TW201734026A - 分離分析法 - Google Patents
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Abstract
為了將合成寡核苷酸應用在醫藥品，本發明係提供一種將寡核苷酸反應混合物中所含有之非全長的寡核苷酸等雜質高度地分離分析之手法。此係藉由使用離子對試藥之反相層析，將31聚物以上的合成寡核苷酸分離分析之方法。離子對試藥含有二烷基銨鹽。
Description
本發明係關於合成寡核苷酸的高度分離分析法。
本申請案係根據2015年12月28日於日本提出申請之日本特願2015-256976號公報主張優先權，並在此援引該內容。
合成寡核苷酸(合成寡核酸)，係應用在聚合酶連鎖反應的引子、診斷探針、單核苷酸多型性(SNP：Single Nucleotide Polymorphism)檢測、DNA配列決定等之多樣的分子生物學實驗。合成寡核苷酸，主要是藉由在固相載體上使用亞磷醯胺核酸單體之連續性反應而合成。
近年來，合成寡核苷酸於醫療領域上的應用乃逐漸受到關注。例如可列舉出核糖核酸酵素、適配體、反義、及RNA干涉(RNAi)等，此等被稱為核酸醫藥品。
為了於體內穩定地輸送合成寡核苷酸，必須考量到鍵結強度、標的特異性、血清穩定性、耐核酸酶
性、細胞穿透性等之各種因素。改善此等之手法，例如有硫代磷酸酯或膦酸甲酯等之改質，或是鎖核酸(LNA：Locked Nucleic Acid)等的使用等之骨架改變。
此等骨架改變，可賦予耐核酸酶性，但同時可能產生配列非特異性的效果或穿透性能的降低，且進一步亦可能發揮細胞毒性。
寡核苷酸的合成方法，在對PCR引子等的使用中，可最適化至不須精製的等級，但為了應用在醫藥品，係要求更高度的精製、分析。尤其是長鏈DNA或是改質、骨架改變體，於合成時容易引起偶合未反應、副反應。因此，於合成寡核苷酸反應混合物中，主要含有非全長的寡核苷酸、或是非全體的寡核苷酸。例如，總是含有被稱為n-x碎片之從目的之寡核苷酸產生核酸缺損之碎片(n為目的之核苷酸(核酸)數，x為缺損數，n、x為正整數，n>x，例如n-1、n-2等)，此外，雙重地嵌入之n+1碎片則作為雜質而含有。再者，亦含有非全體或不正確地脫保護之碎片、或是具有部分掌性之異構物(專利文獻1)。
將合成寡核苷酸高度地分離之方法，一般可選擇凝膠電泳、凝膠過濾層析、反相層析、離子交換層析。層析，其操作性優異，尤其不須進行脫鹽操作之反相層析，係被廣泛地應用。
合成寡核苷酸的反相層析中，一般係使用於分子內具有正的解離基與疏水性官能基之離子對試藥(專利文獻
1)。離子對試藥，較多是與負解離的寡核苷酸形成中性的離子對，提高往反相填充劑之保持性，並提升鏈長較長的寡核苷酸、以及改質及骨架改變體等之疏水度的差較小之目的的寡核苷酸，與雜質之分離分析。
例如於非專利文獻1、非專利文獻2中，係記載有使用YMC公司的Hydroshere C18之反相層析之方法。Hydroshere C18，為十八烷基鍵結於具有12nm的孔徑之直徑3μm的二氧化矽基材之粒子型的填充劑。藉由將作為離子對試藥的三乙基胺或二丁基胺加入於溶離液的乙酸緩衝液，可將2聚物至30聚物的合成寡核苷酸高度地分離。
此外，非專利文獻3中，係記載有使用WATERS公司的XBridge OST C18之反相層析之方法。XBridge OST C18，為十八烷基鍵結於具有130Å的孔徑之直徑2.5μm的乙烯交聯型混成二氧化矽基材之粒子型的填充劑。藉由將作為離子對試藥的三乙基胺加入於溶離液的乙酸或HFIP，可將10聚物至60聚物的合成寡核苷酸高度地分離。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2006/107775號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]YMC公司DATA SHEET F21018A
[非專利文獻2]YMC公司APPLICATION DATA COLLECTIONS(5)(P.39)
[非專利文獻3]WATERS公司XBRIDGE OST C18 METHOD GUIDELINES
本發明，為了將合成寡核苷酸應用在醫藥品，係以提供一種將寡核苷酸反應混合物中所含有之非全長的寡核苷酸等雜質高度地分離分析之手法者為目的。
本發明者係對寡核苷酸反應混合物的精密分離進行精心探討，結果發現到藉由使用含有二丁基銨鹽之離子對試藥之反相層析，可將31聚物以上的合成寡核苷酸高度地分離分析，因而完成本發明。本發明如下所述。
[1]一種分離分析法，其係藉由使用離子對試藥之反相層析，將31聚物以上的合成寡核苷酸分離分析之方法，其特徵為：離子對試藥含有二烷基銨鹽。
[2]如[1]之分離分析法，其中前述二烷基銨鹽為二丁基銨鹽。
[3]如[1]或[2]之分離分析法，其中前述反相層析為管柱層析，前述分離分析法，包含：於管柱中，藉由含有前述離子對試藥與水或是前述離子對試藥與水與水溶性有機溶劑之第1溶離液來進行平衡化之步驟；使前述合成寡核苷酸溶解於前述第1溶離液，以製備分析用樣本之步驟；將前述分析樣本注入於在前述平衡化步驟中已使前述樣本平衡化之前述管柱，並固定在前述管柱之步驟；以及使用前述水溶性有機溶劑的含量多之第2溶離液，至少從前述第1溶離液中，選擇性地溶離前述合成寡核苷酸之步驟。
[4]如[1]~[3]中任一項之分離分析法，其中於前述管柱中包含非多孔性的填充劑。
藉由本發明，可提供一種即使是31聚物以上的長鏈合成寡核苷酸，亦可藉由反相層析高度地分離分析之合成寡核苷酸的分離分析法。
第1圖係使用實施例1之反相層析用溶離液所測得之紫外線檢測法(波長254nm)的層析圖。
第2圖係使用實施例2之反相層析用溶離液所測得之紫外線檢測法(波長254nm)的層析圖。
第3圖係使用比較例1之反相層析用溶離液所測得之
紫外線檢測法(波長254nm)的層析圖。
第4圖係使用比較例2之反相層析用溶離液所測得之紫外線檢測法(波長254nm)的層析圖。
第5圖係使用比較例3之反相層析用溶離液所測得之紫外線檢測法(波長254nm)的層析圖。
以下係說明用以實施本發明之最適形態。以下所說明之實施形態，僅表示本發明之代表性實施形態的一例，並非藉此狹隘地解釋本發明的範圍。
本發明之合成寡核苷酸的分離分析法，係藉由使用含有二丁基銨鹽之離子對試藥之反相層析，將31聚物以上之合成寡核苷酸的合成過程中所含有之雜質高度地分離分析之手法。
本發明之一樣態之合成寡核苷酸的分離分析法，較佳為反相管柱層析。此時，本發明之一樣態的分離分析法，係包含：於管柱中，藉由含有前述離子對試藥與水與水溶性有機溶劑之第1溶離液來進行平衡化之步驟；使前述合成寡核苷酸溶解於前述第1溶離液，以製備分析用樣本之步驟；將前述分析樣本注入於在前述平衡化步驟中已使前述樣本平衡化之前述管柱，並固定在前述管柱之步驟；以及使用前述水溶性有機溶劑的含量多之第2溶離液，至少從前述第1溶離液中，選擇性地溶離前述合成寡
核苷酸之步驟。
所謂「合成寡核苷酸」，一般係在固相載體上使核酸單體連續地反應而合成者，較佳為藉由亞磷醯胺法所合成之核酸寡聚物。合成寡核苷酸之目的的鏈長為10至110聚物，較佳為10至70聚物，更佳為31至62聚物。
所謂「反相層析」，係應用目的對象物之疏水性的差，並且根據因往疏水性的固定相(填充劑)及非疏水性的移動相(溶離液)之分配的不同所形成之移動速度的差而成之反相分配層析。因應固定相(填充劑)及移動相(溶離液)之形態的不同，例如有管柱反相層析等。
所謂「離子對試藥」，為具有與離子性的目的對象物形成離子對之疏水性官能基之試藥，其係提高將所形成之目的對象物往疏水性管柱之保持性，以提升分離性。於核苷酸(核酸)的分離中，可使用具有正的解離基與疏水性官能基之離子對藥劑。典型的離子對試藥，可列舉出有機或無機酸的三烷基銨鹽，例如上述非專利文獻2所記載之三乙基銨乙酸酯。
所謂「合成過程中所含有之雜質」，為分子量與目的之合成寡核苷酸不同之雜質，例如經常被稱為n-x碎片之非全長的寡核苷酸(寡核酸)(n為目的之核苷酸(核酸)數，x為缺損數，n、x為正整數，n>x，例如n-1、n-2等)，雙重地嵌入之n+1碎片，乙醯基、異丁醯基、氰乙基、甲基等之保護核酸單體之官能基的脫保護不足之寡核
苷酸，脫嘌呤體或脫嘧啶體等之不完全寡核苷酸，硫代磷酸酯中之磷酸二酯雜質等之不充分骨架改變寡核苷酸，以及具有部分掌性之異構物等。
本發明之一樣態之合成寡核苷酸的分離分析法，係如下所述。亦即，預先使含有含二丁基銨鹽之離子對試藥之溶離液，通液於包含固定有疏水性官能基之填充劑之管柱，來進行平衡化，然後將溶解有合成寡核苷酸之溶液通液於該溶離液，以使合成寡核苷酸鍵結於管柱內。接著藉由依序增大所通液之溶離液中的有機溶劑濃度之斜率，亦即所謂梯度，將合成寡核苷酸的合成過程中所含有之雜質，與目的之合成寡核苷酸分離而溶出。使平衡化時所通液之溶離液再度通液，以將管柱再生。
本發明之一樣態的填充劑，可應用由固定有疏水性官能基之二氧化矽或聚合物所構成之填充劑。填充劑的構成特佳為二氧化矽。此外，該形狀較佳為非多孔性的粒子，該粒徑較佳為3μm以下，更佳為2μm以下。此外，所固定之疏水性官能基，較佳為丁基、苯基、辛基、十八烷基，特佳為十八烷基。
本發明之一樣態的溶離液，除了使用含有二丁基銨鹽之離子對試藥之外，其他並無特別限制，較佳係組合含有由二丁基胺與酸所構成之鹽之水系溶離液與C1至3的醇或腈系有機溶劑。酸，較佳為碳酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸、丙酸。最佳為含有二丁基胺與乙酸之水系溶離液與乙腈之組合。水系溶離液的鹽濃度並無特別限
制，較佳為1至100mM，更佳為5至50mM，特佳為10至20mM。此外，水系溶離液的pH，只要是可進行往管柱之鍵結與溶出之範圍即可，並無特別限制，較佳為6~8，更佳為6.5至7.5。
本發明之一樣態的離子對試藥，例如可使用二丁基銨鹽及二丁基銨鹽以外的烷基銨鹽，例如含有有三乙基銨鹽等之離子對試藥。
此時，相對於離子對試藥，二丁基銨鹽的比率較佳為30%莫耳以上，尤佳為40%莫耳以上，更佳為50%莫耳以上。此外，離子對試藥最佳為二丁基銨鹽。
本發明之一樣態之分離分析時的管柱溫度，較佳為20至100℃，更佳為30至80℃，最佳為40至70℃。
本發明之一樣態之合成寡核苷酸的分離分析法，可使用市售的反相層析裝置，例如可列舉出島津製作所公司的Prominence或Waters公司的Acuity等之分析用裝置。
本發明之一樣態之合成寡核苷酸的分離分析法所使用之管柱，可使用市售的分析用或分離用反相管柱，例如可列舉出EPROGEN公司的MICRA(註冊商標)NPS ODS-1(粒徑1.5μm、33×4.6mm ID)、或是Waters公司的XBridge OST C18(粒徑1.7μm、孔徑135Å、50×4.6mm ID)等之分析或分餾用管柱。
本發明之一樣態之合成寡核苷酸的分離分析
法所使用之檢測方法，例如可列舉出應用合成寡核苷酸等的紫外線/可見光吸收之檢測器，或是應用合成寡核苷酸等的質譜之檢測器等。為紫外線/可見光吸收檢測器時，檢測波長例如可列舉出254nm。
藉由此方法，可將合成寡核苷酸高度地分離分析。
[實施例]
以下係列舉實施例來說明本發明，但本發明並不限定於此實施例。
(實施例1)
使用含有二丁基銨鹽之離子對試藥之合成寡核苷酸的分離分析
(1)管柱的平衡化步驟
管柱係使用EPROGEN公司的MICRA(註冊商標)NPS ODS-1(粒徑1.5μm、33×4.6mm ID)。層析，係使用系統控制器SCL-10AVP、送液單元LC10-AD、自動取樣器SIL-10ADVP、管柱烤爐CTO-AC10VP、檢測器SPD-M10A(島津製作所公司製)，管柱溫度40℃，溶離液使用添加有乙腈之二丁基銨乙酸酯水溶液。將乙腈添加於10mM二丁基銨乙酸酯水溶液(pH7.0)，而調製出含有最終濃度4.5v/v%的乙腈之9.6mM二丁基銨乙酸酯水溶液作為第1溶離液，並使該第1溶離液通液10mL以上而使管柱
平衡化。將移動相的流速設為1.0mL/分。NPS ODS-1，為包含鍵結有十八烷基之非多孔性的二氧化矽粒子填充劑之管柱。
(2)分析用樣本的製備步驟
以10mM二丁基銨乙酸酯水溶液，來溶解從Eurofins Genomics公司所購入之合成寡核苷酸62聚物(商品名稱：Standard Oligo 50nmol規格品salt-free等級；配列號碼1(以(5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCCCACACCGGCTGTTGTCATACTTCTCATGGTTCTTCGGAA-3')所示之鹼配列)，而調製出合成寡核苷酸的濃度成為0.1mg/mL之分析用樣本。
(3)合成寡核苷酸的鍵結步驟
將調製後之分析用樣本10μL注入於在(1)中已平衡化後之管柱，使用第1溶離液使合成寡核苷酸鍵結於管柱。將移動相的流速設為1mL/分。
(4)合成寡核苷酸與雜質之分離溶出步驟
移動相，係從第1溶離液開始，將線性梯度構成為包含：以最初的7.5分使乙腈的最終濃度增大至18v/v%為止之斜率的第1段梯度，並以接下來的32.5分使乙腈的最終濃度增大至31.5v/v%為止之斜率的第2段梯度之2段梯度。藉由依序增大乙腈濃度之線性梯度斜率，以將鍵結於
管柱之合成寡核苷酸或雜質分離而溶出。
檢測器，係使用紫外線/可見光(uv/vis)檢測器，檢測波長為254nm。
結果如第1圖所示，於保持時間29分鐘時觀測到合成寡核苷酸的峰值，在此之前觀測到被視為雜質的峰值。
(實施例2)
使用含有二丁基銨鹽之離子對試藥之合成寡核苷酸的分離分析
(1)管柱的平衡化步驟
與實施例1同樣地進行。
(2)分析用樣本的製備步驟
以10mM二丁基銨乙酸酯水溶液，來溶解從Eurofins Genomics公司所購入之合成寡核苷酸62聚物(商品名稱：Standard Oligo 50nmol規格品salt-free等級；配列號碼1(以(5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCCCACACCGGCTGTTGTCATACTTCTCATGGTTCTTCGGAA-3')所示之鹼配列)，與40聚物(商品名稱：Standard Oligo 50nmol規格品salt-free等級；配列號碼2(以(5'-CCACACCGGCTGTTGTCATACTTCTCATGGTTCTTCGGAA-3')所示之鹼配列)，與80聚物(商品名稱：Standard Oligo 50nmol規
格品salt-free等級；配列號碼3(以(5'-GTTTCATGTTGTTGGGATTGAGTTTTGAACTCGGCAACAAGAAACTGCCTGAGTTACATCAGTCGGTTTTCGTCGAGGGC-3')所示之鹼配列)，與100聚物(商品名稱：Standard Oligo 50nmol規格品salt-free等級；配列號碼4(以(5'-GCTGATCTGTGGCTTAGGTAGTTTCATGTTGTTGGGATTGAGTTTTGAACTCGGCAACAAGAAACTGCCTGAGTTACATCAGTCGGTTTTCGTCGAGGGC-3')所示之鹼配列)，與110聚物(商品名稱：Standard Oligo 50nmol規格品salt-free等級；配列號碼5(以(5'-TGCTCGCTCAGCTGATCTGTGGCTTAGGTAGTTTCATGTTGTTGGGATTGAGTTTTGAACTCGGCAACAAGAAACTGCCTGAGTTACATCAGTCGGTTTTCGTCGAGGGC-3')所示之鹼配列)，而調製出各鏈長之合成寡核苷酸的最終濃度成為0.01mg/mL之分析用樣本。
(3)合成寡核苷酸的鍵結步驟
除了將調製後之分析用樣本往管柱的注入量設為20μL之外，其他與實施例1同樣地實施。
(4)合成寡核苷酸與雜質之分離溶出步驟
除了以不改變斜率之方式，以第2段梯度58.5分使乙腈的最終濃度增大至42.3v/v%為止之外，其他與實施例1同樣地實施。
檢測器，係與實施例1同樣地進行。
結果如第2圖所示，於保持時間24分鐘時觀測到合成寡核苷酸40聚物的峰值，於保持時間29分鐘時觀測到合成寡核苷酸62聚物的峰值，於保持時間32分鐘時觀測到合成寡核苷酸80聚物的峰值，於保持時間35分鐘時觀測到合成寡核苷酸100聚物的峰值，於保持時間37分鐘時觀測到合成寡核苷酸110聚物的峰值。
(比較例1)
使用三乙基銨鹽作為離子對試藥之合成寡核苷酸的分離分析
除了將實施例1的平衡化步驟(1)所使用之溶離液設為10mM三乙基銨乙酸酯(pH7.0)之外，其他與實施例1同樣地實施。
於保持時間8.5分鐘時觀測到合成寡核苷酸的峰值。然而，往管柱之保持性弱，在如實施例1中所觀察到般之主峰值的面前所檢測出之雜質的峰值無法分離，合成寡核苷酸的分離不足，無法進行高度的分離分析。
結果如第3圖所示。
(比較例2)
使用三乙基銨鹽作為離子對試藥之合成寡核苷酸的分離分析
除了將實施例1的平衡化步驟(1)所使用之溶離液設為100mM三乙基銨乙酸酯(pH7.0)，並且將合成寡核苷酸
之鍵結步驟(3)的線性梯度設為以30分鐘使乙腈的最終濃度增大至31.5v/v%為止之1段的梯度之外，其他與實施例1同樣地實施。
於保持時間15分鐘時觀測到合成寡核苷酸的峰值。然而，在如實施例1中所觀察到般之主峰值的面前所檢測出之雜質的峰值無法分離，合成寡核苷酸的分離不足，無法進行高度的分離分析。
結果如第4圖所示。
(比較例3)
使用三乙基銨鹽作為離子對試藥之合成寡核苷酸的分離分析
除了將實施例2的平衡化步驟(1)所使用之溶離液設為10mM三乙基銨乙酸酯(pH7.0)之外，其他與實施例2同樣地實施。
於保持時間8.5分鐘時觀測到合成寡核苷酸的峰值。
然而，往管柱之保持性弱，如實施例2中所觀察到般之5個主峰值無法分離，而整體地溶出。因此，合成寡核苷酸的分離不足，無法進行高度的分離分析。
結果如第5圖所示。
<110> SHOWA DENKO K.K.
<120> 分離或分析方法
<130> PC22450
<150> JP2015-256976
<151> 2015-12-28
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成寡核苷酸
<400> 1
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成寡核苷酸
<400> 2
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成寡核苷酸
<400> 3
<210> 4
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成寡核苷酸
<400> 4
<210> 5
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成寡核苷酸
<400> 5
Claims (4)
- 一種分離分析法，其係藉由使用離子對試藥之反相層析，將31聚物以上的合成寡核苷酸分離分析之方法，其特徵為：離子對試藥含有二烷基銨鹽。
- 如請求項1之分離分析法，其中前述二烷基銨鹽為二丁基銨鹽。
- 如請求項1或2之分離分析法，其中前述反相層析為管柱層析，前述分離分析法，包含：於管柱中，藉由含有前述離子對試藥與水或是前述離子對試藥與水與水溶性有機溶劑之第1溶離液來進行平衡化之步驟；使前述合成寡核苷酸溶解於前述第1溶離液，以製備分析用樣本之步驟；將前述分析樣本注入於在前述平衡化步驟中已使前述樣本平衡化之前述管柱，並固定在前述管柱之步驟；以及使用前述水溶性有機溶劑的含量多之第2溶離液，至少從前述第1溶離液中，選擇性地溶離前述合成寡核苷酸之步驟。
- 如請求項1~3中任一項之分離分析法，其中於前述管柱中包含非多孔性的填充劑。
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