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TW201720843A - 用於治療纖維化及／或纖維化病症之抗－αＶ整合素抗體 - Google Patents

用於治療纖維化及／或纖維化病症之抗－αＶ整合素抗體 Download PDF

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TW201720843A
TW201720843A TW105138308A TW105138308A TW201720843A TW 201720843 A TW201720843 A TW 201720843A TW 105138308 A TW105138308 A TW 105138308A TW 105138308 A TW105138308 A TW 105138308A TW 201720843 A TW201720843 A TW 201720843A
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di17e6
antibody
ssc
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biologically active
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TW105138308A
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艾勒翰 錫利克
艾柯 斯陶柏
米朗姆 爾班
薩班納 勒柏
艾琳 薩米
安卓 班德爾
喬吉安納 西金柏桑姆
音 吳
代根 徐
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馬克專利公司
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Abstract

本發明係關於藉由抗體來治療纖維化及/或纖維化疾病。首先，本發明係關於投與抗-αv整合素(受體)抗體至罹患纖維化及/或纖維化疾病(包括但不限於全身性硬化症(SSc))之患者。更具體言之，本發明係關於藉由該抗體來治療皮膚、肺、心臟、肝及/或腎之纖維化疾病。甚至更具體言之，本發明係關於藉由抗-αv整合素抗體DI17E6及其結構突變體來投與靶向αv整合素之重組型脫免疫單株抗體至罹患全身性硬化症(包括但不限於皮膚、肺、心臟及/或腎之全身性硬化症)之患者。

Description

用於治療纖維化及／或纖維化病症之抗－αＶ整合素抗體
本發明係關於藉由抗體來治療纖維化及/或纖維化疾病。首先，本發明係關於投與抗-αv整合素(受體)抗體至罹患纖維化及/或纖維化疾病(包括但不限於全身性硬化症(SSc))之患者。更具體言之，本發明係關於藉由該抗體來治療皮膚、肺、心臟、肝及/或腎之纖維化疾病。甚至更具體言之，本發明係關於投與靶向αv整合素之重組型脫免疫單株抗體至罹患全身性硬化症(包括但不限於皮膚、肺、心臟及/或腎之全身性硬化症)之患者。特定言之，本發明係關於藉由抗-αv整合素抗體DI17E6 (阿吐珠單抗(Abituzumab))及其結構突變體來治療該等患者。該療法的一個重要目標為減緩、暫停及/或復原患者之該等纖維化及/或纖維化疾病，因此較佳地通常改良罹患纖維化及/或纖維化疾病之患者的狀態。該療法的一個其他重要目標為減緩、暫停及/或復原患者之全身性硬化症，因此較佳地通常改良罹患該全身性硬化症之患者的狀態及生活品質。
較佳地將纖維化定義為在器官或組織中，較佳在修複性或反應性過程中形成過量的纖維組織，較佳纖維結締組織。此纖維化可較佳定性為反應性、良性或病理狀態。作為對損傷之反應，較佳稱此為結疤，且若纖維化自單細胞系產生，則較佳稱此為纖維瘤。生理上而言，纖維化通常作用以沉積結締組織，其可閉塞底層器官或組織之架構及功能。較佳使用纖維化來描述纖維組織過量沉積之病理狀態以及在癒合過程中之結締組織沉積的過程。在本發明語境中，較佳使用術語纖維化來描述纖維組織過量沉積之病理狀態。纖維化在病理意義上而言係類似於結疤之過程，兩者皆涉及刺激鋪設結締組織之細胞，包括膠原蛋白及葡萄糖胺聚糖。稱為巨噬細胞之免疫細胞以及在稱為組織間隙之表面之間的任何受損傷組織通常釋放TGF-β。對此有多種原因，包括伴有循環介體增加之鄰近組織之發炎或廣義發炎狀態。TGF-β刺激成纖維細胞之增殖及活化，其隨後通常觸發結締組織之沉積。 纖維化可發生在身體中之許多器官之許多組織中，通常由發炎或損傷所致，且實例包括： 肺之纖維化，例如肺纖維化、囊性纖維化及/或特發性肺纖維化；肝之纖維化，例如肝硬化； 心臟之纖維化，例如心房纖維化、心內膜心肌層纖維化及/或先前心肌梗塞之間接性損傷。 此外，纖維化，及尤其病理學纖維化，較佳包括關節纖維化(主要在膝蓋及肩膀，還發生在多種其他關節)、克恩氏(Crohn's Disease)病(腸)、杜普伊特倫氏攣縮(Dupuytren's contracture) (主要在手部及/或指部)、瘢瘤(主要影響皮膚)、縱膈纖維化(主要與縱膈腔之軟組織相關)、骨髓纖維化(主要影響骨髓)、佩羅尼氏病(Peyronie’s disease)(陰莖)、腎源性全身性纖維化(主要影響皮膚)、進行性塊狀纖維化(例如，肺部，常常為煤礦工人之塵肺病之間接性併發症)、腹膜後纖維化(主要影響腹膜後腔之軟組織)、及/或硬皮病或全身性硬化症(主要影響皮膚及/或肺)。 此項技術已知且理解術語纖維化、病理學纖維化及纖維化疾病。 較佳地，在本發明語境中，纖維化之所有病理學形式(即，非直接與急性損傷及/或正常傷口癒合相關之形式)亦稱為纖維化病症。因此，纖維化病症較佳係彼等超過通常在所需恰當的傷口癒合過程中所發現之纖維化水平的纖維化狀態。 全身性硬化症(SSc，ICD-10分類M34)係待根據本發明所治療之尤佳纖維化病症。全身性硬化症通常亦稱為全身性硬皮病且有時稱為進行性全身性硬化症。全身性硬化症係具有特徵性但可變範圍之臨床及實驗室表徵的臨床異質性多器官結締組織疾病，其特徵為自體免疫性、血管損傷及進行性纖維化，從而導致疼痛、失能、進行性功能障礙及重要器官(諸如肺、心臟或腎)最終衰竭。較佳地，SSc可分化自稱為局限性硬皮病(localized scleroderma)之疾病群，其較佳包括諸如硬斑病(morphea)、帶狀硬皮病及劍傷性硬皮病(scleroderma en-coup-de-sabre)之病狀，且較佳亦包括擬態硬皮病之一或多種徵兆之其他病症。 目前尚未知SSc之病原學。然而，該範圍的臨床表徵係幾乎任何器官中可能潛在之可變程度之血管異常、免疫介導之損傷及纖維化的結果。當影響重要器官諸如肺、肝、腎及心臟時，在SSc中之器官受累可導致其功能衰退及早熟死亡。皮膚幾乎總是受累。基於皮膚受累的型樣，將SSc分類成瀰漫性皮膚(dc) SSc及局限性皮膚(lc) SSc。在lcSSc中，皮膚受累通常自四肢末端延伸至膝蓋及肘；在dcSSc中，皮膚受累通常向近端延伸，涉及軀幹上肢及/或大腿。關於較佳子集及疾病分類之更多詳情可參見「分類」及「診斷及症狀」部分。SSc可具有與其他結締組織疾病(CTD)諸如全身性紅斑狼瘡、多發性肌炎、類風濕性關節炎或修格蘭氏症候群部分重疊之特徵。 SSc通常與以下組織病理學及病理生理學特徵中之一或多者相關聯： i)血管異常： 在SSc血管異常中之特徵病理發現結果為涉及多血管床中之小型動脈及小動脈的非炎症增殖性/閉塞性血管病變。儘管在長期存在之SSc中，此等病灶通常在無發炎時發生，但是在早期疾病中，在許多器官中炎性細胞浸潤係顯著的。可於受累及不受累皮膚中檢測到纖維化之前存在血管損傷的組織病理學證據，其指示普遍過程。諸如雷諾德現象(Raynaud's phenomenon)之表現通常先於其他疾病表現。SSc血管病變之其他臨床徵兆包括皮膚毛細血管擴張、指甲皺褶毛細血管改變、肺動脈性高血壓(PAH)、指凹坑形成(digital pit formation)、胃竇血管擴張及硬皮病腎危象。 在患有確診SSc之患者中，最具特徵之血管發現結果為在小型及中型動脈中之溫和內膜增生。在該疾病之晚期，大量纖維蛋白沉積及血管周圍纖維化引起進行性管腔閉塞，且病變組織中嚴重缺乏小型血管。血管供應減少導致慢性組織缺氧。 初始血管損傷顯然係內皮細胞損傷。其次，血小板可被活化並釋放可造成血管收縮、成纖維細胞活化及成肌纖維細胞轉分化之介體。內皮功能障礙可導致異常血管擴張/收縮，使得血液流動反應受損及伴隨放大血管損傷之氧化壓力之缺血-再灌注的發作。據報導，患有SSc之患者中內皮素-1(已知之最強效血管收縮劑)升高，其中dcSSc中之水平比lcSSc更高。小型血管之阻塞性血管病變導致組織缺氧及所描述組織重塑。血管生成可在SSc中受損閉並造成進行性血管損失的結果。 ii)組織纖維化： 纖維化之特徵在於以下之過量累積：類型I膠原蛋白及其他纖維狀膠原蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖及在細胞外間質(ECM)中之其他結締組織分子。該過程導致組織架構破壞。在SSc中，皮膚及內臟中之間質及血管纖維化直接造成其等之進行性功能障礙及最終衰竭。最顯著受影響的係肺、胃腸道、心臟、腱鞘及圍繞骨骼肌之束周組織。 皮膚中之纖維化(SSc之標誌)導致真皮顯著擴大。該過程閉塞毛囊、汗腺及其他皮膚附器。膠原蛋白纖維累積係在真皮深層中最顯著，且逐步截留脂肪細胞來侵入近表面脂肪層。為成纖維細胞與平滑肌細胞之間之中間體且在纖維生成中起主要作用的α-平滑肌正肌動蛋白陽性成肌纖維細胞之比例在病變皮膚中增加。 在早期肺病灶中，發現肺泡壁經淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞及嗜酸性粒細胞片狀浸潤。隨著進展，肺間質纖維化及血管損傷佔主導地位，常常共存於相同病灶中。肺動脈之內膜增厚原發PAH，且在剖檢中常常與多發性肺栓塞及心肌纖維化相關聯。肺活組織檢查樣本中發現的典型組織學型樣為非特異性間質肺炎，特徵為輕度至中度間質發炎之間質性肺病形式、類型II肺細胞增生及纖維化均勻分佈。不太常見地，SSc與特徵為分散成纖維細胞變異區及片狀分佈纖維化之常見間質肺炎型樣相關聯。肺泡隔之進行性增厚最終導致空腔閉塞及蜂窩化，及肺血管之後果性損失。此過程損害氣體交換並造成肺動脈張力升高。據報導，dcSSc患者中之間質性肺病的盛行率為約53%及lcSSc患者中為約35%。 在胃腸道中，病理變化可發生在自口至直腸之任何層級。事實上總是影響食道，具有在固有層、黏膜下層及肌層之纖維化、及特徵性血管病灶。正常腸架構之替換導致蠕動活力失調、胃食道逆流及小腸動力障礙、假性梗阻及細菌過度生長。慢性胃食道逆流與食道發炎、潰瘍及狹窄形成併發。 在腎中，血管病灶為主，且腎小球腎炎係罕見的。慢性腎缺血係與腎小球萎縮及其他缺血變化相關聯。患有急性硬皮病腎危象之患者顯示與其他形式之惡性高血壓可無差別的巨大組織變化。SSc腎中之血管變化係在小型小葉間及弓狀動脈中最顯著，其顯示彈性膜加倍、顯著內膜增生及基質累積。亦可於無腎危象之SSc患者中發現此等變化。可發現小動脈壁之類血纖維類蛋白壞死。內膜增厚導致內腔之嚴重狹窄及完全閉塞，常常伴隨微血管病性溶血性貧血。 在剖檢中，在70%患有SSc之患者中發現心臟受累之證據。中度心包積水係常見的；偶爾可發生伴隨狹窄性心包炎之纖維化。特徵性病理發現結果為心肌收縮帶壞死，據認為其反映缺血-再灌注損傷。可在無明顯臨床心臟受累時發生顯著間質及血管周圍纖維化。 具有纖維化變化之其他器官包括甲狀腺、與勃起功能障礙相關之陰莖血管、唾液腺及淚腺。滑液活組織檢查樣本顯示在小型小動脈中之纖維化及特徵性血管變化。 過量沉積膠原蛋白及其他ECM成分之細胞來源為成纖維細胞或類成纖維細胞。通常常駐於結締組織中之成纖維細胞或常駐於血管周圍之外被細胞可由諸如TGF-β之生長因子進行活化，使得增殖及膠原蛋白合成增加。組織損傷、機械張力及TGF-β誘導活化類成纖維細胞及表現型變化，使得此等細胞轉化為成肌纖維細胞，指定該過程為成纖維細胞-成肌纖維細胞轉化(FMT)。成肌纖維細胞之特徵在於活動力提高、表現平滑肌肌動蛋白、膠原蛋白合成增加、金屬蛋白酶之組織抑制劑及其他ECM組分。成肌纖維細胞係在纖維化反應期間之TGF-β活化的主要來源且造成早期肉芽組織之收縮。在病理纖維生成中，成肌纖維細胞持續存在，從而造成慢性疤痕之過度收縮之ECM特徵。 免疫功能障礙： 免疫系統之先天性及適應性武器似乎在早期SSc中被活化，且自體免疫係顯著的；然而，細胞及體液自體免疫效應子路徑在致病原理中之作用尚未確定。 在該疾病早期，在病變皮膚、肺及其他受影響器官之血管周圍區域觀察到活化CD4及CD8淋巴細胞及單核球及巨噬細胞、及不太常見的B細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞及自然殺手細胞。皮膚中之單核球浸潤物主要為CD3CD4陽性 T細胞且其表現活化標記。 可在幾乎所有患有SSc之患者中檢測到具有多抗原特異性之循環自身抗體。 雖然SSc相關聯自身抗體具有經驗證之作為診斷標記的臨床效用，但是其等對疾病表現之貢獻尚未確定且未知此等自身抗體係先於血管損傷、組織傷害及/或纖維化，或係血管損傷、組織傷害及/或纖維化之結果。靶特異性及臨床相關匯總於表1。表 1. 自身抗體頻率及其主要臨床相關 縮寫：PBC，原發性膽汁性肝硬化；PM/DM，多發性肌炎/皮肌炎；SDV，嚴重指血管病變；SRC，硬皮病腎危象。 SSc通常與以下臨床特徵中之一或多者相關聯：SSc之臨床表現係多變的，反映出其複雜的基礎病理。多種臨床特徵之頻率根據該疾病之階段及子集而有所不同。器官受累之過程及嚴重程度在個別患者中係不可預測的。此外，在制定治療決策時需要考慮各併發症之嚴重程度及活性。疲勞及嗜睡常見於整個疾病中，雖然通常在其早期階段更明顯。反應性抑鬱係此通常不間斷且毀形性病症的常見伴隨症狀。 在表2中給出報告於教科書中之主要器官表現之盛行率。近來，歐洲硬皮病試驗及研究(EUSTAR)群組基於7,655位患者之特徵公開更高頻率，所有滿足不同受累器官系統之臨床特徵之1980 ACR準則的係以表格概述(表2及3)呈現。通常，女性比男性更常受影響，據報導為3至5:1之突出。表 2. SSc之臨床特徵 表 3. SSc之臨床特徵 續 分類： SSc之標誌為皮膚硬結及增厚(「硬皮病」)，而且SSc亦可涉及許多內臟。兩個主要臨床子集經由皮膚受累型樣及其他相關臨床及實驗室特徵(表4)來區分。雖然已經基於臨床特徵組合來個體化CREST症候群(縮寫詞源自皮膚鈣沉著症、雷諾德現象、食道動力障礙、指硬化、毛細管擴張)，但是其可歸類為lcSSc。SSc可具有其他結締組織疾病之特徵或滿足其等之準則。無皮膚受累之SSc (「硬皮病無皮膚硬化硬皮病(scleroderma sine scleroderma)」)係罕見的且由於無皮膚徵兆通常在疾病歷程之晚期才診斷出來。在兒童期及青少年期之SSc係極其罕見的。進一步分類可參見以「診斷及症狀」為題之部分。表 4. SSc子集之關鍵臨床特徵 診斷及症狀： 通常基於臨床表現，特定言之皮膚受累之型樣來進行SSc之診斷。美國風濕病學會(American College of Rheumatology，ACR)已經提出診斷準則來分類患者。需要一個主要準則(即，近端硬皮病)或兩個或更多個次要準則(即，[1]指硬化，[2]指尖之指凹坑疤痕或遠端指墊之物質減少，[3]雙側基底肺纖維化)來將患者分類為SSc。 當應用於病例及疾病比較群組時，該準則具有97%之確定性SSc之靈敏度及98%之特異性。此等準則顯然不能包括所有患有SSc之患者。在EUSTAR (EULAR硬皮病試驗及研究組)群組中，僅83.5%之患者滿足1980 ACR準則，患有早期疾病及重疊症候群之患者佔排除組之最大比例。 爲了克服此問題，ACR及歐洲抗風濕病聯盟(European League Against Rheumatism，EULAR)已經同意將應於2013年期間公開之經修訂之SSc準則。經修訂之準則提供於圖1中。 較佳不需要組織活體檢查來診斷SSc。表 5 ： 用於分類全身性硬化症之ACR-EULAR準則 1.此等準則適用於任何經考慮包含於SSc研究中之患者。 2.此等準則不適用於 具有能更好地解釋其等之表現之類全身性硬化症病症的患者，諸如：腎硬化性纖維化、糖尿病性硬腫症、硬化性黏液水腫、肢端紅痛病(erythromyalgia)、卟啉沉著症、硬化性苔癬、移植物抗宿主疾病及糖尿病性手關節病變(diabetic chierarthropathy)。亦不將患有「保 留手 指 之 皮膚增厚 (Skin thickening sparing the fingers) 」 之患者歸類為患有SSc。 下文以表格形式(表6)給出SSc之典型症狀。表 6. SSc之症狀(臨床徵兆及其他臨床特徵參見表2及3) 據報導，所有SSc患者自確診起之平均存活時間為約13年，而患有SSc-ILD之患者的5年存活率據報導為40至60%，這顯示患有SSc-ILD之患者與總體SSc患者相比更高的死亡率。 通常由於SSc-器官受累(~53%)、癌症(~15%)或動脈粥樣硬化導致SSc中之死亡。由SSc-器官受累所致之死亡係在患有瀰漫性皮膚受累之患者、發作時年齡較老之患者及男性患者中更常見。 最近，歐洲抗風濕病聯盟(EULAR)硬皮病試驗及研究組(EUSTAR)資料庫報告SSc中死亡的原因及風險因素。該資料庫包括5,860位滿足ACR 1980分類準則之SSc患者。死亡原因及共病資料為284人中234人致死。其等報告55%之死亡直接與SSc相關且41%與非SSc原因相關，其中剩下4%之病例經考慮為不可分類。在已故之284位患者中，54.6%患有彌散性皮膚疾病(dcSSc)且40.5%患有局限性皮膚疾病(lcSSc)。dcSSc之中值疾病持續時間為7.1年及lcSSc為15年。19%死於肺纖維化及14%死於肺動脈性高血壓。SSc相關心肌疾病死亡為14%，其中大多數原因與心律不整相關。死亡之腎原因僅佔4%，其等全部與硬皮病腎危象相關。百分之三之患者因腸胃相關原因死亡。就非SSc相關死亡而言，原因如下：感染(所有死亡之13%)、腫瘤形成(13%)及心血管疾病(12%)。隨後對非SSc相關死亡之患者進行SSc相關共病之分析。大量死於肺炎之患者亦存在伴有或無吸入記錄之胃食道逆流。十四位死於肺癌之患者中，九位患有伴發性肺纖維化。在此研究中，降低存活率之獨立預測因子包括存在蛋白尿、肺動脈性高血壓、具有低於80%預測值之用力肺活量的肺限制、存在大於紐約心臟協會(New York Heart Association)II類之呼吸困難、雷諾德現象發作時年齡更大、更低擴散一氧化碳能力及大於10之改良羅德曼(Rodman)皮膚得分。因為35%之所有SSc相關死亡可直接歸因於ILD，及26%歸因于PAH，所以此報告加強先前發現：ILD及PAH為SSc相關死亡之首要原因且可能造成非SSc相關死亡。在最近對包括12,829位患者之18個研究的系統評審及元分析中，具有心臟、ILD、肺部高血壓及腎表現之死亡風險上升。 存在ILD與SSc中之死亡率顯著相關聯。FVC降低與死亡率相關聯(VIRGINIA D. STEEN及THOMAS A. MEDSGER, JR., ARTHRITIS & RHEUMATISM，第43卷，第11期，2000年11月，第2437至2444頁，Assassi等人，Arthritis Rheum. 2009年10月15日；61(10): 1403–1411)。在SSc-ILD中，＜70%之FVC預測比＞70%者死亡率更高(Goh等人，ARTHRITIS & RHEUMATISM，第56卷，第6期，2007年6月，第2005至2012頁)。據信FVC在前12、18及24個月內之衰退預示死亡。 在953位患有SSc之患者之回溯性研究中，患有嚴重ILD之患者具有約30%之9年存活率，而器官系統無嚴重受累之患有SSc之患者具有72%之9年存活率。 失能同樣係纖維化疾病且尤其SSc之威脅性問題。例如，呼吸困難常見於SSc中(高達50%)。主要促成因素包括ILD及PAH，但支氣管擴張、齒槽出血、由食道動力障礙所致之伴有吸入之胃食道逆流、關節炎、肥胖、貧血及由缺乏運動所致之失調亦可促成。 呼吸困難為非常重要且功能及健康相關生活品質(HRQoL)的獨立預測因子。FVC及肺動脈收縮壓為呼吸困難之顯著獨立預測因子。 改良健康評定問卷(Health Assessment Questionnaire，HAQ)之失能指數(DI)與硬皮病心臟、腎病、肌腱摩擦、手攣縮及近端肌肉強度相關。HAQ-DI升高為預示死亡且與拳閉合減少、手展開減少及存在壓痛關節相關。SSc中之失能隨時間而惡化，其中呼吸困難及疾病類型為失能之最強預測因子。患有指潰瘍之患者具有顯著更高之全域失能、手失能及焦慮。大多數患有SSc之患者具有日常活動限制且在家需要幫助增加。由改良羅德曼皮膚得分(mRSS)評估之皮膚受累與失能及疼痛強烈相關。比較患有SSc、牛皮癬性關節炎及風濕性關節炎之患者，關節受累在SSc中比牛皮癬性關節炎更失能且SSc患者比患有風濕性關節炎之患者經歷更多疼痛。SSc與抑鬱及焦慮之高盛行率相關聯。抑鬱與ILD相關聯。健康相關生活品質在SSc患者中降低且與風濕性關節炎患者相似。雷諾德現象具有對失能(整體、抓握、吃穿)、疼痛及心情之影響。疼痛及抑鬱症狀為身體機能及社會適應之重要決定因素。 在患有SSc之患者中工作失能及生產力喪失係顯著的，如最近的工作狀態之元分析中所推斷。所報導之標准就業率為介於0.70與0.77之間而患者被雇用之比例範圍為在11.3%與82%之間。全職及兼職病假率亦增加以及估計支付勞動力的生產力損失。據報導，SSc中之工作失能大於風濕性關節炎。 因此，在纖維化、纖維化疾病及尤其在SSc及相關適應症領域中對治療選項有非常高的未滿足的醫療需求。
本發明者已發現，已知之單株抗-αv抗體DI17E6 (亦稱為DI-17E、Di17e6、阿吐珠單抗(Abituzumab/abituzumab)、EMR62242或EMD 525797)在干擾與纖維化及尤其纖維化病症之發展、發生及/或表現相關的細胞信號傳導過程中高度有效。此外，本發明者已發現，該抗-αv抗體DI17E6在干擾與全身性硬化症之發展、發生及/或表現相關的細胞信號傳導過程中高度有效。證據因此示於本文所給之實例部分且如上文及下文所討論。因此，本發明之一標的為一種單株抗-αv抗體DI17E6及/或其生物活性變異體或修飾，其用於治療纖維化及/或纖維化病症。本發明之一較佳標的為一種單株抗-αv抗體DI17E6及/或其生物活性變異體或修飾，其用於治療全身性硬化症。因此本發明之另一標的為一種單株抗-αv抗體DI17E6及/或其生物活性變異體或修飾之用途，其用於製造用於治療纖維化及/或纖維化病症及尤其用於治療全身性硬化症之藥劑；及/或一種用於治療纖維化及/或纖維化病症及尤其用於治療全身性硬化症之方法，其包括向患者投與該單株抗-αv抗體DI17E6及/或其生物活性變異體或修飾。
已發現已知之單株抗-αv抗體DI17E6 (本文亦稱為阿吐珠單抗(Abituzumab/abituzumab)、EMR62242或EMD 525797)在干擾與纖維化及尤其纖維化病症之發展、發生及/或表現相關的細胞信號傳導過程中高度有效。 不受上文及/或下文所詳細討論且尤其下文所討論之機制之束縛，強烈據信且在含於本文中之實例及資料中經充分證明，由於抗體DI17E6及較佳如本文所討論之其生物活性變異體或修飾之靶向位點、結合親和性/結合性質及選擇性曲線的獨有組合，抗體DI17E6及較佳亦如本文所討論之其生物活性變異體或修飾與在纖維化之發展中至關重要之信號傳導路徑及尤其對治療纖維化及/或纖維化病症，尤其本文所述之纖維化病症至關重要之路徑相互作用。根據吾人對構成本發明之結果及資料的理解，下文更詳細地討論相關路徑。 一般而言，纖維化疾病之特徵為由於細胞外間質之產生、沉積及收縮所致之過度結疤，據信其由成肌纖維細胞之增殖及活化驅動。纖維化疾病代表最大的疾病組之一，其至今無有效療法。纖維化過程藉由在前纖維化及抗纖維化介體之網路中之一系列複雜的相互作用進行調節。據信TGF-β (即，轉化生長因子β，亦常常稱為TGFb、TGF b、TGFB、TGF B、TGF-b、TGF-B、TGFbeta、TGF beta或TGF-beta)信號傳導在成纖維細胞至成肌纖維細胞轉變(FMT)中起重要作用，其造成細胞外間質沉積增加，且因此據信其為疾病之主要驅動因素。 作為與含有潛在型相關肽(LAP)區之潛伏TGF-β結合蛋白質複合的潛伏前軀體合成TGF-β同功異型體。存在於此等過程期間αv整合素與TGF-β之間串擾之實質證據。TGF-β1之LAP含有與整合素αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8相互作用導致TGF-β1活化之RGD基元。阿吐珠單抗為泛-αv整合素抗體，發現其異位至結合配體之αv次單元且因此阻止配體結合至所有αvβ異二聚體且因此抑制潛伏TGF-β之αv整合素依賴性活化且因此阻斷成纖維細胞及其他前軀體獲取成肌纖維細胞表現型。 所得資料證實，單株抗-αv抗體DI17E6及/或其生物活性變異體或修飾能夠阻斷αv整合素之多種功能，包括結合至在αv-整合素配體中之含有RGD之序列，諸如玻璃連結蛋白、纖維結合蛋白(fibronection)及TGF-β1之潛在型結合蛋白(LAP-β1)。 因此，發現αv整合素之顯著功能之一為控制TGF-β之活化。因此，基於本文所討論之資料，據信細胞介素TGF-β為生理纖維生成及病理纖維化(包括如本文所述之SSc)之主要調節因子，及抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾能夠以看起來有利於治療纖維化、纖維化疾病及/或全身性硬化症之方式來控制TGF-β之活化。 除此作用以外，TGF-β還具有在組織修復、血管生成、免疫調節及細胞增殖與分化中之許多其他功能。TGF-β可由血小板、單核球/巨噬細胞、T細胞及成纖維細胞分泌。其之信號傳導及細胞調節係高度複雜的。 大多數產生TGF-β之細胞將其產生作為呈潛伏複合物常駐於ECM儲器中之生物學無活性前驅體分子且係不能與其受體相互作用。潛伏TGF-β至其能夠結合其細胞表面受體之活性型的轉化係藉由諸如凝血酶敏感蛋白-1、某些αvβx整合素異二聚體(圖1)及多種蛋白酶之分子來介導，且係經嚴格地調控。經活化之TGF-β結合至II型TGF-β受體，觸發導致誘導靶基因之細胞內信號轉導級聯。迄今為止，存在αvβ3、αvβ3、αvβ6及αvβ8可控制TGF-β活化之證據。上文及/或下文更詳細地對此進行描述及討論。 細胞介素TGF-β被視為生理纖維生成及病理纖維化(包括SSc)之主要調節因子(亦參見與「組織病理學及病理生理學特徵」相關之部分)。本文描述TGF-β之多種細胞效應，且在表7中給出TGF-β之最顯著作用中的一些，包括其與整合素之連接及/或締合：表 7. TGF-β之纖維生成活性 因此，本發明之一較佳標的係關於一種抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其用於治療罹患纖維化疾病及尤其全身性硬化症(SSc)之患者。較佳地，術語「纖維化疾病」及/或「全身性硬化症」具有如此項技術中已知之意義及特徵。更佳地，術語「纖維化疾病」及/或「全身性硬化症」具有如上文及/或下文所述之意義及特徵。 因此，本發明之一較佳標的係關於一種抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其用於全身性硬化症，其中該全身性硬化症包括肺、肝、腎、心血管系統及/或皮膚之全身性硬化症。更佳地，待根據本發明治療之疾病係選自肺、肝及腎之全身性硬化症。尤佳地，待根據本發明治療之疾病為肺之全身性硬化症或包括肺之全身性硬化症。 同樣較佳的係抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其用於全身性硬化症，較佳用於如上文及/或下文所更詳細描述之全身性硬化症，其中該全身性硬化症影響一或多個選自由肺、肝、腎、心臟及皮膚組成之群的器官，更佳地影響肺、肝、腎及/或心臟，且尤其影響肺或心臟。 亦同樣較佳的係抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其用於治療全身性硬化症，較佳用於治療如上文及/或下文所更詳細描述之全身性硬化症，其中該全身性硬化症影響心血管系統、血管及/或血液。因此，待根據本發明治療之疾病較佳係選自舒張功能障礙及骨髓纖維化。 因此，甚至更佳的係抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其用於使用，較佳用於如上文及/或下文所更詳細描述之使用，其中該全身性硬化症包括一或多種選自由以下組成之群的適應症：特發性肺纖維化、原發性硬化性膽管炎、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、原發性局灶性腎小球硬化、原發性節段性腎小球硬化、糖尿病性腎病、舒張功能障礙及骨髓纖維化。 因此，甚至更佳的係抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其用於使用，較佳用於如上文及/或下文所更詳細描述之使用，其中該全身性硬化症包括適應症或疾病，其中存在局灶性腎小球硬化或原發性局灶性腎小球硬化與節段性腎小球硬化或原發性節段性腎小球硬化兩者之臨床現象或表現中一或多者。因此，甚至更佳的係抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其用於，較佳如上文及/或下文所更詳細描述般用於治療局灶性節段性腎小球硬化(FSGS)。 因此，尤佳的係抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其用於使用，較佳用於如上文及/或下文所更詳細描述之使用，其中該治療包括罹患肺纖維化及/或肺泡炎(間質性肺病，ILD)之患者。 或者，較佳的係抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其如技術方案1所使用，其中該待治療之疾病為皮膚之全身性硬化症。 較佳地，皮膚之全身性硬化症係選自由瀰漫性皮膚全身性硬化症(dcSSc)及局限性皮膚全身性硬化症(lcSSc)組成之群。 本發明之尤佳標的包括： 抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，較佳抗-αv整合素抗體DI17E6，其用於治療肺纖維化、肺泡炎(間質性肺病，ILD)及/或硬皮病性間質性肺病(SSc-ILD)。 抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，較佳抗-αv整合素抗體DI17E6，其用於如上文及/或下文所述之治療中，其中該治療包括投與一劑量，較佳有效劑量之該抗體或其生物活性變異體或修飾，投與量為每週或每兩週10 mg至1000 mg。 抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，較佳抗-αv整合素抗體DI17E6，其用於如上文及/或下文所述之治療中，且較佳如直接上一段落中所述般使用，其中該劑量，較佳有效劑量係呈單次劑量進行投與。 抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，較佳抗-αv整合素抗體DI17E6，其用於如上文及/或下文所述之治療中，且較佳如直接正上兩個段落中之至少一個中所述般使用，其中該抗體或該其生物活性變異體或修飾係作為單一療法進行投與。 抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，較佳抗-αv整合素抗體DI17E6，其如上文及/或下文所述般使用，其中該生物活性變異體或修飾包括DI17E6之CDR區及重鏈及輕鏈可變區，該等可變區與DI17E6之可變區相比較在胺基酸序列上有至少80%相同，較佳與DI17E6之可變區相比較在胺基酸序列上有至少90%相同，更佳與DI17E6之可變區相比較在胺基酸序列上有至少95%相同，甚至更佳與DI17E6之可變區相比較在胺基酸序列上有至少98%相同，且尤其與DI17E6之可變區相比較在胺基酸序列上有至少99%相同。 DI17E6抗體，其如上文及/或下文所述，且尤其如正上段落所述般使用，其包括在重鏈架構區內之一或多種修飾： FR1：QVQLQQSG A ELA E PGASVK M SCKASGYTFS (SEQ ID No. 16) FR2：WV K Q R PGQGLEWIG (SEQ ID No. 17) FR3：KATMT A DTS S STAYM Q LS G L T SED S AVYYCAS (SEQ ID No. 18) FR4：WGQGT S VTVSS (SEQ ID No. 19)， 其中加粗及下劃線位置之一或多者係經突變且與原始各自序列相比較係不同的。 DI17E6抗體及/或其生物活性變異體或修飾，其如上文及/或下文所述般使用，其中該生物活性變異體或修飾包括恆定區，其與DI17E6之恆定區相比較在胺基酸序列上有至少80%相同，較佳地其與DI17E6之恆定區相比較在胺基酸序列上有至少90%相同，更佳地其與DI17E6之恆定區相比較在胺基酸序列上有至少95%相同，甚至更佳地其與DI17E6之恆定區相比較在胺基酸序列上有至少98%相同，且尤其其與DI17E6之恆定區相比較在胺基酸序列上有至少99%相同。 DI17E6抗體及/或其生物活性變異體或修飾，其如上文及/或下文所述般使用，其包括人類IgG1恆定區代替人類IgG2，或人類IgG2鉸鏈區代替人類IgG1鉸鏈。 本發明之其他尤佳標的包括： 一種治療纖維化疾病，較佳全身性硬化症且尤其如上文及/或下文所述之全身性硬化症的方法，其包括將DI17E6抗體及/或其生物活性變異體或修飾投與至患者，其中該生物活性變異體或修飾包括CDR區及重鏈及輕鏈可變區，其等與DI17E6之可變區相比較在胺基酸序列上有80%至95%相同。 一種治療纖維化疾病，較佳全身性硬化症且尤其如上文及/或下文所述之全身性硬化症的方法，其包括將DI17E6抗體及/或其生物活性變異體或修飾投與至患者，其中該生物活性變異體或修飾包括恆定區，其與DI17E6之恆定區相比較在胺基酸序列上有至少80%至98%相同。 一種治療纖維化疾病，較佳全身性硬化症且尤其如上文及/或下文所述之全身性硬化症的方法，其包括將DI17E6抗體及/或其生物活性變異體或修飾投與至患者，其包括在重鏈架構區內之一或多種修飾 FR1：QVQLQQSG A ELA E PGASVK M SCKASGYTFS (SEQ ID No. 16) FR2：WV K Q R PGQGLEWIG (SEQ ID No. 17) FR3：KATMT A DTS S STAYM Q LS G L T SED S AVYYCAS (SEQ ID No. 18) FR4：WGQGT S VTVSS (SEQ ID No. 19)， 其中加粗及下劃線位置之一或多者係經突變且與原始各自序列相比較係不同的。 如上文及/或下文所述，較佳如正上方所述之各自方法，其包括投與包括人類IgG1恆定區代替人類IgG2，或人類IgG2鉸鏈區代替人類IgG1鉸鏈區之經修飾DI17E6抗體。 1期開放標籤研究之安全結果顯示，在四種劑量水平之各水平下重複輸注單劑DI17E6 (EMD 525797)通常係良好耐受的且顯示對患者係安全的。不存在劑量限制性毒性(DLT)及輸注反應。就劑量而言，在TEAE、NCI-CTCAE (3.0版本)等級或藥物關係之分佈中未觀察到傾向。此外，不存在任何特異性事件在個別群組中累積的證據。十一位患者經歷視為藥物相關之TEAE。就此而言，在總共四位患者中報告之皮膚症狀(諸如搔癢、紅斑及疹)係與DI17E6 (EMD 525797)相關聯之可預測不良事件，考慮到整合素負責維持上皮表現型。黏膜發炎及舌腫脹之症狀亦可為EMD 525797之作用機制的特徵，但其與疲勞結合時，亦可為原發疾病之症狀。在八位患者中所觀察到之血液學及生物化學毒性轉移亦可由原發疾病以及合併用藥來解釋。 在單劑量及多劑量之研究藥物後的PK評定表明，DI17E6 (EMD 525797)表現地與如針對其他靶向膜相關聯受體之抗體所描述的受體介導之清除率模型一致。與在健康志願者中之早期研究的發現一致，DI17E6 (EMD 525797)在mCRPC患者中之PK係劑量依賴性的，其中清除率主要由未結合受體之利用率決定。對在本研究中所用之劑量而言，可以認為在1000 mg或更高之劑量下，幾乎所有受體皆係飽和且對藥物清除率具有少量貢獻。可於一些(16%)患者中檢測到針對DI17E6之免疫觸發抗體；然而，未發現對PK或安全性之影響。 總言之，呈單劑量或多劑量給定之單劑EMD 525797在患者中顯示良好耐受。不存在可識別安全性問題且在許多患者中存在臨床效益之初步證據。由於其靶及安全概況，DI17E6 (EMD 525797)係用於單劑及/或組合療法之有前景的試劑。 因此，本發明之較佳標的因此為： •如上文及/或下文所述用於治療如上文及/或下文所述之病症之DI17E6抗體，其中該抗體之該劑量，較佳該有效劑量，為每兩週500 mg至1500 mg或每月1000至3000 mg，較佳每兩週500至1000 mg或每月1000至2000 mg。 •如上文及/或下文所述用於治療如上文及/或下文所述之病症之DI17E6抗體，其中該抗體之該劑量，較佳該有效劑量，為約每月500 mg、約每月1000 mg、約每月1500 mg或約每月2000 mg。 •如上文及/或下文所述用於治療如上文及/或下文所述之病症之DI17E6抗體，其中500至1000 mg之該劑量，較佳該有效劑量係藉由單次輸注進行投與。 •一種如上文及/或下文所述用於治療如上文及/或下文所述之病症之DI17E6抗體，其中1000至2000mg之該劑量，較佳該有效劑量係藉由單次輸注進行投與。 •如上文及/或下文所述用於治療如上文及/或下文所述之病症之DI17E6抗體，其中500至1000 mg之該劑量，較佳該有效劑量係藉由一個月一次之單次輸注進行投與。 •如上文及/或下文所述用於治療如上文及/或下文所述之病症之DI17E6抗體，其中1000至2000mg之該劑量，較佳該有效劑量係藉由一個月一次之單次輸注進行投與。 •如上文及/或下文所述用於治療如上文及/或下文所述之病症之DI17E6抗體，其中約1500 mg之該劑量，較佳該有效劑量係藉由單次輸注進行投與。 •如上文及/或下文所述用於治療如上文及/或下文所述之病症之DI17E6抗體，其中約1500 mg之該劑量，較佳該有效劑量係藉由一個月一次之單次輸注進行投與。 •如上文及/或下文所述用於治療如上文及/或下文所述之病症之DI17E6抗體，其中該抗體係以無其他共同治療劑之單一療法設定進行投與。 •如上文及/或下文所述用於治療如上文及/或下文所述之病症之DI17E6抗體，其中該抗體係以與其他共同治療劑組合之組合療法設定進行投與。 •如上文及/或下文所述用於治療如上文及/或下文所述之病症之DI17E6抗體，其中該抗體係以與MMF (黴酚酸酯(Mycophenolat/Mycophenolate))組合之組合療法設定進行投與。 •如上文及/或下文所述用於治療患有SSc-ILD之患者之DI17E6抗體，其中該抗體係以與MMF (黴酚酸酯(Mycophenolat/Mycophenolate))組合之組合療法設定進行投與。 •如上文及/或下文所述用於治療患有SSc-ILD之患者之DI17E6抗體，其中該抗體係以約每月1.500 mg之量，較佳作為一個月一次之單次投與以約1.500 mg之量，以與MMF (黴酚酸酯(Mycophenolat/Mycophenolate))組合之組合療法設定進行投與。 •如上文及/或下文所述用於治療纖維化，較佳過量及/或病理纖維化之DI17E6抗體，較佳以如上文及/或下文所述之方式進行治療。 •如上文及/或下文所述用於治療纖維化病症，較佳如上文及/或下文所述之纖維化病症之DI17E6抗體，較佳以如上文及/或下文所述之方式進行治療。 •如上文及/或下文所述用於治療全身性硬化症(SSc)之DI17E6抗體，較佳以如上文及/或下文所述之方式進行治療。 •如上文及/或下文所述用於治療如上文及/或下文所述之病症之DI17E6抗體，其中經該等纖維化及/或纖維化病症所影響之器官係選自由肺、肝、腎、心血管系統或皮膚組成之群。 •如上文及/或下文所述用於治療纖維化，較佳過量及/或病理纖維化之DI17E6抗體，較佳以如上文及/或下文所述之方式進行治療，其中該纖維化、過量纖維化及/或病理纖維化影響一或多個選自由肺、肝、腎、心臟及皮膚組成之群的器官。 •如上文及/或下文所述用於治療纖維化病症，較佳如上文及/或下文所述之纖維化病症之DI17E6抗體，較佳以如上文及/或下文所述之方式進行治療，其中該纖維化病症影響一或多個選自由肺、肝、腎、心臟及皮膚組成之群的器官。 •如上文及/或下文所述用於治療全身性硬化症(SSc)之DI17E6抗體，其中該全身性硬化症包括肺、肝、腎、心血管系統及/或皮膚之全身性硬化症。 •如上文及/或下文所述用於治療全身性硬化症(SSc)之DI17E6抗體，其中該全身性硬化症影響一或多個選自由肺、肝、腎、心臟及皮膚組成之群的器官。 •如上文及/或下文所述用於治療全身性硬化症(SSc)之DI17E6抗體，其中該全身性硬化症影響心血管系統、血管及/或血液。 •如上文及/或下文所述用於治療全身性硬化症(SSc)之DI17E6抗體，其中該全身性硬化症影響肺及/或皮膚。 •如上文及/或下文所述用於治療全身性硬化症(SSc)之DI17E6抗體，其中該全身性硬化症影響肺。 •如上文及/或下文所述用於治療全身性硬化症(SSc) 之DI17E6抗體，其中該全身性硬化症影響皮膚。 •如上文及/或下文所述用於治療全身性硬化症(SSc)之DI17E6抗體，其中該全身性硬化症影響肝。 •如上文及/或下文所述用於治療全身性硬化症(SSc)之DI17E6抗體，其中該全身性硬化症影響腎。 •如上文及/或下文所述用於治療全身性硬化症(SSc)之DI17E6抗體，其中該全身性硬化症影響心臟。 •如上文及/或下文所述用於治療全身性硬化症(SSc)之DI17E6抗體，其中該全身性硬化症包括一或多種選自由以下組成之群的適應症：特發性肺纖維化、原發性硬化性膽管炎、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、原發性局灶性腎小球硬化、原發性節段性腎小球硬化、糖尿病性腎病、舒張功能障礙及骨髓纖維化。 •如上文及/或下文所述用於治療全身性硬化症(SSc)之DI17E6抗體，其中該全身性硬化症包括肺纖維化及/或肺泡炎(間質性肺病，ILD)。 •如上文及/或下文所述之DI17E6抗體，其用於治療肺纖維化及/或肺泡炎(間質性肺病，ILD)。 •如上文及/或下文所述之DI17E6抗體，其用於治療SSc-ILD或硬皮病-ILD。 •如上文及/或下文所述之DI17E6抗體，其用於治療罹患SSc-ILD之患者。 •如上文及/或下文所述之DI17E6抗體，其用於治療罹患硬皮病-ILD之患者。 •如上文及/或下文所述之DI17E6抗體，其用於治療皮膚全身性硬化症(dcSSc)或局限性皮膚全身性硬化症(lcSSc)。 •如上文及/或下文所述之DI17E6抗體，其用於治療患有全身性硬化症相關聯之間質性肺病(SSc-ILD)的個體，較佳人類個體。 •阿吐珠單抗，其用於治療患有全身性硬化症相關聯之間質性肺病(SSc-ILD)的個體，較佳人類個體。 •如上文及/或下文所述之DI17E6抗體，其用於治療已經接受黴酚酸酯之患有SSc-ILD的個體，較佳人類個體。 •如上文及/或下文所述之DI17E6抗體，其用於治療已經接受黴酚酸酯，較佳恆定劑量之黴酚酸酯之患有SSc-ILD的個體，較佳人類個體。 •阿吐珠單抗，其用於治療已經接受黴酚酸酯之患有SSc-ILD的個體，較佳人類個體。 •如上文及/或下文所述之該抗-αv整合素抗體DI17E6的生物活性變異體或修飾，其用於治療纖維化及/或纖維化病症，其中該生物活性變異體或修飾包括DI17E6之CDR區及重鏈及輕鏈可變區，其等與DI17E6之可變區相比較在胺基酸序列上有至少80%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少98%相同或至少99%相同。 •如上文及/或下文所述之該抗-αv整合素抗體DI17E6的生物活性變異體或修飾，其用於治療纖維化及/或纖維化病症，其中該生物活性變異體或修飾包括DI17E6之重鏈及/或輕鏈可變區，其等與DI17E6之各自重鏈及/或輕鏈可變區相比較在胺基酸序列上有至少90%相同、至少95%相同、至少98%相同、至少99%相同或至少99.5%相同。 •如上文及/或下文所述之該抗-αv整合素抗體DI17E6的生物活性變異體或修飾，其用於治療纖維化及/或纖維化病症，其中該生物活性變異體或修飾包括DI17E6之重鏈及/或輕鏈CDR區，其等與DI17E6之各自重鏈及/或輕鏈CDR區相比較在胺基酸序列上有至少90%相同、至少92%相同、至少94%相同、至少96%相同、至少98%相同或至少99%相同。 •如上文及/或下文所述之該抗-αv整合素抗體DI17E6的生物活性變異體或修飾，其包括在重鏈架構區內之一或多種修飾 •  FR1： QVQLQQSG A ELA E PGASVK M SCKASGYTFS (SEQ ID No. 16) •  FR2： WV K Q R PGQGLEWIG (SEQ ID No. 17) •  FR3： KATMT A DTS S STAYM Q LS G L T SED S AVYYCAS (SEQ ID No. 18) •  FR4： WGQGT S VTVSS (SEQ ID No. 19)， 其中加粗及下劃線位置之一或多者係經突變且與DI17E6的原始各自序列相比較係不同的，其用於治療如上文及/或下文所述之纖維化及/或纖維化病症。 •如上文及/或下文所述之該抗-αv整合素抗體DI17E6的生物活性變異體或修飾，其用於治療纖維化病症，較佳如上文及/或下文所述之纖維化病症，較佳以如上文及/或下文所述之方式進行治療，其中該纖維化病症影響一或多個選自由肺、肝、腎、心臟及皮膚組成之群的器官。 •如上文及/或下文所述之該抗-αv整合素抗體DI17E6的生物活性變異體或修飾，其用於治療全身性硬化症(SSc)，其中該全身性硬化症包括肺、肝、腎、心血管系統及/或皮膚之全身性硬化症。 •如上文及/或下文所述之該抗-αv整合素抗體DI17E6的生物活性變異體或修飾，其用於治療全身性硬化症(SSc)，其中該全身性硬化症影響一或多個選自由肺、肝、腎、心臟及皮膚組成之群的器官。 •如上文及/或下文所述之該抗-αv整合素抗體DI17E6的生物活性變異體或修飾，其用於治療全身性硬化症(SSc)，其中該全身性硬化症影響心血管系統、血管及/或血液。 •如上文及/或下文所述之該抗-αv整合素抗體DI17E6的生物活性變異體或修飾，其用於治療全身性硬化症(SSc)，其中該全身性硬化症影響肺及/或皮膚。 •如上文及/或下文所述之該抗-αv整合素抗體DI17E6的生物活性變異體或修飾，其用於治療全身性硬化症(SSc)，其中該全身性硬化症包括一或多種選自由以下組成之群的適應症：特發性肺纖維化、原發性硬化性膽管炎、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH或Nash)、原發性局灶性腎小球硬化、原發性節段性腎小球硬化、糖尿病性腎病、舒張功能障礙及骨髓纖維化。 •如上文及/或下文所述之該抗-αv整合素抗體DI17E6的生物活性變異體或修飾，其用於治療全身性硬化症(SSc)，其中該全身性硬化症包括肺纖維化及/或肺泡炎(間質性肺病，ILD)。 •如上文及/或下文所述之該抗-αv整合素抗體DI17E6的生物活性變異體或修飾，其用於治療肺纖維化及/或肺泡炎(間質性肺病，ILD)。 •如上文及/或下文所述之該抗-αv整合素抗體DI17E6的生物活性變異體或修飾，其用於治療SSc-ILD或硬皮病-ILD。 •一種藉由投與抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾來治療個體之纖維化及/或纖維化疾病的方法，其中該個體之特徵為自包括2個或更多個，較佳5個或更多個，更佳9個或更多個，甚至更佳15個或更多個且尤其16、17、18或19個基因之多基因特徵計算之高於閥值得分，該等基因係選自由以下基因組成之群：COL15A1 (NM_001855)、COL1A1 (NM_000088)、COMP (NM_000095)、RGS5 (NM_003617)、COL10A1 (NM_000493)、COL5A1 (NM_000093)、IGFBP2 (NM_000597)、NM_005576、MOXD1 (NM_015529)、ADRA2A (NM_000681)、COL5A2 (NM_000393)、MMP10 (NM_002425)、TNFRSF21 (NM_014452)、ITGA7 (NM_002206)、TGF-β3 (NM_003239)、 MMP11 (NM_005940)、SPP1 (NM_000582)、CCL2 (NM_002982)及TNC (NM_002160)，特定言之為基於基因COL15A1 (NM_001855)、COL1A1 (NM_000088)、COMP (NM_000095)、COL10A1 (NM_000493)、COL5A1 (NM_000093)、COL5A2 (NM_000393)、ITGA7 (NM_002206)、MMP11 (NM_005940)及TNC (NM_002160)之9-基因特徵，下文亦稱為TUAD特徵。 •一種藉由追蹤自包括2個或更多個，較佳5個或更多個，更佳9個或更多個，甚至更佳15個或更多個且尤其16、17、18或19個基因之多基因特徵計算之得分的改變來監測個體之纖維化疾病中纖維化之嚴重程度及/或在可能發展出纖維化之疾病中纖維化之出現的方法，該等基因係選自由以下基因組成之群：COL15A1 (NM_001855)、COL1A1 (NM_000088)、COMP (NM_000095)、RGS5 (NM_003617)、COL10A1 (NM_000493)、COL5A1 (NM_000093)、IGFBP2 (NM_000597)、NM_005576、MOXD1 (NM_015529)、ADRA2A (NM_000681)、COL5A2 (NM_000393)、MMP10 (NM_002425)、TNFRSF21 (NM_014452)、ITGA7 (NM_002206)、TGF-β3 (NM_003239)、 MMP11 (NM_005940)、SPP1 (NM_000582)、CCL2 (NM_002982)及TNC (NM_002160)，特定言之為基於基因COL15A1 (NM_001855)、COL1A1 (NM_000088)、COMP (NM_000095)、COL10A1 (NM_000493)、COL5A1 (NM_000093)、COL5A2 (NM_000393)、ITGA7 (NM_002206)、MMP11 (NM_005940)及TNC (NM_002160)之9-基因特徵，下文亦稱為TUAD特徵。 •一種藉由投與抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾來治療個體之纖維化及/或纖維化疾病的方法，其中該個體之特徵為包括2個或更多個，較佳5個或更多個，更佳10個或更多個，甚至更佳15個或更多個且尤其16、17、18或19個基因之基因特徵，該等基因係選自由以下基因組成之群：COL15A1 (NM_001855)、COL1A1 (NM_000088)、COMP (NM_000095)、RGS5 (NM_003617)、COL10A1 (NM_000493)、COL5A1 (NM_000093)、IGFBP2 (NM_000597)、NM_005576、MOXD1 (NM_015529)、ADRA2A (NM_000681)、COL5A2 (NM_000393)、MMP10 (NM_002425)、TNFRSF21 (NM_014452)、ITGA7 (NM_002206)、TGF-β3 (NM_003239)、 MMP11 (NM_005940)、SPP1 (NM_000582)、CCL2 (NM_002982)及TNC (NM_002160)，特定言之為基於基因COL15A1 (NM_001855)、COL1A1 (NM_000088)、COMP (NM_000095)、COL10A1 (NM_000493)、COL5A1 (NM_000093)、COL5A2 (NM_000393)、ITGA7 (NM_002206)、MMP11 (NM_005940)及TNC (NM_002160)之9-基因特徵，下文亦稱為TUAD特徵。 •一種DI17E6或其生物活性變異體或修飾，較佳如本文所述之其生物活性變異體或修飾，且尤其阿吐珠單抗之用途，其用於製造用於預防及/或治療纖維化及/或纖維化病症之藥劑。 •一種DI17E6或其生物活性變異體或修飾，較佳如本文所述之其生物活性變異體或修飾，且尤其阿吐珠單抗之用途，其用於製造用於預防及/或治療如本文所述之纖維化及/或纖維化病症，且尤其預防及/或治療一或多種選自由以下組成之群的適應症之藥劑：特發性肺纖維化、原發性硬化性膽管炎、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、原發性局灶性腎小球硬化、原發性節段性腎小球硬化、糖尿病性腎病、舒張功能障礙及骨髓纖維化。 •一種阿吐珠單抗之用途，其用於製造用於預防及/或治療如本文所述之纖維化及/或纖維化病症，且尤其預防及/或治療一或多種選自由以下組成之群的適應症之藥劑：特發性肺纖維化、原發性硬化性膽管炎、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、原發性局灶性腎小球硬化、原發性節段性腎小球硬化、糖尿病性腎病、舒張功能障礙及骨髓纖維化。 •一種阿吐珠單抗之用途，其用於製造用於預防及/或治療全身性硬化症，較佳包括肺纖維化、肺泡炎(間質性肺病，ILD)及/或硬皮病性間質性肺病(SSc-ILD)之藥劑。 •一種阿吐珠單抗之用途，其用於製造用於預防及/或治療局灶性節段性腎小球硬化(FSGS)之藥劑。 •一種DI17E6或其生物活性變異體或修飾，較佳如本文所述之其生物活性變異體或修飾，且尤其阿吐珠單抗之用途，其用於製造用於預防及/或治療如本文所述之纖維化及/或纖維化病症之藥劑，其中該治療另外包括投與一或多種選自由黴酚酸、黴酚酸酯、黴酚酸嗎啉乙酯、黴酚酸鈉、甲胺喋呤(methotrexate)、胺甲喋呤(amethopterin)及普賴松(prednisone)組成之群的活性成分。 •一種阿吐珠單抗之用途，其用於製造用於預防及/或治療如本文所述之纖維化及/或纖維化病症的藥劑，其中該治療另外包括投與黴酚酸、黴酚酸酯、黴酚酸嗎啉乙酯及/或黴酚酸鈉。 •一種阿吐珠單抗之用途，其用於製造用於預防及/或治療如本文所述之纖維化及/或纖維化病症的藥劑，其中該治療另外包括投與甲胺喋呤及/或胺甲喋呤。 •一種阿吐珠單抗之用途，其用於製造用於預防及/或治療如本文所述之纖維化及/或纖維化病症的藥劑，其中該治療另外包括投與普賴松。 由於其獨有的不同作用方式，DI17E6或其生物活性變異體或修飾，較佳如本文所述之其生物活性變異體或修飾，且尤其阿吐珠單抗被視為可適用於與基本上所有適用於預防及/或治療纖維化及/或纖維化病症，尤其如本文所述之纖維化及/或纖維化病症的治療選項組合。 因此，將DI17E6或其生物活性變異體或修飾，較佳如本文所述之其生物活性變異體或修飾，且尤其阿吐珠單抗添加至包括投與治療纖維化及/或纖維化病症之典型標準藥劑的治療方案，該等標準藥劑包括(但不限於)一或多種選自由黴酚酸、黴酚酸酯、黴酚酸嗎啉乙酯、黴酚酸鈉、甲胺喋呤、胺甲喋呤及普賴松組成之群的活性成分。 根據本發明，抗-αv整合素抗體DI17E6，較佳本文中亦稱為阿吐珠單抗(Abituzumab/abituzumab)係經特別工程改造定制之針對αv整合素(受體)的IgG2雜合單株抗體。此抗體更詳細地描述於WO2009/010290中，其揭示內容以全文引用的方式併入本文中。 其高度變異區(CDR)衍生自鼠類mAb 17E6 (EMD 73034)。此親本小鼠IgG1抗體係由例如Mitjans等人(1995; J.Cell Sci. 108, 2825)及專利案US 5,985,278及EP 719 859描述。小鼠mAb 17E6係由融合瘤細胞系272-17E6製得並以登錄編號DSM ACC2160寄存。 其輕鏈域衍生自人源化單株抗-EGFR抗體425(馬茲替尼(matuzumab))。此抗體係於例如EP 0 531 472B1中詳細描述，且衍生自其鼠類對應體425 (小鼠MAb 425，ATCC HB9629)。該抗體係針對人類A431癌細胞系所產生且發現其結合至人類表皮生長因子受體(EGFR)之外域上的多肽抗原決定基。馬茲替尼在臨床試驗中顯示高療效。 一般而言，如本發明所用之抗-αv整合素抗體DI17E6包括： (i)    衍生自小鼠單株抗-αv整合素抗體17E6之CDR輕鏈及重鏈區 (ii)   獲自人源化單株抗-EGFR抗體425之輕鏈架構區， (iii)  衍生自小鼠單株抗-αv整合素17E6之重鏈架構區，視情況在特定位置上包括一或多個胺基酸突變，及 (iv)   衍生自人類IgG2之重鏈恆定區及人類恆定κ輕鏈區，其中在該IgG2域中，IgG2鉸鏈區由人類IgG1鉸鏈區代替，且；其中視情況在IgG2內進行一或多種突變。 具體而言，用於所主張之治療及如上文及下文所述之臨床試驗中的DI17E6 (稱為「DI17E6γ2h(N297Q)」或「EMD 525797」)具有以下胺基酸序列： (i)可變及恆定輕鏈 序列(SEQ ID No. 1)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLA WYQQKPGKAPKLLIYYTSKIHS GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTFPYT FGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC及 (ii)可變及恆定重鏈 序列(SEQ ID No. 2)：QVQLQQSGGELAKPGASVKVSCKASGYTFSSFWMH WVRQAPGQGLEWIGYINP RSGYTEYNEIFRDKATMTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASFLGRGAMDY WGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVEPKSSDKTHTCPPCP APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQ STFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK， 其中下劃線序列表示具有CDR之可變區(加粗，與親本小鼠抗體相同)。經修飾IgG1鉸鏈區由EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID No. 3)表示，且AQ係在IgG2域內之取代。 然而，如WO 2009/010290所顯示，亦可根據本發明之教示使用DI17E6之變異體。因此，DI17E6變異體在重鏈架構區內包括一或多種修飾 FR1：QVQLQQSG A ELA E PGASVK M SCKASGYTFS (SEQ ID No. 16) FR2：WV K Q R PGQGLEWIG (SEQ ID No. 17) FR3：KATMT A DTS S STAYM Q LS G L T SED S AVYYCAS (SEQ ID No. 18) FR4：WGQGT S VTVSS (SEQ ID No. 19)， 其中加粗及下劃線位置之一或多者係經突變，可用於治療如所述之前列腺癌患者。更詳細而言，以下位置重鏈架構區係在以下可經突變之位置的一者、多者或全部上發生突變：A9、E13、M20、K38、R40、A72、S76、Q82、G85、T87、S91及S113。此等變異體與由上文之其序列所定義之DI17E6相比較，顯示相同或極相似的生物活性及療效。 一般而言，如所述之本發明亦包括與未經修飾之DI17E6在功能上及/或醫藥上相同或相似之DI17E6抗體的修飾及變異體，且其中CDR區及重鏈及輕鏈可變區與DI17E6之各自可變區相比較，在其等之胺基酸序列上有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同。此外，本發明亦包括與未經修飾之DI17E6在功能上及/或醫藥上相同或相似之DI17E6抗體的修飾及變異體，且其中恆定區與DI17E6之各自恆定區相比較，在其等之胺基酸序列上有至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少98%或至少99%相同。抗體之IgG鏈之恆定區中的改變可改良特異性質，如免疫原性、ADCC等等。 較佳地，如所述之本發明亦包括與(未經修飾之)DI17E6或阿吐珠單抗在功能上及/或醫藥上相同或相似之DI17E6抗體的修飾及變異體，且其中重鏈及輕鏈可變區與DI17E6之各自重鏈及輕鏈可變區相比較，在其等之胺基酸序列上有至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。此外，本發明亦包括與未經修飾之DI17E6在功能上及/或醫藥上相同或相似之DI17E6抗體的修飾及變異體，較佳如此段上文中所述，其中恆定區與DI17E6之各自恆定區相比較，在其等之胺基酸序列上有至少90%、或至少95%、或至少99%、或至少99.5%或至少99.9%相同。抗體之IgG鏈之恆定區中的改變可改良特異性質，如免疫原性、ADCC等等。 甚至更佳地，如所述之本發明亦包括與(未經修飾之)DI17E6或阿吐珠單抗在功能上及/或醫藥上相同或相似之DI17E6抗體的修飾及變異體，且其中可變重鏈及/或輕鏈上之CDR區與DI17E6之可變重鏈及/或輕鏈區上之各自CDR區相比較，在其等之胺基酸序列上有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%或至少98%相同。此外，本發明亦包括與未經修飾之DI17E6在功能上及/或醫藥上相同或相似之DI17E6抗體的修飾及變異體，較佳如此段上文中所述，其中恆定區與DI17E6之各自恆定區相比較，在其等之胺基酸序列上有至少90%、或至少95%、或至少99%、或至少99.5%或至少99.9%相同。 尤佳地，如所述之本發明亦包括與(未經修飾之)DI17E6或阿吐珠單抗在功能上及/或醫藥上相同或相似之DI17E6抗體的修飾及變異體，其中重鏈及輕鏈CDR區係與(未經修飾之)DI17E6或阿吐珠單抗100%相同，但其中除該CDR區之外的重鏈及輕鏈可變區與DI17E6之各自重鏈及輕鏈可變區相比較在其等之胺基酸序列上有至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。此外，本發明較佳亦包括與未經修飾之DI17E6在功能上及/或醫藥上相同或相似之DI17E6抗體的修飾及變異體，較佳如此段上文中所述，其中恆定區與DI17E6之各自恆定區相比較在其等之胺基酸序列上有至少90%、或至少95%、或至少99%、或至少99.5%或至少99.9%相同。 尤佳地，如所述之本發明亦包括與(未經修飾之)DI17E6或阿吐珠單抗在功能上及/或醫藥上相同或相似之DI17E6抗體的修飾及變異體，其中可變重鏈及/或輕鏈上之CDR區與DI17E6之可變重鏈及/或輕鏈區上之各自CDR區相比較在其等之胺基酸序列上有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%或至少98%相同，且其中除了該CDR區之外的重鏈及輕鏈可變區與DI17E6之各自重鏈及輕鏈可變區相比較在其等之胺基酸序列上有至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同。此外，本發明較佳亦包括與未經修飾之DI17E6在功能上及/或醫藥上相同或相似之DI17E6抗體的修飾及變異體，較佳如此段上文中所述，其中恆定區與DI17E6之各自恆定區相比較在其等之胺基酸序列上有至少90%、或至少95%、或至少99%、或至少99.5%或至少99.9%相同。 尤佳地，Di17E6抗體或阿吐珠單抗為如上文及下文所述之IgG2子類的重組型脫免疫單株抗體，其靶向人類αv整合素並抑制配體結合至人類αv整合素。尤佳地，通常存在於該Di17E6抗體或阿吐珠單抗之Fc區中的碳水化合物結構已藉由基因改變通常充作使分子無糖基化之附接點的胺基酸殘基來移除。抗體尤佳由4條多肽鏈組成，2條相同重鏈各由447個胺基酸組成及2條相同輕鏈各有214個胺基酸組成。通常地，4條鏈藉由共價及非共價鍵之組合來固定在一起。分子之近似分子量為145 kDa。 更具體言之，本文所述之Di17E6抗體及尤其阿吐珠單抗或EMD 525797之特徵為高親和力泛-αv整合素抑制劑，其活體外顯示抑制潛伏TGF-β之整合素依賴性活化、抑制FMT、阻止成肌纖維細胞上之整合素上調及阻斷成肌纖維細胞收縮。因此，其特異性結合至特異性針對人類αv整合素鏈之獨有抗原決定基。此外，其不與其他整合素(諸如α4β1)及血小板纖維蛋白原受體αIIbβ3交叉反應(crossreact)且較佳不觸發ADCC及CDC。 根據本發明，據信DI17E6在罹患纖維化疾病，更佳全身性硬化症之患者中且尤其在本文所述之全身性硬化症的一或多種適應症中高度有效。更具體言之，據信阿吐珠單抗在罹患纖維化疾病，更佳全身性硬化症之患者中且尤其在本文所述之全身性硬化症的一或多種適應症中高度有效。 此外，據信如本文所述之DI17E6，且尤其阿吐珠單抗適於提供針對如本文所述之纖維化疾病更有效及/或更安全之療法，其相比先前已知之療法中所見將更良好耐受且可刺激更良好免疫反應。較佳地，據信使用阿吐珠單抗之治療在治療患有SSc-ILD之患者，較佳亦已經接受恆定劑量之黴酚酸酯之患者中更有效、更安全，將更良好耐受且可刺激更良好免疫反應。 如本發明所述，顯示TGF-β為組織纖維化之主控介體。結合患有SSc之患者中的發現，TGF-β信號傳導路徑經活化，且αvβx整合素異二聚體中之一些控制TGF-β之活化，據信抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾在SSc中具有有益效果，由於其顯示干擾TGF-β活化，且另外由於其對所發現參與纖維化之αv整合素的TGF非依賴性功能。因此，EMD 525797可經由多種作用模式在患有SSc之患者中有益。上文及/或下文更詳細地對此進行描述。然而，因為缺乏交叉反應性，DI17E6不能直接在囓齒動物纖維化模型中進行測試(參見A3.1.3作用模式部分)。非人靈長類中針對SSc或SSc-ILD之纖維化的臨床前模型視為困難，若非不可行的話。利用除DI17E6外之阻斷αv抗體的臨床前實驗利用人類細胞進行，但是來自活體內實驗之相矛盾的結果限制其等之關聯性。因此，本文中吾人描述在囓齒動物之臨床前纖維化模型中，不存在基因或替代抗體介導之αv整合素阻斷效果，及另外，相比其他器官中之SSc表現，存在αv整合素阻斷支持SSc-ILD疾病適應症(急性肺損傷反應、異常上皮創傷閉合反應、EMT)的更多證據。 雖然活體外αvβ3及αvβ5整合素之抗體介導之阻斷在採取自SSc或特發性肺纖維化(IPF)患者之組織樣本的人類成纖維細胞中顯示抑制TGF-β依賴性反應(Asano等人，American Journal of Pathology，第168卷，第2期，2006年2月，The Journal of Immunology, 2005, 175: 7708–7718, ARTHRITIS & RHEUMATISM，第52卷，第9期，2005年9月，第2897至2905頁，Journal of Investigative Dermatology (2006) 126, 1761–1769, Scotton等人，J. Clin. Invest. 119:2550–2563 (2009))，但迄今為止，不存在此等整合素在活體內活化TGF-β的有力證據。例如，αvβ3及αvβ5之基因缺失對博來黴素誘導之肺纖維化無影響 (Atabai等人，J. Clin. Invest. 119:3713–3722 (2009))。然而，基因切除β8整合素(Itgb8 )與抗體抑制αvβ6之組合顯示導致比在Itgb8 -/-動物中更嚴重之表現型但與在Tgfb1 無效小鼠中所見相似之表現型(Aluwihare等人，Journal of Cell Science 122, 2009, 227-232)，這討論任一種或兩種整合素是否可在小鼠的胚胎至成年小鼠之不同分化狀態下之生物學發育中活體內活化TGF-β中起作用。 Takahashi等人(Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 第24卷，第264至271頁，2001)研究骨橋蛋白在小鼠之博來黴素誘導之肺纖維化之致病原理中的作用。據報導，骨橋蛋白(OPN)係由活化巨噬細胞產生之細胞介素中的一種且藉由與av整合素相互作用來介導多種功能(包括細胞附著及遷移)。 藉由在此模型中添加抗鼠av整合素單株抗體(RMV-7)顯著抑制OPN對成纖維細胞之此等作用。 轉變生長因子β (TGF-β)係肺纖維化之重要驅動因素且正尋求抑制其作用之治療策略。然而，TGF-β具有可造成治療抑制問題之其他穩態作用。Horan等人(Am J Respir Crit Care Med，第177卷，第56至65頁，2008)因此在鼠類博萊霉素誘導之肺纖維化模型中，使用阻斷經avb6介導之TGF-β活化的單株pSmad2/3一級抗體來研究整合素avb6(肺中之TGF-β之關鍵活化因子)的抑制作用。據描述，使用該avb6整合素抗體部分抑制TGF-β係在阻斷鼠類肺纖維化中有效而不會使該鼠類模型中發炎惡化。 據描述，含有RGD序列之合成肽能夠在不同細胞系統中抑制整合素相關功能。Moon等人(Respiratory Research 2009, 10:18)研究合成Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS)肽對於小鼠之對氣管內(i.t.)脂多糖(LPS)治療之關鍵發炎反應及對急性肺損傷的發展期間整合素發信號促分裂原活化蛋白(MAP)激酶路徑之作用。使用RGDS預處理在4或24小時LPS處理後抑制支氣管肺泡灌洗術(BAL)流體中之LPS誘導之嗜中性球及巨噬細胞數量、總蛋白質水平及TNF-α及MIP-2水平、及基質金屬蛋白酶-9之活性的增加。重要地，當在LPS處理後2小時投與此肽時，發炎反應及激酶路徑之抑制仍明顯。同樣，針對αv整合素之阻斷抗體顯著抑制LPS後4或24小時BAL流體中之LPS誘導之發炎細胞遷移至肺中、蛋白質累積及促發炎介體產生。此等結果表明具有對αv整合素高特異性之RGDS在此鼠類模型中於LPS誘導之急性肺損傷發展期間使發炎級聯減弱。 已報導，由αvβ6整合素活化潛伏TGF-β係在急性肺損傷之發展中的一個臨界步驟。Jenkins等人(J. Clin. Invest. 116:1606–1614 (2006))顯示凝血酶及蛋白酶活化受體1 (PAR1)之其他促效劑以αvβ6整合素特異性方式活化TGF-β。此效應係PAR1特異性且據信其由RhoA及Rho激酶介導。氣管內滴入PAR1-特異性肽TFLLRN在高潮氣容積通氣期間使肺水腫增強，且描述此作用係藉由阻斷抗αvβ6整合素之抗體而完全抑制。然而，藉由αvβ6來活化TGF-β可能不僅僅需要結合至LAP，因為吾人已經識別結合LAP但不使TGF-β活化之細胞質突變體。此外，αvβ1及α8β1兩種整合素皆能夠結合LAP而不使TGF-β活化。在此等活體外實驗中所發現之αvβ6依賴性TGF-β活化之PAR1介導的增強可解釋為一種凝血級聯之活化造成急性肺損傷之發展的機制。 轉變生長因子(TGF)-β家族成員經由作用於細胞增殖、基質產生及組織發炎來調節創傷修復之多個態樣，但TGF-β對創傷閉合的作用本身存在爭議。Neuohr等人(Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.第35卷，第252至259頁，2006)報導，在該氣道上皮細胞培養模型中，使用之TGF-β之阻斷抗體增強主氣道上皮單細胞層之劃痕創傷的閉合度，而外源TGF-1β之添加抑制閉合度，此表明TGF-β之內源活化可充作創傷閉合度之止動器。TGF-β1之阻斷增強創傷閉合度，而TGF-β2之阻斷在此細胞培養模型中無作用。此處，TGF-β1 (而非TGF-β2)可藉由整合素家族中之兩個成員(αvβ6及αvβ8)來活化，發現兩者皆在該氣道上皮細胞中表現。在所述模型中，細胞層受創經由兩種整合素之作用誘導TGF-β活化，但所選的抗人類αvβ8之小鼠單株抗體(37E1)增強創傷閉合度，而所選的抗人類αvβ6之小鼠單株抗體 (抗-HEL-AB MSB0011523H-1，10D5)不增強創傷閉合度。 轉變生長因子-b1(TGF-β1)係成纖維細胞分化為成肌纖維細胞之高效介體，其藉由細胞骨架蛋白質a-平滑肌肌動蛋白之出現表徵。Lygoe等人(Wound Rep. Reg. 2004;12:461–470)描述以所選單株小鼠抗-人類抗體(抗αvβ3之LM609、抗β1之P4C10、抗αvβ5之P1F6、抗β1之 A11B2、抗αv之L230)阻斷αv及/或β1整合素防止TGF-β1誘導之成肌纖維細胞的分化，由在三個人類成纖維細胞系(口、皮膚及腎)中a-平滑肌肌動蛋白之表現增加及膠原蛋白凝膠收縮增強可見。此外，阻斷αv特異性整合素αvβ5及αvβ3抑制在口及皮膚之成纖維細胞中之成肌纖維細胞的分化；然而在腎細胞中，僅在阻斷αvβ5整合素而非αvβ3時可見對分化之阻止。此等資料指示αv整合素在口、皮膚及腎中之人類成纖維細胞分化為成肌纖維細胞中的作用且表明可能存在共同分化路徑。 αv整合素亦可經由與多種生長因子(諸如血小板衍生性生長因子(PDGF)、血管內皮生長因子(VEGF)及成纖維細胞生長因子(FGF)因子)相互作用參與血管生成之最佳功能。因為BIBF-1120(一種獲自Boehringer Ingelheim之新穎化學實體(NCE))靶向此等受體之酪胺酸激酶且在特發性肺纖維化(IPF)(具有與SSc-ILD相同之特徵之另一種形式的肺纖維化)之PoC試驗中顯示初步療效，所以預期DI17E6經由抑制此等受體具有潛在有益效果。此符合在人類細胞中觀察到之由DI17E6抑制VEGF誘導之ERK磷酸化。 不受下文所討論之機制之束縛，基於構成本發明之結果，吾人相信上皮至間葉轉變(EMT)造成纖維化、纖維化病症及/或纖維性肺病症的結果。據信TGF-β及αvβx整合素涉及此轉分化過程及由抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾阻斷此等整合素之功能會下調EMT且因此變得在纖維化、纖維化病症及/或纖維性肺病症中有利。 據信氧化壓力在纖維化疾病中起作用。據信表現αvβx整合素之細胞保護其免於氧化壓力誘導之細胞凋亡。因此，顯而易見可阻斷此等整合素之功能的藥劑可增加成纖維細胞及成肌纖維細胞之細胞凋亡。 發現αvβx整合素中的一些在SSc-ILD及其他形式之肺纖維化中過度表現，且在患有SSc-ILD及IPF之患者之肺活組織檢查中的呼吸上皮藉由免疫組織化學表現升高水平之αvβ6。相比正常對照，在患有SSc之患者的支氣管肺泡灌洗流體中發現表現αvβ3、αvβ5及β6之T細胞之數量增加(Luzina等人，Am J Respir Crit Care Med第177卷，第56至65頁，2008)。然而，已顯示β6整合素基因剔除小鼠發展肺發炎，但在博來黴素曝露後不繼續發展肺纖維化(Luzina等人，ARTHRITIS & RHEUMATISM，第48卷，第8期，2003年8月，第2262至2274頁)。 患有SSc之患者的真皮成纖維細胞顯示αvβ3及αvβ5表現增強及TGF-β活化升高，其係藉由阻斷針對αvβ5之抗體P1F6來抑制(Asano等人，ARTHRITIS & RHEUMATISM第52卷，第9期，2005年9月，第2897至2905頁；Journal of Immunology, 2005, 175: 7708–7718; American Journal of Pathology，第168卷，第2期，2006年2月；Journal of Investigative Dermatology (2006) 126, 1761–1769)。在患有IPF之患者的肺中之成纖維細胞變異區中發現使用抗-αvβ5抗體之免疫染色增加(Scotton等人，J. Clin. Invest. 119:2550–2563 (2009))。 軟骨寡聚蛋白質(COMP)為常駐於軟骨、肌腱及其他結締組織中之細胞外間質(ECM)蛋白質。在患有SSc之患者的皮膚活組織檢查中過度表現COMP。在SSc中，血清COMP水平升高，預示死亡率且與肺功能衰退及皮膚纖維化相關聯，如使用改良羅德曼皮膚得分(mRSS)所測得。COMP亦係SSc皮膚中預示皮膚受累之嚴重程度之四種特徵RNA中的一種。 Yang等人描述在硬皮病之小鼠模型中骨膜蛋白經由PI3K/Akt依賴性機制促進皮膚硬化症(Yang L、Serada S、Fujimoto M、Terao M、Kotobuki Y等人(2012) PLoS ONE 7(7): e41994 doi:10.1371/journal.pone.0041994)。使用患者及健康供體之皮膚，亦藉由免疫組織化學及免疫墨點分析來評估骨膜蛋白之表現。此外，發現重組型小鼠骨膜蛋白直接誘導Col1a1活體外表現，且藉由使用抗-av功能阻斷抗體或使用PI3K/Akt激酶抑制劑LY294002阻斷經av整合素介導之PI3K/Akt信號傳導來抑制此作用。因此，結論為骨膜蛋白在小鼠之博來黴素誘導之硬皮病的致病原理中起至關重要的作用及骨膜蛋白可代表用於人類硬皮病之潛在治療靶。 Wu等人(Journal of Investigative Dermatology (2012) 132, 1605–1614)研究在小鼠之博萊霉素誘導之纖維化模型中骨橋蛋白(OPN) (一種具有促發炎及促纖維化性質之基質細胞蛋白質)在全身性硬化症及真皮纖維化的作用。根據該研究，在該纖維化模型中，OPN缺乏小鼠與野生型(WT)小鼠相比較發展更少真皮纖維化。最後，其等發現由OPN缺乏巨噬細胞產生的TGF-β與WT相比較有所減少。總言之，據報導，OPN水平在SSc患者中增加，且所得資料視為表明OPN可在小鼠之真皮纖維化發展中起重要作用及OPN因此可為SSc中之治療靶。 由Lorenzen等人(Rheumatology 2010;49:1989–1991 doi:10.1093/rheumatology/keq223 Advance Access publication 2010年7月20日)對總計70位患有SSc之患者的血漿進行分析，其中二十位年齡匹配之健康志願者及59位患有特發性肺性高血壓之患者作為對照。結果可指示使用OPN抑制劑作為T細胞趨化性之新穎治療靶的可能性，因為單株OPN抗體已經用於膠原蛋白誘導之關節炎模型。總言之，據描述，OPN水平與SSc中之肺纖維化的發展平行且因此可為此併發症之具有吸引力的生物標記。 總之，基於構成本發明之結果及資料，吾人強烈相信DI17E6及較佳亦本文所述之其生物活性變異體或修飾與αvβx整合素之特異性相互作用以解決纖維化、纖維化病症(包括SSc)之致病原理之特別有利的方式控制TGF-β的活化及多種其他機制。因此，預期該與纖維化、纖維化病症，較佳SSc中，且特定言之SSc-ILD中之信號傳導的相互作用之有利的有益效果。 預期EMD 525797在多種癌症適應症中之極佳安全性及耐受性與在纖維化疾病(包括SSc且尤其包括SSc-ILD)中相似。結合所預期之EMD 52579的效益，EMD 525797在SSc-ILD中的效益/風險比在SSc-ILD中應為陽性且大於CYC。因此據信EMD 525797亦對SSc之其他表現有益。 術語「細胞介素 」為一細胞群體所釋放之蛋白質之通稱，該等蛋白質係作為細胞間介體作用於另一細胞。此等細胞介素之實例為淋巴因子、單核細胞因子及傳統多肽激素。包括於細胞介素中的有生長激素，諸如人類生長激素、N-甲硫胺醯基人類生長激素及牛生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；鬆弛素；前鬆弛素；糖蛋白激素，諸如促濾泡素(FSH)、甲狀腺刺激素(TSH)及黃體激素(LH)；肝生長因子；成纖維細胞生長因子；泌乳素；胎盤生乳素；小鼠促性腺激素關聯肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子(VEGF)；整合素；血小板生成素(TPO)；神經生長因子，諸如NGFβ；血小板生長因子；轉變生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β；紅血球生成素(EPO)；干擾素，諸如IFNα、IFNβ及IFNγ；群落刺激因子，諸如M-CSF、GM-CSF及G-CSF；介白素，諸如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；及TNFα或TNFβ。根據本發明之較佳細胞介素為干擾素及TNFa。 「抗 - 血管生成劑 」係指阻斷或在一定程度上干擾血管發展之天然或合成化合物。抗-血管生成分子可(例如)為結合至血管生成生長因子或生長因子受體並將其阻斷之生物學分子。本文之較佳抗血管生成分子結合受體，較佳結合整合素受體或VEGF受體。根據本發明該術語亦包括整合素(受體)抑制劑。 術語「整合素抑制劑 」或「整合素受體抑制劑 」係指阻斷及抑制整合素受體之天然或合成分子。在某些情況下，該術語包括針對該整合素受體之配體的拮抗劑(諸如，針對αv β3 ：玻璃連結蛋白、纖維蛋白、纖維蛋白原、von Willebrand氏因子、凝血栓蛋白、層連結蛋白；針對αv β5 ：玻璃連結蛋白；αv β1 ：纖維連接蛋白及玻璃連結蛋白；αv β6 ：纖維連接蛋白)。根據本發明，針對整合素受體之拮抗劑為較佳。整合素(受體)拮抗劑可為天然或合成肽、非肽、肽模擬物、免疫球蛋白(諸如抗體或其功能片段)或免疫偶聯物(融合蛋白質)。本發明之較佳整合素抑制劑針對αv 整合素之受體(例如，αv β3 、αv β5 , αv β6 及子群)。較佳整合素抑制劑為αv 拮抗劑，且特定言之為αv β3 拮抗劑。根據本發明之較佳αv 拮抗劑為RGD肽、肽模擬物(非肽)拮抗劑及抗-整合素受體抗體，諸如阻斷αv 受體之抗體。例示性非免疫學αv β3 拮抗劑係描述於US 5,753,230及US 5,766,591之教示中。較佳拮抗劑為線性及環狀含有RGD之肽。一般而言，環狀肽係更穩定且引出增強型血清半衰期。然而，本發明之最佳整合素拮抗劑為環-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (EMD 121974, Cilengitide® , Merck KGaA, Germany；EP 0770 622)，其係在阻斷整合素受體αv β3 及αv β5 中有效，並較低有效性地延伸至αv β1 、αv β6 、αv β8 、αIIb β3 。根據本發明，在纖維化疾病患者中之DI17E6結合西侖吉肽(Cilengitide)的組合療法可係有效的。 通常藉由靜脈注射來投與DI17E6，然而此項技術中針對抗體/蛋白質藥劑而言方便之其他投與形式係適用的。所有標準輸注溶液及調配物係適用的，諸如WO 2005/077414或WO 2003/053465中所描述，包括微脂體調配物。另外，有利的是提供載有DI17E6及可選(以增加細胞毒性)化學療法藥劑之人類血清白蛋白奈米粒子(Biomaterials 2010, 8, 2388-98；Wagner等人)。 根據本發明之抗-αv整合素抗體DI17E6或DI17E6尤佳的為具有國際非專利名稱(INN)阿吐珠單抗(Abituzumab)之抗體。 搭配本發明，阿吐珠單抗為IgG2子類的重組型脫免疫單株抗體，其靶向人類αv整合素並阻斷配體結合至人類αv整合素。另外，通常存在於Fc區中之碳水化合物結構已藉由基因改變通常充作使分子無糖基化之附接點的胺基酸殘基來移除。因此，該抗體阿吐珠單抗較佳係由四條多肽鏈(兩條較佳相同的重鏈各由447個胺基酸組成之及兩條較佳相同的輕鏈各有214個胺基酸組成)組成。四條鏈藉由共價(二硫鍵)及非共價鍵之組合來固定在一起。分子之近似分子量為145 kDa。 可藉由在無血清生長培養基中之哺乳動物細胞培養製備抗體阿吐珠單抗。藉由親和力及離子交換層析法純化抗體。製程亦可包括特異病毒減活及移除步驟。抗體阿吐珠單抗可隨後轉移至調配緩衝劑中並使其達到所需濃度。 一種較佳醫學產品之說明及組成： 例如濃度為250 mg/10 mL之阿吐珠單抗可用作呈預期用於靜脈內(i.v.)投與之無菌溶液的最終藥品。阿吐珠單抗藥品可以30 R類型I玻璃小瓶供應，例如用灰色丁基橡膠塞密閉及例如用鋁/紅聚丙烯易拉密封墊密封。此等小瓶可使用作為單次使用之小瓶容器，例如含有250 mg之呈25 mg/mL無防腐劑之經檸檬酸緩衝之鹽水溶液的阿吐珠單抗，例如含有聚山梨醇酯80 (Tween® 80)作為穩定劑。此等小瓶可含有足夠過剩以移除10 mL體積之阿吐珠單抗最終藥品。一般而言，對於此阿吐珠單抗之最終藥品，僅使用視為安全且符合現行歐洲藥典(EP)或美國藥典(USP)或兩者之賦形劑。 尤佳地，阿吐珠單抗為經基因改造以不誘導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)之人源化IgG2抗體。該阿吐珠單抗抗體以高特異性結合至人類αv-整合素受體次單元，藉此抑制配體結合至αv異二聚體(αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8)。其特異性抑制αv整合素並阻斷經αv整合素介導之細胞附著及遷移。其不與其他整合素交叉反應，包括血小板纖維蛋白原受體αIIbβ3，且僅識別人類及猴αv整合素。阿吐珠單抗識別在αv整合素受體次單元上之不位於或靠近配體空穴的抗原決定基。因此，其作用機制與針對諸如環狀RGD肽之純配體競爭性拮抗劑所述的作用機制不同。整合素αvβ3及αvβ5係在活化內皮細胞(EC)、靜息血小板、平滑肌細胞、甲狀腺、一些腎內皮及上皮、輸卵管內皮及破骨細胞中選擇性表現。此外，αv整合素係在來自不同腫瘤實體(包括結腸直腸癌及前列腺癌)之惡性細胞中以可變程度表現。因此，阿吐珠單抗結合至其靶較佳地在功能上阻斷整合素受體且因此抑制其結合至對應細胞外間質(ECM)配體(即，玻璃連結蛋白)。 在人類及不同動物物種中之免疫組織化學(IHC)檢查顯示阿吐珠單抗具有高度物種特異性：阿吐珠單抗僅結合至人類及石蟹獼猴αv整合素，具有相當的人類組織與猴組織之間的交叉反應。阿吐珠單抗顯示在活體外干擾涉及腫瘤血管生成之多個態樣，諸如EC附著至ECM、局灶性接點之去穩定化、EC遷移、血管生成生長因子信號傳導之傳遞(VEGF誘導之ERK磷酸化)及EC生存力。阿吐珠單抗亦直接影響腫瘤細胞。活體外實驗顯示阿吐珠單抗可影響細胞黏著至αv整合素之配體及腫瘤細胞的增殖。 在活體內，針對腫瘤異種移植模型(例如，黑色素瘤、NSCLC、CRC、前列腺癌)使用表現不同αv整合素之腫瘤細胞系來評價阿吐珠單抗之抗腫瘤效應。因為阿吐珠單抗係對人類及猴αv整合素具有特異性，所以其抗-血管生成活性不能在習知囓齒動物之異種移植腫瘤模型中研究。因此，在小鼠中之異種移植腫瘤實驗單獨證實阿吐珠單抗之潛在抗腫瘤活性。阿吐珠單抗能夠抑制在使用不同適應症(例如，黑色素瘤、NSCLC、前列腺癌及CRC)之癌細胞系或原代外植體的活體內腫瘤實驗中的生長。 在人類皮膚異種移植/腫瘤細胞系實驗中，在惡性細胞上無目標αv整合素的情況下評價阿吐珠單抗之抗血管生成作用機制。將抑制人類αv整合素缺陷性黑色素瘤細胞之生長的阿吐珠單抗輸注至已經移植至SCID小鼠上之人類皮膚中。因為其等本身無腫瘤細胞上之靶，所以阿吐珠單抗可僅靶向人類內皮細胞，且最有可能藉由抑制腫瘤血管生成來減少腫瘤生長。阿吐珠單抗在石蟹獼猴中之全身性投與阻斷在含有刺激血管生成之血管生成生長因子的皮下植入基質膠栓塞中之血管生成的誘導。 根據本發明，尤佳的係如本文所述之標的，其中兩種或更多種較佳、更佳及/或尤佳實施例、態樣及/或標的之特徵組合至一個實施例、態樣及/或標的中。較佳地，根據本發明，較佳標的或實施例可與其他較佳標的或實施例組合；更佳標的或實施例可與其他較不佳或甚至更佳標的或實施例組合；尤佳標的或實施例可與其他僅為較佳或僅為甚至更佳之標的或實施例及其類似標的或實施例組合。 本文針對數量、數字、範圍及/或含量所用之術語「約」較佳意指「大約」及/或「近似」。彼等術語之意義係此項技術中所熟知且較佳包括為加/減15%且尤其為加/減10%之各自數量、數字、範圍及/或含量的變量、偏差及/或可變性。 下文藉由實例更詳細地解釋本發明。較佳地，本發明可在整個所請求之範圍中實施且不受本文所給定之實例限制。 此外，給出以下實例以幫助熟習此項技術者藉助示例更佳地理解本發明。實例無意限制由申請專利範圍所賦予之保護範圍。針對實例中所定義之製程、化合物、組合物及/或用途所例示之特徵、性質及優點可讓渡給在實例中未明確描述及/或定義之其他製程、化合物、組合物及/或用途，但落在申請專利範圍中所定義之範圍中。 因此，以下實例更詳細地描述本發明但不限制本發明及如所請求之範圍。實例 實例 1 成肌纖維細胞分化係在上皮 - 成纖維細胞共同培養物中誘導並藉由阿吐珠單抗抑制 縮寫清單 αSMA：                α平滑肌肌動蛋白 BSA：                  牛血清血蛋白 Cy5：                   花青素5 DAPI：                 4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚 ECM：                  細胞外間質 FGM：                  成纖維細胞生長培養基 FMT：                  成纖維細胞至成肌纖維細胞轉變 FITC：                  螢光異硫氰酸鹽 IXM：                  Image Xpress Micro篩選系統 ug：                     微克 mg：                     毫克 mL：                    毫升 ng：                     毫微克 NHDF：                正常人類真皮成纖維細胞 NHLF：                正常人類肺成纖維細胞 PBS：                   經磷酸鹽緩衝之鹽水 TGF-β1：              轉變生長因子-β1 ELISA：               酶聯免疫吸附分析 FBS：                   胎牛血清 IL                         介白素概述 TGF-β1係成纖維細胞至成肌纖維細胞轉變(FMT)之高效介體，其造成細胞外間質沉積增加且係纖維化疾病之主要驅動因素。此等過程期間存在αv整合素與TGF-β之間串擾之實質證據。TGF-β係以含有潛在型相關肽(LAP)區之潛伏形式分泌。TGF-β1之LAP含有與整合素αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8相互作用使得TGF-β1活化之RGD基元。阿吐珠單抗係對αv具有特異性之人類抗體且因此抑制αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8。 使用上皮細胞/成纖維細胞共同培養物，模擬在經歷纖維化之組織中的上皮細胞與成纖維細胞之潛在相互作用來檢查阿吐珠單抗阻斷FMT之能力。NCI-H358或Calu3細胞與成纖維細胞之共同培養導致aSMA及作為FMT標記之多種mRNA轉錄的誘導且亦使IL-6產生增加。在此系統中，此等標記藉由阿吐珠單抗處理而減少，從而證實αv整合素在FMT中起作用。引言 纖維化疾病之特徵為由於細胞外間質之產生、沉積及收縮所致之過度結疤且據信其由成肌纖維細胞之增殖及活化驅動。纖維化疾病代表最大的疾病組之一，其無有效療法。纖維化過程經由在前纖維化及抗纖維化介體之網路中之一系列複雜的相互作用進行調節。據信TGF-β信號傳導在成纖維細胞至成肌纖維細胞轉變(FMT)中起重要作用，其造成細胞外間質沉積增加且係疾病之主要驅動因素。 合成將TGF-β同功異型體合成為與含有潛在型相關肽(LAP)區之潛伏TGF-β結合蛋白質複合之潛伏前軀體。此等過程期間存在αv整合素與TGF-β之間串擾之實質證據。TGF-β1之LAP含有與整合素αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8相互作用使得TGF-β1活化之RGD基元。阿吐珠單抗為泛-αv整合素抗體，其異位結合至結合配體之αv次單元且因此阻止配體結合至所有αvβ異二聚體且因此抑制潛伏TGF-β之αv整合素依賴性活化且因此阻斷成纖維細胞及其他前軀體獲取成肌纖維細胞表現型。研究的本質及目的 本研究之目的為測定阿吐珠單抗阻斷活體外TGF-β活化及FMT之能力且因此顯示其作為用於纖維化疾病之治療劑的潛能。材料及方法 測試系統 測試系統為上皮細胞/成纖維細胞共同培養物，模擬在經歷纖維化之組織中的上皮細胞與成纖維細胞之潛在相互作用。將來自健康供體之正常人類肺成纖維細胞(NHLF)或正常人類真皮成纖維細胞(NHDF)與NCI-H358或Calu 3細胞系共同培養。 測試材料及刺激 供應及 儀器 實驗設計 概述研究設計 成纖維細胞培養基(含有2% FBS之FGM)：FGM™ -2 BulletKit™ (CC-3132)含有一瓶500 ml之成纖維細胞基礎培養基(CC-3131)及具有以下生長補充料之成纖維細胞子彈套組 (CC-4126)：0.5 ml hFGF-B (CC-4065J)；0.5 ml胰島素(CC-4021J)；10 ml FBS (CC-4101J)；0.5 ml GA-1000 (CC-4081J)。 用於FMT分析之成纖維細胞培養基(含有0.1% FBS之FGM)：FGM™ -2 BulletKit™ (CC-3132)含有一瓶500 ml之成纖維細胞基礎培養基(CC-3131)及具有以下生長補充料之成纖維細胞子彈套組 (CC-4126)：0.5 ml hFGF-B (CC-4065J)；0.5 ml胰島素(CC-4021J)；0.5 ml FBS (CC-4101J)；0.5 ml GA-1000 (CC-4081J)。 NCI-H358培養基：含有55 ml經熱滅活之FBS + 5 ml丙酮酸鈉的500 ml RPMI Calu-3培養基：含有55 ml經熱滅活之FBS的500 ml丙酮酸鈉 在分析當天，NHLF及NHDF係在T150組織培養瓶中於含有2% FBS之FGM中生長，直到其等達到70至80%匯合。在室溫下，用6 ml經HEPES緩衝之鹽水溶液(Lonza目錄號CC-5022)淋洗該等細胞，用6 ml胰蛋白酶/EDTA (Lonza目錄號CC-5012)進行胰蛋白酶化持續5分鐘。使用6 ml胰蛋白酶中和溶液(Lonza目錄號CC-5002)滅活胰蛋白酶，在400 g下離心沉降4分鐘並用含有2% FBS之FGM清洗一次。 對於成像研究而言，成纖維細胞(NHLF或NHDF)係以10,000個細胞/孔接種於膠原蛋白1 Cellware 96孔黑色/透明板中。在含有2% FBS之FGM中培養細胞8小時。吸出培養基並使細胞於含有0.1% FBS之FGM中飢餓過夜。吸出培養基並添加100 ul含有濃度為20 ng/ml之阿吐珠單抗或抗-HEL IgG的含0.1%FBS之FGM並培養30分鐘。對於共同培養而言：將NCI-H358或Calu-3以100 ul之NCI-H358或Calu-3培養基中含2,000個細胞的密度塗鋪至含有成纖維細胞之孔中。5天後，收集培養基並在-80℃下儲存以用於IL-6檢測。固定細胞並根據α平滑肌肌動蛋白(αSMA)染色程序進行染色。 對於基因表現研究而言，將成纖維細胞(NHLF或NHDF)以200,000個細胞/孔接種於24孔培養板中。在含有2% FBS之FGM中培養細胞8小時。吸出培養基並使細胞於含有0.1% FBS之FGM中飢餓過夜。吸出培養基並添加300 ul含有濃度為20 ng/ml之阿吐珠單抗或抗-HEL IgG的含0.1%FBS之FGM並培養30分鐘。對於共同培養而言：將NCI-H358或Calu-3以300 ul之NCI-H358或Calu-3培養基中含40,000個細胞的密度塗鋪至含有成纖維細胞之孔中。7天後，收集培養基並在-80℃下儲存以用於IL-6檢測。在-80℃下儲存細胞直到準備用於RNA單離及RT-PCR。 aSMA免疫螢光染色：用PBS清洗細胞2次(200 ul於96孔板中)，並隨後使用固定/滲透溶液在室溫下固定45分鐘(50 uL於96孔板中)。隨後用1X BD滲透洗滌緩衝液(經蒸餾水以1:10之稀釋度稀釋)以5分鐘之培育清洗細胞3次。在室溫下使用Odyssey阻斷緩衝液(50 ul於96孔板中)阻斷細胞60分鐘。用1X BD滲透洗滌緩衝液(200 ul於96孔板中)清洗板2次，在各次清洗之間培育5分鐘。在洗滌緩衝液中以1:100之稀釋度添加抗-SMA抗體並在室溫下培育3小時。隨後用1X BD滲透洗滌緩衝液(200 ul於96孔板中)清洗板2次。以最終體積為100 ul在滲透洗滌緩衝液中以1:200之稀釋度使用與Alexa Fluor 488共軛之二級Ab山羊抗-小鼠IgG並在室溫下培育1小時。用200 ul 1X BD滲透洗滌緩衝液清洗細胞2次，在各次清洗之間培育5分鐘。將DAPI以1:1000之稀釋度添加至洗滌緩衝液中並添加200 ul至板，在室溫下培育5分鐘，吸出溶液並更換為200 ul 1X BD滲透洗滌緩衝液。 對於基因表現分析而言。根據包括於RNeasy 96套組(Qiagen)中之「使用真空技術自動物細胞單離細胞質RNA之RNeasy 96程序(RNeasy 96 Protocol for Isolation of Cytoplasmic RNA from Animal Cells-using Vaccum Technology)」萃取RNA。根據RT2分析工具PCR陣列手冊(Qiagen)中所述之程序，在用於Applied Biosystems循環器之循環條件下，使用RT2 First Strand套組及用於RT2分析工具PCR陣列之即時PCR完成cDNA合成。讀出 用於成像之板讀取程序 使用Image Xpress Micro (IXM)機器及MetaXpress軟體程式進行圖像採集及分析。對於2種顏色染色：DAPI及FITC染色而言，使用板採集成像程序：「2014-YW-SMA488-DAPI-10x」。對於資料分析而言，使用多波長細胞得分分析參數程序「2014-5-7-YW-SMA488-DAPI-4x-2 para a」來量化由於FMT之SMA纖維誘導的量。以BMP文件下載個別孔之影像。IL-6 ELISA 遵循製造商使用說明，使用市售IL-6 ELISA分析(Human Duoset IL-6，R & D Systems)測定人類IL-6之水平。使用Spectramax M5e讀數器(Molecular Devices)進行在450 nm下之光學密度讀數(OD)並自使用來自IL-6內標之OD讀數計算之四參數邏輯曲線擬合來外推出各樣本的IL-6濃度。基因表現分析 在RT-PCR已完成在QuantStudio 12k flex Applied Biosystem循環器中之運行後，將所有孔之CT值下載至Excel試算表以用於計算相對表現。所用電腦程式 相對基因表現 ( 基礎水平 ) 及倍數變化計算 CT 臨限值循環。CT 係反應中生成之螢光與臨限值線交叉的循環次數。CT 值為對數且係直接用於定量分析。 對於相對基因表現(基礎水平)而言： 計算ΔCT 值。ΔCT = CT 目標基因 –CT 內參基因 (GAPDH) 計算2–ΔCT 作為基礎水平之相對基因表現。 對於相對基因表現(處理後之倍數變化)而言： 計算ΔCT 值。ΔCT = CT 目標基因 –CT 內參基因 (GAPDH) 計算ΔΔCT 值。ΔΔCT = ΔCT 測試樣本(經處理)–ΔCT 校準樣本(未經處理) 標準化為內參基因(例如，GAPDH)且相對於校準基因(處理前或對照)之目標基因的量由2–ΔΔCT 給定。結果 阿吐珠單抗阻斷在 H358- 成纖維細胞及 Calu3- 成纖維細胞共同培養物中之 aSMA 表現的升高 ( 亦參見圖 1) 該研究產生在纖維化過程期間存在αv整合素與TGF-β之間所假定之串擾的實質證據。使用腫瘤上皮細胞/成纖維細胞共同培養系統來模擬在經歷纖維化之組織中的上皮細胞與成纖維細胞之潛在相互作用。共同培養7天後，肺成纖維細胞或真皮成纖維細胞單一培養中之aSMA的基礎水平降低。NCI-H358及Calu-3誘導成纖維細胞層中之aSMA表現(圖1)。將阿吐珠單抗添加至NHLF + NCI-H358；NHLF + Calu-3；NHDF + NCI-H358；NHDF + Calu-3共同培養抑制成纖維細胞中之aSMA表現之誘導。阿吐珠單抗阻斷在 H358- 成纖維細胞共同培養物中之 FMT 相關基因表現的升高 ( 亦參見圖 2) NHLF + NCI-H358；NHDF + NCI-H358之共同培養誘導作為FMT標記之多種mRNA轉錄且亦使IL-6產生增加。在此系統中，此等標記藉由阿吐珠單抗處理而減少，這證實αv整合素在FMT中起實質作用。書目 Buscemi L、Ramonet D、Klingberg F、Formey A、Smith-Clerc J、Meister J及Hinz B. The Single-Molecule Mechanics of the Latent TGF-β Complex. Current Biology. 2009. 21: 2046–2054 Eberlein C、Rooney C、Ross SJ、Farren M、Weir HM、Barry ST. E-Cadherin and EpCAM expression by NSCLC tumour cells associate with normal fibroblast activation through a pathway initiated by integrin αvβ6 and maintained through TGF-β signalling. Oncogene. 2015. 34:704-716。 Eberlein C、Kendrew J、McDaid K、Alfred A、Kang JS、Jacobs VN、Ross SJ、Rooney C、Smith NR、Rinkenberger J、Cao A、Churchman A、Marshall JF、Weir HM、Bedian V、Blakey DC、Foltz IN、Barry ST. A human monoclonal antibody 264RAD targeting αvβ6 integrin reduces tumour growth and metastasis, and modulates key biomarkers in vivo. Oncogene. 2013. 32:4406-4416。 Hata S、Okamura K、Hatta M、Ishikawa H、Yamazaki J. Proteolytic and non-proteolytic activation of keratinocyte-derived latent TGF-β1 induces fibroblast differentiation in a wound-healing model using rat skin. J Pharmacol Sci. 2014. 124: 230-243 Mukhopadhyay A、Tan EK、Khoo YT、Chan SY、Lim IJ、Phan TT. Conditioned medium from keloid keratinocyte/keloid fibroblast coculture induces contraction of fibroblast-populated collagen lattices. Br J Dermatol. 2005. 152:639-645。 Shephard P、Martin G、Smola-Hess S、Brunner G、Krieg T、Smola H. Myofibroblast differentiation is induced in keratinocyte-fibroblast co-cultures and is antagonistically regulated by endogenous transforming growth factor-beta and interleukin-1. Am J Pathol. 2004. 164:2055-2066。 Renzoni EA、Abraham DJ、Howat S、Shi-Wen X、Sestini P、Bou-Gharios G、Wells AU、Veeraraghavan S、Nicholson AG、Denton CP、Leask A、Pearson JD、Black CM、Welsh KI、du Bois RM. Gene expression profiling reveals novel TGF-β targets in adult lung fibroblasts. Respir Res. 2004. 5:24。 Lygoe KA、Wall I、Stephens P、Lewis MP. Role of vitronectin and fibronectin receptors in oral mucosal and dermal myofibroblast differentiation. Biol Cell. 2007. 99:601-614 Lygoe KA、Norman JT、Marshall JF、Lewis MP. AlphaV integrins play an important role in myofibroblast differentiation. Wound Repair Regen. 2004. 12:461-470。 Gardner H、Strehlow D、Bradley L、Widom R、Farina A、de Fougerolles A、Peyman J、Koteliansky V、Korn JH. Global expression analysis of the fibroblast transcriptional response to TGF-β. Clin Exp Rheumatol. 2004. 22(Suppl 33):S47-57實例 2 阿吐珠單抗在人類肺成纖維細胞中對 TGF-β 所誘導之 FMT 的作用 圖示列表 圖3：TGF-β增加人類肺成纖維細胞中之整合素的表現 圖4：TGF-β增加肺成纖維細胞中之aSMA、IL-6及其他成肌纖維細胞標記基因的表現 圖5：阿吐珠單抗處理成纖維細胞培養減少TGF-β誘導之aSMA及IL-6的增加 圖6：阿吐珠單抗處理減少TGF-β誘導之膠原蛋白凝膠收縮縮寫清單 αSMA：                α平滑肌肌動蛋白 BSA：                  牛血清血蛋白 Cy5：                   花青素5 DAPI：                 4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚 ECM：                  細胞外間質 FGM：                  成纖維細胞生長培養基 FMT：                  成纖維細胞至成肌纖維細胞轉變 FITC：                  螢光異硫氰酸鹽 IXM：                  Image Xpress Micro篩選系統 ug：                     微克 mg：                     毫克 mL：                    毫升 ng：                     毫微克 NHDF：                正常人類真皮成纖維細胞 NHLF：                正常人類肺成纖維細胞 PBS：                   經磷酸鹽緩衝之鹽水 TGF-β1：              轉變生長因子-β1 ELISA                  酶聯免疫吸附分析 FBS                      胎牛血清 h                          人類 IL                         介白素概述 本文顯示TGF-β1係成纖維細胞至成肌纖維細胞轉變(FMT)之高效介體，其造成細胞外間質沉積增加且係纖維化疾病之主要驅動因素。此外，此等過程期間存在證明aV整合素與TGF-β之間串擾的實質證據。TGF-β係以含有潛在型相關肽(LAP)區之潛伏形式分泌。TGF-β1之LAP含有與整合素avβ1、avβ3、avβ5、avβ6及avβ8相互作用使得TGF-β1活化之RGD基元。阿吐珠單抗係對aV具有特異性之人類抗體且因此抑制avβ1、avβ3、avβ5、avβ6及avβ8。此研究顯示並測定TGF-β對aV整合素及纖維化基因表現之作用及阿吐珠單抗可在活體外阻斷TGF-β誘導之基因表現。 整合素之表現係藉由RT-PCR來分析且發現人類肺成纖維細胞表現ITGB1＞ITGB5＞ITGB8＞ITGB3。TGF-β誘導之FMT引起ITGB5表現增加且較少程度地增加ITGB1及ITGB3表現。TGF-β處理使肺成纖維細胞中之成肌纖維細胞標記基因增加且免疫螢光染色顯示avβ5表現增加。阿吐珠單抗處理使所增加之aSMA表現、IL-6之產生及膠原蛋白凝膠收縮減少且因此證實阻斷TGF-β誘導之FMT的能力。引言 纖維化疾病之特徵為由於細胞外間質之產生、沉積及收縮所致之過度結疤且據信其由成肌纖維細胞之增殖及活化驅動。纖維化疾病代表最大的疾病組之一，其無有效療法。纖維化過程經由在前纖維化及抗纖維化介體之網路中之一系列複雜的相互作用進行調節。據信TGF-β信號傳導在成纖維細胞至成肌纖維細胞轉變(FMT)中起重要作用，其造成細胞外間質沉積增加且係疾病之主要驅動因素。 將TGF-β同功異型體合成為與含有潛在型相關肽(LAP)區之潛伏TGF-β結合蛋白複合的潛伏前軀體。此等過程期間存在aV整合素與TGF-β之間串擾之實質證據。TGF-β1之LAP含有與整合素avβ1、avβ3、avβ5、avβ6及avβ8相互作用使得TGF-β1活化之RGD基元。阿吐珠單抗為泛-αv整合素抗體，其異位結合至結合配體之aV次單元且因此阻止配體結合至所有αvβ異二聚體且因此抑制潛伏TGF-β之αv整合素依賴性活化且因此阻斷成纖維細胞及其他前軀體獲取成肌纖維細胞表現型。本研究提供TGF-β對aV整合素及纖維化基因表現之作用及阿吐珠單抗在正常人類肺成纖維細胞(NHLF)中阻斷TGF-β誘導之基因表現之強有力證據。材料及方法 測試系統 測試系統為來自健康供體之經具有或無潛伏TGF-β的TGF-β1刺激之NHLF。原發性NHLF在TGF-β刺激後上調α平滑肌肌動蛋白(主要讀出)。 測試材料及刺激 供應及儀器 設計 概述研究設計 NHLF培養基(含有2% FBS之FGM)：FGM™ -2 BulletKit™ (CC-3132)含有一瓶500 ml之成纖維細胞基礎培養基(CC-3131)及具有以下生長補充料之成纖維細胞子彈套組(CC-4126)：0.5 ml hFGF-B (CC-4065J)；0.5 ml胰島素(CC-4021J)；10 ml FBS (CC-4101J)；0.5 ml GA-1000 (CC-4081J)。 用於FMT分析之NHLF培養基(含有0.1% FBS之FGM)：FGM™ -2 BulletKit™ (CC-3132)含有一瓶500 ml之成纖維細胞基礎培養基(CC-3131)及具有以下生長補充料之成纖維細胞子彈套組 (CC-4126)：0.5 ml hFGF-B (CC-4065J)；0.5 ml胰島素(CC-4021J)；0.5 ml FBS (CC-4101J)；0.5 ml GA-1000 (CC-4081J)。 在分析當天，NHLF係在T150組織培養瓶中於含有2% FBS之FGM中生長，直到其等達到70至80%匯合。在室溫下，用6 ml經HEPES緩衝之鹽水溶液(Lonza目錄號CC-5022)淋洗該等細胞，用6 ml胰蛋白酶/EDTA (Lonza目錄號CC-5012)進行胰蛋白酶化持續5分鐘。使用6 ml胰蛋白酶中和溶液(Lonza目錄號CC-5002)滅活胰蛋白酶，在400 g下離心沉降4分鐘並用含有2% FBS之FGM清洗一次。對於成像研究而言，細胞係以7500個細胞/孔接種於膠原蛋白1 Cellware 96孔黑色/透明板中。對於基因表現研究而言，細胞係以50,000個細胞/孔接種於24孔培養板中。在含有2% FBS之FGM中培養細胞8小時。吸出培養基並使細胞於含有0.1% FBS之FGM中飢餓過夜。 爲了研究TGF-β對aV整合素、aSMA及基因表現的作用： 吸出培養基並添加100 ul之含有0.1% FBS的FGM，以含於100 ul之含有0.1% FBS的FGM中之2X (20 ng/ml)的所需濃度添加TGF-β。72小時後，收集培養基並在-80℃下儲存以用於IL-6檢測。 爲了研究阿吐珠單抗對TGF-β所誘導之成纖維細胞成肌纖維細胞轉變(FMT)中的作用，NHLF係以7500個細胞/孔接種於膠原蛋白1 Cellware 96孔黑色/透明板中，在含有2% FBS之FGM中培養8小時。吸出培養基並使細胞於含有0.1% FBS之FGM中飢餓過夜。吸出培養基並添加100 ul含有濃度為25ng/ml之阿吐珠單抗或抗-HEL IgG的含0.1%FBS之FGM並培養30分鐘。以含於100 ul之含有0.1% FBS的FGM中之2X (潛伏TGF-β1=40 ng/ml，TGF-β=0.312 ng/ml)的所需濃度添加TGF-β。72小時後，收集培養基並在-80℃下儲存以用於IL-6檢測。 對於使用免疫螢光之aV整合素、aSMA表現研究而言，固定細胞並根據α平滑肌肌動蛋白(αSMA)及aV整合素染色程序進行染色。對於FMT相關基因表現分析而言，在-80℃下儲存細胞直到準備用於RNA單離及RT-PCR。 α平滑肌肌動蛋白及aV整合素免疫螢光染色：用PBS清洗細胞2次(200 ul於96孔板中)，並隨後使用固定/滲透溶液在室溫下固定45分鐘(50 uL於96孔板中)。隨後用1X BD滲透洗滌緩衝液(經蒸餾水以1:10之稀釋度稀釋)在5分鐘之培育下清洗細胞3次。在室溫下使用Odyssey阻斷緩衝液(50 ul於96孔板中)阻斷細胞60分鐘。用1X BD滲透洗滌緩衝液(200 ul於96孔板中)清洗板2次，在各次清洗之間培育5分鐘。在洗滌緩衝液中以1:100之稀釋度添加抗-SMA抗體。以1 ug/ml含於滲透緩衝液中作為最終濃度使用抗-整合素Ab並在室溫下培育3小時。隨後用1X BD滲透洗滌緩衝液(200 ul於96孔板中)清洗板2次。以最終體積為100 ul在滲透洗滌緩衝液中以1:200之稀釋度使用與Alexa Fluor 488共軛之二級Ab山羊抗-小鼠IgG且以1:100之稀釋度使用與Alexa Fluor 647共軛之二級Ab山羊抗-兔IgG並在室溫下培育1小時。用200 ul 1X BD滲透洗滌緩衝液清洗細胞2次，在各次清洗之間培育5分鐘。將DAPI以1:1000之稀釋度添加至洗滌緩衝液中並添加200 ul至板，在室溫下培育5分鐘，吸出溶液並用200 ul 1X BD滲透洗滌緩衝液更換。 對於基因表現分析而言。根據包括於RNeasy 96套組(Qiagen)中之「使用真空技術自動物細胞單離細胞質RNA之RNeasy 96程序」提取RNA。根據RT2分析工具PCR陣列手冊(Qiagen)中所述之程序，在用於Applied Biosystems循環器之循環條件下使用RT2 First Strand套組及用於RT2分析工具PCR陣列之即時PCR，來完成cDNA合成。 對於凝膠收縮分析而言：使用HEPES潤洗在T150中生長之人類成纖維細胞一次並移除上清液，並將6 ml胰蛋白酶添加至各燒瓶中，於室溫下5分鐘，添加6 ml胰蛋白酶中和溶液並藉由在400 g下之離心收集細胞。在含有2% FBS之FGM中且依2x 106 個細胞/ml再懸浮細胞。用10 ug/ml阿吐珠單抗或抗-HELIgG處理細胞15分鐘。藉由混合2份(120 ul)之「經處理的」細胞懸浮液及8份(480 ul)之有或沒有TGF-β (10 ng/ml)的冷膠原蛋白凝膠溶液來形成膠原蛋白晶格。將500 ul細胞-膠原蛋白混合物轉移至24孔板之各孔中，在37℃下培育1小時。膠原蛋白聚合後，將1 ml之培養基添加至各膠原蛋白凝膠晶格之頂部。使用無菌抹刀輕柔地刮起膠原蛋白凝膠，讓凝膠浮於培養基中。監測膠原蛋白凝膠尺寸持續5天並在第5天拍攝照片。讀出 用於成像之板讀取程序 使用Image Xpress Micro (IXM)機器及MetaXpress軟體程式進行圖像採集及分析。進行3種顏色染色：DAPI、FITC及Cy5時，使用板採集成像程序：「2014-YW-SMA-Int-DAPI-647-10x」。進行2種顏色染色： DAPI及FITC染色時，使用板採集成像程序：「2014-YW-SMA488-DAPI-10x」。對於資料分析而言，使用多波長細胞得分分析參數程序「2014-5-7-YW-SMA488-DAPI-4x-2 para a」來定量由FMT所誘導之SMA纖維的量。以BMP檔案下載個別孔之影像。IL-6 ELISA 遵循製造商使用說明，使用市售IL-6 ELISA分析(Human Duoset IL-6，R & D Systems)測定人類IL-6之水平。使用Spectramax M5e讀數器(Molecular Devices)進行在450 nm下之光學密度讀數(OD)並自使用來自IL-6內標之OD讀數計算之四參數邏輯曲線擬合來外推出各樣本的IL-6濃度。基因表現分析 在RT-PCR完成在QuantStudio 12k flex Applied Biosystem循環器中之運行後，將所有孔之CT值下載至Excel試算表用於計算相對表現。所用電腦程式 相對基因表現 ( 基礎水平 ) 及倍數變化計算 CT 臨限值循環。CT 係反應中生成之螢光與臨限值線交叉的循環次數。CT 值為對數且係直接用於定量分析。 對於相對基因表現(基礎水平)而言： 計算ΔCT 值。ΔCT = CT 目標基因 –CT 內參基因 (GAPDH) 計算2–ΔCT 作為基礎水平之相對基因表現。 對於相對基因表現(處理後之倍數變化)而言： 計算ΔCT 值。ΔCT = CT 目標基因 –CT 內參基因 (GAPDH) 計算ΔΔCT 值。ΔΔCT = ΔCT 測試樣本(經處理)–ΔCT 校準樣本(未經處理) 標準化為內參基因(例如，GAPDH)且相對於校準基因(處理前或對照)之目標基因的量由2–ΔΔCT 給定。結果 TGF-β 增加人類肺成纖維細胞中之整合素的表現 ( 亦參見圖 3) 藉由RT-RCR分析NHLF中之整合素的表現並發現NHLF在穩態下表現整合素且表現水平之順序為ITGB1＞ITGB5＞ITGAV＞ITGB8＞ITGB3。假定aV整合素與TGF-β之間存在串擾，因此，吾人關注TGF-β在FMT分析之整合素表現中的作用。吾人發現TGF-β所誘導之FMT引起ITGB5之表現增加且較少程度地增加ITGB1及ITGB3表現；免疫螢光染色顯示avβ5表現增加(參見圖3：TGF-β增加人類肺成纖維細胞中之整合素的表現)。TGF-β 增加肺成纖維細胞中之 aSMA 、 IL-6 及其他成肌纖維細胞標記基因的表現 ( 亦參見圖 4) TGF-β處理使IL6產生及α平滑肌肌動蛋白表現增加，如藉由免疫螢光及RT-PCR所檢測。TGF-β處理使成肌纖維細胞標記基因(諸如α平滑肌、膠原蛋白、纖維連接蛋白、SERPINE1、SNAI1、骨膜蛋白、N-鈣黏附素(N-Caherin))在肺成纖維細胞中之表現增加(參見圖4：TGF-β增加肺成纖維細胞中之aSMA、IL-6及其他成肌纖維細胞標記基因的表現)。阿吐珠單抗處理成纖維細胞培養物減少 TGF-β 所誘導之 aSMA 及 IL-6 的增加 ( 亦參見圖 5) 如圖1所示，TGF-β增加整合素之表現，在此實驗中吾人以次優劑量之活性TGF-β結合高劑量之潛伏型TGF-β處理NHLF來增加整合素之表現。潛伏及活性TGF-β1之組合與單獨潛伏型或活性型相比誘導更多數量之細胞表現aSMA。阿吐珠單抗處理減少由TGF-β活化引起之aSMA表現、IL-6產生及FMT基因表現(參見圖5：阿吐珠單抗處理成纖維細胞培養物減少TGF-β所誘導之aSMA及IL-6的增加)。阿吐珠單抗處理減少 TGF-β 所誘導之膠原蛋白凝膠收縮 ( 亦參見圖 6) 在成纖維細胞收縮研究中使用3維膠原蛋白凝膠分析。爲了測定由TGF-β1及阻斷aV整合素而非阿吐珠單抗引起之aSMA蛋白質中的改變是否具有功能性結果，進行膠原蛋白凝膠收縮分析。當將阿吐珠單抗添加至細胞時，其減少由添加TGF-β所引起之收縮度(參見圖6：阿吐珠單抗處理減少TGF-β所誘導之膠原蛋白凝膠收縮)。討論 在此報告中，吾人顯示TGF-β使aV整合素、aSMA及其他FMT基因(諸如膠原蛋白、纖維連接蛋白、SERPINE1、SNAI1、骨膜蛋白、N-鈣黏附素)在人類肺成纖維細胞中的表現增加。阿吐珠單抗處理成纖維細胞培養物減少TGF-β所誘導之aSMA、IL6、CTGF、SERPINE、PLOD的增加。 已證明阿吐珠單抗在細胞外間質過度產生之部位阻斷αv整合素依賴性活化潛伏TGF-β。本文中吾人證明，當在活體外培養系統中使用時，阿吐珠單抗阻斷成纖維細胞成肌纖維細胞轉變。TGF-β上調aV整合素，其阻斷αv整合素依賴性活化潛伏TGF-β，阻斷成肌纖維細胞膜上整合素之局部上調，且因此能夠中斷TGF-β活化與成肌纖維細胞累積之惡性循環。文獻 Buscemi L、Ramonet D、Klingberg F、Formey A、Smith-Clerc J、Meister J及Hinz B. The Single-Molecule Mechanics of the Latent TGF-β Complex. Current Biology. 2009. 21: 2046–2054 Goodman SL、Grote HJ、Wilm C. Matched rabbit monoclonal antibodies against αv-series integrins reveal a novel αvβ3-LIBS epitope, and permit routine staining of archival paraffin samples of human tumors. Biol Open. 2012. 1(4):329-340。 Scaffidi AK、Petrovic N、Moodley YP、Fogel-Petrovic M、Kroeger KM、Seeber RM、Eidne KA、Thompson PJ、Knight DA. alpha(v)beta(3) Integrin interacts with the transforming growth factor beta (TGF-β) type II receptor to potentiate the proliferative effects of TGF-β1 in living human lung fibroblasts. J Biol Chem. 2004. 279(36):37726-37733 Renzoni EA、Abraham DJ、Howat S、Shi-Wen X、Sestini P、Bou-Gharios G、Wells AU、Veeraraghavan S、Nicholson AG、Denton CP、Leask A、Pearson JD、Black CM、Welsh KI、du Bois RM. Gene expression profiling reveals novel TGF-β targets in adult lung fibroblasts. Respir Res. 2004. 5:24。 Lygoe KA、Wall I、Stephens P、Lewis MP. 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Clin Exp Rheumatol. 2004. 22(Suppl 33):S47-57附錄 用於 RT-PCR 之基因列表 實例 3 ：阿吐珠單抗對 αvβ6 結合至潛在型相關肽 (LAP) 之作用 縮寫清單 αSMA：                α平滑肌肌動蛋白 ECM：                  細胞外間質 ug：                     微克 mg：                     毫克 mL：                    毫升 LAP：                   潛在型相關肽(LAP) LTBP：                 潛伏TGF-β結合蛋白質 ng：                     毫微克 TGF-β1：              轉變生長因子-β1 ELISA：                酶聯免疫吸附分析 h：                       人類 IL：                      介白素概述 αvβ3、αvβ3、αvβ6及αvβ8可控制TGF-β之活化 TGF-β1為在多種器官之組織纖維化之發展中起重要作用的主要前纖維化細胞介素。TGF-β1經由促進組織成纖維細胞分化成成肌纖維細胞從而促成纖維化。成肌纖維細胞可產生細胞外間質(ECM)蛋白質，且係在纖維化期間ECM擴張及收縮之主要驅動因素。TGF-β1係以潛伏複合物分泌，除了TGF-β1亦包含潛在型相關肽(LAP)及潛伏TGF-β結合蛋白(LTBP)。當LTBP錨定至ECM且LAP在αv次單元上結合αv整合素(即，αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8)之一者時，該複合物可採用開放構型以釋放活性TGF-β1。 阿吐珠單抗係對αv整合素之配體結合αv次單元具有特異性的人類抗體。一旦結合至αv次單元，阿吐珠單抗可阻止αv整合素結合至其配體諸如LAP。此研究之目標為評估阿吐珠單抗阻斷LAP結合至αvβ6的能力。 藉由使用基於抗-αvβ6之ELISA分析，吾人證實阿吐珠單抗能夠以劑量依賴性方式阻斷αvβ6結合至預塗覆至ELISA板之LAP。該發現結果清楚地證實阿吐珠單抗阻斷αv整合素結合至LAP(TGF-β活化中之關鍵步驟)的能力。此形成開發阿吐珠單抗用於治療纖維化疾病之科學依據的一部分。引言 TGF-β1(主要前纖維化細胞介素)在多種器官之組織纖維化之發展中起重要作用。TGF-β1經由促進組織成纖維細胞分化成成肌纖維細胞從而促成纖維化。成肌纖維細胞可產生細胞外間質(ECM)蛋白質並收縮。其等係在纖維化期間ECM擴張及收縮之主要驅動因素。TGF-β1係以潛伏複合物分泌，除了TGF-β1亦包含潛在型相關肽(LAP)及潛伏TGF-β結合蛋白質(LTBP)。當LTBP錨定至ECM且LAP在αv次單元上結合αv整合素(即，αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8)之一者時，該複合物可採用開放構型以釋放活性TGF-β1。 本研究之目的為評估阿吐珠單抗阻斷LAP結合至αvβ6的能力。材料及方法 材料 測試系統 測試系統為競爭性結合分析，其中使用重組型人類LAP塗覆板且隨後在存在或不存在阿吐珠單抗(亦稱為DI17E6)下用重組型人類αvβ6培育。藉由ELISA，使用兔抗αvβ6抗體(捕獲抗體)及與辣根過氧化酶(HRP)共軛之山羊抗-兔IgG (檢測抗體)來檢測結合至LAP之αvβ6的量。材料及 儀器 關鍵材料 關鍵設備 對於其他材料及設備而言，參見報告SWE00174。塗覆緩衝液 ( 含於雙蒸餾水中 ) ： 200 mM Tris 150 mM NaCl 用HCl調節pH值至7.4 + 1 mM CaCl2 ；1 mM MgCl2 ；0.01 mM MnCl2 阻斷緩衝液 ( 含於雙蒸餾水中 ) ： 50 mM Tris 100 mM NaCl 用HCl調節pH值至7.4 + 5 mg/ml BSA洗滌及稀釋緩衝液 ( 含於雙蒸餾水中 ) ： 200 mM Tris 150 mM NaCl 用HCl調節pH值至7.4 + 1 mM CaCl2 ；1 mM MgCl2 ；0.01 mM MnCl2 + 0.1 mg/kg BSA實驗設計 概述研究設計 用 LAP 塗覆板。 將重組型人類LAP以0.1 μg/ml之最終濃度添加至板並在4℃下培育過夜使板經LAP塗覆。隨後排乾板並在37℃下用100 μl之阻斷緩衝液培育2小時以阻斷αvβ6非特異性結合至板。將 αvβ6 與阿吐珠單抗或對照抗體添加至經 LAP 塗覆之板。 將50 μl之預稀釋阿吐珠單抗或對照抗體以從高到低之連續稀釋的濃度添加至各孔。隨後將50 μl之αvβ6溶液添加至各孔。抗體的最終濃度為2.5 μg/ml至0.16 ng/ml，且αvβ6的最終濃度為0.25 μg/ml。 將阿吐珠單抗之作用與其他兩種抗-αvβ6抗體：MSB0011521H-1及10D5比較。使用IgG2a作為阿吐珠單抗之同型對照IgG。抗-HEL (MSB0011523H-1)係對非哺乳動物蛋白質(芥菜屬(Arabidopsis )之Hevein-樣前原蛋白)具有特異性之抗體，且係作為MSB0011521H-1之陰性對照抗體使用。17E6係原始非脫免疫小鼠泛抗-αv抗體，阿吐珠單抗或DI17E6係自其衍生而來。以與阿吐珠單抗或DI17E6相同之濃度添加此等抗體。 在37℃下用αvβ6與阿吐珠單抗或其對照抗體培育板60分鐘。隨後清洗板用於添加二級抗體。添加經 HRP 共軛之山羊抗 - 兔 IgG 至板，顯色並讀數。 添加經HRP共軛之山羊抗-兔IgG至板並在37℃下培育90分鐘。隨後添加R&D底物試劑(Pack DY999)至板並在添加R&D停止溶液DY994使反應停止前培育20分鐘以顯色。隨後在Tecan ELISA讀取器InfiniteM200上以450 nm讀板。讀出 藉由使用 ELISA 量測 αvβ6 至 LAP 之結合。 結合至LAP之αvβ6的量係藉由使用上文研究設計中所描述之程序來測定。結果 阿吐珠單抗抑制 αvβ6 結合至 LAP( 亦參見圖 7) 藉由基於特異性抗αvβ6抗體之ELISA來檢測αvβ6至預塗覆LAP之結合。當DI17E6與αvβ6在經LAP預塗覆之板中共同培育時，DI17E6以濃度依賴性方式阻斷該結合。抗-αvβ6抗體MSB0011521H-1及10D5亦抑制該結合。相反地，同型對照IgG2或陰性對照抗體(抗-HEL、MSB0011523H-1)皆不顯示任何抑制作用。αvβ3整合素特異性抑制抗體LM609亦不抑制αvβ6結合至LAP。該發現結果指示DI17E6特異性抑制αvβ6結合至LAP。藉由使用 ELISA 量測 αvβ6 至 LAP 之結合。 結合至LAP之αvβ6的量係藉由使用上文研究設計中所描述之程序來測定。結果 阿吐珠單抗抑制 αvβ6 6 結合至 LAP 藉由基於特異性抗αvβ6抗體之ELISA來檢測αvβ6至預塗覆LAP之結合。當DI17E6與αvβ6在經LAP預塗覆之板中共同培育時，DI17E6以濃度依賴性方式阻斷該結合。抗-αvβ6抗體MSB0011521H-1及10D5亦抑制該結合。相反地，同型對照IgG2或陰性對照抗體(抗-HEL、MSB0011523H-1)皆不顯示任何抑制作用。αvβ3整合素特異性抑制抗體LM609亦不抑制αvβ6結合至LAP。該發現結果指示DI17E6特異性抑制αvβ6結合至LAP。研究報告表 討論 在此研究中，吾人證明阿吐珠單抗(DI17E6)特異性且濃度依賴性地抑制αvβ6結合至LAP。該發現結果清楚地證實阿吐珠單抗阻斷αv整合素結合至LAP(一個TGF-β活化中之關鍵步驟)之能力。此證據形成將阿吐珠單抗用於治療纖維化及/或纖維化疾病之科學依據的重要部分(亦參見圖7：圖7顯示阿吐珠單抗對αvβ6結合至LAP之抑制作用)。以含有αvβ6(未經處理)之孔相比空白孔(不含αvβ6之緩衝液)在光學密度上增加來檢測αvβ6至經塗覆之LAP之結合。將數值標準化，其中前者為100%且後者為0%。兩個批次之DI17E6 (批號40350及13245)皆以濃度依賴性方式減少αvβ6至LAP之結合，與抗-αvβ6抗體MSB0011521H-1相似，但比抗-αvβ6抗體10D5更佳。相反地，同型對照IgG (IgG2)或陰性對照抗體(抗-HEL、MSB0011523H-1，資料未顯示)在相同濃度範圍內皆不影響該結合。同樣，αvβ3特異性抑制抗體LM609不抑制αvβ6結合至LAP。實例 4 ： 纖維化/全身性硬化症基因特徵概述 •此研究之目標為尋找用於診斷及監測患有全身性硬化症(SSc)之患者中纖維化的狀態之穩健的基因特徵。 •使用以下雙重策略識別特徵基因： ○預定義基於文獻之基因的列表並測試在所公開之基於微陣列之基因表現的資料中在SSc皮膚中的上調。 ○在所有基因之無偏性分析中，使用三個公開SSc資料組來尋找在SSc皮膚中上調之候選基因。 •另外，在兩個公開之基因組規模之基因表現的資料組中針對其等與肺纖維化之關聯過濾預最終候選基因列表。 •最後，針對免疫相關組織相比實體組織上調來過濾候選基因列表。 •總之，吾人能夠藉由分析五個適當資料組找到在SSc及肺纖維化組織中上調之19個非免疫相關基因的穩健特徵。 •在由TGF-β補充或與來自人類上皮H358肺細胞系之細胞共同培養之人類成纖維細胞實驗中，包括於TGF-β-上升/阿吐珠單抗-下降特徵(下文稱為TUAD特徵)中之基因在投與TGF-β後顯示上調(中值倍數變化，在3次重複實驗中)。 •另外，使9個基因之最終TUAD特徵經歷正常人類肺成纖維細胞(NHFL)實驗，其與人類H358細胞共同培養並經兩次劑量之抗-HEL(雞蛋溶菌酶)或阿吐珠單抗處理。接受TUAD作為可藉由阿吐珠單抗下調之與TGF-β關聯的纖維化特徵，因為a) 9-基因特徵中的所有基因在阿吐珠單抗處理後下調，及b)因為TUAD 9-基因特徵凈得分下調。引言 此研究旨在使用雙層處理程序尋找用於監測患有全身性硬化症(SSc)之患者的纖維化之穩健的基因特徵。據報導在SSc及經TGF刺激之成纖維細胞中上調的基於文獻之基因以及具有在公開資料組中患有SSc/纖維化的患者中上調之強有力證據的基因經歷進一步分析以最終獲得用於SSc及IPF中之纖維化的穩健基因特徵。 此外，吾人進行nanostring表現圖譜分析實驗來識別藉由TGF-β上調之基因的另一特徵(稱為TUAD特徵)，因此其代表19基因特徵之TGF-β依賴性基因子群。最後，吾人使此TUAD特徵經歷另一實驗以測試阿吐珠單抗是否可下調TUAD特徵。材料 吾人使用以下資料組來評定在SSc/纖維化中上調之基因。可在Gene Expression Omnibus (GEO )資料庫中獲取資料組。 藉由計算每個基因之探針設定強度的平均值來獲得基因表現。全身性硬化症 資料組 GSE9285 (Milano等人，2008)總共包括75個樣本。自17位患有瀰漫性SSc (dSSc)之患者、7位患有局限性SSc (lSSc)之患者、3位患有硬斑病之患者及6位健康對照的前臂及背採取皮膚活組織檢查。 資料組GSE32413 (Pendergrass等人，2012)由總共89份皮膚活組織檢查樣本組成。對22位患有SSc之患者及9位健康對照量測基因表現。SSc患者中之13位用利妥昔單抗(rituximab)處理，其他9位未經處理。吾人將基線/處理前樣本用於評定SSc皮膚與正常皮膚之間的差異表現並排除在處理後6個月及36個月所採之活組織檢查。 GSE45485 (Hincliff等人，2013)總共包括來自12位經黴酚酸嗎啉乙酯(MMF)處理之SSc患者及10位健康對照的83份皮膚活組織檢查。在該分析中僅包括來自SSc患者之基線(處理前)樣本，排除在MMF處理後6個月及12個月所採之樣本。肺纖維化 資料組 GSE24206 (Meltzer等人，2011) 17份來自11位患有早期/晚期特發性肺纖維化(IPF)之患者的肺樣本。6位患者提供一對來自上肺葉及下肺葉之樣本，5位患者捐獻單件樣本。自健康供體肺在肺移植時之常規肺容積減少獲得6份對照樣本。 資料組GSE48149 (未公開)總共包括53份肺樣本。包括8位患有特發性肺動脈性高血壓(IPAH)之患者、13位患有IPF之患者、10位患有由SSc引起之肺動脈性高血壓(SSc-PAH)之患者及13位患有由SSc引起之肺纖維化(SSc-PF)之患者以及9位健康對照。GSE21369包括來自23個個體之29份肺組織樣本。使用11位經診斷患有常見間質肺炎/特發性肺纖維化(UIP/IPF)之患者及6位對照的資料，排除患有非特異性間質肺炎之患者的樣本。免疫相關 資料組 此研究使用包括於資料組GSE1133 (Su等人，2004)中之28個免疫相關組織及118個非免疫/非癌症組織的基因表現。驗證資料組 資料組GSE22459 (Park等人，2010)包括65位在1年程序活組織檢查中伴有纖維化及發炎徵兆之腎移植接受者。 資料組GSE61260 (Hovarth等人，2014)包括134份Nash (非酒精性脂肪變性肝炎)、PSC (原發性硬化性膽管炎)、PBC (原發性膽汁性膽管炎)、NAFLD (非酒精性脂肪肝病)、健康肥胖及正常肝樣本。 資料組GSE48452 (Ahrens等人，2013)包括73份來自Nash (非酒精性脂肪變性肝炎)、脂肪變性、健康肥胖及正常肝之樣本。 資料組GSE49541 (Moylan等人，2014)包括72位患有NAFLD之患者(40位患有輕度NAFLD，纖維化階段0-1及32位患有晚期NAFLD，纖維化階段3-4)。 資料組GSE39491 (Hyland等人，2014)包括120份來自43位BE患者之鱗狀食道(NE)及胃賁門(NC)的巴雷特化生及匹配正常黏膜樣本。 資料組GSE26886 (Wang等人，2013)包括20份巴雷特食道患者之樣本、21份腺癌患者之樣本及19份來自患有正常食道鱗狀上皮組織之患者的活組織檢查、9份鱗狀細胞癌之樣本。 資料組GSE37200 (Silvers等人，2010)包括31份巴特雷食道及15份腺癌樣本。 資料組GSE47460 (未公開)總共包括582位個體，其中254位患有間質性肺病、220位患有COPD及108位為對照。 資料組GSE24988 (Mura等人，2012)包括116份來自經歷肺移植之PF患者之接受者器官的樣本。 資料組GSE17978 (Emblom-Callahan等人，2010)包括來自患有末期特發性肺纖維化之患者的12個肺及6位供體之正常肺(對照)的58份樣本。 資料組GSE53845 (DePianto等人，2015)包括來自40位IPF患者及8位健康對照之樣本。 資料組GSE44426 (Desterke等人，2015)包括6份來自原發性骨髓纖維化之骨髓樣本及6份對照樣本。經 TGF-β 或阿吐珠單抗處理之正常人類成纖維細胞的兩個資料組 資料組包括19個纖維化特徵基因中之17個的表現資料。該17個基因中之三個的表現係低於量化下限(LLOQ)。第一資料組(AB001)因此包括14個基因之表現水平，在9份樣本中量測。該九份樣本可分成三個樣本組：僅NHLF、NHLF + TGF-β、NHLF + H358。第二資料組(AB002)包括十一份樣本：經40 ng/ml抗-HEL處理之NHLF (重複3次)、經40 ng/ml阿吐珠單抗處理之NHLF (重複2次)、經10 μg/ml抗-HEL處理之NHLF (重複3次)、經10 μg/ml阿吐珠單抗處理之NHLF (重複3次)。特徵得分 吾人發現吾人之19-基因及9-基因特徵可以多種方式進行評分以獲得支持吾人之申請專利範圍的結果。 表現原強度可進行對數換算或不進行換算。 Z-標準化：在多樣本(＞=9)資料組中，各基因表現載體可以平均值或中位數為中心並進行標準化以獲得表現Z得分。 使用處理前強度作為參考的標準化：比率可自處理前之表現強度與處理後之表現強度計算。此等比率可視情況進行對數標度化。 各樣本之特徵總分經計算為跨基因之總和、平均值或加權平均值。基於文獻之基因列表 Daigen Xu (TIP免疫學)已經提出在SSc及經TGF刺激之成纖維細胞中與上調相關聯的143個基因，其包括四個來自預示患有瀰漫性SSc之患者之皮膚疾病之「Lafyatis特徵」的基因(Farina等人，2010)。135個係於三個SSc資料組之至少一個中進行量測。該135個基因之列表可參見表 9 。所用電腦程式 識別所需纖維化 /SSc 特徵之策略 在圖中概述識別所需纖維化/SSc特徵之策略。吾人區分文獻衍生及非文獻衍生基因之間的差異。兩個基因組皆在三個SSc資料組中進行測試，在肺纖維化資料組中過濾並最終再次於肺纖維化資料組中驗證。在下一部分中詳細描述單一步驟。步驟 1 ：獲得預最終基因列表 爲了獲得纖維化/SSc相關基因之候選列表，吾人對每個基因在各SSc資料組中進行差異表現分析之中等t-檢定，如R bioconductor套裝軟體limma (Smyth，2004)中所實施。以對比「SSc-正常」樣本對每個基因之線性模型進行擬合。考慮到線性模型擬合，藉由標準誤差至通用值之經驗貝氏(Bayes)改良法計算中等t-統計。藉由控制錯誤發現率(FDR)之Benjamini Hochberg程式(Benjamini及Hochberg，1995)調整多項測試之p值。基於文獻分析之基因的分析 在如上所述之三個SSc資料組中，測試所有基因於SSc與正常皮膚之間的差異表現。若來自文獻之經預定義的基因滿足以下準則，則其等係包括於纖維化基因之預最終列表中： •基因必須在三個公開SSc資料組之至少一個中顯著上調(經調整之p值＜ 0.05)及 •基因必須在三個資料組之任一個中未顯著下調。 沒有基因因在資料組中同時顯著上調或下調而排除。135個來自文獻之經預定義的基因中的40個滿足此等準則。基於公開資料採集之其他纖維化 /SSc 基因 對於非自文獻所預定義之所有其他基因而言，收緊準則。若滿足以下準則，則基因係包括於上調纖維化/SSc基因之預最終列表中： •基因必須在三個公開SSc資料組之(至少)兩個中顯著上調(經調整之p值＜ 0.05)及 •基因必須在三個資料組之任一個中未顯著下調。 發現62個非衍生自文獻之基因與健康皮膚相比在SSc中上調。雖然由於在一個SSc資料組中明顯下調而排除62個基因中的兩個，但是產生60個基因考慮用於進一步分析。 總共有100個基因包括於上調纖維化/SSc基因之預最終列表中。步驟 2 ：針對在肺纖維化中之差異表現過濾預最終基因列表 兩個資料組(GSE24206及GSE48149)係用於評定在SSc中發現上調之基因是否在肺纖維化(PF)中同樣上調。100個基因中之96個存在於至少兩個PF資料組中。吾人使用中等t-檢定以四種比較測試該96個基因在纖維化肺組織中之上調： 1.  GSE24206：正常對早期IPF 2.  GSE24206：正常對晚期IPF 3.  GSE48149：正常對IPF 4.  GSE48149：正常對SSc-IPF 爲了通過此過濾步驟，基因需要在至少兩個比較中顯著上調(經Benjamini Hochberg調整之p值＜ 0.05)且在任何比較中未顯著下調。步驟2後留下20個候選基因。步驟 3 ：針對在免疫相關組織中之上調過濾預最終基因列表 對於來自纖維化/SSc相關基因之候選列表的剩餘基因，吾人對每個基因在正常組織資料組GSE1133中進行差異表現分析之中等t-檢定，如R bioconductor套裝軟體limma中所實施。以對比「免疫-其他」樣本對每個基因之線性模型進行擬合。考慮到線性模型擬合，藉由標準誤差至通用值之經驗貝氏改良法計算中等t-統計。藉由控制錯誤發現率(FDR)之Benjamini Hochberg程式調整多項測試之p值。由於在免疫相關對比其他正常(非癌症)組織樣本中上調而排除一個基因(BIRC3)。纖維化 /SSc 19- 基因特徵 藉由文獻之先前知識及公開可得資料組之基因表現資訊，吾人組成由19個在SSc及肺纖維化中上調之非免疫相關基因所組成之真實纖維化/SSc特徵。表9顯示基因之完整列表。 19個基因之表現資料係經標準化(按照資料組)，即以平均值為中心並對樣本標準化。使用19個基因中之平均值作為各樣本之特徵得分。纖維化 /SSc TGF-β 上升 / 阿吐珠單抗下降 (TUAD)9- 基因特徵 吾人旨在選擇TGF-β上升/阿吐珠單抗下降特徵之基因作為19基因特徵之子集基因。因此，吾人進行以下實驗。由TGF-β補充正常人類肺成纖維細胞(NHLF)且與來自人類上皮H358肺細胞系之細胞共同培養。對於纖維化特徵之19個基因中的14個而言，吾人能夠得到表現信號。對於包括於TGF-β-上升/阿吐珠單抗-下降特徵(下文稱為TUAD特徵)中之基因而言，其在投與TGF-β後顯示上調(中值倍數變化，在3次重複實驗中)。使用此準則，吾人選出9個基因。此等9個基因構成吾人之9-基因TUAD特徵(參見表9，由*表示)。 另外，使9個基因之最終TUAD特徵經歷正常人類肺成纖維細胞(NHFL)實驗，其與人類H358細胞共同培養並經40 ng/ml及10 μg/ml之抗-HEL (雞蛋溶菌酶)或阿吐珠單抗處理(參見上文資料組之描述)。 吾人發現當與抗-HEL對照組比較時，9個基因(其先前發現由TGF-β上調)各可藉由阿吐珠單抗下調。因此，TUAD 9-基因特徵代表可藉由阿吐珠單抗下調之TGF-β可誘導纖維化特徵，由以下兩點證實：a)與抗-HEL相比，9-基因特徵中的所有基因在阿吐珠單抗處理後下調；及b)與抗-HEL相比，TUAD 9-基因特徵凈得分在阿吐珠單抗處理後下調。 包括在纖維化/SSc特徵中之19個基因的差異表現分析結果示於表10、表11及表12中，以比較SSc與正常皮膚，示於表13中以比較SSc-PF與正常肺，示於表14中以比較UIP/IPF與正常肺，示於表15中以比較早期IPF與正常肺，及示於表16中以比較晚期IPF與正常肺。 所有19個纖維化/SSc特徵基因均不在免疫相關對非免疫相關組織中上調(表17)。19- 基因纖維化 /SSc 及 9- 基因 TUAD 特徵之性能 雖然在不同資料組中單一基因如RGS5在SSc中與正常皮膚比較(圖9)及例如COL15A1、COL1A1、COMP、IGFBP2a及SSP1在IPF及SSc-PF中與正常肺比較(圖10至圖14a)顯示上調表現，但是衍生自19-基因纖維化/SSc特徵及9-基因TUAD特徵之特徵得分提供更穩健的用於監測皮膚(圖14b、圖15a、圖15b、圖16a及圖16b)、肺(圖17a、圖17b、圖18a及圖18b)、肝 (圖19a、圖19b、圖20a、圖20b、圖21a及圖21b)及骨髓(圖22a及圖22b)中之纖維化的信號。 對於無對照組織表現資料之食道及腎纖維化而言，包括於19-基因纖維化/SSc及9-基因TUAD特徵中之基因係經協調表現，由高於藉由1000次重複獲得之隨機期望相干性得分(Staub，2012)表示(表18)。 在肝樣本(GSE61260)中，19-基因纖維化/SSc及9-基因TUAD特徵之特徵得分與纖維化得分良好地相關(如在Hovarth等人，2014中所述)，其中Spearman相關係數各自為0.505及0.523(表19)。結論 因為吾人之TUAD多基因表現特徵可藉由經阿吐珠單抗處理而下調，且因為其與多種纖維化疾病中之疾病嚴重程度及/或纖維化度相關(如前述段落中所提及)，所以TUAD特徵可視為纖維化疾病中之高臨床需要的指標。TUAD特徵可用於阿吐珠單抗療法之患者選擇： TUAD特徵之高基線/處理前水平可用於選擇患者，對該等患者而言阿吐珠單抗具有達成治療成功之最高可能，因為吾人不僅證實高TUAD特徵狀態與纖維化疾病狀態相關，而且證實阿吐珠單抗可有效下調TUAD特徵。此外，TUAD特徵可用於監測纖維化，因為吾人已經證實與疾病嚴重程度相關，且因為已經證實之阿吐珠單抗使TUAD特徵下調的能力，因此其亦可用於監測阿吐珠單抗有效性。因為所提及之TUAD特徵充作預測療法反應之標記的能力，及因為與多種纖維化疾病中之疾病嚴重程度或纖維化之存在相關，吾人認為阿吐珠單抗係可用於對抗一般所有纖維化疾病之藥劑。表 格 表 8 在三個 SSc 資料組之至少一個中存在的在 SSc 及經 TGF 刺激之成纖維細胞中上調的基於文獻之基因列表 表 9 19- 基因 SSc/ 纖維化特徵及 9- 基因 TUAD 特徵 ( 由 * 標記之基因 ) 表 10 GSE45485 中比較 SSc 與正常皮膚樣本之 19 纖維化 /SSc 特徵基因之中等 t- 檢定的結果 logFC = log倍數變化(正常皮膚與SSc)表 11 GSE32413 中比較 SSc 與正常皮膚樣本之 19 纖維化 /SSc 特徵基因之中等 t- 檢定的結果 logFC = log倍數變化(正常皮膚與SSc)表 12 GSE9285 中比較 SSc 與正常皮膚樣本之 19 纖維化 /SSc 特徵基因之中等 t- 檢定的結果 logFC = log倍數變化(正常皮膚與SSc)，NA = 不可用(GSE9285中未量測ADRA2A)表 13 GSE48149 中比較 SSc-PF 與正常肺樣本之 19 纖維化 /SSc 特徵基因之中等 t- 檢定的結果 logFC = log倍數變化(正常肺與SSc-PF)表 14 GSE48149 中比較 UIP/IPF 與正常肺樣本之 19 纖維化 /SSc 特徵基因之中等 t- 檢定的結果 logFC = log倍數變化(正常肺與UIP/IPF)表 15 GSE24206 中比較早期 IPF 與正常肺樣本之 19 纖維化 /SSc 特徵基因之中等 t- 檢定的結果 logFC = log倍數變化(正常肺與早期IPF)表 16 GSE24206 中比較晚期 IPF 與正常肺樣本之 19 纖維化 /SSc 特徵基因之中等 t- 檢定的結果 logFC = log倍數變化(正常肺與晚期IPF)表 17 GSE1133 中比較免疫相關與非免疫 / 非癌症樣本之 19 纖維化 /SSc 特徵基因之中等 t- 檢定的結果 logFC = log倍數變化(非免疫相關與免疫相關樣本)表 18 各自資料組中在不同適應症中之 19 基因 SSc/ 纖維化特徵及 9- 基因 TUAD 特徵的相干性得分，其中隨機選取各自 19 個及 9 個基因計算得到最小及最大相干性得分 表 19 GSE61260 中 19- 基因 SSc/ 纖維化特徵及 9- 基因 TUAD 特徵之特徵得分與發炎、 NAS (NADLF 活性得分 ) 及纖維化得分之間的 Spearman 相關 性 書目 實例 5 ： I期研究臨床研究 啟動I期試驗來測定經DI17E6處理之CRPC患者的安全性、藥物動力學(及抗腫瘤活性)，包括對前列腺特異性抗原、循環腫瘤細胞(CTC)及軟組織及骨轉移之作用。所有患者在化學療法後均罹患進展性疾病。經由歷時1小時提供之250、500、1000或1500 mg DI17E6之iv-輸注來處理患者。 合格患者為18歲或更大且患有組織學或細胞學上所證明之前列腺癌，其證據為在先前化學療法後骨轉移。患者曾經歷雙側睪丸切除術或接受使用促性腺激素釋放激素促效劑或拮抗劑之持續雄激素剝奪療法且在登記前已經停止抗雄激素療法至少4週。要求患者處於穩定(即，至少3個月)持續雙膦酸酯療法或不經任何雙膦酸酯療法，其總血清睪固酮水平低於50 ng/dL。所有患者具有進行性疾病之證據，該進行性疾病定義為至少兩種前列腺特異性抗原(PSA)值以10%之最小增加高於個別最低點水平，各值在篩選前至少兩週進行測定；結節或內臟進展針對與PSA無關包含係足夠。此外，患者必須具有0至2之東部腫瘤協作組(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)得分、至少3個月之預期壽命及充足的血液、腎及肝功能。各研究中心之人體試驗委員會核准該研究程序，且所有患者皆提供書面知情同意書。 在此1期多中心開放標籤劑量遞增研究中，在第6週結束時之反應評定之前，對mCRPC患者以每兩週歷時1小時提供之250、500、1000或1500 mg之劑量投與三次靜脈輸注之EMD 525797。無進行性疾病證據的患者有資格接受進一步雙週劑量直到疾病進展或不可接受的毒性。在首個六週期間評估劑量限制性毒性(DLT)並在最後一次投與EMD 525797之後對患者之安全性進行為期四週之隨訪。在四個循序劑量群組中招募患者；在劑量群組內之6位患者中最後一位達到第6週結束時，安全性監測委員會測定後續劑量遞增。 招募二十六位年齡在43歲與80歲之間(中值年齡，66歲)的男性患者並使其等接受至少一次靜脈輸注之EMD 525797，其等構成安全性群體。所有患者均為高加索人起源。一般而言，人口特徵在四個劑量群組中係可相比較的(表1a)，其中從首次診斷之中值時間為5.2年(範圍，2至18年)及自診斷至首次轉移性疾病之中值時間為0.1年(範圍，0至16年)。兩位患者在DLT週期結束之前退出且隨後由在處理6週期間接受三劑量EMD 525797之24位患者取代。 表1a.患者基線人口(安全性群體)。 BMI，體重指數；   總結(表1b)： 來自此I期臨床試驗之臨床結果係在德國之3個位點及比利時之1個位點進行。治療持續時間 在第6週結束時之反應評定之前，24位患者(43至80歲)接受3次劑量(第1、3及5週)。在首個6週期間評估劑量限制性毒性(DLT)並在最後一次投與DI17E6之後對患者之安全性進行為期4週之隨訪。 表2a總結在各群組中之每個患者之藥物曝露。患者具有117.5天之平均EMD 525797曝露持續時間(中值，74.5天；範圍，14至534天)。24位患者中之十三位具有比預期更長之曝露時間(＞84天)，其中在500 mg群組中之兩位患者持續治療達297天及534天，及在1000 mg群組中之一位患者接受治療持續310天。在6週之DLT週期內未報導DLT。所有患者經歷至少一種TEAE且在TEAE中未觀察到劑量依賴性關係。 表2a：在各劑量群組中之每個患者的DI17E6曝露 + = 持續治療；* 退出患者(僅1次及2次輸注) 研究程序規定，個體將每隔一週接受至少3次劑量(250、500、1000 mg /每2週)之DI17E6。表2b：此表顯示治療持續時間之值(狀態：2010年8月)。劑量水平1：250 mg DI17E6；劑量水平2：500 mg DI17E6；劑量水平3：1000 mg DI17E6；及劑量水平4：1500 mg DI17E6。安全性 / 副作用 表3總結藥物相關TEAE。十一位患者(42.3%)經歷藥物相關TEAE，其最常報告於系統器官分類「皮膚及皮下組織病症」(總共4位患者；全身性搔癢、紅斑、疹)、「一般病症與投與部位病狀」(總共3位患者；疲勞、黏膜發炎、外周水腫)、「胃腸病症」(總共2位患者；口乾、舌腫脹、上胃腸道出血)及「感染與傳染」(總共2位患者；鼻炎、敗血病)中。僅有兩位患者(7.7%)患有藥物相關等級3或4之TEAE：一位500 mg群組中之患者經歷等級3之γ-麩胺醯基轉移酶(GGT)之增加及一位1000 mg群組中之患者經歷等級3之敗血病。 兩位患者經歷視為與治療相關之嚴重TEAE。此等TEAE為在一位250 mg群組中之患者的等級1之上胃腸道出血及一位1000 mg群組中之患者的等級3之敗血病。篩選時，後者患者具有持續診斷之尿路感染及敗血病之復發事件，其中最後一次事件視為與DI17E6 (EMD 525797)相關。四位患者死亡且研究者評估所有死亡不合理地與EMD 525797相關。 六位患者(23.1%)由於TEAE永久性中斷治療，包括4位250 mg群組中之患者(在第12天上胃腸道出血，在第53天肌無力，在第46天截癱及在第30天輸尿管梗阻)，及500 mg群組(在第534天等級3 GGT增加)及1500 mg群組(在第85天轉移至中樞神經系統)中各1位之患者。未報告投與部位皮膚反應。在8位患者中發生後基線血液學及生物化學毒性轉變至等級3或4。然而，在實驗室發現結果、生命徵兆或ECG記錄中不存在明顯傾向。總而言之，65.4%之患者與基線相比較在治療時具有相同最糟糕之ECOG性能狀態。 表3.藥物相關治療突發不良事件* (TEAE)。 * MedDRA主要系统器官分類。MedDRA較佳的Term 13.0版本。† 發生在首個6週 (劑量限制性毒性期間) 後之等級3。 所觀察到之副作用的實例： (i)一位62歲男性在第一次且僅輸注DI17E6 (250 mg)後13天經歷等級1之上胃腸道出血。該個體存在非嚴重吐血且係住院。胃鏡檢查顯示食道末端病灶。排除主動出血，使用奧美派唑(omeprazole)處理個體，且該事件解決。 (ii)一位79歲患者在DI17E6 (EMD 525797) (1000 mg)之最近一次輸注1天後及第一次輸注9週後由於糞腸球菌(e. faecalis )而發展出敗血病(等級2)。患者係住院且治癒後出院。一個月後，該患者在最近一次輸注4天後及第一次輸注2.5個月後再次由於糞腸球菌發展出第二次敗血病發作(等級3)。患者係住院且治癒後出院。又一個月後，該患者在最近一次輸注4天後及第一次輸注3.5個月後發展出第三次敗血病發作(等級3)，這歸因於EMD 525797。 總結： ■已經在所有4個SMC中評審累積安全性資料。 ■整體上未觀察到DLT：將DLT定義為直到第6週結束時發生之由研究者及/或試驗委託者懷疑與研究產品合理相關的任何等級3或4之血液學或非血液學毒性，除了在7天內可逆之無臨床相關的過敏性 (allergic/hypersensitivity)反應及任何範圍外實驗室值。 ■至今未達成MTD。 ■總而言之，僅觀察到2例SAE與研究藥物相關。藥物動力學及藥效動力學 在單劑量及多劑量後，EMD 525797顯示劑量依賴性非線性PK曲線。第一次1小時靜脈輸注後，DI17E6 (EMD 525797)之Cmax 通常在給藥開始後1至2小時內達成。由於EMD 525797清除率隨劑量而增加，所以消除半衰期隨劑量而增加，而平均分佈體積在劑量範圍內保持恆定 (表4)。 如下表4中所給出，投與群組2之CRPC患者500 mg/每2週達成IC95 之血清水平，而投與250 mg/每2週之群組1之患者不能達成。群組2 (500 mg/每2週)中之EMD 525797的血清低谷濃度係高於IC95 且達成非線性CL路徑之IC99 (250 mg/每2週不能達成)。 表4： AUCT' ，在一次完整給藥區間內之濃度-時間曲線下面積；Cmax' 最大血清濃度，Cmin' 低谷血清濃度；比率_AUC，曲線下相對面積[AUCT (劑量週期3)/AUCT (劑量週期1)]；比率_Cmax' ，相對最大血清濃度[Cmax (劑量週期3)/Cmax (劑量週期1)]；tmax' ，達成Cmax' 之時間；Vss' ，在穩定階段之表觀分佈體積。 在多劑量後，在1500 mg下，DI17E6 (EMD 525797)最大血清濃度及劑量依賴性累積之曝露各自高至1.33及1.70之最大值(給藥週期3/給藥週期1)。 在大多數患者中，CTC濃度在基線值附近保持穩定(資料未顯示)。在兩位患者中，在開始治療後約14天及42天時觀察到CTC濃度相當大地降低。 在25位可評估患者中有4位(16.0%)檢測到抗-EMD 525797抗體。所有四位患者係在250 mg群組中；兩位患者在兩週後復原至血清陰性狀態，一位患者未隨訪，及一位患者在整個研究期間保持血清陽性。
圖1   阿吐珠單抗阻斷在H358-成纖維細胞及Calu3-成纖維細胞共同培養物中之aSMA表現的升高 圖2   阿吐珠單抗阻斷在H358-成纖維細胞共同培養物中之FMT相關基因表現的升高 圖3   TGF-β增加人類肺成纖維細胞中之整合素的表現 圖4   TGF-β增加肺成纖維細胞中之aSMA、IL-6及其他成肌纖維細胞標記基因的表現 圖5   阿吐珠單抗處理成纖維細胞培養物減少TGF-β所誘導之aSMA及IL-6的增加 圖6   阿吐珠單抗處理減少TGFb所誘導之膠原蛋白凝膠收縮 圖7   與抗-HEL-AB MSB0011523H-1及10D5各自相比較，阿吐珠單抗對αvβ6 6結合至LAP之抑制作用 圖8   尋找纖維化/SSc特徵之策略 圖9   在GSE45485中SSc及正常皮膚的RGS5表現，以及比較RGS5在SSc與正常皮膚中之表現的中等t-檢定之各自結果 圖10 在GSE24206中早期IPF、晚期IPF及正常肺的COL15A1表現，以及分別比較COL15A1在早期IPF與健康肺及晚期IPF與健康肺中之表現的中等t-檢定之各自結果 圖11 在GSE24206中早期IPF、晚期IPF及正常肺的COL1A1表現，以及分別比較COL1A1在早期IPF與健康肺及晚期IPF與健康肺中之表現的中等t-檢定之各自結果 圖12 在GSE48149中IPAH (PPH)、IPF、SSc-PAH、SSc-PF及正常肺(NL)的COMP表現，以及分別比較COMP在早期IPF與健康肺及SSc-PF與健康肺中之表現的中等t-檢定之各自結果 圖13 在GSE48149中IPAH (PPH)、IPF、SSc-PAH、SSc-PF及正常肺(NL)的IGFBP2表現，以及分別比較IGFBP2在早期IPF與健康肺及SSc-PF與健康肺中之表現的中等t-檢定之各自結果 圖14a     在GSE48149中IPAH (PPH)、IPF、SSc-PAH、SSc-PF及正常肺(NL)的SSP1表現，以及分別比較SSP1在早期IPF與健康肺及SSc-PF與健康肺中之表現的中等t-檢定之各自結果 圖14b     在GSE45485中SSc及正常皮膚之19-基因纖維化/SSc特徵的特徵得分，以及比較SSc與正常皮膚中的19-基因特徵得分的單側t-檢定之結果 圖15a     在GSE32413中SSc及正常皮膚之19-基因纖維化/SSc特徵的特徵得分，以及比較SSc與正常皮膚中的19-基因特徵得分的單側t-檢定之結果 圖15b     在GSE32413中SSc及正常皮膚之9-基因TUAD特徵的特徵得分，以及比較SSc與正常皮膚中的9-基因特徵得分的單側t-檢定之結果 圖16a     在GSE9285中SSc及正常皮膚之19-基因纖維化/SSc特徵的特徵得分，以及比較SSc與正常皮膚中的19-基因特徵得分的單側t-檢定之結果 圖16b     在GSE9285中SSc及正常皮膚之9-基因TUAD特徵的特徵得分，以及比較SSc與正常皮膚中的9-基因特徵得分的單側t-檢定之結果 圖17a     在GSE24206中早期IPF、晚期IPF及健康肺之19-基因纖維化/SSc特徵的特徵得分，以及分別比較早期IPF與正常肺及晚期IPF與正常肺中的19-基因特徵得分的單側t-檢定之結果 圖17b     在GSE24206中早期IPF、晚期IPF及健康肺之9-基因TUAD特徵的特徵得分，以及分別比較早期IPF與正常肺及晚期IPF與正常肺中的9-基因特徵得分的單側t-檢定之結果 圖18a     在GSE48149中IPAH (PPH)、IPF、SSc-PAH、SSc-PF及正常肺(NL)之19-基因纖維化/SSc特徵的特徵得分，以及分別比較IPF與正常肺及SSc-PF與正常肺中的19-基因特徵得分的單側t-檢定之結果 圖18b     在GSE48149中IPAH (PPH)、IPF、SSc-PAH、SSc-PF及正常肺之9-基因TUAD特徵的特徵得分，以及分別比較IPF與正常肺及SSc-PF與正常肺中的9-基因特徵得分的單側t-檢定之結果 圖19a     在GSE48452中Nash、脂肪變性、健康肥胖及正常肝之19-基因SSc/纖維化特徵的特徵得分，以及分別比較Nash、脂肪變性及健康肥胖與對照肝組織的19-基因特徵得分的單側t-檢定之結果 圖19b     在GSE48452中Nash、脂肪變性、健康肥胖及正常肝之9-基因TUAD特徵的特徵得分，以及分別比較Nash、脂肪變性及健康肥胖與對照肝組織的9-基因特徵得分的單側t-檢定之結果 圖20a     在GSE49541中之19-基因SSc/纖維化特徵輕度及晚期肝纖維化的特徵得分，以及單側t-檢定之結果 圖20b     在GSE49541中之9-基因TUAD特徵輕度及晚期肝纖維化的特徵得分，以及單側t-檢定之結果 圖21a     在GSE61260中Nash (非酒精性脂肪變性肝炎)、PBC (原發性膽汁性膽管炎)、NAFLD (非酒精性脂肪肝病)、健康肥胖及正常肝之19-基因纖維化/SSc特徵的特徵得分，以及分別比較Nash、PSC、PBC及NAFLD與對照肝組織的19-基因特徵得分的單側t-檢定之結果 圖21b     在GSE61260中Nash (非酒精性脂肪變性肝炎)、PSC (原發性硬化性膽管炎)、PBC (原發性膽汁性膽管炎)、NAFLD (非酒精性脂肪肝病)、健康肥胖及正常肝之9-基因TUAD特徵的特徵得分，以及分別比較Nash、PSC、PBC及NAFLD與對照肝組織的9-基因特徵得分的單側t-檢定之結果 圖22a     在GSE44426中原發性骨髓纖維化及正常骨髓之19-基因SSc/纖維化特徵的特徵得分，以及單側t-檢定之結果 圖22b     在GSE44426中原發性骨髓纖維化及正常骨髓之9-基因TUAD特徵的特徵得分，以及單側t-檢定之結果

Claims (43)

  1. 一種抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其用於治療罹患纖維化及/或纖維化病症之患者。
  2. 如請求項1所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該等纖維化及/或纖維化病症所影響之器官係選自由肺、肝、腎、心血管系統或皮膚組成之群。
  3. 如請求項2所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該纖維化病症影響一或多個選自由肺、肝、腎、心臟及皮膚組成之群的器官。
  4. 如請求項2及/或3所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該纖維化病症包括或係全身性硬化症(SSc)。
  5. 一種抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其用於治療罹患全身性硬化症(SSc)之患者。
  6. 如請求項4及/或5所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該全身性硬化症包括肺、肝、腎、心血管系統或皮膚之全身性硬化症。
  7. 5及/或6所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該全身性硬化症影響一或多個選自由肺、肝、腎、心臟及皮膚組成之群的器官。
  8. 如請求項4所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該全身性硬化症影響心血管系統、血管及/或血液。
  9. 如請求項1至8中任一項所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該纖維化病症及/或該全身性硬化症包括一或多種選自由以下組成之群的適應症：特發性肺纖維化、原發性硬化性膽管炎、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、原發性局灶性腎小球硬化、原發性節段性腎小球硬化、糖尿病性腎病、舒張功能障礙及骨髓纖維化。
  10. 如請求項1至5中任一項所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該纖維化病症及/或全身性硬化症包括肺纖維化及/或肺泡炎(間質性肺病，ILD)。
  11. 如請求項1所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該待治療之疾病為肺及/或皮膚之全身性硬化症。
  12. 如請求項11所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該皮膚之全身性硬化症為瀰漫性皮膚全身性硬化症(dcSSc)或局限性皮膚全身性硬化症(lcSSc)。
  13. 一種抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其用於治療肺纖維化、肺泡炎(間質性肺病，ILD)及/或硬皮病性間質性肺病(SSc-ILD)。
  14. 如請求項1至13中任一項所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該治療包括投與一劑量，較佳為有效劑量之該抗體或其生物活性變異體或修飾，投與量為500 mg至3000 mg/月。
  15. 如請求項1至14中任一項所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該治療包括投與一劑量，較佳為有效劑量之該抗體或其生物活性變異體或修飾，投與量為1000 mg至2000 mg/月。
  16. 如請求項14及/或15所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該劑量，較佳為有效劑量係呈單次劑量進行投與。
  17. 如請求項1至15中任一項之所使用抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該治療包括投與該抗體或其生物活性變異體或修飾，投與量為約500 mg/月、約1000 mg/月、約1500 mg/月、約2000 mg/月或約2500 mg/月。
  18. 如請求項17所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該量係呈單次劑量進行投與。
  19. 如請求項1至18中任一項所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該抗體或該其生物活性變異體或修飾係作為單一療法進行投與。
  20. 如請求項1至19中任一項所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該生物活性變異體或修飾包括DI17E6之CDR區及重鏈及輕鏈可變區，該等可變區與DI17E6之可變區相比較，在胺基酸序列上有至少80%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少98%相同或至少99%相同。
  21. 如請求項20所使用之DI17E6抗體，其包括在重鏈架構區內之一或多種修飾 FR1：QVQLQQSG A ELA E PGASVK M SCKASGYTFS (SEQ ID No. 16) FR2：WV K Q R PGQGLEWIG (SEQ ID No. 17) FR3：KATMT A DTS S STAYM Q LS G L T SED S AVYYCAS (SEQ ID No. 18) FR4：WGQGT S VTVSS (SEQ ID No. 19)， 其中加粗及下劃線位置之一或多者係經突變且與原始各自序列相比較係不同的。
  22. 如請求項1至21中任一項所使用之DI17E6抗體，其中該生物活性變異體或修飾包括恆定區，其與DI17E6之恆定區相比較，在胺基酸序列上有至少80%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同、至少99.5%相同或至少99.9%相同。
  23. 如請求項22所使用之DI17E6抗體，其改包括人類IgG1恆定區代替人類IgG2，或改包括人類IgG2鉸鏈區代替人類IgG1鉸鏈。
  24. 如請求項1至23中任一項所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該抗體係以與MMF (黴酚酸酯)組合之組合療法設定進行投與。
  25. 如請求項24所使用之抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾，其中該病症為全身性硬化症(SSc)或硬皮病-ILD(SSc-ILD)。
  26. 一種纖維化基因特徵，其包括選自由以下組成之群的兩種或更多種基因：COL15A1 (NM_001855)、COL1A1 (NM_000088)、COMP (NM_000095)、RGS5 (NM_003617)、COL10A1 (NM_000493)、COL5A1 (NM_000093)、IGFBP2 (NM_000597)、NM_005576、MOXD1 (NM_015529)、ADRA2A (NM_000681)、COL5A2 (NM_000393)、MMP10 (NM_002425)、TNFRSF21 (NM_014452)、ITGA7 (NM_002206)、TGF-β3 (NM_003239)、MMP11 (NM_005940)、SPP1 (NM_000582)、CCL2 (NM_002982)及TNC (NM_002160)。
  27. 一種纖維化基因特徵，其包括以下基因：COL15A1 (NM_001855)、COL1A1 (NM_000088)、COMP (NM_000095)、RGS5 (NM_003617)、COL10A1 (NM_000493)、COL5A1 (NM_000093)、IGFBP2 (NM_000597)、NM_005576、MOXD1 (NM_015529)、ADRA2A (NM_000681)、COL5A2 (NM_000393)、MMP10 (NM_002425)、TNFRSF21 (NM_014452)、ITGA7 (NM_002206)、TGF-β3 (NM_003239)、MMP11 (NM_005940)、SPP1 (NM_000582)、CCL2 (NM_002982)及TNC (NM_002160)。
  28. 一種藉由投與抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾來治療個體之纖維化及/或纖維化疾病的方法，其中該個體之特徵為如請求項26及/或27之基因特徵。
  29. 一種藉由投與抗-αv整合素抗體DI17E6或其生物活性變異體或修飾來治療個體之纖維化及/或纖維化疾病的方法，其中該個體之特徵為由包括2個或更多個，較佳5個或更多個，更佳9個或更多個，甚至更佳15個或更多個且尤其16、17、18或19個選自以下基因所組成之群中之基因之多基因特徵所計算之高於閥值之得分：COL15A1 (NM_001855)、COL1A1 (NM_000088)、COMP (NM_000095)、RGS5 (NM_003617)、COL10A1 (NM_000493)、COL5A1 (NM_000093)、IGFBP2 (NM_000597)、NM_005576、MOXD1 (NM_015529)、ADRA2A (NM_000681)、COL5A2 (NM_000393)、MMP10 (NM_002425)、TNFRSF21 (NM_014452)、ITGA7 (NM_002206)、TGF-β3 (NM_003239)、 MMP11 (NM_005940)、SPP1 (NM_000582)、CCL2 (NM_002982)及TNC (NM_002160)，特定言之為基於基因COL15A1 (NM_001855)、COL1A1 (NM_000088)、COMP (NM_000095)、COL10A1 (NM_000493)、COL5A1 (NM_000093)、COL5A2 (NM_000393)、ITGA7 (NM_002206)、MMP11 (NM_005940)及TNC (NM_002160)之9個基因特徵，下文亦稱為TUAD特徵。
  30. 一種藉由追蹤由包括2個或更多個，較佳5個或更多個，更佳9個或更多個，甚至更佳15個或更多個且尤其16、17、18或19個選自以下基因所組成之群中之基因之多基因特徵所計算得分的改變來監測個體之纖維化疾病中纖維化之嚴重程度及/或在可能發展出纖維化之疾病中纖維化之出現的方法：COL15A1 (NM_001855)、COL1A1 (NM_000088)、COMP (NM_000095)、RGS5 (NM_003617)、COL10A1 (NM_000493)、COL5A1 (NM_000093)、IGFBP2 (NM_000597)、NM_005576、MOXD1 (NM_015529)、ADRA2A (NM_000681)、COL5A2 (NM_000393)、MMP10 (NM_002425)、TNFRSF21 (NM_014452)、ITGA7 (NM_002206)、TGF-β3 (NM_003239)、MMP11 (NM_005940)、SPP1 (NM_000582)、CCL2 (NM_002982)及TNC (NM_002160)，特定言之為基於基因COL15A1 (NM_001855)、COL1A1 (NM_000088)、COMP (NM_000095)、COL10A1 (NM_000493)、COL5A1 (NM_000093)、COL5A2 (NM_000393)、ITGA7 (NM_002206)、MMP11 (NM_005940)及TNC (NM_002160)之9-基因特徵，下文亦稱為TUAD特徵。
  31. 如請求項26、27、28、29及/或30中一項或多項之方法，其中該纖維化及/或纖維化病症係如請求項1至13中之一或多項中所定義。
  32. 如請求項26至31中一項或多項之方法，其中該等患者亦接受黴酚酸酯(mycophenolate)。
  33. 如請求項26至32中一項或多項之方法，其中該抗-αv整合素抗體DI17E6為阿吐珠單抗(abituzumab)。
  34. 如前述請求項中一項或多項之DI17E6抗體，其中該等患者亦接受黴酚酸酯。
  35. 如前述請求項中一項或多項之DI17E6抗體，其中該病症為SSc-ILD及/或該等患者亦接受黴酚酸酯。
  36. 如前述請求項中一項或多項之DI17E6抗體，其中該抗體為阿吐珠單抗。
  37. 一種如請求項20至23中一項或多項之DI17E6或其生物活性變異體或修飾，較佳為其生物活性變異體或修飾之用途，其用於製造用於預防及/或治療纖維化及/或纖維化病症之藥劑。
  38. 如請求項37之用途，其中該藥劑係用於治療如請求項1至36中一項或多項之纖維化及/或纖維化病症。
  39. 如請求項36及/或37之用途，其中該DI17E6抗體為阿吐珠單抗。
  40. 如請求項36、37、38及/或39之用途，其中該DI17E6抗體為阿吐珠單抗且其中該纖維化病症及/或該全身性硬化症包括一或多種選自由以下組成之群的適應症：特發性肺纖維化、原發性硬化性膽管炎、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、原發性局灶性腎小球硬化、原發性節段性腎小球硬化、糖尿病性腎病、舒張功能障礙及骨髓纖維化。
  41. 如請求項36、37、38、39及/或40之用途，其中該DI17E6抗體為阿吐珠單抗且其中該纖維化病症及/或該全身性硬化症包括肺纖維化、肺泡炎(間質性肺病，ILD)及/或硬皮病性間質性肺病(SSc-ILD)。
  42. 如請求項36、37、38、39、40及/或41之用途，其中該DI17E6抗體為阿吐珠單抗且其中該纖維化病症及/或該全身性硬化症包括局灶性節段性腎小球硬化(FSGS)。
  43. 如請求項36、37、38、39、40、41及/或42之用途，其中該治療另外包括投與一或多種選自由黴酚酸、黴酚酸酯、黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)、黴酚酸鈉、甲胺喋呤(methotrexate)、胺甲喋呤(amethopterin)及普賴松(prednisone)組成之群的活性成分。
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