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TW201722989A - 抗il-2抗體及其組合物及用途 - Google Patents

抗il-2抗體及其組合物及用途 Download PDF

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TW201722989A
TW201722989A TW105134200A TW105134200A TW201722989A TW 201722989 A TW201722989 A TW 201722989A TW 105134200 A TW105134200 A TW 105134200A TW 105134200 A TW105134200 A TW 105134200A TW 201722989 A TW201722989 A TW 201722989A
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TW
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antibody
nos
hil
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TW105134200A
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English (en)
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艾薩克 J 朗頓
納塔莎 奎林
保羅 貝賽特
艾雷諾拉 特洛塔
傑弗瑞 A 布魯斯東
羅倫 Ｋ 艾利
肯南 克利斯多弗 葛西亞
Original Assignee
輝瑞大藥廠
美國加利福尼亞大學董事會
李蘭. 史丹佛學院理事會
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

本發明提供特異性結合至IL-2且減小IL-2結合至IL-2Rα及IL-2Rβ之親和力之抗體或其抗原結合部分。本發明另外提供獲得該等抗體之方法及編碼其之核酸。本發明另外係關於使用該等抗體治療及/或預防自體免疫疾病、病症或病狀及用於免疫阻抑之組合物及治療方法，包含但不限於投與包括該抗體及IL-2之複合物。

Description

抗IL-2抗體及其組合物及用途
本發明係關於特異性結合介白素-2(IL-2)之抗體，例如全長抗體及其抗原結合部分。本發明另外係關於包括IL-2之抗體之組合物及使用該等抗體作為藥劑之方法。抗IL-2抗體可用於治療及預防自體免疫疾病、病症及病狀及用於免疫阻抑。
介白素-2(IL-2)在免疫反應中發揮重要作用且係用於治療與免疫反應有關之疾病(例如自體免疫疾病、病症及病狀)及用於免疫阻抑之潛在靶。長期且未滿足性地需要治療IL-2介導之疾病、病症及病狀之新穎治療劑。本發明滿足該等需要。
本發明者已生成新且有利之抗IL-2抗體。在某些態樣中，本發明係關於特異性結合人類IL-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體減小hIL-2至IL-2受體鏈IL-2Rα及IL-2Rβ之結合，且以高於調控T(Treg)細胞中之程度抑制CD8+ T細胞中之活性。
在某些態樣中，本發明係關於特異性結合人類IL-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體結合hIL-2之螺旋A及C及B-C環。
在某些態樣中，本發明係關於與包括SEQ ID NO：13及14之胺基酸 序列之抗體競爭結合至人類IL-2(hIL-2)或與其結合hIL-2之相同表位的經分離抗體或其抗原結合部分。
在某些態樣中，本發明係關於特異性結合人類IL-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體將hIL-2至IL-2Rα之結合親和力減小1至199倍。在某些實施例中，抗體將hIL-2至IL-2Rα之結合親和力減小10倍。
在某些態樣中，本發明係關於特異性結合hIL-2之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或部分減小hIL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合，且以高於Treg細胞中之程度抑制CD8+ T細胞中之STAT5磷酸化。
在某些態樣中，本發明係關於特異性結合hIL-2之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或部分減小hIL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合，且增加身體中Treg細胞對CD8+或CD4+ T細胞或對NK細胞之比率，如在末梢血單核細胞(PBMC)培養或重構分析中所量測。
在某些態樣中，本發明係關於特異性結合hIL-2之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或部分減小hIL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合，且增加FOXP3、CD25及Icos中之一或多者在Treg細胞中之表現。
在某些態樣中，本發明係關於經分離抗體或抗原結合部分，其中該抗體或部分具有a)：等於或大於約4.53×10-4s-1之hIL-2結合解離速率；及/或b)等於或大於約1.14×10-10M之hIL-2結合親和力。
在某些態樣中，本發明係關於經分離抗體或抗原結合部分，其中該抗體或部分包括：(a)HCDR1，其包括SEQ ID NO：73(Kabat)、74(Chothia)或75(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：76(Kabat)或77(Chothia)； HCDR3，其包括SEQ ID NO：78；LCDR1，其包括SEQ ID NO：79；LCDR2，其包括SEQ ID NO：80；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：81；(b)HCDR1，其包括SEQ ID NO：82(Kabat)、83(Chothia)或84(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：85(Kabat)或86(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：87；LCDR1，其包括SEQ ID NO：88；LCDR2，其包括SEQ ID NO：89；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：90；(c)HCDR1，其包括SEQ ID NO：91(Kabat)、92(Chothia)或93(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：94(Kabat)或95(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：96；LCDR1，其包括SEQ ID NO：97；LCDR2，其包括SEQ ID NO：98；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：99；(d)HCDR1，其包括SEQ ID NO：100(Kabat)、101(Chothia)或102(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：103(Kabat)或104(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：105；LCDR1，其包括SEQ ID NO：106；LCDR2，其包括SEQ ID NO：107；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：108；(e)HCDR1，其包括SEQ ID NO：109(Kabat)、110(Chothia)或111(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：112(Kabat)或113(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：114；LCDR1，其包括SEQ ID NO：115；LCDR2，其包括SEQ ID NO：116；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：117；(f)HCDR1，其包括SEQ ID NO：118(Kabat)、119(Chothia)或120(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：121(Kabat)或122(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：123；LCDR1，其包括SEQ ID NO：124； LCDR2，其包括SEQ ID NO：125；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：126；(g)HCDR1，其包括SEQ ID NO：127(Kabat)、128(Chothia)或129(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：130(Kabat)或131(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：132；LCDR1，其包括SEQ ID NO：133；LCDR2，其包括SEQ ID NO：134；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：135；(h)HCDR1，其包括SEQ ID NO：136(Kabat)、137(Chothia)或138(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：139(Kabat)或140(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：141；LCDR1，其包括SEQ ID NO：142；LCDR2，其包括SEQ ID NO：143；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：144；(i)HCDR1，其包括SEQ ID NO：145(Kabat)、146(Chothia)或147(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：148(Kabat)或149(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：150；LCDR1，其包括SEQ ID NO：151；LCDR2，其包括SEQ ID NO：152；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：153；(j)HCDR1，其包括SEQ ID NO：154(Kabat)、155(Chothia)或156(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：157(Kabat)或158(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：159；LCDR1，其包括SEQ ID NO：160；LCDR2，其包括SEQ ID NO：161；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：162；(k)HCDR1，其包括SEQ ID NO：163(Kabat)、164(Chothia)或165 (延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：166(Kabat)或167(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：168；LCDR1，其包括SEQ ID NO：169；LCDR2，其包括SEQ ID NO：170；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：171；(l)HCDR1，其包括SEQ ID NO：172(Kabat)、173(Chothia)或174(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：175(Kabat)或176(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：177；LCDR1，其包括SEQ ID NO：178；LCDR2，其包括SEQ ID NO：179；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：180；(m)HCDR1，其包括SEQ ID NO：181(Kabat)、182(Chothia)或183(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：184(Kabat)或185(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：186；LCDR1，其包括SEQ ID NO：187；LCDR2，其包括SEQ ID NO：188；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：189；(n)HCDR1，其包括SEQ ID NO：190(Kabat)、191(Chothia)或192(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：193(Kabat)或194(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：195；LCDR1，其包括SEQ ID NO：196；LCDR2，其包括SEQ ID NO：197；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：198；(o)HCDR1，其包括SEQ ID NO：199(Kabat)、200(Chothia)或201(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：202(Kabat)或203(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：204；LCDR1，其包括SEQ ID NO：205；LCDR2，其包括SEQ ID NO：206；及LCDR3，其包括SEQ ID NO： 207；(p)HCDR1，其包括SEQ ID NO：208(Kabat)、209(Chothia)或210(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：211(Kabat)或212(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：213；LCDR1，其包括SEQ ID NO：214；LCDR2，其包括SEQ ID NO：215；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：216；或(q)HCDR1，其包括SEQ ID NO：217；HCDR2，其包括SEQ ID NO：218；HCDR3，其包括SEQ ID NO：219；LCDR1，其包括SEQ ID NO：220；LCDR2，其包括SEQ ID NO：221；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：222。
在一些實施例中，抗體或抗原結合部分包括含有以下之重鏈可變結構域(VH)：a)如表7中所展示之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或71中之重鏈互補決定區(HCDR)3；或b)如表7中所展示之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或71中之HCDR1-3。
在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分包括含有以下之輕鏈可變結構域(VL)：a)如表7中所展示之SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或72中之輕鏈互補決定區(LCDR)3；或b)如表7中所展示之SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或72中之LCDR1-3。
在一些上述實施例中，抗體或抗原結合部分包括：a)如表7中所展示之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71中之HCDR1-3；及/或b)如表7中所展示之SEQ ID NO： 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中之LCDR1-3。
在某些態樣中，本發明係關於特異性結合人類介白素-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其包括含有以下之重鏈可變結構域(VH)：a)如表7中所展示之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71中之HCDR3；b)如表7中所展示之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71中之HCDR1-3；或c)SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71之胺基酸序列。
在某些態樣中，本發明係關於特異性結合hIL-2之經分離抗體或其抗原結合部分，其包括含有以下之輕鏈可變結構域(VL)：a)如表7中所展示之SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中之LCDR3；b)如表7中所展示之SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中之LCDR1-3；或c)SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明係關於經分離抗體或抗原結合部分，其VH包括：a)如表7中所展示之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71中之HCDR3；b)如表7中所展示之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71中之HCDR1-3；或c)SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71之胺基酸序列；且其VL包括：a)如表7中所展示之SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、 16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中之LCDR3；b)如表7中所展示之SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中之LCDR1-3；或c)SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72之胺基酸序列。
在某些態樣中，本發明係關於特異性結合hIL-2之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體分別包括如表7中所展示之以下中之HCDR1-3及LCDR1-3胺基酸序列：SEQ ID NO：1及2，SEQ ID NO：3及4，SEQ ID NO：5及6，SEQ ID NO：7及8，SEQ ID NO：9及10，SEQ ID NO：11及12，SEQ ID NO：13及14，SEQ ID NO：15及16，SEQ ID NO：17及18，SEQ ID NO：19及20，SEQ ID NO：21及22，SEQ ID NO：23及24，SEQ ID NO：25及26，SEQ ID NO：27及28，SEQ ID NO：29及30， SEQ ID NO：31及32，或SEQ ID NO：71及72。
在某些態樣中，本發明係關於經分離抗體或其抗原結合部分，其VH及VL分別包括以下中之胺基酸序列：SEQ ID NO：1及2，SEQ ID NO：3及4，SEQ ID NO：5及6，SEQ ID NO：7及8，SEQ ID NO：9及10，SEQ ID NO：11及12，SEQ ID NO：13及14，SEQ ID NO：15及16，SEQ ID NO：17及18，SEQ ID NO：19及20，SEQ ID NO：21及22，SEQ ID NO：23及24，SEQ ID NO：25及26，SEQ ID NO：27及28，SEQ ID NO：29及30，SEQ ID NO：31及32，或SEQ ID NO：71及72。
在本發明之一些實施例中，經分離抗體係IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。抗體可包括含有SEQ ID NO：33之胺基酸序列之重鏈恆定 區及/或含有SEQ ID NO：34或35之胺基酸序列之輕鏈恆定區。在一些該等實施例中，不存在重鏈C-末端離胺酸。
在某些態樣中，本發明係關於特異性結合hIL-2之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體與任一上述抗體結合至相同表位或與其競爭結合至IL-2Rα及IL-2Rβ。
在某些態樣中，本發明係關於經抗體或抗原結合部分，其VH及VL胺基酸序列與下列胺基酸序列分別至少90%(例如95%、98%或99%)一致：SEQ ID NO：1及2，SEQ ID NO：3及4，SEQ ID NO：5及6，SEQ ID NO：7及8，SEQ ID NO：9及10，SEQ ID NO：11及12，SEQ ID NO：13及14，SEQ ID NO：15及16，SEQ ID NO：17及18，SEQ ID NO：19及20，SEQ ID NO：21及22，SEQ ID NO：23及24，SEQ ID NO：25及26，SEQ ID NO：27及28，SEQ ID NO：29及30，或SEQ ID NO：31及32。
在本發明之一些上述實施例中，抗體係人類抗體。
本發明亦提供編碼本發明之抗體或抗原結合部分之重鏈、輕鏈或二者之經分離核酸。在某些態樣中，經分離核酸包括：a)SEQ ID NO：36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64或66之核苷酸序列；b)SEQ ID NO：37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65或67之核苷酸序列；或c)a)及b)二者。舉例而言，經分離核酸可包括以下之核苷酸序列：SEQ ID NO：36及37，SEQ ID NO：38及39，SEQ ID NO：40及41，SEQ ID NO：42及43，SEQ ID NO：44及45，SEQ ID NO：46及47，SEQ ID NO：48及49，SEQ ID NO：50及51，SEQ ID NO：52及53，SEQ ID NO：54及55，SEQ ID NO：56及57，SEQ ID NO：58及59，SEQ ID NO：60及61，SEQ ID NO：62及63，SEQ ID NO：64及65，或SEQ ID NO：66及67。
在某些態樣中，本發明係關於包括上述經分離核酸中之一或多者之載體。在其他態樣中，本發明提供一種宿主細胞(例如哺乳動物細胞，例如NS0細胞及CHO細胞)，其包括編碼本發明之抗體或抗原結合部分之重鏈、輕鏈或二者之經分離核酸或載體。本發明亦提供產生特異性結合hIL-2之抗體或其抗原結合部分之方法，其包括：a)在容許表現該抗體或抗原結合部分之條件下培養宿主細胞，其中宿主細胞包括編碼抗體或抗原結合部分之重鏈及輕鏈之核苷酸序列，及b)自培養物分離該抗體或抗原結合部分。
在某些態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其包括本發明之抗體或抗原結合部分及醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
在某些態樣中，本發明係關於治療有需要之人類個體之發炎性病狀(例如自體免疫疾病)或誘導免疫阻抑之方法，其包括向個體投與有效量之本發明之抗體或抗原結合部分或本發明之醫藥組合物。在一些實施例中，以與IL-2之複合物形式投與抗體。在相關態樣中，本發明提供用於治療患有發炎性病狀(例如自體免疫疾病)或需要免疫阻抑之人類個體之本發明之抗體或抗原結合部分或本發明之醫藥組合物，其中視情況以與IL-2之複合物形式投與該抗體或部分；且提供本發明之抗體或抗原結合部分製造用於治療發炎性病狀(例如自體免疫疾病)或誘導免疫阻抑之藥劑之用途，其中視情況以與IL-2之複合物形式投與該抗體或部分。
可使用本發明組合物(包含但不限於本文所闡述之抗體或抗體/IL-2複合物)及方法治療之病狀包含但不限於：發炎性皮膚病，包含牛皮癬及皮膚炎(例如異位性皮膚炎)；皮肌炎；全身性硬皮症及硬化；與發炎性腸病有關之病狀(例如克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎)；結腸 炎；胃炎；呼吸窘迫症候群(包含成人呼吸窘迫症候群及ARDS)；皮膚炎；腦膜炎；腦炎；眼色素層炎；腎小球性腎炎；過敏性病狀，例如濕疹及氣喘及其他涉及T細胞浸潤及慢性發炎性反應之病狀；動脈粥樣硬化；白血球黏著缺陷；類風濕性關節炎；全身性紅斑狼瘡(SLE)；糖尿病(例如I型糖尿病)；多發性硬化；雷諾氏症候群(Reynaud's syndrome)；自體免疫甲狀腺炎；過敏性腦脊髓炎；薛格連氏症候群(Sjogren's syndrome)；青少年型糖尿病；及與由通常發現於結核病、類肉瘤病、多肌炎、肉芽腫病及血管炎中之細胞介素及T淋巴球介導之急性及延遲超敏反應有關之免疫反應；韋格納氏病(Wegener’s disease)；惡性貧血(阿狄森氏病(Addison's disease))；涉及白血球血細胞滲出之疾病；中樞神經系統(CNS)發炎性病症；多器官損傷症候群；溶血性貧血(包含但不限於冷球蛋白血症或庫姆斯陽性貧血(Coombs positive anemia))；重症肌無力；抗原-抗體複合物介導之疾病；抗腎小球基底膜病；抗磷脂症候群；過敏性神經炎；格雷夫斯氏病(Graves' disease)；朗-愛二氏肌無力症候群(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自體免疫多內分泌腺病；白癜風；萊特爾氏病(Reiter's disease)；僵體症候群；貝切特氏病(Behcet’s disease)；巨細胞關節炎；免疫複合物腎炎；IgA腎病變；IgM多發性神經病變；免疫型血小板減少性紫斑症(ITP)或自體免疫血小板減少症及自體免疫溶血性疾病；橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)；自體免疫肝炎；自體免疫血友病；自體免疫淋巴組織增殖性症候群(ALPS)；自體免疫葡萄膜視網膜炎；格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)；古巴士德氏症候群(Goodpasture's syndrome)；混合性結締組織疾病；自體免疫相關性不育；結節性多動脈 炎；斑禿；特發性黏液水腫；移植物抗宿主病；及肌肉營養不良症(杜興氏(Duchenne)、貝克氏(Becker)、肌強直性、肢-帶型、顏面肩胛肱骨型、先天性、眼咽型、遠端型及埃-德二氏(Emery-Dreifuss))。在一些實施例中，可使用本發明組合物(包含但不限於本文所闡述之抗體或抗體/IL-2複合物)及方法治療之病狀係糖尿病(例如I型糖尿病)。在一些實施例中，可使用本發明組合物(包含但不限於本文所闡述之抗體或抗體/IL-2複合物)及方法治療之病狀係I型糖尿病。在一些實施例中，可使用本發明組合物(包含但不限於本文所闡述之抗體或抗體/IL-2複合物)及方法治療之病狀係青少年型糖尿病。
自下列詳細闡述及實例性實施例將明瞭本發明之其他特徵及優點。
圖1繪示抗體/IL-2親和力以及IL-2Rα及IL-2Rβ結合。將反應報告為在60秒之後至IL-2α及IL-2Rβ之結合，且單位為兩種代表性純系d1C7及16C3(呈與IL-2之複合物形式)分別至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合之百分比。
圖2繪示抗體/IL-2親和力及IL-2Rα及IL-2Rβ結合。親代及親和力成熟純系皆展示完全抑制抗體/IL-2複合物至IL-2Rβ之結合且與純系d1C7/IL-2複合物相比減小至IL-2Rα之結合。
圖3繪示在IL-2：抗IL-2 mAb治療之後之Treg表型。在hCD45+ CD3+ CD4+ Helios+ FoxP3+細胞上選通Treg群體。
圖4A-C繪示16C3(25μg)及F5.1.11.02(1μg、5μg及25μg)與hIL-2之複合物增加Treg/CD4、Treg/CD8及Treg/NK細胞比率。圖4D-F繪示16C3(25μg)及F5.1.11.02(1μg、5μg及25μg)與hIL-2之複合物增加Treg/CD4、Treg/CD8及Treg/NK細胞比率。
圖5A-C繪示，16C3(25μg)及F5.1.11.02(1μg、5μg及25μg)與hIL-2之複合物增加脾中之CD4+、CD8+細胞及Treg之總數。圖5D-F繪示，16C3(25μg)及F5.1.11.02(1μg、5μg及25μg)與hIL-2之複合物增加脾中之CD4+、CD8+細胞及Treg之總數。
圖6A-C繪示在抗體治療之後Treg上之CD25、Icos及FoxP3平均螢光強度(MFI)。
圖7A-V繪示在抗體治療之後CD8+效應T細胞及Treg細胞中之pSTAT5信號傳導。曲線代表使用0.2ng/mL hIL-2、10ng/mL hIL-2或500ng/mL hIL-2之治療。
圖8A-F繪示在抗體治療之後CD8+效應T細胞及Treg細胞中之pSTAT5信號傳導。曲線代表使用0.5ng/mL hIL-2、5ng/mL hIL-2、50ng/mL hIL-2或500ng/mL hIL-2之治療。
圖9A-D繪示在抗體治療之後CD8+/CD25高T細胞、CD8+/CD25低T細胞及Treg細胞中之pSTAT5信號傳導。x軸係nM抗體。曲線代表使用0.8ng/mL hIL-2、20ng/mL hIL-2或500ng/mL hIL-2之治療。
圖10A-B繪示在使用不同濃度之IL-2時CD8+/CD25高T細胞、CD8+/CD25低T細胞及Treg細胞中之pSTAT5信號傳導。
圖11A-H繪示在抗體F5.1.9、F5.1.9.5及F5.1.11.04治療之後CD8+效應T細胞及Treg細胞中之pSTAT5信號傳導。x軸係nM抗體。曲線代表使用0.8ng/mL hIL-2、20ng/mL hIL-2或500ng/mL hIL-2之治療。
圖12A-B繪示在使用PMA/離子黴素活體外刺激小鼠脾細胞之後之IL-2產生。
圖13A-B繪示hIL-2Tg、NOD或NOD mIL-2+/-小鼠中之活化 (CD44+CD62L-)CD4+或CD8+ T細胞之百分比。
圖14繪示來自hIL-2 Tg、NOD或NOD mIL-2+/-小鼠之Treg上之CD25之細胞表面表現。
圖15繪示在第7天F5.1.11.02：IL-2複合物對脾之整體細胞性之效應。
圖16A-I繪示F5.1.11.02：IL-2複合物對脾、pLN及胰臟中之Treg百分比之效應。
圖17A-F繪示F5.1.11.02(25μg)與hIL-2之複合物對脾、pLN及胰臟中之Treg/CD4及Treg/CD8比率之效應。
圖18A-C繪示F5.1.11.02：IL-2複合物(5μg及25μg F5.1.11.02)對脾、pLN及胰臟中之Treg上之CD25平均螢光強度(MFI)之效應。
圖19A-B繪示25μg F5.1.11.02與hIL-2之複合物對總脾細胞數之效應。
圖20A-F繪示F5.1.11.02抗體：IL-2複合物對脾中之Teff及Treg總細胞數量之效應。在hCD45+ CD3+ CD4+ Helios+ FoxP3+細胞上選通Treg群體。
圖21A-D繪示F5.1.11.02抗體：IL-2複合物對脾中之Treg/CD4及Treg/CD8比率之效應。在hCD45+ CD3+ CD4+ Helios+ FoxP3+細胞上選通Treg群體。
圖22A-H繪示F5.1.11.02抗體：IL-2複合物治療對Treg增殖之效應。
圖23A-H繪示F5.1.11.02抗體：IL-2複合物治療對CD8 T細胞增殖之效應。
圖24A-B繪示，使用二種劑量之F5.1.11.02抗體：IL-2複合物進行治療會與同型對照相比誘導增加脾中之Treg及CD8群體上之CD25平均螢光強 度(MFI)。
圖25A-D繪示F5.1.11.02及F5.1.11對Treg及CD8細胞數之效應之間之比對。
圖26A-C繪示F5.1.11.02及F5.1.11對Treg/CD8比率之效應之間之比對。
圖27A-H繪示抗體在各種劑量下對Treg增殖之效應。
圖28A-H繪示抗體在各種劑量下對CD8細胞增殖之效應。
圖29A-B繪示IL-2Rα至增加濃度之IL-2(A)及IL-2/F5.1.11 Fab(B)之結合之平衡結合分析。
圖30繪示F5.1.11 Fab與IL-2經由輕鏈(LC)CDR1及CDR3環以及重鏈(HC)CDR2及CDR3環之相互作用。
圖31繪示經IL-2-受體四元複合物覆蓋之F5.1.11 Fab/IL-2複合物，其展示F5.1.11 Fab及IL-2Rβ之結合位點重疊(左側圖)。結合至F5.1.11 Fab時之IL-2構象展示相對於受體結合IL-2之構象變化，從而產生IL-2Rα結合位點之別位調節(右側圖)。
圖32繪示非人類靈長類動物交叉反應性之基於結構之文庫設計。人類(SEQ ID NO：224；NCBI登錄號NP_000577.2)及食蟹猴(SEQ ID NO：225；自參考基因體NCBI登錄號NC_022276.1預測)IL-2胺基酸序列之比對展示，IL-2可變環對應於F5.1.11 Fab結合界面。
圖33A-B繪示F5.1.11.02及F5.1.11對脾細胞及hCD45+細胞性之效應之間之比對。
圖34A-B繪示F5.1.11.02及F5.1.11對Treg及CD8細胞CD25表現之效應之間之比對。
圖35A-B繪示在治療之後5天F5.1.11.02抗體：IL-2複合物對Treg、CD4及CD8總細胞數之效應。
圖36A-B繪示在治療之後5天F5.1.11.02抗體：IL-2複合物對Treg/CD4及Treg/CD8細胞比率之效應。
圖37A-B繪示與同型對照相比使用F5.1.11.02抗體：IL-2複合物之治療對Treg及CD8群體上之CD25平均螢光強度(MFI)之效應。
圖38繪示使用F5.1.11.02抗體：IL-2複合物之治療對Treg上之FoxP3平均螢光強度(MFI)之效應。
圖39A-B繪示使用結合IL-2上之不同表位之抗體來促進差異Treg擴增，由此抑制至不同受體表位/結合結構域之結合：IL-2Rα阻斷劑(16C3.4)、IL2Rβ阻斷劑(d1C7)及亦減小IL2至IL-2Rα之結合之IL2Rβ阻斷劑(F5.1.11.02)。統計學單因子ANOVA 16C3.4對d1c7或16C3.4對F5.1.11.02。
圖40繪示與同型對照相比使用16C3.4、d1C7及F5.1.11.02之治療對Treg及CD8群體上之CD25平均螢光強度(MFI)之效應。
圖41繪示F5.1.11.02抗體：IL-2複合物之糖尿病緩解。
圖42繪示F5.1.11.02抗體：IL-2複合物對胰臟中之Treg數量及特性之效應。
聯合研究協議的各方
本文所主張發明係由聯合研究協議之下文所列示各方完成或以其名義完成。聯合研究協議在完成所主張發明當日或在此之前仍有效，且所主張發明係作為在該聯合研究協議範圍內所採取活動之結果而完成。聯合研 究協議之各方係PFIZER INC.及THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA。
發明者已發明特異性結合至hIL-2且減小hIL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合之新及有利抗IL-2抗體或其抗原結合部分。該等抗體及部分可較其抑制Treg細胞增殖更大程度地抑制非Treg細胞(包含效應CD8+、非Treg CD4+及NK細胞)之增殖；與同型對照抗體相比增加Treg增殖；及/或增加Treg細胞對非Treg細胞之比率或維持Treg標記物。本發明抗體不同於國際申請案PCT/US2015/011794(現於2015年7月23日公開為國際公開案第WO 2015/109212號，其全部內容以引用方式併入本文中)中所闡述之IL-2Rα阻斷抗體，此乃因本發明抗體減小但不廢除hIL-2至IL-2Rα之結合且阻斷hIL-2至IL-2Rβ之結合。
抗IL-2抗體或其抗原結合部分可用於預防、治療及/或改善藉由IL-2活性引起及/或與IL-2活性有關之疾病、病症或病狀。該等疾病、病症或病狀尤其包含但不限於Treg介導發炎之1型糖尿病、自體免疫疾病、移植物抗宿主病及其他免疫學疾病，如熟習此項技術者使用本文所揭示之教示內容所瞭解。
一般技術
除非本文另外定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所理解之含義。另外，除非上下文另有需要，否則單數術語應包含複數形式且複數術語應包含單數形式。通常，結合本文所闡述細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質及核酸化學及雜交使用之術語及其技術係業內熟知且常用之彼等。
除非另外指示，否則本發明之實踐將採用分子生物學(包含重組體技 術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學中所熟知之習用技術。該等技術充分闡釋於諸如以下等文獻中：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編輯，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編輯，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney編輯，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather及P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths及D.G.Newell編輯，1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell編輯)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos編輯，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編輯，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人編輯，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人編輯，1991)；Sambrook及Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(2001)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(2002)；Harlow及Lane Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1998)；Coligan等人，Short Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,NY(2003)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.編輯，IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd及C.Dean編輯，Oxford University Press,2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow及D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；及The Antibodies(M.Zanetti及J.D.Capra編輯，Harwood Academic Publishers,1995)。
酶反應及純化技術係根據製造商說明書來實施，以本技術領域內常規方法來實施，或如本文所闡述來實施。與本文中所闡述分析化學、生物化學、免疫學、分子生物學、合成有機化學以及醫學及醫藥化學連用之命名法及其實驗室程序與技術係為本技術領域內已知且常用之彼等。對化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及遞送以及患者治療使用標準技術。
定義
除非另外指示，否則下列術語應理解為具有下列含義：術語「經分離分子」(其中分子係(例如)多肽、多核苷酸或抗體或其部分)係根據其衍生起源或來源具有以下特徵之分子：(1)不與伴隨其(呈其原始狀態)之天然相關組份締合，(2)實質上不含來自相同物種之其他分子，(3)由來自不同物種之細胞表現，或(4)不出現於自然界中。因此，以化學方式合成或表現於不同於天然起源細胞之細胞系統中之分子將與其天然相關組份「分離」。亦可藉由分離使用業內熟知之純化技術來致使分子實質上不含天然相關組份。可藉由業內熟知之諸多方式分析分子純度或均質性。舉例而言，可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳且使用業內熟知技術將凝膠染色以觀察多肽來分析多肽試樣之純度。出於某些目的，可藉由使用HPLC或業內熟知 之其他純化方式提供較高解析度。
如本文中所使用，「實質上純」意指目標物質係存在之主要物質(亦即，以莫耳計，其豐度大於組合物中之任一其他個別物質)，且在一些實施例中，實質上純化部分係目標物質(例如糖蛋白，包含抗體或受體)佔所存在所有巨分子物質之至少約50%(以莫耳計)之組合物。通常，實質上純之組合物包括大於約80%之存在於組合物中之所有巨分子物質，在一些實施例中大於約85%、90%、95%及99%。在一些實施例中，將目標物質純化至基本上均質(藉由習用檢測方法在組合物中不能檢測到污染物物質)，其中組合物基本上由單一巨分子物質組成。在某些實施例中，實質上純之材料為至少50%純(亦即，不含污染物)、在一些實施例中至少90%純、在一些實施例中至少95%純、在一些實施例中至少98%純及在一些實施例中至少99%純。該等量並不意欲具有限制性，且所列舉百分比之間之增量特定設想為本發明之一部分。
「抗體」係能夠經由位於免疫球蛋白分子之可變結構域中之至少一個抗原識別位點特異性結合至靶(例如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等)之免疫球蛋白分子。如本文中所使用，該術語不僅涵蓋完整多株或單株抗體，且除非另外指定，否則亦涵蓋其與完整抗體競爭特異性結合之任何抗原結合部分、包括抗原結合部分之融合蛋白及包括抗原識別位點之免疫球蛋白分子之任何其他經修飾構形。抗原結合部分包含(例如)Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、結構域抗體(dAb，例如鯊及駱駝抗體)、包含互補決定區(CDR)之部分、單鏈可變片段抗體(scFv)、巨抗體、微抗體、嵌合抗體、細胞內抗體、雙價抗體、三價抗體、四價抗體、v-NAR及雙-scFv及至少含有免疫球蛋白之一部分之多肽(該免疫球蛋白之一部分足以 使多肽特異性抗原結合)。端視重鏈之恆定區之抗體胺基酸序列，可將免疫球蛋白分配為不同種類。存在5大類免疫球蛋白(亦即同型)：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等種類中之若干種可進一步分成亞類(亞型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同種類之免疫球蛋白之重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同種類之免疫球蛋白之亞單元結構及三維構形已眾所周知。
本文互換使用之術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」(或簡稱為「抗體部分」)係指抗體之保留特異性結合至抗原(例如IL-2)之能力之一或多個部分。已顯示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之部分來實施。涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內之結合部分之實例包括：(i)Fab部分，其係由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價部分；(ii)F(ab')2部分，其係包括藉由二硫橋在鉸鏈區處連接之兩個Fab部分之二價部分；(iii)Fd部分，其係由VH及CH1結構域組成；(iv)Fv部分，其係由抗體單臂之VL及VH結構域組成，(v)dAb部分(Ward等人(1989)Nature 341：544-546)，其係由VH結構域組成；及(vi)經分離互補決定區(CDR)、二硫化物連接之Fv(dsFv)及抗獨特型(抗Id)抗體及內抗體。另外，儘管Fv部分之兩個結構域(VL及VH)係由單獨基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接體接合在一起，該合成連接體使其能夠成為其中VL及VH區配對形成單價分子之單一蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv))；例如參見Bird等人，Science 242：423-426(1988)及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988))。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，例如雙價抗體。雙價抗體係二價雙特異性抗體，其中VH及VL結構域在單一多肽鏈上表現，但所用連接 體過短而不容許相同鏈上之兩個結構域之間配對，由此迫使結構域與另一鏈上之互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點(例如參見Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)；Poljak等人，1994,Structure 2：1121-1123)。
抗體之「可變結構域」係指抗體輕鏈(VL)之可變結構域或抗體重鏈(VH)之可變結構域(單獨或組合)。如業內所已知，重鏈及輕鏈之可變結構域各自由4個由三個互補決定區(CDR，亦稱為超變區)連結之框架區(FR)組成，且有助於形成抗體之抗原結合位點。若期望標的可變結構域之變體(尤其在CDR外側(亦即在框架區中)之胺基酸殘基中具有取代)，則可藉由比較標的可變結構域與以與標的可變結構域相同之規範種類含有CDR1及CDR2序列之其他抗體之可變結構域來鑑別適當胺基酸取代(在一些實施例中保守胺基酸取代)(例如參見Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196(4)：901-917,1987)。
在某些實施例中，藉由解析抗體結構及/或解析抗體-配體複合物結構來達成CDR之明確描述及包括抗體結合位點之殘基之鑑別。在某些實施例中，可藉由熟習此項技術者已知之各種技術中之任一者(例如X射線結晶學)來達成。在某些實施例中，可採用各種分析方法來鑑別或近似表示CDR。在某些實施例中，可採用各種分析方法來鑑別或近似表示CDR。該等方法之實例包含但不限於Kabat定義、Chothia定義、AbM定義、接觸定義、構象定義及IMGT定義。
Kabat定義係用於編號抗體中之殘基之標準且通常用於鑑別CDR區域。例如參見Johnson & Wu,2000,Nucleic Acids Res.,28：214-8。Chothia定義類似於Kabat定義，但Chothia定義考慮某些結構環區之位 置。例如參見Chothia等人，1986,J.Mol.Biol.,196：901-17；Chothia等人，1989,Nature,342：877-83。AbM定義使用由Oxford Molecular Group所生產對抗體結構建模之電腦程式之積體套件。例如參見Martin等人，1989,Proc Natl Acad Sci(USA),86：9268-9272；「AbMTM,A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies,」Oxford,UK；Oxford Molecular,Ltd.。AbM定義使用知識數據庫及從頭計算法(例如由Samudrala等人，1999,「Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach」,PROTEINS,Structure,Function and Genetics增刊，3：194-198所闡述者)之組合對來自一級序列之抗體之三級結構進行建模。接觸定義係基於可用複合晶體結構之分析。例如參見MacCallum等人，1996,J.Mol.Biol.,5：732-45。在另一方式(在本文中稱為CDR之「構象定義」)中，CDR之位置可鑑別為對抗原結合具有焓貢獻之殘基。例如參見Makabe等人，2008，Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166。其他CDR邊界定義可不嚴格地遵循上述方法中之一者，但將與Kabat CDR之至少一部分重疊，儘管其可根據特定殘基或殘基群不顯著影響抗原結合之預測或實驗發現來縮短或延長。如本文中所使用，CDR可係指藉由業內已知之任一方式(包含方式之組合)定義之CDR。本文所用方法可利用根據該等方法中之任一者定義之CDR。對於含有大於一個CDR之任一給定實施例而言，可根據Kabat、Chothia、延伸、AbM、接觸及/或構象定義中之任一者來定義CDR。在某些實施例中，延伸CDR係指所有藉由Kabat及Chothia方法鑑別之胺基酸殘基。
本文所使用關於抗體或由此特異性結合之抗原之「接觸殘基」係指 抗體/抗原上所存在包括至少一個在同族抗體/抗原上所存在胺基酸殘基之重原子4Å或更小距離內之重原子(亦即非氫)的胺基酸殘基。
如業內所已知，抗體之「恆定區」係指單獨或組合之抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區。
如本文中所使用，「單株抗體」係指自實質上同源抗體之群體獲得之抗體，亦即，除可少量存在之可能天然突變外，構成該群體之個別抗體皆相同。單株抗體具有高度特異性，其針對單一抗原位點。另外，與通常包含針對不同決定子(表位)之不同抗體之多株抗體製劑不同，每一單株抗體針對抗原上之單一決定子。修飾詞「單株」指示抗體之特徵在於自實質上同質之抗體群體獲得，且不應解釋為需要藉由任一特定方法來產生該抗體。舉例而言，擬根據本發明使用之單株抗體可藉由首先由Kohler及Milstein,1975,Nature 256：495闡述之雜交瘤方法製得或可藉由(例如)美國專利第4,816,567號中闡述之重組DNA方法製得。單株抗體亦自使用(例如)McCafferty等人，1990，Nature 348：552-554中所闡述之技術生成之噬菌體文庫分離。如本文中所使用，「人類化」抗體係指非人類(例如鼠類)抗體之形式，其係含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列之嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其部分(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合序列)。在一些實施例中，人類化抗體係如下人類免疫球蛋白(受體抗體)：其中來自接受者CDR之殘基由來自非人類物種(例如小鼠、大鼠或兔)CDR(供體抗體)之具有期望特異性、親和力及能力之殘基代替。人類化抗體可包括既不於抗體中亦不於導入CDR或框架序列中發現、但經包括以進一步改進並優化抗體性能之殘基。
「人類抗體」係擁有對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列之胺基 酸序列及/或使用用於製備如本文所揭示人類抗體之任一技術者。人類抗體之此定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
術語「嵌合抗體」欲指可變結構域序列係衍生自一種物種且恆定區序列係衍生自另一物種之抗體，例如可變結構域序列係衍生自小鼠抗體且恆定區序列係衍生自人類抗體之抗體。該術語亦涵蓋包括來自一種物種(例如第一小鼠)中一個個體之V區及來自相同物種(例如第二小鼠)中另一個體之恆定區之抗體。
術語「抗原(Ag)」係指用於使免疫活性脊椎動物免疫化以產生識別Ag之抗體(Ab)或篩選表現文庫(例如尤其係噬菌體、酵母或核糖體顯示文庫)之分子實體。在本文中，Ag係較廣泛術語且通常意欲包含由Ab特異性識別之靶分子，由此包含用於產生Ab之免疫化過程中或用於選擇Ab之文庫篩選中之分子之部分或模擬物。因此，對於結合至IL-2之本發明抗體而言，來自哺乳動物物種之全長IL-2(例如人類、猴、小鼠及大鼠IL-2，包含其單體及多聚體(例如二聚體、三聚體等)以及IL-2之截短及其他變體)稱為抗原。
通常，術語「表位」係指抗體特異性結合之抗原之區或區域，亦即與抗體物理接觸之區或區域。因此，術語「表位」係指分子中能夠由抗體識別且在抗體之抗原結合區域中之一或多者處結合之部分。通常，表位係在「抗體或其抗原結合部分」(Ab)與其相應抗原之間之分子相互作用之背景下定義。表位通常由分子之表面基團(例如胺基酸或糖側鏈)組成且具有特定三維結構特性以及特定電荷特性。在一些實施例中，表位可為蛋白質表位。蛋白質表位可為線性表位或構象表位。在線性表位中，蛋白質與相互作用分子(例如抗體)之間之所有相互作用點皆沿蛋白質之主要胺基酸 序列線性發生。「非線性表位」或「構象表位」在表位特異性抗體所結合之抗原性蛋白內包括非鄰接多肽(或胺基酸)。本文所用之術語「抗原性表位」定義為抗體可特異性結合之抗原部分，如藉由業內熟知之任一方法(例如藉由習用免疫分析)所測定。或者，在發現過程期間，抗體之生成及表徵可闡明關於期望表位之資訊。根據此資訊，則可競爭性篩選結合至相同表位之抗體。達成此目的之方式係實施競爭及交叉競爭研究以尋找彼此競爭或交叉競爭結合至IL-2之抗體(例如競爭結合至抗原之抗體)。
如本文中所使用，術語「野生型胺基酸」、「野生型IgG」、「野生型抗體」或「野生型mAb」係指天然存在於某一群體(例如人類、小鼠、大鼠、細胞等)內之胺基酸或核酸之序列。
如本文中其他處所概述，可改變抗體分子之某些位置。本文所用之「位置」意指蛋白質序列中之位置。位置可依序或根據確立格式進行編號，舉例而言，可使用EU索引及Kabat索引對抗體之胺基酸殘基進行編號。舉例而言，位置297係人類抗體IgG1中之位置。如上文所概述，通常經由與其他親代序列進行比對來測定相應位置。
本文所用之「殘基」意指蛋白質中之位置及其相關胺基酸一致性。舉例而言，天門冬醯胺297(亦稱為Asn297，亦稱為N297)係人類抗體IgG1中之殘基。
術語「T調控細胞」或「Treg」係指可藉由熟習此項技術者已知之功能或生物標記物表徵之T細胞類型(參見Schmetterer等人，FASEB，第26卷(2012))。在某些實施例中，Treg細胞表現下列標記物中之一或多者：TCR/CD3、CD4、CD25及基於FOXP3基因座之關鍵基因體元件之去甲基化之穩定FOXP3。
術語「Treg保護抗體」係指結合至IL-2且可檢測地將Treg：CD8+細胞比率移向Treg細胞之抗體。在一些實施例中，Treg保護抗體以大於其抑制Treg增殖之程度抑制CD8+細胞增殖。在一些實施例中，Treg保護抗體將Treg：CD8+細胞比率增加至少兩倍。
如業內所已知，本文所互換使用之「多核苷酸」或「核酸」係指任一長度之核苷酸之鏈，且包含DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾核苷酸或鹼基及/或其類似物或任一可藉由DNA或RNA聚合酶納入鏈中之受質。多核苷酸可包括經修飾核苷酸，例如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在組裝鏈之前或之後賦予對核苷酸結構之修飾。非核苷酸組份可中斷核苷酸序列。多核苷酸可在聚合之後藉由(例如)與標記組份偶聯經進一步修飾。其他類型之修飾包含(例如)「帽子」、使用類似物取代天然核苷酸中之一或多者、核苷酸間修飾，例如具有不帶電連接(例如膦酸甲基酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者、含有懸垂部分(例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)者、具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)者、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)者、含有烷基化劑者、具有經修飾鏈接(例如α變旋異構核酸等)者以及多核苷酸之未經修飾形式。另外，通常在糖中存在之羥基中之任一者皆可由(例如)膦酸酯基團、磷酸基團代替，由標準保護基團保護，或經活化以製備與額外核苷酸之額外鏈接，或可結合至固體載體。5’及3’末端OH可經胺或1至20個碳原子之有機封端基團部分磷酸化或取代。其他羥基亦可衍生化成標準保護基團。多核苷酸亦可含有通常業內已知之核糖或去氧核糖之類似形式，包含(例如)2’-O-甲基-、2’-O-烯丙 基、2’-氟-或2’-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-或β-變旋異構糖、差向異構糖(例如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非環類似物及無鹼基核苷類似物(例如甲基核苷)。一或多個磷酸二酯鏈接可由替代連接基團代替。該等替代連接基團包含但不限於如下實施例：其中磷酸酯由P(O)S(「硫代酯」)、P(S)S(「二硫代酯」)、(O)NR2(「醯胺化物」)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(「甲乙縮醛」)代替，其中每一R或R’皆獨立地係H或視情況含有醚(-O-)鏈接之經取代或未經取代之烷基(1-20個C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基(araldyl)。多核苷酸中之所有鏈接並不需要皆相同。前述說明適用於本文中提及之所有多核苷酸，包含RNA及DNA。
「特異性結合」或「優先結合」(在本文中可互換使用)至表位之抗體係業內充分理解之術語，且用以測定該特異性或優先結合之方法亦為業內所熟知。據信，若分子與特定細胞或物質較與替代細胞或物質更頻繁、更快速、以更大持續時間及/或以更大親和力反應或締合，則其展現「特異性結合」或「優先結合」。若抗體較其結合至其他物質以更大親和力、親合力、更易於及/或以更大持續時間結合，則抗體「特異性結合」或「優先結合」至靶。同樣，若抗體較其結合至存在於試樣中之其他物質以更大親和力、親合力、更易於及/或以更大持續時間結合，則抗體「特異性結合」或「優先結合」至試樣中之該靶。舉例而言，特異性或優先結合至IL-2表位之抗體係較其結合至其他IL-2表位或非IL-2表位以更大親和力、親合力、更易於及/或以更大持續時間結合此表位之抗體。藉由閱讀此定義亦應理解，舉例而言，特異性或優先結合至第一靶之抗體(或部分或表位)可或可不特異性或優先結合至第二靶。因此，「特異性結合」或 「優先結合」不一定需要(但其可包含)排他性結合。
可使用各種分析形式來選擇特異性結合所關注分子之抗體或肽。舉例而言，固相ELISA免疫分析、免疫沈澱、BiacoreTM(GE Healthcare,Piscataway,NJ)、KinExA、螢光活化細胞分析(FACS)、OctetTM(FortéBio,Inc.,Menlo Park,CA)及西方印漬分析(Western blot analysis)係可用於鑑別與抗原或受體或其配體結合部分特異性反應、與同族配體或結合配偶體特異性結合之抗體之許多分析。通常，特定或選擇性反應至少兩倍於背景信號或雜訊、更通常大於10倍背景、甚至更通常大於50倍背景、更通常大於100倍背景、更通常大於500倍背景、甚至更通常大於1000倍背景及甚至更通常大於10,000倍背景。同樣，在平衡解離常數(KD)7nM時，抗體可視為「特異性結合」抗原。
術語「結合親和力」在本文中用作兩個分子(例如抗體或其部分與抗原)之間之非共價相互作用之強度的量度。術語「結合親和力」用於闡述單價相互作用(固有活性)。可藉由測定解離常數(KD)來量化兩個分子之間之結合親和力。繼而，可藉由使用(例如)表面電漿共振(SPR)方法(Biacore)量測複合物形成及解離之動力學來測定KD。對應於單價複合物之締合及解離之速率常數分別稱為締合速率常數k a (或k 締合 )及解離常數速率常數k d (或k 解離 )。KD經由方程式KD=k d /k a 相關於k a 及k d 。解離常數值可藉由熟知方法直接測定，且可甚至針對複合物混合物藉由諸如陳述於Caceci等人(1984,Byte 9：340-362)中之方法等方法來計算。舉例而言，可使用雙過濾硝化纖維素過濾結合分析(例如由Wong & Lohman(1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5428-5432)揭示者)來確立KD。業內已知其他用於評估抗體朝向靶抗原之結合能力之標準分析，包含(例如) ELISA、西方印漬、RIA及流式細胞術分析及例示於本文中其他處之其他分析。亦可藉由業內已知之標準分析(例如表面電漿共振(SPR)，例如藉由使用BiacoreTM系統或KinExA)來評價抗體之結合動力學及結合親和力。
在一些實施例中，抗體可以約1.14×10-10M或更大之KD結合至hIL-2。舉例而言，抗體可以約9×10-11M或更大之KD結合至hIL-2。在一些實施例中，抗體可以約8×10-11M或更大之KD結合至hIL-2。在一些實施例中，抗體可以約7×10-11M或更大之KD結合至hIL-2。在一些實施例中，抗體可以約6×10-11M或更大之KD結合至hIL-2。在一些實施例中，抗體可以約5.00×10-11M或更大之KD結合至hIL-2。該等量並不意欲具有限制性，且所列舉值之間之增量特定設想為本發明之一部分。在一些實施例中，抗體可以與如表3中所展示之抗體KD大約相同之k d 結合至hIL-2。
在一些實施例中，抗體可以約4.53×10-4s-1或更大之k d 結合至hIL-2。舉例而言，抗體可以約3×10-4s-1或更大之k d 結合至hIL-2。在一些實施例中，抗體可以約1×10-4s-1或更大之k d 結合至hIL-2。在一些實施例中，抗體可以約9×10-5s-1或更大之k d 結合至hIL-2。在一些實施例中，抗體可以約7×10-5s-1或更大之k d 結合至hIL-2。在一些實施例中，抗體可以約5.00×10-5s-1或更大之k d 結合至hIL-2。該等量並不意欲具有限制性，且所列舉值之間之增量特定設想為本發明之一部分。在一些實施例中，抗體可以與如表3中所展示之抗體k d 大約相同之k d 結合至hIL-2。
可實施競爭性結合分析，其中將抗體至靶抗原之結合與靶由靶之另一配體(例如以其他方式結合靶之另一抗體或可溶性受體)之結合進行比較。發生50%抑制之濃度稱為Ki。在理想條件下，Ki等於KD。Ki值從不小於KD，由此Ki之量測可代替提供KD之上限。
遵循上述定義，可藉由比較個體抗體/抗原複合物之KD值來比較與不同分子相互作用有關之結合親和力(例如比較不同抗體對給定抗原之結合親和力)。類似地，可藉由測定且比較所關注相互作用(例如抗體與抗原之間之特異性相互作用)之KD值與非所關注相互作用(例如已知不結合IL-2之對照抗體)之KD值來評價相互作用之特異性。
特異性結合靶之抗體可以高親和力(亦即展現如上文所論述之低KD)結合其靶，且可以較低親和力結合至其他非靶分子。舉例而言，抗體可以1×10-6M或更大、在一些實施例中1×10-5M或更大、在一些實施例中1×10-4M或更大、在一些實施例中1×10-3M或更大、在一些實施例中1×10-2M或更大之KD結合至非靶分子。在一些實施例中，本發明抗體能夠以至少兩倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍或更大倍數於其結合至另一非IL-2分子之親和力之親和力結合至其靶。該等量並不意欲具有限制性，且所列舉值之間之增量特定設想為本發明之一部分。
本文所用之術語抗體：IL-2「複合物」係指包括特異性結合IL-2之本發明之至少一種抗體或其抗原結合部分及至少一種IL-2細胞介素分子的複合物。複合物包括藉由共價、非共價或任一其他力締合之抗體及IL-2分子。較佳地，即使在投與複合物之後，抗體及IL-2亦可保持締合為複合物。應理解，抗體及IL-2基於(較其他變量)其間之結合相互作用之KD值形成複合物。
「宿主細胞」包含可為或已為載體接受者之個別細胞或細胞培養物，該(等)載體用於納入多核苷酸插入物。宿主細胞包含單一宿主細胞之子代，且子代可因天然、偶然或特意突變而未必與初始親代細胞完全相同 (在形態上或在基因體DNA互補上)。宿主細胞包含在活體內經本發明之多核苷酸轉染及/或轉變之細胞。
如業內所知，術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C-末端區。「Fc區」可為天然序列Fc區或變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可有所變化，但通常將人類IgG重鏈Fc區界定為自位置Cys226處之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基末端。Fc區中之殘基編號係根據EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，國立衛生研究院(National Institutes of Health)，Bethesda,Md.,1991中所闡述。免疫球蛋白之Fc區通常包括兩個恆定結構域CH2及CH3。如業內所已知，Fc區可以二聚體或單體形式存在。
「功能Fc區」擁有原始序列Fc區之至少一種效應子功能。實例性「效應子功能」包含C1q結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調，等等。該等效應子功能通常需要Fc區與結合結構域(例如抗體可變結構域或其抗原結合部分)進行組合且可使用業內已知用於評估該等抗體效應子功能之各種分析予以評價。
「天然序列Fc區」包括與自然界中所發現Fc區之胺基酸序列一致之胺基酸序列。「變體Fc區」包括因至少一個胺基酸修飾而與天然序列Fc區不同之胺基酸序列，但保留原始序列Fc區之至少一種效應子功能。在一些實施例中，變體Fc區與原始序列Fc區或親代多肽之Fc區相比具有至少一個胺基酸取代，例如約1至約10個胺基酸取代，且在一些實施例中在原始序列Fc區中或在親代多肽之Fc區中具有約1至約5個胺基酸取代。本文 之變體Fc區在一些實施例中與原始序列Fc區及/或親代多肽之Fc區擁有至少約80%之序列一致性，且在一些實施例中與其擁有至少約90%之序列一致性，在一些實施例中與其擁有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%之序列一致性。該等量並不意欲具有限制性，且所列舉百分比之間之增量特定設想為本發明之一部分。
如業內所使用，「Fc受體」及「FcR」闡述結合至抗體之Fc區之受體。在一些實施例中，FcR係原始序列人類FcR。此外，在一些實施例中，FcR係結合IgG抗體者(γ受體)且包含FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類之受體，包含該等受體之對偶基因變體及選擇性剪接形式。FcγRII受體包含FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，二者具有主要在胞質結構域上有所不同之類似胺基酸序列。FcR綜述於Ravetch及Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9：457-92；Capel等人，1994,Immunomethods,4：25-34；及de Haas等人，1995,J.Lab.Clin.Med.,126：330-41中。「FcR」亦包含負責將母體IgG轉移至胎中之新生受體FcRn(Guyer等人，1976,J.Immunol.,117：587；及Kim等人，1994,J.Immunol.,24：249)。
如本文中所使用，在第一抗體之存在可檢測地降低第二抗體至抗原(或第二抗體之表位)之結合時，第一抗體可視為與第二抗體競爭結合至抗原(或表位)。在第二抗體存在下第一抗體至抗原(或其表位)之結合亦可檢測地降低之相反方案可(但無需)如此。然而，在每一抗體可檢測地抑制另一抗體至公用抗原之結合之情形下(不論相同或不同程度)，該等抗體可視為彼此「交叉競爭」結合該抗原。本發明涵蓋競爭及交叉競爭抗體。與藉由該競爭或交叉競爭發生之機制(例如立體阻礙、構象變化或結合至共同表位或其部分)無關，熟習此項技術者應瞭解，基於本文所提供之技術， 涵蓋該等競爭及/或交叉競爭抗體且其可用於本文所揭示之方法。
如本文中所使用，「治療」係獲得有益或期望臨床結果之方式。出於本發明目的，有益或期望臨床結果包含但不限於下列中之一或多者：改良存活率(減小之死亡率)、減少發炎、減小組織纖維化之量、改良疾病病灶之外觀、限制局部位點之病理學病灶、降低來自疾病之損害程度、降低疾病持續時間及/或減小疾病相關症狀之數量、程度或持續時間。該術語包含投與本發明之化合物或藥劑以預防或延遲疾病之症狀、併發症或生物化學徵兆之發作，緩解症狀或阻止或抑制疾病、病狀或病症之進一步發展。治療可為在表現疾病之後預防性(用於預防或延遲疾病發作，或用於預防其臨床或亞臨床症狀之表現)或治療性阻抑或緩解症狀。
「改善」意指與不投與IL-2抗體相比減弱或改良一或多種症狀。「改善」亦包含縮短或減小症狀持續時間。
如本文中所使用，藥物、化合物或醫藥組合物之「有效劑量」或「有效量」係足以影響任一或多個有益或期望結果之量。在更具體態樣中，有效量預防、緩解或改善疾病或感染之症狀，及/或延長所治療個體之存活。對於預防性應用而言，有益或期望結果包含消除或降低疾病之風險、減輕其嚴重程度或延遲其發作，該疾病包含疾病之生物化學、組織學及/或行為症狀、其在病症發展期間呈現之併發症及中間病理學表型。對於治療性應用而言，有益或期望結果包含諸如以下等臨床結果：減少IL-2介導之疾病、病症或病狀或IL-2缺陷疾病、病症或病狀之一或多種症狀，降低治療疾病所需之其他藥劑之劑量，增強另一藥劑之效應，及/或延遲患者疾病之發展。有效劑量可以一或多次投與來投與。出於本發明目的，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量係足以達成直接或間接預防性或治 療性治療之量。如在臨床背景中所理解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量可或可不聯合另一藥物、化合物或醫藥組合物達成。因此，可在投與一或多種治療劑之背景下考慮「有效劑量」，且若聯合一或多種其他藥劑可達成或達成期望結果，則可認為單一藥劑係以有效量給予。
如本文中所使用，術語「載體」意指能夠遞送且在一些實施例中表現宿主細胞中一或多個所關注基因或序列之構築體。載體之實例包含但不限於病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏粒或噬菌體載體、與陰離子縮合劑相關之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體及某些真核細胞(例如產生細胞)。
如本文中所使用，「表現控制序列」意指引導核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子(例如組成型或可誘導型啟動子)或增強子。表現控制序列可操作連接至擬轉錄之核酸序列。
如本文中所使用，「醫藥上可接受之載劑」或「醫藥上可接受之賦形劑」包含在與活性成份組合時容許該成份保留生物活性且與個體之免疫系統無反應性之任一材料。實例包含但不限於標準醫藥載劑中之任一者，例如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)及各種類型之潤濕劑。在一些實施例中，用於氣溶膠或非經腸投與之稀釋劑係磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或生理(0.9%)鹽水。藉由熟知習用方法調配包括該等載劑之組合物(例如參見Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro編輯，Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；及Remington,The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Mack Publishing,2000)。
在提及「約」時，本文之值或參數包含(且闡述)涉及該值或參數本身之實施例。舉例而言，提及「約X」之闡述包含闡述「X」。數值範圍包 含定義該範圍之數值。
儘管陳述本發明之寬廣範圍之數值範圍及參數係近似值，但在特定實例中儘可能精確地報告所陳述之數值。然而，每一數值固有地含有必然由其各自測試測量中存在之準則偏差所引起之必然誤差。此外，本文所揭示之所有範圍應理解為涵蓋其中所包含之任一及所有子範圍。舉例而言，「1至10」之陳述範圍應視為包含介於最小值1與最大值10之間(且包含1與10)之任何及所有子範圍；亦即，以最小值1或以上之值(例如1至6.1)開始及以最大值10或以下之值(例如5.5至10)結束之所有子範圍。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義相同的含義。倘若出現衝突，則以本說明書(包含定義)為準。貫穿本說明書及申請專利範圍，詞語「包括」(「comprise」)或變化形式(例如「comprises」或「comprising」)應理解為暗指包含所闡述整數或整數組，但不排除任何其他整數或整數組。除非上下文另外需要，否則單數術語將包含複數形式且複數術語將包含單數。跟隨術語「例如」(「e.g.」或「for example」)之任何實例並不意指具有排他性或限制性。
應理解，只要利用語言「包括」闡述實施例，亦提供就「由......組成」及/或「基本上由......組成」而言闡述之另外相似實施例。
若本發明之態樣或實施例係就Markush組或替代物之其他分組而言闡述，則本發明不僅涵蓋整體列舉之整個組、個別組之每一成員及主要組之所有可能亞組以及不存在一或多個組成員之主要組。本發明亦構想明確排除所主張本發明中之任何群成員中之一或多者。
本文闡述實例性方法及材料，但在本發明實踐或測試中亦可使用類 似於或等效於本文所闡述方法及材料之方法及材料。該等材料、方法及實例僅係闡釋性的且並非意欲加以限制。
概述
介白素-2(IL-2)係用作寬範圍白血球(包含T細胞及天然殺傷(NK)細胞)之生長因子之四螺旋束、I型細胞介素。已投入大量精力來研究將IL-2作為用於各種免疫病症(自AIDS至癌症)之治療靶。以高劑量使用重組人類IL-2(Proleukin®)來治療轉移性黑素瘤及腎細胞癌瘤。然而，僅較小子組之患者(5-10%)自該治療長期存活。高劑量IL-2療法之不良效應(自流感樣症狀至危及生命之血管滲漏症候群及肺水腫)已大大限制了其應用。重要的是，IL-2治療具有不可預測之生物效應。
IL-2藉由結合至包括3條鏈-CD25(IL-2Rα)、CD122(IL-2Rβ)及普通γ鏈(γc)之複合受體(從而該受體稱為IL-2Rαβγ)來介導其效應。三條鏈經展現最高親和力之受體三聚體以不同方式表現。個別地，四元複合物中之三條受體鏈中之每一者以低親和力結合至hIL-2，其中hIL-2Rα具有最強相對親和力(KD~10nM)。hIL-2Rα之表現增加了hIL-2針對T細胞之締合速率且三種受體協同性地以約10pM之KD結合至hIL-2。在由IL-2Rα捕獲後，IL-2被呈遞至IL-2Rβ，且然後呈遞至γc(可能以預形成受體二聚體形式)以形成四級信號傳導複合物。儘管hIL-2可以低親和力(KD~150-300nM)單獨結合hIL-2Rβ，但hIL-2/hIL-2Rα複合物以較高親和力(KD~60nM)結合至hIL-2Rβ，而IL-2Rα與IL-2Rβ之間在四級受體複合物中無直接接觸。最新研究表明，野生型IL-2係以「靜態」形式存在，該形式誘導成代表咬合IL-2Rα之高親和力形式之結構改變之構象。
已努力藉由改變選擇性靶向T效應細胞(Teff)或T調控細胞之能力 (Treg)來改造或修飾IL-2以改良其治療潛力。有趣的是，存在諸多達成較有效及指導性IL-2s之方式。在不直接類似於人類之小鼠模型中，Boyman及同事已證實，在一些情況下，大鼠抗小鼠IL-2 mAb(JES6-1)可與野生型IL-2發生複合且用於優先增強TREG群體(Boyman等人，2006,Science 311：1924-1927；及國際專利公開案第WO 2007/095643號)。儘管尚未完全闡釋關於此效應之機制基礎，但不受限於任一特定理論，含有某些抗體之複合物中之IL-2可以選擇性觸發差別信號之構象「固定」，從而使得選擇性擴增個別TREG或TEFF細胞子組。另外，若干工作集中於研發IL-2突變體蛋白，該突變體蛋白藉由增加IL-2至三分子IL-2R CD25複合物之結合來增強CD25+ T細胞活化啊最小化CD25- NK細胞活化。就此而言，Bayer以針對IL-2Rβγc之顯著較低親和力來製備突變體IL-2，且預計使用此變體IL-2之治療可能不會活化NK或記憶體CD8+ T細胞。然而，IL-2突變體及上述IL-2/抗IL-2抗體複合物方式皆不考慮之藥物可能不能改變在發炎性T細胞反應期間產生之內源性野生型IL-2。此外，使用誘導內源性IL-2(經證實反饋機制)之IL-2變體之任一療法可在活體內產生不能在活體外觀察到之野生型IL-2效應。
因此，儘管IL-2最初因其能夠增強效應T細胞(TEFF)及NK功能而研發為免疫刺激劑，但現據信，IL-2之主要功能並非活化免疫性，而係TREG之生成及存活，此用於抑制免疫反應且預防自體免疫疾病。使用動物模型(包含IL-2及IL-2受體(IL-2R)缺陷小鼠)可日愈理解，IL-2在由TREG細胞介導之周邊免疫耐受性中發揮關鍵作用。研究展示，低劑量IL-2療法優先活化TREG，此乃因其組成型表現高親和力IL-2R。更具體而言，增加數量之動物研究已顯示，TREG可阻抑GVHD及自體免疫性。另外，此潛在阻抑作 用已顯示於兩個最新研究(一個在GVHD中且另一個在自體免疫血管炎中)中之人類中，其中短期低劑量療法使得一些個體中之疾病得以改善。因此，長期且未滿足性地需要較效應子免疫反應選擇性活化致耐受性之基於IL-2之治療(亦即經設計以朝向TREG傾斜TREG：TEFF平衡之療法)，由此治療寬範圍之疾病。本發明滿足該需要。
IL-2抗體
本發明係關於特異性結合至IL-2之抗體，亦即，其結合至IL-2，但其不會可檢測地結合或以較低親和力結合至其他分子。在一些實施例中，抗體特異性結合至人類IL-2。在一些實施例中，抗體特異性結合hIL-2之螺旋A及C及B-C環。在一些實施例中，抗體特異性結合hIL-2之螺旋A。在一些實施例中，抗體特異性結合hIL-2之螺旋C。在一些實施例中，抗體特異性結合hIL-2之螺旋A及C。在一些實施例中，抗體特異性結合hIL-2之B-C環。在一些實施例中，抗體與包括SEQ ID NO：13、14、126、127、128、129、130、131、132、133及134之胺基酸序列之抗體競爭結合至人類IL-2(hIL-2)，或與其結合hIL-2之相同表位。在一些實施例中，抗體特異性結合人類IL-2(hIL-2)，且將hIL-2至IL-2Rα之結合親和力減小約1倍至約199倍。在一些實施例中，抗體將hIL-2至IL-2Rα之結合親和力減小約10倍。在一些實施例中，抗體將hIL-2至IL-2Rα之結合親和力減小約2、10、25、50、75、100、125、150或175倍。
在一些實施例中，IL-2抗體減小IL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合，且不抑制調控T(Treg)細胞之活性。舉例而言，在一些實施例中，IL-2抗體阻斷IL-2至IL-2Rβ之結合，且減小hIL-2結合至IL-2Rα之親和力。在一些實施例中，IL-2抗體將IL-2至IL-2Rα之結合減小約5%、10%、15%、 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施例中，IL-2抗體將IL-2至IL-2Rβ之結合減小至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施例中，IL-2抗體完全阻斷IL-2至IL-2Rβ之結合。特定而言，本發明係關於特異性結合至IL-2之抗體，且另外係關於較抑制Treg細胞增殖抑制非Treg細胞(包含效應CD8+、非Treg CD4+及NK細胞)之增殖或與同型對照抗體相比增加Treg增殖或增加Treg細胞對非Treg細胞之比率或維持Treg標記物或其組合之抗體。在一些實施例中，抗體以大於該抗體抑制Treg增殖至少2倍來抑制CD8+、非Treg CD4+或NK細胞之增殖。在一些實施例中，抗體以大於該抗體抑制Treg增殖至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍來抑CD8+、非Treg CD4+或NK細胞之增殖。在一些實施例中，在末梢血單核細胞(PBMC)培養或重構分析中，抗體減小IL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合且增加T調控細胞(Treg)對CD8+、非Treg CD4+或NK細胞之比率。在一些實施例中，該比率增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍或更大。在一些實施例中，抗體將Treg：CD8+細胞比率增加兩(2)倍或更大，且可反映增加之Treg增殖。在一些實施例中，在IL-2限於(例如)小於1nM之濃度時，抗體在活體外以大於同型對照之程度增強T調控細胞(Treg)增殖。在一些實施例中，抗體抑制CD8+細胞之增殖。在一些實施例中，抗體減小IL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合且維持一或多種FOXP3、CD25及Icos在Treg細胞中之表現。在一些實施例中，抗體減小IL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合且增加一或多種FOXP3、CD25及Icos在Treg細胞中之表現。在一些實施例 中，本發明之IL-2抗體具有該等特徵中之至少一者，且在一些實施例中，抗體具有該等特徵中之兩者或更多者。在一些實施例中，抗體具有所有該等特徵。
在一些實施例中，特異性結合IL-2之抗體或其抗原結合部分減小IL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合，且以高於調控T(Treg)細胞中之程度抑制CD8+ T細胞中之STAT5磷酸化。在一些實施例中，IL-2抗體或抗原結合部分維持大於50%之Treg中之STAT5磷酸化。在一些實施例中，IL-2抗體或抗原結合部分維持大於60%之Treg中之STAT5磷酸化。在一些實施例中，IL-2抗體或抗原結合部分維持大於70%之Treg中之STAT5磷酸化。在一些實施例中，IL-2抗體或抗原結合部分維持大於80%之Treg中之STAT5磷酸化。在一些實施例中，IL-2抗體或抗原結合部分維持大於90%之Treg中之STAT5磷酸化。在一些實施例中，抗體特異性結合至hIL-2。該等量並不意欲具有限制性，且所列舉百分比之間之增量特定設想為本發明之一部分。
本發明亦係關於包括該等抗體之組合物以及該等抗體之用途(包含治療及醫藥用途)。
術語「IL-2」意指可衍生自任一適宜有機體之任一天然形式之IL-2，不論係單體抑或多聚體(包含二聚體、三聚體等)。如本文中所使用，「IL-2」係指哺乳動物IL-2，例如人類、大鼠或小鼠以及非人類靈長類動物、牛、羊或豬IL-2。在一些實施例中，IL-2係人類(例如參見基因庫登錄號P60568)或「hIL-2」。IL-2亦可為食蟹猴IL-2(例如參見基因庫登錄號Q29615)。術語「IL-2」亦涵蓋該等IL-2分子之部分、變體、同種型及其他同系物。變體IL-2分子之特徵通常在於與天然IL-2具有相同類型活 性，例如能夠結合IL-2受體及能夠誘導受體介導之活性。
IL-2可包括一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、十個或更多個、十二個或更多個或十五個或更多個IL-2表面可及殘基。在IL-2包括IL-2之同源多聚體形式之情形下，靶可包括IL-2第一亞單位之一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、十個或更多個、十二個或更多個或十五個或更多個表面可及殘基及IL-2第二亞單位之一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、十個或更多個、十二個或更多個或十五個或更多個表面可及殘基。
靶分子可包括來自IL-2之已知表位。靶分子可包括來自hIL-2之已知表位。在一些實施例中，靶可包括hIL-2之螺旋A。在一些實施例中，靶可包括hIL-2之螺旋C。在一些實施例中，靶可包括hIL-2之螺旋A及C。在一些實施例中，靶可包括hIL-2之B-C環。在一些實施例中，靶可包括hIL-2之螺旋A及C及B-C環。
在一實施例中，本發明提供衍生自下列抗體中之任一者之具有輕鏈序列或其部分及重鏈或其部分之任一抗體或包括其之組合物(包含醫藥組合物)：F4.7.6、F4.7.8、F5.1.11、F5.1.9、F4.7.062、F5.11.1.01、F5.1.11.02、F5.1.11.03、F5.1.11.04、F5.1.11.05、F5.1.11.06、F5.1.11.07、F5.1.11.08、F5.1.11.09、F5.1.9.5或d1C7。F5.1.11亦稱為抗體F5111、5.1.11、5111。該等術語可互換。此親代抗體之變體可藉由 此命名法使用額外編號提及，例如抗體F5111.2、5.1.11.2、F5.1.11.02或5111.2；或抗體F5.1.11.01、F5111.1、5.1.11.1或5111.1。
可用於本發明中之抗體可涵蓋單株抗體、多珠抗體、抗體部分(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、雙特異性抗體、異源偶聯抗體、單鏈(ScFv)、其突變體、包括抗體部分之融合蛋白(例如結構域抗體)、人類化抗體及包括具有所需特異性之抗原識別位點之免疫球蛋白分子之任一其他經修飾構形(包含抗體之醣基化變體、抗體之胺基酸序列變體及共價修飾抗體)。抗體可為鼠類、大鼠、人類或任何其他起源(包含嵌合或人類化抗體)。在一些實施例中，IL-2抗體係單株抗體。在一些實施例中，抗體係人類或人類化抗體。
可藉由業內已知之任一方法來製備本發明之IL-2抗體。用於產生人類及小鼠抗體之一般技術在業內已知及/或闡述於本文中。
可使用業內已知方法來鑑別或表徵IL-2抗體，其中檢測及/或量測IL-2活性之減小、改善或中和(例如pAKT及/或pSTAT5)。在一些實施例中，藉由將候選試劑(例如IL-2)與IL-2受體一起培育且監測IL-2之結合及/或伴隨其生物活性之減小或抑制來鑑別IL-2抗體。在一些實施例中，可使用業內已知方法來鑑別或表徵hIL-2抗體，其中檢測及/或量測hIL-2活性之減小、改善或中和(例如pAKT及/或pSTAT5)。在一些實施例中，藉由將候選試劑(例如hIL-2)與hIL-2受體一起培育且監測hIL-2之結合及/或其生物活性之伴隨減小或抑制來鑑別hIL-2抗體。可使用(例如)經純化IL-2多肽或使用天然表現各種受體或經轉染以表現IL-2受體之細胞來實施結合分析。在一實施例中，結合分析係競爭性結合分析，其中評估候選抗體與已知IL-2抗體競爭IL-2結合之能力。可以各種格式(包含ELISA格式)實施分 析。在一些實施例中，藉由將候選抗體與IL-2一起培育且監測結合來鑑別IL-2抗體。
在初始鑑別後，可進一步證實候選IL-2抗體之活性且藉由已知測試靶定生物活性之生物分析精修。在一些實施例中，使用活體外細胞分析來進一步表徵候選IL-2抗體。舉例而言，可使用生物分析來直接篩選候選物。鑑別及表徵IL-2抗體之一些方法詳細闡述於實例中。
可使用業內熟知方法來表徵IL-2抗體。舉例而言，一種方法係鑑別其所結合之表位或「表位定位」。業內已知許多定位且表徵蛋白質上之表位位置之方法，包含解析抗體-抗原複合物之晶體結構、競爭分析、基因片段表現分析及基於合成肽之分析，如(例如)Harlow及Lane，Using Antibodies,Laboratory Manual，第11章，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1999中所闡述。在其他實例中，可使用表位定位來測定IL-2抗體所結合之序列。表位定位可自各種來源(例如Pepscan Systems(Edelhertweg 15,8219 PH Lelystad,The Netherlands))購得。表位可為線性表位(亦即含於胺基酸之單一片段中)或藉由未必含於單一片段中之胺基酸之三維相互作用形成之構象表位。可分離或合成(例如以重組方式)具有不同長度(例如長至少4-6個胺基酸)之肽且用於使用IL-2抗體之結合分析。在另一實例中，可在系統性篩選中藉由使用衍生自IL-2序列之重疊肽且測定抗體結合來測定IL-2抗體所結合之表位。根據基因片段表現分析，可隨機或藉由特定基因構造來將編碼IL-2之開放閱讀框片段化且使用擬測試抗體測定IL-2之表現片段之反應性。舉例而言，可藉由PCR產生基因片段且然後在活體外在放射性胺基酸存在下將其轉錄及轉譯成蛋白質。然後藉由免疫沈澱及凝膠電泳測定抗體至經放射 性標記之IL-2片段之結合。亦可藉由使用顯示於噬菌體顆粒(噬菌體文庫)或酵母(酵母展示)之表面上之隨機肽序列之大庫來鑑別某些表位。或者，可在簡單結合分析中測試所定義文庫之重疊肽片段至測試抗體之結合。在其他實例中，可實施抗原誘變、結構域交換實驗及丙胺酸掃描誘變來鑑別表位結合所需、勝任及/或需要之殘基。舉例而言，可使用突變體IL-2(其中IL-2多肽之各個殘基已經丙胺酸代替)實施丙胺酸掃描誘變實驗。藉由評價抗體至突變體IL-2之結合，可評價特定IL-2殘基對抗體結合之重要性。
可用於表徵IL-2抗體之又一方法係使用競爭分析利用已知結合至相同抗原(亦即IL-2上之各種片段)之其他抗體來測定IL-2抗體是否與其他抗體結合至相同表位。競爭分析為熟習此項技術者所熟知。
另外，可定義用於給定抗體/抗原結合對之表位且在不同細節程度下使用各種實驗及計算表位定位方法進行表徵。實驗方法包含誘變、X射線晶體學、核磁共振(NMR)光譜、氫/氘交換質譜(H/D-MS)及業內熟知之各種競爭結合方法。因每一方法依賴於獨特原理，故表位闡述與其測定方法緊密相關。因此，端視所採用表位定位方法，以不同方式定義用於給定抗體/抗原對之表位。
在最詳細程度下，可藉由定義Ag-Ab相互作用中所存在原子觸點之空間坐標以及對結合熱動力學之相對貢獻之資訊來定義用於Ag及Ab間相互作用的表位。在較小詳細程度下，可藉由定義Ag及Ab間原子觸點之空間坐標來表徵表位。在進一步較小詳細程度下，可藉由所包括胺基酸殘基(如藉由特定準則所定義，例如根據Ab及Ag中之原子間距離(例如重原子，亦即非氫原子))來表徵表位。在進一步較小詳細程度下，可經由功能 (例如藉由與其他Ab之競爭結合)來表徵表位。更一般而言，表位亦可定義為包括藉由另一胺基酸進行取代將改變Ab及Ag之間之相互作用之特性之胺基酸殘基(例如使用丙胺酸掃描)。
自表位之闡述及定義端視所用表位定位方法係在不同細節程度下所獲得之事實可見，可類似地在不同細節程度下比對同一Ag上之不同Ab之表位。
若含有相同組之胺基酸殘基，則在胺基酸層面下所闡述(例如自X射線結構測定)之表位可視為相同。若至少一個胺基酸由表位共有，則表位可視為重疊。若沒有胺基酸殘基由表位共有，則表位可視為分開(獨特)。
若相應抗體之結合相互排斥(亦即，一種抗體之結合排斥另一抗體之同時或連續結合)，則藉由競爭結合表徵之表位可視為重疊。若抗原能夠同時接納兩種相應抗體之結合，則表位可視為分開(獨特)。
術語「互補位」之定義係藉由逆轉視角源自「表位」之上述定義。因此，術語「互補位」係指抗體上特異性結合抗原之區或區域，亦即抗體上與抗原(IL-2)接觸之胺基酸殘基，「接觸」係如本文中其他處所定義。
可藉由常規方法鑑別給定抗體/抗原對之表位及互補位。舉例而言，可藉由評價抗體結合至不同片段或變體IL-2多肽之能力來測定表位之一般位置。亦可使用常規方法(例如實例中所闡述者)測定IL-2內與抗體接觸之具體胺基酸(表位)及抗體中與IL-2接觸之具體胺基酸(互補位)。舉例而言，可組合抗體及靶分子且可使抗體/抗原複合物結晶。可測定複合物之晶體結構且用於鑑別抗體與其靶之間之具體相互作用位點。
本發明抗體可與本文具體揭示之本發明抗體結合至IL-2之相同表位或結構域。舉例而言，可藉由以下方式來鑑別本發明之其他尚未鑑別抗 體：比較其至IL-2之結合與下列單株抗體中之任一者之結合：F4.7.6、F4.7.8、F5.1.11、F5.1.9、F4.7.062、F5.11.1.01、F5.1.11.02、F5.1.11.03、F5.1.11.04、F5.1.11.05、F5.1.11.06、F5.1.11.07、F5.1.11.08、F5.1.11.09、F5.1.9.5或d1C7及其變體；或藉由比較尚未鑑別抗體之功能與本文所闡述抗體之功能；及/或比較尚未鑑別抗體之IL-2上之表位/接觸殘基與本發明抗體之彼等表位/接觸殘基。可用於該鑑別目的之分析方法及分析包含：評價所關注抗體與IL-2受體之間之IL-2結合競爭之分析、如實例1-5中所闡述之生物活性分析及抗體之晶體結構之分析方法。
本發明抗體可能能夠與本發明之另一抗體競爭或交叉競爭結合至如本文所闡述之IL-2。舉例而言，本發明抗體可與本文所闡述之抗體競爭或交叉競爭結合至IL-2或結合至由本文所揭示抗體結合之IL-2之適宜片段或變體。
亦即，若第一抗體與第二抗體競爭結合至IL-2，但在第二抗體首先結合至IL-2之情形下其不競爭，則其可視為與第二抗體「競爭」(亦稱為單向競爭)。若一種抗體與另一抗體競爭(不論何種抗體首先結合至IL-2)，則該抗體與另一抗體「交叉競爭」結合至IL-2。可在標準結合分析中基於與已知本發明抗體競爭/交叉競爭之能力來鑑別該等競爭或交叉競爭抗體。舉例而言，可使用SPR(例如藉由使用BiacoreTM系統)、ELISA分析或流式細胞術來證實競爭/交叉競爭。該等競爭/交叉競爭可表明，兩種抗體結合至相同、重疊或類似表位。
可由此藉由包括評價測試抗體是否能夠與本發明參考抗體(例如F4.7.6、F4.7.8、F5.1.11、F5.1.9、F4.7.062、F5.11.1.01、F5.1.11.02、 F5.1.11.03、F5.1.11.04、F5.1.11.05、F5.1.11.06、F5.1.11.07、F5.1.11.08、F5.1.11.09、F5.1.9.5或d1C7)競爭/交叉競爭靶分子上之結合位點之結合分析之方法來鑑別本發明抗體。實施競爭性結合分析之方法揭示於本文中及/或在業內已眾所周知。舉例而言，其可涉及使用抗體可結合至靶分子之條件使本發明參考抗體結合至靶分子。然後可將抗體/靶複合物暴露於測試/第二抗體且可評價測試抗體能夠自抗體/靶複合物置換本發明參考抗體之程度。替代方法可涉及使測試抗體與靶分子在容許抗體結合之條件下接觸，然後添加能夠結合該靶分子之本發明參考抗體且評價本發明參考抗體能夠自抗體/靶複合物置換測試抗體或同時結合至靶(亦即非競爭抗體)之程度。
測試抗體抑制本發明參考抗體至靶之結合之能力證明，測試抗體可與本發明參考抗體競爭結合至靶且由此測試抗體與本發明參考抗體結合至IL-2蛋白質上之相同或實質上相同之表位或區域。在此一方法中鑑別為與本發明參考抗體競爭之測試抗體亦係本發明抗體。測試抗體可與本發明參考抗體結合相同區域中之IL-2且可與本發明參考抗體進行競爭之事實表明，測試抗體可在與本發明抗體相同之結合位點處用作配體，且測試抗體可由此模擬參考抗體之作用並由此係本發明抗體。此可藉由使用如更全面闡述於本文中其他處之分析在其他條件相同時比較IL-2在測試抗體存在下之活性與IL-2在參考抗體存在下之活性來證實。
本發明參考抗體可為如本文所闡述之抗體，例如如本文所闡述保留IL-2結合能力之F4.7.6、F4.7.8、F5.1.11、F5.1.9、F4.7.062、F5.11.1.01、F5.1.11.02、F5.1.11.03、F5.1.11.04、F5.1.11.05、F5.1.11.06、F5.1.11.07、F5.1.11.08、F5.1.11.09、F5.1.9.5或d1C7或其 任一變體或部分。本發明抗體可與如本文所闡述保留IL-2結合能力之本文所闡述參考抗體或其任一變體或部分結合至相同表位。
如先前在本文中其他處所陳述，可參照抗體至非靶分子之結合來評價特異性結合。此比對可藉由比較抗體結合至靶之能力與另一分子之能力來進行。此比對可如上文所闡述在評價KD或Ki時進行。此一比對中所用之另一分子可為非靶分子之任一分子。在一些實施例中，另一分子與靶分子不同。在一些實施例中，靶分子並非靶分子之片段。
用於測定特異性結合之另一分子可在結構或功能上與靶不相關。舉例而言，另一分子可為環境中之非相關材料或伴隨材料。
用於測定特異性結合之另一分子可為與靶分子(亦即IL-2)涉及相同活體內路徑之另一分子。藉由確保本發明抗體較另一該分子對IL-2具有特異性，可避免不期望活體內交叉反應性。
本發明抗體可保留結合至一些與靶分子相關之分子之能力。
或者，本發明抗體可對特定靶分子具有特異性。舉例而言，其可結合至如本文所闡述之一種靶分子，但不結合或可以顯著減小之親和力結合至如本文所闡述之不同靶分子。舉例而言，可使用全長成熟人類IL-2作為靶，但結合至該靶之抗體可能不能結合至或可以較小親和力結合至(例如)來自其他物種之其他IL-2蛋白質(例如其他哺乳動物IL-2)。在一些實施例中，抗體結合至人類及小鼠IL-2。
本發明之多肽或抗體「片段」或「部分」可藉由截短來製備，例如藉由自多肽之N及/或C-末端去除一或多個胺基酸。可以此方式自N及/或C末端去除至多10、至多20、至多30、至多40或更多個胺基酸。亦可藉由一或多個內部缺失生成部分。
本發明抗體可為抗體F4.7.6、F4.7.8、F5.1.11、F5.1.9、F4.7.062、F5.11.1.01、F5.1.11.02、F5.1.11.03、F5.1.11.04、F5.1.11.05、F5.1.11.06、F5.1.11.07、F5.1.11.08、F5.1.11.09、F5.1.9.5或d1C7或其變體中之任一者之部分或可包括其。本發明抗體可為或可包括此抗體或其變體之抗原結合部分。舉例而言，本發明抗體可為此抗體或其變體之Fab部分或可為衍生自此抗體或其變體之單鏈抗體。
變體抗體可較上述特異性序列及部分包括1、2、3、4、5、至多10、至多20、至多30或更多個胺基酸取代及/或缺失及/或插入。「缺失」變體可包括缺失個別胺基酸、缺失較小組胺基酸(例如2、3、4或5個胺基酸)或缺失較大胺基酸區域(例如缺失特定胺基酸結構域或其他特徵)。「插入」變體可包括插入個別胺基酸、插入較小組胺基酸(例如2、3、4或5個胺基酸)或插入較大胺基酸區域(例如插入特定胺基酸結構域或其他特徵)。在一些實施例中，「取代」變體涉及使用相同數量之胺基酸代替一或多個胺基酸且進行保守胺基酸取代。舉例而言，胺基酸可經具有類似性質之替代胺基酸(例如另一鹼性胺基酸、另一酸性胺基酸、另一中性胺基酸、另一帶電胺基酸、另一親水性胺基酸、另一疏水性胺基酸、另一極性胺基酸、另一芳香族胺基酸或另一脂肪族胺基酸)取代。可用於選擇適宜取代基之20種胺基酸之一些性質係如下文所闡述。
取代變體在抗體分子中去除至少一個胺基酸殘基且在其位置插入不同殘基。用於取代誘變之最關注位點包含超變區結構域，但亦涵蓋框架改變。保守取代展示於表1中之「保守取代」標題下。若該等取代使得生物活性發生改變，則可引入更大實質性變化(命名為下文所展示之「實例性取代」或如下文參照胺基酸種類進一步所闡述)且篩選產物。
藉由選擇關於維持以下性質之效應顯著不同之取代來達成抗體生物性質之實質性修飾：(a)取代區域中之多肽主鏈之結構，例如β-摺疊或螺 旋構象，(b)分子在靶位點處之電荷或疏水性，或(c)側鏈之體積。基於常用側鏈性質將天然殘基分組：(1)非極性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、lle；(2)無電荷極性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性(帶負電)：Asp、Glu；(4)鹼性(帶正電)：Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe、His。
藉由將該等種類中之一者之成員與另一種類交換來進行非保守取代。
舉例而言，可進行之一類取代係將抗體中之一或多個半胱胺酸(其可為化學反應性)改變為另一殘基(例如但不限於丙胺酸或絲胺酸)。舉例而言，可取代非規範半胱胺酸。取代可在可變結構域之CDR或框架區中或在抗體之恆定區中進行。在一些實施例中，半胱胺酸係規範半胱胺酸。不參與維持抗體之適當構象之任一半胱胺酸殘基通常亦可經絲胺酸取代以改良分子之氧化穩定性及防止異常交聯。相反，可將半胱胺酸鍵添加至抗體中以改良其穩定性(尤其在抗體係諸如Fv部分等抗體部分時)。
本發明亦提供生成、選擇及製備IL-2抗體之方法。本發明抗體可藉由業內已知程序製得。在一些實施例中，抗體可以重組方式製得且使用業內已知之任一方法進行表現。本發明亦提供生成、選擇及製備hIL-2抗體之方法。本發明抗體可藉由業內已知程序製得。在一些實施例中，抗體可以重組方式製得且使用業內已知之任一方法進行表現。
在一些實施例中，可藉由噬菌體展示技術來製備及選擇抗體。例如 參見美國專利第5,565,332號；第5,580,717號；第5,733,743號；及第6,265,150號；及Winter等人，Annu.Rev.Immunol.12：433-455,1994。或者，可使用噬菌體展示技術(McCafferty等人，Nature 348：552-553,1990)在活體外自來自未免疫化供體之免疫球蛋白可變(V)結構域基因譜產生人類抗體及抗體部分。根據此技術，將抗體V結構域基因框內選殖至絲狀噬菌體(例如M13或fd)之主要或次要衣殼蛋白基因中，且在噬菌體顆粒表面上展示為功能抗體部分。由於絲狀顆粒含有噬菌體基因體之單鏈DNA拷貝，故基於抗體功能性質之選擇亦達成對編碼展示彼等性質之抗體之基因實施選擇之目的。因此，噬菌體可模擬B細胞之一些性質。噬菌體展示可以多種格式來實施；有關其之綜述參見(例如)Johnson，Kevin S.及Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571,1993。V-基因片段之若干來源可用於噬菌體展示Clackson等人，Nature,352：624-628,1991自源自經免疫小鼠脾之V基因之小型隨機組合文庫分離出抗噁唑酮抗體之多樣陣列。可構建來自人類供體之V基因譜，且可遵循Marks等人，1991,J.Mol.Biol.222：581-597或Griffith等人，1993,EMBO J.12：725-734所闡述之技術基本上分離出針對抗原多樣陣列(包含自身抗原)之抗體。在天然免疫反應中，抗體基因以高速率累積突變(體細胞超突變)。所引入變化中之一些將賦予較高親和力，且在後續抗原攻擊期間展示高親和力表面免疫球蛋白之B細胞優先複製並分化。可藉由採用稱為「鏈改組」之技術模擬此天然過程。(Marks等人，1992,Bio/Technol.10：779-783)。在此方法中，藉由噬菌體展示所獲得「一級」人類抗體之親和力可藉由使用自未經免疫供體所獲得V結構域基因之天然變體(譜)譜依序代替重鏈及輕鏈V區基因來改良。此技術容許產 生親和力在pM-nM範圍內之抗體及抗體部分。用於製備極大噬菌體抗體譜(亦稱為「所有文庫之母」)之策略已由Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.21：2265-2266,1993闡述。基因改組亦可使用來自齧齒類動物抗體獲得人類抗體，其中該人類抗體具有與起始齧齒類動物抗體相似之親和力及特異性。根據此方法(其亦稱為「表位壓印」)，使用人類V結構域基因譜代替藉由噬菌體展示技術獲得之齧齒類動物抗體之重鏈或輕鏈V結構域基因，從而形成齧齒類動物-人類嵌合體。基於抗原之選擇可分離能夠恢復功能性抗原結合位點之人類可變結構域，亦即表位控制(壓印)配偶體之選擇。在重複該過程以代替剩餘齧齒類動物V結構域時，獲得人類抗體(參見PCT公開案第WO 93/06213號)。不同於藉由CDR移植之齧齒類動物抗體之傳統人類化，此技術完全提供不具有齧齒類動物來源之框架或CDR殘基之人類抗體。
在一些實施例中，抗體可使用雜交瘤技術製得。預計任何哺乳動物個體(包含人類或自其產生抗體之細胞)可經操縱以用作用於產生哺乳動物(包含人類)雜交瘤細胞系之基礎。宿主動物免疫化之途徑及時間表通常與用於抗體刺激及產生之已確立習用技術保持一致，如本文進一步所闡述。通常，經腹膜腔內、肌內、經口、皮下、足蹠及/或真皮內向宿主動物接種一定量之免疫原(包含如本文所闡述之免疫原)。
雜交瘤可自淋巴球及無限增殖之骨髓瘤細胞使用Kohler,B.及Milstein,C.,1975,Nature 256：495-497或如由Buck,D.W.，等人，In Vitro,18：377-381,1982修飾之一般體細胞雜交技術來製備。可獲得之骨髓瘤系(包含但不限於X63-Ag8.653及來自Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA者)可用於雜交。通常，該技 術涉及使用融合劑(例如聚乙二醇)或藉由熟習此項技術者熟知之電構件融合骨髓瘤細胞及淋巴細胞。在融合之後，自融合培養基分離細胞並使其在選擇性生長培養基(例如次黃嘌呤-胺喋呤-胸苷(HAT)培養基)中生長以消除未雜交之親代細胞。補充有或沒有血清之本文所闡述培養基中之任一者皆可用於培養分泌單株抗體之雜交瘤。作為細胞融合技術之另一替代方案，EBV無限增殖之B細胞可用於產生本發明之IL-2單株抗體。使雜交瘤或其他永生化B細胞擴增並亞選殖，若期望，並藉由習用免疫分析程序(例如放射免疫分析、酶免疫分析或螢光免疫分析)分析上清液之抗免疫原活性。
可用作抗體之來源之雜交瘤涵蓋產生對IL-2具有特異性之單株抗體或其部分之親代雜交瘤之所有衍生物、後代細胞。
可使用已知程序使產生該等抗體之雜交瘤在活體外或活體內生長。若期望，則可藉由習用免疫球蛋白純化程序(例如硫酸銨沈澱、凝膠電泳、透析、層析及超濾)自培養基或體液分離單株抗體。可藉由(例如)使製劑流經由附接至固相之免疫原製得之吸附劑並自免疫原洗脫或釋放期望抗體去除不期望活性(若存在)。使用IL-2多肽或含有結合至在擬免疫物種中具有免疫原性之蛋白質(例如鑰孔帽貝血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)之靶胺基酸序列之部分使用雙功能試劑或衍生劑(例如馬來醯亞胺基苯申醯基磺基琥珀醯亞胺酯(經由半胱胺酸殘基結合)、N-羥基琥珀醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N=C=NR(其中R及R1係不同烷基)對宿主動物進行免疫可產生抗體(例如單株抗體)之群體。
若期望，則可對所關注IL-2抗體(單株或多株)進行測序且隨後可將多 核苷酸序列選殖至載體中用於表現或繁殖。可將編碼所關注抗體之序列維持於宿主細胞中之載體中且隨後可使宿主細胞擴增並冷凍用於將來使用。可藉由業內已知之方式經由自B細胞選殖抗體基因在細胞培養中產生重組單株抗體。例如參見Tiller等人，2008,J.Immunol.Methods 329,112；美國專利第7,314,622號。
表2中所指示之質體係在根據美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC),10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110-2209之布達佩斯條約(Budapest Treaty)之術語下進行寄存。已分配質體下列登錄號：
在一些實施例中，多核苷酸序列可用於基因操縱以「人類化」抗體或改良抗體之親和力或其他特徵。抗體亦可經定製以用於(例如)狗、貓、靈長類動物、馬及牛中。
在一些實施例中，可藉由使用經改造以表現特異性人類免疫球蛋白之市售小鼠來獲得完全人類抗體。經設計以產生較期望(例如完全人類抗體)或較穩定免疫反應之轉基因動物亦可用於生成人類化或人類抗體。該技術之實例係來自Abgenix,Inc.(Fremont,CA)之XenomouseTM及來自Medarex,Inc.(Princeton,NJ)之HuMAb-Mouse®及TC MouseTM。
可以重組方式藉由以下方式來製備抗體：首先分離抗體及來自宿主動物之抗體產生細胞，獲得基因序列，且使用基因序列在宿主細胞(例如CHO細胞)中以重組方式表現抗體。可採用之另一方法係在植物(例如煙 草)或轉基因乳液中表現抗體序列。揭示以重組方式在植物或乳液中表現抗體之方法。例如參見Peeters等人，Vaccine 19：2756,2001；Lonberg,N.及D.Huszar Int.Rev.Immunol 13：65,1995；及Pollock，等人，J Immunol Methods 231：147,1999。業內已知製備抗體衍生物(例如結構域、單鏈等)之方法。
亦可採用免疫分析及流式細胞術分析技術(例如螢光活化細胞分析(FACS))來分離對IL-2具有特異性之抗體。
編碼單株抗體之DNA易於使用習用程序分離並測序(例如藉由使用能夠特異性結合編碼單株抗體之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)。在一些實施例中，雜交瘤細胞用作該DNA之來源。在分離之後，可將DNA置於表現載體(例如PCT公開案第WO 87/04462號中所揭示之表現載體)中，隨後將其轉染至原本不產生免疫球蛋白之宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中以在重組宿主細胞中實現單株抗體之合成。例如參見PCT公開案第WO 87/04462號。亦可藉由(例如)使用人類重鏈及輕鏈恆定結構域之編碼序列取代同源鼠類序列(Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851,1984)或藉由使非免疫球蛋白多肽之全部或部分編碼序列恆定結構域共價接合至免疫球蛋白編碼序列上來對DNA進行修飾。以該方式，製備對本文IL-2抗體具有結合特異性之「嵌合」或「雜合」抗體。
可藉由如上文所闡述之重組方法(亦即單一或融合多肽)或藉由化學合成藉由抗體之蛋白水解或其他降解產生抗體部分。藉由化學合成便利地製備抗體之多肽、尤其至多約50個胺基酸之較短多肽。化學合成方法為業內已知且市面有售。舉例而言，可藉由採用固相方法之自動化多肽合成器產 生抗體。亦參見美國專利第5,807,715號、第4,816,567號及第6,331,415號。
在一些實施例中，多核苷酸包括編碼本發明之IL-2抗體之重鏈及/或輕鏈可變結構域之序列。可將編碼所關注抗體之序列維持於宿主細胞中之載體中且然後可使宿主細胞擴增並冷凍用於將來使用。載體(包含表現載體)及宿主細胞進一步闡述於本文中。
本發明包含親和力成熟實施例。舉例而言，親和力成熟抗體可藉由業內已知程序產生(Marks等人，1992,Bio/Technology,10：779-783；Barbas等人，1994,Proc Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813；Schier等人，1995,Gene,169：147-155；Yelton等人，1995,J.Immunol.,155：1994-2004；Jackson等人，1995,J.Immunol.,154(7)：3310-9；Hawkins等人，1992,J.Mol.Biol.,226：889-896；及PCT公開案第WO2004/058184號)。
下列方法可用於調節抗體親和力及表徵CDR。表徵抗體之CDR及/或改變(例如改良)多肽(例如抗體)之結合親和力之一種方式稱為「文庫掃描誘變」。通常，文庫掃描誘變係如下所述進行。使用業內認可方法利用兩個或更多個(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)個胺基酸代替CDR中一或多個位置之胺基酸。此生成純系之較小文庫(在一些實施例中，所分析之每一胺基酸位置具有一種純系)，每一純系具有兩個或更多個成員之複雜度(若在每一位置取代兩個或更多個胺基酸)。通常，文庫亦包含包括含有(未經取代)胺基酸之純系。篩選來自每一文庫之少量純系(例如約20-80個純系(端視文庫複雜度))對靶多肽(或其他結合靶)之結合親和力，且鑑別具有增加、相同、降低或 無結合之候選者。業內熟知測定結合親和力之方法。可使用(例如)BiacoreTM表面電漿共振分析(其檢測約2倍或更大程度之結合親和力差異)、Kinexa® Biosensor、鄰近閃爍分析、ELISA或IGEN®免疫分析、螢光淬滅、螢光轉移及/或酵母顯示測定結合親和力。亦可使用適宜生物分析篩選結合親和力。BiacoreTM尤其可用於起始抗體已以相對較高親和力(例如約10nM或更低之KD)發生結合時。
在一些實施例中，使用業內認可之誘變方法(一些闡述於本文中)利用所有20種天然胺基酸代替(在一些實施例中一次一種)CDR中之每一胺基酸位置。此生成純系之較小文庫(在一些實施例中，所分析之每一胺基酸位置具有一種純系)，每一純系具有20個成員之複雜度(若在每一位置取代所有20個胺基酸)。在一些實施例中，使用業內認可之誘變方法利用所有20種天然胺基酸(除半胱胺酸外)代替(在一些實施例中一次一種)CDR中之每一胺基酸位置。
在一些實施例中，擬篩選文庫在兩個或更多個位置中包括取代，該等取代可位於同一CDR中或位於兩個或更多個CDR中。因此，文庫可在一個CDR中之兩個或更多個位置中包括取代。文庫可在兩個或更多個CDR中之兩個或更多個位置中包括取代。文庫可在3、4、5或更多位置中包括取代，該等位置發現於兩個、三個、四個、五個或六個CDR中。取代可使用低冗餘度密碼子製得。例如參見Balint等人，1993,Gene 137(1)：109-18之表2。
CDR可為重鏈可變結構域(VH)CDR3及/或輕鏈可變結構域(VL)CDR3。CDR可為VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3中之一或多者。CDR可為Kabat CDR、Chothia CDR、延伸CDR、AbM CDR、接觸CDR或構象CDR。
在一些實施例中，文庫係根據SEQ ID NO：71及72製得。
可對具有改良結合之候選者進行測序，由此鑑別產生改良親和力之CDR取代突變體(亦稱為「改良」取代)。亦可對結合候選者進行測序，由此鑑別保留結合之CDR取代。
可實施多輪篩選。舉例而言，具有改良結合之候選者(各自在一或多個CDR中之一或多個位置包括胺基酸取代)亦可用於設計至少在每一改良CDR位置(亦即CDR中取代突變體展示改良結合之胺基酸位置)處含有原始及經取代胺基酸之第二文庫。此文庫之製備及篩選或選擇進一步論述於下文中。
文庫掃描誘變亦提供用於表徵CDR之方式，就此而言，具有改良結合、相同結合、降低結合或無結合之純系頻率亦提供與相關每一胺基酸位置對於抗體-抗原複合物穩定性之重要性之資訊。舉例而言，若CDR之位置在改變至所有20種胺基酸時保持結合，則該位置可鑑別為抗原結合不可能需要之位置。與之相反，若CDR之某一位置僅在較小百分比取代時保持結合，則該位置可鑑別為對於CDR功能較為重要之位置。因此，文庫掃描誘變方法生成關於CDR中可改變至許多不同胺基酸(包含所有20種胺基酸)之位置及CDR中不能改變或僅可改變至少數胺基酸之位置之資訊。
具有改良親和力之候選者可組合於第二文庫中，該第二文庫包含改良胺基酸、位於該位置之原始胺基酸，且可端視使用期望篩選或選擇方法所期望或允許之文庫複雜度進一步包含位於該位置之其他取代。另外，若期望，則可使毗鄰胺基酸位置隨機化至至少兩種或更多種胺基酸。毗鄰胺基酸之隨機化可允許突變體CDR中之額外構象撓性，此可繼而允許或促進 引入較大數量之改良突變。文庫亦可在第一輪篩選中不展示改良親和力之位置包括取代。
使用業內已知之任一方法(包含使用Biacore、KinexaTM生物感測器分析之篩選及使用業內已知用於選擇之任一方法(包含噬菌體展示、酵母展示及核糖體展示)之選擇)篩選或選擇第二文庫中具有改良及/或改變之結合親和力之文庫成員。
為表現本發明之IL-2抗體，可首先使用上文所闡述之任一方法獲得編碼VH及VL區之DNA片段。亦可使用熟習此項技術者已知之標準方法向DNA序列中引入各種修飾(例如突變、缺失及/或添加)。舉例而言，可使用標準方法(例如PCR介導之誘變)實施誘變，其中向PCR引子中納入突變核苷酸，從而PCR產物含有期望突變或定點誘變。
本發明涵蓋錶針對7中所指示可變結構域及CDR之修飾。舉例而言，本發明包含含有不顯著影響性質之功能等效可變結構域及CDR之抗體以及具有增強或降低之活性及/或親和力之變體。舉例而言，可使胺基酸序列突變以獲得對IL-2具有期望結合親和力之抗體。在一些實施例中，可使胺基酸序列突變以獲得對IL-2具有期望結合親和力之抗體。經修飾多肽之實例包含具有胺基酸殘基之保守取代、胺基酸之一或多個缺失或添加(其不顯著有害地改變功能活性或使多肽對其配體之親和力成熟(增強))之多肽或使用化學類似物。
胺基酸序列插入包含胺基-及/或羧基末端融合體(長度介於一個殘基至含有上百或更多殘基之多肽範圍內)以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包含具有N-末端甲二磺醯殘基之抗體或融合至表位標籤之抗體。抗體分子之其他插入變體包含抗體N-末端或C-末端與 酶或增加血液循環中之抗體半衰期之多肽之融合體。
抗體亦可經修飾(例如在重鏈及/或輕鏈之可變結構域中)以(例如)改變抗體之結合性質。可變結構域之變化可改變結合親和力及/或特異性。在一些實施例中，在CDR結構域內進行不大於一至五個保守胺基酸取代。在其他實施例中，在CDR結構域內進行不大於一至三三個保守胺基酸取代。舉例而言，可在一或多個CDR區域中進行突變以增加或降低抗體對IL-2之KD，增加或降低k解離，或改變抗體之結合特異性。定點誘變中之技術在業內已眾所周知。例如參見Sambrook等人及Ausubel等人之文獻(見上文)。
亦可在框架區或恆定區中進行修飾或突變以增加IL-2抗體之半衰期。例如參見PCT公開案第WO 00/09560號。亦可作出框架區或恆定區中之突變以改變抗體之免疫原性，提供用於共價或非共價結合至另一分子之位點，或改變諸如補體固定、FcR結合及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性等性質。根據本發明，單一抗體可在可變結構域之任一或多個CDR或框架區中或在恆定區中具有突變。
修飾亦包含醣基化及非醣基化多肽以及具有其他轉譯後修飾(例如使用不同糖之醣基化、乙醯化及磷酸化)之多肽。抗體在其恆定區中之保守位置進行醣基化(Jefferis及Lund,1997,Chem.Immunol.65：111-128；Wright及Morrison,1997,TibTECH 15：26-32)。免疫球蛋白之寡醣側鏈影響蛋白質之功能(Boyd等人，1996,Mol.Immunol.32：1311-1318；Wittwe及Howard,1990,Biochem.29：4175-4180)並影響糖蛋白之一些部分間之分子內相互作用，該等部分可影響糖蛋白之構象及所呈現三維表面(Jefferis及Lund，見上文；Wyss及Wagner,1996,Current Opin.Biotech.7：409-416)。寡醣亦可用於基於特異性識別結構使給定糖蛋白靶向某些分 子。亦已報導影響抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之抗體之醣基化。特定而言，已報導藉由四環素調控表現β(1,4)-N-乙醯葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)(一種催化二等分GlcNAc形成之糖基轉移酶)之CHO細胞產生之抗體具有經改善ADCC活性(Umana等人，1999,Nature Biotech.17：176-180)。
抗體之醣基化通常係N-連接或O-連接。N-連接係指碳水化合物部分與天門冬醯胺殘基之側鏈附接。三肽序列天門冬醯胺-X-絲胺酸、天門冬醯胺-X-蘇胺酸及天門冬醯胺-X-半胱胺酸(其中X係除脯胺酸外之任一胺基酸)係碳水化合物部分與天門冬醯胺側鏈酶附接之識別序列。因此，多肽中存在此等三肽序列中之任一者均可產生潛在醣基化位點。O-連接之醣基化係指糖N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者與羥基胺基酸(最常見為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸)之附接。
藉由改變胺基酸序列而使抗體中含有一或多個上述三肽序列(對於N-連接醣基化位點)來將醣基化位點便利地添加至抗體中。亦可藉由向原始抗體序列中添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或使用一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基實施取代(對於O-連接醣基化位點)來達成該改變。
亦可改變抗體之醣基化模式而不改變潛在核苷酸序列。醣基化主要取決於用於表現抗體之宿主細胞。由於用於表現作為潛在治療劑之重組糖蛋白(例如抗體)之細胞類型很少為天然細胞，因此可預計對抗體之醣基化模式進行改變(例如參見Hse等人，1997,J.Biol.Chem.272：9062-9070)。
除了宿主細胞之選擇外，在重組產生抗體期間影響醣基化之因素亦 包含生長方式、培養基調配物、培養密度、氧合、pH、純化方案及諸如此類。已提出各種方法來改變在特定宿主有體機中所達成之醣基化模式，包含引入或過度表現在寡醣產生中所涉及之某些酶(美國專利第5,047,335號、第5,510,261號及第5,278,299號)。醣基化或某些類型之醣基化可使用(例如)糖苷內切酶H(Endo H)、N-糖苷酶F、糖苷內切酶F1、糖苷內切酶F2、糖苷內切酶F3以酶方式自糖蛋白去除。另外，重組宿主細胞可經基因改造以不能處理某些類型之多糖。該等及類似技術在業內已眾所周知。
其他修飾方法包含使用業內已知之偶合技術，包含但不限於酶方式、氧化取代及螯合。舉例而言，可使用修飾來附接用於免疫分析之標記。使用業內確立程序來製備經修飾多肽且可使用業內已知之標準分析(一些闡述於下文及實例中)篩選。
在一些實施例中，抗體包括對人類Fc γ受體具有增加或降低之結合親和力之經修飾恆定區，係免疫學惰性或部分地惰性(例如不觸發補體介導之溶解，不刺激抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，或不活化小神經膠質細胞)；或在下列性質中之任一者或多者中具有減小之活性(與未修飾抗體相比)：觸發補體介導之溶解、刺激ADCC，或活化小神經膠質細胞。可使用恆定區之不同修飾達成效應子功能之最佳程度及/或組合。例如參見Morgan等人，Immunology 86：319-324,1995；Lund等人，J.Immunology 157：4963-9 157：4963-4969,1996；Idusogie等人，J.Immunology 164：4178-4184,2000；Tao等人，J.Immunology 143：2595-2601,1989；及Jefferis等人，Immunological Reviews 163：59-76,1998。在一些實施例中，恆定區係如以下文獻中所闡述來進行修飾：Eur.J.Immunol.,1999,29：2613-2624；PCT申請案第PCT/GB99/01441號； 及/或英國專利申請案第9809951.8號。
在一些實施例中，可修飾抗體恆定區以避免與Fcγ受體及補體及免疫系統之相互作用。用於製備該等抗體之技術闡述於WO 99/58572中。舉例而言，可改造恆定區以更類似於人類恆定區，從而在將抗體用於人類中之臨床試驗及治療中時避免免疫反應。例如參見美國專利第5,997,867號及第5,866,692號。
在一些實施例中，恆定區係如以下文獻中所闡述來進行修飾：Eur.J.Immunol.,1999,29：2613-2624；PCT申請案第PCT/GB99/01441號；及/或英國專利申請案第9809951.8號。在該等實施例中，Fc可為人類IgG2或人類IgG4。Fc可為含有突變A330P331至S330S331(IgG2△a)之人類.IgG2，其中胺基酸殘基係參照野生型IgG2序列進行編號。Eur.J.Immunol.,1999,29：2613-2624。在一些實施例中，抗體包括含有下列突變之IgG4之恆定區(Armour等人，2003,Molecular Immunology 40 585-593)：E233F234L235至P233V234A235(IgG4△c)，其中編號係參照野生型IgG4。在又一實施例中，Fc係具有缺失G236之人類IgG4 E233F234L235至P233V234A235(IgG4△b)。在另一實施例中，Fc係含有鉸鏈穩定突變S228至P228之任一人類IgG4 Fc(IgG4、IgG4△b或IgG4△c)(Aalberse等人，2002,Immunology 105,9-19)。
在一些實施例中，抗體包括含有下列突變之人類重鏈IgG2恆定區：A330P331至S330S331(胺基酸編號參照野生型IgG2序列)。Eur.J.Immunol.,1999,29：2613-2624。在其他實施例中，恆定區對於N-連接醣基化而言係無醣基化。在一些實施例中，藉由使恆定區中之寡醣附接殘基及/或係N-醣基化識別序列之一部分之側接殘基突變，使恆定區針對N-連 接醣基化無醣基化。舉例而言，可使N-醣基化位點N297突變至(例如)A、Q、K或H。參見Tao等人，J.Immunology 143：2595-2601,1989；及Jefferis等人，Immunological Reviews 163：59-76,1998。在一些實施例中，恆定區對於N-連接醣基化而言係無醣基化。以酶方式(例如藉由酶PNGase去除碳水化合物)或藉由表現於醣基化缺陷宿主細胞中，恆定區可對於N-連接醣基化而言係無醣基化。
其他抗體修飾包含如PCT公開案第WO 99/58572號中所闡述進行修飾之抗體。除針對靶分子之結合結構域外，該等抗體亦包括具有與人類免疫球蛋白重鏈之所有或一部分恆定區實質上同源之胺基酸序列之效應子結構域。該等抗體能夠結合靶分子且不觸發靶之顯著補體依賴性溶解或細胞介導之破壞。在一些實施例中，效應子結構域能夠特異性結合FcRn及/或FcγRIIb。該等抗體通常基於衍生自兩種或更多種人類免疫球蛋白重鏈CH2結構域之嵌合結構域。此方式修飾之抗體尤其適用於慢性抗體療法中以避免對於習用抗體療法之發炎性及其他不良反應。
本發明亦提供可進一步修飾之抗體恆定結構域。Fc區之變體(例如胺基酸取代、插入及/或添加及/或缺失)已知會增強或減弱效應子功能。例如參見Presta等人，2002,Biochem.Soc.Trans.30：487-490；Strohl,2009,Curr.Opin.Biotechnol.20(6)：685-691；美國專利5,624,821、5,648,260、5,885,573、6,737,056、7,317,091；PCT公開案第WO 99/58572號、第WO 00/42072號、第WO 04/029207號、第WO 2006/105338號、第WO 2008/022152號、第WO 2008/150494號、第WO 2010/033736號；美國專利申請案公開案第2004/0132101號、第2006/0024298號、第2006/0121032號、第2006/0235208號、第 2007/0148170號；Armour等人，1999,Eur.J.Immunol.29(8)：2613-2624(減小之ADCC及CDC)；Shields等人，2001,J.Biol.Chem.276(9)：6591-6604(減小之ADCC及CDC)；Idusogie等人，2000,J.Immunol.164(8)：4178-4184(增加之ADCC及CDC)；Steurer等人，1995,J.Immunol.155(3)：1165-1174(減小之ADCC及CDC)；Idusogie等人，2001,J.Immunol.166(4)：2571-2575(增加之ADCC及CDC)；Lazar等人，2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(11)：4005-4010(增加之ADCC)；Ryan等人，2007,Mol.Cancer.Ther.,6：3009-3018(增加之ADCC)；Richards等人，2008,Mol.Cancer Ther.7(8)：2517-2527。
在一些實施例中，抗體包括與未修飾抗體相比對FcRn具有增加之結合親和力及/或具有增加之血清半衰期之經修飾恆定區。
在稱為「種系化」之過程中，VH及VL序列中之某些胺基酸可發生突變以匹配天然發現於種系VH及VL序列中者。特定而言，VH及VL序列中之框架區之胺基酸序列可發生突變以匹配種系序列，從而在投與抗體時減小免疫原性之風險。人類VH及VL基因之種系DNA序列為業內已知(例如參見the「Vbase」human germline sequence database；亦參見Kabat,E.A.，等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公開案第91-3242號；Tomlinson等人，J.Mol.Biol.,1992,227：776-798；及Cox等人，1994,Eur.J.Immunol.24：827-836)。
可進行之另一類胺基酸取代係去除抗體中之潛在蛋白水解位點。該等位點可出現於可變結構域之CDR或框架區中或抗體之恆定區中。取代半胱胺酸殘基且去除蛋白水解位點可降低抗體產物中之異質性之風險且由此 增加其均質性。另一類胺基酸取代係藉由改變一或二個殘基來消除形成潛在去醯胺化位點之天門冬醯胺-甘胺酸對。在另一實例中，可裂解或以其他方式去除本發明之IL-2抗體之重鏈之C-末端離胺酸。在本發明之各個實施例中，抗體之重鏈及輕鏈可視情況包含信號序列。
在獲得編碼本發明之VH及VL區段之DNA片段後，可藉由標準重組DNA技術進一步操縱該等DNA片段以(例如)將可變結構域基因轉換成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在該等操縱中，編碼VL或VH之DNA片段可操作地連接至編碼另一蛋白質之另一DNA片段，例如抗體恆定區或撓性連接體。如在此上下文中所使用，術語「可操作地連接」欲指接合兩個DNA片段，從而由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保留在框內。
可藉由將編碼VH之DNA可操作地連接至編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子，將編碼VH區之經分離DNA轉換成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為業內已知(例如參見Kabat,E.A.等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號)，且涵蓋該等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但在一些實施例中係IgG1或IgG2恆定區。IgG恆定區序列可為已知出現於不同個體中之各種等位基因或異型中之任一者，例如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)及Gm(17)。該等異型代表IgG1恆定區中之天然胺基酸取代。對於Fab片段重鏈基因而言，編碼VH之DNA可操作地連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。CH1重鏈恆定區可衍生自任一重鏈基因。
可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子，將編碼VL區之經分離DNA轉換成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為業內已知(例如參見Kabat,E.A.等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公開案第91-3242號)，且涵蓋該等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。κ恆定區可為已知出現於不同個體中之各種等位基因中之任一者，例如Inv(1)、Inv(2)及Inv(3)。λ恆定區可衍生自三種λ基因中之任一者。
為產生scFv基因，將編碼VH及VL之DNA片段可操作地連接至編碼撓性連接體之另一片段，從而VH及VL序列可表現為鄰接單鏈蛋白質，且藉由撓性連接體接合VL及VH區(例如參見Bird等人，1988,Science 242：423-426；Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，1990,Nature 348：552-554)。已設計且使用其他序列之連接體(Bird等人，1988，見上文)。可繼而針對其他功能來修飾連接體，例如附接f藥物或附接至固體載體。單鏈抗體可為單價(若僅使用單一VH及VL)、雙價(若使用兩個VH及VL)或多價(若使用大於兩個VH及VL)。可生成特異性結合至IL-2及另一分子之雙特異性或多價抗體。可以重組方式或以合成方式產生單鏈變體。為以合成方式產生scFv，可使用自動化合成器。為重組產生scFv，可將含有編碼scFv之多核苷酸之適宜質體引入適宜宿主細胞(真核(例如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物)細胞或原核細胞(例如大腸桿菌))中。可藉由常規操縱(例如連接多核苷酸)來製備編碼所關注scFv之多核苷酸。可使用業內已知之標準蛋白質純化技術分離所得 scFv。
亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，例如雙價抗體。雙價抗體係二價雙特異性抗體，其中VH及VL在單一多肽鏈上表現，但所用連接體過短而不容許相同鏈上之兩個結構域之間配對，由此迫使結構域與另一鏈上之互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點(例如參見Holliger,P.等人，1993,Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：6444-6448；及Poljak,R.J.等人，1994,Structure 2：1121-1123)。
包括兩個共價接合抗體之異源偶聯抗體亦在本發明範圍內。已使用該等抗體將免疫系統細胞靶向不期望細胞(美國專利第4,676,980號)且用於治療HIV感染(PCT公開案第WO 91/00360號及第WO 92/200373號；及EP 03089)。可使用任一便利交聯方法來製備異源偶聯抗體。適宜交聯劑及技術在業內已眾所周知，且闡述於美國專利第4,676,980號中。
亦可使用已知合成蛋白質化學方法(包含涉及交聯劑者)在活體外製備嵌合或雜合抗體。舉例而言，可使用二硫化物交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築免疫毒素。適用於此目的之試劑之實例包含亞胺基硫醇鹽及4-巰基丁醯亞胺甲酯。
本發明亦涵蓋包括來自本文所揭示抗體之一或多個部分或區域之融合蛋白。在一些實施例中，可製備包括本發明之IL-2抗體中連接至另一多肽之全部或一部分之融合抗體。在另一實施例中，僅IL-2抗體之可變結構域連接至多肽。在另一實施例中，IL-2抗體之VH結構域連接至第一多肽，而IL-2抗體之VL結構域連接至第二多肽，第二多肽與第一多肽以使得VH及VL結構域可彼此相互作用以形成抗原結合位點之方式發生締合。在另一實施例中，VH結構域與VL結構域由連接體分開，從而VH及VL結 構域可彼此相互作用。VH-連接體-VL抗體然後連接至所關注多肽。另外，可產生融合抗體，其中兩個(或更多個)單鏈彼此連接。此可用於試圖在單一多肽鏈上產生二價或多價抗體時或試圖產生雙特異性抗體時。
在一些實施例中，提供包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中所展示可變輕鏈區域之至少10個鄰接胺基酸及/或SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71中所展示可變重鏈區域之至少10個胺基酸之融合多肽。在其他實施例中，提供包括可變輕鏈區域之至少約10、至少約15、至少約20、至少約25或至少約30個鄰接胺基酸及/或可變重鏈區域之至少約10、至少約15、至少約20、至少約25或至少約30個鄰接胺基酸之融合多肽。在另一實施例中，融合多肽包括一或多個CDR。在其他實施例中，融合多肽包括VH CDR3及/或VL CDR3。出於本發明目的，融合蛋白含有一或多個抗體及在原始分子中不附接之另一胺基酸序列(例如來自另一區域之異源序列或同源序列)。實例性異源序列包含但不限於「標籤」，例如FLAG標籤或6His標籤(SEQ ID NO：223)。標籤已為業內所熟知。
可藉由業內已知方法(例如以合成方式或以重組方式)產生融合多肽。通常，本發明之融合蛋白係藉由使用本文所闡述之重組方法製備及表現編碼其之多核苷酸製得，但其亦可藉由業內已知之其他方式(例如包含化學合成)製得。
在其他實施例中，可使用編碼IL-2抗體之核酸分子製備其他經修飾抗體。舉例而言，「κ體」(Ill等人，1997,Protein Eng.10：949-57)、「微小抗體」(Martin等人，1994,EMBO J.13：5303-9)、「雙價抗體」 (Holliger等人，見上文)或「鉀努星(Janusin)」(Traunecker等人，1991,EMBO J.10：3655-3659及Traunecker等人，1992,Int.J.Cancer(增刊)7：51-52)可使用標準分子生物技術遵循說明書之教示內容來製得。
舉例而言，可使用本文所揭示之抗體來製備雙特異性抗體(針對至少兩種不同抗原具有結合特異性之單株抗體)。業內已知製備雙特異性抗體之方法(例如參見Suresh等人，1986,Methods in Enzymology 121：210)。舉例而言，可藉由融合雜交瘤或連接Fab’部分來產生雙特異性抗體或抗原結合部分。例如參見Songsivilai & Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79：315-321及Kostelny等人，1992,J.Immunol.148：1547-1553。傳統上，雙特異性抗體之重組產生係基於共表現兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中兩條重鏈具有不同特異性(Millstein及Cuello,1983,Nature 305,537-539)。另外，雙特異性抗體可形成為「雙價抗體」或「鉀努星」。在一些實施例中，雙特異性抗體結合至IL-2之兩個不同表位。在一些實施例中，使用來自本文所提供IL-2抗體之一或多個可變結構域或CDR區域製備上述經修飾抗體。
根據製備雙特異性抗體之一種方式，具有期望結合特異性(抗體-抗原組合位點)之抗體可變結構域融合至免疫球蛋白恆定區序列。在一些實施例中，融合係與包括鉸鏈、CH2及CH3區域中之至少一部分之免疫球蛋白重鏈恆定區進行。在一些實施例中，含有輕鏈結合所需之位點之第一重鏈恆定區(CH1)存在於至少一個融合體中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體及(若期望)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入分開表現載體中，且共轉染至適宜宿主有機體中。在用於構建之3種多肽鏈之不等比率可提供最佳產率時，此共轉染可為調節實施例中3種多肽部分之相互比例提供較大靈活性。然 而，在以等比率表現至少2種多肽鏈可產生高產率時或在該等比率並無重要意義時，可將2種或所有3種多肽鏈之編碼序列插入一個表現載體中。
在一種方式中，雙特異性抗體係由一臂中具有第一結合特異性之雜合免疫球蛋白重鏈與另一臂中之雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。僅在雙特異性分子之一半中具有免疫球蛋白輕鏈之此不對稱結構促進了期望雙特異性化合物與不期望免疫球蛋白鏈組合之分離。此方式闡述於PCT公開案第WO 94/04690號中。
本發明亦提供包括偶聯(例如連接)至促進至固體載體(例如生物素或抗生物素蛋白)之偶合之藥劑之抗體的組合物。為簡單起見，通常在已理解該等方法適用於本文所闡述之任一IL-2結合實施例下提及抗體。偶聯通常係指連接如本文所闡述之該等組份。可以任一數量之方式來達成連接(其通常至少以鄰近締合形式固定該等組份以用於投與)。舉例而言，在各自擁有能夠彼此反應之取代基時，藥劑與抗體之間可能發生直接反應。舉例而言，一種物質上之親核基團(例如胺基或硫氫基)可能能夠與另一物質上之含有羰基之基團(例如酐或醯鹵)或與含有良好離去基團(例如鹵化物)之烷基發生反應。
抗體可結合至許多不同載劑。載體可活性及/或惰性。熟知載劑之實例包含聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、右旋糖酐、耐輪(nylon)、澱粉酶、玻璃、天然及經修飾纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂及磁石。出於本發明目的，載劑之性質可為可溶性或不溶性。熟習此項技術者知曉用於結合抗體之其他適宜載劑，或能夠使用常規實驗確定該等載劑。
本發明之抗體或多肽可連接至標記劑(例如螢光分子、放射性分子或業內已知之任一其他標記)。業內已知通常提供(直接或間接)信號之標 記。
本文所揭示IL-2抗體之輕鏈可變結構域(VL)及重鏈可變結構域(VH)之胺基酸序列藉由序列鑑別編號匯總於表7中。
本發明抗體可包括：a)包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列之VL，b)包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列之VL，c)包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列之VL，d)包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：8之胺基酸序列之VL，e)包括SEQ ID NO：9之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：10之胺基酸序列之VL，f)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列之VL，g)包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：14之胺基酸序列之VL，h)包括SEQ ID NO：15之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之VL，i)包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之VL，j)包括SEQ ID NO：19之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：20之胺 基酸序列之VL，k)包括SEQ ID NO：21之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：22之胺基酸序列之VL，l)包括SEQ ID NO：23之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：24之胺基酸序列之VL，m)包括SEQ ID NO：25之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：26之胺基酸序列之VL，n)包括SEQ ID NO：27之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：28之胺基酸序列之VL，o)包括SEQ ID NO：29之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：30之胺基酸序列之VL，p)包括SEQ ID NO：31之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：32之胺基酸序列之VL，q)包括SEQ ID NO：71之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：72之胺基酸序列之VL，在另一態樣中，抗體包括該等序列之變體，其中該等變體可包含保守及非保守取代、缺失及/或添加，且通常包含與本文所揭示之任一特異性序列共有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之肽。
舉例而言，在一態樣中，本發明提供包括如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：72中所陳述之VL鏈胺基酸序列之經分離抗體或其抗原結合部分或其變體。在一態樣中，該抗體變體相對於SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：72包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個保守或非保守取代及/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個添加及/或缺失。在另一態樣中，該變體與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：72共有至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之序列一致性，且其中該抗體或抗原結合部分特異性結合IL-2。在一些實施例中，該抗體或抗原結合部分特異性結合hIL-2。
在另一態樣中，本發明提供包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：71中所陳述之VH鏈胺基酸序列之經分離抗體或其抗原結合部分或其變體。在一態樣中，該抗體變體相對於SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：71包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個保守或非保守取代及/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個添加及/或缺失。在另一態樣中，該變體與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：71共有至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之序列一致性，且其中該抗體或抗原結合部分特異性結合IL-2。在一些實施例中，該抗體或抗原結合部分特異性結合hIL-2。
本發明抗體可包括含有VH之重鏈，該VH包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：71之胺基酸序列，其中抗體進一步包括重鏈恆定結構域。如本文中其他處更全面所陳 述，抗體重鏈恆定結構域可選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但在一些實施例中係IgG1或IgG2恆定區。IgG恆定區序列可為已知出現於不同個體中之各種等位基因或異型中之任一者，例如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)及Gm(17)。對於Fab部分重鏈基因而言，編碼VH之DNA可操作地連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。CH1重鏈恆定區可衍生自任一重鏈基因。
在一態樣中，抗體可包括含有選自包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：71之胺基酸序列之VH的VH之重鏈，且進一步包括含有降低或消除Fc效應子功能之三重突變之IgG1恆定結構域(hIgG1-3m；SEQ ID NO：2)。在一態樣中，該抗體變體相對於全長重鏈包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個保守或非保守取代及/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個添加及/或缺失。在另一態樣中，該變體與全長重鏈共有至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之序列一致性，且其中該抗體或抗原結合部分特異性結合IL-2。
本發明抗體可包括含有VL之輕鏈，該VL包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：72之胺基酸序列，其中該抗體進一步包括輕鏈恆定結構域。如本文中其他處更全面所陳述，抗體輕鏈恆定結構域可選自Cκ或Cλ恆定區(例如SEQ ID NO：1之Cλ恆定區)。在一態樣中，該抗體變體相對於全長輕鏈包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個保守或非保守取代及/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個添加及/或缺失。在另一態樣中，該變體與全長輕鏈共有至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之序列一致性，且其中該抗體或抗原結合部分特異性結合IL-2。
本發明抗體可包括表7中所展示VL或VH胺基酸序列中之一者之一部分。舉例而言，本發明抗體可包括來自包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：71之VH或來自包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：72之VL至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少18、至少20或至少25個連續胺基酸之一部分。此一部分較佳地保留一或多個上述功能(例如結合至IL-2之能力)。在一些實施例中，此一部分較佳地保留一或多個上述功能(例如結合至hIL-2之能力)。
在一些實施例中，本發明抗體包括根據如表7中所展示之Kabat、Chothia或延伸序列之VH CDR1、CDR2及CDR3及/或根據Kabat及/或Chothia胺基酸序列之VL CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本發明抗體包括根據下列Kabat胺基酸序列之VH CDR1：SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：199或SEQ ID NO：208。在一些實施例中，本發明抗體包括根據下列Chothia胺基酸序列之VH CDR1：SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：200或SEQ ID NO：209。在一些實施例中，本發明抗體包括根據下列組合胺基酸序列之VH CDR1：SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：201或SEQ ID NO：210。在一些實施例中，本發明抗體包括根據下列Kabat胺基酸序列之VH CDR2：SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：202或SEQ ID NO：211。在一些實施例中，本發明抗體包括根據下列Chothia胺基酸序列之VH CDR2：SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：203或SEQ ID NO：212。在一些實施例中，本發明抗體包括根據下列胺基酸序列之VH CDR3：SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：204或SEQ ID NO：213。在一些實施例中，本發明抗體包括根據下列胺基酸序列之VL CDR1：SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：214或SEQ ID NO：220。在一些實施例中，本發明抗體包括根據下列胺基酸序列之VL CDR2：SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：215或SEQ ID NO：221。在一些實施例中，本發明抗體包括根據下列胺基酸序列之VL CDR3：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：216或SEQ ID NO：222。在一些實施例中，本發明抗體包括根據SEQ ID NO：217之VH CDR1。在一些實施例中，本發明抗體包括根據SEQ ID NO：218之VH CDR2。在一些實施例中，本發明抗體包括根據SEQ ID NO：219之VH CDR3。
在某些實施例中，本發明抗體包括根據如表7中所展示選自以下之抗體之Kabat、Chothia、或延伸序列之VH CDR1、CDR2、及CDR3及/或根據Kabat及/或Chothia胺基酸序列之VL CDR1、CDR2及CDR3：F4.7.6 VH、F4.7.8 VH、F5.1.11 VH、F5.1.9 VH、F4.7.062 VH、F5.1.11.01 VH、F5.1.11.02 VH、F5.1.11.03 VH、F5.1.11.04 VH、F5.1.11.05 VH、F5.1.11.06 VH、F5.1.11.07 VH、F5.1.11.08 VH、F5.1.11.09 VH、F5.1.9.5 VH、d1C7 VH、F4.7.6 VL、F4.7.8 VL、F5.1.11 VL、F5.1.9 VL、F4.7.062 VL、F5.1.11.01 VL、F5.1.11.02 VL、F5.1.11.03 VL、F5.1.11.04 VL、F5.1.11.05 VL、F5.1.11.06 VL、F5.1.11.07 VL、F5.1.11.08 VL、F5.1.11.09 VL、F5.1.9.5 VL或d1C7 VL。在某些實施例中，本發明抗體包括根據如表7中所展示抗體F5.1.11.02之Kabat、Chothia或延伸序列之VH CDR1、CDR2及CDR3及/或根據Kabat及/或Chothia胺基酸序列之VL CDR1、CDR2及CDR3。
該等VH或VL序列中之任一者之適宜部分或變體保留結合至IL-2之能力。在一些實施例中，其較佳地保留特異性結合至IL-2之能力。在一些實施例中，其較佳地保留與衍生其之抗體特異性結合至IL-2分子之相同或類似表位或區域之能力。在一些實施例中，其較佳地保留衍生其之抗體之一 或多種其他功能，例如尤其係結合hIL-2、減小hIL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合及Treg保護。
在一些實施例中，該等VH或VL序列中之任一者之適宜部分或變體保留結合至hIL-2之能力。在一些實施例中，其保留特異性結合至hIL-2之能力。在一些實施例中，其保留與衍生其之抗體特異性結合至hIL-2分子之相同或類似表位或區域之能力。在一些實施例中，其保留衍生其之抗體之一或多種其他功能，例如尤其係結合hIL-2、減小hIL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合及Treg保護。
本發明抗體可包括來自本文所鑑別特異性抗體中之CDR區域，例如來自SEQ ID NO：1-32內之CDR區域。在一些實施例中，此一抗體較佳地保留結合至如本文所闡述之IL-2之能力。在一些實施例中，此一抗體較佳地保留結合至如本文所闡述之hIL-2之能力。舉例而言，本發明抗體之CDR序列展示於序列表(表7)中且SEQ ID NO展示於表6中。在某些實施例中，本發明抗體包括來自本發明抗體內之1、2、3、4、5或6個CDR。
在一態樣中，本發明提供之抗體變體相對於上文所列示之一或多個CDR包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個保守或非保守取代及/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個添加及/或缺失。在另一態樣中，變體與上文所列示之一或多個CDR共有至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之序列一致性，且其中抗體或抗原結合部分特異性結合IL-2。在一些實施例中，抗體或抗原結合部分特異性結合hIL-2。
多核苷酸、載體及宿主細胞
本發明亦提供編碼任一抗體(包含本文所闡述之抗體部分及經修飾抗體，例如具有受損效應子功能之抗體)之多核苷酸。在另一態樣中，本發明提供製備本文所闡述之任一多核苷酸之方法。可藉由業內已知程序來製備及表現多核苷酸。因此，本發明提供編碼下列IL-2抗體及其抗原結合部分中之任一者之多核苷酸或包括多核苷酸之組合物(包含醫藥組合物)：F4.7.6 VH、F4.7.8 VH、F5.1.11 VH、F5.1.9 VH、F4.7.062 VH、F5.1.11.01 VH、F5.1.11.02 VH、F5.1.11.03 VH、F5.1.11.04 VH、F5.1.11.05 VH、F5.1.11.06 VH、F5.1.11.07 VH、F5.1.11.08 VH、F5.1.11.09 VH、F5.1.9.5 VH、d1C7 VH、F4.7.6 VL、F4.7.8 VL、F5.1.11 VL、F5.1.9 VL、F4.7.062 VL、F5.1.11.01 VL、F5.1.11.02 VL、F5.1.11.03 VL、F5.1.11.04 VL、F5.1.11.05 VL、F5.1.11.06 VL、F5.1.11.07 VL、F5.1.11.08 VL、F5.1.11.09 VL、F5.1.9.5 VL或d1C7 VL或其能夠結合IL-2之任一部分或部段。
在一實施例中，VH及VL結構域或其抗原結合部分或全長HC或LC係由分開之多核苷酸編碼。或者，VH及VL或其抗原結合部分或HC及LC係由單一多核苷酸編碼。
在另一態樣中，本發明提供編碼IL-2抗體之多核苷酸及其變體，其中該等變體多核苷酸與本文所揭示之任一特異性核酸共有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之序列一致性。該等量並不意欲具有限制性，且所列舉百分比之間之增量特定設想為本發明之一部分。
本發明亦涵蓋與任一該等序列互補之多核苷酸。多核苷酸可為單鏈 (編碼或反義)或雙鏈，且可為DNA(基因體、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包含HnRNA分子(其含有內含子且以一對一方式對應於DNA分子)及mRNA分子(其不含內含子)。其他編碼或非編碼序列可(但無需)存在於本發明多核苷酸內，且多核苷酸可(但無需)連接至其他分子及/或載體材料。
多核苷酸可包括原始序列(亦即編碼抗體或其部分之內源性序列)或可包括此一序列之變體。多核苷酸變體含有一或多個取代、添加缺、失及/或插入，從而經編碼多肽之免疫反應性相對於原始免疫反應性分子有所減弱。可通常如本文所闡述來評價免疫反應性對經編碼多肽之效應。在一些實施例中，變體與編碼原始抗體或其部分之多核苷酸序列展現至少約70%一致性、在一些實施例中至少約80%一致性、在一些實施例中至少約90%一致性及在一些實施例中至少約95%一致性。該等量並不意欲具有限制性，且所列舉百分比之間之增量特定設想為本發明之一部分。
若在如下文所闡述比對最大對應時兩個多核苷酸或多肽序列中之核苷酸或胺基酸之序列相同，則該兩個序列可視為「一致」。通常藉由比較比對窗口中之序列以鑑別及比較具有序列類似性之局部區域來比較兩個序列。本文所用之「比對窗口」係指至少約20個鄰接位置(通常30至約75或40至約50個)之區段，其中可在最佳比對一個序列與具有相同鄰接位置數之參考序列之後來比較該兩個序列。
可使用bioinformatics軟體之Lasergene®套裝中之MegAlign®程式(DNASTAR®,Inc.,Madison,WI)使用默認參數來實施比對用序列之最佳比對。此程式體現下列參考文獻中所闡述之若干比對方案：Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships。Dayhoff,M.O.(編輯)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC，第5卷，增刊3，第345-358頁；Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes，第626-645頁，Methods in Enzymology，第183卷，Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.及Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5：151-153；Myers,E.W.及Muller W.,1988,CABIOS 4：11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11：105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath,P.H.A.及Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.及Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730。
在一些實施例中，藉由在具有至少20個位置之比對窗口中比較兩個最佳比對序列來測定「序列一致性百分比」，其中與用於最佳比對兩個序列之參考序列(其不包括添加或缺失)相比，比對窗口中之多核苷酸或多肽序列部分可包括20%或更少、通常5%至15%或10%至12%之添加或缺失(亦即間隙)。該百分比係藉由以下方式來計算：測定兩個序列中出現相同核酸鹼基或胺基酸鹼基之位置數以得到匹配位置數，使用匹配位置數除以參考序列中之位置總數(亦即「窗口大小」)，且將結果乘以100以得到序列一致性百分比。
變體亦可或替代地與原始基因或其部分或補體實質上同源。該等多核苷酸變體能夠在濕度嚴格條件下雜交至編碼原始抗體之天然DNA序列(或互補序列)。
適宜「適度嚴格條件」包含在5×SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)之溶液中預洗滌；在50℃-65℃下雜交，5×SSC，過夜；隨後在65℃下使用含有0.1% SDS之2×、0.5×及0.2×SSC中之每一者洗滌20分鐘(兩次)。
如本文中所使用，「高度嚴格條件」或「高嚴格條件」係彼等以下條件：(1)採用低離子強度及高溫進行洗滌，例如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉、在50℃下；(2)在雜交期間採用變性劑，例如甲醯胺，例如含有0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯基吡咯啶酮/50mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.5，含有750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉，42℃)之50%(v/v)甲醯胺；或(3)在42℃下採用50%甲醯胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5×鄧哈特溶液溶液(Denhardt’s solution)、經超音波處理之鮭魚精DNA(50μg/mL)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，其中在42℃下於0.2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中洗滌且在55℃下於50%甲醯胺中洗滌，隨後在55℃下進行由含有EDTA之0.1×SSC組成之高嚴格洗滌。熟習此項技術者將認識到如何視需要調節溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及諸如此類等因素。
熟習此項技術者應瞭解，因基因代碼簡並，故存在許多編碼如本文所闡述之多肽之核苷酸序列。該等多核苷酸中之一些與任一原始基因之核苷酸序列具有最小同源性。然而，本發明特定涵蓋因密碼子使用差異而有所變化之多核苷酸。另外，包括本文所提供多核苷酸序列之基因之等位基因在本發明範圍內。等位基因係因核苷酸之一或多個突變(例如缺失、添加及/或取代)而有所改變之內源性基因。所得mRNA及蛋白質可(但無需) 具有改變之結構或功能。可使用標準技術(例如雜交、擴增及/或數據庫序列比對)鑑別等位基因。
可使用化學合成、重組方法或PCR獲得本發明多核苷酸。化學多核苷酸合成之方法在業內已眾所周知且無需詳細闡述於本文中。熟習此項技術者可使用本文所提供之序列及商業DNA合成器來產生期望DNA序列。
為使用重組方法製備多核苷酸，可將包括期望序列之多核苷酸插入適宜載體中，且繼而可將載體引入適宜宿主細胞中用於複製及擴增，如本文進一步所論述。可藉由業內已知之任一方式將多核苷酸插入宿主細胞中。藉由使用直接攝取、胞吞作用、轉染、F-匹配或電穿孔引入外源性多核苷酸來轉變細胞。在引入後，外源性多核苷酸可作為非整合載體(例如質體)維持於細胞內或整合至宿主細胞基因體中。可自宿主細胞藉由業內熟知方法分離由此擴增之多核苷酸。例如參見Sambrook等人，1989。
或者，PCR容許複製DNA序列。PCR技術為業內熟知且闡述於美國專利第4,683,195號、第4,800,159號、第4,754,065號及第4,683,202號以及PCR：The Polymerase Chain Reaction,Mullis等人編輯，Birkauswer Press,Boston,1994中。
可藉由在適當載體中使用經分離DNA且將其插入適宜宿主細胞中來獲得RNA。在細胞發生複製且將DNA轉錄至RNA中時，然後可使用熟習此項技術者熟知之方法分離RNA，例如如Sambrook等人，1989(見上文)中所陳述。
適宜選殖載體可根據標準技術來構築，或可選自業內可用之大量選殖載體。儘管所選選殖載體可根據意欲使用之宿主細胞有所變化，但有用選殖載體通常能夠自我複製，可擁有用於特定限制內核酸酶之單一靶，及 /或可攜載用於可用於選擇含有載體之純系之標記物之基因。適宜實例包含質體及細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體(例如pSA3及pAT28)。該等及許多其他選殖載體可購自商業供應商，例如BioRad、Strategene及Invitrogen。
另外提供表現載體。表現載體通常係含有本發明之多核苷酸之可複製多核苷酸構築體。據暗示，表現載體必須作為游離基因體或作為染色體DNA之組成部分在宿主細胞中複製。適宜表現載體包含但不限於質體、病毒載體(包含腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒)、黏粒及PCT公開案第WO 87/04462號中所揭示之表現載體。載體組份通常可包含但不限於下列中之一或多者：信號序列；複製起源；一或多個標記物基因；適宜轉錄控制元件(例如啟動子、增強子及終止子)。對於表現(亦即轉譯)而言，亦通常需要一或多個轉譯控制元件，例如核糖體結合位點、轉譯起始位點及停止密碼子。
含有所關注多核苷酸之載體及/或多核苷酸本身可藉由諸多適當方式中之任一者引入宿主細胞中，包含電穿孔、採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-右旋糖酐或其他物質進行轉染、微粒轟擊、脂轉染及感染(例如其中載體係傳染原，例如牛痘病毒)。引入載體或多核苷酸之選擇通常取決於宿主細胞之特徵。
本發明亦提供包括本文所闡述之任一多核苷酸之宿主細胞。任一能夠過度表現異源DNA之宿主細胞皆可用於分離編碼所關注抗體、多肽或蛋白質之基因之目的。哺乳動物宿主細胞之非限制性實例包含但不限於COS、HeLa及CHO細胞。亦參見PCT公開案第WO 87/04462號。適宜非 哺乳動物宿主細胞包含原核生物(例如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌(B.subtillis))及酵母(例如啤酒酵母菌(S.cerevisae)、粟酒裂殖酵母菌(S.pombe)或乳酸克魯維酵母菌(K.lactis))。在一些實施例中，宿主細胞以高於宿主細胞中(若存在)所關注相應內源性抗體或蛋白質約5倍、在一些實施例中高於10倍及在一些實施例中高於20倍之程度表現cDNA。藉由免疫分析或FACS篩選特異性結合至IL-2之宿主細胞。可鑑別過度表現所關注抗體或蛋白質之細胞。
可使用表現載體直接表現IL-2抗體。熟習此項技術者熟知投與表現載體以在活體內表現外源性蛋白質。例如參見美國專利第6,436,908號、第6,413,942號及第6,376,471號。表現載體之投與包含局部或全身性投與，包含注射、口服投與、顆粒槍或插入導管投與及局部投與。在另一實施例中，將表現載體直接投與交感神經幹或神經節或冠狀動脈、心房、心室或心包膜。
亦可使用靶向遞送含有表現載體或亞基因體多核苷酸之治療組合物。受體介導之DNA遞送技術闡述於(例如)以下文獻中：Findeis等人，Trends Biotechnol.,1993,11：202；Chiou等人，Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer,J.A.Wolff編輯，1994；Wu等人，J.Biol.Chem.,1988,263：621；Wu等人，J.Biol.Chem.,1994,269：542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87：3655；Wu等人，J.Biol.Chem.,1991,266：338。以約100ng至約200mg DNA之範圍投與含有多核苷酸之治療組合物以用於基因療法方案中之局部投與。在基因療法方案期間亦可使用約500ng至約50mg、約1μg至約2mg、約5μg至約500μg及約20μg至約100μg DNA之濃度範圍。可 使用基因遞送媒劑來遞送治療性多核苷酸及多肽。基因遞送媒劑可為病毒或非病毒起源(通常參見Jolly,Cancer Gene Therapy,1994,1：51；Kimura,Human Gene Therapy,1994,5：845；Connelly,Human Gene Therapy,1995,1：185；及Kaplitt,Nature Genetics,1994,6：148)。可使用內源性哺乳動物或異源啟動子誘導該等編碼序列之表現。編碼序列之表現可為組成型或調控型。
用於遞送期望多核苷酸且表現於期望細胞中之基於病毒之載體在業內已眾所周知。基於病毒之實例性媒劑包含但不限於重組體逆轉錄病毒(例如參見PCT公開案第WO 90/07936號、第WO 94/03622號、第WO 93/25698號、第WO 93/25234號、第WO 93/11230號、第WO 93/10218號、第WO 91/02805號；美國專利第5,219,740號及第4,777,127號；GB專利第2,200,651號；及EP專利第0 345 242號)、基於甲病毒屬(alphavirus)之載體(例如辛得比斯病毒(Sindbis virus)載體、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、羅氏河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)及委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))及腺相關病毒(AAV)載體(例如參見PCT公開案第WO 94/12649號、第WO 93/03769號、第WO 93/19191號、第WO 94/28938號、第WO 95/11984號及第WO 95/00655號)。亦可採用投與連接至殺滅腺病毒之DNA，如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3：147中所闡述。
亦可採用非病毒遞送媒劑及方法，包含但不限於單獨之連接或未連接至殺滅腺病毒之聚陽離子縮合DNA(例如參見Curiel,Hum.Gene Ther., 1992,3：147)；配體連接之DNA(例如參見Wu,J.Biol.Chem.,1989,264：16985)；真核細胞遞送媒劑細胞(例如參見美國專利第5,814,482號；PCT公開案第WO 95/07994號、第WO 96/17072號、第WO 95/30763號及第WO 97/42338號)及與細胞膜進行核電荷中和或融合。亦可採用裸DNA。實例性裸DNA引入方法闡述於PCT公開案第WO 90/11092號及美國專利第5,580,859號中。可用作基因遞送媒劑之脂質體闡述於美國專利第5,422,120號；PCT公開案第WO 95/13796號、第WO 94/23697號、第WO 91/14445號及第EP 0524968號中。其他方式闡述於Philip,Mol.Cell Biol.,1994,14：2411及Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.,1994,91：1581中。
治療方法
治療方法涉及向需要治療之個體投與治療有效量或「有效量」之IL-2抗體、抗原結合部分或包括如本文所闡述之IL-2抗體之抗體：IL-2複合物且由本發明涵蓋。如本文中所使用，「治療有效」或「有效」量係指抗體或其部分之如下量：其足以降低疾病症狀之嚴重程度，增加無疾病症狀時段之頻率及持續時間，或預防由感病性所致之缺損或失能(以單一劑量形式或根據多劑量方案，單獨或與其他藥劑組合)。熟習此項技術者能夠基於諸如以下等因素來測定該等量：個體身材、個體症狀之嚴重程度及特定組合物或所選投與途徑。個體可為人類或非人類動物(例如兔、大鼠、小鼠、猴或其他低級靈長類動物)。
可共投與抗體、抗原結合部分或包括本發明之IL-2抗體之抗體：IL-2複合物與已知藥劑，且在一些情況下抗體可自身經修飾。舉例而言，抗體可偶聯至免疫毒素或放射性同位素以潛在地進一步增加效能。就與其他治 療劑共投與而言，該等藥劑可包含細胞毒性劑、放射毒性劑或免疫阻抑劑。抗體可連接至藥劑(作為免疫複合物)或可與藥劑分開投與。在後一情形(單獨投與)下，抗體可在藥劑之前、之後或同時投與或可與其他已知療法(例如抗癌療法，例如輻射)共投與。共投與IL-2抗體、其抗原結合部分或包括本發明之IL-2抗體之抗體：IL-2複合物與治療劑會提供兩種藥劑，該等藥劑經由不同機制發揮作用以可向人類疾病提供治療及或許協同效應。
抗體、抗原結合部分及包括本文所揭示之IL-2抗體之抗體：IL-2複合物可作為治療或診斷工具用於IL-2具有不期望活性之各種情況(例如發炎性病狀(例如自體免疫疾病))或期望免疫阻抑之情況下。在某些實施例中，免疫阻抑療法可準備用於器官或骨髓移植。考慮到涉及發炎性路徑及諸多疾病、病症及病狀中之IL-2，許多該等疾病、病症或病狀尤其適於使用抗體、抗原結合部分或包括本發明之IL-2抗體之抗體：IL-2複合物進行治療。因此，IL-2抗體、其抗原結合部分或包括本發明之IL-2抗體之抗體：IL-2複合物可用於治療或預防IL-2介導之病症或IL-2缺陷病症。另外，本發明提供IL-2抗體、其抗原結合部分或包括本發明之IL-2抗體之抗體：IL-2複合物之用途，其用以製造用於治療或預防IL-2介導之病症或IL-2缺陷病症之藥劑。在另一實施例中，本申請案揭示用於治療IL-2介導之病症或IL-2缺陷病症之IL-2抗體、其抗原結合部分或包括本發明之IL-2抗體之抗體：IL-2複合物。在另一實施例中，本申請案揭示包括IL-2抗體、其抗原結合部分或包括本發明之IL-2抗體之抗體：IL-2複合物之醫藥組合物，其用於治療或預防IL-2介導之疾病或IL-2缺陷病症。在某些實施例中，抗體特異性結合hIL-2。
在某些實施例中，該等疾病包含免疫學疾病，例如移植物抗宿主病。在某些實施例中，疾病可為任一與IL-2有關之疾病，例如肌肉營養不良症及肥胖症。可使用本文所提供之抗體、其抗原結合部分或包括IL-2抗體之抗體：IL-2複合物治療之實例性自體免疫疾病及病症包含(例如)發炎性反應，例如發炎性皮膚病，包含牛皮癬及皮膚炎(例如異位性皮膚炎)；皮肌炎；全身性硬皮症及硬化；與發炎性腸病有關之反應(例如克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎)；呼吸窘迫症候群(包含成人呼吸窘迫症候群及ARDS)；皮膚炎；腦膜炎；腦炎；眼色素層炎；結腸炎；胃炎；腎小球性腎炎；過敏性病狀，例如濕疹及氣喘及其他涉及T細胞浸潤及慢性發炎性反應之病狀；動脈粥樣硬化；白血球黏著缺陷；類風濕性關節炎；全身性紅斑狼瘡(SLE)；糖尿病(例如I型糖尿病)；多發性硬化；雷諾氏症候群；自體免疫甲狀腺炎；過敏性腦脊髓炎；薛格連氏症候群；青少年型糖尿病；及與由通常發現於結核病、類肉瘤病、多肌炎、肉芽腫病及血管炎中之細胞介素及T淋巴球介導之急性及延遲超敏反應有關之免疫反應；韋格納氏病；惡性貧血(阿狄森氏病)；涉及白血球血細胞滲出之疾病；中樞神經系統(CNS)發炎性病症；多器官損傷症候群；溶血性貧血(包含但不限於冷球蛋白血症或庫姆斯陽性貧血)；重症肌無力；抗原-抗體複合物介導之疾病；抗腎小球基底膜病；抗磷脂症候群；過敏性神經炎；格雷夫斯氏病；朗-愛二氏肌無力症候群；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自體免疫多內分泌腺病；白癜風；萊特爾氏病；僵體症候群；貝切特氏病；巨細胞關節炎；免疫複合物腎炎；IgA腎病變；IgM多發性神經病變；免疫型血小板減少性紫斑症(ITP)或自體免疫血小板減少症及自體免疫溶血性疾病；橋本氏甲狀腺炎；自體免疫肝炎；自體免疫血友病；自體免疫淋巴組織增殖性症 候群(ALPS)；自體免疫葡萄膜視網膜炎；格林-巴利症候群；古巴士德氏症候群；混合性結締組織疾病；自體免疫相關性不育；結節性多動脈炎；斑禿；及特發性黏液水腫。在一些實施例中，可使用本發明之組合物及方法治療之病狀係糖尿病(例如I型糖尿病)。在一些實施例中，疾病係I型糖尿病。在一些實施例中，疾病係青少年型糖尿病。
為治療前述病症中之任一者，可以習用方式使用一或多種醫藥上可接受之載劑或賦形劑調配用於本發明之醫藥組合物且如下文更全面所論述進行投與。
治療有效量之抗體、其抗原結合部分或包括本發明之IL-2抗體之抗體：IL-2複合物之測定大大取決於特定患者特性、投與途徑及所治療病症之性質且更全面論述於下文中。
抗體、其抗原結合部分或包括本發明之IL-2抗體之抗體：IL-2複合物之投與及投藥更全面論述於下文其他處。
診斷方法
本文所揭示之IL-2抗體或其抗原結合部分可用於診斷測試及成像。舉例而言，IL-2抗體或其抗原結合部分可用於ELISA分析中。抗體或其抗原結合部分亦可用作經放射性標記之單株抗體。例如參見Srivastava(編輯)，Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy,Plenum Press(1988)；Chase,「Medical Applications of Radioisotopes」,Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Gennaro等人(編輯)，Mack Publishing Co.，第624-652頁(1990)及Brown,「Clinical Use of Monoclonal Antibodies」,Biotechnology and Pharmacy,Pezzuto等人(編輯)，Chapman and Hall，第227-249頁
(1993)；Grossman,1986,Urol.Clin.North Amer.13：465-474；Unger等人，1985,Invest.Radiol.20：693-700；及Khaw等人，1980,Science 209：295-297。此技術(亦稱為免疫閃爍法)使用γ照相機檢測偶聯至單株抗體之γ-發射放射性同位素之位置。可使用診斷成像診斷癌症、自體免疫疾病、傳染病及/或心血管疾病。(例如參見Brown，見上文)
在一實施例中，可使用IL-2抗體或其抗原結合部分診斷IL-2相關疾病、病症或病狀(包含免疫相關疾病)。舉例而言，較其他用途，可尤其使用抗體或其抗原結合部分檢測患者中之IL-2含量。
除診斷外，可使用IL-2抗體或其抗原結合部分監測治療反應，檢測疾病復發，且指導後續臨床決定。
在一些實施例中，出於診斷及監測目的，可藉由使用中間官能基使放射性同位素直接或間接結合至抗體部分。該等中間官能基包含(例如)DTPA(二乙烯三胺五乙酸)及EDTA(乙二胺四乙酸)。遞送至患者之輻射劑量通常維持於儘可能低之值下。此可經由選擇用於最小半衰期、最小體內滯留及允許檢測及精確量測之最小同位素量之最佳組合之同位素來達成。可結合至抗體且適用於診斷成像之放射性同位素之實例包含99mTc及111In。
研究指示，抗體部分、尤其Fab及Fab'提供適宜腫瘤/背景比率。(例如參見Brown，見上文)
IL-2抗體或其抗原結合部分亦可經順磁性離子標記以用於活體內診斷目的。尤其可用於磁共振成像之元素包含Gd、Mn、Dy及Fe離子。
IL-2抗體或其抗原結合部分亦可在活體外檢測IL-2之存在。在該等免疫分析中，抗體或其抗原結合部分可以液相利用或結合至固相載劑。舉例 而言，完整抗體或其抗原結合部分可附接至聚合物(例如胺基右旋糖酐)將抗體組份連接至不溶性載體(例如經聚合物塗覆之珠粒、板或管)。在一些實施例中，用於檢測之IL-2係人類IL-2(hIL-2)。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於0.1ng/mL與1000ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於0.1ng/mL與750ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於0.5ng/mL與500ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於0.5ng/mL與250ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於0.5ng/mL與100ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於0.5ng/mL與50ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於0.5ng/mL與25ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於0.5ng/mL與10ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於0.5ng/mL與5ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於0.5ng/mL與1ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於0.1ng/mL與5ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於0.1ng/mL與1ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於0.8ng/mL與500ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於1ng/mL與500ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於1ng/mL與250ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體 外係以介於1ng/mL與100ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於1ng/mL與50ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於1ng/mL與25ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於1ng/mL與10ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於50ng/mL與500ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於100ng/mL與500ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於250ng/mL與500ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於400ng/mL與500ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於500ng/mL與1,000ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以介於750ng/mL與1000ng/mL之間之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以0.8ng/mL之濃度存在。在一些實施例中，用於檢測之hIL-2在活體外係以500ng/mL之濃度存在。該等量並不意欲具有限制性，且所列舉值之間之增量特定設想為本發明之一部分。
或者，可使用IL-2抗體或其抗原結合部分檢測特定抗原在自組織學樣品之組織切片中之存在。可(例如)藉由將可檢測標記之IL-2抗體或其抗原結合部分施加至組織切片來達成該原位檢測。可使用原位檢測測定特定抗原之存在且測定所檢驗組織中之抗原分佈。熟習此項技術者已熟知原位檢測之中心技術。(例如參見Ponder,「Cell Marking Techniques and Their Application」,Mammalian Development：A Practical Approach,Monk(編輯)，IRL Press，第115-138頁(1987)；Coligan等人，見上文)
可藉由業內熟知之習用方法將可檢測標記(例如酶、螢光化合物、電子轉移劑及諸如此類)連接至載劑。該等標記載劑及自其製得之抗體偶聯物可用於活體外免疫分析及原位檢測，但可藉由將標記直接附接至抗體來製備抗體偶聯物。具有複數個標記之抗體偶聯物之加載可增加免疫分析或組織學程序之敏感性，其中僅達成抗體或抗體部分至靶抗原之低結合程度。
組合物
本發明亦提供包括有效量之本文所闡述之IL-2抗體之醫藥組合物。該等組合物之實例以及其調配方式亦闡述於本文中。在一些實施例中，組合物包括一或多種IL-2抗體。在其他實施例中，IL-2抗體識別IL-2。在其他實施例中，IL-2抗體係人類抗體。在其他實施例中，IL-2抗體係人類化抗體。在一些實施例中，IL-2抗體包括能夠觸發期望免疫反應(例如抗體介導之溶解或ADCC)之恆定區。在其他實施例中，IL-2抗體包括不觸發不期望或不合意免疫反應(例如抗體介導之溶解或ADCC)之恆定區。在其他實施例中，IL-2抗體包括抗體之一或多個CDR(例如一個、兩個、三個、四個、五個或在一些實施例中所有六個CDR)。
應理解，組合物可包括一種以上IL-2抗體(例如識別不同IL-2表位之IL-2抗體之混合物)。其他實例性組合物包括一種以上識別相同表位之IL-2抗體或結合至不同IL-2表位之不同IL-2抗體物質。在一些實施例中，組合物包括識別不同IL-2變體之IL-2抗體之混合物。
本發明中所用之組合物可進一步包括呈凍乾調配物或水溶液形式之醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington：The Science and practice of Pharmacy第20版，2000,Lippincott Williams及Wilkins編 輯，K.E.Hoover)。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在劑量及濃度下對接受者無毒，且可包括緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖酐；鼇合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型表面活性劑，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本文中進一步闡述醫藥上可接受之賦形劑。
IL-2抗體及其組合物亦可與用於增強及/或補充藥劑之有效性之其他藥劑聯合使用。
在某些實施例中，IL-2抗體與IL-2在投與之前複合。在某些實施例中，IL-2抗體與IL-2在投與之前不複合。
本發明亦提供包括本發明之任一多核苷酸之組合物，包含醫藥組合物。在一些實施例中，組合物包括含有編碼如本文所闡述之抗體之多核苷酸之表現載體。在其他實施例中，組合物包括含有編碼本文所闡述之任一抗體之多核苷酸之表現載體。在其他實施例中，組合物包括編碼SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、編碼SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二 者、編碼SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、編碼SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、編碼SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、編碼SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、編碼SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、編碼SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、編碼SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、編碼SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、編碼SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、編碼SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、編碼SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、編碼SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、編碼SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者或編碼SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者。在其他實施例中，組合物包括含有中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37、含有SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、含有SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：41中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、含有SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、含有SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、含有SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47中所展示序列之多核苷酸中 之任一者或二者、含有SEQ ID NO：48及SEQ ID NO：49中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、含有SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：51中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、含有SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：53中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、含有SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：55中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、含有SEQ ID NO：56及SEQ ID NO：57中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、含有SEQ ID NO：58及SEQ ID NO：59中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、含有SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：61中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、含有SEQ ID NO：62及SEQ ID NO：63中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者、含有SEQ ID NO：64及SEQ ID NO：65中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者或含有SEQ ID NO：66及SEQ ID NO：67中所展示序列之多核苷酸中之任一者或二者。
在另一態樣中，多核苷酸可編碼本發明抗體之VH、VL及/或VH及VL二者。亦即，組合物包括編碼本發明之抗體或其抗原結合部分之單一多核苷酸或一種以上多核苷酸。
本發明之醫藥組合物亦可以組合療法(例如與其他藥劑組合)投與。舉例而言，組合療法可包含與至少一種其他療法組合之本發明之IL-2抗體或其抗原結合部分，其中該其他療法可為手術、免疫療法或藥物療法。
本發明醫藥化合物可包含一或多種醫藥上可接受之鹽。該等鹽之實例包含酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包含源自無毒無機酸(例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及諸如此類)以及源自無毒有機酸(例如脂肪族單-及二羧酸、經苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳香族酸、脂肪族及芳香族磺酸及諸如此類)者。鹼加成鹽包含源自鹼土金屬(例 如鈉、鉀、鎂、鈣及諸如此類)以及源自無毒有機胺(例如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因及諸如此類)之彼等。
本發明醫藥組合物亦可包含醫藥上可接受之抗氧化劑。醫藥上可接受之抗氧化劑之實例包含：(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及諸如此類；(2)油溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及諸如此類；及(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及諸如此類。
可用於本發明醫藥組合物中之適宜水性及非水性載劑之實例包含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇及諸如此類)及其適宜混合物、植物油(例如橄欖油)及可注射有機酯(例如油酸乙酯)。舉例而言，藉由使用諸如卵磷脂等包衣材料、維持所需粒徑(在分散劑之情形下)及使用表面活性劑可維持適當流動性。
該等組合物亦可含有佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。藉由滅菌程序並藉由納入各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及諸如此類)二者可確保阻止微生物之存在。該等組合物中亦可期望包含等滲劑，例如糖、氯化鈉及諸如此類。另外，可藉由納入吸收延遲劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現可注射醫藥形式之長效吸收。
通常，醫藥組合物必須無菌且在製造及儲存條件下穩定。可將組合物調配成溶液、微乳液、脂質體或其他適於高藥物濃度之有序結構。載劑 可為溶劑或分散介質，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)及其適宜混合物。可(例如)藉由使用塗層(例如卵磷脂)、在分散液情形中藉由維持所需粒徑且藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。在許多情形下，適於將等滲劑(例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉)包含於組合物中。可藉由在組合物中包含延遲吸收劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來實現可注射組合物之長效吸收。
無菌可注射溶液可藉由以下步驟來製備：將所需量之活性化合物納入含有上文所列舉成份中之一者或組合(視需要)之適當溶劑中，隨後進行無菌微濾。
通常，分散液係藉由將活性化合物納入含有基礎分散介質及來自上文所列舉者之所需其他成份之無菌媒劑中來製備。在使用無菌媒劑來製備無菌可注射溶液之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其可自其預先經無菌過濾之溶液產生由活性成份加上任一所期望其他藥劑構成之媒劑。
本發明之醫藥組合物可以適於經眼投與之調配物來製備、包裝或出售。該等調配物可(例如)呈滴眼劑形式，該滴眼劑包含(例如)活性成份於水性或油性液體載劑中之0.1%-1.0%(w/w)溶液或懸浮液。該等滴劑可進一步包括緩衝劑、鹽或本文所闡述之一或多種其他額外成份。其他有用之可經眼投與調配物包含含有呈微晶形式或呈脂質體製劑形式之活性成份者。
如本文中所使用，「其他成份」包含但不限於下列成份中之一或多者：賦形劑；表面活性劑；分散劑；惰性稀釋劑；造粒劑及崩解劑；黏合劑；潤滑劑；潤濕劑；矯味劑；著色劑；防腐劑；生理學可降解組合物， 例如明膠；水性媒劑及溶劑；油性媒劑及溶劑；懸浮劑；分散劑或潤濕劑；乳化劑、緩和劑；緩衝劑；鹽；增稠劑；填充劑；乳化劑；抗氧化劑；抗生素；抗真菌劑；穩定劑；及醫藥上可接受之聚合或疏水性材料。可包含於本發明之醫藥組合物中之其他「額外成份」為業內已知且闡述於(例如)Remington's Pharmaceutical Sciences,Genaro編輯，Mack Publishing Co.,Easton,PA(1985)(其以引用方式併入本文中)中。
在一實施例中，以靜脈內調配物形式投與IL-2抗體或其抗原結合部分，該靜脈內調配物係呈含有5mg/mL或在一些實施例中約10mg/mL或在一些實施例中約15mg/mL或在一些實施例中約20mg/mL抗體以及乙酸鈉、聚山梨醇酯80及氯化鈉(pH介於約5至6之間)之無菌水溶液形式。在一些實施例中，靜脈內調配物係含有5mg/mL或10mg/mL抗體以及20mM乙酸鈉、0.2mg/mL聚山梨醇酯80及140mM氯化鈉(pH 5.5)之無菌水溶液。另外，包括抗體或其抗原結合部分溶液可較許多其他化合物尤其包括組胺酸、甘露醇、蔗糖、海藻糖、甘胺酸、聚(乙烯)二醇、EDTA、甲硫胺酸及其任一組合及相關技術中已知之許多其他化合物。
在一實施例中，本發明之醫藥組合物包括下列組份：100mg本發明之IL-2抗體或抗原結合部分、10mM組胺酸、5%蔗糖及0.01%聚山梨醇酯80(pH 5.8)。此組合物可以凍乾粉末形式提供。在粉末以全體積重構時，組合物保留相同配方。或者，可以半體積重構粉末，在該情形下，組合物包括100mg本發明之IL-2抗體或其抗原結合部分、20mM組胺酸、10%蔗糖及0.02%聚山梨醇酯80(pH 5.8)。
在一實施例中，藉由靜脈內濃注投與一部分劑量且藉由輸注抗體調配物來投與其餘部分。舉例而言，可以濃注形式給予IL-2抗體或其抗原結 合部分之0.01mg/kg靜脈內注射，且可藉由靜脈內注射投與抗體劑量之其餘部分。可(例如)經一個半小時至兩小時至五小時之時段投與預定劑量之IL-2抗體或其抗原結合部分。
對於治療劑而言，如熟知所業內，在藥劑係(例如)小分子之情形下，其可以生理上可接受之酯或鹽形式存在於醫藥組合物中，例如與生理上可接受之陽離子或陰離子進行組合。
本文所闡述醫藥組合物之調配物可藉由任一已知方法製得或將來在藥理學領域內研發。一般而言，該等製備方法包含以下步驟：使活性成份與載劑或一或多種其他輔助成份混合，且然後視需要或期望使產物成型或包裝為期望單一或多劑量單元。
在一實施例中，本發明組合物係不含熱原之調配物，其實質上不含內毒素及/或相關致熱性物質。內毒素包含限於微生物內部且在該等微生物破裂或死亡時釋放之毒素。致熱性物質亦包含來自細菌及其他微生物外膜之誘導發熱之熱穩定物質(糖蛋白)。該等物質二者若投與人類皆可引起發熱、低血壓及休克。因潛在有害效應，可有利地自經靜脈內投與之醫藥藥物溶液去除極低量之內毒素。食品藥品監督管理局(The Food and Drug Administration)(「FDA」)已設立對於靜脈內藥物施加在單一一小時時段中5個內毒素單位(EU)/劑量/公斤體重之上限(The United States Pharmacopeial Convention,Pharmacopeial Forum 26(1)：223(2000))。在以數百或數千毫克/公斤體重之量投與治療蛋白時，可有利地去除甚至痕量之內毒素。在一實施例中，組合物中之內毒素及熱原含量小於10EU/mg或小於5EU/mg或小於1EU/mg或小於0.1EU/mg或小於0.01EU/mg或小於0.001EU/mg。在另一實施例中，組合物中之內毒素及熱原 含量小於約10EU/mg或小於約5EU/mg或小於約1EU/mg或小於約0.1EU/mg或小於約0.01EU/mg或小於約0.001EU/mg。
在一實施例中，本發明包括投與組合物，其中該投與係經口、非經腸、肌內、鼻內、陰道、直腸、經舌、舌下、經頰、頰內、靜脈內、經皮、皮下或經真皮投與。
在另一實施例中，本發明進一步包括投與組合物與其他療法(例如手術、化學療法、激素療法、生物療法、免疫療法或輻射療法)之組合。
投藥/投與
為製備包含本發明之IL-2抗體或其抗原結合部分之醫藥或無菌組合物，將抗體與醫藥上可接受之載劑或賦形劑混合。可藉由與生理上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合以(例如)凍乾粉末、漿液、水溶液、洗液或懸浮液之形式來製備治療及診斷劑之調配物(例如參見Hardman等人(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams及Wilkins,New York,N.Y.；Avis等人(編輯)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編輯)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編輯)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner及Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.)。
選擇用於治療劑之投與方案取決於若干因素，包含實體之血清或組 織轉換率、症狀之程度、實體之免疫原性及生物基質中靶細胞之易接近性。在某些實施例中，投與方案使與可接受之副效應程度一致之遞送至患者之治療劑的量最大化。因此，所遞送生物製劑之量部分地取決於具體實體及所治療病狀之嚴重程度。可獲得選擇適當劑量之抗體、細胞介素及小分子之導則(例如參見Wawrzynczak,1996,Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(編輯)，1991,Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,N.Y.；Bach(編輯)，1993,Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,N.Y.；Baert等人，2003,New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等人，1999,New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等人，2001,New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等人，2000,New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等人，2003,New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等人，2000,New Engl.J.Med.343：1594-1602)。
適當劑量之確定係由臨床醫師(例如)使用此項技術中已知或懷疑影響治療或預計影響治療之參數或因素來進行。通常，劑量係以稍微小於最佳劑量之量開始且此後以小的增益增加，直至相對於任何不利副效應達成期望或最佳效應為止。重要之診斷量度包含(例如)發炎之症狀或所產生發炎細胞介素之含量。
本發明醫藥組合物中之活性成份之實際劑量值可變以便獲得對特定患者、組合物及投與模式有效達成有期望治療反應之活性成份之量，且對患者無毒。所選劑量值將端視多種藥物動力學因素而定，該等參數包含所用本發明特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投與途徑、投與時間、所 用特定化合物之排泄速率、治療之持續時間、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、身體狀況、一般健康情況及先前病史及已為醫學技術中所熟知之類似因素。
可藉由連續輸注或藉由間隔(例如)一天、一週或每週1-7次之劑量提供包括本發明之IL-2抗體或其抗原結合部分之組合物。可經靜脈內、皮下、局部、經口、經鼻、經直腸、經肌內、經大腦內或藉由吸入提供劑量。具體劑量方案係涉及避免不期望副效應之最大劑量或投藥頻率者。總週劑量可為至少0.05μg/kg體重、至少0.2μg/kg、至少0.5μg/kg、至少1μg/kg、至少10μg/kg、至少100μg/kg、至少0.2mg/kg、至少1.0mg/kg、至少2.0mg/kg、至少10mg/kg、至少15mg/kg、至少20mg/kg、至少25mg/kg或至少50mg/kg(例如參見Yang，等人，2003,New Engl.J.Med.349：427-434；Herold等人，2002,New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu等人，1999,J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji，等人，2003 Cancer.Immunol.Immunother.52：133-144)。劑量可為至少15μg、至少20μg、至少25μg、至少30μg、至少35μg、至少40μg、至少45μg、至少50μg、至少55μg、至少60μg、至少65μg、至少70μg、至少75μg、至少80μg、至少85μg、至少90μg、至少95μg或至少100μg。投與個體之劑量數可為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或更多。
對於本發明之IL-2抗體或其抗原結合部分而言，投與患者之劑量可為0.0001mg/kg至100mg/kg患者體重。劑量可在以下範圍之間：0.0001mg/kg至20mg/kg、0.0001mg/kg至10mg/kg、0.0001mg/kg至5mg/kg、0.0001mg/kg至2mg/kg、0.0001mg/kg至1mg/kg、0.0001 mg/kg至0.75mg/kg、0.0001mg/kg至0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001mg/kg至0.15mg/kg、0.0001mg/kg至0.10mg/kg、0.001mg/kg至0.5mg/kg、0.01mg/kg至0.25mg/kg或0.01mg/kg至0.10mg/kg患者體重。
可使用患者體重(以公斤(kg)計)乘以擬投與劑量(以mg/kg計)來計算IL-2抗體或其抗原結合部分之劑量。本發明抗體之劑量可為150μg/kg或更低、125μg/kg或更低、100μg/kg或更低、95μg/kg或更低、90μg/kg或更低、85μg/kg或更低、80μg/kg或更低、75μg/kg或更低、70μg/kg或更低、65μg/kg或更低、60μg/kg或更低、55μg/kg或更低、50μg/kg或更低、45μg/kg或更低、40μg/kg或更低、35μg/kg或更低、30μg/kg或更低、25μg/kg或更低、20μg/kg或更低、15μg/kg或更低、10μg/kg或更低、5μg/kg或更低、2.5μg/kg或更低、2μg/kg或更低、1.5μg/kg或更低、1μg/kg或更低、0.5μg/kg或更低或0.1μg/kg或更低之患者體重。
本發明之IL-2抗體或其抗原結合部分之單位劑量可為0.1mg至200mg、0.1mg至175mg、0.1mg至150mg、0.1mg至125mg、0.1mg至100mg、0.1mg至75mg、0.1mg至50mg、0.1mg至30mg、0.1mg至20mg、0.1mg至15mg、0.1mg至12mg、0.1mg至10mg、0.1mg至8mg、0.1mg至7mg、0.1mg至5mg、0.1至2.5mg、0.25mg至20mg、0.25至15mg、0.25至12mg、0.25至10mg、0.25至8mg、0.25mg至7mg、0.25mg至5mg、0.5mg至2.5mg、1mg至20mg、1mg至15mg、1mg至12mg、1mg至10mg、1mg至8mg、1mg至7mg、1mg至5mg或1mg至2.5mg。
本發明之IL-2抗體或其抗原結合部分之劑量可在個體中達成以下血 清效價：至少0.1μg/mL、至少0.5μg/mL、至少1μg/mL、至少2μg/mL、至少5μg/mL、至少6μg/mL、至少10μg/mL、至少15μg/mL、至少20μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少125μg/mL、至少150μg/mL、至少175μg/mL、至少200μg/mL、至少225μg/mL、至少250μg/mL、至少275μg/mL、至少300μg/mL、至少325μg/mL、至少350μg/mL、至少375μg/mL或至少400μg/mL。或者，本發明抗體之劑量可在個體中達成以下血清效價：至少0.1μg/mL、至少0.5μg/mL、至少1μg/mL、至少、2μg/mL、至少5μg/mL、至少6μg/mL、至少10μg/mL、至少15μg/mL、至少20μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少125μg/mL、至少150μg/mL、至少175μg/mL、至少200μg/mL、至少225μg/mL、至少250μg/mL、至少275μg/mL、至少300μg/mL、至少325μg/mL、至少350μg/mL、至少375μg/mL或至少400μg/mL。
可重複本發明之IL-2抗體或其抗原結合部分之劑量且投與可相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2個月、75天、3個月或至少6個月。
用於特定患者之有效量可端視諸如以下等因素而有所變化：所治療病狀、患者之整體健康狀況、投與之方法途徑及劑量及副效應嚴重程度(例如參見Maynard等人，1996,A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,FIa.；Dent,2001,Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ,London,UK)。
投與途徑可為(例如)藉由局部或經皮施加、藉由靜脈內、腹膜腔內、大腦內、肌內、眼內、動脈內、腦脊髓內、病灶內注射或輸注或藉由持續 釋放系統或植入體(例如參見Sidman等人，1983,Biopolymers 22：547-556；Langer等人，1981,J.Biomed.Mater.Res.15：167-277；Langer,1982,Chem.Tech.12：98-105；Epstein等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688-3692；Hwang等人，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030-4034；美國專利第6,350466號及第6,316,024號)。若需要，則組合物亦可包含增溶劑及局部麻醉劑(例如利多卡因(lidocaine))以減輕注射位點處之疼痛。另外，亦可採用經肺投與，例如藉由使用吸入器或噴霧器，及與氣溶膠化劑一起調配。例如參見美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第5,985,309號、第5,934,272號、第5,874,064號、第5,855,913號、第5,290,540號及第4,880,078號及PCT公開案第WO 92/19244號、第WO 97/32572號、第WO 97/44013號、第WO 98/31346號及第WO 99/66903號，每一者之全部內容以引用方式併入本文中。在一實施例中，使用Alkermes AIRTM肺部藥物遞送技術(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)投與本發明之IL-2抗體或其抗原結合部分或組合物。
本發明組合物亦可使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者經由一或多個投與途徑投與。如熟習此項技術者應瞭解，投藥途徑及/或模式應端視期望結果而有所變化。用於本發明抗體之所選投與途徑包含靜脈內、肌內、皮內、腹膜腔內、皮下、脊椎或其他非經腸投與途徑，例如藉由注射或輸注。非經腸投與可代表除經腸及局部投與外之投與模式，通常係藉由注射且包含但不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、莢膜內、眶內、心臟內、真皮內、腹膜腔內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。或者，本發明組合物可經由腸道途徑投與，例如局部、表皮或黏膜投與途徑，例如經鼻內、 經口、經陰道、經直腸、經舌下或經局部。
若本發明之IL-2抗體或其抗原結合部分係以受控釋放或持續釋放系統投與，則可使用幫浦達成受控或持續釋放(參見Langer，見上文；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：20；Buchwald等人，1980,Surgery 88：501；Saudek等人，1989,N.Engl.J.Med.321：514)。
可使用聚合材料達成本發明療法之受控或持續釋放(例如參見Medical Applications of Controlled Release,Langer及Wise(編輯)，CRC Pres.,Boca Raton,FIa.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen及Ball(編輯)，Wiley,New York(1984)；Ranger及Peppas,1983,J.,Macromol.ScL Rev.Macromol.Chem.23：61；亦參見Levy等人，1985,Science 11 225：190；During等人，19Z9,Ann.Neurol.25：351；Howard等人，1989,J.Neurosurg.71：105)；美國專利第5,679,377號；美國專利第5,916,597號；美國專利第5,912,015號；美國專利第5,989,463號；美國專利第5,128,326號；PCT公開案第WO 99/15154號；及PCT公開案第WO 99/20253號。用於持續釋放調配物之聚合物之實例包含但不限於聚(甲基丙烯酸2-羥乙基酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚(交酯-共-乙醇酸交酯)(PLGA)及聚原酸酯。在一實施例中，持續釋放調配物中所用聚合物係惰性的、不含可浸出雜質、在儲存時穩定、無菌且生物可降解。可靠近預防或治療靶放置受控或持續釋放系統，由此僅需要一部分全身劑量(例如參見Goodson,Medical Applications of Controlled Release， 見上文，第2卷，第115-138頁(1984))。
受控釋放系統論述於Langer,1990,Science 249：1527-1533之綜述中。可使用熟習此項技術者已知之任一技術來產生包括本發明之一或多種抗體或其偶聯物之持續釋放調配物。例如參見美國專利第4,526,938號、國際專利公開案第WO 91/05548號、WO 96/20698、Ning等人，1996,「Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel」,Radiotherapy and Oncology 59：179-189；Song等人，1995，「Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions」,PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 50：372-397；Cleek等人，1997,「Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application」,Pro.Ml.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；及Lam等人，1997,「Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery」,Proc.Ml.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-160，該等文獻中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
若經局部投與本發明之IL-2抗體或其抗原結合部分，則其可調配成軟膏、乳霜、經皮貼劑、洗劑、凝膠、洗髮精、噴霧劑、氣溶膠、溶液、乳液形式或熟習此項技術者熟知之其他形式。例如參見Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack Pub.Co.,Easton,Pa.(1995)。對於不可噴霧局部劑型而言，通常採用包括與局部施加相容之載劑或一或多種賦形劑且具有在一些情況下比水大之動力學黏度之黏稠至半固體或固體形式。適宜調配 物包含但不限於溶液、懸浮液、乳液、乳霜、軟膏、粉劑、擦劑、油膏及諸如此類，若期望，則其經滅菌或與輔助劑(例如防腐劑、穩定劑、潤濕劑、緩衝劑或鹽)混合以影響多種性質(例如滲透壓)。其他適宜局部劑型包含可噴霧氣溶膠製劑，其中活性成份在一些情況下與固體或液體惰性載劑組合包裝成與加壓揮發物(例如氣態推進劑，例如氟利昂)之混合物或包裝於擠壓瓶中。若期望，則亦可向醫藥組合物及劑型中添加潤濕劑或保濕劑。該等其他成份之實例已為業內熟知。
若經鼻內投與包括IL-2抗體或其抗原結合部分之組合物，則可將其調配成氣溶膠形式、噴霧、霧或滴劑形式。特定而言，根據本發明使用之預防劑或治療劑可藉助適當推進劑(例如二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適宜氣體)便利地以氣溶膠噴霧形式由壓力包或霧化器遞送。在加壓氣溶膠之情形下，可藉由提供閥門遞送計量量來確定劑量單位。用於吸入器或吹入器中之膠囊及藥筒(例如由明膠構成)可經調配含有該化合物與適宜粉末基質(例如乳糖或澱粉)之粉末混合物。
使用第二治療劑(例如細胞介素、類固醇、化學治療劑、抗生素或輻射)共投與或治療之方法在業內已眾所周知(例如參見Hardman等人(編輯)(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill,New York,N.Y.；Poole及Peterson(編輯)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A Practical Approach,Lippincott,Williams及Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner及Longo(編輯)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams及Wilkins,Phila.,Pa.)。有效量之治療劑可將症狀降低至少10%、至少20%、至少約30%、至少40%或至少50%。
可與本發明之IL-2抗體或抗原結合部分組合投與之其他療法(例如預防劑或治療劑)可與本發明抗體以以下方式投與：間隔小於5分鐘、間隔小於30分鐘、間隔1小時、間隔約1小時、間隔約1至約2小時、間隔約2小時至約3小時、間隔約3小時至約4小時、間隔約4小時至約5小時、間隔約5小時至約6小時、間隔約6小時至約7小時、間隔約7小時至約8小時、間隔約8小時至約9小時、間隔約9小時至約10小時、間隔約10小時至約11小時、間隔約11小時至約12小時、間隔約12小時至18小時、間隔18小時至24小時、間隔24小時至36小時、間隔36小時至48小時、間隔48小時至52小時、間隔52小時至60小時、間隔60小時至72小時、間隔72小時至84小時、間隔84小時至96小時或間隔96小時至120小時。可在一個相同患者訪視內投與兩種或更多種療法。
可循環投與本發明之IL-2抗體或其抗原結合部分及其他療法。循環療法涉及投與第一療法(例如第一預防劑或治療劑)一定時間段，隨後投與第二療法(例如第二預防劑或治療劑)一定時間段，視情況隨後投與第三療法(例如預防劑或治療劑)一定時間段等等，且重複此依序投與(亦即循環)以減少對一種療法之抗性產生，避免或減少一種療法之副效應，及/或改良療法效能。
在一實施例中，本發明之IL-2抗體可與用於治療自體免疫疾病及病症之組合物共投與，該等組合物包含但不限於阿德力黴素(adriamycin)、硫唑嘌呤(azathiopurine)、白消安(busulfan)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、環孢素A、癌得星(Cytoxan)、氟達拉濱(fludarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、胺甲喋呤(methotrexate)、嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil)、6-巰基鳥嘌呤、皮質類固醇、非類 固醇抗發炎劑、西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin))及他克莫司(tacrolimus)(FK-506)。在替代實施例中，免疫調節劑或免疫阻抑劑係抗體選自由以下組成之群：莫羅單抗-CD3(muromonab-CD3)、阿倫單抗(alemtuzumab)(Campath®)、巴利昔單抗(basiliximab)、達克珠單抗(daclizumab)、莫羅單抗(OKT3®)、利妥昔單抗(rituximab)、抗胸腺細胞球蛋白及IVIg及熟習此項技術者已知之其他藥劑。
在一實施例中，本發明之IL-2抗體可與用於治療糖尿病之組合物共投與，該等組合物包含但不限於雙胍(例如丁福明(buformin)、二甲雙胍(metformin)及苯乙雙胍(phenform))、激素及其類似物(澱粉素、胰島素、門冬胰島素(insulin aspart)、地特胰島素(insulin detemir)、甘精胰島素(insulin glargine)、谷賴胰島素(insulin glulisine)、賴脯胰島素(insulin lispro)、利拉魯肽(liraglutide)及普蘭林肽(pramlintide))、磺醯脲衍生物(乙酸已脲(acetohexamide)、磺胺丁脲(carbutamide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、格列波脲(glibornuride)、格列齊特(gliclazide)、格列美脲(glimepiride)、格列吡嗪(glipizide)、格列喹酮(gliquidone)、格列派特(glisoxepid)、格列苯脲(glyburide)、格列噻唑(glybuthiazole)、格列丁唑(glybuzole)、格列己脲(glyhexamide)、格列嘧啶(glymidine)、甲磺吖庚脲(tolazamide)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)及甲磺環己脲(tolcyclamide))、噻唑啶二酮(吡格列酮(pioglitazone)、羅格列酮(rosiglitazone)及曲格列酮(troglitazone))、阿卡波糖(acarbose)、艾塞那肽(exenatide)、米格列醇(miglitol)、米格列奈(mitiglinide)、莫格列他(muraglitazar)、那格列奈(nateglinide)、瑞格列奈(repaglinide)、西他列汀(sitagliptin)、特撒格列他(tesaglitazar)、維格列汀(vildagliptin)及伏格 列波糖(voglibose)。
在某些實施例中，可調配本發明之IL-2抗體或其抗原結合部分以確保合理活體內分佈。舉例而言，血腦障壁(BBB)排斥許多高度親水性化合物。為確保本發明之治療性化合物穿過BBB(若期望)，則可將其調配成(例如)脂質體形式。關於製造脂質體之方法參見例如美國專利4,522,811；5,374,548；及5,399,331。脂質體可包含一或多個選擇性轉運至特定細胞或器官中、由此增強靶向藥物遞送之部分(例如參見V.V.Ranade,1989,J.Clin.Pharmacol.29：685)。實例性靶向部分包含葉酸鹽或生物素(例如參見美國專利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗體(P.G.Bloeman等人，1995,FEBS Lett.357：140；M.Owais等人，1995,Antimicrob..Agents Chemother.39：180)；表面活性劑蛋白質A受體(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；pl20(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；亦參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen,1994,FEBS Lett.346：123；Killion；Fidler,1994；Immunomethods 4：273。
本發明提供用於向有需要之個體投與包括本發明之IL-2抗體或其抗原結合部分(單獨或與其他療法組合)之醫藥組合物之方案。本發明組合療法之療法(例如預防劑或治療劑)可並行或依序投與個體。本發明組合療法之療法(例如預防劑或治療劑)亦可循環投與。循環療法涉及投與第一療法(例如第一預防劑或治療劑)一定時間段，隨後投與第二療法(例如第二預防劑或治療劑)一定時間段且重複此依序投與(亦即循環)以減少對一種療法(例如藥劑)之抗性產生，避免或減少一種療法(例如藥劑)之副效應，及/或改良療法效能。
本發明組合療法之療法(例如預防劑或治療劑)可同時投與個體。術語「同時」並不限於在嚴格相同之時間下投與療法(例如預防劑或治療劑)，而係意指以一定序列且在一定時間間隔內將包括本發明之IL-2抗體或其抗原結合部分之醫藥組合物投與個體，從而本發明抗體或其偶聯物可與其他療法一起發揮作用以較其以其他方式投與時提供增加之益處。舉例而言，每一療法可在相同時間或以任一順序在不同時間點依序投與個體；然而，若不在相同時間投與，則其應在時間上充分靠近投與以提供期望治療或預防效應。每一療法可單獨地、以任一適當形式及藉由任何適宜途徑投與個體。在各個實施例中，將療法(例如預防劑或治療劑)以以下方式投與個體：間隔小於15分鐘、間隔小於30分鐘、間隔小於1小時、間隔約1小時、間隔約1小時至約2小時、間隔約2小時至約3小時、間隔約3小時至約4小時、間隔約4小時至約5小時、間隔約5小時至約6小時、間隔約6小時至約7小時、間隔約7小時至約8小時、間隔約8小時至約9小時、間隔約9小時至約10小時、間隔約10小時至約11小時、間隔約11小時至約12小時、間隔24小時、間隔48小時、間隔72小時或間隔1週。在其他實施例中，在相同患者訪視內投與兩種或更多種療法(例如預防劑或治療劑)。
可以同一醫藥組合物將組合療法之預防劑或治療劑投與個體。或者，可以單獨醫藥組合物將組合療法之預防劑或治療劑同時投與個體。可藉由相同或不同投與途徑將預防劑或治療劑投與個體。
套組
本發明亦提供包括本文所闡述之任一或所有抗體之套組。本發明套組包含一或多個包括本文所闡述IL-2抗體之容器及根據本文所闡述之本發明任一方法之使用說明書。通常，該等說明書包括關於投與用於上述治療 性治療之抗體之闡述。在一些實施例中，提供用於產生單一劑量投與單元之套組。在某些實施例中，套組可含有具有乾燥蛋白質之第一容器及具有水性調配物之第二容器。在某些實施例中，包含含有施加器(例如單室及多室預填充注射器(例如液體注射器及凍乾劑注射器(lyosyringe)))之套組。
關於IL-2抗體使用之說明書通常包含關於用於預期治療之劑量、投藥時間表及投與途徑之資訊。容器可為單位劑量、本體包裝(例如多劑量包裝)或亞單位劑量。本發明套組中供應之說明書通常係標記或包裝插頁(例如包含於套組中之紙頁)上之書面說明書，但亦可接受機讀說明書(例如載於磁性或光學存儲盤上之說明書)。
本發明套組係呈適宜包裝。適宜包裝包含但不限於小瓶、瓶、廣口瓶、撓性包裝(例如密封Mylar或塑膠袋)及諸如此類。亦涵蓋與特定裝置(例如吸入器、經鼻投與裝置(例如霧化器)或輸注裝置(例如微型幫浦)組合使用之包裝。套組可具有無菌出入孔(舉例而言，容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子之小瓶)。容器亦可具有無菌出入孔(舉例而言，容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子之小瓶)。該組合物中之至少一種活性劑係本發明之IL-2抗體。容器可進一步包括第二醫藥活性劑。
套組可視情況提供其他組份，例如緩衝液及解釋性資訊。通常，套組包括容器及位於該容器上或與該容器相連之標記或包裝插頁。
本發明亦提供包括本文所闡述之任一或所有抗體之診斷套組。診斷套組可用於(例如)檢測試樣中之IL-2之存在。在一些實施例中，可使用診斷套組鑑別患有可使得處於發生IL-2介導之疾病、病症或病狀或IL-2缺陷 疾病、病症或病狀之潛伏性疾病、病症或病狀之風險下之個體。在一些實施例中，可使用診斷套組檢測在懷疑患有IL-2介導之疾病或IL-2缺陷疾病、病症或病狀之個體中IL-2之存在及/或含量。
本發明之診斷套組包含一或多個包括本文所闡述IL-2抗體之容器及根據本文所闡述之本發明任一方法之使用說明書。通常，該等說明書包括關於使用IL-2抗體檢測在處於IL-2介導之疾病或IL-2缺陷疾病、病症或病狀風險下或懷疑患有該疾病、病症或病狀之個體中IL-2之存在之闡述。在一些實施例中，實例性診斷套組可經構形以含有試劑(例如IL-2抗體)、陰性對照試樣、陽性對照試樣及使用套組之指導。
等效內容
前述闡述及下列實例詳述本發明之某些具體實施例且闡述由發明者涵蓋之最佳模式。然而，應瞭解，無論可能出現在文本中之上述內容如何詳盡，本發明可以許多方式實踐且應根據隨附申請專利範圍及其任何等效內容來解釋本發明。
儘管已參照各種應用、方法、套組及組合物來闡述所揭示教示內容，但應瞭解，可作出各種變化及修改，此並不背離本文之教示內容及下文之所主張揭示內容。提供下列實例以更佳地闡釋所揭示教示內容且並不意欲限制本文所呈現教示內容之範圍。儘管已針對該等實例性實施例闡述本教示內容，但熟習此項技術者易於理解，無需過多實驗即可對該等實例性實施例作出諸多改變及修改。所有該等改變及修改皆在本教示內容之範圍內。
本文所引用之所有參考文獻(包含專利、專利申請案、文件、教科書及諸如此類及其中所引用之參考文獻)以其尚未獲得之程度其全部內容以 引用方式併入本文中。若所納入文獻及類似材料中之一或多者與本申請案(包含但不限於所定義術語、術語使用、所闡述技術或諸如此類)不同或衝突，則應以本申請案為準。
實例性實施例
藉由參照下列實驗實例來進一步詳細闡述本發明。除非另外指定，否則該等實例係僅出於闡釋目的而提供，且並不意欲具有限制性。因此，本發明決不應解釋為限於下列實例，而應解釋為涵蓋因本文所提供之教示而變得明瞭之任何及所有變化形式。
實例 實例1. IL-2抗體結合動力學及親和力
藉由表面電漿共振使用Biacore T200儀器(GE Healthcare,Piscataway,NJ)來測定抗體對IL-2之親和力。在CM5感測器晶片上藉由使用Biacore人類抗體捕獲套組根據製造指導(GE Healthcare)製得之抗人類IgG捕獲抗IL-2 IgG。在使用Biacore小鼠抗體捕獲套組根據製造指導(GE Healthcare)製得之抗小鼠IgG捕獲表面上捕獲小鼠抗人類IL-2純系5344(純系5344.111，BD Biosciences)。在25℃下使用30μL/分鐘流速在0.01M pH 7.4 HEPES、0.15M NaCl及0.005% v/v表面活性劑P20(HBS-P)緩衝液中實施實驗。在每一循環之後，使用3M MgCl2再生晶片表面且捕獲新抗體。將重組IL-2(Humanzyme,Chicago,IL)注射於表面上保持3分鐘且進一步監測締合20分鐘。使用Biacore T200評估軟體分析數據，將來自僅具有固定捕獲抗體之毗鄰對照流動槽之信號進行背景扣除，且對用於每一抗體之僅緩衝液注射液進行背景扣除。使用1：1蘭格繆爾(Langmuir)結合模型擬合所有結合曲線。
結果
所測試人類抗體以介於536pM至13.4nM之間之親和力結合至IL-2(表3)。與比對純系16C3及d1C7相比，經鑑別能夠抑制IL-2Rβ結合且相對於dIC7/IL-2複合物降低IL-2Rα結合之抗體對IL-2具有較弱親和力。已發現，5344抗體具有超出Biacore儀器之檢測限值之極穩定解離速率，假設所計算親和力為50pM或更低，其中解離速率顯著慢於所測試人類抗體純系。5344之顯著減緩之解離速率可導致抗體不具有由本申請案在下文所闡述其他hIL-2抗體所展現之期望Treg保護性質(實例5)。
*解離速率位於儀器之規定之外，假設解離速率為5.0E-05或更小
使用抗體F5.1.11、d1C7、13A10及16C3之mIL-2及hIL-2結合研究指示，F5.1.11及d1C7不結合至mIL-2且13A10及16C3以小於hIL-2之親和力結合mIL-2(數據未展示)。
實例2. IL-2/抗體複合物受體結合
使用Biacore T200儀器(GE Healthcare,Piscataway,NJ)評價抗體修飾IL-2結合至IL-2受體IL-2Rα及IL-2Rβ之能力。對重組IL-2α及IL-2Rβ蛋 白質進行生物素標記且捕獲於Biacore鏈黴抗生物素蛋白晶片(GE Healthcare)上。在25℃下使用10μL/分鐘流速在10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl及0.005% v/v表面活性劑P20緩衝液中實施實驗。將IL-2(333nM)與IgG(1000nM)一起預培育至少20分鐘。將IL-2/抗體複合物注射於受體偶合之晶片表面上保持60秒且使其解離20分鐘。使用毗鄰對照流動槽及僅緩衝液注射液對數據進行背景扣除。將反應報告為在60秒之後至IL-2α及IL-2Rβ之結合，且單位為兩種代表性純系d1C7及16C3(呈與IL-2之複合物形式)分別至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合之百分比。
結果
純系16C3/IL-2複合物結合IL-2Rβ但不結合IL-2Rα，而d1C7/IL-2複合物結合至IL-2Rα但不結合IL-2Rβ。使用該兩種抗體/IL-2複合物作為代表性純系以針對IL-2Rα及IL-2Rβ結合正規化。將每一測試抗體/IL-2複合物報告為其至每一受體之相對結合。純系4.7.062、F5.1.11、F4.7.6、F4.7.8、F5.1.9及市售5344(純系5344.111，BD Biosciences)皆類似於d1C7/IL-2複合物抑制IL-2至IL-2Rβ之結合且展示小於d1C7/IL-2複合物之IL-2Rα結合。因此，該等抗體可鑑別為能夠阻斷IL-2至IL-2Rβ之結合且減小至IL-2Rα之結合速率(圖1)。
實例3.親和力成熟純系之抗體/IL-2親和力及受體結合
使用表面電漿共振量測親和力成熟F5.1.11之抗體/IL-2複合物結合動力學及受體結合特徵，如針對親代抗體(實例1)所闡述。
結果
親和力成熟活動將純系F5.1.11對IL-2之表觀結合親和力增加最高16倍。經量測，三種親和力成熟變體F5.1.11.02、F5.1.11.04及F5.1.11.08分 別具有114pM、624pM及205pM之對IL-2之結合親和力。抗體/IL-2複合物至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合之表徵發現，與親代分子相比，較高親和力變體之受體結合特徵得以維持。親代及親和力成熟純系展示完全抑制抗體/IL-2複合物至IL-2Rβ之結合且與純系d1C7/IL-2複合物相比減小至IL-2Rα之結合。據觀察，在實驗過程中，親代F5.1.11/IL-2至IL-2Rα之結合略有變化，此由圖形上之虛線表示以繪示潛在範圍。三種較高親和力變體F5.1.11.02、F5.1.11.04及F5.1.11.08皆在此範圍內(表4及圖2)。
實例4. Treg在IL-2：抗IL-2 mAb治療之後之表型 IL-2-抗IL-2複合物治療
藉由ficoll自健康供體分離PBMC且使用12.5ng/mL抗CD3及25ng/mL抗CD28過夜活化。在過夜培育之後，收穫細胞且在PBS中深度洗滌並以30×106個細胞之濃度再懸浮於200μL PBS中。將PBMC經靜脈內注射至NSG接受者中。在37℃下經30分鐘向注射人類PBMC之NSG小鼠經腹膜腔內注射與25μg同型、25μg 16C3、1μg、5μg或25μg Ab F5.1.11.02複合之8,000U hIL-2(Proleukin)並持續5天。
脾細胞分離及細胞染色
使用CO2將小鼠處死且收穫脾細胞，且使用抗人類CD45太平洋橙(Pacific Orange)、CD4 PercPCy 5.5、CD3 PeCy7/太平洋藍(Pacific Blue)/PercP、CD25 APC-Cy7/Pe、CD238 Pe、CD39 PeCy7、CD8 APC-H7、Ki67 Pe、NKG2D PeCy7、CD44 V450在細胞外染色並使用抗人類Helios FITC及FoxP3 APC在細胞內染色。經標記抗體係購自BD PharMingen或Ebioscience。使用Fortessa流式細胞儀(運行使用FLOWJO軟體分析及呈遞之FACSDiva(BD Biosciences)及FSC 3.0文件)分析經染色單一細胞懸浮液。
結果
抗體16C3與hIL-2之複合物增加了脾中之Treg百分比。亦因應於使用兩個不同劑量(5μg及25μg)抗體F5.1.11.02進行治療觀察到Treg百分比中之增量增加。在hCD45+ CD3+ CD4+ Helios+ FoxP3+細胞上選通Treg群體(圖3)。16C3及F5.1.11.02與hIL-2之複合物增加了Treg/Teff及Treg/NK細胞比率。
16C3(25μg)與hIL-2之複合物增加了Treg/CD4、Treg/CD8及Treg/NK細胞比率。在第一實驗中使用最低劑量(1μg)之F5.1.11.02進行治療不展示比率增加。另外，據觀察，因應於5μg及25μg F5.1.11.02與hIL-2之複合物，Treg/CD4、Treg/CD8及Treg/NK細胞比率顯著增加(圖4A-C)。在第二實驗中，針對16C3及5μg及25μg F5.1.11.02觀察到相同結果，且另外，使用低劑量之F5.1.11.02(1μg)亦顯著增加比率(圖4D-F)。16C3及F5.1.11.02與hIL-2之複合物皆增加Teff及Treg總細胞數量。在兩個實驗中，16C3(25μg)與hIL-2之複合物增加脾中之CD4+、CD8+細胞及Treg之總數。
F5.1.11.02與hIL-2之複合物亦展示CD4+、CD8+及Treg總細胞數量有所增加。該效應在第一實驗中於5μg及25μg F5.1.11.02之劑量下更為 明顯(圖5A-C)。第二實驗展示CD4+、CD8+細胞及Treg之總數因應於F5.1.11.02以劑量依賴性方式有所增加(圖5D-F)。使用F5.1.11.02之治療亦誘導Treg上之CD25、Icos及FoxP3平均螢光強度(MFI)有所增加，此效應在16C3存在下觀察不到(圖6A-C)。
實例5.抗IL-2抗體抑制pSTAT5
收穫來自C57Bl6之在Foxp3啟動子控制下表現GFP之脾細胞，處理成單一細胞懸浮液，且再懸浮於RPMI 0.1% BSA中。使細胞在37℃下於組織培養培育器中靜置直至分析時(1-2小時)。
自人類Trima residuals(Blood Centers of the Pacific)純化PBMC且再懸浮於RPMI 0.1% BSA中。使細胞在37℃下於組織培養培育器中靜置直至分析時(1-2小時)。
IL-2誘導之pSTAT5分析
將PBMC或脾細胞平鋪於96孔V形板中，從而在每孔中於50μL體積(RPMI,0.1% BSA)中具有100萬個細胞。將板返回37℃培育器中以維持溫度。滴定抗體(JES6-1(JES6-1A12 eBioscience)或抗人類IL-2)，且在以下4個濃度下測試IL-2：500ng/mL、50ng/mL、5ng/mL及0.5ng/mL。
市售小鼠IL-2單株抗體JES6-1阻斷IL-2之IL2Rα及IL2Rβ界面(León等人，2013,「Mathematical models of the impact of IL2 modulation therapies on T cell dynamics」,Frontiers in Immunology,4：439，其全部內容以引用方式併入本文中)。JES6-1結合mIL-2且不結合hIL-2，此乃因表位在hIL-2中不保守。用於使JES6-1結合至IL-2之關鍵胺基酸殘基(包含mIL-2殘基Q36及E37，其對應於hIL-2殘基Q22及M23)詳述於Spangler等人，2015,「Antibodies to Interleukin-2 Elicit Selective T Cell Subset Production through Distinct Conformational Mechanisms」,Immunity,42：815(其全部內容以引用方式併入本文中)之圖3、4、S2、S3及S4中。mIL-2/mIL-2Rβ之KD由Spangler等人報告為>7μM，且mIL-2/mIL-2Rα之KD弱於hIL-2 2-4倍。小鼠及人類IL-2胺基酸序列之比對可在Yokota等人，1985,「Use of a cDNA expression vector for isolation of mouse interleukin 2 cDNA clones：Expression of T-cell growth-factor activity after transfection of monkey cells」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：68(其全部內容以引用方式併入本文中)之圖6中獲得。
將等體積(50μL)之2×IL2：抗體複合物(在37℃下製備1hr)添加至孔中，且將細胞在37℃培育器中培養40分鐘。藉由添加100μL IC固定緩衝劑(eBioscience)來固定細胞。在固定15分鐘之後，將細胞洗滌且儲存於FACs緩衝液(PBS+0.2%BSA)中直至染色。
自分析板離心出糰粒細胞，且使用滲透緩衝液III(BD Biosciences)再懸浮細胞，隨後在冰上培育30分鐘。將細胞在FACs緩衝液中洗滌2次，且使用來自eBioscience之下列Ab針對PBMC進行染色：抗人類CD3 APC e780、CD4 Percp e710及CD127(PE)。CD8 FITC、CD25(PeCy7)、FoxP3(e660)及pSTAT5(太平洋藍(Pacific blue))係購自BD Biosciences。對於脾細胞而言，使用來自eBioscience之下列抗小鼠抗體：CD4 e660及CD8a PeCy7。將pSTAT5太平洋藍(BD Biosciences)用於小鼠細胞及人類細胞。
在LSR Fortessa上收集數據，且使用FlowJo軟體分析。將數據繪圖為背景扣除之MFI，正規化至每一細胞類型之最大信號(500ng/mL IL2+同型)。將背景定義為未刺激但染色之pSTAT5。將人類Treg定義為 CD3+CD8-CD4+CD25hiCD127lo。將小鼠Treg定義為CD8- CD4+Foxp3.GFP+細胞。
結果 PBMC中之pSTAT5抑制：F5.1.11親和力變體
F5.1.11之親和力變體顯示，對IL-2具有增加之親和力之抗體(例如F5.1.11.02及F5.1.11.08)可更有效地抑制CD8+效應T細胞及非Treg CD4+ T細胞中之pSTAT5信號傳導。在5-500ng/mL之IL-2濃度下，Treg pSTAT5維持為大於50%。在IL-2測試之最低濃度(0.5ng/mL)下，Treg中之pSTAT5含量經抑制低於最大信號之50%，然而，pSTAT5在所有Ab濃度下仍可檢測到(圖7A-V)。亦在pSTAT5信號傳導分析中測試5344抗體，且Treg pSTAT5在低IL-2濃度下不再可檢測到(數據未展示)。
JES6-1及抗體F5.1.11.02之比對
類似於同型對照，小鼠IL-2抗體JES6-1在所測試大部分IL-2濃度下保護Treg pSTAT5信號傳導(圖8A-F)。與之相比，在小鼠CD8+ T細胞中，在所測試之所有IL-2濃度下，IL-2誘導之pSTAT5信號傳導由JES6-1強烈抑制。此數據與公開觀察一致，亦即JES6-1與IL-2之複合物在活體內促進Treg細胞之生長。
在所測試抗大部分IL-2濃度下，人類IL-2抗體F5.1.11.02大大保護人類Treg pSTAT5信號傳導。在所測試之所有IL-2濃度下，CD8+ T細胞pSTAT5由IL-2抗體F5.1.11.02抑制。總而言之，IL-2抗體F5.1.11.02在CD8及Treg中之pSTAT5抑制模式類似於使用小鼠IL-2抗體JES6-1之觀察。
在表5中，使用來自圖8A-F之pSTAT5%最大值生成使用同型或抗 IL-2抗體處理之Treg或CD8細胞之曲線下面積值。列示每一IL-2濃度之Treg/CD8 AUC比率。在同型處理試樣中，降低量之IL-2使得AUC比率有所增加，從而反映Treg中之pSTAT5信號傳導大於CD8+效應細胞。儘管絕對數有所不同，但此觀察在小鼠細胞與人類細胞之間一致。
在較高IL-2濃度下，JES6-1處理使比率移向Treg。AUC比率之類似變化出現於使用F5.1.11.02抗體處理之人類細胞中。
總而言之，F5.1.11.02似乎與JES6-1具有類似pSTAT5信號傳導特徵。
抗體表位對CD25hi CD8 + T細胞之pSTAT5抑制之影響
一些周邊CD8+ T細胞表現CD25(IL-2Rα)。如圖10A-B中所展示，若基於CD25表現來選通細胞，則CD25hi CD8細胞對低含量之IL-2更為敏感。可由此需要IL-2抗體之CD25結合阻斷(完全或部分)以抑制CD25hi CD8+ T細胞中之pSTAT5信號傳導。
如圖9中所展示，由低劑量之IL-2(0.8ng/mL)誘導之pSTAT5由阻斷 IL-2Rα至IL-2之結合之IL-2抗體(例如13A10或F5.1.11.02)最佳地抑制。相反，高濃度IL-2(500ng/M1)，很可能無需存在IL-2Rα來使得能夠信號傳導)由阻斷IL-2至IL-2Rβ之結合之抗體(例如d1C7或F5.1.11.02)最佳地抑制。在一定範圍之IL-2濃度下，抗體F5.1.11.02能夠最佳地抑制CD8+效應T細胞中之pSTAT5信號傳導。
藉由IL-2抗體F5.1.9之pSTAT5抑制
評價IL-2抗體F5.1.9及變體F5.1.9.5之pSTAT5抑制(圖11A-H)。F5.1.9之親和力變體F5.1.9.5可以大於其抑制Treg中之pSTAT5信號傳導之程度來有效抑制CD8+效應T細胞中之pSTAT5信號傳導。F5.1.9.5 k a (M-1s-1)為1.23E+06，k d (s-1)為8.18E-04，且KD(M)為6.63E-10。
實例6.NOD mIL-2 -/- hIL-2 +/-小鼠之生成
改造含有小鼠IL-2之細菌人工染色體(BAC)(純系RP23-290D8)以表現人類IL-2編碼序列。在BAC中進行下列修飾：使小鼠IL-2啟動子、5’及3’UTR及內含子保持完整；使用人類信號肽代替小鼠信號肽；使用人類序列代替外顯子1中位於信號肽下游之3’半、外顯子2及3；使用人類編碼序列代替外顯子4之5’半。
隨後經由前核注射將經改造BAC轉移至FVB/NJ(朋友病毒B)雌性小鼠(Jackson)之受精卵母細胞中。然後將受精卵母細胞移植至FVB雌性小鼠中以生成FVB mIL-2 +/+ hIL-2 BAC +小鼠。為生成缺乏mIL2表現之NOD背景小鼠，將FVB mIL-2 +/+ hIL-2 BAC +小鼠與NOD mIL-2 -/-小鼠回交。將自此初始繁殖生成之NOD mIL-2 -/- hIL-2 BAC +/-小鼠與NOD mIL-2 -/-小鼠回交8代以生成患有I型糖尿病之小鼠。將所獲得小鼠用於實驗中。
方法
在ACK溶解之後，使用PMA/離子黴素過夜刺激全血(100μL)，收集上清液(125μL)且針對mIL-2(50μL)及hIL-2(50μL)(ELISA：ebioscience)實施ELISA。
在14週齡時，向雌性NOD mIL2 -/- hIL2 +/-小鼠注射且使其經5天接受8,000IU hIL-2(Proleukin)與25μg同型或5μg或25μg F5.1.11.02抗體之複合物之腹膜腔內注射。藉由將IL-2及抗體在37℃下一起培育30分鐘來形成IL2：抗體複合物。
不同器官之分離及細胞染色
使用CO2將小鼠處死且立即經由左心室使用PBS灌注直至流出物變澄清為止。收穫脾細胞及胰淋巴結(pLN)且使用CD25 PeCy7、CD4 BV605、CD8 PercP-Cy5.5、CD44 Pe、CD62L Al647實施細胞外染色，並使用FoxP3 FITC實施細胞內染色。
藉由以下方式來製備全胰臟：在37℃下使用0.8mg/mL膠原酶P及20μg/mL DNase(Roche)消解30分鐘，隨後切碎。在消解之後，藉由使用40μm細胞濾網將均質物過濾兩次，且使用CD45 PercP Cy5.5、CD25 Pe、CD4 PeCy7、CD8 Al647、Thy1.2 BV605實施細胞外染色，並使用FoxP3 FITC實施細胞內染色。經標記抗體係購自BD Pharmingen或Ebioscience。分析經染色單一細胞懸浮液且使用FLOWJO軟體呈遞。
結果 人類IL-2轉基因(hIL-2 Tg)小鼠之表型
使用PMA/離子黴素活體外刺激小鼠脾細胞(圖12A-B)證實自轉基因小鼠產生人類IL-2，但所產生人類IL-2之含量低於來自野生型小鼠之小鼠 IL2。hIL-2 Tg/mIL-2-/-小鼠表現地較為健康且有活力。然而，與NOD或NOD mIL-2+/-小鼠相比，hIL-2Tg小鼠具有增加百分比之活化(CD44+CD62L-)CD4+或CD8+ T細胞(圖13A-B)。儘管Treg頻率類似於NOD或NOD mIL-2+/-小鼠，但來自hIL-2 Tg小鼠之Treg具有降低之CD25細胞表面表現(圖14)。
使用F5.1.11.02：hIL-2複合物治療hIL-2 Tg小鼠
使用F5.1.11.02：IL-2複合物治療hIL-2 Tg小鼠，如上所述(方法)。治療在第7天不會增加脾之整體細胞性，且在5μg治療組中觀察到總脾細胞略有降低(圖15)。與所有器官(除pLN同型外)中之對照相比，因應於使用二種劑量之F5.1.11.02與hIL-2之複合物之治療，觀察到Treg百分比有所增加，其中在胰臟中之增加更為顯著(圖16A-I)。在脾及pLN中，在CD4+ CD25+ FoxP3+細胞上選通Treg群體且在胰臟Treg細胞中藉由選通於CD45+ Thy1.2+ CD4+ CD25+ FoxP3+細胞上來進行鑑別。
在使用複合物治療之後，在脾及pLN中觀察到CD4、CD8及Treg總細胞數量有所降低。然而，在胰臟中，F5.1.11.02複合物治療誘導Treg總細胞數量因應於25μg劑量之F5.1.11.02略有增加。在胰臟中觀察到CD4及CD8總細胞數量無差異(數據未展示)。
使用F5.1.11.02(25μg)與hIL-2之複合物治療hIL-2 Tg小鼠誘導脾中之Treg/CD4及Treg/CD8細胞比率顯著增加(圖17A-F)。在胰臟中觀察到相同結果，其中使用5μg及25μg F5.1.11.02觀察到Treg/CD4及Treg/CD8之比率顯著增加。F5.1.11.02：IL2複合物治療對胰淋巴結中之細胞比率具有較小效應。
最後，使用F5.1.11.02：IL-2複合物(5μg及25μg F5.1.11.02)治療 huIL2 Tg小鼠在所有器官中誘導Treg上之CD25平均螢光強度(MFI)有所增加(圖18A-C)。此增加在胰臟中尤其顯著，其中在治療之前Treg CD25 MFI極低。
使用CTV之NSG實驗
藉由ficoll自健康供體分離PBMC且使用12.5ng/mL抗CD3及25ng/mL抗CD28過夜活化。在過夜活化之後，收穫細胞且使用CellTrace Violet(Life technology)以1μL CTV/10×106個細胞之濃度標記。在染色之後，在PBS中深度洗滌細胞並以30×106個細胞之濃度再懸浮於200μL PBS中。將PBMC經靜脈內注射至NSG接受者中。在37℃下經30分鐘以指示量向注射人類PBMC之NSG小鼠經腹膜腔內注射與同型或抗體複合之8,000U hIL-2(Proleukin)並持續5天。
脾細胞分離及細胞染色
在第3天及第5天使用CO2將小鼠處死且收穫脾細胞，且使用抗人類CD45太平洋橙、CD4 PercPCy5.5、CD25Pe、CD8 APC-H7、NKG2D PeCy7實施細胞外染色並使用抗人類Helios FITC及FoxP3 APC實施細胞內染色。經標記抗體係購自BD PharMingen或Ebioscience。使用Fortessa流式細胞儀(運行使用FLOWJO軟體分析及呈遞之FACSDiva(BD Biosciences)及FSC 3.0文件)分析經染色單一細胞懸浮液。
結果
使用25μg F5.1.11.02與hIL-2之複合物進行治療在第5天誘導總脾細胞數量有所增加，但在第3天不能(圖19A-B)。
F5.1.11.02抗體：IL-2複合物亦能夠在第5天增加脾中之Teff及Treg總細胞數量(圖20A-F)及Treg/CD4及Treg/CD8比率(圖21A-D)，此結果不能 在第3天觀察到。在hCD45+ CD3+ CD4+ Helios+ FoxP3+細胞上選通Treg群體。
藉由在轉移及治療之前包含CTV標記觀察到，使用F5.1.11.02抗體：IL-2複合物進行治療與同型相比誘導Treg增殖(在第3天即已明顯之效應)且到第5天時使得未分裂細胞之數量有所降低(圖22A-H)。亦藉由使用F5.1.11.02抗體：IL-2複合物進行治療來增加CD8 T細胞增殖，然而，此結果僅在第5天較為顯著且較Treg群體較大數量之未分裂細胞得以保留(圖23A-H)。總而言之，此CTV數據證實，隨著觀察到Treg/CD8比率發生偏移，Treg增殖亦潛在增加。
最後，在脾中，與同型對照相比，使用二個劑量之複合物進行治療會誘導增加Treg及CD8群體上之CD25平均螢光強度(MFI)(圖24A-B)。然而，CD25在Treg上之絕對表現高於CD8細胞許多倍。
在追蹤實驗中，比較F5.1.11.02與較低親和力之「親代」抗體F5.1.11。將劑量範圍延伸至125μg抗體與hIL2之複合物以評價較高劑量之較低親和力抗體是否具有相當之活體內效應。在125μg下，等效於25μg F5.1.11.02，F5.1.11對Treg及CD8細胞數量、增加之Treg/CD8比率及細胞性具有相當效應(圖25A-D、26A-C及33A-B)。此同樣可藉由增加之Treg增殖來證實，如在CTV稀釋中所觀察(圖27A-H、28A-H及38A-B)。預計F5.1.11.02在活體外類似地增加人類Treg上之Foxp3及CD25蛋白質含量。
實例7. 食蟹猴IL-2之IL-2抗體結合親和力
在哺乳動物細胞中表現重組食蟹猴(長尾獼猴(Macaca fascicularis))IL-2且使用固定金屬離子親和力層析(IMAC)純化。使用表面電漿共振量 測抗體對食蟹猴IL-2(1-100nM)之親和力，如針對人類IL-2所闡述(實例1)。使用1：1蘭格繆爾結合模型擬合結合曲線或自濃度-反應曲線計算穩態親和力常數。在針對1-100nM IL-2所觀察之濃度-反應關係不足以計算表觀結合親和力之情形下，將純系指定為「極弱」。
結果
所測試之人類抗體純系以介於516pM至不能量化於此分析中之極弱締合之間的親和力結合至食蟹猴IL-2(表6)。所測試大部分純系係基於抑制IL-2Rβ結合之能力進行選擇(實例2及3)，該等純系展示在與人類IL-2相比時顯著損失對食蟹猴IL-2之親和力。16C3(據觀察抑制IL-2Rα結合(實例2))展示等效結合至人類及食蟹猴IL-2。該等結果與結構分析一致，後者發現人類IL-2與食蟹猴IL-2之間之不同區域在IL-2Rβ結合位點及F5.1.11抗體純系之表位內(實例9)。
*解離速率位於儀器之規定之外，假設解離速率為5.0E-05或更小。
實例8. IL-2/Fab複合物受體結合親和力
使用Biacore T200儀器(GE Healthcare,Piscataway,NJ)量測IL-2Rα對IL-2或IL-2/F5.1.11 Fab複合物之親和力。對重組IL-2α實施生物素標記 且捕獲於Biacore鏈黴抗生物素蛋白晶片(GE Healthcare)上。在25℃下使用10μL/分鐘流速在10mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl及0.005% v/v表面活性劑P20緩衝液中實施實驗。將IL-2(1-50nM)或IL-2/F5.1.11 Fab(1-500nM IL-2，使用過量Fab預複合)以30μL/分鐘注射於受體偶合晶片表面上保持120秒且使其解離5分鐘。使用毗鄰對照流動槽及僅緩衝液注射液對數據進行背景扣除。自平衡下之濃度-反應關係計算相互作用之親和力。
結果
IL-2/F5.1.11 Fab複合物以低於非配體化IL-2之親和力結合至IL-2Rα。複合物及非配體化IL-2之平衡結合分析發現，結合IL-2之F5.1.11 Fab之親和力弱於IL-2Rα大約7倍(9.97nM與70.1nM)(圖29A-B)。此結果與IL-2/抗體複合物受體結合分析中所觀察之減小之結合(實例2)及IL-2/F5.1.11 Fab晶體結構之分析(實例9)一致。
實例9. 結合至人類IL-2之F5.1.11 Fab之晶體結構 介白素-2表現及純化
如(Rickert等人，2004)所闡述來純化全長IL-2(殘基1-133)。簡言之，將基因選殖至pAcgp67A載體中，與該載體之gp67A信號序列同框，且後接C-末端六組胺酸標籤(SEQ ID NO：223)。使用草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)細胞生成高效價重組病毒。使用病毒感染Insect Xpress培養基(Lonza)中所生長之粉紋夜蛾(Trichopulsia ni)(High-Five)細胞且使其在28℃下表現蛋白質48小時。藉由Ni-NTA純化蛋白質且使用羧肽酶A及B在4℃下消解過夜，然後在Superdex 200凝膠過濾管柱(GE Healthcare)上純化。
含有介白素-2之5.1.11 Fab複合物之結晶
將F5.1.11 Fab與1.5倍過量之IL-2混合且藉由FPLC在Superdex 200管柱(GE Healthcare)上純化複合物。將經純化Fab/IL-2複合物濃縮至10mg/mL，如在280nm下使用1.49mL*mg-1*cm-1之消光係數所量測。將複合物與等體積之沈澱劑溶液(100mM pH 5.0檸檬酸鈉；20%聚乙二醇6000)混合且藉由坐滴蒸發擴散在沈澱劑溶液之儲槽中來實施結晶。在一週內形成棱柱形晶體。藉由添加甘油至30%(v/v)來冷凍保護晶體，收穫，且藉由投入液氮中來快速冷卻。
晶體學數據收集及精修
在Advanced Light Source Beamline 8.2.1(Berkeley,CA)下收集繞射數據。以空間群P21使用晶胞尺寸a=86.01Å、b=145.73Å、c=107.32Å、β=95.38°來指定晶體。使用2.75Å之最大解析度進行結構解析及精修。藉由分子代替使用程式Phaser來解析結構(McCoy等人，2007)。研究模型包含來自PDB條目3U1S之重鏈恆定結構域、來自4NPY之重鏈可變結構域、來自3N9G之輕鏈恆定結構域、來自4HP0之輕鏈可變結構域及來自2B5I之介白素-2(Wang等人，2005；McLellan等人，2011；Ogata等人，2013；Sok等人，2013；Kaufmann等人)。以不對稱單元對4個拷貝之Fab/IL-2複合物進行建模。藉由人工重建及精修之迭代循環使用程式Coot(Emsley等人，2010)及PHENIX(Adams等人，2010)來構建結構。藉由在Coot中目測檢查且使用PISA(Krissinel及Henrick，2005；2007)來分析蛋白質-蛋白質相互作用。利用I-TASSER(Roy等人，2010；Yang等人，2015)使用人類apo-IL-2(PDB ID 1M47(Arkin等人，2003))作為模板來製備食蟹猴(長尾獼猴)IL-2之同源性模型。
結果
F5.1.11與IL-2在螺旋A及C及B-C環處經由輕鏈CDR1及CDR3環及重鏈CDR2及CDR3環相互作用(圖30)。與IL-2/IL-2Rβ/γc/CD25四級結構(PDB ID 2B5I)之比對揭示，F5.1.11遮蔽IL-2之IL-2Rβ結合位點，但不遮蔽CD25或γc結合位點。IL-2之整體結構類似於結合前結構(RMSD 0.359Å，95個Cα原子)。顯著干擾發生於F5.1.11結合IL-2之B-C環之情形下；此干擾擴散至毗鄰IL-2 A-B環(圖31)。因A-B環形成四元複合物中之CD25結合位點之一部分，故此移動可闡釋F5.1.11/IL-2對CD25之降低之親和力。
為闡釋F5.1.11至食蟹猴IL-2之弱交叉反應性，基於結合前人類IL-2結構生成食蟹猴IL-2之同源性模型。儘管序列係95%一致，但食蟹猴IL-2之B-C環中之插入似乎很可能破壞與輕鏈CDR1殘基(Ala30、Ser31、Asn32及Tyr33)及重鏈CDR3殘基(Gly105及Asp106)之相互作用(圖32)。
為改良mAb F5.1.11.02至非人類靈長類動物IL-2之結合，基於F5.1.11 Fab/hIL-2晶體結構來選擇側鏈接觸在人類IL-2與食蟹猴IL-2之間有所變化之IL-2環之靶mAb殘基。藉由PCR使用編碼19個胺基酸(不包含半胱胺酸)之簡並寡核苷酸將對應於重鏈中CDRH3之殘基Gly105、Asp106及輕鏈中CDRL1之Ala30、Ser31、Asn32、Tyr33的密碼子以組合方式進行隨機化。藉由表面顯示方法篩選結合至食蟹猴IL-2及人類IL-2之呈scFv格式之所得文庫。
實例10.藉由IL-2複合物抗IL-2：IL-2複合物治療來緩解糖尿病
藉由ficoll自健康供體分離PBMC且使用12.5ng/mL抗CD3及25ng/mL抗CD28過夜活化。在過夜培育之後，收穫細胞且使用CellTrace Violet(Life technology)以1μL CTV/10×106個細胞之濃度標記。在染色之後，在PBS中深度洗滌細胞並以30×106個細胞之濃度再懸浮於200μL PBS中。將PBMC經靜脈內注射至NSG接受者中。藉由將同型或抗IL-2抗體以指示濃度與8000U人類IL2(Proleukin)一起在37℃下培育30分鐘來形成抗體：IL-2複合物。使注射人類PBMC之NSG小鼠接受每天抗體：IL-2複合物之腹膜腔內注射且持續5天。
脾細胞分離及細胞染色
使用CO2將小鼠處死且收穫脾細胞，且使用抗人類CD45太平洋橙、CD4 PercPCy 5.5、CD3 PeCy7/太平洋藍/PercP、CD25 APC-Cy7/Pe、CD238 Pe、CD39 PeCy7、CD8 APC-H7、Ki67 Pe、NKG2D PeCy7、CD44 V450在細胞外染色並使用抗人類Helios FITC及FoxP3 APC在細胞內染色。根據製造商說明書使用FoxP3緩衝液套組(eBioscience)進行固定及滲透，然後進行細胞內染色。經標記抗體係購自BD PharMingen或Ebioscience。使用Fortessa流式細胞儀(運行使用FLOWJO軟體分析及呈遞之FACSDiva(BD Biosciences)及FSC 3.0文件)分析經染色單一細胞懸浮液。
藉由IL2複合物緩解糖尿病
使用與125μg同型或125μg F5.1.11.02複合之8,000U hIL-2(Proleukin)及與5μg JES6-1(Ebioscience)複合之0.5μg mIL2(Ebioscience)將自發新發作糖尿病NOD小鼠(介於250mg/dl與350mg/dl之間之一個血糖濃度)治療5天。隨時間監測血糖濃度。
在緩解1週之後，將一些小鼠處死且分析胰臟。藉由以下方式來製備全胰臟：在37℃下使用0.8mg/mL膠原酶P及20μg/mL DNase(Roche)消 解30分鐘，隨後切碎。在消解之後，藉由使用40μm細胞濾網將均質物過濾兩次，且使用CD45 PercP Cy5.5、CD25 Pe、CD4 PeCy7、CD8 Al647、Thy1.2 BV605進行細胞外染色，並使用FoxP3 FITC進行細胞內染色。經標記抗體係購自BD Pharmingen或Ebioscience。分析經染色單一細胞懸浮液且使用FLOWJO軟體呈遞。
結果
使用F5.1.11.02與hIL2之複合物(F5.1.11.02：IL2複合物)進行治療會誘導脾中Treg百分比之增加。在hCD45+ CD3+ CD4+ Helios+ FoxP3+細胞上選通Treg群體。F5.1.11.02抗體：IL-2複合物增加Treg總細胞數量，但亦觀察到總CD4及CD8細胞數量有所增加(圖35A-B)。總而言之，Treg/CD4及Treg/CD8之比率(圖36A)以劑量依賴性方式有所增加。該效應在1μg劑量下開始顯著。
藉由在轉移及治療之前包含CTV標記，據觀察，使用F5.1.11.02抗體：IL-2複合物進行治療會與同型相比誘導增加Treg之增殖。藉由使用F5.1.11.02抗體：IL-2複合物進行治療，CD8 T細胞增殖亦有所增加，然而，較Treg群體，較大數量之未分裂細胞保留於CD8群體中(圖36B)。總而言之，此CTV數據證實，隨著觀察到Treg/CD8比率發生偏移，Treg增殖亦潛在增加。
在脾中，與同型對照相比，使用所有劑量之複合物進行治療會誘導增加Treg及CD8群體上之CD25平均螢光強度(MFI)。然而，CD25在Treg上之絕對表現高於CD8細胞許多倍(圖37A-B)。另外，在使用F5.1.11.02：IL-2複合物治療之後，亦觀察到Treg上之FoxP3 MFI有所增加(圖38)。總而言之，該等數據表明，擴增之Treg維持表型及功能。
活體外數據已表明，阻斷IL2Rb至IL-2之結合之抗IL2抗體能夠更佳地促進差異Treg擴增。為直接測試此假設，對阻斷IL-2：IL-2Rα阻斷劑(16C3.4)、IL2Rβ阻斷劑(d1C7)及亦減小IL2至IL-2Rα之結合之IL2Rβ阻斷劑(F5.1.11.02)上之不同受體表位的抗體進行比較。所有三種抗體與hIL2之複合物皆增加Treg細胞數量，且亦以較小程度增加CD4及CD8細胞數量。因應於16C3.4之CD8細胞數量之增加遠大於任一IL-2Rb阻斷抗體(d1C7或F5.1.11.02)(圖39A)。
與改變之細胞數量一致，d1C7及F5.1.11.02：IL-2複合物展示Treg/CD4及Treg/CD8比率有所增加，此在使用16C3.4時未觀察到(圖39B)。使用d1C7及F5.1.11.02之複合物進行治療會增加Treg及CD8上之CD25 MFI，然而，在使用d1C7時CD8上之CD25表現較高，從而表明F5.1.11.02可對Treg具有更大選擇性(圖40)。
最後，評價投與F5.1.11.02：IL-2複合物5天是否可有效治癒NOD小鼠之臨床糖尿病。值得注意的是，此治療在1週內在50%之小鼠中誘導糖尿病緩解且大部分小鼠在實驗之4週持續時間中保持血糖正常。JES6-1：小鼠IL-2複合物提供小於F5.1.11.02之治癒性效應且因應於同型未觀察到效應(圖41)。
為確定F5.1.11.02抗體：IL-2複合物效應是否與胰臟中之Treg數量及特性之改變相關，在緩解1週之後量化胰臟中之其比例。據觀察，在使用F5.1.11.02之複合物治療之後，胰臟Treg之百分比顯著增加。亦觀察到，使用複合物進行治療涉及增加與Treg細胞功能有關之標記物(例如CD25及FoxP3)之表現，此在使用同型對照時未觀察到(圖42)。總而言之，該等數據表明，在治療之後胰臟中之Treg增加可控制至糖尿病小鼠中至破壞性 胰島炎之進展。
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在下列編號段落中陳述本發明之特定實施例：
1. 一種特異性結合人類IL-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體結合hIL-2之螺旋A及C及B-C環。
2. 一種經分離抗體或其抗原結合部分，其與包括SEQ ID NO：13及14之胺基酸序列之抗體競爭結合至人類IL-2(hIL-2)或與其結合hIL-2之相同表位。
3. 一種特異性結合人類IL-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體將hIL-2至IL-2Rα之結合親和力減小1至199倍。
4. 如段落3之抗體或抗原結合部分，其中該抗體將hIL-2至IL-2Rα之該結合親和力減小10倍。
5. 一種特異性結合人類IL-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體減小hIL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合，且以高於調控T(Treg)細胞中之程度抑制CD8+ T細胞中之活性。
6. 一種特異性結合人類介白素-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體減小hIL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合，且以高於調控T(Treg)細胞中之程度抑制CD8+ T細胞中之STAT5磷酸化。
7. 一種特異性結合人類介白素-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體減小hIL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合，且增加調控T(Treg)細胞對CD8+或CD4+ T細胞或對NK細胞之比率，如在末梢血單核細胞(PBMC)培養或重構分析中所量測。
8. 一種特異性結合人類介白素-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體減小hIL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合，且增加調控T(Treg)細胞中之FOXP3、CD25及Icos中之一或多者之表現。
9. 如段落1至8中任一項之經分離抗體或抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分具有下列性質中之至少一者：a)以大於約4.53×10-4s-1之解離速率結合至hIL-2；及b)以大於約1.14×10-10M之KD結合至hIL-2。
10. 如段落1至9中任一項之抗體或抗原結合部分，其中該抗體係人類抗體。
11. 如段落1至10中任一項之抗體或抗原結合部分，其包括：(a)HCDR1，其包括SEQ ID NO：73(Kabat)、74(Chothia)或75(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：76(Kabat)或77(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：78；LCDR1，其包括SEQ ID NO：79；LCDR2，其包括SEQ ID NO：80；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：81；(b)HCDR1，其包括SEQ ID NO：82(Kabat)、83(Chothia)或84(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：85(Kabat)或86(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：87；LCDR1，其包括SEQ ID NO：88；LCDR2，其包括SEQ ID NO：89；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：90；(c)HCDR1，其包括SEQ ID NO：91(Kabat)、92(Chothia)或93(延 伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：94(Kabat)或95(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：96；LCDR1，其包括SEQ ID NO：97；LCDR2，其包括SEQ ID NO：98；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：99；(d)HCDR1，其包括SEQ ID NO：100(Kabat)、101(Chothia)或102(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：103(Kabat)或104(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：105；LCDR1，其包括SEQ ID NO：106；LCDR2，其包括SEQ ID NO：107；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：108；(e)HCDR1，其包括SEQ ID NO：109(Kabat)、110(Chothia)或111(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：112(Kabat)或113(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：114；LCDR1，其包括SEQ ID NO：115；LCDR2，其包括SEQ ID NO：116；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：117；(f)HCDR1，其包括SEQ ID NO：118(Kabat)、119(Chothia)或120(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：121(Kabat)或122(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：123；LCDR1，其包括SEQ ID NO：124；LCDR2，其包括SEQ ID NO：125；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：126；(g)HCDR1，其包括SEQ ID NO：127(Kabat)、128(Chothia)或129(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：130(Kabat)或131(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：132；LCDR1，其包括SEQ ID NO：133；LCDR2，其包括SEQ ID NO：134；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：135； (h)HCDR1，其包括SEQ ID NO：136(Kabat)、137(Chothia)或138(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：139(Kabat)或140(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：141；LCDR1，其包括SEQ ID NO：142；LCDR2，其包括SEQ ID NO：143；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：144；(i)HCDR1，其包括SEQ ID NO：145(Kabat)、146(Chothia)或147(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：148(Kabat)或149(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：150；LCDR1，其包括SEQ ID NO：151；LCDR2，其包括SEQ ID NO：152；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：153；(j)HCDR1，其包括SEQ ID NO：154(Kabat)、155(Chothia)或156(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：157(Kabat)或158(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：159；LCDR1，其包括SEQ ID NO：160；LCDR2，其包括SEQ ID NO：161；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：162；(k)HCDR1，其包括SEQ ID NO：163(Kabat)、164(Chothia)或165(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：166(Kabat)或167(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：168；LCDR1，其包括SEQ ID NO：169；LCDR2，其包括SEQ ID NO：170；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：171；(l)HCDR1，其包括SEQ ID NO：172(Kabat)、173(Chothia)或174(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：175(Kabat)或176(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：177；LCDR1，其包括SEQ ID NO：178； LCDR2，其包括SEQ ID NO：179；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：180；(m)HCDR1，其包括SEQ ID NO：181(Kabat)、182(Chothia)或183(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：184(Kabat)或185(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：186；LCDR1，其包括SEQ ID NO：187；LCDR2，其包括SEQ ID NO：188；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：189；(n)HCDR1，其包括SEQ ID NO：190(Kabat)、191(Chothia)或192(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：193(Kabat)或194(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：195；LCDR1，其包括SEQ ID NO：196；LCDR2，其包括SEQ ID NO：197；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：198；(o)HCDR1，其包括SEQ ID NO：199(Kabat)、200(Chothia)或201(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：202(Kabat)或203(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：204；LCDR1，其包括SEQ ID NO：205；LCDR2，其包括SEQ ID NO：206；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：207；(p)HCDR1，其包括SEQ ID NO：208(Kabat)、209(Chothia)或210(延伸)；HCDR2，其包括SEQ ID NO：211(Kabat)或212(Chothia)；HCDR3，其包括SEQ ID NO：213；LCDR1，其包括SEQ ID NO：214；LCDR2，其包括SEQ ID NO：215；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：216；或(q)HCDR1，其包括SEQ ID NO：217；HCDR2，其包括SEQ ID NO：218；HCDR3，其包括SEQ ID NO：219；LCDR1，其包括SEQ ID NO：220；LCDR2，其包括SEQ ID NO：221；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：222。
12. 如段落1至10中任一項之抗體或抗原結合部分，其包括：(a)重鏈可變結構域(VH)，其包括：i)如表7中所展示之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或71中之HCDR3；或ii)如表7中所展示之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或71中之HCDR1至3；或(b)輕鏈可變結構域(VL)，其包括：i)如表7中所展示之SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或72中之LCDR3；或ii)如表7中所展示之SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或72中之LCDR1至3。
13. 一種特異性結合人類介白素-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其包括含有以下之重鏈可變結構域(VH)：a)如表7中所展示之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71中之HCDR3；b)如表7中所展示之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71中之HCDR1至3；或c)SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71之胺基酸序列。
14. 一種特異性結合人類介白素-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原 結合部分，其包括含有以下之輕鏈可變結構域(VL)：a)如表7中所展示之SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中之LCDR3；b)如表7中所展示之SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中之LCDR1至3；或c)SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72之胺基酸序列。
15. 一種特異性結合人類IL-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體分別包括如表7中所展示之以下中之HCDR1至3及LCDR1至3胺基酸序列：SEQ ID NO：1及2，SEQ ID NO：3及4，SEQ ID NO：5及6，SEQ ID NO：7及8，SEQ ID NO：9及10，SEQ ID NO：11及12，SEQ ID NO：13及14，SEQ ID NO：15及16，SEQ ID NO：17及18，SEQ ID NO：19及20，SEQ ID NO：21及22，SEQ ID NO：23及24，SEQ ID NO：25及26， SEQ ID NO：27及28，SEQ ID NO：29及30，SEQ ID NO：31及32，或SEQ ID NO：71及72。
16. 如段落15之分離抗體或抗原結合部分，其中該抗體包括以下之胺基酸序列：SEQ ID NO：1及2，SEQ ID NO：3及4，SEQ ID NO：5及6，SEQ ID NO：7及8，SEQ ID NO：9及10，SEQ ID NO：11及12，SEQ ID NO：13及14，SEQ ID NO：15及16，SEQ ID NO：17及18，SEQ ID NO：19及20，SEQ ID NO：21及22，SEQ ID NO：23及24，SEQ ID NO：25及26，SEQ ID NO：27及28，SEQ ID NO：29及30，SEQ ID NO：31及32，或SEQ ID NO：71及72。
17. 如段落15或16之抗體或抗原結合部分，其中該抗體係IgG抗體。
18. 如段落17之抗體或抗原結合部分，其進一步包括含有SEQ ID NO：33之胺基酸序列之重鏈恆定區。
19. 如段落17之抗體或抗原結合部分，其進一步包括含有不含C-末端離胺酸之SEQ ID NO：33之胺基酸序列之重鏈恆定區。
20. 如段落18或19之抗體或抗原結合部分其進一步包括含有SEQ ID NO：34或35之胺基酸序列之輕鏈恆定區。
21. 一種經分離核酸，其編碼如段落11至20中任一項之抗體或抗原結合部分之重鏈、輕鏈或二者。
22. 一種經分離核酸，其編碼特異性結合人類介白素-2(hIL-2)之抗體或其抗原結合部分之重鏈、輕鏈或二者，其中該核酸包括：a)SEQ ID NO：36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64或66之核苷酸序列；b)SEQ ID NO：37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65或67之核苷酸序列；或c)下列核苷酸序列對中之一者：SEQ ID NO：36及37，SEQ ID NO：38及39，SEQ ID NO：40及41，SEQ ID NO：42及43，SEQ ID NO：44及45，SEQ ID NO：46及47， SEQ ID NO：48及49，SEQ ID NO：50及51，SEQ ID NO：52及53，SEQ ID NO：54及55，SEQ ID NO：56及57，SEQ ID NO：58及59，SEQ ID NO：60及61，SEQ ID NO：62及63，SEQ ID NO：64及65，或SEQ ID NO：66及67。
23. 一種載體，其包括如段落21或22之核酸。
24. 一種宿主細胞，其包括如段落21或22之核酸或如段落23之載體。
25. 如段落24之宿主細胞，其中該細胞係哺乳動物細胞。
26. 一種產生特異性結合人類介白素-2(hIL-2)之抗體或其抗原結合部分之方法，該方法包括：a)在容許表現該抗體或抗原結合部分之條件下培養如段落24或25之宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼該抗體或抗原結合部分之重鏈及輕鏈之核苷酸序列，及b)自培養物分離該抗體或抗原結合部分。
27. 一種特異性結合人類介白素-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體與如段落16之抗體或抗原結合部分競爭結合至hIL-2，或與其結合至相同表位。
28. 如段落27之抗體或抗原結合部分，其中該抗體包括分別與下列胺基酸序列至少95%一致之VH胺基酸序列及VL胺基酸序列：SEQ ID NO：1及2，SEQ ID NO：3及4，SEQ ID NO：5及6，SEQ ID NO：7及8，SEQ ID NO：9及10，SEQ ID NO：11及12，SEQ ID NO：13及14，SEQ ID NO：15及16，SEQ ID NO：17及18，SEQ ID NO：19及20，SEQ ID NO：21及22，SEQ ID NO：23及24，SEQ ID NO：25及26，SEQ ID NO：27及28，SEQ ID NO：29及30，或SEQ ID NO：31及32。
29. 一種醫藥組合物，其包括如段落1至20、27及28中任一項之抗體或抗原結合部分及醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
30. 一種治療人類個體之發炎性病狀之方法，其包括向該個體投與有效量之如段落1至20、27及28中任一項之抗體或抗原結合部分或如段落29之醫藥組合物。
31. 一種在有需要之人類個體中誘導免疫阻抑之方法，其包括向該個體投與有效量之如段落1至20、27及28中任一項之抗體或抗原結合部分或如段落29之醫藥組合物。
32. 如段落1至20、27及28中任一項之抗體或抗原結合部分或如段落29之醫藥組合物，其用於治療患有發炎性病狀或需要免疫阻抑之人類個體。
33. 一種如段落1至20、27及28中任一項之抗體或抗原結合部分之用途，其用以製造用於在有需要之人類個體中治療發炎性病狀或誘導免疫阻抑之藥劑。
34. 如段落30或31之方法、如段落32之抗體、部分或醫藥組合物或如段落33之用途，其中該個體患有自體免疫疾病或移植物抗宿主病。
35. 如段落30或31之方法、如段落32之抗體、部分或醫藥組合物或如段落33之用途，其中以與IL-2之複合物形式投與該抗體或部分。
36. 如段落30或31之方法、如段落32之抗體、部分或醫藥組合物或如段落33之用途，其中該個體患有糖尿病。
37. 如段落30或31之方法、如段落32之抗體、部分或醫藥組合物或如段落33之用途，其中該個體患有I型糖尿病。
38. 一種組合物，其包括與人類IL-2複合之如段落1至20、27及27中任一項之抗體或抗原結合部分。
39. 一種醫藥組合物，其包括與人類IL-2複合之如段落1至20、27及28中任一項之抗體或抗原結合部分及醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
40. 一種治療人類個體之發炎性病狀之方法，其包括向該個體投與有效量之與人類IL-2複合之如段落1至20、27及28中任一項之抗體或抗原 結合部分、如段落29之醫藥組合物、如段落38之組合物或如段落39之醫藥組合物。
41. 一種特異性結合人類介白素-2(hIL-2)之經分離抗體F5.1.11.02或其抗原結合部分，其中該抗體包括：重鏈可變結構域(VH)，其包括由在ATCC登錄號___________下寄存之質體之cDNA插入體編碼之胺基酸序列；及/或輕鏈可變結構域(VL)，其包括藉由在ATCC登錄號____________下寄存之質體之cDNA插入體編碼之胺基酸序列。
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<213> 智人
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<213> 長尾獼猴
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Claims (29)

  1. 一種特異性結合人類IL-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體結合hIL-2之螺旋A及C及B-C環。
  2. 一種特異性結合人類IL-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體將hIL-2至IL-2Rα之結合親和力減小1至199倍。
  3. 如請求項2之抗體或抗原結合部分，其中該抗體將hIL-2至IL-2Rα之該結合親和力減小10倍。
  4. 一種特異性結合人類IL-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體：(a)減小hIL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合，且以高於調控T(Treg)細胞中之程度抑制CD8+ T細胞中之活性；(b)減小hIL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合，且以高於調控T(Treg)細胞中之程度抑制CD8+ T細胞中之STAT5磷酸化；(c)減小hIL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合，且增加調控T(Treg)細胞對CD8+或CD4+ T細胞或對NK細胞之比率，如在末梢血單核細胞(PBMC)培養或重構分析中所量測；或(d)減小hIL-2至IL-2Rα及IL-2Rβ之結合，且增加調控T(Treg)細胞中之FOXP3、CD25及Icos中之一或多者之表現。
  5. 如請求項1之經分離抗體或抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分具有下列性質中之至少一者：a)以大於約4.53×10-4s-1之解離速率結合至hIL-2；及b)以大於約1.14×10-10M之KD結合至hIL-2。
  6. 如請求項1之抗體或抗原結合部分，其中該抗體係人類抗體。
  7. 一種特異性結合人類IL-2之經分離抗體或其抗原結合部分，該抗體包括：(i)(a)HCDR1，其包括SEQ ID NO：73、74或75；HCDR2，其包括SEQ ID NO：76或77；HCDR3，其包括SEQ ID NO：78；LCDR1，其包括SEQ ID NO：79；LCDR2，其包括SEQ ID NO：80；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：81；(b)HCDR1，其包括SEQ ID NO：82、83或84；HCDR2，其包括SEQ ID NO：85或86；HCDR3，其包括SEQ ID NO：87；LCDR1，其包括SEQ ID NO：88；LCDR2，其包括SEQ ID NO：89；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：90；(c)HCDR1，其包括SEQ ID NO：91、92或93；HCDR2，其包括SEQ ID NO：94或95；HCDR3，其包括SEQ ID NO：96；LCDR1，其包括SEQ ID NO：97；LCDR2，其包括SEQ ID NO：98；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：99；(d)HCDR1，其包括SEQ ID NO：100、101或102；HCDR2，其包括SEQ ID NO：103或104；HCDR3，其包括SEQ ID NO： 105；LCDR1，其包括SEQ ID NO：106；LCDR2，其包括SEQ ID NO：107；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：108；(e)HCDR1，其包括SEQ ID NO：109、110或111；HCDR2，其包括SEQ ID NO：112或113；HCDR3，其包括SEQ ID NO：114；LCDR1，其包括SEQ ID NO：115；LCDR2，其包括SEQ ID NO：116；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：117；(f)HCDR1，其包括SEQ ID NO：118、119或120；HCDR2，其包括SEQ ID NO：121或122；HCDR3，其包括SEQ ID NO：123；LCDR1，其包括SEQ ID NO：124；LCDR2，其包括SEQ ID NO：125；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：126；(g)HCDR1，其包括SEQ ID NO：127、128或129；HCDR2，其包括SEQ ID NO：130或131；HCDR3，其包括SEQ ID NO：132；LCDR1，其包括SEQ ID NO：133；LCDR2，其包括SEQ ID NO：134；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：135；(h)HCDR1，其包括SEQ ID NO：136、137或138；HCDR2，其包括SEQ ID NO：139或140；HCDR3，其包括SEQ ID NO：141；LCDR1，其包括SEQ ID NO：142；LCDR2，其包括SEQ ID NO：143；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：144；(i)HCDR1，其包括SEQ ID NO：145、146或147；HCDR2，其包括SEQ ID NO：148或149；HCDR3，其包括SEQ ID NO：150；LCDR1，其包括SEQ ID NO：151；LCDR2，其包括SEQ ID NO：152；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：153；(j)HCDR1，其包括SEQ ID NO：154、155或156；HCDR2， 其包括SEQ ID NO：157或158；HCDR3，其包括SEQ ID NO：159；LCDR1，其包括SEQ ID NO：160；LCDR2，其包括SEQ ID NO：161；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：162；(k)HCDR1，其包括SEQ ID NO：163、164或165；HCDR2，其包括SEQ ID NO：166或167；HCDR3，其包括SEQ ID NO：168；LCDR1，其包括SEQ ID NO：169；LCDR2，其包括SEQ ID NO：170；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：171；(l)HCDR1，其包括SEQ ID NO：172、173或174；HCDR2，其包括SEQ ID NO：175或176；HCDR3，其包括SEQ ID NO：177；LCDR1，其包括SEQ ID NO：178；LCDR2，其包括SEQ ID NO：179；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：180；(m)HCDR1，其包括SEQ ID NO：181、182或183；HCDR2，其包括SEQ ID NO：184或185；HCDR3，其包括SEQ ID NO：186；LCDR1，其包括SEQ ID NO：187；LCDR2，其包括SEQ ID NO：188；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：189；(n)HCDR1，其包括SEQ ID NO：190、191或192；HCDR2，其包括SEQ ID NO：193或194；HCDR3，其包括SEQ ID NO：195；LCDR1，其包括SEQ ID NO：196；LCDR2，其包括SEQ ID NO：197；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：198；(o)HCDR1，其包括SEQ ID NO：199、200或201；HCDR2，其包括SEQ ID NO：202或203；HCDR3，其包括SEQ ID NO：204；LCDR1，其包括SEQ ID NO：205；LCDR2，其包括SEQ ID NO：206；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：207； (p)HCDR1，其包括SEQ ID NO：208、209或210；HCDR2，其包括SEQ ID NO：211或212；HCDR3，其包括SEQ ID NO：213；LCDR1，其包括SEQ ID NO：214；LCDR2，其包括SEQ ID NO：215；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：216；或(q)HCDR1，其包括SEQ ID NO：217；HCDR2，其包括SEQ ID NO：218；HCDR3，其包括SEQ ID NO：219；LCDR1，其包括SEQ ID NO：220；LCDR2，其包括SEQ ID NO：221；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：222；(ii)重鏈可變結構域(VH)，其包括：a)如表7中所展示之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或71中之HCDR3；或b)如表7中所展示之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或71中之HCDR1至3；(iii)輕鏈可變結構域(VL)，其包括：a)如表7中所展示之SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或72中之LCDR3；或b)如表7中所展示之SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或72中之LCDR1至3；(iv)重鏈可變結構域(VH)，其包括：a)如表7中所展示之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71中之HCDR3；b)如表7中所展示之SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71中之HCDR1至3；或 c)SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或71之胺基酸序列；(v)輕鏈可變結構域(VL)，其包括：a)如表7中所展示之SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中之LCDR3；b)如表7中所展示之SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72中之LCDR1至3；或c)SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或72之胺基酸序列；(vi)如以下中所展示之HCDR1至3及LCDR1至3胺基酸序列：a)分別SEQ ID NO：1及2；b)分別SEQ ID NO：3及4；c)分別SEQ ID NO：5及6；d)分別SEQ ID NO：7及8；e)分別SEQ ID NO：9及10；f)分別SEQ ID NO：11及12；g)分別SEQ ID NO：13及14；h)分別SEQ ID NO：15及16；i)分別SEQ ID NO：17及18；j)分別SEQ ID NO：19及20；k)分別SEQ ID NO：21及22；l)分別SEQ ID NO：23及24；m)分別SEQ ID NO：25及26； n)分別SEQ ID NO：27及28；o)分別SEQ ID NO：29及30；p)分別SEQ ID NO：31及32；或q)分別SEQ ID NO：71及72；如表7中所展示；(vii)如以下中所展示之胺基酸序列：a)分別SEQ ID NO：1及2；b)分別SEQ ID NO：3及4；c)分別SEQ ID NO：5及6；d)分別SEQ ID NO：7及8；e)分別SEQ ID NO：9及10；f)分別SEQ ID NO：11及12；g)分別SEQ ID NO：13及14；h)分別SEQ ID NO：15及16；i)分別SEQ ID NO：17及18；j)分別SEQ ID NO：19及20；k)分別SEQ ID NO：21及22；l)分別SEQ ID NO：23及24；m)分別SEQ ID NO：25及26；n)分別SEQ ID NO：27及28；o)分別SEQ ID NO：29及30；p)分別SEQ ID NO：31及32；或q)分別SEQ ID NO：71及72。
  8. 如請求項7之抗體或抗原結合部分，其中該抗體係IgG抗體。
  9. 如請求項8之抗體或抗原結合部分，其進一步包括重鏈恆定區，該重鏈恆定區包括含有或不含C-末端離胺酸之SEQ ID NO：33之胺基酸序列。
  10. 如請求項7(vii)(g)之抗體或抗原結合部分，其進一步包括含有SEQ ID NO：35之胺基酸序列之輕鏈恆定區。
  11. 一種經分離核酸，其編碼如請求項7之抗體或抗原結合部分之重鏈、輕鏈或二者。
  12. 一種經分離核酸，其編碼特異性結合人類介白素-2(hIL-2)之抗體或其抗原結合部分之重鏈、輕鏈或二者，其中該核酸包括：a)SEQ ID NO：36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64或66之核苷酸序列；b)SEQ ID NO：37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65或67之核苷酸序列；或c)下列核苷酸序列對中之一者：SEQ ID NO：36及37，SEQ ID NO：38及39，SEQ ID NO：40及41，SEQ ID NO：42及43，SEQ ID NO：44及45， SEQ ID NO：46及47，SEQ ID NO：48及49，SEQ ID NO：50及51，SEQ ID NO：52及53，SEQ ID NO：54及55，SEQ ID NO：56及57，SEQ ID NO：58及59，SEQ ID NO：60及61，SEQ ID NO：62及63，SEQ ID NO：64及65，或SEQ ID NO：66及67。
  13. 一種載體，其包括如請求項12之核酸。
  14. 一種宿主細胞，其包括如請求項13之核酸。
  15. 如請求項14之宿主細胞，其中該細胞係哺乳動物細胞。
  16. 一種產生特異性結合人類介白素-2(hIL-2)之抗體或其抗原結合部分之方法，該方法包括：a)在容許表現該抗體或抗原結合部分之條件下培養如請求項15之宿主細胞，其中該宿主細胞包括編碼該抗體或抗原結合部分之重鏈及輕鏈之核苷酸序列，及 b)自培養物分離該抗體或抗原結合部分。
  17. 一種特異性結合人類介白素-2(hIL-2)之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該抗體與如請求項7之抗體或抗原結合部分競爭結合至hIL-2，或與其結合至相同表位。
  18. 如請求項17之抗體或抗原結合部分，其中該抗體包括分別與如請求項7(vii)(g)之胺基酸序列至少95%一致之VH胺基酸序列及VL胺基酸序列。
  19. 一種醫藥組合物，其包括如請求項7之抗體或抗原結合部分及醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
  20. 一種治療人類個體之發炎性病狀之方法，其包括向該個體投與有效量之如請求項7之抗體或抗原結合部分。
  21. 一種在有需要之人類個體中誘導免疫阻抑之方法，其包括向該個體投與有效量之如請求項7之抗體或抗原結合部分。
  22. 如請求項7之抗體或抗原結合部分，其用於治療患有發炎性病狀或需要免疫阻抑之人類個體。
  23. 一種如請求項7之抗體或抗原結合部分之用途，其用以製造用於在有需要之人類個體中治療發炎性病狀或誘導免疫阻抑之藥劑。
  24. 如請求項21之方法，其中該個體患有自體免疫疾病或移植物抗宿主病。
  25. 如請求項21之方法，其中以與IL-2之複合物形式投與該抗體。
  26. 如請求項21之方法，其中該個體患有1型糖尿病。
  27. 一種組合物，其包括與人類IL-2複合之如請求項7之抗體或其抗原結合部分。
  28. 一種醫藥組合物，其包括與人類IL-2複合之如請求項7之抗體或其抗原結合部分及醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
  29. 一種治療人類個體之發炎性病狀之方法，其包括向該個體投與有效量之與人類IL-2複合之如請求項7之抗體或其抗原結合部分。
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