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TW201717998A - 新穎胰島素衍生物及其醫學用途 - Google Patents

新穎胰島素衍生物及其醫學用途 Download PDF

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TW201717998A
TW201717998A TW105127056A TW105127056A TW201717998A TW 201717998 A TW201717998 A TW 201717998A TW 105127056 A TW105127056 A TW 105127056A TW 105127056 A TW105127056 A TW 105127056A TW 201717998 A TW201717998 A TW 201717998A
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彼得 麥德森
安東尼 梅瑞
馬汀 曼恩尼爾
克勞迪亞 理奇 裘琳恩加德
蘇珊娜 胡斯特普
汀 格蘭德夫
瑪西爾斯 諾曼恩
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諾佛 儂迪克股份有限公司
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Abstract

本發明係屬於用於與糖尿病有關的醫學病況的藥物之治療領域。更具體言之，本發明係關於新穎的人類胰島素類似物之經醯化衍生物。本發明亦提供包含如此胰島素衍生物的醫藥組成物，且係關於如此衍生物於治療或預防與糖尿病有關的醫學病況的用途。

Description

新穎胰島素衍生物及其醫學用途
本發明係屬於用於與糖尿病有關的醫學病況的藥物的治療領域。更具體言之，本發明係關於新穎的人類胰島素類似物之經醯化衍生物。本發明亦提供包含如此經衍生化胰島素類似物的醫藥組成物，且係關於如此衍生物於治療或預防與糖尿病有關的醫學病況的用途。
用於治療糖尿病的胰島素療法已使用幾十年了。胰島素療法通常涉及每日投予數次胰島素之注射。如此療法通常涉及投予每日一次或兩次的長時間作用性基礎注射，與於進餐時間的快速作用性胰島素之注射(即餐中(prandial)使用)。於胰島素療法中的關鍵改善之一係快速作用性胰島素類似物之導入。然而，即使使用快速作用性胰島素類似物，尖峰胰島素水平典型在注射後50至70分鐘後才會發生。
因此胰島素注射並不複製胰島素之天然時間-作用輪廓。特別是，於無糖尿病的人類中的第一期胰島素釋放之天然尖峰會造成血液胰島素水平在來自膳食的葡萄糖進入血液中後數分鐘內上升。相反地，注射的胰島素僅緩緩地進入血液，而尖峰胰島素水平在注射普通人類胰島素後 80至100分鐘內發生。
因為快速作用性胰島素類似物並不充分地模擬第一期胰島素釋放，使用胰島素療法的糖尿病患者持續具有在膳食開始時存在的不適當胰島素水平，以及於兩餐間存在的過多胰島素。此於胰島素遞送的延遲可會造成於膳食開始後早期的高糖血症。
胰島素具有自我聯結特性，且其濃度扮演了自我聯結之主要因子。於高濃度(特別是於醫藥調配物中)，胰島素會自我聯結成二聚體、六聚體、十二聚體、與結晶體。然而，胰島素之生理活性形式係單體，其與胰島素受體結合並觸發生物反應。
胰島素作用多快取決於胰島素多快自皮下組織被吸收。當普通的人類胰島素被皮下地注射時，調配物主要由含有兩個鋅離子的六聚體構成。由於其尺寸，六聚體胰島素具有較低的擴散速率，且因此其吸收速率比較小的物種之吸收速率慢。
在六聚體內，有兩個鋅原子，其等穩定化該分子對抗化學與物理降解。於注射後，濃度驅動性動態平衡在皮下組織中發生，造成六聚體分離成二聚體，且然後分離成單體。歷史上，此等普通人類胰島素調配物需要大約120分鐘才達到最大血漿濃度水平。鋅-胰島素製劑(其相較於普通人類胰島素被吸收更快)已被商業化，例如胰島素aspart與胰島素lispro。
無鋅胰島素調配物可使更快的皮下吸收成為可能，但對於胰島素，大體而言，無鋅調配物之化學與物理穩定性係一個挑戰。
種種胰島素衍生物已被建議用於不同的用途： WO 1998 042749描述用於肺部投予的無鋅胰島素結晶體。
US 6960561描述具有改善的穩定性的無鋅與低鋅胰島素製劑。
WO 2007/096431描述某種人類胰島素衍生物(包括類似物)，其(除其他外)於位置A22持有經醯化離胺酸殘基，於位置B29持有精胺酸殘基，且為desB30，該衍生物可於生理pH值下溶解且具有延長的作用之輪廓，且係意欲用作為長時間作用性胰島素。
WO 2009/022013描述某種經醯化胰島素類似物(包括類似物)，其(除其他外)於位置A22持有經醯化離胺酸殘基，於位置B29持有精胺酸殘基，且為desB30，具有較高的胰島素受體結合親和力，且係意欲用作為長時間作用性胰島素。
WO 2009/112583描述某種胰島素類似物(包括類似物)，其於位置A22持有離胺酸殘基，於位置B29持有精胺酸殘基，且為desB30，其展現改善的蛋白酶穩定性。
WO 2011/161124描述某種含有額外的二硫鍵以改善穩定性的經醯化胰島素類似物(包括類似物)，其(除其他外)於位置A22持有離胺酸殘基，於位置B29持有精胺酸殘基，且為desB30。
WO 2012/171994描述某種包含二或更多個取代的胰島素衍生物(包括類似物)，其(除其他外)於位置A22持有經醯化離胺酸殘基，於位置B29持有精胺酸殘基，且為desB30，以延長活體內活性。
WO 2013 063572描述經超濃縮快速作用性胰島素類似物調配物，其視需要不含鋅。
此外，具有白蛋白結合部分的胜肽與蛋白質之醯化已被用於延長該等胜肽與蛋白質之作用之持續時間。
然而，根據本發明的胰島素衍生物尚未被報導過，且其等作為用於餐中使用的快速作用胰島素衍生物之用途未曾被建議過。
本發明之目標
本發明之目標之一係提供在皮下投予後具有餐中輪廓的胰島素類似物。
本發明之另一個目標係提供於調配物中化學穩定的胰島素類似物。
本發明之第三個目標係提供未加鋅而於調配物中化學穩定的胰島素類似物。
本發明之第四個目標係提供於調配物中物理穩定的胰島素類似物。
本發明之第五個目標係提供未加鋅而於調配物中物理穩定的胰島素類似物。
本發明之第六個目標係提供於調配物中化學與物理穩定的胰島素類似物。
本發明之第七個目標係提供未加鋅而於調配物中化學與物理穩定的胰島素類似物。
本發明之第八個目標係提供在皮下投予後相較於目前市售 的餐中胰島素為肝臟優先的胰島素類似物。
本發明之第九個目標係提供在皮下投予後相較於目前市售的餐中胰島素為肝臟選擇性的胰島素類似物。
本發明之第十個目標係提供在餐中皮下投予後相較於目前市售的餐中胰島素較不傾向誘發低血糖的胰島素類似物。
本發明之第十一個目標係提供在餐中皮下投予後相較於目前市售的餐中胰島素較不傾向誘發獲重的胰島素類似物。
本發明之第十二個目標係提供在餐中皮下投予後相較於目前市售的餐中胰島素較不傾向誘發低血糖與獲重的胰島素類似物。
本發明之第十三個目標係提供在皮下投予後相較於目前市售的餐中胰島素於肌肉及/或脂肪組織中作用較小的胰島素類似物。
本發明之其他目標係關於以上提及的目標之一或多者之組合，且特別是提供在皮下投予後顯示餐中輪廓且同時於調配物中(且特別是於未加鋅的調配物中)係化學穩定的胰島素類似物。
本發明之概要
吾人已發現到本發明之A22K經醯化胰島素衍生物相較於先前技術之類似的胰島素衍生物具有顯著改善的特性。吾人已特別發現到本發明之胰島素衍生物，於不含外加的鋅離子的調配物中，且當與與先前技術之類似的衍生物比較時，係與分子聚集體之較小的尺寸聯結。已知較小的物種相較於較大的物種擴散更快，且因此被預期會更快被吸收。此等分子聚集體之尺寸可例如如本文中描述的藉由如於實施例章節中描述的小 角度X光散射(SAXS)測量。
吾人亦已發現到本發明之胰島素衍生物，相較於先前技術之類似的衍生物，於不含外加的鋅離子的調配物中，在皮下投予至豬及/或大鼠後被更快速地吸收，從而展示作為用於餐中使用的胰島素的潛在臨床用途。吾人已發現到本發明之胰島素衍生物，相較於先前技術之類似的衍生物，於不含外加的鋅離子的調配物中在皮下投予至豬後係與較少的「曳尾(tailing)」聯結。所謂較少的曳尾意謂所注射的胰島素之皮下積存被更快速地吸收(相較於先前技術之類似的類似物)，使得本發明之胰島素衍生物在皮下投予後的平均滯留時間(MRT)更短(當與先前技術之類似的經醯化衍生物比較時)。
無鋅調配物使更快的皮下吸收成為可能，但對於胰島素，大體而言，無鋅調配物之化學與物理穩定性係一個挑戰，且直到現在僅被顯示在使用胰島素glulisine(Apidra®；B3K，B29E人類胰島素)與僅在表面活性劑之存在下為可能的(當配於小瓶中時)。
吾人現已發現到非常未被預期地且無前例地，本發明之A22K經醯化胰島素衍生物(其具有於位置B3的取代)於無添加的鋅離子且無添加的表面活性劑的調配物中係化學與物理都穩定的。
胰島素在皮下投予後的吸收速率在很大的程度上與擴散速率有關。因此，較小的物種相較於較大的物種具有較快的擴散速率且伴隨的較快吸收速率。
含有鋅的胰島素製劑相較於無鋅調配物被更慢地吸收，而此係因為調配物之鋅-六聚體在吸收可發生前必須分離成二聚體及/或單體。
胰島素調配物之化學與物理穩定性需要鋅之存在，而鋅之缺乏對於快速吸收而言是需要的。本發明提供了此問題之一個解答。
由於胰島素在調配物中必須穩定以在臨床上有用，本發明之胰島素之特性(其在無鋅調配物中是穩定的)會造成比先前技術之胰島素之藥動學與藥效學特性優越的藥動學與藥效學特性。此係因為先前技術之胰島素必須以鋅離子調配以在調配物中穩定。關於藥動學與藥效學特性的適當比較因此係比較穩定調配物，且因此係比較本發明之胰島素之穩定的無鋅調配物與先前技術之胰島素之含鋅調配物。
使用經醯化胰島素衍生物作為餐中胰島素療法的優點之一係達到較高的血漿胰島素濃度(相較於該等由使用未經醯化的餐中胰島素(例如胰島素aspaut、胰島素lispro或胰島素glulisine)的治療所達到者)。
根據本發明的A22K經醯化胰島素衍生物在皮下投予後具有類餐中時間-作用輪廓。
根據本發明的具有基於十四烷二酸、十五烷二酸、或十六烷二酸的白蛋白結合子的A22K經醯化胰島素衍生物已顯示會賦予非常高的胰島素受體結合親和力，其為在1.5%人類血清白蛋白(HAS)之存在下會減低的親和力。
根據本發明的A22K經醯化胰島素衍生物於生理的鹽濃度下溶解度不會減少。
因此，於其第一個方面，本發明提供人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys,B3aar1]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且 位於位置B26、B27及/或B28的胺基酸殘基之一、二或三者如下被取代：位於位置B26的胺基酸殘基被取代成Glu(E)或Asp(D)；及/或位於位置B27的胺基酸殘基被取代成Glu(E)、Asp(D)、或Pro(P)；及/或位於位置B28的胺基酸殘基被取代成Glu(E)、Asp(D)或Arg(R)；然而其先決條件為；若位於位置B27的胺基酸殘基被取代成Pro(P)；則位於位置B28的胺基酸殘基被取代成Glu(E)、Asp(D)或Arg(R)；與若位於位置B28的胺基酸殘基未經取代，則位於位置B29的胺基酸殘基被取代成B29Arg(R)，或若位於位置B28的胺基酸殘基被取代成Glu(E)或Asp(D)，則位於位置B29的胺基酸殘基被取代成B29Pro(P)或B29Arg(R)，與若位於位置B29的胺基酸殘基為Pro(P)，則位於位置B30的胺基酸殘基被取代成B30Arg(R)；與若位於位置B28的胺基酸殘基被取代成Arg(R)，則位於位置B29與B30的胺基酸殘基已被刪除(即desB29、desB30)；與若位於位置B29的胺基酸殘基被取代成Arg(R)，則位於位置B30的胺基酸殘基已被刪除(即desB30)；與該類似物可另外包含A8Arg(R)及/或A14Glu(E)取代；與該胰島素類似物係藉由位於A22位置的離胺酸殘基之ε胺基基團以式II之基團醯化衍生而來[醯基]-[連接子]- 其中該連接子基團係由選自gGlu及/或OEG的1至10個胺基酸殘基構成的胺基酸鏈；其中gGlu代表γ麩胺酸殘基；OEG代表8-胺基-3,6-二氧辛酸之殘基(即式-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-的基團)；該等胺基酸殘基可以任何順序出現；與該胺基酸鏈包含至少一個gGlu殘基；與其中該醯基基團係選自1,14-十四烷二酸；1,15-十五烷二酸；與1,16-十六烷二酸的α,ω-二-羧酸之殘基。
在另一個方面，本發明提供包含本發明之胰島素衍生物、與一或多種醫藥上可接受的賦形劑的醫藥組成物。
在一個進一步的方面，本發明係關於本發明之胰島素衍生物作為醫藥品的用途。
在又進一步的方面，本發明提供用於治療、預防或減輕與以下者有關的疾病、疾患或病況的方法：糖尿病、第1型糖尿病、第2型糖尿病、受損的葡萄糖耐受性、高糖血症、異常血脂症、肥胖、代謝症候群(代謝症候群X、胰島素抗性症候群)、高血壓、認知疾患、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風、心血管疾患、冠心病、發炎性腸症候群、消化不良、或胃潰瘍，該方法包含將治療有效量的本發明之胰島素衍生物投予至需要其的接受者。
本發明之其他目標對於所屬技術領域中具有通常知識者而言基於以下實施方式與實施例會是明顯的。
本發明藉由參照所附圖式進一步闡明，其中：圖1A、1B與1C顯示當於本文中描述的「ThT微纖維生成分析」測量時的微纖維生成程序之概要圖解；圖2A與2B分別顯示在皮下注射至史-道二氏大鼠(Sprague Dawley rat)後本發明之基於C14的類似物(分別為實施例11與12、及實施例4與10)之PK輪廓、與先前技術之基於C14的類似物(先前技術類似物2與3、及先前技術類似物2與3)之PK輪廓；圖2C顯示在皮下注射至史-道二氏大鼠後本發明之基於C16的類似物(實施例33)之PK輪廓、與先前技術之基於C16的類似物(先前技術類似物1)之PK輪廓；圖2D1(0-180分鐘)、2D2(0-30分鐘)、2E1(0-180分鐘)與2E2(0-30分鐘)顯示在皮下注射至史-道二氏大鼠後本發明之基於C14二酸的類似物之PD輪廓與先前技術之基於C14二酸的類似物之PD輪廓(得自圖2A與2B中顯示的PK輪廓)；圖2F1(0-180分鐘)與2F2(0-60分鐘)顯示在皮下注射至史-道二氏大鼠後本發明之基於C16二酸的類似物之PD輪廓與先前技術之基於C16二酸的類似物之PD輪廓(得自圖2C中顯示的PK輪廓)；圖3A與3B分別顯示在皮下注射至LYD豬後先前技術之胰島素衍生物(先前技術類似物1，即A22K(N(eps)-十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B29R,desB30人類胰島素，WO 2009/022013，實施例45)(以每6個胰島素 分子0個鋅調配)(1nmol/kg)之PK(藥動學)輪廓(胰島素濃度vs.時間)以及所導致的血漿葡萄糖之改變(1nmol/kg)；圖4A與4B顯示在皮下注射至LYD豬後先前技術類似物2(先前技術之代表性胰島素衍生物之C14二酸類似物，即A22K(N(eps)-十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B29R,desB30人類胰島素，WO 2009/022013，實施例45，先前技術類似物1)(以每6個胰島素分子0個鋅調配)(72nmol/動物)之PK(藥動學)輪廓(胰島素濃度vs.時間)、以及所導致的血漿葡萄糖之改變(72nmol/動物)；圖5A與5B分別顯示在皮下注射至LYD豬後實施例12之胰島素衍生物(即A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素)(以每6個胰島素分子0個鋅調配)之PK(藥動學)輪廓(胰島素濃度vs.時間)(1nmol/kg)、以及所導致的血漿葡萄糖之改變(1nmol/kg)；圖6A與6B分別顯示在皮下注射至LYD豬後實施例1之胰島素衍生物(即A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素)(以每6個胰島素分子0個鋅調配)之PK(藥動學)輪廓(胰島素濃度vs.時間)(1nmol/kg)、以及所導致的血漿葡萄糖之改變(1nmol/kg)；圖7A與7B分別顯示在皮下注射至LYD豬後實施例7之胰島素衍生物(即A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素)(以每6個胰島素分子0個鋅調配)之PK(藥動學)輪廓(胰島素濃度vs.時間)(1nmol/kg)、以及所導致的血漿葡萄糖之改變 (1nmol/kg)；與圖8A與8B分別顯示在皮下注射至LYD豬後實施例10之胰島素衍生物(即A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素)(以每6個胰島素分子0個鋅調配)之PK(藥動學)輪廓(胰島素濃度vs.時間)(1nmol/kg)、以及所導致的血漿葡萄糖之改變(1nmol/kg)。
胰島素衍生物
於其第一方面，本發明提供新穎胰島素衍生物，該胰島素衍生物係人類胰島素之經醯化類似物。
本發明之胰島素衍生物特別可被界定成一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys,B3aar1]；與其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；與位於位置B26、B27及/或B28的胺基酸殘基之一、二或三者係如下取代：位於位置B26的胺基酸殘基(即Tyr)被取代成Glu(E)或Asp(D)；及/或位於位置B27的胺基酸殘基(即Thr)被取代成Glu(E)、Asp(D)、或Pro(P)；及/或位於位置B28的胺基酸殘基(即Pro)被取代成Glu(E)、Asp(D)或Arg(R)；然而其先決條件為；若位於位置B27的胺基酸殘基(即Thr)被取代成Pro(P)；則位於位置B28 的胺基酸殘基(即Pro)被取代成Glu(E)、Asp(D)或Arg(R)；與若位於位置B28的胺基酸殘基(即Pro)未經取代，則位於位置B29的胺基酸殘基被取代成B29Arg(R)、或若位於位置B28的胺基酸殘基(即Pro)被取代成Glu(E)或Asp(D)，則位於位置B29的胺基酸殘基(即Lys)被取代成B29Pro(P)或B29Arg(R)，與若位於位置B29的胺基酸殘基(即Lys)係Pro(P)，則位於位置B30的胺基酸殘基(即Thr)被取代成B30Arg(R)；與若位於位置B28的胺基酸殘基(即Pro)被取代成Arg(R)，則位於位置B29與B30的胺基酸殘基(即Lys與Thr)已被刪除(即desB29,desB30)；與若位於位置B29的胺基酸殘基(即Lys)被取代成Arg(R)，則位於位置B30的胺基酸殘基(即Thr)已被刪除(即desB30)；與該類似物可另外包含A8Arg(R)及/或A14Glu(E)取代；與該胰島素類似物係藉由位於A22位置的離胺酸殘基之ε胺基基團以式II之基團醯化衍生而來[醯基]-[連接子]-其中該連接子基團係由選自gGlu及/或OEG的1至10個胺基酸殘基構成的胺基酸鏈；其中gGlu代表γ麩胺酸殘基；OEG代表8-胺基-3,6-二氧辛酸之殘基(即式-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-的基團)；該等胺基酸殘基可以任何順序出現；與 該胺基酸鏈包含至少一個gGlu殘基；與其中該醯基基團係選自1,14-十四烷二酸；1,15-十五烷二酸；與1,16-十六烷二酸的α,ω-二-羧酸之殘基。
本發明之較佳特徵
本發明之人類胰島素之經醯化類似物可藉由參照以下條款之一或多者來進一步界定特徵：
1.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；與位於位置B26、B27及/或B28的胺基酸殘基之一、二或三者係以Glu(E)或Asp(D)取代。
2.一種本發明之經醯化類似物，其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Gly(G)、Ser(S)或Thr(T)。
3.一種本發明之經醯化類似物，其中aar1代表Glu(E)或Gln(Q)。
4.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
5.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)或Gln(Q)；且aar2代表Glu(E)。
6.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)；且aar2代表Glu(E)。
7.根據條款4的經醯化類似物，其中該[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B29Arg；desB30]類似物係A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-4xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-6xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu-2xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B26E,B29R,desB30人類胰島素。
8.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
9.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)； 且aar3代表Glu(E)。
10.根據條款8的經醯化類似物，其中該[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B29Arg；desB30]類似物係A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B29R,desB30人類胰島素；或A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B29R,desB30人類胰島素。
11.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
12.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
13.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)；且aar4代表Glu(E)。
14.根據條款12的經醯化類似物，其中該[A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]類似物係A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素； A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素；或A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素。
15.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)。
16.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
17.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)；且aar4代表Asp(D)。
18.根據條款16的經醯化類似物，其中該[A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Arg；desB30]類似物係A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；或 A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素。
19.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
20.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)；且aar4代表Glu(E)。
21.根據條款19的經醯化類似物，其中該[A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Pro；B30Arg]類似物係A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B28E,B29P,B30R人類胰島素。
22.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)。
23.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
24.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
25.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類 胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
26.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
27.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)；且aar2代表Glu(E)。
28.根據條款26的經醯化類似物，其中該[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]類似物係A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27P,B28R,desB29,desB30人類胰島素。
29.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
30.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)或Gln(Q)；aar2代表Glu(E)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
31.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)；aar2代表Glu(E)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
32.根據條款29的經醯化類似物，其中該[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Arg；desB30]類似物係A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；或A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B26E,B28E,B29R,desB30人類胰島素。
33.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
34.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)；aar2代表Glu(E)；且aar4代表Glu(E)。
35.根據條款33的經醯化類似物，其中該[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Pro；B30Arg]類似物係A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28E,B29P,B30R人類胰島素。
36.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
37.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar3代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
38.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)；aar3代表Glu(E)；且aar4代表Glu(E)。
39.根據條款37的經醯化類似物，其中該[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]類似物係A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；或A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素。
40.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類 胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar3代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
41.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)；aar3代表Glu(E)；且aar4代表Glu(E)。
42.根據條款40的經醯化類似物，其中該[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Pro；B30Arg]類似物係A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29P,B30R人類胰島素。
43.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
44.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)；且aar3代表Glu(E)。
45.根據條款43的經醯化類似物，其中該[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]類似物係A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28R,desB29,desB30人類胰島素。
46.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類 胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
47.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
48.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)。
49.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；aar3代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
50.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)；aar2代表Glu(E)；aar3代表Glu(E)；且aar4代表Glu(E)。
51.根據條款49的經醯化類似物，其中該[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]胰島素類似物係A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B28E,B29R,desB30人 類胰島素。
52.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
53.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)；aar2代表Glu(E)；且aar3代表Glu(E)。
54.根據條款52的經醯化類似物，其中該[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]類似物係A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B28R,desB29,desB30人類胰島素。
55.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
56.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
57.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B29Pro；B30Arg]；其中aar1 代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
58.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)；aar2代表Glu(E)；且aar3代表Glu(E)。
59.根據條款57的經醯化類似物，其中該[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B29Pro；B30Arg]類似物係A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B29P,B30R人類胰島素。
60.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
61.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)；且aar2代表Glu(E)。
62.根據條款60的經醯化類似物，其中該[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B29Arg；desB30]類似物係A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素。
63.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B29Arg；desB30]；其中aar1代 表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
64.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
65.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
66.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)。
67.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
68.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
69.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類 胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)。
70.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
71.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
72.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
73.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
74.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)；且aar2代表Glu(E)。
75.根據條款73的經醯化類似物，其中該[A8Arg；A22Lys； B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]類似物係A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27P,B28R,desB29,desB30人類胰島素。
76.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
77.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)；aar2代表Glu(E)；且aar4代表Glu(E)。
78.根據條款76的經醯化類似物，其中該[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Arg；desB30]類似物係A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28E,B29R,desB30人類胰島素。
79.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
80.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
81.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar3代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
82.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)；aar3代表Glu(E)；且aar4代表Glu(E)。
83.根據條款81的經醯化類似物，其中該[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]類似物係A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素。
84.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar3代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
85.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
86.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)；且aar3代表Glu(E)。
87.根據條款85的經醯化類似物，其中該[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]類似物係A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28R,desB29,desB30人類胰島素。
88.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
89.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
90.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)。
91.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；aar3代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
92.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]； 其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
93.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)；aar2代表Glu(E)；且aar3代表Glu(E)。
94.根據條款92的經醯化類似物，其中該[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]類似物係A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B28R,desB29,desB30人類胰島素。
95.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
96.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；BB27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
97.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(s)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
98.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類 胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
99.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
100.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
101.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)。
102.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
103.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Gln(Q)；且aar4代表Asp(D)。
104.根據條款102的經醯化類似物，其中該[A14Glu；A22Lys； B3aar1；B28aar4；B29Arg；desB30]類似物係A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B28D,B29R,desB30人類胰島素。
105.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
106.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)。
107.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
108.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
109.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
110.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
111.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
112.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
113.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；BB26aar2；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
114.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar3代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
115.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]； 其中aar1代表Glu(E)或Gln(Q)；aar3代表Glu(E)；且aar4代表Glu(E)。
116.根據條款114的經醯化類似物，其中該[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]類似物係A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A14E,A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A14E,A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；或A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素。
117.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar3代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
118.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
119.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類 胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
120.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
121.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)。
122.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；aar3代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
123.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
124.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表 Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
125.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
126.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
127.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
128.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；與aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
129.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
130.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類 胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)。
131.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
132.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
133.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)。
134.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
135.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
136.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類 胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
137.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
138.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
139.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
140.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
141.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar3代表 Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
142.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar3代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
143.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
144.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
145.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
146.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)。
147.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28aar4；B29Arg； desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；aar3代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
148.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
149.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
150.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A14Glu；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
151.一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8R,A22K,B3E,B26E,B27E,B28R,desB29,desB30]；[A8R,A22K,B3E,B26E,B27P,B28R,desB29,desB30]；[A8R,A22K,B3E,B26E,B28E,B29R,desB30]；[A8R,A22K,B3E,B26E,B29R,desB30]；[A8R,A22K,B3E,B27E,B28E,B29R,desB30]； [A8R,A22K,B3E,B27E,B28R,desB29,desB30]；[A14E,A22K,B3E,B27E,B28E,B29R,desB30]；[A14E,A22K,B3Q,B27E,B28E,B29R,desB30]；[A14E,A22K,B3Q,B28D,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B26E,B27E,B28E,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B26E,B27E,B28R,desB29,desB30]；[A22K,B3E,B26E,B27E,B29P,B30R]；[A22K,B3E,B26E,B27P,B28R,desB29,desB30]；[A22K,B3E,B26E,B28E,B29P,B30R]；[A22K,B3E,B26E,B28E,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B26E,B28D,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B26E,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B27E,B28E,B29P,B30R]；[A22K,B3E,B27E,B28E,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B27E,B28R,desB29,desB30]；[A22K,B3E,B27E,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B27P,B28E,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B28D,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B28E,B29P,B30R]；[A22K,B3Q,B26E,B28E,B29R,desB30]；或[A22K,B3Q,B26E,B29R,desB30]。
本發明之胰島素類似物係藉由於A22位置的離胺酸殘基之ε胺基基團以式II之基團醯化衍生而來[醯基]-[連接子]-其中該連接子基團係由選自gGlu及/或OEG的1至10個胺基酸殘基構成的胺基酸鏈；其中gGlu代表γ麩胺酸殘基；OEG代表8-胺基-3,6-二氧辛酸之殘基(即式-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-的基團)；該等胺基酸殘基可以任何順序出現；與該胺基酸鏈包含至少一個gGlu殘基；與其中該醯基基團係選自1,14-十四烷二酸；1,15-十五烷二酸；與1,16-十六烷二酸的α,ω-二-羧酸之殘基。
152.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該連接子基團係由選自gGlu及/或OEG的1至10個胺基酸殘基構成的胺基酸鏈。
153.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該連接子基團係由1至6個胺基酸殘基構成的胺基酸鏈。
154.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該連接子基團係由1至5個胺基酸殘基構成的胺基酸鏈。
155.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該連接子基團係由1至4個胺基酸殘基構成的胺基酸鏈。
156.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該連接子基團係由2至6個胺基酸殘基構成的胺基酸鏈。
157.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該連接子基團係由2、3、4或5個胺基酸殘基構成的胺基酸鏈。
158.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該連接子基團係由3或4個胺基酸殘基構成的胺基酸鏈。
159.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該本發明之經醯化胰島素類似物包含至少一個gGlu殘基。
160.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該本發明之經醯化胰島素類似物包含1至10個gGlu殘基。
161.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該本發明之經醯化胰島素類似物包含1至8個gGlu殘基。
162.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該本發明之經醯化胰島素類似物包含1至6個gGlu殘基。
163.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該本發明之經醯化胰島素類似物包含1、2、3、4或5個gGlu殘基。
164.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該本發明之經醯化胰島素類似物之醯基基團係選自1,14-十四烷二酸；1,15-十五烷二酸；與1,16-十六烷二酸的α,ω-二-羧酸之殘基。
165.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該本發明之經醯化胰島素類似物之醯基基團係1,14-十四烷二酸之殘基。
166.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該本發明之經醯化胰島素類似物之醯基基團係1,15-十五烷二酸之殘基。
167.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該本發明之經醯 化胰島素類似物之醯基基團係1,16-十六烷二酸之殘基。
168.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該式II之基團係十四烷二醯基-4xgGlu；十四烷二醯基-gGlu-2xOEG；十六烷二醯基-4xgGlu；十六烷二醯基-4xgGlu-2xOEG；十六烷二醯基-gGlu-2xOEG；十六烷二醯基-gGlu-4xOEG；或十六烷二醯基-gGlu-6xOEG。
169.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該式II之基團係十四烷二醯基-4xgGlu；十四烷二醯基-gGlu-2xOEG；十六烷二醯基-4xgGlu；或十六烷二醯基-gGlu-2xOEG。
170.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該式II之基團係十四烷二醯基-4xgGlu。
171.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該式II之基團係十四烷二醯基-gGlu-2xOEG。
172.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該式II之基團係十六烷二醯基-4xgGlu。
173.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該式II之基團係十六烷二醯基-4xgGlu-2xOEG。
174.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該式II之基團係十六烷二醯基-gGlu-2xOEG。
175.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該式II之基團係十六烷二醯基-gGlu-4xOEG。
176.一種人類胰島素之經醯化類似物，其中該式II之基團係十六烷二醯基-gGlu-6xOEG。
177.一種人類胰島素之經醯化類似物，其係A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B28D,B29R,desB30人類胰島素； A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27P,B28R,desB29,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28R,desB29,desB30人類胰島素；A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27P,B28R,desB29,desB30人類胰島素；A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28R,desB29,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B28R,desB29,desB30人類胰島素；A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B28R,desB29,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B28E,B29P,B30R人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28E,B29P,B30R人類胰島 素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29P,B30R人類胰島素；A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B29R,desB30人類胰島素；A14E,A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A14E,A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B29R,desB30人類胰島素； A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B29P,B30R人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B26E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-4xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-6xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu-2xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰 島素；或A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B26E,B29R,desB30人類胰島素。
本文中描述的具體態樣之二或更多者之任何組合被視為落入本發明之範圍內。
定義 命名
於本文中，胰島素之命名係根據以下原則完成：術語「類似物」被頻繁地用於在經歷進一步化學修飾(衍生化)(且特別是醯化)前的討論中的胰島素蛋白質或胜肽。得自如此化學修飾(衍生化)的產物通常被稱為「衍生物」或「經醯化類似物」。然而，於本申請案之前後文中，術語「類似物」表明人類胰島素之類似物以及如此人類胰島素類似物之(經醯化)衍生物。
名稱係給成相較於人類胰島素的類似物、衍生物與修飾(醯化)。對於醯基部分(即[醯基]-[連接子]-式II之基團)之命名，在一些例子中，命名係根據IUPAC命名完成，而在其他的例子中，命名係如胜肽命名完成。
作為一個實例，以下結構(Chem.1)： 之醯基部分可被命名為「十四烷二醯基-4xgGlu」、「十四烷二醯基-4xγGlu」、或「1,14-十四烷二醯基-4xgGlu」或類似者，其中γGlu(與gGlu)係呈L-構 形的胺基酸γ麩胺酸之簡寫註記，且「4x」意謂接著的殘基重複4次。
類似地，以下結構(Chem.2)： 之醯基部分可例如被命名成「十六烷二醯基-(gGlu-OEG)3-gGlu)」、「十六烷二醯基-(gGlu-OEG)3-gGlu)」、「十六烷二醯基-3x(gGlu-OEG)-gGlu)」、「1,16-十六烷二醯基-(gGlu-OEG)3-gGlu)」、「1,16-十六烷二醯基-(gGlu-OEG)3-gGlu)」、「1,16-十六烷二醯基-3x(gGlu-OEG)-gGlu)」、「十六烷二醯基-(γGlu-OEG)3-γGlu)」、「十六烷二醯基-(γGlu-OEG)3-γGlu)」、或「十六烷二醯基-3x(γGlu-OEG)-γGlu)」；其中以下結構(Chem.3)： 之部分可例如被命名成十四烷二醯基、1,14-十四烷二醯基或(簡寫註記)C14二酸。類似的註記適用於具有15與16個碳原子的類似的殘基，分別為十五烷二醯基、C15二酸、與十六烷二醯基、C16二酸。
γGlu(與gGlu)係呈L-構形的胺基酸γ麩胺酸，H2N-CH(CO2H)-CH2CH2-CO2H(經由α胺基基團且經由γ(側鏈)羧基基團連接)之簡寫註記。
OEG係胺基酸殘基8-胺基-3,6-二氧-辛酸，NH2(CH2)2O(CH2)2OCH2CO2H之簡寫註記。
「2x」與「3x」意謂接著的殘基分別重複2與3次。
例如，實施例1之胰島素衍生物被命名為「A22K(N(eps)十 四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素」以指出A-鏈(其在人類胰島素中含有21個胺基酸殘基)已被以離胺酸(K)延伸了1個胺基酸(位置A22)，其係進一步藉由以下者來修飾：以部分十四烷二醯基-gGlu-2xOEG於A22之離胺酸殘基中的ε氮(表示成Nε(或N(eps))上醯化，在人類胰島素中的位置B3的胺基酸(N)已被E(麩胺酸)取代，在人類胰島素中的位置B27的胺基酸(T)已被E(麩胺酸)取代，在人類胰島素中的位置B28的胺基酸(P)已E(麩胺酸)取代，在人類胰島素中的位置B29的胺基酸(K)已被R(精胺酸)取代，在人類胰島素中的位置B30的胺基酸(蘇胺酸，T)已被刪除。於以下式中的星號指出與人類胰島素不同(即取代的)的討論中的殘基。
於本申請案通篇中，給出了本發明之較佳胰島素之式與名稱兩者。
此外，本發明之胰島素亦根據IUPAC命名(OpenEye，IUPAC式樣)來命名。根據此命名，實施例1之胰島素衍生物被指定了以下名稱：N{α}([GluB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
應注意可以離胺酸殘基(其係藉由醯化修飾)描寫的各式係將離胺酸殘基展開來繪製(如於例如實施例8中顯示的)或將離胺酸殘基收縮來繪製(如於例如實施例1中顯示的)。在所有的例子中，醯基基團係接附至離胺酸殘基之ε氮。
物理穩定性
用於本文中，術語胰島素製劑之「物理穩定性」係有關於蛋白質由於其暴露至熱學-力學壓力及/或和去穩定性界面與表面(諸如疏水性表面與界面)交互作用而形成生物上不活性及/或不可溶的蛋白質聚集體的傾向。水性蛋白質製劑之物理穩定性係透過在於不同溫度下使充入適合的容器(例如匣筒或小瓶)中的該製劑暴露至力學/物理壓力(例如攪動)種種時段後目視檢視及/或測量濁度之方式來評估。製劑之目視檢視係在暗背景中以聚焦的銳光進行。當一製劑於日光中顯示可目視的渾濁時，其在蛋白質聚集方面被歸類為物理上不穩定的。供選擇地，製劑之濁度可藉由技術領域中具有通常知識者所熟知的簡單濁度測量來評估。水性蛋白質製劑之物理穩定性亦可藉由使用分光劑或蛋白質之構形狀態之探針來評估。探針較佳為與蛋白質之非天然構形物優先結合的小型分子。蛋白質結構之小型分子分光探針之一個實例為硫代黃素T。硫代黃素T係一種螢光染料，其已被廣泛地用於偵測澱粉樣微纖維。在微纖維(且或許同樣地其他的蛋白質構形)之存在下，當與微纖維蛋白質形式結合時，硫代黃素T引起位於約450nm的新最大激發與位於約482nm的提高發射。未結合的硫代黃素T於該等波長基本上是無螢光的。
化學穩定性
用於本文中，術語蛋白質製劑之「化學穩定性」係有關於導致與天然蛋白質結構比較有潛在較少的生物效能及/或潛在增加的致免疫特性的化學降解產物之形成的共價蛋白質結構變化。種種化學降解產物可依 天然蛋白質之種類與特性與蛋白質所暴露至的環境而形成。漸增量的化學的降解產物往往在蛋白質製劑之儲存與使用期間看到。大部分的蛋白質傾向脫醯胺，其為其中麩醯胺醯基或天門冬醯胺醯基殘基中的側鏈醯胺基團被水解以形成自由羧酸或天門冬醯胺醯基殘基以形成異Asp衍生物的程序。其他降解途徑涉及高分子量產物之形成，其中二或更多個蛋白質分子透過轉醯胺基作用及/或二硫交互作用彼此共價地結合，導致形成共價結合的二聚物、寡聚物與聚合物降解產物(Stability of Protein Pharmaceuticals，Ahern TJ & Manning MG，Plenum Press，紐約1992)。氧化(例如甲硫胺酸殘基之氧化)可作為化學降解之另一種變體提及。蛋白質製劑之化學穩定性可藉由在暴露至不同的環境條件(降解產物之形成往往可藉由例如增加溫度來加速)後於種種時間點測量化學降解產物之量來評估。個別降解產物之量往往使用種種色層分離法技術(例如SEC-HPLC及/或RP-HPLC)依照分子尺寸、疏水性、及/或電荷分離降解產物來測定。由於HMWP產物係潛在致免疫的且非生物活性的，低水平的HMWP係有利的。
合成之方法
本發明之胰島素衍生物可藉由用於製備胰島素、胰島素類似物與胰島素衍生物的習用方法(且特別是於實施例中描述的方法)來獲得。
生物活性
在另一個方面，本發明提供用作為醫藥品、或用於製造醫藥品或醫藥組成物的新穎胰島素衍生物。
本發明之胰島素衍生物被發現係被視為十分適合供餐中使用的短時間且快速作用胰島素衍生物。
本發明之胰島素衍生物皆具有足以活化胰島素受體的胰島素受體親和力以給出所需的血糖反應，即能夠於動物與人類中降低血液葡萄糖。作為本發明之胰島素之功能(促效)活性之度量，於原代大鼠脂肪細胞中的脂肪生成活性被展示。
本發明之胰島素衍生物被發現具有平衡的胰島素受體(IR)對類胰島素生長因子1受體(IGF-1R)親和力比例(IR/IGF-1R)。
在一個方面，本發明之A22K經醯化胰島素具有高於0.3；高於0.4；高於0.5；高於0.6；高於0.7；高於0.8；高於0.9；高於1；高於1.5；或高於2的IR/IGF-1R比例。
在另一個方面，該A22K經醯化胰島素類似物係本發明之化合物，其中式II之醯基基團係自1,14-十四烷二酸衍生，且在將600μM(大約)本發明之經醯化胰島素類似物之調配物(其含有1.6%(w/vol，大約)甘油與30mM酚/間甲酚，pH 7.4)皮下注射至豬後，該經醯化胰島素類似物具有少於250分鐘；少於200分鐘；少於175分鐘；少於150分鐘；少於125分鐘；少於100分鐘的平均滯留時間(MRT)；。
在另一個方面，該A22K經醯化胰島素類似物係本發明之化合物，其中式II之醯基基團係自1,16-十六烷二酸衍生，且在將600μM(大約)本發明之經醯化胰島素類似物之調配物(其含有1.6%(w/vol，大約)甘油與30mM酚/間甲酚，pH 7.4)皮下注射至豬後，該經醯化胰島素類似物具有少於700分鐘；少於600分鐘；少於500分鐘；少於400分鐘；少於 300分鐘；少於250分鐘的平均滯留時間(MRT)。
在一個進一步的方面，本發明係關於本發明之經醯化胰島素類似物之醫學用途，且特別是關於如此胰島素衍生物於治療、預防或減輕與以下者有關的疾病、疾患或病況的用途：糖尿病、第1型糖尿病、第2型糖尿病、受損的葡萄糖耐受性、高糖血症、異常血脂症、肥胖、代謝症候群(代謝症候群X、胰島素抗性症候群)、高血壓、認知疾患、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風、心血管疾患、冠心病、發炎性腸症候群、消化不良、或胃潰瘍，該方法包含將治療有效量的本發明之胰島素衍生物投予至需要其的接受者。
在另一個具體態樣中，本發明係關於如此胰島素衍生物於治療、預防或減輕與以下者有關的疾病、疾患或病況的用途：糖尿病、第1型糖尿病、第2型糖尿病、或受損的葡萄糖耐受性，該方法包含將治療有效量的本發明之胰島素衍生物投予至需要其的接受者。
在第三個具體態樣中，本發明係關於如此胰島素衍生物於治療、預防或減輕與以下者有關的疾病、疾患或病況的用途：糖尿病，且特別是第1型糖尿病或第2型糖尿病。
醫藥組成物
本發明係關於可用作為醫藥品、或有用於製造醫藥組成物/醫藥品的經醯化胰島素類似物。
因此，在另一個方面，本發明提供包含治療有效量的根據本發明的胰島素衍生物的新穎醫藥組成物。
根據本發明的醫藥組成物視需要地包含一或多種醫藥上可接受的載劑及/或稀釋劑。
本發明之醫藥組成物可進一步包含於醫藥組成物中一般使用的其他賦形劑，例如保存劑、螯合劑、張力劑、吸收提高劑、穩定劑、抗氧化劑、聚合物、表面活性劑、金屬離子、油性媒劑與蛋白質(例如人類血清白蛋白、明膠或蛋白質)。
於本發明之一個具體態樣，本發明之醫藥組成物係水性製劑，即包含水的製劑。如此製劑典型係溶液或懸浮液。在本發明之一個進一步具體態樣中，該醫藥組成物係水溶液。
術語「水性製劑」係定義為包含至少50% w/w水的製劑。同樣地，術語「水溶液」係定義為包含至少50% w/w水的溶液，且術語「水性懸浮液」係定義為包含至少50% w/w水的懸浮液。水性懸浮液可含有與適合用於製造水性懸浮液的賦形劑混合的活性化合物。
在本發明之一個具體態樣中，該胰島素製劑包含本發明之胰島素衍生物之水溶液，其中該胰島素化合物係以約0.1mM至約20.0mM；更具體係約0.2mM至約4.0mM；約0.3mM至約2.5mM；約0.5mM至約2.5mM；約0.6mM至約2.0mM；或約0.6mM至約1.2mM的濃度存在。
在本發明之另一個具體態樣中，該胰島素製劑包含本發明之胰島素衍生物之水溶液，其中該胰島素化合物係以約0.1mM、約0.3mM、約0.4mM、約0.6mM、約0.9mM、約1.2mM、約1.5mM、或約1.8mM的濃度存在。
本發明之醫藥組成物可進一步包含緩衝劑系統。緩衝劑可自 由以下者(但不限於其等)所組成的群組：醋酸鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉、與參(羥基甲基)-胺基甲烷、二羥乙甘胺酸、三(羥甲基)甲基甘胺酸、蘋果酸、甘胺醯基-甘胺酸、乙二胺、琥珀酸、馬來酸、延胡索酸、酒石酸、天門冬胺酸或其混合物。此等特殊緩衝劑之每一者構成本發明之供選擇的具體態樣。
在一個具體態樣中，該緩衝劑係磷酸鹽緩衝劑。在又另一個具體態樣中，該磷酸鹽緩衝劑之濃度係在約0.1mM至20mM的範圍。在又另一個具體態樣中，該磷酸鹽緩衝劑之濃度係在0.1mM至約10mM、或約0.1mM至約8mM、約1mM至約8mM、或約2mM至約8mM、或6mM至8mM的範圍。
可注射的本發明之醫藥組成物之pH係在3至8.5的範圍。較佳地，根據本發明的可注射的醫藥組成物具有範圍在約6.8至約7.8的pH。
在一個具體態樣中，該pH係在約7.0至約7.8、或7.2至7.6的範圍。
本發明之胰島素製劑可進一步包含張力劑。張力劑可選自由以下者所組成的群組：鹽(例如氯化鈉)、糖或糖醇、胺基酸(例如L-甘胺酸、L-組胺酸、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、天門冬胺酸、色胺酸、蘇胺酸)、醛醣醇(例如甘油(丙三醇)、1,2-丙二醇(伸丙基二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)聚乙二醇(例如PEG400)、或其混合物。可使用任何糖(諸如單醣、二醣、或多醣)或水溶性葡聚糖(包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖聚糖、聚三葡萄糖、 糊精、環糊精、可溶性澱粉、羥基乙基澱粉與羧基甲基纖維素Na。在一個具體態樣中，該糖添加物係蔗糖。糖醇包括(例如)甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、甜醇、木糖醇、與阿拉伯糖醇。在一個具體態樣中，該糖醇添加物係甘露糖醇。以上提及的糖或糖醇可單獨地使用或組合使用。此等特殊張力劑或其混合物之每一者構成本發明之供選擇的具體態樣。
在本發明之一個具體態樣中，甘油及/或甘露糖醇及/或氯化鈉可以對應於至0至250mM、0至200mM、或0至100mM的濃度的量存在。
本發明之胰島素製劑可進一步包含醫藥上可接受的保存劑。保存劑可以足以獲得保存性功效的量存在。於本發明之醫藥組成物中的保存劑之量可自例如所屬技術領域中的文獻及/或於(例如)商業產品中的保存劑之已知量決定。此等特殊保存劑或其混合物之每一者構成本發明之供選擇的具體態樣。保存劑於醫藥製劑中的用途係於例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995中描述。
在一個具體態樣中，該可注射的醫藥組成物包含至少一種酚化合物作為保存劑劑。
在另一個具體態樣中，根據本發明使用的酚化合物可以至多達約6mg/mL的最終可注射的醫藥組成物，特別是至多達約4mg/mL的最終可注射的醫藥組成物存在。
在另一個具體態樣中，根據本發明使用的酚化合物可以至多達約4.0mg/mL；特別是約0.5mg/mL至約4.0mg/mL；或約0.6mg/mL至約4.0mg/mL的最終可注射的醫藥組成物的量存在。
在另一個具體態樣中，該保存劑係酚。
在另一個具體態樣中，該可注射的醫藥組成物包含酚與間甲酚之混合物作為保存劑劑。
在另一個具體態樣中，該可注射的醫藥組成物包含約16mM酚(1.5mg/mL)與約16mM間甲酚(1.72mg/mL)。
本發明之醫藥組成物可進一步包含螯合劑。螯合劑於醫藥製劑中的用途係技術領域中具有通常知識者所熟知的。為方便起見，請參照Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
本發明之醫藥組成物可進一步包含吸收提高劑。吸收提高劑之群組可包括但不限於菸鹼化合物。術語菸鹼化合物包括菸鹼醯胺、菸鹼酸、菸酸、菸酸醯胺與維生素B3及/或其鹽及/或其任何組合。
在一個具體態樣中，該菸鹼化合物係菸鹼醯胺、及/或菸鹼酸、及/或其鹽。在另一個具體態樣中，該菸鹼化合物係菸鹼醯胺。根據本發明使用的菸鹼化合物特別可為N-甲基菸鹼醯胺、N,N-二乙基菸鹼醯胺、N-乙基菸鹼醯胺、N,N-二甲基菸鹼醯胺、N-丙基菸鹼醯胺或N-丁基菸鹼醯胺。
在另一個具體態樣中，該菸鹼化合物係以約5mM至約200mM的量；特別是以約20mM至約200mM的量；以約100mM至約170mM的量；或以約130mM至約170mM的量，諸如約130mM、約140mM、約150mM、約160mM或約170mM的量存在。
本發明之醫藥組成物可進一步包含穩定劑。用於本文中，術語「穩定劑」係有關於添加至含多肽醫藥製劑以穩定該胜肽(即以增加如 此製劑之保存期限及/或使用期限)的化學品。為方便起見，請參照Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
本發明之醫藥組成物可進一步包含足以在組成物之儲存期間減少透過多肽或蛋白質的聚集體形成的量的胺基酸鹼。術語「胺基酸鹼」係有關於胺基酸或胺基酸之組合，其中任何給定的胺基酸係以其自由鹼形式或以其鹽形式存在。該等胺基酸特別可為精胺酸、離胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、胺基胍、鳥胺酸或N-單乙基L-精胺酸、乙硫胺酸或丁硫胺酸、或S-甲基-L半胱胺酸。在本發明之一個具體態樣中，該胺基酸鹼可以對應於1至100mM；1至50mM；或1至30mM的濃度的量存在。
在一個具體態樣中，本發明之醫藥組成物可進一步包含表面活性劑。用於本文中，術語「表面活性劑」係有關於包含水可溶性(親水性)部分、頭部、與脂肪可溶性(親脂性)節段的任何分子或離子。表面活性劑偏好於界面堆積，於該處其親水性部分被定位向水(親水性相)且其親脂性部分被定向至油或疏水性相(即玻璃、空氣、油等等)。表面活性劑開始形成微胞的濃度以臨界微胞濃度或CMC為人所知。此外，表面活性劑降低液體之表面張力。表面活性劑亦以雙性化合物為人所知。表面活性劑於醫藥製劑中的用途係技術領域中具有通常知識者所熟知的。為方便起見，請參照Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
本發明進一步係關於用於製備如此胰島素製劑的方法。本發明之胰島素製劑可藉由使用一些被認可的方法之任一者來製備。例如，該等製劑可藉由混合賦形劑之水溶液與胰島素衍生物之水溶液，之後將pH調整至所欲的水平並將混合物以水調整至最終體積然後無菌過濾來製備。
無鋅醫藥組成物
胰島素製劑傳統上包含以例如氯化物或醋酸鹽形式添加的鋅以獲得該醫藥製劑之可接受的穩定性。然而，已出人意料地發現本發明之胰島素衍生物(在維持足夠的化學與物理穩定性下)可不添加鋅就調配成醫藥組成物，藉此得到比需要Zn2+離子以維持足夠的化學與物理穩定性的可比較的胰島素類似物更快的作用起始。該無鋅調配物被更快地自皮下組織吸收，且因此允許用於餐中使用。
於此方面，需提及無鋅胰島素醫藥組成物確實難以獲得，而此係因為微量的鋅(至或多或少的程度上)可存在於習用於醫藥組成物之製造的賦形劑中，且特別是在醫學容器中使用的橡膠材料中。
因此，在一個方面，本發明提供包含以低鋅組成物的形式調配的本發明之胰島素衍生物而無外加的鋅離子的醫藥組成物。如此醫藥組成物通常被稱為「無鋅組成物」，雖然其等可能事實上被視為「低鋅組成物」。
然而，若可提供無鋅賦形劑，本發明之胰島素衍生物事實上允許無鋅醫藥組成物之製備。因此，在另一個方面，本發明提供包含本發明之胰島素衍生物、及一或多種醫藥上可接受的載劑或稀釋劑、且缺乏任何鋅的無鋅醫藥組成物。
吾人已另外發現到本發明之A22K經醯化胰島素衍生物，持有於位置B3的取代，其增加無添加鋅離子且無添加表面活性劑來調配的醫藥組成物之化學與物理穩定性兩者。因此，在一個進一步的方面，本發明 提供如以上描述的低鋅或無鋅醫藥組成物，其包含含有於位置B3的另外的取代(即B3E或B3Q)的本發明之胰島素衍生物、與一或多種醫藥上可接受的載劑或稀釋劑，其中然而該醫藥組成物未添加表面活性劑。
在一個具體態樣中，本發明提供如以上描述的低鋅醫藥組成物，其中鋅離子可以對應於以下者的濃度的量存在：每6個胰島素分子少於0.2個Zn2+離子；每6個胰島素分子少於0.15個Zn2+離子；每6個胰島素分子少於0.12個Zn2+離子；每6個胰島素分子0.1個Zn2+離子；每6個胰島素分子少於0.09個Zn2+離子；每6個胰島素分子少於0.08個Zn2+離子；每6個胰島素分子少於0.07個Zn2+離子；每6個胰島素分子少於0.06個Zn2+離子；每6個胰島素分子少於0.05個Zn2+離子；每6個胰島素分子少於0.04個Zn2+離子；每6個胰島素分子少於0.03個Zn2+離子；每6個胰島素分子少於0.02個Zn2+離子；或每6個胰島素分子少於0.01個Zn2+離子。
在另一個具體態樣中，本發明提供以低鋅組成物形式調配而無外加的鋅離子的醫藥組成物，其包含胰島素衍生物與一或多種醫藥上可接受的載劑或稀釋劑。
在進一步的具體態樣中，本發明提供以如以上描述的低鋅組成物的形式調配，且其中未添加無表面活性劑的醫藥組成物。
在更進一步的具體態樣中，本發明提供以如以上描述的低鋅組成物的形式調配，且其中未添加無表面活性劑，且包含如以上描述的菸鹼化合物(且特別是菸鹼醯胺)的醫藥組成物。
投予之方法
本發明之醫藥組成物可藉由習用方法投予。
非經腸投予可藉由皮下、肌肉內、腹膜內或靜脈內注射透過注射器之方式(視需要為筆形注射器)進行。供選擇地，非經腸投予可透過輸注泵之方式進行。作為進一步的選擇，亦可使含有本發明之胰島素化合物的胰島素製劑適用於跨皮投予(例如藉由無針注射或從微針貼片，視需要為離子電離子透入貼片)或跨黏膜(例如頰部)投予。
本發明之醫藥組成物可於數種位置投予至需要如此治療的患者，例如於局部位置、皮膚或黏膜位置、於繞過吸收的位置，諸如於動脈中、於靜脈中、或於心臟中投予、與於涉及吸收的位置，例如於皮膚中、在皮膚下、在肌肉中或在腹部中投予。
本發明之醫藥組成物可用於藉由非經腸投予治療糖尿病。實際上的劑量取決於欲治療的疾病之特性與嚴重性，且係於醫師之判斷內，且可透過按照本發明之特定情況滴定劑量來作變化以產生所欲的治療功效。
然而，目前思量根據本發明的胰島素衍生物應以約0.1mM至約20.0mM；更特別是約0.2mM至約4.0mM；約0.3mM至約2.5mM；約0.5mM至約2.5mM；約0.6mM至約2.0mM；或約0.6mM至約1.2mM的量存在在最終醫藥組成物中。
本發明之醫藥組成物亦可被製備以用於通常用於投予胰島素的種種醫學裝置中，包括用於透過注射的胰島素療法的筆形裝置、透過使用泵的連續皮下胰島素灌注療法、及/或用於基礎胰島素療法。
在一個具體態樣中，本發明之醫藥組成物被調配入筆形裝置 中以用於透過注射的胰島素療法。
在另一個具體態樣中，本發明之醫藥組成物被調配至用於胰島素投予的外部泵中。
治療方法
本發明係關於用於治療用途的藥物。更具體言之，本發明係關於本發明之人類胰島素類似物之經醯化衍生物於治療或預防與糖尿病有關的醫學病況的用途。
因此，在另一個方面，本發明提供用於治療或減輕活動物體(包括人類)之疾病或疾患或病況的方法，其中該疾病、疾患或病況可選自與以下者有關的疾病、疾患或病況：糖尿病、第1型糖尿病、第2型糖尿病、受損的葡萄糖耐受性、高糖血症、異常血脂症、肥胖、代謝症候群(代謝症候群X、胰島素抗性症候群)、高血壓、認知疾患、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風、心血管疾患、冠心病、發炎性腸症候群、消化不良、或胃潰瘍，該方法包含將治療有效量的本發明之人類胰島素之經醯化類似物投予至需要其的接受者的步驟。
在另一個具體態樣中，本發明提供用於治療或減輕活動物體(包括人類)之疾病或疾患或病況的方法，該疾病、疾患或病況可選自與以下者有關的疾病、疾患或病況：糖尿病、第1型糖尿病、第2型糖尿病、受損的葡萄糖耐受性、高糖血症、異常血脂症、肥胖、代謝症候群(代謝症候群X、胰島素抗性症候群)、高血壓、認知疾患、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風、心血管疾患、冠心病、發炎性腸症候群、消化不良、或胃潰 瘍，該方法包含將治療有效量的本發明之人類胰島素之經醯化類似物投予至需要其的接受者。
在第三具體態樣中，本發明提供用於治療或減輕活動物體(包括人類)之疾病或疾患或病況的方法，其中該疾病、疾患或病況可選自與以下者有關的疾病、疾患或病況：糖尿病、第1型糖尿病、第2型糖尿病、受損的葡萄糖耐受性、高糖血症、異常血脂症、肥胖、或代謝症候群(代謝症候群X、胰島素抗性症候群)。
在第四具體態樣中，本發明提供用於治療或減輕活動物體(包括人類)之疾病或疾患或病況的方法，其中該疾病、疾患或病況可選自與以下者有關的疾病、疾患或病況：糖尿病，特別是第1型糖尿病、或第2型糖尿病。
實施例
本發明進一步參照以下實施例來闡明，其非意欲以任何方式限於所請發明之範圍。
胰島素類似物表現與純化 胰島素類似物表現
根據本發明使用的胰島素類似物(即二鏈非經醯化胰島素類似物)係藉由透過為人熟知的技術(例如如於US 6500645中揭示者)在適合的宿主細胞中表現編碼討論中的胰島素類似物的DNA序列來重組地製造。該胰島素類似物被直接表現或被表現成前驅物分子，其可在B鏈上具有N 端延伸及/或在B鏈與A鏈間具有連接胜肽(C胜肽)。此N端延伸與C胜肽係藉由適合的蛋白酶(例如水解無色桿菌(Achromobactor lyticus)蛋白酶(ALP)或胰蛋白酶)試管內剪切掉，且因此會具有分別在位置B1與A1旁邊的剪切位置。適於根據本發明使用的類型的N端延伸與C胜肽係於例如US 5395922、EP 765395與WO 9828429中揭示。
編碼根據本發明使用的胰島素類似物前驅物的多核苷酸序列可藉由已建立的方法(例如由Beaucage等人(1981)Tetrahedron Letters 22 1859-1869描述的亞磷醯胺方法、或由Matthes等人(1984)EMBO Journal 3 801-805描述的方法)合成地製備。根據亞磷醯胺方法，寡核苷酸係於(例如)自動DNA合成儀中合成、純化、雙股化、並連接以形成合成的DNA構築體。目前，製備DNA構築體之較佳的方式係藉由聚合酶連鎖反應(PCR)。
重組方法典型會利用載體，其能夠於所挑選的微生物或宿主細胞中複製且其帶有編碼根據本發明使用的胰島素類似物前驅物的多核苷酸序列。該重組載體可為自主複製載體，即以染色體外實體之形式存在且其複製獨立於染色體複製的載體，例如質體、染色體外因子、袖珍染色體、或人工染色體。載體可含有用於確保自我複製的任何工具。供選擇地，載體可為當導入至宿主細胞中時，被併入基因組中並與其已併入至的染色體一起複製的載體。此外，可使用單一載體或質體或一起含有欲導入至宿主細胞之基因組中的完整DNA的二或更多個載體或質體、或轉位子。載體可為線形或封閉環形質體且較佳會含有允許該載體穩定併入至宿主細胞之基因組中或允許該載體於細胞中獨立於基因組自主複製的元件。
重組表現載體可為能夠在酵母菌中複製者。使載體能夠在酵母菌中複製的序列之實例為酵母菌質體2μm複製基因REP 1-3與複製起點。
載體可含有一或多個可挑選標記，其允許輕易挑選經轉形的細胞。可挑選標記係一種基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、原養性至自養性、與類似者。細菌可挑選標記之實例為來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因、或賦予抗生素抗性(諸如胺苄青黴素、康黴素、氯黴素或四環素抗性)的標記。用於絲狀真菌宿主細胞的可挑選標記包括amdS(乙醯胺酶)、argB(鳥胺酸胺甲醯基轉移酶)、pyrG(血苷-5’-磷酸脫羧酶)與trpC(鄰胺苯甲酸合成酶)。適用於酵母菌宿主細胞的標記係ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、與URA3。一種十分適合用於酵母菌的可挑選標記係粟酒裂殖酵母TPI基因(Russell(1985)Gene 40 125-130)。
於載體中，多核苷酸序列係可操縱地連接至適合的啟動子序列。啟動子可為在所選宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核酸序列(包括突變、經截短、與雜合啟動子)且可自編碼對宿主細胞而言是同源或異源的細胞外或細胞內多肽的基因獲得。
適用於指揮於細菌宿主細胞中的轉錄的啟動子之實例為獲自以下者的啟動子：大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂酶(agarase)基因(dagA)、枯草芽孢桿菌聚果糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α澱粉酶基因(amyL)、脂肪嗜熱芽孢桿菌產麥芽糖澱粉酶基因(amyM)、液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) α澱粉酶基因(amyQ)、與地衣芽孢桿菌青黴素酶基因(penP)。適用於在絲狀真菌宿主細胞中指揮轉錄的啟動子之實例為獲自以下者之基因的啟動子：米麴菌TAKA澱粉酶、米氏假根毛黴天門冬胺酸蛋白酶、黑麴菌中性α澱粉酶、與黑麴菌酸穩定性α澱粉酶。於酵母菌宿主中，有用的啟動子為啤酒釀母菌Mal、TPI、ADH、TDH3或PGK啟動子。
編碼根據本發明使用的胰島素胜肽主鏈的多核苷酸序列亦典型會被可操縱地連接至適合的終止子。於酵母菌中，適合的終止子為TPI終止子(Alber等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1 419-434)。
用於分別結合編碼根據本發明使用的胰島素類似物的多核苷酸序列、啟動子與終止子並將其等插入至含有對於在所挑選的宿主中複製而言為必須的訊息的適合載體的程序對所屬技術領域中具有通常知識者而言是廣為人知的。應瞭解載體可藉由以下二者之一構築：首先製備含有編碼根據本發明使用的胰島素主鏈的整個DNA序列的DNA構築體，隨後將此片段插入至適合的表現載體中，或連續地插入含有個別元件(諸如訊息胜肽與前胜肽(B鏈之N端延伸)、C胜肽、A鏈與B鏈)之遺傳訊息的DNA片段，接著連接。
包含編碼根據本發明使用的胰島素類似物的多核苷酸序列的載體被導入至宿主細胞中，使得該載體係以染色體整體之部分之形式或以自我複製性染色體外載體之形式維持。術語「宿主細胞」涵蓋由於在複製期間發生的突變而與親本細胞不完全相同的親本細胞之任何後代。宿主細胞可為單細胞微生物，例如原核生物、或非單細胞微生物，例如真核生物。有用的單細胞細胞係細菌細胞，諸如革蘭氏陽性細菌，包括(但不限 於)芽孢桿菌細胞、鏈黴菌細胞、或革蘭氏陰性細菌，諸如大腸桿菌與假單胞菌屬物種。真核生物細胞可為哺乳類動物、昆蟲、植物、或真菌細胞。
宿主細胞特別可為酵母菌細胞。酵母菌生物可為在培養後將胰島素胜肽主鏈或其前驅物分泌至培養基中的任何適合的酵母菌生物。適合的酵母菌生物之實例包括選自以下者的品系：啤酒釀母菌、克魯弗釀母菌(Saccharomyces kluyveri)、粟酒裂殖酵母、葡萄汁釀母菌(Sacchoromyces uvarum)、乳酸克魯弗酵母菌(Kluyveromyces lactis)、多型漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)、巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、嗜甲醇畢赤酵母菌(Pichia methanolica)、克魯弗畢赤酵母菌、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)、假絲酵母菌屬物種、產朊假絲酵母菌(Candida utilis)、可可假絲酵母菌(Candida cacaoi)、地絲菌屬(Geotrichum)物種、與發酵地絲菌(Geotrichum fermentans)。
酵母菌細胞之轉形可例如透過原生質體形成接著藉由已知方法轉形實現。用於培養細胞的培養基可為適用於生長酵母菌生物的任何習用的培養基。
胰島素類似物純化
經分泌的胰島素類似物或其前驅物可藉由習用的程序自培養基回收，該等程序包括藉由離心、藉由過濾或藉由將胰島素類似物或其前驅物捕捉或吸附在離子交換基質上或在逆相吸收基質上自培養基分離酵母菌細胞、沈澱上清液之蛋白質組份、或藉由透過鹽(例如硫酸銨)來過濾、接著藉由種種色層分離法程序(例如離子交換色層分離法、親和力色 層分離法、等等)來純化。
本發明之胰島素胜肽主鏈之純化與消化係如下進行：藉由陽離子交換自酵母菌培養物上清液純化並濃縮單鏈胰島素類似物前驅物(其可含有B鏈之N端延伸與在B鏈與A鏈間的經修飾的C胜肽)(Kjeldsen等人(1998)Prot.Expr.Pur.14309-316)。
藉由以離胺酸專一性固定化ALP消化(Kristensen等人(1997)J.Biol.Chem.20 12978-12983)或藉由使用胰蛋白酶以剪切掉B鏈之N端延伸(若存在)與C胜肽來使單鏈胰島素類似物前驅物成熟成雙鏈胰島素胜肽主鏈。
胰蛋白酶消化
將來自陽離子交換色層分離法步驟且含有胰島素類似物前驅物的洗出物以水稀釋至15-20%的乙醇濃度。將甘胺酸添加至50mM的濃度並藉由NaOH將pH調整至9.0-9.5。以1：300(w：w)的比例添加胰蛋白酶並使消化於4度下進行。每20分鐘分析性地監視消化直到消化完成。消化係藉由以3：100(體積：體積)的比例添加1M檸檬酸來終止。
消化反應係藉由分析性LC在Waters Acquity超高效能液相色層分離系統上使用C18管柱分析且分子量係藉由MALDI-TOF MS(Bruker Daltonics Autoflex II TOF/TOF)確認。
雙鏈胰島素類似物係藉由逆相HPLC(Waters 600系統)在C18管柱上使用乙腈梯度純化。所欲的胰島素類似物係藉由冷凍乾燥回收。
純度係藉由分析性LC在Waters Acquity超高效能液相色層 分離系統使用C18管柱測定，且分子量係藉由MALDI-TOF MS確認。
縮寫
ALP-水解無色桿菌蛋白酶
C胜肽-連接胜肽
HPLC-高效能液相色層分離法
IR-胰島素受體
IGF-1R類胰島素生長因子1受體
LC-液相色層分離法
MALDI-TOF-基質輔助雷射脫附游離飛行時間
MS-質譜法
PD-藥效學(血液/血漿葡萄糖降低功效)
PK-藥效學(血液/血漿胰島素濃度對時間輪廓)
tBu係三級丁基；DCM係二氯甲烷；DIPEA=DIEA係N,N-二異丙基乙基胺；DMF係N,N-d甲基甲醯胺；DMSO係二甲亞碸；Fmoc係9-茀基甲基氧基羰基；γGlu(gGlu)係γ L-麩胺醯基；HCl係氫氯酸；NMP係N-甲基吡咯啶酮； OtBu係三級丁基酯；OEG係[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基羰基；OSu係琥珀醯亞胺-1-基氧基=2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基氧基；RT係室溫；TFA係三氟乙酸；TRIS係參(羥基甲基)胺基甲烷；與TSTU係O-(N-琥珀醯亞胺基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽。
藥動學(PK)參數
T½係終端半生期；MRT係平均滯留時間；F係生物可利用性(被吸收的部分)；Tmax係至最大血漿暴露的時間；Cmax係最大血漿濃度；D係劑量；Cmax/D係對劑量標準化的最大血漿濃度；AUC係曲線下面積；AUC/D係對劑量標準化的曲線下面積；%extrap係外推輪廓之百分比。
一般說明
以下實施例與一般程序係關於在說明書中與在合成流程中鑑認的中間化合物與終產物。本發明之化合物之製備係使用以下實施例詳細描述，但所描述的化學反應係在其等對本發明之化合物之製備的一般適用性方面揭示。
偶而，反應可能並非對包含在所揭示的本發明之範圍內的每一個化合物而言皆如所描述地可應用。會發生此情況的化合物對對所屬技術領域中具有通常知識者而言可輕易辨別。於此等例子中，反應可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知的習用修改(即藉由適當地保護干擾性基團、藉由改變成其他習用試劑、或藉由反應條件之例行修改)成功地進行。
供選擇地，其他於本文中揭示的或否則習用的反應會可應用於製備本發明之相對應化合物。於所有的製備方法中，所有的起始材料皆為已知的或可自已知的起始材料輕易地製備。所有的溫度皆以攝氏度提出，且除非另加指出，當提及產率時所有的部分與百分比係以重量計且當提及溶劑與洗提液時所有的部分皆以體積計。
本發明之化合物可藉由利用所屬技術領域中為典型的以下程序之一或多者純化。若需要，可針對梯度、pH、鹽、濃度、流率、管柱、等等修改此等程序。取決於諸如討論中的胰島素之不純輪廓、溶解度、等等因子，此等修改可由所屬技術領域中具有通常知識者輕易辨別與完成。
在酸性HPLC或脫鹽後，化合物係藉由冷凍乾燥純的部分來分離。
在中性HPLC或陰離子交換色層分離法後，化合物被脫鹽、於等電位的pH沈澱、或藉由酸性HPLC純化。
典型的純化程序 RP-HPLC系統：
由以下者所組成的Gilson系統：液體處理器型號215，泵型號322-H2與UV偵測器型號155(UV 215nm與280nm)。
陰離子交換與脫鹽系統：
由以下者所組成的Äkta Explorer系統：泵型號P-900、UV偵測器型號UV-900(UV 214、254與280nm)、pH與電導度偵測器型號pH/C-900、部分收集器型號Frac-950。
酸性RP-HPLC：
管柱：Phenomenex Gemini，5μM 5u C18 110Å，30x250mm
流率：20mL/min
緩衝劑A：0.1% TFA，於水中
緩衝劑B：0.1% TFA，於乙腈中
中性RP-HPLC：
管柱：Phenomenex Gemini，5μM 5u C18 110Å，30x250mm
流率：20mL/min
緩衝劑A：10mM Tris，15mM(NH4)2SO4，pH=7.3，20%乙 腈，於milliQ中
緩衝劑B：20% milliQ，於乙腈中
陰離子交換色層分離法：
管柱：Poros50HQ或Source30Q
流率：取決於管柱
緩衝劑A：15mM Tris，25mM NH4Oac，50% EtOH，pH=7.5。
緩衝劑B：15mM Tris，500mM NH4Oac，50% EtOH，pH=7.5。
脫鹽：
管柱：HiPrep 26/10
流率：20mL/min
緩衝劑A：0.1% TFA，於水中
緩衝劑B：0.1% TFA，於乙腈中
醯化試劑係類似於例如WO 2009/115469中描述的於溶液中或在固相上合成。
用於通式III之醯化試劑之固相合成的一般程序
[醯基]-[連接子]-Act
其中該醯基與連接子基團係如上定義，且Act係活性酯之離去基，諸如N-羥基琥珀醯亞胺(Osu)、或1-羥基苯并三唑，且其中在醯基 內的羧酸與醯基部分之連接子部分被以三級丁基酯之形式保護。
通式III之化合物可在固體撐體上使用技術領域中具有通常知識者已知的固相胜肽合成之技術領域中的程序合成。
如此程序之一包含將經Fmoc保護的胺基酸接附至聚苯乙烯2-氯三苯甲基氯化物樹脂。該接附可使用自由的N經保護的胺基酸在三級胺(例如三乙胺或N,N-二異丙基乙基胺)之存在下完成(參見以下文獻)。此胺基酸之C端(其接附至樹脂)係位於偶聯至本發明之親本胰島素的合成序列之末端。
在將Fmoc胺基酸接附至樹脂後，Fmoc基團係使用(例如)二級胺(如哌啶或二乙胺)脫保護，接著偶聯另一(或相同的)經Fmoc保護的胺基酸與脫保護。合成的序列係藉由偶聯經單三級丁基保護的脂肪(α,ω)二酸(如十六烷二酸、十五烷二酸、或十四烷二酸單三級丁基酯)來終止。
將化合物自樹脂剪切下來係使用經稀釋的酸(如0.5-5% TFA/DCM(三氟乙酸，於二氯甲烷中)、乙酸(例如10%，於DCM、或HOAc/三氟乙醇/DCM 1：1：8)、或六氟異丙醇，於DCM中)來完成(參見例如F.Z.Dörwald：Organic Synthesis on Solid Phase；Wiley-VCH 2000，ISBN 3-527-29950-5；N.Sewald & H.-D.Jakubke：Peptides：Chemistry and Biology；Wiley-VCH，2002，ISBN 3-527-30405-3；或The Combinatorial Cheemistry Catalog，1999，Novabiochem AG，與其中引用的文獻)。此確保以羧酸保護基形式存在於化合物中的三級丁基酯不被脫保護。
最後，C端羧基基團(自樹脂釋放)係(例如)以N-羥基 琥珀醯亞胺酯(Osu)的形式活化。此經活化的酯係例如使用純淨的TFA脫保護，且被直接使用或在純化(結晶)後以接附至本發明之親本胰島素的偶聯試劑之形式使用。此程序係於以下闡明。
用於在固相上合成醯化試劑的一般程序： 十四烷二醯基-4xgGlu-OSu(Chem.4)之合成
使2-氯三苯甲基樹脂100-200篩孔1.5mmol/g(15.79g，23.69mmol)在乾二氯甲烷(150mL)中膨脹20分鐘。將Fmoc-Glu-OtBu(6.72g，15.79mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(10.46mL，60.01mmol)於乾二氯甲烷(120mL)中的溶液添加至樹脂並將混合物搖動共16hr。過濾樹脂並以N,N-二異丙基乙基胺(5.5mL，31.59mmol)於甲醇/二氯甲烷混合物(9：1,150mL)中的溶液處理(5min)。然後以N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)與N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)洗滌樹脂。
藉由以於N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶處理(2 x 150mL，1 x 5min，1 x 20min)處理來移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)、2-丙醇(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)與N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)洗滌樹脂。將Fmoo-Glu-OtBu(10.08g，23.69mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TCTU，8.42g，23.69mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(7.43mL，42.64mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(120mL)中的溶液添加至樹脂並將混合物搖動共16hr。過濾樹脂並以 N,N-二異丙基乙基胺(5.5mL，31.59mmol)於甲醇/二氯甲烷混合物(9：1,150mL)中的溶液處理(5min)。然後以N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)與N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)洗滌樹脂。
藉由以於N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶(2 x 150mL，1 x 5min，1 x 20min)處理來移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)、2-丙醇(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)與N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)洗滌樹脂。將Fmoc-Glu-OtBu(10.08g，23.69mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TCTU，8.42g，23.69mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(7.43mL，42.64mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(120mL)中的溶液添加至樹脂並將混合物搖動共16hr。過濾樹脂並以N,N-二異丙基乙基胺(5.5mL，31.59mmol)於甲醇/二氯甲烷混合物(9：1，150mL)中的溶液處理(5min)。然後以N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)與N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)洗滌樹脂。
藉由以於N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶(2 x 150mL，1 x 5min，1 x 20min)處理來移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)、2-丙醇(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)與N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)洗滌樹脂。將Fmoc-Glu-OtBu(10.08g，23.69mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TCTU，8.42g，23.69mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(7.43mL，42.64mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(120mL)中的溶液添加至樹脂並將混合物搖動共16hr。過濾樹脂並以N,N-二異丙基乙基胺(5.5mL，31.59mmol)於甲醇/二氯甲烷混合物(9：1，150mL)中的溶液(5min)處理。然後以N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)與N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)洗滌樹脂。
藉由以於N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶(2 x 150mL，1 x 5min，1 x 20min)處理來移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)、2-丙醇(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)與N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)洗滌樹脂。將十四烷二酸單三級丁基酯(7.45g，23.69mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TCTU，8.42g，23.69mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(7.43mL，42.64mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(40mL)與二氯甲烷(80mL)之混合物中的溶液添加至樹脂並將混合物搖動共16hr。過濾樹脂並以二氯甲烷(2 x 150mL)、N,N-二甲基甲醯胺(2 x 150mL)、甲醇(2 x 150mL)與二氯甲烷(10 x 150mL)洗滌。
藉由以三氟乙醇(150mL)處理過夜來將產物自樹脂切下。濾出樹脂並以二氯甲烷(3 x 100mL)洗滌。在減壓下移除溶劑。藉由管柱色層分離法在矽膠上純化殘餘物(梯度洗提二氯甲烷/甲醇100：0至95：5)，得到呈白色固體的標題化合物。
將產物於真空中乾燥以產生(S)-2-((S)-4-三級丁氧基羰基-4-{(S)-4-三級丁氧基羰基-4-[(S)-4-三級丁氧基羰基-4-(13-三級丁氧基羰基-十三醯基胺基)-丁醯基胺基]-丁醯基胺基}-丁醯基胺基)-戊二酸1-三級丁基酯。
產率：14.77g(89%)。
1H NMR光譜(300MHz,CDCl3,δ H)：7.22(d,J=7.7Hz,1 H)；6.97(d,J=7.9Hz,1 H)；6.72(d,J=7.9Hz,1 H)；6.41(d,J=7.9Hz,1 H)；4.59-4.43(m,4 H)；2.49-2.13(m,16 H)；2.06-1.72(m,4 H)；1.70-1.52(m,4 H)；1.52-1.38(m, 45 H)；1.35-1.21(m,16 H)。
LC-MS純度：100%(ELSD)。
LC-MS Rt(Sunfire 4.6mm x 100mm，乙腈/水50：50至100：0+0.1% FA)7.39min。
LC-MS m/z：1055.0(M+H)+。
將所獲得的經三級丁基保護的十四烷二醯基-4xgGlu-OH((S)-2-((S)-4-三級丁氧基羰基-4-{(S)-4-三級丁氧基羰基-4-[(S)-4-三級丁氧基羰基-4-(13-三級丁氧基羰基-十三醯基胺基)-丁醯基胺基]-丁醯基胺基}-丁醯基胺基)-戊二酸1-三級丁基酯)溶解在四氫呋喃中。添加DIPEA然後添加溶解於乙腈中的TSTU。將反應混合物攪拌3h且然後將其於真空中蒸發、再溶解於乙酸乙酯中、以0.1M HCl(aq)洗滌、以MgSO4乾燥、過濾並於真空中蒸發。LC-MS(電噴灑)：m/z=1174.7(M+Na+)。計算值：1175.4。
將經保護且經OSu活化的化合物溶解於10mL TFA中並於室溫下攪拌過夜。添加二乙醚並濾出所形成的沈澱物並在真空上乾燥過夜以提供(S)-2-((S)-4-羧基-4-{(S)-4-羧基-4-[(S)-4-羧基-4-(13-羧基-十三醯基胺基)-丁醯基胺基]-丁醯基胺基}-丁醯基胺基)-戊二酸5-(2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基)酯(十四烷二醯基-4xgGlu-Osu)。
LC-MS(電噴灑)：m/z=872.2(M+H+)。計算值：871.9。
用於在固相上合成醯化試劑的一般程序： 十四烷二醯基-gGlu-2xOEG-OSu(Chem.5)之合成
13-{(S)-1-三級丁氧基羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}-十三酸三級丁基酯
使2-氯三苯甲基樹脂100-200篩孔1.7mmol/g(79.8g，135.6mmol)在乾二氯甲烷(450mL)中膨脹20分鐘。將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，34.9g，90.4mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(59.9mL，343,6mmol)於乾二氯甲烷(100mL)中的溶液添加至樹脂並將混合物搖動共4hr。過濾樹脂並以N,N-二異丙基乙基胺(31.5mL，180.8mmol)於甲醇/二氯甲烷混合物(4：1，150mL)中的溶液處理(2 x 5min)。然後以N,N-二甲基甲醯胺(2 x 300mL)、二氯甲烷(2 x 300mL)與N,N-二甲基甲醯胺(3 x 300mL)洗滌樹脂。藉由以於二甲基甲醯胺中的20%哌啶(1 x 5min，1 x 30min，2 x 300mL)處理來移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺(3 x 300mL)、2-丙醇(2 x 300mL)與二氯甲烷(350mL，2 x 300mL)洗滌樹脂。
將{2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，52.3g，135.6mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TCTU，48.2g，135.6mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(42.5mL，244.1mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(250mL)中的溶液添加 至樹脂並將混合物搖動共2hr。由於寧海準測試仍為陽性，過濾樹脂並以相同量的試劑處理另外30分鐘。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺(2 x 300mL)、二氯甲烷(2 x 300mL)與N,N-二甲基甲醯胺(3 x 300mL)洗滌。藉由以於二甲基甲醯胺中的20%哌啶(1 x 5min，1 x 30min，2 x 300mL)處理來移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺(3 x 300mL)、2-丙醇(2 x 300mL)與二氯甲烷(350mL，2 x 300mL)洗滌樹脂。
將(S)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-戊二酸1-三級丁基酯(Fmoc-LGlu-OtBu,57.7g，135.6mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TCTU，48.2g，135.6mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(42.5mL，244.1mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(250mL)中的溶液添加至樹脂並將混合物搖動共1hr。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺(2 x 300mL)、二氯甲烷(2 x 300mL)與N,N-二甲基甲醯胺(2 x 300mL)洗滌。藉由以於二甲基甲醯胺中的20%哌啶(1 x 5min，1 x 30min，2 x 300mL)處理來移除Fmoc基團。以N,N-二甲基甲醯胺(3 x 300mL)、2-丙醇(2 x 300mL)與二氯甲烷(350mL，2 x 300mL)洗滌樹脂。
將十四烷二酸單三級丁基酯(C14(OtBu)-OH，42.7g，135.6mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TCTU，48.2g，135.6mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(42.5mL，244.1mmol)於二氯甲烷/N,N-二甲基甲醯胺混合物(4：1，300mL)中的溶液添加至樹脂並將混合物搖動共1.5hr。過濾樹脂並以N,N-二甲基甲醯胺(6 x 300mL)、二氯甲烷(4 x 300mL)、甲醇(4 x 300mL)與二氯甲烷(7 x 600mL)洗滌。藉由以2,2,2-三氟乙醇(600mL)處理18hr而自樹脂切下產物。濾出樹脂並以 二氯甲烷(4 x 300mL)、二氯甲烷/2-丙醇混合物(1：1，4 x 300mL)、2-丙醇(2 x 300mL)與二氯甲烷(6 x 300mL)洗滌。將溶液結合；蒸發溶劑並藉由管柱色層分離法(Silicagel 60A，0.060-0.200mm；洗提液：二氯甲烷/甲醇1：0-9：1)純化粗產物。
於真空中乾燥並獲得呈橘色油的純13-{(S)-1-三級丁氧基羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}-十三酸三級丁基酯。
產率：55.2g(77%)。
RF(SiO2，二氯甲烷/甲醇9：1)：0.35。
1H NMR光譜(300MHz,CDCl3,δ H)：7.37(bs,1 H)；7.02(bs,1 H)；6.53(d,J=7.9Hz,1 H)；4.54-4.38(m,1 H)；4.17(s,2 H)；4.02(s,2 H)；3.82-3.40(m,16 H)；2.37-2.12(m,7 H)；2.02-1.82(m,1 H)；1.71-1.51(m,4 H)；1.47(s,9 H)；1.43(s,9 H)；1.25(bs,16 H)。
LC-MS純度：100%。
LC-MS Rt(Sunfire 4.6mm x 100mm，乙腈/水70：30至100：0+0.1% FA)：3.93min。
LC-MS m/z：791.0(M+H)+。
將13-{(S)-1-三級丁氧基羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}-十三酸三級丁基酯(十四烷二醯基-gGlu-2xOEG-OH，8.89g，11,3mmol)溶解於100mL的乙腈中，並將TSTU(4.07g，13.5mmol)與DIPEA(2.35mL，13.5mmol)添加至受攪拌的溶液並將混合物於室溫攪拌1個小時。蒸發溶劑並將殘餘 物溶解於二氯甲烷中並以0.05M HCl洗滌兩次。
乾燥(MgSO4)有機相並於真空中蒸發。此提供9.98g(100%)呈油的13-((S)-1-三級丁氧基羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-丙基胺甲醯基)-十三酸三級丁基酯。
將13-((S)-1-三級丁氧基羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-丙基胺甲醯基)-十三酸三級丁基酯(4g)溶解於三氟乙酸(10mL)中並將混合物於室溫攪拌1個小時並於真空中蒸發。將殘餘物溶解於二氯甲烷(10mL)中並於真空中蒸發。添加冷二乙醚(10mL)造成了白色油脂狀固體之沈澱。藉由傾倒分離此並於真空中乾燥。此提供了3.4g(定量)的14-[[(1S)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基-2-側氧基乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-4-側氧基丁基]胺基]-14-側氧基十四酸(十四烷二醯基-gGlu-2xOEG-Osu)，其被儲存在-18℃下。
LC-MS(電噴灑)：m/z=775,33；計算值：774,8。
用於胰島素之醯化與經醯化類似物之純化的一般程序(A)
用於醯化與純化本發明之胰島素衍生物的一般程序(A)係於以下實施例1詳細描述，且已應用於合成如以下指出的其他化合物。使用其他方法(如以上描述者)的純化亦已用於此等衍生物中的一些。
本發明之經醯化類似物係藉由於水性環境中於諸如pH 9.5、 10、10.5、11、11.5、12、12.5或13的高pH下醯化的重組胰島素類似物之醯化來製造。可將醯化試劑溶解於水中或於非水性極性溶劑(諸如DMF或NMP)中，並伴隨著強力的攪拌添加至胰島素溶液。在添加醯化試劑後，藉由HPLC分析轉化且(若需要)添加更多的醯化試劑。純化係如以上描述地完成。
用於經醯化類似物之固相合成與純化的一般程序(B)
用於本發明之胰島素衍生物之固相合成與純化的一般程序(B)係於以下詳細描述，且已應用於合成如以下指出的其他化合物。使用其他方法(如以上描述者)的純化亦已用於此等衍生物中的一些。
胰島素A與B鏈係於Prelude胜肽合成儀上使用一般基於Fmoc的固相胜肽偶聯方法製備。
所使用的樹脂：
Fmoc-Lys(Mtt)-Wang；與Fmoc-Arg-Pbf-Wang。
將胺基酸(於以下列舉)與oxyma溶解在DMF中至0.3M的濃度：Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Glu(OtBu)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH； 與Fmoc-Val-OH。
特殊/非天然胺基酸：Boc-Phe-OH；Boc-Gly-OH；與Fmoc-Cys(Acm)-OH。
程序
用於樹脂上的標準偶聯條件為：8eq胺基酸、DIC、柯林鹼與oxyma(乙基(羥基亞胺基)氰基醋酸酯)於NMP中共1個小時，至於Fmoc-Arg(Pbf)-OH，使用雙重偶聯方案(2x1h)。
所使用的標準脫保護條件為：於NMP中的20%哌啶(2x 5.5ml共2x 7.5min或2x 10min)，接著以NMP與DCM洗滌。
對於在自樹脂切下前於Lys醯化，使用以下方案(於此例子中N端的胺基酸係經Boc保護的)。
A鏈之在A22K上的Mtt基團脫保護與使用經tBu保護的經活化的醯化試劑([醯基]-[連接子]-Osu，例如十四烷二醯基-gGlu-2xOEG-Osu與十四烷二醯基-gGlu-2xOEG-Osu(兩者皆於末端與α羧基基團經以tBu酯的形式保護)的醯化
步驟1：將HFIP(12mL)添加至樹脂，並將反應搖動20min。在藉由過濾移除溶劑後，以DCM(4x15ml)洗滌樹脂並以氮氣流乾燥。
步驟2：將DMF(8mL)與DIPEA(1.5m)加至以上樹脂。然後添加經活化的醯化試劑之溶液(0.75g於2mL DMF中)並將反應搖動15h，倒出並以DCM(3x15ml)洗滌。
Mtt基團之脫保護與側鏈之連續製備
將HFIP(6mL)添加至樹脂，並將反應培養20min。在移除溶劑後，以DCM(6mL)洗滌樹脂。將HFIP(6ml)添加至樹脂，並將反應培養20min。以DCM(2x 7.5mL)與柯林鹼(2x 7.5mL)洗滌樹脂，接著再以DCM(2x 7.5mL)洗滌。
側鏈係藉由連續的標準偶聯使用Fmoc-Glu-OtBu、Fmoc-OEG-OH、與14-三級丁氧基-14-側氧基-十四酸或16-三級丁氧基-16-側氧基-十六烷酸建立。
A6C-A11C二硫鍵形成
將樹脂以於DCM/HFIP(30mL的1：1混合物)中的碘之0.5%溶液處理15min。在藉由過濾移除溶劑後，以DCM(3x20ml)洗滌樹脂並以氮氣流乾燥。
自樹脂切下A鏈並以S-S-吡啶基的形式活化A20-Cys
以TFA(30ml)、三異丙基矽烷(1mL)、水(0.75ml)與二硫二吡啶(0.75g)之溶液處理樹脂共3h，然後收集濾出物並將其添加至150ml乙醚(分至6個塑膠NUNC管中)以沈澱胜肽。於3500rpm下將管離心3min，倒出乙醚層，並重複此乙醚步驟3次。結合粗材料並使其於RT下乾燥過夜以給出所欲的胜肽A鏈。
自樹脂切下B鏈
以TFA(30ml)、三異丙基矽烷(1mL)、水(0.75mL)與二硫蘇糖醇(0.5g)之溶液處理樹脂3h，然後收集濾出物並將其添加至乙醚(150mL，分至6個塑膠NUNC管中)以沈澱胜肽。於3500rpm下將管離心3min，倒出乙醚層，並重複此乙醚步驟3次。使粗材料於RT下乾燥過夜以給出所欲的胜肽B鏈。
A20C-B19C二硫鍵形成
將DMSO(8mL)與DIPEA(1mL)添加至A鏈(0.33g)與B鏈(0.33g)之混合物並將混合物攪拌共20min，然後伴隨攪拌逐滴添加140mL的中性緩衝劑溶液(水、TRIS(10mM)、硫酸銨(15mM)、20%乙腈)達到大約150ml的總體積。
然後藉由逆相色層分離法使用以下設置純化混合物
˙Phenomenex Gemini 5μM 5u C18 110Å 30x250mm管柱，以20mL/min流動，10% B至60% B，在40min的期間
˙洗提劑A=10mM TRIS、15mM硫酸銨，pH=7.3、20% CAN，於milliQ水中
˙洗提劑B=20% miliQ水，於乙腈中
將純的部分倒在一起，快速冷凍並冷凍乾燥。
A7C-B7C二硫鍵形成
將來自前面的步驟的冷凍乾燥中間物再溶解在5mL DMSO 中。添加乙酸(20mL)與水(4mL)，然後添加於AcOH中的碘(3mL，40mM)。
在20min的總反應時間後，以1M抗壞血酸鈉淬滅反應，然後將其加至水(90mL)之經攪拌的溶液。
然後藉由逆相色層分離法使用以下設置純化混合物：
˙Phenomenex Gemini 5μM 5u C18 110Å30x250mm管柱，以20mL/min流動，10% B至45% B，在40min的期間
˙洗提劑A=0.1% TFA，於milliQ水中
˙洗提劑B=0.1% TFA，於乙腈中
將純的部分倒在一起，快速冷凍並冷凍乾燥以給出所欲的產物。
實施例1 一般程序(A)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與16)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
將A22K,B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素(0.5g，0.084mmol)溶解在7ml 100mM Na2CO3水溶液中。藉由添加1N NaOH水溶液來將pH調整至11.3。將14-[[(1S)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基-2-側氧基乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-2-側氧基乙氧基]乙氧基]乙基胺基]-4-側氧基丁基]胺基]-14-側氧基十四酸(十四烷二醯基-gGlu-2xOEG-OSu)(0.26g，0.336mmol)溶解於1ml乙腈與1ml NMP之混合物中並在強力的攪拌下添加至胰島素溶液。在添加期間添加1N NaOH水溶液以將pH維持在10.5-11.4。將水(7mL)添加至混合物並添加1N HCl以酸化反應混合物(至pH 1.5)並添加乙腈(1mL)。藉由製備性HPLC(管柱：Phenomenex Axiai，5μM C18 110Å，30x250mm，使用10% B至40% B的梯度，於50min的期間，20ml/min。A緩衝劑：0.1% TFA，於水中，B緩衝劑：0.1% TFA，於乙腈中)純化混合物。將純的部分倒在一起並冷凍乾燥以提供106mg(19%)的標題胰島素。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1650.4(M+4)/4。計算值：1650.4。
實施例2 一般程序(A)
A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：2與16)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：{α}([GluA14,GluB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1641.9(M+4)/4。計算值：1641.3。
實施例3 一般程序(A)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：2與16)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱： N{α}([GluB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1674.7(M+4)/4。計算值：1674.2。
實施例4 一般程序(A)
A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：2與16)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluA14,GluB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1665.7(M+4)/4。計算值：1666.1。
實施例5 一般程序(A)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與17)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,ProB27,GluB28,Arg]329],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1642.0(M+4)/4。計算值：1642.4。
實施例6 一般程序(A)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與18)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB27,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1666.4(M+4)/4。計算值：1666.7。
實施例7 一般程序(A)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與20)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,AspB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1639.6(M+4)/4。計算值：1639.9。
實施例8 一般程序(B)
A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B28D,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：2與22)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluA14,GlnB3,AspB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧 基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1655.2.(M+4)/4。計算值：1655.4。
實施例9 一般程序(B)
A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：2與19)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluA14,GlnB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1665.7(M+4)/4。計算值：1665.9。
實施例10 一般程序(A)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與20)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,AspB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1664.1(M+4)/4。計算值：1664.3。
實施例11 一般程序(A與B)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與10)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB26,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1658.8(M+4)/4。計算值：1658.0。
實施例12 一般程序(A與B)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與11)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB26,Arg]329],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1650.8(M+4)/4。計算值：1651.1。
實施例13 一般程序(B)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27P,B28R, desB29,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與7)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB26,ProB27,ArgB28]-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B1-28)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1625.7(M+4)/4。計算值：1625.7。
實施例14 一般程序(B)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28R,desB29,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與14)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB27,ArgB28]-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]-丁醯基]Lys,(B1-B28)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1642.2(M+4)/4。計算值：1642.3。
實施例15 一般程序(B)
A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：1與11)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([ArgA8,GluB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1664.6(M+4)/4。計算值：1664.9。
實施例16 一般程序(B)
A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27P,B28R,desB29,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：1與7)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([ArgA8,GluB3,GluB27,ArgB28]-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B1-28)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1639.4(M+4)/4。計算值：1639.6。
實施例17 一般程序(B)
A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28R,desB29,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：1與14)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([ArgA8,GluB3,GluB27,ArgB28]-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B1-B28)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1655.7(M+4)/4。計算值：1656.1。
實施例18 一般程序(B)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B28R,desB29,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與5)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB26,GluB27,ArgB28]-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B1-B28)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1633.8(M+4)/4。計算值：1633.8。
實施例19 一般程序(B)
A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B28R,desB29,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：1與5)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([ArgA8,GluB3,GluB26,GluB27,ArgB28]-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B1-B28)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1647.5(M+4)/4。計算值：1647.6。
實施例20 一般程序(A與B)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B28E,B29P,B30R人類胰島素；(SEQ ID NO：3與21)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB28,ProB29,ArgB30]-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1691.9(M+4)/4。計算值：1691.8。
實施例21 一般程序(B)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28E,B29P,B30R人類胰島素；(SEQ ID NO：3與9)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB26,GluB28,ProB29,ArgB30]-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1683.3(M+4)/4。計算值：1683.4。
實施例22 一般程序(B)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29P,B30R人類胰島素；(SEQ ID NO：3與15)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB27,GluB28,ProB29,ArgB30]-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1698.7(M+4)/4。計算值：1698.9。
實施例23 一般程序(B)
A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：1與10)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([ArgA8,GluB3,GluB26,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1672.6(M+4)/4。計算值：1672.9。
實施例24 一般程序(B)
A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：1與16)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([ArgA8,GluB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1688(M+4)/4。計算值：1688.3。
實施例25 一般程序(A)
A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與18)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB27,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1649.3(M+4)/4。計算值：1649.4。
實施例26 一般程序(A)
A14E,A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：2與16)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluA14,GluB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基] 胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1648.7(M+4)/4。計算值：1647.8
實施例27 一般程序(A)
A14E,A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：2與16)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluA14,GluB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1672.7(M+4)/4。計算值：1672.0
實施例28 一般程序(A)
A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與16)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1681.3(M+4)/4。計算值：1680.5。
實施例29 一般程序(A)
A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與17)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱： N{α}([GluB3,ProB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1649.3(M+4)/4。計算值：1649.4。
實施例30 一般程序(A)
A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與17)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,ProB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1673.5(M+4)/4。計算值：1673.7。
實施例31 一般程序(A)
A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與16)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1657.2(M+4)/4。計算值：1656.3。
實施例32 一般程序(A)
A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與18)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB27,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1673.4(M+4)/4。計算值：1673.7。
實施例33 一般程序(A)
A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與20)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,AspB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1647.2(M+4)/4。計算值：1647.4。
實施例34 可根據一般程序(A或B)製備
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與8)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB26,AspB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
實施例35 可根據一般程序(A或B)製備
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B29P,B30R人類胰島素；(SEQ ID NO：3與6)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB26,GluB27,GluB28,ProB29,ArgB30]-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
實施例36 一般程序(B)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與4)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB26,GluB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1666.0(M+4)/4。計算值：1666.1
實施例37 一般程序(A)
A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與4)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,AspB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1671.1(M+4)/4。計算值：1671.1
實施例38 一般程序(A)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與17)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,ProB27,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1666.4(M+4)/4。計算值：1666.7
實施例39 一般程序(A)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B26E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與12)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GlnB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1650.9(M+4)/4。計算值：1650.8
實施例40 一般程序(A)
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B26E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與13)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GlnB3,GluB26,GluB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1658.7(M+4)/4。計算值：1658.9
實施例41 一般程序(A)
A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與11)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-胰島素-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1658.1(M+4)/4。計算值：1658.1
實施例42 一般程序(A)
A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與11)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-胰島素-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1633.9(M+4)/4。計算值：1633.9
實施例43 一般程序(A)
A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-4xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與11)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-胰島素-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1706.5(M+4)/4。計算值：1706.4
實施例44 一般程序(A)
A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-6xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與11)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-胰島素-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1779.1(M+4)/4。計算值：1779.0
實施例45 一般程序(A)
A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu-2xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與11)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GluB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-胰島素-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基 -4-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
LC-MS(電噴灑)：m/z=1730.9(M+4)/4。計算值：1730.7
實施例46 一般程序(A)
A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B26E,B29R,desB30人類胰島素；(SEQ ID NO：3與12)
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([GlnB3,GluB26,ArgB29],des-ThrB30-胰島素-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁 醯基]胺基]-丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
先前技術類似物1
A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B29R,desB30人類胰島素：WO 2009 022013；實施例45
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
先前技術類似物2
A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B29R,desB30人類胰島素：先前技術類似物1之十四烷二酸類似物
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙醯基]Lys,(B)-胜肽。
此類似物係於例如WO 2009 022013實施例45中揭示的十六烷二酸類似物(先前技術類似物1)之十四烷二酸類似物。胰島素取代(=突變)與於WO 2009 022013中描述者相同，且唯一的差別係脂肪二酸之長度和隨之的與增加二酸長度聯結的血清白蛋白結合親和力。
先前技術類似物3
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B28D,B29R,desB30人類胰島素：於WO 2007 096431中揭示的胰島素類似物之十四烷二醯基-4xgGlu類似物
IUPAC(OpenEye，IUPAC式樣)名稱：N{α}([AspB28,ArgB29],des-ThrB30-胰島素(人類)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三醯基胺基)丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]胺基]丁醯基]Lys,(B)-胜肽。
於此胰島素類似物(A22K,B28D,B29R,desB30)中的B28D取代已於先前技術中揭示。然而，於此參考分子中，側鏈係自藉由連接子4xgGlu連接的十四烷二酸衍生(與本發明中的類似物之許多者相同)。
此係為直接去評估將B3N(於人類胰島素中和於先前技術中)改變成B3E之有益且無法預期的功效。
先前技術類似物4
A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B26E,B28E,B29R,desB30人類胰島素：於WO 2009 022013中揭示的胰島素類似物之十四烷二醯基-gGlu-2xOEG類似物
B28E取代已於先前技術(於A22K,B28E,B29R,desB30，WO 2009 02213)中提及。進一步地，已建議將B26修改成Q、E、S、或desB26(WO 2009 02213)。B28E與B26E之組合尚未被建議過，且於此參考分子中，側鏈係自十四烷二酸(透過連接子gGlu-2xOEG連接)衍生(與本發明中的類似物之許多者相同).
此係為直接去評估將B3N(於人類胰島素中和於先前技術中)改變成B3E之有益且無法預期的功效。
先前技術類似物5
A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B28E,B29R,desB30人類胰島素：如WO 2009 022013中的實施例18所揭示的具有基於十八烷二酸的側鏈的類似的胰島素類似物(十八烷二醯基-gGlu-2xOEG)之十四烷二醯基-4xgGlu類似物
此胰島素類似物中的取代(A22K,B28E,B29R,desB30)已於先前技術中揭示。然而，於此參考分子中，側鏈係自透過連接子4xgGlu連接的十四烷二酸(非如於先前技術中的十八烷二酸)衍生(與本發明中的類似物之許多者相同)。
此係為直接去評估將B3N(於人類胰島素中和於先前技術中)改變成B3E之有益且無法預期的功效。
先前技術類似物6
A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B28E,B29R,desB30人類胰島素：如WO 2009 022013中的實施例18揭示的具有基於十八烷二酸的側鏈的類似的胰島素類似物(十八烷二醯基-gGlu-2xOEG)之十四烷二醯基-gGlu-2xOEG類似物
於此胰島素類似物中的取代(A22K,B28E,B29R,desB30)已於先前技術中揭示。然而，於此參考分子中，側鏈係自透過連接子gGlu-2xOEG連接的十四烷二酸(而非如先前技術中的十八烷二酸)衍生(與本發明中的類似物之許多者相同)。
此係為直接去評估將B3N(於人類胰島素中和於先前技術中)改變成B3E之有益且無法預期的功效。
實施例47 本發明所挑選的胰島素衍生物之胰島素受體親和力，在溶解的受體上測量
本發明之胰島素類似物對於人類胰島素受體(IR)的相對結合親和力係藉由競爭結合於鄰近閃爍分析(SPA)中測定(根據Glendorf T等人(2008)Biochemistry 47 4743-4751)。
簡言之，人類胰島素標準品與欲測試的胰島素類似物之稀釋系列係於於96槽孔Optiplate(Perkin-Elmer Life Sciences)中進行，接著添加[125I-A14Y]-人類胰島素、抗IR小鼠抗體83-7、溶解的人類IR-A(藉由小麥胚芽凝集素色層分離法自過度表現IR-A全受體的倉鼠嬰腎(BHK)細胞部分純化)、與SPA珠粒(抗小鼠聚乙烯甲苯SPA珠粒，GE Healthcare)，於由以下者所組成的結合緩衝劑：100mM HEPES(pH 7.8)、100mM NaCl、10mM MgSO4、與0.025%(v/v)Tween 20。將盤於22℃下伴隨著溫和的搖動培養22-24h，以2000rpm離心2分鐘並於TopCount NXT(Perkin-Elmer Life Sciences)上計數。
根據四參數對數模式分析來自SPA的數據(Vølund A(1978) Biometrics 34 357-365)，且類似物之結合親和力係與在相同的盤中測量的人類胰島素標準品之結合親和力比較來計算。
亦使用相關的分析，其中結合緩衝劑含有1.5% HSA(w/v)(Sigma A1887)以模擬更生理的條件。
本發明所挑選的胰島素類似物之胰島素受體親和力與其他試管內數據係於以下表1中呈現。
實施例48 本發明所挑選的胰島素衍生物之胰島素與類胰島素生長因子-1受體親和力，在與膜聯結的受體上測量
與膜聯結的人類IR與IGF-1R係自含有人類IR-A、IR-B或IGF-IR插入的pZem219B載體穩定轉染的BHK細胞純化。BHK細胞係於冰冷緩衝劑(25mM HEPES pH 7.4，25mM CaCl2與1mM MgCl2，250mg/L枯草菌素，0.1mM Pefablock)中收穫與均質化。將均質物在41%(w/v)蔗糖墊上堆積成層並於4℃下於95000g下離心75分鐘。收集血漿膜，以緩衝劑(如上)稀釋1：5並於4℃下於40000g下再次離心45分鐘。將小丸再懸浮於最小體積的緩衝劑中並透過針(尺寸23)抽取三次，然後於-80℃下儲存直到使用。
對與膜聯結的人類IR-A、IR-B或IGF-1R之一的相對結合親和力係藉由競爭結合在SPA設置中測定。IR分析係以二重複於96槽孔OptiPlate(Perkin-Elmer Life Sciences)中進行。將膜蛋白質於25℃下伴隨溫和的攪拌以以下者培養150分鐘：於總體積200μL的分析緩衝劑(50mM HEPES、150mM NaCl、5mM MgSO4、0.01% Triton X-100、0.1%(w/v)HSA(Sigma A1887)、完全無EDTA的蛋白酶抑制劑)中的50pM[125I-A14Y]-人類胰島素、50μg經小麥胚芽凝集物(WGA)塗覆的PVT微球(GE Healthcare)與漸增濃度的配體。藉由於2000rpm下將盤離心2分鐘來終止分析並在TopCount NXT(Perkin-Elmer Life Sciences)上計數來定量所結合的放射活性。
除了利用與膜聯結的IGF-1R與50pM[125I-Tyr31]-人類IGF-1外，以基本上如對IR結合分析所實施者實施IGF-1R分析。根據四參數對數模式(Vølund A(1978)Biometrics 34 357-365)分析來自SPA的數據，並與在相同盤內測量的人類胰島素標準品之結合親和力比較來計算欲測試的類似物之結合親和力。
本發明所挑選的胰島素類似物之IR(A同功型)、IR(B同功型)、與IGF-1R結合數據係於以下表1給出。
實施例49 於大鼠脂肪細胞中的脂肪生成
作為本發明之胰島素之試管內效能之度量，可使用脂肪生成。
自附睪脂肪墊分離原代大鼠脂肪細胞並以於含有例如0.1%無脂肪HSA與標準品(人類胰島素，HI)或本發明之胰島素之一的緩衝劑中的3H-葡萄糖培養。經標定的葡萄糖被以劑量依賴性的方式轉換成可抽取的脂質，導致完全劑量反應曲線。結果係以相對效能(%)之形式表現，而與標準品(HI)比較本發明之胰島素信賴界限為95%。
數據係於以上表1給出。
實施例50 藉由小角度X光散射(SAXS)測量的自我聯結
使用SAXS數據以估計欲測試的胰島素類似物在皮下注射後的自我聯結狀況。自含有0.6mM的欲測試的胰島素類似物與140mM NaCl且pH 7.4的無Zn調配物收集SAXS數據。對於每個類似物，使用以下事實估計單體、二聚體與較大的物種之相對量：多組份混合物中的所有個別組份對SAXS散射輪廓有強度貢獻。藉由使用來自各個組份的強度(形狀因數)，可以估計混合物中各組份之體積分率貢獻。使用運用非負或無約束最小平方之演算法的線性方程式系統以最小化實驗散射曲線與計算的散射曲線間的誤差。自單體、二聚體、六聚體等等之結晶體結構計算形狀因數。 體積分率係以百分比(%)的形式表現。
自本發明之衍生物獲得的結果與先前技術之衍生物之結果係於以下表2顯示。
自此等研究，可獲得以下結論：於模擬注射後的皮下組織中的條件的條件下，本發明之衍生物遠較傾向於分離成單體且因此在皮下注射後相較於先前技術之類似的類似物會遠較快地被吸收。本發明之類似物之單體與二聚體相加的含量範圍在96-100%，且大於二聚體的物種含量極少(至多4%)。
先前技術之類似物之大部分係由遠大於本發明之類似物的物種構成，只有一個例外(先前技術類似物4)。然而，此類似物在無鋅調配物中不穩定，如於以下實施例中顯示的。
實施例51 醫藥製劑之製備
本發明之醫藥製劑可以水溶液的形式調配。水溶液係以(例如)氯化鈉及/或甘油調成等張的。此外，水性培養基可含有緩衝劑與保存劑。製劑之pH值被調整至所欲的值且可在約3至約8.5間、在約3與約5 間、或約6.5、或約7.4、或約7.5，取決於討論中的胰島素類似物之等電位點(pI)。
無鋅胰島素調配物之製備
將無鋅胰島素類似物溶解於水溶液中，其在最終調配物中含有0.6mM胰島素類似物、16mM間甲酚、16mM酚與適當量的菸鹼醯胺與甘油，且pH係使用1N氫氯酸/1N NaOH調整至7.3-7.5(於室溫下測量)。添加水以達最終體積並將溶液透過0.2μm濾紙無菌過濾。將調配物充入2ml小瓶中並使用鉗口蓋(crimp cap)密封。
實施例52 用於評估蛋白質調配物之物理穩定性的ThT微纖維生成分析
胜肽之低物理穩定性可能導致澱粉樣微纖維形成，其被以樣 本中的良序絲狀巨分子結構之形式觀察到，最終導致凝膠形成。當與微纖維結合時，硫代黃素T(ThT)具有獨特的螢光特徵(Naiki等人(1989)Anal.Biochem.177 244-249；LeVine(1999)Methods.Enzymol.309 274-284)。
胜肽之部分折疊中間物之形成被建議為微纖維生成之一般起始機制。該等中間物中僅有很小部分集結以形成於其上其他中間物可集合且微纖維生成進行的模版。延遲時間對應於其中核之臨界質量被建立起的間隔且明顯速率常數係微纖維本身形成的速率(圖1)。
樣本製備
樣本係於各個分析前新鮮地製備。各個組成物之樣本係與水性ThT-溶液(0.1mM ThT)以990：10的體積比率混合並轉移至96槽孔微滴定盤(Packard Opti-PlateTM-96，白色聚苯乙烯)。通常，將各樣本(對應於一個測試條件)之四或八個重複物置於一排槽孔中。將盤以Scotch 15 Pad(Qiagen)密封。
培養與螢光測量
於給定溫度的培養、搖動與ThT螢光發射之測量係於Fluososkan Ascent FL螢光讀盤機或Varioskan讀盤機(Thermo Lab Systems)中完成。將溫度調整至37℃。將軌道式搖床調整成960rpm，在所有所呈現的數據中幅度皆為1mm。螢光測量係使用透過444nm濾鏡的激發與透過485nm濾鏡的發射之測量完成。各次運轉係以於分析溫度下將盤培養10分鐘來起始。每20分鐘測量盤一次共45個小時。在每次測量間，如描述地搖動並 加熱盤。
數據處理
於Microsoft Excel中產生螢光vs.時間圖並將延遲時間以在遲延區與纖維化區之線性近似間的截距的形式估計，如於圖1A、1B與1C中闡明的。延遲時間增加對應於物理穩定性增加。數據點典型為四或八個樣本之平均。
針對本發明之A22K經醯化類似物獲得的結果與先前技術之類似的A22K經醯化類似物之結果係於以下表4顯示。
得到以下結論：相較於先前技術之類似的類似物，本發明之A22K經醯化胰島素類似物於添加或不添加菸鹼醯胺的無鋅調配物中展現較佳的或類似的對微纖維生成的穩定性(即具有增加的物理穩定性)。此係非常令人意外的，因為SAXS數據指出本發明之胰島素類似物尺寸較小(即由單體與二聚體構成)，其對技術領域中具有通常知識者而言會預期會導致較低的物理穩定性。
實施例53 胰島素化學穩定性之分析 粒徑排阻色層分離法 所使用的調配物：參見實施例52
高分子量蛋白質(HMWP)與單體胰島素類似物之定量測定係於Waters Acquity BEH200 SEC管柱(150x2.4mm，part no.186005225)上使用含有55%(v/v)乙腈、0.05% TFA的洗提液以0.2ml/min的流率與40℃的管柱溫度進行。使用可調吸收偵測器(Waters Acquity TUV)以215nm進行偵測。注射體積係1.5μl的600μM胰島素類似物調配物與600μM人類胰島素標準品兩者。於5、25與37℃下於2ml小瓶中培養各個類似物製劑。於所限定的時間，測量HMWP與製劑之含量。
結果係於以下表5顯示。
結論為由於無鋅調配物中於37℃下儲存造成的高分子量蛋白質(HMWP)之形成非常非常少，且少於或類似於先前技術之胰島素衍生物。
逆相色層分離法(UPLC)
與胰島素相關的雜質之測定係在UPLC系統上使用CSH苯基-己基管柱(2.1x150mm，1.7μm)(Waters part no.186005408)以0.3ml/min的流率於30℃下進行且於215nm下以UV偵測。使用由以下者所組成的移動相進行洗提：A：10%(v/v)乙腈、100mM磷酸氫二銨，pH 3.6，與B：80%(v/v)乙腈。梯度：0-3min自26% B線性改變至28.5% B，3-34min線性改變至37% B，34-36分鐘線性改變至80% B以洗滌管柱，之後於39min回復初始條件26% B。以呈在保存劑之洗提後測定的總吸收面積之百分比的吸收面積之形式測定雜質之量。於5、25與37℃下於2ml小瓶中培養各個類似物製劑。於限定的時間，測量製劑之與胰島素相關的雜質。
結果係於以下表6顯示。
得到以下結論：相較於先前技術之類似的A22K經醯化類似物，在無鋅調配物中本發明之胰島素衍生物遠較穩定。先前技術之類似物極不穩定以至於於無鋅調配物中在儲存2週後觀察到7-12%(絕對)純度喪失與在儲存5週後觀察到約20%純度喪失。先前技術之類似物之穩定性不足以去用於無鋅調配。本發明之類似物展現顯著較少的純度喪失且因此遠較穩定且十分適用於無鋅調配。
實施例54 LYD豬中的皮下PK/PD輪廓
根據此方案，本發明之胰島素衍生物可藉由皮下投予至豬來測試，例如與呈商業上可購得的調配物的胰島素aspart(NovoRapid)比較或與先前技術之類似的A22K經醯化胰島素類似物比較。可針對藥動學及/或藥效學參數來測試衍生物。
所使用的一般方法 超音波檢查與注射區域之標記
在用於佈置永久靜脈內導管的麻醉期間，藉由超音波使用Esaote超音波掃描器型號「MyLabFive」與線性探針型式「LA435 6-18MHz」來檢查豬。鑑認出在耳部與肩胛骨間的頸部中部，右或左側(與導管相反)，下面沒有肌肉的2 x 2cm之區域(適用於皮下注射)並藉由刺青標記。
餵食時間表
在實驗前使豬禁食(無早餐)。
在整個實驗期間豬係於其等之正常圍欄中且其等未被麻醉。使豬禁食直到已收集12個小時的血液樣本，但使其等可自由得到水。在12個小時的血液樣本後，以食物與蘋果餵食養豬。
給藥
將Penfill裝在NovoPen®4中。對每隻豬使用新的針。使用針塞以確保最大s.c.穿透到表皮下5mm。對每隻豬計算並註記劑量體積(IU體積)。
劑量體積(U)=((重量x劑量nmol/kg)/濃度nmol/ml)x 100U/mL
豬係在頸部之右或左側(與導管相反)的皮下組織中側面給藥且在注射後使針保持在皮下組織中最少10秒鐘以確保化合物之堆積。
低血糖之治療
在皮下給藥後，葡萄糖溶液應已被準備好以用於i.v.注射以預防低血糖，即將4-5個注射器(20mL)充以無菌20%葡萄糖，準備好使用。低血糖之診斷係基於臨床的徵候與在血糖儀(Glucocard X-meter)上的血液葡萄糖測量結果。
治療係由緩慢i.v.注射50-100ml 20%葡萄糖(10-20g葡萄糖)組成。在5-10分鐘的期間逐部分給予葡萄糖直到有效。
血液取樣
在實驗前以無添加10IU/mL肝素的無菌0.9% NaCl來檢查頸靜脈導管之開放性。
在給藥前與給藥後，於以下時間點在畜舍中自中央靜脈導管取血液樣本：給藥前(-10、0)、3、6、9、12、15、20、30、45、60、90、120、150、180、240、300、360、420、480、540、600與720分鐘
以3向栓閥取樣本。在取樣本前抽4-5mL的廢血並丟棄。
將0.8ml血液樣本收集至塗有EDTA的管中以用於葡萄糖與胰島素分析。
在每個血液樣本後，將導管以5mL未添加10IU/mL肝素的無菌0.9% NaCl沖洗。
將管溫和地傾斜最少10次以確保血液與抗凝血劑(EDTA)充分混合且於一分鐘後將其放置在濕冰上。於取樣後1個小時內於3000rpm 與4℃下旋轉管10min。將樣本儲存在濕冰上直到以移液管移動。
需要無菌技術以避免導管中會增加凝塊之風險的細菌生長。
實驗後導管之封閉
若血液取樣未使用無菌技術進行，可通過已用於血液取樣的導管緩慢地i.v.投予使用1ml每10kg Pentrexyl®(1g的胺苄青黴素，溶解於10ml 0.9% NaCl中)的單一靜脈內治療。於此治療後，以10ml 0.9% NaCl沖洗導管。
以添加肝素(10IU/ml)的5mL無菌0.9% NaCl沖洗導管。以具有乳膠注射膜的新luer鎖緊接口封閉導管並透過膜注射1.0mL的TauroLockHep500作為導管之閉鎖。
血液樣本之分析
血漿葡萄糖：以移液管將10ul的血漿移至500ul的緩衝劑溶液中以於BIOSEN自動分析儀測量血漿中的葡萄糖濃度。
血漿胰島素：以移液管將1 x 50μl的血漿移至0.65ml Micronic®管(ELISA/LOCI/SPA設置)中以用於分析，使用ELISA或LC-MS。
於-20℃下冷凍儲存血漿。
實施例55 於LYD豬中實施例12之胰島素衍生物之皮下PK/PD輪廓
按照以上一般程序，針對實施例12之胰島素衍生物(A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素)獲得以下PK與PD輪廓。
所使用的調配物
化合物實施例12，608.6μM；1.6%(w/vol)甘油；16mM酚；16mM間甲酚；7mM磷酸鹽，10mM氯化鈉；pH=7.4(0個Zn/六聚體)，1nmol/kg。
此等測定之結果係於所附的圖5A與5B以及以下表1中呈現。
圖5A與5B分別顯示實施例12之胰島素衍生物(即A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素)(以每6個胰島素分子0個鋅調配)之PK(藥動學)輪廓(胰島素濃度vs.時間)(1nmol/kg)以及所導致的血漿葡萄糖之改變(1nmol/kg)。
得到以下結論：實施例12之胰島素衍生物(於無鋅調配物中)與具有早Tmax(45分鐘)與短MRT(91分鐘)以及短T½(46分鐘)兩者的引人注目的輪廓聯結。此使此胰島素高度有用於餐中使用。
實施例56 於LYD豬中實施例1之胰島素衍生物之皮下PK/PD輪廓
按照以上一般程序，針對實施例1之胰島素衍生物(A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素)獲得以下PK與PD輪廓。
所使用的調配物
實施例1之化合物，611.6μM；2%(w/vol)甘油；16mM酚；16mM間甲酚；7mM磷酸鹽；pH=7.4(0個Zn/六聚體)，1nmol/kg。
此等測定之結果係於所附的圖6A與6B以及以下表2中呈現。
圖6A與6B分別顯示實施例1之胰島素衍生物(即A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素)(以每6個胰島素分子0個鋅調配)之PK(藥動學)輪廓(胰島素濃度vs.時間)(1nmol/kg)以及所導致的血漿葡萄糖之改變(1nmol/kg)。
得到以下結論：實施例1之胰島素衍生物(於無鋅調配物中)與具有早Tmax(30分鐘)與短MRT(113分鐘)以及短T½(103分鐘)兩者 的引人注目的輪廓聯結。此使此胰島素高度有用於餐中使用。
實施例57 於LYD豬中實施例7之胰島素衍生物之皮下PK/PD輪廓
按照以上一般程序，針對實施例7之胰島素衍生物(A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素)獲得以下PK與PD輪廓。
所使用的調配物
實施例7之化合物，610μM；2%(w/vol)甘油；16mM酚；16mM間甲酚；7mM磷酸鹽；pH=7.4(0個Zn/六聚體)，1nmol/kg。
此等測定之結果係於所附的圖7A與7B以及以下表3中呈現。
圖7A與7B分別顯示實施例7之胰島素衍生物(即A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素)(以每6個胰島素分子0個鋅調配)之PK(藥動學)輪廓(胰島素濃度vs.時間)(1nmol/kg)以及所導致的血漿葡萄糖之改變(1nmol/kg)。
得到以下結論：實施例7之胰島素衍生物(於無鋅調配物中)與具有早Tmax(30分鐘)與短MRT(133分鐘)以及短T½(86分鐘)兩者的引人注目的輪廓聯結。此使此胰島素高度有用於餐中使用。
實施例58 於LYD豬中實施例10之胰島素衍生物之皮下PK/PD輪廓
按照以上一般程序，針對實施例10之胰島素衍生物(A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素)獲得以下PK與PD輪廓。
所使用的調配物
實施例10之化合物，610μM；2%(w/vol)甘油；16mM酚；16mM間甲酚；7mM磷酸鹽；pH=7.4(0個Zn/六聚體)，1nmol/kg。
此等測定之結果係於所附的圖8A與8B以及以下表4中呈現。
圖8A與8B分別顯示實施例10之胰島素衍生物(即A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素)(以每6個胰島素分子0個鋅調配)之PK(藥動學)輪廓(胰島素濃度vs.時間)(1nmol/kg)以及所導致的血漿葡萄糖之改變(1nmol/kg)。
得到以下結論：實施例10之胰島素衍生物(於無鋅調配物中)係與具有早Tmax(25分鐘)與短MRT(118分鐘)以及短T½(97分鐘) 兩者的引人注目的輪廓聯結。此使此胰島素高度有用於餐中使用。
實施例59 於LYD豬中先前技術之胰島素衍生物之皮下PK/PD輪廓
按照以上一般程序，針對先前技術之胰島素衍生物(先前技術類似物1)(A22K(N(eps)-十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B29R,desB30人類胰島素)(WO 2009/022013實施例45)獲得以下PK與PD輪廓。
所使用的調配物
WO 2009/022013實施例45之化合物，588μM；1.6%(w/vol)甘油；30mM酚；7mM tris，pH=7.4(0個Zn/六聚體)，1nmol/kg。
此等測定之結果係於所附的圖3A與3B以及以下表11中呈現。
圖3A與3B分別顯示先前技術之胰島素衍生物(即A22K(N(eps)-十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B29R,desB30人類胰島素)(WO 2009/022013實施例45)(以每6個胰島素分子0個鋅調配)之PK(藥動學)輪廓(胰島素濃度vs.時間)(1nmol/kg)以及所導致的血漿葡萄糖之改變(1nmol/kg)。
得到以下結論：先前技術之胰島素衍生物(WO 2009/022013實施例45)(於無鋅調配物中)係與延長的曳尾(可能源自皮下積存之一部份之延遲吸收)聯結。此胰島素於24個小時(1440分鐘)時間點的血漿濃度係98pM。進一步地，血液葡萄糖降低功效被延伸至持續至少8個小時(480分鐘)。平均滯留時間係1287分鐘，幾乎為1日。此使先前技術之此胰島素不適用於餐中使用。
實施例60 於LYD豬中先前技術之胰島素衍生物之接近類似物之皮下PK/PD輪廓
按照以上一般程序，針對代表如於WO 2009/022013(特別參見實施例45(A22K(N(eps)-十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B29R,desB30人類胰島素)中描述的先前技術的C14二酸類似物(先前技術類似物2)(A22K(N(eps)-十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B29R,desB30人類胰島素)獲得以下PK與PD輪廓。
所使用的調配物
A22K(N(eps)-十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B29R,desB30人類胰島素(WO 2009/022013實施例45之1,16-十六烷二醯基(C16二酸)類似物之1,14-十四烷二醯基(C14二酸)類似物)，588μM；1.6%(w/vol)甘油；30mM酚；7mM tris，pH=7.4(0個Zn/六聚體)
此等測定之結果係於所附圖4A與4B與以下表12中呈現。
圖4A與4B分別顯示先前技術類似物2(代表先前技術(即A22K(N(eps)-十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B29R,desB30人類胰島素(WO 2009/022013實施例45，先前技術類似物1))的胰島素衍生物之C14二酸類似物)(以每6個胰島素分子0個鋅調配)之PK(藥動學)輪廓(胰島素濃度vs.時間)(72nmol/動物)以及所導致的血漿葡萄糖之改變(72nmol/動物)。
得到以下結論：先前技術(WO 2009/022013實施例45)之胰島素衍生物之C14二酸版本(於無鋅調配物中)係與延長的曳尾(可能源自皮下積存之一部份之延遲吸收)聯結。此胰島素於10個小時(600分鐘)時間點的血漿濃度係24pM。發現此先前技術之C14二酸類似物之平均滯留時間(MRT)是271分鐘。
由本發明之實施例1與2之C14二酸類似物獲得的相對應結果分別係165與111分鐘。進一步，血液葡萄糖降低功效被延伸至持續至少11個小時(660分鐘)。
此使此先前技術之胰島素不適用於餐中使用。
實施例61 史-道二氏大鼠中本發明與先前技術之胰島素類似物之皮下PK/PD輪廓
根據此方案，本發明之胰島素衍生物可藉由皮下投予至大鼠來測試，例如與呈商業上可購得的調配物的胰島素aspart(NovoRapid)比較或與先前技術之類似的B29K經醯化胰島素類似物比較。可針對藥動學及/或藥效學參數來測試衍生物。
先前技術之胰島素衍生物僅在鋅離子之存在下於調配物中穩定，而本發明之胰島素衍生物在未加鋅下於調配物中穩定。為了比較本發明之胰島素衍生物之輪廓與先前技術之類似物之輪廓，於此方案中使用無鋅調配物測試本發明之類似物，且使用3個鋅離子每六聚體測試先前技術之類似物。此係為了獲得可在臨床上有用的(即化學與物理穩定的)調配物中獲得的最快PK輪廓。
活體內方案
將雄性史-道二氏大鼠(~400克)用於此等實驗。在測試前未使大鼠禁食。在三個小時的研究期間，使大鼠可自由得到水但非食物。於以下時間點自未經麻醉的動物抽取血液樣本(舌下靜脈；200μl放入microvette®200 EDTA管中)與收集血漿：0(給藥前胰島素衍生物)與給藥胰島素衍生物後3、7、15、30、60、120與180分鐘。大鼠係於頸部使用裝有Softfine® 12mm針的NovoPen Echo®皮下地給藥(25nmol/kg；600μM胰島素衍生物之調配物)。分別使用BIOSEN分析儀與免疫分析/LCMS分析來定量葡萄糖與胰島素衍生物之血漿濃度。
自測試本發明之類似物所得的結果與先前技術之結果係於表5與6以及以下圖式中給出：圖2A與2B分別顯示在皮下注射至史-道二氏大鼠後本發明之基於C14的類似物(分別為實施例11與12以及實施例4與10)之PK輪廓與先前技術之基於C14的類似物(先前技術類似物2與3以及先前技術類似物2與3)之PK輪廓；圖2C顯示在皮下注射至史-道二氏大鼠後本發明之基於C16的類似物(實施例33)之PK輪廓與先前技術之基於C16的類似物(先前技術類似物1)之PK輪廓；圖2D1與2D2顯示在皮下注射至史-道二氏大鼠後本發明之基於C14二酸的類似物之PD輪廓與先前技術之基於C14二酸的類似物之PD輪廓(得自於圖2A中顯示的PK輪廓)；與 圖2E1與2E2顯示在皮下注射至史-道二氏大鼠後本發明之基於C14二酸的類似物之PD輪廓與先前技術之基於C14二酸的類似物之PD輪廓(得自於圖2B中顯示的PK輪廓)；與圖2F1與2F2顯示在皮下注射至史-道二氏大鼠後本發明之基於C16二酸的類似物之PD輪廓與先前技術之基於C16二酸的類似物之PD輪廓(得自於圖2C中顯示的PK輪廓)。
得到以下結論：如由Tmax數據可見，相較於先前技術之類似物(在3個鋅離子每六聚體的調配物中)，本發明之C14二酸經醯化類似物(在無鋅調配物中)被更快速地吸收。先前技術類似物之Tmax係約30分鐘而本發明之胰島素具有約15分鐘的Tmax。比率AUC15/AUC60係與於1個小時後吸收的部分相比在首15分鐘期間吸收的部分的度量。因此，比率越高在首15分鐘期間吸收的胰島素越多。可見到相較於先前技術之類似的類似物，本發明之胰島素係與較高的比率聯結且因此更快被吸收。
因此，相較於先前技術之胰島素，本發明之類似物更適用於餐中投予。
得到以下結論：如由Tmax數據可見，相較於先前技術之類似物(在3個鋅離子每六聚體的調配物中)本發明之C16二酸經醯化類似物(在無鋅調配物中)更快被吸收。先前技術類似物之Tmax係約60分鐘而本發明之胰島素具有約30分鐘的Tmax。比率AUC15/AUC60係與於1個小時後吸收的部分相比在首15分鐘期間吸收的部分的度量。因此，比率越高在首15分鐘期間吸收的胰島素越多。可見到相較於先前技術之類似的類似物，本發明之胰島素係與較高的比率聯結且因此更快被吸收。
因此，相較於先前技術之C16二酸胰島素，本發明之C16二酸類似物更適用於餐中投予。

Claims (34)

  1. 一種人類胰島素之經醯化類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys,B3aar1]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且位於位置B26、B27及/或B28的胺基酸殘基之一、二或三者係如下取代：位於位置B26的胺基酸殘基被取代成Glu(E)或Asp(D)；及/或位於位置B27的胺基酸殘基被取代成Glu(E)、Asp(D)、或Pro(P)；及/或位於位置B28的胺基酸殘基被取代成Glu(E)、Asp(D)或Arg(R)；然而其先決條件為；若位於位置B27的胺基酸殘基被取代成Pro(P)；則位於位置B28的胺基酸殘基被取代成Glu(E)、Asp(D)或Arg(R)；與若位於位置B28的胺基酸殘基係未經取代，則位於位置B29的胺基酸殘基被取代成B29Arg(R)、或若位於位置B28的胺基酸殘基被取代成Glu(E)或Asp(D)，則位於位置B29的胺基酸殘基被取代成B29Pro(P)或B29Arg(R)，與若位於位置B29的胺基酸殘基係Pro(P)，則位於位置B30的胺基酸殘基被取代成B30Arg(R)；與若位於位置B28的胺基酸殘基被取代成Arg(R)，則位於位置B29與B30的胺基酸殘基已被刪除(即desB29,desB30)；與若位於位置B29的胺基酸殘基被取代成Arg(R)，則位於位置B30的胺基酸殘基已被刪除(即desB30)；與 該類似物可另外包含A8Arg(R)及/或A14Glu(E)取代；與該胰島素類似物係藉由在A22位置的離胺酸殘基之ε胺基基團以式II之基團醯化衍生而來[醯基]-[連接子]-其中該連接子基團係由選自gGlu及/或OEG的1至10個胺基酸殘基構成的胺基酸鏈；其中gGlu代表γ麩胺酸殘基；OEG代表8-胺基-3,6-二氧辛酸之殘基(即式-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-的基團)；該等胺基酸殘基可以任何順序出現；與該胺基酸鏈包含至少一個gGlu殘基；與其中該醯基基團係選自1,14-十四烷二酸；1,15-十五烷二酸；與1,16-十六烷二酸的α,ω-二-羧酸之殘基。
  2. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且位於位置B26、B27及/或B28的胺基酸殘基之一、二或三者係以Glu(E)或Asp(D)取代。
  3. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
  4. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
  5. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27Pro；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
  6. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
  7. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
  8. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
  9. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人 類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
  10. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
  11. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar3代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
  12. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Pro；B30Arg]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar3代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
  13. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且 aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
  14. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
  15. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
  16. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27Pro；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar2代表Glu(E)或Asp(D)。
  17. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
  18. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar3代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
  19. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
  20. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8Arg；A22Lys；B3aar1；B26aar2；B27aar3；B28Arg；desB29；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar2代表Glu(E)或Asp(D)；且aar3代表Glu(E)或Asp(D)。
  21. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
  22. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於 人類胰島素係[A14Glu；A22Lys；B3aar1；B27aar3；B28aar4；B29Arg；desB30]；其中aar1代表Glu(E)、Gln(Q)、Asp(D)、Ser(S)或Thr(T)；aar3代表Glu(E)或Asp(D)；且aar4代表Glu(E)或Asp(D)。
  23. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，該類似物相較於人類胰島素係[A8R,A22K,B3E,B26E,B27E,B28R,desB29,desB30]；[A8R,A22K,B3E,B26E,B27P,B28R,desB29,desB30]；[A8R,A22K,B3E,B26E,B28E,B29R,desB30]；[A8R,A22K,B3E,B26E,B29R,desB30]；[A8R,A22K,B3E,B27E,B28E,B29R,desB30]；[A8R,A22K,B3E,B27E,B28R,desB29,desB30]；[A14E,A22K,B3E,B27E,B28E,B29R,desB30]；[A14E,A22K,B3Q,B27E,B28E,B29R,desB30]；[A14E,A22K,B3Q,B28D,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B26E,B27E,B28E,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B26E,B27E,B28R,desB29,desB30]；[A22K,B3E,B26E,B27E,B29P,B30R]；[A22K,B3E,B26E,B27P,B28R,desB29,desB30]；[A22K,B3E,B26E,B28E,B29P,B30R]；[A22K,B3E,B26E,B28E,B29R,desB30]； [A22K,B3E,B26E,B28D,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B26E,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B27E,B28E,B29P,B30R]；[A22K,B3E,B27E,B28E,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B27E,B28R,desB29,desB30]；[A22K,B3E,B27E,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B27P,B28E,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B28D,B29R,desB30]；[A22K,B3E,B28E,B29P,B30R]；[A22K,B3Q,B26E,B28E,B29R,desB30]；或[A22K,B3Q,B26E,B29R,desB30]。
  24. 根據申請專利範圍第1-23項中任一項的經醯化胰島素類似物，其中，於式II之基團[醯基]-[連接子]-中該連接子基團係由選自gGlu及/或OEG的1至10個胺基酸殘基構成的胺基酸鏈；該等胺基酸殘基可以任何順序出現；且該胺基酸鏈包含至少一個gGlu殘基。
  25. 根據申請專利範圍第1-23項中任一項的經醯化胰島素類似物，其中，於式II之基團[醯基]-[連接子]-中該醯基基團係選自1,14-十四烷二酸；1,15-十五烷二酸；與1,16-十六烷二酸的α,ω-二-羧酸之殘基。
  26. 根據申請專利範圍第1-23項中任一項的經醯化胰島素類似物，其中該式II之基團係十四烷二醯基-4xgGlu；十四烷二醯基-gGlu-2xOEG；十六烷二醯基-4xgGlu；十六烷二醯基-4xgGlu-2xOEG；十六烷二醯基-gGlu-2xOEG；十六烷二醯基-gGlu-4xOEG；或十六烷二醯基-gGlu-6xOEG。
  27. 根據申請專利範圍第1項的經醯化胰島素類似物，其係A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島 素；A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B28D,B29R,desB30人類胰島素；A14E,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27P,B28R,desB29,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28R,desB29,desB30人類胰島素；A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27P,B28R,desB29,desB30人類胰島素；A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28R,desB29,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B28R,desB29,desB30人類胰島素；A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B28R,desB29, desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B28E,B29P,B30R人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28E,B29P,B30R人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29P,B30R人類胰島素；A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A8R,A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B29R,desB30人類胰島素；A14E,A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A14E,A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素； A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B29P,B30R人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B27E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B28D,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3E,B27P,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十四烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B26E,B28E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-2xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-4xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素； A22K(N(eps)十六烷二醯基-gGlu-6xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu-2xOEG),B3E,B26E,B29R,desB30人類胰島素；或A22K(N(eps)十六烷二醯基-4xgGlu),B3Q,B26E,B29R,desB30人類胰島素。
  28. 一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1-27項中任一項的胰島素衍生物、與一或多種醫藥上可接受的載劑或稀釋劑。
  29. 根據申請專利範圍第28項的醫藥組成物，其被調配成低鋅組成物，無外加的鋅離子。
  30. 根據申請專利範圍第29項的醫藥組成物，其被調配成低鋅組成物，包含每6個胰島素分子少於0.2個Zn2+離子。
  31. 根據申請專利範圍第29-30項中任一項的低鋅醫藥組成物，其中未添加表面活性劑。
  32. 根據申請專利範圍第29-31項中任一項的低鋅醫藥組成物，其包含菸鹼化合物，且特別是菸鹼醯胺。
  33. 一種用作醫藥品之根據申請專利範圍第1-27項中任一項的胰島素類似物、或其醫藥上可接受的鹽。
  34. 一種治療、預防或減輕包括人類的活動物體之代謝疾病或疾患或病況的方法，該方法包含將治療有效量的根據申請專利範圍第1-27項中任一項的經醯化胰島素類似物投予至需要其的該活動物體的步驟。
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