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TW201818075A - 條件性活性多肽及產生其之方法 - Google Patents

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TW201818075A
TW201818075A TW106129568A TW106129568A TW201818075A TW 201818075 A TW201818075 A TW 201818075A TW 106129568 A TW106129568 A TW 106129568A TW 106129568 A TW106129568 A TW 106129568A TW 201818075 A TW201818075 A TW 201818075A
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杰 Ｍ 休特
懷文 張
傑爾哈 弗雷
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美商拜奧亞特拉公司
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Abstract

本發明提供一種自親代多肽製備條件性活性多肽之方法，其包含以下步驟：藉由使用一或多種選自以下之技術增加該親代多肽之淨電荷來演化編碼該親代多肽之DNA：增加該DNA中帶電荷胺基酸殘基之密碼子之總數及減少該DNA中不帶電荷胺基酸殘基之密碼子之總數，以產生突變體DNA；表現該等突變體DNA以獲得突變體多肽；及自該等突變體多肽選擇該條件性活性多肽，該條件性活性多肽展現與相同條件之第二值下第二分析中之相同活性相比，該條件之第一值下第一分析中之活性降低。亦提供該條件性活性多肽、含有其之醫藥組合物、其奈米顆粒及藥物偶聯物以及其用途。

Description

條件性活性多肽及產生其之方法
本發明係關於提供具有期望活性之改良多肽之領域。特定而言，本發明係關於條件性活性多肽及自親代多肽產生條件性活性多肽之方法，其中條件性活性多肽在一種條件下較在另一種條件下活性更強。
有大量文獻闡述使蛋白質、尤其酶或抗體之多種特徵演化以在不同條件下具有活性或穩定之方法。舉例而言，可使酶演化以在較高溫度下穩定。在其中酶活性在較高溫度下改良之情況中，大部分改良可歸因於一般藉由Q10原理闡述之較高動力學活性，其中估計在酶情形中每升高10℃，轉化率加倍。 另外，存在使蛋白質在其正常作用條件下不穩定之天然突變，由此降低在正常作用條件下之蛋白質活性。例如，存在已知溫度突變體，其在較低溫度下具有活性，但通常與衍生出其之野生型蛋白質相比，活性程度較低。 可期望產生具有條件性活性之多肽，例如在一種條件下活性較低或實際上無活性，且在另一種條件下活性更強。亦可期望產生在某些環境中活化或不活化，或隨時間活化或不活化之多肽。除了溫度以外，多肽可針對條件性活性演化或改良之其他條件包括pH、滲透壓、滲透重量莫耳濃度、氧化壓力及電解質濃度。除了多肽活性外，通常可期望在演化期間改良其他性質，包括耐化學性及蛋白水解抗性。 存在多種已知的具有改良性質之突變多肽，其中已進行一或多個胺基酸取代以達成改良性質。舉例而言，美國專利第8,318,469號揭示突變體布氏棲熱菌(Thermus brockianus )核酸聚合酶，其具有以下兩個突變中之一者：G43D及F665Y。與無該等突變之聚合酶相比，突變體聚合酶具有降低之5′-3′外核酸酶活性。通常不期望DNA聚合酶之5′-3′外核酸酶活性，此乃因此活性可消化具有未保護5′端之核酸(包括引子)。 美國專利第8,536,301號揭示以高親和力結合至纖連蛋白α5β1或玻連蛋白αvβ3及αvβ5整聯蛋白之細胞表面受體之突變體多肽。突變體肽係基於分子支架，可將含有RGD整聯蛋白結合基序之子序列插入該分子支架中。該子序列具有約9-13個胺基酸之長度，且RGD側接有多種胺基酸。分子支架較佳係基於打結素，例如EETI、AgRP及Agatoxin IVB，該等肽具有嚴格定義之三維構形。 美國專利第8,921,086號揭示對進入活性位點區域中之核苷酸類似物具有改良耐受性之突變體DNA聚合酶。突變體聚合酶可相對於野生型DNA聚合酶在位置375及位置512具有胺基酸取代。位置375之取代包括E375H、E375S、E375K、E375R、E375A、E375Q、E375W、E375Y及E375F。位置52之取代包括K512W、K512Y、K512F、K512L、K512H、K512D及K512E。 美國專利第6,329,178號揭示藉由使活性位點中之一或多個胺基酸突變衍生自天然DNA聚合酶之突變體DNA聚合酶。突變體DNA聚合酶具有與天然DNA聚合酶相比改變的保真度或改變的酶活性。天然DNA聚合酶具有包含以下胺基酸序列基序之活性位點：AspTyrSerGlnIleGluLeuArg或LeuLeuVa1AlaLeuAspTyrSerGlnIleGluLeuArg。突變體DNA聚合酶具有(a) 胺基酸序列基序中之兩個或更多個胺基酸取代，或(b) 胺基酸序列基序中除Glu以外之胺基酸取代。 該等突變體蛋白質具有與衍生出其之野生型蛋白質相比改變之性質。然而，該等突變體蛋白質之改變性質不隨條件變化而改變。 使親代多肽演化為在一種條件下無活性或實際上無活性(小於50%、30%或10%活性且尤其1%活性)，而在另一種條件下維持等效或更佳活性，可能需要一或多個去穩定性突變與一或多個活性增加突變共存。業內需要研發條件性活性多肽。 美國專利第8,709,755號揭示產生條件性活性抗體之方法，其包含以下步驟：演化編碼野生型抗體之DNA以產生突變體抗體，使突變體抗體及野生型抗體經歷第一條件下之分析及第二條件下之分析，且自至少一種突變體抗體選擇條件性活性抗體，該條件性活性抗體展現以下二者：(a) 與在第一條件下之相同分析中野生型抗體之結合活性相比，在第一條件下之分析中與抗原之結合活性降低，及(b) 與在第二條件下之相同分析中野生型抗體之活性相比，在第二條件下之分析中與抗原之結合活性增加。 在用作治療性抗體時，條件性活性抗體較佳在正常生理條件下具有降低活性，且在可在治療位點存在之異常條件(例如腫瘤微環境)下具有增加活性。由於此優先作用，條件性活性抗體可潛在地對其中存在正常生理條件之正常組織/器官造成較少損害，由此產生較少副作用。此可容許治療延長更久及/或使用更高劑量之條件性活性抗體。 本發明提供產生條件性活性多肽之新穎方法，其利用定向誘變更有效地產生。本發明亦提供藉由此方法產生之新穎條件性活性多肽。
在一態樣中，本發明提供可藉由增加親代多肽之淨電荷獲得之條件性活性多肽，其中該條件性活性多肽展現與相同條件之第二值下第二分析中之相同活性相比，該條件之第一值下第一分析中之活性降低。帶電荷胺基酸殘基可選自天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、離胺酸及視情況組胺酸。 在前述各實施例中，淨電荷可經由一或多種選自以下之技術增加：增加多肽中帶電荷胺基酸殘基之總數、減少多肽中不帶電荷胺基酸殘基之總數或其組合。在前述各實施例中，條件可選自pH、溫度、滲透壓、滲透重量莫耳濃度、氧化壓力、電解質濃度、蛋白質濃度及該等條件中兩者或更多者之組合。 在前述各實施例中，條件可為pH，且條件性活性多肽可展現在正常生理pH下降低之活性及在不同於正常生理pH之異常pH下增加之活性。 在前述各實施例中，條件性活性可在至少一種物質存在下分析，該至少一種物質之分子量小於900 a.m.u.且pKa遠離期望增加活性之pH多達2單位或多達3單位。在前述實施例中，物質之pKa可在pH之第一值與pH之第二值之間。 在前述各實施例中，條件性活性可在至少一種選自以下之物質存在下分析：組胺酸、組織胺、氫化二磷酸腺苷、硫化氫、氫化三磷酸腺苷、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、二硫化物、銨、碳酸氫鹽、磷酸二氫鹽及其組合。 在前述各實施例中，第一分析及第二分析可在血清不存在下在分析溶液中實施。 在前述各實施例中，可藉由將一或多個帶電荷胺基殘基經由胺基酸殘基取代、胺基酸插入或其組合引入親代多肽中來增加淨電荷。 在前述各實施例中，可將一或多個帶電荷胺基殘基引入親代多肽之活性位點中。在前述各實施例中，可將一或多個帶電荷胺基殘基引入親代多肽之活性位點外部之區域中。在前述各實施例中，條件性活性多肽可為條件性活性抗體且可將一或多個帶電荷胺基酸殘基引入條件性活性抗體之至少一個互補決定區中。 在前述各實施例中，一或多個帶電荷胺基酸殘基可為少於5個帶電荷胺基酸殘基、或少於4個帶電荷胺基酸殘基、或少於3個帶電荷胺基酸殘基、或少於2個帶電荷胺基酸殘基。在前述各實施例中，一或多個帶電荷胺基酸殘基可選自天冬胺酸及麩胺酸。 在前述各實施例中，條件性活性多肽可在該條件之第一值下可逆地不活化。 在前述各實施例中，第一及第二分析可在選自以下之物質存在下實施：組胺酸、組織胺、氫化二磷酸腺苷、硫化氫、氫化三磷酸腺苷、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、碳酸氫鹽、二硫化物、銨、磷酸二氫鹽及其組合。 在前述各實施例中，該條件之第一值可為正常生理條件之值，其在將條件性活性多肽投與個體之位點處或在個體之條件性活性多肽作用位點之組織或器官處之生理條件之正常範圍內；且該條件之第二值可為異常條件之值，其偏離在投與條件性活性多肽之位點處或在條件性活性多肽作用位點之組織或器官處之生理條件之正常範圍。 在前述各實施例中，條件性活性多肽可為蛋白質或蛋白質片段。在前述各實施例中，條件性活性多肽可為抗體、單鏈抗體及抗體片段，且活性係與抗原之結合活性；條件性活性多肽可為抗體Fc區；或條件性活性多肽可為酶且活性係酶活性，或條件性活性多肽可為受體、調控蛋白、可溶蛋白、細胞介素及受體、調控蛋白之片段、壓力蛋白、穹窿體相關蛋白、神經元蛋白、消化道蛋白、生長因子、粒線體蛋白、胞質蛋白、動物蛋白、結構蛋白及植物蛋白。 在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含有效量之前述任一實施例之條件性活性多肽及醫藥上可接受之載劑。 在前述各實施例中，醫藥組合物可進一步包含至少一種抗癌劑。在前述各實施例中，至少一種抗癌劑可為化學治療劑、輻射治療劑、激素治療劑、毒素或免疫治療劑。在前述各實施例中，至少一種抗癌劑可為選自以下之毒素：紫杉烷、類美登素(maytansinoid)、奧裡斯他汀(auristatin)、卡奇黴素(calicheamicin)、倍癌黴素(duocramycin)、mmae、安眠藥、金黴素(duomycin)、蒽環、CC-1065類似物、多西他賽(docetaxel)、細胞自溶酶、蓖麻毒蛋白(ricin)、白樹素(gelonin)、假單胞菌屬(Pseudomonas)外毒素、白喉毒素、RNase及毒性放射性同位素。在前述各實施例中，條件性活性多肽可偶聯至至少一種抗癌劑、或至少4種抗癌劑、或至少6種抗癌劑。 在另一態樣中，本發明提供前述各實施例之條件性活性多肽之用途，其用於治療實體腫瘤、發炎關節或腦疾病或病症，或自個體移除衰老細胞。 在另一態樣中，本發明提供治療實體腫瘤、發炎關節或腦疾病或病症之方法，其包含投與前述各實施例之條件性活性多肽之步驟。 在另一態樣中，本發明提供編碼前述各實施例之條件性活性多肽之核酸分子。在另一態樣中，本發明提供包含前述實施例之核酸分子之表現載體或包含此一表現載體之宿主細胞。 在另一態樣中，本發明提供診斷個體中癌症之存在之方法，其包含以下步驟：(a) 使個體之細胞或組織與前述各實施例之可檢測標記之條件性活性多肽接觸，其中條件性活性多肽結合至癌細胞上之靶；(b) 測定條件性活性多肽是否結合至個體之細胞或組織。 在前述各實施例中，使細胞或組織與條件性活性多肽接觸可在活體外進行。在前述各實施例中，使細胞或組織與條件性活性多肽接觸可在該個體體內進行。 在另一態樣中，本發明提供包含至少一個結合結構域之雙特異性抗體，該至少一個結合結構域含有至少一種前述實施例之條件性活性多肽。在另一態樣中，本發明提供含有兩個不同結合或催化結構域之嵌合蛋白，其中一個或兩個該等結構域包含至少一種前述實施例之條件性活性多肽。在另一態樣中，本發明提供包含至少一種前述實施例之條件性活性多肽之溶瘤病毒。 在另一態樣中，本發明提供自親代多肽製備條件性活性多肽之方法。在該方法中，使用一或多種選自以下之技術使編碼親代多肽之DNA演化以增加多肽之淨電荷：增加DNA中帶電荷胺基酸殘基之密碼子之總數, 減少DNA中不帶電荷胺基酸殘基之密碼子之總數或其組合，以產生突變體DNA。突變體DNA經表現獲得突變體多肽；且條件性活性多肽選自突變體多肽。所選擇條件性活性多肽展現與相同條件之第二值下第二分析中之相同活性相比，該條件之第一值下第一分析中之活性降低。帶電荷胺基酸殘基選自天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、離胺酸及組胺酸。 在前述各實施例中，演化步驟可採用定點誘變技術，視情況選自寡核苷酸介導之誘變、PCR誘變及盒式誘變。在前述各實施例中，演化步驟可採用密碼子取代或密碼子插入。 在前述各實施例中，帶電荷胺基酸殘基可選自天冬胺酸及麩胺酸。 在前述各實施例中，可將一或多個密碼子引入DNA之編碼親代多肽之活性位點之區域中。在前述各實施例中，親代多肽可為親代抗體且活性位點可為親代抗體之互補決定區。 在前述各實施例中，可將一或多個帶電荷胺基殘基引入親代多肽之活性位點外部之區域中。 在前述各實施例中，活性位點外部之區域可為抗體恆定區或抗體框架區。 在前述各實施例中，條件性活性多肽可該條件之第一值下可逆地不活化。 在前述各實施例中，條件可選自pH、溫度、滲透壓、滲透重量莫耳濃度、氧化壓力、電解質濃度及蛋白質濃度。 在前述各實施例中，第一及第二分析可在包含血液中發現之蛋白質之分析溶液中實施。在前述各實施例中，血液蛋白質可為白蛋白。 在前述各實施例中，第一及第二分析可在不存在血清之分析溶液中實施。 在前述各實施例中，第二條件之值可為正常生理條件之值，其在將條件性活性多肽投與個體之位點處或在個體之條件性活性多肽作用位點之組織或器官處之生理條件之正常範圍內；且第一條件之值可為異常條件之值，其偏離在投與條件性活性多肽之位點處或在條件性活性多肽作用位點之組織或器官處之生理條件之正常範圍。 在前述各實施例中，條件可為pH且第一及第二分析可在包括至少一種物質之分析介質中實施，該至少一種物質之分子量小於900 a.m.u.且pKa遠離pH之第一值多達3單位。 在前述各實施例中，條件可為pH且第一及第二分析可在包括至少一種物質之分析介質中實施，該至少一種物質之分子量小於900 a.m.u.且pKa介於pH之第二值與pH之第一值之間。 在前述各實施例中，第一及第二分析可在包括選自以下之物質之分析介質中實施：組胺酸、組織胺、氫化二磷酸腺苷、氫化三磷酸腺苷、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、硫化氫、二硫化物、銨、碳酸氫鹽、磷酸二氫鹽及其組合。 在前述各實施例中，選擇步驟可進一步包含基於選自親和力、表現程度及人類化之性質選擇條件性活性多肽。 在前述各實施例中，表現步驟可採用噬菌體展示或真核細胞產生宿主。在前述各實施例中，表現步驟可在真核細胞產生宿主中實施且所選條件性活性多肽可在相同真核細胞產生宿主中表現。
定義 為促進理解本文所提供之實例，將在本文中定義某些經常出現之方法及/或術語。以下術語之定義係自美國專利第8,709,755 B2號以引用方式併入：「試劑」、「多義鹼基需要」、「胺基酸」、「擴增」、「嵌合性質」、「同源」、「比較窗口」、「保守胺基酸取代」、「對應於」、「降解有效」、「確定序列框架」、「確定序列核」、「消化」、「定向連接」、「DNA改組」、「藥物」或「藥物分子」、「有效量」、「表位」、「酶」、「演化(evolution)」或「演化(evolving)」、「片段」或「衍生物」或「類似物」、「單一胺基酸取代之全部範圍」、「基因」、「遺傳不穩定」、「異源」、「同源」或「部分同源」、「工業應用」、「一致」或「一致性」、「一致性區域」、「經分離」、「經分離核酸」、「配體」、「連接」、「連接體」或「間隔體」、「微環境」、「欲演化之分子性質」、「突變」、「N,N,G/T」、「正常生理條件」或「野生型作用條件」、「核酸分子」、「核酸分子」、「編碼……之核酸序列」或「……之DNA編碼序列」或「編碼……之核苷酸序列」、「編碼酶(蛋白質)之核酸」或「編碼酶(蛋白質)之DNA」或「編碼酶(蛋白質)之多核苷酸」、「特定核酸分子物質」、「將工作核酸樣品裝配至核酸庫中」、「核酸庫」、「構築體」、「寡核苷酸(oligonucleotide)」(或同義地「寡核苷酸(oligo)」)、「同源」、「可操作連接」、「親代多核苷酸集」、「患者」或「個體」、「生理條件」、「群體」、「原-形式(pro-form)」、「偽隨機」、「准重複單元」、「隨機肽庫」、「隨機肽序列」、「受體」、「重組體」酶、「合成」酶、「相關多核苷酸」、「還原性重配」、「參照序列」、「重複指數(RI)」、「限制位點」、「可選擇多核苷酸」、「序列一致性」、「相似性」、「特異性結合」、「特異性雜交」、「特定多核苷酸」、「嚴格雜交條件」、「實質上一致」、「實質上純的酶」、「實質上純」、「治療」、「可變區段」及「變體」。 如本文結合所量測量所用術語「約」係指該所量測量之正常差異，其可由進行量測並以一定謹慎程度行事之熟習此項技術者所預期，且與量測目標及所用量測設備之精密度相稱。除非另外指示，否則「約」係指所提供值之+/- 10%之差異。 如本文所用術語「活性」係指蛋白質可發揮之任何功能，包括催化反應及結合至配偶體。對於酶，活性可為酶活性。對於抗體，活性可為抗體與其抗原之間之結合活性(即，結合活性)。對於受體或配體，活性可為受體與其配體之間之結合活性。 本文所用術語「過繼性細胞療法」係指將具有抗腫瘤活性之免疫細胞轉移至癌症患者中。過繼性細胞療法係涉及活體外鑑別具有抗腫瘤活性之淋巴球、活體外擴增該等細胞至大數目且將其輸注至患有癌症之宿主之治療方法。本發明尤其關注自體過繼性細胞療法，即其中欲轉移至癌症患者中之具有抗腫瘤活性之免疫細胞源自同一患者之過繼性細胞療法。 如本文所用術語「抗體」係指完整免疫球蛋白分子，以及能結合至抗原表位之免疫球蛋白分子之片段，例如Fab、Fab'、(Fab')2 、Fv即SCA片段。該等抗體片段保留衍生出其之抗體之選擇性結合至抗原(例如，多肽抗原)之一定能力，可使用業內熟知方法來製備(例如，參見Harlow即Lane，上文文獻)，且進一步闡述如下。抗體可用於藉由免疫親和層析分離製備量之抗原。該等抗體之各種其他用途係診斷疾病(例如，贅瘤形成)及/或將疾病分期，且用於治療性應用以治療疾病，例如：贅瘤形成、自體免疫疾病、AIDS、心血管疾病、感染及諸如此類。嵌合、人類樣、人類化或完全人類抗體尤其可用於投與人類患者。 Fab片段由抗體分子之單價抗原結合片段組成，且可藉由用木瓜酶消化完整抗體分子來產生，以得到由完整輕鏈及重鏈之一部分組成之片段。 抗體分子之Fab'片段可藉由用胃蛋白酶處理完整抗體分子、之後還原來獲得，以得到由完整輕鏈及重鏈之一部分組成之分子。以此方式處理之每個抗體分子獲得兩個Fab'片段。 抗體之(Fab')2片段可藉由在隨後不還原之情況下用胃蛋白酶處理完整抗體分子來獲得。(Fab')2 片段係藉由兩個二硫鍵固持在一起之兩個Fab'片段之二聚體。 Fv片段定義為遺傳工程化片段，其含有表現為雙鏈之輕鏈可變區及重鏈可變區。 單鏈抗體(「SCA」或scFv)係遺傳工程化單鏈分子，其含有藉由適宜撓性多肽連接體連接之輕鏈可變區及重鏈可變區，且其可在胺基末端及/或羧基末端包括額外胺基酸序列。舉例而言，單鏈抗體可包括用於連接至編碼多核苷酸之系帶區段。功能性單鏈抗體通常含有輕鏈可變區之足夠部分及重鏈可變區之足夠部分以保留全長抗體結合至特定靶分子或表位之性質。 術語「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指一種細胞毒性形式，其中所分泌免疫球蛋白結合至存在於某些細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性球及巨噬球)上之Fc受體(FcR)，使得該等細胞毒性效應細胞能特異性結合至帶有抗原之靶細胞且隨後用細胞毒素殺死該靶細胞。定向至靶細胞表面之配體特異性高親和力IgG抗體刺激細胞毒性細胞且為該殺死所需。靶細胞之裂解係在細胞外，需要細胞間直接接觸，且不涉及補體。 可分析任何特定抗體藉由ADCC介導靶細胞裂解之能力。為評價ADCC活性，將所關注抗體添加至展示靶配體之靶細胞與免疫效應細胞之組合，該等免疫效應細胞可藉由抗原抗體複合物活化，導致靶細胞之細胞溶解。細胞溶解通常係藉由自裂解細胞釋放之標記(例如，放射性受質、螢光染料或天然細胞內蛋白質)來檢測。可用於該等分析之效應細胞包括末梢血單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。活體外ADCC分析之具體實例闡述於以下文獻中：Bruggemann等人，1987,J. Exp. Med, 第166卷，第1351頁；Wilkinson等人，2001,J. Immunol. Methods, 第258卷，第183頁；Patel等人，1995J. Immunol. Methods, 第184卷，第29頁。或者或另外，所關注抗體之ADCC活性可在活體內、例如在動物模型中評價，例如Clynes等人，1998,PNAS USA, 第95卷，第652頁所揭示。 如本文所用術語「抗原」或「Ag」定義為能觸發免疫反應之分子。此免疫反應可涉及抗體產生或特異性免疫勝任細胞之活化或二者。熟習此項技術者將理解，包括幾乎所有蛋白質或肽在內之任何巨分子皆可用作抗原。顯而易見，抗原可產生，合成或可源自生物樣品。此一生物樣品可包括但不限於組織樣品、腫瘤樣品、細胞或生物流體。 如本文所用術語「反義RNA」係指能經由與另一RNA分子互補或部分互補與另一RNA分子形成雙鏈體之RNA分子。反義RNA分子可與另一RNA分子之轉譯或未轉譯區域互補。反義RNA無需與另一RNA分子完全互補。反義RNA可具有或可不具有另一RNA分子之相同長度；反義RNA分子可長於或短於另一RNA分子。若另一RNA分子係mRNA，則反義RNA之結合將防止mRNA完全或部分轉譯為功能性蛋白質產物。 術語「生物仿製藥(biosimilar)」或「後發生物製劑(follow-on biologic)」係以與美國食品藥品管理局(FDA)公佈之工作定義一致之方式來使用，該工作定義將生物仿製藥定義為與參照產品「高度相似」(但臨床上無活性之組分可存在微小差異)之產品。在實踐中，參照產品與生物仿製藥產品之間在安全性、純度及功效方面可無臨床上顯著之差異(Public Health Service (PHS) Act §262)。生物仿製藥亦可係滿足歐洲藥物管理局之人體用藥委員會(CHMP)於2012年5月30日通過且由歐盟以「Guideline on similar biological medicinal products containing monoclonal antibodies— non-clinical and clinical issues」(文件參考號EMA/CHMP/BMWP/403543/2010)發表之一或多個準則之產品。舉例而言，「生物仿製藥抗體」係指由不同公司製造之創新抗體(參照抗體)之後續形式通常。生物仿製藥抗體與參照抗體之間之差異可包括轉譯後修飾，例如將其他生物化學基團(例如磷酸酯、各種脂質及碳水化合物)附接至抗體；在轉譯後蛋白水解裂解；改變胺基酸之化學性質(例如，甲醯化)；或多種其他機制。其他轉譯後修飾可為製程操作之結果，例如可藉由使產物暴露於還原性糖來進行醣化。在一些情形中，儲存條件可容許發生某些降解路徑，例如氧化、去醯胺或聚集。如所有該等產物相關變體皆可包括於生物仿製藥抗體中。 術語「癌症」及「癌性」係指或闡述哺乳動物中通常特徵為細胞生長/增殖失調之生理病況。「腫瘤」包含一或多個癌細胞。癌症之實例包括但不限於癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴樣惡性病。該等癌症之更具體實例包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)；肺癌，包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌(「NSCLC」)、肺腺癌及肺鱗狀癌；腹膜癌；肝細胞癌；胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)，包括胃腸癌；胰臟癌、膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney cancer)或腎癌(renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、以及頭頸癌。 如本文所用術語「嵌合抗原受體」或「CAR」係指工程化受體，其將抗原特異性移植至細胞毒性細胞(例如T細胞、NK細胞及巨噬細胞)上。本發明CAR可包括至少一個抗原特異性靶向區域(ASTR)、細胞外間隙結構域(ESD)、跨膜結構域(TM)、一或多個共刺激結構域(CSD)及細胞內信號傳導結構域(ISD)。在一些實施例中，ESD及/或CSD係可選的。在一個實施例中，ASTR具有雙特異性且可識別兩種不同抗原或表位。在ASTR特異性結合至靶抗原後，ISD活化細胞毒性細胞之細胞內信號傳導。舉例而言，ISD可以非MHC限制性方式將T細胞特異性及細胞毒性朝向所選靶重定向，此依賴於CAR之抗原結合性質。非MHC限制性抗原識別給予表現CAR之細胞毒性細胞獨立於抗原處理識別抗原之能力，由此繞過腫瘤逃逸之主要機制。此外，在T細胞中表現時，CAR有利地不與內源T細胞受體(TCR) α及β鏈二聚化。 如本文所用術語「互補決定區」或「CDR」係指抗體中參與抗原結合之胺基酸殘基所位於之區域。CDR在抗體可變結構域之胺基酸比對中具有最高變異性。資料庫(例如Kabat資料庫)可用於CDR鑑別，CDR例如被定義為包含輕鏈可變結構域之胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)及89-97 (L3)以及重鏈可變結構域之31-35 (H1)、50- 65 (H2)及95-102 (H3) (Kabat等人，The Journal of Immunology , 第147卷，第1709-1719頁, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生及公共服務部, NIH公開號91-3242)。或者，CDR可定義為彼等來自「超變環」之殘基(輕鏈可變結構域中之殘基26-33 (L1)、50-52 (L2)及91 -96 (L3)以及重鏈可變結構域中之26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)) (Chothia及Lesk,J. Mol. Biol 1987；196: 901 -917)。通常，可變結構域中胺基酸殘基之編號係藉由Kabat等人(上文文獻)中所述之方法來實施。本文中諸如「Kabat位置」、「Kabat殘基」及「根據Kabat」等片語係指Kabat等人針對重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域所述之編號系統。使用Kabat編號系統，可變結構域之實際線性胺基酸序列可含有較少或額外之對應於可變結構域框架(FR)或CDR之縮短或插入之胺基酸。舉例而言，重鏈可變結構域可包括在CDR H2之殘基52後之胺基酸插入(根據Kabat，殘基52a、52b及52c)及在重鏈FR殘基82後之插入殘基(例如，根據Kabat，殘基82a、82b及82c等)。可藉由抗體序列與「標準」Kabat編號序列之同源區之比對來確定給定抗體中殘基之Kabat編號。 術語「條件性活性多肽」係指親代多肽之變體或突變體，其在至少一種條件下之活性高於親代多肽且在第二條件下之活性低於親代多肽，或係指親代多肽之變體或突變體，其中該變體或突變體多肽在第一條件下之活性係在第二條件下之至少1.3倍。此條件性活性多肽可在身體一或多個所選位置展現活性，及/或在身體另一位置展現增加或降低之活性。舉例而言，在一態樣中，經演化條件性活性多肽在體溫下實際上無活性，但在較低溫度下有活性。條件性活性多肽包括條件性活性蛋白質、蛋白質片段、抗體、抗體片段、酶、酶片段、受體及受體片段、細胞介素及其片段、激素及其片段、配體及其片段、調控蛋白及其片段及生長因子及其片段。本文所述各條件性活性多肽較佳係條件性活性生物多肽。 如本文所用術語「細胞介素」係指一大類生物分子，其實現/影響免疫系統之細胞。該定義意欲包括但不限於彼等局部作用或經由血液循環在遠離分泌位點之其他位置作用以調控或調節個體免疫反應之生物分子。實例性細胞介素包括但不限於干擾素-α (IFN-α)、干擾素-β (IFN-β)及干擾素-γ (IFN-γ)、介白素(例如，IL-1至IL-29，特定而言IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15及IL-18)、腫瘤壞死因子(例如，TNF-α及TNF-β)、促紅血球生成素(EPO)、MIP3a、單核球趨化蛋白(MCP)-1、細胞內黏著分子(ICAM)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)及顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)。 如本文所用術語「電解質」用於定義血液或其他體液中攜帶電荷之礦物質。舉例而言，在一態樣中，正常生理條件及異常條件可具有不同「電解質濃度」值。實例性電解質包括但不限於離子化鈣、鈉、鉀、鎂、鹽酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、碳酸氫鹽及磷酸鹽。 術語「全長抗體」係指包含抗原-結合可變區(VH 或VL )以及輕鏈恆定結構域(CL)及重鏈恆定結構域CH1、CH2及CH3之抗體。恆定結構域可為天然序列恆定結構域(例如人類天然序列恆定結構域)或其胺基酸序列變體。端視全長抗體重鏈中恆定結構域之胺基酸序列，可將該等全長抗體指定為不同「類別」。全長抗體有5個主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等類別中之若干種可進一步分為「子類」(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。對應於不同抗體類別之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。 如本文所用術語「生長因子」係指能完成細胞分化之多肽分子。生長因子之實例包括但不限於表皮生長因子(EGF)、轉變生長因子-α(TGFα)、轉變生長因子-β(TGF-β)、人類內皮細胞生長因子(ECGF)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、骨形態演發蛋白(BMP)、神經生長因子(NGF)、血管內皮生長因子(NEGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、軟骨源形態演發蛋白(CDMP)及血小板源生長因子(PDGF)。 如本文所用術語「激素」指示通常鑑別為介導物之物質，其通常由生物體之一部分中之細胞或腺體釋放，用作與生物體其他部分之信使。實例性激素包含直接釋放至血流中之內分泌激素及直接分泌至導管中且其自該導管流至血流中或藉由在稱為旁分泌信號傳導之過程中擴散自細胞流至細胞之外分泌激素(或外激素)。脊椎動物激素可歸類為以下三個化學類別：肽激素、脂質及磷脂源激素以及單胺. 肽激素由多肽鏈組成。肽激素之實例包括胰島素及生長激素。脂質及磷脂源激素源自脂質(例如亞麻油酸及花生油酸)及磷脂。主要類別係源自膽固醇及類花生酸之類固醇激素。類固醇激素之實例係睪固酮及皮質醇。單胺藉由芳香族胺基酸去羧酶之作用源自芳香族，例如苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸。單胺之實例係甲狀腺素及腎上腺素。 如本文所用術語「免疫調節劑」係指其對免疫系統之作用導致至少一個參與免疫反應之路徑之活性立即或延遲增強或下降之藥劑。該反應可作為先天或適應性免疫系統或二者之部分經天然或人工觸發。免疫調節劑之實例包括細胞介素、幹細胞生長因子、淋巴毒素(例如腫瘤壞死因子(TNF))及造血因子(例如介白素(例如，介白素-1 (IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18及IL-21))、群落刺激因子(例如，顆粒球-群落刺激因子(G-CSF)及顆粒球巨噬細胞-群落刺激因子(GM-CSF))、干擾素(例如，干擾素-α、-β及-γ)、命名為「S1因子」之幹細胞生長因子、促紅血球生成素及促血小板生成素。適宜免疫調節劑部分之實例包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素、TNF (例如，TNF-α)及諸如此類。 「個體(individual)」或「個體(subject)」係哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養動物(例如，牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，例如猴子)、兔及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。 如本文所用術語「庫」係指單一池中之蛋白質集合。庫可使用DNA重組技術來產生。舉例而言，可將cDNA或任何其他蛋白質編碼DNA之集合插入表現載體中以產生蛋白質庫。亦可將cDNA或蛋白質編碼DNA之集合插入噬菌體基因體中以產生野生型蛋白質之噬菌體展示庫。cDNA集合可自所選細胞群體或組織樣品產生，例如藉由Sambrook等人(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)揭示之方法來產生。來自所選細胞類型之cDNA集合亦可自供應商(例如Stratagene®)購得。如本文所用野生型蛋白質庫並非生物樣品之集合。 如本文所用術語「配體」係指由特定受體識別且特異性結合一或多個結合位點中之該受體之分子。配體之實例包括但不限於細胞膜受體之激動劑及拮抗劑、毒素及毒液、病毒表位、激素、激素受體、肽、酶、酶受質、輔因子、藥物(例如鴉片劑、類固醇等)、凝集素、糖、多核苷酸、核酸、寡醣、蛋白質及單株抗體。通常，配體包含兩個結構部分：第一部分，其參與配體與其受體之結合；及第二部分，其不參與該結合。 如本文所用術語「受體」係指對給定配體具有親和力之分子。受體可為天然或合成分子。受體可以未改變狀態或作為與其他物質之聚集體來使用。受體可直接或經由特定結合物質共價或非共價地附接至結合構件。受體之實例包括但不限於與特定抗原性決定子(例如在病毒、細胞或其他材料上)具有反應性之抗體(包括單株抗體及抗血清)、細胞膜受體、複雜碳水化合物及醣蛋白、酶及激素受體。配體與其受體之結合指示配體與其受體分子經由特異性分子識別組合以形成複合物，該複合物可藉由熟習此項技術者已知之多種配體受體結合分析來檢測。 如本文所用術語「微小RNA」或「miRNA」係指來自miRNA基因之未經處理或經處理RNA轉錄物。未經處理微小RNA基因轉錄物通常包含長度為約70-100個核苷酸之RNA轉錄物。經轉錄微小RNA可藉由用RNase (例如Dicer、Argonaut或RNase III)消化為19-25個核苷酸之活性RNA分子來處理。此19-25個核苷酸之活性RNA分子亦稱為「經處理」微小RNA基因轉錄物或「成熟」微小RNA。 如本文所用術語「多特異性抗體」係指對至少兩個不同表位具有結合特異性之抗體。實例性多特異性抗體可結合BBB-R及腦抗原二者。多特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab′)2 雙特異性抗體)。亦涵蓋具有2個、3個或更多個(例如4個)功能性抗原結合位點之工程化抗體(例如，參見US 2002/0004587 A1)。 如本文所用術語「誘變性引子」係指用於線性環狀擴增反應(例如聚合酶鏈式反應或PCR)中之寡核苷酸引子，其中該引子與模板DNA序列不精確匹配。誘變性引子中之失配核苷酸稱為關於誘變性引子之突變位點。因此，在擴增反應期間，將引子之失配核苷酸納入擴增產物中，由此導致合成包含誘變性引子之經誘變DNA股。誘變性引子由此可將特定突變引入模板DNA序列中。 如本文所用術語「奈米顆粒」係指微觀顆粒，其大小為奈米(nm)級且最大線性尺寸小於約1000 nm或小於約500 nm、或小於約200 nm、或小於約100 nm、或小於約50 nm。如本文所用線性尺寸係指奈米顆粒上任兩點之間如按直線量測之距離。本發明奈米顆粒之形狀可為不規則、長方形、紡錘形、棒狀、盤形、餅狀、圓柱形、紅血球樣、球形或大體球形，只要其形狀及大小容許結合相互作用即可。本發明奈米顆粒較佳係自生物相容材料(聚合物或脂質)製得。 如應用於物體之如本文所用術語「天然的」係指以下事實：一物體可在自然界中發現。舉例而言，可自自然界中來源分離且尚未在實驗室中由人有意修飾之存在於生物體(包括病毒)中之多肽或多核苷酸序列係天然的。自較大多肽切除之多肽並非天然多肽，此乃因所切除多肽之端基在切除形式中與在較大天然多肽中不同，此乃因該等端基將不再結合至毗鄰多肽。通常，術語天然的係指存在於非病理性(未患病)個體中之物體，例如對於物種可為典型的。 術語多肽之「淨電荷」係多肽中帶電荷胺基酸殘基之總數與多肽中胺基酸殘基總數之比率。帶電荷胺基酸殘基包括天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、離胺酸及視情況組胺酸。不帶電荷胺基酸殘基包括其他15種天然胺基酸。多肽淨電荷可藉由增加多肽中帶電荷胺基酸殘基之總數、減少多肽中不帶電荷胺基酸殘基之總數或其組合來增加。 如本文所用術語「氧化壓力」係指例如作為利用分子氧之代謝過程的副產物(例如，參見Coyle等人，Science 262:689-695 (1993))產生之反應性氧自由基(例如，超氧化物陰離子(O2 '')、一氧化氮、羥基自由基(OH)及過氧化氫(H2 O2 ))之產生與生物系統容易地使反應性中間體去毒或容易地修復所致損傷之能力之間之不平衡。氧化壓力可係指活體外或活體內動物細胞或組織之狀態。活細胞內正常氧化還原狀態之擾動可經由產生損害細胞所有組分(包括蛋白質、脂質及DNA)之過氧化物及自由基而引起毒性效應。 在人類中，氧化壓力參與多種疾病，例如動脈粥樣硬化、帕金森氏病(Parkinson's disease)、心臟衰竭、心肌梗塞、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、X染色體易裂症候群及慢性疲勞症候群，但短期氧化壓力亦可藉由誘導粒線體激效(mitohormesis)在預防老化中起重要作用。活性含氧物可係有益的，此乃因其被免疫系統用作攻擊並殺死病原體之手段。活性含氧物亦用於細胞信號傳導中。此稱為氧化還原信號傳導。 在化學方面，氧化壓力係細胞還原電位升高(負性變低)，或細胞氧化還原電對(例如麩胱甘肽)之還原能力下降。氧化壓力之效應取決於該等變化之大小，且細胞能克服小的干擾並恢復其初始狀態。然而，更嚴重氧化壓力可引起細胞死亡且甚至中度氧化可觸發細胞凋亡，而更強壓力可引起壞死。 如本文所用術語「親代多肽」及「親代蛋白質」係指可使用本發明方法演化以產生條件性活性多肽或蛋白質之多肽或蛋白質。親代多肽蛋白質可為野生型蛋白質或非野生型蛋白質。舉例而言，治療性多肽或蛋白質或突變體或變體多肽或蛋白質可用作親代多肽或蛋白質。親代多肽及蛋白質之實例包括抗體、抗體片段、酶、酶片段、細胞介素及其片段、激素及其片段、配體及其片段、受體及其片段、調控蛋白及其片段以及生長因子及其片段。 如本文所用術語「pH依賴性」係指性質或活性在不同pH值下不同之多肽。 如本文所用術語「多肽」係指其中單體係胺基酸且經由肽或二硫鍵接合在一起之聚合物。多肽可為全長天然胺基酸鏈或片段、其突變體或變體，例如胺基酸鏈中在結合相互作用方面受關注之所選區域。多肽亦可為合成胺基酸鏈，或天然胺基酸鏈或其片段與合成胺基酸鏈之組合。片段係指係全長蛋白質一部分之胺基酸序列且通常長度介於約8與約500個胺基酸之間，長度為較佳約8至約300個胺基酸、更佳約8至約200個胺基酸且甚至更佳約10至約50或100個胺基酸。另外，多肽中可包括並非天然胺基酸之胺基酸(例如β-丙胺酸、苯基甘胺酸及高精胺酸)。多肽中亦可包括經常遇到之非基因編碼之胺基酸。胺基酸可為D-或L-光學異構物。D-異構物較佳用於下文進一步闡述之特定情況中。另外，其他肽模擬物亦可用於例如多肽連接體序列中(參見Spatola, 1983，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides and Proteins, Weinstein編輯，Marcel Dekker, New York, 第267頁)。一般而言，術語「蛋白質」不欲傳達除了包括包含兩個或若干個藉由共價或非共價鍵固持在一起之多肽鏈之結構以外，與術語「多肽」之任何顯著差異。 如本文所用術語「前藥」係指前體化合物，其將在活體內經歷代謝活化以產生活性藥物。充分論述提供於T. Higuchi及V. Stella, 「Pro-drugs as Novel Delivery Systems,」 A.C.S. Symposium Series第14卷；及Edward B. Roche編輯，「Bioreversible Carriers in Drug Design,」 American Pharmaceutical Association and Pergamon Press (1987)中。 如本文所用術語「重組體抗體」係指由包含編碼抗體之核酸之宿主細胞表現之抗體(例如嵌合、人類化或人類抗體或其抗原結合片段)。用於產生重組體抗體之「宿主細胞」之實例：(1) 哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)、COS、骨髓瘤細胞(包括Y0及NS0細胞)、幼小倉鼠腎(BHK)、Hela及Vero細胞；(2) 昆蟲細胞，例如sf9、sf21及Tn5；(3) 植物細胞，例如屬菸草屬(Nicotiana )之植物(例如菸草(Nicotiana tabacum ))；(4) 酵母細胞，例如彼等屬酵母菌屬(Saccharomyces ) (例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ))或麴菌屬(Aspergillus ) (例如黑麯黴(Aspergillus niger ))者；(5) 細菌細胞，例如大腸桿菌(Escherichia. coli )細胞 或枯草桿菌(Bacillus subtilis )細胞等。 如本文所用術語「調控蛋白」係指任何蛋白質，其增加或降低另一多肽或RNA分子之活性；增加或降低另一多肽或RNA分子之豐度；改變另一多肽或RNA分子與其他多肽、DNA或RNA分子或任何其他結合受質之間之相互作用；及/或改變另一多肽或RNA分子之細胞位置。調控蛋白在增加或降低基因轉錄率時，通常將其稱為對基因啟動子或增強子區域有效應之轉錄因子。轉錄因子之實例包括哺乳動物轉錄因子，例如NFkB、NF1、環狀AMP反應元件結合蛋白(CREB)、MyoDl、同源異形盒轉錄因子、Spl、致癌基因及jun、Mep-1、GATA-1、Isl-1、LFB1、NFAT、Pit- 1、OCA-B、Oct-1及Oct-2、酵母A/α、cErb-A、myc、mad及max、p53、mdml以及Latchman, 1998, Eukaryotic Transcription Factors, 第三版，Academic Press: New York中所述之其他轉錄因子。亦可使用該等或其他轉錄因子之融合蛋白衍生物(其中至少融合蛋白之提供結合特異性之DNA結合基序融合至小分子調控劑結合位點)。 如本文所用術語「定點誘變」係指其中在親代多肽中之確定位點產生預定突變之方法。確定位點係指如根據研究需要所期望選擇之位點。預定突變可為用特定胺基酸取代確定位點之胺基酸殘基、在確定位點插入特定胺基酸殘基或在確定位點缺失特定胺基。 如本文所用術語「小干擾RNA」或「siRNA」係指RNA或RNA樣分子，其可相互作用且引起與siRNA共享序列同源性之mRNA分子之破壞(Elbashir等人，Genes Dev , 第15卷，第188-200頁，2001)。人們認為，可將siRNA納入稱為RNA誘導沉默複合物(RISC)之核糖核蛋白複合物中。RISC使用siRNA序列鑑別與所納入siRNA股至少部分互補之mRNA分子，隨後裂解該等靶mRNA分子或抑制其轉譯。典型siRNA係雙股核酸分子，每股具有約19至約28個核苷酸(即約19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個核苷酸)。siRNA亦可係單股RNA，但不如雙股siRNA有效。單股siRNA之長度為約19至約49個核苷酸。單股siRNA具有5′磷酸酯或在原位或活體內在5′位置磷酸化。單股siRNA可以化學方式或藉由活體外轉錄合成，或自表現載體或表現盒內源表現。5′磷酸酯基團可經由激酶添加，或可係RNA之核酸酶裂解之結果。 術語「小分子」係指分子量通常小於900 a.m.u.或更佳小於500 a.m.u.或更佳小於200 a.m.u.或甚至更佳小於100 a.m.u.之分子或離子。在本發明之分析及環境中，小分子通常可作為分子混合物及分子之去質子化離子存在，主要取決於分析或環境之pH。 如本文所用術語「治療性蛋白質」係指任何蛋白質及/或多肽，其可投與哺乳動物以引發組織、系統、動物或人類之例如研究者或臨床醫師所尋求之生物或醫學反應。治療性蛋白質可引發多於一種生物或醫學反應。治療性蛋白質之實例包括抗體、酶、激素、細胞介素、調控蛋白及其片段。 如本文所用術語「治療有效量」意指任何量，與未接受該量之相應個體相比，該量導致但不限於疾病、病症或副作用之癒合、預防或改善，或疾病或病症之進展率之降低。該術語之範圍內亦包括有效增強正常生理功能之量以及有效引起患者之增強或有助於另一醫藥劑之治療效應之生理功能之量。 如本文所用術語「腫瘤微環境」係指實體腫瘤中或周圍支持腫瘤細胞生長及轉移之微環境。腫瘤微環境包括血管周圍、免疫細胞、纖維母細胞、其他細胞、可溶性因子、信號傳導分子、細胞外基質及機械信號，其可促進腫瘤轉變，支持腫瘤生長及侵襲，針對宿主免疫性保護腫瘤，培養治療抗性，且提供休眠性轉移之利基以順利生長。腫瘤及其周圍微環境密切相關且不斷相互作用。腫瘤可藉由釋放細胞外信號、促進腫瘤血管生成及誘導周圍免疫耐受性來影響其微環境，而微環境中之免疫細胞可影響癌細胞之生長及演化。參見Swarts等人，「Tumor Microenvironment Complexity: Emerging Roles in Cancer Therapy」，Cancer Res , 第72卷，第2473-2480頁, 2012；Weber等人，「The tumor microenvironment」，Surgical Oncology , 第21卷，第172-177頁, 2012；Blagosklonny, 「Antiangiogenic therapy and tumor progression」，Cancer Cell , 第5卷，第13-17頁, 2004；Siemann, 「Tumor microenvironment」，Wiley, 2010；及Bagley, 「The tumor microenvironment」，Springer, 2010。 如本文所用術語「野生型」意指，多核苷酸不包含任何突變。「野生型蛋白質」、「野生型蛋白質」、「野生型生物蛋白質」或「野生型生物蛋白質」可係指可自自然界分離且將具有在自然界中發現之活性程度之活性且將包含在自然界中發現之胺基酸序列之蛋白質。術語「親代分子」及「靶蛋白」亦涵蓋野生型蛋白質。 A. 條件性活性多肽 本發明提供條件性活性多肽及自親代多肽產生條件性活性多肽之方法。條件性活性多肽具有與親代多肽相比增加之淨電荷。淨電荷增加可藉由將一或多個帶電荷胺基酸殘基引入親代多肽中或藉由自親代多肽缺失一或多個不帶電荷胺基酸殘基或二者來產生，由此增加親代多肽之淨電荷。帶電荷胺基酸殘基選自天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、離胺酸及組胺酸。在一態樣中，突變可為用一或多個帶電荷胺基酸殘基替代親代多肽中之一或多個不帶電荷胺基酸殘基之取代。在另一態樣中，突變可為將一或多個額外帶電荷胺基酸殘基插入親代多肽中之插入。亦可採用該等取代及插入之組合。在另一態樣中，突變可為自親代多肽缺失一或多個不帶電荷胺基酸殘基。 引入親代多肽中之帶電荷胺基酸殘基係D (天冬胺酸或Asp)、E (麩胺酸或Glu)、R (精胺酸或Arg)、K (離胺酸或Lys)及H (組胺酸或His)。D及E係帶負電荷胺基酸殘基。R、K及H係帶正電荷胺基酸殘基。天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸及精胺酸通常在正常生理pH下帶電荷。組胺酸亦可在正常生理pH下帶電荷。 提供有增加數目之帶電荷胺基酸殘基之條件性活性多肽展現以下二者：(a) 與第一分析中親代多肽之相同活性相比，條件之第一值下第一分析中之活性降低，及(b) 與第二分析中親代多肽之相同活性相比，在相同條件之第二值下第二分析中之相同活性增加。 在一些實施例中，條件性活性多肽展現與相同條件之第二值下第二分析中之相同活性相比，條件之第一值下第一分析中之活性降低。 在一態樣中，條件性活性多肽可為針對Axl蛋白質之抗體之輕鏈可變區(SEQ ID NOS: 2-5)，自具有SEQ ID NO: 1之親代輕鏈可變區產生。在另一態樣中，條件性活性多肽可為針對Axl蛋白質之抗體之重鏈可變區(SEQ ID NOS: 7-9)，自具有SEQ ID NO: 6之親代重鏈可變區產生。在另一態樣中，條件性活性抗體可含有選自SEQ ID NOS: 2-5之輕鏈可變區及選自SEQ ID NOS: 7-9之重鏈可變區二者。 在另一態樣中，條件性活性多肽係針對Ror2蛋白質之抗體之輕鏈可變區(SEQ ID NOS: 11-13)，自具有SEQ ID NO: 10之親代輕鏈可變區產生。在另一態樣中，條件性活性多肽係針對Ror2蛋白質之抗體之重鏈可變區(SEQ ID NOS: 15-18)，自具有SEQ ID NO: 14之親代重鏈可變區產生。在另一態樣中，條件性活性抗體可含有選自SEQ ID NOS: 11-13之輕鏈可變區及選自SEQ ID NOS: 15-18之重鏈可變區二者。 針對Axl或Ror2之條件性活性抗體進一步闡述於本發明之實例15-22中。該等條件性活性輕鏈可變區及重鏈可變區包括胺基酸取代，其中將帶電荷胺基酸殘基、尤其E及D引入親代輕鏈可變區及親代重鏈可變區之互補決定區中。 實施分析之條件係相同條件，但具有不同的第一及第二值或範圍。舉例而言，條件可為pH，使得第二正常生理pH (正常生理條件)為7.0至7.8或7.2-7.6，而第一異常pH (作為異常條件)為5.8至7.0或6.2-6.8。條件亦可為但不限於溫度、電解質濃度、有機分子濃度或滲透壓。 在一態樣中，條件係pH且條件性活性多肽在pKa在期望活性之pH之2 pH單位或3 pH單位內之物質存在下具有pH依賴性活性。在另一態樣中，本發明係關於條件性活性多肽，其在pKa為約4至約10、或約4.5至約9.5、或約5至約9、或約5.5至約8、或約6.0至約7.0之物質存在下具有pH依賴性活性。在另一態樣中，本發明係關於條件性活性多肽，其在選自二硫化物、碳酸氫鹽、組胺酸、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽及其混合物之物質存在下具有pH依賴性活性。 存於分析介質中對條件性活性多肽之活性具有顯著影響之物質往往係具有至少兩個離子化狀態之物質：不帶電荷或帶較少電荷之狀態，及帶電荷或帶更多電荷之狀態。因此，影響條件性活性多肽之活性之物質之pKa可在確定該物質將對多肽之特定活性及/或在特定pH下所具有之影響程度時起作用。 pH依賴性條件性活性多肽在第一pH下較在不同第二pH下具有較高活性，兩個活性係在一或多種上文所列物質存在下在分析中量測。為確定條件性活性多肽之pH依賴性，在相同分析介質中在兩種不同pH值下分析多肽之相同活性。 在相同分析介質中在第一pH下之活性對在第二pH下之相同活性之比率可稱為pH依賴性條件性活性多肽之選擇性。pH依賴性條件性活性多肽具有至少約1.3、或至少約1.5、或至少約1.7、或至少約2.0、或至少約3.0、或至少約4.0、或至少約6.0、或至少約8.0、或至少約10.0、或至少約20.0、或至少約40.0、或至少約60.0、或至少約100.0之選擇性。 亦觀察到，pH依賴性條件性活性多肽通常在分析介質中之不同物質存在下具有不同活性。具有至少兩個離子化狀態(即不帶電荷或帶較少電荷之狀態以及帶電荷或帶較多電荷之狀態)之物質可端視pKa值，在特定pH下以較大程度解離，由此增加與存於條件性活性多肽中之帶電荷胺基酸殘基相互作用之機率。此因素可用於增強條件性活性多肽之選擇性及/或pH依賴性活性。 不受限於理論，人們認為，隨著分析介質中之pH改變，引入親代多肽中之帶電荷胺基酸殘基藉由改變條件性活性多肽上之電荷而改變條件性活性多肽在不同pH下之活性。舉例而言，在分析介質中之pH在酸性pH範圍中時，條件性活性多肽中之帶負電荷胺基酸殘基(例如，E及D)不帶電荷或帶較少電荷，但在分析介質中之pH為中性或在鹼性pH範圍中時，帶負電荷。人們認為，條件性活性多肽上之電荷變化使得多肽能在不同pH值下與上文所論述之物質中之一者不同地相互作用。在一態樣中，條件性活性多肽在一個pH下更有可能與分析介質中之帶電荷物質相互作用，但在另一不同pH下較不可能與相同分析介質中之相同帶電荷物質相互作用。此繼而被認為會影響條件性活性多肽之活性。 條件性活性多肽上電荷之性質可為用於確定影響條件性活性多肽之活性之適宜物質之一個因子。在一些實施例中，與親代多肽相比，條件性活性多肽可具有更多帶正電荷胺基酸殘基：離胺酸、精胺酸及組胺酸。條件性活性多肽可由此經選擇以具有與其中期望該活性之環境中存在之特定物質之期望相互作用程度，及/或具有與其中期望降低活性之環境中存在之特定物質之期望相互作用程度。類似地，與親代多肽相比，條件性活性多肽可具有更多帶負電荷胺基酸殘基：天冬胺酸根及麩胺酸根。 帶電荷胺基酸殘基在pH依賴性條件性活性多肽上之位置亦可影響活性。舉例而言，可使用靠近條件性活性多肽之結合位點之帶電荷胺基酸殘基來影響多肽活性。 在一些實施例中，帶電荷環境物質與條件性活性多肽之相互作用可阻斷或妨礙pH依賴性條件性活性多肽之活性。舉例而言，與帶電荷環境物質相互作用之帶電荷胺基酸可表現對條件性活性多肽之結合位點之別位效應。 在其他實施例中，帶電荷環境物質與條件性活性多肽之相互作用可在多肽上不同部分(尤其帶電荷或極性化之部分)之間形成鹽橋。已知鹽橋之形成可穩定多肽結構(Donald等人，「Salt Bridges: Geometrically Specific, Designable Interactions,」Proteins, 79(3): 898-915, 2011；Hendsch等人，「Do salt bridges stabilize proteins? A continuum electrostatic analysis,」Protein Science , 3:211-226, 1994).鹽橋可穩定或固定通常經歷稱為「呼吸(breathing)」之恆定微小結構變化之蛋白質結構(Parak, 「Proteins in action: the physics of structural fluctuations and conformational changes」，Curr Opin Struct Biol ., 13(5):552-557, 2003)。蛋白質結構「呼吸」對蛋白質功能及其與其配偶體之結合十分重要，此乃因結構波動允許條件性活性蛋白質有效識別並結合至其配偶體(Karplus等人，「Molecular dynamics and protein functions,」PNAS , 第102卷，第6679-6685頁, 2015)。藉由形成鹽橋，條件性活性多肽上之結合位點(尤其結合袋)可較不可及其配偶體，可能係由於鹽橋可直接阻斷配偶體到達結合位點所致。即使鹽橋離結合位點較遠，別位效應亦可改變結合位點之構形以抑制結合。因此，在鹽橋穩定(固定)條件性活性多肽之結構後，多肽可變得與其配偶體之結合活性較低，導致活性降低。 多肽及其結構如何被鹽橋穩定化之一個已知實例係血紅素。結構及化學研究已揭露，至少兩組化學基團負責鹽橋：組胺酸β146及α122之胺基末端及側鏈，其pKa值接近pH 7。在去氧血紅素中，β146之末端羧基與另一αβ二聚體之α亞單元中之離胺酸殘基形成鹽橋。此相互作用將組胺酸β146之側鏈鎖定在其可與同一鏈中之帶負電荷之天冬胺酸94一起參與鹽橋之位置，條件係組胺酸殘基之咪唑基團經質子化(圖6)。在高pH下，組胺酸β146之側鏈不經質子化且不形成鹽橋。然而，隨著pH降低，組胺酸β146之側鏈變得經質子化，組胺酸β146與天冬胺酸β94之間形成鹽橋，其穩定去氧血紅素之四級結構，導致更大的在代謝活躍組織(具有較低pH)處釋放氧之傾向。血紅素顯示對氧之pH依賴性結合活性，其中在低pH下，對氧之結合活性由於形成鹽橋而下降。另一方面，在高pH下，對氧之結合活性由於不存在鹽橋而增加。 類似地，諸如碳酸氫鹽等小分子可藉由在條件性活性多肽中形成鹽橋來降低條件性活性多肽與其配偶體之結合活性。舉例而言，在低於其6.4之pKa之pH下，碳酸氫鹽經質子化且由此不帶電荷。不帶電荷之碳酸氫鹽不能形成鹽橋，因此對條件性活性多肽與其配偶體之結合幾乎無影響。因此，在低pH下，條件性活性多肽與其配偶體具有高結合活性。另一方面，在大於碳酸氫鹽之pKa之高pH下，碳酸氫鹽因失去質子而離子化，由此變得帶負電荷。帶負電荷之碳酸氫鹽將在條件性活性多肽上之帶正電荷之部分或極性化部分之間形成鹽橋以穩定條件性活性多肽之結構。此將阻斷或降低條件性活性多肽與其配偶體之結合。因此，條件性活性多肽在高pH下具有低活性。條件性活性多肽因此在碳酸氫鹽存在下具有條件性活性之活性，其中在低pH下之結合活性高於在高pH下之結合活性。 在分析介質中不存在諸如碳酸氫鹽等物質時，條件性活性多肽可喪失其條件性活性。此可能係由於缺少條件性活性多肽上之鹽橋來穩定(固定)多肽結構所致。因此，在任一pH下配偶體將對條件性活性多肽上之結合位點具有類似可及性，從而在第一pH及第二pH下產生類似活性。 在其他實施例中，小分子或離子與條件性活性多肽之間之相互作用可以增加其活性之方式改變多肽結構。舉例而言，結構改變可藉由改變結合親和性所需結合位點之位置、立體阻礙或結合能而改良條件性活性多肽之結合親和性。在該等情形中，可期望選擇在期望活性之pH下結合至條件性活性多肽之小分子。 應理解，儘管鹽橋(離子鍵)係化合物及離子影響條件性活性多肽之活性之最強且最常見方式，該等化合物及離子與條件性活性多肽之間之其他相互作用亦可有助於穩定(固定)條件性活性多肽之結構。其他相互作用包括氫鍵、疏水相互作用及凡得瓦(van der Waals)相互作用。 在一些實施例中，為選擇適宜化合物或離子，將條件性活性多肽與演化出其之親代多肽相比較，以確定條件性活性多肽是否具有較高比例之帶負電荷胺基酸殘基或帶正電荷胺基酸殘基。隨後可分別選擇在第二pH下具有適宜電荷之化合物來影響條件性活性多肽之活性。舉例而言，在條件性活性多肽所具有帶正電荷胺基酸殘基之比例高於親代多肽時，適宜小分子通常應在第二pH下帶負電荷以與條件性活性多肽相互作用。另一方面，在條件性活性多肽所具有帶負電荷胺基酸殘基之比例高於親代多肽時，適宜小分子通常應在第二pH下帶正電荷以與條件性活性多肽相互作用。 在其他實施例中，條件性活性多肽之活性受小分子或離子與係條件性活性多肽之結合配偶體之靶多肽之相互作用的控制。在此情形中，亦適用上文所論述相同原理，但目標係產生小分子或離子與靶多肽之間之相互作用。靶多肽可為例如條件性活性抗體之抗原或條件性活性受體之配體。 適宜小分子可為自第一pH下不帶電荷或帶較少電荷之狀態轉換至第二pH下帶電荷或帶較多電荷之狀態的任何無機或有機分子。因此，小分子之pKa通常應介於第一pH與第二pH之間。舉例而言，碳酸氫鹽之pKa為6.4。因此，在較高pH(例如pH 7.4)下，帶負電荷之碳酸氫鹽將結合至條件性活性多肽中之帶電荷胺基酸殘基且降低活性。另一方面，在較低pH(例如pH 6.0)下，帶較少電荷之碳酸氫鹽將不以相同量結合至條件性活性多肽且由此容許條件性活性多肽之較高活性。 二硫化物之pKa為7.05。因此，在較高pH(例如pH 7.4)下，帶更多負電荷之二硫化物將結合至條件性活性多肽中之帶正電荷胺基酸殘基且降低其活性。另一方面，在較低pH(例如pH 6.2-6.8)下，帶較少電荷之硫化氫/二硫化物將不以相同程度結合至條件性活性多肽且由此容許條件性活性多肽之較高活性。 pKa介於第一與第二pH之間之小分子較佳用於本發明。較佳物質選自二硫化物、碳酸氫鹽、組胺酸、組織胺、檸檬酸鹽、乙酸鹽及乳酸鹽。該等小分子各自具有介於6.2與7.0之間之pKa。此外，亦可使用其他小分子，例如三(羥甲基)甲基甘胺酸(tricine，pKa 8.05)及二羥乙甘胺酸(pKa 8.26)。在使用本申請案原理之教科書中亦可發現其他適宜小分子，該等教科書例如CRC Handbook of Chemistry and Physics, 第96版，CRC press, 2015；Chemical Properties Handbook, McGraw-Hill Education, 1998。 分析介質或環境中小分子之濃度較佳為或接近小分子在個體中之生理濃度。舉例而言，碳酸氫鹽(在人類血清中)之生理濃度在15至30 mM範圍內。因此，碳酸氫鹽在分析介質中之濃度可為10 mM至40 mM、或15 mM至30 mM、或20 mM至25 mM、或約20 mM。二硫化物之生理濃度亦較低。二硫化物在分析介質中之濃度可為3至100 mM、或5至80 mM、或10至50 mM、或10至30 mM。 在本發明中，條件性活性多肽經選擇且以多個濃度使用，其中特定物質在環境中之正常生理濃度將對條件性活性多肽在所關注pH範圍內之活性具有顯著效應。因此，在多種治療性治療中，使條件性活性多肽在血液或人類血清之pH 7.2-7.4附近具有低活性可係有利的，以容許在最小化或防止條件性活性多肽活化的同時經由血流遞送治療性治療。因此，對於該等治療，選擇pKa低於pH 7.2-7.4之小分子將係有利的，以確保小分子在血流pH下足夠量之離子化，以對條件性活性多肽之活性具有顯著效應。同時，小分子之pKa應為或高於期望條件性活性多肽之活性之pH，以確保藉由小分子之質子化釋放條件性活性多肽上之結合位點，活化條件性活性多肽。 小分子較佳具有低分子量及/或相對小構形以藉由使立體阻礙降至最低來確保對靶多肽或條件性活性多肽上之小袋之最大可及性。因此，小分子之分子量通常小於900 a.m.u.，或更佳小於500 a.m.u.，或更佳小於200 a.m.u.，或甚至更佳小於100 a.m.u.。舉例而言，二硫化物及碳酸氫鹽二者皆具有低分子量及小結構，其提供對靶多肽或條件性活性多肽上之袋之可及性，如下文實例13及14中所示。 小分子可以實質上相同之濃度存於分析或環境中，例如碳酸氫鹽為約20 μM。在一些實施例中，小分子可以不同濃度存於不同環境中，且因此可期望其在分析中模擬此情形。舉例而言，二硫化物在腫瘤微環境中之濃度高於在人類血清中。因此，一種分析可模擬具有酸性pH及較高二硫化物濃度之腫瘤微環境，而第二分析可模擬具有中性或弱鹼性pH及較低二硫化物濃度之人類血清。酸性pH可在6.0至6.8範圍內，而中性或弱鹼性pH可為約7.4。第一分析之較高二硫化物可為30 μM，而第二緩衝液之較低二硫化物可為10 μM或更低，或5 μM。 在一些實施例中，在存在兩種或更多種不同小分子(例如碳酸氫鹽與組胺酸之組合)時，條件性活性多肽具有pH依賴性。 在不存在小分子時，條件性活性多肽可喪失其pH依賴性。因此，在小分子不存在下，條件性活性多肽可在小分子不存在下在第一pH與第二pH之間具有類似活性。 在一些實施例中，第一pH係酸性pH，而第二pH係鹼性或中性pH。在其他實施例中，第一pH係鹼性pH，而第二pH係酸性或中性pH。舉例而言，第一pH可為在約5.5至7.2、或約6.0至7.0、或約6.2至6.8範圍內之pH。第二pH可為在約7.0至7.8、或約7.2至7.6範圍內之pH。 在酸性pH下活性更高且在鹼性或中性pH下活性更低之條件性活性多肽可靶向其中pH為酸性、為約5.5至7.2或約6.2至6.8之腫瘤微環境。 在其他實施例中，pH依賴性多肽活性更高之第一pH可為鹼性pH，例如7.6-7.9，例如在滑液中，(參見Jebens等人，「On the viscosity and pH of synovial fluid and pH of blood」，Journal of Bone and Joint Surgery，第41 B卷，第388-400頁, 1959)。第二pH可為約7.2-7.6之血液pH，在其下條件性活性多肽活性較低。該等條件性活性多肽可適於靶向關節疾病，例如關節發炎。 在其他實施例中，條件性活性多肽可經設計以靶向腦。在血腦屏障兩側之間存在pH差異，其中腦側pH較血液pH低約0.2 pH單位。因此，腦之條件性活性多肽活性更高之第一pH為約7.0至7.2 (腦pH)，而第二pH可為約7.4 (血液pH)。 條件性活性多肽可為酶、細胞介素、受體(尤其細胞受體)、調控多肽、可溶性多肽、抗體或激素。 條件性活性多肽可為親代多肽之片段。舉例而言，條件性活性多肽可為抗體片段、單鏈抗體、酶片段、受體片段、細胞介素片段或激素片段。抗體片段可為抗體Fc片段。 Fc片段可用作親代多肽以供產生在第一pH下與補體之結合活性高於在第二pH下與相同補體之結合活性之條件性活性Fc片段。Fc片段與補體之結合可用於提供抗體依賴性細胞介導之細胞毒性。第一pH可為酸性，在5.5至7.2或6.2至6.8範圍內，例如在腫瘤微環境中之pH，而第二pH在7.2-7.6範圍內。第一pH與溶酶體中之pH不同，在溶酶體中pH通常為約4.0。此外，溶酶體係Fc片段如同任何其他多肽一般經靶向以供降解之位置。溶酶體中無補體且無經由溶酶體引起之細胞介導之細胞毒性。 條件性活性多肽可具有兩個功能性結構域，其中至少一個、較佳兩個功能性結構域具有pH依賴性活性。該兩個功能性結構域可同時經演化且進行選擇以鑑別同一突變體多肽中之兩個功能性結構域。或者，該兩個功能性結構域可經獨立演化且經選擇以單獨鑑別pH依賴性活性。若兩個功能性結構域不在同一突變體多肽中，其可融合為具有單獨鑑別之功能性結構域二者之嵌合多肽。 條件性活性多肽在第一條件或正常生理條件下可逆地或不可逆地不活化，但在第二條件或異常條件下以與第一條件或正常生理條件下相同或等效之程度具有活性。該等條件性活性多肽及產生該等多肽之方法已闡述於美國專利第8,709,755 B2號中。條件性活性多肽對於在宿主體內短時間或有限時間段具有活性之新穎治療劑之研發尤其有價值。倘若給定劑量之治療機之延長作用對宿主有害，但需要有限活性以實施期望療法，則此條件性活性多肽尤其有價值。有益應用之實例包括在高劑量下之局部或全身性治療，以及在高濃度下之局部化治療。在第一條件或正常生理條件下之不活化可藉由給藥及多肽不活化率之組合來確定。此基於條件之不活化對於催化活性在相對短時間段內引起顯著不良效應之酶治療劑尤其重要。 條件性活性多肽隨時間可逆地或不可逆地活化或不活化，或僅當其在體內某些微環境中(包括在體內特定器官中，例如在腫瘤微環境、滑液、膀胱或腎中)時活化或不活化。在一些態樣中，條件性活性多肽係如本文所述針對一或多種靶蛋白(抗原)之抗體或抗體片段。 條件性活性多肽可為具有pH依賴性活性之經分離多肽，其中在選自碳酸氫鹽、組胺酸、組織胺、二硫化物、檸檬酸鹽、乳酸鹽及其組合之物質存在下，在第一pH下之活性係在第二pH下之活性之至少約1.3倍。在小分子不存在下，相同活性並非pH依賴性。在一些實施例中，在第一pH下之活性係在第二pH下之相同活性之至少約1.5倍、或至少約1.7倍、或至少約2.0倍、或至少約3.0倍、或至少約4.0倍、或至少約6.0倍、或至少約8.0倍、或至少約10.0倍、或至少約20.0倍、或至少約40.0倍、或至少約60.0倍、或至少約100.0倍。第一pH可為異常pH，在約5.5-7.2、或約6.2-6.8範圍內，而第二pH可為正常生理pH，在約7.2-7.6範圍內。 對於所選條件性活性多肽，可鑑別或合成編碼條件性活性多肽之核酸(例如DNA序列)。核酸可用於重組體技術以大量產生條件性活性多肽。舉例而言，可將核酸插入表現載體中，其中表現載體具有可操作連接至核酸之啟動子以確保條件性活性多肽之高表現程度。可將表現載體引入宿主細胞中，例如酵母、昆蟲細胞產生宿主或哺乳動物細胞產生宿主。宿主細胞之實例包括3T3小鼠纖維母細胞細胞；BHK21敘利亞倉鼠纖維母細胞細胞；MDCK，狗上皮細胞；Hela人類上皮細胞；PtK1鼠袋鼠上皮細胞；SP2/0小鼠漿細胞；及NS0小鼠漿細胞；HEK 293人類胚腎細胞；COS猴腎細胞；CHO、CHO-S中國倉鼠卵巢細胞；R1小鼠胚細胞；E14.1小鼠胚細胞；H1人類胚細胞；H9人類胚細胞；及PER C.6，人類胚細胞。 B. 條件性活性多肽之工程化 條件性活性多肽可藉由本文所述之一或多種蛋白質工程化技術來工程化。蛋白質工程化技術之非限制性實例包括將條件性活性多肽偶聯至核酸、將條件性活性多肽偶聯至奈米顆粒、將條件性活性多肽工程化於嵌合抗原受體中及工程化經遮蔽條件性活性多肽。 可經由連接體將本發明條件性活性多肽偶聯至核酸分子，例如DNA或RNA分子。條件性活性多肽可有助於將核酸分子遞送至個體之靶位置，在該靶位置之條件下條件性活性多肽之活性高於不存在該條件之其他位置。舉例而言，條件性活性多肽可為條件性活性抗體，其在腫瘤微環境中之條件下與其抗原之結合活性高於在其他位置(例如在人類血清中)之條件下。此效應可用於藉由將核酸分子偶聯至條件性活性多肽並將偶聯物投與個體來將核酸分子遞送至腫瘤微環境。 在一些實施例中，核酸分子可為調節靶位置處基因表現之藥劑。異常基因表現與多種疾病相關。因此，矯正異常基因表現可有助於控制或甚至治癒該等疾病。舉例而言，異常基因表現係大多數癌細胞之特徵，一些基因在癌細胞中具有升高表現程度，例如多種致癌基因(例如，表皮生長因子受體2 (HER2)在乳癌細胞中過表現)。選擇性抑制致癌基因之組成型升高的表現提供抑制癌細胞增殖之機會。 可抑制基因表現之核酸分子包括反義RNA、小干擾RNA (siRNA)、微小RNA、寡DNA及具有與核鹼基連接之不帶電荷之非手性聚醯胺主鏈之寡核苷酸模擬物(Pooga等人，Curr Cancer Drug Targets , 1(3):231-9, 2001；Pandey等人，Expert Opin Biol Ther ., 9(8):975-89, 2009)。 反義RNA係短RNA分子，其可藉由鹼基配對結合至mRNA之特定互補區域，從而以序列特異性方式抑制mRNA表現。反義RNA可誘導在與反義RNA之結合位點裂解mRNA之RNaseH，或可在物理上阻斷mRNA處理及蛋白質合成中之轉譯或其他步驟。 小干擾RNA (siRNA)通常係短雙股RNA區段，其序列之至少一部分與欲阻斷轉譯之mRNA序列互補。siRNA經由基因沉默之轉錄後機制使用染色質重建、抑制蛋白質轉譯或直接mRNA降解來發揮功能，其在真核細胞中普遍存在(Caplen, 「Gene therapy progress and prospects. Downregulating gene expression: the impact of RNA interference,」Gene Ther ., 11(16):1241-1248, 2004；及Bertrand等人，「Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo,」Biochem Biophys Res Commun ., 296(4):1000-1004, 2002)。 特定而言，經由RISC，siRNA可起始與siRNA具有同源性之mRNA之序列特異性降解之有效級聯(Fire等人，「Potent and specific genetic interference by doubles-stranded RNA inCaenorhabditis elegans 」，Nature 391:806-811, 1998)。在將siRNA引入細胞中時，其由稱為Dicer之RNase III酶處理，該酶將長siRNA裂解為短21-23個核苷酸之雙鏈體，該等雙鏈體具有對稱2-3個核苷酸之3’懸突及5’磷酸酯及3’羥基(Tuschl等人，「Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro」，Genes Dev . 13:3191–3197, 1999；Hamilton及Baulcombe, 「A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants,」Science , 286:950–952, 1999)。因此，有效siRNA僅需鄰接互補序列之小區段與mRNA配對，以觸發siRNA介導之沉默(Jackson及Linsley, 「Noise amidst the silence: off-target effects of siRNA?」Trends Genet ., 20:521-524, 2004)。siRNA不整合至基因體中，由此提供較質體或病毒媒介更高之安全性。 微小RNA (miRNA)係一類長度為21-25個核苷酸之天然非編碼小RNA分子。微小RNA與微小RNA所作用之mRNA分子部分互補。微小RNA之主要功能係經由轉譯抑制、mRNA裂解及去腺苷化來降低基因表現。miRNA物質、序列資料、注釋及靶預測之中央線上儲存庫稱為miRBase，由大不列顛之Sanger Institute託管。微小RNA基因由RNA聚合酶II轉錄以產生具有5’端帽及多A尾之初級miRNA。在核中，初級miRNA經微處理器複合物處理以產生前體miRNA，該微處理器複合物由RNAe III酶Drosha及雙股RNA Pasha/DGCR8組成。該等前體miRNA由核運輸蛋白外輸蛋白(Exp5)及Ran-GTP複合物輸出至細胞質中，其中Ran GTPase與Exp5結合以與前體miRNA形成核異三聚體。該等前體miRNA另外經RNAe III酶Dicer處理以產生成熟微小RNA。 可藉由條件性活性多肽遞送之另一類核酸係寡核苷酸模擬物，其包含與核鹼基連接之不帶電荷之非手性聚醯胺主鏈。寡核苷酸模擬物通常稱為肽核酸(PNA)。更特定而言，PNA係DNA類似物，其中N-(2-胺基乙基)甘胺酸聚醯胺代替磷酸-核糖環主鏈，且亞甲基-羰基連接體將天然以及非天然核-鹼基連接至N-(2-胺基乙基)甘胺酸之中央胺。儘管主鏈結構顯著變化，但PNA能遵循Watson-Crick鹼基配對原則序列特異性結合至DNA及mRNA。 PNA以高於天然核酸之親和力結合至互補DNA/RNA，此部分係由於主鏈上缺少負電荷且因此減少電荷間排斥，以及有利的幾何學因素所致。PNA與DNA/mRNA之複合物在生物流體中極其穩定，導致藉由與DNA或mRNA特異性雜交而抑制靶基因之轉錄及轉譯。通常，PNA係使用熟知的固相肽合成方案來合成。參見Kim等人，J. Am. Chem. Soc., 115, 6477-6481, 1993；Hyrup等人，J. Am. Chem. Soc., 116, 7964-7970, 1994；Egholm等人，Nature, 365, 566-568, 1993；Dueholm等人，New J. Chem., 21, 19-31, 1997；Wittung等人，J. Am. Chem. Soc., 118, 7049-7054, 1996；Leijon等人，Biochemistry, 33, 9820-9825, 1994；Orum等人，BioTechniques, 19, 472-480, 1995；Tomac等人，J. Am. Chem. Soc., 118, 5544-5552, 1996)。與在經強酸處理時去嘌呤化且在鹼氫氧化物中水解之DNA相比，PNA係完全酸穩定的且對弱鹼足夠穩定。 可藉由條件性活性多肽遞送之另一類核酸係寡DNA。寡DNA係DNA之短單股區段，其在進入細胞漿後可選擇性抑制與寡DNA序列互補之基因之表現。對於反義應用，寡DNA與靶mRNA或前mRNA相互作用且形成雙鏈體並抑制其轉譯或處理，因此抑制蛋白質生物合成。對於抗原應用，寡DNA必須進入細胞核，與雙股基因體DNA形成三鏈體，且抑制基因轉錄，由此產生較少mRNA，導致產生蛋白質之較少基因產物。 可藉由條件性活性多肽遞送之另一類核酸係球形核酸(SNA，參見Zhang,J Am Chem Soc ., 134(40):16488-16491, 2012)。SNA包含共價附接至金屬、半導電或絕緣無機或聚合核心材料之緻密官能化且高度定向之核酸。其亦可係無核心中空結構，幾乎完全由核酸分子構成。該等球形核酸能繞過個體針對外源核酸之自然防禦。球形核酸利用源自其緻密包裝、高度定向之核酸殼之獨特性質達成核酸之保護及有效遞送。該等殼產生高局部鹽濃度之區域，其在與空間抑制組合時用於降低核酸酶活性並防止核酸被酶降解。另外，該等球形核酸將清除劑蛋白質自天然細胞外環境招募至其表面，此促進胞吞作用。 在進入細胞質後，球形核酸可經由反義或siRNA路徑抑制靶基因之表現。因此，球形核酸提供優於病毒載體及多種其他合成系統之若干優點，包括低毒性、低免疫原性、對酶降解之抗性及更持久之基因敲低。條件性活性多肽、尤其條件性活性抗體可將球形核酸遞送至靶位置，例如患病或發炎組織(例如，腫瘤及發炎關節)。 亦可經由連接體將條件性活性多肽偶聯至奈米顆粒以幫助將奈米顆粒遞送至靶位置，在該靶位置之條件下條件性活性多肽之活性更高。奈米顆粒係已知媒介毒素、放射性試劑或其他治療劑之已知媒介，其可囊封於奈米顆粒中。 囊封於奈米顆粒中之治療劑可為蛋白質，其可使腫瘤細胞去分化，且由此可能將腫瘤細胞逆轉回至正常細胞(Friedmann-Morvinski及Verma, 「Dedifferentiation and reprogramming: origins of cancer stem cells」，EMBO Reports , 15(3):244-253, 2014)。可將奈米顆粒連接至條件性活性抗體以將所連接奈米顆粒及經囊封治療劑選擇性遞送至其中條件性活性抗體之活性最高之環境中。 若干種類型之具有不同構形之奈米顆粒可用於本發明中。奈米顆粒可自多種生物相容材料製得，包括生物穩定聚合物、生物可降解聚合物、富勒烯、脂質或其組合。生物穩定聚合物係指在活體內不降解之聚合物。生物可降解聚合物係指在遞送至患者後能被降解之聚合物。舉例而言，在將聚合物暴露於體液(例如血液)時，其可在體內逐漸被吸收及/或被酶消除。產生具有不同降解速率之奈米顆粒之方法為熟習此項技術者已知，例如，參見美國專利第6,451,338號、美國專利第6,168,804號及美國專利第6,258,378號。 本發明實例性奈米顆粒包括脂質體、聚合物囊泡及聚合物顆粒。脂質體係指完全由通常由磷脂組成之雙層封閉之區室。脂質體可根據熟習此項技術者已知之標準技術來製備。一種技術係使適宜脂質(例如磷脂醯基膽鹼)懸浮於水性介質中，之後對混合物進行超音波處理。另一種技術係例如經由使用針將脂質注射至經攪動乙醇-水溶液中來快速混合脂質於乙醇-水中之溶液。在一些實施例中，脂質體亦可另外或替代地包含其他兩親性物質，例如鞘磷脂或含有聚(乙二醇) (PEG)之脂質。 聚合物囊泡包含二嵌段或三嵌段共聚物，其經修飾以形成與脂質體類似之雙層結構。端視嵌段共聚物之長度及組成，聚合物囊泡可較脂質體顯著更穩健。另外，控制嵌段共聚物中各嵌段之化學之能力允許調諧聚合物囊泡之組成以適合期望應用。舉例而言，聚合物囊泡之膜厚度、即雙層結構之厚度可藉由改變嵌段共聚物中個別嵌段之鏈長來控制。調節共聚物中各嵌段之玻璃轉換溫度會影響流動性，且因此影響聚合物囊泡之膜的滲透性。甚至所囊封試劑的釋放機制亦可藉由改變共聚物之特徵來修改。 聚合物囊泡可藉由涉及以下步驟之方法來製備：(i) 將嵌段共聚物溶解於有機溶劑中，(ii) 將所得溶液施加至容器表面，然後(iii) 移除溶劑，在容器壁上留下共聚物薄膜。然後使薄膜水合以形成聚合物囊泡。或者，將嵌段共聚物溶解於溶劑中，然後添加共聚物中嵌段之一的弱溶劑，亦可產生聚合物囊泡。 可使用若干種技術將治療劑囊封於聚合物囊泡中。舉例而言，可將治療劑混合於水中，然後使用其使共聚物薄膜再水合。另一實例係藉由以滲透壓方式驅使治療劑進入預成型聚合物囊泡之核心中，此方法稱為強制性加載(force loading)。另一實例係使用雙重乳化技術，其可產生具有相對單分散性及高加載效率之聚合物囊泡。雙重乳化技術涉及使用微流體技術以產生包含有機溶劑層包圍之水微滴之雙重乳化物。隨後使該等液滴中之微滴(droplet-in-a-drop)結構分散於連續水相中。將嵌段共聚物溶解於有機溶劑中且自裝配為雙重乳化物之同心界面上之原-聚合物囊泡。最終聚合物囊泡在自原-聚合物囊泡之殼完全蒸發有機溶劑後形成。此技術容許精細控制聚合物囊泡大小。另外，在整個方法中維持內部流體與外部流體完全分離之能力容許極為有效地囊封治療劑。 與脂質體及聚合物囊泡之殼結構相比，聚合物顆粒係指實心或多孔顆粒。將治療劑黏附至聚合物顆粒結構表面或將生物活性劑整合至聚合物顆粒結構中之方法為熟習此項技術者已知。 可用於製備本發明奈米顆粒之聚合物包括但不限於聚(N-乙醯基葡糖胺) (幾丁質)、幾丁聚醣、聚(3-羥基戊酸酯)、聚(乳酸交酯-共-乙交酯)、聚(3-羥基丁酸酯)、聚(4-羥基丁酸酯)、聚(3-羥基丁酸酯-共-3-羥基戊酸酯)、聚原酸酯、聚酸酐、聚(乙醇酸)、聚(乙交酯)、聚(L-乳酸)、聚(L-乳酸交酯)、聚(D,L-乳酸)、聚(D,L-乳酸交酯)、聚(L-乳酸交酯-共-D,L-乳酸交酯)、聚(己內酯)、聚(L-乳酸交酯-共-己內酯)、聚(D,L-乳酸交酯-共-己內酯)、聚(乙交酯-共-己內酯)、聚(三亞甲基碳酸酯)、聚酯醯胺、聚(乙醇酸-共-三亞甲基碳酸酯)、共-聚(醚-酯) (例如PEO/PLA)、聚磷氮烯、生物分子(例如纖維蛋白、纖維蛋白膠、纖維蛋白原、纖維素、澱粉、膠原及玻尿酸、彈性蛋白及玻尿酸)、聚胺基甲酸酯、聚矽氧、聚酯、聚烯烴、聚異丁烯及乙烯-α烯烴共聚物、除了聚丙烯酸酯以外之丙烯酸聚合物及共聚物、鹵乙烯聚合物及共聚物(例如聚氯乙烯)、聚乙烯基醚(例如聚乙烯基甲醚)、聚偏鹵乙烯(例如聚二氯亞乙烯)、聚丙烯腈、聚乙烯基酮、聚乙烯基芳香族烴(例如聚苯乙烯)、聚乙烯基酯(例如聚乙酸乙烯酯)、丙烯腈-苯乙烯共聚物、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)樹脂、聚醯胺(例如耐綸66及聚己內醯胺)、聚碳酸酯(包括基於酪胺酸之聚碳酸酯)、聚甲醛、聚醯亞胺、聚醚、聚胺基甲酸酯、嫘縈、嫘縈-三乙酸酯、纖維素、乙酸纖維素、丁酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、賽璐玢(cellophane)、硝酸纖維素、丙酸纖維素、纖維素醚及羧甲纖維素。 在一些實施例中，除了源自條件性活性多肽之選擇性以外，奈米顆粒亦可經由塗料提供組織選擇性。舉例而言，奈米顆粒可經靜電吸附之基於聚(麩胺酸)之肽塗料塗佈以改變核心顆粒之外部組成。與含有RDG代替RGD之亂序序列塗佈顆粒相比，含有精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)配體之帶負電荷之基於聚麩胺酸之肽可促進活體外基因遞送至內皮細胞。該等肽由以下三個組分組成：提供負電荷之聚(麩胺酸)延伸段、聚甘胺酸連接體及電荷變化且可能改變顆粒生物物理性質及組織選擇性之末端序列。塗料以及顆粒本身分別經由其醯胺及酯鍵聯係生物可降解的。參見Harris等人(「Tissue-Specific Gene Delivery via Nanoparticle Coating,」Biomaterials, 第31卷，第998-1006頁，2010)。 哺乳動物免疫系統使用T細胞針對具有外來抗原之物質或細胞。在遇到實體腫瘤時，T細胞通常無法產生有效反應。即使在T細胞到達腫瘤位點時，其亦面對使得癌細胞能逃脫免疫系統之免疫抑制因子之阻攔。CAR-T技術使用遺傳工程化方法藉由將嵌合抗原受體(CAR)插入T細胞以產生高特異性CAR-T細胞來使天然循環T細胞重編程，其中CAR藉由特異性結合至靶組織表面上之抗原將工程化CAR-T細胞引導至靶組織。因此，CAR-T細胞可特異性靶向腫瘤細胞，使CAR-T細胞較天然循環T細胞顯著更有效。CAR-T細胞亦可經工程化以靶向其他靶組織，例如發炎關節及腦組織。 本發明CAR包括至少一個抗原特異性靶向區域(ASTR)、細胞外間隙結構域(ESD)、跨膜結構域(TM)、一或多個共刺激結構域(CSD)及細胞內信號傳導結構域(ISD)，參見圖5及Jensen等人，「Design and implementation of adoptive therapy with chimeric antigen receptor-modified T cells」，Immunol. Rev ., 第257卷，第127-144頁, 2014。在ASTR特異性結合至腫瘤或其他所靶向組織上之靶抗原後，ISD活化CAR-T細胞中之細胞內信號傳導。舉例而言，ISD可以非MHC限制性方式將CAR-T細胞特異性及反應性朝向所選靶(例如，腫瘤細胞或其他所靶向細胞)重定向，從而利用抗體之抗原結合性質。非MHC限制之抗原識別給予CAR-T細胞識別腫瘤細胞並起始抗原處理之能力，由此繞過腫瘤自免疫系統監督逃脫之主要機制。在實施例中，ESD及/或CSD係可選的。在另一實施例中，ASTR具有雙特異性，此容許其可與兩種不同抗原或表位特異性結合。 本發明條件性活性多肽可經工程化為ASTR或其部分，以使CAR結合至靶抗原之活性在特定環境(例如腫瘤微環境或滑液)中高於在血液或存在不同環境之身體另一部分中。該等CAR可優先將T細胞遞送至患病位點，從而顯著降低T細胞攻擊對正常組織之副作用。此容許使用更高劑量之T細胞以增強治療效能並改善個體對治療之耐受性。 該等CAR對研發在個體體內短或限制時間段所需之新穎治療劑尤其有價值。有益應用之實例包括以高劑量全身性治療以及以高濃度局部化治療。參見Maher, 「Immunotherapy of Malignant Disease Using Chimeric Antigen Receptor Engrafted T Cells」，ISRN Oncology , 第2012卷，文章編號278093, 2012。 ASTR可包含條件性活性多肽，例如抗體，尤其單鏈抗體或其片段，其特異性結合至腫瘤或其他所靶向組織上之抗原。適於ASTR之多肽之一些實例包括經連接細胞介素(其導致識別帶有細胞介素受體之細胞)、親和體、來自天然受體之配體結合結構域及受體之可溶蛋白/肽配體，其例如在腫瘤細胞上。事實上，幾乎任何能以高親和力結合至給定抗原之分子皆可用於ASTR中。 在一些實施例中，本發明CAR包括至少兩個ASTR，其靶向至少兩種不同抗原或同一抗原上之兩個表位。在一個實施例中，CAR包括三個或更多個ASTR，其靶向至少三種或更多種不同抗原或表位。在CAR中存在複數個ASTR時，ASTR可串聯排列且可藉由連接體肽隔開(圖5)。 在另一實施例中，ASTR包括雙價抗體。在雙價抗體中，scFv係用連接體肽產生，該等連接體肽過短而使兩個可變區無法摺疊在一起，從而驅使scFv二聚化。更短連接體(1個或2個胺基酸)導致形成三聚體，即所謂三價抗體或三鏈抗體。四價抗體亦可用於ASTR中。 CAR所靶向抗原存在於經靶向以移除之組織中細胞之表面上或細胞內部，該組織例如腫瘤、腺性(例如前列腺)增生、疣及不期望脂肪組織。儘管CAR之ASTR更有效地識別並結合表面抗原，但CAR亦可靶向細胞內抗原。在一些實施例中，靶抗原較佳為癌症、發炎性疾病、神經元病症、糖尿病、心血管疾病或傳染病所特有。靶抗原之實例包括各種免疫細胞、癌瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖細胞瘤、母細胞瘤及與各種血液學疾病、自體免疫疾病及/或發炎性疾病相關之細胞表現之抗原。 ASTR可靶向之癌症所特有之抗原包括以下中之一或多者：4-IBB、5T4、腺癌抗原、α-胎兒蛋白、BAFF、B-淋巴瘤細胞、C242抗原、CA- 125、碳酸酐酶9 (CA-IX)、C-MET、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23 (IgE受體)、CD28、CD30 (TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CTLA-4、DR5、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、纖連蛋白額外結構域-B、葉酸鹽受體1、GD2、GD3神經節苷酯、醣蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人類離散因子受體激酶、IGF-1受體、IGF-I、IgGl、LI-CAM、IL-13、IL-6、胰島素樣生長因子I受體、整聯蛋白α5β1、整聯蛋白ανβ3、MORAb-009、MS4A1、MUC1、黏蛋白CanAg、N-羥乙醯基神經胺酸、NPC-1C、PDGF-Ra、PDL192、磷酯醯絲胺酸、前列腺癌細胞、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、生腱蛋白C、TGF β 2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、腫瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2或波形蛋白。 ASTR可靶向之發炎性疾病所特有之抗原包括以下中之一或多者：AOC3 (VAP-1)、CAM-3001、CCL11 (伊紅趨素-1)、CD125、CD147 (基礎免疫球蛋白(basigin))、CD154 (CD40L)、CD2、CD20、CD23 (IgE受體)、CD25 (IL-2受體之鏈)、CD3、CD4、CD5、IFN-a、IFN-γ、IgE、IgE Fc區、IL-1、IL-12、IL-23、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-22、IL-4、IL-5、IL-5、IL-6、IL-6受體、整聯蛋白a4、整聯蛋白α4β7、大羊駝、LFA-1 (CD1 la)、MEDI-528、肌肉生長抑制素、OX-40、rhuMAb β7、骨硬化素、SOST、TGF β 1、TNF-a或VEGF-A。 本發明ASTR可靶向之神經元病症所特有之抗原包括以下中之一或多者：β類澱粉或MABT5102A。本發明ASTR可靶向之糖尿病所特有之抗原包括以下中之一或多者：L-Ιβ或CD3。本發明ASTR可靶向之心血管疾病所特有之抗原包括以下中之一或多者：C5、心臟肌凝蛋白、CD41 (整聯蛋白α-lib)、纖維蛋白 II、β鏈、ITGB2 (CD 18)及神經鞘胺醇-1-磷酸酯。 本發明ASTR可靶向之傳染病所特有之抗原包括以下中之一或多者：炭疽毒素、CCR5、CD4、凝集因子A、巨細胞病毒、巨細胞病毒醣蛋白B、內毒素、大腸桿菌、肝炎B表面抗原、B型肝炎病毒、HIV-1、Hsp90、流行性感冒A血球凝集素、脂磷壁酸、綠膿桿菌、狂犬病病毒醣蛋白、呼吸道融合病毒及TNF-a。 靶抗原之其他實例包括以特定或擴增方式發現於癌細胞上之表面蛋白，例如IL-14受體、B細胞淋巴瘤之CD19、CD20及CD40、各種癌瘤之Lewis Y及CEA抗原、乳癌及結腸直腸癌之Tag72抗原、肺癌之EGF-R、通常在人類乳癌及卵巢癌中擴增之葉酸結合蛋白及HER-2蛋白或病毒蛋白，例如HIV之gpl20及gp41套膜蛋白、來自B及C型肝炎病毒之套膜蛋白、人類巨細胞病毒之醣蛋白B及其他套膜醣蛋白及來自致癌病毒(例如卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)相關皰疹病毒)之套膜蛋白。其他潛在靶抗原包括CD4，其中配體係HIV gpl20套膜醣蛋白及其他病毒受體，例如ICAM (其係人類鼻病毒受體)及脊髓灰白質炎病毒之相關受體分子。 在另一實施例中，CAR可靶向銜接癌症治療細胞(例如NK細胞)以藉由作為免疫效應細胞作用來活化癌症治療細胞之抗原。此一實例係靶向CD16A抗原以銜接NK細胞以針對表現CD30之惡性病之CAR。雙特異性、四價AFM13抗體係可遞送此效應之抗體之實例。此類型實施例之其他詳情可參見例如以下文獻：Rothe, A.等人，「A phase 1 study of the bispecific anti-CD30/CD16A antibody construct AFM13 in patients with relapsed or refractory Hodgkin lymphoma」，Blood , 2015年6月25日，Vl. 125, 第26期，第4024-4031頁。 在一些實施例中，細胞外間隙結構域及跨膜結構域可具有泛素化抗性，其可增強CAR-T細胞信號傳導且由此增大抗腫瘤活性(Kunii等人，「Enhanced function of redirected human t cells expressing linker for activation of t cells that is resistant to ubiquitylation」，Human Gene Therapy , 第24卷，第27-37頁, 2013)。在此區域內，細胞外間隙結構域在CAR-T細胞外部，且由此暴露於不同條件並可潛在地使其具有條件性泛素化抗性。 C. 使經遮蔽條件性活性多肽工程化 本發明條件性活性多肽、尤其條件性活性抗體之條件性活性可經遮蔽，及/或其偶聯試劑之活性可經遮蔽部分遮蔽。經遮蔽活性將在遮蔽部分自條件性活性多肽移除或裂解後變得可獲得。適宜遮蔽技術闡述於例如以下文獻中：Desnoyers等人，「Tumor-Specific Activation of an EGFR-Targeting Probody Enhances Therapeutic Index」，Sci. Transl. Med . 5, 207ra144, 2013。 在一些實施例中，條件性活性抗體與遮蔽部分連接，其遮蔽條件性活性及/或其偶聯試劑之活性。舉例而言，在條件性活性抗體偶合至遮蔽部分時，該偶合或修飾可實現降低或抑制條件性活性抗體與其抗原特異性結合之能力之結構變化。在條件性活性抗體到達靶組織或微環境後，遮蔽部分立即被存於靶組織或微環境中之酶裂解，由此釋放經遮蔽活性。舉例而言，該酶可為一般在腫瘤微環境中具有活性之蛋白酶，其可裂解遮蔽部分以釋放在腫瘤組織內具有活性之條件性活性抗體。 在一些實施例中，活性經遮蔽至初始活性之小於約50%、或初始活性之小於約30%、或初始活性之小於約10%、或初始活性之小於約5%、或初始活性之小於約2%、或初始活性之小於約1%、或初始活性之小於約0.1%、或初始活性之小於約0.01%。在一些實施例中，例如，為確保足夠遞送時間，當在活體內或在靶位移活體外免疫吸附分析中量測時，遮蔽效應經設計持續至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、96小時，或5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或更久。 在某些實施例中，遮蔽部分在結構上與條件性活性抗體之天然結合配偶體(抗原)類似。遮蔽部分可為條件性活性抗體之經修飾天然結合配偶體，其含有至少略微降低結合至條件性活性抗體之親和力及/或親合力之胺基酸變化。在一些實施例中，遮蔽部分沒有或實質上沒有與條件性活性抗體之天然結合配偶體之同源性。在其他實施例中，遮蔽部分與條件性活性抗體之天然結合配偶體之序列一致性不大於5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%。 遮蔽部分可以多種不同形式提供。在某些實施例中，遮蔽部分可為條件性活性抗體之已知結合配偶體，條件係遮蔽部分以低於在遮蔽部分裂解後條件性活性抗體所靶向之靶蛋白之親和力及/或親合力結合至條件性活性抗體，亦降低與靶具有期望結合之遮蔽部分之干擾。因此，遮蔽部分較佳係在遮蔽部分裂解前遮蔽條件性活性抗體之靶結合，但在遮蔽部分已自抗體裂解後不會實質性或顯著干擾或競爭結合活性分子與靶之結合的部分。在具體實施例中，條件性活性抗體及遮蔽部分不含天然結合配偶體對之胺基酸序列，使得條件性活性抗體及遮蔽部分中之至少一者不具有天然結合配偶體之成員之胺基酸序列。 或者，遮蔽部分可不特異性結合至條件性活性抗體，而係經由非特異性相互作用(例如立體阻礙)干擾條件性活性抗體-靶結合。舉例而言，遮蔽部分可經定位使得抗體之結構或構形容許遮蔽部分經由例如基於電荷之相互作用遮蔽條件性活性抗體，由此干擾靶到達條件性活性抗體。 在一些實施例中，遮蔽部分藉由共價結合偶合至條件性活性抗體。在另一實施例中，藉由使遮蔽部分結合至條件性活性抗體之N-末端來防止條件性活性抗體結合至其靶。在另一實施例中，藉由遮蔽部分與條件性活性抗體之間之半胱胺酸-半胱胺酸二硫橋阻止條件性活性抗體偶合至遮蔽部分。 在一些實施例中，條件性活性抗體進一步偶合至可裂解部分(CM)。CM能由酶裂解，或CM能由還原劑還原，或CM能光裂解。在一個實施例中，CM之胺基酸序列可與遮蔽部分重疊或包括在遮蔽部分內。在另一實施例中，CM位於條件性活性抗體與遮蔽部分之間。應注意，CM之全部或部分可在裂解前促進對條件性活性抗體之遮蔽。在CM被裂解時，條件性活性抗體結合至其抗原之活性變得更高。 CM可為與靶抗原共定位於個體治療位點之酶之受質。或者，或另外，CM可具有半胱胺酸-半胱胺酸二硫鍵，其可由於此二硫鍵之還原而裂解。CM亦可係可由光源活化之光不穩定受質。 裂解CM之酶應優先定位於條件性活性抗體之期望靶組織中，其中條件性活性抗體在存於靶組織中之條件(異常條件)下活性更高，在例如患病組織或腫瘤組織中。舉例而言，在多種癌症(例如實體腫瘤)中存在含量增加之已知蛋白酶。例如參見La Rocca等人，(2004)British J. of Cancer 90(7): 1414-1421。該等疾病之非限制性實例包括：所有類型之癌症(乳房、肺、結腸直腸、前列腺、頭頸、胰臟等)、類風濕性關節炎、克隆氏病(Crohn's disease)、黑色素瘤、SLE、心血管損傷、缺血等。因此，可選擇適宜CM，其包含可由存於腫瘤組織中、尤其與非癌性組織相比以升高含量存於腫瘤組織中之蛋白酶裂解之肽受質。 在一些實施例中，CM可為選自以下之酶之受質：天冬醯胺內肽酶(legumain)、胞漿素、TMPRSS-3/4、MMP-9、MTl-MMP、細胞自溶酶、半胱天冬酶、人類嗜中性球彈性蛋白酶、β-分泌酶、uPA及PSA。與非治療位點之組織中(例如健康組織中)相比，裂解CM之酶以相對較高含量存於治療位點之靶組織(例如患病組織或腫瘤組織；例如對於治療性治療或診斷性治療)中。因此，除了在患病組織或腫瘤組織處活性可更高之抗體之條件性活性以外，存於患病組織或腫瘤組織之酶可裂解CM，此進一步增強條件性活性抗體之活性或偶聯試劑之活性。未修飾或未裂解之CM可容許有效抑制或遮蔽條件性活性抗體之活性，使得條件性活性抗體在正常組織(正常生理條件)中活性較低。抑制條件性活性抗體在正常組織之活性之雙重機制(條件性活性及遮蔽部分)容許使用顯著高劑量之條件性活性抗體而不引起嚴重不良效應。 在一些實施例中，CM可為選自下表1中所列示酶之酶之受質。表 1. 實例性酶 / 蛋白酶 或者或另外，CM可包括半胱胺酸對之二硫鍵，其因此可由還原劑(例如細胞還原劑)裂解，該還原劑包括麩胱甘肽(GSH)、硫氧還蛋白、NADPH、黃素、抗壞血酸鹽及諸如此類，其可大量存於實體腫瘤之組織中或周圍。 在一些實施例中，條件性活性抗體含有CM及遮蔽部分二者。條件性活性抗體之活性在酶裂解CM時暴露。在一些實施例中，可期望在抗體、遮蔽部分及CM之間插入一或多個連接體(例如撓性連接體)，以提供撓性。舉例而言，遮蔽部分及/或CM可不含足夠數目之殘基(例如，Gly、Ser、Asp、Asn，尤其Gly及Ser，特定而言Gly)以提供期望撓性。因此，引入一或多個胺基酸以提供撓性連接體可係有益的。舉例而言，經遮蔽條件性活性抗體可具有以下結構(其中下式代表N-末端至C-末端方向或C-末端至N-末端方向之胺基酸序列)： (MM)-L1 -(CM)-(AB) (MM)-(CM)-L1 -(AB) (MM)-L1 -(CM)-L2 -(AB) 環[L1 -(MM)-L2 -(CM)-L3 -(AB)] 其中MM係遮蔽部分且AB係條件性活性抗體；L1 、L2 及L3 代表各自獨立且視情況存在或不存在之包括至少一個撓性胺基酸(例如，Gly)之相同或不同撓性連接體；且若存在環基，則由於在結構之N-末端及C-末端二者處或附近之半胱胺酸對之間存在二硫鍵，整個結構呈環狀結構形式。 適用於本發明之連接體通常係向遮蔽部分提供撓性以促進抑制條件性活性抗體之活性之連接體。該等連接體通常稱為撓性連接體。適宜連接體可易於選擇且可具有任何適宜的不同長度，例如1個胺基酸(例如Gly)至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、3個胺基酸至12個胺基酸，包括4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸或7個胺基酸至8個胺基酸，且可為1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個胺基酸。 實例性撓性連接體包括甘胺酸聚合物(G)n 、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n 、(GSGGS)n 及(GGGS)n ，其中n係至少1之整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物及其他業內已知之撓性連接體。實例性撓性連接體包括但不限於Gly-Gly-Ser-Gly、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly、GIy- Ser-Gly-Ser-Gly、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly、Gly-Ser-Ser-Ser-Gly及諸如此類。 一些用於遮蔽條件性活性抗體之活性之技術闡述於WO2010081173A2中。 在一些態樣中，條件性活性多肽係條件性活性抗體，其可使用本文所述技術工程化。抗體工程化技術之非限制性實例包括抗體偶聯、多特異性抗體之工程化、針對免疫效應物-細胞表面抗原及靶抗原之雙特異性條件性活性抗體之工程化、抗體Fc區之工程化。 偶聯條件性活性抗體之方法已闡述於WO 2015/175375中。在一態樣中，條件性活性抗體可偶聯於抗體Fc區上。上述偶聯分子、化合物或藥物可偶聯至Fc區，如美國專利第8,362,210號中所述。舉例而言，可將Fc區偶聯至欲遞送至條件性活性抗體展示優先活性之位點之細胞介素或毒素。將多肽偶聯至抗體Fc區之方法為業內已知。例如參見美國專利第5,336,603號、第5,622,929號、第5,359,046號、第5,349,053號、第5,447,851號、第5,723,125號、第5,783,181號、第5,908,626號、第5,844,095號及第5,112,946號；EP 307,434；EP 367,166；EP 394,827；WO 91/06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO 97/34631及WO 99/04813；Ashkenazi等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 第88卷，第10535-10539頁, 1991；Traunecker等人，Nature , 第331卷，第84-86頁, 1988；Zheng等人，J. Immunol ., 第154卷，第5590-5600頁, 1995；及ViI等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 第89卷，第11337-11341頁, 1992。 在一態樣中，可將條件性活性抗體經由具有至少兩個反應性基團之中間連接體共價附接至偶聯試劑，一個反應性基團與條件性活性抗體反應且一個與偶聯試劑反應。連接體可包括任何相容有機化合物，其可經選擇使得與條件性活性抗體或偶聯試劑之反應對條件性活性抗體之反應性及/或選擇性無不良影響。此外，連接體附接至偶聯試劑可不破壞偶聯試劑之活性。 適用於經氧化條件性活性抗體之連接體包括彼等含有選自以下之基團之連接體：一級胺、二級胺、肼、醯肼、羥胺、苯基肼、胺基脲及硫胺脲基團。適用於經還原條件性活性抗體之連接體包括彼等具有某些能與經還原條件性活性抗體中之硫氫基反應之反應性基團之連接體。該等反應性基團包括但不限於：反應性鹵代烷基(包括例如鹵代乙醯基)、對苯甲酸汞基團及能進行Michael型加成反應之基團(包括例如馬來醯亞胺及Mitra及Lawton，J. Amer. Chem. Soc . 第101卷，第3097-3110頁, 1979所述類型之基團)。 工程化多特異性條件性活性抗體之方法已闡述於WO 2015/175375中。條件性活性抗體可經工程化以產生針對免疫效應物-細胞表面抗原及靶抗原之雙特異性條件性活性抗體。本發明雙特異性條件性活性抗體可將免疫效應細胞吸引至存在靶抗原之患病位點。雙特異性條件性活性抗體係可特異性結合至兩種不同抗原之抗體：免疫效應物-細胞表面抗原及靶抗原。雙特異性抗體可為包含兩條臂之全長抗體，其中一條臂結合至免疫效應物-細胞表面抗原且另一條臂結合至靶抗原。雙特異性抗體可為僅包含重鏈可變結構域(VH )及輕鏈可變結構域(VL )之抗體片段。在一個實施例中，抗體片段包括至少兩個VH VL 單元：一個結合至免疫效應物-細胞表面抗原且另一條臂結合至靶抗原。在另一實施例中，抗體片段包括至少兩個單一可變結構域(VH 或VL )：一個結合至免疫效應物-細胞表面抗原且另一條臂結合至靶抗原。在一些實施例中，雙特異性條件性活性抗體包含兩個scFv：一個結合至免疫效應物-細胞表面抗原且另一個結合至靶抗原。 所吸引免疫效應細胞及其與免疫效應物-細胞及患病細胞或患病組織上之靶抗原二者之結合活性可將免疫效應物-細胞吸引至含有靶抗原之患病細胞或患病組織。所吸引免疫效應物-細胞隨後將攻擊患病細胞或患病組織，由此幫助治癒疾病，此乃因免疫效應細胞能抑制或甚至破壞患病細胞或患病組織。舉例而言，免疫效應物-細胞可破壞腫瘤細胞或經感染細胞。免疫效應細胞包括天然殺手細胞(NK細胞)、巨噬細胞、淋巴介質活化之殺手(LAK)細胞及T細胞。 雙特異性條件性活性抗體具有兩種結合活性，每種各自係與免疫效應物-細胞表面抗原及靶抗原。在一個實施例中，兩種結合活性皆係條件性，意指雙特異性條件性活性抗體對免疫效應物-細胞表面抗原及靶抗原之結合活性低於親代抗體在正常生理條件下之結合活性，且高於親代抗體在異常條件下之結合活性。在一個實施例中，兩種結合活性中僅一種為條件性，意指雙特異性條件性活性抗體對免疫效應物-細胞表面抗原之結合活性或雙特異性條件性活性抗體對靶抗原之結合活性中之任一者係條件性。在此情形中，雙特異性條件性活性抗體對免疫效應物-細胞表面抗原之結合活性或雙特異性條件性活性抗體對靶抗原之結合活性中之一者低於親代抗體在正常生理條件下之相應活性，且高於親代抗體在異常條件下之相應活性。 雙特異性條件性活性抗體中之兩條臂(例如，兩個VH VL 單元或兩個scFv)可藉助習用方法接合。如業內所熟知，含有完整抗原結合位點之最小抗體片段具有一個重鏈可變結構域與一個輕鏈可變結構域(VH 及VL )之呈非共價締合之二聚體。此構形對應於在天然抗體中發現之構形，其中每一可變結構域之3個互補決定區(CDR)相互作用以界定VH -VL 二聚體表面上之抗原結合位點。6個CDR共同賦予抗體以抗原結合特異性。側接CDR之框架(FR)具有在多樣化如人類及小鼠之物種之天然免疫球蛋白中基本上保守之三級結構。該等FR用於將CDR保持在其適當定向。結合功能不需要恆定結構域，但其可幫助穩定VH -VL 相互作用。即使單一可變結構域(或僅包含對抗原具有特異性之3個CDR之一半Fv)亦具有識別並結合抗原之能力，但親和力通常低於完整結合位點(Painter等人，「Contributions of heavy and light chains of rabbit immunoglobulin G to antibody activity. I. Binding studies on isolated heavy and light chains」，Biochemistry, 第11卷，第1327-1337頁, 1972)。因此，雙特異性條件性活性抗體之結合位點之該結構域可構築為不同免疫球蛋白之VH -VL 、VH -VH 或VL -VL 結構域對。 在一些實施例中，雙特異性條件性活性抗體可藉助重組體DNA技術構築為鄰接多肽鏈，例如構築方式使得編碼雙特異性條件性活性抗體之核酸分子經表現以構築鄰接多肽鏈(例如，參見Mack等人，「A small bispecific antibody construct expressed as a functional single-chain molecule with high tumor cell cytotoxicity」，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 第92卷，第7021-7025頁, 2005)。多肽鏈內VH 及VL 結構域之順序對於本發明無關緊要，只要VH 及VL 結構域之排列使得抗原結合位點可適當摺疊以形成一個對免疫效應物-細胞表面抗原之結合位點及一個對靶抗原之結合位點即可。 本文所述之一些用於工程化多特異性條件性活性抗體之技術可用於產生針對免疫效應細胞表面抗原及靶抗原之雙特異性條件性活性抗體。 雙特異性抗體可構形為單一多肽鏈，如以下文獻中所述：WO 99/54440；Mack,J. Immunol . (1997), 158, 3965-3970；Mack,PNAS , (1995), 92, 7021-7025；Kufer,Cancer Immunol. Immunother ., (1997), 45, 193-197；Loffler,Blood , (2000), 95, 6, 2098-2103；Bruhl,J. Immunol ., (2001), 166, 2420-2426。雙特異性抗體之尤佳構形係多肽構築體，其中VH 及VL 區域藉由連接體-結構域彼此連接。單一多肽鏈中VH 及VL 區域之順序無關緊要。在一個實施例中，單一多肽鏈構形為VH1 -連接體結構域-VL1 -連接體結構域-VH2 -連接體結構域-VL2 。在另一實施例中，單一多肽鏈構形為VL1 -連接體結構域-VH1 -連接體結構域-VL2 -連接體結構域-VH2 。在另一實施例中，單一多肽鏈構形為VH1 -連接體結構域-VH2 -連接體結構域-VL1 -連接體結構域-VL2 。在另一實施例中，單一多肽鏈構形為VH1 -連接體結構域-VL2 -連接體結構域-VL1 -連接體結構域-VH2 。單一多肽鏈可摺疊成兩條臂，每一臂能與免疫效應細胞表面抗原或靶抗原結合。 雙特異性條件性活性抗體中之連接體結構域係足夠長以容許該等VH 及VL 結構域之間之分子間締合之肽片段。適於此目的之連接體之設計闡述於先前技術中，例如EP 623 679 B1、美國專利第5,258,498號、EP 573 551 B1及美國專利第5,525,491號。連接體結構域較佳係1至25個選自甘胺酸、絲胺酸及/或甘胺酸/絲胺酸之胺基酸之親水撓性連接體。在一個實施例中，連接體結構域係序列(Gly4 Ser)3 之15個胺基酸連接體。 其他連接體結構域包含寡聚結構域。寡聚結構域可促進其兩個或若干個VH 及VL 結構域之組合摺疊成兩條臂，每條能與免疫效應細胞表面抗原或靶抗原結合。寡聚結構域之非限制性實例包含白胺酸拉鍊(如jun-fos、GCN4、E/EBP；Kostelny, J. Immunol . 148 (1992), 1547-1553；Zeng,Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (1997), 3673-3678；Williams,Genes Dev . 5 (1991), 1553-1563；Suter, 「Phage Display of Peptides and Proteins」，第11章, (1996), Academic Press)、抗體源寡聚結構域(如恆定結構域CH1及CL) (Mueller,FEBS Letters 422 (1998), 259-264)及/或四聚結構域(如GCN4-LI) (Zerangue,Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (2000), 3591-3595). 在一些實施例中，杵臼結構(knob-in-hole)技術可用於穩定單一多肽鏈雙特異性條件性抗體之摺疊。杵臼結構技術闡述於以下文獻中：Ridgway等人，(「'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization」，Protein Eng . 1996年7月；9(7):617-21)。此方法已用於包裝毗鄰a-螺旋之間之胺基酸側鏈，其中a-螺旋中殘基之側鏈表示為在圓柱體表面上之間隔杵(knob)，其與臼(hole)交替，毗鄰a-螺旋之杵可配合於該等臼中(O'Shea等人，(1991) Science, 254, 539-544)。 免疫效應物-細胞表面抗原應對一種或一類免疫效應細胞具有特異性。已知多種免疫效應細胞之表面抗原。天然殺手細胞具有表面抗原，包括CD56、CD8、CD16、KIR家族受體、NKp46、NKp30、CD244 (2B4)、CD161、CD2、CD7、CD3及殺手細胞免疫球蛋白樣受體(Angelis等人，「Expansion of CD56-negative, CD16-positive, KIR-expressing natural killer cells after T cell-depleted haploidentical hematopoietic stem cell transplantation」，Acta Haematol . 2011；126(1):13-20；Dalle等人，「Characterization of Cord Blood Natural Killer Cells: Implications for Transplantation and Neonatal Infections」，Pediatric Research (2005) 57, 649-655；Agarwal等人，「Roles and Mechanism of Natural Killer Cells in Clinical and Experimental Transplantation」，Expert Rev. Clin. Immunol . 2008；4(1):79-91)。 巨噬細胞具有表面抗原，包括CD11b、F4/80、CD68、CSF1R、MAC2、CD11c、LY6G、LY6C、IL-4Rα、CD163、CD14、CD11b、F4/80 (小鼠)/EMR1 (人類)、CD68及MAC-1/MAC-3、PECAM-1 (CD31)、CD62、CD64、CD45、Ym1、CD206、CD45RO、25F9、S100A8/A9及PM-2K (Murray等人，「Protective and pathogenic functions of macrophage subsets,」Nature Reviews Immunology , 11, 723-737；Taylor等人，「Macrophage receptors and immune recognition,」Annu. Rev. Immunol. 2005；23:901-44; Pilling等人，「Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts,」PLoS ONE 4(10): e7475. doi:10.1371/journal.pone.0007475, 2009)。 淋巴介質-活化殺手(LAK)細胞具有表面抗原，包括T3、T4 T11、T8、TII、Leu7、Leu11 (Ferrini等人，「Surface markers of human lymphokine-activated killer cells and their precursors,」 Int J Cancer. 1987 Jan 15;39(1):18-24；Bagnasco等人，「Glycoproteic nature of surface molecules of effector cells with lymphokine-activated killer (LAK) activity,」 Int J Cancer. 1987 Jun 15;39(6):703-7；Kaufmann等人，「Interleukin 2 induces human acute lymphocytic leukemia cells to manifest lymphokine-activated-killer (LAK) cytotoxicity,」 The Journal of Immunology, August 1, 1987, 第139卷，第3期，977-982)。 T細胞、尤其細胞毒性T細胞具有表面抗原，包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、T58、CD27、CD45、CD84、CD25、CD127及CD196 (CCR6)、CD197 (CCR7)、CD62L、CD69、TCR、T10、T11及CD45RO (Ledbetter等人，「Enhanced transmembrane signaling activity of monoclonal antibody heteroconjugates suggests molecular interactions between receptors on the T cell surface」，Mol. Immunol . 1989 Feb；26(2):137-45；Jondal等人，「SURFACE MARKERS ON HUMAN T AND B LYMPHOCYTES」，JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE , 第136卷，1972, 207-215；Mingari等人，「Surface markers of human T lymphocytes」，Ric Clin Lab . 1982 Jul-Sep;12(3):439-448)。 雙特異性條件性活性抗體在與免疫效應細胞結合後可將免疫效應細胞帶至其中存在靶抗原(較佳在表面上)之細胞或組織。一旦雙特異性條件性活性抗體(與免疫效應細胞)與靶抗原結合，免疫效應細胞可攻擊患病細胞或患病組織。免疫效應細胞(例如天然殺手細胞、巨噬細胞、LAK細胞、T細胞(細胞毒性))皆能殺死及/或破壞患病細胞或組織，例如破壞腫瘤組織。 患病細胞或患病組織可選自癌症、發炎性疾病、神經元病症、糖尿病、心血管疾病或傳染病。靶抗原之實例包括以下表現之抗原：各種免疫細胞、癌瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖細胞瘤、母細胞瘤及與各種血液學疾病、自體免疫疾病及/或發炎性疾病相關之細胞。 雙特異性條件性活性抗體可靶向之癌症特有之靶抗原包括以下中之一或多者：4-IBB、5T4、腺癌抗原、α-胎兒蛋白、BAFF、B-淋巴瘤細胞、C242抗原、CA- 125、碳酸酐酶9 (CA-IX)、C-MET、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23 (IgE受體)、CD28、CD30 (TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNT0888、CTLA-4、DR5、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、纖連蛋白額外結構域-B、葉酸鹽受體1、GD2、GD3神經節苷酯、醣蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人類離散因子受體激酶、IGF-1 受體、IGF-I、IgGl、LI -CAM、IL-13、IL-6、胰島素樣生長因子 I 受體、整聯蛋白α5β1、整聯蛋白ανβ3、MORAb-009、MS4A1、MUC1、黏蛋白CanAg、N-羥乙醯基神經胺酸、NPC-1C、PDGF-R a、PDL192、磷酯醯絲胺酸、前列腺癌細胞、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、生腱蛋白C、TGF β 2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、腫瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2或波形蛋白。 欲用本發明遺傳工程化細胞毒性細胞或醫藥組合物治療之癌症類型包括癌瘤、母細胞瘤及肉瘤，及某些白血病或淋巴惡性病、良性及惡性腫瘤以及惡性病，例如肉瘤、癌瘤及黑色素瘤。癌症可為非實體腫瘤(例如血液學腫瘤)或實體腫瘤。亦包括成年腫瘤/癌症及兒科腫瘤/癌症。 血液學癌症係血液或骨髓癌症。血液學(或血原性)癌症之實例包括白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴球性白血病、急性骨髓細胞性白血病、急性骨髓性白血病及骨髓母細胞性、前髓細胞性、骨髓單核球性、單核球性及紅血球性白血病)、慢性白血病(例如慢性骨髓細胞性(顆粒球性)白血病、慢性骨髓性白血病及慢性淋巴球性白血病)；真性多血症、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(惰性及高級形式)、多發性骨髓瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重鏈病、骨髓發育不良症候群、毛細胞白血病及骨髓發育不良。 實體腫瘤係通常不含囊腫或液體區域之異常組織腫塊。實體腫瘤可為良性或惡性。針對形成實體腫瘤之細胞之類型對不同類型實體腫瘤進行命名(例如肉瘤、癌瘤及淋巴瘤)。可治療實體腫瘤之實例包括肉瘤及癌瘤，包括纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤及其他肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤恩氏腫瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、淋巴惡性病、胰臟癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細胞癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓樣癌、乳頭狀甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、威爾姆氏瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、精原細胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤及CNS腫瘤(例如神經膠質瘤(例如腦幹神經膠質瘤及混合型神經膠質瘤)、神經膠母細胞瘤(亦稱為多形性神經膠母細胞瘤)星細胞瘤、CNS淋巴瘤、胚細胞瘤、髓母細胞瘤、神經鞘瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、腦脊髓膜瘤、神經胚細胞瘤、視網膜母細胞瘤及腦轉移)。 雙特異性條件性活性抗體可靶向之發炎性疾病所特有之靶抗原包括以下中之一或多者：AOC3 (VAP-1)、CAM-3001、CCL11 (伊紅趨素-1)、CD125、CD147 (基礎免疫球蛋白)、CD154 (CD40L)、CD2、CD20、CD23 (IgE受體)、CD25 (IL-2受體之鏈)、CD3、CD4、CD5、IFN-a、IFN-γ、IgE、IgE Fc區、IL-1、IL-12、IL-23、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-22、IL-4、IL-5、IL-5、IL-6、IL-6受體、整聯蛋白a4、整聯蛋白α4β7、LFA-1 (CD1 la)、MEDI-528、肌肉生長抑制素、OX-40、rhuMAb β7、骨硬化素、SOST、TGF β 1、TNF-a或VEGF-A。 本發明雙特異性條件性活性抗體可靶向之靶神經元病症所特有之抗原包括以下中之一或多者：β類澱粉或MABT5102A。本發明雙特異性條件性活性抗體可靶向之糖尿病所特有之抗原包括以下中之一或多者：L-Ιβ或CD3。本發明雙特異性條件性活性抗體可靶向之心血管疾病所特有之抗原包括以下中之一或多者：C5、心臟肌凝蛋白、CD41 (整聯蛋白α-lib)、纖維蛋白II、β鏈、ITGB2 (CD 18)及神經鞘胺醇-1-磷酸酯。 本發明雙特異性條件性活性抗體可靶向之傳染病所特有之靶抗原包括以下中之一或多者：炭疽毒素、CCR5、CD4、凝集因子A、巨細胞病毒、巨細胞病毒醣蛋白B、內毒素、大腸桿菌、肝炎B表面抗原、B型肝炎病毒、HIV-1、Hsp90、流行性感冒A血球凝集素、脂磷壁酸、綠膿桿菌、狂犬病病毒醣蛋白、呼吸道融合病毒及TNF-a。 靶抗原之其他實例包括以特定或擴增方式發現於癌細胞上之表面蛋白，例如IL-14受體、B細胞淋巴瘤之CD19、CD20及CD40、各種癌瘤之Lewis Y及CEA抗原、乳癌及結腸直腸癌之Tag72抗原、肺癌之EGF-R、通常在人類乳癌及卵巢癌中擴增之葉酸結合蛋白及HER-2蛋白或病毒蛋白，例如HIV之gpl20及gp41套膜蛋白、來自B及C型肝炎病毒之套膜蛋白、人類巨細胞病毒之醣蛋白B及其他套膜醣蛋白及來自致癌病毒(例如卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒)之套膜蛋白。其他潛在靶抗原包括CD4，其中配體係HIV gpl20套膜醣蛋白，及其他病毒受體，例如ICAM (其係人類鼻病毒受體)及脊髓灰白質炎病毒之相關受體分子。 人類免疫缺失病毒(HIV)無法進入人類細胞，除非其首先結合至細胞表面上之兩個關鍵分子CD4及輔受體。最初識別之輔受體係CCR5，之後在該病毒之生命週期中另一趨化介素受體CXCR4變為HIV-1之輔受體(D'Souza,Nature Med . 2, 1293 (1996)；Premack,Nature Med . 2, 1174；Fauci,Nature 384, 529 (1996))。引起大部分藉由性接觸之病毒傳播之HIV-1株稱為M-趨性病毒。該等HIV-1株(亦稱為非融合誘導之(NSI)初代病毒)可在初代CD4+ T細胞及巨噬細胞中複製並使用趨化介素受體CCR5 (及較不經常地CCR3)作為其輔受體。T-趨性病毒(有時稱為融合誘導之(SI)初代病毒)亦可在初代CD4+ T細胞中複製，但可活體外另外感染已確立CD4+ T細胞系，此係經由趨化介素受體CXCR4 (融合素)來進行。多種該等T-趨性株除了CXCR4以外可使用CCR5，且至少在某些活體外條件下一些可經由CCR5進入巨噬細胞(D'Souza,Nature Med . 2, 1293 (1996)；Premack,Nature Med . 2, 1174；Fauci,Nature 384, 529 (1996))。由於M-趨性HIV-1株參與約90% HIV性傳播，CCR5係該病毒在患者中之主要輔受體。 靶細胞上輔受體分子之數目及屬性以及HIV-1株可能經由不同輔受體進入細胞之能力似乎係疾病進展之關鍵決定子。在源自患有霍奇金氏病之患者之淋巴結之T細胞及B細胞中亦觀察到CCR3及CCR5之高表現。I型糖尿病被視為T細胞介導之自體免疫疾病。在相關動物模型中， CCR5受體在胰臟中之表現與I型糖尿病之進展相關(Cameron (2000)J. Immunol . 165, 1102-1110)。在一個實施例中，雙特異性條件性活性抗體結合至作為靶抗原之CCR5，其可用於抑制宿主細胞之HIV感染以及減慢其他疾病之進展。 若干種特異性結合至(人類) CCR5之抗體為業內已知且包含MC-1 (Mack (1998)J. Exp. Med . 187, 1215-1224或MC-5 (Blanpain (2002)Mol. Biol. Cell . 13:723-37, Segerer (1999)Kidney Int . 56:52-64, Kraft (2001)Biol. Chem . 14; 276:34408-18)。因此，雙特異性條件性活性抗體較佳包含例如對CCR5、較佳人類CCR5具有特異性之抗體之VL 及VH 結構域(即Ig源第二結構域)，及對T細胞上之CD3抗原具有特異性之抗體之VH 及VL 結構域。 在另一實施例中，本發明提供針對T細胞上之CD3及作為靶抗原之CD19之雙特異性條件性活性抗體。已證實CD19係極為有用之醫療靶。CD19在自原B細胞至成熟B細胞之全部B細胞譜系中表現，以及在所有淋巴瘤細胞上一致地表現，且在幹細胞中不存在(Haagen,Clin Exp Immunol 90 (1992), 368-75；Uckun,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8603-7)。已揭示採用針對CD19之抗體及另一免疫調控抗體二者之組合療法用於治療B細胞惡性病(WO 02/04021、US2002006404、US2002028178)及自體免疫疾病(WO 02/22212、US2002058029)。WO 00/67795號揭示使用針對CD19之抗體治療B細胞淋巴瘤之惰性及侵襲性形式以及淋巴性白血病之急性及慢性形式。WO 02/80987號揭示基於針對抗原CD19之抗體之免疫毒素用於治療諸如以下等疾病之治療性用途：B細胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤或B細胞白血病(例如B細胞急性淋巴白血病(B-ALL)、(例如毛細胞淋巴瘤) B細胞前體急性淋巴白血病(前-B-ALL)、B細胞慢性淋巴白血病(B-CLL))。 在另一實施例中，本發明提供針對T細胞上之CD3及作為靶抗原之CD20之雙特異性條件性活性抗體。CD20係一種存於B-淋巴球上之細胞表面蛋白。CD20抗原發現與正常及惡性前-B及成熟B淋巴球中，包括在超過90% B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)中之彼等。該抗原在造血幹細胞、活化B淋巴球(漿細胞)及正常組織中不存在。已闡述若干種主要來源於鼠類之抗體：1F5 (Press等人，1987,Blood 69/2, 584-591)、2B8/C2B8、2H7、1H4 (Liu等人，1987,J Immunol. 139, 3521-3526；Anderson等人，1998, 美國專利第5,736,137號；Haisma等人，1998,Blood 92, 184-190；Shan等人，1999,J. Immunol . 162, 6589-6595)。 CD20已闡述於用於使用以編碼連接至載體蛋白之scFv之DNA進行疫苗接種來治療漿細胞惡性病之免疫治療策略中(Treon等人，2000,Semin. Oncol. 27(5), 598)，且已顯示使用CD20抗體(IDEC-C2B8)之免疫治療性治療可有效治療非霍奇金氏B細胞淋巴瘤。 在一些實施例中，雙特異性條件性活性抗體係多核苷酸分子編碼之單一多肽鏈。多核苷酸可為例如DNA、cDNA、RNA或合成產生之DNA或RNA或包含單獨或組合之彼等多核苷酸中任一者之重組產生之嵌合核酸分子。多核苷酸可為載體、例如表現載體之一部分，該載體包括質體、黏粒、病毒及噬菌體，或習用於遺傳工程化之任何表現系統。載體可包含其他基因，例如標記物基因，其容許在適宜宿主細胞中及在適宜條件下選擇載體。 在一態樣中，多核苷酸可操作連接至表現控制序列，容許在原核或真核細胞中表現。源自病毒(例如反轉錄病毒、牛痘病毒、腺相關病毒、皰疹病毒或牛乳頭瘤病毒)之表現載體可用於將多核苷酸或載體遞送至哺乳動物細胞。可藉由熟知方法將含有本發明多核苷酸之載體轉移至宿主細胞中，該等方法端視細胞宿主之類型而變。舉例而言，氯化鈣轉染一般用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主。 在另一態樣中，條件性活性多肽可經工程化以產生雙特異性條件性活性多肽。使雙特異性條件性活性多肽工程化之方法類似於如WO 2015/175375中所述使雙特異性條件性活性抗體工程化之方法。舉例而言，雙特異性條件性活性多肽可具有兩個活性位點，其各自具有條件性活性，即在正常生理條件下活性低於野生型位點且在異常條件下活性高於野生型位點。該兩個條件性活性位點可獨立演化及篩選，之後用連接體將兩個活性位點連接至同一雙特異性條件性活性多肽中。在一態樣中，用於雙特異性條件性活性抗體中之連接體適於藉由連接條件性活性多肽中之兩個條件性活性位點來產生雙特異性條件性活性多肽。 使條件性活性抗體之Fc區工程化之方法已闡述於WO 2015/175375中。使條件性活性病毒顆粒工程化之方法亦已闡述於WO 2015/175375中。 在一些態樣中，可使用WO 2015/175375中所述方法將條件性活性多肽插入病毒顆粒中，該病毒顆粒係溶瘤病毒。溶瘤病毒係在與腫瘤細胞接觸時能殺死彼等腫瘤細胞之病毒。插入溶瘤病毒中之條件性活性多肽在腫瘤微環境中活性較高，但在個體其他位點中活性較低。舉例而言，條件性活性多肽在腫瘤微環境之pH (例如，pH 6.2-6.8)下活性較高，但在存於個體其他位點中之pH (例如，pH 7.2-7.6)下活性較低。插入溶瘤病毒中之條件性活性多肽將使得溶瘤病毒能被遞送遞送至腫瘤，其中溶瘤病毒可靶向並殺死腫瘤細胞。 所關注溶瘤病毒包括腺病毒；單純皰疹病毒-1；牛痘病毒；小病毒；裡奧病毒；新城雞瘟病毒；及諸如此類。牛痘病毒尤其受關注。 在一態樣中，溶瘤病毒選自由以下組成之群：副黏液病毒、裡奧病毒、皰疹病毒、腺病毒及塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)。在另一態樣中，副黏液病毒選自由以下組成之群：新城雞瘟病毒(NDV)、麻疹病毒及腮腺炎病毒。在另一態樣中，NDV來自選自由MTH68/H、PV-701及73-T組成之群之病毒株。 在另一態樣中，溶瘤病毒選自皰疹病毒、裡奧病毒、E1B缺失之腺病毒、水皰性口炎病毒及痘病毒。該等溶瘤病毒具有不僅破壞腫瘤細胞，且亦自所破壞腫瘤細胞釋放抗原，由此觸發免疫反應之潛能。 溶瘤病毒之具體實例包括但不限於腺病毒(例如Δ-24、Δ-24-RGD、ICOVIR-5、ICOVIR-7、Onyx-015、ColoAdl、H101 、AD5/3-D24-GMCSF)、裡奧病毒、單純皰疹病毒(HSV；OncoVEX GMCSF)、新城雞瘟病毒、麻疹病毒、反轉錄病毒(例如流行性感冒病毒)、痘病毒(例如牛痘病毒，包括Copenhagen、Western Reserve、Wyeth株)、黏液瘤病毒、棒狀病毒(例如水皰性口炎病毒(VSV))、微小RNA病毒(例如塞尼卡穀病毒(Seneca Valley virus)；SW-001)、柯薩奇病毒及小病毒。 在一態樣中，溶瘤病毒係腺病毒，包括其57個人類血清型(HAdV-1至57)中任一者之成員。在一個實施例中，腺病毒係Ad5血清型。在其他態樣中，腺病毒係雜合血清型，其可包含或可不包含Ad5組分。適宜腺病毒之非限制性實例包括Δ-24、Δ-24-RGD、ICOVIR-5、ICOVIR-7、ONYX-015、ColoAdl、H101及AD5/3-D24-GMCSF。ONYX-015係病毒血清型Ad2及Ad5之雜合體，其在E1B-55K及E3B區域具有缺失以增強癌症選擇性。HI 01係Onyx-015之經修飾形式。ICOVIR-5及ICOVIR-7包含El A之Rb-結合位點缺失且用E2F啟動子替代El A啟動子。Colo Ad 1係嵌合Addl lp/Ad3血清型。AD5/3-D24-GMCSF (CGTG-102)係編碼GM-CSF之血清型5/3衣殼經修飾之腺病毒(Ad5衣殼蛋白杵經來自血清型3之杵結構域替代)。 在一尤佳實施例中，溶瘤病毒係Δ-24或Δ-24-RGD腺病毒。Δ-24闡述於美國專利申請公開案第2003/0138405號及第2006/0147420號中。Δ-24腺病毒源自腺病毒5型(Ad-5)且含有El A基因之CR2部分內之24-鹼基對缺失。Δ-24-RGD進一步包含將RGD-4C序列(其強結合至ανβ3及ανβ5整聯蛋白)插入纖維杵蛋白之HI環中(Pasqualini R.等人，Nat. Biotechnol. , 15:542-546, 1997)。 溶瘤腺病毒亦可經進一步修飾以改良溶瘤腺病毒治療癌症之能力。溶瘤腺病毒之該等修飾已闡述於Jiang等人(Curr. Gene Ther ., 2009 Oct 9(5):422-427)中，亦參見美國專利申請案第2006/0147420號。 具有條件性活性多肽之溶瘤病毒可局部或全身投與。例如但不限於，溶瘤病毒可以以下方式投與：血管內(動脈內或靜脈內)、腫瘤內、肌內、真皮內、腹膜內、皮下、經口、非經腸、鼻內、氣管內、經皮、脊椎內、經眼或顱內。 溶瘤病毒可以單次投與或多次投與來投與。該病毒可以以下劑量投與：至少1 × 105 噬菌斑形成單位(PFU)、至少5 × 105 PFU、至少1 × 106 PFU、至少5 × 106 或至少5 × 106 PFU、1 × 107 、至少1 × 107 PFU、至少1 × 108 或至少1 × 108 PFU、至少1 × 108 PFU、至少5 × 108 PFU、至少1 × 109 或至少1 × 109 PFU、至少5 × 109 或至少5 × 109 PFU、至少1 × 1010 PFU或至少1 × 1010 PFU、至少5 × 1010 或至少5 × 1010 PFU、至少1 × 1011 PFU或至少1 × 1011 PFU、至少1 × 1012 PFU或至少1 × 1013 PFU。舉例而言，溶瘤病毒可以以下劑量投與：介於約107 -1013 PFU之間、介於約108 -1013 PFU之間、介於約109 -1012 PFU之間或介於約108 - 1012 PFU之間。 在某些態樣中，欲用溶瘤病毒治療之癌症包括任何實體腫瘤，例如肺、卵巢、乳房、子宮頸、胰臟、胃、結腸、皮膚、喉、膀胱及前列腺癌。在一態樣中，癌症係中樞神經系統癌症。癌症可為神經上皮腫瘤，例如星形細胞瘤(例如星細胞瘤、分化不良星細胞瘤、神經膠母細胞瘤、神經膠肉瘤、毛狀細胞星細胞瘤、巨細胞星細胞瘤、多形性黃色瘤型星細胞瘤)、寡樹突神經膠細胞瘤、室管膜瘤、寡星細胞瘤、海綿絲原細胞瘤、星狀胚細胞瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、脈絡叢癌、神經節細胞瘤、神經節神經膠質瘤、神經細胞瘤、神經上皮腫瘤、神經胚細胞瘤、松果體區腫瘤(例如松果體細胞瘤、松果體母細胞瘤或混合型松果體細胞瘤/松果體母細胞瘤)、髓上皮瘤、髓母細胞瘤、神經胚細胞瘤或神經節神經胚細胞瘤、視網膜母細胞瘤或室管膜母細胞瘤。癌症可為中樞神經系統腫瘤，例如鞍區腫瘤(例如垂體腺瘤、垂體癌或顱咽管瘤)、血液腫瘤(例如原發性惡性淋巴瘤、漿細胞瘤或顆粒球性肉瘤)、生殖細胞瘤(例如胚細胞瘤、胚胎性癌、卵黃囊瘤、絨毛膜癌、畸胎瘤或混合型生殖細胞瘤)、腦脊髓膜瘤、間質瘤、黑色素細胞瘤或腦神經或脊神經腫瘤(例如神經鞘瘤或神經纖維瘤)。癌症可為低級神經膠質瘤(例如室管膜瘤、星細胞瘤、寡樹突神經膠細胞瘤或混合型神經膠質瘤)或高級(惡性)神經膠質瘤(例如多形性神經膠母細胞瘤)。癌症可為原發性或轉移腦瘤。 D. 產生條件性活性多肽 自親代多肽產生條件性活性多肽之方法包含以下步驟：使用一或多種選自以下之技術演化編碼親代多肽之DNA以增加親代多肽之淨電荷：增加DNA中帶電荷胺基酸殘基之密碼子之總數、減少DNA中不帶電荷胺基酸殘基之密碼子之總數及其組合，從而產生突變體DNA；表現突變體DNA以產生突變體多肽；及使突變體多肽及親代多肽經歷第一條件(其可為正常生理條件)下之篩選分析及第二條件(其可為異常條件)下之篩選分析。條件性活性多肽選自彼等展現以下二者之突變體多肽：(a) 與第一分析中親代多肽之相同活性相比，條件之第一值下第一分析中之活性降低，及(b) 與第二分析中親代多肽之相同活性相比，在相同條件之第二值下第二分析中之相同活性增加。條件性活性多肽在第一條件或正常生理條件下之活性降低可為可逆或不可逆。 i. 親代多肽 親代多肽可為野生型多肽、源自野生型多肽之突變體多肽(例如治療多肽)、源自不同野生型多肽之嵌合多肽或甚至合成多肽。親代多肽可選自抗體、酶、細胞介素、調控蛋白、激素、受體、配體、生物仿製藥、免疫調節劑、生長因子、壓力蛋白、穹窿體相關蛋白、神經元蛋白、消化道蛋白、生長因子、粒線體蛋白、胞質蛋白、動物蛋白、結構蛋白、植物蛋白及該等多肽之片段。 在一些實施例中，親代多肽可為野生型多肽之片段、治療多肽之片段或抗體片段。在一些其他實施例中，親代多肽可為選自突變體多肽之多肽，該等突變體多肽係藉由誘變方法產生，其中該多肽經選擇具有期望性質，例如高結合活性、高表現程度或人類化。所選擇多肽(在此情形中並非野生型多肽)可用作欲在本文所揭示方法中演化之親代多肽。 關於適宜野生型多肽及可對其進行演化及選擇以供產生條件性活性多肽之方式的說明已闡述於美國專利第8,709,755 B2號中。 在一些實施例中，親代多肽可選自野生型多肽或突變體多肽之庫，例如噬菌體展示庫。在該等實施例中，尤其藉由表面展示技術在噬菌體庫中表現眾多種候選多肽。針對適宜親代多肽篩選來自庫之候選多肽。典型噬菌體庫可含有在細菌宿主中表現數千種或甚至數百萬種候選多肽之噬菌體。在一個實施例中，噬菌體庫可包括複數種噬菌體。 為構築噬菌體庫，通常藉由將編碼候選多肽之寡核苷酸插入一種噬菌體外殼蛋白之編碼序列中對絲狀噬菌體(例如絲狀大腸桿菌噬菌體M13)進行遺傳修飾。噬菌體之外殼蛋白隨後與候選多肽一起表現，使得在噬菌體顆粒之表面上展示候選多肽。隨後針對適宜親代多肽篩選所展示候選多肽。 一種用於針對適宜親代多肽進行篩選之常用技術係將帶有期望候選多肽的噬菌體顆粒固定在載體上。載體可為塗佈有可與期望候選多肽結合之「餌料(bait)」之塑膠板。可自板洗除未結合噬菌體顆粒。藉由洗滌溶析結合至板(帶有期望候選者)之噬菌體顆粒且在細菌中擴增所溶析噬菌體顆粒。隨後可藉由定序來確定所選噬菌體顆粒中編碼候選多肽之序列。候選多肽與餌料之間之關係可為例如配體-受體或抗原-抗體關係。 針對適宜親代多肽篩選之另一常用技術係使用個別噬菌體純系之酶分析來分析候選多肽展現之期望酶活性。端視具體酶活性，熟習此項技術者可設計適當分析來篩選具有期望酶活性程度之親代多肽。 在一些實施例中，噬菌體庫係作為陣列來提供，使得每一噬菌體純系佔據陣列上之特定位置。此一陣列可提供於固體載體上，例如膜、瓊脂板或微量滴定板，將庫之每一噬菌體純系置於或黏附於其上，在固體載體上之特定預定位置。在瓊脂板情形中，該等板較佳包括細菌生長培養基以支持細菌生長。在陣列提供於膜(例如硝化纖維素或耐綸膜)上時，將細菌培養物施加至膜上並用營養生長培養基浸泡該膜。另外，噬菌體純系亦可提供於珠粒上，在該情形中可將單一噬菌體純系黏附至單一珠粒。或者，噬菌體純系可各自提供於光纖末端上，在該情形中使用該纖維光學連通來自光源之紫外輻射。 典型噬菌體庫可含有106 至1010 種噬菌體，其各自依據帶有不同候選多肽之外殼蛋白(例如在噬菌體M13情形中，gp3或gp8)來區別。用於噬菌體庫之細菌宿主可選自多種細菌屬，包括例如沙門桿菌屬(Salmonella )、葡萄球菌屬(Staphylococcus )、鏈球菌屬(Streptococcus )、志賀桿菌屬(Shigella )、李氏菌屬(Listeria )、曲桿菌屬(Campylobacter )、克留氏菌屬(Klebsiella )、耶爾辛氏菌屬(Yersinia )、假單胞菌屬(Pseudomonas )及大腸桿菌屬(Escherichia )。 編碼候選多肽之寡核苷酸可為編碼野生型多肽之cDNA集合。已知自生物樣品合成cDNA之方法，其中可表現適宜親代多肽。可採集任何經由轉錄物表現生理活性之遺傳資訊作為cDNA。在產生cDNA時，合成全長cDNA係必需的。有若干種方法可用於合成全長cDNA。舉例而言，適宜方法包括利用酵母或Hela細胞之端帽結合蛋白標記5'端帽位點之方法(I. Edery等人，「An Efficient Strategy To Isolate Full-length cDNAs Based on a mRNA Cap Retention Procedure (CAPture)」,Mol. Cell. Biol. , 第15卷，第3363-3371頁, 1995)；及其中藉由使用鹼性磷酸酶移除無5'端帽之不完整cDNA之磷酸酯，隨後用煙草嵌紋病毒之脫帽酶處理整個cDNA，使得僅全長cDNA具有磷酸酯之方法(K. Maruyama等人，「Oligo-capping: a simple method to replace the cap structure of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleotides」,Gene , 第138卷，第171-174頁，1995；及S. Kato等人，「Construction of a human full-length cDNA bank」,Gene , 第150卷，第243-250頁, 1995)。 在親代多肽係抗體之實施例中，候選抗體庫可使用源自生物體之完整抗體譜之重組體抗體來產生。將代表抗體譜之遺傳資訊裝配為完整抗體之大集合，可針對具有期望抗原結合活性及/或一或多種其他功能性特徵之適宜親代抗體篩選該大集合。在一些實施例中，自經抗原免疫之動物(例如經免疫人類、小鼠或兔)分離B細胞。收集來自經分離B細胞之mRNA並轉化為cDNA，然後對其進行定序。將編碼輕鏈之最常見cDNA片段及編碼重鏈之最常見cDNA片段裝配為抗體。在一個實施例中，裝配100個編碼輕鏈之最常見cDNA片段及100個編碼重鏈之最常見cDNA片段以產生候選抗體。在另一實施例中，裝配僅編碼重鏈可變區及輕鏈可變區之最常見cDNA片段以產生僅含可變區，不含恆定區之抗體片段。 在一些實施例中，將編碼IgG重鏈可變區之cDNA片段與IgK或IgK輕鏈之最常見可變區裝配在一起。所裝配抗體含有來自IgG之重鏈可變區及來自IgK之輕鏈可變區或IgK。 隨後較佳以基於板之格式選殖並表現編碼所裝配抗體之cDNA。所表現抗體之結合活性可用基於珠粒之ELISA分析來分析且適宜親代抗體可基於該ELISA分析來選擇。編碼所裝配抗體之cDNA亦可在噬菌體展示庫中表現，隨後可藉由本文所揭示任一技術針對一或多種期望親代抗體對其進行篩選。 在親代多肽係抗體之實施例中，親代抗體較佳具有至少一種特定特徵使得更易於將該親代抗體演化為條件性活性抗體。在某些實施例中，在正常生理條件及異常條件兩種條件下，親代抗體可具有類似結合活性及/或特徵。在該等實施例中，親代抗體係基於在正常生理條件及異常條件兩種條件下具有最相似結合活性及/或最相似的一或多種特徵之組合來選擇。舉例而言，若正常生理條件及異常條件分別係pH 7.4及pH 6.0，則相對於在pH 7.4及6.0下具有較不相似之結合活性之抗體，可選擇在pH 7.4及6.0下具有最相似結合活性之親代抗體。 ii. 演化親代多肽 在一些態樣中，使用一或多種定點誘變技術使編碼親代多肽之DNA突變以將一或多個帶電荷胺基酸殘基引入親代多肽中。在一態樣中，帶電荷胺基酸殘基可在親代多肽內之任一位置引入。在另一態樣中，將帶電荷胺基酸殘基引入親代多肽之活性位點中。活性位點係親代多肽內負責親代多肽之特定性質之區域。該性質可為酶受質特異性、酶產物選擇性、蛋白質分泌性質、配體選擇性、配體結合活性、蛋白質穩定性及抗體結合活性。活性位點之實例包括酶催化位點、配體或受體之結合位點、抗體之互補決定區及抗原之表位。 在一態樣中，將帶電荷胺基酸殘基引入親代抗體或親代抗體可變區之兩個或更多個互補決定區中。在另一態樣中，將帶電荷胺基酸殘基引入親代多肽之參與與配體、受體或激素之結合之兩個或更多個區域中。在另一態樣中，將帶電荷胺基酸殘基引入親代多肽之參與催化活性(例如形成酶之催化袋)之兩個或更多個區域中。 在另一態樣中，可將帶電荷胺基酸殘基引入親代多肽之活性位點外部之區域中。舉例而言，該區域可與活性位點相鄰、在其周圍或甚至遠離該活性位點。在一態樣中，該區域係抗體重鏈或輕鏈之恆定區。該區域亦可係抗體重鏈或輕鏈之可變區之框架區。 為將一或多個帶電荷胺基酸殘基引入親代多肽中，藉由用帶電荷胺基酸之密碼子取代DNA中之密碼子或藉由將帶電荷胺基酸之密碼子插入DNA中使編碼親代多肽之DNA突變，由此產生可表現以產生突變體多肽之突變體DNA。帶電荷胺基酸殘基之密碼子之取代或插入可使用本文所述一或多種定點誘變技術完成。 欲引入編碼親代多肽之DNA中之帶電荷胺基酸殘基之密碼子顯示於表2。表 2. 帶電荷胺基酸之密碼子 在一態樣中，突變體多肽與親代多肽相比具有少於6個突變、或少於5個突變、或少於4個突變、或少於3個突變、或少於2個突變。該等突變數目可足以產生期望條件性活性多肽。 在一些態樣中，使用一或多種定點誘變技術使編碼親代多肽之DNA突變以使不帶電荷胺基酸殘基之一或多個密碼子缺失。親代多肽中一或多個不帶電荷胺基酸殘基之缺失增加親代多肽之淨電荷。 在另一態樣中，可藉由使不具有或具有極少帶電荷胺基酸殘基之區域缺失來使親代多肽突變，由此相對於親代多肽之淨電荷增加突變多肽之淨電荷。舉例而言，全長抗體可具有不具有或具有極少帶電荷胺基酸殘基之恆定區。藉由使恆定區缺失及連接兩個抗體可變區以形成單鏈抗體，此亦可導致與親代抗體之淨電荷相比，突變體單鏈抗體之淨電荷增加。在一實例中，全長抗體係IgG抗體且轉化為淨電荷增加之單鏈抗體。 在一些態樣中，可使用任何定點誘變技術使編碼親代多肽之DNA突變，例如闡述於美國專利第6,391,548號、第7,132,265號及第6,713,285號中之彼等。在一些實施例中，可採用之定點誘變技術包括編碼親代多肽之DNA之寡核苷酸介導之誘變、PCR誘變及盒式誘變。 寡核苷酸介導之誘變係將一或多個密碼子取代至或插入編碼親代多肽之DNA中之適宜方法。此技術先前已闡述於以下文獻中：Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989，第二版，第15.51章，「Oligonucleotide-mediated mutagenesis」。簡言之，藉由使攜載期望突變之寡核苷酸引子與已還原為單股形式之DNA雜交來改變DNA。在雜交後，使用DNA聚合酶合成DNA之整個第二互補股，其將由此納入寡核苷酸引子並產生含有期望突變之產物。 通常，使用長度為至少25個核苷酸之寡核苷酸。最佳寡核苷酸將具有在突變任一側與模板完全互補之12至15個核苷酸。此確保寡核苷酸將與單股DNA正確雜交。寡核苷酸易於使用業內已知之技術來合成，例如以下文獻中所述之技術：Crea等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 75: 5765, 1978)。 在一態樣中，編碼親代多肽之DNA在環狀DNA分子、例如質體或黏粒內。使寡核苷酸在適宜雜交條件下與單股環狀DNA分子雜交。隨後添加DNA聚合酶(通常DNA聚合酶I之Klenow片段)以使用寡核苷酸作為合成引子來合成單股環狀DNA分子之互補股。由此形成異源雙鏈體分子，使得DNA之一股具有突變，且另一股(初始股)不具有突變。此異源雙鏈體分子隨後轉變至適宜宿主細胞(通常係原核生物，例如大腸桿菌JM101)中。在細胞生長後，將其平鋪至瓊脂醣板上且使用經32-磷酸酯放射標記之寡核苷酸引子加以篩選以鑑別含有突變DNA之細菌群落。隨後移除突變DNA並置於適當表現載體中以供產生蛋白質。 可修改此程序使得產生同源雙鏈體分子，其中質體之兩個股皆含突變。修改如下：使寡核苷酸引子退火至如上所述之單股環狀DNA分子。將3種去氧核糖核苷酸(去氧核糖腺苷(dATP)、去氧核糖鳥苷(dGTP)及去氧核糖胸苷(dTTP))之混合物與稱為dCTP-(aS)之經修飾硫代-去氧核糖胞嘧啶組合。將此混合物添加至單股環狀DNA分子-寡核苷酸雜交複合物。在將DNA聚合酶添加至此混合物之後，產生除突變外與單股環狀DNA分子一致之DNA股。另外，此新DNA股將含有dCTP-(aS)代替dCTP，其用於防止其被限制內核酸酶消化。在異源雙鏈體經適當限制性酶切口後，可用ExoIII核酸酶或另一適當核酸酶越過含有欲誘變位點之區域消化異源雙鏈體中之單股環狀DNA分子。隨後停止反應以產生僅為部分單股之DNA分子。隨後在所有4種三磷酸去氧核糖核苷酸、ATP及DNA連接酶存在下使用DNA聚合酶形成完整雙股DNA同源雙鏈體。隨後可將此同源雙鏈體分子轉變至如上所述之適宜宿主細胞中，例如大腸桿菌JM101。 將兩個或更多個突變引入(插入及/或取代)至編碼親代多肽之DNA中可以若干種方式中之一種來完成。若欲突變位置在DNA分子中靠近在一起，則其可使用一個具有所有期望突變之寡核苷酸引子同時突變。然而，若欲突變位置彼此相距一定距離(例如，間隔多於約25個核苷酸)，則更難產生具有所有期望突變之單一寡核苷酸引子。而係可採用兩種替代方法中之一種。 在一種替代方法中，每一突變使用單獨寡核苷酸引子。隨後使寡核苷酸引子同時退火至單股環狀DNA分子，且所合成DNA之第二互補股將含有來自單獨寡核苷酸引子之所有期望突變。 另一種替代方法涉及兩輪或更多輪定點誘變以產生具有所有突變之期望DNA。第一輪如所述用於單一突變：使用具有第一期望突變之寡核苷酸引子產生異源雙鏈體DNA分子. 第二輪誘變利用第一輪中產生之異源雙鏈體DNA分子作為模板，其已含有一個突變。隨後使編碼另一突變之第二寡核苷酸引子退火至此模板以產生含有來自第一輪及第二輪誘變二者之突變之第二DNA分子。若期望，則可在第三輪誘變中使用第二DNA分子作為模板，等等。 另一適宜定點誘變方法係PCR誘變，其可用於進行親代多肽中之插入及/或取代突變。作為環狀擴增技術，PCR已廣泛用於定點誘變中，其中使用誘變性引子引入期望突變(參見Allemandou等人，J Biomed. Biotechnol. S , 202-207, (2003)；An等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. S 68, 774-778, (2005)；Jeltsch等人，Methods MoI. Biol. S 182, 85-94 (2002)；Hall等人Protein Eng . 4:601 (1991)；Hemsley等人，Nucleic Acids Research 17:6545-6551 (1989)；Ho等人，Gene 77:51-59 (1989)；Hultman等人，Nucleic Acids Research 18:5107-5112 (1990)；Jones等人，Nature 344:793-794 (1990)；Jones等人，Biotechniques 12:528-533 (1992)；Landt等人，Gene 96:125-128 (1990)；Nassal等人，Nucleic Acids Research 18:3077-3078 (1990)；Nelson等人，Analytical Biochemistry 180:147-151 (1989)；Vallette等人，Nucleic Acids Research 17:723-733 (1989)；Watkins等人，Biotechniques 15:700-704 (1993)；Weiner等人，Gene 126:35-41 (1993)；及Yao等人，PCR Methods and Applications 1:205-207 (1992))。 特定而言，使用少量編碼親代多肽之DNA作為PCR中之模板DNA。誘變性引子之序列與模板DNA中之相應區域略有不同，用於產生相對大量之僅在誘變性引子與模板DNA不同之位置具有期望突變之特定DNA片段。對於將突變引入環形DNA中，一種引子經設計與突變位置重疊且含有該突變；另一引子之序列可與環形DNA相對股之序列延伸段一致，但此序列可定位於沿環形DNA之任何位置。然而，第二引子之序列較佳定位於距第一引子之序列200個核苷酸內，使得最終引子結合之整個DNA擴增區域可易於定序以確認突變。使用引子對之PCR擴增得到在誘變性引子中之突變位置不同之DNA片段。 分開位置之突變可藉由使用第二誘變性引子或用不同誘變性引子實施第二輪PCR且將兩個所得PCR片段以三(或更多)部分連接同時連接至載體同時引入。 在PCR誘變之具體實例中，藉由用限制內核酸酶消化使模板質體DNA (1 μg)線性化，該酶在質體DNA中在欲擴增區域外部具有獨特識別位點。將100 ng此材料添加至PCR混合物中，該混合物包含含有4種三磷酸去氧核苷酸且包括於GeneAmp®套組(得自Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn.及Emeryville, Calif.)中之PCR緩衝液及25 pmole每一寡核苷酸引子，最終體積50 μl。反應混合物經35 μl礦物油覆蓋。使反應在100℃下變性5分鐘，短暫置於冰上，隨後在礦物油層下方添加1 μl水生棲熱菌(Thermus aquaticus ) (Taq) DNA聚合酶(5單位/μl，購自Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn.及Emeryville, Calif.)。隨後將反應混合物插入如下程式化之DNA熱循環儀(購自Perkin-Elmer Cetus)中：2 min. 55℃，30 sec. 72℃，隨後19個以下之循環：30 sec. 94℃.，30 sec. 55℃，及30 sec. 72℃。在方法最後，自熱循環儀移除反應小瓶並將水相轉移至新小瓶，用酚/氯仿(50:50:vol.)萃取，且用乙醇沈澱，且藉由標準程序回收DNA。隨後使此材料經歷適當處理以供插入載體中。 盒式誘變係另一種定點誘變技術，其可用於將插入及/或取代引入編碼親代多肽之DNA中。此技術已闡述於Wells等人(Gene , 34:315, (1985))中。在突變之每一側上必須有獨特限制內核酸酶位點。若不存在該等限制位點，則其可使用上述寡核苷酸介導之誘變技術將其在DNA之適當位置引入來產生。在該等限制位點切割編碼親代多肽之DNA。在限制位點之間具有相同DNA序列但含有期望突變之單獨雙股DNA片段係使用標準化學合成程序來合成。此含有突變之合成DNA片段稱為盒。此盒經設計具有與經限制內核酸酶處理之DNA之末端相容之3'端及5'端，使得可將其直接連接至限制內核酸酶處理之DNA。所連接DNA現含有期望突變。 使用一或多種定點誘變技術，使編碼親代多肽之DNA突變以引入一或多個帶電荷胺基酸殘基之密碼子。由此產生之突變體DNA編碼具有對應於所引入密碼子之帶電荷胺基酸殘基之突變體多肽。因此，突變體多肽可具有與親代多肽相比增加之帶電荷胺基酸殘基總數。 iii. 突變體多肽之表現 在使用一或多種定點誘變技術產生突變體DNA後，表現突變體DNA以產生突變體多肽。表現突變體DNA以產生突變體多肽之適宜方法已闡述於美國專利第8,709,755 B2號中。 在一態樣中，突變體DNA可使用肽展示方法來表現，以供有效篩選條件性活性多肽。該等方法進一步闡述於PCT專利公開案第WO 91/17271號、第WO 91/18980號、第WO 91/19818號及第WO 93/08278號中。 WO 93/08278闡述用於展示肽配體之重組體DNA方法，其包括產生融合蛋白庫，各融合蛋白由可用於有效結合至巨分子之通常包含可變序列之第一多肽部分及結合至DNA (例如編碼個別融合蛋白之DNA載體)之第二多肽部分組成。當在容許表現融合蛋白之條件下培養經轉變宿主細胞時，融合蛋白結合至編碼其之DNA載體。在宿主細胞裂解後，可以與在基於噬菌體之展示系統中篩選噬菌體顆粒相同之方式，針對固定巨分子篩選融合蛋白/載體DNA複合物，其中所選融合蛋白/載體DNA複合物中之DNA載體之複製及定序用作鑑別所選多肽序列之基礎。 肽展示方法包括活體外及活體內展示單鏈抗體之方法，例如多核糖體上之新生scFv或在噬菌體上展示之scFv，其使得能大規模篩選具有可變區序列及結合特異性之寬多樣性之scFv庫。 其他表現突變體多肽之方法使用無細胞酶機構來完成突變體多肽之活體外合成。該等方法依賴於活體外轉譯，通常包含經穩定多核糖體複合物，進一步闡述於PCT專利公開案第WO 88/08453號、第WO 90/05785號、第WO 90/07003號、第WO 91/02076號、第WO 91/05058號及第WO 92/02536號中。 親和力富集方法容許篩選突變體多肽之極大庫及篩選編碼期望多肽之突變體DNA。隨後可分離突變體DNA並改組以組合地重組所選多肽(或其預定部分)或單鏈抗體(或僅其VH、VL或CDR部分)之胺基酸序列。使用該等方法，可將突變體多肽或單鏈抗體鑑別為對分子具有期望結合親和性，且可利用改組方法快速會聚至期望高親和力突變體多肽或scFv。 iv. 條件性活性多肽之篩選 篩選突變體多肽以供選擇條件性活性多肽之方法已闡述於美國專利第8,709,755 B2號中，該等方法係以引用方式併入本文中。 v. 篩選及選擇條件性活性多肽之分析條件 用於篩選步驟中之分析之第一條件及第二條件或正常生理條件及異常條件可使用選自以下之條件來實施：溫度、pH、滲透壓、滲透重量莫耳濃度、氧化壓力、電解質濃度、蛋白質濃度以及該等條件中兩種或更多種之組合。舉例而言，溫度之正常生理條件可為正常人類體溫37.0℃，而溫度之異常條件可為與37.0℃溫度不同之溫度，例如腫瘤微環境中之溫度，其可較正常生理溫度高1-2℃。在另一實例中，正常生理條件及異常條件亦可為在7.2-7.8或7.2-7.6範圍內之正常生理pH及例如存於腫瘤微環境中之在5.5-7.2、6-7或6.2-6.8範圍內之異常pH。 在第一條件及第二條件或正常生理條件及異常條件二者下之分析可在分析介質中實施。分析介質可為溶液，其可含有例如緩衝液以及其他組分。可用於分析介質中之一般緩衝液包括檸檬酸鹽緩衝液(例如檸檬酸鈉)、磷酸鹽緩衝液、碳酸氫鹽緩衝液(例如Krebs緩衝液)、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)緩衝液、漢克氏緩衝液(Hank’s buffer)、Tris緩衝液、HEPES緩衝液等。可使用熟習此項技術者已知適於該等分析之其他緩衝液。該等緩衝液可用於模擬人類或動物體液(例如血漿或淋巴液)組成之特徵或組分。 可用於本發明方法中之分析溶液可含有至少一種選自以下之組分：無機化合物、離子及有機分子，較佳一般發現於哺乳動物(例如人類或動物)體液中之組分。該等組分之實例包括營養組分及代謝物，以及任何其他可發現於體液中之組分。本發明涵蓋此組分可為或可不為緩衝液系統之一部分。舉例而言，分析溶液可為添加有碳酸氫根離子之PBS緩衝液，其中碳酸氫根並非PBS緩衝液之一部分。或者，碳酸氫根離子係Krebs緩衝液之組分。 該組分可以實質上相同之濃度存於兩種分析溶液(對於第一及第二條件)中，同時兩種分析溶液在諸如pH、溫度、電解質濃度或滲透壓等另一態樣中不同。因此，使用該組分作為第一及第二條件或正常生理條件及異常條件之兩種條件之間之常數而非差異。 在一些實施例中，組分以與該組分在哺乳動物中、尤其在人類中之正常生理濃度接近或相同之濃度存於兩種分析溶液中。 無機化合物或離子可選自以下中之一或多者：硼酸、氯化鈣、硝酸鈣、磷酸氫二銨、硫酸鎂、磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鉀、硫酸銅、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂、硝酸鈣、鈣、銅、鐵、錳及鋅之螯合物、鉬酸銨、硫酸銨、碳酸鈣、磷酸鎂、碳酸氫鉀、硝酸鉀、鹽酸、二氧化碳、硫酸、磷酸、碳酸、尿酸、氯化氫、尿素、磷離子、硫酸根離子、氯離子、鎂離子、鈉離子、鉀離子、銨離子、鐵離子、鋅離子及銅離子。 一些無機化合物之正常生理濃度之實例包括：在2-7.0 mg/dL濃度範圍內之尿酸、在8.2-11.6 mg/dL濃度範圍內之鈣離子、在355-381 mg/dL濃度範圍內之氯離子、在0.028-0.210 mg/dL濃度範圍內之鐵離子、在12.1-25.4 mg/dL濃度範圍內之鉀離子、在300-330 mg/dL濃度範圍內之鈉離子、在15-30 mM濃度範圍內之碳酸、約80 μM之檸檬酸根離子、在0.05-2.6 mM範圍內之組胺酸根離子、在0.3-1 μM範圍內之組織胺、在1-20 μM範圍內之HAPT離子(氫化三磷酸腺苷)及在1-20 μM範圍內之HADP離子。 在一些實施例中，存於第一條件及第二條件或正常生理條件及異常條件二者之分析溶液中之離子選自氫氧離子、鹵離子(氯、溴、碘)、鹵氧化物離子、硫酸根離子、鎂離子、鈣離子、硫酸氫根離子、碳酸根離子、碳酸氫根離子、磺酸根離子、鹵氧化物離子、硝酸根離子、亞硝酸根離子、磷酸根離子、磷酸氫根離子、磷酸二氫根離子、過硫酸根離子、單過硫酸根離子離子、硼酸根離子、銨離子；或有機離子，例如羧酸根離子、酚離子、磺酸根離子(有機硫酸根，例如甲基硫酸根)、釩酸根離子、鎢酸根離子、硼酸根離子、有機硼酸根離子、檸檬酸根離子、草酸根離子、乙酸根離子、五硼酸根離子、組胺酸根離子及酚離子。 存於第一條件及第二條件或正常生理條件及異常條件二者之分析溶液中之有機化合物可選自例如胺基酸，例如組胺酸、丙胺酸、異白胺酸、精胺酸、白胺酸、天冬醯胺、離胺酸、天冬胺酸、甲硫胺酸、半胱胺酸、苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、甘胺酸、纈胺酸、吡咯離胺酸、脯胺酸、硒基半胱胺酸、絲胺酸、酪胺酸及其混合物。 一些胺基酸之正常生理濃度之實例包括：3.97 ±0.70 mg/dL之丙胺酸、2.34±0.62 mg/dL之精胺酸、3.41±1.39 mg/dL之麩胺酸、5.78±1.55 mg/dL之麩醯胺酸、1. 77±0.26 mg/dL之甘胺酸、1.42±0.18 mg/dL之組胺酸、1.60±0.31 mg/dL之異白胺酸、1.91±0.34 mg/dL之白胺酸、2.95±0.42 mg/dL之離胺酸、0.85±0.46 mg/dL之甲硫胺酸、1.38±0.32 mg/dL之苯丙胺酸、2.02±6.45 mg/dL之蘇胺酸、1.08±0.21 mg/dL之色胺酸、1.48±0.37 mg/dL之酪胺酸及2.83±0.34 mg/dL之纈胺酸。 存於第一條件及第二條件或正常生理條件及異常條件二者之分析溶液中之有機化合物可選自非蛋白質含氮化合物，例如肌酸、肌酸酐、胍基乙酸、尿酸、尿囊素、腺苷、尿素、氨及膽鹼。一些該等化合物之正常生理濃度之實例包括： 1.07 ±0.76 mg/dL之肌酸、0.9至1.65 mg/dL之肌酸酐、0.26±0.24 mg/dL之胍基乙酸、4.0±2.9 mg/dL之尿酸、0.3至0.6 mg/dL之尿囊素、1.09±0.385 mg/dL之腺苷、27.1±4.5 mg/dL之尿素及0.3至1.5 mg/dL之膽鹼。 存於第一條件及第二條件或正常生理條件及異常條件二者之分析溶液中之有機化合物可選自有機酸，例如檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、乙醯乙酸、β-羥基丁酸、乳酸、丙酮酸、α-酮酸、乙酸及揮發性脂肪酸。一些該等有機酸之正常生理濃度之實例包括： 2.5±1.9 mg/dL之檸檬酸、0.8 mg/dL之α-酮戊二酸、0.5 mg/dL之琥珀酸、0.46±0.24 mg/dL之蘋果酸、0.8至2.8 mg/dL之乙醯乙酸、0.5±0.3 mg/dL之β-羥基丁酸、8至17 mg/dL之乳酸、1.0±0.77 mg/dL之丙酮酸、0.6至2.1 mg/dL之a-酮酸、1.8 mg/dL之揮發性脂肪酸。 存於第一條件及第二條件或正常生理條件及異常條件二者之分析溶液中之有機化合物可選自糖(碳水化合物)，例如葡萄糖、戊醣、己糖、木糖、核糖、甘露糖及半乳糖，以及二醣，包括乳糖、GlcNAcβ1-3Gal、Galα1-4Gal、Manα1-2Man、GalNAcβ1-3Gal及O-、N-、C-或S-醣苷。一些該等糖之正常生理濃度之實例包括： 83±4 mg/dL之葡萄糖、102±73 mg/dL之多醣(以己糖計)、77±63 mg/dL之葡糖胺、0.4至1.4 mg/dL之己糖醛酸酯(以葡糖醛酸計)及2.55±0.37 mg/dL之戊醣。 存於第一條件及第二條件或正常生理條件及異常條件二者之分析溶液中之有機化合物可選自脂肪或其衍生物，例如膽固醇、卵磷脂、腦磷脂、鞘磷脂及膽汁酸。一些該等化合物之正常生理濃度之實例包括： 40至70 mg/dL之游離膽固醇、100至200 mg/dL之卵磷脂、0至30 mg/dL之腦磷脂、10至30 mg/dL之鞘磷脂及0.02至0.3 mg/dL之膽汁酸(以膽酸計)。 存於第一條件及第二條件或正常生理條件及異常條件二者之分析溶液中之有機化合物可選自蛋白質，例如纖維蛋白原、抗血友病球蛋白、免疫γ-球蛋白、免疫優球蛋白、同族凝集素、β-假球蛋白、醣蛋白、脂蛋白及白蛋白。舉例而言，哺乳動物血清白蛋白之正常生理濃度為3.5-5.0 g/dL。在一個實施例中，白蛋白係牛血清白蛋白。 在一些態樣中，分析溶液可包括血液蛋白質，例如彼等發現於個體血液中者。熟習此項技術者可自血樣確定特定個體中之適宜血液蛋白質。舉例而言，適宜人類血液蛋白質可包括白蛋白及血紅素。 存於第一條件及第二條件或正常生理條件及異常條件二者之分析溶液中之有機化合物可選自維生素，例如維生素A、胡蘿蔔素、維生素E、抗壞血酸、硫胺素、肌醇、葉酸、生物素、泛酸、核黃素。一些該等維生素之正常生理濃度之實例包括： 0.019至0.036 mg/dL之維生素A、0.90至1.59 mg/dL之維生素E、0.42至0.76 mg/dL之肌醇、0.00162至0.00195 mg/dL之葉酸及0.00095至0.00166 mg/dL之生物素。 無機化合物、離子或有機分子在分析溶液中之濃度(對於在第一條件及第二條件或正常生理條件及異常條件下之兩種分析)可在無機化合物、離子或有機分子在人類或動物血清中之正常生理濃度範圍內。然而，亦可使用在正常生理範圍以外之濃度。舉例而言，人類血清中鎂離子之正常範圍係1.7-2.2 mg/dL，且鈣係8.5至10.2 mg/dL。鎂離子在分析溶液中之濃度可為約0.17 mg/dL至約11 mg/dL。鈣離子在分析溶液中之濃度可為約0.85 mg/dL至約51 mg/dL。一般而言，無機化合物、離子或有機分子在分析溶液中之濃度可低至無機化合物、離子或有機分子在人類血清中之正常生理濃度之5%、或10%、或20%、或30%、或40%、或50%、或60%、或70%、或80%，或高至無機化合物、離子或有機分子在人類血清中之正常生理濃度之1.5倍、或2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或7倍、或9倍、或10倍、或甚至20倍。分析溶液之不同組分可以相對於其各別正常生理濃度之不同濃度值使用。 使用在第一條件及第二條件或正常生理條件及異常條件下之分析來量測突變體多肽之活性。在分析期間，突變體多肽及其結合配偶體二者存在於分析溶液中。突變體多肽及其結合配偶體之間之關係可為例如抗體-抗原、配體-受體、酶-受質或激素-受體。為使突變體多肽表現其活性，突變體多肽應能接觸並結合至其結合配偶體。隨後在突變體多肽與其結合配偶體之間結合後表現並量測突變體多肽對其結合配偶體之活性。 在一些實施例中，分析中所用離子可作用於在所篩選突變體多肽與其結合配偶體、尤其包括帶電荷胺基酸殘基之彼等之間形成橋。離子可因此能結合至突變體多肽及其結合配偶體二者經由氫鍵及/或離子鍵。此可藉由容許離子到達大分子(突變體多肽或其結合配偶體)可難以到達之位點來幫助突變體多肽與其結合配偶體之間之結合。在一些情形中，分析溶液中之離子可增加突變體多肽及其結合配偶體彼此結合之機率。此外，離子可另外或替代地藉由結合至較大分子(突變體多肽或其結合配偶體)來幫助突變體多肽與其結合配偶體之間之結合。此結合可改變大分子之構形及/或引起較大分子保留有助於與其結合配偶體之結合之特定構形。 已觀察到，離子可能藉由與突變體多肽及其結合配偶體形成離子鍵來幫助突變體多肽與其結合配偶體之間之結合。因此，與不使用離子之相同分析相比，篩選可顯著更有效且可鑑別更多命中(候選條件性活性多肽)。適宜離子可選自鎂離子、硫酸根離子、硫酸氫根離子、碳酸根離子、檸檬酸根離子、HAPT離子、HADP離子、碳酸氫根離子、硝酸根離子、亞硝酸根離子、磷酸根離子、磷酸氫根離子、磷酸二氫根離子、過硫酸根離子、單過硫酸根離子離子、硼酸根離子、乳酸根離子、檸檬酸根離子、組胺酸根離子、組織胺離子及銨離子。 已發現，離子發揮功能以幫助在接近離子pKa之pH下突變體多肽與其結合配偶體之間之結合。該等離子較佳相對於突變體多肽之大小相對較小。 在一個實施例中，在異常條件係與正常生理條件下之正常生理pH不同之pH時，適於增加候選條件性活性多肽之命中數之離子可選自pKa接近欲在分析中測試之異常pH之離子。舉例而言，離子pKa可為遠離異常pH多達3 pH單位、遠離異常pH多達2 pH單位、遠離異常pH多達1 pH單位、遠離異常pH多達0.8 pH單位、遠離異常pH多達0.6 pH單位、遠離異常pH多達0.5 pH單位、遠離異常pH多達0.4 pH單位、遠離異常pH多達0.3 pH單位、遠離異常pH多達0.2 pH單位或遠離異常pH多達0.1 pH單位。 可用於本發明中之離子(其pKa在不同溫度下可略有變化)之實例性pKa如下：銨離子之pKa為約9.24、磷酸二氫鹽之pKa為約7.2、乙酸之pKa為約4.76、組胺酸之pKa為約6.04、碳酸氫根離子之pKa為約6.4、檸檬酸鹽之pKa為6.4、乳酸根離子之pKa為約3.86、組織胺之pKa為約6.9、HATP之pKa為6.95 (HATP3- ó ATP4- + H+ )及HADP之pKa為6.88 (HADP3- ó ADP4- + H+ )。 在一個實施例中，在二硫化物存在下分析並選擇條件性活性多肽。二硫化物之pKa為7.05。在一些實施例中，可在分析中使用不同濃度之二硫化物代表正常及異常生理條件。或者，正常生理條件及異常條件二者之分析介質具有大致相等之二硫化物濃度以及特定條件之值的一定差異，例如，分析可在不同pH下實施。欲在分析中使用之二硫化物之濃度可為1 mM至100 mM。較佳地，分析介質具有2至50 mM、或3至35 mM、或5至20 mM之二硫化物濃度。已知在二硫化物存在下實施之分析。 在某些實施例中，在得知異常條件之pH (即，異常pH) 後，適於增加候選條件性活性多肽之命中之離子可選自pKa為或接近異常pH之離子，例如，候選離子之pKa可遠離異常pH多達3 pH單位、遠離異常pH多達2 pH單位、遠離異常pH多達1 pH單位、遠離異常pH多達0.8 pH單位、遠離異常pH多達0.6 pH單位、遠離異常pH多達0.5 pH單位、遠離異常pH多達0.4 pH單位、遠離異常pH多達0.3 pH單位、遠離異常pH多達0.2 pH單位或遠離異常pH多達0.1 pH單位。 如上所述，在為或接近離子pKa之pH下，離子幫助突變體多肽與其結合配偶體之間之結合最有效。舉例而言，已發現，在pH 7.2-7.6之分析溶液中，碳酸氫根離子(pKa為約6.4)幫助突變體多肽與其結合配偶體之間之結合並非十分有效。在分析溶液中之pH下降至6.7且進一步下降至約6.0時，碳酸氫根離子在幫助突變體多肽與其結合配偶體之間之結合中逐漸變得有效。因此，與pH 7.2-7.6下之分析相比，可在pH 6.0下之分析中鑑別更多命中。類似地，在pH 7.4下組胺酸在幫助突變體多肽與其結合配偶體之間之結合中並非十分有效。在分析溶液之pH下降至6.7且進一步下降至約6.0時，組胺酸在幫助突變體多肽與其結合配偶體之間之結合中逐漸變得有效，在例如約6.2-6.4範圍內之pH下亦容許鑑別更多命中。 本發明令人驚訝地發現，在正常生理條件下(即，正常生理pH)及異常條件下(即，異常pH)之分析溶液之pH不同時，pKa在約正常生理pH與異常pH之中點至約異常pH之範圍內之離子可顯著幫助所篩選突變體多肽與其結合配偶體之間之結合。因此，篩選分析顯著更有效地發現在異常條件下具有高活性之更多命中或候選條件性多肽。 在一些實施例中，pKa甚至可為遠離異常pH至少1 pH單位。在異常pH係酸性pH時，適宜離子之pKa可在(異常pH -1)至異常pH與正常生理pH之間之中點之範圍內。在異常pH係鹼性pH時，適宜離子之pKa可在(異常pH+1)至異常pH與正常生理pH之間之中點之範圍內。離子可選自本申請中所述之彼等。然而，亦可使用本申請中未明確闡述之多種其他離子。應理解，在選擇篩選分析之異常pH及正常生理pH後，熟習此項技術者可使用本發明之指導原則選擇任何具有適宜pKa之離子，其pKa適於增加篩選效率以鑑別更多在異常條件下具有高活性之命中。 舉例而言，在實例性篩選之異常pH為8.4且正常生理pH為7.4時，可在篩選中使用任何pKa在約7.9 (中點)至9.4 (即，8.4+1)範圍內之離子。一些pKa在此範圍內之離子包括源自以下之離子：三(羥甲基)甲基甘胺酸(pKa 8.05)、肼(pKa 8.1)、二羥乙甘胺酸(pKa 8.26)、N-(2-羥基乙基)六氫吡嗪-N′-(4-丁磺酸) (pKa 8.3)、N-參[羥基甲基]甲基-3-胺基丙烷磺酸(pKa 8.4)、牛磺酸(pKa 9.06)。對於另一實例，在實例性篩選之異常pH為6且正常生理pH為7.4時，可在篩選中使用任何pKa在約5 (即，6-1)至6.7 (中點)範圍內之離子。一些pKa在此範圍內之離子包括源自以下之離子：蘋果酸鹽(pKa 5.13)、吡啶(pKa 5.23)、六氫吡嗪(pKa 5.33)、二甲基胂酸鹽(pKa 6.27)、琥珀酸鹽(pKa 5.64)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(pKa 6.10)、檸檬酸鹽(pKa 6.4)、組胺酸(pKa 6.04)及bis-tris (6.46)。熟習此項技術者將能查閱大量化學手冊及教科書以鑑別可轉化為pKa落在該等範圍內之離子之已知化學化合物，包括無機化學化合物及有機化學化合物二者。在具有適宜pKa之化學化合物之間，分子量較小者可較佳。 因此，本發明意外地發現，最終鑑別之條件性活性多肽之產生不僅依賴於自野生型多肽產生正確多肽突變體，且亦依賴於在分析溶液中使用具有適宜pKa之離子。本發明涵蓋，除了產生突變體多肽之大型庫(例如，經由CPE及CPS)以外，亦應努力尋找用於分析溶液中之適宜離子(具有適當pKa)，此乃因該離子可促進自該大型庫有效選擇具有高活性之突變體。另外涵蓋，在無適宜離子之情況下，篩選較不有效且發現具有高活性之突變體之機率減小。因此，在無適宜離子之情況下，可能需要多輪篩選才可獲得相同數目之具有高活性之突變體。 分析溶液中之離子可自分析溶液之組分原位形成，或直接包括於分析溶液中。舉例而言，可將空氣中之CO2 溶解於分析溶液中以提供碳酸根離子及碳酸氫根離子。對於另一實例，可將磷酸二氫鈉添加至分析溶液以提供磷酸二氫根離子。 此組分在分析溶液(對於在第一或正常生理條件下之分析及在第二或異常條件下之分析二者)中之濃度可與通常發現於哺乳動物(例如人類)之天然體液中之相同組分之濃度相同或實質上相同。在其他實施例中，尤其在組分係可作用以幫助突變體多肽與其結合配偶體之間之結合之離子時，組分濃度可較高，此乃因已觀察到，較高濃度之該離子可與突變體多肽及其結合配偶體形成離子鍵，實際上促進結合並增加發現更多命中或候選條件性活性多肽之機率。 在一些實施例中，尤其在採用超過正常生理濃度之濃度時，離子在分析溶液中之濃度可與使用分析發現更多命中之機率正相關。舉例而言，人類血清具有約15-30 mM濃度之碳酸氫根離子。在一實例中，在碳酸氫根離子於分析溶液中之濃度自3 mM增加至10 mM、至20 mM、至30 mM、至50 mM及至100 mM時，分析中之命中數亦隨著碳酸氫鹽濃度之每次增加而增加。鑒於此，分析溶液可採用介於以下範圍內之碳酸氫鹽濃度：約3 mM至約200 mM、或約5 mM至約150 mM、或約5 mM至約100 mM、或約10 mM至約100 mM、或約20 mM至約100 mM、或約25 mM至約100 mM、或約30 mM至約100 mM、或約35 mM至約100 mM、或約40 mM至約100 mM、或約50 mM至約100 mM。 在另一實施例中，檸檬酸鹽在分析溶液中之濃度可為約30 μM至約120 μM、或約40 μM至約110 μM、或約50 μM至約110 μM、或約60 μM至約100 μM、或約70 μM至約90 μM、或約80 μM。 在一個實施例中，正常生理條件係在7.2-7.6範圍內之正常生理pH且異常條件係在5.5-7.2、6-7或6.2-6.8範圍內之異常pH。用於正常生理條件下之分析之分析溶液具有正常生理pH及50 mM碳酸氫根離子。用於異常條件下之分析之分析溶液具有異常pH及50 mM碳酸氫根離子。由於碳酸氫根離子之pKa為約6.4，碳酸氫根離子可在6.0-6.4之異常pH (例如pH 6.0或6.2)下幫助突變體多肽與其結合配偶體之間之結合。 在另一實施例中，正常生理條件係在7.2-7.6範圍內之正常生理pH且異常條件係在5.5-7.2、6-7或6.2-6.8範圍內之異常pH。用於正常生理條件下之分析之分析溶液具有正常生理pH及80 μM檸檬酸根離子。用於異常條件下之分析之分析溶液具有異常pH及80 μM檸檬酸根離子。由於檸檬酸根離子之pKa為6.4，檸檬酸根離子可在具有pH 6.0-6.4異常條件之分析溶液中有效幫助突變體多肽與結合配偶體之間之結合。因此，可鑑別更多在pH 6.0-6.4條件下具有較高結合活性且在pH 7.2-7.8條件下具有較低活性之候選條件性活性多肽。其他離子(包括乙酸根、組胺酸、碳酸氫根、HATP及HADP)以類似方式發揮功能，使得含有該離子之分析溶液能有效篩選在約為離子pKa之pH下具有較高結合活性且在不同於離子pKa之pH (例如，正常生理pH)下具有較低結合活性之突變體多肽。 在另一實施例中，正常生理條件係37℃之正常生理溫度且異常條件係38-39℃之異常溫度(一些腫瘤微環境中之溫度)。用於正常生理條件下之分析之分析溶液具有正常生理溫度及20 mM碳酸氫根離子。用於異常條件下之分析之分析溶液具有異常溫度及20 mM碳酸氫根離子。 在另一實施例中，正常生理條件係正常人類血清中之特定電解質濃度，且異常條件係不同的異常濃度之相同電解質之濃度，其可存於動物或人類之不同位置或可源自動物或人類之改變人類血清中電解質正常生理濃度之病況。 亦可以多種其他方式影響突變體多肽及/或其結合配偶體之間之結合。通常，此影響將藉由在分析溶液中包括一或多種額外組分來施加。該等額外組分可經設計與突變體多肽、結合配偶體或二者相互作用。另外，該等額外組分可使用兩種或更多種相互作用之組合以及兩種或更多種類型之相互作用之組合來影響結合。 在一個實施例中，所關注結合相互作用係介於抗體與抗原之間。在此實施例中，一或多種額外組分可包括於分析溶液中以對抗體、抗原或二者施加影響。以此方式，可增強期望結合相互作用。 除了可與突變體多肽及/或其結合配偶體形成離子鍵以幫助突變體多肽與結合配偶體之間之結合之離子以外，本發明亦包括其他組分可用於幫助突變體多肽與其結合配偶體之間之結合。在一個實施例中，採用可與突變體多肽及/或其結合配偶體形成氫鍵之分子。在另一實施例中，可使用能與突變體多肽及/或其結合配偶體疏水相互作用之分子。在另一實施例中，涵蓋能與突變體多肽及/或其結合配偶體凡得瓦相互作用之分子。 如本文所用術語「氫鍵」係指共價鍵結至電負性原子(例如碳、氮、氧、硫、氯或氟(氫鍵供體))之氫與電子供體原子(例如氮、氧、硫、氯或氟(氫鍵接受體))之非共有電子對之間相對較弱之非共價相互作用。 能與突變體多肽及/或其結合配偶體形成氫鍵之組分包括有機分子以及具有極性鍵之無機分子。突變體多肽及/或突變體多肽之結合配偶體通常含有可形成氫鍵之胺基酸。適宜胺基酸之側鏈具有能形成氫鍵之極性基團。適宜胺基酸之非限制性實例包括麩醯胺酸(Gln)、麩胺酸(Glu)、精胺酸(Arg) 天冬醯胺(Asn)、天冬胺酸(Asp)、離胺酸(Lys)、組胺酸(His)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、酪胺酸(Tyr)、半胱胺酸(Cys)、甲硫胺酸(Met)及色胺酸(Trp)。 該等胺基酸可用作氫供體及氫接受體二者。舉例而言，例如可發現於Ser、Thr及Tyr中之-OH基團中之氧原子，例如可發現於Glu及Asp中之-C=O基團中之氧原子，例如可發現於Cys及Met中之-SH基團或-SC-中之硫原子，例如可發現於Lys及Arg中之-NH3 + 基團中之氮原子，及例如可發現於Trp、His及Arg中之-NH-基團中之氮原子皆可用作氫接受體。同樣，此列表中包括氫原子之基團(例如-OH、-SH、NH3 + 及-NH-)可用作氫供體。 在一些實施例中，突變體多肽及/或其結合配偶體之主鏈亦可參與形成一或多個氫鍵。舉例而言，主鏈可具有-(C=O) -NH-之重複結構，例如在肽鍵中。此結構中之氧及氮原子可用作氫接受體，而氫原子可參與氫鍵。 具有至少一個包括可用於氫鍵結之氫或氧原子之極性鍵之無機化合物可包括例如H2 O、NH3 、H2 O2 、肼、碳酸鹽、硫酸鹽及磷酸鹽。有機化合物，例如醇；酚；硫醇；脂肪族、胺、醯胺；環氧化物、羧酸；酮、醛、醚、酯、有機氯化物及有機氟化物。可形成氫鍵之化合物為化學文獻中所熟知，例如彼等論述於例如以下文獻中者：「The Nature of the Chemical Bond」，Linus Pauling, Cornell University Press, 1940，第284至334頁。 在一些實施例中，醇可包括甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、戊醇、1-己醇、2-辛醇、1-癸醇、環己醇及更高級醇；二醇，例如乙二醇、丙二醇、甘油、二乙二醇及聚伸烷基二醇。適宜酚包括氫醌、間苯二酚、兒茶酚、酚、鄰甲酚、間甲酚及對甲酚、瑞香草酚(thymol)、α-萘酚及β-萘酚、五倍子酚、愈創木酚及間苯三酚。適宜硫醇包括甲烷硫醇、乙烷硫醇、1-丙烷硫醇、2-丙烷硫醇、丁烷硫醇、第三丁基硫醇、戊烷硫醇、己烷硫醇、苯硫酚、二巰基琥珀酸、2-巰基乙醇及2-巰基吲哚。適宜胺包括甲胺、乙胺、丙胺、異丙胺、苯胺、二甲胺及甲基乙胺、三甲胺、氮丙啶、六氫吡啶、N-甲基六氫吡啶、聯苯胺、環己胺、乙二胺、六亞甲基二胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺及對甲苯胺及N-苯基六氫吡啶。適宜醯胺包括乙醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基甲氧基乙醯胺及N-甲基-N-對氰基乙基甲醯胺。環氧化物可包括環氧乙烷、環氧丙烷、第三丁基氫過氧化物、氧化苯乙烯、縮水甘油環氧化物、氧化環己烯、二-第三丁基過氧化物、異丙苯氫過氧化物或乙基苯氫過氧化物、氧化異丁烯及1,2-環氧辛烷。羧酸可包括對苯二甲酸、間苯二甲酸、苯二甲酸、柳酸、苯甲酸、乙酸、月桂酸、己二酸、乳酸、檸檬酸、丙烯酸、甘胺酸、六氫苯甲酸、鄰甲基苯甲酸、間甲基苯甲酸及對甲基苯甲酸、菸鹼酸、異菸鹼酸及對胺基苯甲酸。酮可包括丙酮、3-丙酮、丁酮、戊酮、甲基乙基酮、二異丁基酮、乙基丁基酮、甲基異丁基酮、甲基第三丁基酮、環己酮、丙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、甲基丁基酮、甲基戊基酮、甲基己基酮、二乙酮、乙基丁基酮、二丙基酮、二異丁基酮、二丙酮醇、佛爾酮、異佛爾酮、環己酮、甲基環己酮及苯乙酮。醛可包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、苯甲醛、桂皮醛、異丁醛、戊醛、辛醛、苯甲醛、桂皮醛、環己酮、柳基醛及糠醛。酯包括乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸丁酯、甲酸戊酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙酸甲基異戊酯、乙酸甲氧基丁酯、乙酸己酯、乙酸環己基酯、乙酸苄基酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯、丙酸戊酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯、丁酸戊酯、乙醯乙酸甲酯及乙醯乙酸乙酯。可用於本發明中之醚包括二甲醚、甲基乙基醚、二乙醚、甲基丙基醚及二甲氧基乙烷。醚可為環狀，例如環氧乙烷、四氫呋喃及二噁烷。 有機氯化物包括氯仿、五氯乙烷、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、四氯甲烷、四氯乙烷、五氯乙烷、三氯乙烯、四氯乙烯及二氯化乙烯。有機氟化物可包括氟甲烷、二氟甲烷、三氟甲烷、三氟乙烷、四氟乙烷、五氟乙烷、二氟丙烷、三氟丙烷、四氟丙烷、五氟丙烷、六氟丙烷及七氟丙烷。 氫鍵可依照鍵強度來劃分：強、中等或弱氫鍵(Jeffrey、George A.；An introduction to hydrogen bonding, Oxford University Press, 1997)。強氫鍵之供體-接受體距離為2.2-2.5 Å且能量在14-40 kcal/mol範圍內。中等氫鍵之供體-接受體距離為2.5-3.2 Å且能量在4-15 kcal/mol範圍內。弱氫鍵之供體-接受體距離為3.2-4.0 Å且能量在＜ 4 kcal/mol範圍內。具有多個能階之氫鍵之一些實例係：F−H… :F (38.6 kcal/mol)、O−H… :N (6.9 kcal/mol)、O−H… :O (5.0 kcal/mol)、N−H… :N (3.1 kcal/mol)及N−H… :O (1.9 kcal/mol)。更多參見以下文獻：Perrin等人「Strong」 hydrogen bonds in chemistry and biology,Annual Review of Physical Chemistry , 第48卷，第511-544頁, 1997；Guthrie, 「Short strong hydrogen bonds: can they explain enzymic catalysis?」Chemistry & Biology 1996年3月, 3:163-170。 在一些實施例中，本發明中所用組分可與突變體多肽及/或其結合配偶體形成強氫鍵。該等組分往往具有帶有強陰電性之原子。已知具有最強陰電性之原子係F ＞ O ＞ Cl ＞ N，按此順序。因此，本發明較佳在氫鍵形成中使用包括氟、羥基或羰基之有機化合物。在一個實施例中，有機氟可用於本發明中形成強氫鍵。 在另一實施例中，採用能與突變體多肽及/或其結合配偶體疏水相互作用之組分。該等組分包括具有疏水基團之有機化合物。 如本文所用術語「疏水相互作用」係指疏水化合物或化合物之疏水區域與另一疏水化合物或另一化合物之疏水區域之間之可逆吸引性相互作用。此類型之相互作用已闡述於「Hydrophobic Interactions」 A. Ben-Nairn (1980), Plenum Press, New York中。 疏水材料由於其非極性性質而被水分子排斥。在水溶液中之相對非極性分子或基團與其他非極性分子而非與水締合時，稱其為「疏水相互作用」。 突變體多肽及其結合配偶體通常包括能疏水相互作用之胺基酸。該等胺基酸之特徵通常將為具有至少一個具有能疏水相互作用之非極性基團之側鏈。疏水胺基酸包括例如丙胺酸(Ala)、異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)、苯丙胺酸(Phe)、纈胺酸(Val)、脯胺酸(Pro)、甘胺酸(Gly)，程度較低地，甲硫胺酸(Met)及色胺酸(Trp)。 能與突變體多肽及/或其結合配偶體疏水相互作用之組分包括有機化合物，其係疏水分子或含有至少一個疏水部分之分子。在一些實施例中，該等疏水組分可為選自以下之烴：芳香族烴、經取代芳香族烴、聚芳香族烴、芳香族或非芳香族雜環、環烷烴、烷烴、烯烴及炔烴。疏水基團可包括芳香族基團、烷基、環烷基、烯基及炔基。如本文所用術語「烷基」、「烯基」及「炔基」係指具有1至30個碳原子之不飽和脂肪族基團，包括直鏈烯基/炔基、具支鏈烯基/炔基、環烯基(脂環族)基團、烷基取代之環烷基及環烷基取代之烯基/炔基。該等烴部分亦可在一或多個碳原子上經取代。 可理解，疏水相互作用之強度係基於可彼此相互作用之「疏水物」之可用量。因此，疏水相互作用可藉由例如增加分子中參與疏水相互作用之疏水部分之量及/或「疏水」性質來調節。例如，呈其初始形式之疏水部分可包括烴鏈，可藉由將疏水側鏈附接至其碳主鏈之一個碳經修飾以增加其疏水性(增加涉及該部分之疏水相互作用強度之能力)。在本發明之較佳實施例中，此可包括附加多種多環化合物，包括例如多種類固醇化合物及/或其衍生物，例如固醇型化合物，更特定而言膽固醇。一般而言，側鏈可為直鏈、芳香族、脂肪族、環狀、多環或如熟習此項技術者所預期之任何多種其他類型之疏水側鏈。 能與突變體多肽及/或其結合配偶體凡得瓦相互作用之組分類型通常為但不總為具有極性部分之化合物。如本文所用「凡得瓦相互作用」係指原子、部分、分子及表面之間之吸引，其係由鄰近原子、部分或分子由於量子動力學所致之偶極-偶極相互作用及/或波動式極化中之關聯而引起。 本發明之凡得瓦相互作用係突變體多肽或結合配偶體與組分之間之吸引力。凡得瓦相互作用可自三個來源產生。第一，一些分子/部分儘管係電中性，但仍可係永久電偶極。由於一些分子/部分結構中電子電荷分佈中之固定失真，分子/部分之一側始終略呈正性且相對側略呈負性。該等永久偶極彼此對準之傾向產生淨吸引力。此係兩個永久偶極之間之相互作用(Keesom力)。 第二，係永久偶極之分子之存在可使其他鄰近極性或非極性分子中之電子電荷暫時失真，由此誘導進一步極化。另一吸引力源自永久偶極與相鄰感應偶極之相互作用。此係永久偶極與相應感應偶極之間之相互作用，可稱為Debye力。第三，即使所涉及分子皆非永久偶極(例如，有機液體苯)，在分子中具有兩個瞬時感應偶極之分子之間亦存在吸引力。此係兩個瞬時感應偶極之間之相互作用，可稱為London分散力。 突變體多肽及/或結合配偶體中有多個胺基酸能凡得瓦相互作用。該等胺基酸可具有極性側鏈，包括麩醯胺酸(Gln)、天冬醯胺(Asn)、組胺酸(His)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、酪胺酸(Tyr)、半胱胺酸(Cys)、甲硫胺酸(Met)、色胺酸(Trp)。該等胺基酸亦可具有帶有非極性基團之側鏈，包括丙胺酸(Ala)、異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)、苯丙胺酸(Phe)、纈胺酸(Val)、脯胺酸(Pro)、甘胺酸(Gly)。 能與突變體多肽及/或其結合配偶體凡得瓦相互作用之組分包括可溶於分析溶液中之極性或非極性無機化合物。分析溶液通常係水溶液且因此該等極性或非極性無機化合物較佳可溶於水。凡得瓦相互作用之較佳材料係彼等極性材料，使得其能偶極-偶極相互作用。例如，AlF3 具有極性Al-F鍵且可溶於水(約0.67 g/100 ml水，在20℃下)。HgCl2 具有極性Hg-Cl鍵且可在20℃下以7.4 g/100 ml溶於水中。PrCl2 具有極性Pr-Cl鍵且可在20℃下以約1 g/100 ml溶於水中。 能凡得瓦相互作用之適宜極性化合物包括醇、硫醇、酮、胺、醯胺、酯、醚及醛。該等化合物之適宜實例已關於氫鍵結闡述於上文中。能凡得瓦相互作用之適宜非極性化合物包括芳香族烴、經取代芳香族烴、聚芳香族烴、芳香族或非芳香族雜環、環烷烴、烷烴、烯烴、炔烴。 氫鍵結組分、疏水組分及凡得瓦組分可用於以多種方式影響突變體多肽與其結合配偶體之結合。在一個實施例中，氫鍵結、疏水相互作用及/或凡得瓦相互作用可在突變體多肽與其結合配偶體之間形成橋。此一橋可使突變體多肽及結合配偶體彼此更接近地靠近，從而以促進結合之方式促進突變體多肽及/或結合配偶體相對於彼此之結合及/或定位。 在另一實施例中，氫鍵結及/或疏水相互作用可藉由例如以增加結合機率之方式引起多肽及結合配偶體彼此聚集或締合來增加突變體多肽結合至其結合配偶體之機率。因此，可單獨或組合使用該等相互作用中之一或多種，藉由例如將結合位點更接近地拉到一起或使分子之非結合部分進一步彼此遠離地佈置，由此使結合位點之位置可彼此更接近，將突變體多肽及結合配偶體更接近地聚集在一起或以促進結合之方式佈置突變體多肽及結合配偶體。 在另一實施例中，氫鍵結及/或疏水相互作用可影響突變體多肽及/或其結合配偶體之構形，以提供更有助於突變體多肽與其結合配偶體結合之構形。特定而言，結合至突變體多肽及/或結合配偶體之一或多個胺基酸或與該一或多個胺基酸相互作用可引起突變體多肽或結合配偶體中有利於突變體多肽/結合配偶體結合反應之一或多種構形轉變。 本發明實施兩對分析，一對分析尋求在正常生理條件下分析中，與在該正常生理條件下衍生出突變體多肽之親代多肽相比，降低突變體多肽之活性，且第二分析尋求在異常條件下之分析中，與在該異常條件下衍生出突變體多肽之親代多肽相比，增加突變體多肽之活性。在一些情形中，衍生出突變體多肽之親代多肽係野生型多肽。在其他情形中，親代多肽自身可為突變體多肽，其係使用本文中別處闡述之一或多種突變技術來製備。 用於本發明分析對中之條件可選自溫度、pH、滲透壓、滲透重量莫耳濃度、氧化壓力、電解質濃度及分析溶液或介質中任何其他組分之濃度。因此，分析介質之特定組分可在兩對分析中以實質上相同之濃度來使用。在該情形中，組分通常為模擬人類或動物中之特定環境之目的而存在，該特定環境例如血清、腫瘤微環境、滑液環境、神經環境或在投與時可遇到、所投與治療可經歷或在治療時可遇到之任何其他環境。選擇模擬該等環境之一或多種組分之一個重要態樣在於，其可改良使用分析對實施之選擇過程之結果。舉例而言，模擬特定環境使得可在選擇過程中評估該環境之特定組分對突變體多肽之各種效應。特定環境之組分可例如改變突變體多肽或與該突變體多肽結合，抑制突變體多肽之活性，使突變體多肽不活化等。 在一些實施例中，分析溶液之一或多種組分較佳係小化合物，例如二硫化物、碳酸氫鹽、組胺酸、組織胺、檸檬酸鹽、乳酸鹽及乙酸鹽。在一個實施例中，小分子組分較佳以約100 µm至約100 mM、或更佳約0.5至約50 mM、或約1至約10 mM之濃度存於分析溶液中。 分析溶液中組分之濃度可與相同組分通常發現於哺乳動物(例如人類)之天然體液中之濃度相同或實質上相同。可將此稱為組分在體液中之正常生理濃度。在其他實施例中，分析溶液中特定組分之濃度可小於或大於相同組分通常發現於哺乳動物(例如人類)之天然體液中之濃度。 在另一實施例中，組分可以顯著不同之濃度存於每對分析中。在該情形中，組分之存在、不存在或濃度變為所分析條件，此乃因組分濃度係在正常生理條件下之分析之分析溶液與異常條件下之分析之分析溶液之間區別之條件。因此，可至少部分端視組分濃度，針對活性選擇藉由本發明方法之實施例產生之條件性活性多肽。 在一些實施例中，組分可存於一對分析溶液中，但在另一對分析溶液中完全不存在。舉例而言，可將異常條件下分析溶液中之乳酸鹽濃度設為模擬腫瘤微環境中乳酸鹽濃度之值。乳酸鹽可在正常生理條件下之分析溶液對中不存在。 在一個實施例中，正常生理條件係代表正常生理條件之第一乳酸鹽濃度，且異常條件係代表存在於身體特定位置之異常條件之第二乳酸鹽濃度。 在另一實例中，葡萄糖可在異常條件之分析溶液中不存在，以模擬可發現於腫瘤微環境中之葡萄糖之不存在，同時可在正常生理條件之分析溶液對中將葡萄糖設為模擬血糖濃度之濃度。此特徵可用於將條件性活性多肽以在運輸中無活性或具有最小活性之方式優先遞送至位置或環境，且在其到達存在異常條件之分析溶液中之組分濃度之環境時活化條件性活性多肽。 舉例而言，腫瘤微環境通常具有與人類血清相比較低葡萄糖濃度及較高乳酸鹽濃度二者。在血清中葡萄糖之正常生理濃度在約2.5 mM至約10 mM範圍內。另一方面，在腫瘤微環境中葡萄糖濃度通常極低，在0.05 mM至0.5 mM範圍內。在一個實施例中，在正常生理條件下之分析之分析溶液之葡萄糖濃度在約2.5 mM至約10 mM範圍內，且在異常條件下之分析之分析溶液之葡萄糖濃度在約0.05 mM至約0.5 mM範圍內。由此產生之條件性活性多肽在低葡萄糖環境中(在腫瘤微環境中)之活性高於在較高葡萄糖環境中(在正常組織或血液中)。此條件性活性多肽將在腫瘤微環境中發揮功能，但在血流運輸中具有低活性。 血清中乳酸鹽之正常生理濃度在約1 mM至約2 mM範圍內。另一方面，腫瘤微環境中乳酸鹽濃度通常在10 mM至20 mM範圍內。在一個實施例中，在正常生理條件下之分析之分析溶液之乳酸鹽濃度在約1 mM至約2 mM範圍內，且在異常條件下之分析之分析溶液之乳酸鹽濃度在約10 mM至約20 mM範圍內。由此產生之條件性活性多肽在高乳酸鹽濃度環境中(在腫瘤微環境中)之活性高於在較低乳酸鹽環境中(在正常組織或血液中)。此條件性活性多肽將因此在腫瘤微環境中發揮功能，但在血流運輸中具有低活性。 類似地，已知肌肉酸痛具有與正常相比較高(異常)之乳酸鹽濃度。因此，在尋找將在肌肉酸痛環境中有活性之突變體多肽時，可在較高濃度之乳酸鹽存在下實施異常條件下之分析對以模擬肌肉酸痛環境，而正常生理條件下之分析對可以較低濃度之乳酸鹽或在乳酸鹽不存在下實施。以此方式，可用增加之乳酸鹽濃度針對在肌肉酸痛環境中之增強活性來選擇突變體多肽。此一條件性活性多肽可例如用作消炎劑。 在另一實施例中，可在兩對分析溶液中使用兩種或更多種組分。在此類型之分析中，可使用上述兩種類型之分析之特徵來選擇條件性活性多肽。或者，可使用兩種或更多種組分來增加條件性活性多肽之選擇性。舉例而言，返回至腫瘤微環境，異常條件下之分析對可在具有高乳酸鹽濃度及低葡萄糖濃度二者之分析介質中實施，而正常生理條件下之相應分析對可在具有相對較低乳酸鹽濃度及相對較高葡萄糖濃度二者之分析介質中實施。 本發明涵蓋，選自無機化合物、離子及有機分子之每一組份可單獨或組合用於選擇在一種組分濃度下之活性高於在相同組份之不同濃度下之活性之條件性活性多肽。 依賴於作為正常環境(正常生理條件)與異常環境(異常條件)之間之區別性條件之一或多種代謝物之不同濃度之分析可尤其適於選擇在腫瘤微環境之活性高於在血漿中之活性之條件性活性多肽，此乃因腫瘤微環境通常具有大量與血漿中相同代謝物之濃度相比具有不同濃度之代謝物。 Kinoshita等人(「Absolute Concentrations of Metabolites in Human Brain Tumors UsingIn Vitro Proton Magnetic Resonance Spectroscopy」，NMR IN BIOMEDICINE , 第10卷，第2-12頁，1997)比較正常腦與腦瘤中之代謝物。此小組發現，N-乙醯基天冬胺酸鹽在正常腦中之濃度為5000-6000 μM，但在神經膠母細胞瘤中濃度為僅300-400 μM，在星細胞瘤中濃度為1500-2000 μM，且在分化不良星細胞瘤中濃度為600-1500 μM。此外，肌醇在正常腦中之濃度為1500-2000 μM，但在神經膠母細胞瘤中濃度為2500-4000 μM，在星細胞瘤中濃度為2700-4500 μM，且在分化不良星細胞瘤中濃度為3800-5800 μM。磷醯基乙醇胺在正常腦中之濃度為900-1200 μM，但在神經膠母細胞瘤中濃度為2000-2800 μM，在星細胞瘤中濃度為1170-1370 μM，且在分化不良星細胞瘤中濃度為1500-2500 μM。甘胺酸在正常腦中之濃度為600-1100 μM，但在神經膠母細胞瘤中濃度為4500-5500 μM，在星細胞瘤中濃度為750-1100 μM，且在分化不良星細胞瘤中濃度為1900-3500 μM。丙胺酸在正常腦中之濃度為700-1150 μM，但在神經膠母細胞瘤中濃度為2900-3600 μM，在星細胞瘤中濃度為800-1200 μM，且在分化不良星細胞瘤中濃度為300-700 μM。該等代謝物在血液中亦可具有不同濃度，例如，N-乙醯基天冬胺酸鹽在血液中之濃度為約85000 μM；肌醇在血液中之濃度為約21700 μM；甘胺酸在血液中之濃度為約220-400 μM；丙胺酸在血液中之濃度為約220-300 μM。 因此，該等代謝物(包括至少N-乙醯基天冬胺酸鹽、肌醇、甘胺酸及丙胺酸)可以不同濃度用於分析溶液中以選擇在腦瘤中有活性但在血液或正常腦組織中無活性之條件性活性多肽。舉例而言，具有85000 μM濃度之N-乙醯基天冬胺酸鹽之分析溶液可用於正常生理條件下之分析對，且具有350 μM濃度之N-乙醯基天冬胺酸鹽之分析溶液可用於異常條件下之分析對，以選擇在神經膠母細胞瘤之腫瘤微環境中有活性，但在血液或正常腦組織中無活性或至少較低活性之條件性活性多肽。 Mayers等人(「Elevated circulating branched chain amino acids are an early event in pancreatic adenocarcinoma development」，Nature Medicine , 第20卷，第1193-1198頁, 2014)研究多種不同代謝物(包括具支鏈胺基酸)在胰臟患者之診斷前血漿中之濃度。發現在胰臟腫瘤患者中，有若干種代謝物相對於相同代謝物在無胰臟癌人類之血液中之濃度以不同濃度存於血流中。Mayers等人亦發現，與正常個體相比，胰臟癌患者在其血漿中具有顯著升高之具支鏈胺基酸。以升高濃度存在之具支鏈胺基酸包括異白胺酸、白胺酸及纈胺酸(Mayers等人之表1)。Mayers之圖1中顯示其他代謝物以與正常健康人類相比顯著不同之濃度存於胰臟癌患者之血漿中。該等代謝物包括至少乙醯基甘胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、2-胺基己二酸酯、牛磺去氧膽酸鹽/牛磺鵝去氧膽酸鹽、烏頭酸鹽、異檸檬酸鹽、乳酸鹽、a-甘油磷酸鹽及尿酸鹽。因此，基於某些代謝物以不同濃度存於胰臟癌患者及正常健康患者之血漿中之發現，可預測胰臟癌之腫瘤微環境亦將具有與健康患者之胰臟微環境中可存在之濃度不同之該等代謝物之濃度。 因此，在一個實施例中，一或多種該等代謝物可以接近該等代謝物在健康個體血漿中之濃度(即，代謝物之正常生理濃度)之量用於正常生理條件之分析溶液中。舉例而言，健康個體之血漿中之已知正常生理濃度為約1.60±0.31 mg/dL異白胺酸、約1.91±0.34 mg/dL白胺酸及約2.83±0.34 mg/dL纈胺酸。正常生理條件下之分析溶液可具有在一或多種該等具支鏈胺基酸之該等範圍內之正常生理濃度。異常條件之分析溶液可以較相應具支鏈胺基酸在健康個體中之正常生理濃度高約5倍、或約10倍、或約20倍、或約50倍、或約70倍、或約100倍、或約150倍、或約200倍、或約500倍之濃度具有相同具支鏈胺基酸。此可反映以下事實：可基於Mayers等人之發現預期胰臟腫瘤微環境具有顯著升高濃度之該等具支鏈胺基酸，此乃因在Mayers等人所檢測血漿中發現之該等具支鏈胺基酸之較高濃度源自腫瘤微環境且在血流中稀釋。類似地，即使在癌症患者中特定代謝物之濃度顯著低於在正常個體中之濃度，異常條件下之分析可反映其他代謝物在胰臟癌患者血液中之濃度。以此方式，篩選可模擬實際環境且由此確保選擇在該特定環境中之最高活性突變體。 在一些其他實施例中，正常生理條件之分析溶液可以模擬胰臟癌患者血漿中之濃度之濃度包含一或多種具支鏈胺基酸，以模擬該等患者之實際血漿環境。在該等實施例中，異常條件之分析溶液可以較相應具支鏈胺基酸在胰臟癌患者血漿中之濃度高約2倍、或約3倍、或約4倍、或約5倍、或約7倍、或約8倍、或約10倍、或約15倍、或約20倍、或約50倍之濃度具有相同具支鏈胺基酸，以反映該等較高濃度源於腫瘤微環境且血流中之濃度代表腫瘤微環境之實際濃度之稀釋的事實。類似地，其他代謝物亦可在正常生理條件及異常條件之分析溶液中具有不同濃度，以反映自血流收集之資料預期之實際差異。在一些情況下，可在胰臟患者之血流中注意到特定代謝物之缺乏，在該情形中反映血流中之所量測濃度之濃度可用於正常生理條件之分析中，且甚至更低之濃度可用於異常條件之分析中，以說明該代謝物可能正在腫瘤微環境中消耗之預期。使用該等分析溶液由此選擇之條件性活性多肽在胰臟癌微環境中之活性將高於在胰臟癌患者之血漿中之活性。 在一些實施例中，胰臟癌患者之整個血漿可用於本發明中。舉例而言，在一個實施例中，對胰臟癌患者血漿之一或多種組分之模擬可用於正常生理條件及異常條件下之一或兩種分析之分析溶液中。在實例性實施例中，正常生理條件之分析溶液具有在7.2-7.6範圍內之pH且添加30 wt.%胰臟癌患者血漿，且異常條件之分析溶液具有在6.2-6.8範圍內之pH且添加30 wt.%胰臟癌患者血漿。在此實施例中，存在胰臟癌患者之血漿以達成以下二者：(1) 確保條件性活性多肽在pH 7.2-7.6之血液中不活化，(2) 亦確保即使在發現於胰臟癌患者血液中之此代謝物組合物存在下，條件性活性多肽可由腫瘤微環境中之pH 5.5-7.2、6-7或6.2-6.8活化。此將調整對胰臟癌患者之治療。 在另一實例性實施例中，正常生理條件之分析溶液具有在7.2-7.6範圍內之pH且添加30 wt.%胰臟癌患者血漿，且異常條件之分析溶液具有在5.5-7.2或6.2-6.8範圍內之pH且不添加任何胰臟癌患者血漿。 選自無機化合物、離子及有機分子之相同組分可用於上文所論述若干種類型之分析之每一種中。舉例而言，在乳酸鹽情形中，乳酸鹽可以實質上相同之濃度用於正常生理條件及異常條件二者之分析溶液對中。則正常生理條件及異常條件將在一或多個其他態樣中不同，例如溫度、pH、另一組分之濃度等。在不同實施例中，乳酸鹽可作為正常生理條件與異常條件之間之一種區別性因子用於反映以下事實：乳酸鹽在異常腫瘤微環境中之濃度高於在正常生理條件(非腫瘤微環境)中之濃度。 在一些實施例中，以實質上相同之濃度將兩種或更多種組分添加至正常生理條件及異常條件之兩種分析溶液中。舉例而言，將檸檬酸鹽及牛血清白蛋白(BSA)二者添加至分析溶液中。在兩種分析溶液中，檸檬酸鹽濃度可為約80 μM且BSA濃度可為約10-20%。更特定而言，正常生理條件下之分析對之分析溶液可具有在7.2-7.6範圍內之pH，且檸檬酸鹽之濃度為約80 μM且BSA之濃度為約10-20%。異常條件下之分析對之分析溶液可具有在6.2-6.8範圍內之pH ，且檸檬酸鹽之濃度為約80 μM且BSA之濃度為約10-20%。 在一個實施例中，可以實質上相同之濃度將血清添加至正常生理條件及異常條件之兩種分析溶液中。由於血清具有大量無機化合物、離子、有機分子(包括多肽)，分析溶液將具有多種且大量之以在兩種分析溶液之間實質上相同之濃度存在之選自無機化合物、離子、有機分子之組分。分析溶液可具有5至30 vol.%、或7至25 vol.%、或10至20 vol.%、或10至15 vol.%血清。在一些其他實施例中，正常生理條件及異常條件二者之分析溶液不含血清。血清可為人類血清、牛血清或來自任何其他哺乳動物之血清。在一些其他實施例中，分析溶液不含血清。 正常生理條件及異常條件之分析溶液可具有不同pH。該等分析溶液之pH可經由使用碳酸氫鹽使用緩衝液中之CO2 及O2 含量來調節。 在一些其他實施例中，以不同濃度將兩種或更多種組分中之至少一種添加至正常生理條件及異常條件之分析溶液。舉例而言，將乳酸鹽及牛血清白蛋白(BSA)二者添加至分析溶液中。在正常生理條件及異常條件之分析溶液之間乳酸鹽濃度可不同，而BSA可在兩種分析溶液中具有相同濃度。乳酸鹽在異常條件之分析溶液中之濃度可在30至50 mg/dL範圍內，且在正常生理條件之分析溶液中之濃度在8-15 mg/dL範圍內。另一方面，BSA在兩種分析溶液中具有相同濃度，例如約10-20%。由此使用該等分析溶液選擇之條件性活性多肽在30-50 mg/dL之高乳酸鹽濃度下之活性高於在BSA存在下8-15 mg/dL之低乳酸鹽濃度下之活性。 在一些實施例中，分析溶液可經設計用於選擇活性取決於兩個或更多個條件之條件性活性多肽。在一個實例性實施例中，條件性活性多肽之活性可取決於pH及乳酸鹽二者。用於選擇此一條件性活性多肽之分析溶液可為正常生理條件之分析溶液，其pH為7.2-7.6，乳酸鹽濃度在8至15 mg/dL範圍內。異常條件之分析溶液之pH可為6.2-6.8，乳酸鹽濃度在30至50 mg/dL範圍內。視情況，正常生理條件及異常條件二者之分析溶液可亦包含離子以幫助突變體多肽與其結合配偶體之間之結合，由此增加候選生物活性多肽之命中數。 在另一實例性實施例中，條件性活性多肽之活性可取決於pH、葡萄糖及乳酸鹽。用於選擇此一條件性活性多肽之分析溶液可為正常生理條件之分析溶液，其pH為7.2-7.6，葡萄糖濃度在2.5-10 mM範圍內，乳酸鹽濃度在8至15 mg/dL範圍內。異常條件之分析溶液之pH可為6.2-6.8，葡萄糖濃度在0.05至0.5 mM範圍內，乳酸鹽濃度在30至50 mg/dL範圍內。視情況，正常生理條件及異常條件二者之分析溶液亦可包含離子以幫助突變體多肽與其結合配偶體之間之結合，由此增加在pH 6.2-6.8下結合至結合配偶體之候選生物活性多肽之數目。使用該等分析溶液所選擇條件性活性多肽在pH 6.2-6.8、0.05至0.5 mM葡萄糖濃度及30至50 mg/dL乳酸鹽濃度之環境中之活性高於在pH 7.2-7.6、2.5-10 mM葡萄糖濃度及8至15 mg/dL乳酸鹽濃度之環境中之活性。 兩種或更多種選自無機化合物、離子及有機分子之組分用於製備模擬欲將所選條件性活性多肽遞送至其之位置/位點(即，所靶向位點)之環境之異常條件之分析溶液。在一些實施例中，可將至少三種存於所靶向位點之環境中之組分添加至分析溶液，或可將至少四種存於所靶向位點之環境中之組分添加至分析溶液，或可將至少五種存於所靶向位點之環境中之組分添加至分析溶液，或可將至少六種存於所靶向位點之環境中之組分添加至分析溶液。 在一個實施例中，自所靶向位點(其中條件性活性多肽之活性將更強)回收之流體可直接用作異常條件下之分析之分析溶液。舉例而言，可自個體、較佳自患有關節疾病需要治療之個體回收滑液。視情況經稀釋之所回收滑液可在異常條件下之分析對中用作分析溶液用於選擇條件性活性多肽。藉由使用視情況經稀釋之所回收滑液作為異常條件下之分析之分析溶液及正常生理條件下之分析之模擬人類血漿之分析溶液，所選條件性活性多肽(例如，TNF-α)在關節之活性將高於在其他位置或器官之活性。舉例而言，患有發炎關節(例如關節炎)之個體可經TNF-α治療。然而，TNF-α 通常具有損害其他組織及器官之嚴重副作用。在滑液中活性較高但在血液中無活性或活性較低之條件性活性TNF-α將TNF-α之活性遞送至關節，同時減小或潛在地消除TNF-α對身體其餘部分之副作用。 具有依賴於多種條件之活性之條件性活性多肽之研發將改良條件性活性多肽對個體體內靶位點之選擇性。理想地，在僅存在該等條件中之一些之其他位置，條件性活性多肽無活性或至少活性顯著較低。在一個實施例中，在pH 6.2-6.8、0.05至0.5 mM葡萄糖濃度及30至50 mg/dL乳酸鹽濃度下有活性之條件性活性多肽可特異性遞送至腫瘤微環境，此乃因該等條件在腫瘤微環境中皆存在。其他組織或器官可存在該等條件中之一者或二者，但不存在所有三個該等條件，因此在其他組織或器官中不足以完全活化條件性活性多肽。舉例而言，經鍛煉肌肉可具有在6.2-6.8範圍內之低pH。然而，其可不具有另一所分析條件。因此，條件性活性多肽在經鍛煉肌肉中無活性或至少活性較低。 在一些實施例中，可進行多個步驟確認，條件性活性多肽之活性確實依賴於用於選擇條件性活性多肽之條件。舉例而言，條件性活性多肽經選擇依賴於三個條件：pH 6.2-6.8、0.05至0.5 mM之葡萄糖濃度及30至50 mg/dL之乳酸鹽濃度。則可在該三個條件之每一個條件下個別地測試且在具有該三個條件中之成對條件之環境中測試所選擇條件性活性多肽，以確認條件性活性多肽在該等測試條件或環境中無活性或活性較低。 在一些實施例中，有意地自分析介質最小化或省略血清中之某些組分。舉例而言，在篩選抗體時，可在分析介質中最小化或自其省略血清中與抗體結合或吸附抗體之組分。該等經結合抗體可得出偽陽性，由此包括並非條件性活性而在多種不同條件下僅結合至存於血清中之組分之經結合突變體抗體。因此，可藉由謹慎選擇分析組分以最小化或省略分析中與突變體潛在結合之組分，從而減小由於結合至分析中除所期望結合配偶體以外之組分而可能針對條件性活性被不經意鑑別為陽性之非功能性突變體之數目。舉例而言，在一些篩選具有與人類血清中之組分鍵結之傾向之突變體多肽之實施例中，分析溶液中可使用BSA以減小或消除由鍵結至人類血清之組分之突變體多肽引起偽陽性之可能性。在特定情形中亦可進行類似替代以達成相同目標。 在一些實施例中，分析條件模擬細胞膜附近(例如在細胞膜內部、在細胞膜處或在細胞膜外部)之環境或關節中之環境。當在細胞膜環境中篩選時，一些因素可影響結合活性，包括受體之表現、內化、抗體藥物複合物(ADC)功效等。 分析模式可為熟習此項技術者已知之任何適宜分析。實例包括ELISA、酶活性分析、活體外真實組織篩選(器官等)、組織載片、完整動物、細胞系及使用3D系統。舉例而言，適宜的基於細胞之分析闡述於WO 2013/040445中，基於組織之分析闡述於US 7,993,271中，基於完整動物之篩選方法闡述於US 2010/0263599中，基於3D系統之篩選方法闡述於US 2011/0143960中。 在一些實施例中，演化步驟可產生除了上文所論述之條件性活性特徵以外同時具有其他期望性質之突變體多肽。可演化之適宜的其他期望性質可包括結合活性、表現、人類化等。因此，本發明可用於產生至少一或多個該等其他期望性質亦經改良之條件性活性多肽。選擇步驟可用於選擇突變體多肽之條件性活性及一或多種其他期望性質二者。 在一些實施例中，本發明產生條件性活性多肽。可在例如第二演化步驟中使用本文所揭示之一種誘變技術使所選擇條件性活性多肽進一步突變，以改良所選擇條件性活性多肽之另一性質，例如結合活性、表現、人類化等。在第二演化步驟後，可針對條件性活性及所改良性質二者篩選突變體多肽。 在一些實施例中，在演化親代多肽以產生突變體多肽後，選擇第一條件性活性多肽，其展現以下二者：(a) 與親代多肽相比，在正常生理條件下之分析中第一活性下降，及(b) 與親代多肽相比，在異常條件下之分析中第一活性增加。隨後第一條件性活性多肽可進一步經歷一或多次額外演化、表現及選擇步驟，以選擇至少第二條件性活性多肽，其(1) 展現以下二者：(a) 與親代相比，在正常生理條件下之分析中第二活性下降，及(b) 與親代多肽相比，在異常條件下之分析中第二活性增加，或(2) 與第一條件性活性多肽及/或親代多肽相比，異常條件之第一活性與正常生理條件之第一活性之間之比率較大。注意，與親代多肽相比，第二條件性活性多肽之第一活性及第二活性二者在異常條件下可皆較高，以及與親代多肽相比，第一活性及第二活性二者在正常生理條件可皆較低。 在一些態樣中，在真核細胞產生宿主中實施表現步驟。宿主可為3T3小鼠纖維母細胞細胞；BHK21敘利亞倉鼠纖維母細胞細胞；MDCK，狗上皮細胞；Hela人類上皮細胞；PtK1鼠袋鼠上皮細胞；SP2/0小鼠漿細胞；及NS0小鼠漿細胞；HEK 293人類胚腎細胞；COS猴腎細胞；CHO、CHO-S中國倉鼠卵巢細胞；R1小鼠胚細胞；E14.1小鼠胚細胞；H1人類胚細胞；H9人類胚細胞；PER C.6,人類胚細胞；啤酒酵母細胞；及畢赤酵母(pichia)細胞。隨後可在相同真核細胞產生宿主中大量產生所選擇條件性活性多肽。藉由在兩個表現步驟中使用相同真核細胞產生宿主且對於最終產生，可達成條件性活性多肽之較高表現程度。 在某些實施例中，本發明旨在產生在異常條件(或第二條件)下之活性與在正常生理條件(或第一條件)下之活性之活性比率較大(例如，在異常與正常生理條件之間之選擇性較大)之條件性活性多肽。異常條件(或第二條件)下之活性與正常生理條件(或第一條件)下之活性之比率或選擇性可為至少約2:1、或至少約3:1、或至少約4:1、或至少約5:1、或至少約6:1、或至少約7:1、或至少約8:1、或至少約9:1、或至少約10:1、或至少約11:1、或至少約12:1、或至少約13:1、或至少約14:1、或至少約15:1、或至少約16:1、或至少約17:1、或至少約18:1、或至少約19:1、或至少約20:1、或至少約30:1、或至少約40:1、或至少約50:1、或至少約60:1、或至少約70:1、或至少約80:1、或至少約90:1、或至少約100:1。 在一個實施例中，條件性活性多肽係抗體，其在異常條件下之活性與在正常生理條件下之活性之間之比率可為至少約5:1、或至少約6:1、或至少約7:1、或至少約8:1、或至少約9:1、或至少約10:1、或至少約15:1、或至少約20:1、或至少約40:1、或至少約80:1。在一個實施例中，條件性活性多肽用於靶向腫瘤位點，其中條件性活性多肽在腫瘤位點(在腫瘤微環境中)有活性且在非腫瘤位點(正常生理條件)活性顯著較低或無活性。 在一個實施例中，條件性活性多肽係意欲與另一藥劑(例如本文中別處所揭示之彼等)偶聯之抗體。條件性活性抗體在異常條件之活性與在正常生理條件下之活性之比率可較高。舉例而言，欲與另一藥劑偶聯之條件性活性抗體在異常條件下之活性對在正常生理條件下之活性之比率可為至少約10:1、或至少約11:1、或至少約12:1、或至少約13:1、或至少約14:1、或至少約15:1、或至少約16:1、或至少約17:1、或至少約18:1、或至少約19:1、或至少約20:1。此在偶聯試劑係例如毒性或放射性時可尤其重要，此乃因此一偶聯試劑可期望地集中於疾病或治療位點(其中存在異常條件)。 E. 條件性活性多肽之產生 可產生具有可逆或不可逆活性之所選擇條件性活性多肽用於治療、診斷、研究及相關目的，及/或其可經歷演化及選擇之一或多個額外循環。 條件性活性多肽可使用多肽表現細胞產生宿主或生物體來產生。為使產生方法更有效，編碼條件性活性多肽之DNA可經歷針對細胞產生宿主或生物體之密碼子最佳化。先前已闡述密碼子最佳化，例如Narum等人，「Codon optimization of gene fragments encoding Plasmodium falciparum merzoite proteins enhances DNA vaccine protein expression and immunogenicity in mice」，Infect. Immun. 2001年12月, 69(12):7250-3，其闡述小鼠系統中之密碼子最佳化；Outchkourov等人，「Optimization of the expression of Equistatin in Pichia pastoris, protein expression and purification」，Protein Expr. Purif. 2002年2月；24(1): 18-24，其闡述酵母系統中之密碼子最佳化；Feng等人，「High level expression and mutagenesis of recombinant human phosphatidylcholine transfer protein using a synthetic gene: evidence for a C-terminal membrane binding domain」，Biochemistry 2000年12月19日，39(50): 15399-409，其闡述大腸桿菌中之密碼子最佳化；Humphreys等人，「High-level periplasmic expression in Escherichia coli using a eukaryotic signal peptide: importance of codon usage at the 5' end of the coding sequence」，Protein Expr. Purif . 2000年11月，20(2):252-64，其闡述密碼子使用如何影響大腸桿菌中之蛋白質分泌。 細胞產生宿主可為選自由以下組成之群中之一者之哺乳動物系統：CHO、HEK293、IM9、DS-I、THP-I、Hep G2、COS、NIH 3T3、C33a、A549、A375、SK-MEL-28、DU 145、PC-3、HCT 116、Mia PACA-2、ACHN、Jurkat、MMl、Ovcar 3、HT 1080、Panc-1、U266、769P、BT-474、Caco-2、HCC 1954、MDA-MB-468、LnCAP、NRK-49F及SP2/0細胞系；及小鼠脾細胞及兔PBMC。在一個實施例中，哺乳動物系統選自CHO或HEK293細胞系。在一個特定態樣中，哺乳動物系統係CHO-S細胞系。在另一實施例中，哺乳動物系統係HEK293細胞系。 在一些實施例中，細胞產生宿主係酵母細胞系統，例如啤酒酵母細胞或畢赤酵母細胞。在一些實施例中，細胞產生宿主係原核細胞，例如大腸桿菌(Owens RJ及Young RJ,J. Immunol. Meth ., 第168卷，第149頁, 1994；Johnson S及Bird RE,Methods Enzymol ., 第203卷，第88頁，1991)。條件性活性多肽亦可在植物中產生(Firek等人，Plant MoI. Biol ., 第23卷，第861頁，1993)。 條件性活性多肽亦可藉由合成方法使用業內熟知之化學方法產生。例如，參見Caruthers, 「New chemical methods for synthesizing polynucleotides」，Nucleic Acids Res . Symp. Ser . 215-223, 1980；Horn, 「Synthesis of oligonucleotides on cellulose. Part II: design and synthetic strategy to the synthesis of 22 oligodeoxynucleotides coding for Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP)」，Nucleic Acids Res . Symp. Ser . 225-232, 1980；Banga, A. K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Lancaster, Pa, 1995。舉例而言，肽合成可使用多種固相技術實施(例如，參見Roberge, 「A strategy for a convergent synthesis of N-linked glycopeptides on a solid support」,Science 269:202, 1995；Merrifield, 「Concept and early development of solid-phase peptide synthesis」,Methods Enzymol . 289:3-13, 1997)，且自動化合成可例如使用ABI 43 IA肽合成器(Perkin Elmer)根據製造商提供之說明書來達成。 固相化學肽合成方法自1960年代早期為業內已知(Merrifield, R. B., 「Solid-phase synthesis I. The synthesis of a tetrapeptide」,J. Am. Chem. Soc , 85:2149-2154, 1963) (亦參見Stewart, J. M.及Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 第2版, Pierce Chemical Co., Rockford, 111.，第11-12頁))且最近已用於市售實驗室肽設計及合成套組(Cambridge Research Biochemicals)。該等市售實驗室套組通常使用H. M. Geysen等人，「Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid」，Proc. Natl. Acad. Sci., USA , 81:3998, 1984之教示且在多個「棒(rod)」或「針(pin)」之尖端上提供合成肽，該等棒或針皆連接至單一板。在使用此一系統時，將棒或針之板倒置並插入相應孔或儲存器之第二板中，該等孔或儲存器含有用於將適當胺基酸附接或錨定至針或棒尖端之溶液。藉由重複此一方法步驟，即將棒及針之尖端倒置並插入適當溶液中，將胺基酸構建為期望肽。另外，可利用多種可得FMOC肽合成系統。舉例而言，多肽或片段之裝配可在固體載體上使用Applied Biosystems, Inc.之Model 431 A™自動化肽合成器來實施。該設備使得易於藉由直接合成或藉由合成一系列可使用其他已知技術偶合之片段得到本發明肽。 條件性活性多肽亦可經醣基化。醣基化可在轉譯後以化學方式或藉由細胞生物合成機制添加，其中該等細胞生物合成機制包含使用已知醣基化基序，該等醣基化基序對於序列可為天然的，或可作為肽添加，或添加於核酸編碼序列中。醣基化可為O-連接或N-連接。 條件性活性多肽包括所有「模擬物」及「肽模擬物」形式。術語「模擬物」及「肽模擬物」係指具有本發明多肽之實質上相同之結構及/或功能特徵之合成化學化合物。模擬物可完全由胺基酸之合成非天然類似物組成，或係部分天然肽胺基酸及胺基酸之部分非天然類似物之嵌合分子。模擬物亦可納入任一量之天然胺基酸保守取代，只要該等取代亦不顯著改變模擬物之結構及/或活性即可。對於係保守變體之本發明多肽，常規實驗將確定模擬物是否在本發明範圍內，即其結構及/或功能未顯著改變。 本發明之多肽模擬物組合物可含有非天然結構組分之任一組合。在替代性態樣中，本發明之模擬物組合物包括以下三個結構群組中之一者或全部：a) 除天然醯胺鍵(「肽鍵」)鍵聯以外之殘基鍵聯基團；b) 代替天然胺基酸殘基之非天然殘基；或c) 誘導二級結構模擬、即誘導或穩定二級結構(例如β轉折、γ轉折、β褶疊、α螺旋構形及諸如此類)之殘基。舉例而言，在本發明多肽之所有或一些殘基藉由除天然肽鍵以外之化學方式接合時，本發明多肽可被表徵為模擬物。個別肽模擬物殘基可藉由肽鍵、其他化學鍵或偶合方式(例如戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯、雙官能馬來醯亞胺、N,N'-二環己基碳二亞胺(DCC)或N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC))接合。可為傳統醯胺鍵(「肽鍵」)鍵聯之替代之連接基團包括例如酮基亞甲基(例如，-(C=O)CH2 -，用於-(C=O)-NH-)、胺基亞甲基(CH2 -NH)、伸乙基、烯烴(CH=CH)、醚(CH2 -O)、硫醚(CH2 -S)、四唑(CN4 --)、噻唑、逆醯胺、硫醯胺或酯(例如，參見Spatola (1983)，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins，第7卷，第267-357頁，「Peptide Backbone Modifications」，Marcell Dekker, N. Y.)。 本發明多肽亦可因含有全部或一些非天然殘基代替天然胺基酸殘基而被表徵為模擬物。非天然殘基在科學及專利文獻中已充分闡述；少數可用作天然胺基酸殘基模擬物之實例性非天然組合物及準則闡述於下文中。芳香族胺基酸之模擬物可藉由用例如以下各項替代來產生：D-或L-萘基丙胺酸；D-或L-苯基甘胺酸；D-或L-2噻吩基丙胺酸；D-或L-1-、2-、3-或4-芘基丙胺酸；D-或L-3噻吩基丙胺酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙胺酸；D-或L-(4-異丙基)-苯基甘胺酸；D-(三氟甲基)-苯基甘胺酸；D-(三氟甲基)-苯丙胺酸；D-對氟-苯丙胺酸；D-或L-對聯苯苯丙胺酸；D-或L-對甲氧基-聯苯苯丙胺酸；D-或L-2-吲哚(烷基)丙胺酸；及D-或L-烷基胺，其中烷基可為經取代或未經取代之甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、異丙基、異丁基、第二異丁基、異戊基；或非酸性胺基酸。非天然胺基酸之芳香族環包括例如噻唑基、苯硫基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基及吡啶基芳香族環。 酸性胺基酸之模擬物可藉由用例如以下各項取代來產生：在維持負電荷的同時非羧酸胺基酸；(膦醯基)丙胺酸；硫酸化蘇胺酸。羧基側基(例如，天冬胺醯基或麩胺醯基)亦可藉由與碳二亞胺(R'~N—C--N--R') (例如1-環己基-3(2-嗎啉基-(4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3(4-氮陽離子-4,4-二甲基戊基)碳二亞胺)反應經選擇性修飾。天冬胺醯基或麩胺醯基亦可藉由與銨離子反應而轉化為天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基殘基。鹼性胺基酸之模擬物可藉由用例如以下各項取代來產生：(除離胺酸及精胺酸外)胺基酸鳥胺酸、瓜胺酸或(胍基)-乙酸或(胍基)烷基-乙酸，其中烷基定義於上文中。可用腈衍生物(例如，含有CN-部分代替COOH)取代天冬醯胺或麩醯胺酸。天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基殘基可去胺基為響應天冬胺醯基或麩胺醯基殘基。精胺酸殘基模擬物可可藉由較佳在鹼性條件下使精胺醯基與例如一或多種習用試劑(包括例如苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-環己烷二酮或寧海準(ninhydrin))反應來產生。酪胺酸殘基模擬物可藉由使酪胺醯基與例如芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應來產生。N-乙醯基咪唑及四硝基甲烷可分別用於形成O-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。半胱胺酸殘基模擬物可藉由使半胱胺醯基殘基與例如α-鹵代乙酸鹽(例如2-氯乙酸或氯乙醯胺)及相應胺反應得到羧基甲基或羧基醯胺基甲基衍生物來產生。半胱胺酸殘基模擬物亦可藉由使半胱胺醯基殘基與例如以下各項反應來產生：溴-三氟丙酮、α-溴-β-(5- 咪唑基)丙酸；氯乙醯基磷酸酯、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物；甲基2-吡啶基二硫化物；對氯汞基苯甲酸鹽；2-氯汞基-4硝基苯酚；或氯-7-硝基苯并-氧雜-1,3-二唑。離胺酸模擬物可藉由使離胺醯基與例如琥珀酸或其他羧酸酸酐反應來產生(且胺基末端殘基可改變)。離胺酸及其他含α-胺基殘基模擬物亦可藉由與亞胺酸酯(例如甲基吡啶亞胺甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、硼氫化氯、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2,4-戊二酮)反應及與乙醛酸鹽進行轉醯胺酶催化反應來產生。甲硫胺酸之模擬物可藉由與例如甲硫胺酸亞碸反應來產生。脯胺酸之模擬物包括例如六氫菸鹼酸、噻唑啶羧酸、3-或4-羥基脯胺酸、去氫脯胺酸、3-或4-甲基脯胺酸或3,3-二甲基脯胺酸。組胺酸殘基模擬物可藉由使組胺醯基與例如焦炭酸二乙酯或對溴苯醯甲基溴反應來產生。其他模擬物包括例如彼等藉由以下方式產生者：脯胺酸及離胺酸之羥基化；絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基之磷酸化；離胺酸、精胺酸及組胺酸之α-胺基之甲基化； N-末端胺之乙醯化；主鏈醯胺殘基之甲基化或經N-甲基胺基酸取代；或C-末端羧基之醯胺化。 本發明多肽之殘基(例如胺基酸)亦可由相反手性之胺基酸(或肽模擬物殘基)替代。因此，任何以L-構形(其亦可稱為R或S，端視化學實體之結構而定)天然存在之胺基酸可由相同化學結構類型但具有相反手性(稱為D-胺基酸，但亦可稱為R-或S-形式)之胺基酸或肽模擬物替代。 本發明亦提供藉由天然方法(例如轉譯後處理(例如，磷酸化、醯化等))或藉由化學修飾技術修飾條件性活性多肽之方法。修飾可在多肽中之任何位置進行，包括肽主鏈、胺基酸側鏈及胺基或羧基末端。應瞭解，在給定多肽之若干位點可以相同或變化程度存在相同類型之修飾。給定多肽亦可具有多種類型之修飾。修飾包括乙醯化、醯化、聚乙二醇化、ADP-核糖基化、醯胺化、黃素之共價附接、血紅素部分之共價附接、核苷酸或核苷酸衍生物之共價附接、脂質或脂質衍生物之共價附接、磷脂醯肌醇之共價附接、交聯環化、二硫鍵形成、去甲基化、共價交聯之形成、半胱胺酸之形成、焦麩胺酸鹽之形成、甲醯化、γ-羧基化、醣基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻醯化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解處理、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒醯化、硫酸化及轉移RNA介導之將胺基酸添加至蛋白質(例如精胺醯化)。例如參見Creighton, T. E., a s—Structure and Molecular Properties，第2版, W. H. Freeman and Company, New York (1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson編輯，Academic Press, New York, 第1-12頁(1983)。 F. 醫藥組合物 所選擇條件性活性多肽或自條件性活性多肽工程化之產物可用於醫藥組合物中。在一態樣中，該等條件性活性多肽或工程化條件性活性多肽係使用本文所揭示之方法之一商業生產。一些適宜醫藥組合物闡述於美國專利第8,709,755 B2號中。 醫藥組合物可用於治療各種類型之癌症，包括癌瘤、母細胞瘤及肉瘤、及某些白血病或淋巴惡性病、良性及惡性腫瘤、及惡性病，例如肉瘤、癌瘤及黑色素瘤。癌症可為非實體腫瘤(例如血液學腫瘤)或實體腫瘤。亦包括成年腫瘤/癌症及兒科腫瘤/癌症。 血液學癌症係血液或骨髓之癌症。血液學(或血原性)癌症之實例包括白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴球性白血病、急性骨髓細胞性白血病、急性骨髓性白血病及骨髓母細胞性、前髓細胞性、骨髓單核球性、單核球性及紅血球性白血病)、慢性白血病(例如慢性骨髓細胞性(顆粒球性)白血病、慢性骨髓性白血病及慢性淋巴球性白血病)、真性多血症、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(惰性及高級形式)、多發性骨髓瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症、重鏈病、骨髓發育不良症候群、毛細胞白血病及骨髓發育不良。 實體腫瘤係通常不含囊腫或液體區域之異常組織腫塊。實體腫瘤可為良性或惡性。不同類型之實體腫瘤係針對形成其之細胞類型來命名(例如肉瘤、癌瘤及淋巴瘤)。可治療之實體腫瘤之實例包括肉瘤及癌瘤，包括纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤及其他肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤恩氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、淋巴惡性病、胰臟癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細胞癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓樣癌、乳頭狀甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、威爾姆氏瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、精原細胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤及CNS腫瘤(例如神經膠質瘤(例如腦幹神經膠質瘤及混合型神經膠質瘤)、神經膠母細胞瘤(亦稱為多形性神經膠母細胞瘤)星細胞瘤、CNS淋巴瘤、胚細胞瘤、髓母細胞瘤、神經鞘瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、腦脊髓膜瘤、神經胚細胞瘤、視網膜母細胞瘤及腦轉移)。 條件性活性多肽亦可用於自個體移除衰老細胞。衰老細胞包括特徵為具有基本上永久之生長停止之細胞。衰老細胞對增殖信號基本上無反應。衰老現象可在正常細胞增殖壽命結束時出現，或在正常或腫瘤細胞中因應例如化學治療劑、輻射、DNA損傷或其他細胞損傷而出現。業內闡述，衰老細胞經由p53-p21ciP 1或p l6ink4a之獨立活性自細胞週期退出，p53-p21ciP 1或p l6ink4a各自闡述為個別地足以誘導並維持非增殖狀態(Rodier等人，J Cell Bio l 192:547- 556 (2011))。 在多種疾病或病況中，移除衰老細胞係有益的。該等疾病或病況可包括癌症，較佳黑色素瘤，更佳轉移黑色素瘤、慢性發炎性疾病或神經疾病(例如阿茲海默氏病或帕金森氏病)。其他疾病包括動脈粥樣硬化、慢性發炎性疾病(例如關節炎或關節病)、癌症、骨關節炎、糖尿病、糖尿病潰瘍、脊柱後彎、脊柱側彎、肝功能不全、硬化、Hutchinson-Gilford早衰症候群(HGPS)、核纖層蛋白病、骨質疏鬆症、失智症、(心)血管疾病、肥胖症、代謝症候群、急性心肌梗塞、肺氣腫、胰島素敏感性、蒲東熱(boutonneuse fever)、肌少症、神經退化疾病(例如阿茲海默氏病、杭丁頓氏病(Huntington's disease)或帕金森氏病)、白內障、貧血、高血壓、纖維化、年齡相關性黃斑退化、COPD、氣喘、腎功能不全、失禁、聽力損失(例如耳聾)、視力損失(例如失明)、睡眠障礙、疼痛(例如關節痛或腿痛)、不平衡、恐懼、抑鬱症、呼吸困難、體重減輕、脫髮、肌肉損失、骨密度下降、脆弱及/或健適下降。 包括條件性活性多肽或自條件性活性多肽工程化之產物之醫藥組合物可根據用於製備醫藥組合物之已知方法來調配。在該等方法中，條件性活性多肽通常與含有醫藥上可接受之載劑之混合物、溶液或組合物組合。 醫藥上可接受之載劑係接受者患者可耐受之材料。無菌磷酸鹽緩衝鹽水係醫藥上可接受之載劑之一個實例。其他適宜醫藥上可接受之載劑為熟習此項技術者所熟知。(例如，參見Gennaro (編輯), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 第19版，1995))。調配物可進一步包括一或多種賦形劑、防腐劑、增溶劑、緩衝劑、白蛋白以防止病毒表面上之蛋白質損失等。 醫藥組合物之形式、投與途徑、劑量及方案自然取決於欲治療之病況、疾病嚴重度、患者之年齡、體重及性別等。該等熟習此項技術者可考慮該等考慮因素以調配適宜醫藥組合物。本發明醫藥組合物可經調配用於局部、經口、非經腸、鼻內、靜脈內、肌內、皮下或眼內投與及諸如此類。 較佳地，醫藥組合物含有醫藥上可接受之媒介以使調配物能注射。該等媒介可尤其係等滲、無菌鹽水溶液(磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂及諸如此類或該等鹽之混合物)，或乾燥、尤其冷凍乾燥組合物，其在添加例如無菌水或生理鹽水後允許構成可注射溶液。 在一些實施例中，存在張力劑(有時稱為「穩定劑」)以調節或維持組合物中液體之張力。在與較大帶電荷生物分子(例如蛋白質及抗體)一起使用時，張力劑通常稱為「穩定劑」，此乃因其可與胺基酸側鏈之帶電荷基團相互作用，由此減小分子間及分子內相互作用之可能性。張力劑可以醫藥組合物之按重量計0.1%至25%、較佳1至5%之任一量存在。較佳張力劑包括多元糖醇，較佳三元或更高元糖醇，例如丙三醇、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。 其他賦形劑包括可用作以下中之一或多者之試劑：(1) 增積劑，(2) 溶解度增強劑，(3) 穩定劑及(4) 以及防止變性或黏附至容器壁之試劑。該等賦形劑可包括：多元糖醇(上文所列舉)；胺基酸，例如丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇，例如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環多醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫還原劑，例如尿素、麩胱甘肽、類脂酸、巰基乙酸鈉、硫甘油、α-一硫代甘油及硫代硫酸鈉；低分子量蛋白質，例如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其他免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；單醣(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二醣(例如，乳糖、麥芽糖、蔗糖)；三醣，例如棉子糖；及多醣，例如糊精或聚葡萄糖。 可採用非離子表面活性劑或清潔劑(亦稱作「潤濕劑」)以幫助溶解治療劑以及保護治療性蛋白質免於攪動誘導之聚集，其亦允許調配物暴露於剪切表面應力而不引起活性治療性蛋白質或抗體變性。非離子表面活性劑可以在約0.05 mg/ml至約1.0 mg/ml、較佳約0.07 mg/ml至約0.2 mg/ml範圍內之濃度存在。 適宜非離子表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer) (184、188等)、PLURONIC®多元醇、TRITON®、聚氧乙烯去水山梨醇單醚(TWEEN®-20、TWEEN®-80等)、聚桂醇400、聚烴氧40硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50及60、甘油單硬脂酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素及羧甲基纖維素。可使用之陰離子清潔劑包括月桂基硫酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉及二辛基磺酸鈉。陽離子清潔劑包括氯化苄烷銨或氯化本索寧(benzethonium chloride)。 在一態樣中，條件性活性多肽可與一或多種用於治療癌症之抗癌劑一起用於醫藥組合物中。舉例而言，抗癌劑可為化學治療劑、輻射治療劑、激素治療劑、毒素或免疫治療劑。抗癌劑可選自任何已知抗癌劑，包括但不限於紫杉烷、類美登素、奧裡斯他汀、倍癌黴素、單甲基奧裡斯他汀E (MMAE)、安眠藥、金黴素、卡奇黴素、蒽環、CC-1065類似物、多西他賽、細胞自溶酶、蓖麻毒蛋白、白樹素、假單胞菌屬外毒素、白喉毒素、RNase及毒性放射性同位素。 在另一態樣中，條件性活性多肽可偶聯至抗癌劑。偶聯可為共價連接抗癌劑與條件性活性多肽。在一些情形中，偶聯可為非共價，例如抗癌劑與條件性活性多肽之間之離子鍵。 所偶聯抗癌劑分子對條件性活性多肽分子之比率多達3:1、或4:1、或5:1、或6:1。在一個實例中，抗癌劑對條件性活性多肽之比率為約4:1。 用於投與之劑量可隨多種參數、且尤其隨所用投與模式、相關病理學或者期望治療持續時間而調整。為製備醫藥組合物，可將有效量之條件性活性多肽或自條件性活性多肽進一步工程化之產物溶解或分散於醫藥上可接受之載劑或水性介質中。 適於注射應用之醫藥調配物包括無菌水溶液或分散液；載劑，例如芝麻油、花生油或丙二醇水溶液；及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。在所有情形中，調配物必須無菌且必須具有易於注射之流動性程度。其必須在製造及儲存條件下穩定，且必須經防腐以針對微生物(例如細菌及真菌)之污染作用。 條件性活性多肽作為游離鹼或藥理學可接受之鹽之溶液可在適宜地與表面活性劑混合之水中製備。分散液亦可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中及油中製備。在普通儲存及使用條件下，該等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。 可將條件性活性多肽及自條件性活性多肽工程化之產物調配為呈鹽形式之組合物。醫藥上可接受之鹽包括酸加成鹽(與蛋白質之游離胺基形成)，且其係用無機酸(例如鹽酸或磷酸)或有機酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸或諸如此類)形成。與游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)或有機鹼(例如異丙胺、三甲胺、組胺酸、普魯卡因(procaine)及諸如此類)。 載劑亦可為溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)、其適宜混合物及植物油。可例如藉由使用塗層(例如卵磷脂)、藉由在分散液情形中維持所需粒徑及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及諸如此類)來防止微生物作用。在多種情形中，將較佳包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用吸收延遲劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)來實現。 無菌可注射溶液係藉由以下方式來製備：將條件性活性多肽視需要以所需量納入具有上文所列舉一或多種其他成分之適當溶劑中，隨後進行過濾滅菌。通常，分散液係藉由將各種經滅菌活性成分納入含有基礎分散介質及/或來自上文所列舉之彼等之所需其他成分之無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情形中，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥技術，其自預先無菌過濾之溶液產生活性成分加上任一其他期望成分之粉末。 亦涵蓋用於直接注射之更濃縮或高度濃縮溶液之製備，其中設想使用二甲亞碸(DMSO)作為溶劑來得到極快滲透，從而將高濃度之活性劑遞送至小腫瘤區域。 調配後，將以與劑量調配相容之方式且以例如治療有效之量來投與溶液。調配物易於以多種劑型投與，例如上述可注射溶液之類型，但亦可採用藥物釋放膠囊及諸如此類。 對於在水溶液中之非經腸投與，例如，若需要，溶液應經適當緩衝，且液體稀釋劑首先用足夠鹽水或葡萄糖使其等滲。該等特定水溶液尤其適於靜脈內、肌內、皮下及腹膜內投與。就此而言，可採用之無菌水性介質將為熟習此項技術者根據本揭示內容已知。舉例而言，可將一個劑量溶解於1 ml等滲NaCl溶液中並添加至1000 ml皮下輸液液體或在建議輸注位點注射(例如，參見「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版，第1035-1038頁及第1570-1580頁)。端視所治療個體之狀況，將需要進行一定劑量變化。負責投與者將在任一事件中確定用於個別個體之適當劑量。 條件性活性多肽及自條件性活性多肽工程化之產物可在治療性混合物內調配以遞送每劑量約0.0001至10.0毫克、或約0.001至5毫克、或約0.001至1毫克、或約0.001至0.1毫克、或約0.1至1.0毫克或甚至約10毫克。亦可以所選時間間隔投與多次劑量。 在一些實施例中，用於治療本申請中所揭示疾病及病況之條件性活性多肽之劑量上限為2.0 µg/ml個體體液，或更佳1.11 µg/ml個體體液。 除了經調配用於非經腸投與(例如靜脈內或肌內注射)之化合物外，其他醫藥上可接受之形式包括例如錠劑或用於經口投與之其他固體；定時釋放膠囊；及目前使用之任何其他形式。 在某些實施例中，涵蓋使用脂質體及/或奈米顆粒將條件性活性多肽或自條件性活性多肽進一步工程化之產物引入宿主細胞中。脂質體及/或奈米顆粒之調配及使用為熟習此項技術者已知。 奈米膠囊通常可以穩定且可複現之方式包入化合物。為避免由於細胞內聚合超載所致之副作用，該等超細顆粒(約0.1 μm粒徑)通常使用能在活體內降解之聚合物來設計。涵蓋符合該等要求之生物可降解聚烷基-氰基丙烯酸酯奈米顆粒用於本發明中。 脂質體係自分散於水性介質中且自發形成多層同心雙層囊泡(亦稱為多層囊泡(MLV))之磷脂形成。MLV之直徑通常為25 nm至4 μm。MLV之超聲處理導致形成核心中含有水溶液之直徑在200至500 Å範圍內之小單層囊泡(SUV)。脂質體之物理特徵取決於pH、離子強度及二價陽離子之存在。 含有如本文所述條件性活性多肽或自條件性活性多肽工程化之產物之醫藥調配物係藉由與一或多種可選醫藥上可接受之載劑混合來製備(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol, A.編輯(1980))，其呈凍乾調配物或水溶液形式。醫藥上可接受之載劑包括但不限於：緩衝液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；氯化苄烷銨；氯化本索寧；苯酚；丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。 本文之實例性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶中性活性透明質酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶PH-20透明質酸酶醣蛋白，例如rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)。某些實例性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)闡述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，將sHASEGP與一或多種額外糖胺聚醣酶(例如軟骨素酶)組合。 實例性凍乾抗體調配物闡述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括彼等闡述於美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中者，後者調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。 本文調配物亦可含有多於一種所治療特定適應症所需之活性成分。較佳地，可將具有對彼此無不良影響之互補活性之成分組合為單一調配物。舉例而言，除本發明之條件性活性抗體、抗體片段或免疫偶聯物以外，可期望提供EGFR拮抗劑(例如厄洛替尼(erlotinib))、抗血管生成劑(例如VEGF拮抗劑，其可為抗VEGF抗體)或化學治療劑(例如類紫杉醇或鉑試劑)。該等活性成分適宜地以有效用於既定目的之量組合存在。 活性成分可例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之囊封於微膠囊中。舉例而言，可採用分別於膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或於巨乳液中之羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol, A.編輯(1980)中。 亦可製備持續釋放型製劑。持續釋放製劑之適宜實例包括含有抗體或抗體片段之固體疏水性聚合物之半滲透性基質，該等基質可呈成形物件形式，例如薄膜或微膠囊。 在一態樣中，本發明之兩種或更多種條件性活性多肽可同時或依序用於治療個體。該治療方法可顯著降低毒性。 在另一態樣中，條件性活性多肽之免疫調節活性適於組合療法。舉例而言，該條件性活性多肽可與前藥組合使用。 在另一態樣中，條件性活性多肽自身可具有前藥活性。 在另一態樣中，條件性活性多肽可用於診斷個體之癌症。條件性活性多肽可暴露於個體之細胞或組織，其中條件性活性多肽結合至癌細胞上之靶。可在條件性活性多肽經標記時測定條件性活性多肽與癌細胞之結合。標記可為放射性試劑或螢光團，例如藻紅素或螢光黃異硫氰酸酯(亦稱為氟異硫氰酸酯或FITC)。使細胞或組織與條件性活性多肽接觸在活體外或在個體身體內部進行。 在一些實施例中，條件性活性多肽或自條件性活性多肽工程化之產物可用於製造含有可用於治療、預防及/或診斷所述病症之材料之製品。該製品包含容器及位於該容器上或與該容器相連之標記或包裝插頁。適宜容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可自諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。容器裝有自身或與另一組合物組合有效治療、預防及/或診斷病況之組合物，且可具有無菌接入埠(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑係本發明之條件性活性多肽或自條件性活性多肽進一步工程化之產物。標記或包裝插頁指示，組合物用於治療所選病況。此外，製品可包含(a) 其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之條件性活性多肽或自條件性活性多肽工程化之產物；及(b) 其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。本發明此實施例中之製品可進一步包含包裝插頁，指示組合物可用於治療特定病況。或者或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者角度來看期望之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。 製品可視情況包含容器作為非經腸、皮下、肌內、靜脈內、關節內、支氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊椎內、滑膜內、胸廓內、子宮內、膀胱內、濃注、經陰道、經直腸、經頰、舌下、鼻內或經皮遞送裝置或系統之組件。 條件性活性多肽或自條件性活性多肽工程化之產物可包括於醫療裝置中，其中該裝置適於藉由至少一種選自以下之模式接觸或投與條件性活性多肽或自條件性活性多肽進一步工程化之產物：非經腸、皮下、肌內、靜脈內、關節內、支氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊椎內、滑膜內、胸廓內、子宮內、膀胱內、濃注、經陰道、經直腸、經頰、舌下、鼻內或經皮。 在一些其他實施例中，條件性活性多肽或自條件性活性多肽工程化之產物可以凍乾形式包括於套組之第一容器中，且可選第二容器包含無菌水、無菌緩衝水或於水性稀釋劑中之至少一種選自由以下組成之群之防腐劑：酚、間甲酚、對甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苄醇、亞硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化鎂、烷基對羥苯甲酸酯、氯化苄烷銨、氯化本索寧、去氫乙酸鈉及硫柳汞或其混合物。在一態樣中，在套組中，條件性活性多肽或自條件性活性多肽工程化之產物在第一容器中之濃度經第二容器中之內容物重構至約0.1 mg/ml至約500 mg/ml之濃度。在另一態樣中，第二容器進一步包含等滲劑。在另一態樣中，第二容器進一步包含生理上可接受之緩衝液。在一態樣中，本發明提供治療至少一種親代蛋白質介導之病況之方法，其包含向有需要之患者投與在套組中提供且在投與前重構之調配物。 以下實例說明本發明，但不加以限制。通常在業內遇到且為熟習此項技術者顯而易見之各種條件及參數之其他適宜修改及調整在本發明範圍內。實例 實例 1-5 用於製備條件性活性多肽，已闡述於美國專利第8,709,755 B2號中，其係以引用方式併入本文中。實例 6 ：演化抗體之輕鏈或重鏈 使用CPE單獨演化抗體F1-10F10之重鏈及輕鏈。篩選輕鏈突變體以發現26個具有條件性活性之輕鏈突變體，在此情形中突變體在pH 6.0下之活性高於野生型，且突變體在pH 7.4下之活性低於野生型。該26個輕鏈突變體在輕鏈中之8個不同位置具有其突變。該8個位置中之3個在26個輕鏈突變體之多於5個中出現。認為該3個位置係輕鏈中之熱點。篩選重鏈突變體以發現28個具有條件性活性之重鏈突變體。該28個重鏈突變體在重鏈中之8個不同位置具有其突變。該8個位置中之3個在28個重鏈突變體中之多於5個中出現。認為該3個位置係重鏈中之熱點。輕鏈突變體及重鏈突變體之條件性活性係藉由ELISA分析來確認。 此實例產生之最佳條件性活性抗體在pH 6.0下之活性與在pH 7.4下之活性相差17倍。另外，多種條件性活性抗體之活性在介於7.4之正常生理pH與6.0之異常pH之間係可逆的。有趣的是，在藉由ELISA分析在5.0至7.4之pH範圍內測試條件性活性抗體之活性時，自此實例產生之大多數條件性活性抗體在約5.5至6.5之pH下展現最佳結合活性。 亦藉由FACS (螢光-活化細胞分選)分析使用完整細胞確認此實例產生之條件性活性抗體之活性，其中在pH 6.0及pH 7.4下使用CHO細胞表現該等抗體之抗原。將條件性活性抗體添加至CHO細胞以量測結合活性。FACS分析確認條件性活性抗體在pH 6.0下相對於pH 7.4之選擇性之ELISA分析結果之一般趨勢。實例 7 ：在特殊緩衝液中選擇條件性活性抗體 使根據本發明藉由演化步驟產生之突變體抗體經歷在7.4之正常生理pH下之分析且經歷在6.0之異常pH下之分析。兩個分析皆使用包括在人類血清中發現之碳酸氫鹽之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)溶液來實施。溶液中碳酸氫鹽之濃度係人類血清中碳酸氫鹽之典型濃度，即生理濃度。使用不含碳酸氫鹽之相同PBS溶液進行比較測試。 用於量測本實例中之突變體抗體或條件性活性抗體之結合活性之分析係ELISA分析，其係如下實施： 1. ELISA之前日(pre-day)：用100 ul抗體Ab-A ECD his標籤(2.08 mg/ml)抗原以1 ug/ml及PBS塗佈孔， 3. 自經抗體Ab-A-His抗原塗佈之96孔板彈除(flick off)緩衝溶液，且在紙巾上吸乾。 4. 用緩衝液N或PBS將板洗滌3×， 5. 將板用200 ul指定緩衝液在室溫下封阻1小時， 6. 根據佈局將所選CPE/CPS突變體及野生型蛋白質在指定緩衝溶液中稀釋至75 ng/ml。將緩衝溶液之pH設為6.0或7.4 (下文「指定緩衝溶液」)， 6. 彈除緩衝液並根據板佈局將100 ul 75 ng/ml樣品添加至每孔， 7. 將板在室溫下培育1小時， 8. 自96孔板彈除緩衝液並在紙巾上吸乾， 9. 根據佈局將板用200 ul指定緩衝溶液洗滌共3次， 10. 在指定緩衝溶液中以1:5000稀釋度製備抗Flag HRP，且根據佈局將100 ul抗Flag辣根過氧化物(HRP)添加至每孔， 11. 將板在室溫下培育1小時， 13. 將板用200 ul指定緩衝溶液洗滌共3次， 14. 將板用50 ul 3,3',5,5;-四甲基聯苯胺(TMB)顯影1.5 min。 發現含有碳酸氫鹽之PBS緩衝溶液中之分析對於條件性活性抗體之選擇導致顯著較高之成功率。另外，使用含有碳酸氫鹽之PBS緩衝溶液選擇之條件性活性抗體往往具有顯著較高之在pH 6.0下之活性對在pH 7.4下之活性之比率，由此提供顯著較高之選擇性。 進一步觀察到，在不含碳酸氫鹽之PBS緩衝溶液中測試所選條件性活性抗體(使用含有碳酸氫鹽之PBS緩衝溶液)時，條件性活性抗體在pH 6.0下相對於pH 7.0之選擇性顯著降低。然而，在將碳酸氫鹽以生理量添加至此PBS緩衝溶液中時，相同條件性活性抗體之選擇性得以恢復。 在另一分析中，在添加有碳酸氫鹽之Krebs緩衝溶液中測試所選條件性活性抗體。在此添加有碳酸氫鹽之Krebs緩衝溶液中亦觀察到較高之在pH 6.0下之活性對在pH 7.4下之活性之比率。此似乎可至少部分係由於Krebs緩衝溶液中存在碳酸氫鹽所致。 在PBS緩衝溶液中之碳酸氫鹽濃度降低至低於其生理濃度之濃度時，觀察到條件性活性抗體在7.4之正常生理pH下之活性增加。觀察到條件性活性抗體在pH 7.4下活性之增加與PBS緩衝溶液中碳酸氫鹽濃度之降低有關。 野生型抗體不受PBS緩衝溶液中不同量之碳酸氫鹽影響在pH 7.4下分析時，此乃因其活性在PBS緩衝溶液中針對條件性活性抗體所測試之所有相同濃度之碳酸氫鹽下保持相同。實例 8 ：在不同緩衝液中選擇條件性活性抗體 使根據本發明藉由演化步驟產生之突變體抗體經歷在正常生理pH (7.4)下之ELISA分析及在異常pH (6.0)下之ELISA分析。兩個ELISA分析係使用不同緩衝液實施，包括含有牛血清白蛋白(BSA)之基於Krebs緩衝液之緩衝液，及含有碳酸氫鹽及BSA之基於PBS緩衝液之緩衝液。 ELISA分析係如下實施： 1. ELISA之前日：用100 ul抗體Ab-A ECD his標籤(2.08 mg/ml)抗原以1 ug/ml及塗佈緩衝液(碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液)塗佈孔。 2. 自經抗體Ab-A-His抗原塗佈之96孔板彈除緩衝溶液，且在紙巾上吸乾。 3. 用200ul之20種緩衝液將板洗滌3×。 4. 將板用200 ul之20種緩衝液在室溫下封阻1小時。 5. 根據佈局將突變體及嵌合體在20種緩衝液中稀釋至75 ng/ml。 6. 彈除緩衝液並根據板佈局將100 ul稀釋樣品添加至每孔。 7. 將板在室溫下培育1小時。 8. 自96孔板彈除緩衝液，且使用紙巾將板吸乾。 9. 將板用200 ul之20中緩衝液洗滌共3次。 10. 在20種緩衝液中以1:5000稀釋度製備抗flag IgG HRP。將100 μl抗flag IgG HRP溶液添加至每孔。 11. 將板在室溫下培育1小時。 12. 將板用200 ul之20中緩衝液洗滌共3次。 13. 將板用50 ul 3,3',5,5;-四甲基聯苯胺顯影30秒。 與彼等使用不含碳酸氫鹽之PBS緩衝溶液中之分析選擇者相比，使用含有碳酸氫鹽之PBS緩衝溶液中之分析選擇之條件性活性抗體展現顯著較高之在pH 6.0下之活性對在pH 7.4下之活性之比率。另外，與不含碳酸氫鹽之PBS緩衝溶液中之分析相比，添加有碳酸氫鹽之Krebs緩衝溶液亦提供較高之在pH 6.0下之活性對在pH 7.4下之活性之比率。碳酸氫鹽似乎對期望條件性活性抗體之選擇很重要。實例 9 ：在不同緩衝液中選擇條件性活性抗體 在此實例中篩選在pH 6.0下之活性高於野生型抗體且在pH 7.4下之活性低於野生型抗體之針對抗原之條件性活性抗體。篩選步驟係使用下表2及3中之緩衝液來實施。表2中之緩衝液係基於Krebs緩衝液，且所添加額外組分如表2第1欄中所示。表 2. 基于 Krebs 缓冲液之分析缓冲液 一些含有額外組分之基於PBS緩衝液之分析緩衝液顯示於下表3中。表3及4中緩衝液中之組分係如一升緩衝液中添加之克數計之量存在。但人類血清之濃度為10 wt.%緩衝液。表 3. 基於 PBS 緩衝液之分析緩衝液 篩選係使用ELISA分析以該等分析緩衝液來實施。ELISA分析係如實例7-8中所述來實施。10種分析緩衝液中每一種之所選擇條件性活性抗體呈現於下表4中。OD 450吸光度與ELISA分析中之結合活性負相關。表 4. 使用不同分析緩衝液選擇之條件性活性抗體 ( 突變體 ) 一些所選條件性活性抗體之選擇性係使用緩衝液8及9確認，且發現其確實具有在pH 6.0中相對於pH 7.4之期望選擇性，如圖1中所呈現。注意，使用不同緩衝液影響條件性活性抗體之選擇性。實例 10 ：條件性活性抗體在不同緩衝液中之活性 在兩種不同緩衝液中量測分別自兩種單株抗體(mAb 048-01及mAb 048-02作為親代抗體)演化之條件性活性抗體之活性(圖2)。該兩種緩衝液係磷酸鹽緩衝液(條件IV)及Krebs緩衝液(條件I)。自mAb 048-01演化6種條件性活性抗體：CAB Hit 048-01、CAB Hit 048-02、CAB Hit 048-03、CAB Hit 048-04、CAB Hit 048-05及CAB Hit 048-06。自mAb 048-02演化3種條件性活性抗體：CAB Hit 048-07、CAB Hit 048-08及CAB Hit 048-09。 此研究顯示，條件性活性抗體之選擇性(在pH 6.0下之分析中之活性對在pH/7.4下之分析中之活性之比率)受分析中所用緩衝液之影響。自野生型mAb 048-02演化之條件性活性抗體顯示在Krebs緩衝液中之選擇性顯著高於在磷酸鹽緩衝液中(圖2)。實例 11 ：條件性活性抗體及碳酸氫鹽之選擇性 在實例10中，觀察到條件性活性抗體在Krebs緩衝液(條件I)中之選擇性高於在磷酸鹽緩衝液(條件IV)中。此係針對鑑別Krebs緩衝液中對在實例10中觀察到之較高選擇性做出最重要貢獻之組分。在藉由自Krebs緩衝液一次一個地減去不同組分衍生自Krebs緩衝液之緩衝液中再測試一種條件性活性抗體之選擇性(圖3，左側條形組)。在使用完整Krebs緩衝液時，條件性活性抗體之選擇性高， pH 6.0/7.4之活性比率為約8。隨著組分A-F各自自Krebs緩衝液減去，條件性活性抗體之選擇性不損失，但在減去組分C及D之每一者時，條件性活性抗體之選擇性變低。然而，在自Krebs緩衝液減去組分G (碳酸氫鹽)時，條件性活性抗體完全喪失選擇性。參見圖3。此圖指示，碳酸氫鹽至少部分負責條件性活性抗體在Krebs緩衝液中之高選擇性。 隨後在不含碳酸氫鹽之磷酸鹽緩衝液(條件IV)中量測相同條件性活性抗體之選擇性，且觀察到條件性活性抗體在該磷酸鹽緩衝液中完全喪失選擇性。在將碳酸氫鹽添加至磷酸鹽緩衝液時，條件性活性抗體之選擇性恢復至在Krebs緩衝液中觀察到之程度。此確認，此條件性活性抗體之選擇性需要碳酸氫鹽。實例 12 ：碳酸氫鹽在 pH 7.4 下抑制結合 此實例量測在具有介於0至碳酸氫鹽生理濃度(約20 mM，圖4)範圍內之不同碳酸氫鹽濃度之緩衝液中，3種條件性活性抗體(CAB Hit A、CAB Hit B及CAB Hit C)在pH 7.4下之結合活性。觀察到隨著碳酸氫鹽濃度自0增加至生理濃度，所有3種條件性活性抗體在pH 7.4下之結合活性皆以劑量依賴性方式下降(圖4)。另一方面，野生型抗體之結合活性不受碳酸氫鹽影響。此研究顯示，條件性活性抗體在碳酸氫鹽存在下之選擇性可能至少部分係由於條件性活性抗體在pH 7.4下之結合活性因與碳酸氫鹽相互作用而損失所致。實例 13 ：在不同緩衝液中條件性活性抗體針對 ROR2 之活性 在不同緩衝液中測試使用含有碳酸氫鈉之分析溶液(如實例9中所述)選擇之針對ROR2之條件性活性抗體：CAB-P係在6.0或7.4之pH下使用之標準磷酸鹽水緩衝液(PBS緩衝液)；CAB-PSB係在偏離6.0或7.4之pH下之補充有15 mM碳酸氫鈉之PBS緩衝液；且CAB-PSS係在偏離6.0或7.4之pH下之補充有10 mM硫化鈉九水合物之PBS緩衝液。 根據以下ELISA方案量測該等條件性活性抗體之活性： 1. 在ELISA前一天：將板在PBS中在4℃下用100 ul之1 ug/ml抗原塗佈過夜。 2. 根據板佈局用200 ul之CAB-P、CAB-PSB或CAB-PSS緩衝液將板洗滌兩次。 3. 根據板佈局將板用200 ul之CAB-P、CAB-PSB或CAB-PSS緩衝液在室溫下封阻1小時。 4. 如板佈局中所指示，在CAB-P、CAB-PSB或CAB-PSS緩衝液中稀釋抗體樣品及陽性對照。 5. 自96孔板彈除封阻緩衝液，在紙巾上吸乾。 6. 根據板佈局將100 ul稀釋抗體樣品、陽性對照或陰性對照添加至每孔。 6. 將板在室溫下培育1小時。 7. 根據板佈局在CAB-P、CAB-PSB或CAB-PSS緩衝液中製備二級抗體。 8. 自96孔板彈除緩衝液，在紙巾上吸乾。 9. 根據板佈局將板用200 ul CAB-P、CAB-PSB或CAB-PSS緩衝液洗滌共3次。 10. 根據板佈局將CAB-P、CAB-PSB或CAB-PSS緩衝液中之稀釋二級抗體添加至每孔。 11. 將板在室溫下培育1小時。 12. 自96孔板彈除緩衝液，在紙巾上吸乾。 13. 將板用CAB-P、CAB-PSB或CAB-PSS緩衝液洗滌共3次。 14. 使3,3´,5,5´-四甲基聯苯胺(TMB)受質達到室溫。 15. 自板彈除緩衝液，在紙巾上吸乾。 16. 添加50 ul TMB受質。 17. 用50 ul 1N HCl停止顯影。顯影時間為3 min。 18. 在OD450 nm下使用讀板儀讀取。 該等條件性活性抗體針對ROR2之活性呈現於圖7中。條件性活性抗體顯示在CAB-PSB緩衝液中在pH 6.0下之活性高於在pH 7.4下，即在pH 6.0下相對於pH 7.4之選擇性。若干種條件性活性抗體之此選擇性在CAB-P緩衝液中喪失或顯著降低。但在CAB-PSS緩衝液中在pH 6.0下亦觀察到相對於pH 7.4之此選擇性。相反，野生型抗體在任一緩衝液中顯示相對極小或無選擇性。 此實例顯示，對於介導所測試條件性活性抗體針對ROR2之條件性結合，二硫化物與碳酸氫鹽具有類似功能。實例 14 ：在不同緩衝液中條件性活性抗體針對 Axl 之活性 在不同緩衝液中測試使用含有碳酸氫鈉之分析溶液(如實例9中所述)選擇之針對Axl之條件性活性抗體：CAB-P、CAB-PSB及CAB-PSS，如實例13中所述。使用與實例13中所述相同之ELISA方案量測該等條件性活性抗體針對Axl之活性且呈現於圖8中。條件性活性抗體顯示在CAB-PSB緩衝液中在pH 6.0下之活性高於在pH 7.4下之活性，即在pH 6.0下相對於pH 7.4之選擇性。該等條件性活性抗體之此選擇性在CAB-P緩衝液中喪失或顯著降低。在CAB-PSS緩衝液中在pH 6.0下亦觀察到相對於pH 7.4之選擇性。相反，野生型抗體顯示在任何緩衝液中基本上無選擇性。 此實例亦顯示，對於介導所測試條件性活性抗體針對Axl之條件性結合，二硫化物具有與碳酸氫鹽類似之功能。實例 15 ：抗 Axl 抗體之細胞殺死 使用A549細胞測試若干種條件性活性抗Axl抗體之細胞殺死活性。在兩個pH值下量測細胞殺死活性：6.0及7.4，分別代表腫瘤微環境中之pH及正常生理pH。不同抗體濃度下之細胞殺死百分比顯示於圖9A-9E中。 該兩個測試得到一致結果。陰性對照(抗Axl人類化WT)在pH 6.0及pH 7.4二者下對A549細胞顯示類似細胞殺死活性(圖9A)。相反，尤其在抗體未使A549細胞飽和之低抗體濃度下，與在pH 7.4下之細胞殺死活性相比，條件性活性抗Axl抗體在pH 6.0下顯示顯著較高之細胞殺死活性(圖9B-9E)。實例 16 ：抗 Axl 抗體對食蟹猴 -Axl 之結合親和性 在PBS及Krebs緩衝液緩衝液中在6.0及7.4之pH下量測條件性活性抗Axl抗體對食蟹猴-Axl之結合親和性並與對人類Axl (hAxl)之結合親和性相比較(圖10A-10D)。食蟹猴-Axl係來自非人類靈長類動物、即食蟹獼猴(cynomolgus macaques )之Axl蛋白。 陰性對照(BA-3831-WT)在pH 6.0及7.4二者下在PBS及Krebs緩衝液(圖10A)中對人類Axl (hAxl)及食蟹猴Axl (食蟹猴-Axl)二者顯示類似結合親和性。與在pH 6.0下對食蟹猴-Axl之結合親和性相比，條件性活性抗Axl抗體顯示在pH 7.4下對食蟹猴-Axl之較低結合親和性(圖10B-10D)。由於在PBS緩衝液中不存在碳酸氫根離子，在PBS緩衝液中在pH 6.0及pH 7.0下之結合親和性之間之差異不顯著。實例 17 ：偶聯至金黴素之抗 Axl 抗體之細胞毒性 金黴素具有細胞毒性，此乃因其藉由停止蛋白質合成而抑制細胞生長。一種條件性活性抗Axl抗體BAP063.9 4007偶聯至金黴素。在此測試中使用兩個陰性對照，BAP063 hum WT (野生型抗Axl抗體，自其衍生BAP063.9 4007)及B12 (抗B12抗體)，二者亦偶聯金黴素。 在6.0及7.4之pH下用三種金黴素偶聯之抗體(BAP063.9 4007、BAP063 hum WT及B12)處理若干種細胞系(圖11A-11H)。與在pH 7.4下對相同細胞之細胞毒性相比，金黴素偶聯之抗體BAP063.9 4007顯示在pH 6.0下顯著較高之對細胞系DU145 (前列腺癌細胞)、MDA-MD-231 (乳癌細胞)、PL45 (胰臟癌細胞)及A549 (腺癌細胞)之細胞毒性。另一方面，陰性對照未顯示在pH 6.0與pH 7.4之間之細胞毒性差異。實例 18 ：偶聯至模式毒素之抗 Axl 抗體 條件性活性抗Axl抗體偶聯至模式毒素(例如，金黴素)以產生條件性活性抗體-藥物偶聯物(CAB-Axl-ADC)。首先測試CAB-Axl-ADC以確認條件性細胞殺死活性不被藥物偶聯過程改變。此測試顯示，CAB-Axl-ADC在pH 6.0下殺死之細胞顯著多於在pH 7.4下(圖12)。 然後每週兩次將CAB-Axl-ADC以1 mg/kg之劑量注射至帶有MiaPaCa2異種移植物腫瘤之小鼠達3週。在此研究中使用若干個對照，包括裸CAB (無偶聯之相同抗Axl抗體)、媒介、單獨之毒素(吉西他濱(gemcitabine))、對照ADC (偶聯至不結合至腫瘤細胞之抗體之金黴素)及親和力匹配之抗AxlADC (AM-ADC)及金黴素。研究顯示，與對照相比，CAB-Axl-ADC (CAB-ADC)及金黴素以及AM-ADC及金黴素提供顯著更大之腫瘤大小的減小(圖13)。單獨之毒素或單獨之媒介皆不減小腫瘤大小。此研究顯示，與毒素偶聯之條件性活性抗Axl抗體在減小腫瘤大小中與親和力匹配之抗體(AM-ADC)同樣有效。實例 19 ：食蟹獼猴中抗 Axl 抗體藥物偶聯物之血清濃度 將條件性活性抗Axl抗體(CAB-ADC)之藥物(金黴素)偶聯物以以下三個劑量注射至雄性及雌性食蟹獼猴中：0.1 mg/kg、1 mg/kg及10 mg/kg。使用非偶聯抗Axl抗體作為對照。亦使用親和力匹配之抗體藥物偶聯物(AM-ADC)作為對照。在一周時間段期間(168小時，參見圖14A-14B)量測(CAB-ADC)之血清濃度。CAB-ADC在猴血清中持續長於AM-ADC對照(圖14B)。在雄性及雌性猴之間無顯著差異(圖14A-14B)。實例 20 ：抗 Axl 抗體藥物偶聯物在食蟹獼猴中之毒性 在食蟹獼猴中測試CAB-ADC之毒性。食品藥品管理局(FDA)已使用天冬胺酸胺基轉移酶(AST)及丙胺酸胺基轉移酶(ALT)作為藥物肝毒性之指示物。在雄性及雌性猴二者中量測血清AST及ALT含量(圖15A-15B)。媒介(PBS)不引起血清中之AST或ALT含量變化，同時匹配之抗體藥物偶聯物(AM-ADC)及金黴素顯示極高AST及ALT含量。與AM-ADC對照相比，CAB-ADC顯示顯著降低之AST及ALT含量。此指示，相對於匹配之抗體藥物偶聯物AM-ADC，本發明之抗Axl抗體藥物偶聯物具有顯著降低之肝毒性。 亦發現CAB-ADC及金黴素在猴中引起較少發炎(圖16)。在注射CAB-ADC、AM-ADC及PBS後收集猴血液中之淋巴球計數。與引起嚴重發炎之AM-ADC相比，CAB-ADC在猴中僅引起輕度發炎。實例 21 ：偶聯至模式毒素之抗 Ror2 抗體 使條件性活性抗Ror2抗體偶聯至模式毒素(例如，太平洋紫杉醇)以產生條件性活性抗體-藥物偶聯物(Ror2-CAB-ADC)。 在小鼠中藉由注射MDA-MB-436腫瘤細胞來誘導腫瘤，以產生異種移植小鼠。然後將Ror2-CAB-ADC每週一次以0.3或1 mg/kg之劑量注射至異種移植小鼠中達2週。此研究中使用之對照包括作為媒介之PBS緩衝液及單獨之毒素(太平洋紫杉醇)。研究顯示，與對照相比，Ror2-CAB-ADC提供顯著更大之腫瘤大小的減小(圖17A-17C)。0.3 mg/kg劑量組之結果呈現於圖17B中，且1 mg/kg劑量組之結果呈現於圖17C中。此研究顯示，與毒素偶聯之條件性活性抗Ror2抗體有效減小小鼠之腫瘤大小。 必須注意，如本文中及在隨附申請專利範圍中所用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數個參考物。此外，術語「一(a)」(或「一(an)」)、「一或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。術語「包含」、「包括」、「具有」及「自……構築」亦可互換使用。 除非另有指示，否則不論是否存在術語「約」，說明書及申請專利範圍中所用所有表示成分數量、性質(例如，分子量)、百分比、比率、反應條件等之數字皆應理解為在所有情況下皆由術語「約」修飾。因此，除非指示相反情況，否則說明書及申請專利範圍中所述數字參數係近似值，可端視本發明尋求獲得之期望性質而變化。最低限度地且不試圖限制申請專利範圍之等效原則之應用，每一數字參數應至少根據所報告有效數位數且藉由應用普通舍入技術來解釋。儘管陳述本發明之寬範圍之數值範圍及參數係近似值，但具體實例中所陳述之數值係儘可能精確地報告。然而，任一數值固有地含有在其各別測試量測中發現之標准偏差必然產生之某些誤差。 應理解，本文揭示之每一組分、化合物、取代基或參數欲解釋為揭示單獨使用或與本文揭示之每一其他組分、化合物、取代基或參數中之一或多者組合使用。 亦應理解，本文所揭示每一組分、化合物、取代基或參數之每一量/值或量/值之範圍欲解釋為亦揭示與針對本文所揭示之任何其他組分、化合物、取代基或參數所揭示之每一量/值或量/值之範圍組合，且本文所揭示兩個或更多個組分、化合物、取代基或參數之量/值或量/值之範圍之任一組合因此亦出於本說明之目的彼此組合揭示。 進一步應理解，本文所揭示之每一範圍欲解釋為揭示所揭示範圍內之每一具體值，其具有相同有效數位數。因此，1-4之範圍欲解釋為明確揭示值1、2、3及4。進一步應理解，本文所揭示每一範圍內之每一下限欲解釋為揭示與每一範圍之每一上限及本文針對相同組分、化合物、取代基或參數揭示之每一範圍內之每一具體值組合。因此，此揭示欲解釋為揭示藉由將每一範圍之每一下限與每一範圍之每一上限或與每一範圍內之每一具體值組合，或藉由將每一範圍之每一上限與每一範圍內之每一具體值組合得到之所有範圍。 此外，說明或實例中所揭示組分、化合物、取代基或參數之具體量/值欲解釋為揭示範圍之下限或上限，且因此可與範圍之任何其他下限或上限或本申請其他地方所揭示相同組分、化合物、取代基或參數之具體量/值組合，以形成該組分、化合物、取代基或參數之範圍。 本文所提及之所有文件皆係全文以引用方式併入本文中，或者提供其明確依賴之揭示內容。申請人不欲將任何所揭示實施例獻於公眾，且就任何所揭示修改或改變在字面上可不落於申請專利範圍內而言，其可在等效原則下視為申請專利範圍之一部分。 然而，應理解，即使在上述說明中已連同本發明結構及功能之細節一起陳述了本發明之多個特徵及優點，但本發明僅為說明性，且可在其中表述隨附申請專利範圍之術語之廣泛一般含義所指示之全部範圍內，在本發明原則內改變細節，尤其改變關於部件之形狀、大小及佈置之內容。
圖1顯示實例9中產生之條件性活性抗體在pH 6.0下相對於pH 7.4之選擇性。 圖2顯示在不同緩衝溶液中分析之若干種不同條件性活性抗體對抗原之結合活性。 圖3顯示改變Krebs緩衝液之組成對條件性活性抗體之結合活性之效應。 圖4顯示，三種不同條件性活性抗體之結合活性取決於在pH 7.4下碳酸氫鹽之存在及濃度，如實例12中所述。 圖5係顯示嵌合抗原受體(CAR)之結構之簡圖。 圖6係顯示在去氧血紅素中形成鹽橋之簡圖，其中3個胺基酸殘基形成兩個鹽橋，其穩定去氧血紅素之T四級結構，導致對氧之親和力較低。 圖7顯示在不同緩衝溶液中條件性活性抗體針對ROR2之活性。 圖8顯示在不同緩衝溶液中條件性活性抗體針對Axl之活性。 圖9A-9E顯示使用野生型抗Axl抗體及條件性活性抗Axl抗體在pH 6.0及pH 7.4下在不同抗體濃度下對A549細胞進行細胞殺死之結果。 圖10A-10D顯示在不同緩衝液中及在不同pH值下條件性活性抗Axl抗體對人類Axl及食蟹猴Axl之結合親和性。 圖11A-11H顯示在不同pH值下偶聯至金黴素之條件性活性抗Axl抗體對不同細胞系之細胞殺死。 圖12顯示在不同pH值下偶聯至金黴素之條件性活性抗Axl抗體對A549細胞之細胞殺死。 圖13顯示金黴素偶聯之條件性活性抗Axl抗體治療對異種移植小鼠中腫瘤體積之效應。 圖14A-14B顯示在注射抗Axl抗體/金黴素偶聯物後，金黴素偶聯之條件性活性抗Axl抗體在食蟹猴血液中隨時間之所檢測存在。 圖15A顯示自金黴素偶聯之條件性活性抗Axl抗體即將注射前(注射前(D-3))開始直至注射後3天(注射後(D-3))，天冬胺酸胺基轉移酶(AST)在食蟹猴血液中隨時間之所檢測存在。 圖15B顯示自金黴素偶聯之條件性活性抗Axl抗體即將注射前(注射前(D-3))開始直至注射後3天(注射後(D-3))，丙胺酸天冬胺酸胺基轉移酶(ALT)在食蟹猴血液中隨時間之所檢測存在。 圖16顯示在注射金黴素偶聯之條件性活性抗Axl抗體後，在食蟹猴血液中隨時間之淋巴球計數。 圖17A-17C顯示在用太平洋紫杉醇偶聯之條件性活性抗Ror2抗體治療後，對異種移植小鼠中之腫瘤體積之效應，如實例21中所述。

Claims (84)

  1. 一種可藉由增加親代多肽之淨電荷獲得之條件性活性多肽，其中該條件性活性多肽展現與相同條件之第二值下第二分析中之相同活性相比，該條件之第一值下第一分析中之活性降低。
  2. 如請求項1之條件性活性多肽，其中該條件係pH。
  3. 如請求項1之條件性活性多肽，其中該第一分析及該第二分析係在血清不存在下在分析溶液中實施。
  4. 如請求項1之條件性活性多肽，其中該淨電荷係藉由將一或多個帶電荷胺基殘基經由胺基酸殘基取代、胺基酸插入或其組合引入該親代多肽中來增加。
  5. 如請求項2之條件性活性多肽，其中該等帶電荷胺基酸殘基選自天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、組胺酸及離胺酸。
  6. 如請求項5之條件性活性多肽，其中該等帶電荷胺基酸殘基選自天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸及離胺酸。
  7. 如請求項5之條件性活性多肽，其中將該一或多個帶電荷胺基殘基引入該親代多肽之活性位點中。
  8. 如請求項5之條件性活性多肽，其中將該一或多個帶電荷胺基殘基引入該親代多肽之活性位點外部之區域中。
  9. 如請求項8之條件性活性多肽，其中該活性位點外部之該區域係抗體恆定區或該抗體之框架區。
  10. 如請求項4至9中任一項之條件性活性多肽，其中該一或多個帶電荷胺基酸殘基係少於5個帶電荷胺基酸殘基、或少於4個帶電荷胺基酸殘基、或少於3個帶電荷胺基酸殘基、或少於2個帶電荷胺基酸殘基。
  11. 如請求項4至9中任一項之條件性活性多肽，其中該一或多個帶電荷胺基酸殘基選自天冬胺酸及麩胺酸。
  12. 如請求項4至9中任一項之條件性活性多肽，其中該條件性活性多肽係條件性活性抗體且將該一或多個帶電荷胺基酸殘基引入該條件性活性抗體之至少一個互補決定區中。
  13. 如請求項1至9中任一項之條件性活性多肽，其中該條件性活性多肽在該條件之該第一值下可逆地不活化。
  14. 如請求項1至9中任一項之條件性活性多肽，其中該條件選自pH、溫度、滲透壓、滲透重量莫耳濃度、氧化壓力、電解質濃度。
  15. 如請求項1至9中任一項之條件性活性多肽，其中該條件係pH。
  16. 如請求項15之條件性活性多肽，其中該等第一及第二分析係在至少一種分子量小於900 a.m.u.且pKa遠離該pH之該第二值多達3單位之物質存在下實施。
  17. 如請求項15之條件性活性多肽，其中該等第一及第二分析係在相同溫度下且在至少一種分子量小於900 a.m.u.且pKa介於該pH之該第一值與該pH之該第二值之間之物質存在下實施。
  18. 如請求項12之條件性活性多肽，其中該等第一及第二分析係在選自以下之物質存在下實施：組胺酸、組織胺、氫化二磷酸腺苷、硫化氫、氫化三磷酸腺苷、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、碳酸氫鹽、二硫化物、銨、磷酸二氫鹽及其組合。
  19. 如請求項1至9中任一項之條件性活性多肽，其中在該條件之該第二值下之該分析中之該增加活性對在該條件之該第一值下之該分析中之該降低活性的比率為至少1.3、或至少1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少3.0、或至少4.0、或至少6.0、或至少8.0、或至少10.0、或至少20.0、或至少40.0、或至少60.0、或至少100.0。
  20. 如請求項1至9中任一項之條件性活性多肽，其中該條件之該第一值係正常生理條件之值，其在將該條件性活性多肽投與個體之位點處或在個體之該條件性活性多肽作用位點之組織或器官處之生理條件之正常範圍內，且該條件之該第二值係異常條件之值，其偏離在投與該條件性活性多肽之該位點處或在該條件性活性多肽之該作用位點之該組織或器官處之該生理條件之該正常範圍。
  21. 如請求項1至9中任一項之條件性活性多肽，其中該條件性活性多肽係蛋白質或蛋白質片段。
  22. 如請求項1至9中任一項之條件性活性多肽，其中該條件性活性多肽選自抗體、單鏈抗體及抗體片段且該活性係與抗原之結合活性。
  23. 如請求項1至9中任一項之條件性活性多肽，其中該條件性活性多肽係抗體Fc區。
  24. 如請求項1至9中任一項之條件性活性多肽，其中該條件性活性多肽係酶且該活性係酶活性。
  25. 如請求項1至9中任一項之條件性活性多肽，其中該條件性活性多肽選自受體、調控蛋白、可溶蛋白、細胞介素及受體、調控蛋白之片段、壓力蛋白、穹窿體相關蛋白、神經元蛋白、消化道蛋白、生長因子、粒線體蛋白、胞質蛋白、動物蛋白、結構蛋白及植物蛋白。
  26. 一種醫藥組合物，其包含有效量之如請求項1至25中任一項之條件性活性多肽及醫藥上可接受之載劑。
  27. 一種如請求項1至25中任一項之條件性活性多肽之用途，其用於製造用於自個體移除衰老細胞之藥劑。
  28. 一種如請求項1至25中任一項之條件性活性多肽之用途，其用於製造用於治療實體腫瘤、發炎關節或腦疾病或病症之藥劑。
  29. 如請求項28之用途，其中該條件性活性多肽呈包含該條件性活性多肽之嵌合抗原受體之部分之形式，且該嵌合抗原受體引入T細胞或NK細胞中。
  30. 如請求項29之用途，其中該等T細胞或NK細胞用作過繼性細胞療法之一部分。
  31. 如請求項28之用途，其中該條件性活性多肽連接至奈米顆粒。
  32. 如請求項28之用途，其中該條件性活性多肽呈包含該條件性活性多肽之抗體-藥物偶聯物之形式。
  33. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至25中任一項之條件性活性多肽。
  34. 一種表現載體，其包含如請求項33之核酸分子。
  35. 一種宿主細胞，其包含如請求項34之表現載體。
  36. 如請求項26之醫藥組合物，其進一步包含至少一種額外抗癌劑。
  37. 如請求項36之醫藥組合物，其中該至少一種額外抗癌劑係化學治療劑、輻射治療劑、激素治療劑、毒素或免疫治療劑。
  38. 如請求項36之醫藥組合物，其中該至少一種額外抗癌劑係選自以下之毒素：紫杉烷、類美登素(maytansinoid)、奧裡斯他汀(auristatin)、卡奇黴素(calicheamicin)、倍癌黴素(duocramycin)、mmae、安眠藥、金黴素(duomycin)、蒽環、CC-1065類似物、多西他賽(docetaxel)、細胞自溶酶、蓖麻毒蛋白、白樹素、假單胞菌屬(Pseudomonas )外毒素、白喉毒素、RNase及毒性放射性同位素。
  39. 如請求項36之醫藥組合物，其中該條件性活性多肽偶聯至該至少一種額外抗癌劑、或至少4種額外抗癌劑、或至少6種額外抗癌劑。
  40. 一種如請求項1至25中任一項之條件性活性多肽之用途，其用於製造用於診斷個體中癌症之存在之藥劑，其中該藥劑用於接觸該個體之細胞或組織，且其中該條件性活性多肽結合至癌細胞上之靶且該條件性活性多肽已經可檢測標記。
  41. 如請求項40之用途，其中該藥劑係用於在活體外接觸該等細胞或組織。
  42. 如請求項40之用途，其中該藥劑係用於在該個體體內接觸該等細胞或組織。
  43. 一種雙特異性抗體，其包含至少一個含有如請求項1至25中任一項之條件性活性多肽之結合結構域。
  44. 一種含有兩個不同結合或催化結構域之嵌合蛋白，其中該等結構域之一者或二者包含如請求項1至25中任一項之條件性活性多肽。
  45. 一種溶瘤病毒，其包含如請求項1至25中任一項之條件性活性多肽。
  46. 如請求項1至9中任一項之條件性活性多肽，其中該條件性活性多肽偶聯至核酸。
  47. 如請求項46之條件性活性多肽，其中該核酸係非共價或共價地偶聯且該核酸係包含至少一種非天然核苷酸之核酸。
  48. 如請求項16之條件性活性多肽，其中該至少一種物質與該多肽經由親水、疏水或共價相互作用而相互作用。
  49. 如請求項17之條件性活性多肽，其中該至少一種物質與該多肽經由親水、疏水或共價相互作用而相互作用。
  50. 如請求項18之條件性活性多肽，其中該至少一種物質與該多肽經由親水、疏水或共價相互作用而相互作用。
  51. 如請求項16之條件性活性多肽，其包含兩種或更多種物質。
  52. 如請求項17之條件性活性多肽，其包含兩種或更多種物質。
  53. 如請求項18之條件性活性多肽，其包含兩種或更多種物質。
  54. 如請求項28至32中任一項之用途，其中該藥劑包含兩種或更多種如請求項1至25之條件性活性多肽以供同時或依序投與。
  55. 如請求項28至32中任一項之用途，其中如請求項1至25之條件性活性多肽具有免疫調節活性且該藥劑用於組合療法中。
  56. 如請求項55之用途，該組合療法係與前藥組合。
  57. 如請求項1至9中任一項之條件性活性多肽，其中該條件性活性多肽具有前藥活性。
  58. 一種自親代多肽製備條件性活性多肽之方法，該方法包含以下步驟： i. 使用一或多種選自以下之技術演化編碼該親代多肽之DNA以增加該親代多肽之淨電荷：增加該DNA中帶電荷胺基酸殘基之密碼子之總數、減少該DNA中不帶電荷胺基酸殘基之密碼子之總數及其組合，以產生突變體DNA； ii. 表現該等突變體DNA以獲得突變體多肽；及 iii. 自該等突變體多肽選擇該條件性活性多肽，該條件性活性多肽展現與相同條件之第二值下第二分析中之相同活性相比，該條件之第一值下第一分析中之活性降低，且該等帶電荷胺基酸殘基選自天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、離胺酸及組胺酸。
  59. 如請求項58之方法，其中該演化步驟採用定點誘變。
  60. 如請求項59之方法，其中該定點誘變選自寡核苷酸介導之誘變、PCR誘變及盒式誘變。
  61. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該演化步驟包含將一或多個帶電荷胺基酸殘基之密碼子引入該DNA中。
  62. 如請求項61之方法，其中該一或多個帶電荷胺基酸殘基之密碼子係少於5個密碼子、或少於4個密碼子、或少於3個密碼子、或少於2個密碼子。
  63. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該演化步驟包含密碼子取代、密碼子缺失或密碼子插入。
  64. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該等帶電荷胺基酸殘基選自天冬胺酸及麩胺酸。
  65. 如請求項61之方法，其中將該一或多個密碼子引入該DNA之編碼該親代多肽之活性位點之區域中。
  66. 如請求項65之方法，其中該親代多肽係親代抗體且該活性位點係該親代抗體之互補決定區。
  67. 如請求項61之方法，其中將該一或多個帶電荷胺基殘基引入該親代多肽之活性位點外部之區域中。
  68. 如請求項67之方法，其中該活性位點外部之該區域係抗體恆定區或該抗體之框架區。
  69. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該條件性活性多肽在該條件之該第一值下可逆地不活化。
  70. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該條件選自pH、溫度、滲透壓、滲透重量莫耳濃度、氧化壓力、電解質濃度及蛋白質濃度。
  71. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該等第一及第二分析係在包含血液中發現之蛋白質之分析溶液中實施。
  72. 如請求項71之方法，其中該血液蛋白質係白蛋白。
  73. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該等第一及第二分析係在血清不存在下在分析溶液中實施。
  74. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該第二條件之該值係正常生理條件之值，其在將該條件性活性多肽投與個體之位點處或在個體之該條件性活性多肽作用位點之組織或器官處之生理條件之正常範圍內，且該第一條件之該值係異常條件之值，其偏離在投與該條件性活性多肽之該位點處或在該條件性活性多肽之該作用位點之該組織或器官處之該生理條件之該正常範圍。
  75. 如請求項70之方法，其中該條件係pH且該等第一及第二分析係在分析介質中實施，該等分析介質包括至少一種分子量小於900 a.m.u.且pKa遠離pH之該第一值多達3單位之物質。
  76. 如請求項70之方法，其中該條件係pH且該等第一及第二分析係在分析介質中實施，該等分析介質包括至少一種分子量小於900 a.m.u.且pKa介於pH之該第二值與pH之該第一值之間之物質。
  77. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該等第一及第二分析係在分析介質中實施，該等分析介質包括選自以下之物質：組胺酸、組織胺、氫化二磷酸腺苷、氫化三磷酸腺苷、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、硫化氫、二硫化物、銨、碳酸氫鹽、磷酸二氫鹽及其組合。
  78. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該親代多肽選自抗體、單鏈抗體及抗體片段，且該活性係與抗原之結合活性。
  79. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該親代多肽係抗體Fc區。
  80. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該親代多肽係酶且該活性係酶活性。
  81. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該親代多肽選自受體、調控蛋白、可溶蛋白、細胞介素及受體、調控蛋白之片段、壓力蛋白、穹窿體相關蛋白、神經元蛋白、消化道蛋白、生長因子、粒線體蛋白、胞質蛋白、動物蛋白、結構蛋白及植物蛋白。
  82. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該選擇步驟進一步包含基於選自親和力、表現程度及人類化之性質來選擇該條件性活性多肽。
  83. 如請求項58至60中任一項之方法，其中該表現步驟採用噬菌體展示或真核細胞產生宿主。
  84. 如請求項83之方法，其中表現步驟係在該真核細胞產生宿主中實施且該所選條件性活性多肽係在相同真核細胞產生宿主中表現。
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