TW201805004A - 用於預防具風險病患之阿茲海默症之㗁衍生物 - Google Patents

Abstract

本發明係關於㗁𠯤衍生物BACE-1抑制劑及包含該㗁𠯤衍生物之醫藥組合物，其用於預防具有發展阿茲海默症(Alzheimer’s disease)臨床症狀風險之病患之阿茲海默症，且具體而言，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之該病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝。

Description

用於預防具風險病患之阿茲海默症之㗁𠯤衍生物

本發明係關於㗁𠯤衍生物及包含該㗁𠯤衍生物之醫藥組合物，其用於預防具有發展阿茲海默症(Alzheimer’s disease)臨床症狀風險之病患之阿茲海默症；且具體而言，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝。

阿茲海默症(Alzheimer’s disease；AD)係全世界最盛行的神經病症之一，且係最常見及造成衰弱的年齡相關病況，其會造成進展性健忘症、失智症及最終整體認知失敗及死亡。目前，僅有的可用藥理學療法係對症藥物(例如膽鹼酯酶抑制劑)或其他用於控制AD之繼發性行為症狀之藥物。靶向AD致病性級聯之研究性治療包括旨在干擾類澱粉β (Aβ)物質之產生、累積或毒性後遺症之彼等(Kramp VP, Herrling P, 2011)。藉由以下靶向減少Aβ之策略具有潛在治療價值：(1)利用針對Aβ之主動或被動免疫療法來增強類澱粉清除；(2)藉助抑制β位點-APP裂解酶1 (BACE-1，參與類澱粉前體蛋白[APP]處理之酶)來降低產生。 基於靶向疾病失智症階段之最新臨床試驗中之動物數據及有限益處，人們愈來愈相信Aβ降低療法在預防或減緩AD在臨床前階段之進展中可能最為有效。此方法容許參與者在症狀及疾病發作之前或在症狀及疾病發作之最早期階段中、在原纖維Aβ之平臺期、tau (神經原纖維)病理學之廣泛出現及不可逆突觸或神經元損失之前進行治療。 載脂蛋白E (ApoE4)基因之ε4等位基因係阿茲海默症(AD)之主要風險因素。APOE基因以三種多形性等位基因ε2、ε3及ε4存在，而ε3係最常見的。APOE同種型不同地影響Aβ清除、聚集及沈積；ε2似乎具有保護性，而ε4載體具有增強之病理學及加速之年齡依賴性認知下降(綜述參見Liu CC等人，2013))。 人類ApoE位於染色體19上(基因APOE ，Uniprot P02649，該基因編碼317個胺基酸，包括18個胺基酸之前肽)，成熟形式係由299個胺基酸組成，且具有2個由撓性連接體接合之單獨N末端及C末端結構域。儘管N末端結構域含有用於受體結合之結合結構域(aa 136-150)，但脂質結合結構域(aa 240-260)位於C末端部分中。在人類中已知三種主要同種型(apoE2、apoE3及apoE4)，在人類中ApoE3 (在位置112處具有Cys且在位置158處具有Arg)之等位基因頻率為約50-90%。在人類中，ApoE2 (在位置112及158處具有Cys)具有1-5%之等位基因頻率，且ApoE4 (在位置112及158處具有Arg)具有5-35%之等位基因頻率。ApoE3及4以高親和力結合至LDL受體，而ApoE2 (因Cys-158所致)僅具有低親和力。 據估計ApoE4同型合子佔總群體之約2%至3%且發展AD症狀之風險較具有其他APOE基因型之人高得多，其中發作時之平均年齡為68歲(Corder EH等人，1993)。截止至85歲，症狀性AD之終生風險對於男性同型合子可高達51%且對於女性同型合子可高達60-68%。85歲ApoE4異型合子之相應百分比風險對於攜帶ApoE3/4基因型之男性及女性分別為23%及30%且對於攜帶ApoE2/4基因型之男性及女性分別為20%及27%(Genin E等人，2011)。有人提出ApoE4基因之存在藉由影響Aβ清除、聚集及沈積而增強AD之風險(Liu CC等人，2013)。預計與同型合子相比，為ApoE4異型合子之腦類澱粉病理學之存在顯著增加發展AD臨床症狀之風險。

化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺在本文中稱作「化合物1」，其係口服活性BACE抑制劑，其先前於WO 2012/095469 A1中有闡述，其對BACE-1之選擇性約為BACE-2之3倍且無相關脫靶結合或活性。 鑒於迄今在該領域中具有較高的挫敗及失望率(Cummings JL等人，2014)，故關於任一實驗，疾病改良性AD療法是否將證實在有風險病患中有效存在較高的不確定度。然而，本文中由化合物1展示之在以下方面之高有效性程度表明化合物1將在具有發展AD臨床症狀風險之病患且具體而言攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝之彼等病患中有效地預防AD：在不存在不合意副作用(例如毛髮變色)下，降低ApoE4轉基因小鼠及人類ApoE4載體中之Aβ含量；及在APP23小鼠模型中減少類澱粉β沈積。 在本文中闡述II/III期臨床試驗，其經設計以展示化合物1在認知未受損之ApoE4同型合子病患中或認知未受損之類澱粉陽性ApoE4異型合子病患中預防AD之有效性。基於當前知識，來自此所提出臨床試驗之發現及本文所闡述之結果可推廣且適用於除ApoE4同型合子及異型合子以外之有風險病患中(例如攜帶類澱粉前體蛋白(APP)、早老素-1及早老素-2之基因之突變之病患中(O’Brien RJ, Wong PC, 2011)或唐氏症候群病患中(Head E等人，2012))之AD，乃因預計BACE抑制劑療法可獨立於類澱粉沈積之多個潛在原因來減少及/或預防類澱粉斑塊累積。 在本發明之第一態樣中，因此提供化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症。 在本發明之第二態樣中，提供包含N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之醫藥組合物，其用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症。 在本發明之第三態樣中，提供用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症之方法，該方法包含向該病患投與治療有效量之化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽。 在本發明之第四態樣中，提供用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症之方法，該方法包含向該病患投與包含治療有效量之化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之醫藥組合物。 在本發明之第五態樣中，提供化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症。 在本發明之第六態樣中，提供包含化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之醫藥組合物之用途，其用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症。 在本發明之第七態樣中，提供化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用以預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症之藥劑。

本文闡述本發明之多個實施例。本發明之第一態樣之系列 A 實施例 實施例A1：一種化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症。 實施例A2：如實施例A1所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶發展阿茲海默症臨床症狀之遺傳傾向性或患有唐氏症候群。 實施例A3：如實施例A2所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該病患攜帶發展阿茲海默症臨床症狀之遺傳傾向性且該遺傳傾向性為： (i) 類澱粉前體蛋白、早老素-1或早老素-2之基因之突變；或 (ii) ApoE4等位基因之一或兩個拷貝之存在。 實施例A4：如實施例A3所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝。 實施例A5：如實施例A4所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該病患攜帶ApoE4等位基因之一個拷貝。 實施例A6：如實施例A4所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該病患攜帶ApoE4等位基因之兩個拷貝。 實施例A7：如實施例A1至A6中任一項所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該病患為類澱粉陽性。 實施例A8：如實施例A7所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該類澱粉陽性係藉由PET或CSF量測來確定。 實施例A9：如實施例A3至A8中任一項所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該病患之年齡在60歲與75歲之間。 實施例A10：如實施例A1至A9中任一項所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中化合物係以在兩週化合物暴露之後引起CSF中之Aβ 1-40降低至少70%之日劑量使用。 實施例A11：如實施例A1至A9中任一項所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中化合物係以在兩週化合物暴露之後引起CSF中之Aβ 1-40降低至少50%之日劑量使用。 實施例A12：如實施例A1至A9中任一項所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中化合物係以介於10 mg/天與30 mg/天之間之劑量使用。 實施例A13：如實施例A1至A9中任一項所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中化合物係以介於30 mg/天與50 mg/天之間之劑量使用。 實施例A14：如實施例A1至A9中任一項所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中化合物係以15 mg/天之劑量使用。 實施例A15：如實施例A1至A9中任一項所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中化合物係以50 mg/天之劑量使用。 實施例A16：如實施例A1至A9中任一項所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中化合物係以引起介於70 ng/ml與170 ng/ml之間之血漿穩態Cmax值之日劑量使用。 實施例A17：如實施例A1至A9中任一項所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中化合物係以引起介於200 ng/ml與500 ng/ml之間之血漿穩態Cmax值之日劑量使用。 實施例A18：一種化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝。 實施例A19：一種化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝，且其中化合物係以15 mg/天或50 mg/天之劑量使用。 實施例A20：如實施例A1至A19中任一項所使用之化合物，其中化合物係呈游離形式。 實施例A21：如實施例A1至A20中任一項所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該病患並非同時用CYP3A4之抑制劑或誘導物來治療。 實施例A22：如實施例A1至A20中任一項所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該病患並非同時用CYP3A4抑制劑或誘導物治療達長於三個月之時段。 實施例A23：如實施例A21或A22所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中CYP3A4抑制劑係CYP3A4之強、中等或弱抑制劑；且CYP3A4誘導物係CYP3A4之強、中等或弱誘導物。 實施例A24：如實施例A23所使用之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中CYP3A4抑制劑係CYP3A4之強抑制劑；且CYP3A4誘導物係CYP3A4之強誘導物。本發明之第二態樣之系列 B 實施例 實施例B1：一種醫藥組合物，其包含化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症。 實施例B2：如實施例B1所使用之醫藥組合物，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶發展阿茲海默症臨床症狀之遺傳傾向性或患有唐氏症候群。 實施例B3：如實施例B2所使用之醫藥組合物，其中該病患攜帶發展阿茲海默症臨床症狀之遺傳傾向性且該遺傳傾向性為： (i) 類澱粉前體蛋白、早老素-1或早老素-2之基因之突變；或 (ii) ApoE4等位基因之一或兩個拷貝之存在。 實施例B4：如實施例B3所使用之醫藥組合物，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝。 實施例B5：如實施例B4所使用之醫藥組合物，其中該病患攜帶ApoE4等位基因之一個拷貝。 實施例B6：如實施例B4所使用之醫藥組合物，其中該病患攜帶ApoE4等位基因之兩個拷貝。 實施例B7：如實施例B1至B6中任一項所使用之醫藥組合物，其中該病患為類澱粉陽性。 實施例B8：如實施例B7所使用之醫藥組合物，其中類澱粉陽性係藉由PET或CSF量測來確定。 實施例B9：如實施例B3至B8中任一項所使用之醫藥組合物，其中該病患之年齡在60歲與75歲之間。 實施例B10：如實施例B1至B9中任一項所使用之醫藥組合物，其中化合物係以在兩週化合物暴露之後引起CSF中之Aβ 1-40降低至少70%之日劑量使用。 實施例B11：如實施例B1至B9中任一項所使用之醫藥組合物，其中化合物係以在兩週化合物暴露之後引起CSF中之Aβ 1-40降低至少50%之日劑量使用。 實施例B12：如實施例B1至B9中任一項所使用之醫藥組合物，其中化合物係以介於10 mg/天與30 mg/天之間之劑量使用。 實施例B13：如實施例B1至B9中任一項所使用之醫藥組合物，其中化合物係以介於30 mg/天與50 mg/天之間之劑量使用。 實施例B14：如實施例B1至B9中任一項所使用之醫藥組合物，其中化合物係以15 mg/天之劑量使用。 實施例B15：如實施例B1至B9中任一項所使用之醫藥組合物，其中化合物係以50 mg/天之劑量使用。 實施例B16：如實施例B1至B9中任一項所使用之醫藥組合物，其中化合物係以引起介於70 ng/ml與170 ng/ml之間之血漿穩態Cmax值之日劑量使用。 實施例B17：如實施例B1至B9中任一項所使用之醫藥組合物，其中化合物係以引起介於200 ng/ml與500 ng/ml之間之血漿穩態Cmax值之日劑量使用。 實施例B18：一種醫藥組合物，其包含化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝。 實施例B19：一種醫藥組合物，其包含化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝，且其中化合物係以15 mg/天或50 mg/天之劑量使用。 實施例B20：如實施例B1至B19中任一項所使用之醫藥組合物，其中化合物係呈游離形式。 實施例B21：如實施例B1至B20中任一項所使用之醫藥組合物，其中該病患並非同時用CYP3A4之抑制劑或誘導物來治療。 實施例B22：如實施例B1至B20中任一項所使用之醫藥組合物，其中該病患並非同時用CYP3A4抑制劑或誘導物治療達長於三個月之時段。 實施例B23：如實施例B21或B22所使用之醫藥組合物，其中CYP3A4抑制劑係CYP3A4之強、中等或弱抑制劑；且CYP3A4誘導物係CYP3A4之強、中等或弱誘導物。 實施例B24：如實施例B23所使用之醫藥組合物，其中CYP3A4抑制劑係CYP3A4之強抑制劑；且CYP3A4誘導物係CYP3A4之強誘導物。本發明之第三態樣之系列 C 實施例 實施例C1：一種用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症之方法，該方法包含向該病患投與治療有效量之化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽。 實施例C2：如實施例C1之方法，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶發展阿茲海默症臨床症狀之遺傳傾向性或患有唐氏症候群。 實施例C3：如實施例C2之方法，其中該病患攜帶發展阿茲海默症臨床症狀之遺傳傾向性且該遺傳傾向性為： (i) 類澱粉前體蛋白、早老素-1或早老素-2之基因之突變；或 (ii) ApoE4等位基因之一或兩個拷貝之存在。 實施例C4：如實施例C3之方法，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝。 實施例C5：如實施例C4之方法，其中該病患攜帶ApoE4等位基因之一個拷貝。 實施例C6：如實施例C4之方法，其中該病患攜帶ApoE4等位基因之兩個拷貝。 實施例C7：如實施例C1至C6中任一項之方法，其中該病患為類澱粉陽性。 實施例C8：如實施例C7之方法，其中該類澱粉陽性係藉由PET或CSF量測來確定。 實施例C9：如實施例C3至C8中任一項之方法，其中該病患之年齡超過60歲、61歲、62歲、63歲、64歲、65歲、66歲、67歲、68歲、69歲、70歲、71歲、72歲、73歲、74歲或75歲。 實施例C10：如實施例C3至C8中任一項之方法，其中該病患之年齡在60歲與75歲之間。 實施例C11：如實施例C1至C10中任一項之方法，其中化合物係以在2週、13週、26週、52週、78週、104週、130週、156週、182週、208週、234週、260週、286週、312週、338週、332週、390週或416週之化合物暴露之後引起CSF、血液或血漿中之Aβ 1-40降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%之日劑量使用。 實施例C12：如實施例C1至C10中任一項之方法，其中化合物係以在2週、13週、26週、52週、78週、104週、130週、156週、182週、208週、234週、260週、286週、312週、338週、332週、390週或416週之化合物暴露之後引起CSF、血液或血漿中之Aβ 1-40降低至少70%之日劑量使用。 實施例C13：如實施例C1至C10中任一項之方法，其中化合物係以在2週、13週、26週、52週、78週、104週、130週、156週、182週、208週、234週、260週、286週、312週、338週、332週、390週或416週之化合物暴露之後引起CSF、血液或血漿中之Aβ 1-40降低至少50%之日劑量使用。 實施例C14.如實施例C1至C10中任一項之方法，其中化合物係以在2週、13週、26週、52週、78週、104週、130週、156週、182週、208週、234週、260週、286週、312週、338週、332週、390週或416週之化合物暴露之後引起CSF、血液或血漿中之Aβ 1-40降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%至99%、97%、95%、93%、90%、87%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%或50%之範圍之日劑量使用。 實施例C15.如實施例C1至C10中任一項之方法，其中化合物係以在至少80%、85%、90%、93%、95%、97%或99%之病患中或在至少80%、85%或90%至99%、97%、95%或93%之病患中引起CSF、血液或血漿中之Aβ 1-40降低40%至70%、45%至65%或50%至60%之範圍或至少50%之日劑量使用。 實施例C16.如實施例C1至C10中任一項之方法，其中化合物係以在至少80%、85%、90%、93%、95%、97%或99%之病患中或在至少80%、85%或90%至99%、97%、95%或93%之病患中引起CSF、血液或血漿中之Aβ 1-40降低65%至95%、75%至90%或80%至90%之範圍或至少80%之日劑量使用。 實施例C17：如實施例C1至C10中任一項之方法，其中化合物係以介於5mg/天與10mg/天之間、10mg/天與15mg/天之間、15mg/天與20mg/天之間、20mg/天與25mg/天之間、25 mg/天與30 mg/天之間、30 mg/天與35 mg/天之間、35 mg/天與40 mg/天之間、45 mg/天與50 mg/天之間、50 mg/天與55 mg/天之間、55 mg/天與60 mg/天之間、60 mg/天與100 mg/天之間、100 mg/天與200 mg/天之間、200 mg/天與300 mg/天之間、15 mg/天與85 mg/天之間、50 mg/天與85 mg/天之間、15 mg/天與300 mg/天之間或50 mg/天與300 mg/天之間之劑量使用。 實施例C18：如實施例C1至C10中任一項之方法，其中化合物係以介於10 mg/天與30 mg/天之間。之劑量使用 實施例C19：如實施例C1至C10中任一項之方法，其中化合物係以介於30 mg/天與50 mg/天之間之劑量使用。 實施例C20：如實施例C1至C10中任一項之方法，其中化合物係以15 mg/天之劑量使用。 實施例C21：如實施例C1至C10中任一項之方法，其中化合物係以50 mg/天之劑量使用。 實施例C22：如實施例C1至C10中任一項之方法，其中化合物係以引起介於0 ng/ml與50 ng/ml之間、50 ng/ml與100 ng/ml之間、100 ng/ml與150 ng/ml之間、150 ng/ml與200 ng/ml之間、200 ng/ml與250 ng/ml之間、250 ng/ml與300 ng/ml之間、300 ng/ml與350 ng/ml之間、350 ng/ml與400 ng/ml之間、400 ng/ml與450 ng/ml之間、450 ng/ml與500 ng/ml之間、500 ng/ml與550 ng/ml之間、550ng/ml與600 ng/ml之間、600 ng/ml與650 ng/ml之間或650 ng/ml與700 ng/ml之間之血漿穩態Cmax值之日劑量使用。 實施例C23：如實施例C1至C10中任一項之方法，其中化合物係以引起介於70 ng/ml與170 ng/ml之間之血漿穩態Cmax值之日劑量使用。 實施例C24：如實施例C1至C10中任一項之方法，其中化合物係以引起介於200 ng/ml與500 ng/ml之間之血漿穩態Cmax值之日劑量使用。 實施例C25：一種用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症之方法，該方法包含向該病患投與治療有效量之化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝。 實施例C26：一種用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症之方法，該方法包含向該病患投與治療有效量之化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝，且其中化合物係以15 mg/天或50 mg/天之劑量使用。 實施例C27：如實施例C1至C26中任一項之方法，其中化合物係呈游離形式。 實施例C28：如實施例C1至C27中任一項之方法，其中化合物1係包含在醫藥組合物內。 實施例C29：如實施例C1至C28中任一項之方法，其中該病患並非同時用CYP3A4之抑制劑或誘導物來治療。 實施例C30：如實施例C1至C28中任一項之方法，其中該病患並非同時用CYP3A4抑制劑或誘導物治療達長於三個月之時段。 實施例C31：如實施例C29或C30之方法，其中CYP3A4抑制劑係CYP3A4之強、中等或弱抑制劑；且CYP3A4誘導物係CYP3A4之強、中等或弱誘導物。 實施例C32：如實施例C31之方法，其中CYP3A4抑制劑係CYP3A4之強抑制劑；且CYP3A4誘導物係CYP3A4之強誘導物。本發明之第五態樣之系列 D 實施例 實施例D1：一種化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症。 實施例D2：如實施例D1之用途，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶發展阿茲海默症臨床症狀之遺傳傾向性或患有唐氏症候群。 實施例D3：如實施例D2之用途，其中該病患攜帶發展阿茲海默症臨床症狀之遺傳傾向性且該遺傳傾向性為： (i) 類澱粉前體蛋白、早老素-1或早老素-2之基因之突變；或 (ii) ApoE4等位基因之一或兩個拷貝之存在。 實施例D4：如實施例D3之用途，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝。 實施例D5：如實施例D4之用途，其中該病患攜帶ApoE4等位基因之一個拷貝。 實施例D6：如實施例D4之用途，其中該病患攜帶ApoE4等位基因之兩個拷貝。 實施例D7：如實施例D1至D6中任一項之用途，其中該病患為類澱粉陽性。 實施例D8：如實施例D7之用途，其中類澱粉陽性係藉由PET或CSF量測來確定。 實施例D9：如實施例D3至D8中任一項之用途，其中該病患之年齡在60歲與75歲之間。 實施例D10：如實施例D1至D9中任一項之用途，其中化合物係以在兩週化合物暴露之後引起CSF中之Aβ 1-40降低至少70%之日劑量使用。 實施例D11：如實施例D1至D9中任一項之用途，其中化合物係以在兩週化合物暴露之後引起CSF中之Aβ 1-40降低至少50%之日劑量使用。 實施例D12：如實施例D1至D9中任一項之用途，其中化合物係以介於10 mg/天與30 mg/天之間之劑量使用。 實施例D13：如實施例D1至D9中任一項之用途，其中化合物係以介於30 mg/天與50 mg/天之間之劑量使用。 實施例D14：如實施例D1至D9中任一項之用途，其中化合物係以15 mg/天之劑量使用。 實施例D15：如實施例D1至D9中任一項之用途，其中化合物係以50 mg/天之劑量使用。 實施例D16：如實施例D1至D9中任一項之用途，其中化合物係以引起介於70 ng/ml與170 ng/ml之間之血漿穩態Cmax值之日劑量使用。 實施例D17：如實施例D1至D9中任一項之用途，其中化合物係以引起介於200 ng/ml與500 ng/ml之間之血漿穩態Cmax值之日劑量使用。 實施例D18：一種化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝。 實施例D19：一種化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝，且其中化合物係以15 mg/天或50 mg/天之劑量使用。 實施例D20：如實施例D1至D19中任一項之用途，其中化合物係呈游離形式。 實施例D21：如實施例D1至D20中任一項之用途，其中化合物係包含在醫藥組合物內。 實施例D22：如實施例D1至D21中任一項之用途，其中該病患並非同時用CYP3A4之抑制劑或誘導物來治療。 實施例D23：如實施例D1至D21中任一項之用途，其中該病患並非同時用CYP3A4抑制劑或誘導物治療達長於三個月之時段。 實施例D24：如實施例D22或D23之用途，其中CYP3A4抑制劑係CYP3A4之強、中等或弱抑制劑；且CYP3A4誘導物係CYP3A4之強、中等或弱誘導物。 實施例D25：如實施例D24之用途，其中CYP3A4抑制劑係CYP3A4之強抑制劑；且CYP3A4誘導物係CYP3A4之強誘導物。本發明之第七態樣之系列 E 實施例 實施例E1：一種化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用以預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症之藥劑。 實施例E2：如實施例E1之用途，其中具有發展阿茲海默症之臨床症狀風險之病患攜帶發展阿茲海默症臨床症狀之遺傳傾向性或患有唐氏症候群。 實施例E3：如實施例E2之用途，其中該病患攜帶發展阿茲海默症臨床症狀之遺傳傾向性且該遺傳傾向性為： (i) 類澱粉前體蛋白、早老素-1或早老素-2之基因之突變；或 (ii) ApoE4等位基因之一或兩個拷貝之存在。 實施例E4：如實施例E3之用途，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝。 實施例E5：如實施例E4之用途，其中該病患攜帶ApoE4等位基因之一個拷貝。 實施例E6：如實施例E4之用途，其中該病患攜帶ApoE4等位基因之兩個拷貝。 實施例E7：如實施例E1至E6中任一項之用途，其中該病患為類澱粉陽性。 實施例E8：如實施例E7之用途，其中類澱粉陽性係藉由PET或CSF量測來確定。 實施例E9：如實施例E3至E8中任一項之用途，其中該病患之年齡在60歲與75歲之間。 實施例E10：如實施例E1至E9中任一項之用途，其中化合物係以在兩週化合物暴露之後引起CSF中之Aβ 1-40降低至少70%之日劑量使用。 實施例E11：如實施例E1至E9中任一項之用途，其中化合物係以在兩週化合物暴露之後引起CSF中之Aβ 1-40降低至少50%之日劑量使用。 實施例E12：如實施例E1至E9中任一項之用途，其中化合物係以介於10 mg/天與30 mg/天之間之劑量使用。 實施例E13：如實施例E1至E9中任一項之用途，其中化合物係以介於30 mg/天與50 mg/天之間之劑量使用。 實施例E14：如實施例E1至E9中任一項之用途，其中化合物係以15 mg/天之劑量使用。 實施例E15：如實施例E1至E9中任一項之用途，其中化合物係以50 mg/天之劑量使用。 實施例E16：如實施例E1至E9中任一項之用途，其中化合物係以引起介於70 ng/ml與170 ng/ml之間之血漿穩態Cmax值之日劑量使用。 實施例E17：如實施例中任一項之用途E1至E9，其中化合物係以引起介於200 ng/ml與500 ng/ml之間之血漿穩態Cmax值之日劑量使用。 實施例E18：一種化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用以預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症之藥劑，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝。 實施例E19：一種化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用以預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症之藥劑，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝，且其中化合物係以15 mg/天或50 mg/天之劑量使用。 實施例E20：如實施例E1至E19中任一項之用途，其中化合物係呈游離形式。 實施例E21：如實施例E1至E20中任一項之用途，其中該藥劑係醫藥組合物。 實施例E22：如實施例E1至E21中任一項之用途，其中該病患並非同時用CYP3A4之抑制劑或誘導物治療。 實施例E23：如實施例E1至E21中任一項之用途，其中該病患並非同時用CYP3A4抑制劑或誘導物治療達長於三個月之時段。 實施例E24：如實施例E22或E23之用途，其中CYP3A4抑制劑係CYP3A4之強、中等或弱抑制劑；且CYP3A4誘導物係CYP3A4之強、中等或弱誘導物。 實施例E25：如實施例E24之用途，其中CYP3A4抑制劑係CYP3A4之強抑制劑；且CYP3A4誘導物係CYP3A4之強誘導物。 在另一發明中，提供用於治療或預防阿茲海默症之方法，該方法包含向有需要之病患投與治療有效量之化合物N-(6-((3R,6R)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其中該病患並非同時用CYP3A4之抑制劑或誘導物來治療。在一個實施例中，病患並非同時用CYP3A4之抑制劑或誘導物治療達長於三個月之時段。在一個實施例中，病患係用CYP3A4抑制劑或誘導物同時治療達不長於三個月之時段。在一個實施例中，CYP3A4抑制劑係CYP3A4之強、中等或弱抑制劑；且CYP3A4誘導物係CYP3A4之強、中等或弱誘導物。在一個實施例中，CYP3A4抑制劑係CYP3A4之強抑制劑；且CYP3A4誘導物係CYP3A4之強誘導物。在一個實施例中，病患之年齡超過60歲、61歲、62歲、63歲、64歲、65歲、66歲、67歲、68歲、69歲、70歲、71歲、72歲、73歲、74歲或75歲。在一個實施例中，病患之年齡在60歲與75歲之間。在一個實施例中，化合物係以在2週、13週、26週、52週、78週、104週、130週、156週、182週、208週、234週、260週、286週、312週、338週、332週、390週或416週之化合物暴露之後引起CSF、血液或血漿中之Aβ 1-40降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%之日劑量使用。在一個實施例中，化合物係以在2週、13週、26週、52週、78週、104週、130週、156週、182週、208週、234週、260週、286週、312週、338週、332週、390週或416週之化合物暴露之後引起CSF、血液或血漿中之Aβ 1-40降低至少70%之日劑量使用。在一個實施例中，化合物係以在2週、13週、26週、52週、78週、104週、130週、156週、182週、208週、234週、260週、286週、312週、338週、332週、390週或416週之化合物暴露之後引起CSF、血液或血漿中之Aβ 1-40降低至少50%之日劑量使用。在一個實施例中，化合物係以介於5 mg/天與10 mg/天之間、10 mg/天與15 mg/天之間、15 mg/天與20 mg/天之間、20 mg/天與25 mg/天之間、25 mg/天與30 mg/天之間、30 mg/天與35 mg/天之間、35 mg/天與40 mg/天之間、45 mg/天與50 mg/天之間、50 mg/天與55 mg/天之間、55 mg/天與60 mg/天之間、60 mg/天與100 mg/天之間、100 mg/天與200 mg/天之間、200 mg/天與300 mg/天之間、15 mg/天與85 mg/天之間、50 mg/天與85 mg/天之間、15 mg/天與300 mg/天之間或50 mg/天與300 mg/天之劑量使用。在一個實施例中，化合物係以介於10 mg/天與30 mg/天之間之劑量使用。在一個實施例中，化合物係以介於30 mg/天與50 mg/天之間之劑量使用。在一個實施例中，化合物係以15 mg/天之劑量使用。在一個實施例中，化合物係以50 mg/天之劑量使用。在一個實施例中，化合物係以引起介於0 mg/天與50 mg/天之間、50 mg/天與100 mg/天之間、100 mg/天與150 mg/天之間、150 mg/天與200 mg/天之間、200 mg/天與250 mg/天之間、250 mg/天與300 mg/天之間、300 mg/天與350 mg/天之間、350 mg/天與400 mg/天之間、400 mg/天與450 mg/天之間、450 mg/天與500 mg/天之間、500 mg/天與550 mg/天之間、550 mg/天與600 mg/天之間、600 mg/天與650 mg/天之間或650 mg/天與700 ng/ml之間之血漿穩態Cmax值之日劑量使用。在一個實施例中，化合物係以引起介於70 ng/ml與170 ng/ml之間之血漿穩態Cmax值之日劑量使用。在一個實施例中，化合物係以引起介於200 ng/ml與500 ng/ml之間之血漿穩態Cmax值之日劑量使用。在另一實施例中，化合物係以游離形式使用。 在另一發明中，提供化合物N-(6-((3R,6R)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其係用作藥劑，其中該病患係用該藥劑進行治療，且並非同時用CYP3A4之抑制劑或誘導物來治療。在該另一發明之另一態樣中，提供化合物N-(6-((3R,6R)-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H-1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療或預防阿茲海默症，其中該病患並非同時用CYP3A4之抑制劑或誘導物來治療。在此另一發明之一個實施例中，該病患並非同時用CYP3A4之抑制劑或誘導物治療達長於三個月之時段。在此另一發明之一個實施例中，該病患係用CYP3A4抑制劑或誘導物同時治療達不長於三個月之時段。在另一實施例中，CYP3A4抑制劑係CYP3A4之強、中等或弱抑制劑；且CYP3A4誘導物係CYP3A4之強、中等或弱誘導物。在另一實施例中，CYP3A4抑制劑係CYP3A4之強抑制劑；且CYP3A4誘導物係CYP3A4之強誘導物。在另一實施例中，化合物係以15 mg/天或50 mg/天之劑量使用。在另一實施例中，該化合物係以游離形式使用。在另一實施例中，該化合物係包含在醫藥組合物內。定義 如本文所用術語「化合物1」或「Cmpd 1」係指N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺且具有以下結構式：

。 在實例1中，使用替代化學命名格式，「化合物1」亦稱為3-氯-5-三氟甲基-吡啶-2-甲酸[6-((3R,6R)-5-胺基-3,6-二甲基-6-三氟甲基-3,6-二氫-2H-[1,4]㗁𠯤-3-基)-5-氟-吡啶-2-基]-醯胺。 術語「化合物1」、「Cmpd 1」及其相應全化學名稱在本發明之整個闡述中可互換使用。除非上下文明確指示僅指定化合物之一種形式，否則預計該術語係指呈游離形式或醫藥上可接受之鹽形式之化合物。化合物1闡述於WO 2012/095469 A1之實例34中。WO 2012/095469 A1之全部內容、具體而言與實例34之合成相關之揭示內容以引用方式併入本文中。 除非上下文明確僅指定臨床前阿茲海默症或僅臨床阿茲海默症，否則如本文所用術語「阿茲海默症」或「AD」涵蓋臨床前及臨床阿茲海默症。 除非上下文明確僅指定由AD引起之MCI或由AD引起之失智症，否則如本文所用術語「臨床阿茲海默症」或「臨床AD」涵蓋由AD引起之輕度認知損害(MCI)及由AD引起之失智症。 如本文所用術語「臨床前阿茲海默症」或「臨床前AD」係指在不存在臨床症狀下存在AD之活體內分子生物標記。美國國立衰老研究院及阿茲海默症協會(National Institute on Aging and Alzheimer’s Association)提供顯示於下表1中之方案，該表陳述臨床前AD之不同階段(Sperling等人，2011)。表 1 ：臨床前 AD 分期類別 sMRI = 結構磁共振成像 如本文所用術語「阿茲海默症之預防」係指AD之預防性治療；或延遲AD之發作或進展。舉例而言，AD之發作或進展延遲至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在一個實施例中，「阿茲海默症之預防」係指臨床前AD之預防性治療；或延遲臨床前AD之發作或進展。在另一實施例中，臨床前AD之發作或進展延遲至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在另一實施例中，「阿茲海默症之預防」係指臨床AD之預防性治療；或延遲臨床AD之發作或進展。在另一實施例中，臨床AD之發作或進展延遲至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。 臨床前AD之發作或進展的延遲可藉由相對於初始基線值量測活體內分子生物標記來評估，例如，藉由量測以下來評估： (a) 腦類澱粉沈積之減少。舉例而言，藉由使用正電子發射斷層攝影術(positron emission tomography；PET)成像來量測複合皮質類澱粉標準攝取值比率(standard uptake value ratio；SUVR)自基線之變化。適於量測SUVR比之PET示蹤劑係¹⁸ F-氟比他匹(¹⁸ F-florbetapir)(((E )-4-(2-(6-(2-(2-(2-([¹⁸ F]-氟乙氧基)乙氧基)乙氧基)吡啶-3-基)乙烯基)-N-甲基苯胺))。藉由此方法，可量測非精神錯亂個體之獨立試樣中類澱粉累積隨時間之發展(Palmqvist S等人，2015)。參考預先界定參考區中所攝入之示蹤劑計算出在預先界定的感興趣皮質腦區(cortical brain regions of interest；ROI)SUVR量測值。皮質ROI包括已知在AD中具有高類澱粉沈積之區域，包括(但不限於)頂骨、枕骨、外側顳葉及內側顳葉新皮質區以及在早期AD中通常受影響之區(Vlassenko AG等人，2012)。在一個實施例中，相對於初始基線值，腦類澱粉沈積減少至每年治療小於0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10.0%之比率； (b) 對潛在tau病理學之效應，更特定而言使用PET及適宜Tau示蹤劑(例如¹⁸ F-THK5351) (Harada R等人，2016)來量測腦Tau病理學中自基線之SUVR變化，或使用腦脊髓液(CSF)來量測總Tau及磷酸化Tau (Forlenza OV等人，2015)。在一個實施例中，相對於初始基線值，CSF Tau或磷酸化Tau之含量降低每年治療至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%； (c) 對神經元葡萄糖代謝、密度及/或活性之效應，使用¹⁸ F-FDG (2-去氧-2-[¹⁸ F]氟葡萄糖) PET (每一掃描200 MBq)。AD影響之腦區中之¹⁸ F-FDG PET信號已顯示與AD中之認知損害、隨後認知下降及神經病理學相關且在AD之臨床及臨床前階段中隨時間進展，且係疾病及治療效能生物標記(Foster NL等人，2007)。分析數據以測定相對於所選參考區之葡萄糖代謝變化。在一個實施例中，AD影響之腦區中神經元葡萄糖代謝相對於初始基線值之降低(如藉由¹⁸ F-FDG PET所測定)限於每年治療小於5%、10%、15%、20%、25%或30%；或 (d) 腦體積損失之減慢之下降，如藉由用來量測腦體積自基線之變化之體積磁共振成像(vMRI)所評估。vMRI可用於量測海馬體、側腦室及總腦體積之變化。在一個實施例中，海馬體體積損失限於每年治療小於1%、2%或3%。 亦可使用敏感認知量測使用(例如)阿茲海默預防計劃(Alzheimer’s Prevention Initiative，API)臨床前複合認知(Alzheimer’s Prevention Initiative preclinical composite cognitive，APCC)測試組合追蹤疾病臨床前階段之變化來評估相對於初始基線值之臨床前AD發作或進展之延遲。APCC經開發為敏感工具，以檢測及追蹤具有進展為遲發型AD (LOAD)之臨床階段風險之個體的認知下降(Langbaum JB等人，2014)。 可藉由量測因AD引起之認知及功能損害的延遲、例如藉由量測因AD引起之輕度認知損害(Mild Cognitive Impairment；MCI)及/或因AD引起之失智症之臨床診斷時間之延遲來評估臨床AD發作之延遲。由美國國立衰老研究院-阿茲海默症協會工作組提出之核心臨床診斷準則可用於(例如)診斷MCI (Albert MS等人，2011)或失智症(McKhann GM等人，2011)。歐洲藥物管理局(European Medicines Agency，EMA)在其「Draft guidelines on the clinical investigation of medicines for the treatment of AD and other dementias」 (EMA/人用藥品委員會(Committee for Medicinal Products for Human Use，CHMP)/539931/2014)中概述美國國立衰老研究院準則可用於診斷因AD引起之MCI及AD失智症，如下文所陳述。 因AD引起之MCI之診斷需要個體內衰弱的證據，該證據係藉由以下來表現： a) 與先前達到之水準之認知上的變化，如由自我或填報者報告及/或臨床醫師之判斷所記錄。 b) 相對於年齡及教育匹配之標準值，至少一個域之受損認知(但不一定為情節記憶)；容許一個以上認知域之損害。 c) 在功能能力上保持獨立性，但該準則亦接受實施工具性日常生活活動能力(instrumental activities of daily living，IADL)中之「輕度問題」，即便當此只有在輔助下才可達成時(換言之，非堅決要求獨立性，該準則容許因功能損失所引起之輕度依賴性)。 d) 無失智症，此名義性地就是隨(前項)c 而變化。 e) 在沒有潛在癡呆病症下呈現與AD之表型一致之臨床表現。增加之診斷信心可藉由以下來表明： 1) 最佳：陽性Aβ生物標記及陽性退化生物標記 2) 次最佳： i. 陽性Aβ生物標記，無退化生物標記 ii. 陽性退化生物標記，未測試Aβ生物標記 AD失智症之診斷需要： a) 失智症之存在，如藉由個體內認知及功能下降所測定。 b) 隱匿發作及進展性認知下降。 c) 兩個或多個認知域之損害；儘管遺忘表現最為常見，但該準則容許基於非遺忘表現(例如執行功能及視覺空間能力之損害)之診斷。 d) 不存在與其他癡呆病症相關之明顯特徵。 e) 增加之診斷信心可藉由在上文由AD引起之MCI部分中論述之生物標記算法來表明。 由AD引起之MCI及AD失智症之診斷中之認知損害及下降可使用用來追蹤疾病之臨床階段變化之敏感認知量測來量測，例如，使用以下來量測： a) 臨床失智評定(Clinical Dementia Rating，CDR)量表-框得分總和(Sum of Boxes，SOB)。CDR係評估認知及功能性能之整體量測且廣泛用於AD之臨床研究中(Morris JC, 1993)。該量表評估六個域：記憶、定向、判斷及解決問題、社區事務、家居生活及自我照護。對每一域分配分值，對該等分值求和以獲得框得分總和(SOB)分值； b) 神經心理狀態評估可重複性成套測試(Repeatable Battery for the Assessment of Neuropsychological Status，RBANS)。RBANS (Randolph C, 1998)係特定地設計用於診斷目的及追蹤神經認知狀態隨時間之變化二者之臨床工具。該成套測試之關鍵設計目標之一係檢測及表徵極輕失智症；或 c) 日常認知量表(Everyday Cognition Scale，ECog)。ECog量測認知相關日常能力，包括39個覆蓋6個認知相關域之項目：日常記憶、日常語言、日常視覺空間能力、日常計劃、日常組織及日常分配性注意(Farias ST等人，2008)。 適用於診斷由AD引起之MCI及AD失智症之Aβ生物標記包括(例如)腦中之CSF Aβ 1-40、Aβ 1-42或β類澱粉神經炎性斑塊之PET成像，如上文所闡述。 適用於診斷由AD引起之MCI及AD失智症之退化生物標記係如上文關於用於評估臨床前AD之發作或進展之延遲之活體內分子生物標記所闡述且包括(例如)對潛在tau病理學之效應；對神經元葡萄糖代謝之效應；或腦體積損失之減慢之下降。 如本文所用術語「病患」係指人類個體。 如本文所用術語「具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患」係指： (a) 具有發展阿茲海默症臨床症狀之遺傳傾向性之人類個體，例如： i. 攜帶類澱粉前體蛋白(APP)或早老素-1及早老素-2之基因之突變之個體(O’Brien RJ, Wong PC, 2011)，或 ii. 攜帶ApoE4等位基因之一或兩個拷貝之個體(Liu CC等人，2013)； (b) 患有唐氏症候群之人類個體(Head E等人，2012)；或 (c) 超過84歲齡之人類個體。 如本文所用術語「類澱粉陽性」係指在腦中具有可檢測量之累積Aβ之病患。在一個實施例中，若基於CSF中之Aβ或類澱粉PET成像或二者之評估，病患在腦中具有可檢測量之累積Aβ則病患為「類澱粉陽性」。如本文所用術語「藉由PET確定之類澱粉陽性」係指與背景相比類澱粉PET示蹤劑保留之程度有所增加。適於量測類澱粉陽性之PET示蹤劑包括¹⁸ F-氟比他匹(Palmqvist S等人，2015)、¹⁸ F-氟比他苯(¹⁸ F-florbetaben) (NeuraCeq)及¹⁸ F-氟美他莫(¹⁸ F-flutemetamol) (Vizamyl)。舉例而言，可使用腦¹⁸ F-氟比他匹PET掃描(每一掃描260 MBq)上1.1或更高之SUVR作為類澱粉陽性診斷臨限值(Schreiber S等人，2015)。亦可使用1.2或1.3之SUVR作為臨限值。 如本文所用術語「藉由CSF量測確定之類澱粉陽性」係指與在健康對照組中觀察到者相比降低之CSF Aβ 1-42值。舉例而言，可藉由CSF中192 ng/L或更小之Aβ 1-42值來確定類澱粉陽性(Mattsson N等人，2015)。Aβ 1-42值可使用標準免疫分析技術來量測，例如使用Luminex平臺上之單株單一抗體夾心酶聯免疫吸附分析(ELISA)來量測(Herskovitz AZ等人，2013)。然而，用於確定類澱粉陽性之CSF Aβ 1-42截止值將端視所用具體技術而變化(Forlenza OV等人，2015)。 如本文所用術語「CYP3A4」係指細胞色素P450 3A4。CYP3A4係在眾多藥物之代謝中起主要作用之酶(Luo G等人，2004)。 如本文所用術語「CYP3A4之誘導物」係指使得CYP3A4活性程度增加之藥物。CYP3A4誘導物之實例包括(但不限於)卡巴馬平(carbamazepine)、苯妥英(phenytoin)、利福平(rifampicin)及聖約翰草(St John’s wort)。適於量測CYP3A4活性之技術眾所周知(例如參見，Sevrioukova IF及Poulos TL, 2015)。CYP3A4之「強」、「中等」及「弱」誘導物係使化合物1之血漿曲線下面積(AUC) (計算為0至無窮大之曲線下面積(AUCinf))分別降低≥80%、≥50%至＜80%及≥20%至＜50%之藥物。在一個實施例中，「CYP3A4之誘導物」係「CYP3A4之強誘導物」。CYP3A之強誘導物之實例包括(但不限於)卡巴馬平、恩雜魯胺(enzalutamide)、米托坦(mitotane)、苯妥英、雷發平(rifampin) (亦稱為利福平)及聖約翰草。CYP3A之中等誘導物之實例包括(但不限於)波生坦(bosentan)、依法韋侖(efavirenz)、依曲韋林(etravirine)及莫達非尼(modafinil)。CYP3A之弱誘導物之實例包括(但不限於)阿莫達非尼(armodafinil)及盧非醯胺(rufinamide)。參見http://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/DevelopmentResources/ DrugInteractionsLabeling/ucm093664.htm#table3-3 (2016年10月11日最後一次訪問)。 如本文所用術語「CYP3A4之抑制劑」係指使得CYP3A4活性程度降低之藥物。適於量測CYP3A4活性之技術眾所周知(例如參見，Sevrioukova IF及Poulos TL, 2015)。CYP3A4抑制劑之實例包括(但不限於)克拉黴素(clarithromycin)、葡萄柚汁及伊曲康唑(itraconazole)。CYP3A4之「強」、「中等」及「弱」抑制劑係使化合物1之血漿AUC (計算為0至無窮大之曲線下面積(AUCinf))分別增加≥5倍、≥2倍至＜5倍及≥1.25倍至＜2倍之藥物。在一個實施例中，「CYP3A4之抑制劑」係「CYP3A4之強抑制劑」。CYP3A之強抑制劑之實例包括(但不限於)波普瑞韋(boceprevir)、可比西他(cobicistat)、考尼伐坦(conivaptan)、丹諾普韋(danoprevir)及利托那韋(ritonavir)、埃替格韋(elvitegravir)及利托那韋、葡萄柚汁、茚地那韋(indinavir)及利托那韋、伊曲康唑、酮康唑(ketoconazole)、洛匹那韋(lopinavir)及利托那韋、帕利瑞韋(paritaprevir)及利托那韋及(奧比他韋(ombitasvir)及/或達薩布韋(dasabuvir))、泊沙康唑(posaconazole)、利托那韋、沙奎那韋(saquinavir)及利托那韋、特拉匹韋(telaprevir)、替拉那韋(tipranavir)及利托那韋、醋竹桃黴素(troleandomycin)、伏立康唑(voriconazole)、克拉黴素、地爾硫卓(diltiazem)、艾代拉裏斯(idelalisib)、奈法唑酮(nefazodone)及奈芬那韋(nelfinavir)。CYP3A之中等抑制劑之實例包括(但不限於)阿瑞匹坦(aprepitant)、希美替定(cimetidine)、環丙沙星(ciprofloxacin)、克黴唑(clotrimazole)、克唑替尼(crizotinib)、環孢素(cyclosporine)、決奈達隆(dronedarone)、紅黴素(erythromycin)、氟康唑(fluconazole)、氟伏沙明(fluvoxamine)、伊馬替尼(imatinib)、托非索泮(tofisopam)及維拉帕米(verapamil)。CYP3A之弱抑制劑之實例包括(但不限於)氯唑沙宗(chlorzoxazone)、西洛他唑(cilostazol)、福沙匹坦(fosaprepitant)、伊曲茶鹼(istradefylline)、伊伐卡托(ivacaftor)、洛美他派(lomitapide)、雷尼替丁(ranitidine)、雷諾嗪(ranolazine)、他克莫司(tacrolimus)及替格雷洛(ticagrelor)。參見http://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/DevelopmentResources/DrugInteractionsLabeling/ucm093664.htm#table3-2 (2016年10月11日最後一次訪問)。 本文所用術語「用CYP3A4之抑制劑或誘導物同時治療」係指其中病患經受利用CYP3A4之抑制劑或誘導物之治療方案同時亦經受利用化合物1之治療方案之情形。在一個實施例中，病患並非同時用CYP3A4之抑制劑或誘導物及化合物1治療達長於1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週或16週。在另一實施例中，病患並非同時用CYP3A4之抑制劑或誘導物及化合物1治療達長於1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、7個月、10個月或12個月。在某一實施例中，病患並非同時用CYP3A4之抑制劑或誘導物及化合物1治療達長於3個月。 如本文所用術語「醫藥上可接受之鹽」係指保留本發明化合物之生物有效性且通常在生物或其他方面並非不合意之鹽(Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, 第2修訂版(2011) P. Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth)。 本文所用「醫藥組合物」包含本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽及至少一種醫藥上可接受之載劑，其呈適於經口投與之固體形式(通常明膠膠囊)。 術語本發明化合物之「治療有效量」係指本發明化合物將在病患中引發BACE-1之抑制(如藉由相對於初始基線值CSF或血漿Aβ 1-40含量之降低所證明)之量。 出於澄清，每當本文提供範圍時，該範圍意欲包括本數。舉例而言，介於30 mg/天與50 mg/天之間之劑量範圍亦包含30 mg/天及50 mg/天之劑量。 縮寫清單實例 以下實例闡釋可如何製備化合物1 (實例 1 )；展示化合物1在野生型小鼠中在不存在利用比較劑化合物NB-360觀察到之不合意毛髮變色副作用下可有效地降低Aβ含量(實例 2 )；顯示化合物1在APOE4轉基因小鼠模型中之PK/PD效應(實例 3 )；顯示化合物1在首次於人類中之臨床研究中之PD效應(實例 4 )；展示化合物1在3個月臨床研究中之安全性及耐受性(實例 5 )；顯示在3個月臨床研究中ApoE4基因型對化合物1 PD反應之效應(實例 6 )；展示化合物1在APP23 AD小鼠模型中在降低類澱粉斑塊數量及面積方面之治療有效性(實例 7 )；闡釋在ApoE4同型合子有風險病患中可如何實施化合物效能研究(實例 8 )；且顯示在與CYP3A4之強抑制劑或誘導物組合給予時化合物1之AUC如何受影響(實例 9 )。實例 1 ：化合物 1 之製備 化合物1之製備闡述於WO 2012/095469 A1 (實例34)中。化合物1亦可如下文所闡述來製備。NMR 方法 除非另外說明，否則在Bruker 400 MHz超屏蔽光譜儀上記錄質子譜。化學位移係相對於甲醇(δ 3.31)、二甲亞碸(δ 2.50)或氯仿(δ 7.29)以ppm來報告。將少量乾燥試樣(2-5 mg)溶解於適當氘化溶劑(0.7 mL)中。自動化勻場並根據熟習此項技術者熟知之程序獲得光譜。一般層析資訊 HPLC 方法 H1 (Rt_H1 ) ： HPLC管柱尺寸： 3.0 × 30 mm HPLC管柱類型： Zorbax SB-C18, 1.8 µm HPLC-溶析劑： A)水+ 0.05 Vol.-% TFA；B) ACN + 0.05 Vol.-% TFA HPLC-梯度： 30-100 % B保持3.25分鐘，流速= 0.7 ml / minLCMS 方法 H2 (Rt_H2 ) ： HPLC管柱尺寸： 3.0 × 30 mm HPLC管柱類型： Zorbax SB-C18, 1.8 µm HPLC-溶析劑： A)水+ 0.05 Vol.-% TFA, B) ACN + 0.05 Vol.-% TFA HPLC-梯度： 10-100 % B保持3.25分鐘，流速= 0.7 ml /分鐘UPLCMS 方法 H3 (Rt_H3 ) ： HPLC管柱尺寸： 2.1 × 50 mm HPLC管柱類型： Acquity UPLC HSS T3, 1.8 µm HPLC-溶析劑： A)水+ 0.05 Vol.-%甲酸+ 3.75 mM乙酸銨B) ACN + 0.04 Vol.-%甲酸 HPLC-梯度： 2-98 % B保持1.4分鐘，98% B 0.75分鐘，流速= 1.2 ml /分鐘 HPLC管柱溫度： 50℃LCMS 方法 H4 (Rt_H4 ) ： HPLC管柱尺寸： 3.0 × 30 mm HPLC管柱類型： Zorbax SB-C18, 1.8 µm HPLC-溶析劑： A)水+ 0.05 Vol.-% TFA；B) ACN + 0.05 Vol.-% TFA HPLC-梯度： 70-100 % B保持3.25分鐘，流速=0.7 ml/分鐘LCMS 方法 H5 (Rt_H5 ) ： HPLC管柱尺寸： 3.0 × 30 mm HPLC管柱類型： Zorbax SB-C18, 1.8 µm HPLC-溶析劑： A)水+ 0.05 Vol.-% TFA；B) ACN + 0.05 Vol.-% TFA HPLC-梯度： 80-100 % B保持3.25分鐘，流速= 0.7 ml /分鐘LCMS 方法 H6 (Rt_H6 ) ： HPLC管柱尺寸： 3.0 × 30 mm HPLC管柱類型： Zorbax SB-C18, 1.8 µm HPLC-溶析劑： A)水+ 0.05 Vol.-% TFA；B) ACN + 0.05 Vol.-% TFA HPLC-梯度： 40-100 % B保持3.25分鐘，流速= 0.7 ml /分鐘a) 2- 溴 -5- 氟 -4- 三乙基矽烷基 - 吡啶 在-75℃下用乾冰丙酮浴冷卻二異丙胺(25.3 g, 250 mmol)於370 ml THF中之溶液。逐滴添加BuLi (100 ml, 250 mmol, 2.5 M於己烷中)同時維持溫度低於-50℃。在混合物之溫度已再次達到-75℃之後，逐滴添加2-溴-5-氟吡啶(36.7 g, 208 mmol)於45 ml THF中之溶液。將混合物在-75℃下攪拌1 h。快速添加三乙基氯矽烷(39.2 g, 260 mmol)。溫度保持低於-50℃。去除冷卻浴並使反應混合物升溫至-15℃，倒入NH₄ Cl水溶液(10%)中。添加TBME並分離各層。用鹽水洗滌有機層，用MgSO₄ .H₂ O乾燥，過濾並蒸發以得到褐色液體，在0.5 mm Hg下對其進行蒸餾以得到淺黃色液體狀標題化合物(b.p. 105-111℃)。HPLC: Rt_H4 = 2.284 min；ESIMS: 290, 292 [(M+H)⁺ , 1Br]；¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ): 8.14 (s, 1H), 7.40 (d, 1H), 1.00-0.82 (m, 15H)。b) 1-(6- 溴 -3- 氟 -4- 三乙基矽烷基 - 吡啶 -2- 基 )- 乙酮 使二異丙胺(25.4 g, 250 mmol)於500 ml THF中之溶液冷卻至-75℃。逐滴添加BuLi (100 ml, 250 mmol, 2.5 M於己烷中)同時維持溫度低於-50℃。在反應溫度已再次達到-75℃之後，逐滴添加2-溴-5-氟-4-三乙基矽烷基-吡啶(56.04 g, 193 mmol)於60 ml THF中之溶液。將混合物在乾燥冰浴中攪拌70分鐘。快速添加N,N-二甲基乙醯胺(21.87 g, 250 mmol)，使反應溫度上升至-57℃。將反應混合物在乾燥冰浴中攪拌15分鐘，接著使其升溫至-40℃。將其倒入2M HCl水溶液(250 ml, 500 mmol)、250 ml水及100 ml鹽水之混合物中。用TBME萃取混合物，用鹽水洗滌，經MgSO₄ .H₂ O乾燥，過濾並蒸發以得到黃色油狀物，在矽膠管柱上藉由用己烷/0-5% TBME溶析對其進行純化以得到58.5 g黃色液體狀標題化合物。TLC (Hex/TBME 99/1): R_f = 0.25；HPLC: Rt_H4 = 1.921 min；ESIMS: 332, 334 [(M+H)⁺ , 1Br]；¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ): 7.57 (d, 1H), 2.68 (s, 3H), 1.00-0.84 (m, 15H)。c) (S)-2-(6- 溴 -3- 氟 -4- 三乙基矽烷基 - 吡啶 -2- 基 )-2- 三甲基矽烷基氧基 - 丙腈 首先，藉由將水(54 mg, 3.00 mmol)溶解於100 ml無水DCM (≦0.001%水)中來製備觸媒溶液。將此濕DCM (44 ml, 1.32 mmol水含量)添加至丁醇鈦(IV) (500 mg, 1.47 mmol)於20 ml無水DCM充分攪拌之溶液中。將所得澄清溶液回流1小時。然後使此溶液冷卻至室溫並添加2,4-二-第三丁基-6-{[(E)-(S)-1-羥基甲基-2-甲基-丙基亞胺基]-甲基}-酚[CAS 155052-31-6] (469 mg, 1.47 mmol)。將所得黃色溶液在室溫下攪拌1小時。將此觸媒溶液(0.023 M, 46.6 ml, 1.07 mmol)添加至1-(6-溴-3-氟-4-三乙基矽烷基-吡啶-2-基)-乙酮(35.53 g, 107 mmol)及三甲基氰矽烷(12.73 g, 128 mmol)於223 ml無水DCM中之溶液中。將混合物攪拌2天並蒸發以得到47 g橙色油狀粗標題化合物。HPLC: Rt_H5 = 2.773 min；ESIMS: 431, 433 [(M+H)⁺ , 1Br]；¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ): 7.46 (d, 1H), 2.04 (s, 3H), 1.00 (t, 9H), 1.03-0.87 (m, 15H), 0.20 (s, 9H)。d) (R)-1- 胺基 -2-(6- 溴 -3- 氟 -4- 三乙基矽烷基 - 吡啶 -2- 基 )- 丙 -2- 醇鹽酸鹽 將硼烷二甲硫複合物(16.55 g, 218 mmol)添加至粗製(S)-2-(6-溴-3-氟-4-三乙基矽烷基-吡啶-2-基)-2-三甲基矽烷基氧基-丙腈(47 g, 109 mmol)於470 ml THF中之溶液中。將混合物回流2小時。去除加熱浴並藉由小心且逐滴添加MeOH來淬滅反應混合物。在停止氣體逸出之後，緩慢添加6 M HCl水溶液(23.6 ml, 142 mmol)。蒸發所得溶液並將殘餘物溶解於MeOH中並蒸發(兩次)以得到44.5 g黃色泡沫狀物，其純度足以用於其他反應。HPLC: Rt_H1 = 2.617 min；ESIMS: 363, 365 [(M+H)⁺ , 1Br]；¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ): 7.93 (s, br, 3H), 7.53 (d, 1H), 6.11 (s, br, 1H), 3.36-3.27 (m, 1H), 3.18-3.09 (m, 1H), 1.53 (s, 3H), 0.99-0.81 (m, 15H)。e) (R)-N-(2-(6- 溴 -3- 氟 -4-( 三乙基矽基 ) 吡啶 -2- 基 )-2- 羥基丙基 )-4- 硝基苯磺醯胺 向粗製(R)-1-胺基-2-(6-溴-3-氟-4-三乙基矽烷基-吡啶-2-基)-丙-2-醇鹽酸鹽(43.5 g, 109 mmol)於335 ml THF中之溶液中添加NaHCO₃ (21.02 g, 250 mmol)於500 ml水中之溶液。使混合物冷卻至0-5℃並逐滴添加4-硝基苯磺醯氯(26.5 g, 120 mmol)於100 ml THF中之溶液。將所得乳液攪拌過夜同時容許溫度達到室溫。用TBME萃取混合物。用MgSO₄ .H₂ O乾燥有機層，過濾並蒸發以得到橙色樹脂，在矽膠管柱上藉由用己烷/10-20% EtOAc溶析對其進行純化以得到37.56 g黃色樹脂狀標題化合物。TLC (Hex/EtOAc 3/1): R_f = 0.34；HPLC: Rt_H4 = 1.678 min；ESIMS: 548, 550 [(M+H)⁺ , 1Br]；¹ H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ): 8.40 (d, 2H), 8.06 (t, 1H), 7.97 (d, 2H), 7.45 (d, 1H), 5.42 (s, 1H), 3.23 (d, 2H), 1.44 (s, 3H) 0.97-0.81 (m, 15H)；手性HPLC (Chiralpak AD-H 1213, UV 210 nm): 90% ee。f) 6- 溴 -3- 氟 -2-[(S)-2- 甲基 -1-(4- 硝基 - 苯磺醯基 )- 氮丙啶 -2- 基 ]-4- 三乙基矽烷基 - 吡啶 使三苯基膦(21.55 g, 82 mmol)及(R)-N-(2-(6-溴-3-氟-4-(三乙基矽基)吡啶-2-基)-2-羥基丙基)-4-硝基苯磺醯胺(37.56 g, 69 mmol)於510 ml THF中之溶液冷卻至4℃。逐滴添加偶氮二甲酸二乙基酯於甲苯中之溶液(40重量%, 38.8 g, 89 mmol)同時維持溫度低於10℃。去除冷卻浴並將反應混合物在室溫下攪拌1小時。用約1000 ml甲苯稀釋反應混合物並藉由在旋轉蒸發器處蒸發去除THF。在矽膠管柱上藉由用己烷/5-17% EtOAc溶析來預純化所得粗產物之甲苯溶液。合併最純流份，蒸發並自TBME/己烷結晶，以得到29.2 g白色晶體狀標題化合物。HPLC: Rt_H4 = 2.546 min；ESIMS: 530, 532 [(M+H)⁺ , 1Br]；¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ): 8.40 (d, 2H), 8.19 (d, 2H), 7.39 (d, 1H), 3.14 (s, 1H), 3.02 (s, 1H), 2.01 (s, 3H) 1.03 – 0.83 (m, 15H)；a[D] -35.7° (c = 0.97, DCM)。g) 6- 溴 -3- 氟 -2-[(S)-2- 甲基 -1-(4- 硝基 - 苯磺醯基 )- 氮丙啶 -2- 基 ]- 吡啶 將氟化鉀(1.1 g, 18.85 mmol)添加至6-溴-3-氟-2-[(S)-2-甲基-1-(4-硝基-苯磺醯基)-氮丙啶-2-基]-4-三乙基矽烷基-吡啶(5 g, 9.43 mmol)及AcOH (1.13 g, 9.43 mmol)於25 ml THF中之溶液中。添加DMF (35 ml)並將懸浮液在室溫下攪拌1小時。將反應混合物倒入飽和NaHCO₃ 水溶液及TBME之混合物中。分離各層並用鹽水及TBME洗滌。將合併之有機層經MgSO₄ .H₂ O乾燥，過濾並蒸發以得到黃色油狀物，使其自TBME/己烷結晶，以得到3.45 g白色晶體狀標題化合物。HPLC: Rt_H6 = 2.612 min；ESIMS: 416, 418 [(M+H)⁺ , 1Br]；¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ): 8.41 (d, 2H), 8.19 (d, 2H), 7.48 (dd, 1H), 7.35 (t, 1H), 3.14 (s, 1H), 3.03 (s, 1H), 2.04 (s, 3H)；a[D] -35.7° (c = 0.89, DCM)。h) (R)-2-[(R)-2-(6- 溴 -3- 氟 - 吡啶 -2- 基 )-2-(4- 硝基 - 苯磺醯基胺基 )- 丙氧基 ]-3,3,3- 三氟 -2- 甲基 - 丙酸乙酯 將(R)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基-丙酸乙酯(11.93 g, 64.1 mmol)於DMF (158 ml)中之溶液抽真空/用氮沖洗兩次。逐滴添加KOtBu (6.21 g, 55.5 mmol)於DMF (17 ml)中之溶液同時使用水浴冷卻維持約25℃之反應溫度。15分鐘後，添加固體6-溴-3-氟-2-[(S)-2-甲基-1-(4-硝基-苯磺醯基)-氮丙啶-2-基]-吡啶(17.78 g, 42.7 mmol)並繼續攪拌3小時。將反應混合物倒入1M HCl (56 ml)、鹽水及TBME之混合物中。分離各層，用鹽水及TBME洗滌。經MgSO₄ ^. H₂ O乾燥合併之有機層，過濾並蒸發。經由在矽膠(己烷/25-33% TBME)上層析來純化粗反應產物以得到16.93 g經異構副產物污染之黃色樹脂狀標題化合物(比率70:30，藉由¹ H-NMR)。 HPLC: Rt_H6 = 2.380 min；ESIMS: 602, 604 [(M+H)⁺ , 1Br]；¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ): 8.32 (d, 2H), 8.07 (d, 2H), 7.46 – 7.41 (m, 1H), 7.30 – 7.23 (m, 1H), 6.92 (s, 1H), 3.39 – 4.30 (m, 2H), 3.95 (d, 1H), 3.84 (d, 1H), 1.68 (s, 3H), 1.56 (s, 3H), 1.40-1.34 (m, 3H) +異構副產物。i) (R)-2-[(R)-2-(6- 溴 -3- 氟 - 吡啶 -2- 基 )-2-(4- 硝基 - 苯磺醯基胺基 )- 丙氧基 ]-3,3,3- 三氟 -2- 甲基 - 丙醯胺 將(R)-2-[(R)-2-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-(4-硝基-苯磺醯基胺基)-丙氧基]-3,3,3-三氟-2-甲基-丙酸乙酯(16.93 g, 28.1 mmol)於NH₃ /MeOH (7M, 482 ml)中之溶液在50℃下在密封容器中攪拌26小時。蒸發反應混合物並使殘餘物自DCM結晶以得到9.11 g無色晶體狀標題化合物。 HPLC: Rt_H6 = 2.422 min；ESIMS: 573, 575 [(M+H)⁺ , 1Br]；¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ): 8.33 (d, 2H), 8.06 (d, 2H), 7.42 (dd, 1H), 7.30 – 7.26 (m, 1H), 7.17 (s, br, 1H), 6.41 (s, 1H), 5.57 (s, br, 1H), 4.15 (m, 2H), 1.68 (s, 3H), 1.65 (s, 3H)。j) N-[(R)-1-(6- 溴 -3- 氟 - 吡啶 -2- 基 )-2-((R)-1- 氰基 -2,2,2- 三氟 -1- 甲基 - 乙氧基 )-1- 甲基 - 乙基 ]-4- 硝基 - 苯磺醯胺 使(R)-2-[(R)-2-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-(4-硝基-苯磺醯基胺基)-丙氧基]-3,3,3-三氟-2-甲基-丙醯胺(8.43 g, 14.70 mmol)及三乙胺(5.12 ml, 36.8 mmol)於85 ml DCM中之懸浮液冷卻至0-5℃。經30分鐘逐滴添加三氟乙酸酐(2.49 ml, 17.64 mmol)。添加其他三乙胺(1.54 ml, 11.07 mmol)及三氟乙酸酐(0.75 ml, 5.29 mmol)以完成反應。藉由添加14 ml氨水溶液(25%)及14 ml水淬滅反應混合物。將乳液攪拌15分鐘，添加更多水及DCM並分離各層。用MgSO₄ H₂ O乾燥有機層，過濾並蒸發。藉由在矽膠(己烷/10-25% EtOAc)上管柱層析進行純化得到8.09 g黃色樹脂狀標題化合物。 HPLC: Rt_H6 = 3.120 min；ESIMS: 555, 557 [(M+H)⁺ , 1Br]；¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ): 8.35 (d, 2H), 8.11 (d, 2H), 7.50 (dd, 1H), 7.32 (dd, 1H), 6.78 (s, 1H), 4.39 (d 1H), 4.22 (d, 1H), 1.68 (s, 6H)。k) (2R,5R)-5-(6- 溴 -3- 氟 - 吡啶 -2- 基 )-2,5- 二甲基 -2- 三氟甲基 -5,6- 二氫 -2H-[1,4] 㗁 𠯤 -3- 基胺 將N-[(R)-1-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2-((R)-1-氰基-2,2,2-三氟-1-甲基-乙氧基)-1-甲基-乙基]-4-硝基-苯磺醯胺(9.18 g, 16.53 mmol)及N-乙醯基半胱胺酸(5.40 g, 33.10 mmol)於92 ml乙醇中之溶液抽真空並用氮沖洗。添加K₂ CO₃ (4.57 g, 33.1 mmol)並將混合物在80℃下攪拌3天。在真空中將反應混合物濃縮至最初體積之約1/4並將其分配於水與TBME之間。用10% K₂ CO₃ 水溶液洗滌有機層，經Na₂ SO₄ 乾燥，過濾並蒸發以得到黃色油狀物。在二氧化矽(己烷/14-50% (EtOAc:MeOH 95:5))上管柱層析得到4.55 g灰白色固體狀標題化合物。 HPLC: Rt_H2 = 2.741 min；ESIMS: 370, 372 [(M+H)⁺ , 1Br]；¹ H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ): 7.71 – 7.62 (m, 2H), 5.97 (s, br, 2H), 4.02 (d 1H), 3.70 (d, 1H), 1.51 (s, 3H), 1.47 (s, 3H)。l) (2R, 5R)-5-(6- 胺基 -3- 氟 - 吡啶 -2- 基 )-2,5- 二甲基 -2- 三氟甲基 -5,6- 二氫 -2H-[1,4] 㗁 𠯤 -3- 基胺 用氮吹掃玻璃/不銹鋼高壓釜。添加於乙二醇(130 ml)中之Cu₂ O (0.464 g, 3.24 mmol)、氨(101 ml, 25%, aq., 648 mmol, 30當量)及(2R,5R)-5-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氫-2H-[1,4]㗁𠯤-3-基胺(8 g, 21.6 mmol)。閉合高壓釜並將懸浮液加熱至60℃並將溶液攪拌約48小時(最大壓力0.7巴(bar)，內部溫度59-60℃)。使用乙酸乙酯及水稀釋反應混合物。用水洗滌有機相並用12%氨水溶液洗滌4次且最後用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發。粗產物(7 g，含有一些乙二醇，定量產率)不經進一步純化即用於下一步驟中。 HPLC: Rt_H3 = 0.60 min；ESIMS: 307 [(M+H)⁺ ]。m) [(2R, 5R)-5-(6- 胺基 -3- 氟 - 吡啶 -2- 基 )-2,5- 二甲基 -2- 三氟甲基 -5,6- 二氫 -2H-[1,4] 㗁 𠯤 -3- 基 ]- 胺基甲酸第三丁基酯 在室溫下將(2R, 5R)-5-(6-胺基-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氫-2H-[1,4]㗁𠯤-3-基胺(6.62 g, 21.6 mmol)、Boc₂ O (4.72 g, 21.6 mmol)及休尼格鹼(Hünig’s base) (5.66 ml, 32.4 mmol)於二氯甲烷(185 ml)中之溶液攪拌18小時。用飽和NaHCO₃ 水溶液及鹽水洗滌反應混合物。用二氯甲烷反萃取水層並將合併之有機層經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發以得到淺綠色固體(14 g)。在矽膠(環己烷:乙酸乙酯95:5至60:40)上層析粗產物以得到7.68 g標題化合物。 TLC (環己烷:乙酸乙酯3:1): R_f = 0.21；HPLC: Rt_H3 = 1.14 min；ESIMS: 408 [(M+H)⁺ ]；¹ H-NMR (400 MHz, CDCl3): 11.47 (br. s, 1H), 7.23 (dd,J =10.42, 8.78 Hz, 1H), 6.45 (dd,J =8.78, 2.64 Hz, 1H), 4.50 (br. s, 2H), 4.32 (d,J =2.38 Hz, 1H), 4.10 (d,J =11.80 Hz, 1H), 1.69 (s, 3H, CH3), 1.65 (s, 3H, CH3), 1.55 (s, 9H)。n) ((2R, 5R)-5-{6-[(3- 氯 -5- 三氟甲基 - 吡啶 -2- 羰基 )- 胺基 ]-3- 氟 - 吡啶 -2- 基 }-2,5- 二甲基 -2- 三氟甲基 -5,6- 二氫 -2H-[1,4] 㗁 𠯤 -3- 基 )- 胺基甲酸第三丁基酯 將[(2R, 5R)-5-(6-胺基-3-氟-吡啶-2-基)-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氫-2H-[1,4]㗁𠯤-3-基]-胺基甲酸第三丁基酯(3.3 g, 8.12 mmol)、3-氯-5-三氟甲基吡啶甲酸(2.2 g, 9.74 mmol)、HOAt (1.99 g, 14.62 mmol)及EDC鹽酸鹽(2.33 g, 12.18 mmol)於DMF (81 ml)中之混合物在室溫下攪拌48小時。使用乙酸乙酯稀釋反應混合物，並用水及鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發。在矽膠(環己烷至環己烷:乙酸乙酯1:1)上層析粗產物(12 g)以得到5.2 g標題化合物。 TLC (二氧化矽，環己烷:乙酸乙酯3:1): R_f =0.47；HPLC: Rt_H3 = 1.40 min；ESIMS: 615, 616 [(M+H)⁺ , 1Cl]；¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃ ): 11.68 (s, 1H), 10.41 (s, 1H), 8.81 (dd,J =1.82, 0.69 Hz, 1 H), 8.45 (dd,J =8.91, 3.14 Hz, 1 H), 8.19 (dd,J =1.88, 0.63 Hz, 1 H), 7.59 (dd,J =9.79, 9.16Hz, 1 H), 4.38 (d,J =2.13 Hz, 1 H), 4.18 (d,J =11.80 Hz, 1 H), 1.75 (s, 3H), 1.62 (s, 3H), 1.60 (s, 9H)。o) 3- 氯 -5- 三氟甲基 - 吡啶 -2- 甲酸 [6-((3R,6R)-5- 胺基 -3,6- 二甲基 -6- 三氟甲基 -3,6- 二氫 -2H-[1,4] 㗁 𠯤 -3- 基 )-5- 氟 - 吡啶 -2- 基 ]- 醯胺 將((2R, 5R)-5-{6-[3-氯-5-三氟甲基-吡啶-2-羰基)-胺基]-3-氟-吡啶-2-基}-2,5-二甲基-2-三氟甲基-5,6-二氫-2H-[1,4]㗁𠯤-3-基)-胺基甲酸第三丁基酯(4.99 g, 8.13 mmol)及TFA (6.26 ml, 81 mmol)於二氯甲烷(81 ml)中之混合物在室溫下攪拌18小時。蒸發溶劑並用適宜有機溶劑(例如乙酸乙酯及氨水溶液)稀釋殘餘物。添加冰並用水及鹽水洗滌有機相，經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發以得到3.78 g標題化合物。 HPLC: Rt_H3 = 0.87 min；ESIMS: 514, 516 [(M+H)⁺ , 1Cl]；¹ H-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 11.11 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.13 (dd,J = 8.8, 2.6 Hz, 1H), 7.80 – 7.68 (m, 1H), 5.88 (br. s, 2H), 4.12 (d,J = 11.5 Hz, 1H), 3.72 (d,J = 11.4 Hz, 1H), 1.51 (s, 3H), 1.49 (s, 3H)。實例 2 ：在 野生型 小鼠中 化合物 1 及 比較劑 化合物 NB-360 之長期 投藥 在商業野生型小鼠中實施本文所闡述之研究，以便研究化合物1尤其對毛皮變色之長期治療效應，以確定在野生型小鼠中之有效劑量，且將效能與毛皮色彩變化間之窗口與比較劑BACE-1抑制劑化合物NB-360 (N -(3-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H-1,4-㗁𠯤-3-基)-4-氟苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶醯胺)進行比較(Neumann U等人，2015；及Shimshek DR等人，2016)。動物 C57BL/6小鼠係在Charles River Laboratories, France處訂購的。化合物調配及投藥 將化合物1及NB-360調配為懸浮液。每天一次(上午)以10 ml/kg之體積經口給予媒劑、化合物1或NB-360達8週。媒劑：於0.5 %甲基纖維素水溶液中之0.1 % Tween80。體重及毛皮色彩評分 每週三次(星期一、星期三、星期五)秤取體重。每週一次(星期三)實施任何毛髮色彩變化之主觀評分。分值(具有灰色毛皮之身體之%)：0：無變化；1：斑點；2：＞ 30%；3：＞50%；4：＞75%；5：100%。當觀察到毛皮色彩變化時，照相記載動物。最終毛皮色彩評分係以盲化方式且由不參與研究之人員實施。 離體試樣及試樣收穫方法 使用血液試樣來分析全血化合物含量且其係在生命中部分期間自尾靜脈獲得至EDTA管(CB300, Sarstedt, Germany)中或在屍體剖檢當天自軀幹血液獲得至EDTA埃彭道夫管(Eppendorf tube)(Milian SA, CatNoTOM-14, Fisher Scientific, Wohlen, Switzerland)中或至血清管(CB300Z, Sarstedt, Nümbrecht, Germany)中。 藉由EDTA血液之離心(8000 rpm/6800×g, 15分鐘, 4℃)收集用於類澱粉β (Aβ)分析之血漿並將其收集至蛋白質Lo-Bind埃彭道夫管(003 0108.116, Eppendorf, Hamburg, Germany)中。 20分鐘後，在室溫下，藉由離心(8000×g, 15分鐘, 4℃)分離血清並將其收集至蛋白質Lo-Bind埃彭道夫管中以檢查腎毒性生物標記。在乾冰上冷凍所有血液/血漿/血清試樣並在-80℃下儲存直至分析為止。 在斷頭術之後立即去除腦，用鹽水沖洗並沿中線向下矢狀地切片。使用小腦之左半部分來分析化合物含量並將其置於玻璃管(Chromacol, 125 × 5-SV T051, Welwyn Garden City, United Kingdom)中，稱重並在乾冰中冷凍，使用前腦之左半部分(無嗅球)進行Aβ分析，且在金屬板上在乾冰上進行冷凍並置於蛋白質Lo-bind管(003 0108.116, Eppendorf, Hamburg, Germany)中。 獲取腹部及背部皮膚來分析化合物含量，稱重並在乾冰上冷凍。化合物含量之分析 藉由液相層析/串聯質譜(HPLC/MS/MS)在血液、腦及皮膚中量化生物試樣中之化合物1及NB-360含量。將腦試樣與2體積KH₂ PO₄ 緩衝液混合並使用Covaris®裝置進行均質化。將皮膚試樣與約6倍體積之甲醇/水混合並使用Precellys管進行均質化。30 µL血液、腦或皮膚均質物均摻加結構相關之內標準品且隨後與至少6倍過量體積乙腈混合用於蛋白質沈澱。將上清液直接注射至LC/MS/MS系統中用於分析。表 2 ：用於血液及腦試樣之儀器條件 表 3 ：用於皮膚試樣之儀器條件 小鼠腦中Aβ 1-40之分析 腦均質化 將冷凍小鼠前腦稱重並在9體積(w/v)之冰冷的完整配方TBS(20 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 1× 完整配方 [蛋白酶抑制劑混合劑錠劑：1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany])中藉由音波處理(90%工作週期，輸出控制5，40至55個脈衝，[Sonifier 450, Branson])進行均質化。均質化之後，製備若干50 µl等份試樣用於分析並在-80℃下儲存。 作為標準品之合成Aβ1-40溶液之製備 使用人類Aβ肽(1-40)三氟乙酸鹽(H 1194.1000, Bachem, Bubendorf, Switzerland)作為Aβ1-40之校正曲線。在室溫(RT)下經約30分鐘將其以1 mg/ml之濃度溶解於無水DMSO (41647, Fluka)中，接著視覺檢查完全溶解。 在LoBind管(0030 108.094, Eppendorf, Hamburg, Germany)中製備剩餘溶液之20 × 5 µl等份試樣及100 µl等份試樣，用氮氣覆蓋以便保護Aβ肽免予氧化並在-80℃下儲存。對於校正曲線， 5 µl等份試樣僅使用一次，接著就丟棄。小鼠腦中 Aβ 1-40 之測定 利用Meso Scale Discovery (MSD) 96孔多陣列人類/齧齒類動物(4G8) Aβ 1-40超敏分析(編號K110FTE-3, Meso Scale Discovery, Gaithersburg, USA)測定小鼠中之內源性Aβ 1-40。該分析係根據製造商之說明書來實施(校正曲線及試樣製備除外)。使用1% TX-100從前腦提取TritonX-100 (TX-100)可溶性Aβ 1-40，其係將每一50 μl等份試樣之1:10前腦均質物與溶於完整配方TBS(20 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 1× 完整配方[蛋白酶抑制劑混合劑錠劑：1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, Penzberg Germany])之50 μl 2% TX-100混合，以達到1% TX-100之最終濃度及1:20前腦稀釋物。將試樣在冰上培育15分鐘且每5分鐘加以渦漩震盪。對試樣進行超離心(100000×g, 4℃, 15分鐘)並將50 μl澄清上清液轉移至新管。為進行Aβ 1-40分析，該上清液進一步在3%封阻劑A溶液(來自套組)稀釋1:5稀釋至最終前腦稀釋物為1:100並將其施加至板。 在摻有合成Aβ1-40肽(1.56-100 pg/ml)之1%封阻劑A溶液之相應稀釋物中製備校正曲線，非轉基因小鼠腦試樣除外：在此情形中，在摻有合成Aβ1-40肽(1.56-100 pg/ml)之相應地稀釋之APP剔除小鼠前腦中製備校正曲線。對於所有試樣及標準品，每孔施加25 μl。對於每一測定，均重複兩個孔。使用重複兩個孔之平均值進行計算。由於MSD未提供量化軟體，將試樣及標準品之相對單位輸入SOFTmax PRO 4.0中用於計算標準曲線及量化試樣。結果 在用 NB-360 或化合物 1 長期治療之 C57BL/6 小鼠中對體重及毛皮色彩之效應 用化合物1或NB360將野生型未經治療之小鼠(C57BL/6)長期治療8週且每三天(星期一、星期三、星期五)量測體重。可能未觀察到治療組與媒劑相比之整體顯著體重差異以及在第56天在研究結束時未觀察到顯著差異。然而，對於治療組，可能觀察到顯著體重增加(第0天與第56天之體重比較)。 在研究過程期間，在用NB-360治療之小鼠中觀察到毛皮色彩變化。C57BL/6之黑色毛皮慢慢地以斑紋形式變成灰色。該等灰色斑紋在動物之腹部部分上可見，而背部部分不受影響。灰色斑紋之外觀在3週治療之後顯而易見且在高及低劑量NB-360組中以不同程度存在。實施主觀評分系統以量化毛皮變色。NB-360組中之所有動物皆顯示毛皮變色。儘管低劑量NB-360組(20 µmol/kg)僅顯示輕微但顯著的毛皮分值變化，但高劑量NB-360組(100 µmol/kg)展示更嚴重且顯著的毛皮色彩變化，圖1。令人注目地，毛皮變色之擴延及增加在5週NB-360治療之後達到平臺期而無任何另外變化。重要的是，在化合物1治療組中未檢測到明顯毛皮色彩變化。血液及組織中之暴露 在第一劑量之後第1天、在第14天之中期及在最後一次劑量之後在研究結束時測定血液中之化合物1暴露。最後一天時之暴露始終低於實驗開始時之暴露。化合物1之暴露降低約35%。 在不同組織中在最後24小時內化合物1之暴露(表示為AUC_0-24h )概述於表4中。對於血液，AUC係自1小時、4小時、7小時及24小時時之數據來計算，而且「迷你」 AUC僅係自4小時及24小時時之數據來計算。該兩個值之比較不顯示大的差異。對於組織暴露而言，僅4小時及24小時時之數據可用。可推斷出「迷你」 AUC足以充分代表組織暴露。 對於化合物1及NB-360二者而言，腦及皮膚中之暴露遠遠高於血液，表4。具體而言，皮膚暴露較血液暴露高若干倍。另外，腹部之暴露似乎高於皮膚之背部，尤其於NB-360而言，表5。在所有組織中，皆存在暴露之良好劑量比例性。表 4 ：最後一次劑量 ( 第 56 天 ) 之後各種血液及腦組織中之化合物 AUC_0-24h ^a 來自1 h、4 h、7 h及24 h時間點之AUC；^b 來自4 h及24 h時間點之AUC；^c n=2保持24小時表 5 ： 正規化為血液化合物暴露之組織暴露 ( 低劑量及高劑量之平均值 ) Rel.：相對 – 正規化為AUC血液 小鼠腦中之類澱粉β降低 在研究之最後一天，在接受最後一次劑量之後4小時及24小時將n=4隻小鼠之組處死。分離出前腦，並分析β類澱粉肽1-40。媒劑組及治療組之Aβ1-40之濃度概述於表6中且可見於圖2中。計算相對於相應媒劑治療組之降低之百分比。在最後一次劑量之後4小時，治療引起顯著的Aβ 1-40降低。相對於媒劑，在最後一次劑量之後24小時，化合物1仍顯示Aβ 1-40降低25%，但此不顯著。在高劑量組中，在最後一次劑量之後24小時化合物1顯示顯著更低量之Aβ 1-40。50 µmol/kg化合物1劑量組顯示幾乎平坦的輪廓，其中在整個24小時時程內Aβ 1-40降低80-90%。表 6 ：在最後一次劑量之後在小鼠腦中 BACE 抑制劑治療對 Aβ 1-40 含量之效應 ( 平均值 ± SD ， n=4) n.s.：不顯著 NB-360係雙重BACE-1/BACE-2抑制劑，如藉由BACE-1及BACE-2酶抑制活體外分析所指示(Neumann U等人，(2015))，其對BACE-1之選擇性為BACE-2之1.0倍。在相同分析中，發現化合物1對BACE-1之選擇性為BACE-2之3倍。總之，據信在化合物1與NB-360之間之酶選擇性及組織分佈之中等變化對長期小鼠研究中毛髮變色之發展具有效應。儘管化合物1在活體內具有活性，但在小鼠中未顯示毛髮變色之體徵。實例 3 ：在 APOE4-TR 小鼠中化合物 1 之短期 PK/PD 劑量反應研究 為研究化合物1對人類APOE4情形下APP代謝之效應，在攜帶人類APOE4等位基因之轉基因小鼠中實施PK/PD研究(小鼠Apoe基因由人類APOE4替代；APOE4-TR；(Knouff C等人，1999))。 在此研究中，用化合物1以不同劑量(3, 10, 30 mmol/kg)短期治療3至5月齡之雄性及雌性APOE4-TR動物並在治療後4小時及24小時將其處死。動物 雄性及雌性轉基因同型接合APOE4-TR (B6.129P2-Apoe^{tm3(APOE*4)Mae} N8，Taconic，模型001549，3-5月齡，n=48)係自Taconic獲得。劑量選擇 化合物1係以3 µmol/kg、10 µmol/kg及30 µmol/kg投與。化合物形式、調配物及投藥 將化合物1調配為懸浮液。藉由以10 ml/kg之體積經口投與一次來給予媒劑或化合物。媒劑：於0.5 %甲基纖維素水溶液中之0.1 % Tween80。表 7 ：治療組 體重 投藥前秤取一次體重。離體試樣及試樣收穫方法 使用血液試樣來分析全血化合物含量且其係在屍體剖檢當天自軀幹血液獲得至EDTA埃彭道夫管(Milian SA, CatNoTOM-14, Fisher Scientific, Wohlen, Switzerland)中或至血清管(CB300Z, Sarstedt, Nümbrecht, Germany)中。 藉由EDTA血液之離心(8000 rpm/6800×g, 15分鐘, 4℃)收集用於類澱粉β (Aβ)分析之血漿並將其收集至蛋白質Lo-Bind埃彭道夫管(003 0108.116, Eppendorf, Hamburg, Germany)中。 所有血液/血漿/血清試樣皆在乾冰上冷凍且在-80℃下儲存直至分析為止。 在斷頭術之後立即去除腦，用鹽水沖洗並沿中線向下矢狀地切片。使用左小腦來分析化合物含量並將其置於玻璃管(Chromacol, 125 × 5-SV T051, Welwyn Garden City, United Kingdom)中，稱重並在乾冰中冷凍，使用前腦左半部分(無嗅球)進行Aβ分析，並在金屬板上在乾冰上冷凍並將其置於蛋白質Lo-bind管(003 0108.116, Eppendorf, Hamburg, Germany)中。在4%多聚甲醛中固定右腦，在PBS中洗滌，接著包埋於石蠟中用於可能的未來組織學分析。 在研究結束時收集尾部並在-20℃下儲存。表 8 ：化合物含量之分析 小鼠腦中 Aβ 1-40 及 CSF 中 Aβ 1-40 及 Aβ 1-42 之分析 腦均質化 將冷凍小鼠前腦稱重，並在9體積(w/v)之冰冷的完整配方TBS(20 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 1 × 完整配方[蛋白酶抑制劑混合劑錠劑：1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany])中藉由音波處理(90%工作週期，輸出控制5，40-55個脈衝，[Sonifier 450, Branson])進行均質化。均質化之後，製備若干50 µl等份試樣用於分析並在-80℃下儲存。作為標準品之合成 Aβ 1-40 溶液之製備 使用人類Aβ 1-40三氟乙酸鹽(H 1194.1000, Bachem, Bubendorf, Switzerland)作為Aβ1-40之校正曲線。在室溫(RT)下，經約30分鐘將其以1 mg/ml之濃度溶解於無水DMSO (41647, Fluka)中，接著視覺檢查完全溶解。 在LoBind管(0030 108.094, Eppendorf, Hamburg, Germany)中製備剩餘溶液之20 × 5 µl等份試樣及100 µl等份試樣，用氮氣覆蓋以便保護Aβ肽免予氧化並在-80℃下儲存。對於校正曲線，5 µl等份試樣僅使用一次，接著就丟棄。小鼠腦中 Aβ 1-40 之測定 利用Meso Scale Discovery (MSD) 96孔多陣列人類/齧齒類動物(4G8) Aβ 1-40超敏分析(編號K110FTE-3, Meso Scale Discovery, Gaithersburg, USA)測定小鼠中之內源性Aβ 1-40。該分析係根據製造商之說明書來實施(校正曲線及試樣製備除外)。使用1% TX-100從前腦均質物萃取出TritonX-100 (TX-100)可溶性Aβ 1-40，其係將每一50 μl等份試樣之1:10前腦均質物與溶於完整配方TBS (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 1 × 完整配方[蛋白酶抑制劑混合劑錠劑：1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, Penzberg Germany])之50 μl 2% TX-100混合，以達到1% TX-100之最終濃度及1:20前腦稀釋物。在冰上將試樣培育15分鐘且每5分鐘加以渦漩震盪。對試樣進行超離心(100000×g, 4℃, 15分鐘)並將50 μl澄清上清液轉移至新管。為進行Aβ 1-40分析，該上清液進一步在3%封阻劑A溶液(來自套組)稀釋1:5至最終前腦稀釋物為1:100並施加至板。 在摻有合成Aβ1-40肽(1.56-100 pg/ml)之1%封阻劑A溶液之相應稀釋物中製備校正曲線，非轉基因小鼠腦試樣除外：在此情形中，在摻有合成Aβ1-40肽(1.56-100 pg/ml)之相應地稀釋之APP剔除小鼠前腦中製備校正曲線。對於所有試樣及標準品，每孔施加25 μl。對於每一測定，均進行重複兩個孔。使用重複兩個孔之平均值進行計算。由於MSD不提供量化軟體，將試樣及標準品之相對單位輸入SOFTmax PRO 4.0中用於計算標準曲線並量化試樣。結果 用三個不同劑量(3 µmol/kg、10 µmol/kg及30 µmol/kg)之BACE抑制劑化合物1短期治療APOE4-TR小鼠(小鼠Apoe基因由人類APOE4替代)。在最後一次劑量之後4小時及24小時將動物處死並分離出前腦。各個組之Aβ1-40及Aβ1-42之濃度概述於圖3、圖4及圖5及表9、表10及表11中。計算相對於媒劑治療組之降低之百分比。在最後一次劑量之後4小時及24小時，所有治療皆引起顯著且劑量依賴性的Aβ 1-40降低，效應在4小時時係在43%至77%之範圍內且在24小時時係在20%至66%之範圍內。對於兩個較低劑量組(3 µmol/kg及10 µmol/kg)，Aβ 1-40降低效應在4小時及24小時時會顯著降低，但在最後一次劑量之後24小時時實質上接近基線含量。高劑量之化合物1 (30 µmol/kg)顯示幾乎平坦的輪廓，其中在整個24小時時程內Aβ 1-40降低77-66%。表 9 ： 在 APOE4-TR 小鼠腦中化合物 1 治療對 Aβ 1-40 含量之效應 (n=6 (n=3 隻雄性， n=3 隻雌性 )) n.a.：不適用，媒劑：組合之所有媒劑表 10 ：在 APOE4-TR 小鼠 CSF 中化合物 1 治療對 Aβ 1-40 含量之效應 (n=6 隻 (n=3 隻雄性， n=3 隻雌性 )) n.a.：不適用，媒劑：合併之所有媒劑，ns：不顯著表 11 ：化合物 1 治療對 APOE4-TR 小鼠 CSF 中之 Aβ 142 含量之效應 (n=6 隻 (n=3 隻雄性， n=3 隻雌性 )) n.a.：不適用，媒劑：合併之所有媒劑，ns：不顯著 短期投藥4小時及24小時時在血液及腦中之PK數據顯示於圖6及表12中。在血液及腦中在24小時內之化合物1暴露(表示為AUC_0-24h )概述於表13中。血液及腦中之化合物1暴露與劑量成比例且展示24小時後化合物含量之預計少量下降，此再次與劑量成比例。腦中之化合物暴露遠遠高於血液。3 µmol/kg、10 µmol/kg及30 µmol/kg劑量組之腦血液比率係類似的，其中在4小時時分別為5、3及4且在24小時時分別為9、4及3。計算4小時/24小時之暴露比率，其容許比較不同劑量下化合物暴露之下降(表12)。化合物1具有中等2-5倍暴露降低，且在不同劑量之間及在血液與腦之間無大的差異。表 12 ： APOE4-TR 小鼠之血液及腦中之化合物 1 含量 (n=6 隻 (n=3 隻雄性， n=3 隻雌性 ) 表 13 ： APOE4-TR 小鼠之血液及腦中之化合物 1 AUC_0-24h 4小時及24小時時間點之AUC 所有劑量組之個別動物之腦藥物動力學/藥效學關係皆顯示於圖7中。化合物1明顯存在明確的PK/PD關係；在低化合物含量下，Aβ降低效能最小，而在高化合物含量下，檢測到最大效能效應。 圖8展示不同劑量下平均值之PK/PD關係。再次，明瞭對Aβ降低之暴露依賴性效應，且顯而易見最小及最大效能效應。總結 此實驗實例中所呈現之研究展示在APOE4-TR小鼠中化合物1係口服可用的、中樞活性且高效的活體內BACE抑制劑。使用表現來自小鼠內源性Apoe基因座之人類APOE4之APOE4-TR小鼠來研究化合物1之PK/PD關係。已暗示ApoE4為阿茲海默症之高風險因素且APOE4-TR小鼠與阿茲海默症腦中之ApoE4效應類似。 在APOE4-TR小鼠中化合物1之PK性質與在野生型小鼠中所觀察到之彼等並非不同。在血液及腦中觀察到劑量依賴性的化合物1暴露，且腦中之含量遠遠更高。此外，24小時後之暴露降低與在野生型小鼠中所觀察到者類似。30 µmol/kg下之化合物1在APOE4-TR之腦中引起對Aβ降低之最大效應(＞ 70%)，且對於短期投藥而言類似程度持續超過24小時。PK/PD關係與野生型小鼠及大鼠極其相當。在最高劑量(30 µmol/kg)下在APOE4-TR小鼠之腦中明顯存在對Aβ降低之輕微降低之最大效能效應。此可能由在APOE-4 TR小鼠中所觀察到之較低之類澱粉β清除率引起(Castellano JM等人，2011)。實例 4 ：首次用於人體之研究 此研究已在臨床上完成且係隨機化、雙盲、安慰劑對照、單一及多個遞增口服劑量的研究，其主要用來評估化合物1在健康成人及老年個體中之安全性及耐受性以及藥物動力學及藥效學。此研究之目的係確定化合物1之單一及多個最大耐受劑量及使用CSF中之Aβ作為主要PD生物標記來評估藥物動力學/藥效學(PK/PD)關係。 在≥60歲齡之健康老年個體中，確定兩週內750 mg單一劑量及300 mg QD之最高測試劑量係安全且耐受的。使用CSF中之Aβ濃度作為藥物作用之主要生物標記進行藥效學評估亦應用於健康老年個體中。在單次及多次投藥之後，Aβ 1-40濃度之劑量依賴性降低經確定分別高達約80%及90% (表14及表15，圖9)。表 14 ： CSF 中之 A β 1-40- 隨時間自基線之變化百分比之概述 表 15 ：在第 15 天 ( 最後一次劑量後 24 小時 )CSF 中之 A β 1-40 自基線之變化百分比之概述 實例 5 ： 3 個月劑量範圍安全性及耐受性研究 在I期臨床劑量範圍安全性及耐受性研究中將化合物1投與60歲或60歲以上之個體。此研究列示於NCT02576639標識代碼下之ClinicalTrials.gov中。 此隨機化、雙盲、安慰劑對照的研究具有平行組設計且化合物1係以每天一次的口服劑量投與5個治療組(化合物1：2mg、10mg、35mg或85mg QD及安慰劑)。 此研究之主要目的係對先前在首次用於人類之研究中在2週及4週持續時間內獲得之安全性及耐受性數據進行擴充且藉此容許在具有AD風險之個體中開始未來長期效能試驗。另外，獲得適於藥物動力學/藥效學建模之數據以便支持劑量選擇決定用於未來效能研究。 在此研究中，發現化合物1在每天一次2 mg、10mg、35 mg及85mg之劑量下在三個月內係安全且耐受的。所投與化合物1對CSF Aβ含量之藥效學效應顯示於表16及圖10中。Aβ降低之程度隨時間穩定，且在約2-3週之後達到PD穩態。表 16 ：在第 3 個月時 CSF 中之 A β - A β1- 38 、 A β1- 40 及 A β1- 42 自基線之變化百分比之分析 在三個月(91天)的每日以2 mg、10 mg、35 mg及85 mg投藥之後化合物1之藥物動力學參數顯示於表17中。表 17 ：第 91 天之化合物 1 藥物動力學參數 Cmax,ss值代表在91天之每天一次(qd)以指定劑量投藥之後的化合物1之最大血漿穩態濃度。「CV%」代表變異係數百分比。 基於該等結果，預計15 mg化合物1之一次日劑量引起介於70 ng/ml與170 ng/ml之間之血漿Cmax,ss值，且預計50 mg化合物1之一次日劑量引起介於200 ng/ml及500 ng/ml之間之血漿Cmax,ss值。 基於實例4及5中所呈現之數據，藥物計量學建模預測在90%之個體中50 mg之日劑量達到80% CSF Aβ 1-40降低且15 mg之劑量達到60% CSF Aβ 1-40降低。實例 6 ： ApoE4 基因型對對化合物 1 治療之反應之效應 在闡述於實例5及6中之所完成的首次用於人體及3個月的劑量範圍安全性及耐受性臨床研究中，在第一劑量(基線)之前及分別在多次投藥2週及3個月之後藉助腰椎穿刺獲得CSF中之Aβ濃度。亦在同意之個體中獲得ApoE4基因型。在採取研究治療且沒有對藥效學效應之評估具有潛在影響之主要方案偏差之個體中計算Aβ 1-40及Aβ 1-42濃度自基線之變化百分比。下表18至21提供對於治療組及ApoE基因型(E4異型合子對E4非載體)而言自基線之變化百分比之概述統計量。僅一名具有CSF數據之個體為E4同型合子(來自3個月的劑量範圍安全性及耐受性研究)。此個體係用安慰劑進行治療且顯示Aβ 1-40濃度及Aβ 1-42濃度二者均降低11%且不包括於下表中。該數據顯示在ApoE4載體與非載體之間在對化合物1治療之CSF Aβ 1-40及Aβ 1-42反應方面無差異。表 18 ： 3 個月時對於 ApoE 基因型及化合物 1 治療組而言 Aβ 1-40 自基線之變化 % 表 19 ： 3 個月時對於 ApoE 基因型及化合物 1 治療組而言 Aβ 1-42 自基線之變化 % 表 20 ：在首次用於人體之臨床研究中在 2 週時對於 ApoE 基因型及化合物 1 治療組而言 Aβ 1-40 自基線之變化 % 表 21 ：在首次用於人體之臨床研究中在 2 週時對於 ApoE 基因型及化合物 1 治療組而言 Aβ 1-42 自基線之變化 % 實例 7 ：利用 BACE 抑制劑化合物 1 對帶有斑塊之雄性 APP23 小鼠之長期治療性治療 概述 將化合物1以兩個劑量長期投與處於帶有斑塊之年齡(12個月)之APP23轉基因小鼠達6個月。與僅接受媒劑之組相比，以0.03 g/kg食物投與化合物1引起類澱粉β 40及42輕微降低，且與媒劑組相比，投與0.3g/kg食物引起類澱粉β 40及42顯著降低。小鼠腦中Aβ之量與基線(12月齡)時之小鼠類似。血漿及CSF中之可溶性Aβ僅在高劑量組中顯著降低。藉由免疫組織化學檢測到之斑塊負載在低劑量組中亦輕微(約20%)降低且在高劑量組中顯著(約70%)降低。小斑塊、中等斑塊及大斑塊之數目對治療之反應等同。藉由GFAP染色來測定經活化星狀膠質細胞之數目。藉由化合物1治療可以劑量依賴性方式降低總GFAP免疫反應性。儘管大多數GFAP陽性星狀膠質細胞與斑塊不相關，但與在斑塊遠端之彼等相比，斑塊相關之星狀膠質細胞對化合物1治療之反應更加強烈。藉由IBA1染色檢測經活化微膠質細胞。藉由化合物1治療可劑量依賴性地降低IBA1陽性微膠質細胞之數目。與在斑塊遠端之微膠質細胞相比，緊密靠近類澱粉斑塊之微膠質細胞藉由治療之降低更多。 概言之，與未經治療之媒劑相比，化合物1治療顯示腦類澱粉β負載之劑量依賴性降低及兩種神經發炎標記物(小鼠腦中經活化星狀膠質細胞及微膠質細胞相比之數目)之相關性降低。方法 動物及劑量選擇 用0.3 g/kg或0.03 g/kg呈食物糰粒形式之化合物1治療雄性轉基因、異型接合APP23 (B6,D2-Tg(Thy1App)23Sdz (Sturchler-Pierrat C等人，1997)，12至14月齡，n=64)。表 22 ：治療組 3個治療組，n=18隻小鼠/治療組；1個基線組，n=10 離體試樣及試樣收穫方法 使用血液試樣來分析全血化合物含量且其係在屍體剖檢當天自軀幹血液獲得至EDTA埃彭道夫管(Milian SA, CatNoTOM-14, Fisher Scientific, Wohlen, Switzerland)中或至血清管(CB300Z, Sarstedt, Nümbrecht, Germany)中。 藉由EDTA血液之離心(8000 rpm/6800×g, 15分鐘, 4℃)收集用於類澱粉β (Aβ)分析之血漿並將其收集至蛋白質Lo-Bind埃彭道夫管(003 0108.116, Eppendorf, Hamburg, Germany)中。 在乾冰上冷凍所有血液/血漿/血清試樣並將其儲存在-80℃下直至分析為止。 在斷頭術之後立即去除腦，用鹽水沖洗並沿中線向下矢狀地切片。使用腦之左半部分來分析化合物含量並將其置於玻璃管(Chromacol, 125 × 5-SV T051, Welwyn Garden City, United Kingdom)中，稱重並在乾冰中冷凍，使用前腦之左半部分(無嗅球)進行Aβ分析，並在金屬板上在乾冰上冷凍並置於蛋白質Lo-bind管(003 0108.116, Eppendorf, Hamburg, Germany)中。 在研究結束時收集尾部並在-20℃下儲存。 化合物含量之分析 藉由液相層析/串聯質譜(HPLC/MS/MS)來量化血液及腦中生物試樣之化合物1含量。將腦試樣與2體積之KH₂ PO₄ 緩衝液混合並使用Covaris®裝置均質化。30 µL血液或腦均質物均摻加結構相關之內標準品且隨後將其與至少6倍過量體積之乙腈混合用於蛋白質沈澱。將上清液直接注射至LC/MS/MS系統中用於分析。 表23：用於血液及腦試樣之儀器條件 小鼠組織中Aβ 1-40及Aβ 1-42之分析 腦均質化 將冷凍小鼠前腦稱重並在9體積(w/v)之冰冷的完整配方TBS (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 1 × 完整配方 [蛋白酶抑制劑混合劑錠劑：1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany])中藉由音波處理(90%工作週期，輸出控制5，40-55個脈衝，[Sonifier 450, Branson])進行均質化。在均質化之後，製備若干50 µl等份試樣用於分析並在-80℃下儲存。 作為標準品之合成Aβ溶液之製備 使用人類Aβ肽(1-40)三氟乙酸鹽(H 1194.1000, Bachem, Bubendorf, Switzerland)作為Aβ1-40之校正曲線。在室溫(RT)下經約30分鐘將其以1 mg/ml之濃度溶解於無水DMSO (41647, Fluka)中，接著視覺檢查完全溶解。 在LoBind管(0030 108.094, Eppendorf, Hamburg, Germany)中製備剩餘溶液之20 × 5 µl等份試樣及100 µl等份試樣，用氮氣覆蓋以便保護Aβ肽免予氧化並在-80℃下儲存。對於校正曲線， 5 µl等份試樣僅使用一次，接著就丟棄。 APP23小鼠腦中Triton X-100可溶性Aβ之測定 利用Meso Scale Discovery (MSD) 96孔多陣列人類/齧齒類動物(6E10) Aβ 1-40/42分析(Meso Scale Discovery, Rockville, MD, USA)來測定小鼠中之人類Aβ 1-40及42，如[RD-2010-00284]中所闡述。該分析係根據製造商之說明書進行(校正曲線及試樣製備除外)。使用1% TX-100從前腦提取TritonX-100 (TX-100)可溶性Aβ 1-40及42，其係將每一50 μl等份試樣之1:10前腦均質物與溶於完整配方TBS (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 1 × 完整配方 [蛋白酶抑制劑混合劑錠劑：1 836 145, Roche Diagnostics GmbH, Penzberg Germany])之50 μl 2% TX-100混合，以達到1% TX-100之最終濃度及1:20前腦稀釋物。在冰上將試樣培育15分鐘且每5分鐘加以渦漩震盪。對試樣進行超離心(100000×g, 4℃, 15分鐘)並將50 μl澄清上清液轉移至新管。該上清液進一步在3%封阻劑A溶液(來自套組)稀釋1:5成最終前腦稀釋物為1:100並將其施加至板。 在摻有合成Aβ1-40肽(1.56-100 pg/ml)之1%封阻劑A溶液之相應稀釋物中製備校正曲線，非轉基因小鼠腦試樣除外：在此情形中，在摻有合成Aβ1-40肽(1.56-100 pg/ml)之相應地稀釋之APP剔除小鼠前腦中製備校正曲線。對於所有試樣及標準品，每孔施加25 μl。對於每一測定，均重複兩個孔。使用重複兩個孔之平均值進行計算。將試樣及標準品之相對單元輸入SOFTmax PRO 4.0中用於計算標準曲線並量化試樣。 APP23小鼠腦中甲酸可溶性Aβ 1-40之測定 將50微升前腦均質物與116.6 µl 100%甲酸混合，得到70%之最終甲酸濃度。在冰上儲存試樣且每5分鐘加以渦漩震盪。為進行中和，將50 µl混合物吸量至新管中，並添加950 µl含有1×全蛋白酶抑制劑之1 M Tris鹼。將管在室溫下儲存過夜，接著在4℃下在Eppendorf Microzentrifuge中以14000 rpm離心15分鐘。自頂層，去除100 µl並將其與100 µl 3%封阻劑A溶液(MesoScale分析套組之一部分)混合。將此試樣直接施加至分析板(稀釋1:1332)或在1%封阻劑A溶液中進一步稀釋。 小鼠CSF中Aβ 1-40之分析 用57 µL 1%封阻劑A (MSD)稀釋小鼠CSF試樣(3 µl)並將25 µl施加至分析板。小鼠血漿中 Aβ 1-40 之分析 將血漿試樣(30 µl)與30 µl 3 %封阻劑A (MSD)混合並將25 µl施加至分析板。 使用雙重螢光免疫組織化學對類澱粉β斑塊及經活化星狀膠質細胞之組織學分析 使用識別類澱粉肽之C末端部分之兔抗Aβ一級抗體(該抗體係如Schrader-Fischer G, Paganetti PA, 1996；Schrader-Fischer G等人，1997中所闡述提出)對類澱粉斑塊進行染色。使用商業兔抗GFAP (來自Dako Schweiz GmbH, Baar, Switzerland之參考Z0334)檢測經活化星狀膠質細胞。 所有染色皆係使用完全自動化儀器Ventana Discovery® Ultra (Roche Diagnostics Schweiz AG, Rotkreuz, Switzerland)來實施。所有化學品皆由Roche Diagnostic提供。 使用所有研究動物且新切割3微米之腦組織切片並在SuperFrost+ 載玻片上收集。將組織切片脫蠟並在無溶劑條件(EZprep溶液)下再水合，隨後在基於EDTA之緩衝液(CC1溶液)中藉由熱修復循環將抗原修復(解蔽)實施32分鐘。隨後，使用DISCOVERY抑制劑(參考07017944001 (Roche))將載玻片封阻4分鐘。將在抗體稀釋劑中以1/20’000稀釋之一級抗體手動添加於組織切片上並在室溫下培育1小時。實施短暫後固定(0.05%之戊二醛)，之後施加多聚體UltraMap抗兔HRP即用型抗體(參考05269717001)並保持16分鐘。 使用DISCOVERY FITC®遵循製造商之推薦實施檢測。然後將載玻片在92℃下熱變性20分鐘，之後手動施加第二一級抗體(以1 / 2’000稀釋之抗GFAP)並培育1小時。再次使用UltraMap-抗兔HRP抗體並保持20分鐘以與DISCOVERY Rhodamine套組(參考07259883001)組合檢測GFAP。 洗滌載玻片並使用Prolong® Gold抗褪色試劑(參考P36931, ThermoFisher, Switzerland)安裝並用Hamamatsu幻燈片式掃描儀儀器(NanoZoomer 2.0 HT，掃描軟體NDP-Scan Vers. 2.5, Hamamatsu Photonics France, Swiss Office, Solothurn, Switzerland)在40倍物鏡下進一步掃描。掃描設置如下：將利用DAPI濾波器以及FITC濾波器之暴露時間設為57ms。將TRITC濾波器(Rhodamine之檢測)之暴露時間設為14.2ms。使用雙重螢光免疫組織化學對類澱粉 β 斑塊及經活化微膠質細胞之分析 使用相同抗體對類澱粉斑塊進行染色且使用來自Wako Chemicals GmbH (Neuss, Germany)之兔抗IBA1抗體(參考019-19741)檢測微膠質細胞並在抗體稀釋劑中以1/200進行稀釋。染色方案與針對類澱粉β斑塊及星狀膠質細胞之方案完全類似。利用相同設置掃描載玻片。 影像分析 為基於影像分析進行定量斑塊評估，基於MS Visual Studio 2010及來自Matrox MIL V9庫(Matrox Inc, Quebec, Canada)之許多功能研發專有影像分析平臺(ASTORIA, Automated Stored Image Analysis)。 為進行β類澱粉斑塊及神經發炎分析，實施以下步驟序列： - 用Hamamatsu Nanozoomer以40倍放大率掃描載玻片。對於每一螢光標記(DAPI、FITC及TRITC)，創建單獨影像 - 手動描繪ROI (目標區)之輪廓以界定腦切片中之皮質用於在綠色FITC通道影像上進行Aβ斑塊評估，然後使用所得輪廓亦用於另外兩個通道影像(拷貝所得xml檔案) - 運行內部研發之ImageScope (V12.1.0.5029, Aperio Inc., USA)插件用於針對3個螢光通道中之每一者創建及輸出*.tif影像圖塊(image tile)(在10倍放大率下) 影像分批處理： - 藉助存取每一個別螢光通道影像來獲得每一切片之組合真實彩色影像(DAPI、FITC、TRITC) - 自黑色未染色背景對有效試樣(在所描繪ROI內)進行分段 - 應用自適應臨限值處理技術用於對綠色通道影像中之物體(FITC標記之Aβ斑塊)進行分段 - 在綠色(FITC)通道中消除顯示信號之過小碎片之後分離接觸物體用於正確的後續個別物體分析 - 藉助形態tophat轉變及臨限值處理對紅色通道中TRITC標記之物體(特異性針對指示星狀膠質細胞或微膠質細胞之GFAP或Iba1染色)進行分段 - 基於特徵之物體分類 4個物體類別 - 不確定碎片(過模糊、過小物體)排除在外 - 小斑塊(40 … 1000像素) - 中等斑塊(1000 … 6500像素) - 大斑塊(＞ 6500像素) 針對有效斑塊之若干形態計量及密度計量特徵之計算 - 斑塊之數目 - 「比光學密度」，其經闡述係基於以非線性方式量測及使用適當抗體之染色強度來反映蛋白質(抗原)濃度之量(Rahier等人，1989；Ruifrok等人，2001) - 基於相對於斑塊面積之TRITC+信號之比率來評估「斑塊相關之GFAP或Iba1」，基於斑塊周圍膨脹環內TRITC+信號之比率來評估「近端GFAP或Iba1」結果 表 24 ：腦及血液中之化合物 1 含量 在2個月及4個月投藥之後及在6個月之研究結束時測定血液中化合物1之濃度。如表24中所顯示，在研究過程期間存在恆定暴露，且在動物之間具有可接受變化，平均為18% (8-36%)。平均化合物1血液濃度對於0.03 g/kg食物投藥組為0.25 ± 0.13 µM (平均值± SD)，且對於0.3 g/kg投藥組為2.10 ± 0.47 µM，其與化合物劑量之10倍差異具有良好一致性。在此研究中觀察到之暴露大致對應於5 mg/kg及45 mg/kg每日口服劑量之化合物1。在實驗結束時測定之腦/血液比率對於0.03 g/kg組為2.7且對於0.3 g/kg組為3.3。 APP代謝物：來自小鼠腦之Triton TX-100可溶性APP代謝物之生物化學測定 用於緩衝液中之1% Triton X-100提取腦均質物且所得上清液被視為代表APP代謝物之可溶性形式。除Aβ 1-40及42以外，吾人測定N末端APP片段sAPPα (α分泌酶之直接裂解產物)及sAPPβ (Swe) (BACE1裂解之直接產物)。如表25中所顯示，在未治療組中在研究過程期間，可溶性Aβ 1-40及42中等地(小於2倍)增加。由於已知在此階段期間在APP表現及Aβ生成方面未發展變化，故假定媒劑組(18至20月齡)中增加之值係由Aβ沈積物之「洩漏」引起(此增加若干倍，見下文)。另外，在未治療組中，可溶性APP代謝物sAPPα及β之值未發展顯著變化。 用低劑量化合物1(0.03 g化合物1/kg食物)治療之小鼠顯示弱的但不顯著的可溶性Aβ 1-40及42降低及中等的sAPPα增加(表25及表26，圖11、圖12及圖13)。可溶性APPβ (Swe)顯著降低29% (表25及表26，圖14)。用0.3 g/kg劑量之化合物1治療之小鼠顯示Aβ及sAPPβ (Swe)二者之顯著降低以及sAPPα之3倍增加(表25及表26，圖11、圖12及圖14)。 綜上所述，化合物1治療引起所有可溶性BACE1裂解產物之劑量依賴性降低及sAPPα之劑量依賴性增加。表 25 ：在用化合物 1 治療之後小鼠腦之 Aβ 1-40 及 42 含量 表 26 ：各組之間變化之比較 ( 鄧奈特氏多重比較測試 ) CSF中之APP代謝物 在屍體剖檢時自所有小鼠收集CSF。將基線組之試樣儲存約6個月，且在研究結束時與剩餘試樣一起分析。表27及圖15中之數據顯示CSF Aβ在基線組(12月齡時之APP23小鼠)中最高，但在媒劑組(18月齡時之APP23小鼠)中下降。與此媒劑組相比，在0.03g/kg食物化合物1治療組中CSF Aβ 1-40之降低不顯著，且在0.3g/kg食物化合物1治療組中顯著。目前尚不知曉高基線值之原因。當Aβ之寡聚形式之解離可導致更高的單體濃度時，假設此係長期儲存之效應。超過來自腦提取物之Triton TX-100溶解之Aβ之CSF Aβ代表對Aβ生成之變化具有直接反應之可溶性類澱粉β之穩態濃度。在低化合物1劑量下小且非顯著的治療效應(-4.6%至-20%)以及在高化合物1劑量下明顯且顯著的效應(-43.7%至-77%)在自腦組織分離之可溶性Aβ物質與CSF中之Aβ 1-40之間極其相當。表 27 ：針對 CSF Aβ 1-40 之結果之概述 前腦中之甲酸可溶性類澱粉β肽 在用甲酸提取不溶性Aβ物質之後研究化合物1對APP23小鼠腦中類澱粉β之沈積形式之治療效應。如表28及表29及圖16至圖19中所顯示，與基線相比，在媒劑組中觀察到所沈積Aβ之大量增加。類澱粉β 1-42增加且超過Aβ 1-40 (在媒劑組中Aβ 1-42/1-40比率增加55%)，此與其更高聚集傾向一致。與媒劑相比，在用低劑量之化合物1治療之後，Aβ 1-40及Aβ 1-42顯示降低約17%，但其未達到統計顯著性。所提取材料之Aβ 1-42/40比率未發展變化。在高化合物1治療組中觀察到所沈積Aβ 1-40及1-42強力且高度顯著(相對於媒劑約80%)的降低，且Aβ 1-42/40比率返回至0.07之基線值。概言之，在APP23小鼠中利用高劑量化合物1治療幾乎完全阻斷類澱粉β之增加。表 28 ：小鼠前腦中之甲酸可溶性類澱粉 β 肽 表 29 ：組比較及統計學 ( 鄧奈特氏多重比較測試 ) 類澱粉病理學及神經發炎之組織學評估：斑塊數量及斑塊面積 用識別類澱粉肽之C末端部分之抗Aβ抗體對APP23腦片上之類澱粉斑塊進行染色。對於更詳細的數據分析，將APP23小鼠中各種形式之類澱粉β沈積分類為「小」、「中等」及「大」斑塊。此外，測定總免疫染色面積。量化結果顯示於表30及表31及圖20至圖23中。大多數Aβ沈積物被分類為「小」斑塊，而「中等」斑塊之數目少10倍且「大」斑塊之數目少100倍。在研究之持續時間期間在媒劑組中所有形式之斑塊之數目皆增加約4-6倍，對於總斑塊面積觀察到相同情況。利用化合物1治療在低劑量治療組中使增加降低約25%且在高劑量治療組中使增加降低約60%。與生物化學測定相比，在組織學分析中媒劑組中之Aβ增加及0.3 g/kg食物化合物1治療組中之效應更低。二維組織學分析可能未充分概括實際上在所有3維中發展之斑塊體積變化。表 30 ：化合物 1 治療對 APP23 小鼠中之斑塊數量及斑塊面積 ( 正規化為總面積 (1000000 * 平均值 ± SEM)) 之效應 表 31 ：組比較及統計學 對經活化星狀膠質細胞之效應 GFAP (膠質酸性原纖維蛋白質)見於靜止以及經活化星狀膠質細胞中。GFAP免疫反應性通常用作星狀膠質細胞數目及活化之標記物。在APP23小鼠中，正規化之GFAP陽性面積隨小鼠年齡增加約2倍，且此增加藉由化合物1治療以劑量依賴性方式降低(表32及表33及圖24至圖28)。就與類澱粉斑塊之關聯來進一步檢查GFAP免疫反應性(以與IBA1免疫反應性相同之方式實施)。此分析顯示絕大多數GFAP免疫反應性與斑塊不相關(遠端)，且僅10%與斑塊相關或在近端。斑塊相關及近端之GFAP免疫反應性之分數在媒劑組中有所增加，表明在類澱粉斑塊之緊鄰區中星狀膠質細胞數目/活化主導性的增加。隨老化之增加對於遠端及非斑塊相關之GFAP陽性染色較低。化合物1治療之效應在斑塊相關之GFAP免疫反應性與非斑塊相關之GFAP免疫反應性之間亦有所不同：對斑塊先關/近端GFAP免疫反應性之效應強於非斑塊相關/遠端染色。該等數據表明化合物1主要在類澱粉斑塊之直接鄰近區且最可能藉助對斑塊本身之效應來對GFAP染色施加其效應。表 32 ：化合物 1 治療對經活化星狀膠質細胞之效應 ( 表示為 GFAP 陽性面積，正規化為總面積 (100 * 平均值 ± SEM)) 表 33 ：針對正規化 GFAP 陽性面積之治療效應及統計學 對IBA1陽性微膠質細胞之效應 IBA1 (離子化鈣結合銜接分子1)係微膠質細胞/巨噬細胞特異性蛋白質。IBA1免疫反應性通常用作微膠質細胞數目及活化之標記物。在APP23小鼠中，正規化之IBA1陽性面積隨小鼠年齡增加約5倍，且此增加藉由化合物1治療以劑量依賴性方式降低(表34及表35)。就與類澱粉斑塊之關聯來進一步檢查IBA1免疫反應性。此分析顯示約75%之IBA1免疫反應性為非斑塊相關(遠端)，且僅25%為斑塊相關或在近端。斑塊相關及近端之IBA1免疫反應性之分數在媒劑組中有所增加。在較小程度上，遠端及非斑塊相關之IBA1陽性染色亦隨小鼠年齡增加。化合物1治療之效應在斑塊相關之IBA1免疫反應性與非斑塊相關之IBA1免疫反應性之間亦有所不同：對斑塊相關/近端之IBA1免疫反應性之效應強且顯著。未發現對非斑塊相關/遠端染色之顯著效應。此進一步闡釋於圖29至圖33中，顯示相對於斑塊面積之總IBA1染色及斑塊相關之IBA1染色之效應。該等數據表明化合物1主要在類澱粉斑塊之直接鄰近區且最可能經由影響斑塊本身來對IBA1染色施加其效應。對斑塊之效應不同樣強烈地影響遠離斑塊之微膠質細胞活化/數目(此係大多數IBA1+ 免疫反應性)。表 34 ：化合物 1 治療對 IBA1 陽性微膠質細胞之效應 ( 經總面積正規化 ) ( 值為平均值 ± SEM) 表 35 ：針對正規化之 IBA1 陽性面積之治療效應及統計學 實例 8 ：用來評估化合物 1 在具有發作 AD 臨床症狀風險之參與者中之效能之隨機化、雙盲、安慰劑對照之研究之概述 在本文所闡述之臨床試驗中，採用ApoE4同型合子之鑑別作為預後富集策略以在合理時幀內選擇具有實質認知惡化之較大可能性之個體，該實質認知惡化可在臨床試驗之設置內進行實際評估。此研究列示於ClinicalTrials.gov中NCT02565511識別碼下。在替代中，此實例可利用60歲至75歲之認知未受損之ApoE4攜帶者(同型合子；或具有額外強化腦類澱粉病理學之異型合子，其中腦類澱粉病理學(「類澱粉陽性」)藉由PET或CSF量測確定)以每天一次15mg或50 mg化合物1之口服劑量來實施。此研究列示於ClinicalTrials.gov中NCT03131453標識碼下。 在至少5年之治療持續時間期間在所提出臨床試驗中，預計顯著比例之參與者將被診斷患有由AD引起之輕度認知損害(MCI)或失智症。預計大多數診斷為MCI，預計此可在失智症診斷之前2至4年進行。表 36 ：用來評估化合物 1 在具有發作 AD 臨床症狀風險之參與者中之效能之隨機化、雙盲、安慰劑對照之研究之概述 實例 9 ：化合物 1 在單獨給予及與強 CYP3A4 抑制劑伊曲康唑或強 CYP3A4 誘導物利福平組合時之藥物動力學之用於人類之研究 在健康志願者中之藥物間相互作用(DDI)研究中，評估強CYP3A4抑制劑(伊曲康唑)及強CYP3A4誘導物(利福平)對化合物1之PK之效應。DDI研究設計概括於圖34中。與當單獨給予化合物1時相比，當與化合物1一起給予時200 mg q.d.之劑量之伊曲康唑使化合物1之平均AUC增加2-3倍且使化合物1之平均Cmax增加25%(表37)。如與當單獨給予化合物1時相比，當與化合物1一起給予時600 mg q.d.之劑量之利福平使化合物1之平均AUC降低5-6倍且使化合物1之平均Cmax降低2.5倍(表38)。總之，在1期研究中強CYP3A4誘導物及強CYP3A4抑制劑對化合物1暴露之效應已顯示CYP3A4/5對於化合物1之消除至關重要。表 37 ： 藥物動力學結果 – 伊曲康唑對化合物 1 之血漿 PK 參數之效應之統計分析：化合物 1 30 mg SD + 伊曲康唑 200 mg QD 對化合物 1 30 mg SD n* =具有非缺失值之個體之數目。 將針對治療及個體具有固定效應之ANOVA模型擬合至每一對數轉變之PK參數。反轉變結果以獲得「經調解幾何平均數」、「幾何平均數比率」及「90% CI」。表 38 ： 藥物動力學結果 – 利福平對化合物 1 之血漿 PK 參數之統計分析之效應：化合物 1 100 mg SD + 利福平 600 mg QD 對化合物 1 100 mg SD n* = 具有非缺失值之個體之數目。 將針對治療及個體具有固定效應之ANOVA模型擬合至每一對數轉變之PK參數。反轉變結果以獲得「經調節幾何平均數」、「幾何平均數比率」及「90% CI」。參考文獻 Albert MS等人，(2011) The diagnosis of mild cognitive impairment due to 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圖1：用化合物1或NB-360長期治療達8週之C57BL/6小鼠之毛皮色彩分值(平均值± SEM) 圖2：在C57BL/6小鼠中在用8 µmol/kg及50 µmol/kg之化合物1治療時在最後一次劑量後腦Aβ 1-40之降低(平均值± SD, n=4隻/組) 圖3：在APOE4-TR雄性及雌性小鼠(3-5月齡)中短期投與化合物1對前腦Aβ 1-40含量之效應(平均值± SEM) 圖4：在APOE4-TR雄性及雌性小鼠(3-5月齡)中短期投與化合物1對CSF Aβ 1-40含量之效應(平均值± SEM) 圖5：在APOE4-TR雄性及雌性小鼠(3-5月齡)中短期投與化合物1對CSF Aβ 1-42含量之效應(平均值± SEM) 圖6：在APOE4-TR雄性及雌性小鼠中化合物1之長期暴露(3-5月齡，平均值± SD) 圖7：腦PK/PD關係(個別數據) 圖8：腦PK/PD關係(平均值± SD) 圖9：在人類個體之多個遞增口服劑量研究中在兩週暴露後化合物1對CSF Aβ 1-40含量之效應 圖10：在人類個體中化合物1對CSF Aβ 1-40含量之效應-在3個月時自基線之變化% (最後一次劑量後24小時) 圖11：在Triton TX-100提取之APP23腦中化合物1對Aβ 1-40之效應 圖12：在Triton TX-100提取之APP23腦中化合物1對Aβ 1-42之效應 圖13：在Triton TX-100提取之APP23腦中化合物1對sAPPα之效應 圖14：在Triton TX-100提取之APP23腦中化合物1對sAPPβ (Swe)之效應 圖15：在APP23小鼠之腦脊髓液中化合物1治療對Aβ 1-40之效應 圖16：在小鼠中化合物1對甲酸可溶性Aβ 1-40之效應(值為平均值± SEM) 圖17：在小鼠中化合物1對甲酸可溶性Aβ 1-42之效應(值為平均值± SEM) 圖18：在小鼠中化合物1對甲酸可溶性總Aβ (1-40 + 1-42)之效應(值為平均值± SEM) 圖19：在小鼠中化合物1對甲酸可溶性Aβ 1-42/1-40比率之效應(值為平均值± SEM) 圖20：化合物1對斑塊組織學之效應-小斑塊之數目(數據正規化為總面積) 圖21：化合物1對斑塊組織學之效應- 中等斑塊之數目(數據正規化為總面積) 圖22：化合物1對斑塊組織學之效應-大斑塊之數目(數據正規化為總面積) 圖23：化合物1對斑塊組織學之效應-總斑塊面積(數據正規化為總面積) 圖24：針對總面積正規化之總GFAP陽性面積。所顯示為平均值± SEM。比較係利用鄧奈特氏多重比較測試(Dunnett’s multiple comparison test)來實施。 圖25：針對總面積正規化之斑塊相關GFAP陽性面積。所顯示為平均值± SEM。比較係利用鄧奈特氏多重比較測試來實施。 圖26：針對總面積正規化之非斑塊相關之GFAP陽性面積。所顯示為平均值± SEM。比較係利用鄧奈特氏多重比較測試來實施。 圖27：針對總面積正規化之近端GFAP陽性面積。所顯示為平均值± SEM。比較係利用鄧奈特氏多重比較測試來實施。 圖28：針對總面積正規化之遠端GFAP陽性面積。所顯示為平均值± SEM。比較係利用鄧奈特氏多重比較測試來實施。 圖29：化合物1治療對總IBA1陽性面積之效應。所顯示為不同的微膠質細胞群體，其經試樣面積正規化。所顯示為平均值± SEM。比較係利用鄧奈特氏多重比較測試來實施。 圖30：化合物1治療對斑塊相關之IBA1陽性面積之效應。所顯示為不同的微膠質細胞群體，其經試樣面積正規化。所顯示為平均值± SEM。比較係利用鄧奈特氏多重比較測試來實施。 圖31：化合物1治療對非斑塊相關之IBA1+面積之效應。所顯示為不同的微膠質細胞群體，其經試樣面積正規化。所顯示為平均值± SEM。比較係利用鄧奈特氏多重比較測試來實施。 圖32：化合物1治療對近端IBA1+面積之效應。所顯示為不同的微膠質細胞群體，其經試樣面積正規化。所顯示為平均值± SEM。比較係利用鄧奈特氏多重比較測試來實施。 圖33：化合物1治療對遠端IBA1+面積之效應。所顯示為不同的微膠質細胞群體，其經試樣面積正規化。所顯示為平均值± SEM。比較係利用鄧奈特氏多重比較測試來實施。 圖34：在健康個體中兩部分、開放標籤、兩階段、固定序列研究之設計以評估化合物1在單獨給予及與強CYP3A4抑制劑伊曲康唑(itraconazole)或強CYP3A4誘導物利福平(rifampicin)組合給予時之PK。

Claims (16)

1. 一種化合物N -(6-((3R ,6R )-5-胺基-3,6-二甲基-6-(三氟甲基)-3,6-二氫-2H -1,4-㗁𠯤-3-基)-5-氟吡啶-2-基)-3-氯-5-(三氟甲基)吡啶醯胺之用途，其用於製造用以預防具有發展阿茲海默症(Alzheimer’s disease)臨床症狀風險之病患之阿茲海默症之藥劑。
2. 如請求項1之用途，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之該病患攜帶發展阿茲海默症臨床症狀之遺傳傾向性或患有唐氏症候群(Down syndrome)。
3. 如請求項2之用途，其中該病患攜帶發展阿茲海默症臨床症狀之遺傳傾向性且該遺傳傾向性為： (i) 類澱粉前體蛋白、早老素-1或早老素-2之基因的突變；或 (ii) ApoE4等位基因之一或兩個拷貝之存在。
4. 如請求項3之用途，其中具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之該病患攜帶該ApoE4等位基因之一或兩個拷貝。
5. 如請求項4之用途，其中該病患攜帶該ApoE4等位基因之一個拷貝。
6. 如請求項4之用途，其中該病患攜帶該ApoE4等位基因之兩個拷貝。
7. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該病患係呈類澱粉陽性。
8. 如請求項7之用途，其中該類澱粉陽性係藉由PET或CSF來確定。
9. 如請求項3至6中任一項之用途，其中該病患年齡在60歲75歲之間。
10. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該化合物係以經兩週化合物暴露後會引起CSF中之Aβ 1-40降低至少70%之日劑量使用。
11. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該化合物係以經兩週化合物暴露後會引起CSF中之Aβ 1-40降低至少50%之日劑量使用。
12. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該化合物係以15 mg/天之劑量使用。
13. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該化合物係以50 mg/天之劑量使用。
14. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該化合物係呈游離形式或呈醫藥上可接受之鹽形式。
15. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該化合物係呈游離形式。
16. 一種醫藥組合物之用途，該醫藥組合物包含如請求項1至13中任一項之呈游離形式或呈醫藥上可接受之鹽形式之化合物，其用於製造用以預防具有發展阿茲海默症臨床症狀風險之病患之阿茲海默症之藥劑。