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TW201720931A - 用於丁二烯生物合成之微生物及方法 - Google Patents

用於丁二烯生物合成之微生物及方法 Download PDF

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TW201720931A
TW201720931A TW105130341A TW105130341A TW201720931A TW 201720931 A TW201720931 A TW 201720931A TW 105130341 A TW105130341 A TW 105130341A TW 105130341 A TW105130341 A TW 105130341A TW 201720931 A TW201720931 A TW 201720931A
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馬克Ｊ 柏克
安東尼Ｐ 柏賈德
孫俊
羅賓Ｅ 歐斯特赫
普利提 法基亞
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Abstract

本發明提供具有丁二烯路徑之非天然存在微生物有機體。本發明另外提供使用該等有機體產生丁二烯之方法。

Description

用於丁二烯生物合成之微生物及方法
本發明大體上係關於生物合成方法，且更特定言之，係關於具有丁二烯生物合成能力之有機體。
每年產生250億磅以上之丁二烯(1,3-丁二烯，BD)且其應用於製造諸如合成橡膠及ABS樹脂之聚合物以及諸如己二胺及1,4-丁二醇之化學物質。丁二烯通常以諸如石腦油、液化石油氣、乙烷或天然氣之石油原料轉化為乙烯及其他烯烴之蒸汽裂解方法的副產物形式產生。自替代性及/或再生性原料製造丁二烯之能力將代表尋求更加可持續化學製造方法之主要進展。
再生性產生丁二烯之一可能方法包括使糖或其他原料醱酵以產生諸如1,4-丁二醇或1,3-丁二醇之二醇，在包括基於金屬之催化作用的第二步驟中將該等二醇分離、純化且隨後脫水生成丁二烯。自再生性原料直接醱酵產生丁二烯將避免需要脫水步驟且丁二烯氣體(沸點-4.4℃)將自醱酵槽連續逸出且容易冷凝並收集。開發醱酵產生方法將消除對基於化石之丁二烯的需求且相對於石油化學來源之丁二烯，將使成本、能量得到大量節省，且使有害廢物及排放大量減少。
本文描述微生物有機體及自廉價之再生性原料有效產生丁二烯的方法，該等原料為諸如糖蜜、甘蔗汁及源自生物質來源(包括農業 及木材廢物)之糖，以及諸如合成氣及二氧化碳之C1原料，且該等有機體及方法包括所述優點。
本發明提供含有丁二烯路徑之非天然存在微生物有機體，其包含至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯。本發明另外提供使用該等微生物有機體產生丁二烯之方法，其係藉由在產生丁二烯之條件下且持續足夠長時段培養如本文所述之含有丁二烯路徑之非天然存在微生物有機體。
圖1展示類異戊二烯及萜類之天然路徑。用於將所鑑別受質轉化為產物之酶包括：A.乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶；B.羥基甲基戊二醯基輔酶A合成酶；C.3-羥基-3-甲基戊二醯基輔酶A還原酶(醇形成)；D.甲羥戊酸激酶；E.磷酸甲羥戊酸激酶；F.二磷酸甲羥戊酸去羧酶；G.異戊烯基-二磷酸異構酶；H.異戊二烯合成酶；圖2展示經由巴豆醇自乙醯基輔酶A、戊烯二醯基輔酶A、戊二醯基輔酶A、3-胺基丁醯基輔酶A或4-羥基丁醯基輔酶A產生丁二烯之例示性路徑。用於將所鑑別受質轉化為產物之酶包括：A.乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶；B.乙醯乙醯基輔酶A還原酶；C.3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶；D.巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)；E.巴豆醛還原酶(醇形成)；F.巴豆醇激酶；G.2-丁烯基-4-磷酸激酶；H.丁二烯合成酶；I.巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶、轉移酶；J.巴豆酸還原酶；K.巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)；L.戊烯二醯基輔酶A去羧酶；M.戊二醯基輔酶A去氫酶；N.3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶；O.4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶；P.巴豆醇二磷酸激酶；圖3展示自赤藻糖-4-磷酸產生丁二烯之例示性路徑。用於將所鑑別受質轉化為產物之酶包括：A.赤藻糖-4-磷酸還原酶；B.赤藻糖醇- 4-磷酸胞苷醯基轉移酶；C.4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶；D.赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶；E.1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶；F.1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶；G.丁烯基4-二磷酸異構酶；H.丁二烯合成酶；I.赤藻糖-4-磷酸激酶；J.赤藻糖還原酶；K.赤藻糖醇激酶；及圖4展示自丙二醯基輔酶A+乙醯基輔酶A產生丁二烯之例示性路徑。用於將所鑑別受質轉化為產物之酶包括：A.丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶；B.3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(酮還原)；C.3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)；D.3-羥基-5-側氧基戊酸還原酶；E.3,5-二羥基戊酸激酶；F.3H5PP激酶；G.3H5PDP去羧酶；H.丁烯基4-二磷酸異構酶；I.丁二烯合成酶；J.3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醇形成)；K.3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)；L.3,5-二側氧基戊酸還原酶(酮還原)；M.3,5-二側氧基戊酸還原酶(醛還原)；N.5-羥基-3-側氧基戊酸還原酶；O.3-側氧基-戊二醯基輔酶A還原酶(輔酶A還原及醇形成)。化合物縮寫包括：3H5PP=3-羥基-5-膦醯氧根基(phosphonatooxy)戊酸及3H5PDP=3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基(phosphonooxy))磷醯基]氧基戊酸。
本發明係關於設計及產生具有丁二烯生物合成產生能力之細胞及有機體。特定言之，本發明係關於藉由引入一或多種編碼丁二烯路徑酶之核酸來設計能夠產生丁二烯之微生物有機體。
在一實施例中，本發明利用可鑑別生物合成產生丁二烯之代謝設計的大腸桿菌(Escherichia coli)代謝之電子雜交(in silico)化學計量模型。本文所述之結果表明可設計且重組工程改造代謝路徑以在大腸桿菌及其他細胞或有機體中達成丁二烯之生物合成。可藉由建構具有所設計代謝基因型之菌株來證實丁二烯生物合成產生(例如，關於電 子雜交設計)。此等經代謝工程改造之細胞或有機體亦可經受適應進化以進一步加強丁二烯生物合成，包括在接近理論最大生長之條件下。
在某些實施例中，所設計菌株之丁二烯生物合成特徵使其遺傳穩定且尤其適用於連續生物方法中。如下鑑別獨立之菌株設計策略：將不同非天然或異源反應能力併入大腸桿菌或其他宿主有機體中，得到自乙醯基輔酶A、戊烯二醯基輔酶A、戊二醯基輔酶A、3-胺基丁醯基輔酶A、4-羥基丁醯基輔酶A、赤藻糖-4-磷酸或丙二醯基輔酶A+乙醯基輔酶A產生丁二烯之代謝路徑。鑑別可在微生物中自此等受質或代謝中間物中之每一者生物合成丁二烯的電子雜交代謝設計。
經由平台之計算組件鑑別之菌株可藉由遺傳工程改造任何所預測代謝變化而進行實際製備，從而生物合成產生丁二烯或其他中間物及/或下游產物。在另一實施例中，展現可生物合成產生此等化合物之菌株可進一步經受適應進化以進一步加強產物生物合成。亦可藉由系統之計算組件預測適應進化後產物生物合成產量之水準。
自葡萄糖之最大理論丁二烯產量為1.09mol/mol(0.33g/g)。
11 C6H12O6=12 C4H6+18 CO2+30 H2O
圖2及圖4中呈現之路徑達到每莫耳所用葡萄糖1.0莫耳丁二烯之產量。若細胞能夠經由諸如還原性(或反向)TCA循環或Wood-Ljungdahl路徑之路徑固定CO2，則產物產量有可能增加至理論最大值。經工程改造以具有圖3中所述之路徑的有機體亦能夠達到接近丁二烯之理論最大產量。
如本文所用之術語「非天然存在」在關於本發明之微生物有機體或微生物使用時欲意謂微生物有機體具有至少一種在所提及物種之天然存在菌株(包括所提及物種之野生型菌株)中通常不存在的遺傳改變。遺傳改變包括例如對微生物有機體之遺傳物質的引入編碼代謝多 肽之可表現核酸的修飾、其他核酸添加、核酸缺失及/或其他功能破壞。該等修飾包括例如對於所提及物種之異源多肽、同源多肽或異源多肽與同源多肽的編碼區域及其功能片段。其他修飾包括例如修飾改變基因或操縱子之表現的非編碼調節區域。例示性代謝多肽包括丁二烯生物合成路徑之酶或蛋白質。
代謝修飾係指自其天然存在狀態改變之生物化學反應。因此，非天然存在微生物可具有對編碼代謝多肽之核酸或其功能片段的遺傳修飾。本文中揭示例示性代謝修飾。
如本文所用之術語「丁二烯」具有分子式C4H6及分子質量54.09g/mol(參見圖2-4)(IUPAC名稱丁-1,3-二烯)，其在本文中與1,3-丁二烯、二乙烯、丁間二烯、二乙烯基、乙烯基乙烯互換使用。丁二烯為無色、非腐蝕性液化氣體，具有輕微芳香或類汽油氣味。由於閃點低，丁二烯具有爆炸性與可燃性。
如本文所用之術語「分離」在關於微生物有機體使用時欲意謂有機體實質上不含至少一種如所提及微生物有機體在自然界中所存在之組分。該術語包括當微生物有機體存在於其天然環境中時經移除一些或所有組分之微生物有機體。該術語亦包括當微生物有機體存在於非天然環境中時經移除一些或所有組分之微生物有機體。因此，當微生物有機體存在於自然界中或當其生長、儲存或生存於非天然存在環境中時，經分離之微生物有機體與其他物質部分或完全分離。經分離之微生物有機體的特定實例包括部分純微生物、實質上純微生物及於非天然存在培養基中培養之微生物。
如本文所用之術語「微生物有機體」或「微生物」欲意謂包括於古菌、細菌或真核域中之以微觀細胞形式存在的任何有機體。因此，該術語意欲涵蓋具有微觀尺寸之原核或真核細胞或有機體且包括所有物種之細菌、古菌及真細菌以及諸如酵母及真菌之真核微生物。 該術語亦包括可經培養以製備生物化學品之任何物種之細胞培養物。
如本文所用之術語「CoA」或「輔酶A」欲意謂有機輔因子或輔基(酶之非蛋白質部分)，其存在為許多酶(去輔基酶)之活性所需以形成活性酶系統。輔酶A以某些縮合酶形式起作用，在乙醯基或其他醯基轉移中及脂肪酸合成及氧化、丙酮酸氧化中以及其他乙醯化中發揮作用。
如本文所用之術語「實質上厭氧」在關於培養或生長條件使用時欲意謂氧含量小於液體培養基中之溶解氧之飽和度的約10%。該術語亦意欲包括維持在小於約1%氧之氛圍下的液體或固體培養基之密封室。
「外源」在本文中使用時欲意謂所提及分子或所提及活性係引入宿主微生物有機體中。分子可如下引入：例如將編碼核酸引入宿主遺傳物質中，諸如整合於宿主染色體或非染色體遺傳物質(諸如質體)中。因此，該術語在關於編碼核酸之表現使用時係指將編碼核酸以可表現形式引入微生物有機體中。當關於生物合成活性使用時，該術語係指引入宿主參考有機體中之活性。來源可為例如在引入宿主微生物有機體中之後表現所提及活性的同源或異源編碼核酸。因此，術語「內源」係指存在於宿主中之所提及分子或活性。類似地，該術語在關於編碼核酸之表現使用時係指微生物有機體內所含之編碼核酸的表現。術語「異源」係指源自除所提及物種外之來源的分子或活性，而「同源」係指源自宿主微生物有機體之分子或活性。相應地，本發明編碼核酸之外源表現可利用異源或同源編碼核酸中之任一者或兩者。
應瞭解，當一種以上外源核酸包括於微生物有機體中時，該一種以上外源核酸如上所述係指所提及編碼核酸或生物合成活性。應進一步瞭解，如本文所揭示，該一種以上外源核酸可經引入宿主微生物有機體中之各別核酸分子上、多順反子核酸分子上或其組合上，且仍 視作一種以上外源核酸。舉例而言，如本文所揭示，微生物有機體可經工程改造以表現兩種或兩種以上編碼所需路徑酶或蛋白質的外源核酸。在兩種編碼所需活性之外源核酸經引入宿主微生物有機體中的情況下，應瞭解，兩種外源核酸可以單一核酸形式引入例如單一質體、各別質體上，可在單一位點或多個位點整合入宿主染色體中，且仍視作兩種外源核酸。類似地，應瞭解，兩種以上外源核酸可以任何所需組合形式引入宿主有機體中(例如，單一質體、各別質體上)，可在單一位點或多個位點整合入宿主染色體中，且仍視作兩種或兩種以上外源核酸，例如三種外源核酸。因此，所提及外源核酸或生物合成活性之數目係指編碼核酸之數目或生物合成活性之數目，而非引入宿主有機體中之各別核酸的數目。
本發明之非天然存在微生物有機體可含有穩定遺傳改變，其係指微生物可經培養5代以上而不損失改變。一般而言，穩定遺傳改變包括修飾持續10代以上，特定言之穩定修飾將持續約25代以上，且更特定言之穩定遺傳修飾將為50代以上，包括無限期。
熟習此項技術者將瞭解到，遺傳改變(包括本文例示之代謝修飾)係關於適合之宿主有機體(諸如大腸桿菌)及其相應代謝反應或適合之源有機體關於所需代謝路徑之所需遺傳物質(諸如基因)所述。然而，考慮到多種有機體之完全基因組測序及基因組學領域之高技能水準，熟習此項技術者將能夠容易地將本文提供之教示及指導應用於基本上所有其他有機體。舉例而言，本文例示之大腸桿菌代謝變化可容易地藉由併入來自除所提及物種以外之物種的相同或類似編碼核酸而應用於其他物種。該等遺傳改變包括例如一般而言物種同源物且詳言之直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因置換之遺傳改變。
直系同源物為垂直後代相關之基因且在不同有機體中負責實質上相同或一致之功能。舉例而言，就環氧化物水解之生物功能而言， 小鼠環氧化物水解酶與人類環氧化物水解酶可視為直系同源物。基因與垂直後代相關(例如基因具有的序列相似度足以指示其同源時)，或與自共同祖先進化相關。若基因具有共同三維結構、但序列未必相似(足以指示其自共同祖先進化之相似度，在此範圍內，主要序列相似性不可鑑別)，則基因亦可視為直系同源物。直系同源基因可編碼序列相似性為約25%至100%胺基酸序列一致性之蛋白質。編碼具有小於25%胺基酸相似性之蛋白質的基因在其三維結構亦顯示相似性時亦可視為由垂直後代而產生。酶之絲胺酸蛋白酶家族成員(包括組織纖維蛋白溶酶原活化因子及彈性蛋白酶)視為由共同祖先之垂直後代產生。
直系同源物包括例如經由進化而出現結構或總體活性趨異之基因或其編碼基因產物。舉例而言，若一物種編碼展現兩種功能之基因產物且若該等功能在第二物種中已分離至不同基因中，則該三種基因及其相應產物視為直系同源物。對於生物化學產物之產生，熟習此項技術者應瞭解，具有經引入或破壞之代謝活性之直系同源基因經選擇以建構非天然存在微生物。展現可分離活性之直系同源物之實例為其中不同活性已分離至兩種或兩種以上物種之間或單一物種內之不同基因產物中。特定實例為彈性蛋白酶蛋白水解及纖維蛋白溶酶原蛋白水解(兩種類型之絲胺酸蛋白酶活性)分離至作為纖維蛋白溶酶原活化因子及彈性蛋白酶之不同分子中。第二實例為黴漿菌5'-3'外切核酸酶與果蠅(Drosophila)DNA聚合酶III活性的分離。來自第一物種之DNA聚合酶可視為來自第二物種之外切核酸酶或聚合酶之任一者或兩者的直系同源物，且反之亦然。
與之相比，旁系同源物為與例如複製後接著進化之趨異性相關之同源物，且具有類似或共同，但不完全相同之功能。旁系同源物可源自或來源於例如相同物種或不同物種。舉例而言，微粒體環氧化物 水解酶(環氧化物水解酶I)及可溶性環氧化物水解酶(環氧化物水解酶II)可視為旁系同源物，因為其代表自共同祖先共同進化之兩種不同酶，其在相同物種中催化不同反應且具有不同功能。旁系同源物為來自相同物種之蛋白質，其彼此具有代表其同源性之顯著序列相似性，或因自共同祖先共同進化而具相關性。旁系同源蛋白質家族群體包括HipA同源物、螢光素酶基因、肽酶及其他物質。
非直系同源基因置換為來自一物種之非直系同源基因可以取代不同物種中該所提及基因功能。該取代包括例如與不同物種中之所提及功能相比，能夠在原始物種中執行實質上相同或類似功能。儘管一般而言，非直系同源基因置換將因與編碼所提及功能之已知基因在結構上相關而可鑑別，但結構相關性較小而功能類似之基因及其相應基因產物仍在如本文所用之術語之含義內。與編碼試圖取代之功能的基因相比，功能相似性需要例如在非直系同源基因產物之活性位點或結合區域中存在至少一些結構相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源物或不相關基因。
因此，在鑑別及建構本發明之具有丁二烯生物合成能力之非天然存在微生物有機體時，熟習此項技術者應瞭解，藉由將本文所提供之教示及指導應用於特定物種，代謝修飾作用之鑑別法可包括直系同源物之鑑別及包涵或失活化。基於可編碼催化類似或實質上類似代謝反應之酶的所提及微生物中所存在旁系同源物及/或非直系同源基因置換法，熟習此項技術者亦可利用此等進化之相關基因。
可藉由熟習此項技術者所熟知的方法測定直系同源物、旁系同源物及非直系同源基因置換。舉例而言，檢查兩種多肽之核酸或胺基酸序列，將揭示所比較序列之間的序列一致性及相似性。基於該等相似性，熟習此項技術者可確定相似性是否足夠高以指示蛋白質係經由自共同祖先進化而相關。熟習此項技術者所熟知之演算法(諸如 Align、BLAST、Clustal W及其他演算法)比較且確定原始序列相似性或一致性，且亦確定可賦予加權或計分之序列中缺口的存在或顯著性。該等演算法亦在此項技術中已知且可類似地應用於確定核苷酸序列相似性或一致性。基於用於計算統計學相似性之熟知方法、或在隨機多肽中發現類似匹配之概率及所測定匹配之顯著性來計算足以判定相關之相似性的參數。必要時亦可由熟習此項技術者通過目視對兩種或兩種以上序列之電腦比較進行最佳化。相關基因產物或蛋白質可預期具有高相似性，例如，25%至100%序列一致性。若掃描到足夠大小之資料庫(約5%)，則不相關蛋白質可具有與預期偶然出現基本上相同之一致性。介於5%與24%之間的序列可能或可能不代表足夠同源性以推斷所比較序列為相關的。在考慮資料集大小的情況下可執行測定該等匹配顯著性之其他統計學分析以測定此等序列之相關性。
使用BLAST演算法用於測定兩種或兩種以上序列之相關性的例示性參數例如可闡述於下文。簡言之，胺基酸序列比對可使用BLASTP 2.0.8版(1999年1月05日)及以下參數進行：矩陣：0 BLOSUM62；缺口打開：11；缺口延伸：1；x_dropoff：50；預期值：10.0；字長：3；過濾器：開。核酸序列比對可使用BLASTN 2.0.6版(1998年9月16日)及以下參數進行：匹配：1；錯配：-2；缺口打開：5；缺口延伸：2；x_dropoff：50；預期值：10.0；字長：11；過濾器：關。熟習此項技術者將知曉可對上述參數進行何種修飾以例如增加或降低比較嚴格度且測定兩種或兩種以上序列之相關性。
在一些實施例中，本發明提供非天然存在微生物有機體，其包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、 巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)、戊烯二醯基輔酶A去羧酶、戊二醯基輔酶A去氫酶、3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶或巴豆醇二磷酸激酶(圖2)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶(圖2，步驟A-H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶及巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)(圖2，步驟A-C、K、F、G、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟A-C、K、P、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水 酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶及巴豆酸還原酶(圖2，步驟A-C、I、J、E、F、G、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟A-C、I、J、E、P、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟A-E、P、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括戊烯二醯基輔酶A去羧酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶(圖2，步驟L、D-H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括戊烯二醯基輔酶A去羧酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶及巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)(圖2，步驟L、K、F、G、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體， 該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括戊烯二醯基輔酶A去羧酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟L、K、P、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括戊烯二醯基輔酶A去羧酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶及巴豆酸還原酶(圖2，步驟L、I、J、E、F、G、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括戊烯二醯基輔酶A去羧酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟L、I、J、E、P、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、戊烯二醯基輔酶A去羧酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟L、C、D、E、P、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括戊二醯基輔酶A去氫酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶(圖2，步驟M、D-H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物 有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括戊二醯基輔酶A去氫酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶及巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)(圖2，步驟M、K、F、G、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括戊二醯基輔酶A去氫酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟M、K、P、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括戊二醯基輔酶A去氫酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶及巴豆酸還原酶(圖2，步驟M、I、J、E、F、G、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括戊二醯基輔酶A去氫酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟M、I、J、E、P、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、戊二醯基輔酶A去氫酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟M、C、D、E、P、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二 烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶(圖2，步驟N、D-H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶及巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)(圖2，步驟N、K、F、G、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟N、K、P、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶及巴豆酸還原酶(圖2，步驟N、I、J、E、F、G、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟N、I、J、E、P、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以 產生丁二烯，該丁二烯路徑包括3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟N、C、D、E、P、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶(圖2，步驟O、D-H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶及巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)(圖2，步驟O、K、F、G、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟O、K、P、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶及巴豆酸還原酶(圖2，步驟O、I、J、E、F、G、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括4-羥 基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟O、I、J、E、P、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟L、C、D、E、P、H)。
在一些實施例中，本發明提供非天然存在微生物有機體，其包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括赤藻糖-4-磷酸還原酶、赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、赤藻糖-4-磷酸激酶、赤藻糖還原酶或赤藻糖醇激酶(圖3)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括赤藻糖-4-磷酸還原酶、赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶及丁二烯合成酶(圖3，步驟A-F及H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括赤藻糖-4-磷酸還原酶、赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉 移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶、丁烯基4-二磷酸異構酶及丁二烯合成酶(圖3，步驟A-H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶、丁二烯合成酶、赤藻糖-4-磷酸激酶、赤藻糖還原酶及赤藻糖醇激酶(圖3，步驟I、J、K、B-F、H)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、赤藻糖-4-磷酸激酶、赤藻糖還原酶及赤藻糖醇激酶(圖3，步驟I、J、K、B-H)。
在一些實施例中，本發明提供非天然存在微生物有機體，其包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(酮還原)、3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)、3-羥基-5-側氧基戊酸還原酶、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基(phosphonatooxy)戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基(phosphonooxy))磷醯基(phosphoryl)]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醇形成)、3- 側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)、3,5-二側氧基戊酸還原酶(酮還原)、3,5-二側氧基戊酸還原酶(醛還原)、5-羥基-3-側氧基戊酸還原酶或3-側氧基-戊二醯基輔酶A還原酶(輔酶A還原及醇形成)(圖4)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(酮還原)、3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)、3-羥基-5-側氧基戊酸還原酶、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶及丁二烯合成酶(圖4，步驟A-I)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)、3,5-二側氧基戊酸還原酶(醛還原)及5-羥基-3-側氧基戊酸還原酶(圖4，步驟A、K、M、N、E、F、G、H、I)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3-羥基-5-側氧基戊酸還原酶、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)及3,5-二側氧基戊酸還原酶(酮還原)(圖4，步驟A、K、L、D、E、F、G、H、I)。在一態樣 中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、5-羥基-3-側氧基戊酸還原酶及3-側氧基-戊二醯基輔酶A還原酶(輔酶A還原及醇形成)(圖4，步驟A、O、N、E、F、G、H、I)。在一態樣中，非天然存在微生物有機體包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該微生物有機體具有至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(酮還原)、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶及3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醇形成)(圖4，步驟A、B、J、E、F、G、H、I)。
在另一實施例中，本發明提供具有丁二烯路徑之非天然存在微生物有機體，其中該非天然存在微生物有機體包含至少一種編碼酶或蛋白質之外源核酸，該酶或蛋白質將受質轉化為產物選自由以下組成之群：乙醯基輔酶A至乙醯乙醯基輔酶A、乙醯乙醯基輔酶A至3-羥基丁醯基輔酶A、3-羥基丁醯基輔酶A至巴豆醯基輔酶A、巴豆醯基輔酶A至巴豆醛、巴豆醛至巴豆醇、巴豆醇至2-丁烯基-磷酸、2-丁烯基-磷酸至2-丁烯基-4-二磷酸、2-丁烯基-4-二磷酸至丁二烯、赤藻糖-4-磷酸至赤藻糖醇-4-磷酸、赤藻糖醇-4-磷酸至4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇至2-磷酸基-4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇、2-磷酸基-4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇至赤藻糖醇-2,4-環二磷酸、赤藻糖醇-2,4-環二磷酸至1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸、 1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸至丁烯基4-二磷酸、丁烯基4-二磷酸至2-丁烯基4-二磷酸、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸至2-丁烯基4-二磷酸、2-丁烯基4-二磷酸至丁二烯、丙二醯基輔酶A及乙醯基輔酶A至3-側氧基戊二醯基輔酶A、3-側氧基戊二醯基輔酶A至3-羥基戊二醯基輔酶A至3-羥基-5-側氧基戊酸、3-羥基-5-側氧基戊酸至3,5-二羥基戊酸、3,5-二羥基戊酸至3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸至3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸至丁烯基4-雙磷酸、戊烯二醯基輔酶A至巴豆醯基輔酶A、戊二醯基輔酶A至巴豆醯基輔酶A、3-胺基丁醯基輔酶A至巴豆醯基輔酶A、4-羥基丁醯基輔酶A至巴豆醯基輔酶A、巴豆醯基輔酶A至巴豆酸、巴豆酸至巴豆醛、巴豆醯基輔酶A至巴豆醇、巴豆醇至2-丁烯基-4-二磷酸、赤藻糖-4-磷酸至赤藻糖、赤藻糖至赤藻糖醇、赤藻糖醇至赤藻糖醇-4-磷酸、3-側氧基戊二醯基輔酶A至3,5-二側氧基戊酸、3,5-二側氧基戊酸至5-羥基-3-側氧基戊酸、5-羥基-3-側氧基戊酸至3,5-二羥基戊酸、3-側氧基戊二醯基輔酶A至5-羥基-3-側氧基戊酸、3,5-二側氧基戊酸至3-羥基-5-側氧基戊酸及3-羥基戊二醯基輔酶A至3,5-二羥基戊酸。熟習此項技術者將瞭解到，此等僅為例示性且熟習此項技術者可根據本文中之教示內容容易地確定本文揭示之任何適於產生所需產物且適當活性可用於將受質轉化為產物之受質-產物對。因此，本發明提供含有至少一種編碼酶或蛋白質之外源核酸的非天然存在微生物有機體，其中該酶或蛋白質轉化丁二烯路徑之受質及產物，諸如圖2-4中所示。
儘管本文中一般描述為含有丁二烯路徑之微生物有機體，但應瞭解，本發明另外提供包含至少一種以足以產生丁二烯路徑之中間物之量表現的編碼丁二烯路徑酶之外源核酸的非天然存在微生物有機體。舉例而言，如本文中所揭示，丁二烯路徑例示於圖2-4中。因 此，除了含有產生丁二烯之丁二烯路徑的微生物有機體外，本發明另外提供包含至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸的非天然存在微生物有機體，其中該微生物有機體產生丁二烯路徑中間物，例如，乙醯乙醯基輔酶A、3-羥基丁醯基輔酶A、巴豆醯基輔酶A、巴豆醛、巴豆醇、2-丁烯基-磷酸、2-丁烯基-4-二磷酸、赤藻糖醇-4-磷酸、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇、2-磷酸基-4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇、赤藻糖醇-2,4-環二磷酸、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸、丁烯基4-二磷酸、2-丁烯基4-二磷酸、3-側氧基戊二醯基輔酶A、3-羥基戊二醯基輔酶A、3-羥基-5-側氧基戊酸、3,5-二羥基戊酸、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸、巴豆酸、赤藻糖、赤藻糖醇、3,5-二側氧基戊酸或5-羥基-3-側氧基戊酸。
應瞭解，如本文揭示(如實例中所述且圖式中所例示)之任何路徑(包括圖2-4之路徑)可用於產生非天然存在微生物有機體，其按需要產生任何路徑中間物或產物。如本文所揭示，產生中間物之該微生物有機體可與表現下游路徑酶之另一微生物有機體組合使用以產生所需產物。然而，應瞭解，產生丁二烯路徑中間物之非天然存在微生物有機體可用於產生中間物作為所需產物。
本發明在本文中一般根據代謝反應、其反應物或產物，或具體根據一或多種編碼酶或蛋白質之核酸或基因加以描述，該酶或該蛋白質與所提及之代謝反應、反應物或產物相關，或該酶催化所提及之代謝反應、反應物或產物。除非本文另外明確說明，否則熟習此項技術者將瞭解到，提及反應亦等同於提及反應物及反應產物。類似地，除非本文另外明確說明，否則提及反應物或產物亦提及反應，且提及任何此等代謝組分亦提及編碼酶或蛋白質的基因，該等酶催化所提及之反應、反應物或產物，該等蛋白質牽涉所提及之反應、反應物或產物。同樣，鑒於代謝生物化學、酶學及基因組學之熟知領域，本文提 及基因或編碼核酸亦等同於提及相應所編碼酶及其所催化之反應或與反應以及反應物及反應產物相關之蛋白質。
可藉由引入編碼一或多種參與一或多種丁二烯生物合成路徑之酶或蛋白質之可表現核酸來產生本發明之非天然存在微生物有機體。視選用於生物合成之宿主微生物有機體而定，可針對一些或所有特定丁二烯生物合成路徑來表現核酸。舉例而言，若所選宿主缺乏所需生物合成路徑之一或多種酶或蛋白質，則將所缺乏酶或蛋白質之可表現核酸引入該宿主中以隨後進行外源表現。或者，若所選宿主展現一些路徑基因之內源表現，但缺乏其他，則需要所缺乏酶或蛋白質之編碼核酸以達成丁二烯生物合成。因此，本發明之非天然存在微生物有機體可藉由引入外源酶或蛋白質活性以獲得所需生物合成路徑而產生，或可藉由引入與一或多種內源酶或蛋白質一起產生諸如丁二烯之所需產物的一或多種外源酶或蛋白質活性來獲得所需生物合成路徑。
宿主微生物有機體可選自例如細菌、酵母、真菌或可應用於醱酵方法之任何多種其他微生物，且在其中產生非天然存在微生物有機體。例示性細菌包括選自以下之物種：大腸桿菌、產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、產丁二酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、產丁二酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)、產丁二酸曼哈米亞桿菌(Mannheimia succiniciproducens)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、麩胺酸生產菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)、運動醱酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、乳酸球菌(Lactococcus lactis)、胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)及惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。例示性酵母或真 菌包括選自以下之物種：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲黴菌(Aspergillus terreus)、黑麴菌(Aspergillus niger)、畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、少根根黴(Rhizopus arrhizus)、米根黴(Rhizobus oryzae)及其類似物。大腸桿菌為尤其適用之宿主有機體，因為其為適於遺傳工程之經充分表徵之微生物有機體。其他尤其適用之宿主有機體包括酵母，諸如釀酒酵母。應瞭解，任何適合之微生物宿主有機體可用於引入代謝及/或遺傳修飾以產生所需產物。
視所選宿主微生物有機體之丁二烯生物合成路徑成分而定，本發明之非天然存在微生物有機體將包括至少一種外源表現之丁二烯路徑編碼核酸及一或多種丁二烯生物合成路徑之至多所有編碼核酸。舉例而言，可經由相應編碼核酸之外源表現在缺乏路徑酶或蛋白質之宿主中建立丁二烯生物合成。在缺乏丁二烯路徑之所有酶或蛋白質之宿主中，可包括路徑中所有酶或蛋白質之外源表現，但應瞭解即使在宿主含有至少一種路徑酶或蛋白質之情況下路徑之所有酶或蛋白質亦可經表現。舉例而言，可包括產生丁二烯路徑中所有酶或蛋白質之外源表現，諸如乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶(圖2，步驟A-H)。
鑒於本文提供之教示及指導，熟習此項技術者將瞭解到，以可表現形式引入之編碼核酸之數目將至少與所選宿主微生物有機體之丁二烯路徑缺乏相同。因此，本發明之非天然存在微生物有機體可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個、至多所有編碼構成本文揭示之丁二烯生物合成路徑之酶或蛋白質的核酸。在一些實施例中，非天然 存在微生物有機體亦可包括促進或最佳化丁二烯生物合成或賦予宿主微生物有機體其他有用功能之其他遺傳修飾。一種此類其他功能性可包括例如加強諸如乙醯基輔酶A、戊烯二醯基輔酶A、戊二醯基輔酶A、3-胺基丁醯基輔酶A、4-羥基丁醯基輔酶A、赤藻糖-4-磷酸或丙二醯基輔酶A之一或多種丁二烯路徑前驅體的合成。
一般而言，宿主微生物有機體經選擇以使得其以天然產生之分子形式或經工程改造之產物形式產生丁二烯路徑之前驅體，該經工程改造之產物提供所需前驅體之重新產生或增加由宿主微生物有機體天然產生之前驅體的產生。舉例而言，乙醯基輔酶A、戊烯二醯基輔酶A、戊二醯基輔酶A、3-胺基丁醯基輔酶A、4-羥基丁醯基輔酶A、赤藻糖-4-磷酸或丙二醯基輔酶A係在諸如大腸桿菌之宿主有機體中天然產生。宿主有機體可經工程改造以增加前驅體之產生，如本文所揭示。另外，已經工程改造以產生所需前驅體之微生物有機體可用作宿主有機體且進一步經工程改造以表現丁二烯路徑之酶或蛋白質。
在一些實施例中，本發明之非天然存在微生物有機體係自含有合成丁二烯之酶促能力之宿主產生。在此特定實施例中，其可適用於增加丁二烯路徑產物之合成或積聚以例如驅動丁二烯路徑反應向丁二烯產生進行。合成或積聚增加可例如藉由編碼一或多種上述丁二烯路徑酶或蛋白質之核酸的過度表現來實現。丁二烯路徑之一或多種酶及/或一或多種蛋白質之過度表現可例如經由一或多種內源基因之外源表現或經由一或多種異源基因之外源表現發生。因此，天然存在有機體可容易地經由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(亦即至多所有)編碼丁二烯生物合成路徑酶或蛋白質之核酸的過度表現而產生為本發明之例如產生丁二烯之非天然存在微生物有機體。另外，非天然存在有機體可藉由使得丁二烯生物合成路徑中酶活性增加之內源基因的突變誘發而產生。
在尤其適用之實施例中，使用編碼核酸之外源表現。外源表現賦予宿主及應用以定製表現及/或調節元件之能力以達成由使用者控制之所需表現量。然而，在其他實施例中亦可利用內源表現，諸如藉由移除負性調節效應子或在連接至可誘導啟動子或其他調節元件時基因啟動子之誘導。因此，具有天然存在可誘導啟動子之內源基因可藉由提供適當誘導劑上調，或內源基因之調節區域可經工程改造以併入可誘導調節元件，藉此允許調節內源基因在所需時刻之增加之表現。類似地，可誘導啟動子可以經引入非天然存在微生物有機體中之外源基因之調節元件形式包括。
應瞭解，在本發明之方法中，任何一或多種外源核酸可經引入微生物有機體中以產生本發明之非天然存在微生物有機體。可引入核酸以賦予例如丁二烯生物合成路徑至微生物有機體。或者，可引入編碼核酸以產生具有催化一些所需反應之生物合成能力之中間物微生物有機體以賦予丁二烯生物合成能力。舉例而言，具有丁二烯生物合成路徑之非天然存在微生物有機體可包含至少兩種編碼所需酶或蛋白質之外源核酸，諸如以下兩者之組合：巴豆醇激酶及丁二烯合成酶、或者4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶及丁二烯合成酶、或者1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶及丁二烯合成酶、或者3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶及丁二烯合成酶、或者巴豆醯基輔酶A水解酶及巴豆醇二磷酸激酶、或者赤藻糖還原酶及丁二烯合成酶、或者3-側氧基-戊二醯基輔酶A還原酶(輔酶A還原及醇形成)及3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶，及其類似組合。因此，應瞭解，生物合成路徑之兩種或兩種以上酶或蛋白質之任何組合可包括於本發明之非天然存在微生物有機體中。類似地，應瞭解，生物合成路徑之三種或三種以上酶或蛋白質之任何組合可包括於本發明之非天然存在微生物有機體中，例如，巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶、或者 1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶及丁二烯合成酶、或者3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶、3-羥基-5-側氧基戊酸還原酶及丁二烯合成酶、或者乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、巴豆醇激酶及丁二烯合成酶、或者戊烯二醯基輔酶A去羧酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶、或者赤藻糖-4-磷酸激酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶及1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、或者3,5-二側氧基戊酸還原酶(醛還原)、丁烯基4-二磷酸異構酶及丁二烯合成酶，等等，按照需要，只要所需生物合成路徑之酶及/或蛋白質之組合產生相應所需產物即可。類似地，如本文揭示之生物合成路徑之四種或四種以上酶或蛋白質的任何組合可包括於本發明之非天然存在微生物有機體中，諸如巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶、或者1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶、丁烯基4-二磷酸異構酶及丁二烯合成酶、或者3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸激酶、丁烯基4-二磷酸異構酶及丁二烯合成酶、或者赤藻糖-4-磷酸還原酶、赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶及丁二烯合成酶、或者3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)、巴豆醇二磷酸激酶及丁二烯合成酶、或者赤藻糖還原酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶及1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶、或者丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醇形成)、丁烯基4-二磷酸異構酶及丁二烯合成酶，按照需要，只要所需生物合成路徑之酶及/或蛋白質之組合產生相應所需產物即可。
除了如本文所述之丁二烯生物合成，本發明之非天然存在微生物有機體及方法亦可以彼此之間及與此項技術中熟知之其他微生物有 機體及方法的各種組合形式利用以藉由其他途徑達成產物生物合成。舉例而言，除了使用丁二烯產生劑之外產生丁二烯之一替代方法為經由添加另一種能夠將丁二烯路徑中間物轉化為丁二烯之微生物有機體。一種此程序包括例如使產生丁二烯路徑中間物之微生物有機體醱酵。丁二烯路徑中間物隨後可用作將丁二烯路徑中間物轉化為丁二烯之第二微生物有機體的受質。可將丁二烯路徑中間物直接添加至第二有機體之另一培養物，或可藉由例如細胞分離使丁二烯路徑中間物產生劑之原始培養物缺乏此等微生物有機體，且隨後向醱酵培養液中後續添加第二有機體可用於在無中間純化步驟之情況下產生最終產物。
在其他實施例中，本發明之非天然存在微生物有機體及方法可以多種子路徑裝配以達成例如丁二烯之生物合成。在此等實施例中，本發明之所需產物之生物合成路徑可分離成不同微生物有機體，且該等不同微生物有機體可經共同培養以產生最終產物。在此生物合成流程中，微生物有機體之產物為第二微生物有機體之受質，直至合成最終產物。舉例而言，可藉由建構含有將一路徑中間物轉化為另一路徑中間物或產物之生物合成路徑的微生物有機體來實現丁二烯之生物合成。或者，丁二烯亦可經由使用兩種有機體在同一容器中共同培養或共同醱酵而自微生物有機體生物合成產生，其中第一微生物有機體產生丁二烯中間物且第二微生物有機體將中間物轉化為丁二烯。
鑒於本文提供之教示及指導，熟習此項技術者將瞭解到，本發明之非天然存在微生物有機體及方法，以及其他微生物有機體、具有子路徑之其他非天然存在微生物有機體之共同培養及此項技術中熟知之產生丁二烯之其他化學及/或生物化學程序的組合，存在多種組合及排列。
丁二烯路徑酶或蛋白質之編碼核酸的來源可包括例如所編碼基因產物能夠催化所提及反應之任何物種。該等物種包括原核及真核有 機體，包括(但不限於)細菌，包括古菌及真細菌；及真核生物，包括酵母、植物、昆蟲、動物及哺乳動物，包括人類。此等來源之例示性物種包括例如大腸桿菌、醱酵胺基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、貝氏不動桿菌(Acinetobacter baylyi)、乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)、不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)ADP1、不動桿菌屬菌株M-1、超嗜熱菌(Aquifex aeolicus)、阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、阿拉伯芥col、阿拉伯芥col、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)DSM 4304、固氮弧菌屬(Azoarcus sp.)CIB、仙人掌桿菌(Bacillus cereus)、枯草桿菌、溫帶牛(Bos Taurus)、馬爾他布魯氏菌(Brucella melitensis)、艾比伐利亞伯克氏菌(Burkholderia ambifaria)AMMD、瘤狀伯克氏菌(Burkholderia phymatum)、空腸彎麴菌(Campylobacter jejuni)、白色念珠菌(Candida albicans)、木蘭念珠菌(Candida magnoliae)、橙色綠曲撓菌(Chloroflexus aurantiacus)、楊氏檸檬酸桿菌(Citrobacter youngae)ATCC 29220、丙酮丁醇梭菌、胺基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、拜氏梭菌NCIMB 8052、拜氏梭菌NRRL B593、肉毒梭菌C依庫蘭德菌株(Clostridium botulinum C str.Eklund)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、克氏梭菌DSM 555、諾維氏梭菌NT(Clostridium novyi NT)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、麩胺酸生產菌ATCC 13032、臺灣貪銅菌(Cupriavidus taiwanensis)、藍菌(Cyanobium)PCC7001、盤基網柄菌(Dictyostelium discoideum)AX4、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、赤細菌屬(Erythrobacter sp.)NAP1、大腸桿菌K12、大腸桿菌K-12菌株MG1655亞菌株、直腸真桿菌(Eubacterium rectale)ATCC 33656、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、具核梭桿菌具核梭亞種(Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum)ATCC 25586、熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(Geobacillus thermoglucosidasius)、雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、嗜鹽古生菌(Haloarcula marismortui)ATCC 43049、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、智人(Homo sapiens)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)、胚芽乳桿菌、胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、海洋γ變形細菌(marine gamma proteobacterium)HTCC2080、勤奮金屬球菌(Metallosphaera sedula)、詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、小家鼠(Mus musculus)、鳥分枝桿菌副結核亞種(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis)K-10、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)BCG、海洋分枝桿菌(Mycobacterium marinum)M、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)MC2 155、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae)M129、鼻疽諾卡氏菌(Nocardia farcinica)IFM 10152、艾瓦諾卡氏菌(Nocardia iowensis)(菌種NRRL 5646)、家兔(Oryctolagus cuniculus)、脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、產黃青黴菌(Penicillium chrysogenum)、銀白楊樹(Populus alba)、歐洲山楊-銀白楊樹雜交種(Populus tremula x Populus alba)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、牙齦卟啉單胞菌W83、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、綠膿桿菌PAO1、螢光假單胞菌、螢光假單胞菌Pf-5、克氏假單胞菌(Pseudomonas knackmussii)(B13)、惡臭假單胞菌、惡臭假單胞菌E23、惡臭假單胞菌KT2440、假單胞菌屬(Pseudomonas sp)、山葛(Pueraria Montana)、耐超高溫熱棒菌(Pyrobaculum aerophilum)菌株IM2、極端嗜熱古細菌(Pyrococcus furiosus)、真養羅爾斯頓氏菌(Ralstonia eutropha)、真養羅爾斯頓氏菌H16、真養羅爾斯頓氏菌H16、耐金屬羅爾斯頓氏菌 (Ralstonia metallidurans)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、球形紅桿菌(Rhodobacter spaeroides)、橡膠赤球菌(Rhodococcus rubber)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、腸羅斯氏菌(Roseburia intestinalis)L1-82、依奴林羅斯氏菌(Roseburia inulinivorans)DSM16841、羅斯氏菌屬(Roseburia sp.)A2-183、卡斯特玫瑰彎菌(Roseiflexus castenholzii)、釀酒酵母、紅色糖多胞菌(Saccharopolyspora rythraea)NRRL 2338、、腸道沙門氏菌亞利桑那血清型亞種(Salmonella enterica subsp.arizonae serovar)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、裂殖酵母、荷荷芭(Simmondsia chinensis)、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus ureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、天藍色鏈黴菌、灰色鏈黴菌灰色亞種(Streptomyces griseus subsp.griseus)、BRC 13350、鏈黴菌屬(Streptomyces sp.)ACT-1、、嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius)、芝田硫化葉菌(Sulfolobus shibatae)、硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)、東大硫化葉菌(Sulfolobus tokodaii)、集胞藻屬(Synechocystis sp.)菌株PCC6803、嗜酸互營菌(Syntrophus ciditrophicus)、布氏嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter brockii)HTD4、騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4、臺灣溫泉菌(Thermosynechococcus elongates)、海棲熱袍菌(Thermotoga maritime)MSB8、溫泉菌(Thermus thermophilus)、溫泉菌HB8、陰道滴蟲(Trichomonas vaginalis)G3、類絲孢酵母(Trichosporonoides megachiliensis)、布氏錐蟲(Typanosoma brucei)、微代謝塚村氏菌(Tsukamurella paurometabola)DSM 20162、中間耶爾森菌(Yersinia intermedia)ATCC 29909、生枝動膠菌(Zoogloea ramigera)、魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、運動醱酵單胞菌，以及本文揭示之其他 例示性物種可以相應基因之源有機體形式獲得。然而，利用關於現今550種以上物種可獲得之完全基因組序列(其中一半以上此等基因組序列可獲自公共資料庫，諸如NCBI)，包括395種微生物基因組及多種酵母、真菌、植物及哺乳動物基因組，在相關或遠緣物種中鑑別編碼一或多種基因之必要丁二烯生物合成活性之基因(包括例如已知基因之同源物、直系同源物、旁系同源物及非直系同源基因置換)，及有機體之間的遺傳改變之交換，為常規且為此項技術中所熟知。因此，關於諸如大腸桿菌之特定有機體允許本文所述之丁二烯生物合成之代謝變化可容易地應用於其他微生物，同樣包括原核及真核有機體。鑒於本文提供之教示及指導，熟習此項技術者將知曉，在一有機體中例示之代謝變化可同樣適用於其他有機體。
在一些情況下，諸如當不相關物種中存在另一丁二烯生物合成路徑時，可例如藉由來自催化類似但不一致代謝反應以替代所提及反應之不相關物種之旁系同源物或旁系同源物的外源表現，賦予宿主物質以丁二烯生物合成。因為不同有機體之間存在代謝網路之某些差異，所以熟習此項技術者應瞭解，不同有機體之間的實際基因使用可能不同。然而，鑒於本文提供之教示及指導，熟習此項技術者亦應瞭解，本發明之教示及方法可應用於本文所例示之使用同源代謝變化之所有微生物有機體以在將合成丁二烯之相關物種中建構微生物有機體。
可例如藉由此項技術中熟知之重組及偵測方法來進行建構及測試產生非天然存在丁二烯之宿主之表現量的方法。該等方法可發現並描述於例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)中。
可使用此項技術中熟知之技術將產生丁二烯之路徑中所涉及之外源核酸序列穩定地或短暫地引入宿主細胞中，該等技術包括(但不限於)接合、電穿孔、化學轉化、轉導、轉染及超音波轉化。對於大腸桿菌或其他原核細胞中之外源表現，真核核酸之基因或cDNA中之一些核酸序列可編碼靶向信號(諸如N端粒線體或其他靶向信號)，其可在必要時在轉化入原核宿主細胞之前移除。舉例而言，移除粒線體前導序列導致大腸桿菌中表現增加(Hoffmeister等人，J.Biol.Chem.280：4329-4338(2005))。對於酵母或其他真核細胞中之外源表現，基因可在未添加前導序列之情況下於細胞溶質中表現，或可藉由添加適合靶向序列(諸如適於宿主細胞之粒線體靶向或分泌信號)經靶向粒線體或其他細胞器，或靶向以進行分泌。因此，應瞭解，對核酸序列進行移除或包括靶向序列之適當修飾可併入外源核酸序列中以賦予理想性質。此外，可藉由此項技術中熟知之技術對基因進行密碼子最佳化以達成蛋白質之最佳化表現。
可建構一或多種表現載體以包括一或多種如本文所例示之丁二烯生物合成路徑編碼核酸可操作地連接於在宿主有機體中起作用之表現控制序列。可應用於本發明之微生物宿主有機體之表現載體包括例如質體、噬菌體載體、病毒載體、游離基因體(episome)及人工染色體，包括可操作用於穩定整合至宿主染色體中之載體及選擇序列或標記物。另外，表現載體可包括一或多種可選擇標記基因及適當表現控制序列。亦可包括例如提供對抗生素或毒素之抗性、補充營養缺陷或供應培養基中不存在之關鍵營養素的可選擇標記基因。表現控制序列可包括此項技術中熟知之組成性及可誘導啟動子、轉錄增強子、轉錄終止子及其類似物。當兩種或兩種以上外源編碼核酸經共同表現時，兩種核酸可插入例如單個表現載體或各別表現載體中。對於單個載體表現，編碼核酸可操作性連接於一共同表現控制序列或連接於不同表 現控制序列，諸如一可誘導啟動子及一組成性啟動子。可使用此項技術中熟知之方法確定代謝或合成路徑中所涉及之外源核酸序列轉化。該等方法例如包括諸如北方墨點法(Northern blots)或mRNA聚合酶鏈反應(PCR)擴增之核酸分析，或基因產物表現之免疫墨點法，或用於測試所引入核酸序列或其相應基因產物之其他適合分析方法。熟習此項技術者應瞭解，外源核酸以足以產生所需產物之量表現，且應進一步瞭解，可使用此項技術中熟知且如本文所揭示之方法最佳化表現量以獲得足夠表現。
在一些實施例中，本發明提供產生丁二烯之方法，其包括培養非天然存在微生物有機體，包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)、戊烯二醯基輔酶A去羧酶、戊二醯基輔酶A去氫酶、3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶或巴豆醇二磷酸激酶(圖2)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶(圖2，步驟A-H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶及巴豆醯基輔酶A還原 酶(醇形成)(圖2，步驟A-C、K、F、G、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟A-C、K、P、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶及巴豆酸還原酶(圖2，步驟A-C、I、J、E、F、G、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟A-C、I、J、E、P、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟A-E、P、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括戊烯二醯基輔酶A去羧酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶(圖2，步驟L、D-H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括戊烯二醯基輔酶A去羧酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶及巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)(圖2，步驟L、K、F、G、H)。在一態樣中，該方 法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括戊烯二醯基輔酶A去羧酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟L、K、P、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括戊烯二醯基輔酶A去羧酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶及巴豆酸還原酶(圖2，步驟L、I、J、E、F、G、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括戊烯二醯基輔酶A去羧酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟L、I、J、E、P、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、戊烯二醯基輔酶A去羧酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟L、C、D、E、P、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括戊二醯基輔酶A去氫酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶(圖2，步驟M、D-H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括戊二醯基輔酶A去氫酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶及巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)(圖2，步驟M、K、F、G、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括戊二醯基輔酶A去氫酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟M、K、P、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括戊二醯基輔酶A去氫酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4- 磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶及巴豆酸還原酶(圖2，步驟M、I、J、E、F、G、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括戊二醯基輔酶A去氫酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟M、I、J、E、P、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、戊二醯基輔酶A去氫酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟M、C、D、E、P、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶(圖2，步驟N、D-H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶及巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)(圖2，步驟N、K、F、G、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟N、K、P、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶及巴豆酸還原酶(圖2，步驟N、I、J、E、F、G、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移 酶、巴豆酸還原酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟N、I、J、E、P、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟N、C、D、E、P、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶(圖2，步驟O、D-H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶及巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)(圖2，步驟O、K、F、G、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟O、K、P、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶及巴豆酸還原酶(圖2，步驟O、I、J、E、F、G、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟O、I、J、E、P、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶及巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟 O、C、D、E、P、H)。
在一些實施例中，本發明提供產生丁二烯之方法，其包括培養非天然存在微生物有機體，包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括赤藻糖-4-磷酸還原酶、赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、赤藻糖-4-磷酸激酶、赤藻糖還原酶或赤藻糖醇激酶(圖3)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括赤藻糖-4-磷酸還原酶、赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶及丁二烯合成酶(圖3，步驟A-F及H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括赤藻糖-4-磷酸還原酶、赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶、丁烯基4-二磷酸異構酶及丁二烯合成酶(圖3，步驟A-H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶、丁二烯合成酶、赤藻糖-4-磷酸激酶、赤藻糖還原酶及赤藻糖醇激酶(圖3，步驟I、J、K、B-F、H)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成 酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、赤藻糖-4-磷酸激酶、赤藻糖還原酶及赤藻糖醇激酶(圖3，步驟I、J、K、B-H)。
在一些實施例中，本發明提供產生丁二烯之方法，其包括培養非天然存在微生物有機體，包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包括丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(酮還原)、3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)、3-羥基-5-側氧基戊酸還原酶、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醇形成)、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)、3,5-二側氧基戊酸還原酶(酮還原)、3,5-二側氧基戊酸還原酶(醛還原)、5-羥基-3-側氧基戊酸還原酶或3-側氧基-戊二醯基輔酶A還原酶(輔酶A還原及醇形成)(圖4)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(酮還原)、3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)、3-羥基-5-側氧基戊酸還原酶、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶及丁二烯合成酶(圖4，步驟A-I)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)、3,5-二側氧基戊酸還原酶(醛還原)及5-羥基-3-側氧基戊酸還原酶(圖4，步驟 A、K、M、N、E、F、G、H、I)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3-羥基-5-側氧基戊酸還原酶、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)及3,5-二側氧基戊酸還原酶(酮還原)(圖4，步驟A、K、L、D、E、F、G、H、I)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、5-羥基-3-側氧基戊酸還原酶及3-側氧基-戊二醯基輔酶A還原酶(輔酶A還原及醇形成)(圖4，步驟A、O、N、E、F、G、H、I)。在一態樣中，該方法包括具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包括丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(酮還原)、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶及3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醇形成)(圖4，步驟A、B、J、E、F、G、H、I)。
可使用熟知方法進行用於測試丁二烯產生之適合純化及/或檢定。對於待測試之各工程改造菌株可生長適合之複製(諸如一式三份)培養物。舉例而言，在工程改造產生宿主中可監測到產物及副產物形成。可藉由諸如HPLC(高效液相層析)、GC-MS(氣相層析-質譜分析)及LC-MS(液相層析-質譜分析)或其他適合分析方法之方法使用此項技術中熟知之常規程序分析最終產物及中間物，及其他有機化合物。亦可利用培養上清液測試醱酵液(fermentation broth)中產物之釋放。可 藉由HPLC使用例如用於葡萄糖及醇之折射率偵測劑、及用於有機酸之UV偵測劑(Lin等人，Biotechnol.Bioeng.90：775-779(2005))或此項技術中熟知之其他適合檢定及偵測方法來定量副產物及殘餘葡萄糖。亦可使用此項技術中熟知之方法來檢定來自外源DNA序列之個別酶或蛋白質活性。對於典型檢定方法，參見Manual on Hydrocarbon Analysis(ASTM Manula Series,A.W.Drews編，第6版，1998,American Society for Testing and Materials,Baltimore,Maryland)。
可使用此項技術中熟知之多種方法將丁二烯與培養物中之其他組分分離。該等分離方法包括例如萃取程序以及包括連續液-液萃取、滲透蒸發、膜過濾、膜分離、逆滲透、電滲析、蒸餾、結晶、離心、萃取過濾、離子交換層析、尺寸排阻層析、吸附層析及超濾之方法。此項技術中熟知所有上述方法。
本文描述之任何非天然存在微生物有機體可經培養以產生及/或分泌本發明之生物合成產物。舉例而言，丁二烯產生劑可經培養以生物合成產生丁二烯。
對於丁二烯之產生，在具有碳源及其他基本營養素之培養基中培養重組菌株。有時需要且可能極為需要維持醱酵槽中之厭氧條件以降低整個方法之成本。可例如藉由首先用氮氣噴射培養基且隨後用隔膜及卷曲蓋(crimp-cap)密封燒瓶來獲得該等條件。對於在厭氧條件下未觀測到生長之菌株，可藉由用小孔刺穿隔膜以進行有限通氣來應用微需氧或實質上厭氧條件。先前已描述例示性厭氧條件且其為此項技術中所熟知。例示性需氧及厭氧條件例如描述於2007年8月10日申請之美國公開案2009/0047719中。如本文所揭示，可以分批、分批饋料或連續方式進行醱酵。
必要時，可藉由按照維持培養基在理想pH值所需添加鹼(諸如NaOH或其他鹼)或酸，將培養基之pH值維持在所需pH值，尤其中性 pH值，諸如約7之pH值。可藉由使用分光光度計(600nm)量測光學密度來測定生長速率，且藉由隨時間監測碳源損耗來測定葡萄糖攝取速率。
生長培養基可包括例如任何碳水化合物源，其可供應碳源至非天然存在微生物。該等來源包括例如糖，諸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖及澱粉。其他碳水化合物源包括例如再生性原料及生物質。可用作本發明方法中之原料的例示性生物質類型包括纖維素生物質、半纖維素生物質及木質素原料或原料部分。該等生物質原料含有例如可用作碳源之碳水化合物受質，諸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖及澱粉。鑒於本文提供之教示及指導，熟習此項技術者應瞭解，除上文所例示以外之再生性原料及生物質亦可用於培養本發明之微生物有機體以產生丁二烯。
除諸如上文所例示以外之再生性原料，本發明之丁二烯微生物有機體亦可經修飾以在合成氣作為其碳源時生長。在此特定實施例中，一或多種蛋白質或酶於產生丁二烯之有機體中表現以提供利用合成氣或其他氣態碳源之代謝路徑。
合成氣體(亦稱作合成氣或發生氣)為煤及含碳材料(諸如生物質材料，包括農作物及殘餘物)氣化之主要產物。合成氣為主要由H2及CO組成之混合物且可獲自任何有機原料(包括但不限於煤、煤油、天然氣、生物質及廢棄有機物質)之氣化。一般在高的燃料/氧氣比下進行氣化。儘管主要為H2及CO，但合成氣亦可包括少量CO2及其他氣體。因此，合成氣體提供氣態碳(諸如CO及另外CO2)之成本有效來源。
Wood-Ljungdahl路徑催化CO及H2轉化為乙醯基輔酶A及諸如乙酸鹽之其他產物。能夠利用CO及合成氣之有機體一般亦具有經由Wood-Ljungdahl路徑所涵蓋之相同基本酶集合及轉化利用CO2及CO2/H2混合 物之能力。在揭示亦可由相同有機體使用CO且包括相同路徑之前，早已認識到藉由微生物使CO2在H2依賴性條件下轉化為乙酸鹽。許多產乙酸菌(acetogen)已顯示在CO2存在下生長且產生諸如乙酸鹽之化合物，只要存在氫氣以供應必要還原等效物即可(參見例如Drake,Acetogenesis，第3-60頁，Chapman及Hall,New York,(1994))。此可由以下反應式概述：2 CO2+4 H2+n ADP+n Pi → CH3COOH+2 H2O+n ATP
因此，具有Wood-Ljungdahl路徑之非天然存在微生物亦可利用CO2及H2混合物以產生乙醯基輔酶A及其他所需產物。
此項技術中熟知Wood-Ljungdahl路徑且其由12種反應組成，該等反應可分成兩個分枝：(1)甲基分枝及(2)羰基分枝。甲基分枝將合成氣轉化為甲基-四氫葉酸(甲基-THF)，而羰基分枝將甲基-THF轉化為乙醯基輔酶A。甲基分枝中之反應係由下列酶或蛋白質依序催化：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶、甲酸去氫酶、甲醯基四氫葉酸合成酶、甲醯基四氫葉酸環脫水酶、亞甲基四氫葉酸去氫酶及亞甲基四氫葉酸還原酶。羰基分枝中之反應係由下列酶或蛋白質依序催化：甲基四氫葉酸：類咕啉蛋白質甲基轉移酶(例如AcsE)、類咕啉鐵-硫蛋白、鎳-蛋白裝配蛋白(例如AcsF)、鐵氧化還原蛋白、乙醯基輔酶A合成酶、一氧化碳去氫酶及鎳-蛋白裝配蛋白(例如CooC)。根據本文提供之用於引入足夠數目之編碼核酸以產生丁二烯路徑的教示及指導，熟習此項技術者應瞭解，亦可關於至少引入編碼宿主有機體中不存在之Wood-Ljungdahl酶或蛋白質之核酸進行相同工程設計。因此，將一或多種編碼核酸引入本發明之微生物有機體中以使得經修飾有機體含有完全Wood-Ljungdahl路徑將賦予合成氣利用能力。
另外，還原性(逆向)三羧酸循環與一氧化碳去氫酶及/或氫化酶活性偶合亦可用於將CO、CO2及/或H2轉化為乙醯基輔酶A及諸如乙酸 鹽之其他產物。能夠經由還原性TCA路徑固定碳之有機體可利用一或多種下列酶：ATP檸檬酸-解離酶、檸檬酸解離酶、鳥頭酸酶、異檸檬酸去氫酶、α-酮戊二酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶、丁二醯基輔酶A合成酶、丁二醯基輔酶A轉移酶、反丁烯二酸還原酶、反丁烯二酸酶、蘋果酸去氫酶、NAD(P)H：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶、一氧化碳去氫酶及氫化酶。特定言之，藉由一氧化碳去氫酶及氫化酶自CO及/或H2提取之還原等效物係用於經由還原性TCA循環將CO2固定至乙醯基輔酶A或乙酸鹽中。可藉由諸如乙醯基輔酶A轉移酶、乙酸激酶/磷酸轉乙醯酶及乙醯基輔酶A合成酶之酶將乙酸鹽轉化為乙醯基輔酶A。藉由丙酮酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶及葡糖新生之酶，乙醯基輔酶A可轉化為對甲苯甲酸鹽、對苯二甲酸鹽或(2-羥基-3-甲基-4-側氧基丁氧基)膦酸鹽前驅體、甘油醛-3-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸鹽及丙酮酸鹽。根據本文提供之用於引入足夠數目之編碼核酸以產生對甲苯甲酸鹽、對苯二甲酸鹽或(2-羥基-3-甲基-4-側氧基丁氧基)膦酸鹽路徑的教示及指導，熟習此項技術者應瞭解，亦可關於至少引入編碼宿主有機體中不存在之還原性TCA路徑酶或蛋白質之核酸進行相同工程設計。因此，將一或多種編碼核酸引入本發明之微生物有機體中以使得經修飾有機體含有完全還原性TCA路徑將賦予合成氣利用能力。
因此，鑒於本文提供之教示及指導，熟習此項技術者應瞭解，可產生當在諸如碳水化合物之碳源上生長時分泌本發明之生物合成化合物的非天然存在微生物有機體。該等化合物包括例如丁二烯及丁二烯路徑中之任何中間代謝物。僅需要工程改造入一或多種所需酶或蛋白質活性以達成所需化合物或中間物之生物合成，包括例如包涵一些或所有丁二烯生物合成路徑。因此，本發明提供當在碳水化合物或其他碳源上生長時產生及/或分泌丁二烯及當在碳水化合物或其他碳源上生長時產生及/或分泌丁二烯路徑中所示之任何中間代謝物的非天 然存在微生物有機體。本發明之產生丁二烯之微生物有機體可自例如以下中間物起始合成：乙醯乙醯基輔酶A、3-羥基丁醯基輔酶A、巴豆醯基輔酶A、巴豆醛、巴豆醇、2-丁烯基-磷酸、2-丁烯基-4-二磷酸、赤藻糖醇-4-磷酸、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇、2-磷酸基-4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇、赤藻糖醇-2,4-環二磷酸、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸、丁烯基4-二磷酸、2-丁烯基4-二磷酸、3-側氧基戊二醯基輔酶A、3-羥基戊二醯基輔酶A、3-羥基-5-側氧基戊酸、3,5-二羥基戊酸、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸、巴豆酸、赤藻糖、赤藻糖醇、3,5-二側氧基戊酸或5-羥基-3-側氧基戊酸。
本發明之非天然存在微生物有機體係以如本文所例示之此項技術中熟知之方法建構而以足以產生丁二烯之量外源表現至少一種編碼丁二烯路徑酶或蛋白質之核酸。應瞭解，本發明之微生物有機體係在足以產生丁二烯之條件下培養。根據本文提供之教示及指導，本發明之非天然存在微生物有機體可達成丁二烯之生物合成，使得細胞內濃度介於約0.001-2000mM或2000mM以上。一般而言，丁二烯之細胞內濃度介於約3-1500mM，尤其介於約5-1250mM且更尤其介於約8-1000mM，包括約10mM、100mM、200mM、500mM、800mM或800mM以上。自本發明之非天然存在微生物有機體亦可達成在各此等例示性範圍之間及以上之細胞內濃度。
在一些實施例中，培養條件包括厭氧或實質上厭氧生長或維持條件。先前已描述例示性厭氧條件且其為此項技術中所熟知。用於醱酵方法之例示性厭氧條件描述於本文中且例如描述於2007年8月10日申請之美國公開案2009/0047719中。任何此等條件以及此項技術中熟知之其他厭氧條件可供非天然存在微生物有機體使用。在該等厭氧或實質上厭氧條件下，丁二烯產生劑可合成細胞內濃度為5-10mM或10 mM以上以及本文中例示之所有其他濃度的丁二烯。應瞭解，儘管上文描述係指細胞內濃度，但產生丁二烯之微生物有機體可在細胞內產生丁二烯及/或將產物分泌至培養基中。
除本文揭示之培養及醱酵條件以外，用於達成丁二烯生物合成之生長條件可包括添加滲透保護劑(osmoprotectant)至培養條件。在某些實施例中，本發明之非天然存在微生物有機體可在滲透保護劑存在下如本文中所述維持、培養或醱酵。簡言之，滲透保護劑係指充當滲透溶質(osmolyte)且有助於如本文所述之微生物有機體經受得住滲透應力的化合物。滲透保護劑包括(但不限於)甜菜鹼、胺基酸及海藻糖。該等滲透保護劑之非限制性實例為甘胺酸甜菜鹼、堅果糖甜菜鹼、二甲基噻亭(dimethylthetin)、二甲基二氫硫基丙酸酯、3-二甲基二氫硫基-2-甲基丙酸酯、哌啶甲酸(pipecolic acid)、二甲基二氫硫基乙酸酯、膽鹼、L-肉鹼及艾克托因(ectoine)。在一態樣中，滲透保護劑為甘胺酸甜菜鹼。熟習此項技術者應瞭解，適於保護本文所述之微生物有機體免受滲透應力之滲透保護劑的量及類型將取決於所用微生物有機體。培養條件中滲透保護劑之量可為例如不大於約0.1mM、不大於約0.5mM、不大於約1.0mM、不大於約1.5mM、不大於約2.0mM、不大於約2.5mM、不大於約3.0mM、不大於約5.0mM、不大於約7.0mM、不大於約10mM、不大於約50mM、不大於約100mM或不大於約500mM。
培養條件可包括例如液體培養程序以及醱酵及其他大規模培養程序。如本文所述，本發明之生物合成產物之尤其有用產量可在厭氧或實質上厭氧培養條件下獲得。
如本文所述，用於達成丁二烯生物合成之一例示性生長條件包括厭氧培養或醱酵條件。在某些實施例中，本發明之非天然存在微生物有機體可在厭氧或實質上厭氧條件下維持、培養或醱酵。簡言之， 厭氧條件係指無氧環境。實質上厭氧條件包括例如培養、分批醱酵或連續醱酵以致培養基中所溶解之氧濃度保持介於飽和度之0與10%之間。實質上厭氧條件亦包括使在密封室內部之液體培養基中或固體瓊脂上生長或停留之細胞維持在小於1%氧之氛圍中。氧百分比可藉由例如用N2/CO2混合物或一或多種其他適合之非氧氣體噴射培養物來維持。
本文描述之培養條件可按比例擴大且連續生長以製造丁二烯。例示性生長程序包括例如分批饋料醱酵及分批分離；分批饋料醱酵及連續分離；或連續醱酵及連續分離。所有此等方法為此項技術中所熟知。醱酵程序尤其適用於生物合成產生商業量之丁二烯。一般而言，且如同非連續培養程序一樣，連續及/或接近連續產生丁二烯將包括在足夠營養素及培養基中培養本發明之產生非天然存在丁二烯的有機體以維持及/或機會維持以指數態生長。在該等條件下連續培養可包括例如生長1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或7天以上。另外，連續培養可包括1週、2週、3週、4週或5週或5週以上且至多若干月之較長時段。或者，若適於特定應用，則本發明之有機體可經培養數小時。應瞭解，連續及/或接近連續培養條件亦可包括介於此等例示性時期中的所有時間間隔。應進一步瞭解，培養本發明微生物有機體之時間為對於所需目的產生足夠量之產物的足夠時段。
醱酵程序為此項技術中所熟知。簡言之，用於生物合成產生丁二烯之醱酵可以例如分批饋料醱酵及分批分離；分批饋料醱酵及連續分離；或連續醱酵及連續分離方式利用。分批及連續醱酵程序之實例為此項技術中所熟知。
除了使用本發明之丁二烯產生劑連續產生大量丁二烯之上述醱酵程序之外，丁二烯產生劑亦可例如同時進行化學合成程序以將產物轉化為其他化合物，或可將產物與醱酵培養物分離且必要時繼續進行 化學轉化以將產物轉化為其他化合物。
為產生更佳產生劑，可利用代謝模型化來最佳化生長條件。模型化亦可用於設計另外最佳化路徑利用之基因剔除(參見例如美國專利公開案US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654及US 2004/0009466，及美國專利第7,127,379號)。模型化分析使得可靠預測代謝向更有效產生丁二烯方向移動對細胞生長之影響。
一種鑑別及設計有利於生物合成所需產物之代謝變化的計算方法為OptKnock計算框架(Burgard等人，Biotechnol.Bioeng.84：647-657(2003))。OptKnock為提出致使產生可過度產生目標產物之遺傳穩定微生物之基因缺失或破壞策略的代謝模型化及模擬程式。特定言之，該框架研究微生物之完全代謝及/或生物化學網路以提出迫使所需生物化學物質變成細胞生長之強制副產物的基因操縱。藉由經由策略安置之基因缺失或其他功能性基因破壞將生物化學產生與細胞生長偶合，在生物反應器中長時期後施加於經工程改造菌株上的生長選擇壓力使得效能由於與生長強制偶合之生物化學產生而得以改良。最後，當建構基因缺失時，因為由OptKnock所選之基因將自基因組完全移除，所以所設計菌株回復至其野生型狀態的可能性可忽略。因此，此計算方法可用於鑑別生物合成所需產物之替代路徑或與非天然存在微生物有機體結合使用以進一步最佳化所需產物之生物合成。
簡言之，OptKnock為本文中用於指模型化細胞代謝之計算方法及系統的術語。OptKnock程式係關於將特定約束併入通量平衡分析(flux balance analysis，FBA)模型中的模型框架及方法。此等約束包括例如定性動力學資訊、定性調節資訊及/或DNA微陣列實驗資料。OptKnock亦藉由例如收緊經由通量平衡模型獲得之通量邊界且隨後探測在基因添加或缺失存在下代謝網路之效能限度來計算各種代謝問 題之解決方案。OptKnock計算框架允許建構可有效查詢代謝網路之效能限度的模型組成且提供解決所得混合整數線性程式化問題的方法。本文稱為OptKnock之代謝模型化及模擬方法描述於例如2002年1月10日申請之美國公開案2002/0168654；2002年1月10日申請之國際專利第PCT/US02/00660號及2007年8月10日申請之美國公開案2009/0047719中。
另一鑑別及設計有利於生物合成產生產物之代謝變化的計算方法為稱作SimPheny®之代謝模型化及模擬系統。此計算方法及系統描述於例如2002年6月14日申請之美國公開案2003/0233218及2003年6月13日申請之國際專利申請案第PCT/US03/18838號中。SimPheny®為可用於產生電子雜交網路模型且模擬貫穿生物系統之化學反應之質量、能量或電荷之通量以限定含有系統中化學反應之任何及所有可能功能之解空間且進而確定生物系統之多種允許活性的計算系統。因為解空間係由諸如所包括反應之已知化學計量以及與貫穿反應之最大通量有關之反應熱力學及容量約束的約束限定，所以此方法稱作基於約束之模型化。由此等約束限定之空間可經詢問以確定生物系統或其生物化學組分之表型能力及特性。
此等計算方法與生物事實相一致，因為生物系統為靈活的且可以許多不同方式達到相同結果。生物系統係經由所有活系統必須面對之基本約束所限制的進化機制設計。因此，基於約束之模型化策略涵蓋此等一般事實。此外，經由收緊約束進一步對網路模型連續施加約束之能力使得解空間之大小減小，進而增強可預測生理學效能或表型之精確度。
鑒於本文提供之教示及指導，熟習此項技術者應能夠應用代謝模型化及模擬之各種計算框架來設計及實施所需化合物在宿主微生物有機體中之生物合成。該等代謝模型化及模擬方法包括例如上文例示 為SimPheny®及OptKnock之計算系統。對於本發明之說明，本文中關於模型化及模擬之OptKnock計算框架來描述一些方法。熟習此項技術者應知曉如何將使用OptKnock對代謝變化之鑑別、設計及實施應用於此項技術中熟知之任何該等其他代謝模型化及模擬計算框架及方法。
上述方法將提供一組代謝反應以破壞。消除組內各反應或代謝修飾可使所需產物在有機體之生長階段內作為強制產物。因為反應係已知，所以雙層OptKnock問題之解決方案將提供一或多種編碼催化該組反應內各反應之一或多種酶的相關基因。鑑別一組反應及其編碼參與各反應之酶的相應基因一般為經由反應與具有酶與編碼基因之間的關係之反應資料庫之相關性實現的自動過程。
一旦經鑑別，即藉由功能破壞至少一種編碼組內各代謝反應之基因在目標細胞或有機體中實施待加以破壞以達成產生所需產物之該組反應。達成反應組之功能破壞之一尤其有用方式為藉由缺失各編碼基因。然而，在一些情況下，藉由包括例如突變、調節區域(諸如啟動子)或調節因子之順式結合位點缺失的其他基因異常，或藉由在多個位置中之任何位置截斷編碼序列來破壞反應可為有利的。例如當需要快速評估產物偶合時或當基因回復不太可能發生時，產生小於基因組之總缺失的此等後者異常可為有用的。
為鑑別使得其他組反應經破壞或引起可產生生物合成(包括與生長偶合之所需產物生物合成)之代謝修飾的上述雙層OptKnock問題之其他生產性解決方案，可實施稱作整數切割(integer cuts)之最佳化方法。此方法藉由在各迭代時併入稱作整數切割之另一約束來迭代求解上文例示之OptKnock問題而進行。整數切割約束有效防止求解程序選擇在強制偶合產物生物合成與生長之任何先前迭代中所鑑別之完全相同組反應。舉例而言，若先前鑑別之生長偶合代謝修飾指定反應 1、2及3用於破壞，則以下約束防止在隨後解決方案中同時考慮相同反應。整數切割方法為此項技術中所熟知且可見描述於例如Burgard等人，Biotechnol.Prog.17：791-797(2001)中。如同本文關於與代謝模型化及模擬之OptKnock計算框架組合使用所述的所有方法一樣，減少迭代計算分析中之冗餘的整數切割方法亦可與此項技術中熟知之其他計算框架(包括例如SimPheny®)一起應用。
本文例示之方法允許建構生物合成性產生所需產物之細胞及有機體，包括將目標生物化學產物製備與經工程改造以具有所鑑別遺傳改變之細胞或有機體的生長強制偶合。因此，本文所述之計算方法允許鑑別及實施由選自OptKnock或SimPheny®之電子雜交方法鑑別的代謝修飾。該代謝修飾集合可包括例如添加一或多種生物合成路徑酶及/或功能破壞一或多種代謝反應(包括例如藉由基因缺失破壞)。
如上文所述，在當進行長時期生長選擇時突變微生物網路可向其經計算方法預測之最大生長表型進化之前提下開發OptKnock方法。換言之，該方法槓桿調節有機體在選擇性壓力下自最佳化之能力。OptKnock框架允許詳盡列舉基於網路化學計量迫使生物化學產生與細胞生長之間偶合的基因缺失組合。鑑別最佳基因/反應剔除需要雙層最佳化問題之解決方案，其選擇活性反應組以使得所得網路之最佳生長解決方案過度產生相關生物化學物質(Burgard等人，Biotechnol.Bioeng.84：647-657(2003))。
大腸桿菌代謝之電子雜交化學計量模型可用於鑑別如先前所例示且例如以下文獻中所述之代謝路徑之基本基因：美國專利公開案US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654及US 2004/0009466，及美國專利第7,127,379號。如本文所揭示，OptKnock數學框架可應用於精確定位引起與生長偶合之所需產物產生之基因缺 失。此外，雙層OptKnock問題之解決方案僅提供一組缺失。為列舉所有有意義之解決方案，亦即引起形成與生長偶合之產生的所有組剔除，可實施稱作整數切割之最佳化技術。此使得能夠藉由在各迭代時併入稱作整數切割之另一約束來迭代求解OptKnock問題，如上文所述。
如本文所揭示，可將編碼丁二烯路徑所需活性之核酸引入宿主有機體中。在一些情況下，可能需要改變丁二烯路徑酶或蛋白質之活性以增加丁二烯之產生。舉例而言，可將增加蛋白質或酶之活性的已知突變引入編碼核酸分子中。另外，可應用最佳化方法以增加酶或蛋白質之活性及/或降低抑制活性，例如降低負調節劑活性。
一種此最佳化方法為定向進化(directed evolution)。定向進化為涉及引入靶向特定基因之突變以改良及/或改變酶性質的有效方法。可經由開發及實施允許自動篩選許多酶變異體(例如>104)之靈敏性高產量篩選檢定來鑑別改良及/或改變之酶。通常進行突變誘發及篩選之迭代循環以得到具有最佳化性質之酶。亦已開發出可有助於鑑別用於突變誘發之基因區域的計算演算法且其可顯著降低需要產生且篩選之酶變異體的數目。已開發可有效產生多樣化變異體文庫之眾多定向進化技術(關於評述，參見Hibbert等人，Biomol.Eng 22：11-19(2005)；Huisman及Lalonde,Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries第717-742頁(2007),Patel(編)，CRC Press；Otten及Quax.Biomol.Eng 22：1-9(2005)；及Sen等人，Appl Biochem.Biotechnol 143：212-223(2007))，且此等方法已成功應用於改良許多酶類別之多種性質。已藉由定向進化技術改良及/或改變之酶特性包括例如：選擇性/特異性，關於非天然受質之轉化；溫度穩定性，關於穩固高溫加工；pH值穩定性，關於在較低或較高pH值條件下生物加工；受質或產物耐受性，以致可達成高產物效價；結合(Km)，包括 拓寬受質結合以包括非天然受質；抑制(Ki)，以藉由產物、受質或關鍵中間物移除抑制；活性(kcat)，以增加達成所需通量之酶促反應速率；表現量，以增加蛋白質產量及總路徑通量；氧穩定性，關於在需氧條件下操作空氣敏感性酶；及厭氧活性，關於在氧不存在下操作需氧酶。
下文更詳細描述已開發用於突變誘發及多樣化基因以靶向特定酶之所需性質的例示性方法。熟習此項技術者熟知該等方法。任何此等方法可用於改變及/或最佳化丁二烯路徑酶或蛋白質之活性。
EpPCR(Pritchard等人，J Theor.Biol.234：497-509(2005))藉由添加Mn2+離子、藉由偏離dNTP濃度或藉由其他條件變化而在PCR反應中降低DNA聚合酶之保真度來引入隨機點突變。將突變誘發限定於相關目標基因之五步選殖法包括：1)相關基因之易誤PCR擴增；2)限制酶消化；3)所需DNA片段之凝膠純化；4)接合至載體中；5)基因變異體轉化至適合宿主中且針對改良之效能篩選文庫。此方法可在單個基因中同時產生多個突變，其可用於篩選較大數目之具有所需活性之潛在變異體。可藉由EpPCR產生較高數目之突變體，因此高產量篩選檢定或選擇方法(例如使用機器人技術)可用於鑑別具有理想特徵之突變體。
易誤滾環擴增(Error-prone Rolling Circle Amplification，epRCA)(Fujii等人，Nucleic Acids Res.32：e145(2004)；及Fujii等人，Nat.Protoc.1：2493-2497(2006))具有許多與epPCR相同之要素，其中例外為使用完整圓形質體作為模板且使用在最後2個核苷酸上具有外切核酸酶抗性硫代磷酸酯鍵之隨機6聚體來擴增質體，接著轉化至在串聯重複單元處再環化質體之細胞中。調節Mn2+濃度可在某種程度上改變突變率。此技術使用簡單的易誤、單步法來產生具有3-4個突變/kbp之質體的完全複本。無需限制酶消化或特定引子。另外，此方法 通常可以市售套組形式獲得。
DNA或家族改組(Stemmer,Proc Natl Acad Sci USA 91：10747-10751(1994)；及Stemmer,Nature 370：389-391(1994))通常包括用核酸酶(諸如Dnase I或EndoV)消化兩種或兩種以上變異基因以產生隨機片段之彙集，該等片段係藉由在DNA聚合酶存在下黏接及延伸之循環再裝配以產生嵌合基因文庫。片段彼此引導且當一複本引導另一複本時發生重組(模板切換)。此方法可用於>1kbp DNA序列。除了由片段再裝配產生之突變重組體之外，此方法以類似於易誤PCR之速率在延伸步驟中引入點突變。該方法可用於移除有害、隨機及中性突變。
交錯延伸(Staggered Extension，StEP)(Zhao等人，Nat.Biotechnol.16：258-261(1998))使得能夠在變性及極短黏接/延伸持續時間(短至5秒)下進行模板引導，接著進行2步PCR之重複循環。生長之片段黏接至不同模板且進一步延伸，重複該步驟直至獲得全長序列。模板切換意謂大多數所得片段具有多個親本。低保真度聚合酶(Taq及Mutazyme)之組合由於相反突變範圍而降低易誤偏差。
在隨機引發重組(Random Priming Recombination，RPR)隨機序列中，使用引子產生許多與模板之不同區段互補之短DNA片段(Shao等人，Nucleic Acids Res 26：681-683(1998))。鹼基錯誤併入及經由epPCR錯誤引導得到點突變。短DNA片段基於同源性彼此引導且藉由重複熱循環重組且再裝配成全長DNA。在此步驟前移除模板確保低親本重組體。與大多數其他方法相同，此方法可經多次迭代進行以發展不同性質。此技術避免序列偏差，與基因長度無關，且關於應用需要極少親本DNA。
在異雙螺旋重組中，使用線性化質體DNA來形成由錯配修復而修復之異雙螺旋(Volkov等人，Nucleic Acids Res.27：e18(1999)；及Volkov等人，Methods Enzymol.328：456-463(2000))。錯配修復步驟 至少在某種程度上具誘變性。異雙螺旋比線性同雙螺旋更有效地轉型。此方法適於較大基因及完整操縱子。
短暫模板隨機嵌合發生法(Random Chimeragenesis on Transient Templates，RACHITT)(Coco等人，Nat.Biotechnol.19：354-359(2001))係使用單股DNA(ssDNA)之Dnase I斷裂及尺寸分級。同源片段在不存在聚合酶之情況下雜交成互補ssDNA骨架。任何重疊之未雜交片段末端係由外切核酸酶裁減。片段之間的間隙經過填充，隨後接合，得到經雜交成骨架之全長多樣化股的彙集物，其含有U以阻止擴增。隨後破壞骨架，且由藉由PCR擴增而與多樣化股互補之新股置換。該方法包括僅來自一親本之一股(骨架)，而引導片段則源自其他基因；親本骨架係相反選擇。因此，不會與親本片段再黏接。用外切核酸酶修剪重疊片段。否則，其在概念上與DNA改組及StEP類似。因此，應不存在同胞、幾乎沒有非活性之親本且沒有未改組之親本。此技術之優點在於產生很少或不產生親本基因，且相對於標準DNA改組可產生更多交配。
截短模板重組延伸法(Recombined Extension on Truncated templates，RETT)係使來自引子之單向生長股能夠在用作模板彙集物之單向ssDNA片段存在下進行模板切換(Lee等人，J.Molec.Catalysis 26：119-129(2003))。未使用DNA核酸內切酶。單向ssDNA係在隨機引子下藉由DNA聚合酶製得或在外切核酸酶下藉由連續缺失製得。單向ssDNA僅為模板且非引子。隨機引導及外切核酸酶並未引入DNA改組/RACHITT之酶促裂解真正偏好之序列。RETT可比StEP更容易最佳化，因為其使用正常PCR條件來替代極短延伸。重組過程成為PCR步驟之組成分，亦即，無直接改組。此方法亦可由於沒有暫停期而比StEP更隨機。
在簡併寡核苷酸基因改組法(Degenerate Oligonucleotide Gene Shuffling，DOGS)中，使用簡併引子來控制分子之間的重組(Bergquist及Gibbs,Methods Mol.Biol 352：191-204(2007)；Bergquist等人，Biomol.Eng 22：63-72(2005)；Gibbs等人，Gene 271：13-20(2001))，此可用於控制諸如DNA改組之其他方法再生親本基因之趨勢。此方法可與所選基因區段之隨機突變誘發(epPCR)組合。此可為阻斷再形成親本序列之良好方法。無需核酸內切酶。藉由調節所製得區段之輸入濃度，可偏向所需主鏈。此方法允許在無限制酶消化之情況下，自不相關親本進行DNA改組，且允許選擇隨機突變誘發方法。
產生雜合酶之遞增式截短法(Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes，ITCHY)可產生組合文庫，其中相關基因或基因片段具有1個鹼基對缺失(Ostermeier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：3562-3567(1999)；及Ostermeier等人，Nat.Biotechnol.17：1205-1209(1999))。在2個不同基因片上以相反方向引入截短。將此等截短物接合在一起且選殖融合物。此技術不需2個親本基因之間的同源性。當將ITCHY與DNA改組組合時，該系統稱作SCRATCHY(參見下文)。兩者之主要優點為無需親本基因之間的同源性；例如，經由ITCHY產生大腸桿菌與人類基因之間的功能融合物。當製得ITCHY文庫時，捕捉所有可能之交配物。
產生雜合酶之硫遞增式截短法(Thio-Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes，THIO-ITCHY)與ITCHY類似，其中例外為使用硫代磷酸酯dNTP來產生截短(Lutz等人，Nucleic Acids Res 29：E16(2001))。相對於ITCHY，THIO-ITCHY可更容易最佳化，提供更多再現性及可調節性。
SCRATCHY將重組基因之兩種方法ITCHY及DNA改組組合(Lutz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：11248-11253(2001))。SCRATCHY將ITCHY與DNA改組之最佳特徵組合。首先，以與DNA 同源性無關之方式使用ITCHY來產生基因片段之間之融合物的詳盡集合。此人工家族隨後進行DNA改組步驟以增加交配物數目。計算預測可用於最佳化中。當序列一致性低於80%時，SCRATCHY比DNA改組更有效。
在隨機漂移突變誘發(Random Drift Mutagenesis，RNDM)中，經由epPCR進行突變，接著篩選/選擇保持可用活性者(Bergquist等人，Biomol.Eng.22：63-72(2005))。隨後，將此等物質用於DOGS中以產生具有多種活性突變體之間或活性突變體與一些其他所需親本之間之融合物的重組體。設計以促進中性突變分離；其目的在於篩選保持催化活性者，無論此活性高於抑或低於原始基因中之活性。當篩選能夠偵測高於背景之活性時，RNDM可用於高產量檢定中。在產生多樣性時，RNDM已用作DOGS之前端。該技術在改組或其他後續步驟之前賦予活性需求；中性漂變文庫指示自較小文庫產生較高/較快活性改良。儘管使用epPCR公開，但此可應用於其他大規模突變誘發方法。
序列飽和突變誘發(Sequence Saturation Mutagenesis，SeSaM)為一種隨機突變誘發方法，其：1)使用隨機併入硫代磷酸酯核苷酸及裂解產生隨機長度片段之彙集物；此彙集物用作模板以2)在諸如肌苷之「通用」鹼基存在下延伸；3)複製含肌苷補體，得到隨機鹼基併入且因此突變誘發(Wong等人，Biotechnol.J.3：74-82(2008)；Wong等人，Nucleic Acids Res.32：e26(2004)；及Wong等人，Anal.Biochem.341：187-189(2005))。使用此技術，有可能使用簡單方法在2至3天內產生較大突變體文庫。此技術與DNA聚合酶之突變偏好相比具非定向性。此方法中之差異使得此技術與epPCR互補(或為替代)。
在合成改組中，重疊寡核苷酸經設計以編碼「目標中之所有遺傳多樣性」且允許經改組後代之極高多樣性(Ness等人，Nat.Biotechnol.20：1251-1255(2002))。在此技術中，可設計待改組之片 段。此有助於增加所得後代多樣性。可設計序列/密碼子偏好以使得更遠緣相關之序列以接近更緊密相關序列所觀測之速率重組。另外，該技術不需要物理加工模板基因。
核苷酸交換及切除技術(Nucleotide Exchange and Excision Technology，NexT)利用以下之組合：dUTP併入，接著依次用尿嘧啶DNA糖基化酶及哌啶處理以進行端點DNA片段化(Muller等人，Nucleic Acids Res.33：e117(2005))。在校正聚合酶下使用內部PCR引子延伸再裝配基因。改組尺寸可使用不同之dUPT：dTTP比率直接控制。此為使用尿嘧啶併入及裂解之簡單方法的端點反應。此方法可使用諸如8-側氧基-鳥嘌呤之其他核苷酸類似物。另外，該技術在極短片段(86bp)下作用良好且具有低誤差率。此技術中所用DNA之化學裂解產生極少未改組純系。
在與序列同源性無關之蛋白質重組(Sequence Homology-Independent Protein Recombination，SHIPREC)中，使用連接子來促進兩種遠緣相關或不相關基因之間的融合。使用核酸酶處理產生兩種基因之間的多種嵌合體。此等融合物產生單交配雜合體之文庫(Sieber等人，Nat.Biotechnol.19：456-460(2001))。此產生有限類型之改組且突變誘發需要另一方法。另外，因為無需同源性，所以此技術可產生兩種不相關親本基因之每一者之分率不同的嵌合體文庫。用與哺乳動物CP450之N端域融合之細菌CP450的血紅素結合域來測試SHIPREC；其在可溶性更大之酶中產生哺乳動物活性。
在基因位點飽和突變誘發TM(Gene Site Saturation MutagenesisTM，GSSMTM)中，起始物質為含有一個插入子及兩個引子之超螺旋dsDNA質體，其係在所需突變位點簡併(Kretz等人，Methods Enzymol.388：3-11(2004))。帶有相關突變之引子黏接至相反DNA股上之相同序列。突變通常在引子中部且由恰當序列之約20個核苷酸側 接在各側上。引子中之序列為NNN或NNK(編碼)及MNN(非編碼)(所有N皆=4，K=G、T，M=A，C)。延伸後，使用DpnI來消化dam甲基化DNA以消除野生型模板。此技術在既定位點(亦即，一密碼子)探索所有可能之胺基酸取代。該技術促進在不具有無義密碼子之情況下在單一位點產生所有可能之置換且產生大多數可能之對偶基因之相等至接近相等表示。此技術不需要對目標酶之結構、機制或領域的先前瞭解。若接著改組或基因再裝配，則此技術產生含有單一位點向上突變之所有可能組合之重組體的多樣化文庫。此技術組合之有用性已關於50種以上不同酶之成功進化以及既定酶中之一種以上性質得以證實。
組合卡匣突變誘發(Combinatorial Cassette Mutagenesis，CCM)包括使用短寡核苷酸卡匣來置換具有大量可能之胺基酸序列改變的有限區域(Reidhaar-Olson等人，Methods Enzymol.208：564-586(1991)；及Reidhaar-Olson等人，Science 241：53-57(1988))。使用此技術可能在兩個或三個位點同時取代。另外，該方法測試有限範圍之位點處較大多重性之可能序列變化。此技術已用於探索λ抑制子DNA結合域之資訊內容。
組合多卡匣突變誘發(Combinatorial Multiple Cassette Mutagenesis，CMCM)與CCM基本上類似，其中例外為其用作較大程式之一部分：1)在高突變率下使用epPCR以2)鑑別熱點及熱區域且隨後3)藉由CMCM延伸以覆蓋蛋白質序列空間之限定區域(Reetz等人，Angew.Chem.Int.Ed Engl.40：3589-3591(2001))。與CCM一樣，此方法可實際上測試目標區域上所有可能之改變。若與用於產生隨機突變及改組基因之方法一起使用，則其提供產生多樣化改組蛋白之優良手段。此方法可成功地使酶之對映選擇性增加51倍。
在突變子菌株技術中，習知ts突變子質體在選擇期間及在不需要選擇時阻斷有害突變積聚期間使隨機及天然突變頻率增加20至4000倍 (Selifonova等人，Appl.Environ.Microbiol.67：3645-3649(2001))。此技術係基於源自質體之mutD5基因，其編碼DNA聚合酶III之突變體次單元。此次單元結合至內源DNA聚合酶III且在任何具有該質體之菌株中有損聚合酶III之校正能力。寬泛範圍之鹼基取代及移碼突變發生。為了有效使用，突變子質體應在達成所需表型後立即移除；此係經由溫度敏感性(ts)複製起點實現，其使得質體在41℃下固化。應注意，已對突變子菌株探索相當長時間(參見Low等人，J.Mol.Biol.260：359-3680(1996))。在此技術中，觀測到極高自發突變率。條件性質使非所需背景突變最小化。此技術可與適應進化組合以增強突變誘發率且更迅速地達成所需表型。
瀏覽突變誘發(Look-Through Mutagenesis，LTM)為一種評估且最佳化所選胺基酸之組合突變的多維突變誘發方法(Rajpal等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：8466-8471(2005))。並非用所有可能之胺基酸變化飽和各位點，選擇一組9個以覆蓋胺基酸R基團化學之範圍。每個位點較少變化使得多個位點經受此類型之突變誘發。已經由此方法達成對於低奈米莫耳至皮莫耳之抗體的結合親和力增加800倍以上。此為最小化隨機組合之數目的合理方法且可藉由極大降低待篩選之純系的數目增加找出改良之特性的能力。此已應用於抗體工程，特定言之用於增加結合親和力及/或降低解離。該技術可與篩選或選擇組合。
基因再裝配(Gene Reassembly)為可同時應用於多個基因或用於產生單一基因之嵌合體大型文庫(多種突變)的DNA改組方法(由Verenium公司提供之可調節基因再裝配TM(GeneReassemblyTM，TGRTM)技術)。通常此技術與超高產量篩選組合用於查詢所表示序列空間之所需改良。此技術允許在與同源性無關之情況下進行多基因重組。可使用經由生物資訊分析設計之片段預先確定交配事件之確切數目及位置。此 技術導致多樣性程度極高，其中實際上無親本基因再形成且非活性基因含量較低。與GSSMTM組合，可測試較大範圍突變之改良活性。該方法允許DNA改組之「摻合」及「精細調節」，例如，密碼子使用可經最佳化。
電子雜交蛋白質設計自動化(In Silico Protein Design Automation，PDA)為錨定具有特定摺疊之結構上限定之蛋白質主鏈且搜索可使摺疊及總體蛋白質能量學穩定化的用於胺基酸取代之序列空間的最佳化演算法(Hayes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：15926-15931(2002))。此技術使用基於電子雜交結構之熵的預測以探索針對蛋白質胺基酸變化之結構耐受性。應用統計力學來計算各位置處之偶合相互作用。針對胺基酸取代之結構耐受性為偶合之量度。最終，此技術經設計以得到蛋白質性質之所需修飾，同時維持結構特徵之完整性。該方法利用計算方法評估且允許過濾極大數目之可能的序列變異體(1050)。用於測試之序列變異體之選擇與基於最有利熱力學進行之預測有關。利用此技術可有效處理表面上僅穩定性或與穩定性相關聯之性質。該方法已成功地用於一些治療性蛋白中，尤其用於工程改造免疫球蛋白。電子雜交預測避免測試非常大數目之可能變異體。基於現有三維結構之預測比基於假定結構之預測更可能成功。此技術可容易地預測且允許對多種同時突變進行靶向篩選，該多種同時突變有時由於數目指數性增加而在純實驗技術下不可能預測。
迭代飽和突變誘發(Iterative Saturation Mutagenesis，ISM)包括：1)使用結構/功能知識來選擇酶改良之可能位點；2)使用諸如Stratagene QuikChange(Stratagene；San Diego CA)之突變誘發方法在所選位點進行飽和突變誘發；3)針對所需性質進行篩選/選擇；及4)使用經改良之純系，在另一位點重新開始且繼續重複，直至達成所需活性(Reetz等人，Nat.Protoc.2：891-903(2007)；及Reetz等人，Angew. Chem.Int.Ed Engl.45：7745-7751(2006))。此為經證實之方法，其確保用於篩選/選擇的所有可能置換皆在既定位置進行。
任何上述突變誘發方法可單獨或以任何組合形式使用。另外，定向進化方法中之任一者或組合可與如本文所述之適應進化技術結合使用。
應瞭解，本文提供之本發明定義中亦提供實質上不影響本發明之各種實施例之活性的修飾。因此，以下實例意欲說明而非限制本發明。
實例I 產生丁二烯之路徑
本文揭示使用具有將常見代謝物轉化為四碳二烯(1,3-丁二烯)所必需之酶的經工程改造之非天然微生物直接產生丁二烯之新穎方法。一直接產生丁二烯之新穎途徑需要以下步驟：經由醛及醇去氫酶還原使已知丁醇路徑代謝物巴豆醯基輔酶A還原為巴豆醇，接著用激酶磷酸化得到焦磷酸巴豆酯且隨後使用異戊二烯合成酶或其變異體轉化為丁二烯(參見圖2)。另一途徑(圖3)為用於類異戊二烯生物合成之經充分表徵DXP路徑之變異體。在此途徑中，受質缺乏2-甲基且經由丁二烯合成酶提供丁二烯而非異戊二烯。該丁二烯合成酶可利用諸如本文所述之定向進化之方法衍生自異戊二烯合成酶。最終，圖4顯示包括受質3-羥基戊二醯基輔酶A之丁二烯路徑，該受質充當天然甲羥戊酸路徑受質3-羥基-3-甲基-戊二醯基輔酶A(顯示於圖1中)之替代物。下文提供圖2之步驟A-P、圖3之步驟A-K及圖4之步驟A-O的酶候選物。
乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶(圖2，步驟A)
乙醯乙醯基輔酶A硫解酶將兩分子乙醯基輔酶A轉化為各一分子乙醯乙醯基輔酶A及輔酶A。例示性乙醯乙醯基輔酶A硫解酶包括來自大腸桿菌之atoB(Martin等人，Nat.Biotechnol 21：796-802(2003))、來 自丙酮丁醇梭菌之thlA及thlB(Hanai等人，Appl Environ Microbiol 73：7814-7818(2007)；Winzer等人，J.Mol.Microbiol Biotechnol 2：531-541(2000))及來自釀酒酵母之ERG10(Hiser等人，J.Biol.Chem.269：31383-31389(1994))的基因產物。
乙醯乙醯基輔酶A還原酶(圖2，步驟B)
催化乙醯乙醯基輔酶A還原為3-羥基丁醯基輔酶A之乙醯乙醯基輔酶A還原酶在若干種梭菌屬(Clostridia)物種中參與乙醯基輔酶A轉化為丁酸之醱酵路徑且已詳細研究(Jones等人，Microbiol Rev.50：484-524(1986))。由hbd編碼之來自丙酮丁醇梭菌之酶已經選殖且於大腸桿菌中功能性表現(Youngleson等人，J Bacteriol.171：6800-6807(1989))。另外，大腸桿菌中由fadB及fadJ編碼之兩種脂肪酸氧化複合物之次單元充當3-羥基醯基輔酶A去氫酶(Binstock等人，Methods Enzymol.71 Pt C：403-411(1981))。顯示可將乙醯乙醯基輔酶A還原為3-羥基丁醯基輔酶A之其他基因候選物為來自生枝動膠菌之phbB(Ploux等人，Eur.J Biochem.174：177-182(1988))及來自球形紅桿菌之phaB(Alber等人，Mol.Microbiol 61：297-309(2006))。先前基因候選物具有NADPH依賴性，其核苷酸序列已經確定(Peoples等人，Mol.Microbiol 3：349-357(1989))且基因已於大腸桿菌中表現。對於基因之受質特異性研究產生以下結論：除乙醯乙醯基輔酶A以外，其可接受3-側氧基丙醯基輔酶A作為受質(Ploux等人，同上，(1988))。其他基因候選物包括克氏梭菌中之Hbd1(C端域)及Hbd2(N端域)(Hillmer 及Gottschalk,Biochim.Biophys.Acta 3334：12-23(1974))及溫帶牛中之HSD17B10(WAKIL等人，J Biol.Chem.207：631-638(1954))。
多種類似酶已發現於梭菌屬之其他物種及勤奮金屬球菌中(Berg等人，Science.318：1782-1786(2007))。
3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶(圖2，步驟C)
3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶(EC 4.2.1.55)(亦稱為巴豆酸酶)為烯醯基輔酶A水合酶，其可逆地將3-羥基丁醯基輔酶A脫水以形成巴豆醯基輔酶A。在一些有機體、尤其梭菌屬物種中形成正丁醇需要巴豆酸酶，且亦包含在硫化葉菌(Sulfolobus)屬、嗜酸兩面菌(Acidianus)屬及金屬球菌(Metallosphaera)屬之嗜熱嗜酸古菌中3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環之一步驟。編碼巴豆酸酶之例示性基因可發現於丙酮丁醇梭菌(Atsumi等人，Metab Eng.10：305-311(2008)；Boynton等人，J Bacteriol.178：3015-3024(1996))、克氏梭菌(Hillmer等人，FEBS Lett. 21：351-354(1972))及勤奮金屬球菌(Berg等人，Science 318：1782-1786(2007a))中，但後者基因之序列尚未知。由ech編碼之惡臭假單胞菌之烯醯基輔酶A水合酶催化巴豆醯基輔酶A轉化為3-羥基丁醯基輔酶A(Roberts等人，Arch Microbiol.117：99-108(1978))。其他烯醯基輔酶A水合酶候選物為惡臭假單胞菌之phaA及phaB，以及來自螢光假單胞菌之paaA及paaB(Olivera等人，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 95：6419-6424(1998))。最後，已顯示多種大腸桿菌基因展示烯醯基輔酶A水合酶功能性，包括maoC(Park等人，J Bacteriol.185：5391-5397(2003))、paaF(Ismail等人，Eur.J Biochem.270：3047-3054(2003)；Park等人，Appl.Biochem.Biotechnol 113-116：335-346(2004)；Park等人，Biotechnol Bioeng 86：681-686(2004))及paaG(Ismail等人，同上，(2003)；Park及Lee，同上，(2004)；Park及Yup，同上，(2004))。下文鑑別此等蛋白質。
巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)(圖2，步驟D)
若干種醯基輔酶A去氫酶能夠將醯基輔酶A還原為其相應醛。因此其可天然地將巴豆醯基輔酶A還原為巴豆醛或可經工程改造以將巴豆醯基輔酶A還原為巴豆醛。編碼該等酶之例示性基因包括編碼脂肪 醯基輔酶A還原酶之乙酸鈣不動桿菌acr1(Reiser等人，J.Bacteriol.179：2969-2975(1997))、不動桿菌屬M-1脂肪醯基輔酶A還原酶(Ishige等人，Appl.Environ.Microbiol.68：1192-1195(2002))及由克氏梭菌中之sucD基因編碼的輔酶A及NADP依賴性丁二酸半醛去氫酶(Sohling等人，J Bacteriol.178：871-880(1996)；Sohling等人，J.Bacteriol.178：871-80(1996))。牙齦卟啉單胞菌之SucD為另一種丁二酸半醛去氫酶(Takahashi等人，J.Bacteriol.182：4704-4710(2000))。此等丁二酸半醛去氫酶特定展示於文獻(Burk等人，WO/2008/115840：(2008))中以將4-羥基丁醯基輔酶A轉化為4-羥基丁醛作為產生1,4-丁二醇之路徑的一部分。由bphG編碼之醯化假單胞菌屬中之乙醛去氫酶的酶為另一種有效酶，因為已證明其氧化且醯化乙醛、丙醛、丁醛、異丁醛及甲醛(Powlowski等人，J.Bacteriol.175：377-385(1993))。
將醯基輔酶A轉化為其相應醛之另一類酶為丙二醯基輔酶A還原酶，其將丙二醯基輔酶A轉化為丙二酸半醛。丙二醯基輔酶A還原酶為在嗜熱嗜酸古細菌中經由3-羥基丙酸循環進行自養碳固定中的關鍵酶(Berg等人，Science 318：1782-1786(2007b)；Thauer,318：1732-1733(2007))。該酶利用NADPH作為輔因子且已於金屬球菌屬及硫化葉菌屬中表徵(Alber等人，J.Bacteriol.188：8551-8559(2006)；Hugler等人，J.Bacteriol.184：2404-2410(2002))。該酶由勤奮金屬球菌中之Msed_0709編碼(Alber等人，同上，(2006)；Berg等人，同上， (2007b))。編碼來自東大硫化葉菌之丙二醯基輔酶A還原酶的基因經選殖且於大腸桿菌中異源表現(Alber等人，同上，(2006))。儘管此等酶之醛去氫酶功能性與來自橙色綠曲撓菌之雙功能去氫酶類似，但序列相似性很小。兩種丙二醯基輔酶A還原酶候選物與天冬胺酸-半醛去氫酶(催化天冬胺醯基-4-磷酸還原且同時去磷酸化為天冬胺酸半醛的酶)具有高序列相似性。其他基因候選物可依據蛋白質序列同源性而發現於包括硫磺礦硫化葉菌及嗜酸熱硫化葉菌之其他有機體中。輔酶A醯化醛去氫酶之另一候選物為來自拜氏梭菌之ald基因(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65：4973-4980(1999))。據報導此酶將乙醯基輔酶A及丁醯基輔酶A還原為其相應醛。此基因與編碼傷寒沙門氏菌及大腸桿菌之乙醛去氫酶的eutE極為相似(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65：4973-4980(1999))。下文鑑別此等蛋白質。
巴豆醛還原酶(醇形成)(圖2，步驟E)
展現巴豆醛還原酶(醇形成)活性之酶能夠自巴豆醛形成巴豆醇。下列酶可天然具有其活性或可經工程改造以展現其活性。編碼催化醛轉化為醇之酶(亦即，醇去氫酶或等效醛還原酶)的例示性基因包括編碼C2-C14之中鏈醇去氫酶的alrA(Tani等人，Appl.Environ.Microbiol.66：5231-5235(2000))、來自釀酒酵母之ADH2(Atsumi等人，Nature 451：86-89(2008))、對長於C(3)之分子具優先性的來自大腸桿菌之 yqhD(Sulzenbacher等人，J.Mol.Biol.342：489-502(2004))，及來自丙酮丁醇梭菌之bdh I及bdh II(其將丁醛轉化為丁醇)(Walter等人，J.Bacteriol.174：7149-7158(1992))。已證明來自運動醱酵單胞菌之ADH1對多種醛具有活性，包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛及丙烯醛(Kinoshita,Appl.Microbiol.Biotechnol.22：249-254(1985))。來自拜氏梭菌NCIMB 8052之Cbei_2181編碼能夠將巴豆醛轉化為巴豆醇之另一有用醇去氫酶。
展現4-羥基丁酸去氫酶活性之酶(EC 1.1.1.61)亦屬於此類別。該等酶已於真養羅爾斯頓氏菌(Bravo等人，J.Forensic Sci.49：379-387(2004))、克氏梭菌(Wolff等人，ProteinExpr.Purif.6：206-212(1995))及阿拉伯芥(Breitkreuz等人，J.Biol.Chem.278：41552-41556(2003))中表徵。
巴豆醇激酶(圖2，步驟F)
巴豆醇激酶催化巴豆醇之磷酸基轉化為羥基。下文所述之酶天然具有該活性或可經工程改造以展現此活性。催化磷酸基向醇基轉移的激酶為EC 2.7.1酶類別之成員。下表列出EC 2.7.1酶類別中若干有 用之激酶。
此步驟之良好候選物為磷酸化3,5-二羥基戊酸之甲基類似物甲羥戊酸之末端羥基的甲羥戊酸激酶(EC 2.7.1.36)。此步驟之一些基因候選物為來自釀酒酵母之erg12、來自詹氏甲烷球菌之mvk、來自智人之MVK及來自阿拉伯芥col之mvk。
甘油激酶亦磷酸化甘油中之末端羥基以形成甘油-3-磷酸。此反應在若干物種中發生，包括大腸桿菌、釀酒酵母及海棲熱袍菌。大腸桿菌甘油激酶已顯示接受諸如二羥基丙酮及甘油醛之替代受質(Hayashi等人，J Biol.Chem.242：1030-1035(1967))。海棲熱袍菌具有兩種甘油激酶(Nelson等人，Nature 399：323-329(1999))。甘油激酶已顯示具有廣泛多種受質特異性。Crans及Whiteside研究來自四種不同有機體之甘油激酶(大腸桿菌、釀酒酵母、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)及黏膜念珠菌(Candida mycoderma))(Crans等人，J.Am.Chem.Soc.107：7008-7018(2010)；Nelson等人，同上，(1999))。其研究66種不同之甘油類似物且推斷出：酶可接受多種取代基來替代一末端羥基且C2處之氫原子可由甲基置換。有趣的是，來自所有四種有機體之酶的動力學常數極為相似。基因候選物為：
高絲胺酸激酶為可導致3,5-二羥基戊酸磷酸化之另一可能候選物。此酶亦存在於包括大腸桿菌、鏈黴菌屬及釀酒酵母之多種有機體中。來自大腸桿菌之高絲胺酸激酶已顯示對多種受質具有活性，該等受質包括L-2-胺基,1,4-丁二醇、天冬胺酸半醛及2-胺基-5-羥基戊酸(Huo等人，Biochemistry 35：16180-16185(1996)；Huo等人， Arch.Biochem.Biophys.330：373-379(1996))。此酶可作用於α位置之羧基已經酯或羥基甲基置換的受質。基因候選物為：
2-丁烯基-4-磷酸激酶(圖2，步驟G)
2-丁烯基-4-磷酸激酶催化磷酸基向2-丁烯基-4-磷酸之磷酸基之轉移。下述酶天然具有該活性或可經工程改造以展現此活性。催化磷酸基向另一磷酸基轉移之激酶為EC 2.7.4酶類別之成員。下表列出EC 2.7.4酶類別中若干有用之激酶。
尤其關注磷酸甲羥戊酸激酶。磷酸甲羥戊酸激酶(EC 2.7.4.2)催化類似轉化為2-丁烯基-4-磷酸激酶。此酶係由釀酒酵母中之erg8(Tsay等人，Mol.Cell Biol.11：620-631(1991))及肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌及糞腸球菌中之mvaK2(Doun等人，Protein Sci.14：1134-1139(2005)；Wilding等人，J Bacteriol.182：4319-4327(2000))編碼。肺炎鏈球菌及糞腸球菌酶經選殖且於大腸桿菌中表徵(Pilloff等人，J Biol.Chem.278：4510-4515(2003)；Doun等人，Protein Sci.14：1134-1139(2005))。
丁二烯合成酶(圖2，步驟H)
丁二烯合成酶催化2-丁烯基-4-二磷酸轉化為1,3-丁二烯。下述酶天然具有該活性或可經工程改造以展現此活性。異戊二烯合成酶天然催化二甲基烯丙基二磷酸轉化為異戊二烯，但亦可催化自2-丁烯基-4-二磷酸合成1,3-丁二烯。異戊二烯合成酶可發現於若干有機體中，包括銀白楊樹(Sasaki等人，FEBS Letters,2005,579(11),2514-2518)、山葛(Lindberg等人，Metabolic Eng,2010,12(1),70-79；Sharkey等人，Plant Physiol.,2005,137(2),700-712)及歐洲山楊-銀白楊樹雜交 種(Miller等人，Planta,2001,213(3),483-487)。其他異戊二烯合成酶描述於(Chotani等人，WO/2010/031079,Systems Using Cell Culture for Production of Isoprene；Cervin等人，美國專利申請案20100003716,Isoprene Synthase Variants for Improved Microbial Production of Isoprene)中。
巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶、轉移酶(圖2，步驟I)
巴豆醯基輔酶A水解酶催化巴豆醯基輔酶A轉化為巴豆酸。下述酶天然具有該活性或可經工程改造以展現此活性。在纈胺酸降解期間3-羥基異丁醯基輔酶A水解酶有效催化3-羥基異丁醯基輔酶A轉化為3-羥基異丁酸(Shimomura等人，J Biol Chem.269：14248-14253(1994))。編碼此酶之基因包括褐家鼠(Shimomura等人，同上；Shimomura等人，Methods Enzymol.324：229-240(2000))及智人(Shimomura等人，同上)之hibch。智人酶亦接受3-羥基丁醯基輔酶A及3-羥基丙醯基輔酶A作為受質(Shimomura等人，同上)。根據序列同源性之候選基因包括釀酒酵母之hibch及仙人掌桿菌之BC_2292。下文鑑別此等蛋白質。
若干真核乙醯基輔酶A水解酶(EC 3.1.2.1)具有寬泛受質特異性且因此代表適合之候選酶。舉例而言，來自褐家鼠腦部之酶(Robinson等人，Res.Commun.71：959-965(1976))可與丁醯基輔酶A、己醯基輔 酶A及丙二醯基輔酶A反應。儘管來自豌豆葉粒線體之酶的序列尚未報導，但其亦具有寬泛受質特異性，證明對乙醯基輔酶A、丙醯基輔酶A、丁醯基輔酶A、棕櫚醯基輔酶A、油醯基輔酶A、丁二醯基輔酶A及巴豆醯基輔酶A具有活性(Zeiher等人，Plant.Physiol.94：20-27(1990))。來自釀酒酵母之乙醯基輔酶A水解酶ACH1代表另一候選水解酶(Buu等人，J.Biol.Chem.278：17203-17209(2003))。下文鑑別此等蛋白質。
另一候選水解酶為人類二羧酸硫酯酶acot8，其對戊二醯基輔酶A、己二醯基輔酶A、辛二醯基輔酶A、癸二醯基輔酶A及十二烷二醯基輔酶A展現活性(Westin等人，JBiol.Chem.280：38125-38132(2005))；及最接近大腸桿菌同源物tesB，其亦可水解寬泛範圍之輔酶A硫酯(Naggert等人，J Biol.Chem.266：11044-11050(1991))。類似酶亦已於大鼠肝臟中表徵(Deana等人，Biochem.Int.26：767-773(1992))。其他潛在之大腸桿菌硫酯水解酶包括tesA(Bonner等人，Chem.247：3123-3133(1972))、ybgC(Kuznetsova等人，FEMS Microbiol Rev 29：263-279(2005)；及Zhuang等人，FEBS Lett.516：161-163(2002))、paaI(Song等人，J Biol.Chem.281：11028-11038(2006))及ybdB(Leduc等人，J Bacteriol.189：7112-7126(2007))之基因產物。下文鑑別此等蛋白質。
另一候選水解酶為來自醱酵胺基酸球菌之戊烯二酸輔酶A轉移酶。此酶藉由定點突變誘發轉化為對戊二醯基輔酶A、乙醯基輔酶A及3-丁烯醯基輔酶A具有活性之醯基輔酶A水解酶(Mack等人，FEBS.Lett.405：209-212(1997))。此表明編碼丁二醯基輔酶A：3-酮酸-輔酶A轉移酶及乙醯乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A轉移酶之酶亦可充當此反應步驟之候選物，但會需要某些突變以改變其功能。下文鑑別此等蛋白質。
巴豆醯基輔酶A合成酶催化巴豆醯基輔酶A轉化為巴豆酸。下述酶天然具有該活性或可經工程改造以展現此活性。一候選酶(形成ADP之乙醯基輔酶A合成酶)(ACD，EC 6.2.1.13)將醯基輔酶A酯轉化為其相應酸與同時合成ATP相偶合。若干具有寬泛受質特異性之酶已描述於文獻中。由AF1211編碼之來自閃爍古生球菌之ACD I展示對多種線性及分支鏈受質起作用，該等受質包括乙醯基輔酶A、丙醯基輔酶A、丁醯基輔酶A、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、異丁酸酯、異戊酸酯、丁二酸酯、反丁烯二酸酯、苯基乙酸酯、吲哚乙酸酯(Musfeldt等人，J Bacteriol 184：636-644(2002))。來自嗜鹽古生菌之酶(註釋為丁二醯基輔酶A合成酶)接受丙酸酯、丁酸酯及分支鏈酸(異戊酸酯及異丁酸酯)作為受質，且顯示在正向及逆向中起作用(Brasen等人，Arch Microbiol 182：277-287(2004))。來自超嗜熱泉古菌(hyperthermophilic crenarchaeon)耐超高溫熱棒菌之由PAE3250編碼之ACD顯示所有經表 徵ACD之最寬泛受質範圍，其與乙醯基輔酶A、異丁醯基輔酶A(較佳受質)及苯基乙醯基輔酶A反應(Brasen等人，同上)。來自閃爍古生球菌、嗜鹽古生菌及耐超高溫熱棒菌之酶皆經選殖，於大腸桿菌中功能性表現且表徵(Musfeldt等人，同上；Brasen等人，同上)。下文鑑別此等蛋白質。
另一候選輔酶A合成酶為丁二醯基輔酶A合成酶。大腸桿菌之sucCD基因形成丁二醯基輔酶A合成酶複合物，其天然催化自丁二酸酯形成丁二醯基輔酶A，同時消耗一ATP，該反應在活體內可逆(Buck等人，Biochem.24：6245-6252(1985))。下文鑑別此等蛋白質。
其他例示性輔酶A連接酶包括大鼠二羧酸酯-輔酶A連接酶，其序列尚未經表徵(Vamecq等人，Biochemical Journal 230：683-693(1985))；來自產黃青黴菌之兩種經表徵之苯基乙酸酯-輔酶A連接酶中的任一者(Lamas-Maceiras等人，Biochem.J.395：147-155(2005)；Wang等人，Biochem Biophy Res Commun 360(2)：453-458(2007))；來自惡臭假單胞菌之苯基乙酸酯-輔酶A連接酶(Martinez-Blanco等人，J.Biol.Chem.265：7084-7090(1990))；及來自枯草桿菌之6-羧基己酸酯-輔酶A連接酶(Bower等人，J.Bacteriol.178(14)：4122-4130(1996))。其他候選酶為來自小家鼠(Hasegawa等人，Biochim Biophys Acta 1779：414-419(2008))及智人(Ohgami等人，Biochem Pharmacol 65：989-994(2003))之乙醯乙醯基輔酶A合成酶，其天然催化乙醯乙酸酯在ATP依賴性下轉化為乙醯乙醯基輔酶A。下文鑑別此等蛋白質。
巴豆醯基輔酶A轉移酶催化巴豆醯基輔酶A轉化為巴豆酸。下述酶天然具有該活性或可經工程改造以展現此活性。許多轉移酶具有寬泛特異性且因此可尤其利用如乙酸酯、丁二酸酯、丙酸酯、丁酸酯、2-甲基乙醯乙酸酯、3-酮己酸酯、3-酮戊酸、戊酸酯、巴豆酸酯、3-巰基丙酸酯、丙酸酯、乙烯基乙酸酯、丁酸酯之多樣化輔酶A受體。舉例而言，來自羅斯氏菌屬A2-183之酶經展示具有丁醯基輔酶A：乙酸酯：輔酶A轉移酶及丙醯基輔酶A：乙酸酯：輔酶A轉移酶活性(Charrier等人，Microbiology 152,179-185(2006))。接近之同源物可發現於例如腸羅斯氏菌L1-82、依奴林羅斯氏菌DSM 16841、直腸真桿菌ATCC 33656中。另一具有丙醯基輔酶A轉移酶活性之酶可發現於丙酸梭菌(Selmer等人，Eur J Biochem 269,372-380(2002))中。此酶可使用乙酸酯、(R)-乳酸酯、(S)-乳酸酯、丙烯酸酯及丁酸酯作為輔酶A受體(Selmer等人，Eur J Biochem 269,372-380(2002)；Schweiger及Buckel,FEBS Letters,171(1)79-84(1984))。接近之同源物可發現於例如諾維氏梭菌NT、拜氏梭菌NCIMB 8052及肉毒梭菌C依庫蘭德菌株中。YgfH編碼大腸桿菌中之丙醯基輔酶A：丁二酸酯輔酶A轉移酶(Haller等人，Biochemistry,39(16)4622-4629)。接近之同源物可發現於例如楊氏檸檬酸桿菌ATCC 29220、腸道沙門氏菌亞利桑那血清型 亞種及中間耶爾森菌ATCC 29909中。下文鑑別此等蛋白質。
另一候選酶為由假單胞菌中之pcaI及pcaJ編碼之雙單元酶，其已顯示具有3-側氧基己二醯基輔酶A/丁二酸轉移酶活性(Kaschabek等人，同上)。基於同源性之類似酶存在於不動桿菌屬ADP1(Kowalchuk等人，Gene 146：23-30(1994))及天藍色鏈黴菌中。其他例示性丁二醯基輔酶A：3：含氧酸-輔酶A轉移酶存在於幽門螺旋桿菌(Corthesy-Theulaz等人，J.Biol.Chem.272：25659-25667(1997))及枯草桿菌(Stols等人，Protein.Expr.Purif.53：396-403(2007))中。下文鑑別此等蛋白質。
可利用乙酸酯作為輔酶A受體之輔酶A轉移酶為乙醯乙醯基輔酶A轉移酶，其由大腸桿菌atoA(α次單元)及atoD(β次單元)基因編碼(Vanderwinkel等人，Biochem.Biophys.Res Commun.33：902-908(1968)；Korolev等人，Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr.58：2116-2121(2002))。此酶亦顯示將多種分支及線性醯基輔酶A受質之輔酶A部分轉移至乙酸酯中，該等受質包括異丁酸酯(Matthies等人，Appl Environ Microbiol 58：1435-1439(1992))、戊酸酯(Vanderwinkel等人，同上)及丁酸酯(Vanderwinkel等人，同上)。類似酶存在於麩胺酸生產菌ATCC 13032(Duncan等人，Appl Environ Microbiol 68：5186-5190(2002))、丙酮丁醇梭菌(Cary等人，Appl Environ Microbiol 56：1576-1583(1990))及糖乙酸多丁醇梭菌(Kosaka等人，Biosci.Biotechnol Biochem.71：58-68(2007))中。下文鑑別此等蛋白質。
上述酶亦可對巴豆醯基輔酶A展現所需活性。其他例示性轉移酶 候選物係由克氏梭菌之cat1、cat2及cat3之基因產物催化，其已顯示分別展現丁二醯基輔酶A、4-羥基丁醯基輔酶A及丁醯基輔酶A轉移酶活性(Seedorf等人，同上；Sohling等人，Eur.J Biochem.212：121-127(1993)；Sohling等人，J Bacteriol.178：871-880(1996))。類似輔酶A轉移酶活性亦存在於陰道滴蟲(van Grinsven等人，J.Biol.Chem.283：1411-1418(2008))及布氏錐蟲(Riviere等人，J.Biol.Chem.279：45337-45346(2004))中。下文鑑別此等蛋白質。
來自厭氧細菌醱酵胺基酸球菌之戊烯二酸輔酶A-轉移酶(EC 2.8.3.12)與二酸戊烯二醯基輔酶A及3-丁烯醯基輔酶A反應(Mack等人，FEBS Lett.405：209-212(1997))。編碼此酶之基因為gctA及gctB。此酶相對於包括戊二醯基輔酶A、2-羥基戊二醯基輔酶A、己二醯基輔酶A及丙烯醯基輔酶A之其他輔酶A衍生物具有降低但可偵測之活性(Buckel等人，Eur.J.Biochem.118：315-321(1981))。該酶已經選殖且於大腸桿菌中表現(Mack等人，Eur.J.Biochem.226：41-51(1994))。下文鑑別此等蛋白質。
巴豆酸還原酶(圖2，步驟J)
巴豆酸還原酶能夠催化巴豆酸轉化為巴豆醛。下述酶天然具有該活性或可經工程改造以展現此活性。羧酸還原酶催化羧酸在鎂、 ATP及NADPH依賴性下還原為其相應醛(Venkitasubramanian等人，J.Biol.Chem.282：478-485(2007))。由car編碼之此酶經選殖且於大腸桿菌中功能性表現(Venkitasubramanian等人，J.Biol.Chem.282：478-485(2007))。npt基因產物之表現經由轉錄後修飾改良酶之活性。npt基因編碼特定磷酸泛醯硫基乙胺轉移酶(PPTase)，該酶將無活性apo-酶轉化為活性holo-酶。此酶之天然受質為香草酸，且該酶對芳族及脂族受質展現寬泛接受性(Venkitasubramanian等人，Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnology Industires,R.N.Patel編，第15章，第425-440頁，CRC Press LLC,Boca Raton,FL.(2006))。
可基於序列同源性鑑別其他car及npt基因。
另一發現於灰色鏈黴菌中之酶候選物係由griC及griD基因編碼。咸信此酶將3-胺基-4-羥基苯甲酸轉化為3-胺基-4-羥基苯甲醛，因為缺失griC或griD導致3-胺基-4-羥基苯甲酸代謝之分路產物3-乙醯基胺基-4-羥基苯甲酸細胞外積聚(Suzuki等人，J.Antibiot.60(6)：380-387(2007))。griC及griD經SGR_665(序列與艾瓦諾卡氏菌npt類似之酶)共同表現可為有利的。
具有類似特徵之酶α-胺基己二酸還原酶(AAR，EC 1.2.1.31)參與一些真菌物種中之離胺酸生物合成路徑。此酶天然地還原α-胺基己二酸為α-胺基己二酸半醛。羧基首先經由腺苷酸之ATP依賴性形成而活化，其隨後由NAD(P)H還原得到醛及AMP。如同CAR一樣，此酶利用鎂且需要由PPTase活化。關於AAR及其相應PPTase之酶候選物發現於釀酒酵母(Morris等人，Gene 98：141-145(1991))、白色念珠菌(Guo等人，Mol.Genet.Genomics 269：271-279(2003))及裂殖酵母(Ford等人，Curr.Genet.28：131-137(1995))中。來自裂殖酵母之AAR於大腸桿菌中表現時展現顯著活性(Guo等人，Yeast 21：1279-1288(2004))。來自產黃青黴菌之AAR接受S-羧基甲基-L-半胱胺酸作為替代受質，但不與己二酸酯、L-麩胺酸或二胺基庚二酸酯反應(Hijarrubia等人，J.Biol.Chem.278：8250-8256(2003))。編碼產黃青黴菌PPTase之基因迄今為止尚未鑑別。
巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)(圖2，步驟K)
巴豆醛還原酶(醇形成)催化自巴豆醯基輔酶A形成巴豆醇所需之2個還原步驟。下文提供將醯基輔酶A轉化為醇之例示性2步驟氧化還原酶。該等酶可天然地將巴豆醯基輔酶A轉化為巴豆醇或可經工程改造以將巴豆醯基輔酶A轉化為巴豆醇。此等酶包括將諸如乙醯基輔酶A之受質轉化為乙醇之酶(例如，來自大腸桿菌之adhE(Kessler等人，FEBS.Lett.281：59-63(1991)))及將諸如丁醯基輔酶A之受質轉化為丁醇之酶(例如，來自丙酮丁醇梭菌之adhE2(Fontaine等人，J.Bacteriol.184：821-830(2002)))。文獻中特定展示之來自丙酮丁醇梭菌之adhE2酶(Burk等人，同上，(2008))可自4-羥基丁醯基輔酶A產生BDO。除了將乙醯基輔酶A還原為乙醇之外，由腸膜明串珠菌中之adhE編碼之酶已顯示將分支鏈化合物異丁醛氧化為異丁醯基輔酶A(Kazahaya等人，J.Gen.Appl.Microbiol.18：43-55(1972)；Koo等人，Biotechnol.Lett.27：505-510(2005))。
另一例示性酶可將丙二醯基輔酶A轉化為3-HP。具有此活性之 NADPH依賴性酶已於橙色綠曲撓菌中表徵，其中該酶參與3-羥基丙酸循環(Hugler等人，同上，(2002)；Strauss等人，215：633-643(1993))。質量為300kDa之此酶具有高受質特異性且展示與其他已知氧化還原酶之序列相似性很小(Hugler等人，同上，(2002))。其他有機體中之酶均未顯示催化此特定反應；但有生物資訊證據表明其他有機體可具有類似路徑(Klatt等人，Environ Microbiol.9：2067-2078(2007))。可根據序列相似性推斷包括卡斯特玫瑰彎菌、赤細菌屬NAP1及海洋γ變形細菌HTCC2080之其他有機體中的酶候選物。
戊烯二醯基輔酶A去羧酶(圖2，步驟L)
於麩胺酸-醱酵厭氧細菌中表徵之戊烯二醯基輔酶A去羧酶為鈉離子移位去羧酶，其利用生物素作為輔因子且由四種次單元(α、β、γ及δ)組成(Boiangiu等人，J Mol.Microbiol Biotechnol 10：105-119(2005)；Buckel,Biochim Biophys Acta.1505：15-27(2001))。該等酶已於具核梭桿菌(Beatrix等人，Arch Microbiol.154：362-369(1990))及醱酵胺基酸球菌(Braune等人，Mol.Microbiol 31：473-487(1999))中表徵。具核梭桿菌戊烯二醯基輔酶A去羧酶α、β及δ次單元之類似物發現於嗜酸互營菌中。註釋為烯醯基輔酶A去氫酶之基因syn_00480(另一GCD)位於生物素-羧基載體(syn_00479)與戊烯二醯基輔酶A去羧酶α次單元(syn_00481)之間的預測操縱子中。可使用下文所示之下列GenBank寄存編號找出例示性基因產物之蛋白質序列。
戊二醯基輔酶A去氫酶(圖2步驟M)
戊二醯基輔酶A去氫酶(GCD，EC 1.3.99.7及EC 4.1.1.70)為催化戊二醯基輔酶A氧化去羧化變為巴豆醯基輔酶A之雙功能酶(圖3，步驟3)。雙功能GCD酶為利用電子轉移黃素蛋白作為電子受體之同型四聚體(Hartel等人，Arch Microbiol.159：174-181(1993))。該等酶首先於在芳族化合物上生長期間假單胞菌株KB740及K172之細胞提取物中表徵(Hartel等人，同上，(1993))，但此等有機體中之相關基因未知。編碼戊二醯基輔酶A去氫酶(gcdH)及其同源轉錄調控子(gcdR)之基因於固氮弧菌屬CIB中鑑別(Blazquez等人，Environ Microbiol.10：474-482(2008))。使用缺乏gcdH活性之固氮弧菌株鑑別來自惡臭假單胞菌之異源基因gcdH(Blazquez等人，同上，(2008))。惡臭假單胞菌中之同源轉錄調控子未經鑑別，但位點PP_0157與固氮弧菌酶具有高序列同源性(一致性>69%)。其他GCD酶發現於螢光假單胞菌及脫氮副球菌中(Husain等人，J Bacteriol.163：709-715(1985))。人類GCD已經廣泛研究，於大腸桿菌中過度表現(Dwyer等人，Biochemistry 39：11488-11499(2000))，結晶，且已描述在活性位點涉及保守麩胺酸殘基之催 化機制(Fu等人，Biochemistry 43：9674-9684(2004))。嗜酸互營菌中之GCD在於巴豆酸上生長期間在CO2同化方向中起作用(Mouttaki等人，Appl Environ Microbiol。73：930-938(2007))。藉由與固氮弧菌GcdH之蛋白質序列同源性鑑別嗜酸互營菌中之兩種GCD基因：syn_00480(31%)及syn_01146(31%)。發現與固氮弧菌GcdR調節蛋白無顯著同源性。可使用下文所示之下列GenBank寄存編號找出例示性基因產物之蛋白質序列。
3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶(圖2，步驟N)
3-胺基丁醯基輔酶A為離胺酸醱酵中之中間物。其亦可經由轉胺酶或胺化去氫酶自乙醯乙醯基輔酶A形成。3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶(或3-胺基丁醯基輔酶A解氨酶)催化3-胺基丁醯基輔酶A去胺化形成巴豆醯基輔酶A。此可逆酶存在於具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌、騰沖嗜熱厭氧菌及若干其他有機體中且與離胺酸醱酵中所涉及之若干種基因一起共同定位(Kreimeyer等人，J Biol Chem,2007,282(10)7191-7197)。
4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶(圖2，步驟O)
若干種酶天然地催化4-羥基丁醯基輔酶A脫水為巴豆醯基輔酶A。此轉化為藉由胺基丁酸梭菌之4-胺基丁酸醱酵(Scherf等人，Eur.J Biochem.215：421-429(1993))及藉由克氏梭菌之丁二酸酯-乙醇醱酵(Scherf等人，Arch.Microbiol 161：239-245(1994))所需。該轉化亦為古菌(例如勤奮金屬球菌)中作為3-羥基丙酸/4-羥基丁酸自養二氧化碳同化路徑(Berg等人，同上，(2007))之一部分的關鍵步驟。4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶之可逆性已充分記錄(Muh等人，Biochemistry.35：11710-11718(1996)；Friedrich等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.47：3254-3257(2008)；Muh等人，Eur.J.Biochem.248：380-384(1997))且就巴豆醯基輔酶A而言之平衡常數已報導為約4(Scherf及Buckel，同上，(1993))。
巴豆醇二磷酸激酶(圖2，步驟P)
巴豆醇二磷酸激酶催化巴豆醇之二磷酸基向羥基之轉移。下述酶天然具有該活性或可經工程改造以展現此活性。催化二磷酸基轉移之激酶為EC 2.7.6酶類別之成員。下表列出EC 2.7.6酶類別中若干種有用之激酶。
尤其關注核糖-磷酸二磷酸激酶，其已於大腸桿菌(Hove-Jenson等人，J Biol Chem,1986,261(15)；6765-71)及肺炎黴漿菌M129(McElwain等人，International Journal of Systematic Bacteriology,1988,38：417-423)中鑑別；以及硫胺二磷酸激酶。例示性硫胺二磷酸激酶發現於阿拉伯芥中(Ajjawi,Plant Mol Biol,2007,65(1-2)；151-62)。
赤藻糖-4-磷酸還原酶(圖3，步驟A)
在路徑之步驟A中，赤藻糖-4-磷酸藉由赤藻糖-4-磷酸還原酶或赤藻糖醇-4-磷酸去氫酶轉化為赤藻糖醇-4-磷酸。在產生赤藻糖醇期間在酒明串珠菌(Leuconostoc oenos)中觀測到赤藻糖-4-磷酸還原(Veiga-da-Cunha等人，J Bacteriol.175：3941-3948(1993))。NADPH經鑑別為輔因子(Veiga-da-Cunha等人，同上，(1993))。然而，尚未鑑別赤藻糖-4-磷酸之基因。因此，有可能鑑別來自酒明串珠菌之赤藻糖-4-磷酸還原酶基因且應用於此步驟。另外，催化類似反應之酶可用於此步驟。此等酶之實例為催化1-去氧-D-木糖5-磷酸轉化為2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸之1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶(EC 1.1.1.267)，其與步驟A相比具有一額外甲基。編碼1-去氧-D-木酮糖- 5-磷酸還原異構酶之dxr或ispC基因已經充分研究：來自大腸桿菌及結核分枝桿菌之Dxr蛋白經純化且測定其晶體結構(Yajima等人，Acta Crystallogr.Sect.F.Struct.Biol.Cryst.Commun.63：466-470(2007)；Mac等人，J Mol.Biol.345：115-127(2005)；Henriksson等人，Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.62：807-813(2006)；Henriksson等人，J Biol.Chem.282：19905-19916(2007))；來自集胞藻屬之Dxr蛋白係藉由定點突變誘發研究，其具有改良之活性及改變之動力學(Fernandes等人，Biochim.Biophys.Acta 1764：223-229(2006)；Fernandes等人，Arch.Biochem.Biophys.444：159-164(2005))。此外，來自大腸桿菌之甘油醛3-磷酸還原酶YghZ催化甘油醛3-磷酸與甘油-3-磷酸之間的轉化(Desai等人，Biochemistry 47：7983-7985(2008))且亦可應用於此步驟。以下基因可用於步驟A轉化：
赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶(圖3，步驟B)
在路徑之步驟B中，赤藻糖醇-4-磷酸藉由赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶或4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇合成酶轉化為4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇。此步驟之確切酶尚未經鑑別。然而，催化類似反應之酶可應用於此步驟。一實例為2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷醯基轉移酶或4-(胞苷5'-二磷酸基)-2-C-甲基-D-赤藻糖醇合成酶(EC 2.7.7.60)。2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷醯基轉移酶在類異戊二烯生物合成之甲基赤藻糖醇磷酸路徑中且催化2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸與4-(胞苷5'-二磷酸基)-2-C-甲基-D-赤藻糖醇之間的轉化，其與步 驟B轉化相比具有額外甲基。2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷醯基轉移酶係由ispD基因編碼且測定大腸桿菌IspD之晶體結構(Kemp等人，Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.57：1189-1191(2001)；Kemp等人，Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.59：607-610(2003)；Richard等人，Nat.Struct.Biol.8：641-648(2001))。來自結核分枝桿菌H37Rv之ispD基因經選殖且於大腸桿菌中表現，且利用N端His標記純化重組蛋白(Shi等人，J Biochem.Mol.Biol.40：911-920(2007))。另外，天藍色鏈黴菌ispD基因經選殖且於大腸桿菌中表現，且物理上且動力學表徵重組蛋白(Cane等人，Bioorg.Med.Chem.9：1467-1477(2001))。以下基因可用於步驟B轉化：
4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶(圖3，步驟C)
在路徑之步驟C中，4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇藉由4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶轉化為2-磷酸基-4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇。此步驟之確切酶尚未經鑑別。然而，催化類似反應之酶可應用於此步驟。一實例為4-二磷酸胞苷醯基-2-C-甲基赤藻糖醇激酶(EC 2.7.1.148)。4-二磷酸胞苷醯基-2-C-甲基赤藻糖醇激酶亦在類異戊二烯生物合成之甲基赤藻糖醇磷酸路徑中且催化4-(胞苷5'-二磷酸基)-2-C-甲基-D-赤藻糖醇與2-磷酸基-4-(胞苷5'-二磷酸基)-2-C-甲基-D-赤藻糖醇之間的轉化，其與步驟C轉化相比具有額外甲基。4-二磷酸胞苷醯基-2-C-甲基赤藻糖醇激酶係由ispE基因編碼且測定大腸桿菌、溫泉菌HB8及超嗜熱菌IspE之晶體結構(Sgraja等人，FEBS J 275：2779-2794(2008)；Miallau等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100：9173-9178 (2003)；Wada等人，J Biol.Chem.278：30022-30027(2003))。來自上述有機體之ispE基因經選殖並表現，且重組蛋白經純化以進行結晶。以下基因可用於步驟C轉化：
赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶(圖3，步驟D)
在路徑之步驟D中，2-磷酸基-4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇藉由赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶轉化為赤藻糖醇-2,4-環二磷酸。此步驟之確切酶尚未經鑑別。然而，催化類似反應之酶可應用於此步驟。一實例為2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶(EC 4.6.1.12)。2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶亦在類異戊二烯生物合成之甲基赤藻糖醇磷酸路徑中且催化2-磷酸基-4-(胞苷5'二磷酸基)-2-C-甲基-D-赤藻糖醇與2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2,4-環二磷酸之間的轉化，其與步驟D轉化相比具有額外甲基。2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶係由ispF基因編碼且測定大腸桿菌、溫泉菌、流感嗜血桿菌及空腸彎麴菌IspF之晶體結構(Richard等人，J Biol.Chem.277：8667-8672(2002)；Steinbacher等人，J Mol.Biol.316：79-88(2002)；Lehmann等人，Proteins 49：135-138(2002)；Kishida等人，Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.59：23-31(2003)；Gabrielsen等人，J Biol.Chem.279：52753-52761(2004))。來自上述有機體之ispF基因經選殖並表現，且重組蛋白經純化以進行結晶。以下基因可用於步驟D轉化：
1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶(圖3，步驟E)
圖3之步驟E藉由1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶使赤藻糖醇-2,4-環二磷酸轉化為1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸。具有此活性之酶迄今為止尚未經表徵。此轉化與藉由(E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸合成酶(EC 1.17.7.1)使2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2,4-環二磷酸還原為1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸之反應類似。此酶為細菌及植物中發現之參與類異戊二烯生物合成之非甲羥戊酸路徑的鐵-硫蛋白。由ispG編碼之包括大腸桿菌酶之大多數細菌酶利用還原之鐵氧化還原蛋白或黃素氧化還原蛋白作為電子供體(Zepeck等人，J Org.Chem.70：9168-9174(2005))。由gcpE編碼之來自嗜熱藍藻(thermophilic cyanobacterium)臺灣溫泉菌BP-1之類似酶於大腸桿菌中異源表現且表徵(Okada等人，J Biol.Chem.280：20672-20679(2005))。來自溫泉菌及阿拉伯芥之其他酶候選物已於大腸桿菌中表徵且表現(Seemann等人，J Biol.Inorg.Chem.10：131-137(2005)；Kollas等人，FEBS Lett.532：432-436(2002))。
1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶(圖3，步驟F)
1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸同時進行脫水及還原係由具有1-羥基-2- 丁烯基4-二磷酸還原酶活性之酶催化(圖3，步驟F)。該酶將形成產物丁烯基4-二磷酸或2-丁烯基4-二磷酸之混合物。類似反應係由類異戊二烯生物合成之非甲羥戊酸路徑中的4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶(EC 1.17.1.2)催化。此酶為利用還原之鐵氧化還原蛋白或黃素氧化還原蛋白作為電子供體之鐵-硫蛋白。由ispH編碼之4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶大腸桿菌之最大活性需要黃素氧化還原蛋白與黃素氧化還原蛋白還原酶(Wolff等人，FEBS Lett.541：115-120(2003)；Grawert等人，J Am.Chem.Soc.126：12847-12855(2004))。在所表徵催化系統中，還原之黃素氧化還原蛋白係由NAD(P)+依賴性黃素氧化還原蛋白還原酶再生。由lytB編碼之來自超嗜熱菌之酶以His標記酶形式於大腸桿菌中表現且表徵(Altincicek等人，FEBS Lett.532：437-440(2002))。植物中之類似酶係由阿拉伯芥之hdr編碼(Botella-Pavia等人，Plant J 40：188-199(2004))。
改變鐵-硫叢集物形成中所涉及之基因的表現量可對所提出路徑中鐵-硫蛋白(例如，圖3之步驟E及F中所需之酶)之活性具有有利影響。在大腸桿菌中，顯示含有鐵-硫之蛋白質IspH之過度表現(與圖3之步驟F類似)係由鐵-硫叢集物裝配中所涉及之isc區域之基因的共同表現而增強(Grawert等人，J Am.Chem.Soc.126：12847-12855(2004))。基因叢集物係由基因icsS、icsU、icsA、hscB、hscA及fdx組成。此等基因之過度表現展示改良鐵-硫裝配管線之合成能力，此為鐵-硫蛋白之功能表現所需。類似方法可應用於目前應用中。
丁烯基4-二磷酸異構酶(圖3，步驟G)
丁烯基4-二磷酸異構酶催化2-丁烯基-4-二磷酸與丁烯基-4-二磷酸之可逆相互轉化。以下酶可天然具有此活性或可經工程改造以展現此活性。有用之基因包括編碼可使異戊烯基二磷酸與二甲基烯丙基二磷酸相互轉化之酶的基因。此等酶包括來自大腸桿菌(Rodríguez-Concepción等人，FEBS Lett,473(3)：328-332)、釀酒酵母(Anderson等人，J Biol Chem,1989,264(32)；19169-75)及芝田硫化葉菌(Yamashita等人，Eur J Biochem,2004,271(6)；1087-93)之異戊烯基二磷酸異構酶。由大腸桿菌之Idi蛋白催化之異構化反應機制已在機制上詳細表徵(de Ruyck等人，J Biol.Chem.281：17864-17869(2006))。來自釀酒酵母、枯草桿菌及雨生紅球藻之異戊烯基二磷酸異構酶已於大腸桿菌中異源表現(Laupitz等人，Eur.J Biochem.271：2658-2669(2004)；Kajiwara等人，Biochem.J 324(Pt 2)：421-426(1997))。
丁二烯合成酶(圖3，步驟H)
丁二烯合成酶催化2-丁烯基-4-二磷酸轉化為1,3-丁二烯。下述酶 天然具有該活性或可經工程改造以展現此活性。異戊二烯合成酶天然催化二甲基烯丙基二磷酸轉化為異戊二烯，但亦可催化自2-丁烯基-4-二磷酸合成1,3-丁二烯。異戊二烯合成酶可發現於若干有機體中，包括銀白楊樹(Sasaki等人，FEBS Letters,579(11),2514-2518(2005))、山葛(Lindberg等人，Metabolic Eng,12(1)：70-79(2010)；Sharkey等人，Plant Physiol.,137(2)：700-712(2005))及歐洲山楊-銀白楊樹雜交種(Miller等人，Planta,213(3)：483-487(2001))。其他異戊二烯合成酶描述於(Chotani等人，WO/2010/031079,Systems Using Cell Culture for Production of Isoprene；Cervin等人，美國專利申請案20100003716,Isoprene Synthase Variants for Improved Microbial Production of Isoprene)中。
赤藻糖-4-磷酸激酶(圖3，步驟I)
在路徑之步驟I中，赤藻糖-4-磷酸藉由赤藻糖-4-磷酸激酶轉化為赤藻糖。在利用酵母工業醱酵產生赤藻糖醇中，葡萄糖經由戊糖磷酸路徑轉化為赤藻糖-4-磷酸，且赤藻糖-4-磷酸經去磷酸化且還原產生赤藻糖醇(Moon等人，Appl.Microbiol Biotechnol.86：1017-1025(2010))。因此，赤藻糖-4-磷酸激酶存在於許多此等產生赤藻糖醇之酵母中，包括類絲孢酵母SN-G42(Sawada等人，J Biosci.Bioeng.108：385-390(2009))、木蘭念珠菌(Kohl等人，Biotechnol.Lett.25：2103-2105(2003))及圓酵母屬(Torula sp.)(HAJNY等人，Appl.Microbiol 12：240-246(1964)；Oh等人，J Ind.Microbiol Biotechnol.26：248-252(2001))。然而，赤藻糖-4-磷酸激酶基因尚未 經鑑別。存在許多可應用於此步驟之具有寬泛受質範圍的多元醇磷酸轉移酶。一實例為催化甘油醛與甘油醛-3-磷酸之間的可逆轉化之丙糖激酶(EC 2.7.1.28)，其與步驟I相比少一個碳。其他實例包括催化5C多元醇醛之磷酸化的木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)或阿拉伯糖激酶(EC 2.7.1.54)。下列基因可用於步驟I轉化：
赤藻糖還原酶(圖3，步驟J)
在路徑之步驟J中，赤藻糖藉由赤藻糖還原酶轉化為赤藻糖醇。在利用酵母工業醱酵產生赤藻糖醇中，葡萄糖經由戊糖磷酸路徑轉化為赤藻糖-4-磷酸，且赤藻糖-4-磷酸經去磷酸化且還原產生赤藻糖醇(Moon等人，同上，(2010))。因此，赤藻糖還原酶存在於許多此等產生赤藻糖醇之酵母中，包括類絲孢酵母SN-G42(Sawada等人，同上，(2009))、木蘭念珠菌(Kohl等人，同上，(2003))及圓酵母屬(HAJNY等人，同上，(1964)；Oh等人，同上，(2001))。赤藻糖還原酶經表徵且自克拉利納圓酵母(Torula corallina)(Lee等人，Biotechnol.Prog.19：495-500(2003)；Lee等人，Appl.Environ.Microbiol 68：4534-4538(2002))、木蘭念珠菌(Lee等人，Appl.Environ.Microbiol 69：3710-3718(2003))及類絲孢酵母SN-G42(Sawada等人，同上，(2009))中純化。若干赤藻糖還原酶基因經選殖且可應用於步驟J。下列基因可用於步驟J轉化：
赤藻糖醇激酶(圖3，步驟K)
在路徑之步驟K中，赤藻糖醇藉由赤藻糖醇激酶轉化為赤藻糖醇-4-磷酸。赤藻糖醇激酶(EC 2.7.1.27)催化赤藻糖醇之磷酸化。赤藻糖醇激酶表徵於利用赤藻糖醇之細菌中，諸如流產布魯氏菌(Brucella abortus)(Sperry等人，J Bacteriol.121：619-630(1975))。流產布魯氏菌之eryA基因已於大腸桿菌中功能性表現且所得EryA展示催化赤藻糖醇在ATP依賴性下轉化為赤藻糖醇-4-磷酸(Lillo等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.13：737-739(2003))。下列基因可用於步驟K轉化：
丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶(圖4，步驟A)
在圖4中所述之路徑的步驟A中，丙二醯基輔酶A及乙醯基輔酶A藉由丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、β-酮硫解酶縮合形成3-側氧基戊二醯基輔酶A。儘管迄今為止未報導對丙二醯基輔酶A具有活性之酶，但關於此轉化之良好候選物為β-酮己二醯基輔酶A硫解酶(EC 2.3.1.174)(亦稱為3-側氧基己二醯基輔酶A硫解酶)，其將β-酮己二醯基輔酶A轉化為丁二醯基輔酶A及乙醯基輔酶A，且為芳族化合物降解之β-酮己二酸路徑的關鍵酶。該酶廣泛分佈於土壤細菌及真菌中，包括惡臭假單胞菌(Harwood等人，J Bacteriol.176：6479-6488 (1994))及乙酸鈣不動桿菌(Doten等人，J Bacteriol.169：3168-3174(1987))。由假單胞菌株B13中之pcaF(Kaschabek等人，J Bacteriol.184：207-215(2002))、惡臭假單胞菌U中之phaD(Olivera等人，同上，(1998))、螢光假單胞菌ST中之paaE(Di Gennaro等人，Arch Microbiol.88：117-125(2007))及來自大腸桿菌之paaJ(Nogales等人，Microbiology,153：357-365(2007))編碼的基因產物亦催化此轉化。若干β-酮硫解酶在形成側氧基己二醯基輔酶A之方向上展現顯著且選擇性活性，包括來自惡臭假單胞菌之bkt、來自綠膿桿菌PAO1之pcaF及bkt、來自艾比伐利亞伯克氏菌AMMD之bkt、來自大腸桿菌之paaJ及來自惡臭假單胞菌之phaD。此等酶亦可用於合成3-側氧基戊二醯基輔酶A，其為一種在結構上與3-側氧基己二醯基輔酶A類似之化合物。
另一相關β-酮硫解酶為側氧基庚二醯基輔酶A：戊二醯基輔酶A醯基轉移酶(EC 2.3.1.16)，其將戊二醯基輔酶A與乙醯基輔酶A組合形成3-側氧基庚二醯基輔酶A。催化此轉化之酶發現於真養羅爾斯頓氏菌(先前稱作真養產鹼桿菌(Alcaligenes eutrophus))中，其由基因bktB及bktC編碼(Slater等人，J.Bacteriol.180：1979-1987(1998)；Haywood等人，FEMS Microbiology Letters 52：91-96(1988))。已知BktB蛋白之序列；但BktC蛋白之序列尚未報導。沼澤紅假單胞菌之pim操縱子亦編 碼β-酮硫解酶，該β-酮硫解酶由pimB編碼，預測其在苯甲醯基輔酶A降解期間在降解方向上催化此轉化(Harrison等人，Microbiology 151：727-736(2005))。藉由與bktB之序列同源性鑑別嗜酸互營菌中之β-酮硫解酶候選物(43%一致性，e值=1e-93)。
催化自乙醯基輔酶A及丙醯基輔酶A形成β-酮戊醯基輔酶A之β-酮硫解酶亦可能夠催化形成3-側氧基戊二醯基輔酶A。生枝動膠菌具有兩種可自丙醯基輔酶A及乙醯基輔酶A形成β-酮戊醯基輔酶A之酮硫解酶，且真養羅爾斯頓氏菌具有亦能夠催化此轉化之β-氧化酮硫解酶(Slater等人，J.Bacteriol,180：1979-1987(1998))。此等基因或其轉譯蛋白質之序列尚未報導，但可基於與來自真養羅爾斯頓氏菌之hktB的序列同源性鑑別真養羅爾斯頓氏菌、生枝動膠菌或其他有機體中之若干候選物。此等物質包括：
其他候選物包括已知將兩分子乙醯基輔酶A轉化為乙醯乙醯基輔酶A之β-酮硫解酶(EC 2.1.3.9)。例示性乙醯乙醯基輔酶A硫解酶包括來自大腸桿菌之atoB(Martin等人，同上，(2003))、來自丙酮丁醇梭菌之thlA及thlB(Hanai等人，同上，(2007)；Winzer等人，同上，(2000))及來自釀酒酵母之ERG10(Hiser等人，同上，(1994))的基因產物。
3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(酮還原)(圖4，步驟B)
此酶在圖4中所示路徑之步驟B中催化3-側氧基戊二醯基輔酶A中之3-側氧基還原為3-羥基。
3-側氧基醯基輔酶A去氫酶將3-側氧基醯基輔酶A分子轉化為3-羥基醯基輔酶A分子且通常牽涉脂肪酸β-氧化或苯基乙酸分解代謝。舉例而言，大腸桿菌中由fadB及fadJ編碼之兩種脂肪酸氧化複合物之次單元充當3-羥基醯基輔酶A去氫酶(Binstock等人，Methods Enzymol.71 Pt C：403-411(1981))。此外，在苯基乙酸或苯乙烯之分解代謝期間，由惡臭假單胞菌U中之phaC(Olivera等人，同上，(1998))及螢光假單胞菌ST中之paaC(Di等人，同上，(2007))編碼的基因產物催化3-羥基己二醯基輔酶A可逆氧化形成3-側氧基己二醯基輔酶A。另外，考慮到大腸桿菌中paaH與其他基因在苯基乙酸降解操縱子方面的親 近性(Nogales等人，同上，(2007))以及paaH突變體不能生長於苯基乙酸上(Ismail等人，同上，(2003))，預期大腸桿菌paaH基因編碼3-羥基醯基輔酶A去氫酶。
3-羥基丁醯基輔酶A去氫酶(亦稱作乙醯乙醯基輔酶A還原酶)催化乙醯乙醯基輔酶A在NAD(P)H依賴性下可逆轉化為3-羥基丁醯基輔酶A。此酶在若干梭菌屬物種中參與乙醯基輔酶A形成丁酸之醱酵路徑且已詳細研究(Jones及Woods，同上，(1986))。酶候選物包括來自丙酮丁醇梭菌之hbd(Boynton等人，J.Bacteriol.178：3015-3024(1996))、來自拜氏梭菌之hbd(Colby等人，Appl Environ.Microbiol 58：3297-3302(1992))，及多種來自勤奮金屬球菌之類似酶(Berg等人，同上，(2007))。由hbd編碼之來自丙酮丁醇梭菌之酶已經選殖且於大腸桿菌中功能性表現(Youngleson等人，同上，(1989))。證明將乙醯乙醯基輔酶A還原為3-羥基丁醯基輔酶A之其他基因為來自生枝動膠菌之phbB(Ploux等人，同上，(1988))及來自球形紅桿菌之phaB(Alber等人，同上，(2006))。前者基因具NADPH依賴性，其核苷酸序列已確定(Peoples及Sinskey，同上，(1989))且該基因已於大腸桿菌中表現。其他基因包括克氏梭菌中之hbd1(C端域)及hbd2(N端域)(Hillmer及Gottschalk,Biochim.Biophys.Acta 3334：12-23(1974))及溫帶牛中之HSD17B10(WAKIL等人，同上，(1954))。
3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)(圖4，步驟C)
3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶將3-羥基戊二醯基輔酶A還原為3-羥基-5-側氧基戊酸。若干種醯基輔酶A去氫酶將醯基輔酶A還原為其相應醛(EC 1.2.1)。編碼該等酶之例示性基因包括編碼脂肪醯基輔酶A還原酶之乙酸鈣不動桿菌acr1(Reiser及Somerville，同上，(1997))、不動桿菌屬M-1脂肪醯基輔酶A還原酶(Ishige等人，同上，(2002))及由克氏梭菌中之sucD基因編碼的輔酶A及NADP依賴性丁二酸半醛去氫酶(Sohling及Gottschalk，同上，(1996)；Sohling及Gottschalk，同上，(1996))。牙齦卟啉單胞菌之SucD為另一種丁二酸半醛去氫酶(Takahashi等人，同上，(2000))。假單胞菌屬中由bphG編碼之醯化乙醛去氫酶之酶為另一種，因為已證明其氧化且醯化乙醛、丙醛、丁醛、異丁醛及甲醛(Powlowski等人，同上，(1993))。除了將乙醯基輔酶A還原為乙醇之外，由腸膜明串珠菌中之adhE編碼之酶已顯示將分支鏈化合物異丁醛氧化為異丁醯基輔酶A(Koo等人，Biotechnol Lett.27：505-510(2005))。在諸如糖乙酸多丁酶梭菌之生溶劑性有機體中，丁醛去氫酶催化丁醯基輔酶A轉化為丁醛之類似反應(Kosaka等人， Biosci.Biotechnol Biochem.71：58-68(2007))。
將醯基輔酶A轉化為其相應醛之另一類酶為丙二醯基輔酶A還原酶，其將丙二醯基輔酶A轉化為丙二酸半醛。丙二醯基輔酶A還原酶為在嗜熱嗜酸古細菌中經由3-羥基丙酸循環進行自養碳固定中的關鍵酶(Berg等人，同上，(2007b)；Thauer，同上，(2007))。該酶利用NADPH作為輔因子且已於金屬球菌屬及硫化葉菌屬中表徵(Alber等人，同上，(2006)；Hugler等人，同上，(2002))。該酶由勤奮金屬球菌中之Msed_0709編碼(Alber等人，同上，(2006)；Berg等人，同上，(2007b))。編碼來自東大硫化葉菌之丙二醯基輔酶A還原酶的基因經選殖且於大腸桿菌中異源表現(Alber等人，同上，(2006))。此酶亦顯示催化甲基丙二醯基輔酶A轉化為其相應醛(WO/2007/141208)。儘管此等酶之醛去氫酶功能性與來自橙色綠曲撓菌之雙功能去氫酶類似，但序列相似性很小。兩種丙二醯基輔酶A還原酶候選物與天冬胺酸-半醛去氫酶(催化天冬胺醯基-4-磷酸還原且同時去磷酸化為天冬胺酸半醛的酶)具有高序列相似性。其他基因候選物可藉由蛋白質序列同源性發現於包括硫磺礦硫化葉菌及嗜酸熱硫化葉菌之其他有機體中。另一醯基輔酶A還原酶(醛形成)候選物為來自拜氏梭菌之ald基因(Toth等人，Appl Environ.Microbiol 65：4973-4980(1999))。此酶已報導將乙醯 基輔酶A及丁醯基輔酶A還原為其相應醛。此基因與編碼傷寒沙門氏菌及大腸桿菌之乙醛去氫酶的eutE極為相似(Toth等人，同上，(1999))。
3-羥基-5-側氧基戊酸還原酶(圖4，步驟D)
此酶將3-羥基-5-側氧基戊酸中之末端醛基還原為醇基。編碼催化醛轉化為醇之酶(亦即，醇去氫酶或等效醛還原酶，1.1.1.a)的例示性基因包括編碼C2-C14之中鏈醇去氫酶的alrA(Tani等人，同上，(2000))、來自釀酒酵母之ADH2(Atsumi等人，同上，(2008))、對長於C(3)之分子具優先性的來自大腸桿菌之yqhD(Sulzenbacher等人，同上，(2004))，及來自丙酮丁醇梭菌之bdh I及bdh II(其將丁醛轉化為丁醇)(Walter等人，同上，(1992))。yqhD之基因產物使用NADPH作為輔因子催化乙醛、丙二醛、丙醛、丁醛及丙烯醛還原(Perez等人，283：7346-7353(2008)；Perez等人，J Biol.Chem.283：7346-7353(2008))。來自運動醱酵單胞菌之adhA基因產物已證明對多種醛具有活性，包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛及丙烯醛(Kinoshita等人，Appl Microbiol Biotechnol 22：249-254(1985))。
展現4-羥基丁酸去氫酶活性之酶(EC 1.1.1.61)亦屬於此類別。該等酶已於真養羅爾斯頓氏菌(Bravo等人，同上，(2004))、克氏梭菌(Wolff及Kenealy，同上，(1995))及阿拉伯芥(Breitkreuz等人，同上，(2003))中表徵。阿拉伯芥酶經選殖且於酵母[12882961]中表徵。另一基因為來自熱葡糖苷酶地芽孢桿菌之醇去氫酶adhI(Jeon等人，J Biotechnol 135：127-133(2008))。
另一例示性酶為3-羥基異丁酸去氫酶(EC 1.1.1.31)，其催化3-羥基異丁酸可逆氧化為甲基丙二酸半醛。此酶參與纈胺酸、白胺酸、異白胺酸降解且已於細菌、真核細胞及哺乳動物中鑑別。由來自溫泉菌HB8之P84067編碼的酶已在結構上表徵(Lokanath等人，J Mol Biol 352：905-17(2005))。使用同位素標記受質證明人類3-羥基異丁酸去氫酶之可逆性(Manning等人，Biochem J 231：481-4(1985))。編碼此酶之其他基因包括智人(Hawes等人，Methods Enzymol 324：218-228(2000))及家兔(Hawes等人，同上，(2000)；Chowdhury等人，Biosci.Biotechnol Biochem.60：2043-2047(1996))中之3hidh、綠膿桿菌中之mmsb，及惡臭假單胞菌中之dhat(Aberhart等人，J Chem.Soc.[Perkin 1]6：1404-1406(1979)；Chowdhury等人，同上，(1996)；Chowdhury等人，Biosci.Biotechnol Biochem.67：438-441(2003))。
亦可藉由兩種其他酶來實現丙二酸半醛轉化為3-HP：NADH依賴性3-羥基丙酸去氫酶及NADPH依賴性丙二酸半醛還原酶。認為NADH依賴性3-羥基丙酸去氫酶在細菌及植物中參與自丙酸之β-丙胺酸生物合成路徑(Rathinasabapathi B.,Journal of Plant Pathology 159：671-674(2002)；Stadtman,J.Am.Chem.Soc.77：5765-5766(1955))。迄今為止此酶尚未與任何有機體中之基因相關聯。NADPH依賴性丙二酸半醛還原酶催化自養CO2固定細菌中的可逆反應。儘管在勤奮金屬球菌中已偵測到酶活性，但基因身分未知(Alber等人，同上，(2006))。
3,5-二羥基戊酸激酶(圖4，步驟E)
此酶磷酸化圖4(步驟E)中之3,5-二羥基戊酸形成3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸(3H5PP)。此轉化可由EC類別2.7.1中之酶催化，該酶能夠在ATP依賴性下將磷酸基轉移至醇上。
此步驟之良好候選物為甲羥戊酸激酶(EC 2.7.1.36)，其將3,5-二羥基戊酸之甲基類似物甲羥戊酸的末端羥基磷酸化。此步驟之一些基因候選物為來自釀酒酵母之erg12、來自詹氏甲烷球菌之mvk、來自智人之MVK，及來自阿拉伯芥col之mvk。
甘油激酶亦磷酸化甘油中之末端羥基以形成甘油-3-磷酸。此反應在若干物種中發生，包括大腸桿菌、釀酒酵母及海棲熱袍菌。大腸桿菌甘油激酶已顯示接受諸如二羥基丙酮及甘油醛之替代受質(Hayashi及Lin，同上，(1967))。海棲熱袍菌具有兩種甘油激酶(Nelson等人，同上，(1999))。甘油激酶已顯示具有廣泛多種受質特異性。Crans及Whiteside研究來自四種不同有機體之甘油激酶(大腸桿菌、釀酒酵母、嗜熱脂肪芽孢桿菌及念珠菌)(Crans及Whitesides，同上，(2010)；Nelson等人，同上，(1999))。其研究66種不同之甘油類似物且推斷出：酶可接受多種取代基來替代一末端羥基且C2處之氫原子可由甲基置換。有趣的是，來自所有四種有機體之酶的動力學常數極為相似。基因候選物為：
高絲胺酸激酶為可導致3,5-二羥基戊酸磷酸化之另一可能候選物。此酶亦存在於包括大腸桿菌、鏈黴菌屬及釀酒酵母之多種有機體中。來自大腸桿菌之高絲胺酸激酶已顯示對多種受質具有活性，該等受質包括L-2-胺基-1,4-丁二醇、天冬胺酸半醛及2-胺基-5-羥基戊酸(Huo及Viola，同上，(1996)；Huo及Viola，同上，(1996))。此酶可作用於α位置之羧基已經酯或羥基甲基置換的受質。基因候選物為：
3H5PP激酶(圖4，步驟F)
3H5PP磷酸化為3H5PDP係由3H5PP激酶催化(圖4，步驟F)。磷酸甲羥戊酸激酶(EC 2.7.4.2)催化甲羥戊酸路徑中之類似轉化。此酶係由釀酒酵母中之erg8(Tsay等人，Mol.Cell Biol.11：620-631(1991))及肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌及糞腸球菌中之mvaK2(Doun等人，Protein Sci.14：1134-1139(2005)；Wilding等人，J Bacteriol.182：4319-4327(2000))編碼。肺炎鏈球菌及糞腸球菌酶經選殖且於大腸桿菌中表徵(Pilloff等人，J Biol.Chem.278：4510-4515(2003)；Doun等人，Protein Sci.14：1134-1139(2005))。
3H5PDP去羧酶(圖4，步驟G)
丁烯基4-二磷酸係藉由3H5PDP去羧酶自3H5PDP之ATP依賴性去羧化形成(圖4，步驟G)。儘管迄今為止具有此活性之酶未經表徵，但類似反應係由甲羥戊酸二磷酸去羧酶(EC 4.1.1.33)催化，該酶為參與類異戊二烯生物合成之甲羥戊酸路徑的酶。此反應係由釀酒酵母中之MVD1、智人中之MVD以及金黃色葡萄球菌及布氏錐蟲中之MDD催化(Toth等人，J Biol.Chem.271：7895-7898(1996)；Byres等人，J Mol.Biol.371：540-553(2007))。
丁烯基4-二磷酸異構酶(圖4，步驟H)
丁烯基4-二磷酸異構酶催化2-丁烯基-4-二磷酸與丁烯基-4-二磷酸之可逆相互轉化。以下酶可天然具有此活性或可經工程改造以展現此活性。有用之基因包括編碼可相互轉化異戊烯基二磷酸與二甲基烯丙基二磷酸之酶的基因。此等酶包括來自大腸桿菌(Rodríguez-Concepción等人，FEBS Lett,473(3)：328-332)、釀酒酵母(Anderson等人，J Biol Chem,1989,264(32)；19169-75)及芝田硫化葉菌(Yamashita等人，Eur J Biochem,2004,271(6)；1087-93)之異戊烯基二磷酸異構酶。由大腸桿菌之Idi蛋白催化之異構化的反應機制已在機制上詳細表徵(de Ruyck等人，J Biol.Chem.281：17864-17869(2006))。來自釀酒酵母、枯草桿菌及雨生紅球藻之異戊烯基二磷酸異構酶已於大腸桿菌中異源表現(Laupitz等人，Eur.J Biochem.271：2658-2669(2004)；Kajiwara等人，Biochem.J 324(Pt 2)：421-426(1997))。
丁二烯合成酶(圖4，步驟I)
丁二烯合成酶催化2-丁烯基-4-二磷酸轉化為1,3-丁二烯。下述酶天然具有該活性或可經工程改造以展現此活性。異戊二烯合成酶天然催化二甲基烯丙基二磷酸轉化為異戊二烯，但亦可催化自2-丁烯基-4-二磷酸合成1,3-丁二烯。異戊二烯合成酶可發現於若干有機體中，包括銀白楊樹(Sasaki等人，FEBS Letters,2005,579(11),2514-2518)、山葛(Lindberg等人，Metabolic Eng,12(1)：70-79(2010)；Sharkey等人，Plant Physiol.,137(2)：700-712(2005))及歐洲山楊-銀白楊樹雜交種(Miller等人，Planta,213(3)：483-487(2001))。其他異戊二烯合成酶 描述於(Chotani等人，WO/2010/031079,Systems Using Cell Culture for Production of Isoprene；Cervin等人，美國專利申請案20100003716,Isoprene Synthase Variants for Improved Microbial Production of Isoprene)中。
3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醇形成)(圖4，步驟J)
此步驟催化3-羥基戊二醯基輔酶A中之醯基輔酶A基團還原為醇基。將醯基輔酶A轉化為醇之例示性雙功能氧化還原酶包括將諸如乙醯基輔酶A之受質轉化為乙醇之酶(例如，來自大腸桿菌之adhE(Kessler等人，同上，(1991)))及將諸如丁醯基輔酶A之受質轉化為丁醇之酶(例如，來自丙酮丁醇梭菌之adhE2(Fontaine等人，同上，(2002)))。除了將乙醯基輔酶A還原為乙醇之外，由腸膜明串珠菌中之adhE編碼之酶已顯示將分支鏈化合物異丁醛氧化為異丁醯基輔酶A(Kazahaya等人，同上，(1972)；Koo等人，同上，(2005))。
另一例示性酶可將丙二醯基輔酶A轉化為3-HP。具有此活性之NADPH依賴性酶已於橙色綠曲撓菌中表徵，其中該酶參與3-羥基丙酸循環(Hugler等人，同上，(2002)：Strauss及Fuchs，同上，(1993))。質量為300kDa之此酶具有高受質特異性且展示與其他已知氧化還原酶之序列相似性很小(Hugler等人，同上，(2002))。其他有機體中之酶均未顯示催化此特定反應；但有生物資訊證據表明其他有機體可具有類似路徑(Klatt等人，同上，(2007))。可根據序列相似性推斷包括卡斯特玫瑰彎菌、赤細菌屬NAP1及海洋γ變形細菌HTCC2080之其他有機體中的酶候選物。
較長鏈醯基輔酶A分子可藉由諸如荷荷芭FAR之酶還原為其相應醇，該酶編碼形成醇之脂肪醯基輔酶A還原酶。其在大腸桿菌中過度表現產生FAR活性且導致脂肪醇積聚(Metz等人，Plant Physiology 122：635-644(2000))。
用於催化此步驟之另一候選物為3-羥基-3-甲基戊二醯基輔酶A還原酶(或HMG-輔酶A還原酶)。此酶將3-羥基-3-甲基戊二醯基輔酶A中之輔酶A基團還原為形成醇之甲羥戊酸。此步驟之基因候選物包括：
編碼3-羥基-3-甲基戊二醯基輔酶A還原酶之硫磺礦硫化葉菌之hmgA基因已經選殖、測序且於大腸桿菌中表現(Bochar等人，J Bacteriol.179：3632-3638(1997))。釀酒酵母中亦具有兩種HMG-輔酶A還原酶(Basson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 83：5563-5567(1986))。該基因亦已自阿拉伯芥中分離且已顯示在釀酒酵母中補充HMG-輔酶A還原酶活性(Learned等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86：2779-2783(1989))。
3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)(圖4，步驟K)
若干種醯基輔酶A去氫酶能夠將醯基輔酶A還原為其相應醛。因此其可天然地將3-側氧基戊二醯基輔酶A還原為3,5-二側氧基戊酸或可經工程改造以將3-側氧基戊二醯基輔酶A還原為3,5-二側氧基戊酸。編碼該等酶之例示性基因論述於圖4，步驟C中。
3,5-二側氧基戊酸還原酶(酮還原)(圖4，步驟L)
存在若干種將酮轉化為羥基官能基之例示性醇去氫酶。兩種來自大腸桿菌之該等酶係由蘋果酸去氫酶(mdh)及乳酸去氫酶(ldhA)編碼。另外，來自真養羅爾斯頓氏菌之乳酸去氫酶已顯示對各種鏈長之2-酮酸展示高活性，包括乳酸、2-側氧基丁酸、2-側氧基戊酸及2-側氧基戊二酸(Steinbuchel等人，Eur.J.Biochem.130：329-334(1983))。將α-酮己二酸轉化為α-羥基己二酸可由2-酮己二酸還原酶催化，該酶據報導發現於大鼠及人類胎盤中(Suda等人，Arch.Biochem.Biophys.176：610-620(1976)；Suda等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.77：586-591(1977))。用於此步驟之另一候選物為來自人類心臟之粒線體3-羥基丁酸去氫酶(bdh)，其已經選殖且表徵(Marks等人，J.Biol.Chem.267：15459-15463(1992))。此酶為對3-羥基酸起作用之去氫酶。另一例示性醇去氫酶將丙酮轉化為異丙醇，如拜氏梭菌(Ismaiel等人，J.Bacteriol.175：5097-5105(1993))及布氏嗜熱厭氧菌(Lamed等人，Biochem.J.195：183-190(1981)；Peretz等人，Biochemistry.28：6549-6555(1989))中所示。甲基乙基酮還原酶或者2-丁醇去氫酶催化MEK還原形成2-丁醇。例示性酶可發現於橡膠赤球菌(Kosjek等人，Biotechnol Bioeng.86：55-62(2004))及極端嗜熱古細菌(van der等人，Eur.J.Biochem.268：3062-3068(2001))中。
多種有機體可催化4-羥基-2-丁酮還原為1,3-丁二醇，尤其包括屬於桿菌(Bacillus)屬、短桿菌(Brevibacterium)屬、念珠菌(Candida)屬及克雷伯氏菌(Klebsiella)屬之有機體，如由Matsuyama等人，美國專利5,413,922所述。經突變之赤球菌苯基乙醛還原酶(Sar268)及賴氏菌(Leifonia)醇去氫酶亦已顯示在高產率下催化此轉化(Itoh等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.75(6)：1249-1256)。
高絲胺酸去氫酶(EC 1.1.1.13)催化天冬胺酸半醛在NAD(P)H依賴性下還原為高絲胺酸。在包括大腸桿菌之許多有機體中，高絲胺酸去氫酶為亦催化天冬胺酸在ATP依賴性下轉化為天冬胺醯基-4-磷酸之雙功能酶(Starnes等人，Biochemistry 11：677-687(1972))。功能域具催化獨立性且由連接域連接(Sibilli等人，J Biol Chem 256：10228-10230(1981))且兩種域皆經受蘇胺酸異位抑制。將由thrA編碼之大腸桿菌酶之高絲胺酸去氫酶域與天冬胺酸激酶域分離，表徵且發現其展現高催化活性及受蘇胺酸抑制降低(James等人，Biochemistry 41：3720-3725(2002))。此可應用於包括例如胚芽乳桿菌(Cahyanto等人，Microbiology 152：105-112(2006))及阿拉伯芥之hom1的其他雙功能蘇胺酸激酶。由釀酒酵母中之hom6(Jacques等人，Biochim Biophys Acta 1544：28-41(2001))及胚芽乳桿菌中之hom2(Cahyanto等人，同上，(2006))編碼的單功能高絲胺酸去氫酶已於大腸桿菌中功能表現且表 徵。
3,5-二側氧基戊酸還原酶(醛還原)(圖4，步驟M)
若干種還原醛之還原酶能夠將醛還原為其相應醇。因此其可天然地將3,5-二側氧基戊酸還原為5-羥基-3-側氧基戊酸或可經工程改造以將3,5-二側氧基戊酸還原為5-羥基-3-側氧基戊酸。編碼該等酶之例示性基因論述於圖4，步驟D中。
5-羥基-3-側氧基戊酸還原酶(圖4，步驟N)
若干種還原酮之還原酶能夠將酮還原為其相應羥基。因此其可天然地將5-羥基-3-側氧基戊酸還原為3,5-二羥基戊酸或經工程改造以將5-羥基-3-側氧基戊酸還原為3,5-二羥基戊酸。編碼該等酶之例示性基因論述於圖4，步驟L中。
3-側氧基-戊二醯基輔酶A還原酶(輔酶A還原及醇形成)(圖4，步驟O)
3-側氧基-戊二醯基輔酶A還原酶(輔酶A還原及醇形成)催化自3-側氧基-戊二醯基輔酶A形成5-羥基-3-側氧基戊酸所需的2個還原步驟。對於圖4，步驟J提供將醯基輔酶A轉化為醇之例示性2步驟氧化還原酶。該等酶可天然地將3-側氧基-戊二醯基輔酶A轉化為5-羥基-3-側氧基戊酸或可經工程改造以將3-側氧基-戊二醯基輔酶A轉化為5-羥基-3-側氧基戊酸。
在整個本申請案中參考多個公開案。此等公開案之揭示內容全文(包括GenBank及GI編號公開案)係以引用的方式併入本申請案中以 更充分描述本發明所屬領域之目前先進技術。儘管已關於上文提供之實例描述本發明，但應瞭解，可在不悖離本發明之精神的情況下作出各種修改。

Claims (59)

  1. 一種非天然存在微生物有機體，其包含具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包含至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包含乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)、戊烯二醯基輔酶A去羧酶、戊二醯基輔酶A去氫酶、3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶或巴豆醇二磷酸激酶。
  2. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該微生物有機體包含兩種各編碼丁二烯路徑酶之外源核酸。
  3. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該微生物有機體包含三種各編碼丁二烯路徑酶之外源核酸。
  4. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該微生物有機體包含四種各編碼丁二烯路徑酶之外源核酸。
  5. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶。
  6. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷 酸激酶、丁二烯合成酶及巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)。
  7. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶。
  8. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶及巴豆酸還原酶。
  9. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶及巴豆醇二磷酸激酶。
  10. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含乙醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶及巴豆醇二磷酸激酶。
  11. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含戊烯二醯基輔酶A去羧酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶。
  12. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含戊烯二醯基輔酶A去羧酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、 丁二烯合成酶及巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)。
  13. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含戊烯二醯基輔酶A去羧酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶。
  14. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含戊烯二醯基輔酶A去羧酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶及巴豆酸還原酶。
  15. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含戊烯二醯基輔酶A去羧酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶及巴豆醇二磷酸激酶。
  16. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、戊烯二醯基輔酶A去羧酶及巴豆醇二磷酸激酶。
  17. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含戊二醯基輔酶A去氫酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶。
  18. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含戊二醯基輔酶A去氫酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶及巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)。
  19. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含戊二醯基輔酶A去氫酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶。
  20. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含戊二醯基輔酶A去氫酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶及巴豆酸還原酶。
  21. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含戊二醯基輔酶A去氫酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶及巴豆醇二磷酸激酶。
  22. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、戊二醯基輔酶A去氫酶及巴豆醇二磷酸激酶。
  23. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶。
  24. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶及巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)。
  25. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶。
  26. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶及巴豆酸還原酶。
  27. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶及巴豆醇二磷酸激酶。
  28. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、3-胺基丁醯基輔酶A去胺酶及巴豆醇二磷酸激酶。
  29. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶及丁二烯合成酶。
  30. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶及巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)。
  31. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醇形成)及巴豆醇二磷酸激酶。
  32. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、巴豆醇激酶、2-丁烯基-4-磷酸激酶、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶及巴豆酸還原酶。
  33. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、巴豆醯基輔酶A水解酶、合成酶或轉移酶、巴豆酸還原酶及巴豆醇二磷酸激酶。
  34. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含3-羥基丁醯基輔酶A脫水酶、巴豆醯基輔酶A還原酶(醛形成)、巴豆醛還原酶(醇形成)、丁二烯合成酶、4-羥基丁醯基輔酶A脫水酶及巴豆醇二磷酸激酶。
  35. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該至少一種外源核酸為異源核酸。
  36. 如請求項1之非天然存在微生物有機體，其中該非天然存在微生物有機體處於實質上厭氧培養基中。
  37. 一種非天然存在微生物有機體，其包含具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包含至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包含赤藻糖-4-磷酸還原酶、赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、赤藻糖-4-磷酸激酶、赤藻糖還原酶或赤藻糖醇激酶。
  38. 如請求項37之非天然存在微生物有機體，其中該微生物有機體包含兩種各編碼丁二烯路徑酶之外源核酸。
  39. 如請求項37之非天然存在微生物有機體，其中該微生物有機體包含三種各編碼丁二烯路徑酶之外源核酸。
  40. 如請求項37之非天然存在微生物有機體，其中該微生物有機體包含四種各編碼丁二烯路徑酶之外源核酸。
  41. 如請求項37之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含赤藻糖-4-磷酸還原酶、赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸 還原酶及丁二烯合成酶。
  42. 如請求項37之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含赤藻糖-4-磷酸還原酶、赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶、丁烯基4-二磷酸異構酶及丁二烯合成酶。
  43. 如請求項37之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶、丁二烯合成酶、赤藻糖-4-磷酸激酶、赤藻糖還原酶及赤藻糖醇激酶。
  44. 如請求項37之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含赤藻糖醇-4-磷酸胞苷醯基轉移酶、4-(胞苷5'-二磷酸基)-赤藻糖醇激酶、赤藻糖醇2,4-環二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸合成酶、1-羥基-2-丁烯基4-二磷酸還原酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、赤藻糖-4-磷酸激酶、赤藻糖還原酶及赤藻糖醇激酶。
  45. 如請求項37之非天然存在微生物有機體，其中該至少一種外源核酸為異源核酸。
  46. 如請求項37之非天然存在微生物有機體，其中該非天然存在微生物有機體處於實質上厭氧培養基中。
  47. 一種非天然存在微生物有機體，其包含具有丁二烯路徑之微生物有機體，該丁二烯路徑包含至少一種編碼丁二烯路徑酶之外源核酸，其表現量足以產生丁二烯，該丁二烯路徑包含丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(酮還原)、3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)、3-羥基- 5-側氧基戊酸還原酶、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基(phosphonatooxy)戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基(phosphonooxy))磷醯基(phosphoryl)]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醇形成)、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)、3,5-二側氧基戊酸還原酶(酮還原)、3,5-二側氧基戊酸還原酶(醛還原)、5-羥基-3-側氧基戊酸還原酶或3-側氧基-戊二醯基輔酶A還原酶(輔酶A還原及醇形成)。
  48. 如請求項47之非天然存在微生物有機體，其中該微生物有機體包含兩種各編碼丁二烯路徑酶之外源核酸。
  49. 如請求項47之非天然存在微生物有機體，其中該微生物有機體包含三種各編碼丁二烯路徑酶之外源核酸。
  50. 如請求項47之非天然存在微生物有機體，其中該微生物有機體包含四種各編碼丁二烯路徑酶之外源核酸。
  51. 如請求項47之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(酮還原)、3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)、3-羥基-5-側氧基戊酸還原酶、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶及丁二烯合成酶。
  52. 如請求項47之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)、3,5-二側氧基戊酸還原酶(醛還原)及5-羥基-3-側氧基戊酸還原酶。
  53. 如請求項47之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3-羥基-5-側氧基戊酸還原酶、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(醛形成)及3,5-二側氧基戊酸還原酶(酮還原)。
  54. 如請求項47之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶、5-羥基-3-側氧基戊酸還原酶及3-側氧基-戊二醯基輔酶A還原酶(輔酶A還原及醇形成)。
  55. 如請求項47之非天然存在微生物有機體，其中該丁二烯路徑包含丙二醯基輔酶A：乙醯基輔酶A醯基轉移酶、3-側氧基戊二醯基輔酶A還原酶(酮還原)、3,5-二羥基戊酸激酶、3-羥基-5-膦醯氧根基戊酸激酶、3-羥基-5-[羥基(膦醯氧基)磷醯基]氧基戊酸去羧酶、丁烯基4-二磷酸異構酶、丁二烯合成酶及3-羥基戊二醯基輔酶A還原酶(醇形成)。
  56. 如請求項47之非天然存在微生物有機體，其中該至少一種外源核酸為異源核酸。
  57. 如請求項47之非天然存在微生物有機體，其中該非天然存在微生物有機體處於實質上厭氧培養基中。
  58. 一種產生丁二烯之方法，其包含在產生丁二烯之條件下且持續足夠長時段培養如請求項1至57中任一項之非天然存在微生物有機體。
  59. 如請求項58之方法，其中該非天然存在微生物有機體處於實質上厭氧培養基中。
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