活化的抗體。在一例子中，成熟TGF-beta 1的量，減少或增加，可用成熟TGF-beta 1的濃度(例如，g/ml、mg/ml、microgram/ml、ng/ml或pg/ml等)測量。在另一例子中，成熟TGF-beta的量，減少或增加，可用與成熟TGF-beta直接或間接相關的標記的光密度(optical density，O.D.)(例如，以mm或nm的波長等)測量。

在一些特定實施例中，相較於在類似條件下的負控制組，在此分析中，抑制TGF-beta 1的活化包含減少至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或更多成熟TGF-beta 1的量。在一些實施例中，其指的是抑制TGF-beta 1的活化，換句話說，抑制至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多成熟TGF-beta 1的釋放。

在一些實施例中，測試抗體是否抑制潛伏性TGF-beta 1的活化，換句話說，抑制成熟TGF-beta 1自潛伏性 TGF-beta 1釋放，也是藉由偵測成熟的TGF-beta 1活性進行判定，例如，對TGF-beta 1受體的結合活性、或在表達TGF-beta 1受體的細胞等中介導訊號傳導的活性。在一些實施例中，可使用受體結合分析，偵測TGF-beta 1對TGF-beta 1受體的結合。在一些實施例中，可藉由偵測TGF-beta 1/Smad途徑的活化，測定介導TGF-beta 1訊號傳導的活性。有益於這些分析的細胞可為表達內源TGF-beta 1受體的那些，或細胞轉染TGF-beta 1受體基因。例如，可使用在操作實施例中所使用的HEK-Blue^TMTGF-beta 1細胞，或可為經短暫地或穩定地基因修飾以表達編碼TGF-beta 1受體的轉殖基因的那些。訊號傳導途徑中任一程度之TGF-beta 1介導的訊號傳導可被偵測，例如，藉由檢視Smad多肽的磷酸化、檢視TGF-beta 1調節的基因(包含報導基因)的表達、或測量TGF-beta 1依賴性細胞的增殖。

在一些實施例中，也可藉由偵測TGF-beta 1/Smad途徑的活化、藉由檢視Smad多肽的磷酸化(見，例如Fukasawa等人，Kidney International.65(1)：63-74(2004)和Ganapathy等人，Molecular Cancer 26；9：122(2010))，測定介導TGF-beta 1訊號傳導的活性。在另一些實施例中，可藉由檢視TGF-beta抑制“受傷的”單層培養的BAE細胞的細胞遷移(cell migration)的能力、檢視TGF-beta抑制細胞生長的能力、檢視TGF-beta抑制血纖維蛋白溶酶原活化劑(plasminogen activator，PA)活性的能力、檢視TGF-beta上調血纖維蛋白溶酶原活化子抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)的能力等(見，Mazzieri等人，Methods inMolecular Biology 142： 13-27(2000))，測定介導TGF-beta 1訊號傳導的活性。

TGF-beta 1活化的抑制亦可使用操作實施例中例舉及示例的方法進行偵測及/或測量。利用這些或其它合適類型的分析，測試抗體可被篩選為能夠抑制TGF-beta 1的活化的那些。在一些特定實施例中，相較於相似條件下的負控制組，TGF-beta 1活化的抑制包含，在測定中TGF-beta 1的活性減少至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%、或更多。在一些實施例中，其代表TGF-beta 1的活化抑制至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%、或更多。在一些特定實施例中，相較於相似條件下的負控制組，TGF-beta 1活化的抑制包含，在測定中成熟TGF-beta 1的量減少至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%、或更多的。在一些實施例中，其代表成熟TGF-beta 1的量減少至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%、或更多。

在一些實施例中，測試抗體是否抑制LAP部的裂解，是藉由偵測潛伏性TGF-beta 1的裂解產物和/或非裂解的潛伏性TGF-beta 1進行判定，其在測試抗體存在或不存在下，於蛋白酶與潛伏性TGF-beta 1接觸之後，利用所屬領域習知的方法，如電泳、層析、免疫點墨分析、酶連接免疫吸附測定(ELISA)或質譜分析進行。例如，蛋白標記(例如FLAG標記等)加至潛伏性TGF-beta 1的LAP區的N末端，當蛋白酶介導的裂解發生時，被蛋白標記加入的部分被切下。因此，可在沒有蛋白標記下，藉由偵測潛伏性TGF-beta 1(或潛伏性TGF-beta 1 的LAP區)，偵測潛伏性TGF-beta 1的裂解產物；和/或可在有蛋白標記下，藉由偵測潛伏性TGF-beta 1，偵測無裂解的潛伏性TGF-beta 1。

例如，蛋白標記(例如FLAG標記等)加至潛伏性TGF-beta 1的LAP區的N末端，且蛋白酶裂解位的位置不靠近潛伏性TGF-beta 1的潛伏性相關胜肽區的N末端，當蛋白酶介導的裂解發生時，具有蛋白標記的LAP區變短。因此，可藉由偵測具有變短的LAP區的潛伏性TGF-beta 1，其有蛋白標記(或偵測潛伏性TGF-beta 1的變短的LAP區)，偵測潛伏性TGF-beta 1的裂解產物。

在一些實施例中，相較於測試抗體不存在下所偵測的量，在測試抗體存在下(或接著與測試抗體接觸)，偵測到潛伏性TGF-beta 1的裂解產物的量減少，則測試抗體被鑒定為可抑制潛伏性TGF-beta 1的裂解的抗體。相反地，相較於測試抗體不存在下所偵測的量，在測試抗體存在下(或與測試抗體接觸)，潛伏性TGF-beta 1的裂解產物的量沒有顯著減少，則測試抗體被鑒定為不會抑制潛伏性TGF-beta 1的裂解的抗體。在一些實施例中，相較於測試抗體不存在下所偵測的量，在測試抗體存在下(或接著與測試抗體接觸)，偵測到無裂解的潛伏性TGF-beta 1的量增加，則測試抗體被鑒定為可抑制潛伏性TGF-beta 1的裂解的抗體。相反地，相較於測試抗體不存在下所偵測的量，在測試抗體存在下(或接著與測試抗體接觸)，無裂解的潛伏性TGF-beta 1的量沒有顯著增加，則測試抗體被鑒定為不會抑制潛伏性TGF-beta 1的裂解的抗體。在一些特定 實施例中，測試抗體是否阻礙蛋白酶接近潛伏性TGF-beta 1，是藉由蛋白酶和潛伏性TGF-beta 1之間的蛋白質交互作用的偵測方法來判定，例如ELISA或表面電漿共振(例如BIACORE(註冊商標))或類似的技術(例如KinExa或OCTET(註冊商標))。相較於測試抗體不存在下所偵測的交互作用，在測試抗體存在下(或接著與測試抗體接觸)，偵測到蛋白酶和潛伏性TGF-beta 1之間的交互作用減少，則測試抗體被鑒定為可阻礙蛋白酶接近潛伏性TGF-beta 1的抗體。

在一些特定實施例中，相較在相似條件下的負控制組，不抑制潛伏性TGF-beta 1的裂解包含在測定中，潛伏性TGF-beta 1的裂解產物的量的減少至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%、或更多。在一些實施例中，相較於相似條件下的負控制組，不抑制潛伏性TGF-beta 1的裂解包含在測定中，無裂解的潛伏性TGF-beta 1的量的增加至少50%或更少、45%或更小、40%或更少、35%或更少、30%或更少、25%或更少、20%或更少、15%或更少、10%或更少、5%或更少。

3.篩選方法

在一態樣中，本發明的抗體的篩選方法包含各種本文所述的分析，和所屬領域習知的方法。例如，抗TGF-beta 1抗體的篩選方法包含：(a)將生物樣品與測試抗體接觸，生物樣品包含潛伏性TGF-beta 1以及蛋白酶；(b)偵測(i)測試抗體是否抑制潛伏性TGF-beta 1的LAP 區的裂解和(ii)測試抗體是否抑制潛伏性TGF-beta 1的活化；以及(c)選擇測試抗體，其抑制自潛伏性TGF-beta 1的活化，而不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP部的裂解。

或者，不是上述步驟(b)和(c)，抗TGF-beta 1抗體的篩選方法包含，例如以下步驟(b)和(c)：(b)量測(i)無裂解的潛伏性TGF-beta 1的量和(ii)成熟TGF-beta 1的量；以及(c)相較於無測試抗體的情況下，如果無裂解的潛伏性TGF-beta 1的量未顯著增加，且成熟TGF-beta 1的量減少，選擇抑制蛋白酶介導成熟TGF-beta 1自潛伏性TGF-beta 1的釋放而不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區的裂解的測試抗體。

或者，不是上述步驟(b)和(c)，抗TGF-beta 1抗體的篩選方法包含，例如以下步驟(b)和(c)：(b)測量(i)潛伏性TGF-beta 1的裂解產物的量和(ii)成熟TGF-beta 1的活性程度；以及(c)相較於無測試抗體的情況下，如果裂解產物的量未顯著減少，且成熟TGF-beta 1的活性程度減少，選擇抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化而不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區的裂解的測試抗體。再者，除了上述步驟(a)至(c)以外，本發明提供抗TGF-beta 1抗體的生產方法，其包含例如以下步驟(d)和(e)：(d)獲得選自步驟(c)的抗TGF-beta 1抗體的胺基酸序列 資訊；以及(e)將編碼抗TGF-beta 1抗體的基因引入宿主細胞。

在本文中，用語“未顯著增加/減少”，例如在詞組“無裂解的潛伏性TGF-beta 1的量未顯著增加”和“(潛伏性TGF-beta 1的)裂解產物的量未顯著減少”中，意思是增加/減少的程度(level/degree)可為零，或可不為零但接近零，或可為小到足以被技術性忽略，或大致上(realistically/substantially)被本發明所屬技術領域中具有通常知識者視為零。例如，在免疫點墨分析中，當研究員無法偵測或觀察到任何無裂解的潛伏性TGF-beta 1的顯著訊號或條帶(或相對高或強的訊號)，則無裂解的潛伏性TGF-beta 1的量被認為“未顯著增加”，或(潛伏性TGF-beta 1的)裂解產物的量被認為“未顯著減少”。此外，用語“未顯著增加/減少”與用語“大致上未增加/減少”可互換使用。

在一些實施例中，測試抗體是否抑制潛伏性TGF-beta 1的LAP區的裂解，及測試抗體是否抑制潛伏性TGF-beta 1的活化，其可藉由本文所述的各種分析和本領域習知的方法進行判定。

D.免疫偶聯物

本發明亦提供免疫偶聯物，其包括本文之抗TGF-beta 1抗體偶聯至一或多個細胞毒性劑，例如，化療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物來源的蛋白毒素、酶活性毒素、或其片段)或放射性同位素。

在一實施例中，免疫偶聯物是抗體-藥物偶聯物 (ADC)，其中抗體與一或多種藥物偶聯，包含但不限於美登木素生物鹼(maytansinoid)(請參照，美國專利號5,208,020、5,416,064及歐洲專利EP 0 425 235 B1)；auristatin例如單甲基auristatin藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(請參照，美國專利號5,635,483及5,780,588及7,498,298)；尾海兔素(dolastatin)；加利車黴素(calicheamicin)或其衍生物(請參照，美國專利號5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001及5,877,296；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽環類抗生素例如道諾黴素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(請參照Kratz等人，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美國專利號6,630,579)；甲氨蝶呤；長春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)例如多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、Iarotaxel、tesetaxel、及ortataxe；單端孢黴素(trichothecene)；及CC1065。

在另一實施例中，免疫偶聯物包括如本文所述的抗體偶聯至酶活性毒素或其片段，其包含但不限於白喉A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒 蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、α-帚曲毒蛋白(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolacca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、白樹毒蛋白(gelonin)、米托黴素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)和單端孢黴素(tricothecene)。

在另一實施例中，免疫偶聯物包括本文所述的抗體偶聯至放射性原子以形成放射性偶聯物。多種放射性同位素可用於製造放射性偶聯物。例子包含²¹¹At,¹³¹I,¹²⁵I,⁹⁰Y,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,¹⁵³Sm,²¹²Bi,³²P,²¹²Pb及Lu的放射性同位素。在使用放射性偶聯物進行檢測時，它可包括供閃爍法研究用的放射性原子，例如Tc-99m或¹²³I，或供核磁共振(NMR)成像(又稱為磁共振成像，MRI)用的自旋標記物，例如再次的碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。

可使用多種雙功能蛋白偶合劑以形成抗體及細胞毒劑的偶聯物，例如N-琥珀醯亞氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞氨基-4-(N-馬來醯亞氨基甲基)環己烷-I-羧酸酯(SMCC)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(例如鹽酸己二醯亞氨酸二甲酯)的雙功能衍生物、活性酯類(例如辛二酸二琥珀醯亞氨基酯)、醛類(例如戊二醛)、雙疊氮化合物(例如雙(對-疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(例如雙(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)、及雙活 性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述製備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸苄基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用於將放射性核種(radionuclide)與抗體偶聯的示例性螯合劑。請參照WO94/11026。連接子(linker)可為有利於在細胞中釋放細胞毒性藥物的“可切割連接子”。例如，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫化物連接子(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利號5,208,020)。

本文的免疫偶聯物或ADC明確設想，但不限於用交聯劑製備的此類偶聯物，所述交聯劑包含但不限於BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、及sulfo-SMPB，及SVSB(琥珀醯亞氨基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，其為市售的(例如，取自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。

E.用於診斷及偵測的方法及組合物

在一些特定實施例中，本文提供之任一抗TGF-beta 1抗體對偵測TGF-beta 1，例如潛伏性TGF-beta 1在生物樣品中的存在是有用的。用詞“偵測”，如本文所使用，涵蓋定量或定性偵測/測量。在一些特定實施例中，生物樣品包括細胞或組織，例如血清、全血液、血漿、切片樣品、組織樣品、細胞懸浮液、唾液、痰、口腔液、腦脊髓液、羊膜液、腹水、乳汁、初乳、 乳腺分泌物、淋巴、尿液、汗、淚液、胃液、關節液、腹腔液、眼內液和黏液。

在一實施例中，提供用於診斷或偵測方法中的用途的抗TGF-beta 1抗體。在又一態樣中，提供在生物樣品中偵測TGF-beta 1，例如潛伏性TGF-beta 1的存在的方法。例如，偵測潛伏性TGF-beta 1的存在的方法包括：(a)在允許抗TGF-beta 1抗體結合至潛伏性TGF-beta 1的條件下，使生物樣品與本發明所述之抗TGF-beta 1抗體接觸；以及(b)偵測是否有複合物形成於抗TGF-beta 1抗體及潛伏性TGF-beta 1之間。

此種方法可為體外或體內的方法。在一實施例中，抗TGF-beta 1抗體被用於選擇適合抗TGF-beta 1抗體療法的對象，例如，在TGF-beta 1(例如，潛伏性TGF-beta 1)為用於選擇患者的生物標記的情況下。換句話說，抗TGF-beta 1抗體作為標記TGF-beta 1的診斷試劑是有用的。

更具體地說，抗TGF-beta 1抗體對纖維化的診斷是有用的，較佳用於心肌纖維化、肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化，皮膚纖維化、眼纖維化和骨髓纖維變性的診斷。本發明的抗TGF-beta 1抗體亦對癌症的診斷是有用的。

在一些實施例中，本發明提供方法，其在生物樣品中，抑制成熟TGF-beta 1自潛伏性TGF-beta 1釋放，但不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的潛伏性相關胜肽(LAP)區的裂解，方法包含在允許抗TGF-beta 1抗體結合至潛伏性 TGF-beta 1的條件下，使含有潛伏性TGF-beta 1的生物樣品與如本發明所述之抗TGF-beta 1抗體接觸。

在一些特定實施例中，例如為了偵測/診斷目的，提供標記的抗TGF-beta 1抗體。標記包含但不限於，直接被偵測的標記或部分(例如，螢光、發色、電子密集、化學發光及放射性標記)，以及間接(例如藉由酶反應或分子相互作用)被偵測的部分，像是酶或配體。示例性標記包含但不限於，放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H及¹³¹I、螢光團如稀土螯合物或螢光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯(dansyl)、傘形酮(umbellifeixme)、螢光素酶(luceriferase)，例如，螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶(美國專利號4,737,456)、螢光素(luciferin)、2,3-二氫酞嗪二酮、辣根過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶、beta-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶解酶、糖類氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、雜環氧化酶如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，結合利用過氧化氫以氧化染料前驅物的酶如HRP、乳過氧化酶、或微過氧化酶(microperoxidase)、生物素/親和素、自旋標記物、噬菌體標記、穩定的自由基等。

F.醫藥配方

如本文所述的抗TGF-beta 1抗體的醫藥配方藉由將具有所需程度純度的這種抗體與一或多種可選的醫藥上可接受的載體(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))混合，以凍乾配方或水溶液的形式製備。醫藥上可接受的載體通常在所使用的劑量及濃度對接受者無毒，且包 含但不限於：緩衝劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑，包含抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(如氯化十八烷基二甲基苄銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚；丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，如甘胺酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；單糖、雙糖和其它糖類，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽平衡離子，如鈉；金屬複合體(例如Zn-蛋白質複合體)；及/或非離子表面活性劑，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性醫藥上可接受的載體尚包含藥物間質分散劑，如可溶性中性-活性透明質酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人類可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，如rHuPH20(HYLENEX(註冊商標)，Baxter International,Inc.))。特定的示例性sHASEGP及使用方法，包含rHuPH20，描述於美國專利公開號2005/0260186及2006/0104968中。在一態樣中，sHASEGP與一或多種額外的葡糖胺聚糖酶，例如軟骨素酶，組合。

示例性凍乾的抗體配方描述於美國專利號6,267,958中。水溶液抗體配方包含描述於美國專利號6,171,586及WO 2006/044908中的那些，後者配方包含組胺酸-醋酸鹽緩衝液。

本文的配方亦可包含多於一種的活性成分，若為 被治療的特定適應症所需，較佳地具有不會不利地影響彼此的互補活性的那些活性成分。例如，進一步提供免疫檢查哨抑制劑是可期望的，例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD160、CD57、CD244、LAG-3、CD272、KLRG1、CD26、CD39、CD73、CD305、TIGIT、TIM-3或VISTA。此種活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。

可將活性成分截留於例如藉由凝聚技術或藉由介面聚合所製備的微膠囊中，例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，分別地，在膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或在粗滴乳狀液中。這類技術揭露於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)中。

可製備持續釋放配方。持續釋放配方的合適例子包含含有抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質，所述基質呈成形物品，例如薄膜或微膠囊形式。

將被用於體內施用的配方通常為無菌的。無菌可例如，藉由通過無菌過濾膜的過濾，而輕易地實現。

G.治療方法和組合物

本文提供的任一抗TGF-beta 1抗體可用於治療方法。

在一態樣中，提供用作藥物的抗TGF-beta 1抗體。在又一態樣中，提供用於治療癌症或纖維化(例如肝纖維化、腎纖維化或肺纖維化)等的抗TGF-beta 1抗體。在一些特定的實施例中，提供用於治療方法中的抗TGF-beta 1抗體。在一些特定的實施例中，本發明提供抗TGF-beta 1抗體，其用於治療具有癌 症或纖維化(例如肝纖維化、腎纖維化或肺纖維化)等的個體的方法，所述方法包括對個體施用有效量的抗TGF-beta 1抗體。在這樣一實施例中，所述方法尚包括對個體施用有效量的至少一種額外的治療劑，例如如下文所述。在又一些實施例中，發明提供用於抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化的用途的抗TGF-beta 1抗體。在一些特定實施例中，發明提供抗TGF-beta 1抗體，其使用於在個體中抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化的方法，包括施用有效量的抗TGF-beta 1抗體於個體以抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化。根據以上任一實施例，“個體”較佳為人類。

在又一態樣中，本發明提供抗TGF-beta 1抗體在生產或製備藥物中的用途。在一實施例中，藥物是用於癌症或纖維化(例如肝纖維化、腎纖維化或肺纖維化)等的治療。在又一實施例中，藥物是用於治療癌症或纖維化(例如肝纖維化、腎纖維化或肺纖維化)等的方法中，其包括向具有癌症或纖維化(例如肝纖維化、腎纖維化或肺纖維化)等的個體施用有效量的藥物。在一這樣實施例中，所述方法更包括對個體施用有效量的至少一種額外的治療劑，例如如下文所述。在又一實施例中，藥物是用以抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化。在又一實施例中，藥物是使用於在個體中抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化的方法，包括施用有效量的藥物於個體以抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化。根據以上任一實施例，“個體”可為人類。

在另一態樣中，發明提供用於治療癌症或纖維化 (例如肝纖維化、腎纖維化或肺纖維化)等的方法。在一實施例中，方法包括向具有所述癌症或纖維化(例如肝纖維化、腎纖維化或肺纖維化)等的個體施用有效量之本文提供的抗TGF-beta 1抗體。在一實施例中，所述方法更包括對個體施用有效量的至少一種額外的治療劑，如下文所述。根據以上任一實施例，“個體”可為人類。

在又一態樣中，發明提供用於在個體中抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化的方法。在一實施例中，方法包括對個體施用有效量之本文提供的抗TGF-beta 1抗體，以抑制潛伏性TGF-beta 1的蛋白酶介導的活化。在一實施例中，“個體”為人類。

在又一態樣中，發明提供醫藥配方，其包括任一本文提供的抗TGF-beta 1抗體，例如，用於任一以上的治療方法。在一實施例中，醫藥配方包括任一本文提供的抗TGF-beta 1抗體及醫藥上可接受的載體。在另一實施例中，醫藥配方包括任一本文提供的抗TGF-beta 1抗體以及至少一種額外的治療劑，例如如下文所述。

在治療中，本發明的抗體可被單獨使用或與其它試劑組合使用。例如，本發明的抗體可與至少一種額外的治療劑共同施用(co-administered)。在一些特定實施例中，額外的治療劑為免疫檢查哨抑制劑，例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD160、CD57、CD244、LAG-3、CD272、KLRG1、CD26、CD39、CD73、CD305、TIGIT、TIM-3或VISTA。

如上述這樣的組合療法包含組合施用(其中兩種 或更多的治療劑被包含在相同或分開的配方中)，及分別施用，在這情況下，發明的抗體的施用可以發生在額外的治療劑及/或試劑的施用前、同時及/或之後。在一實施例中，抗TGF-beta 1抗體的施用及額外治療劑的施用在約一個月內，或約一、二或三個星期內，或約一、二、三、四、五或六天內彼此發生。本發明的抗體也可與放射治療組合使用。

本發明的抗體(及任何額外的治療劑)可藉由任何合適的方法施用，包含腸胃外施用、肺內施用及鼻內施用，並且，若局部治療需要，病變內施用。腸胃外輸注包含肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。在一定程度上根據用藥是短期或長期性而定，可藉由任何適合途徑，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射用藥。本文中涵蓋各種用藥時程，包含但不限於，單次施用或在多個時間點多次施用、推注施用及脈衝輸注。

發明的抗體會與良好醫療實踐相符的方式進行配方、配量及施用。在此背景下考慮的因素包含待治療的特定病症、待治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床狀態、病症的原因、遞送試劑的位置、施用方法、施用時間安排、及醫療從業者已知的其它因素。抗體不需要、但可選地，與目前用於預防或治療問題病症的一或多種試劑一起配製。其它試劑的有效量取決於配方中存在的抗體量、病症或治療的類型、及以上討論的其它因素。這些一般以相同劑量，及使用如本文所述的施用途徑，或以本文所述的劑量的約1至99%，或以藉由經驗/臨床確定合適的任一劑量及任一途徑加以使用。

為了疾病的預防或治療，本發明的抗體的合適劑量(當單獨或與一或多種其它額外的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、抗體的種類、疾病的嚴重性及進程、抗體是否以預防或治療目的施用、以前的治療、患者的臨床病史和對抗體的反應、及主治醫師的判斷。發明的抗體以一次性治療或經過一系列治療合適地施用於患者。根據疾病的類型及嚴重性，約1micro g/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的抗體可為用於對患者施用的最初候選劑量，無論，例如，藉由一次或多次分別施用，或藉由連續輸注。一典型的每日劑量可在約1micro g/kg至100mg/kg或更多的範圍內，其取決於上文提及的因素。為了重複施用數日或更久，根據病症，通常將持續治療直至出現疾病症狀的理想抑制。抗體的一示例性劑量應為約0.05mg/kg-約10mg/kg的範圍內。因此，約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意組合)的一或多個劑量可施用於患者。這樣的劑量可間隔地，例如每週或每三周施用(例如，以使得患者接受約2至約20，或例如約6個劑量的抗體)。可施用最初較高的負荷劑量，接著是一或多個較低的劑量。然而，其它劑量療法可能是有用的。此療法的進展可藉由常規方法及測定容易進行監測。

H.製品

在發明的另一態樣中，提供一種製品，其包含可用於治療、預防及/或診斷上述病症的材料。製品包括容器及於容器上或與容器結合的標籤或藥品仿單(package insert)。適合的容器包含，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液包等。容器可 由各種材料如玻璃或塑膠製成。容器裝有組合物，所述組合物是單獨地或與可有效用於治療、預防及/或診斷病症的另一組合物結合，對於症狀的治療有效的組合物，且可具有無菌的存取口(例如，容器可具有可被皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中至少一活性成分為本發明的抗體。標籤或藥品仿單標明組合物是用於治療特定的病症。此外，所述製品可包含(a)包含組合物於其中的第一容器，其中組合物包括本發明的抗體；及(b)包含組合物於其中的第二容器，其中組合物包括另外的細胞毒性劑或其它的治療劑。在本發明的此實施例中的製品，可更包括標明組合物可用於治療特定症狀的藥品仿單。替代地或額外地，製品可更包括第二(或第三)容器，其包括醫藥上可接受的緩衝劑，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer氏溶液及葡萄糖溶液。從商業及用戶立場，它尚可包涵所需的其它材料，包含其它緩衝劑、稀釋劑、濾膜、針頭及注射器。

應理解的是，上述任一製品可包含本發明的免疫偶聯物以替代或添加至抗TGF-beta 1抗體。

【實施例】

以下為本發明的方法及組合物的例子。應理解的是，根據以上提供的一般性描述，可實施多種其它的實施例。

實施例1：人類或小鼠潛伏性TGF-beta 1及小鼠潛伏性相關胜肽(LAP)之表達及純化

用於表達及純化的序列為：人類潛伏性TGF-beta 1(序列辨識號：45、46)及小鼠潛伏性TGF-beta 1(序列辨識號：47、 48)，兩者皆具有來自於大鼠血清白蛋白(albumin)的訊號序列(序列辨識號：49)、C33S突變及Flag標記於LAP的N末端。

利用FreeStyle293-F或Expi293F細胞系(Thermo Fisher Schientific)短暫地表達Flag標記的人類潛伏性TGF-beta 1(本文中亦稱之為“重組人類潛伏性TGF-beta 1”)或Flag標記的小鼠潛伏性TGF-beta 1(本文中亦稱之為“重組小鼠潛伏性TGF-beta 1”)。將表達人類或小鼠潛伏性TGF-beta 1的條件培養基施用於裝填抗Flag M2親和性樹脂(Sigma)的管柱中，且以Flag胜肽(Sigma)洗提潛伏性TGF-beta 1。收集包含人類或小鼠潛伏性潛伏性TGF-beta 1的級分(fraction)，接著施加於經1x PBS平衡的Superdex 200膠體過濾管柱(GE healthcare)。收集包含人類或小鼠重組潛伏性TGF-beta 1的級分並儲存於-80℃。

N末端Flag標記的小鼠LAP(序列辨識號：50、51)(本文中亦稱為“重組小鼠潛伏性相關蛋白(LAP)”)(序列辨識號：1)的表達及純化以和人類或小鼠重組潛伏性轉形TGF-beta 1相同之方法實行。

實施例2：抗潛伏性TGF-beta 1抗體的辨識

以下列方式製備、選擇及分析本發明的抗體：以N末端Flag標記的重組潛伏性TGF-beta 1或N末端Flag標記的小鼠重組TGF-beta 1潛伏性相關蛋白(50-100microgram/劑量/兔)皮內地免疫12至16周大的NZW兔。在2個月的期間重複此劑量4次。在最後一次免疫的一星期後，收集經免疫的兔子的脾臟及血液。以NHS-PEG4-Biotin(PEIRCE,Cat No.21329)標 記人類重組潛伏性TGF-beta 1，且抗原特異性的B細胞用標記的抗原染色，並被FCM細胞分選器分選(FACS aria III,BD)，以1個細胞/孔的密度與25,000個細胞/孔的EL4細胞(European Collection of Cell Cultures)一起分盤於96孔盤中，且以兔子T細胞條件培養基稀釋20倍，並培養7-12天。預先以絲裂黴素C(mitomycin C)(Sigma,Cat No.M4287)處理EL4細胞2小時並清洗3次。藉由培養兔子胸腺細胞於包含植物血球凝集素-M(Roche,Cat No.1 1082132-001)、佛波醇12-肉荳蔻酸酯13-乙酸酯(Sigma,Cat No.P1585)及2% FBS的RPMI-1640中以製備兔子T細胞條件培養基。在培養後，收集B細胞培養上清液供進一步分析，以及冷凍保存沉澱物(pellet)。

使用ELISA分析以測試B細胞培養上清液中抗體的特異性。將人類或小鼠重組潛伏性TGF-beta 1被覆於384孔MAXISorp(Nunc,Cat No.164688)上，在16nM的PBS中放置常溫1小時。接著以稀釋5倍的Blocking One(Nacalai Tesque,Cat No.03953-95)阻斷盤。以具有0.05% Tween-20的Tris緩衝鹽水(Tris-buffered Serine with 0.05% Tween-20，TBS-T)清洗。將B細胞培養上清液加至ELISA盤，培養1小時並以TBS-T清洗。藉由山羊的抗-兔子IgG-辣根過氧化酶(BETHYL,Cat No.A120-111P)接著加入ABTS(KPL,Cat No.50-66-06)進行結合的偵測。

總共篩選8,560個B細胞系對老鼠及/或人類潛伏性TGF-beta 1的結合特異性，188個系被選擇且指定為TBS001至TBS118。使用ZR-96 Quick-RNA套組(ZYMO RESEARCH, Cat No.R1053)由對應的細胞沉澱物純化RNA。藉由反轉錄PCR將其重鏈可變區的DNA放大，並與mF18或F1332m重鏈恆定區(序列辨識號：52、53)重組。藉由反轉錄PCR將其輕鏈可變區的DNA放大，並與mk1或hk0MC輕鏈恆定區(序列辨識號：54、55)重組。利用FreeStyle^TM FS293-F細胞(Invitrogen)表達選殖的抗體，且從培養基上清液純化選殖的抗體，以評估其功能活性。

實施例3：抗潛伏性TGF-beta 1抗體生成之抗體篩選

使用偵測成熟TGF-beta 1的ELISA(Human TGF-beta 1 Quantikine ELISA套組，R&D system)，以評估血漿激肽釋放酶原(prekallikrein)和血纖維蛋白溶酶介導的TGF-beta 1的活化。在有或沒有抗潛伏性TGF-beta 1抗體的存在下，將小鼠重組潛伏性TGF-beta 1與人類血漿激肽釋放酶原(Enzyme Research Laboratories)或血纖維蛋白溶酶(Calbiochem)一同培養於37℃一個小時。利用前文所述的ELISA，分析混合物中成熟TGF-beta 1的含量。前述偵測是根據製造商的步驟所進行。篩選出抗潛伏性TGF-beta 1抗體(例如TBS139、TBS182、TBA865和TBA873)，其對血漿激肽釋放酶原和血纖維蛋白溶酶介導的TGF-beta 1的活化具有抑制活性。TBS139的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如序列辨識號：56和57所示，TBS182的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如序列辨識號：58和59所示，TBA865的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如序列辨識號：60和61所示，且TBA873的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別如 序列辨識號：62和63所示。再者，TBS139和TBS182的可變區(VR)和CDR(HVR)的胺基酸序列如下所示。

表3

實施例4：重組抗體的表達及純化

利用FreeStyle293-F或Expi293F細胞系(Thermo Fisher Schientific)短暫地表達重組抗體。使用蛋白質A或蛋白質G，以傳統方法從表達抗體的條件培養基進行純化。進一步進行膠體過濾，如果有必要的話。

實施例5：抗潛伏性TGF-beta 1抗體的性質分析

1.抗潛伏性TGF-beta 1抗體抑制血漿激肽釋放酶原和血纖維蛋白溶酶介導的TGF-beta 1的活化

在有或沒有抗潛伏性TGF-beta 1抗體(TBS139、TBS182、TBA865或TBA873)的存在下，將小鼠重組潛伏性TGF-beta 1與人類血漿激肽釋放酶原(Enzyme Research Laboratories)或血纖維蛋白溶酶(Calbiochem)一同培養於37℃一個小時。根據製造商的步驟，利用成熟TGF-beta 1的ELISA(Human TGF-beta 1 Quantikine ELISA套組，R&D system)，分析血漿激肽釋放酶原 和血纖維蛋白溶酶介導的TGF-beta 1的活化以及抗體介導的抑制。如第1圖所示，血漿激肽釋放酶原和血纖維蛋白溶酶介導的TGF-beta 1的活化被抗潛伏性TGF-beta 1抗體(TBS139、TBS182、TBA865和TBA873)抑制。

2.抗潛伏性TGF-beta 1抗體抑制TGF-beta 1自發性的活化

在有或沒有抗潛伏性TGF-beta 1抗體(TBS139、TBS182、TBA865和TBA873)的存在下，將小鼠重組潛伏性TGF-beta 1於37℃下培養一個小時。根據製造商的步驟，利用成熟TGF-beta 1的ELISA(Human TGF-beta 1 Quantikine ELISA套組，R&D system)，分析TGF-beta 1的自發性活化。如第2圖所示，TGF-beta 1的自發性活化被抗潛伏性TGF-beta 1抗體(TBS139、TBS182、TBA865和TBA873)抑制。

3.抗潛伏性TGF-beta 1抗體抑制血漿激肽釋放酶原和血纖維蛋白溶酶介導的TGF-beta 1原胜肽的裂解

在有或沒有抗潛伏性TGF-beta 1抗體(TBS139、TBS182、TBA865或TBA873)的存在下，將小鼠重組潛伏性TGF-beta 1與人類血纖維蛋白溶酶(Calbiochem)一同培養於37℃一個小時。抗鑰孔血藍蛋白(KLH)抗體(IC17)作為負控制組。甲磺酸卡莫司他(camostat mesylate)(TOCRIS)，其為絲胺酸蛋白酶抑制劑的一種，作為正控制組。與4倍SDS-PAGE樣品緩衝液(Wako)混合，將樣品加熱至95℃五分鐘，接著，將其裝填，以進行SDS膠體電泳。利用Trans-Blot(註冊商標)Turbo^TM Transfer System(Bio-rad)，將蛋白轉移至膜上。使用M2抗Flag 抗體(Sigma-Aldrich)偵測原胜肽，其接著被抗小鼠IgG-HRP(Santa Cruz)偵測。將膜與ECL基質一同培養，且利用ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare)拍攝影像。如第3圖所示，在有TBA865和TBA873存在下，偵測到無裂解的潛伏性TGF-beta 1(亦即，有Flag標記的LAP區)，但在有TBS139和TBS182存在下，則沒有偵測到無裂解的潛伏性TGF-beta 1。這顯示血纖維蛋白溶酶裂解原胜肽只受TBA865和TBA873抑制，但不受TBS139和TBS182抑制。

4.於小鼠周邊血液單核細胞(PBMC)中，抗潛伏性TGF-beta 1抗體部分抑制或未抑制整合素介導的TGF-beta 1的活化

進行小鼠周邊血液單核細胞和HEK-Blue^TM TGF-beta細胞共培養分析，以偵測整合素介導的潛伏性TGF-beta 1的活化。使用Histopaque-1083密度梯度培養基(Sigma-Alrich)，自小鼠血液中分離出小鼠周邊血液單核細胞。表達可誘導Smad3/4結合元素(SBE)的SEAP報導基因之HEK-Blue^TM TGF-beta細胞(Invivogen)，可藉由監測Smad3/4的活化，使生物活性TGF-beta 1的偵測得以進行。活性TGF-beta 1刺激SEAP於細胞上清液中的產生。利用QUANTI-Blue^TM試劑(Invivogen)評估SEAP的分泌量。

將HEK-Blue^TM TGF-beta細胞維持於以10%胎牛血清、50U/mL鏈黴素、50micro g/mL青黴素、100micro g/mL Normocin^TM、30micro g/mL的Blasticidin、200micro g/mL的HygroGold^TM及100micro g/mL的Zeocin^TM補充的DMEM培養 基(Gibco)中。在功能分析期間，將細胞所用的培養基換成分析培養基(具有10%胎牛血清的RPMI1640)並接種至96孔盤中。然後，將抗潛伏性TGF-beta 1抗體(TBS139、TBS182、TBA865或TBA873)和小鼠周邊血液單核細胞加至孔中，並與HEK-Blue^TM TGF-beta細胞一同培養隔夜。接著，將細胞上清液與QUANTI-Blue^TM混合，並於比色盤讀取器中測量在620nm的光學密度。證實於小鼠周邊血液單核細胞中，TGF-beta 1的活化主要依靠整合素介導的活化。如第4圖所示，負控制組抗體IC17不影響TGF-beta 1活性，然而抗成熟TGF-beta 1抗體GC1008(在第4圖中以“GC”表示)抑制TGF-beta 1活性。甲磺酸卡莫司他蛋白酶抑制劑完全未抑制TGF-beta 1活化。另一方面，在小鼠周邊血液單核細胞中，RGD胜肽(GRRGDLATIH,GenScript)強烈抑制TGF-beta 1的活化，上述RGD胜肽為抑制整合素介導的TGF-beta 1的活化的誘餌胜肽。再者，RGE控制組胜肽(GRRGELATIH,GenScript)只些微抑制活化。這些結果顯示，於小鼠周邊血液單核細胞中，TGF-beta 1的活化主要依靠整合素介導的活化

如第4圖所示，於小鼠周邊血液單核細胞中，TBA865和TBA873完全未抑制整合素介導的TGF-beta 1的活化。然而，於小鼠周邊血液單核細胞中，TBS139和TBS182部分抑制整合素介導的TGF-beta 1的活化。

5.以Biocore分析，評估抗潛伏性TGF-beta 1抗體的結合親和性

利用BIACORE^® T200儀器(GE Healthcare)在pH7.4下於 37℃，測定抗潛伏性TGF-beta 1抗體結合至人類或小鼠潛伏性TGF-beta 1的親和性。使用胺偶合套組(GE Healthcare)將抗人類Fc(GE Healthcare)固定於CM4感測晶片的所有流路(flow cell)上。在含有20mM ACES、150mM NaCl、1.2mM CaCl₂、0.05% Tween 20、0.005% NaN₃的ACES pH7.4中，製備所有抗體及分析物。每一抗體被抗人類Fc捕捉於感測表面上。抗體捕捉程度目標為300共振單位(resonance unit，RU)。對TBA865和TBA873，以經兩倍連續稀釋製備的12.5至200nM的濃度注射重組人類或小鼠潛伏性TGF-beta 1，接續為解離。對TBS139和TBS182，以經兩倍連續稀釋製備的3.125至50nM的濃度注射重組人類或小鼠潛伏性TGF-beta 1，接續為解離。在每個周期以3M MgCl₂ pH 1.5再生感測表面。利用Biacore T200評估軟體，2.0版本(GE Healthcare)處理及擬合數據至1：1結合模型，以判定結合親和性。

抗潛伏性TGF-beta 1抗體結合至人類或小鼠潛伏性TGF-beta 1的親和性如表4所示。

6.於串聯阻斷分析中進行Biacore

於串聯阻斷分析中進行Biacore，以分析TBA865、TBA873、TBS139和TBS182的結合抗原決定基的性質。在含 有20mM ACES、150mM NaCl、1.2mM CaCl₂、0.05% Tween 20、0.005% NaN₃的ACES pH7.4緩衝液中，在25℃下，在Biacore T200儀器(GE Healthcare)上進行分析。使用胺偶合套組(GE Healthcare)將單株ANTI-FLAG(註冊商標)M2抗體(Sigma)固定於CM5感測晶片的流路(flow cell)1和2上。在流路2，捕捉約200RU含有N末端Flag標記的小鼠重組潛伏性TGF-beta 1。流路1作為參考流路。接著，以飽和濃度注射500nM的TBS139或TBS182 5分鐘，接續以500nM的TBA865或TBA873進行相同的注射，作為競爭的mAb。相同注射的TBS139或TBS182 mAb作為自我阻斷的參考。在每個周期以100mM Gly-HCl pH 2.4，0.5M NaCl再生感測表面。結合反應大於相同注射的TBS139或TBS182所觀察到的結合反應表示結合至不同的抗原決定基，而反應小於或類似於相同注射的TBS139或TBS182所觀察到的那些表示結合至相同或重疊或鄰近的抗原決定基。此分析的結果如第5圖所示。

實施例6：活體內功效分析

1.於CDAHFD誘發的非酒精性脂肪肝炎(NASH)/肝纖維化的小鼠模型中，抗潛伏性TGF-beta 1抗體的活體內功效

於非酒精性脂肪肝炎/肝纖維化模型中，評估單株抗體TBS139和TBS182的活體內功效。所有實驗動物的照護及處理皆依照中外製藥有限公司的實驗動物照護及使用指南(Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals at Chugai Pharmaceutical Co.Ltd.)的建議實行，其由國際實驗動物評估認證協會(Association for Assessment and Accrediation of Laboratory Animal Care International)所認可。

自日本SLC公司(Shizuoka,Japan)購買五週大的無特定病原菌(specific-pathogen-free，SPF)的C57BL/6J公小鼠，並在處理開始前，使其適應一星期。動物安置於20-26℃及12：12小時的光/暗循環下，且以市售標準飲食(#CE-2；CLEA Japan Inc.,Shizuoka,Japan)和自來水任意餵食。自Research Diets(New Brunswick,NJ,USA)購買試驗飲食，其為缺乏膽鹼、限定L胺基酸和高脂的飲食(choline-deficient,L-amino acid-defined,high-fat diet，CDAHFD；#A06071302)。在研究過程中，10組餵食CDAHFD(n=8)，1組餵食CE-2作為正常控制組。

藉由靜脈注射(intravenous injection)，給予不同劑量(2、10、50mg/kg)的單株抗體，一個禮拜一次，持續兩個禮拜。在此研究中，使用10mg/kg的抗成熟TGF-beta抗體GC1008(如美國專利號US 8383780中所述)作為正控制組，且使用100mg/kg的抗鑰孔血藍蛋白(KLH)抗體IC17作為負控制組。在第14天，將動物稱重，且在異氟醚(isoflurane)麻醉下，藉由放血(exsanguination)將其殺死。從心室或後大靜脈收集血液樣品，且保存於-80℃直到分析。迅速取下肝臟並稱重。部分肝臟組織於液態氮中或於乾冰上快速冷凍，以進行分子分析。

使用RNeasy Mini套組(Qiagen,Tokyo,Japan)自肝臟組織萃取總RNA，且使用Transcriptor Universal cDNA Master(Roche Applied Science,Tokyo,Japan)合成cDNA。使用 LightCycler 480 System(Roche Applied Science)量測基因表達。自Applied Biosystems購買用於基因的引子和Taq-Man探針。小鼠甘油醛三磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為每一樣品的內源參考。使用雙delta Ct分析，計算mRNA表現的相對值。

此實驗的結果如第6圖所示。就抗體而言，從肝臟中第一型膠原蛋白alpha 1的mRNA的表現程度，評估對肝纖維化的抑制活性。CDAHFD顯著增加小鼠中膠原蛋白的mRNA量，且三種抗體(GC1008、TBS139和TBS182)皆減少膠原蛋白的mRNA量。

資料以平均+/-平均標準差(standard error of the mean，SEM)呈現。使用變異數分析法(ANOVA)和學生T檢定(Student's t-test)，進行統計分析。P值小於0.05、小於0.01或小於0.001被視為顯著。

2.在單側輸尿管阻塞(UUO)誘發的腎纖維化小鼠模型中，活體內抗潛伏性TGF-beta 1抗體的功效

於單側輸尿管阻塞(Unilateral Ureteral Obstruction，UUO)已誘發腎纖維化的小鼠模型中，評估單株抗體TBS139和TBS182的活體內功效。

自日本Charles River公司(Kanagawa,Japan)購買七週大的無特定病原菌(specific-pathogen-free，SPF)的C57BL/6J公小鼠，並在處理開始前，使其適應一星期。動物安置於20-26℃及12：12小時的光/暗循環下，且以市售標準飲食(#CE-2；CLEA Japan Inc.,Shizuoka,Japan)和自來水任意餵 食。

在異氟醚麻醉的情況下，進行UUO手術。剔除腹部左側的毛，且形成穿過皮膚的垂直切口。形成穿過腹腔的第二切口，接著，收起第二切口以露出腎臟。用鑷子將腎臟帶至表面，將左側輸尿管以手術線打結兩次，在腎臟下方。將打結的的腎臟輕輕放回其正確的解剖位置，接著縫合腹腔和皮膚。給予止痛劑以減少動物的痛苦。在假手術(sham-operated)組，腹腔和皮膚只有切開並縫合。

在手術前，所有的單株抗體皆透過靜脈內注射，投予一次。假手術組給予媒液(vehicle)。TBS139和TBS182皆投予不同的劑量(10、30、100mg/kg)。在此研究中，使用50mg/kg的抗成熟TGF-beta抗體GC1008(如美國專利號US 8383780中所述)作為正控制組，且使用100mg/kg的抗鑰孔血藍蛋白(KLH)抗體IC17作為負控制組。在第7天，將動物稱重，且在異氟醚(isoflurane)麻醉下，藉由放血(exsanguination)將其殺死。從心室或後大靜脈收集血液樣品，且保存於-80℃直到分析。迅速取下腎臟並稱重。部分腎臟組織於液態氮中或於乾冰上快速冷凍，以進行分子分析。

利用實施例6-1所述的方法，自腎臟組織萃取總RNA。小鼠粒線體核糖體蛋白L19(mitochondrial ribosomal protein L19，MRPL19)作為每一樣品的內源參考。使用雙delta Ct分析，計算mRNA表現的相對值。此實驗的結果如第7圖所示。就抗體而言，從腎臟中第一型膠原蛋白alpha 1的mRNA的表現程度，評估對腎纖維化的抑制活性。UUO顯著增加小鼠 中膠原蛋白的mRNA量，且三種抗體(GC1008、TBS139和TBS182)皆減少膠原蛋白的mRNA量。

量測腎臟中的羥脯胺酸(hydroxyproline)的含量，其為膠原蛋白所包含的胺基酸之一，以評估組織中的基質外沉積(extramatrical deposition)。將濕腎臟組織在110℃乾燥三個小時，並稱重。然後，6N HCl(100uL/1mg乾組織)加至乾組織，並在110℃煮沸三個小時。利用過濾，以純化樣品，且將10microliter的每一樣品分配至96孔盤。有樣品的盤在室溫乾燥隔夜，且使用羥脯胺酸分析套組(BioVision)，量測羥脯胺酸。此實驗的結果如第8圖所示。在誘發疾病的腎臟中，觀察到羥脯胺酸的含量顯著增加，且所有的抗體(GC1008、TBS139和TBS182)皆抑制腎纖維化。

資料以平均+/-平均標準差呈現。使用變異數分析法(ANOVA)和學生T檢定，進行統計分析。P值小於0.05、小於0.01或小於0.001被視為顯著。

3.在博來黴素(bleomycin，BLM)誘發肺纖維化的小鼠模型中，活體內抗潛伏性TGF-beta 1抗體的功效

於博來黴素誘發肺纖維化的小鼠模型中評估單株抗體TBS139和TBS182的活體內功效，上述小鼠模型的特點在於白血球的浸潤、人類纖維母細胞的增生和膠原蛋白在肺臟組織中增加。所有實驗動物的照護及處理皆依照中外製藥有限公司的實驗動物照護及使用指南(Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals at Chugai Pharmaceutical Co.Ltd.)的建議實行，其由國際實驗動物評估認證協會所認可。

自日本Charles River公司(Kanagawa,Japan)購買七週大的無特定病原菌的C57BL/6J公小鼠，並在處理開始前，使其適應一星期。動物安置於20-26℃及12：12小時的光/暗循環下，且以市售標準飲食(#CE-2；CLEA Japan Inc.,Shizuoka,Japan)和自來水任意餵食。

在異氟醚麻醉下，從氣管滴入劑量為1.5mg/kg的博來黴素(Nihon Kayaku,Tokyo,Japan)。從氣管滴入食鹽水作為無疾病控制組。博來黴素刺激前，所有的單株抗體皆透過靜脈內注射，投予一次。TBS139和TBS182皆投予兩種劑量(10和50mg/kg)。在此研究中，使用抗成熟TGF-beta抗體GC1008(如美國專利號US 8383780中所述)作為正控制組，且使用抗鑰孔血藍蛋白抗體IC17作為負控制組(兩者劑量皆為50mg/kg)。在第7天，將動物稱重，且在異氟醚麻醉下，藉由放血將其殺死。從心室或後大靜脈收集血液樣品，且保存於-80℃直到分析。迅速取下肺臟並稱重。部分肺臟組織於液態氮中或於乾冰上快速冷凍，以進行分子分析。

利用實施例6-1所述的方法，自肺臟組織萃取總RNA。小鼠甘油醛三磷酸脫氫酶(GAPDH)作為每一樣品的內源參考。使用雙delta Ct分析，計算mRNA表現的相對值。此實驗的結果如第9和10圖所示。就抗體而言，從肺臟中serpine 1(PAI-1)的mRNA的表現程度，評估對肺纖維化的抑制活性。博來黴素顯著增加小鼠中PAI-1的mRNA量，且所有抗體(GC1008、TBS139和TBS182)皆減少PAI-1的mRNA量。藉由量測肺臟中CCL2(MCP-1)的mRNA表現程度，評估發炎反應。 GC1008劇烈地增加發炎反應，但TBS139和TBS182未顯著增加疾病的進展。

資料以平均+/-平均標準差呈現。使用變異數分析法(ANOVA)和學生T檢定，進行統計分析。P值小於0.05、小於0.01或小於0.001被視為顯著。

實施例7：毒性分析

在正常小鼠毒性研究中，證實抗潛伏性TGF-beta 1中和抗體的潛在毒性，且與抗成熟TGF-beta抗體的潛在毒性比較。

間歇地每兩天，持續五個禮拜，劑量皆為50mg/kg，靜脈注射投予GC1008(抗成熟TGF-beta抗體)、TBS139和TBS182(抗潛伏性TGF-beta 1抗體)至六週大的母BALB/c小鼠(見表5)。控制組只接受媒液(20mmol/L含有150mmol/L NaCl的組胺酸-HCl緩衝液，pH 6.0)。在投予的期間，每天至少進行兩次臨床觀察。每三天量一次體重，持續一個禮拜(亦即，第1天、第4天和第7天)。在第37天，從所有動物收集血液樣品，用於評估血液化學、血液學和免疫分型法。在投予期間結束時，對所有動物進行全身解剖(gross necropsy)和組織病理學檢驗。

在GC1008組中，分別在第27、28和35天，發現三隻動物死亡，且注意到較低的體重和食物攝取量。在組織病理上，觀察到檢品相關的(test article-related)發炎的改變、增生的改變和對細胞外間質(ECM)的影響。主要的發現如以下所示：心臟的主動脈根/瓣的發炎的改變(4隻)、肺臟的發炎的改變(9隻)、食道的發炎的改變(2隻)和胃的發炎的改變(1隻)、舌的類囊(cyst-like)的改變(1隻)、牙齒的發育不全的改變(12隻)、肝臟的肝細胞的改變(3隻)、皮膚或皮下組織的毛囊的改變(4隻)和骨骼的低成骨作用(hypoosteogenesis)(股骨/胸骨，12隻)。死亡的動物表現出比排定犧牲的動物更為嚴重的改變，尤其是在心臟。死因被認為是循環障礙(circulatory disturbance)，其與心臟病變相關，例如在主動脈根/瓣的出血(hemorrhage)/類纖維蛋白滲出(fibrinoid exudation)。觀察到鹼性磷酸酶(alkaline phosphate，ALP)的減少，且認為這與骨骼的發現相關，例如低成骨作用的改變。

在TBS139和TBS182組中，沒有觀察到死亡、一般狀況、體重和食物攝取量的改變。另一方面，在TBS139/TBS182中，觀察到組織病理上檢品相關的改變，如下所示：發炎細胞的浸潤和出血/類纖維蛋白滲出(1隻)、只有在TBS182組中的間質細胞出現於心臟的主動脈根/瓣(2隻)、發炎細胞在TBS139組(4隻)和TBS182組(7隻)的肺臟中增加、發炎細胞在TBS139組(1隻)和TBS182組(2隻)的黏膜下層浸潤、只有在TBS182的食道的上皮組織過度增生(1隻)。上述的改變與GC1008組的類似，但這些發現的嚴重度和發生率明顯 低於GC1008組。在TBS139或TBS182組中，均未發現到舌、胃、牙齒、肝臟、皮膚/皮下組織和骨骼的檢品相關的改變，上述改變可在GC1008組中觀察到。

在所有組中，並未在血液學和免疫分型法中觀察到毒理相關的檢品相關的改變。

綜上所述，在GC1008組注意到檢品相關的死亡、較低的體重和食物攝取量。此外，在心臟、肺臟、食道、舌、胃、牙齒、皮膚/皮下組織、肝臟和骨骼(股骨/胸骨)觀察到組織病理上發炎的改變、增生的改變和對細胞外間質的影響。心臟病變被認為類似於先前研究的死因。在TBS139和TBS182組中，沒有注意到死亡、體重的改變或食物攝取量的改變。組織病理上，在TBS139組的肺臟和食道，觀察到類似於GC1008組的改變，但沒有心臟的改變；在TBS182組中，觀察到心臟、肺臟和食道的改變。然而，相較於GC1008組，在TBS139和TBS182組中，這些發現的嚴重度和發生率明顯減少。

在三個檢品中的主要發現摘要如下：表6

實施例8：鑒定抗人類潛伏性TGF-beta 1抗體如以下所述，製備、挑選和分析結合至細胞表面的TGF-beta 1之額外的抗人類潛伏性TGF-beta 1抗體：首先，用人類和小鼠重組潛伏性TGF-beta 1蛋白(100microgram/劑量/兔)皮內地免疫12-16週大的NZW兔。在最初免疫的兩週後，再給予四次每週的劑量，其中交替給予小鼠和人類重組潛伏性TGF-beta 1蛋白(50microgram/劑量/兔)。在最後一次免疫的一星期後，收集經免疫的兔子的脾臟及血液。抗原特異性的B細胞被染色、分選和分盤，如實施例2所述。在培養後，收集B細胞培養上清液供進一步分析，以及冷凍保 存細胞沉澱物(pellet)。

使用過度表達人類或小鼠潛伏性TGF-beta 1的FS293細胞，以細胞為基礎的ELISA篩選總共3587個B細胞上清液，如BioTechniques 2003,35：1014-1024所述。

挑選總共94個B細胞系用於抗體基因選殖和下游分析，上述94個B細胞系結合至細胞表面的人類潛伏性TGF-beta 1，並且結合至或不結合至細胞表面的小鼠潛伏性TGF-beta 1。如實施例2所述，選殖來自這94個系的抗潛伏性TGF-beta 1抗體。藉由反轉錄PCR將其抗體重鏈可變區的DNA放大，並與F1332m重鏈恆定區(序列辨識號：53)重組。藉由反轉錄PCR將其抗體輕鏈可變區的DNA放大，並與hk0MC輕鏈恆定區(序列辨識號：55)重組。根據製造商的指示(Life technologies)，利用FreeStyle^TM 293-F細胞短暫地表達重組抗體，且使用AsaayMAP Bravo平台和蛋白質A匣(cartridge)(Agilent)(TBA1235-TBA1328)進行純化。

實施例9：抗潛伏性TGF-beta 1抗體生成之抗體篩選

使用偵測成熟TGF-beta 1的ELISA(Human TGF-beta 1 Quantikine ELISA套組，R&D system)，以評估血纖維蛋白溶酶介導的TGF-beta 1的活化。在有或沒有抗潛伏性TGF-beta 1抗體的存在下，將人類重組潛伏性TGF-beta 1與人類血纖維蛋白溶酶(Calbiochem)一同培養於37℃，一個小時。利用前文所述的ELISA，分析混合物中成熟TGF-beta 1的含量。前述偵測是根據製造商的步驟所進行。篩選出抗潛伏性TGF-beta 1抗體 (例如TBA1277、TBA1300和TBA1314)，其對血纖維蛋白溶酶介導的TGF-beta 1的活化具有抑制活性。TBA1277的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別顯示於序列辨識號：64和65，TBA1300的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別顯示於序列辨識號：66和67，TBA1314的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別顯示於序列辨識號：68和69。再者，TBA1277、TBA1300和TBA1314的可變區(VR)和CDR(HVR)的胺基酸序列如下所示。

表8

實施例10：抗潛伏性TGF-beta 1抗體的性質分析

1.抗潛伏性TGF-beta 1抗體抑制基質金屬蛋白酶2和基質金屬蛋白酶9介導的小鼠潛伏性TGF-beta 1的活化在有或沒有抗潛伏性TGF-beta 1抗體的存在下，將小鼠重組潛伏性TGF-beta 1與活化的小鼠基質金屬蛋白酶2或小鼠基質金屬蛋白酶9一同培養於37℃，兩個小時。根據製造商的步驟，使用成熟TGF-beta 1的ELISA(Human TGF-beta 1 Quantikine ELISA套組，R&D system)，以評估基質金屬蛋白酶2和基質金屬蛋白酶9介導的小鼠潛伏性TGF-beta 1的活化和抗體介導的抑制。

如第11圖所示，基質金屬蛋白酶2和基質金屬蛋白酶9介導的小鼠潛伏性TGF-beta 1的活化受到抗潛伏性TGF-beta 1抗體(TBS139、TBS182、TBA865和TBA873)的抑制。

2.抗潛伏性TGF-beta 1抗體抑制血漿激肽釋放酶原和血纖維蛋白溶酶介導的人類潛伏性TGF-beta 1的活化

在有或沒有抗潛伏性TGF-beta 1抗體(TBA1277、TBA1300或TBA1314)的存在下，將人類重組潛伏性TGF-beta 1與人類血漿激肽釋放酶原(Enzyme Research Laboratories)或血纖維蛋白溶酶(Calbiochem)一同培養於37℃下，一個小時。根據製造商的步驟，利用成熟TGF-beta 1的ELISA(Human TGF-beta 1 Quantikine ELISA套組，R&D system)，分析血漿激狀釋放酶原和血纖維蛋白溶酶介導的TGF-beta 1的活化以及抗體介導的抑制。如第12圖所示，血漿激肽釋放酶原和血纖維蛋白溶酶介導的人類潛伏性TGF-beta 1的活化被抗潛伏性TGF-beta 1抗體(TBA1277、TBA1300或TBA1314)抑制。

3.利用抗潛伏性TGF-beta 1抗體抑制血纖維蛋白溶酶介導的TGF-beta 1原胜肽的裂解

在有或沒有抗潛伏性TGF-beta 1抗體(TBA1277、TBA1300、TBA1314或TBA873)的存在下，將人類重組潛伏性TGF-beta 1與人類血纖維蛋白溶酶(Calbiochem)一同培養於37℃下，一個小時。抗鑰孔血藍蛋白之抗體(IC17)作為負控制組。甲磺酸卡莫司他(TOCRIS)，其為絲胺酸蛋白酶抑制劑的一種，作為正控制組。與4倍SDS-PAGE樣品緩衝液(Wako)混合，將樣品加熱至95℃五分鐘，接著，將其裝填，以進行SDS膠體電泳。利用Trans-Blot(R)TurboTM Transfer System(Bio-rad)，將蛋白轉移至膜上。使用小鼠抗Flag M2-HRP抗體(Sigma-Aldrich)偵測原胜肽。將膜與ECL基質一同培養，且利用ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare)拍攝影像。如第13圖所示，在TBA873存在下，偵測到無裂解的潛伏性TGF-beta 1(亦即，有Flag標記的LAP區)，但在有TBA1277、TBA1300和TBA1314存在下，則沒有偵測到無裂解的潛伏性TGF-beta 1。這顯示血纖維蛋白溶酶裂解原胜肽只受TBA873抑制，但不受TBA1277、TBA1300和TBA1314抑制。

4.抗潛伏性TGF-beta 1抗體結合至大潛伏性TGF-beta 1複合體

藉由螢光流式細胞分選儀(FACS)測試抗潛伏性TGF-beta 1抗體對細胞表面的潛伏性TGF-beta 1的結合，上述FACS使用Ba/F3細胞和FreeStyle^TM 293-F細胞(ThermoFisher)，兩者皆內源性表達潛伏性TGF-beta 1，且形成大潛伏性複合體。將抗潛伏性TGF-beta 1抗體與每一細胞株一同於培養4℃，30分鐘，且使用FACS緩衝液(2% FBS,2mM EDTA於PBS)沖洗。抗鑰孔血藍蛋白之抗體(IC17)作為負控制組抗體。接著加入山羊F(ab’)2抗人類IgG、小鼠ads-PE(Southern Biotech.Cat.2043-09)或山羊F(ab’)2抗小鼠IgG(H+L)、人類ads-PE(Southern Biotech.Cat.1032-09)，並於4℃培養30分鐘，且使用FACS緩衝液沖洗。於FACS Verse(Becton Dickinson)上取得數據，接著使用FlowJo軟體(Tree Star)和GraphPad Prism軟體(GraphPad)進行分析。如第14圖所示，TBS139和TBS182結合至Ba/F3細胞。TBA1277、TBA1300和TBA1314結合至FreeStyle^TM 293-F細胞。

5.抗潛伏性TGF-beta 1抗體抑制基質金屬蛋白酶2和基質金屬蛋白酶9介導的TGF-beta 1原胜肽的裂解

在有或沒有抗潛伏性TGF-beta 1抗體(TBS139、TBS182、 TBA865或TBA873)的存在下，將小鼠重組潛伏性TGF-beta 1與小鼠基質金屬蛋白酶2或小鼠基質金屬蛋白酶9(R&D systems)一同於37℃培養24小時。抗鑰孔血藍蛋白之抗體(IC17)作為負控制組。GM6001(TOCRIS)，其為基質金屬蛋白酶抑制劑中一種，作為正控制組。與4倍SDS-PAGE樣品緩衝液(Wako)混合，將樣品加熱至95℃五分鐘，接著，將其裝填，以進行SDS膠體電泳。利用Trans-Blot(R)TurboTM Transfer System(Bio-rad)，將蛋白轉移至膜上。使用小鼠抗Flag M2-HRP抗體(Sigma-Aldrich)偵測原胜肽。將膜與ECL基質一同培養，且利用ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare)拍攝影像。如第15圖所示，在TBA865和TBA873存在下，偵測到裂解的潛伏性TGF-beta 1(亦即，潛伏性TGF-beta 1的變短的LAP區)，其條帶在影像的較低部分出現。這顯示，利用MMP2的原胜肽裂解(第15A圖)和利用MMP9的原胜肽裂解(第15B圖)，只受TBS139和TBS182的抑制，但不受TBA865和TBA873的抑制。

6.抗潛伏性TGF-beta 1抗體抑制基質金屬蛋白酶2和基質金屬蛋白酶9介導的人類潛伏性TGF-beta 1的活化

在有或沒有抗TGF-beta 1抗體的存在下，將人類重組潛伏性TGF-beta 1與小鼠基質金屬蛋白酶2或小鼠基質金屬蛋白酶9(R&D systems)一同培養於37℃，2小時。根據製造商的步驟，利用成熟TGF-beta 1的ELISA(Human TGF-beta 1 Quantikine ELISA套組，R&D system)，分析基質金屬蛋白酶2和基質金屬 蛋白酶9介導的人類潛伏性TGF-beta 1的活化以及抗體介導的抑制。如第16圖所示，基質金屬蛋白酶2和基質金屬蛋白酶9介導的人類潛伏性TGF-beta 1的活化受到抗潛伏性TGF-beta 1抗體(TBA865、TBA873、TBA1300和TBA1277)的抑制。

7.以Biacore分析，評估抗潛伏性TGF-beta 1抗體的結合親和性

利用BIACORE^® T200儀器(GE Healthcare)在pH7.4下於37℃，測定抗潛伏性TGF-beta 1抗體結合至人類潛伏性TGF-beta 1的親和性。使用胺偶合套組(GE Healthcare)將抗人類Fc(GE Healthcare)固定於CM4感測晶片的所有流路(flow cell)上。在含有20mM ACES、150mM NaCl、1.2mM CaCl₂、0.05% Tween 20和0.005% NaN₃的pH7.4 ACES中，製備所有抗體及分析物。每一抗體被抗人類Fc捕捉至感測表面上。抗體捕捉程度目標為300共振單位(resonance unit，RU)。以經兩倍連續稀釋製備的12.5至200nM的濃度注射重組人類潛伏性TGF-beta 1，接續為解離。在每個周期以3M MgCl₂再生感測表面。利用Biacore T200評估軟體，2.0版本(GE Healthcare)處理及擬合數據至1：1結合模型，以判定結合親和性。抗潛伏性TGF-beta 1抗體結合至人類潛伏性TGF-beta 1的親和性如表9所示。

表9

雖然前述發明已為了清楚理解的目的，藉由說明及實施例詳細描述，然此描述及實施例不應理解為用以限定本發明的範圍。本文引用的所有專利及科學文獻之內容明確地以參考方式完整併入於此。

<110> 中外製藥股份有限公司

<120> TGF-beta 1抗體及使用方法

<130> C1-A1612-TW

<150> JP 2016-172728

<151> 2016-09-05

<160> 69

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成序列

<400> 61

<210> 62

<211> 437

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成序列

<400> 62

<210> 63

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成序列

<400> 63

<210> 64

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成序列

<400> 64

<210> 65

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成序列

<400> 65

<210> 66

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成序列

<400> 66

<210> 67

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成序列

<400> 67

<210> 68

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成序列

<400> 68

<210> 69

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成序列

<400> 69

Claims (15)

1. 一種抗TGF-beta 1抗體，其結合至潛伏性TGF-beta 1，其中該抗體抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的活化，而不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的潛伏性相關胜肽(LAP)區的裂解。
2. 一種抗TGF-beta 1抗體，其結合至潛伏性TGF-beta 1，其中該抗體抑制蛋白酶介導的成熟TGF-beta 1自潛伏性TGF-beta 1的釋放，而不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區的裂解。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之抗TGF-beta 1抗體，其中該抗體結合至潛伏性TGF-beta 1的LAP區。
4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之抗TGF-beta 1抗體，其中該蛋白酶係選自由血纖維蛋白溶酶(PLN)、血漿激肽釋放酶(PLK)、基質金屬蛋白酶2(MMP2)和基質金屬蛋白酶9(MMP9)所組成的群組。
5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之抗TGF-beta 1抗體，其中該抗體不抑制整合素介導的潛伏性TGF-beta 1的活化。
6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之抗TGF-beta 1抗體，其中該抗體不結合至成熟TGF-beta 1。
7. 一種抗TGF-beta 1抗體，其與TBS139或TBS182競爭結合至小鼠TGF-beta 1。
8. 一種抗TGF-beta 1抗體，其結合至小鼠TGF-beta 1上的一抗原決定基，且該抗原決定基被TBS139或TBS182結合。
9. 一種抗TGF-beta 1抗體，其結合至人類TGF-beta 1上的一抗原決定基，其中該抗原決定基對應小鼠TGF-beta 1上與TBS139或TBS182結合的一抗原決定基。
10. 一種抗TGF-beta 1抗體，其與TBS1277、TBA1300或TBA1314競爭結合至人類TGF-beta 1。
11. 一種抗TGF-beta 1抗體，其結合至人類TGF-beta 1上的一抗原決定基，且該人類TGF-beta 1被TBS1277、TBA1300或TBA1314結合。
12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之抗TGF-beta 1抗體，其中該抗體為人類、人源化或嵌合抗體。
13. 一種醫藥組合物，包括如申請專利範圍第1至12項中任一項所述之抗TGF-beta 1抗體以及一醫藥上可接受的載體。
14. 一種抗TGF-beta 1抗體的篩選方法，包括：(a)將一生物樣品與一測試抗體接觸，該生物樣品包括潛伏性TGF-beta 1以及一蛋白酶；(b)測量(i)未裂解的潛伏性TGF-beta 1的量和(ii)成熟TGF-beta 1的量；以及(c)相較於該測試抗體不存在的情況下，若未裂解的潛伏性TGF-beta 1的量未顯著增加且成熟TGF-beta 1的量減少，選擇抑制蛋白酶介導的成熟TGF-beta 1自潛伏性TGF-beta 1釋放而不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區裂解的該測試抗體。
15. 一種抗TGF-beta 1抗體的生產方法，包括：(a)將一生物樣品與一測試抗體接觸，該生物樣品包括潛伏 性TGF-beta 1以及一蛋白酶；(b)測量(i)未裂解的潛伏性TGF-beta 1的量和(ii)成熟TGF-beta 1的量；(c)相較於該測試抗體不存在的情況下，若未裂解的潛伏性TGF-beta 1的量未顯著增加且成熟TGF-beta 1的量減少，選擇抑制蛋白酶介導的成熟TGF-beta 1自潛伏性TGF-beta 1釋放而不抑制蛋白酶介導的潛伏性TGF-beta 1的LAP區裂解的該測試抗體。 (d)獲得於步驟(c)中選擇的該抗TGF-beta 1抗體的胺基酸序列資訊；以及(e)將編碼該抗TGF-beta 1抗體的一基因引入一宿主細胞。