交叉參考申請案
本申請案主張2016年5月20日提出申請之美國臨時申請案第62/339,757號及2017年5月12日提出申請之美國臨時申請案第62/505,470號之益處，每一申請案之全部內容以引用方式併入本文中。 序列表 本申請案含有已以ASCII格式經由EFS-Web提交之序列表且其全部內容以引用方式併入本文中。於2017年5月16日創建之該ASCII拷貝命名為SC7201TWO1_Sequence_Listing_ST25且大小為53.5 KB (54,812個字節)。 本發明可以許多不同形式來體現。本文揭示本發明之例示其原理之非限制性、闡釋性實施例。本文所使用之任一部分標題僅出於組織目的，且不應理解為限制所闡述標的物。出於本發明目的，除非另外說明，否則所有鑑別序列登錄號可參見NCBI參考序列(RefSeq)資料庫及/或NCBI GenBank®檔案序列資料庫。
I. 導論
人類ASCL1係25千道爾頓(kDa)基本螺旋-環-螺旋(bHLH)轉錄因子，其用作主導不同組織類型中之組織特異性基因級聯之主要譜系轉錄因子。在癌症背景中，最初發現人類ASCL1蛋白與神經內分泌腫瘤有關。已展示，升高之ASCL1表現指示腫瘤分化成展現神經內分泌特徵之腫瘤。ASCL1亦表現於以下腫瘤中：展現至神經內分泌表型之較差分化之腫瘤、轉變成神經內分泌表型之腫瘤、包含具有神經內分泌特徵之細胞之腫瘤(包含不展現神經內分泌特徵之腫瘤)。 神經內分泌腫瘤之發生率在過去二十年顯著增加且繼續平穩上升。各種類型之神經內分泌腫瘤可發生於身體中之許多不同位置，以不同方式生長，且端視位置及神經內分泌腫瘤是功能性抑或非功能性而產生不同症狀。功能性神經內分泌腫瘤係基於因由腫瘤分泌過量激素而存在臨床症狀所定義。非功能性神經內分泌腫瘤不分泌激素；然而，其可產生由腫瘤生長引起之症狀。 神經內分泌腫瘤通常在疾病過程早期不引起症狀，且由此其有時會誤診，或在晚期(例如在轉移之後)方診斷出。因此，在早期鑑別神經內分泌腫瘤(包含將疾病階段分類)係計劃適當治療之重要步驟。本發明提供新穎抗體及其用於檢測作為用於各種腫瘤(包含神經內分泌腫瘤)之診斷生物標記之ASCL1表現之用途。
II. ASCL1 生理學
無剛毛鱗甲同系物1 (ASCL1，亦稱為Ash1、hASH-1、bHLHa46或基本螺旋-環-螺旋蛋白46)係25 kDa基本螺旋-環-螺旋(bHLH)蛋白。在人類中，bHLH超家族包括100種以上編碼與稱為E盒之DNA共有序列(5’-CANNTG-3’)處之其他bHLH蛋白結合成二聚體之轉錄因子之基因。自其名稱可明瞭，bHLH蛋白含有兩個螺旋，每一螺旋皆含有基本胺基酸殘基。二聚體之兩個蛋白質亞單元一起構成平行4螺旋束，該平行4螺旋束可定位基本螺旋以容許在蛋白質與E盒處DNA之大溝中之特定核苷酸殘基之間發生相互作用。一些bHLH蛋白(例如E12及E47)表現於許多組織中，且可形成同源二聚體以控制基因表現。其他bHLH蛋白(例如ASCL1)展示更具組織限制性之表現模式且及可能或可能不用作同源二聚體；相反，其通常與I類蛋白質發生異二聚合，由此在其反應基因中傳遞組織特異性基因表現模式。細胞類型特異性bHLH蛋白涉及諸多生物過程，包含(但不限於)神經生成、心臟生成、肌生成及造血作用(PMID: 20219281)。 代表性ASCL1蛋白直向同源物包含(但不限於)人類(NP_004307；SEQ ID NO: 1)、黑猩猩(XP_009424458)、食蟹猴(XP_005572101)、大鼠(NP_032579)及小鼠(NP_032579)蛋白。在人類中，ASCL1基因係由2個跨越染色體12q23.2處之大約3 kBp之外顯子組成。人類ASCL1基因座之轉錄產生編碼236胺基酸蛋白質(NP_004307)之2490核苷酸轉錄物(NM_004316)。尚未報告替代剪接轉錄物或變體蛋白。人類ASCL1 (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列展示於緊接之下文中。 NP_004307.2無剛毛鱗甲同系物1 [智人] MESSAKMESGGAGQQPQPQPQQPFLPPAACFFATAAAAAAAAAAAAAQSAQQQQQQQQQQQQAPQLRPAADGQPSGGGHKSAPKQVKRQRSSSPELMRCKRRLNFSGFGYSLPQQQPAAVARRNERERNRVKLVNLGFATLREHVPNGAANKKMSKVETLRSAVEYIRALQQLLDEHDAVSAAFQAGVLSPTISPNYSNDLNSMAGSPVSSYSSDEGSYDPLSPEEQELLDFTNWF 人類ASCL1在1993年首次鑑別為高度表現於神經內分泌腫瘤(包含小細胞肺癌(SCLC)及髓質甲狀腺癌)中之轉錄因子(PMID: 8390674)。自此以後，對ASCL1功能之研究已揭示其在肌生成(例如PMID: 8662987)及神經生成(綜述於PMID: 25520623中)或作為所需前神經內分泌轉錄因子用於產生肺神經內分泌細胞(PMID: 9126746)、甲狀腺濾泡旁細胞(PMID: 17103415)、腎上腺髓質之嗜鉻細胞(PMID: 12361965)及腺體胃神經內分泌細胞(PMID: 18173746)中之作用。在該等組織中之每一者中，ASCL1用作主導組織特異性基因級聯之主要譜系轉錄因子。 就神經發生中之調控作用而言，發現Ascl1係在一起表現時可在活體內將小鼠胚胎及出生後纖維母細胞再程式化成功能神經元之三種轉錄因子之一(PMID: 20107439)。該等結果再現於人類纖維母細胞(PMID: 21617644)中，且一起指示，細胞或至少某些細胞類型可在其命運上具有極大靈活性。更多最新研究已揭示，bHLH轉錄因子Ascl1、Hes1及Olig2以振盪方式表現於神經祖細胞(NPC)中，此乃因在RNA及蛋白質層面上具有複雜反饋環(PMID: 24179156)。NPC之多能性及增殖性狀態與該等因子之振盪表現相關，而分化狀態與單一因子之持續表現相關(Ascl1與神經元相關，Hes1與星形細胞相關且Olig2與少突膠質細胞相關)。有趣的是，Hes1及Ascl1之振盪彼此不同步，且Hes1之鈍化消除了Ascl1振盪，此與SCLC細胞系中之Notch效應物基因HES1直接抑制ASCL1之先前報導一致(PMID: 9144241；PMID: 11940670)。蛋白質之相對較短振盪週期(2-3 hr)可產生一種蛋白質或另一蛋白質在細胞領域中之特徵性「鹽與胡椒」表現模式，此指示細胞在特定時間點之快照(snapshot)，而非指示定型至分化(PMID: 25520623)。與該等振盪相比，在G1期間NPC中之持續Ascl1表現發生於NPC即將不對稱分裂成子代NPC (此將重新開始Ascl1及Hes1振盪)之前，且Ascl1表現細胞發生神經元分化。轉變成持續表現之決定因素尚不明了，但振盪之週期及幅值變化可與Notch細胞內結構域之量之波動相關。已提出，Ascl I及其他bHLH因子之類似振盪行為可闡釋個體因子在發育中骨髓之離散、交叉抑制結構域中之最終表現(PMID: 24257627；PMID: 15901662)。總而言之，該等研究暗示，端視背景、表現持續時間及絕對表現程度，ASCL1可支持幹性及增殖或細胞命運決定。 在癌症背景中，發現人類ASCL1蛋白與神經內分泌腫瘤有關。使用靶向ASCL1之反義寡核苷酸來證實ASCL1表現與腫瘤中之神經內分泌表型之間的關聯，該等反義寡核苷酸消耗SCLC細胞系中之ASCL1表現，從而同時減小神經內分泌標記物之表現(PMID: 9126746)。其他研究已展示，ASCL1表現與SCLC (PMID: 16322211；PMID: 19176379)及神經內分泌非SCLC (PMID: 25267614)之存活相關。因此，ASCL1可視為譜系成癮癌基因，其在正常發育背景中促進神經或神經內分泌分化(最可能來自多能性前體細胞)，而在正常發育過程之外再活化或失調時，其負責表型可塑性、達成部分地分化或部分多能性狀態及/或具有強神經內分泌特徵之癌性細胞表型。 有趣的是，已展示，ASCL1可作為同源二聚體或作為與bHLH蛋白NEUROG2之二聚體結合Notch信號傳導路徑蛋白DLL3之啟動子(PMID: 19389376)。因此，儘管Notch信號傳導效應蛋白HES1可阻抑ASCL1，但此ASCL1/DLL3相互作用表明，ASCL1本身可誘導Notch信號傳導之負性調控劑之表現。亦已展示，siRNA-調介之ASCL1敲低使得同時減小DLL3 mRNA濃度(PMID: 19176379)。DLL3已知過度表現於許多神經內分泌腫瘤中(US9089615, US9089616)且已顯示可作為用於研發用於治療高級肺神經內分泌腫瘤之抗體-藥物偶聯物之可跟蹤靶(PMID: 26311731；US9107961)。因此，ASCL1表現可為用於神經內分泌腫瘤之有用生物標記。 III.
抗體
本發明提供新穎抗ASCL1抗體及包括新穎抗ASCL1抗體之組合物。本發明之抗ASCL1抗體係如本文所提供之實例中所闡述來產生。本發明之ASCL1抗體可用於本文所提供之任一方法中。圖1A-B提供實例性鼠類抗ASCL1結合或靶向結構域(稱為SC72.2、SC72.28、SC72.52、SC72.63、SC72.76、SC72.91、SC72.94、SC72.96、SC72.132、SC72.165、SC72.181、SC72.201、SC72.216及SC72.93)之注釋胺基酸序列。ASCL1抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區之胺基酸序列亦分別繪示於圖1A及1B中，且由SEQ ID NO: 21-73 (奇數)代表。ASCL1抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區之核苷酸序列繪示於圖1C中，且由SEQ ID NO: 20-72 (偶數)代表。
A. 抗體結構
抗體及其變體及衍生物(包含公認命名及編號系統)已廣泛闡述於(例如) Abbas等人(2010),
Cellular and Molecular Immunology
(第6版), W.B. Saunders Company；或Murphey等人(2011),
Janeway’s Immunobiology
(第8版), Garland Science中。 「抗體」或「完整抗體」通常係指包括藉由共價二硫鍵及非共價相互作用保持在一起之兩個重多肽鏈(H)及兩個輕多肽鏈(L)之Y形四聚體蛋白質。每一輕鏈係由一個可變結構域(VL)及一個恆定結構域(CL)構成。每一重鏈包括一個可變結構域(VH)及恆定區，在IgG、IgA及IgD抗體之情形下其包括三個結構域，稱為CH1、CH2及CH3 (IgM及IgE具有第四結構域CH4)。在IgG、IgA及IgD種類中，CH1與CH2結構域藉由撓性鉸鏈區分開，該撓性鉸鏈區係可變長度(在不同IgG子類中為約10個至約60個胺基酸)之富含脯胺酸及半胱胺酸之區段。輕鏈及重鏈二者中之可變結構域藉由約12個或更多個胺基酸之「J」區接合至恆定結構域，且重鏈亦具有約10個額外胺基酸之「D」區。每一類抗體進一步包括由成對半胱胺酸殘基形成之鏈間及鏈內二硫鍵。 如本文中所使用，術語抗體摂包含多株抗體(polyclonal antibodies、multiclonal antibodies)、單株抗體、嵌合抗體、人類化及靈長化抗體、CDR移植抗體、人類抗體、重組產生之抗體、胞內抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗-遺傳型抗體、合成抗體(包含突變蛋白及其變體)、免疫特異性抗體片段(例如Fd、Fab、F(ab')
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、F(ab')片段)、單鏈片段(例如ScFv及ScFvFc)；及其衍生物，包含Fc融合物及其他修飾，及任何其他免疫反應性分子，只要其展現與決定子優先締合或結合即可。此外，除非藉由上下文約束另外指示，否則該術語進一步包括所有種類之抗體(亦即IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及所有子類(亦即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。對應於不同抗體種類之重鏈恆定結構域通常分別由相應之小寫希臘字母α、δ、ε、γ及μ表示。基於來自任何脊椎動物物種之抗體之恆定結構域之胺基酸序列，可將該等抗體之輕鏈指配為兩種完全不同之類型，稱為卡帕型(κ)及拉姆達型(λ)。 抗體之可變結構域展示抗體之間胺基酸組成之相當變化，且主要負責抗原識別及結合。每一輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點，從而IgG抗體具有兩個結合位點(亦即其為二價)。VH及VL結構域包括三個極端可變區，其稱為超變區，或更通常稱為互補決定區(CDR)，其藉由四個較不可變區(稱為框架區(FR))構架並分開。VH區與VL區之間之非共價締合形成含有抗體之兩個抗原結合位點中之一者之Fv片段(對於可變片段摂)。ScFv片段(對於單鏈可變片段，其可藉由基因改造獲得)以單一多肽鏈形式締合抗體之VH及VL區域且由肽連接體分開。 如本文中所使用，除非另有所述，否則可根據由以下文獻所提供之方案之一來將胺基酸分配至每一結構域、框架區及CDR：Kabat等人(1991)
Sequences of Proteins of Immunological Interest
(第5版), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH公開案第91-3242號；Chothia等人，1987, PMID: 3681981；Chothia等人，1989, PMID: 2687698；MacCallum等人，1996, PMID: 8876650；或Dubel編輯(2007)
Handbook of Therapeutic Antibodies
，第3版，Wily-VCH Verlag GmbH and Co or AbM (Oxford Molecular/MSI Pharmacopia)。如業內所熟知，可變區殘基編號通常係如Chothia或Kabat中所陳述。如自Abysis網站資料庫(見下文)所獲得，包括如由Kabat、Chothia、MacCallum (亦稱為接觸)及AbM定義之CDR之胺基酸殘基闡釋於下文中。應注意，MacCallum使用Chothia編號系統。
表 1
抗體序列中之可變區及CDR可根據業內已研發出之一般規則(如上文所闡釋，例如Kabat編號系統)或藉由比對該等序列與已知可變區之資料庫來鑑別。用於鑑別該等區域之方法闡述於以下文獻中：Kontermann及Dubel編輯，Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001；以及Dinarello等人，Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc.，Hoboken, NJ, 2000。抗體序列之實例性資料庫闡述於以下網站且可經由其存取：「Abysis」 website at www.bioinf.org.uk/abs (由Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, London, England之A.C. Martin維護)及VBASE2網站www.vbase2.org，如Retter等人，Nucl. Acids Res., 33中所闡述(資料庫期號): D671 -D674 (2005)。 較佳使用Abysis資料庫來分析序列，該Abysis資料庫將來自Kabat、IMGT及蛋白質資料庫(PDB)之序列數據與來自PDB之結構數據整合在一起。參見Dr. Andrew C. R. Martin之書之章節
Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains
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Antibody Engineering Lab Manual
(編者：Duebel, S.及Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547，亦可在網站bioinforg.uk/abs上獲得)。Abysis資料庫網站進一步包含經研發用於鑑別可用於本文教示內容中之CDR之一般規則。附圖1D - 1F展示SC72.165、SC72.181及SC72.216抗體之實例性重鏈及輕鏈可變區(VH及VL)之注釋之該分析的結果。除非另外指明，否則本文所述之所有CDR皆系根據Kabat等人根據Abysis數據庫網站衍生而來。 本發明中所論述之鼠類重鏈恆定區胺基酸位置在業內已眾所周知且可易於使用習用基因改造及生物化學技術來衍生、改變或操縱。在分析該等序列時，可採用類似於首次闡述於Edelman等人，1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1): 78-85 (闡述經報導為第一個經測序之人類IgG1之骨髓瘤蛋白Eu之胺基酸序列)中之Eu索引之編號系統。Edelman之Eu指數亦陳述於Kabat等人，1991 (見上文)中。類似地，用於人類輕鏈恆定區胺基酸序列之編號系統陳述於Kabat等人(見上文)中且類似系統可用於本文所揭示之鼠類輕鏈中。 舉例而言，與本發明相容之鼠類κ (SEQ ID NO: 2)及λ (SEQ ID NO: 3)輕鏈恆定區胺基酸序列緊接陳述於下文中： RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC - (SEQ ID NO: 2) GQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQGMETTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRADCS - (SEQ ID NO: 3) 類似地，與本發明相容之實例性IgG1鼠類重鏈恆定區胺基酸序列(SEQ ID NO: 4)緊接陳述於下文中： AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK - SEQ ID NO: 4) 可使用標準分子生物學技術使所揭示恆定區序列或其變化形式或衍生物與所揭示重鏈及輕鏈可變區可操作地締合以提供可由此用於或納入本發明之診斷ADC中之全長抗體。 熟習此項技術者應瞭解，在免疫球蛋白分子中存在兩類二硫橋或鍵：鏈間及鏈內二硫鍵。如業內所熟知，鏈間二硫鍵之位置及數量根據免疫球蛋白之種類及類別而有所變化。儘管本發明不限於任一特定種類或子類之抗體，但出於闡釋性目的IgG1免疫球蛋白應用於本發明通篇中。在野生型IgG1分子中，存在12個鏈內二硫鍵(4個位於每一重鏈上且兩個位於每一輕鏈上)及4個鏈間二硫鍵。鏈內二硫鍵通常經輕微保護且較鏈間鍵相對較不易還原。相反，鏈間二硫鍵位於免疫球蛋白之表面上，易接近溶劑且通常相對易於還原。兩個鏈間二硫鍵存在於重鏈之間且一個鏈間二硫鍵自每一重鏈延伸至其各別輕鏈。已證實，鏈間二硫鍵對於鏈締合併非必不可少。IgG1鉸鏈區在重鏈中含有形成鏈間二硫鍵之半胱胺酸，該等鏈間二硫鍵提供結構支持以及促進Fab移動之撓性。
B. 抗體生成及產生
可使用業內已知之各種方法來產生本發明抗體。
1. 宿主動物中之多株抗體之產生
多種宿主動物中多株抗體之產生為業內所熟知(例如參見Harlow及Lane (編輯) (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press；及Harlow等人(1989) Antibodies, NY, Cold Spring Harbor Press)。為產生多株抗體，使用抗原蛋白或包括抗原蛋白之細胞或製劑對免疫活性動物(例如小鼠、大鼠、兔、山羊、非人類靈長類動物等)實施免疫。一定時間段之後，藉由采血或處死動物來獲得含有多株抗體之血清。血清可以自動物獲得之形式使用或抗體可經部分或完全純化以提供免疫球蛋白部分或經分離之抗體製劑。 就此而言，可自在免疫活性動物中誘導免疫反應之任一ASCL1決定子生成本發明抗體。如本文中所使用，「決定子」或「靶」意指可鑑別與特定細胞、細胞群體或組織締合或特定發現於特定細胞、細胞群體或組織中或其上之任何可檢測性狀、性質、標記物或因子。決定子或靶之性質可為形態的、功能的或生物化學的且較佳係表型的。在較佳實施例中，決定子係由特定細胞類型或由某些條件下之細胞(例如在細胞週期之特定點期間或特定生態位之細胞)差異表現(過度表現或過少表現)之蛋白質。出於本發明目的，決定子較佳在可表現DLL3之異常癌細胞上差異表現，且可包括ASCL1蛋白，或其剪接變體、同種型、同系物或家族成員中之任一者，或其特定結構域、區域或表位。「抗原」、「免疫原性決定子」、「抗原決定子」或「免疫原」意指在引入免疫活性動物中時可刺激免疫反應且由藉由該免疫反應產生之抗體識別的任何ASCL1蛋白或其任何片段、區域或結構域。可使用本文所涵蓋ASCL1 (及/或DLL3)決定子之存在或不存在來鑑別細胞、細胞亞群或組織(例如腫瘤、致瘤細胞或CSC)。 可使用任何形式之抗原或含有該抗原之細胞或製劑來產生特異性用於ASCL1決定子之抗體。所提及術語「抗原」係以廣義使用且可包括所選靶之任何免疫原性片段或決定子，包含單一表位、多表位、單一或多結構域或整個細胞外結構域(ECD)或蛋白質。抗原可為經分離之全長蛋白質、細胞表面蛋白質(例如使用在其表面上表現抗原之至少一部分之細胞實施免疫)或可溶性蛋白質(例如僅使用該蛋白質之ECD部分實施免疫)或蛋白質構築體(例如Fc-抗原)。抗原可在經基因修飾之細胞中產生。上文所提及抗原中之任一者可單獨使用或與一或多種業內已知之免疫原性增強佐劑組合使用。編碼抗原之DNA可為基因組DNA或非基因組DNA (例如cDNA)，且可編碼足以誘發免疫原性反應之ECD之至少一部分。可採用任何載體來轉化表現抗原之細胞，包含(但不限於)腺病毒載體、慢病毒載體、質體及非病毒載體(例如陽離子脂質)。
2. 單株抗體
在所選實施例中，本發明涵蓋單株抗體之用途。如業內所已知，術語「單株抗體」或「mAb」係指自實質上同源之抗體群獲得之抗體，亦即，除可能存在極少量可能突變(例如天然突變)外，構成該群體之個別抗體皆相同。 單株抗體可使用業內已知之眾多種技術來製備，包含雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、轉基因動物(例如XenoMouse
®
)或其一些組合。舉例而言，單株抗體可使用(例如)以下文獻中更詳細闡述之雜交瘤以及生物化學及遺傳改造技術來產生：An, Zhigiang (編輯)
Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic
, John Wiley and Sons，第1版，2009；Shire等人(編輯)
Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing
, Springer Science + Business Media LLC，第1版，2010；Harlow等人，
Antibodies: A Laboratory Manual
, Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988；Hammerling等人，
Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas
563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)。在產生多種特異性結合至決定子之單株抗體後，可基於(例如)對決定子之親和力或內化速率經由多個篩選過程選擇尤其有效之抗體。如本文所闡述產生之抗體可用作「源」抗體且進一步修飾以(例如)改良對靶之親和力，改良其在細胞培養液中之產生，降低活體內免疫原性，產生多特異性構築體等。單株抗體產生及篩選之更詳細闡述陳述於下文及隨附實例中。
3. 衍生抗體
在如上文所闡述生成源抗體、選擇且分離後，可立即將其進一步改變以提供具有改良醫藥特性之抗ASCL1抗體。較佳地，使用已知分子改造技術修飾或改變源抗體以提供具有期望治療性質之衍生抗體。 本發明之所選實施例包括免疫特異性結合至ASCL1且可視為「源」抗體之鼠類單株抗體。在所選實施例中，本發明抗體可自該等「源」抗體經由視情況修飾源抗體之恆定區及/或表位結合胺基酸序列來衍生。在某些實施例中，若經由缺失、突變、取代、整合或組合來改變源抗體之所選胺基酸，則抗體「衍生」自源抗體。在另一實施例中，「衍生」抗體係將源抗體之片段(例如一或多個CDR或整個重鏈及輕鏈可變區)與受體抗體序列組合或納入其中以提供衍生性抗體(例如嵌合或人類化抗體)者。可使用如下文所闡述之標準分子生物技術生成該等「衍生」抗體以(例如)改良對決定子之親和力；改良抗體穩定性；改良細胞培養液中之產量及產率；減小活體內免疫原性；減小毒性；促進活性部分之偶聯；或產生多特異性抗體。該等抗體亦可藉由化學方式或轉譯後修飾來修飾成熟分子(例如醣基化模式或聚乙二醇化)以衍生自源抗體。 在一實施例中，本發明抗體包括衍生自共價接合之至少兩個不同類別或種類之抗體之蛋白質區段之嵌合抗體。術語「嵌合」抗體系指如下構築體：其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來自具體物種或屬具體抗體類別或子類之抗體以及該等抗體之片段的相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與來自另一物種或屬另一抗體類別或子類之抗體以及該等抗體之片段的相應序列一致或同源(U.S. P.N. 4,816,567；Morrison等人，1984, PMID: 6436822)。在一些實施例中，本發明之嵌合抗體可包括可操作地連接至人類輕鏈及重鏈恆定區之所選鼠類重鏈及輕鏈可變區的全部或大部分。在其他選擇實施例中，抗ASCL1抗體可「衍生」自本文所揭示之小鼠抗體。 在其他實施例中，本發明之嵌合抗體係「CDR移植」抗體，其中CDR (如使用Kabat、Chothia、McCallum等所定義)衍生自特定物種或屬特定抗體種類或子類，而抗體之其餘部分主要衍生自來自另一物種或屬另一抗體種類或子類之抗體。對於人類中之應用而言，可將一或多個所選齧齒類動物CDR (例如小鼠CDR)移植至人類受體抗體中，從而代替人類抗體之一或多個天然CDR。該等構築體通常具有以下優點：提供全強度人類抗體功能(例如補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC))，同時減小個體對抗體之不期望免疫反應。在一實施例中，CDR移植抗體將包括一或多個自小鼠獲得之納入人類框架序列中之CDR。 類似於CDR移植抗體者係「人類化」抗體。如本文中所使用，「人類化」抗體係包括一或多個衍生自一或多種非人類抗體(供體或源抗體)之胺基酸序列(例如CDR序列)之人類抗體(受體抗體)。在某些實施例中，可將「回復突變」引入人類化抗體中，其中接受者人類抗體之可變區之一或多個FR之殘基經來自非人類物種供體抗體之相應殘基代替。該等回復突變可幫助維持移植CDR之適當三維構形且由此改良親和力及抗體穩定性。可使用來自多個供體物種之抗體，包含(但不限於)小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物。另外，人類化抗體可包括未在接受者抗體或供體抗體中發現之新殘基以(例如)進一步細化抗體性能。提供與本發明相容之包括來自源抗體之鼠類組分及來自受體抗體之人類組分的CDR移植及人類化抗體，如下文實例中所陳述。 可利用多種業內公認技術來確定使用哪個人類序列作為受體抗體來提供本發明之人類化構築體。確定適於作為受體序列之相容性人類種系序列及方法之編譯揭示於(例如)以下文獻中：Dubel及 Reichert (編輯) (2014)
Handbook of Therapeutic Antibodies
，第2版，Wiley-Blackwell GmbH；Tomlinson, I. A.等人(1992)
J. Mol. Biol
. 227:776-798；Cook, G. P.等人(1995)
Immunol. Today
16: 237-242；Chothia, D.等人(1992)
J. Mol. Biol.
227:799-817；及Tomlinson等人(1995)
EMBO J
14:4628-4638)。V-BASE目錄(VBASE2 - Retter等人，Nucleic Acid Res. 33; 671-674, 2005)提供人類免疫球蛋白可變區序列之全面目錄(經Tomlinson, I. A.等人，MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK編譯)，亦可使用該目錄來鑑別相容性受體序列。另外，舉例而言，U.S.P.N. 6,300,064中所闡述之共有人類框架序列亦可證實為相容性受體序列且可根據本發明之教示內容使用。一般而言，基於與鼠類來源框架序列之同源性以及源及受體抗體之CDR規範結構之分析選擇人類框架受體序列。然後可使用業內公認技術合成衍生抗體之重鏈及輕鏈可變區之衍生序列。 舉例而言，CDR移植及人類化抗體以及相關方法闡述於U.S.P.N. 6,180,370及5,693,762中。關於其他細節參見(例如) Jones等人，1986, (PMID: 3713831)；以及U.S.P.N. 6,982,321及7,087,409。 CDR移植或人類化抗體可變區與人類受體可變區之序列一致性或同源性可如本文所論述來測定，且在如此量測時，將較佳共有至少60%或65%序列一致性，更佳至少70%、75%、80%、85%或90%序列一致性，甚至更佳至少93%、95%、98%或99%序列一致性。較佳地，不同殘基位置因保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」係一個胺基酸殘基由另一個具有側鏈(R基團)有類似化學性質(例如電荷或疏水性)之胺基酸殘基取代者。一般而言，保守胺基酸取代將不實質上改變蛋白質之功能性質。若兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同，則可向上調節序列一致性百分比或類似性程度以校正取代之保守性質。 應瞭解，附圖1A及1B中所提供之註釋CDRs及框架序列係根據Kabat等人使用專有Abysis資料庫來定義。然而，如本文所論述及圖1D-1F中所示，熟習此項技術者可輕易地根據Chothia等人、ABM或MacCallum等人以及Kabat等人所提供之定義來鑑別CDRs。因此，包括一或多個根據上文所提及系統中任一者衍生之CDR之抗ASCL1人類化抗體明確保持在本發明範圍內。
4. 恆定區修飾及改變之醣基化
本發明之所選實施例亦可包括恆定區(亦即Fc區)之取代或修飾，包含(但不限於)胺基酸殘基取代、突變及/或修飾，其產生具有包含(但不限於)以下特徵之化合物：改變之藥物動力學、增加之血清半衰期、增加之結合親和力、減小之免疫原性、增加之產生、改變之Fc配體結合至Fc受體(FcR)、增強或減小之ADCC或CDC、改變之醣基化及/或二硫鍵及修飾之結合特異性。 例如，可經由改變涉及Fc域與Fc受體(例如FcγRI、FcγRIIA及B、FcγRIII及FcRn)之間相互作用之胺基酸殘基來生成具有改良Fc效應功能的化合物，此可導致增加之細胞毒性及/或改變之藥物動力學，諸如增加之血清半衰期(參見例如Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34 (1994)；及de Haas等人，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)。 在所選實施例中，可藉由修飾(例如取代、缺失或添加)鑑別為涉及Fc結構域與FcRn受體間之相互作用之胺基酸殘基來生成具有增加之活體內半衰期的抗體(例如參見國際公開案第WO 97/34631號；第WO 04/029207號；U.S.P.N. 6,737,056及U.S.P.N. 2003/0190311)。就該等實施例而言，Fc變體可在哺乳動物、較佳地人類中提供以下半衰期：大於5天、大於10天、大於15天、較佳地大於20天、大於25天、大於30天、大於35天、大於40天、大於45天、大於2個月、大於3個月、大於4個月或大於5個月。增加之半衰期產生較高血清效價，此由此減小抗體之投與頻率及/或減小擬投與抗體之濃度。可(例如)在轉基因小鼠或表現人類FcRn之經轉染人類細胞系中或在投與具有變體Fc區之多肽之靈長類動物中分析人類活體內FcRn結合及人類FcRn高親和力結合多肽的血清半衰期。WO 2000/42072闡述具有改良或減弱之FcRn結合之抗體變體。亦參見(例如) Shields等人，J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)。令人吃驚地，在除用於提供可選位點特異性偶聯物之修飾外並無任何抗體恆定區修飾下，某些本發明ADC展現延長之終末半衰期(例如約兩週)。
5. 片段
根據本文之教示內容，無論選擇哪種形式之抗體(例如嵌合、人類化等)來實踐本發明，應瞭解，可使用其免疫反應性片段(自身或作為抗體藥物偶聯物之一部分)。「抗體片段」包括完整抗體之至少一部分。如本文中所使用，術語抗體分子之「片段」包含抗體之抗原結合片段，且術語「抗原結合片段」係指免疫球蛋白或抗體中免疫特異性結合所選抗原或其免疫原性決定子或與其反應或與衍生片段之完整抗體競爭特異性抗原結合之多肽片段。 實例性位點特異性片段包含：可變輕鏈片段(VL)、可變重鏈片段(VH)、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、單一結構域抗體片段、雙價抗體、線性抗體、單鏈抗體分子及自抗體片段形成之多特異性抗體。另外，活性位點特異性片段包括抗體中保留其與抗原/受質或受體相互作用之能力且以類似於完整抗體之方式進行修飾(但可具有略小之效率)之部分。可進一步改造該等抗體片段以包括如本文所闡述之一或多個游離半胱胺酸。 在其他實施例中，抗體片段係包括Fc區且保留正常地與存在於完整抗體中之Fc區相關之生物學功能中之至少一者(例如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補體結合)者。在一實施例中，抗體片段係活體內半衰期實質上與完整抗體類似之單價抗體。舉例而言，此一抗體片段可包括連接至能夠賦予片段活體內穩定性之包括至少一個游離半胱胺酸之Fc序列之抗原結合臂。 如熟習此項技術者所充分認識到，片段可藉由分子改造或經由完整或完全抗體或抗體鏈之化學或酶促處理(例如木瓜酶或胃蛋白酶)或藉由重組方式來獲得。關於抗體片段之更詳細描述，例如參見Fundamental Immunology, W. E. Paul編輯，Raven Press, N.Y. (1999)。
6. 抗體之重組產生
可使用自抗體產生細胞獲得之基因材料及重組技術來產生或修飾抗體及其片段(例如參見；Dubel及Reichert (編輯) (2014)
Handbook of Therapeutic Antibodies
，第2版，Wiley-Blackwell GmbH；Sambrook及Russell (編輯) (2000)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(第3版), NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel等人(2002)
Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology
, Wiley, John & Sons, Inc.；及U.S.P.N. 7,709,611)。 本發明之另一態樣系關於編碼本發明抗體之核酸分子。該等核酸可存在於完整細胞中，存在於細胞溶解物中，或以部分純化或實質上純淨之形式存在。核酸係在藉由標準技術(包含鹼性/SDS處理、CsCl分級、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及業內所熟知之其他技術)與其他細胞組分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)分離時「經分離」或使其實質上純。本發明核酸可為(例如) DNA (例如基因體DNA、cDNA)、RNA及其人工變體(例如肽核酸)，而不論係單鏈抑或雙鏈DNA、RNA且可或可不含有內含子。在所選實施例中，核酸係cDNA分子。 本發明核酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於由雜交瘤(例如如下文實例中所闡述製備之雜交瘤)表現之抗體，可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術獲得編碼抗體之輕鏈及重鏈之cDNA。對於自免疫球蛋白基因文庫(例如使用噬菌體顯示技術)獲得之抗體，可自文庫回收編碼抗體之核酸。 編碼VH及VL區段之DNA片段可藉由標準重組DNA技術進一步操縱以(例如)將可變區基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在該等操縱中，編碼VL或VH之DNA片段操作性連接至編碼另一蛋白質或蛋白質片段之另一DNA片段，例如抗體恆定區或撓性連接體。如在此上下文中所使用，術語「操作性連接」意指，接合兩個DNA片段，從而由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保留在框內。 可藉由將編碼VH之DNA操作性連接至編碼鼠類或人類重鏈恆定區(在IgG1情形下，CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子，將編碼VH區之經分離DNA轉化成全長重鏈基因。業內已知人類及鼠類重鏈恆定區基因之序列且可藉由標準PCR擴增獲得涵蓋該等區域之DNA片段。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳係IgG1或IgG4恆定區。實例性IgG1恆定區陳述於SEQ ID NO: 4中。對於Fab片段重鏈基因而言，編碼VH之DNA操作性連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。 可藉由將編碼VL之DNA操作性連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子，將編碼VL區之經分離DNA轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。鼠類及人類輕鏈恆定區基因之序列為業內已知，且涵蓋該等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，但最佳係κ恆定區。實例性相容κ及λ輕鏈恆定區陳述於SEQ ID NOS: 2及3中。 本文涵蓋展現與本發明多肽之「序列一致性」、「序列相似性」或「序列同源性」之某些多肽(例如抗原或抗體)。舉例而言，所衍生人類化抗體VH或VL結構域可與源(例如鼠類)或受體(例如人類) VH或VL結構域展現序列類似性。「同源」多肽可展現65%、70%、75%、80%、85%或90%之序列一致性。在其他實施例中，「同源」多肽可展現93%、95%或98%之序列一致性。如本文中所使用，兩個胺基酸序列之間之同源性%等效於兩個序列之間之一致性%。考慮為達成兩個序列最佳比對而需要引入之間隙數及各間隙長度，兩個序列之間之一致性百分比隨該等序列共有之一致位置數而變化(亦即同源性% = 一致位置數/總位置數乘以100)。兩條序列之間之序列對比及一致性%測定可使用數學演算法來完成，如下文非限制性實例中所闡述。 兩個胺基酸序列之間之一致性%可使用已納入ALIGN程式(2.0版)中之E. Meyers及W. Miller之演算法(
Comput. Appl. Biosci.,
4:11-17 (1988))、使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4來測定。另外，兩個胺基酸序列之間之一致性%可使用已納入GCG軟體包(在www.gcg.com上獲得)中之GAP程式中之Needleman及Wunsch (
J. Mol. Biol.
48:444-453 (1970))演算法、使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣及空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來測定。 另外或或者，本發明之蛋白質序列可進一步用作「詢問序列」來實施針對公共資料庫之檢索以(例如)鑑別相關序列。該等檢索可使用Altschul等人(1990)
J. Mol. Biol.
215:403-10之XBLAST程式(2.0版)來實施。BLAST蛋白質檢索可使用XBLAST程式、評分=50、字長=3來實施以獲得與本發明之抗體分子同源之胺基酸序列。為獲得空位比對以用於對比目的，可如Altschul等人(1997)
Nucleic Acids Res.
25(17):3389-3402中所闡述使用空位BLAST。在使用BLAST及空位BLAST程式時，可使用各別程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。 不一致之殘基位置可因保守胺基酸取代或不保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」係胺基酸殘基經具有相似化學性質(例如電荷或疏水性)之側鏈之另一胺基酸殘基取代者。一般而言，保守胺基酸取代將不實質上改變蛋白質之功能性質。倘若兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同，則可向上調節序列一致性百分比或類似性程度以校正取代之保守性質。倘若使用不保守胺基酸取代，則在實施例中，展現序列一致性之多肽將保留本發明多肽(例如抗體)之期望功能或活性。 本文亦涵蓋展現與本發明核酸之「序列一致性」、「序列相似性」或「序列同源性」之核酸。「同源序列」意指展現至少約65%、70%、75%、80%、85%或90%序列一致性之核酸分子序列。在其他實施例中，核酸之「同源序列」可展現與參考核酸93%、95%或98%之序列一致性。 本發明亦提供包括該等上述核酸之載體，該等載體可可操作地連接至啟動子(例如參見 WO 86/05807；WO 89/01036；及U.S.P.N. 5,122,464)；及真核分泌路徑之其他轉錄調控及處理控制元件。本發明亦提供具有彼等載體及宿主表現系統之宿主細胞。 如本文中所使用，術語「宿主表現系統」包含可經改造以生成本發明之核酸或多肽及抗體之任一類型細胞系統。該等宿主表現系統包含(但不限於)使用重組細菌噬菌體DNA或質體DNA轉變或轉染之微生物(例如大腸桿菌(
E. coli
)或枯草芽胞桿菌(
B. subtilis)
)；使用重組酵母表現載體轉染之酵母(例如酵母菌屬(
Saccharomyces
))；或具有含有衍生自哺乳動物細胞或病毒之基因體之啟動子(例如腺病毒晚期啟動子)之重組表現構築體的哺乳動物細胞(例如COS、CHO-S、HEK293T、3T3細胞)。可使用兩種表現載體(例如編碼重鏈源多肽之第一載體及編碼輕鏈源多肽之第二載體)共轉染宿主細胞。 轉變哺乳動物細胞之方法在業內已眾所周知。例如參見U.S.P.N. 4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455。亦可改造宿主細胞以容許產生具有各種特性之抗原結合分子(例如具有GnTIII活性之經修飾糖型或蛋白質)。 對於重組蛋白之長期、高產率產生而言，穩定表現係較佳的。因此，可使用業內公認之標準技術來改造穩定表現所選抗體之細胞系且形成本發明之一部分。不使用含有複製之病毒源之表現載體，可使用藉由適當表現控制元件(例如啟動子或增強子序列、轉錄終止子、多聚腺苷酸化位點等)控制之DNA及可選標記物來轉變宿主細胞。可使用業內熟知之任一選擇系統，包含麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)，其提供用於在所選條件下增強表現之有效方式。結合EP 0 216 846、EP 0 256 055、EP 0 323 997及EP 0 338 841及U.S.P.N. 5,591,639及5,879,936完全或部分地論述GS系統。用於研發穩定細胞系之另一相容表現系統系Freedom
™
CHO-S套組(Life Technologies)。 在藉由重組表現或任一其他所揭示技術產生本發明抗體後，可立即藉由業內已知方法加以純化或分離，其中予以鑑別且自其天然環境分離及/或回收並與干擾抗體或相關ADC之診斷或治療應用之污染物分離。所分離抗體包含重組細胞內之原位抗體。 可使用各種業內公認技術(例如離子交換及粒徑篩析層析、透析、滲濾及親和力層析、尤其蛋白質A或蛋白質G親和力層析)來純化該等所分離製劑。相容方法更全面地論述於下文實例中。
7. 產生後選擇
無論如何獲得，皆可選擇、選殖並進一步篩選抗體產生細胞(例如雜交瘤、酵母菌落等)之期望特性，包含(例如)穩健生長、高抗體產生及期望抗體特性(例如對所關注抗原之高親和力)。雜交瘤可在細胞培養液中進行活體外擴增或在同基因免疫受損動物中進行活體內擴增。選擇、選殖及擴增雜交瘤及/或菌落之方法為熟習此項技術者已知。在鑑別出期望抗體後，可立即使用常用業內公認分子生物學及生物化學技術分離、操縱及表現相關基因材料。 由原始文庫(天然或合成)產生之抗體可具有中等親和力(K
a
約為10
6
M
-1
至10
7
M
-1
)。為增強親和力，可藉由構築抗體文庫(例如藉由使用易錯聚合酶在活體外引入隨機突變)及自彼等二級文庫重新選擇對抗原具有高親和力之抗體(例如藉由使用噬菌體或酵母顯示)在活體外模擬親和力成熟。WO 9607754闡述在免疫球蛋白輕鏈CDR中誘導誘變以產生輕鏈基因文庫之方法。 可使用各種技術來選擇抗體，包含(但不限於)噬菌體或酵母顯示，其中在噬菌體或酵母上合成人類組合抗體或scFv片段之文庫，使用所關注抗原或其抗體結合部分篩選該文庫，並自可獲得抗體或免疫反應性片段者分離結合該抗原之噬菌體或酵母(Vaughan等人，1996, PMID: 9630891；Sheets等人，1998, PMID: 9600934；Boder等人，1997, PMID: 9181578；Pepper等人，2008, PMID: 18336206)。用於產生噬菌體或酵母顯示文庫之套組市面有售。業內亦存在可用於產生及篩選抗體顯示文庫之其他方法及試劑(參見U.S.P.N. 5,223,409；WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；及Barbas等人，1991, PMID: 1896445)。該等技術有利地允許篩選大量候選抗體且提供序列之相對較容易之操縱(例如藉由重組改組)。
8. 抗體特性
在某些實施例中，可選擇、選殖並進一步篩選抗體產生細胞(例如雜交瘤或酵母菌落)之有利性質，包含(例如)穩健生長、高抗體產生及穩定性、減小之免疫原性。在其他情形下，可藉由選擇用於接種動物之特定抗原(例如特異性ASCL1同種型)或靶抗原之免疫反應性片段來賦予抗體之特性。在其他實施例中，所選抗體可如上文所闡述經改造以增強或精修諸如親和力或藥物動力學等免疫化學特性。
8.1 . 結合親和力
本文揭示對ASCL1具有高結合親和力之抗體。術語「K
D
」係指特定抗體-抗原相互作用之解離常數或表觀親和力。本發明抗體在解離常數K
D
(k
解離
/k
締合
) ≤ 10
-7
M時可免疫特異性結合其靶抗原。抗體在K
D
≤ 5×10
-9
M時以高親和力特異性結合抗原，且在K
D
≤ 5×10
-10
M時以極高親和力特異性結合抗原。在本發明之一實施例中，抗體具有≤ 10
-9
M之K
D
及約1×10
-4
/sec之解離速率。在本發明之一實施例中，解離速率＜ 1×10
-5
/sec。在本發明之其他實施例中，抗體以介於約10
-7
M與10
-10
M之間之K
D
結合至決定子，且在又一實施例中，其以≤ 2×10
-10
M之K
D
結合至決定子。本發明之其他所選實施例包括K
D
(k
解離
/k
締合
)小於10
-6
M、小於5×10
-6
M、小於10
-7
M、小於5×10
-7
M、小於10
-8
M、小於5×10
-8
M、小於10
-9
M、小於5×10
-9
M、小於10
-10
M、小於5×10
-10
M、小於10
-11
M、小於5×10
-11
M、小於10
-12
M、小於5×10
-12
M、小於10
-13
M、小於5×10
-13
M、小於10
-14
M、小於5×10
-14
M、小於10
-15
M或小於5×10
-15
M之抗體。 在某些實施例中，免疫特異性結合至ASCL1之本發明抗體可具有至少10
5
M
-l
s
-l
、至少2×10
5
M
-l
s
-l
、至少5×10
5
M
-l
s
-l
、至少10
6
M
-l
s
-l
、至少5×10
6
M
-l
s
-l
、至少10
7
M
-l
s
-l
、至少5×10
7
M
-l
s
-l
或至少10
8
M
-l
s
-l
之締合速率常數或
k 締合
(或
ka
)
速率(抗體+抗原(Ag)
k 締合
←抗體-Ag)。 在另一實施例中，免疫特異性結合至ASCL1之本發明抗體可具有小於l0
-l
s
- l
、小於5×l0
-l
s
- l
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或小於l0
-10
s
- l
之解離速率常數或
k 解離
(或
kd
)
速率(抗體+抗原(Ag)
k 解離
←抗體-Ag)。 結合親和力可使用業內已知之各種技術來測定，例如表面電漿共振、生物層干涉術、雙極化干涉術、靜態光散射、動態光散射、等溫滴定量熱、ELISA、分析超速離心及流式細胞術。
8.2. 分倉及表位定位
可針對所締合之離散表位來表徵本文所揭示之抗體。「表位」係決定子中為抗體或免疫反應性片段所特異性結合之部分。可基於結合親和力(如上所述)或藉由抗體對蛋白質及/或大分子之複雜混合物中之其靶抗原之優先識別(例如在競爭分析中)來證實及定義免疫特異性結合。「線性表位」係藉由抗原中容許免疫特異性結合抗體之鄰接胺基酸所形成。即使在抗原變性時，通常亦維持優先結合線性表位之能力。相反，「構象表位」通常包括抗原胺基酸序列中之非鄰接胺基酸，但在抗原之二級、三級或四級結構之背景中，該等非鄰接胺基酸足以近似為同時由單一抗體結合。在具有構象表位之抗原發生變性時，抗體通常不再識別抗原。表位(鄰接或非鄰接)通常包含至少3個及更通常至少5個或8-10個或12-20個呈獨特空間構象之胺基酸。 亦可針對本發明抗體所屬之組或「倉」來對其進行表徵。「分倉」係指使用競爭性抗體結合分析來鑑別不能同時結合免疫原性決定子之抗體對，由此鑑別「競爭」結合之抗體。可藉由所測試抗體或免疫學功能片段防止或抑制參考抗體至公用抗原之特異性結合之分析來測定競爭抗體。通常，此一分析涉及結合至固體表面或細胞、未經標記之測試抗體及經標記參考抗體之經純化抗原(例如DLL3、ASCL1或結構域或其片段)之使用。藉由測定在測試抗體存在下結合至固體表面或細胞之標記之量來量測競爭性抑制。關於測定競爭性結合之方法之其他細節提供於本文實例中。通常，在存在過量競爭性抗體時，其將抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%之參考抗體與公用抗原之特異性結合。在一些情況下，抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多之結合。相反，在結合參考抗體時，其較佳將抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%之隨後添加之測試抗體(亦即DLL3抗體或ASCL1抗體)之結合。在一些情況下，抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多之測試抗體之結合。 通常，分倉或競爭性結合可使用各種業內公認技術來測定，例如免疫分析，例如西方印漬(western blot)、放射性免疫分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、「夾心」免疫分析、免疫沈澱分析、沈澱素反應、凝膠擴散沈澱素反應、免疫擴散分析、凝集分析、補體固定分析、免疫放射量測定分析、螢光免疫分析及蛋白質A免疫分析。該等免疫分析係常規的且為業內所熟知(參見Ausubel等人編輯(1994)
Current Protocols in Molecular Biology
，第1卷，John Wiley & Son, Inc., New York)。另外，可使用交叉阻斷分析(例如參見WO 2003/48731；及Harlow等人(1988)
Antibodies, A Laboratory Manual
, Cold Spring Harbor Laboratory， Harlow及David Lane編輯)。 用於測定競爭性抑制(且因此「倉」)之其他技術包含：表面電漿共振，其使用(例如) BIAcore™ 2000系統(GE Healthcare)；生物層干涉術，其使用(例如) ForteBio
®
Octet RED (ForteBio)；或流式細胞術珠粒陣列，其使用(例如) FACSCanto II (BD Biosciences)或多倍體LUMINEX™檢測分析(Luminex)。 Luminex係使得能夠進行大規模多倍體抗體配對之基於珠粒之免疫分析平臺。該分析比較抗體對與靶抗原之同時結合模式。該對之一種抗體(捕獲mAb)結合至Luminex珠粒，其中每一捕獲mAb結合至不同顏色之珠粒。另一抗體(檢測mAb)結合至螢光信號(例如藻紅素(PE))。該分析分析抗體與抗原之同時結合(配對)且將具有相似配對特徵之抗體分組在一起。檢測mAb及捕獲mAb之類似特徵指示，兩種抗體結合至相同或密切相關之表位。在一實施例中，可使用皮爾森相關係數(Pearson correlation coefficient)測定配對特徵以鑑別與所測試抗體組中之任一特定抗體最密切相關之抗體。在實施例中，若抗體對之皮爾森相關係數為至少0.9，則測試/檢測mAb經測定與參考/捕獲mAb在同一倉中。在其他實施例中，皮爾森相關係數為至少0.8、0.85、0.87或0.89。在其他實施例中，皮爾森相關係數為至少0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1。分析自Luminex分析獲得之數據之其他方法闡述於U.S.P.N. 8,568,992中。Luminex分析100種不同類型之珠粒(或更多)之能力同時提供幾乎無限之抗原及/或抗體表面，從而在抗體表位剖析中產生與生物感測器分析相比經改良之通量及解析度(Miller等人，2011, PMID: 21223970)。 包括表面電漿共振之類似分倉技術與本發明相容。如本文中所使用，「表面電漿共振」係指容許藉由檢測生物感測器基質內蛋白質濃度之變化分析實時特異性相互作用之光學現象。使用市售設備(例如BIAcore™ 2000系統)，可易於測定所選抗體是否彼此競爭結合至所定義抗原。 在其他實施例中，可用於測定測試抗體是否與參考抗體「競爭」結合之技術係「生物層干涉術」，其係一種分析自以下兩個表面反射之白光之干涉圖案的光學分析技術：生物感測器尖端上之固定蛋白質層及內部參考層。結合至生物感測器尖端之分子之任何數量變化使得可實時量測之干涉圖案發生移位。該等生物層干涉術分析可使用ForteBio
®
Octet RED機器如下實施。將參考抗體(Ab1)捕獲至抗小鼠捕獲晶片上，然後使用高濃度之非結合抗體封阻晶片且收集基線。然後藉由特異性抗體(Ab1)捕獲單體重組靶蛋白，且將尖端浸泡至含有與對照相同之抗體(Ab1)之孔中或浸泡至含有不同測試抗體(Ab2)之孔中。若如藉由比較與對照Ab1之結合量所測定未發生進一步結合，則Ab1及Ab2經測定為「競爭性」抗體。若使用Ab2觀察到額外結合，則Ab1及Ab2經測定不彼此競爭。可擴大此過程以使用96孔板中代表獨特倉之一整列抗體篩選獨特抗體之大文庫。在實施例中，若參考抗體抑制至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%之測試抗體與公用抗原之特異性結合，則測試抗體將與參考抗體競爭。在其他實施例中，將抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多之結合。 在定義涵蓋一組競爭性抗體之倉後，可立即實施進一步表徵以確定抗原上抗體組所結合之特異性結構域或表位。可使用Cochran等人，2004, PMID: 15099763所闡述方案之修改來實施結構域層級表位定位。精細表位定位係確定抗原上包括抗體所結合之決定子表位之特定胺基酸的過程。 在某些實施例中，可使用噬菌體或酵母顯示來實施精細表位定位。其他相容表位定位技術包含丙胺酸掃描突變體、肽印漬(Reineke, 2004, PMID: 14970513)或肽裂解分析。另外，可採用諸如表位切除、表位提取及抗原化學修飾等方法(Tomer, 2000, PMID: 10752610)，其使用：酶，例如蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、內蛋白酶Glu-C、內蛋白酶Asp-N胰、凝乳蛋白酶等)；化學試劑，例如琥珀醯亞胺基酯及其衍生物、含有一級胺之化合物、肼及碳醯肼、游離胺基酸等。在另一實施例中，可使用修飾輔助剖析(亦稱為基於抗原結構之抗體剖析(ASAP))根據每一抗體至經化學或酶促修飾之抗原表面的結合特徵之相似性來分類針對同一抗原之大量單株抗體(U.S.P.N. 2004/0101920)。 在確定抗原上之期望表位後，可立即(例如)藉由使用本文所闡述之技術使用包括所選表位之肽實施免疫來產生針對該表位之其他抗體。
Ⅳ . 診斷
本發明提供檢測、診斷或監測增殖性病症之活體外及活體內方法及自患者篩選細胞以鑑別腫瘤細胞(包含致瘤細胞)之方法。該等方法包含鑑別患有用於治療之癌症之個體或監測癌症進展，包括使患者或自患者獲得之試樣(活體內或活體外)與能夠特異性識別ASCL1決定子且與其締合之檢測劑(例如抗體或核酸探針)接觸且檢測試樣中檢測劑之存在或不存在或締合程度。在所選實施例中，檢測劑包括與如本文所闡述之可檢測標記或報告基因分子締合之抗體。在某些其他實施例中，投與ASCL1抗體且使用二級經標記抗體(例如抗鼠類抗體)進行檢測。在其他實施例(例如原位雜交或ISH)中，將使用與基因組ASCL1決定子反應之核酸探針來檢測、診斷或監測增殖性病症。本發明之抗ASCL1抗體另外可用於預後、診斷及治療診斷腫瘤(例如處於轉變成神經內分泌表型之風險下之腺癌)。 本發明另外提供用於以下之方法：選擇具有ASCL1
+
腫瘤之患者以用於基於ASCL1之一或多種下游靶(例如DLL3)來投與預防性及治療性干預，且提供用於在腫瘤進展至其變得抵抗靶向癌症療法之階段之前預防或治療腫瘤之個性化方案。在某些實施例中，本發明提供使用抗體組合物(例如抗DLL3抗體或抗DLL3抗體藥物偶聯物(ADC))靶向ASCL1下游靶(例如DLL3)以用於預防或治療腺癌處於轉變成神經內分泌表型之風險下之方法。
A. 診斷方法
本發明之抗ASCL1抗體組合物可用於檢測、診斷或監測增殖性病症之活體外、離體及活體內方法中及自患者篩選細胞以鑑別腫瘤細胞(包含致瘤細胞)之方法中。該等方法包含鑑別患有用於治療或監測癌症之進展或形態轉變之癌症之個體。代表性方法包含以下步驟：(a)使抗ASCL1抗體與自個體獲得之腫瘤試樣接觸；及(b)檢測結合至腫瘤試樣之ASCL1抗體。可用於本發明中之抗體包含繪示於圖1A - 1B中者及該等抗體之如上文所闡述之變體。如業內所熟知，可在腫瘤試樣中藉助結合至抗體之可檢測標記或藉由使用二級及/或三級抗體放大信號來檢測ASCL1抗體。 更通常而言，ASCL1決定子之存在及/或量可使用熟習此項技術者可獲得之諸多技術中之任一者來量測用於蛋白質或核酸分析，該等技術為(例如)直接物理量測(例如質譜)、結合分析(例如免疫分析、凝集分析及免疫層析分析)、聚合酶鏈反應(PCR、RT-PCR；RT-qPCR)技術、分枝寡核苷酸技術、北方印漬(Northern blot)技術、寡核苷酸雜交技術及原位雜交技術。該方法亦可包括量測源自化學反應之信號，例如吸光度之變化、螢光之變化、化學發光或電化學發光之產生、反射率、折射率或光散射之變化、可檢測標記自表面之累積或釋放、氧化或還原或氧化還原物質、電流或電位、磁場之變化等。適宜檢測技術可經由標記之光致發光(例如經由量測螢光、時間解析螢光、衰減波螢光、上轉換磷光體、多光子螢光等)、化學發光、電化學發光、光散射、吸光度、放射性、磁場、酶活性(例如經由引起吸光度或螢光之變化或引起化學發光發射之酶反應來量測酶活性)量測該等標記以量測經標記結合試劑之參與來檢測結合事件。或者，可使用無需使用標記之檢測技術，例如基於量測質量(例如表面聲波量測)、折射率(例如表面電漿共振量測)或分析物之固有發光之技術。 在一些實施例中，檢測劑與試樣中之特定細胞或細胞組分之締合指示該試樣可含有致瘤細胞，由此表示可使用如本文所闡述之抗體或ADC有效地治療患有癌症之個體。 在某些較佳實施例中，分析可包括免疫組織化學(IHC)分析或其變體(例如螢光ABC、發色ABC、標準ABC、標準LSAB等)、免疫細胞化學或其變體(例如直接、間接、螢光、發色等)。 就此而言，本發明之某些態樣包括使用經標記ASCL1用於免疫組織化學(IHC)。更特定而言，可使用ASCL1 IHC作為診斷工具來幫助診斷各種增殖性疾病及監測對治療(例如DLL3抗體療法)之潛在反應。可對已經化學固定(相容技術包含(但不限於)：甲醛、戊二醛、四氧化鋨、重鉻酸鉀、乙酸、醇、鋅鹽、氯化汞、四氧化鉻及苦味酸)及包埋(相容方法包含(但不限於)：乙二醇甲基丙烯酸酯、石蠟及樹脂)或經由冷凍保藏之組織實施相容診斷分析。該等分析可用於指導治療決策及確定投藥方案及時刻。 可使用免疫組織化學技術且使用所揭示ASCL1抗體來推導如業內已知之H評分。簡言之，觀察(較佳地藉由明場顯微術)腫瘤切片且記下經切片腫瘤上之ASCL1表現以推導H評分。藉由以下式獲得H評分：3 ×強染色細胞核百分比+ 2 ×中等染色細胞核百分比+弱染色 細胞核百分比，從而得到0至300之範圍。 可使用該等ASCL1 H評分來指示哪些患者可適於使用適宜組合物(例如抗DLL3 ADC)進行治療。300點量表上大約90、大約100、大約110、大約120、大約130、大約140、大約150、大約160、大約170、大約180、大約190或大約200或更高之ASCL1 H評分可在所選實施例中指示哪些患者可對本發明治療方法(例如使用DLL3 ADC及/或化學治療劑)具有有益反應。舉例而言，在某些實施例中，擬使用DLL3 ADC治療之患者在300點量表上具有至少90之ASCL1 H評分(亦即，腫瘤係ASCL1
+
)。在其他實施例中，擬使用如本發明中所陳述DLL3 ADC治療之患者具有至少120之ASCL1 H評分。在其他實施例中，擬使用本發明DLL3 ADC治療之患者具有至少180之ASCL1 H評分。出於本發明目的，任一在300點量表上展現90或更高之ASCL1 H評分之腫瘤可視為ASCL1
+
且使用任一可用於治療神經內分泌腫瘤之已知療法(包含靶向ASCL1之轉錄靶)實施治療，如下文進一步所闡述。 在其他所選實施例中，亦可使用包括200點量表之H評分來選擇或診斷可對如本文所揭示之治療具有反應之患者。在該等200 H評分量表中，120之H評分大約等效於300 H評分量表上180之H評分。在兩種情形(例如120/200或180/300)下，該等H評分可歸類為ASCL1
+
(亦即，其皆大於300點量表上90之H評分及/或≥ 10%之組分細胞表現DLL3)且指示可對本發明治療方法具有有益反應之患者。 在其他實施例中，患者選擇可基於在腫瘤試樣中量測之陽性染色ASCL1細胞百分比。就此而言，在使用抗ASCL1抗體探詢時於IHC試樣中展現某一陽性染色細胞百分比之患者將視為ASCL1
+
且選擇用於根據本文之教示內容進行治療。在該等實施例中，在量測為陽性細胞百分比時，展現大於10%、大於20%、大於30%、大於40%或大於50%陽性細胞染色之腫瘤試樣可歸類為ASCL1
+
。在其他實施例中，在量測為陽性百分比時，展現大於60%、大於70%、大於80%、大於90%或大於95%陽性細胞染色之腫瘤試樣可歸類為ASCL1
+
。在某些較佳態樣中，在量測為陽性百分比時，ASCL1
+
腫瘤在≥ 50%之組分細胞中表現ASCL1。在前述實施例中之每一者中，患有ASCL1
+
腫瘤之患者可使用如本文所陳述之DLL3 ADC進行治療。 在其他實施例中，患者選擇可基於具有某一強度之ASCL1陽性細胞染色之百分比。舉例而言，＞20%細胞展現2+強度或更大強度之腫瘤係用於使用DLL3 ADC進行治療之候選者。在其他實施例中，若在使用ASCL1抗體染色且根據如本文所揭示之標準IHC方案進行檢驗時≥ 20%、≥ 30%、≥ 40%、≥ 50%、≥ 60%、≥ 70%或≥ 80%之腫瘤細胞展現1+強度或更大強度，則患者係使用DLL3 ADC或其他化學治療劑進行治療之候選者。在其他某些實施例中，若在使用ASCL1抗體染色且根據如本文所揭示之標準IHC方案進行檢驗時≥ 20%、≥ 30%、≥ 40%、≥ 50%、≥ 60%、≥ 70%或≥ 80%之腫瘤細胞展現2+強度或更大強度，則患者係使用DLL3 ADC或其他化學治療劑進行治療之候選者。在其他所選實施例中，若在使用ASCL1抗體染色且根據如本文所揭示之標準IHC方案進行檢驗時≥ 10%、≥ 20%、≥ 30%、≥ 40%或≥ 50%之腫瘤細胞展現1+強度或更大強度，則患者係使用DLL3 ADC或其他化學治療劑進行治療之候選者。在其他實施例中，若在使用ASCL1抗體染色且根據如本文所揭示之標準IHC方案進行檢驗時≥ 10%、≥ 20%、≥ 30%、≥ 40%或≥ 50%之腫瘤細胞展現2+強度或更大強度，則患者係使用DLL3 ADC或其他化學治療劑進行治療之候選者。又一實施例包括治療具有包括如下腫瘤細胞之腫瘤之個體之方法：其中在使用ASCL1抗體染色且根據標準IHC方案進行檢驗時≥ 10%之腫瘤細胞展現1+強度或更大強度，該方法包括投與抗DLL3 ADC之步驟。就上文所提及之每一實施例而言，應瞭解，可易於使用熟習此項技術者所熟知之標準病理學技術及方法來測定使用ASCL1抗體之染色強度。 在本發明之其他實施例中，可使用流式細胞術(包括螢光抗體染色)來量測ASCL1決定子之表現。在使用該等技術時，腫瘤細胞可基於ASCL1濃度定義為展現正、低及負螢光信號。具有陰性表現(亦即「FMO
-
」)之細胞可定義為表現小於或等於在螢光通道中在標記其他螢光發射通道中之其他所關注蛋白質之完全抗體染色混合劑存在下利用同種型對照抗體所觀察到表現之95%的彼等細胞。熟習此項技術者應瞭解，用於定義陰性事件之此程序稱為「螢光減一對照」或「FMO對照」染色。表現大於使用上述FMO染色程序利用同型對照抗體所觀察到表現之95%之細胞可在本文中定義為「陽性」 (亦即「FMO
+
」)。如本文中所定義，存在各種廣泛定義為「陽性」之細胞群體，包含可定義為FMO
+
者。若抗原之所觀察到之平均表現大於如上文所闡述使用FMO染色利用同型對照抗體測定的95%，則細胞定義為FMO
+
。若所觀察到之平均表現大於藉由FMO染色測定之95%且在95%之一個標准偏差內，則陽性細胞可稱為具有低表現(亦即「FMO-低」)之細胞。或者，若所觀察到之平均表現大於藉由FMO染色測定之95%且大於95%以上之一個標准偏差，則陽性細胞可稱為具有高表現(亦即「FMO-hi」)之細胞。在其他實施例中，99%可較佳地用作陰性FMO染色與陽性FMO染色之間之區別點。與對照試樣相比，對於特定標記物為FMO
+
之試樣(例如ASCL1
+
)對標記物具有可檢測表現程度。對特定標記物為陽性之腫瘤可在一或多種細胞中具有可檢測濃度之標記物。 本發明之其他尤其相容之態樣涉及使用原位雜交來檢測或監測ASCL1決定子。原位雜交技術或ISH為熟習此項技術者所熟知。簡言之，將細胞固定且將含有特定核苷酸序列之可檢測探針添加至經固定細胞中。若該等細胞含有互補核苷酸序列，則可檢測到之探針將與其雜交。可使用本文所陳述之序列資訊設計探針來鑑別表現基因型ASCL1決定子之細胞。探針較佳與對應於該等決定子之核苷酸序列雜交。雜交條件可以常規方式最佳化以藉由不完全互補雜交使背景信號最小化，但較佳地探針較佳與所選ASCL1決定子完全互補。在所選實施例中，探針經附接至可容易地藉由標準螢光方法檢測之探針之螢光染料標記。 相容活體內治療診斷劑或診斷分析可包含業內公認之成像或監測技術，例如磁共振成像、電腦化斷層掃描(例如CAT掃描)、正電子斷層掃描(例如PET掃描)、放射線攝影、超音波等，如熟習此項技術者將已知。 在某些實施例中，本發明抗體可用於檢測及量化特定決定子(例如ASCL1蛋白)在患者試樣(例如血漿或血液)中之含量，此可繼而用於使用檢測、診斷或監測與相關決定子有關之增殖性病症。在相關實施例中，本發明抗體可用於檢測、監測及/或量化活體內或活體外循環腫瘤細胞(WO 2012/0128801)。在其他實施例中，循環腫瘤細胞可包含腫瘤生成細胞。 在另一實施例中，本發明提供分析活體內癌症進展及/或發病機制之方法。在另一實施例中，癌症進展及/或發病機制之活體內分析包括測定腫瘤進展程度。在另一實施例中，分析包括鑑別腫瘤。在另一實施例中，針對原發性腫瘤來分析腫瘤進展。在另一實施例中，端視如熟習此項技術者已知之癌症類型，隨時間實施分析。在另一實施例中，在活體內進一步分析源自原發性腫瘤之轉移細胞之繼發性腫瘤。在另一實施例中，分析繼發性腫瘤之大小及形狀。在一些實施例中，進一步實施離體分析。 在另一實施例中，本發明提供分析活體內癌症進展及/或發病機制之方法，其包含測定細胞轉移或檢測及量化循環腫瘤細胞之含量。在又一實施例中，細胞轉移分析包括測定在與原發性腫瘤不連續之位點處細胞之進展性生長。在一些實施例中，可實施程序以監測經由血管、淋巴管、在體腔內或其組合擴散之腫瘤細胞。在另一實施例中，針對細胞遷移、擴散、外滲、增殖或其組合實施細胞轉移分析。 在某些實例中，可在療法之前使用所揭示抗體來評價或表徵個體或來自個體之試樣中之致瘤細胞以確立基線或選擇患者。在其他實例中，試樣係衍生自經治療個體。在一些實例中，在個體開始或終止治療之後至少約1天、2天、4天、6天、7天、8天、10天、12天、14天、15天、16天、18天、20天、30天、60天、90天、6個月、9個月、12個月或＞12個月自個體獲取試樣。在某些實例中，在某一數量之劑量之後(例如在2、5、10、20、30或更多個療法劑量之後)評價或表徵致瘤細胞。在其他實例中，在接受一或多個療法之後，於1週、2週、1個月、2個月、1年、2年、3年、4年或更長時間之後表徵或評價致瘤細胞。
B. 適應症
本發明之組合物及方法可用於鑑別、檢測或診斷表現ASCL1及潛在下游治療靶(例如DLL3)之增殖性病症(例如癌症)。該等檢測及診斷將有助於病症之分類及病因分析且可指示某些可尤其有效地治療患者之治療組合物(例如DLL3 ADC)。較佳地，擬治療之「個體」或「患者」係人類，但本文所用之該等術語明確包括任何哺乳動物物種。 在某些態樣中，增殖性病症包括實體腫瘤，包含(但不限於)腎上腺腫瘤、肝腫瘤、腎腫瘤、膀胱腫瘤、乳房腫瘤、胃腫瘤、卵巢腫瘤、子宮頸腫瘤、子宮腫瘤、食管腫瘤、結腸直腸腫瘤、前列腺腫瘤、胰臟腫瘤、肺腫瘤(小細胞及非小細胞)、甲狀腺腫瘤、癌瘤、肉瘤、神經膠母細胞瘤及各種頭頸腫瘤。在其他較佳實施例中，所揭示ASCL1抗體尤其有效地診斷已治療胰臟癌及(在所選態樣中)肺腺癌之患者。在某些實施例中，肺癌對於蒽環及/或紫杉烷(taxane) (例如多西他賽(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他賽(larotaxel)或卡巴他賽(cabazitaxel))係難治性、復發性或抵抗性。在本發明之其他態樣中，所揭示抗體可用於指示哪些患者尤其適於髓質甲狀腺癌、大細胞神經內分泌癌瘤(LCNEC)、神經膠母細胞瘤、神經內分泌前列腺癌(NEPC)、高級胃腸胰臟癌(GEP)及惡性黑素瘤之DLL3 ADC治療。在其他較佳實施例中，所揭示抗體可用於指示可使用DLL3 ADC治療膀胱癌之患者。 實例性增殖性病症包含(但不限於)腎上腺瘤、AIDS相關癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌(鱗狀細胞癌瘤及移行細胞癌瘤)、骨癌(牙釉質瘤、動脈瘤樣骨囊腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦及脊髓癌症、轉移性腦瘤、乳癌、頸動脈體瘤、子宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色性腎細胞癌瘤、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、良性皮膚纖維組織細胞瘤、結締組織增生性小圓細胞腫瘤、室管膜瘤、尤恩氏腫瘤(Ewing's tumor)、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維生成不良、骨纖維發育不良、膽囊及膽管癌、妊娠滋養細胞疾病、生殖細胞瘤、腺病、頭頸癌、胰島細胞瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、腎癌(腎胚細胞瘤、乳頭狀腎細胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤性腫瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤性腫瘤、肝癌(肝母細胞瘤、肝細胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小細胞癌、腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌瘤等)、髓母細胞瘤、黑素瘤、腦脊髓膜瘤、多發性內分泌贅瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、神經胚細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳頭狀甲狀腺癌瘤、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、外周神經鞘膜瘤、嗜鉻細胞瘤、腦下垂體瘤、前列腺癌、後代眼色素層黑素瘤、罕見血液病、腎轉移癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌瘤、胸腺瘤、甲狀腺轉移癌及子宮癌(子宮頸癌、子宮內膜癌瘤及平滑肌瘤)。 在某些實施例中，增殖性病症包括小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC) (例如鱗狀細胞非小細胞肺癌或鱗狀細胞小細胞肺癌)。在某些實施例中，肺癌對基於鉑之藥劑(例如卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、托泊替康(topotecan))及/或紫杉烷(例如多西他賽、太平洋紫杉醇、拉洛他賽或卡巴他賽)係難治性、復發性或抵抗性。在某些實施例中，增殖性病症係侷限期疾病。在其他實施例中，增殖性病症係擴散期疾病。在其他實施例中，增殖性病症係難治性(亦即在初始療法進程期間或在完成初始療法進程之後不久復發)。在其他實施例中，增殖性病症發生於敏感患者(亦即在初步療法之後長於2-3個月復發者)。在上文所提及之每一實例中，可在使用本發明ASCL1抗體檢測、分類或診斷癌症後使用DLL3 ADCs治療個體。 在某些實施例中，增殖性病症包括具有神經內分泌特徵或表型之腫瘤，包含神經內分泌腫瘤。源自分散內分泌系統之真實或典型神經內分泌腫瘤(NETs)相對稀少，且發生率為每100,000人中有2-5例，但具有高度攻擊性。神經內分泌腫瘤發生於腎、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸及子宮內膜)、胃腸道(結腸、胃)、甲狀腺(髓質甲狀腺癌)及肺(小細胞肺癌及大細胞神經內分泌癌)中。該等腫瘤可分泌若干激素，包含血清素及/或染色顆粒素(chromogranin) A，可引起稱為類癌症候群之衰弱症狀。該等腫瘤可藉由陽性免疫組織化學標記物(例如神經元特異性烯醇酶(NSE，亦稱為γ烯醇酶，基因符號= ENO2)、CD56 (或NCAM1)、染色顆粒素A (CHGA)及突觸素(synaptophysin)(SYP))或藉由已知展現升高表現(例如ASCL1)之基因來指示。不幸地，傳統化學療法在治療NETs中已非特別有效且肝轉移係常見結果。 假神經內分泌腫瘤(pNETs)在基因型上或在表型上模擬、類似或展現典型神經內分泌腫瘤之共同特質。假神經內分泌腫瘤或具有神經內分泌特徵之腫瘤係源自瀰漫性神經內分泌系統之細胞或源自神經內分泌分化級聯在致癌過程期間已經異常再活化之細胞之腫瘤。該等pNET通常共有傳統定義之神經內分泌腫瘤之某些表型或生物化學特徵，包含能夠產生生物活性胺、神經傳遞質及肽激素之子集。在組織學上，該等腫瘤(NET及pNET)共有共同外觀，通常展示密集連結之小細胞，其具有極少輕微細胞病理學細胞質及圓形至橢圓形斑點狀細胞核。因此，如本文中所用，所提及神經內分泌腫瘤亦包含假神經內分泌腫瘤。 亦可使用抗ASCL1抗體組合物來檢測或診斷處於轉變成神經內分泌表型之風險下之腫瘤。因此，可使用抗ASCL1抗體組合物來診斷出現於以下部分中之腺癌：肺、前列腺、膀胱、腎、泌尿生殖道，包含膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸及子宮內膜；胃腸道，包含結腸及胃；甲狀腺，包含髓質甲狀腺癌；及肺，包含小細胞肺癌瘤及大細胞神經內分泌癌瘤。同樣，在每一情形下，可在診斷或分類病症後使用靶向療法(例如DLL3 ADC)治療患者。 亦可使用抗ASCL1抗體組合物來檢測或診斷已經受或正經受靶向療法之個體中處於神經內分泌轉變之風險下之腫瘤，或用於選擇經受靶向療法之個體。在一些實施例中，可使用抗ASCL1抗體來診斷抵抗靶向療法之腫瘤。因此，可使用抗ASCL1抗體來診斷EGFR抑制劑抗性肺癌或閹割抗性前列腺癌。 因此，本發明之抗ASCL1抗體組合物可有益地用於診斷假神經內分泌腫瘤及典型神經內分泌腫瘤。就此而言，可使用如本文所闡述之抗ASCL1抗體組合物來診斷出現於腎、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸及子宮內膜)胃腸道(結腸、胃)、甲狀腺(髓質甲狀腺癌)及肺(小細胞肺癌瘤及大細胞神經內分泌癌瘤)中之神經內分泌腫瘤(NET及pNET)。基於本文之教示內容，可期望使用DLL3 ADC治療該等ASCL1陽性患者，即使該等患者腫瘤在使用標準診斷技術測試時並非明顯為DLL3陽性。
C. 製品
在某些實施例中，本發明係關於一種包裝物件，其包括一或多個包括本發明之任一抗ASCL1抗體組合物之容器或貯器(例如製品，例如分析及/或診斷套組)以及視情況之標記及/或使用說明書。該等標記包含成分、量或劑量及/或適應症。該等說明書包含引導或促進(包含通告)使用該製品。在某些其他實施例中，包裝物件含有可檢測量之抗ASCL1抗體(含有或不含相關報告基因分子)及視情況一或多種用於檢測、量化及/或觀察癌性細胞之其他試劑。本發明所涵蓋之套組亦可含有適當試劑以組合本發明抗體與診斷劑或治療劑(例如參見U.S.P.N. 7,422,739)。 在一或多種液體溶液中提供套組之組分時，液體溶液可為非水性，但水溶液通常較佳，且無菌水溶液尤佳。套組之調配物亦可以可在添加適宜液體時經重構之乾燥粉末或凍乾形式提供。用於重構之液體可含於單獨容器中。該等液體可包括無菌、醫藥上可接受之緩衝劑或其他稀釋劑，例如加抑菌劑注射用水、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。在該套組包括本發明之抗體與其他診斷標記物或藥劑之組合時，溶液可以等莫耳組合或以一種組分超過另一種組分之方式預混合。或者，本發明抗體及任一可選診斷劑或其他試劑可在使用之前分開保持於不同容器內。 在某些較佳實施例中，包括本發明組合物之上文所提及之套組包括指示套組內容物可用於治療、預防、檢測、預後及/或診斷癌症之標記、標記物、包裝插頁、條碼及/或讀本。在其他較佳實施例中，套組可包括指示套組內容物可根據某一方案或計劃投與以診斷患有癌症之個體之標記、標記物、包裝插頁、條碼及/或讀本。在一尤佳態樣中，標記、標記物、包裝插頁、條碼及/或讀本指示，套組內容物可用於治療、預防、檢測、預後及/或診斷血液學惡性腫瘤(例如AML)或提供用於診斷其之方案或計劃。在其他尤佳態樣中，標記、標記物、包裝插頁、條碼及/或讀本指示，套組內容物可用於治療、預防、檢測、預後及/或診斷肺癌(例如腺癌)。 適宜容器包含(例如)瓶、小瓶、注射器等。該等容器可自多種材料(例如玻璃或醫藥上相容之塑膠)形成。在某些實施例中，該(等)容器可包括無菌入口孔(舉例而言，容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。 在一些實施例中，該套組可含有分配抗體及任何可選組分之構件，例如一或多個針或注射器(預填充或空的)、滴管、移液管或可將調配物注射或引入檢測表面(例如載玻片或微量滴定板)上或注射或引入至用於收集腫瘤試樣之個體中或施加至身體之患病區域之其他此類裝置。本發明套組通常亦將包含在商業規模用封閉限制器中含有小瓶或諸如此類及其他組分之構件，例如放置且保留期望小瓶及其他裝置之吹模塑膠容器。 在某些實施例中，本發明係關於製造包括本文所闡述之本發明任一抗ASCL1抗體組合物之製品之方法，其包括包裝組合物以獲得製品且指導、引導或促進使用該製品以用於本文所闡述之任一用途中。該指導、引導或促進包含通告。 在某些實施例中，可使用任何分析(包含含有本發明之抗ASCL1抗體組合物之診斷套組或任一製品)作為搭配診斷。 在其他實施例中，本發明之抗ASCL1抗體組合物可結合可用於預防或治療增殖性病症之診斷或治療組合物及/或器件來使用或包括該等診斷或治療組合物及/或器件。舉例而言，在較佳實施例中，本發明之化合物及組合物可與可用於檢測、監測、量化或描述涉及增殖性病症之病因或表現 之細胞或標記物化合物之某些診斷器件或儀器組合。在某些其他實施例中，標記物化合物可包括NSE、CD56、突觸素、染色顆粒素A及PGP9.5。 在其他實施例中，可使用組合物及/或器件在活體內或在活體外檢測、監測及/或量化循環腫瘤細胞(例如參見WO 2012/0128801，其以引用方式併入本文中)。在其他較佳實施例中且如上文所論述，循環腫瘤細胞可包括癌症幹細胞。
D. 患者選擇
在其他情況下，使用業內公認之程序(例如免疫組織化學(IHC)或RT-PCR)實施活體外診斷方法。如本文所闡述，ASCL1係控制DLL3表現之轉錄因子且係神經內分泌轉變之早期標記物。在某些實施例中，本發明包括基於使用本發明之抗ASCL1抗體組合物作出之診斷來選擇用於抗癌療法之個體之方法。因此，較佳實施例包括藉由檢測腫瘤試樣中之ASCL1表現來選擇用於使用抗DLL3抗體藥物偶聯物進行治療之個體之方法。此一方法可包括(a)使抗ASCL1抗體與自個體獲得之腫瘤試樣接觸；(b)檢測結合至腫瘤試樣之ASCL1抗體；及(c)選擇具有(例如)使用抗DLL3抗體藥物偶聯物(ADC)進行適當治療之ASCL1
+
腫瘤試樣之個體。可用於本發明中之代表性抗體包含繪示於圖1A - 1B中者及如上文所闡述之該等抗體之變體。如業內所熟知，可在腫瘤試樣中藉助結合至抗體或以其他方式與抗體締合之可檢測標記或藉由使用二級及/或三級抗體放大信號來檢測ASCL1抗體。 用於ASCL1陽性患者之適當治療包含業內已知之任一癌症治療，尤其係已知有效治療神經內分泌病症者。代表性抗癌劑包含(但不限於)細胞毒性劑(或細胞毒素)、細胞生長抑制藥劑、抗血管生成劑、減積劑、化學治療劑、放射治療劑、靶向抗癌劑、生物反應改良劑、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、抗轉移劑及免疫治療劑。 可用於靶向療法中之實例性抗癌劑或細胞毒素(包含其同系物及衍生物)包括1-去氫睪甾酮(1-dehydrotestosterone)、安麯黴素(anthramycin)、放線菌素D (actinomycin D)、博來黴素(bleomycin)、卡奇黴素(包含n-乙醯基卡奇黴素)、秋水仙鹼(colchicin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、細胞鬆弛素B (cytochalasin B)、更生黴素(dactinomycin) (舊稱放線菌素)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、多卡米星(duocarmycin)、吐根素(emetine)、表柔比星(epirubicin)、溴乙錠(ethidium bromide)、依託泊苷(etoposide)、糖皮質激素、短桿菌素D (gramicidin D)、利多卡因(lidocaine)、類美登素(例如DM-1及DM-4 (Immunogen))、光輝黴素(mithramycin)、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、普魯卡因(procaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)、替尼泊苷(tenoposide)、四卡因(tetracaine)及上述任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。 其他相容靶向療法包括多拉斯他汀(dolastatin)及奧裡斯他汀(auristatin) (包含單甲基奧裡斯他汀E (MMAE)及單甲基奧裡斯他汀F (MMAF) (Seattle Genetics))、瓢菌素(例如α-瓢菌素、β-瓢菌素、γ-瓢菌素或ε-瓢菌素(Heidelberg Pharma))、DNA小溝結合劑(例如多卡米星衍生物(Syntarga))、烷基化劑(例如改質或二聚體吡咯并苯并二氮呯(PBD)、氮芥(mechlorethamine)、塞替派(thioepa)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine) (BCNU)、洛莫司汀(lomustine) (CCNU)、環磷醯胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順式二氯二胺鉑(II) (DDP)順鉑(cisplatin))、剪接抑制劑(例如米亞黴素(meayamycin)類似物或衍生物(例如FR901464，如U.S.P.N. 7,825,267中所陳述))、管式結合劑(例如埃博黴素(epothilone)類似物及微管溶素(tubulysin))、太平洋紫杉醇及DNA損害劑(例如卡奇黴素及埃斯培拉黴素(esperamicin))、抗代謝物(例如胺甲喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)及5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine))、抗有絲分裂劑(例如長春鹼(vinblastine)及長春新鹼(vincristine))及蒽環黴素(anthracycline) (例如柔紅黴素(daunorubicin) (舊稱道諾黴素(daunomycin))及多柔比星(doxorubicin))及上述任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。 在其他實施例中，可結合本文之教示內容使用之ADC可包括細胞毒素(包括使用適當連接體偶聯之治療性放射性同位素)。可與該等實施例相容之實例性放射性同位素包含(但不限於)碘(
131
I、
125
I、
123
I、
121
I)、碳(
14
C)、銅(
62
Cu、
64
Cu、
67
Cu)、硫(
35
S)、鐳(
223
R)、氚(
3
H)、銦(
115
In、
113
In、
112
In、
111
In)、鉍(
212
Bi、
213
Bi)、鍀(
99
Tc)、鉈(
201
Ti)、鎵(
68
Ga、
67
Ga)、鈀(
103
Pd)、鉬(
99
Mo)、氙(
133
Xe)、氟(
18
F)、
153
Sm、
177
Lu、
159
Gd、
149
Pm、
140
La、
175
Yb、
166
Ho、
90
Y、
47
Sc、
186
Re、
188
Re、
142
Pr、
105
Rh、
97
Ru、
68
Ge、
57
Co、
65
Zn、
85
Sr、
32
P、
153
Gd、
169
Yb、
51
Cr、
54
Mn、
75
Se、
113
Sn、
117
Sn、
225
Ac、
76
Br及
211
At。其他放射性核素亦可用作診斷劑及治療劑，尤其在60 keV至4,000 keV之能量範圍內者。 在本發明之其他態樣中，適宜療法包括含有與前述抗癌劑中之任一者偶聯或以其他方式締合之靶向抗體之抗體藥物偶聯物。
V. 雜項
除非本文另有定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所理解之含義。另外，除非上下文另有需要，否則單數術語應包含複數形式且複數術語應包含單數形式。另外，本說明書及隨附申請專利範圍中所提供之範圍包含兩個終點及該等終點之間之所有點。因此，2.0至3.0之範圍包含2.0、3.0及2.0與3.0之間之所有點。 通常，本文所闡述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及化學之技術為業內所熟知且常用之彼等。本文結合該等技術使用之術語亦為業內所常用。除非另外指示，否則本發明之方法及技術通常係根據業內所熟知且如本說明書通篇所引用之多個參考文獻中所闡述之習用方法來實施。
VI. 參考文獻
無論片語「以引用方式併入」是否用於特定參考文獻中，本文所引用之所有專利、專利申請案及公開案以及可以電子方式獲得之材料的完整揭示內容(包含(例如) GenBank及RefSeq中之(例如)核苷酸序列提交，及(例如) SwissProt、PIR、PRF、PDB中之胺基酸序列提交，及GenBank及RefSeq中之注釋編碼區之轉譯)皆以引用方式併入本文中。前述詳細闡述及隨附實例係僅出於清楚理解之目的給出。自此應理解無不必要限制。本發明並不限於所展示及闡述之確切細節。熟習此項技術者所明瞭之變化形式包含於由申請專利範圍所定義之本發明中。本文所用之任何章節標題僅出於組織目的，且不應理解為限制所述標的物方法。
實例
藉由參照下列實例將更容易地理解上文由此通常闡述之本發明，該等實例係以說明方式提供且並不意欲對本發明加以限制。該等實例並不意欲表示下文實驗係所實施之所有實驗或唯一實驗。除非另外指示，否則份數係重量份數，分子量係重量平均分子量，溫度以℃表示，且壓力為大氣壓力或接近大氣壓力。
實例 1 重組 ASCL1 融合蛋白之選殖及表現以及過度表現 ASCL1 蛋白之細胞系之改造 編碼人類 ASCL1 及 ASCL2 蛋白質之 DNA 片段。
為生成本發明中涉及人類ASCL1 (hASCL1)蛋白(基因庫登錄號NP_004307)之某些材料，使用標準分子技術將編碼ASCL1 mRNA (基因庫登錄號NM_004316, nts 572-1282)之開放閱讀框之合成DNA片段亞選殖至CMV驅動之表現載體中，該開放閱讀框與IgK信號肽序列同框且在其下游並在9-組胺酸標籤或人類IgG2 Fc cDNA上游。該等CMV驅動之表現載體允許HEK-293T及/或CHO-S細胞中之高瞬時表現程度。利用該等表現構築體使用聚乙烯亞胺聚合物作為轉染試劑來轉染HEK-293T細胞之懸浮液或黏附培養液或CHO-S細胞懸浮液。在轉染之後3至5天，使用AKTA explorer及Nickel-EDTA (Qiagen)或MabSelect SuRe
™
蛋白質A (GE Healthcare Life Sciences)管柱自澄清細胞上清液分別純化加His標籤或加Fc標籤之重組蛋白。以類似方式使用編碼ASCL2 mRNA (基因庫登錄號NM_005170, nts 621-1202)之開放閱讀框之合成DNA片段來產生重組ASCL2蛋白。 在其他情況下，在原核系統(例如大腸桿菌)中如下所述來產生ASCL1蛋白之片段。在大腸桿菌表現載體(pET-Duet1)中在N-末端麩胱甘肽S-轉移酶標籤之下游且與其同框亞選殖針對大腸桿菌表現經密碼子最佳化且編碼ASCL1殘基H79至D178 (基因庫登錄號NM_004316, nts 809-1105，包括ASCL1 bHLH結構域之蛋白質序列)之合成DNA片段。將衍生物pET-Duet1構築體轉變至BL21細胞中，使用IPTG誘導重組蛋白之表現，且自包涵體純化GST-ASCL1融合蛋白且使用標準分子技術再摺疊。 為產生編碼hASCL1蛋白之慢病毒載體質體，將編碼hASCL1開放閱讀框之合成DNA框內亞選殖至慢病毒表現載體pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP (System Biosciences, Mountain View CA)之多選殖位點(MCS)處，該慢病毒表現載體先前已經修飾以在多選殖位點(MCS)之上游引入編碼DDDK表位標籤之核苷酸序列。MCS下游之T2A序列促進肽鍵縮合之核糖體跳躍，從而獲得以下兩種獨立蛋白質之表現：高含量表現編碼於T2A肽上游之加DDDK標籤細胞表面蛋白且共表現編碼於T2A肽下游之GFP標記物蛋白。此選殖步驟產生慢病毒載體質體pLMEGPA-hASCL1-NFlag。
細胞系改造
使用上述pLMEGPA-hASCL1-NFlag慢病毒載體構築過度表現hASCL1蛋白之經改造細胞系以使用熟習此項技術者熟知之標準慢病毒轉導技術轉導HEK-293T細胞系。使用高表現HEK-293T亞純系之螢光活化細胞分選(FACS)來選擇hASCL1陽性細胞(例如對GFP為強陽性之細胞，其用作用於在細胞中高細胞內表現ASCL1之代用品)。
實例 2 鼠類 ASCL1 抗體之生成
在如下兩個免疫化活動中產生抗ASCL1鼠類抗體。對於第一活動而言，向來自菌株Balb/c、CD-1及FVB之小鼠接種10 µg經等體積TiterMax®佐劑乳化之 hASCL1-Fc。在初始接種後，每週兩次持續4週向小鼠注射10 µg經等體積之明礬佐劑加上CpG乳化之hASCL1蛋白。 將小鼠殺死，且解剖引流淋巴結(膕、鼠蹊及髂骨肌)並將其用作抗體產生細胞之來源。產生B細胞之單細胞懸浮液且藉由電細胞融合使用BTX Hybrimmune系統模型(BTX Harvard裝置)使(122.5×10
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個細胞)與非分泌SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞(ATCC編號CRL-1581)以1:1之比率融合。將細胞再懸浮於由補充有氮雜絲胺酸、15%胎兒純系I血清(Thermo編號SH30080-03)、10% BM condimed (Roche編號10663573001)、1 mM非必需胺基酸(Corning編號25-025-CI)、1 mM HEPES (Corning編號25-060-CI)、100 IU青黴素(penicillin)-鏈黴素(streptomycin) (Corning編號30-002-CI)、100 IU L-麩醯胺酸(Corning編號25-005-CI)之DMEM培養基組成之雜交瘤選擇培養基中且培養於三個含有100 mL選擇培養基之T225燒瓶中。將燒瓶於含有7% CO2及95%空氣之37℃加濕培育器中放置6天。 在融合之後第6天，將雜交瘤文庫細胞暫時冷凍。將細胞在雜交瘤選擇培養基中解凍且容使其在加濕37℃培育器中靜置1天。自燒瓶分選細胞且以一個細胞/孔平鋪(使用BD FACSAria I細胞分選儀)於12 Falcon 384孔板之90 μL經補充雜交瘤選擇培養基(如上所述)中。將剩餘不用之雜交瘤文庫細胞冷凍於液氮中以供將來文庫測試及篩選。 將雜交瘤培養10天且藉由ELISA針對對hASCL1具有特異性但不與家族成員hASCL2交叉反應之抗體使用下列方法來篩選來自12 × 384種純系之上清液。使用經純化hASCL1-Fc或hASCL2-Fc以0.5 μg/mL在PBS緩衝液中塗覆板且在4℃下培育過夜。然後使用PBST洗滌板且使用含有5% FBS之PBS在37℃下阻斷30 min。去除阻斷溶液且向孔中添加15 μl PBST。添加25 μl雜交瘤上清液且在4℃下培育過夜。在使用PBST洗滌之後，在室溫下添加30 μL/孔HRP標記之山羊抗小鼠IgG (以1:10,000稀釋於PBSA中)30 min.。洗滌板且藉由在室溫下添加25 μL/孔之TMB受質溶液(Thermo Scientific)大約5 min.來進行顯影。添加等體積之0.2 M H
2
SO
4
以停止受質顯影。然後藉由分光光度計在OD 450下來分析試樣。OD 450大於ASCL1板上之背景3倍以上之上清液可視為正反應性，而OD 450亦大於ASCL2板上之背景3倍以上之任一純系則因交叉反應性而放棄。來自hASCL1-Fc免疫化活動之該等12 × 384種純系之篩選得到特異性結合至hASCL1但不結合至相關家族成員ASCL2之諸多抗體，其中之80種純系用於進一步表徵。 類似於第一免疫化活動來實施第二免疫化活動，且進行下列修改：1)藉由電細胞融合使用BTX Hybrimmune系統模型(BTX Harvard裝置)使299×10
6
個細胞)與非分泌SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞(ATCC編號CRL-1581)以1:1之比率融合。在第6天，在融合之後，並不冷凍雜交瘤細胞且在此日分選。在培養10天之後，藉由ELISA選擇針對對hASCL1-GST (麩胱甘肽S-轉移酶)為陽性之抗體篩選6 × 384種純系且針對加GST標籤之不相關蛋白質進行計數器篩選。作為此過程之一部分，使用磷酸酶標記之山羊抗小鼠IgG (以1:5000稀釋於PBSA中)代替HRP標記之山羊抗小鼠IgG (以1:10:000稀釋)。在OD405下而非OD450下分析ELISA試樣。 為證實ELISA漿液(soup)篩選之結果，在來自所選純系之純化抗體上運行類似ELISA。然後測定ELISA正比率(定義為針對hASCL1之ELISA染色除以針對不相關蛋白質之ELISA染色)且以欄標記「ELISA正比率」陳述於圖3中。 應瞭解，圖3中之欄中所陳述之ELISA正比率值指示抗體與所選靶免疫特異性締合。因此，此數據與來自雜交瘤篩選之數據之組合指示，第二hASCL1免疫化活動亦得到與hASCL1具有反應性之諸多鼠類抗體。
實例 3 ASCL1 抗體之測序
基於前述內容，選擇諸多以極高親和力結合固定人類ASCL1或h293-hASCL1細胞之不同實例性單株抗體用於測序及進一步分析。來自實例2中生成之所選單株抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區之序列分析證實，許多抗體具有新穎互補決定區且通常顯示新穎VDJ配置。 如下文所闡述對實例2中所生成之抗ASCL1小鼠抗體進行測序。根據製造商說明書使用RNeasy Miniprep套組(Qiagen)自所選雜交瘤細胞純化總RNA。對每個試樣使用10
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至10
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個細胞。將經分離RNA試樣儲存在-80℃下直至使用。 使用包括86個經設計以靶向完整小鼠VH譜之小鼠特定前導序列引子之兩種5’引子混合物與特異性針對所有小鼠Ig同型之3'小鼠Cγ引子的組合來擴增每一雜交瘤之Ig重鏈之可變區。類似地，使用含有64個經設計以擴增Vκ小鼠家族中之每一者之5' Vκ前導序列之兩種引子混合物與特異性針對小鼠κ恆定區之單一後置引子的組合來擴增κ輕鏈並測序。自100 ng總RNA使用Qiagen One Step RT-PCR套組如下所述來擴增VH及VL轉錄物。對每一雜交瘤運行總共四次RT-PCR反應，對Vκ輕鏈運行兩次且對VH重鏈運行兩次。PCR反應混合物包含1.5 μL RNA、0.4 μL 100 μM重鏈或κ輕鏈引子(由Integrated DNA Technologies定製合成)、5 μL 5× RT-PCR緩衝液、1 μL dNTP及0.6 μL含有逆轉錄酶及DNA聚合酶之酶混合物。熱循環儀程式為RT步驟50℃ 60 min.、95℃ 15 min.，隨後35個循環(94.5℃ 30秒、57℃ 30秒、72℃ 1 min.)。然後最後在72℃下培育10 min。 使用與如上文針對可變區之擴增所闡述相同之特異性可變區引子來對所提取PCR產物進行測序。將PCR產物發送至進行PCR純化及測序服務之外部測序供應商(MCLAB)。使用可在鑑別為http://www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html之網站處在線獲得之IMGT序列分析工具分析核苷酸序列以鑑別具有最高序列同源性之種系V、D及J基因成員。藉由使用專有抗體序列資料庫比對VH及VL基因與小鼠種系資料庫來將衍生序列與Ig V-及J-區之已知種系DNA序列進行比較。 圖1A繪示來自抗ASCL1抗體之新穎鼠類輕鏈可變區之鄰接胺基酸序列，而圖1B繪示來自相同抗ASCL1抗體之新穎鼠類重鏈可變區之鄰接胺基酸序列。總而言之，鼠類輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列提供於SEQ ID NO: 21 -73 (奇數)中。 更特定而言，圖1A及1B提供鼠類抗ASCL1抗體之包括以下之注釋序列：(1) SEQ ID NO: 21之輕鏈可變區(VL)及SEQ ID NO: 23之重鏈可變區(VH)；或(2) SEQ ID NO: 25之VL及SEQ ID NO: 27之VH；或(3) SEQ ID NO: 29之VL及SEQ ID NO: 31之VH；或(4) SEQ ID NO: 33之VL及SEQ ID NO: 35之VH；或(5) SEQ ID NO: 37之VL及SEQ ID NO: 39之VH；或(6) SEQ ID NO: 41之VL及SEQ ID NO: 43之VH；或(7) SEQ ID NO: 45之VL及SEQ ID NO: 47之VH；或(8) SEQ ID NO: 49之VL及SEQ ID NO: 51之VH；或(9) SEQ ID NO: 53之VL及SEQ ID NO: 55之VH；或(10) SEQ ID NO: 57之VL及SEQ ID NO: 59之VH；或(11) SEQ ID NO: 61之VL及SEQ ID NO: 63之VH；或(12) SEQ ID NO: 65之VL及SEQ ID NO: 67之VH；或(13) SEQ ID NO: 69之VL及SEQ ID NO: 71之VH；或(14) SEQ ID NO: 21之VL及SEQ ID NO: 73之VH。 所揭示抗體(或產生其之純系)以及其各別名稱(例如SC72.2、SC72.28等)及可變區核酸或胺基酸SEQ ID NO (參見圖1A - 1C)之匯總緊接展示於下表2中。
表 2
注釋圖1A及1B中之VL及VH胺基酸序列以鑑別根據Kabat等人所定義之框架區(亦即FR1 - FR4)及互補決定區(亦即圖1A中之CDR-L1 - CDR-L3或圖1B中之CDR-H1 - CDR-H3)。使用Abysis資料庫之專有版本分析可變區序列以提供CDR及FR名稱。儘管CDR係根據Kabat等人進行定義，但熟習此項技術者應瞭解，CDR及FR名稱亦可根據Chothia、McCallum或任何其他公認命名系統來定義。另外，圖1C提供編碼圖1A及1B中所陳述之胺基酸序列之核酸序列(SEQ ID NO: 20-72，偶數)。 如圖1A及1B及表2中可見，每一特定鼠類抗體之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列之SEQ ID NO.通常係連續奇數。因此，單株抗ASCL1抗體SC72.2之輕鏈及重鏈可變區分別包括胺基酸SEQ ID NO: 21及23；SC72.28包括SEQ ID NO: 25及27；SC72.52包括SEQ ID NO: 29及31，等等。依序編號方案之唯一例外係SC72.93，其包括與純系SC72.2相同之輕鏈可變區胺基酸序列 (SEQ ID NO: 21)以及獨特重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO: 73)。在任一情形下，編碼鼠類抗體胺基酸序列(陳述於圖1C中)之相應核酸序列具有緊接在相應胺基酸EQ ID NO.之前之SEQ ID NO。因此，舉例而言，SC72.2抗體之VL及VH之核酸序列之SEQ ID NO.分別為SEQ ID NO: 20及22。 除圖1A - 1C中之注釋序列外，圖1D - 1F分別提供SC72.165、SC72.181及SC72.216之輕鏈及重鏈可變區之CDR名稱，如使用Kabat、Chothia、ABM及接觸方法所測定。圖1D - 1F中所繪示之CDR名稱係使用如上文所論述之Abysis資料庫之專有版本所衍生。熟習此項技術者應瞭解，可根據本發明將所揭示鼠類CDR移植至鼠類或人類框架序列中以提供CDR移植或人類化抗ASCL1抗體。此外，根據本發明，可易於根據本文之教示內容測定所製備任一抗ASCL1抗體之CDR並測序且使用所衍生CDR序列提供CDR移植或人類化之本發明之抗ASCL1抗體。此尤其適用於具有圖1A - 1B中所陳述之重鏈及輕鏈可變區序列之抗體。
實例 4 ASCL1 mRNA 在 PDX 腫瘤中之表現
為描述實體腫瘤在存在於癌症患者中時之細胞一致性且闡明給定腫瘤適應症內之分子亞型，研發PDX腫瘤庫且使用業內公認之技術維持。經由使最初自患有各種實體腫瘤惡性腫瘤之癌症患者獲得之腫瘤細胞多次傳代來使包括大量離散腫瘤細胞系之PDX腫瘤庫在免疫受損小鼠中繁殖。低傳代PDX腫瘤代表處於其自然環境中之腫瘤，從而提供對於促成腫瘤生長及當前療法抗性之潛在機制之臨床相關視野。然後探詢胰臟、結腸直腸及肺腫瘤之所選PDX細胞系，如下文緊接所陳述。 為實施ASCL1微陣列分析，在PDX腫瘤達到800 - 2,000 mm
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之後將其自小鼠切除。使用業內公認之酶促消解技術將所切除PDX腫瘤解離至單細胞懸浮液中(例如參見U.S.P.N. 2007/0292414)。將經解離本體腫瘤細胞與4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)一起培育以檢測死亡細胞，與抗小鼠CD45及H-2K
d
抗體一起培育以鑑別小鼠細胞且與抗人類EPCAM抗體一起培育以鑑別人類細胞。藉由以下方式自腫瘤細胞提取RNA：在補充有1% 2-巰基乙醇之RLTplus RNA裂解緩衝液(Qiagen)中裂解細胞，在-80℃下冷凍裂解物且然後解凍裂解物以用於使用RNeasy分離套組(Qiagen)進行RNA提取。使用Nanodrop分光光度計(Thermo Scientific)及/或Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)量化RNA。自各種來源(LifeTechnology、Agilent、ScienCell、BioChain及Clontech)購買正常組織RNA。藉由微陣列分析(Agilent Technologies)評價所得總RNA製劑。 對各種PDX細胞系(及經改造293細胞對照)實施微陣列實驗且如下所述來分析數據：實質上如上文所闡述自PDX細胞系提取1-2 µg全腫瘤總RNA。使用Agilent SurePrint GE人類8x60 v2微陣列平臺(其含有50,599個針對人類基因體中之27,958種基因及7,419種lncRNA所設計之生物探針)分析RNA試樣。使用標準工業實踐來正規化及轉變強度值以量化每一試樣之基因表現。ASCL1表現之正規化強度陳述於圖2之第1欄中。 如圖2中所展示，微陣列分析顯示，ASCL1表現於諸多肺癌細胞系中，從而指示其可提供用於檢測、診斷或監測某些贅瘤性病症之標記物。
實例 5 藉由 IHC 表現 ASCL1
為證實先前實例中所展示之微陣列數據且進一步表徵實體腫瘤在存在癌症患者中時之細胞異質性，對PDX腫瘤切片實施免疫組織化學(IHC)分析以評價ASCL1在腫瘤細胞中之表現。 對於來自第一免疫化活動之實例性抗體SC72.2而言，在業內之標準福馬林(formalin)固定及石蠟包埋(FFPE)組織上實施IHC。切割組織之平面切片且安裝於玻璃顯微鏡載玻片上。在二甲苯去蠟之後，使用抗原回收溶液(Dako)將5 µm切片在99℃下預處理20 min.，冷卻至75℃且然後使用於PBS中之0.3%過氧化氫處理，隨後使用抗生物素蛋白/生物素阻斷溶液(Vector實驗室)進行處理。然後使用於3% BSA中之10%馬血清在PBS緩衝液中阻斷FFPE載玻片且與一級抗ASCL1抗體(純系SC72.2)一起培育，在室溫下於3% BSA/PBS中經30 min稀釋至10 µg/ml。對於來自第二活動之實例性抗體(SC72.201及SC72.216)而言，如上所述來實施IHC，只是將一級抗體培育1 hr而非30 min。 然後將FFPE載玻片與生物素偶聯之馬抗小鼠抗體(Vector實驗室)一起培育，在室溫下於3% BSA/PBS中經30 min.稀釋至2.5 µg/ml，隨後在鏈黴抗生物素蛋白(Streptavidin)-HRP (ABC Elite套組；Vector實驗室)中培育。使用3,3’-二胺基聯苯胺(Thermo Scientific)在室溫下進行發色檢測5 min.且使用Meyer’s蘇木精(IHC World)複染組織，使用乙醇洗滌且浸漬於二甲苯中。然後藉由明場顯微術觀察切片且記錄ASCL1表現。研究結果以表格形式展示於圖2之4個右側欄中。 圖2證實，所揭示抗體可用於有效地生成關於ASCL1改造細胞及表現人類ASCL1蛋白之患者源腫瘤異種移植物(PDX)細胞系之IHC數據。此外，IHC數據通常與如藉由微陣列分析量測之ASCL1表現相關，從而進一步顯示，ASCL1表現與腫瘤有關且提供用於管控其之可行診斷或預後靶。
實例 6 ASCL1 之細胞內 FACS 染色
亦藉由流式細胞術分析實例2中所產生之所選抗hASCL1鼠類抗體以進一步闡明其結合特性且另外證實該等抗體可用作診斷劑。為此，在2 mL培養基中培養實例性抗體純系且然後純化所分泌抗體。然後藉由細胞內FACS染色使用對hASCL1具有特異性之抗體如下所述來表徵經純化抗體。 使用冷PBS洗滌經hASCL1瞬時轉導之1×10
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/孔HEK293T細胞(如實例1中所闡述)及僅經GFP瞬時轉導之HEK293T細胞且然後與PBS及Dylight 450固定細胞活力染料(Fixable viability dye)之溶液一起培育30分鐘。在培育之後，使用PBS將細胞洗滌兩次。為滲透細胞壁，將100ul BD Cytofix/Cytoperm添加至細胞中且在冰上培育20分鐘。然後使用BD Phosflow perm/wash溶液洗滌細胞。然後將最終濃度為10ug/ml之經純化抗體添加至於45ul BD Phosflow perm/wash溶液中之細胞中，在冰上培育30分鐘，且然後使用BD Phosflow perm/wash洗滌2次。以1ug/ml添加50ul溶於BD Phosflow perm/wash中之Alexa Fluor 647偶聯山羊-抗小鼠IgG二級抗體，且在冰上培育30分鐘，然後使用BD Phosflow perm/wash洗滌3次。然後將細胞再懸浮於FACS緩衝液中以根據製造商說明書在BD FACS Canto上讀取。 使用FlowJo軟體包裝(FlowJo LLC)計算每一抗ASCL1抗體之gMFI (幾何平均螢光強度)。實例性抗體展現計算之細胞內gMFI值(圖3中標記為「IC比率」之欄)，該等值指示，該等抗體結合至經hASCL1瞬時轉導之HEK293T細胞中之細胞內hASCL1，但對於僅經GFP瞬時轉導之HEK293T細胞而言並不結合。 該等量測進一步證實，所揭示抗體選擇性結合至ASCL1且提供用於贅瘤性病症之潛在診斷劑。
實例 7 抗 ASCL1 抗體結合細胞裂解物中之 ASCL1
為進一步證實所揭示ASCL1抗體之結合特異性，使用來自實例2之所選純系實施細胞裂解物MSD ELISA。 自T150組織培養燒瓶收穫經ASCL1蛋白瞬時轉染之293T細胞(如上所述)，藉由離心粒化，並在冷PBS中洗滌兩次。將蛋白質提取緩衝液(Biochain Institute)添加至細胞糰粒中以裂解細胞。藉由離心(20,000 g, 20 min., 4℃)清洗裂解物且使用二喹啉甲酸量化總蛋白質濃度。以類似方式製備來自經對照蛋白轉導之293細胞之裂解物以用作陰性對照。將ASCL1或陰性對照蛋白質裂解物在PBS中稀釋至40ug/ml且以15µL/孔添加至MSD 384孔標準板中。密封板且在4℃下培育過夜。第二天，搖動板內容物且在室溫下經1小時使用35µL含PBS 3% BSA更換。將ASCL1抗體在含有0.05% Tween 20及1% BSA之PBS (PBSTA緩衝液)中稀釋至2ug/mL。在使用PBST洗滌緩衝液將阻斷板洗滌三次之後，一式兩份經1小時將經稀釋抗體以10µL/孔添加至板中。將山羊抗小鼠IgG加磺基標籤抗體以0.5µg/ml及10 µL/孔(於PBSTA中)添加至洗滌板中。然後在PBST洗滌緩衝液中洗滌板。將含有表面活性劑之MSD讀取緩衝液T在水中稀釋至1×且將35µl添加至每一孔中。在MSD SECTOR成像儀儀器(Meso Scale Discovery)上讀取板。 生成來自ASCL1裂解物/不相關蛋白質之原始電化學發光值之比率且報告於圖3中，如在欄「CL比率」中所指示。較大值指示較陰性對照裂解物特異性結合至ASCL1裂解物。因此，圖3中之數據進一步指示，所測試抗體選擇性結合自細胞獲得之ASCL1且可用作臨床環境中之診斷劑。
