TW201708248A

TW201708248A - 細胞毒性ｔ淋巴球抗原決定位胜肽及其用途

Info

Publication number: TW201708248A
Application number: TW105119067A
Authority: TW
Inventors: dong-liang Li; Hironori Otaka; Kazue Nakano; Shingo Toji
Original assignee: Medical And Biological Laboratories Co Ltd
Priority date: 2015-06-17
Filing date: 2016-06-17
Publication date: 2017-03-01
Also published as: WO2016203577A1; JPWO2016203577A1; CN107709351A

Abstract

本發明提供對於艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus，以後記載為EBV)有專一性之細胞毒性T淋巴球(cytotoxic T lymphocyte，以後稱為CTL)抗原決定位胜肽、使用該胜肽之治療或預防EBV之感染及同病毒陽性之癌的疫苗、對抗EBV之被動免疫療法劑、及對於EBV有專一性之CTL之定量方法。又，本發明提供一種來自細胞骨架相關蛋白質(cytoskeleton-associated protein 4：以下稱為CKAP4，別名：CLIMP-63、ERGIC-63、P63)，且由IYTEVRELV之序列(序列編號：43)構成之HLA-A*24：02限制性抗原決定位胜肽。該胜肽專一性之細胞毒性T淋巴球(以下CTL)能夠攻撃高度表現CKAP4之惡性腫瘤細胞。

Description

細胞毒性T淋巴球抗原決定位胜肽及其用途

本發明係關於對於艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus，以下記載為EBV)有專一性之細胞毒性T淋巴球(cytotoxic T lymphocyte，以下稱為CTL)抗原決定位胜肽、使用該胜肽之治療或預防EBV之感染及同病毒陽性之癌的疫苗、對抗EBV之被動免疫療法劑、及對於EBV為專一之CTL之定量方法。再者，本發明係關於能誘導出以癌細胞作為目標之CTL的胜肽。又，本發明係關於含有前述胜肽之癌疫苗及抗癌劑。本發明更關於用於誘導以癌細胞作為目標之CTL之前述胜肽的用途、獲得之CTL及含前述CTL之抗癌劑。

1964年，艾司坦(Epstein)與巴爾(Barr)從來自勃奇氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)組織之培養細胞發現了新的皰疹病毒，並命名為艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus,EBV)(非專利文獻1)。EBV分類為有8種之人皰疹病毒(HHV)中之一的HHV-4，是於全世界廣泛潛伏感染的病毒(非專利文獻2)。通常小兒期會經由唾液而感染口腔‧咽頭黏膜，於口腔‧咽頭黏膜上皮細胞產生之病毒會進而感染通過上皮間質之B細胞而擴散到全身。主要係利用細胞毒性T淋巴球(CTL)所為之免疫監視機制對於感染B細胞給予傷害而殺傷排除，但有一部分會成為不產生病毒之潛伏感染狀態。

1970年從鼻咽頭癌之組織找到來自EBV病毒的DNA斷片，自此開始，EBV是感染人的病毒之中最先被稱為腫瘤病毒(非專利文獻3、4)者。EBV以外，腫瘤病毒之代表例可列舉成為肝癌原因之C型肝炎病毒(HCV)、成為子宮頸癌之原因之人乳突病毒(HPV)、成為成人T細胞白血病之原因之人T細胞白血病病毒(HTLV-1)等。

EBV主要感染為人淋巴球成分之一的B細胞，但是，除了B細胞以外也會感染上皮細胞、T細胞、NK細胞等，據認為其多樣化細胞向性和產生多種類的腫瘤相關。例如，據認為EBV感染係原因之癌，可列舉勃奇氏淋巴瘤(BL)、何杰金氏淋巴瘤(HL)、NK/T細胞淋巴瘤、鼻咽頭癌(NPC)、胃癌(MK)等惡性腫瘤。又，EBV和多種免疫不全疾病也密切相關，例如已知淋巴球增殖性疾病(LPD)、傳染性單核球症(IM)、移植後淋巴球增殖性疾病(PTLD)等(非專利文獻4)。

最近的研究已逐漸明瞭EBV也和自體免疫疾病有關。據報告多發性硬化症(MS)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎(RA)、修連格氏症候群(Sjoegren Syndrome，(SS))等患者的EBV之病毒量值較高。又，來自EBV之小分子RNA(EBV encoded small RNA,EBER)、一些蛋白質據認為和自體免疫疾病之發病及進展密切相關，已尋求解開其機制中(非專利文獻5、6、7)。

如上，據認為EBV和癌及免疫不全疾病密切關連，故以EBV作為標靶的免疫細胞療法的臨床研究在近十數年已大有進展，成果輝煌。例如，針對EBV相關的淋巴球增殖性疾病(LPD)、移植後淋巴球增殖性疾病(PTLD)，已實施將能排除為原因之病毒感染細胞的免疫活性細胞(immunocompetent cell)輸注到患者體內之所謂免疫細胞療法，並已證實其治療效果(非專利文獻8、9、10)。又，針對何杰金氏淋巴瘤、鼻咽頭癌等EBV相關惡性腫瘤，也有人報告免疫細胞療法之有效性(非專利文獻11、12、13、14、15)。

由於此等有效果的臨床研究，免疫細胞療法作為新的癌治療戰略受到重大關注。據認為免疫細胞療法對於習知的外科處置、放射線療法、化學療法難以治療的惡性腫瘤、免疫不全疾病可成為有力的治療法。

免疫細胞療法係利用使患者具備之免疫力活化，而專一性地攻撃‧排除成為目標之癌細胞或病毒感染細胞的治療方法，具有習知之治療方法所無的特徵。發揮對於該等成為目標之細胞專一性地攻撃之中心作用的是細胞毒性T淋巴球(CTL)。於CTL辨識癌細胞或病毒感染細胞此類目標細胞時，在CTL細胞膜表面上表現之T細胞受體(TCR)擔任重要作用。TCR並不是直接辨識癌抗原分子、病毒粒子本身，而是藉由和在目標細胞之膜表面上表現之HLA(人白血球型抗原)與為腫瘤細胞時係來自癌抗原者、或為病毒感染細胞時係來自病毒之由8~10個胺基酸構成的胜肽(抗原決定位胜肽)的複合體結合，而讓CTL辨識目標細胞並發揮殺傷效果。HLA大致分為第I型與第II型，HLA第I型與胜肽之複合體會由在CD8陽性T細胞表現之TCR辨識，HLA第II型與胜肽之複合體會由在CD4陽性T細胞表現之TCR辨識而引起免疫回應。HLA第I型進一步區別為稱為HLA-A、B、C之古典的分類，及稱為HLA-E、F、G之非古典的分類。移植醫療中，就捐贈者與接受者間的HLA相容性而言，HLA-A、B與分類為HLA第II型之HLA-DRB之6座相容性係為重要，尤其在非血緣者間之移植，據認為是排斥之風險因子。現在依IMGT之HLA資料庫(http：//www.imgt.org/)，HLA-A已有2,041種、HLA-B有2,688種、HLA-C有1,677種蛋白質被登錄。但是已知人種之間有集中性，例如日本人約60%之人保有HLA-A24，HLA-A2為白人之50%以上，日本人也有約20%保有。發明人等鑑定的來自EBV之LMP2及EBNA1專一性CTL抗原決定位胜肽會專一地結合於HLA-A11，並由辨識其之CTL將EBV感染細胞予以殺傷排除。HLA-A11之保有率在日本人中約10%，在東南亞則是為保有率第3位之對偶基因而呈現廣人口分布。東南亞中，HLA-A24、HLA-A2及HLA-A11之對偶基因頻度各為32.1%、24.5%、23.7%(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/ihwg.cgi)。

至今為止報告的免疫細胞療法中，多數係以世界性地以HLA-A2為對象之臨床試驗最多，在日本國內，以HLA-A24作為對象者的情形為多。在亞洲地區，預測由於平均壽命延長，癌患者會更增加，免疫細胞療法尋求增加目前成為治療對象之HLA型。迄今報告的HLA-A11限制性CTL抗原決定位數，相較於HLA-A2、HLA-A24為極端少，幾乎沒有以保有HLA-A11之患者為對象者之臨床試驗之報告例，故可想見本發明之呈HLA-A11限制性之EBV LMP2及EBV EBNA1專一性CTL抗原決定位之鑑定的意義重大。

EBV相關惡性腫瘤中，值得特別注意的是鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，以下記載為NPC)。NPC在包括中國南部、香港地區、新加坡、越南、馬來西亞、菲律賓等之東南亞有高發病率。又，在北非等地區也有比較高發病率。2012年，全世界有86,691人診斷新罹患NPC，死亡數達50,828人(GLOBOCAN2012)。又，據報告放射線治療後，1、3、5、10年生存率各為89.86%、60.60%、47%、33.03%(非專利文獻18)。有一份有趣的報告，係關於NPC之發病風險之一的HLA型(非專利文獻17)。例如以統計學分析NPC患者之HLA-A型之頻度，結果據報告：顯示較高頻度的HLA-A型的頻度為，A11保持者為50%、A2保持者為50%、A24保持者為30%、B40保持者32%(非專利文獻15)。或依另一研究團隊的調査結果，報告：A11保持者為58%、A2保持者為53%、A24保持者為30%、B40保持者為43%(非專利文獻16)。最近使用次世代定序技術，全面調查HLA之胺基酸序列之變體與SNPs的結果，據報告HLA-A11是和NPC之發病有密切相關的HLA型(非專利文獻19)。如此，NPC中，HLA-A11保持者的發病率高，本發明之能提供使用呈HLA-A11限制性之EBV LMP2及EBV EBNA1專一性CTL抗原決定位之治療法之意義深遠。

NPC為難治性惡性腫瘤，故接續外科處置、化學療法、放射線療法，對於作為第4治療法之利用於活體外(in vitro)活化之EBV專一性CTL之免疫細胞治療之關注非常多，已有多數臨床試驗報告其有效性。但是在這些臨床試驗使用之CTL抗原決定位胜肽主要是HLA-A2、HLA-A24限制性胜肽，幾乎沒有HLA-A11限制性CTL抗原決定位胜肽之臨床試驗報告例。理由可列舉，HLA-A11限制性CTL抗原決定位胜肽之鑑定在全世界幾乎無人嘗試，及鑑別在NPC表現之來自EBNA1之CTL抗原決定位非常困難等。

本發明中，使用後述鑑定手法，針對對於在EBV相關惡性腫瘤，尤其在NPC患者保有率最高之HLA-A11呈限制性之CTL抗原決定位胜肽之鑑定努力研究。

EBV帶有編碼為約85個基因產物之約170kbp之雙股DNA，在NPC之癌患部據報告有來自EBV之蛋白質LMP1、LMP2、EBNA1表現。LMP1於一部分患者未能檢測到，但LMP2與EBNA1則是於NPC不斷地表現(非專利文獻20、21)，此2種蛋白質係用以鑑定細胞毒性T淋巴球抗原決定位胜肽之有吸引力的目標。但是迄今的報告中，CTL之免疫回應係優先指向LMP2，據信EBNA1不會被CTL辨識(非專利文獻22、23、24、25)。其理由已解明係為：EBNA1由全長641個胺基酸構成，但是其中心區域(101號至324號之胺基酸)存在由約200個胺基酸構成的甘胺酸-丙胺酸重複序列(GAr)，會妨礙產生MHC第I型抗原決定位之主要的催化機構即蛋白酶體所為的處理(非專利文獻26、27、28)。再者，已解明，該中心區域會妨礙EBNA1 mRNA之轉譯，已有人報告EBNA1蛋白質之表現本身為低(非專利文獻29、30)。

另一方面，LMP2之CTL抗原決定位已有多數研究團隊報告。已有人對於由全長497個胺基酸(來自B95.8株)構成之LMP2蛋白質製作重疊(overlapping)胜肽庫，並搜尋以HLA-A2、HLA-A24、HLA-A11等作為目標之CTL抗原決定位，鑑定出了許多HLA-A2、HLA-A24限制性胜肽，反觀HLA-A11限制性胜肽到今日為止，只鑑定出1個(非專利文獻15)。EBV是在全世界的90%以上成人潛伏感染的病毒，但儘管如此，NPC之罹患率存在強地域性。例如依疫學調査，已知在東南亞、北非、阿拉斯加等地域，NPC之發生率是其他地域之100倍左右之高(Rickinson,A.B.,and E.Kieff.1996.Epstein-Barr virus,p.2397-2446.In B.N.Fields,D.M.Knipe,and P.M.Howley(ed.),Fields virology,3rd ed.,vol.2.Lippincott-Raven,Philadelphia,Pa)。發生此強地域性之原因可列舉環境、遺傳、生活習慣等要因，但據認為原因尚有EBV株不同、致癌性蛋白質之表現量不同、胺基酸之變異所致免疫回應不同，感染株不同據認為也是和NPC之發病相關的另一重要因子。待注意之點是，NPC之罹患率非常高之地域之一為中國的廣東省，在此廣泛傳播的一種EBV株為GD1(Zeng MS,Li DJ,Liu QL,Song LB,Li MZ,Zhang RH,Yu XJ,Wang HM,Ernberg I,Zeng YX.Genomic sequence analysis of Epstein-Barr virus strain GD1 from a nasopharyngeal carcinoma patient.J Virol.2005 Dec；79(24)：15323-30)。在此，EBV株間，例如，B95.8株與GD1株間，有時相當於專一性CTL抗原決定位胜肽之序列會有不同，因而可能影響CTL誘導能力、MHC-四聚物試藥之檢測能力。此意指，藉由將混合2種以上的胜肽而誘導出的CTL 利用於治療，能夠製備不依存感染者之株種之治療用CTL。

另一方面，擔任細胞性免疫之CTL自以往已知會專一性地辨識各種病毒、病原菌感染細胞並進行攻撃‧排除。其原因為，感染細胞經由主要組織相容性抗原複合體(major histocompatibility complex，以下稱為MHC，於人稱為HLA)而呈現來自病毒、病原菌之抗原胜肽，其被T細胞所辨識而引起免疫回應。具體而言，MHC有第I型及第II型，MHC第I型(以下MHC-I)在所有有核細胞之細胞膜表面表現，主要將來自病毒蛋白質之非自體胜肽對於CTL呈現而使其活化。另一方面，MHC第II型(以下稱為MHC-II)表現在樹狀細胞等抗原呈現細胞之細胞膜表面，將非自體胜肽對於CD4⁺ T細胞呈現而誘導細胞介素之分泌‧抗體之產生。即，防禦活體受感染之機制有MHC-I-CTL與MHC-II-CD4⁺ T細胞之二種路徑。

1991年有人報告在惡性黑色瘤專一性地表現的來自MAGE抗原之胜肽會被CTL辨識(非專利文獻31)。此係MHC-I會將來自癌細胞之自體抗原胜肽對於CTL呈現且誘導專一性細胞毒性之首次示例。即，CTL也會對於自體抗原反應，可能藉由利用此作用而治療癌。之後，於癌專一性地表現之蛋白質(以下稱癌抗原)與來自此蛋白質之胜肽斷片之鑑定積極進行。隨該等發現，癌免疫療法之開發也積極進行。癌免疫療法，係指使殺傷‧排除癌細胞之CTL等免疫活性細胞於活體內外增殖並治療癌之方法。癌免疫療法據認為有幾種方法。

1. 將患者之癌組織以液態氮等進行粉碎處理，並將其和免疫賦活劑一起接種到患者之自體癌免疫療法

2. 將患者之癌組織以液態氮等進行粉碎處理，將其和從患者周邊血分離培養之樹狀細胞進行共培養後，接種到患者之自體癌樹狀細胞療法

3. 將患者之癌組織以液態氮等進行粉碎處理，並將其和從患者周邊血分離培養之淋巴球進行混合培養，再回到患者體內之自體癌感作淋巴球移入療法

1~3並不一定會引起癌抗原專一性的免疫回應，為非專一性的癌免疫療法。又，尚有需要從癌患者切除癌患部等外科處置的缺點。

4. 將癌抗原專一性CTL抗原決定位胜肽與免疫賦活劑接種到患者之癌胜肽疫苗療法

5. 將癌抗原專一性CTL抗原決定位胜肽對於從患者周邊血分離培養之樹狀細胞進行脈衝後，接種到患者之胜肽脈衝(pulse)樹狀細胞療法

6. 使用癌抗原專一性CTL抗原決定位胜肽將從患者周邊血分離培養之淋巴球進行刺激培養，並誘導專一性CTL，使其回到患者體內之CTL移入療法

7. 4與6之組合療法。將癌抗原專一性CTL抗原決定位胜肽與免疫賦活劑對於患者接種。藉由將此從患者周邊血分離之淋巴球以癌抗原專一性CTL抗原決定位胜肽進行刺激培養，以誘導專一性CTL，使其回到患者體內之方法。

8. 從癌抗原專一性CTL抽出T細胞受體(TCR)基因，將其對於從患者周邊血分離培養之淋巴球進行基因導入以製作人工CTL，並回到患者體內之人工CTL移入療法。

4~8皆引起、利用癌抗原專一性之免疫回應，是專一性的癌免疫療法。惟為了實施此等方法，鑑定癌抗原專一性CTL抗原決定位，並證明辨識其的CTL存在乃第一要件。

如上述，已開發出引起、利用癌抗原專一性之免疫回應的各種癌免疫療法，但此等的治療效果不一定高，在許多臨床試驗於第II相、第III相失敗。因為該等失敗，於實施癌免疫療法時考慮以下的注意點。

(1)適當的CTL監測

癌免疫療法係期待在活體內辨識癌而進行攻撃之CTL之增幅所進行的治療法，為效果成分之CTL之監測係重要。作為CTL之監測法，有細胞內細胞介素染色法、細胞毒性之測定等，這些方法係間接檢測CTL之方法。例如：細胞內細胞介素染色法係測定對應於胜肽刺激之IFNγ(interferon gamma)、TNFα(tumor necrosis factor-alpha)之產生之方法，有可能也會檢測到抗原胜肽專一性之免疫回應以外之反應。另一方面，作為更適當的方法，有使用MHC-四聚物試藥之方法。MHC-四聚物試藥係於試管內製造MHC與β2-微球蛋白(以下稱為β2m)及胜肽斷片之3者複合體(MHC-單體)並將MHC-單體予以4聚化而得之試藥。

以下說明此試藥為何適合CTL之監測的理由。構成MHC-單體之MHC是富有多樣性的分子，依據IMGT之HLA資料庫(http：//hla.alleles.org/nomenclature/stats.html)，已登錄 HLA-A有2077種、HLA-B有2741種、HLA-C有1739種蛋白質(截至2014年10月)。又，依各MHC之對偶基因型，結合之胜肽斷片(8~12個胺基酸殘基長)的特徵亦不同。即，MHC/胜肽複合體之組合只就MHC之對偶基因型與胜肽斷片之種類即已存在龐大數量。另一方面，CTL會以TCR辨識MHC-I所呈現之胜肽。各個TCR由TCR基因之再編組而生成，每1個體之TCR之曲目數據說達到10¹⁸種以上。即，目標細胞之MHC/胜肽複合體、及CTL側之TCR皆具有龐大的多樣性。且各個CTL，一般而言在細胞膜表面上表現一種TCR，且只辨識對其為專一的MHC/胜肽複合體而活化。MHC-四聚物試藥是利用此機制的試藥。亦即，MHC-四聚物試藥係模仿目標細胞膜上之MHC/胜肽複合體之結構之試藥，藉此能只選擇性地檢測出帶有專一性的TCR的CTL。由此觀點，MHC-四聚物試藥據認為是對於CTL監測為理想的試藥。又，將MHC-單體予以4聚體化，原因是因為增強和CTL所表現之TCR間之結合力，且能使得以流式細胞儀等設備檢測。

(2)癌細胞之抗原呈現分子(HLA及β2m)之變異

癌細胞之HLA與β2m之變異已知係癌細胞之免疫逃避機構。若發生此現象，則癌細胞不會呈現抗原胜肽，CTL無法辨識癌細胞且無法攻撃。HLA之變異已知有同一基因座之單側缺損的LOH型變異(loss of heterozygosity)。又，β2m之變異已知有讀框偏移(frame shift)變異等。有人嘗試藉由針對β2m之變異，將β2m基因利用腺病毒載體進行基因導入，以補強β2m之表現，使癌細胞呈現抗原胜肽。

(3)癌細胞之目標抗原之表現

癌抗原有各種種類，表現哪種癌抗原是依癌種類、個人而異。所以，在進行癌免疫療法時，確認患者之癌抗原之表現非常重要。例如，來自胜肽疫苗之癌抗原在患者之癌患部完全不表現時，癌細胞不能成為目標，無法期待癌胜肽疫苗療法之治療效果。近年來，在一些癌胜肽疫苗療法之臨床試驗，已利用使用癌抗原專一性抗體之組織染色等，確認了患者之癌細胞表現來自胜肽疫苗之抗原。另一方面，為惡性神經膠質母細胞瘤等的情形，不易取得癌細胞樣本，故不易確認癌抗原在癌患部之表現。

(4)免疫抑制分子之作用

CTL若專一性地辨識目標細胞所呈現之抗原胜肽則活化並發揮細胞毒性。另一方面，已知有妨礙CTL活化之分子存在，有TGFβ、PD-1、CTLA-4等。TGFβ是癌細胞分泌之抑制性細胞介素，會妨礙CTL、CD4⁺T細胞之增殖‧分化。PD-1、CTLA-4皆為T細胞之細胞膜上之分子，若各和癌細胞所表現之配體結合，則會傳遞抑制性的信號，CTL失活。近年來，據報告藉由利用抗PD-1抗體、抗CTLA-4抗體妨礙該等免疫抑制分子的作用，能促進CTL之作用。

(5)患者之HLA型

抗原決定位胜肽基本上只會被1種HLA呈現。此現象稱為HLA限制性。所以，即使是對於未保有能呈現抗原決定位胜肽之HLA型的患者實施癌免疫療法，因為此患者中之癌細胞不呈現抗原決定位胜肽，故無法期待治療效果。即，癌免疫療法之對象患者受限於使用之抗原決定位胜肽之HLA限制性。實際上，在癌免疫療法之臨床試驗，係利用使用抗HLA抗體之血清型判定、基因型判定預先判定患者之HLA型，符合使用之抗原決定位之HLA限制性之患者方可登錄於試驗。

如以上，為了利用癌免疫療法獲得治療效果，實施適當的CTL監測、確認抗原呈現分子之表現、確認癌患部之癌抗原之表現、妨礙免疫抑制分子之作用、選擇適合患者HLA型之癌抗原抗原決定位胜肽係為重要。其中，為了選擇適合患者之HLA型之癌抗原抗原決定位胜肽，前提是鑑定各種HLA限制性抗原決定位胜肽。因此為了能夠廣泛因應多樣的癌患者，希望在多數癌抗原中儘可能鑑別出多數HLA限制性之抗原決定位胜肽。所以，抗原決定位胜肽之鑑定有重大意義。HLA-A*24：02是日本人中保有率最高的HLA-A對偶基因，約60%的人保有。而本發明之目的為提供在專一性之癌免疫療法能使用之HLA-A*24：02限制性之新穎癌抗原抗原決定位胜肽、使用此胜肽之癌疫苗及抗癌劑、及檢測抗原決定位胜肽專一性CTL之試藥。

CKAP4係分子量63kDa，由全長602個胺基酸構成之II型膜貫通蛋白質。從N末端側起，存在由106個胺基酸構成之細胞質內區、由21個胺基酸構成之膜貫通區、由475個胺基酸構成之細胞外區共3個區(非專利文獻32)。CKAP4，於細胞周期之間期，在細胞質內區結合於內質網(endoplasmic reticulum)與微小管，有使內質網固定於微小管之作用(非專利文獻33)。細胞進入有絲分裂前，從CKAP4之N末端側算起第100號之胺基酸即半胱胺酸殘基會可逆地被棕櫚醯基化(非專利文獻34)，藉由此棕櫚醯基化，CKAP4之存在位置變成細胞膜(非專利文獻35)，和微小管間的交互作用受妨礙。又，據報告：在有絲分裂期，CKAP4被磷酸化，喪失和微小管間之結合能力(非專利文獻36)。另一方面，已知微小管於有絲分裂期會構成分配染色體而使細胞正確分為二之作用的紡錘體。所以，據認為CKAP4在有絲分裂期，藉由適當地和微小管解離而涉及正常有絲分裂的控制。又，CKAP4亦已知在肺泡細胞表面也作為擔任界面活性劑(肺表面活性物質)除去之surfactant protein-A(以下稱為SP-A)的受體的作用(非專利文獻32)。在肺泡細胞表面，由脂質構成的界面活性劑藉由減少被覆表面之水分之表面張力，貢獻於肺泡伸展。SP-A帶有去除界面活性劑之功能，藉由和受體CKAP4一起作用，擔任肺泡細胞之恆定性的維持。

CKAP4在正常細胞也會表現，但是於來自乳癌、中樞神經系腫瘤、肺癌、腎臟癌、惡性黑色瘤等各種癌癌之細胞株中有高度表現(http：//129.187.44.58：7070/NCI60/protein/show/10796)。又，據報告：CKAP4在骨肉瘤患者中有高度表現(http：//www.ebi.ac.uk/gxa/experiments/E-MEXP-3628？geneQuery=ENSG00000136026&queryFactorValues=g2_g1&_specific=on)、在肝臟癌患者中有高度表現(非專利文獻37)。所以據認為CKAP4可能是在癌細胞中會高度表現之過度表現型之癌抗原(非專利文獻38)。過度表現型之癌抗原，例如已知Her-2等，也已有人實施使用來自Her-2之胜肽之癌胜肽疫苗之臨床試驗(非專利文獻39、40)。

如上述，據認為CKAP4在各種癌症有高度表現，但是針對CKAP4在癌細胞之抗原性並不了解。即，CKAP4是否作為癌抗原而成為免疫系之目標，亦即，來自CKAP4之胜肽是否會被癌細胞表面之HLA呈現並由專一性地辨識其之CTL攻撃癌細胞之點係尚不明瞭。

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本發明係有鑑於如此的狀況而產生，目標著重於EBV之LMP2與EBNA1，目的為鑑別LMP2專一性之細胞毒性T淋巴球抗原決定位胜肽、及EBNA1專一性之細胞毒性T淋巴球抗原決定位胜肽，並提供使用該胜肽之NPC為主之EBV相關惡性腫瘤及免疫不全治療或預防用之疫苗、針對EBV之被動免疫療法劑、及對於EBV為專一性之細胞毒性T淋巴球之定量方法。又，本案發明人等針對各種來自CKAP4之胜肽，就癌抗原性，亦即CTL誘導能力努力研究。其結果找到序列編號：43所示之CKAP4之細胞外區內之特定胜肽會誘導HLA-A*24：02限制性之CKAP4專一性CTL，該專一性CTL會顯示細胞毒性。本發明係基於該等知識見解而完成。

本發明係基於如此的知識見解而完成，具體態樣例如關於以下發明。

[1]一種抗原決定位胜肽，具有對於艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)有專一性之細胞毒性T淋巴球之誘導活性，在此，該抗原決定位胜肽係由選自於由序列編號：1、序列編號：2、序列編號：3、序列編號：4、序列編號：5、序列編號：6、序列編號：26、序列編號：27及序列編號：28構成之群組中之胺基酸序列構成。

[2]一種抗原決定位胜肽，具有對於艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)有專一性之細胞毒性T淋巴球之誘導活性，在此，該抗原決定位胜肽係在序列編號：1、序列編號：2、序列編號：3、序列編號：4、序列編號：5、序列編號：6、序列編號：26、序列編號：27或序列編號：28記載之胺基酸序列中，1個或多數個胺基酸被取代、缺失、插入及/或加成。

[3]一種核酸，編碼為如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽。

[4]一種表現載體，包括編碼為如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽之核酸。

[5]一種用於治療、或預防EBV之感染或EBV陽性之癌的疫苗，包括如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽作為有效成分。

[6]如[5]之疫苗，其中，EBV係選自於AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[7]一種用於治療、或預防EBV之感染或EBV陽性之癌的疫苗，包括如[3]~[4]之任一項中記載之核酸或表現載體作為有效成分。

[8]如[7]之疫苗，其中，EBV係選自於AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[9]一種用於治療、或預防EBV之感染或EBV病毒陽性之癌的疫苗，包括呈現如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽於HLA的抗原呈現細胞作為有效成分。

[10]如[9]之疫苗，其中，EBV係選自於AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[11]一種對抗EBV之被動免疫療法劑，包括EBV專一性之細胞毒性T淋巴球，該EBV專一性之細胞毒性T淋巴球係利用如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽或於HLA呈現該抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞刺激周邊血液淋巴球而得。

[12]一種對抗EBV之被動免疫療法劑，包括細胞毒性T淋巴球，該細胞毒性T淋巴球係使從如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備而得之主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物和周邊血液淋巴球接觸，形成細胞毒性T淋巴球結合於該主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物之結合體，並從該結合體單離而得。

[13]一種對於EBV有專一性之細胞毒性T淋巴球之定量方法，包括：以如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽刺激來自對象之周邊血的步驟；獲得利用前述步驟產生之EBV專一性之細胞毒性T淋巴球的步驟；及測定獲得之細胞毒性T淋巴球所產生之細胞介素及/或趨化介素及/或細胞表面分子的步驟。

[14]一種周邊血中之對於EBV有專一性之細胞毒性T淋巴球之定量方法，包括：使如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽與主要組織相容性抗原複合體與β2-微球蛋白混合的步驟；及使製備之主要組織相容性抗原複合體-四聚物和來自對象之周邊血接觸的步驟。

[15]一種對於EBV有專一性之細胞毒性T淋巴球之誘導方法，包括使如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽和抗原呈現細胞接觸的步驟。

[16]一種用於誘導細胞毒性T淋巴球之套組，包括如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽作為構成要素。

[17]一種生產EBV專一性CTL之方法，包括使如[1]~[2]之任一項中記載之胜肽和周邊血單核球於含血漿之培養基中接觸的步驟。

[18]一種對於CKAP4有專一性之CTL抗原決定位胜肽，係由序列編號：43記載之胺基酸序列所構成。

[19]一種對於CKAP4有專一性之CTL抗原決定位胜肽，係在序列編號：43記載之胺基酸序列中，1個或多數個胺基酸被取代、缺失、插入及/或加成。

[20]如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽，係HLA-A*24：02分子限制性之抗原胜肽，其特徵在於係誘導具有專一性地辨識在細胞表面呈現和HLA-A*24：02分子之複合體的細胞的T細胞受體的CTL。

[21]一種核酸，編碼為如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽。

[22]一種表現載體，包括編碼為如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽之核酸。

[23]一種用於癌治療或預防之疫苗，包括如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽作為有效成分。

[24]一種用於癌治療或預防之疫苗，其含有如[21]~[22]之任一項中記載之核酸或表現載體作為有效成分。

[25]一種用於癌治療或預防之疫苗，包括於HLA呈現如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞作為有效成分。

[26]一種用於癌治療之被動免疫療法劑，包括CKAP4專一性之CTL作為有效成分，該CKAP4專一性之CTL係利用如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽或於HLA呈現該抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞刺激周邊血液淋巴球而得。

[27]一種用於癌治療之被動免疫療法劑，包括CTL作為有效成分，該CTL係使從如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備的主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物和周邊血液淋巴球接觸、形成CTL結合於該主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物之結合體，並從該結合體進行單離而得。

[28]一種對於CKAP4有專一性之CTL之定量方法，包括：以如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽刺激來自對象之周邊血的步驟；取得對於由前述步驟產生之CKAP4有專一性之CTL的步驟；及測定該取得之CTL所產生之細胞介素及/或趨化介素及/或細胞表面分子的步驟。

[29]一種周邊血中之對於CKAP4有專一性之CTL之定量方法，包括：從如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備主要組織相容性抗原複合體-四聚物的步驟；及使主要組織相容性抗原複合體-四聚物與來自對象之周邊血接觸的步驟。

[30]一種CKAP4專一性CTL之誘導方法，包括使如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽和來自對象之周邊血單核球接觸的步驟。

[31]一種治療癌之被動免疫療法劑之製造方法，包括：利用如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽或於HLA呈現該抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞刺激周邊血液淋巴球而取得CKAP4專一性之CTL的步驟。

[32]一種用於癌治療之被動免疫療法劑之製造方法，包括：使從如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備之主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物和周邊血液淋巴球接觸的步驟；形成CTL結合於該主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物之結合體的步驟；及取得從該結合體單離而得之CTL的步驟。

[33]一種對於主要組織相容性抗原複合體有專一性之抗體，係從如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備。

[A1]一種如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽之用途，係用於為了治療、或預防EBV之感染或EBV陽性之癌之藥劑之製造。

[A2]如[A1]之用途，其中，EBV係選自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[A3]一種如[3]~[4]之任一項中記載之核酸或表現載體之用途，係用於為了治療、或預防EBV之感染或EBV陽性之癌之藥劑之製造。

[A4]如[A3]之用途，其中，EBV係選自AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[A5]一種於HLA呈現如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞之用途，係用於為了治療、或預防EBV之感染或EBV病毒陽性之癌之藥劑之製造。

[A6]如[A5]之用途，其中，EBV係選自於AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[A7]一種利用如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽或於HLA呈現該抗原決定位之胜肽抗原呈現細胞刺激周邊血液淋巴球而得之EBV專一性之細胞毒性T淋巴球之用途，係用於對抗EBV之被動免疫療法劑之製造。

[A8]一種使由如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備之主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物和周邊血液淋巴球接觸，形成於該主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物結合細胞毒性T淋巴球而得之結合體，並從該結合體單離而得之細胞毒性T淋巴球之用途，係用於對抗EBV之被動免疫療法劑之製造。

[A9]一種如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽之用途，係用於治療或預防癌之藥劑之製造。

[A10]一種如[21]~[22]之任一項中記載之核酸或表現載體之用途，係用於治療或預防癌之藥劑之製造。

[A11]一種於HLA呈現如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞之用途，係用於治療或預防癌之藥劑之製造。

[A12]一種利用如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽或於HLA呈現該抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞刺激周邊血液淋巴球而得之CKAP4專一性之CTL之用途，係用於治療癌之被動免疫療法劑之製造。

[A13]一種使由如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備之主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物和周邊血液淋巴球接觸，形成於該主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物結合CTL而得之結合體，從該結合體單離而得之CTL之用途，係用於治療癌之被動免疫療法劑之製造。

[B1]一種疫苗組成物，用於治療、或預防EBV之感染或EBV陽性之癌，包括如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽作為有效成分。

[B2]如[B1]之疫苗組成物，其中，EBV係選自於AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[B3]一種疫苗組成物，係用於治療、或預防EBV之感染或EBV陽性之癌，包括如[3]~[4]之任一項中記載之核酸或表現載體作為有效成分。

[B4]如[B3]之疫苗組成物，其中，EBV係選自於AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[B5]一種疫苗組成物，係用於治療、或預防EBV之感染或EBV病毒陽性之癌，包括於HLA呈現如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽的抗原呈現細胞作為有效成分。

[B6]如[B5]之疫苗組成物，其中，EBV選自於AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[B7]一種組成物，係用於對抗EBV之被動免疫療法，包括利用如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽或於HLA呈現該抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞刺激周邊血液淋巴球而得之EBV專一性之細胞毒性T淋巴球。

[B8]一種組成物，係用於對抗EBV之被動免疫療法，包括使由如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備之主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物和周邊血液淋巴球接觸，形成於該主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物結合細胞毒性T淋巴球而得之結合體，從該結合體單離而得之細胞毒性T淋巴球。

[B9]一種疫苗組成物，係用於治療或預防癌，包括如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽作為有效成分。

[B10]一種疫苗組成物，係用於治療或預防癌，包括如[21] ~[22]之任一項中記載之核酸或表現載體作為有效成分。

[B11]一種疫苗組成物，係用治療或預防癌，包括於HLA呈現如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽的抗原呈現細胞作為有效成分。

[B12]一種組成物，係用於利用被動免疫療法治療癌，包括利用如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽或於HLA呈現該抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞刺激周邊血液淋巴球而得之CKAP4專一性之CTL作為有效成分。

[B13]一種組成物，係用於利用被動免疫療法治療癌，包括使從如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備之主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物和周邊血液淋巴球接觸，形成於該主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物結合CTL而得之結合體，從該結合體單離而得之CTL作為有效成分。

[C1]一種治療、或預防EBV之感染或EBV陽性之癌之方法，包括將如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽對於需要之個體投予的步驟。

[C2]如[C1]之方法，其中，EBV係選自於AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[C3]一種治療、或預防EBV之感染或EBV陽性之癌之方法，包括將如[3]~[4]之任一項中記載之核酸或表現載體對於需要之個體投予之步驟。

[C4]如[C3]之方法，其中，EBV選自於AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[C5]一種治療、或預防EBV之感染或EBV病毒陽性之癌之方法，包括將於HLA呈現如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞對於需要之個體投予之步驟。

[C6]如[C5]之方法，其中，EBV選自於AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。

[C7]一種對抗EBV之被動免疫療法，包括將利用如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽或於HLA呈現該抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞刺激周邊血液淋巴球而獲得之EBV專一性之細胞毒性T淋巴球對於需要之個體投予之步驟。

[C8]一種對抗EBV之被動免疫療法，包括：：使由如[1]~[2]之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備之主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物和周邊血液淋巴球接觸的步驟；形成於該主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物結合細胞毒性T淋巴球而得之結合體的步驟；將從該結合體單離而得之細胞毒性T淋巴球對於需要之個體投予的步驟。

[C9]一種治療或預防癌之方法，包括將如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽對於需要之個體投予的步驟。

[C10]一種治療或預防癌之方法，包括將如[21]~[22]之任一項中記載之核酸或表現載體對於需藥之個體投予的步驟。

[C11]一種治療或預防癌之方法，包括將於HLA呈現如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞對於需要之個體投予的步驟。

[C12]一種治療癌之被動免疫療法，包括將利用如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽或於HLA呈現該抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞刺激周邊血液淋巴球而得之CKAP4專一性之CTL對於需要之個體投予的步驟。

[C13]一種治療癌之被動免疫療法，包括：使由如[18]~[19]之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備之主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物和周邊血液淋巴球接觸的步驟；形成於該主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物結合CTL而得之結合體的步驟；將從該結合體單離而得之CTL對於需要之個體投予的步驟。

第1圖顯示確認MHC-單體形成時之代表的凝膠過濾管柱分析例之圖。

第2圖顯示EBV LMP2專一性CTL抗原決定位候選胜肽之折疊試驗(folding test)結果之圖。

第3圖顯示EBV EBNA1專一性CTL抗原決定位候選胜肽之折疊試驗結果之圖。

第4圖顯示使用對照胜肽之細胞內IFNγ產生細胞定量法之檢討結果之圖。

第5圖顯示利用細胞內IFNγ產生細胞定量法確認EBV LMP2專一性CTL誘導，並將CD8陽性細胞中存在之IFNγ產生生細胞之比例予以數值化而得之圖。

第6圖顯示利用細胞內IFNγ產生細胞定量法確認LMP2專一性CTL誘導(捐出者ID *11-11)。係X軸將CD8以log尺度表示、Y軸將對應IFNγ之螢光強度以log尺度表示之點圖展開圖，係使用和誘導使用之胜肽為相同胜肽進行再刺激而定量細胞內IFNγ產生細胞而得之結果之圖。

第7圖顯示利用製得之MHC-四聚物試藥進行LMP2專一性CTL之檢測結果之圖(捐出者ID *11-11)。

第8圖顯示利用製得之MHC-四聚物試藥進行EBNA1專一性CTL之檢測結果(1)之圖。

第9圖顯示利用製得之MHC-四聚物試藥進行EBNA1專一性CTL之檢測結果(2)之圖。

第10圖顯示利用細胞內IFNγ產生細胞定量法進行EBNA1專一性CTL誘導之確認結果之圖(捐出者ID *11-8)。

第11圖顯示由於ASS(10mer)之N末端與C末端之胺基酸缺失所致MHC親和性之變化之圖。

第12圖顯示由於ASS(10mer)之N末端與C末端之胺基酸缺失所致CTL誘導能力之變化之圖(捐出者ID *11-11)。

第13圖顯示由於ASS(10mer)之N末端與C末端之胺基酸缺失所致TCR結合性之變化之圖(捐出者ID *11-11)。

第14圖顯示ASS(10mer)及HRG之EBV株間之胺基酸變異比較之圖。

第15圖顯示ASS(10mer)CTL抗原決定位之定序結果之圖。

第16圖顯示ASS(10mer)之胺基酸變異導致誘導能力差異之圖(捐出者ID：*11-11)。

第17圖顯示ASS(10mer)之胺基酸取代導致TCR結合性之變化之圖(捐出者ID：*11-11)。

第18圖顯示使用培養袋進行CTL大量培養(1)之結果之圖。

第19圖顯示使用培養袋進行CTL大量培養(2)之結果之圖。

第20圖顯示使用培養袋進行CTL大量培養(3)之結果之圖。

第21圖顯示確認MHC-單體形成時之代表的凝膠過濾管柱分析例之圖。

第22圖顯示CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽之折疊試驗結果之圖。

第23圖顯示CKAP4專一性CTL之誘導結果之圖(檢體編號；A24-37，第1階段)。

第24圖顯示CKAP4專一性CTL之誘導結果之圖(檢體編號；A24-37，第2階段，lane 7)。

第25圖顯示CKAP4專一性CTL之誘導結果之圖(檢體編號；A24-39，第1階段)。

第26圖顯示CKAP4專一性CTL之誘導結果之圖(檢體編號；A24-39，第2階段，lane 10‧11)。

第27圖顯示CKAP4專一性CTL之IFNγ產生細胞之定量結果之圖。

針對本發明進一步詳細說明。

[抗原決定位胜肽]

本發明所指胜肽係：有生理活性，且利用相鄰之胺基酸殘基之α-胺基與羧基間之胜肽鍵互相鍵結成的線狀的胺基酸的分子鏈。胜肽不指特定長度者，可以為各種長度。又，可為無電荷或鹽的形態，視情形，也可經糖化、醯胺化、磷酸化、羧基化、磷酸化等修飾。進而，本發明之抗原決定位胜肽只要是生理活性及免疫活性未實質改變，投予時不具有害活性即可，有1個或數個(例如，1~10個)胺基酸或胺基酸類似物插入、加成、取代、缺失等的胜肽亦包括在本發明內。如此的胺基酸的變更目的，可列舉例如：1. 為了提高和HLA之親和性之變更(Rosenberg SA,Yang JC,Schwartzentruber DJ,Hwu P,Marincola FM,Topalian SL,Restifo NP,Dudley ME,Schwarz SL,Spiess PJ,Wunderlich JR,Parkhurst MR,Kawakami Y,Seipp CA,Einhorn JH,White DE.Immunologic and therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatment of patients with metastatic melanoma.Nat Med.1998；4：321-327、Berzofsky JA,Ahlers JD,Belyakov IM.Strategies for designing and optimizing new generation vaccines.Nat Rev Immunol.2001；1：209-219)、

2. 為了使TCR之辨識性改善的變更(Fong L,Hou Y,Rivas A,Benike C,Yuen A,Fisher GA,Davis MM,Engleman EG.Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy.Proc Natl Acad Sci U S A.2001；98：8809-8814、Rivoltini L,Squarcina P,Loftus DJ,Castelli C,Tarsini P,Mazzocchi A,Rini F,Viggiano V,Belli F,Parmiani G.A superagonist variant of peptide MART1/Melan A27-35 elicits anti-melanoma CD8+ T cells with enhanced functional characteristics：implication for more effective immunotherapy.Cancer Res.1999；59：301-306)、

3. 為了避免因為血清中之胜肽分解酵素等而代謝之變更(Berzofsky JA,Ahlers JD,Belyakov IM.Strategies for designing and optimizing new generation vaccines.Nat Rev Immunol.2001；1：209-219、Parmiani G,Castelli C,Dalerba P,Mortarini R,Rivoltini L,Marincola FM,Anichini A.Cancer immunotherapy with peptide-based vaccines：what have we achieved？Where are we going？J Natl Cancer Inst.2002；94：805-818、Brinckerhoff LH,Kalashnikov VV,Thompson LW,Yamshchikov GV,Pierce RA,Galavotti HS,Engelhard VH,Slingluff CL Jr.Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MAR第三1(27-35)peptide：implications for peptide vaccines.Int J Cancer.1999；83：326-334)等。

也包括為了如此的目的而於胜肽之N末端或C末端插入附加的胺基酸序列者。又，本發明之胜肽，能以附加了糖類、聚乙二醇、脂質等而得之複合體、放射性同位元素等而得之衍生物、或聚合體等形態使用。前述胺基酸類似物可以列舉各種胺基酸之N-醯基化物、O-醯基化物、酯化物、醯胺化物、烷基化物等。

又，只要是在CTL能專一性地辨識細胞表面呈現HLA分子與β2-微球蛋白、抗原決定位胜肽之3者複合體的細胞之範圍內即可，抗原胜肽之N末端、游離之胺基也可以鍵結甲醯基、乙醯基、第三丁氧基羰基(t-Boc)基等，在抗原胜肽之C末端、游離羧基也可以鍵結甲基、乙基、第三丁基、苄基等。

又，本發明之抗原決定位胜肽也可以是施以能容易導入到活體內之各種修飾者。作為能容易導入到活體內之各種修飾，例如PT(Protein Transduction)微域係有名。HIV之PT微域係由Tat蛋白質之49~57號胺基酸(Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg)構成之胜肽。據報告藉由將此PT微域附加於目的之蛋白質或胜肽之N末端與C末端之兩者、或任一者，能輕易地導入到細胞內(Ryu J,Han K,Park J,Choi SY.Enhanced uptake of a heterologous protein with an HIV-1 Tat protein transduction domains(PTD)at both termini.Mol Cells.2003；16：385-391、Kim DT,Mitchell DJ,Brockstedt DG,Fong L,Nolan GP,Fathman CG,Engleman EG,Rothbard JB.Introduction of soluble proteins into the MHC class I pathway by conjugation to an HIV tat peptide.J Immunol.1997；159：1666-1668)。

經由HLA第I型分子而呈現之大部分抗原，於利用細胞質內之蛋白酶體分解後，移送到TAP(transporter in antigen processing)，在粗糙面內質網內，和締合於TAP之HLA第I型分子與β2-微球蛋白之複合體結合，並經由高基氏體而利用胞洩作用(exocytosis)運送到細胞表面。藉由能在此等一連串的抗原呈現路徑作用之伴護蛋白(chaperone)HSP(heat shock prtein)70、HSP90、或gp96及目的之胜肽、蛋白質融合，能使其有效率地進行抗原呈現(Basu S,Binder RJ,Ramalingam T,Srivastava PK.CD91 is a common receptor for heat shock proteins gp96,hsp90,hsp70,and calreticulin.Immunity.2001；14：303-313)。

[編碼為抗原決定位胜肽之核酸]

編碼為抗原決定位胜肽之核酸，對於使用基因重組技術使寄主內產生抗原決定位胜肽係重要。於此情形，因為胺基酸密碼子在寄主間之密碼子使用(codon usage)不同，故宜變更胺基酸之密碼子使其適合產生寄主之密碼子使用(codon usage)較理想。編碼為抗原決定位胜肽之核酸就疫苗而言亦為重要，可以就裸露之核酸的形式移送，也可使用適當的病毒或細菌載體移送(Berzofsky JA,Ahlers JD,Janik J,Morris J,Oh S,Terabe M,Belyakov IM Progress on new vaccine strategies against chronic viral infections.J Clin Invest.2004；114：450-462、Berzofsky JA,Terabe M,Oh S,Belyakov IM,Ahlers JD,Janik JE,Morris JC.Progress on new vaccine strategies for the immunotherapy and prevention of cancer.J Clin Invest.2004；113：1515-1525)。適當的細菌載體為沙門氏菌屬亞種之細菌。適當的病毒載體例如：反轉錄病毒載體、EBV載體、痘病毒載體、仙台病毒載體、慢病毒載體。適當的痘病毒載體之一例為改變安卡拉痘病毒(Vaccinia ankara)載體。

[CTL抗原決定位候選胜肽之選擇]

1. 使用電腦預測演算法之分析

本發明之對於EBV有專一性之CTL抗原決定位候選胜肽，可針對LMP2及EBNA1之胺基酸序列，參照能檢索對於目的之HLA第I型分子有結合模體之由8~10個胺基酸構成之胜肽的在網際網路上公開之多數的抗原決定位預測軟體(Pingping Guan,Irini A.Doytchinova,Christianna Zygouri,and Darren R.Flower MHCPred：a server for quantitative prediction of peptide？MHC binding Nucleic Acids Res.,2003；31：3621-3624、Karosiene E,Lundegaard C,Lund O,Nielsen M.NetMHCcons：a consensus method for the major histocompatibility complex class I predictions.Immunogenetics.2012 Mar；64(3)：177-86.、Jorgensen KW,Rasmussen M,Buus S,Nielsen M.NetMHCstab-predicting stability of peptide-MHC-I complexes；impacts for cytotoxic T lymphocyte epitope discovery.Immunology.2014 Jan；141(1)：18-26.)選擇。

2. 使用錨定模體(anchor motif)之探討

HLA第I型分子主要有HLA-A、HLA-B、HLA-C，和它們結合並被呈現之抗原決定位胜肽由8~10個胺基酸構成。抗原決定位胜肽之N末端側算起2號、及9或10號之胺基酸是對於和HLA第I型分子之結合最重要的胺基酸，稱為錨定模體。此錨定模體據報告依各HLA第I型分子之種類而異。例如，作為和全世界研究最先進的HLA-A2結合之胜肽，最為已知的是在距N末端2號的位置配置Leu，在9或10號位置配置Leu 或Val之胜肽且由9~10個胺基酸構成的胜肽(T Sudo,N Kamikawaji,A Kimura,Y Date,CJ Savoie,H Nakashima,E Furuichi,S Kuhara,and T Sasazuki Differences in MHC class I self peptide repertoires among HLA-A2 subtypes J.Immunol.,1995；155：4749-4756)。又，作為和包括日本人在內的東南亞人種常見的HLA-A11(Chang CX,Tan AT,Or MY,Toh KY,Lim PY,Chia AS,Froesig TM,Nadua KD,Oh HL,Leong HN,Hadrup SR,Gehring AJ,Tan YJ,Bertoletti A,Grotenbreg GM.Conditional ligands for Asian HLA variants facilitate the definition of CD8+ T-cell responses in acute and chronic viral diseases.Eur J Immunol.2013 Apr；43(4)：1109-20.)結合之胜肽而言，最為人知的是在距N末端起算2號位置配置Ile、Met、Ser、Thr、或Val之任一者，在9或10號位置配置Lys或Arg之任一者的胜肽且係由9~10個胺基酸構成的胜肽(Rapin N,Hoof I,Lund O,Nielsen M.The MHC motif viewer：a visualization tool for MHC binding motifs.Curr Protoc Immunol.2010 Feb；Chapter 18：Unit 18.17.)。可以從蛋白質之胺基酸序列中選擇有此錨定模體之8~10個胺基酸序列，並選擇CTL抗原決定位候選胜肽。

3. 胜肽庫之製作

合成構成EBV之蛋白質之中之網羅目的之蛋白質全體之由約20個胺基酸序列構成之胜肽庫。以約20個胺基酸之中，有約10個胺基酸序列和前後胜肽為重複的方式製作庫。藉此，能全面地檢索蛋白質全體，只要製作庫一次，即可針對HLA限制性也全面地探討。

[胜肽之合成]

本發明之序列編號：1~35所示之CTL抗原決定位候選胜肽可利用習知的各種胜肽合成方法製備。例如可以使用固相胜肽合成法等有機化學的合成法、或製備編碼為胜肽之核酸並使用重組DNA技術製備。又，也可利用市售的化學合成裝置(例如：Applied Biosystems公司之胜肽合成裝置)合成。

[CTL抗原決定位候選胜肽之探討]

依前述方法選出的CTL抗原決定位候選胜肽不一定能成為CTL抗原決定位胜肽，可經過以下所示之探討而首次成為EBV LMP2專一性CTL抗原決定位胜肽及EBV EBNA1專一性CTL抗原決定位胜肽。

(1)使用培養細胞株之探討

由蛋白酶體進行蛋白質分解而生成的胜肽斷片會藉由TAP(transporter associated with antigen processing)分子而引導到內質網內腔，和HLA第I型分子與β2-微球蛋白之複合體結合並輸送到細胞膜表面。缺少此TAP分子之TAP基因缺損細胞株，內在性蛋白質之分解產物即胜肽斷片無法在細胞膜表面表現。又，對於為代表的TAP基因缺損細胞株的人淋巴芽球樣細胞株T2、或T2將HLA-A11分子進行基因導入而得之細胞株(T2-A11)之HLA分子在細胞膜表面上之表現非常不安定。但是當和從外部供給之胜肽已結合時，HLA分子在細胞膜表面上會安定化。利用此性質，TAP基因缺損細胞株可使用在驗證HLA分子與從外部供給之胜肽之結合性的實驗。具體而言，將TAP基因缺損細胞株與CTL抗原決定位候選胜肽混合培養後，以抗HLA抗體染色，以流式細胞儀計算HLA分子之表現強度之變化，藉此可以探討目的之HLA分子與CTL抗原決定位候選胜肽之結合性。當添加之CTL抗原決定位候選胜肽結合於TAP基因缺損細胞株所表現之HLA分子時，HLA分子與胜肽之複合體在細胞膜表面上安定化，以抗HLA抗體染色時，觀察到HLA分子之表現增強。另一方面，添加之CTL抗原決定位候選胜肽未和HLA分子顯示結合性時，細胞膜表面上之HLA分子不安定，即使以抗HLA抗體染色仍未確認HLA分子之表現增強。可使用如此的方法，驗證HLA分子與CTL抗原決定位候選胜肽之結合性。

(2)折疊試驗

MHC-四聚物試藥係於試管內製造MHC(人的情形為HLA)與β2-微球蛋白及胜肽斷片之3者複合體(MHC-單體)並將MHC-單體予以4聚體化而得之試藥。MHC-四聚物試藥是能夠選擇性地檢測顯示MHC限制性之抗原專一性之細胞毒性T淋巴球(CTL)之唯一試藥。而且，MHC-四聚物試藥於和抗CD(cluster of differentiation)抗體、抗細胞介素抗體等共染色後，藉由以流式細胞儀分析，不只能夠定量CTL之數目，還可就每一細胞個別評價其活化狀態、分化階段。MHC-四聚物試藥製造之最初步驟係從將原料MHC與β2-微球蛋白與胜肽在試管內的適當溶液中混合的折疊開始。在折疊溶液中，由於此3種原料的締合反應形成3者複合體(MHC-單體)。於此時，若MHC與胜肽之結合力越高，此締合反應會越順利進行，藉由以凝膠過濾管柱分析，能夠檢測3種原料的複合體(MHC-單體)。另一方面，MHC與胜肽沒有結合力時，幾乎檢測不到MHC-單體。因此藉由經時分析折疊溶液或進行熱處理等，能夠驗證MHC與胜肽之結合性及安定性。

(3)抗原決定位胜肽專一性CTL之檢測

(3-1)抗原決定位胜肽決定方法

將從有EBV感染歷史的人分離而得的周邊血單核球(peripheral blood mononuclear cells；PBMC)、或從PBMC分離而得的T細胞以0.1~2×10⁶/mL的細胞濃度漂浮在適當的培養基中。於其中加入從同一人預先分離培養而得的EBV感染細胞1×10⁵/mL，於5%二氧化碳氣體(CO₂)恆溫箱中於37℃培養7日。培養7日後添加EBV感染細胞與介白素2(IL-2)，之後利用每週以EBV感染細胞與IL-2進行刺激以誘導CTL。對於以此方式誘導而得之CTL是否對於抗原決定位候選胜肽有專一性的探討，係以MHC-四聚物法、Elispot分析、鉻釋放分析法、細胞內細胞介素染色法等進行判定(Current Protocols in Immunology Edited by：John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober 6.19 ELISPOT Assay to Detect Cytokine-Secreting Murine and Human Cells 6.24 Detection of Intracellular Cytokines by Flow Cytometry published by John Wiley & Sons,Inc.)。

(3-2)抗原決定位胜肽決定方法2

將從有EBV感染歷史的人分離而得的PBMC以0.1~2×10⁶/mL的細胞濃度漂浮在適當的培養基中，於其中將抗原決定位候選胜肽的任意1種以0.01~100μg/mL的濃度添加。於5% CO₂恆溫箱於37℃進行培養，2日後添加IL-2。以後，以每週1次或每2週1次重複進行前述胜肽與IL-2所為之刺激以誘導CTL。針對以此方式誘導而得之CTL是否對於抗原決定位候選胜肽有專一性之探討，係以MHC-四聚物法、Elispot分析、鉻釋放分析、細胞內細胞介素染色法等進行判定。

(3-3)抗原決定位胜肽決定方法3

使由有EBV感染歷史的人分離而得的PBMC以0.1~2×10⁶/mL的細胞濃度漂浮在適當的培養基，於其中加入以適當數量(例如各10種)合併(pooled)合成的胜肽庫者。以5% CO₂恆溫箱以37℃進行培養，於2日後添加IL-2。以後，以每週1次或每2週1次重複進行利用合併胜肽與IL-2所為之刺激，以誘導CTL。針對以此方式誘導而得之CTL是否對於抗原決定位候選胜肽有專一性之探討，係以MHC-四聚物法、Elispot分析、鉻釋放分析、細胞內細胞介素染色法等進行判定。對於顯示良好結果之合併胜肽各加入1種胜肽並重複上述實驗，則可選出有CTL誘導能力之胜肽。針對反應的胜肽按順序縮短，最後獲得由8~10個胺基酸構成的抗原決定位胜肽，作為本發明之抗原決定位胜肽。

[EBV LMP2與EBNA1專一性MHC-單體及MHC-四聚物試藥之製造]

使用了EBV LMP2專一性CTL抗原決定位候選胜肽與EBV EBNA1專一性CTL抗原決定位候選胜肽之MHC-單體及MHC-四聚物試藥，可依公知方法(US Patent Number 5,635,363、French Application Number FR9911133)製備。使從蛋白質表現用之基因重組寄主精製而得之HLA第I型分子、β2-微球蛋白及本發明之LMP2專一性CTL抗原決定位候選胜肽、或EBNA1專一性CTL抗原決定位候選胜肽之3者之複合體MHC-單體，於折疊溶液內形成。在重組HLA第I型分子之C末端預先附加生物素結合部位，於MHC-單體形成後在此部位附加生物素。藉由將市售之經色素標記的鏈黴親和素與生物素化MHC-單體以莫耳比1：4進行混合，可以製造MHC-四聚物試藥。藉由將MHC-四聚物試藥與對抗細胞表面蛋白質之抗體(CD62L、CCR7、CD45RA等)組合使用，可以檢查CTL之分化階段(Seder RA,Ahmed R.Similarities and differences in CD4+ and CD8+ effector and memory T cell generation.Nat Immunol.2003；4：835-842.)。或藉由和細胞內細胞介素染色法組合，可以用於CTL之機能性評價。例如：存在因應HCV(Hepatitis C virus)之CTL係C型肝炎維持持續感染的原因之一，但是據報告CTL有可能不產生細胞介素等、或產生之CTL之比例極低而在免疫學成為不回應性(anergy)(Gruener NH,Lechner F,Jung MC,Diepolder H,Gerlach T,Lauer G,Walker B,Sullivan J,Phillips R,Pape GR,Klenerman P.Sustained dysfunction of antiviral CD8+ T lymphocytes after infection with hepatitis C virus.J Virol.2001；75：5550-5558.)。又，已開始有人認為針對骨髓移植後之CMV專一性CTL，不只調查是否存在CTL，而且也檢查細胞介素產生能力的強弱，對於抗病毒藥投予等的時點為有效(Ozdemir E,St John LS,Gillespie G,Rowland-Jones S,Champlin RE,Molldrem JJ,Komanduri KV.Cytomegalovirus reactivation following allogeneic stem cell transplantation is associated with the presence of dysfunctional antigen-specific CD8+ T cells.Blood.2002；100：3690-3697.)。若以此方式鑑別專一性之CTL抗原決定位胜肽並製造MHC-四聚物試藥，能夠進行專一性之CTL之定量與定性，在獲得診斷資訊方面可能有重大貢獻。

[主動免疫疫苗]

胜肽疫苗

本發明之CTL抗原決定位胜肽在主動免疫療法可以作為胜肽疫苗使用。亦即，將含有本發明之CTL抗原決定位胜肽而成的疫苗對於患者投予，使EBV LMP2專一性CTL或EBV EBNA1專一性CTL在體內增殖，在對於感染之預防、及對於傳染病及EBV陽性腫瘤之治療可發揮效用。使用之抗原決定位胜肽可只有1種，或可因應疫苗之使用目的而將2種以上之胜肽組合、混用。

利用抗原呈現細胞之疫苗

呈現本發明之CTL抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞可在主動免疫療法作為疫苗使用。呈現CTL抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞，係指：

1. 使抗原呈現細胞與CTL抗原決定位胜肽在適當的培養液中混合30分鐘到1小時而得的CTL抗原決定位胜肽脈衝抗原呈現細胞

2. 使用編碼為CTL抗原決定位胜肽之核酸，以基因導入等使抗原呈現細胞呈現CTL抗原決定位胜肽之細胞

3. 具有人工製備之抗原呈現能力之人工抗原呈現細胞。抗原呈現細胞係指，例如，樹狀細胞、B細胞、巨噬細胞、某種T細胞等，係在其細胞表面上表現該胜肽能結合之HLA分子的細胞，且有CTL刺激能力。具有人工製備的抗原呈現能力的人工抗原呈現細胞，可藉由例如將HLA分子與CTL抗原決定位胜肽與β2-微球蛋白之三者複合體固定在脂雙層、塑膠或乳膠等珠粒，並固定能夠刺激CTL之CD80、CD83、CD86等共刺激分子，或固定會對於和共刺激分子結合之T細胞側之配體即CD28以致效性作用之抗體等以製備(Oelke M,Maus MV,Didiano D,June CH,Mackensen A,Schneck JP.Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.Nat Med.2003；9：619-624、Walter S,Herrgen L,Schoor O,Jung G,Wernet D,Buhring HJ,Rammensee HG,Stevanovic S.Cutting edge：predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres.J Immunol.2003；171：4974-4978、Oosten LE,Blokland E,van Halteren AG,Curtsinger J,Mescher MF,Falkenburg JH,Mutis T,Goulmy E.Artificial antigen-presenting constructs efficiently stimulate minor histocompatibility antigen-specific cytotoxic T lymphocytes.Blood.2004；104：224-226)。

基因疫苗

本發明之CTL抗原決定位胜肽之核酸在主動免疫療法可用於DNA疫苗、重組病毒載體疫苗等。於此情形，CTL抗原決定位胜肽之核酸序列宜變更為適合重組疫苗、產生重組病毒疫苗之寄主的密碼子使用(codon usage)(Casimiro,D.R.et al.Comparative Immunogenicity in Rhesus Monkeys of DNA Plasmid,Recombinant Vaccinia Virus,and Replication-Defective Adenovirus Vectors Expressing a Human Immunodeficiency Virus Type 1 gag Gene J.Virol.,2003；77：6305-6313、Berzofsky JA,Ahlers JD,Janik J,Morris J,Oh S,Terabe M,Belyakov IM.Progress on new vaccine strategies against chronic viral infections.J Clin Invest.2004；114：450-462)。

本發明之CTL抗原決定位胜肽、或含有呈現CTL抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞而成的疫苗，可使用該領域公知之方法製備。例如，該疫苗有含有本發明之CTL抗原決定位胜肽作為有效成分之注射劑或固體劑等。CTL抗原決定位胜肽能以中性或鹽的形態配方，例如，作為藥學上可容許之鹽可列舉鹽酸、磷酸等無機鹽、或乙酸、酒石酸等有機酸。又，呈現本發明之CTL抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞，可以使用製藥上可容許，且和該胜肽或該細胞之活性有相容性之賦形劑，例如，水、食鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油、DMSO(dimethyl sulphoxide)、及其他佐劑等、或和該等之組合混合使用。再者，視需要也可以添加白蛋白、濕潤劑、乳化劑等輔助劑。

本發明之疫苗可利用非經口投予及經口投予進行投予，一般係以非經口投予為較佳。非經口投予有經鼻投予、皮下注射、肌肉內注射、靜脈內注射等注射劑、栓劑等。又，經口投予可以製備成和澱粉、甘露醇、乳糖、硬脂酸鎂、纖維素等賦形劑之混合物。

本發明之疫苗係以治療上有效的量投予。投予量取決於治療對象、免疫系，必要的投予量依臨床醫師的判斷決定。通常適當投予量係每名患者，CTL抗原決定位胜肽為1~100mg，CTL抗原決定位胜肽刺激細胞為10⁶~10⁹個之含量。又，投予間隔可依對象、目的設定。

[被動免疫疫苗]

本發明之CTL抗原決定位胜肽可用於被動免疫治療劑之製備。可使依以下方式獲得之對於EBV LMP2為專一性之CTL或對於EBV EBNA1為專一性之CTL懸浮在含人白蛋白之PBS等，製成針對EBV之被動免疫療法劑。被動免疫療法劑所含之對於EBV為專一性之CTL可依如以下的製備方法獲得，為了提高CTL的純度，亦可精製後使用。

CTL製備方法1

使PBMC和適當濃度的EBV專一性MHC-四聚物試藥反應。和MHC-四聚物試藥結合之EBV專一性CTL因為已以標記色素染色，所以使用細胞分選儀、顯微鏡等只將已染色的CTL予以單離。使依此方式單離的EBV專一性之CTL刺激經以抗CD3抗體、PHA、IL-2等T細胞刺激藥劑、X射線照射或絲裂黴素處理等損失了增殖能力的抗原呈現細胞刺激並使其增殖，確保對於被動免疫療法為必要的細胞數。

CTL製備方法2

將EBV專一性MHC-單體及/或MHC-四聚物試藥固相化於無菌細胞培養盤等，將PBMC以固相化盤進行培養。為了將和固相化於盤之MHC-單體及/或MHC-四聚物試藥所結合之EBV專一性CTL予以單離，將未結合而是漂浮的其他細胞洗掉後，只將殘留在盤上之專一性CTL懸浮於新的培養基。使以此方式單離而得的EBV專一性CTL利用抗CD3抗體、PHA、IL-2等T細胞刺激藥劑、經以X射線照射或絲裂黴素處理等而損失增殖能力之抗原呈現細胞刺激並使其增殖，確保被動免疫療法所必要之細胞數。

CTL製備方法3

將EBV專一性MHC-單體及/或MHC-四聚物試藥、以及CD80、CD83、CD86等共刺激分子、或對於和共刺激分子結合之T細胞側之配體CD28為致效性作用之抗體等固相化於無菌細胞培養盤等，將PBMC以固相化盤進行培養。2日後添加IL-2到培養基，於5% CO₂恆溫箱中於37℃培養7~14日。回收培養後的細胞，重新在固相化盤上繼續培養。藉由重複此操作，確保被動免疫療法所必要之細胞數之CTL。

CTL製備方法4

以本發明之CTL抗原決定位胜肽直接刺激PBMC或T細胞，或以已脈衝了該胜肽之抗原呈現細胞、經基因導入之抗原呈現細胞、或具有人工製備之抗原呈現能力之人工抗原呈現細胞進行刺激。刺激可為活體外(in vitro)進行，也可為活體內(in vivo)進行。以活體外(in vitro)刺激時，係將經刺激而誘導之CTL於5% CO₂恆溫箱於37℃培養7~14日。在培養時每週1次重複進行利用CTL抗原決定位胜肽與IL-2、或抗原呈現細胞與IL-2所為之刺激，以確保被動免疫療法所必要之細胞數之CTL。

CTL之精製法

在CTL製備方法中，專一性CTL之比例低時，可藉由隨時使用以下方法而能以高純度回收專一性CTL。

利用MHC-四聚物試藥所為之精製

可使EBV專一性MHC-四聚物試藥和以CTL製備方法誘導出的CTL反應，並將對抗標記MHC-四聚物試藥之標記色素之抗體等以經磁性標記之2次抗體進行分離。如此之經磁性標記之2次抗體與磁性標記細胞分離裝置，例如可以由Dynal公司、Miltenyi Biotec GmbH公司取得。依此方式單離而得的EBV專一性CTL以抗CD3抗體、PHA、IL-2等T細胞刺激藥劑刺激並使其增殖，確保被動免疫療法所必要之細胞數。

利用分泌之細胞介素所為之精製

EBV專一性CTL可利用釋放之細胞介素等而進行EBV專一性CTL之精製。例如，可藉由使用由Miltenyi Biotec GmbH公司能取得之套組，將從CTL釋放的細胞介素在細胞表面以專一抗體捕捉，以抗細胞介素標記抗體進行染色，然後以經磁性標記之標記物質專一性之抗體反應後，使用磁性標記細胞分離裝置進行精製亦可。將以此方式單離而得之EBV專一性CTL以抗CD3抗體、PHA、IL-2等T細胞刺激藥劑刺激並使其增殖，確保被動免疫療法所必要之細胞數。

使用細胞表面蛋白質專一性抗體之精製

據報告在專一性CTL之細胞表面有因專一性刺激而增強表現之細胞表面蛋白質(例如CD137、CD107a、CD107b、CD63、CD69等)(Betts MR,Brenchley JM,Price DA,De Rosa SC,Douek DC,Roederer M,Koup RA.Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation.J Immunol Methods.2003；281：65-78、Trimble LA,Shankar P,Patterson M,Daily JP,Lieberman J.Human immunodeficiency virus-specific circulating CD8 T lymphocytes have down-modulated CD3zeta and CD28,key signaling molecules for T-cell activation.J Virol.2000；74：7320-7330)。藉由將如此的蛋白質的專一抗體進行磁性標記，可使用磁性分離裝置等將CTL予以精製。又，藉由將對抗如此的專一抗體之抗IgG抗體等進行磁性標記，也同樣可進行CTL之精製。或將這些專一抗體包被在培養用之塑膠盤，使用此盤來培養已施以刺激之PBMC，將未結合於盤之細胞群體洗掉，亦可將專一性CTL予以精製。使以此方式單離而得的EBV專一性CTL以抗CD3抗體、PHA、IL-2等T細胞刺激藥劑刺激並使其增殖，確保被動免疫療法所必要之細胞數。

[EBV專一性CTL之定量]

了解EBV專一性CTL是否存在於癌患者之周邊血、或其量之變動，是為了預測EBV專一性CTL抗原決定位胜肽之重要資訊。EBV專一性CTL之定量，可利用使用本發明之CTL抗原決定位胜肽之以下3種方法進行。

定量方法1(MHC-四聚物法)

可採用使用本發明之CTL抗原決定位胜肽而製得之MHC-四聚物試藥，周邊血中之對於EBV專一性之CTL進行定量。定量，例如可依以下方式實施。使周邊血或PBMC和適當濃度之MHC-四聚物試藥反應。因為和該MHC-四聚物試藥結合的CTL會被標記色素染色，故可使用流式細胞儀、顯微鏡等計數。和MHC-四聚物試藥反應時，藉由和以與MHC-四聚物試藥為不同色素標記之抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD8抗體等反應，亦能同時判定EBV專一性之CTL之T細胞次組。

定量方法2

藉由以本發明之CTL抗原決定位胜肽刺激PBMC，以定量CTL所產生之IFNγ(interferon gamma)、TNFα(tumor necrosis factor alpha)、介白素等細胞介素及/或趨化介素之方法。以下舉IFNγ為例，顯示具體方法。

2-1 利用細胞介素定量所為之方法1(細胞內IFNγ產生細胞定量法)

將PBMC以約2×10⁶/mL的細胞濃度漂浮於適當培養基中，加入本發明之CTL抗原決定位胜肽。然後，加入細胞內蛋白質輸送抑制劑(例如，Brefeldin A、Monensin等)，於5% CO₂恆溫箱內於37℃培養5~16小時。培養後，使其和T細胞指標抗體(抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD8抗體)或MHC-四聚物試藥反應，將細胞固定後，透過透膜處理，使其和色素標記抗IFNγ抗體反應。使用流式細胞儀等進行解析，定量全部細胞中，T細胞中或MHC-四聚物試藥陽性細胞中之IFNγ陽性細胞率。

2-2 利用細胞介素定量所為之方法2(Elispot分析)

於已固相化抗IFNγ抗體之96孔MultiScreen-HA盤(Millipore公司)接種PBMC。之後，將CTL抗原決定位胜肽放入各孔，於37℃之5% CO₂恆溫箱培養器培養20小時。次日洗滌盤，按照抗IFNγ抗體、過氧化酶(peroxidase)標記抗IgG抗體的順序使其反應。然後，加入過氧化酶之基質，利用發色使IFNγ點可見化，使用實體顯微鏡或是ELISPOT分析儀(C.T.L.公司)進行計數以定量。

2-3 利用細胞介素定量所為之方法3(將分泌到培養上清中之IFNγ予以定量之方法)

將PBMC以約2×10⁶/mL之細胞濃度漂浮在適當的培養基中，加入本發明之CTL抗原決定位胜肽。於5% CO₂恆溫箱中，於37℃培養24~48小時。培養後回收上清，將其中所含之IFNγ濃度使用市售ELISA套組(例如R&D Systems公司之Quantikine ELISA Human IFNγ Immunoassay)進行定量。

定量方法3

使用細胞表面蛋白質專一性抗體進行定量。據報告對於CTL抗原決定位胜肽有專一性之CTL由於專一性刺激，細胞表面蛋白質(例如CD137、CD107a、CD107b、CD63、CD69等)之表現會增強。因此藉由將經CTL抗原決定位胜肽等刺激之PBMC和專一性地辨識細胞表面蛋白質之標記抗體進行混合，CTL會和標記抗體結合並被標記色素染色。經染色之CTL可以使用流式細胞儀、顯微鏡等計數並定量。再者，藉由添加以和標記抗體為不同色素標記之抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD8抗體等，可同時判定專一性CTL之T細胞次組。

[使用培養袋之CTL大量培養]

本培養步驟之特徵為，在習知方法之抗原專一性之細胞毒性T淋巴球(CTL)之誘導不使用樹狀細胞，而使用自體血漿，故能夠以低廉且簡便的操作製備大量CTL。技術之詳情詳細記載於發明人等的提申專利(日本專利申請案第2009-166630號)。

以肝素(heparin)採血管收集HLA-A11陽性健康成人周邊血20~200mL，於室溫以3,000rpm進行10分鐘離心處理。分取上清之血漿，進行非動化處理(56℃、20分鐘)。再度於室溫以3,000rpm進行10分鐘離心處理，回收上清後，分注於小容器，保存於-30℃，準備隨時溶解作為培養用血漿。分取上清血漿後的殘餘物加入等量RPMI1640培養基，以Ficoll比重離心分離法將PBMC予以單離。計測細胞數，使10/11量之細胞懸浮於RPMI1640培養基，加入培養用血漿使終濃度成為10%。接著添加CTL抗原決定位胜肽，使用Luer-Lock注射筒注入到培養用袋(CultiLife215 TAKARA BIO公司)，於37℃、5% CO₂之CO₂恆溫箱靜置(CTL誘導袋)。使1/11量之細胞懸浮於RPMI1640培養基，加入培養用血漿使終濃度成為10%，並添加抗CD3抗體使終濃度成為1μg/mL後，使用Luer-Lock注射筒注入到培養用袋，於37℃、5% CO₂之CO₂恆溫箱靜置(抗原呈現細胞誘導袋)。2日後將等量之含IL-2之培養基(RPMI1640 IL-2 100IU/mL)注入到培養用袋。於CO₂ 恆溫箱內進行5日培養後，將等量之含IL-2之培養基(AlyS505N IL-2 100IU/mL)注入到培養用袋。之後每隔3日注入等量之含IL-2之培養基(AlyS505N IL-2 100IU/mL)(在此之間隔不一定需要統一)。利用以上操作，能在培養開始起約14日的期間誘導抗原專一性CTL與抗原呈現細胞兩者。約14日後回收抗原呈現細胞誘導袋之細胞，計數細胞數並進行離心處理後，懸浮於RPMI1640培養基，添加CTL抗原決定位胜肽，於室溫培養1小時。離心後吸去上清，懸浮於含IL-2之培養基(AlyS505N IL-2 100IU/mL 10%血漿)(胜肽脈衝抗原呈現細胞)。同樣，回收CTL誘導袋之細胞，計數細胞數並進行離心處理後，吸去上清，將細胞懸浮於含IL-2之培養基(AlyS505N IL-2 100IU/mL 10%血漿)。和CTL誘導袋之細胞數為等量之胜肽脈衝抗原呈現細胞混合，使用Luer-Lock注射筒注入到培養用袋。之後，將培養用袋移到37℃、5% CO₂之CO₂恆溫箱內，開始培養。1日後於培養用袋內追加增殖用培養基(AlyS505N IL-2 1000IU/mL)。於CO₂恆溫箱內培養3日後，於培養用袋內追加增殖用培養基。之後每隔2日進行增殖用培養基之追加。利用以上操作，可於培養開始起約20~24日之短時間獲得抗原專一性CTL。

[CTL抗原決定位候選胜肽之選擇]

1. 使用電腦之分析

本發明之對於CKAP4有專一性之CTL抗原決定位候選胜肽，可針對CKAP4蛋白質之胺基酸序列，參照能檢索對於目的之HLA第I型分子有結合模體之由8~12個胺基酸構成的胜肽之在網際網路上公開之多數軟體(Lundegaard C,Lund O,Buus S,Nielsen M,Major histocompatibility complex class I binding predictions as a tool in epitope discovery.Immunology.,2010；130：309-318)進行選擇。

2. 使用錨定模體之探討

HLA第I型分子主要有HLA-A、HLA-B、HLA-C，和它們結合並被呈現之抗原決定位胜肽係由8~10個胺基酸構成。自抗原決定位胜肽之N末端側起2號、及9或10號之胺基酸是對於和HLA第I型分子之結合最重要的胺基酸，稱為錨定模體。此錨定模體據報告依各HLA第I型分子之種類而異。例如作為和全世界研究最進步的HLA-A2分子結合之胜肽，係以在N末端起2號之位置配置Leu，在9或10號位置配置Leu或Val之胜肽且由9~10個胺基酸構成之胜肽最為人所知(T Sudo,N Kamikawaji,A Kimura,Y Date,CJ Savoie,H Nakashima,E Furuichi,S Kuhara,and T Sasazuki Differences in MHC class I self peptide repertoires among HLA-A2 subtypes.J.Immunol.,1995；155：4749-4756)。又，作為和在包括日本人在內的亞洲人種多有的HLA-A24分子結合之胜肽，係以自N末端起2號位置配置Tyr、Phe、Met或Trp中任一者，在9或10號位置配置Leu、Ile、Trp或Phe中任一者之胜肽且係由9~10個胺基酸構成之胜肽最為人所知(A Kondo,J Sidney,S Southwood,MF del Guercio,E Appella,H Sakamoto,E Celis,HM Grey,RW Chesnut,and RT Kubo,Prominent roles of secondary anchor residues in peptide binding to HLA-A24 human class I molecules.,J.Immunol.,1995；155：4307-4312)。可以從蛋白質之胺基酸序列中檢索由具此錨定模體之8~12個胺基酸構成的序列並且選擇CTL抗原決定位候選胜肽。

[胜肽之合成]

本發明之序列編號：36~47所示之CTL抗原決定位候選胜肽可依習知之各種胜肽合成方法製備。例如，可使用固相胜肽合成法等有機化學合成法、或製備編碼為胜肽之核酸並使用重組DNA技術製備。又，也可以利用市售之化學合成裝置(例如，Applied Biosystems公司之胜肽合成裝置)合成。

[CTL抗原決定位候選胜肽之探討]

如上述，藉由使用預測軟體，能於短時間分析構成蛋白質之胺基酸序列，並且預測CTL抗原決定位候選胜肽與HLA之結合力、解離之半衰期。但是使用如此的預測軟體獲得之候選胜肽不一定在活體內會作為CTL抗原決定位作用。

作為第一個理由，可列舉該等分析軟體幾乎未考慮到因蛋白質之分解所致胜肽斷片產生之效率。CTL抗原決定位係由8-12個胺基酸殘基長的胜肽斷片構成，它們是在細胞內因抗原蛋白質受到各種分解而產生。具體而言，首先抗原蛋白質在細胞質內因為蛋白酶體而受分解，形成胜肽之C末端。之後，利用TAP(transporter associated with antigen processing)分子而輸送到內質網內腔，於此利用稱為ERAP1之蛋白酶而形成N末端，方成為8-12個胺基酸殘基長之胜肽斷片。CTL抗原決定位候選胜肽之預測必需考慮在該等細胞內之胜肽斷片之產生過程‧效率，但現在並無法正確地預測。所以，使用預測軟體獲得之候選胜肽之中，實際上會包括在細胞內無法構成8-12個胺基酸殘基長之胜肽斷片者。

第二個理由是T細胞之選擇性分化過程。癌抗原為自體抗原，對於來自自體抗原之胜肽斷片強力反應之T細胞會因為負選擇(negative selection)而在胸腺內誘導細胞凋亡並排除。另一方面，對於外來抗原反應之T細胞會被正選擇所選擇。從如此的T細胞之分化過程，和來自自體抗原之胜肽斷片反應之T細胞通常會在胸腺被除去，據認為於周邊血中僅有極少存在。又，在全部的有核細胞、血小板之膜表面表現之HLA分子會呈現來自自體抗原之胜肽斷片，和HLA結合之胜肽斷片有無數種存在。即，在細胞膜表面上HLA所呈現之來自自體抗原之胜肽斷片之中，CTL會辨識的只有非常少數，據認為預測軟體得到的CTL抗原決定位候選胜肽大部分都無法被CTL辨識。亦即據認為無抗原性。

由該等理由，可以說只是簡單以預測軟體獲得CTL抗原決定位候選胜肽，和鑑定擔任免疫回應之CTL抗原決定位胜肽大不相同。發明人等利用使用MHC-四聚物試藥直接檢測對於候選胜肽為專一性之活體內之CTL的方法，來進行CTL抗原決定位胜肽之鑑定。亦即，從周邊血等試樣利用MHC-四聚物試藥來檢測專一性CTL之情事，係指在活體內引發候選胜肽專一性之免疫回應，代表候選胜肽為CTL抗原決定位胜肽。

由以上，以前述方法選擇之CTL抗原決定位候選胜肽經以下所示(1)~(3)之探討，方可成為CKAP4專一性CTL 抗原決定位胜肽。

(1)使用培養細胞株之探討

利用蛋白酶體所為之蛋白質分解而生成的胜肽斷片藉由TAP分子而引導到內質網內腔，結合於HLA第I型分子與β2-微球蛋白之複合體，並向細胞膜表面輸送。此TAP分子缺損之TAP基因缺損細胞株，無法在細胞膜表面表現係內在性蛋白質之分解產物的胜肽斷片。又，在代表性的TAP基因缺損細胞株即人淋巴芽球樣細胞株T2、或T2將HLA-A24分子進行基因導入而得之細胞株(T2-A24)之HLA分子，在細胞膜表面上之表現非常不安定。但是若和從外部供給之胜肽結合時，HLA分子會在細胞膜表面上安定化。利用此性質，TAP基因缺損細胞株可使用在驗證HLA分子與從外部供給之胜肽之結合性的實驗。具體而言，將TAP基因缺損細胞株與CTL抗原決定位候選胜肽混合培養後，以抗HLA抗體染色，以流式細胞儀算出HLA分子之表現強度之變化，可以探討目的之HLA分子與CTL抗原決定位候選胜肽之結合性。當添加的CTL抗原決定位候選胜肽結合於TAP基因缺損細胞株所表現之HLA分子時，HLA分子與胜肽之複合體會在細胞膜表面上安定化，以抗HLA抗體染色時，觀察到HLA分子之表現增強。另一方面，添加之CTL抗原決定位候選胜肽未顯示和HLA分子之結合性時，細胞膜表面上之HLA分子不安定，即使以抗HLA抗體染色，仍不能確認到HLA分子之表現增強。利用如此的方法可以驗證HLA分子與CTL抗原決定位候選胜肽之結合性。

(2)折疊試驗

MHC-四聚物試藥係於試管內製造MHC(人的情形為HLA)與β2-微球蛋白及胜肽斷片之3者複合體(MHC-單體)並將MHC-單體予以4聚體化而得之試藥。MHC-四聚物試藥是能夠選擇性地檢測顯示MHC限制性之抗原專一性之CTL之唯一之試藥。又，MHC-四聚物試藥在和抗CD(cluster of differentiation)抗體、抗細胞介素抗體等共染色後以流式細胞儀分析，不只能定量CTL之量，還能就每一細胞逐一評價其活化狀態、分化階段。MHC-四聚物試藥製造之最初步驟，係從將原料MHC與β2-微球蛋白與胜肽在試管內的適當溶液中混合之折疊開始。在折疊溶液中，由於此3種原料之締合反應，形成3者複合體(MHC-單體)。於此時，MHC與胜肽之結合力越高，則此締合反應越順利進行，利用以凝膠過濾管柱分析，能夠檢測3種原料之複合體(MHC-單體)。另一方面，MHC與胜肽沒有結合力時，則幾乎不能檢測到MHC-單體。因此藉由經時分析折疊溶液，或進行熱處理等，能夠驗證MHC與胜肽之結合性及安定性。

(3)抗原決定位胜肽專一性CTL之檢測

將從健常人分離而得的周邊血單核球(peripheral blood mononuclear cells；PBMC)以1~3×10⁶/mL之細胞濃度漂浮在適當的培養基，於其中加入CTL抗原決定位候選胜肽(序列編號：36~47)中任一者或數種，使其成為1~100μg/mL之濃度，分注於96孔培養盤，使其成為100μL/孔。於5% CO₂恆溫箱於37℃進行培養，2日後添加IL-2。以後每7~14日進行1次利用胜肽與IL-2所為之刺激，以誘導CTL。針對以此方式誘導而得之CTL是否對於CTL抗原決定位候選胜肽有專一性之探討，係以MHC-四聚物法判定。當檢測到能以MHC-四聚物試藥染色之CTL時，使用之CTL抗原決定位候選胜肽可鑑別是有CTL誘導能力之抗原性胜肽(抗原決定位胜肽)。一般而言，從胸腺移出之T細胞(未改變T細胞)係受到樹狀細胞、巨噬細胞等抗原呈現細胞所為之抗原刺激方會活化而分化成效應子T細胞。單純將PBMC與胜肽混合培養之方法，尤其是因為沒有使用人為製備的抗原呈現細胞，故周邊血之未改變T細胞分化之可能性低，據認為在PBMC存在之效應子/記憶T細胞會因胜肽刺激而增殖。因此當檢測到能以MHC-四聚物試藥染色之CTL時，意指原本供血者周邊血PBMC存在效應子/記憶型的CTL，啟示在活體內不斷地引起介由抗原性胜肽之免疫回應。

[CKAP4專一性MHC-單體及MHC-四聚物試藥之製造]

使用CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽之MHC-單體及MHC-四聚物試藥可依公知方法(US Patent Number 5,635,363、French Application Number FR9911133)製備。從蛋白質表現用之基因重組寄主精製所之HLA第I型分子、β2-微球蛋白及本發明之CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽之3者複合體MHC-單體係在折疊溶液內形成。在重組HLA第I型分子之C末端預先附加生物素結合部位，MHC-單體形成後此部位會附加生物素。將市售之經色素標記之鏈黴親和素與生物素化MHC-單體以莫耳比1：4混合，藉此可以製造MHC-四聚物試藥。又，藉由組合使用對抗細胞表面蛋白質之抗體(CD62L、CCR7、CD45RA等)，能夠檢查CTL之分化階段(Seder RA,Ahmed R.Similarities and differences in CD4+ and CD8+ effector and memory T cell generation.Nat Immunol.2003；4：835-842)。或藉由和細胞內細胞介素染色法組合，能夠使用在CTL之機能性評價。例如，於C型肝炎維持持續感染的原因之一，據報告可能是雖存在對抗HCV(Hepatitis C virus)之CTL，但是CTL不產生細胞介素等、或產生之CTL之比例極低，成為免疫學上不回應性(anergy)(Gruener NH,Lechner F,Jung MC,Diepolder H,Gerlach T,Lauer G,Walker B,Sullivan J,Phillips R,Pape GR,Klenerman P.Sustained dysfunction of antiviral CD8+ T lymphocytes after infection with hepatitis C virus.J Virol.2001；75：5550-5558)。又，針對骨髓移植後之HCMV專一性CTL，不只是調查其CTL是否存在，也有人開始認為調查細胞介素產生能力之強弱，在為了計算抗病毒藥投予等的時點為有效(Ozdemir E,St John LS,Gillespie G,Rowland-Jones S,Champlin RE,Molldrem JJ,Komanduri KV.Cytomegalovirus reactivation following allogeneic stem cell transplantation is associated with the presence of dysfunctional antigen-specific CD8+ T cells.Blood.2002；100：3690-3697)。若依如此方式鑑定專一性之CTL抗原決定位胜肽並製造MHC-四聚物試藥，能進行專一性之CTL之定量與定性，在獲得診斷資訊方面有巨大貢獻。

[主動免疫疫苗]

胜肽疫苗

本發明之CTL抗原決定位胜肽在主動免疫療法中可作為胜肽疫苗使用。亦即，含有本發明之CTL抗原決定位胜肽而成之疫苗對於患者投予，使CKAP4專一性CTL在體內增殖，能期待對於惡性腫瘤之治療。

利用抗原呈現細胞之疫苗

呈現本發明之CTL抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞在主動免疫療法中可作為疫苗使用。呈現CTL抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞，係指：

1. 在適當培養液中，使抗原呈現細胞與CTL抗原決定位胜肽混合30分鐘至1小時而得之CTL抗原決定位胜肽脈衝抗原呈現細胞

3. 具有人工製備之抗原呈現能力之人工抗原呈現細胞。抗原呈現細胞係指例如：樹狀細胞、B細胞、巨噬細胞、某種T細胞等，係指在其細胞膜表面上表現該胜肽能結合之HLA分子之細胞且有CTL刺激能力者。具有人工製備之抗原呈現能力之人工抗原呈現細胞，係藉由例如在脂雙層、塑膠或乳膠等珠粒固定HLA分子與CTL抗原決定位胜肽與β2-微球蛋白之3者複合體，並固定能刺激CTL之CD80、CD83、CD86等共刺激分子，或固定對於和共刺激分子結合之T細胞側之配體CD28有致效作用之抗體等以製備(Oelke M,Maus MV,Didiano D,June CH,Mackensen A,Schneck JP.Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.Nat Med.2003；9：619-624、Walter S,Herrgen L,Schoor O,Jung G,Wernet D,Buhring HJ,Rammensee HG,Stevanovic S.Cutting edge：predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres.J Immunol.2003；171：4974-4978、Oosten LE,Blokland E,van Halteren AG,Curtsinger J,Mescher MF,Falkenburg JH,Mutis T,Goulmy E.Artificial antigen-presenting constructs efficiently stimulate minor histocompatibility antigen-specific cytotoxic T lymphocytes.Blood.2004；104：224-226)。

基因疫苗

本發明之CTL抗原決定位胜肽之核酸在主動免疫療法中可用為DNA疫苗、重組病毒載體疫苗等。於此情形，CTL抗原決定位胜肽之核酸序列希望變更為重組疫苗、產生重組病毒疫苗之寄主所適合之密碼子使用(codon usage)(Casimiro,D.R.et al.Comparative Immunogenicity in Rhesus Monkeys of DNA Plasmid,Recombinant Vaccinia Virus,and Replication-Defective Adenovirus Vectors Expressing a Human Immunodeficiency Virus Type 1 gag Gene.J.Virol.,2003；77：6305-6313、Berzofsky JA,Ahlers JD,Janik J,Morris J,Oh S,Terabe M,Belyakov IM.Progress on new vaccine strategies against chronic viral infections.J Clin Invest.2004；114：450-462)。

本發明之CTL抗原決定位胜肽、或含有呈現CTL抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞而成之疫苗可使用該領域公知之方法製備。例如，該疫苗有含有本發明之CTL抗原決定位胜肽作為有效成分之注射劑或固體劑等。CTL抗原決定位胜肽能以中性或鹽的形態配方，例如作為藥學上可容許之鹽可列舉鹽酸、磷酸等無機鹽、或乙酸、酒石酸等有機酸。又，呈現本發明之CTL抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞，可以使用製藥上容許，且和該胜肽或該細胞之活性有相容性之賦形劑、例如：水、食鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油、DMSO(dimethyl sulphoxide)、及其他佐劑等、或將該等之組合混合使用。再者，視需要亦可添加白蛋白、濕潤劑、乳化劑等輔助劑。

本發明之疫苗可利用非經口投予及經口投予進行投予，一般而言以非經口投予為較佳。非經口投予有經鼻投予、皮下‧皮內注射、肌肉內注射、靜脈內注射等注射劑、栓劑等。又，就經口投予而言，可製備成和澱粉、甘露醇、乳糖、硬脂酸鎂、纖維素等賦形劑的混合物。

本發明之疫苗係以治療上有效的量進行投予。投予量取決於治療對象、免疫系，且必要之投予量由臨床醫師的判斷決定。通常適當投予量是患者每人，CTL抗原決定位胜肽為1~100mg、CTL抗原決定位胜肽刺激細胞為10⁶~10⁹個之含量。又，投予間隔可依據對象、目的進行設定。

[被動免疫疫苗]

本發明之CTL抗原決定位胜肽可以用於被動免疫治療劑之製備。可將依以下方式獲得之對於CKAP4有專一性之CTL 懸浮於含有人白蛋白之PBS等，而製成對抗表現CKAP4之惡性腫瘤的被動免疫療法劑。被動免疫療法劑所含有的對於CKAP4為專一性之CTL可依如下之製備方法獲得，為了提高CTL之純度，也可以精製後使用。

CTL製備方法1

使PBMC和適當濃度的CKAP4專一性MHC-四聚物試藥反應。和MHC-四聚物試藥結合之CKAP4專一性CTL會被標記色素所染色，故使用細胞分選儀、顯微鏡等只將已染色的CTL予以單離。使以如此的方式單離而得之CKAP4專一性之CTL利用抗CD3抗體、PHA、IL-2等T細胞刺激藥劑、經X射線照射或絲裂黴素處理等而喪失增殖能力之抗原呈現細胞刺激並使其增殖，以確保被動免疫療法所必要之細胞數。

CTL製備方法2

將CKAP4專一性MHC-單體及/或MHC-四聚物試藥固相化於無菌細胞培養盤等，將PBMC以固相化盤進行培養。為了將和固相化於盤之MHC-單體及/或MHC-四聚物試藥所結合之CKAP4專一性CTL予以單離，將未結合而是漂浮的其他細胞洗掉後，只將殘留在盤上之CKAP4專一性CTL懸浮於新的培養基。使以此方式單離而得的CKAP4專一性CTL利用抗CD3抗體、PHA、IL-2等T細胞刺激藥劑、經以X射線照射或絲裂黴素處理等而損失增殖能力之抗原呈現細胞刺激並使其增殖，確保被動免疫療法所必要之細胞數。

CTL製備方法3

將CKAP4專一性MHC-單體及/或MHC-四聚物試藥、以及CD80、CD83、CD86等共刺激分子、或對於和共刺激分子結合之T細胞側之配體CD28為致效性作用之抗體等固相化於無菌細胞培養盤等，將PBMC以固相化盤進行培養。2日後添加IL-2到培養基，於5% CO₂恆溫箱中於37℃培養7~10日。回收培養後的細胞，重新在固相化盤上繼續培養。藉由重複此操作，確保被動免疫療法所必要之細胞數之CTL。

CTL製備方法4

以本發明之CTL抗原決定位胜肽直接刺激PBMC或T鈀胞，或以脈衝了該胜肽之抗原呈現細胞、經基因導入之抗原呈現細胞、或具有人工製備之抗原呈現能力之人工抗原呈現細胞進行刺激。刺激可為活體外(in vitro)進行，也可為活體內(in vivo)進行。以活體外(in vitro)刺激時，係將經刺激而誘導之CTL於5% CO₂恆溫箱於37℃培養7~14日。在培養時每週1次重複進行利用CTL抗原決定位胜肽與IL-2、或抗原呈現細胞與IL-2所為之刺激，以確保被動免疫療法所必要之細胞數之CTL。

CTL之精製法

利用MHC-四聚物試藥所為之精製

可使CKAP4專一性MHC-四聚物試藥和以CTL製備方法誘導出的CTL反應，並將對抗標記MHC-四聚物試藥之標記色素之抗體等以經磁性標記之2次抗體進行分離。如此之經磁性標記之2次抗體與磁性標記細胞分離裝置，例如可以由Dynal 公司、Miltenyi Biotec GmbH公司取得。依此方式單離而得的CKAP4專一性CTL以抗CD3抗體、PHA、IL-2等T細胞刺激藥劑刺激並使其增殖，確保被動免疫療法所必要之細胞數。

利用分泌之細胞介素所為之精製

CKAP4專一性CTL可利用釋放之細胞介素等而進行CKAP4專一性CTL之精製。例如，可藉由使用由Miltenyi Biotec GmbH公司能取得之套組，將從CTL釋放的細胞介素在細胞表面以專一抗體捕捉，以抗細胞介素標記抗體進行染色，接著以經磁性標記之標記物質專一性之抗體反應後，使用磁性標記細胞分離裝置進行精製亦可。將以此方式單離而得之CKAP4專一性CTL以抗CD3抗體、PHA、IL-2等T細胞刺激藥劑刺激並使其增殖，確保被動免疫療法所必要之細胞數。

使用細胞表面蛋白質專一性抗體之精製

據報告在專一性CTL之細胞表面有因專一性刺激而增強表現之細胞表面蛋白質(例如CD137、CD107a、CD107b、CD63、CD69等)(Betts MR,Brenchley JM,Price DA,De Rosa SC,Douek DC,Roederer M,Koup RA.Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation.J Immunol Methods.2003；281：65-78、Trimble LA,Shankar P,Patterson M,Daily JP,Lieberman J.Human immunodeficiency virus-specific circulating CD8 T lymphocytes have down-modulated CD3zeta and CD28,key signaling molecules for T-cell activation.J Virol.2000；74：7320-7330、Watanabe K,Suzuki S,Kamei M,Toji S, Kawase T,Takahashi T,Kuzushima K,and Akatsuka Y.CD137-guided isolation and expansion of antigen-specific CD8 cells for potential use in adoptive immunotherapy.Int J Hematol,2008；88；311-320)。藉由將如此的蛋白質的專一抗體進行磁性標記，可使用磁性分離裝置等將CKAP4專一性CTL予以精製。又，藉由將對抗如此的專一抗體之抗IgG抗體等進行磁性標記，也同樣可進行CKAP4專一性CTL之精製。或將這些專一抗體包被在培養用之塑膠盤，使用此盤來培養已施以刺激之PBMC，將未結合於盤之細胞群體洗掉，亦可將CKAP4專一性CTL予以精製。使以此方式單離而得的CKAP4專一性CTL以抗CD3抗體、PHA、IL-2等T細胞刺激藥劑刺激並使其增殖，確保被動免疫療法所必要之細胞數。

[CKAP4專一性CTL之定量]

了解CKAP4專一性CTL是否存在於癌患者之周邊血、或其量之變動，是為了預測利用CKAP4專一性CTL抗原決定位胜肽之主動免疫及被動免疫疫苗之有效性之重要資訊。且在被動免疫疫苗中，製劑中之CKAP4專一性CTL之含量需預先測定。CKAP4專一性CTL之定量，可利用使用本發明之CTL抗原決定位胜肽之以下3種方法進行。

定量方法1(MHC-四聚物法)

可採用使用本發明之CTL抗原決定位胜肽而製得之MHC-四聚物試藥，對於周邊血中之CKAP4專一性之CTL進行定量。定量，例如可依以下方式實施。使周邊血或PBMC和適當濃度之MHC-四聚物試藥反應。因為和該MHC-四聚物試藥結合的CTL會被標記色素染色，故可使用流式細胞儀、顯微鏡等計數。和MHC-四聚物試藥反應時，藉由和以與MHC-四聚物試藥為不同色素標記之抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD8抗體等反應，亦能同時判定CKAP4專一性之CTL之T細胞次組。

定量方法2

將PBMC以約2×10⁶/mL的細胞濃度漂浮於適當培養基中，加入本發明之CTL抗原決定位胜肽。然後，加入細胞內蛋白質輸送抑制劑(例如：Brefeldin A、Monensin等)，於5% CO₂恆溫箱內於37℃培養5~16小時。培養後，使其和T細胞指標抗體(抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD8抗體)或MHC-四聚物試藥反應，將細胞固定後，透過透膜處理，使其和色素標記抗IFNγ抗體反應。使用流式細胞儀等進行解析，定量全部細胞中，T細胞中或MHC-四聚物試藥陽性細胞中之IFNγ陽性細胞率。

2-2 利用細胞介素定量所為之方法2(Elispot分析)

於已固相化抗IFNγ抗體之96孔MultiScreen-HA盤 (Millipore公司)接種PBMC。之後，將CTL抗原決定位胜肽放入各孔，於37℃之5% CO₂恆溫箱培養器培養20小時。次日洗滌盤，按照抗IFNγ抗體、過氧化酶(peroxidase)標記抗IgG抗體的順序使其反應。然後，加入過氧化酶之基質，利用發色使IFNγ點可見化，使用實體顯微鏡或是ELISPOT分析儀(C.T.L.公司)進行計數以定量。

定量方法3

使用細胞表面蛋白質專一性抗體進行定量。據報告對於CTL抗原決定位胜肽有專一性之CTL由於專一性刺激，細胞表面蛋白質(例如CD137、CD107a、CD107b、CD63、CD69等)之表現會增強(Watanabe K,Suzuki S,Kamei M,Toji S,Kawase T,Takahashi T,Kuzushima K,and Akatsuka Y.CD137-guided isolation and expansion of antigen-specific CD8 cells for potential use in adoptive immunotherapy.Int J Hematol,2008；88；311-320)。因此藉由將經CTL抗原決定位胜肽等刺激之PBMC和專一性地辨識細胞表面蛋白質之標記抗體進行混合，CTL會和標記抗體結合並被標記色素染色。經染色之CTL 可以使用流式細胞儀、顯微鏡等計數並定量。再者，藉由添加以和標記抗體為不同色素標記之抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD8抗體等，可同時判定專一性CTL之T細胞次組。

[對於胜肽-MHC複合體有專一性之抗體]

針對已鑑定之癌抗原抗原決定位胜肽與MHC之複合體有專一性之單株抗體(以下稱為pMHC抗體)，能夠專一性地檢測將抗原決定位胜肽呈現在細胞膜表面的癌細胞。所以，pMHC抗體能作為癌免疫療法之診斷藥使用，此外，藉由抗體依存性細胞毒性(以下ADCC活性)或使其和抗癌劑結合等，作為高專一性的治療用抗體亦為有用。pMHC抗體之取得，一般係利用噬菌體呈現法進行。噬菌體呈現法，係指以不使噬菌體的感染力喪失的方式，使外來基因表現為融合蛋白質之系統。利用此系統，使噬菌體表現抗體可變區並篩選，據認為可以將專一性之單株抗體予以分離(Tsukahara T,Emori M,Murata K,Hirano T,Muroi N,Kyono M,Toji S,Watanabe K,Torigoe T,Kochin V,Asanuma H,Matsumiya H,Yamashita K,Himi T,Ichimiya S,Wada T,Yamashita T,Hasegawa T,Sato N.Specific targeting of a naturally presented osteosarcoma antigen,papillomavirus binding factor peptide,using an artificial monoclonal antibody.J Biol Chem.2014；289(32)：22035-22047)。pMHC抗體之取得，係利用抗體庫之製作、淘選、抗體單離、評價之流程進行。淘選係將癌抗原抗原決定位胜肽與MHC之複合體(MHC-單體)固相化在ELISA盤等，或使用以生物素-抗生物素蛋白(biotin-avidin)結合固定者，使其和噬菌體庫反應，重複進行洗滌‧溶出，可將對於抗原決定位胜肽與MHC之複合體有專一性之高結合力之抗體予以單離。於前述TAP基因缺損株T2添加抗原決定位胜肽並使抗體反應，以FCM測定平均螢光強度等，可以評價獲得之抗體。

又，本說明書引用的全部先前技術文獻，係作為參考而納入於本說明書。

【實施例】

以下舉實施例對於本發明具體說明，但本發明不限定於此等。若無特別指明，實驗法係參考成書(免疫實驗操作法，右田俊介、紺田進、本庶佑、濱岡利之、南江堂，1995)進行。

[實施例1]

[EBV專一性CTL抗原決定位候選胜肽之選擇]

EBV依表現之蛋白質的差異等而分類為類型1與類型2。感染‧潛伏於人的大部分是類型1，以AG876為主的類型2的感染在亞洲不多(Dambaugh T,Hennessy K,Chamnankit L,Kieff E.U2 region of Epstein-Barr virus DNA may encode Epstein-Barr nuclear antigen 2.Proc Natl Acad Sci U S A.1984 Dec；81(23)：7632-6)。但是也有人報告於同一個體之EBV共感染例，也有人報告EBV感染株之人種‧地域依存性的多樣性(Apolloni A,Sculley TB.Detection of A-type and B-type Epstein-Barr virus in throat washings and lymphocytes.Virology.1994 Aug 1；202(2)：978-81、Correa RM,Fellner MD,Alonio LV,Durand K,Teyssie AR,Picconi MA.Epstein-barr virus(EBV)in healthy carriers：Distribution of genotypes and 30bp deletion in latent membrane protein-1(LMP-1)oncogene.J Med Virol.2004 Aug；73(4)：583-8、Klemenc P,Marin J,Soba E,Gale N,Koren S,Strojan P.Distribution of Epstein-Barr virus genotypes in throat washings,sera,peripheral blood lymphocytes and in EBV positive tumor biopsies from Slovenian patients with nasopharyngeal carcinoma.J Med Virol.2006 Aug；78(8)：1083-90、Trimeche M,Bonnet C,Korbi S,Boniver J,de Leval L.Association between Epstein-Barr virus and Hodgkin's lymphoma in Belgium：a pathological and virological study.Leuk Lymphoma.2007 Jul；48(7)：1323-31、Tiwawech D,Srivatanakul P,Karalak A,Ishida T.Association between EBNA2 and LMP1 subtypes of Epstein-Barr virus and nasopharyngeal carcinoma in Thais.

J Clin Virol.2008 May；42(1)：1-6.)。迄今，已單離出多數EBV株，但是因為共感染、病毒株多樣性之問題，鹼基序列之解析遇到困難，全部鹼基序列已定序的只有B95.8、AG876、MUTU、GD1、GD2、HKNPC1及AKATA共計7種病毒株(Baer R,Bankier AT,Biggin MD,Deininger PL,Farrell PJ,Gibson TJ,Hatfull G,Hudson GS,Satchwell SC,Seguin C,et al.DNA sequence and expression of the B95-8 Epstein-Barr virus genome.Nature.1984 Jul 19-25；310(5974)：207-11、Zeng MS,Li DJ,Liu QL,Song LB,Li MZ,Zhang RH,Yu XJ,Wang HM,Ernberg I,Zeng YX.Genomic sequence analysis of Epstein-Barr virus strain GD1 from a nasopharyngeal carcinoma patient.J Virol.2005 Dec；79(24)：15323-30、Dolan A,Addison C,Gatherer D,Davison AJ,McGeoch DJ.The genome of Epstein-Barr virus type 2 strain AG876.

Virology.2006 Jun 20；350(1)：164-70、Liu P,Fang X,Feng Z,Guo YM,Peng RJ,Liu T,Huang Z,Feng Y,Sun X,Xiong Z,Guo X,Pang SS,Wang B,Lv X,Feng FT,Li DJ,Chen LZ,Feng QS,Huang WL,Zeng MS,Bei JX,Zhang Y,Zeng YX.Direct sequencing and characterization of a clinical isolate of Epstein-Barr virus from nasopharyngeal carcinoma tissue by using next-generation sequencing technology.J Virol.2011 Nov；85(21)：11291-9.、Kwok H,Tong AH,Lin CH,Lok S,Farrell PJ,Kwong DL,Chiang AK.Genomic sequencing and comparative analysis of Epstein-Barr virus genome isolated from primary nasopharyngeal carcinoma biopsy.PLoS One.2012；7(5)：e36939.、Lin Z,Wang X,Strong MJ,Concha M,Baddoo M,Xu G,Baribault C,Fewell C,Hulme W,Hedges D,Taylor CM,Flemington EK.Whole-genome sequencing of the Akata and Mutu Epstein-Barr virus strains.J Virol.2013 Jan；87(2)：1172-82.)。

此等病毒株間之主要蛋白質之表現差異、胺基酸序列之差異已部分解析出來，針對LMP2與EBNA1也已有一些報告(Midgley RS,Bell AI,Yao QY,Croom-Carter D,Hislop AD,Whitney BM,Chan AT,Johnson PJ,Rickinson AB HLA-A11-restricted epitope polymorphism among Epstein-Barr virus strains in the highly HLA-A11-positive Chinese population：incidence and immunogenicity of variant epitope sequences.J Virol.2003 Nov；77(21)：11507-16、Wang X,Liu X,Jia Y,Chao Y,Xing X,Wang Y,Luo B.Widespread sequence variation in the Epstein-Barr virus latent membrane protein 2A gene among northern Chinese isolates.J Gen Virol.2010 Oct；91(Pt 10)：2564-73.、Han J,Chen JN,Zhang ZG,Li HG,Ding YG,Du H,Shao CK.Sequence variations of latent membrane protein 2A in Epstein-Barr virus-associated gastric carcinomas from Guangzhou,southern China.PLoS One.2012；7(3)：e34276.)。

本發明之LMP2及EBNA1專一性之CTL抗原決定位候選胜肽之選擇，係依據屬於EBV類型1之最有代表性的病毒株B95.8(GenBank：V01555.2)之胺基酸序列，參考其他病毒株之胺基酸之變異而實施。具體而言，係藉由能夠檢索對於HLA-A11分子有結合模體(motif)之由8~10個胺基酸所構成之CTL抗原決定位候選胜肽之在網際網路上公開的多數軟體而實施。其結果，選擇從EBV LMP2及EBNA1之胺基酸序列選出具HLA-A11分子之結合模體之由9個或10個胺基酸所構成之CTL抗原決定位候選胜肽，LMP2為22種、EBNA1為11種，合計33種，並合成該等胜肽，並於以下顯示為CTL抗原決定位候選胜肽。於不同EBV株中之胺基酸變異部位以底線表示。本發明中，B95.8株稱為野生株，其他病毒株中之胺基酸之取代稱為變異。作為陽性對照用之胜肽，為合成來自人類巨細胞病毒(human cytomegalovirus，CMV)之pp65蛋白質之HLA-A*11：01限制性抗原決定位胜肽(ATVQGQNLK、序列編號：34)。作為陰性對照用胜肽，為合成survivin-2B之HLA-A*24：02限制性抗原決定位胜肽(AYACNTSTL、序列編號：35)。

(1)合成之來自EBV LMP2之HLA-A*11：01限制性CTL抗原決定位胜肽候選

Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys(序列編號：1)

Ala Asn Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys(序列編號：2)

Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ala Gln Arg Lys(序列編號：3)

Ala Asn Ser Ser Ala Ala Ala Gln Arg Lys(序列編號：4)

Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg(序列編號：5)

Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys(序列編號：6)

Val Met Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Tyr(序列編號：7)

Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Tyr Arg(序列編號：8)

Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg(序列編號：9)

Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg(序列編號：10)

Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu(序列編號：11)

Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr(序列編號：12)

Lys Val Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr(序列編號：13)

Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr(序列編號：14)

Val Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr(序列編號：15)

Gly Ser Ile Leu Gln Thr Asn Phe Lys(序列編號：16)

Leu Thr Glu Trp Gly Ser Gly Asn Arg(序列編號：17)

Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu(序列編號：18)

Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Ser Leu(序列編號：19)

Thr Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser(序列編號：20)

Thr Val Met Thr Asn Thr Leu Leu Ser(序列編號：21)

Ala Leu Phe Gly Val Ile Arg Cys Cys Arg(序列編號：22)

(2)合成之來自EBV EBNA1之HLA-A*11：01限制性CTL抗原決定位胜肽候選

Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu Lys(序列編號：23)

Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg(序列編號：24)

Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys(序列編號：25)

His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys(序列編號：26)

His Arg Gly Glu Gly Gly Ser Ser Gln Lys(序列編號：27)

His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Gln Lys(序列編號：28)

Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly Ser Lys(序列編號：29)

Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg(序列編號：30)

Gln Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys(序列編號：31)

Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys(序列編號：32)

Ala Ile Lys Asp Leu Val Met Thr Lys(序列編號：33)

(3)對照用而合成之胜肽

Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys(序列編號：34)

Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu(序列編號：35)

表1、表2、表3顯示合成之LMP2及EBNA1之HLA-A11：01限制性CTL抗原決定位胜肽候選與對照用而合成之胜肽的特徵。胜肽名稱係以合成之胜肽之N末端側起3個胺基酸序列來表示。從左邊起，胜肽名(表中a)、胺基酸序列(表中b)、來源蛋白質之胺基酸序列上之位置、胺基酸數、以解析使用之NetMHC3.4(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)之HLA Peptide Binding Predictions(Nielsen M,Lundegaard C,Worning P,Lauemoller SL,Lamberth K,Buus S,Brunak S,Lund O.Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations.Protein Sci.2003 May；12(5)：1007-17、Lundegaard C,Lamberth K,Harndahl M,Buus S,Lund O,Nielsen M.NetMHC-3.0：accurate web accessible predictions of human,mouse and monkey MHC class I affinities for peptides of length 8-11.Nucleic Acids Res.2008 Jul 1；36(Web Server issue)：W509-12.、Lundegaard C,Lund O,Nielsen M.Accurate approximation method for prediction of class I MHC affinities for peptides of length 8,10 and 11 using prediction tools trained on 9mers.Bioinformatics.2008 Jun 1；24(11)：1397-8.)算出的分數(表中c)按高至低順序顯示。此分數係預測HLA-A11與胜肽之親和性之數值，分數越高，代表HLA與胜肽形成安定之複合體之可能性越高。又，表1、表2與表3所示之NetMHC 3.4之分數，係作為分析使用之11種分析軟獲得之代表例表示。

【表1】

【表2】

[EBV專一性CTL抗原決定位候選胜肽之折疊試驗]

發明者人等使用表1、表2與表3記載的35種胜肽實施折疊試驗。具體而言，將利用大腸菌表現系表現精製之HLA-A*11：01與β2-微球蛋白、及合成胜肽添加到折疊溶液並混合後，經時分取折疊溶液，並以凝膠過濾管柱進行分析。以凝膠過濾管柱分析確認形成了HLA-A*11：01與β2-微球蛋白、及EBV專一性CTL抗原決定位候選胜肽之3者複合體(MHC-單體)時，由於MHC-單體比起原料的分子量較大，在凝膠過濾管柱分析之溶出時間較快。又，MHC-單體形成量可利用在280 nm之吸收波長獲得之峰部面積算出。另一方面，和HLA分子沒有結合性之候選胜肽則未確認到MHC-單體形成。確認MHC-單體形成時之代表的凝膠過濾管柱分析例，顯示於第1圖。

凝膠過濾管柱分析之結果，當HLA分子與β2-微球蛋白利用大腸菌表現系進行表現精製時，以封入體的形式將不溶性級分精製後可溶於8M尿素，但為難溶性之HLA分子未形成MHC-單體者以凝聚體的形式於7~8分鐘被檢測出。惟凝聚體多數在為凝膠過濾管柱分析之前處理步驟的濾器過濾被除去。β2-微球蛋白係可溶性蛋白質，在折疊溶液中可溶，使用Superdex75 10/300GL(GE Healthcare公司)時，會在14分鐘附近檢測出。15分鐘以後，則檢測到折疊溶液之組成物、胜肽。緊接開始折疊試驗之後(第0天)未確認到MHC-單體之峰部，但是1日後(第1天)、3日後(第3天)，峰部增大，顯示MHC-單體的形成順利地進行中。

第2圖及第3圖顯示對於35種胜肽實施之折疊試驗之1、3、7日後的分析結果。作為陽性對照胜肽，使用來自CMV之pp65蛋白質之HLA-A*11：01限制性抗原決定位胜肽(ATVQGQNLK、序列編號：34)，作為陰性對照，使用來自survivin-2B之HLA-A*24：02限制性抗原決定位胜肽(AYACNTSTL、序列編號：35)作為比較對象。顯示MHC-單體形成之峰部的面積以條圖表示。序列編號：1~22(LMP2)與序列編號：23~33(EBNA1)和為陽性對照胜肽及陰性對照之序列編號：34~35比較的結果，分別顯示於表4與表5。

【表4】

【表5】

表4與表5顯示胜肽候選之HLA-A*11：01結合性。就結合性之有無而言，在折疊試驗，超過陰性對照之結合性最高值(135,674μV*秒)者判為有結合性，記為○，不及時判為無結合性，記為×。以此方式於實驗值判定之HLA-A*11：01結合性不一定和電腦演算法獲得之預測值一致，折疊試驗之實驗值係代表在活體外(in vitro)之候選胜肽與HLA-A*11：01之結合性。以電腦演算法預測之下位(預測值<0.400)8個胜肽候之任一者，在折疊試驗之實驗的結果中皆顯示HLA-A*11：01結合性。另一方面，折疊試驗之實驗的結果中未顯示HLA-A*11：01結合性之4個胜肽之預測值如下。VML：0.417；LVL(9mer)：0.439；TTM：0.477；KIL：0.602。可知儘管任一預測值皆高於0.400，但未和HLA-A*11：01結合。依此方式，只以電腦演算法無法判斷抗原決定位候選胜肽與HLA分子間的結合性。

[EBV LMP2專一性MHC-四聚物試藥之製造]依折疊試驗之結果，使用HLA-A*11：01結合性之EBV LMP2專一性或EBV EBNA1專一性CTL抗原決定位候選胜肽製造PE標記MHC-四聚物試藥。本發明製造之MHC-四聚物試藥例如以ASS(10mer)-Tet簡單表示，其係使用HLA-A*11：01與ASS(10mer)胜肽(ASSYAAAQRK、序列編號：1)與β2-微球蛋白之3者複合體製得。使從蛋白質表現用之基因重組寄主精製而得之HLA第I型分子、β2-微球蛋白及本發明之EBV LMP2或EBV EBNA1專一性CTL抗原決定位候選胜肽之複合體、MHC-單體，在適當的折疊溶液中形成。在重組HLA第I型分子之C末端預先附加生物素(biotin)結合部位，於MHC-單體形成後在此部位附加生物素。可藉由將市售之經色素標記之鏈黴親和素(streptavidin)與生物素化MHC-單體以莫耳比1：4混合，以製造MHC-四聚物試藥。

[EBV專一性CTL抗原決定位胜肽之鑑定](檢體之HLA型之選定)

EBV專一性CTL抗原決定位候選胜肽係對於HLA-A*11：01選擇有結合模體之33種候選胜肽。又，利用折疊試驗已解明在試管內，HLA-A*11：01與β2-微球蛋白與29種EBV專一性CTL抗原決定位候選胜肽會結合並形成MHC-單體。實際上，為了確認此29種EBV LMP2專一性或EBNA1專一性CTL抗原決定位候選胜肽是否會結合於HLA-A*11：01，而於活體內是否存在辨識其之CTL，有必要使用保持HLA-A*11：01之供血者之周邊血，探討將周邊血中存在之EBV專一性CTL增幅是否可能。最初，供血者是否保持HLA-A*11：01，是使用Genosearch(商標)HLA-A Ver.2(MBL公司)以HLA-A之基因型判定並確認。以後之探討係使用保有HLA-A*11：01之5名健康成人之PBMC進行。

[抗原呈現細胞之製備]

(1)EBV感染B細胞株之製備

依標準方法(Kuzushima K,Yamamoto M,Kimura H,Ando Y,Kudo T,Tsuge I,Morishima T.Establishment of anti-Epstein-Barr virus(EBV)cellular immunity by adoptive transfer of virus-specific cytotoxic T lymphocytes from an HLA-matched sibling to a patient with severe chronic active EBV infection.Clin Exp Immunol.1996；103：192-198)，將為EBV產生細胞株B95.8細胞株(從JCRB Cell Bank取得)之培養上清(包括活EBV病毒)與PBMC進行混合培養，建立EBV感染B細胞株(Lymphoblastoid cell line，以下稱為EBV感染LCL)。約2週後，確認HLA分子之表現、CD80、CD83、CD86及CD20之表現。

(2)CD40-B細胞之製備

將導入人CD40L基因並使其安定表現之NIH3T3細胞(NIH-CD40L)與PBMC於IL-4存在下共培養。NIH-CD40L會因96 Gy之X線照射而妨礙增殖，每3~4日反複共培養(Kondo E,Topp MS,Kiem HP,Obata Y,Morishima Y,Kuzushima K,Tanimoto M,Harada M,Takahashi T,Akatsuka Y.Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.J Immunol.2002；169：2164-2171)。約2週間後確認到HLA分子之表現、CD80、CD83與CD86之表現。

(3)樹狀細胞之製備

將PBMC在塑膠製培養皿中於37℃、5% CO₂恆溫箱內進行2小時培養，將未黏著於培養皿之細胞輕輕地洗掉。於其中添加GM-CSF與IL-4並培養24小時後，接著加入TNFα與IL-1β及PGE2(Prostaglandin E2)，並培養24~48小時。以適當培養基等輕輕流洗而回收得到的細胞作為樹狀細胞(Kondo E,Topp MS,Kiem HP,Obata Y,Morishima Y,Kuzushima K,Tanimoto M,Harada M,Takahashi T,Akatsuka Y.Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.J Immunol.2002；169：2164-2171)。48小時後確認HLA分子之表現、CD80、CD83與CD86之表現。

[EBV專一性CTL之誘導]

1)利用抗原呈現細胞之誘導

經由保持HLA-A*11：01之PBMC，預先製備前述抗原呈現細胞(EBV感染LCL、CD40-B細胞、樹狀細胞)。使抗原呈現細胞漂浮在刺激用培養基(0.1%人血清白蛋白/55μM 2-巰基乙醇/RPMI 1640)或AIM-V medium(Invitrogen公司)，以10μg/mL的濃度添加CTL抗原決定位候選胜肽，約隔15分鐘邊穏定地混合邊於室溫放置30~60分鐘後，以過量洗滌液(2%胎牛血清(FCS)/PBS)進行3次洗滌，洗去未結合於HLA分子之胜肽。藉由進行此操作，據認為CTL抗原決定位候選胜肽會結合在抗原呈現細胞上之HLA分子。進行此操作之抗原呈現細胞稱為胜肽脈衝抗原呈現細胞。胜肽脈衝抗原呈現細胞為了喪失增殖能力，係進行致死量之X射線照射、或絲裂黴素C處理。將其和從同一人物分離而得之PBMC、或CD8陽性或CD4陽性T細胞混合，並於37℃、5% CO₂恆溫箱進行培養。使用之培養基已進行含10%FCS之RPMI1640培養基、或含10%人血清之RPMI1640培養基、或1~10%之含人血RPMI1640培養基等的探討，但本方法以含10%人血清之RPMI1640培養基可獲得良好結果。T細胞之生存維持、及為了以輔助增殖的目的添加了IL-2(鹽野義製藥公司)，但很多報告其時機通常是混合培養開始後第7~14日，本發明，進行在培養開始時、培養開始2日後、6日後等時之IL-2之探討，結果培養開始2日後投予時皆可獲得良好結果，培養開始2日後添加50U/mL。培養開始10~14日後再度使用胜肽脈衝抗原呈現細胞增加刺激。每10~14日使用胜肽脈衝抗原呈現細胞刺激，CTL誘導之評價約在2週後與4週後實施。能確認EBV專一性CTL之誘導時，再使用胜肽脈衝抗原呈現細胞脈衝增加刺激並建立CTL細胞株。

2)未利用抗原呈現細胞之誘導法

本誘導法係於PBMC培養液中投入胜肽而誘導CTL之方法。對於PBMC中存在之抗原呈現細胞，例如，樹狀細胞、B細胞、巨噬細胞、某種T細胞呈現胜肽，據認為PBMC所含之CTL前驅細胞會受刺激並增殖。和前述利用抗原呈現細胞之誘導法不同，區別是無需事前製備抗原呈現細胞，優點是可簡便地實施。係大膽地不利用抗原呈現細胞而刺激在周邊血中循環之記憶/效應子型CTL並使其增殖的系統。

將從保持HLA-A*11：01之健康成人採集的周邊血以3,000rpm進行5~10分鐘離心處理，並回收上清之血漿部分。血漿部分以外依習知方法將PBMC分離。特徵為在誘導使用之培養基中添加數%之血漿。本發明中，加入5%之血漿時可獲得良好結果。培養基係於一般用在細胞培養之培養基中添加適當的添加物及抗生素。本發明使用之CTL誘導培養基，係使用於RPMI1640 Hepes modify(Sigma公司)中添加了2-巰基乙醇、L-麩醯胺酸、作為抗生素之鏈黴素與盤尼西林的培養基。除此以外，也可以添加胰島素、運鐵蛋白、亞硒酸、丙酮酸、人血清白蛋白、非必須胺基酸溶液等。使1~3×10⁶個PBMC漂浮於培養基1~2.5mL。於其中以1~20μg/mL的濃度添加候選胜肽。胜肽濃度可因應胜肽之溶解度而變更。本發明中，以10μg/mL實施。2日後以20~100U/mL之最終濃度進行IL-2之添加。PBMC與胜肽之混合培養，宜使用能進行二氧化碳氣體交換之圓底的培養皿，本發明中，使用聚丙烯製14mL之圓底管(BD Biosciences公司)或96孔U底細胞培養用微孔盤(BD Biosciences公司)。EBV專一性CTL之確認，係以培養2週及4週後為目標實施。以培養2週後為目標，再度以10μg/mL之胜肽刺激。於能夠確認EBV專一性CTL之誘導時，使用胜肽脈衝抗原呈現細胞增加刺激，並建立CTL細胞株。

[EBV專一性CTL之確認] 針對以前述方法培養之細胞群體是否存在有EBV專一性之CTL之探討，利用細胞內IFNγ產生細胞定量法、MHC-四聚物法探討實施。

利用細胞內IFNγ產生細胞定量法所為之專一性CTL誘導之確認

將以前述方法誘導得到的細胞群體的約1/10~全量移到96孔U底細胞培養用微孔盤，添加誘導使用之胜肽使最終成為0.01~0.05μg/mL之濃度。進一步添加細胞內蛋白質輸送抑制劑(例如：Brefeldin A、Monensin等)，於5% CO₂恆溫箱於37℃培養5~16小時。培養後將細胞洗滌，加入PE(phycoerythrin)標記MHC-四聚物試藥與PC5(phycoerythrin-Cy5)標記抗CD8抗體(Beckman Coulter公司)，於室溫放置15~30分鐘。洗滌後以4%甲醛於4℃固定15分鐘後，以過量的洗滌液清洗。以0.1%皂素進行透膜處理後，添加FITC標記抗IFNγ抗體(Beckman Coulter公司)，於室溫反應15~30分鐘。洗滌後使用流式細胞儀，定量T細胞中之IFNγ陽性細胞率或MHC-四聚物試藥陽性細胞中之IFNγ陽性細胞率。

第4圖顯示使用陽性對照胜肽，以不利用抗原呈現細胞之誘導法誘導專一性CTL，並以細胞內IFNγ產生細胞定量法探討的結果。將從保持HLA-A*11：01而未保持HLA-A*24：02之健康成人周邊血分離而得之PBMC以來自HLA-A*11：01限制性CMV pp65之抗原決定位胜肽(ATVQGQNLK，序列編號：34)或作為陰性對照胜肽之來自HLA-A*24：02限制性survivin-2B之抗原決定位胜肽 (AYACNTSTL，序列編號：35)刺激13日後，以用於刺激之各胜肽於Brefeldin A存在下進行14小時再刺激。顯示將其以PE標記MHC-四聚物試藥(MBL公司)、PC5標記抗CD8抗體、FITC標記抗IFNγ抗體進行3重染色，並使用流式細胞儀解析的結果。點圖展開圖中之數字，係代表存在於四分割區域之細胞佔全部活細胞之比例(%)。四分割之區域於今後標示記載為UL(左上)、UR(右上)、LL(左下)、LR(右下)。在X軸係將CD8以log尺度表示、Y軸係將對於INFγ之螢光強度以log尺度表示之點圖展開圖中，以陽性對照胜肽再刺激時，UR出現IFNγ陽性CD8陽性細胞，而當以陰性對照胜肽再刺激，幾乎不出現。以陽性對照胜肽進行13日刺激培養之細胞群體中存在CMV pp65專一性CTL，可由X軸係將CD8以log尺度表示、Y軸係將對於MHC-四聚物試藥之螢光強度以log尺度表示之點圖展開圖中在UR存在CD8陽性MHC-四聚物試藥陽性細胞群體而得知。另一方面，也得知添加了和捐出者對偶基因不同之限制性陰性對照胜肽的細胞群體，並未出現survivin-2B專一性CTL。亦即，在添加了來自HLA~A*11：01限制性CMV pp65之抗原決定位胜肽之細胞群體，誘導出29.37%之專一性CTL，在添加了來自survivin-2B之HLA-A*24：02限制性抗原決定位胜肽之細胞群體則未誘導出專一性CTL。此結果和上述IFNγ之測定結果一致。又，可知於X軸係將IFNγ以log尺度表示、Y軸係將對於MHC-四聚物試藥之螢光強度以log尺度表示之點圖展開圖中，添加陰性對照胜肽時，幾乎不存在MHC-四聚物試藥陽性且IFNγ陽性之細胞，但是由來自HLA-A*11：01限制性CMV pp65之陽性對照胜肽之刺激誘導而得之專一性CTL佔全部細胞群體之29.39%，其中，73%係產生IFNγ(UR)，換言之，具有細胞毒性活性。

由此結果可知，添加捐出者所保持之HLA限制性CTL抗原決定位胜肽而培養之PBMC中，因為再刺激而誘導出產生IFNγ之細胞，此細胞會被MHC-四聚物試藥染色，故係為對於添加之CTL抗原決定位胜肽有專一性之CTL。如此，是否誘導了專一性之CTL，也可利用細胞內IFNγ產生細胞定量法進行判斷。同樣，針對使用EBV LMP2專一性CTL抗原決定位候選胜肽是否會誘導IFNγ產生細胞之探討，以5名健康成人實施。將CD8陽性細胞中存在之IFNγ產生活細胞之比例予以數值化，並示顯於第5圖。第6圖顯示將細胞內IFNγ產生細胞定量而得的代表結果。

第5圖中，使用5名健康成人(捐出者ID編號：*11-13、*11-16、*11-8、*11-11、*11-2)之周邊血，以21種胜肽將細胞內IFNγ產生細胞進行定量。X軸係將CD8陽性IFNγ陽性細胞數佔PBMC之比例(%)以數值表示。和陰性對照進行比較，呈陽性之胜肽候選為ASS(10mer)(序列編號：1)與陽性對照胜肽CMV pp65。呈陽性之胜肽的詳細結果於第6圖說明。

第6圖中，顯示X軸係將CD8以log尺度表示、Y軸係將對於IFNγ之螢光強度以log尺度表示的點圖展開圖，係顯示使用和誘導使用之胜肽為相同之胜肽進行再刺激而將細胞內IFNγ產生細胞予以定量的結果。UR係將CD8陽性IFNγ 陽性細胞數佔PBMC之比例(%)以數值表示。

陽性對照之CMV pp65，UR檢測到28.0%之CD8陽性IFNγ陽性(產生)細胞。相較於陰性對照之survivin-2B時之陽性率(8.67%)，確認有有顯著差異。依該等結果，合成MHC-四聚物試藥，並實施關於其有用性之探討。

[使用EBV專一性MHC-四聚物試藥之探討](MHC-四聚物試藥之合成)

發明人等使用EBV專一性之CTL抗原決定位胜肽與HLA-A*11：01分子，製作PE標記MHC-四聚物試藥。本發明製作之MHC-四聚物試藥，例如以ASS(10mer)-Tet之簡稱表示，其代表使用HLA-A*11：01分子與胜肽ASS(10mer)(ASSYAAAQRK、序列編號：1)與β2-微球蛋白之3者複合體而合成者。

[使用MHC-四聚物試藥之定量法]

採用使用本發明之CTL抗原決定位胜肽製得之MHC-四聚物試藥，對於周邊血或從周邊血分離而得之PBMC添加CTL抗原決定位胜肽，將誘導而得之CTL細胞株當作試樣，實施EBV專一性之CTL之定量。以下將使用PE標記MHC-四聚物試藥時為例，顯示實施例。配合使用之流式細胞儀之機種，可將標記色素適當組合使用，不限於下列。

周邊血的情形

對於已採集的周邊血200μL，加入10μL之PE標記MHC-四聚物試藥、與20μL之FITC標記抗T細胞表面抗體(例如CD8、CD4、CD3)等。再者，為了將已混入之紅血球導致之非專一性之螢光予以排除，也可以添加經PC5等標記之抗CD45抗體。溫和地混合並於室溫放置30分鐘。加入OptiLyse B(Beckam coulter公司)，依包裝內說明書進行溶血固定處理。加入2mL之PBS並攪拌後，以400×g進行5分鐘離心分離。吸取上清並廢棄後，將細胞再懸浮於500μL之PBS，於24小時以內以流式細胞儀解析。

係使用PBMC或CTL抗原決定位胜肽而誘導之CTL細胞株的情形

對於使用適量PBMC(10⁵~10⁶個)或CTL抗原決定位胜肽而誘導之適量CTL細胞株，添加10μL之PE標記MHC-四聚物試藥、與20μL之FITC標記抗T細胞表面抗體(例如CD8、CD4、CD3)等。再者，為了將已混入之紅血球造成之非專一性之螢光排除，也可添加經PC5等標記之抗CD45抗體。溫和地混合並於室溫放置30分鐘。加入3mL之PBS並攪拌後，以400×g進行5分鐘離心分離。吸取上清並廢棄後，將細胞再懸浮於500μL之PBS。為CTL細胞株的情形，為了排除死細胞導致之非專一性之螢光，也可添加7-AAD viability Dye(死細胞檢測試藥，MBL公司)。24小時以內以流式細胞儀解析。

[利用MHC-四聚物試藥所為之健康成人周邊血中之EBV LMP2專一性CTL之檢測]

欲了解因某原因而喪低免疫能力之人、先天性免疫不全症患者、或為了預防接受骨髓移植、造血幹細胞移植、臍帶血移植、固體臟器移植而排斥而接受免疫抑制劑之投予之患者、慢性病毒感染症患者、愛滋病患者、高齡者、幼小兒、孕婦等高風險之患者、或移植捐出者之周邊血中是否存在EBV專一性CTL，對於包括抗病毒劑、免疫抑制劑之適當使用之傳染病管理方面係為重要。但是該等患者之免疫能力低，所以EBV專一性CTL之存在也減少，難以用既存方法了解EBV專一性CTL存在。若使用EBV專一性MHC-四聚物試藥，能夠於採血後1小時左右即判定EBV專一性CTL之存在。所以我們探討是否能使用健康成人周邊血檢測EBV專一性CTL。其結果顯示於第7圖。使用捐出者ID*11-11之周邊血，以3種EBV專一性MHC-四聚物試藥與陽性對照CMV pp65 MHC-四聚物試藥(MBL公司)及陰性對照survivin-2B HLA-A*24：02 MHC-四聚物試藥(MBL公司)進行染色。以X軸係將CD8以log尺度表示、Y軸係將對於MHC-四聚物試藥之螢光強度以log尺度解析之點圖展開圖顯示。點圖展開圖中之數值，係將CD8陽性MHC-四聚物試藥陽性細胞佔CD8陽性細胞中之比例作為陽性率(%)。其結果，於剛採血時(第0天)，CD8陽性MHC-四聚物試藥陽性之細胞群體相較於陰性對照無法說是有顯著差異。此現象的原因可列舉使用之周邊血均為健康成人，由於EBV或CMV導致傳染病伺機性發病之可能性低。接著，將PBMC以各胜肽進行14日刺激培養後(第14天)，同樣以MHC-四聚物試藥染色。其結果，以14日之培養，檢測到ASS(10mer)為44.47%、CMV pp65為40.52%之陽性率。從陰性對照HLA-A*24：02限制性survivin-2B MHC-四聚物試藥獲得的陽性率為0.17%之事，亦可說呈陽性之細胞群體是對於各胜肽有專一性之CTL群體。由該等結果可知，EBV LMP2專一性CTL 係於健康成人周邊血中存在，以2週培養可增殖到能判定是否有CTL存在之程度。此意指本發明實施之不利用抗原呈現細胞之誘導法對於檢測EBV專一性CTL為有效。又，本發明鑑定之來自EBV LMP2之ASS(10mer)(序列編號：1)具有使周邊血中之EBV LMP2專一性CTL增殖之作用，該等細胞群體能以ASS(10mer)-Tet進行檢測，故判別是HLA-A*11：01限制性之EBV LMP2專一性CTL抗原決定位胜肽。

[利用MHC-四聚物試藥所為之健康成人周邊血中之EBV EBNA1專一性CTL之檢測]

接著，發明者人等實施來自EBV EBNA1之HLA-A*11：01限制性之CTL抗原決定位之鑑定。由之前LMP2獲得之驗證結果，於細胞內IFNγ產生細胞定量法，如第6圖所示可知，即使是陰性對照之survivin-2B也檢測到8.67%之非專一反應。另一方面，如第7圖所示可知使用MHC-四聚物試藥之CTL之檢測，幾乎沒有非專一反應。

過去不存在來自HLA-A*11：01限制性EBV EBNA1之CTL抗原決定位之報告，故以非專一染色少的MHC-四聚物染色法進行驗證。

如表5所示，折疊試驗之結果，11個EBV EBNA1專一性CTL抗原決定位候選胜肽皆顯示HLA*11：01結合性。所以，發明人等為了鑑定EBV EBNA1專一性CTL抗原決定位胜肽，使用11個EBV EBNA1之CTL抗原決定位候選胜肽製作MHC-四聚物試藥。接著探討使用健康成人周邊血是否能夠檢測EBNA1專一性CTL。其結果顯示於第8圖與第9圖。首先，使用各3種混合之胜肽，並使用5名健康成人(捐出者ID編號：*11-13、*11-16、*11-8、*11-11、*11-2)之周邊血進行CTL誘導。2週後，使用相應於誘導用胜肽之3種混合MHC-四聚物試藥進行檢測。第8圖中，揭示X軸係將CD8以log尺度表示、Y軸係將對於四聚物之螢光強度以log尺度解析之點圖展開圖。點圖展開圖中之數值，係將CD8陽性細胞中之MHC-四聚物試藥陽性細胞佔活細胞中之比例作為陽性率(%)。其結果，捐出者*11-8，當將使用(HRG+GVF+KTS)之3種混合胜肽誘導而得的細胞群體以使用同樣3種胜肽之各個而合成之3種MHC-四聚物試藥之混合試藥(HRG-Tet+GVF-Tet+KTS-Tet)染色時，檢測到0.38%之陽性細胞。為了驗證對於3種胜肽之中之哪種胜肽有專一性，第9圖使用3種各別的MHC-四聚物試藥分別實施檢測。其結果，以HRG-Tet單獨染色時，以0.42%之陽性率檢測出HRG-Tet陽性細胞。由於Tet-GVF-Tet與KTS-Tet完全未檢測到陽性細胞，所以代表HRG(序列編號：26)是顯示HLA-A*11：01限制性之EBV EBNA1專一性CTL抗原決定位胜肽。

[利用細胞內IFNγ產生細胞定量法所為之EBV EBNA1專一性CTL誘導之確認]

細胞內IFNγ之產生係作為CTL之細胞毒性活性之一指標使用。發明者人等為了評價以利用上述MHC-四聚物試藥所鑑定之EBV EBNA1專一性CTL抗原決定位胜肽誘導之CTL之功能性，實施細胞內IFNγ產生細胞定量。其結果以第10圖表示。

第10圖之上段顯示X軸係將CD8以log尺度表示、Y軸係將對於IFNγ之螢光強度以log尺度表示之點圖展開圖，揭示以和誘導使用之胜肽為相同之胜肽進行再刺激，並驗證IFNγ產生能力的結果。UR中，將CD8陽性細胞中之IFNγ陽性細胞數佔PBMC之比例(%)以數值表示。第10圖之下段，係驗證IFNγ產生能力時以四聚物染色之結果。為X軸係將CD8以log尺度表示、Y軸係將對於四聚物之螢光強度以log尺度表示之點圖展開圖，UR係將CD8陽性細胞中之四聚物陽性細胞數佔PBMC之比例(%)以數值表示。

對於經HRG誘導而得之CTL，使用HRG胜肽或陰性對照之survivin-2B胜肽進行14小時再刺激。其結果，經陰性對照之survivin-2B進行再刺激的情形與未刺激的情形，幾乎未出現CD8陽性IFNγ陽性(產生)細胞(再刺激：0.08%；未刺激：0.06%)，反觀使用HRG(序列編號：26)胜肽之再刺激，出現0.68%之CD8陽性IFNγ陽性(產生)細胞於UR(0.98%之CD8陽性四聚物陽性細胞)。

由以上可知，本發明鑑定之來自EBV EBNA1之HRG(序列編號：26)具有使周邊血中之EBV EBNA1專一性CTL增殖之作用，該等細胞群體有細胞毒性活性且能以HRG-Tet檢測，故判別為HLA-A*11：01限制性之EBV EBNA1專一性CTL抗原決定位胜肽。

[針對ASS(10mer)序列N末端與C末端之胺基酸之重要性之探討]

HLA第I型分子所呈現之CTL抗原決定位胜肽係由8~10 個胺基酸所構成，N末端側起2號及9或10號胺基酸是對於和HLA第I型分子之結合最重要的胺基酸，稱為錨定模體。作為結合於HLA-A11分子之胜肽，從N末端起2號位置配置Ile、Met、Ser、Thr、或Val之任一者，9或10號位置配置Lys或Arg之任一者且由9~10個胺基酸構成的胜肽最為人所熟知(Chang CX,Tan AT,Or MY,Toh KY,Lim PY,Chia AS,Froesig TM,Nadua KD,Oh HL,Leong HN,Hadrup SR,Gehring AJ,Tan YJ,Bertoletti A,Grotenbreg GM.Conditional ligands for Asian HLA variants facilitate the definition of CD8+ T-cell responses in acute and chronic viral diseases.Eur J Immunol.2013 Apr；43(4)：1109-20.)。本發明提供之HLA-A*11：01限制性EBV LMP2專一性CTL抗原決定位胜肽ASS(10mer)係由Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys(序列編號：1)之10個胺基酸所構成，作為錨定模體，自N末端側起2號與3號具有Ser，9號具有Arg與10號具有Lys。所以，為了使本發明之實施形態更為明確，合成自N末端側、或C末端1削去1個胺基酸殘基之胜肽並驗證。N末端側之Ala已削除之序列編號：6之胺基酸序列為Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys，C末端側之Lys已削除之序列編號：5之胺基酸序列為Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg。使用它們的比較實驗之結果顯示於第11、12、13圖。

Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys ASS(10mer)序列編號：1

Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg ASS(9mer)序列編號：5

Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys SSY序列編號：6

第11圖中，為了檢查形成和HLA-A*11：01之複合體之形成能力，實施折疊試驗。其結果，7日之折疊試驗之結果為，MHC-單體形成率從高至低的順序為ASS(9mer)(337,803μV*秒)、SSY(294,932μV*秒)、ASS(10mer)(238,655μV*秒)，而從任一序列和陰性對照(83,587μV*秒)之胜肽的比較，確認具有MHC-單體之形成能力。

第12圖之實驗中，係以前述不利用抗原呈現細胞之誘導法使用3種胜肽而實施各CTL誘導實驗。誘導起14日後使用3種MHC-四聚物試藥分別實施專一性之CTL之檢測。第12圖之上段使用ASS(10mer)誘導CTL，並將其使用ASS(10mer)-Tet、ASS(9mer)-Tet、SSY-Tet染色。其結果，以ASS(10mer)-Tet染色時，檢測到53.31%之ASS(10mer)-Tet陽性CD8陽性之專一性CTL，但未檢測到ASS(9mer)-Tet或SSY-Tet陽性CD8陽性之專一性CTL(上段中央及上段左)。上段之細胞群體儘管有53.31%之ASS(10mer)-Tet陽性CD8陽性之細胞群體存在，但該等細胞群體不能以ASS(9mer)-Tet或SSY-Tet檢測，故判別ASS(10mer)-Tet陽性CD8陽性之細胞群體無法以HLA-A*11：01分子所呈現之ASS(9mer)與SSY辨識。同樣實驗對於經以ASS(9mer)與SSY之胜肽誘導CTL之細胞群體實施，任一細胞群體皆未檢測到對於ASS(10 mer)-Tet、ASS(9mer)-Tet、SSY-Tet顯示反應性之細胞群體(中段及下段)。此現象代表如第11圖所示，ASS(9mer)與SSY之兩胜肽具有和HLA-A*11：01分子結合之能力，但沒有刺激血中存在之EBV LMP2專一性CTL前驅體(效應子/記憶細胞)並增殖之能力，可知ASS(10mer)若N末端側之Ala殘基、或C末端側之Lys殘基中任一者缺損則CTL誘導能力與CTL檢測能力消失。

第13圖顯示檢測對於使用ASS(10mer)、ASS(9mer)、SSY之各胜肽誘導CTL而得之細胞群體，使用和誘導使用之胜肽相同之胜肽再刺激時之IFNγ之產出能力之結果。使用陽性對照用之來自胜肽CMV pp65蛋白質之HLA-A*11：01限制性抗原決定位胜肽(ATVQGQNLK、序列編號：34)誘導之細胞群體中，存在40.52%之ATV-Tet陽性細胞，利用ATV胜肽所為之再刺激，28%之細胞產生了IFNγ。

另一方面，於作為陰性對照用胜肽使用之survivin-2B之HLA-A*24：02限制性抗原決定位胜肽(AYACNTSTL、序列編號：35)的情形，檢測到0.17%之AYA-Tet陽性細胞，但此細胞群體並非以明確的點檢測出，據認為是非專一性之反應。又，使用AYA胜肽之再刺激檢測到8.67%之IFNγ陽性細胞，但其是以細胞內IFNγ染色法之一般的非專一染色的水平。使用本發明鑑定之來自EBV LMP2之HLA-A*11：01限制性ASS(10mer)誘導出的細胞群體，存在53.31%之ASS(10mer)-Tet專一性CTL，且利用ASS(10mer)之再刺激，有68%之細胞群體產生了IFNγ。反觀N末端之Ala 殘基已缺失之SSY之情形，未檢測到SSY-Tet陽性細胞，IFNγ之產生也比起陰性對照還低。由此顯示為具有屬於錨定模體之胺基酸之胜肽且形成MHC-單體之情形，仍不一定可以作為抗原決定位胜肽而專一性地誘導CTL，且能專一性地誘導CTL之抗原決定位胜肽並非可輕易思及。

[利用EBV株多樣性所為之CTL抗原決定位之胺基酸之變異到胜肽雞尾酒療法]

(EBV株間之ASS(10mer)之CTL抗原決定位之胺基酸變異)

因為EBV株之多樣性引起之CTL抗原決定位之胺基酸變異會發生免疫回應降低、免疫逃避，成為使用CTL抗原決定位之免疫療法之潛在問題。為了解決此問題，已有人開始提出將多數種CTL抗原決定位混合之胜肽雞尾酒療法。此療法可說是期待在使用1種抗原決定位時，假設因為變異等原因而有免疫不回應時，能以其他抗原決定位補足之解決方式。此解決方式據認為有針對於1種HLA型使用多數種CTL抗原決定位之方法，及針對多數HLA型使用各別之CTL抗原決定位之方法，但宜將兩者組合。例如，當成為對象之患者保持HLA-A2與HLA-A11時，希望治療時各自選擇HLA限制性之多數種CTL抗原決定位。此課題是本發明欲解決之課題之一。

如前述，迄今許多研究團隊的研究已解明在NPC患者中，HLA-A11保持者最多。但是LMP2及EBNA1之HLA-A11限制性CTL抗原決定位的報告迄今只有SSC一種。

發明人等針對來自HLA-A*11：01限制性LMP2之CTL抗原決定位ASS(10mer)及來自HLA-A*11：01限制性

EBNA1之CTL抗原決定位HRG，調查株間之胺基酸的變異，結果顯示於第14圖。得知新穎之抗原決定位ASS(10mer)係GD2(來自中國廣東省)與HKNPC1(來自香港NPC患者)，2號Ser殘基與4號Tyr殘基分別變異為Asn殘基與Ser殘基(S2N Y4S)。再者，得知新穎抗原決定位HRG在2種株之變異。AG876(來自西非，類型2)中，4號Gln殘基變異為Glu殘基，8號Asn殘基變異為Ser殘基，9號Pro殘基變異為Gln殘基。Mutu(來自亞洲)，9號Pro殘基變異為Gln殘基。

[各檢體之ASS(10mer)CTL抗原決定位之定序]

為了詳細調查本發明新鑑定之ASS(10mer)之CTL抗原決定位之變異，發明人等對於本發明採用之5名捐出者(*11-2、*11-8、*11-11、*11-13、*11-16)，實施包括ASS(10mer)之來自EBV LMP2之DNA序列之解析。DNA序列解析用之引子係設計於LMP2之Exon 2內，擴增的基因產物為292bp。5'引子：TTGCTCTATTCACCCTTACT(序列編號：50)3'引子：ATGCATTGTAAATGGTGCGT(序列編號：51)

從5名之捐出者之PBMC或B95.8細胞株(ATCC公司)，使用GeneJET Viral DNA and RNA Purification Kit(Thermo scientific公司)萃取EBV基因體DNA。將其作為模板，使用上述引子利用PCR反應將Exon 2斷片擴增，並使用TOPO(註冊商標)TA cloning Kit(Life technologies公司)進行選殖。從各檢體使用3個選殖體，進行定序分析。定序結果如第15圖與表6所示。第15圖中，係將在EBV病毒株間見到的ASSYAAAQRK(序列編號：1)(鹼基序列： GCCAGCTCATATGCCGCTGCACAAAGGAAA(序列編號：48)、GCCAGCTCATATGCCGCTGGACAGAGGAAA(序列編號：49))的變異位置特寫表示。表6係ASS(10mer)之定序結果。相較於B95.8，捐出者*11-11在DNA序列上觀測到一個鹼基的取代(CAA變異成CAG)，但胺基酸未取代。又，其他4名和B95.8為相同序列。由此結果，本發明使用之日本人捐出者5名感染最廣泛分布的B95.8株，不能檢測ASS(10mer)CTL抗原決定位之變異。依據上述定序之結果，發明者人等調查在EBV病毒株間見到的ASS(10mer)CTL抗原決定位之變異對於CTL誘導能力之影響。使用合成之胜肽ASS(10mer)(序列編號：1)、ANS(S2N)(序列編號：2)、ASS(Y4S)(序列編號：3)、ANS(S2N；Y4S)(序列編號：4)及作為陰性對照胜肽之survivin-2B，並使用捐出者*11-11之PBMC進行CTL誘導。其結果顯示於第16圖。使用ASS(10mer)之誘導中，檢測到ASS(10mer)-Tet陽性細胞為27.63%，但各變異胜肽未確認到CTL之誘導。據認為是因為捐出者*11-11由EBV LMP2之定序解析認定是B95.8株之感染者，ASS(10mer)未確認有胺基酸之變異的原故。即使對於B95.8株感染者使用ANS(S2N)(序列編號：2)、ASS(Y4S)(序列編號：3)及GD2株與HKNPC1株之ANS(S2N；Y4S)，仍無法誘導專一性CTL，所以可知S2N與Y4S之變異是對於TCR之辨識為重要的變異。因此當進行EBV專一性CTL之誘導時，預先探討在ASS(10mer)之區域是否無變異係為重要，假使有變異時，據認為是使用ANS(S2N)、ASS(Y4S)、ANS(S2N；Y4S)較佳。

[ASS(10mer)CTL抗原決定位之變異所致之CTL誘導能力與TCR結合性之差異]

為了詳細調查S2N與Y4S之變異對於TCR結合能力造成的影響，發明者人等使用3種變異序列胜肽，製作ANS(S2N)-Tet、ASS(Y4S)-Tet、ANS(S2N,Y4S)-Tet之3種MHC四聚物試藥。對於使用本發明提供之ASS(10mer)抗原決定位胜肽(序列編號：1)而從PBMC誘導之HLA-A*11：01限制性EBV LMP2專一性CTL實施四聚物染色。結果顯示於第17圖。

HLA-A*11：01限制性EBV LMP2 ASS(10mer)專一性CTL，如第17圖所示，因為以ANS(S2N)-Tet檢測到，ANS(S2N)-Tet保持了和ASS(10mer)-Tet之交叉反應性(26.87%對27.63%)，反觀ASS(Y4S)-Tet則幾乎未能檢測到陽性細胞，和TCR之結合性幾乎已喪失(0.49%)。ASN(S2N,Y4S)-Tet中，保持著一些和TCR之結合能力(5.93%)。原因據認為是因為S2N與Y4S之兩取代及Y4S之單獨取代所致之胺基酸之疏水性‧親水性之變化程度及側鏈立體配置的差異所致。針對此2個胺基酸變異，在EBV病毒株間並無單獨取代，只見到共取代(GD2、HKNPC1)。但是應注意，本發明提供之ASS(10mer)之變異只在GD2株與HKNPC1株見到。所以，此抗原決定位在功能上互補，亦即，據認為兩者混合使用，能夠避免由於GD2株及HKNPC1株與它們以外的感染EBV病毒株的差異所致胺基酸變異導致免疫回應降低。

再者，關於來自HLA-A*11：01限制性EBV EBNA1之新穎抗原決定位HRG(序列編號：26)，包括來自AG876株之HRG(Q4E,N8S,P9Q)與來自Mutu株之HRG(P9Q)在內，如第3圖所示，成功地合成了對於HLA-A*11：01有結合性且各別的MHC-四聚物試藥。藉由進行和ASS(10mer)同樣之驗證，可知取決於各感染株，誘導效率明顯有別。

[使用培養袋之CTL之大量培養]

本發明中，成功地鑑定出EBV LMP2專一性或EBV EBNA1專一性之新穎CTL抗原決定位，能達成以HLA-A11保持者作為對象之抗原專一性細胞毒性T淋巴球療法(CTL療法)。CTL療法期待作為下一世代之免疫療法。但是為了於活體外製備抗原專一性CTL，會伴隨複雜煩雜的操作，故必需依賴開放系培養系統。所以，醫療用等級之培養細胞加工中心(CPC)內必需具備保持Class100級之潔淨環境的設施並需管理，需要龐大費用。

又，習知方法係使用各種細胞介素，製備時需耗費相當大的費用。再者，雖是在保持Class100級的設施內進行製備，但利用開放系進行培養在安全方面會伴隨風險。如此，習知之抗原專一性CTL製備法的操作性、經濟性及安全性成為實用化的重大妨礙，只能在受限的設施內實施。為了解決上述問題點，發明者等鑽研CTL之大量培養方法，並研究出兼具簡便性與安全性且能以低成本實施之EBV專一性CTL培養系統。使用市售氣體通氣性培養用袋，僅以三週左右成功地大量培養出EBV LMP2專一性CTL。

第18圖係以顯微鏡觀察培養期間中之細胞的結果。經抗CD3抗體刺激之PBMC在第7天、經胜肽刺激之PBMC在第14天觀察到已活化之T細胞塊，於混合培養開始1週後(第21天)，顯示活化T細胞塊進一步增殖。

如前述，混合胜肽之使用是提高癌免疫療法之有效性之一種解決方式。本實施例中，將新鑑定出的CTL抗原決定位ASS(10mer)(序列編號：1)與其變異序列ASN(S2N)(序列編號：2)之4種胜肽混雜並實施CTL大量培養。其結果顯示於第19與20圖。

第19圖顯示培養期間中之總細胞及以4種胜肽誘導而增殖之CTL數。CTL數係由第20圖之四聚物染色結果算出。第19圖為X軸係將CD8以log尺度表示、Y軸係將對於四聚物之螢光強度以log尺度表示之點圖展開圖，以和誘導使用之胜肽為相同胜肽的四聚物進行染色。點圖展開圖中之數值，係將CD8陽性細胞中之MHC-四聚物試藥陽性細胞佔活細胞中之比例作為陽性率(%)表示。

針對ASS(10mer)與ANS(S2N)，大量培養前，分離之PBMC中之MHC-四聚物試藥陽性細胞數僅為0.04%以下，但從可檢測到陽性細胞之第7天至第24天之期間，確認ASS(10mer)從1.3×10³個增殖成2.3×10⁵，ANS從3.2×10³個增殖成3.1×10⁵個，約有100倍的增殖。藉此，顯示使用新穎 CTL抗原決定位胜肽之前述胜肽雞尾酒療法之有效性。再者，成功地將使用新CTL抗原決定位胜肽之CTL大量增殖，顯示在臨床之實用性。

發明者等所探討之上述培養系統，特徵為，並非習知之開放系而是以密閉系進行。所以，據認為抗原專一性CTL之製備之操作性、經濟性及安全性可達成，且能促進CTL療法之實用化。

迄今的癌免疫療法的臨床試驗中，常是對於1種HLA型使用1種抗原決定位進行，雖可確認有效性但無法否定有個人差異。如前述，雞尾酒胜肽療法是解決方式之一。但是迄今只鑑定出1個EBV LMP2抗原專一性及EBNA1抗原專一性HLA-A11限制性抗原決定位胜肽。因為在EBV病毒株間可能發生的胺基酸變異導致的免疫回應降低，被指摘在臨床有潛在問題。據認為無法忽視此問題，本發明努力研究，結果鑑別出新的抗原決定位ASS(10mer)(序列編號：1)及HRG(序列編號：26)。此新的CTL抗原決定位據認為對於EBV相關癌‧免疫不全，尤其HLA-A11患者常患的NPC之治療，在今後應可發揮重大貢獻。

[疫苗注射劑]

於DMSO溶解序列編號：1之胜肽，使其最終濃度成為20mg/ml並進行過濾滅菌。將獲得之含胜肽之溶液各分注1mL到滅菌小玻璃瓶並蓋緊，作為疫苗注射劑。

[實施例2]

[CKAP4專一性HLA-A*24：02限制性抗原決定位胜肽之預測]

CKAP4係由全長602個胺基酸構成之II型膜蛋白質，無同功型之報告。本發明之CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽之選擇，係對於約60%日本人保有之HLA-A*24：02實施。具體而言，參照能檢索對於HLA-A*24：02有結合模體之由8~12個胺基酸構成之CTL抗原決定位候選胜肽的在網際網路上公開的多數軟體並實施。其結果，從CKAP4之胺基酸序列選出有HLA-A*24：02之結合模體之由9~10個胺基酸所構成之CTL抗原決定位候選胜肽10種，並合成胜肽。以下顯示合成之CTL抗原決定位候選胜肽。

合成之HLA-A*24：02結合性CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽

Arg Leu Gly Arg Ala Leu Asn Phe Leu Phe(序列編號：36)

Phe Tyr Leu Ala Leu Val Ala Ala Ala Ala(序列編號：37)

Tyr Leu Ala Leu Val Ala Ala Ala Ala Phe(序列編號：38)

Asp Phe Ser Arg Gln Arg Glu Glu Leu(序列編號：39)

Lys Val Gln Ser Leu Gln Ala Thr Phe(序列編號：40)

Ser Leu Gln Ala Thr Phe Gly Thr Phe(序列編號：41)

Thr Phe Gly Thr Phe Glu Ser Ile Leu(序列編號：42)

Ile Tyr Thr Glu Val Arg Glu Leu Val(序列編號：43)

Lys Val Gln Glu Gln Val His Thr Leu Leu(序列編號：44)

Asp Phe Leu Asp Arg Leu Ser Ser Leu(序列編號：45)

表7顯示合成之HLA-A*24：02結合性CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽之特徵。合成之CKAP4專一性CTL 抗原決定位候選胜肽之N末端側起3個或4個胺基酸序列以簡稱代表胜肽名稱。從左起顯示胜肽名、胺基酸序列、CKAP4胺基酸序列上之位置、胺基酸數、以分析使用之BIMAS(BioInformatics & Molecular Analysis Section/http：//thr.cit.nih.gov/index.shtml)之HLA Peptide Binding Predictions(http：//thr.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)算出之分數。此分數係預測HLA-A*24：02與胜肽之親和性之數值，分數越高，代表HLA分子與胜肽越可能形成安定的複合體。發明者人等除了表7記載之分析軟體BIMAS以外，也使用SYFPEITHI、Rankpep、IEDB Bind prediction、NetCTL等分析軟體，選出10種CTL抗原決定位候選胜肽(序列編號：36~45)。

[CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽之折疊試驗]

發明人使用人工合成的10種CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽，實施折疊試驗。具體而言，將利用大腸菌表現系表現精製之HLA-A*24：02與β2-微球蛋白、及CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽添加到折疊溶液並混合後，經時地分取折疊溶液，於凝膠過濾管柱進行分析。凝膠過濾管柱分析中，確認已形成HLA-A*24：02與β2-微球蛋白、及CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽之3者複合體(MHC-單體)時，由於MHC-單體的分子量比原料還大，於凝膠過濾管柱分析之溶出時間會加快。又，MHC-單體形成量，可由利用280nm之吸收波長獲得之峰部面積算出。另一方面，和HLA分子無結合性之候選胜肽未能確認MHC-單體形成。確認形成MHC-單體形成時之代表凝膠過濾管柱分析例，顯示於第21圖。

HLA分子與β2-微球蛋白，當利用大腸菌表現系表現精製時，係以不溶性級分封入體的形式精製，並可溶於8M尿素，但凝膠過濾管柱分析之結果中，在7~8分鐘時檢測到難溶性HLA分子未形成MHC-單體而成為凝聚體。惟多數凝聚體可利用凝膠過濾管柱分析前之濾器過濾處理除去。β2-微球蛋白係可溶性蛋白質，在折疊溶液中可溶，可於14分鐘附近檢測到。15分鐘以後，檢測到折疊溶液之組成物、胜肽。折疊試驗剛開始時(第0天)未確認到MHC-單體之峰部，但1日後(第1天)、3日後(第3天)，峰部增大，顯示MHC-單體形成順利進行。

第22圖顯示對於10種CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽實施之折疊試驗4日後之分析結果。同時，將由9個胺基酸構成之陽性對照胜肽(序列編號：46)與陰性對照(序列編號：47)作為比較對象。

折疊試驗使用之對照胜肽

Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu(序列編號：46)

Ser Ser Tyr Arg Arg Pro Val Gly Ile(序列編號：47)

圖中，形成MHC-單體形成之峰部面積以條圖表示。序列編號：36~45和陽性對照胜肽與陰性對照(79,031μV*秒)比較之結果、序列編號：36、40、42、43的MHC-單體形成良好，進行以後的解析。

[CKAP4專一性MHC-四聚物試藥之製造]

依折疊試驗之結果，使用序列編號：36、40、42、43之CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽與HLA-A*24：02、及β2-微球蛋白製造PE(phycoerythrin)標記MHC-四聚物試藥。本發明製造之MHC-四聚物試藥，例如以，KVQE-Tet與簡稱表示，其代表使用HLA-A*24：02與胜肽KVQE(KVQEQVHTLL(序列編號：44))與β2-微球蛋白之3者複合體所製造者。使從蛋白質表現用之基因重組寄主所精製之HLA第I型分子、β2-微球蛋白及本發明之CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽之複合體、MHC-單體在適當的折疊溶液中形成。在重組HLA第I型分子之C末端預先附加生物素結合部位，MHC-單體形成後於此部位附加生物素。藉由將市售之經色素標記之鏈黴親和素與生物素化MHC-單體以莫耳比1：4混合，可製造MHC-四聚物試藥。

[CKAP4專一性CTL抗原決定位胜肽之鑑定]

(檢體之HLA型之選定)

CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽，係選擇對於HLA-A*24：02有結合模體之10種候選胜肽。並利用折疊試驗，明白，HLA-A*24：02與β2-微球蛋白與4種CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽(序列編號：36、40、42、43)在試管內結合，並良好地形成MHC-單體。為了實際上確認此4種CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽會HLA-A*24：02並確認辨識其之CTL在活體內是否存在，宜使用保有HLA-A*24：02之供血者之周邊血進行驗證。最初，供血者是否保有HLA-A*24：02係使用Genosearch(商標)HLA-A Ver.2(MBL公司)，以HLA-A之基因型判定確認。以下之探討，係使用保有HLA-A*24：02之7名健康成人之PBMC進行。

[CKAP4專一性CTL之誘導]

[使用MLPC(Mixed Lymphocyte-Peptide Cultures)法之CKAP4專一性CTL之誘導]

MLPC法係於PBMC培養液中添加胜肽並誘導CTL之方法(Karanikas V,Lurquin C,Colau D,van Baren N,De Smet C,Lethe B,Connerotte T,Corbiere V,Demoitie MA,Lienard D,Dreno B,Velu T,Boon T,Coulie PG.Monoclonal anti-MAGE-3 CTL responses in melanoma patients displaying tumor regression after vaccination with a recombinant canarypox virus.J Immunol.2003；171(9)：4898-904、Tsukahara T,Kawaguchi S, Torigoe T,Takahashi A,Murase M,Kano M,Wada T,Kaya M,Nagoya S,Yamashita T,Sato N.HLA-A*0201-restricted CTL epitope of a novel osteosarcoma antigen,papillomavirus binding factor.J Transl Med.2009；7：44)。據認為使PBMC含有之記憶型CTL受PBMC中存在之抗原呈現細胞，例如，樹狀細胞、B細胞、巨噬細胞、某種T細胞呈現胜肽刺激並增殖。將從保有HLA-A*24：02之健康成人採集之周邊血以3,000rpm進行5~10分鐘離心處理，回收上清之血漿部分。血漿部分以外以係習知方法之密度梯度離心法將PBMC分離。本發明中，使用添加了5%血漿之培養基，獲得良好結果。培養基係於一般細胞培養使用之培養基中添加適當的添加物與抗生素。本發明使用之CTL誘導培養基，係使用在RPMI1640 Hepes modify(Sigam公司)添加了2-巰基乙醇、L-麩醯胺酸、作為抗生素之鏈黴素與盤尼西林之培養基。除此以外也可添加胰島素、運鐵蛋白、亞硒酸、丙酮酸、人血清白蛋白、非必須胺基酸溶液等。使約3×10⁷個PBMC漂浮於10mL培養基。於其中各以10μg/mL的濃度添加4種CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽(序列編號：36、40、42、43)中的1~2種胜肽。胜肽濃度可因應胜肽之溶解度而變更。本發明中，以10μg/mL實施。PBMC與胜肽之混合培養，使用96孔U底細胞培養用微孔盤(BECTON DICKINSON公司)。細胞於37℃、5% CO₂恆溫箱培養。2日後以20~100U/mL之最終濃度進行IL-2之添加。之後適當進行IL-2添加CTL誘導培養基之交換。CKAP4專一性CTL之確認，係以培養2週為目標實施。於能夠確認CKAP4專一性CTL 之誘導時，使用胜肽脈衝抗原呈現細胞加以刺激或直接以胜肽刺激，並嘗試建立CTL細胞株。

[CKAP4專一性CTL之確認]

針對以前述方法培養之細胞群體是否存在CKAP4專一性之CTL之探討，係依MHC-四聚物法實施。培養後對於適量細胞數加入10μL之PE標記MHC-四聚物試藥、20μL之FITC(fluorescein isothiocyanate)標記T細胞表面抗體(例如CD8,CD4,CD3)等。再者，為了排除因混入之紅血球所致之非專一性之螢光，也可添加經PC5(phycoerythrin-Cy5)等標記之CD45抗體。之後，溫和地混合並於2~8℃於60分鐘靜置或於室溫靜置30分鐘。加入1.5mL之PBS並攪拌後，以3,000rpm進行5分鐘離心分離。吸除上清並廢棄後，將細胞再懸浮於400μL之PBS。此時，為了排除死細胞所致之非專一性之螢光，也可以加入7-AAD viability Dye(死細胞檢測試藥、MBL公司)。24小時以內以流式細胞儀解析。

CKAP4專一性CTL之確認係以2階段進行。首先，第1階段將96孔U底細胞培養用微孔盤之縱列之8孔各一部分細胞回收，合併成為1個樣本(線道(lane)合併)，以MHC-四聚物法確認是否有CKAP4專一性CTL之誘導。第2階段於在第1階段已確認CKAP4專一性CTL之誘導之行合併，將各孔細胞個別回收並以MHC-四聚物法確認是否有CKAP4專一性CTL誘導。藉由使用如此的方法，可確認在96孔U底細胞培養用微孔盤之某孔是否有誘導出CKAP4專一性CTL。

第23圖、第25圖顯示以MLPC法誘導CKAP4 專一性CTL後，進行第1階段之確認之代表結果。將檢體編號A24-37(第23圖)及A24-39(第25圖)之PBMC以CKAP4專一性CTL抗原決定位候選胜肽之序列編號：43培養14日。點圖展開圖中之數字，於將展開圖分成四部分之區域表示記載UL(左上)、UR(右上)、LL(左下)、LR(右下)時，代表(UR+LR)部分之UR之百分率。X軸係將CD8以log尺度表示、Y軸係將對於MHC-四聚物試藥之螢光強度以log尺度表示之點圖展開圖。於確認IYT-Tet序列編號：43之專一性CTL之誘導時，檢體編號A24-37在lane 7、A24-39在lane 11之UR，檢測到明顯的CD8陽性IYT-Tet陽性之細胞群體。此表示序列編號：43為CKAP4專一性CTL抗原決定位胜肽，檢體編號A24-37及A24-39之周邊血存在記憶型之CKAP4專一性CTL。第24圖、第26圖代表以MLPC法誘導序列編號：43專一性CTL，並以MHC-四聚物法檢測到的第2階段的結果。第23圖、第25圖，將已確認有CKAP4專一性CTL之誘導各lane中各孔是否誘導CKAP4專一性CTL以MHC-四聚物法確認並表示結果。其結果，第24圖所示之檢體編號A24-37 lane 7之G孔(7-G)，及第26圖所示之檢體編號A24-39 lane 11之B孔(11-B)，檢測到序列編號：43專一性CTL。該等情事證明序列編號：43是顯示HLA-A*24：02限制性之CKAP4專一性CTL抗原決定位胜肽。檢體編號A24-37及、A24-39，各在96孔中之1孔檢測到序列編號：43專一性CTL，故以下式算出序列編號：43專一性CTL在周邊血PBMC中之存在比率。

檢體編號A24-37之序列編號：43專一性CTL之

頻度=(MHC-四聚物試藥陽性孔數)/(實驗使用之PBMC之數×誘導前之CD8陽性率)=1/(3×10⁷×0.311)=1.07×10^-7檢體編號A24-39之序列編號：43專一性CTL之頻度=1/(3×10⁷×0.155)=2.15×10^-7

通常以96孔之MLPC法能檢測專一性CTL之極限，於假定誘導前之CD8陽性細胞率為10~20%時，成為1.6~3.3×10^-7。換言之，此情形之96孔之MLPC法中，檢測到的專一性CTL的標準比例係每3~6×10⁶個CD8陽性細胞有1個。

再者，本發明，如表8，使用序列編號36、40、42、43將7人之供血者作為對象，實施同樣之探討，但是序列編號：43以外未能檢測專一性CTL。序列編號：43也只於7名中的2名檢測。原因是CKAP4專一性HLA-A*24：02限制性抗原決定位胜肽之預測困難，要預測此抗原決定位胜肽是否有專一性CTL之誘導能力更困難。

[抗原呈現細胞之製備]

EBV感染B細胞株之製備

依標準定法(Kuzushima K,Yamamoto M,Kimura H,Ando Y,Kudo T,Tsuge I,Morishima T.Establishment of anti-Epstein-Barr virus(EBV)cellular immunity by adoptive transfer of virus-specific cytotoxic T lymphocytes from an HLA-matched sibling to a patient with severe chronic active EBV infection.Clin Exp Immunol.1996；103：192-198)，將為EBV產生細胞株B95-8細胞(從JCRB Cell Bank取得)之培養上清(包括活EBV病毒)與PBMC混合培養，並建立EBV感染B細胞株(Lymphoblastoid cell line，以下稱為EBV感染LCL)。

[使用抗原呈現細胞之專一性CTL之擴增]

使前述抗原呈現細胞(EBV感染LCL)漂浮在刺激用培養基(0.5%人血清白蛋白/RPMI1640)或AIM-V medium(Invitrogen公司)，以10μg/mL之濃度添加CTL抗原決定位候選胜肽，以隔約15分鐘的間隔邊溫和地混合邊於室溫放置30~60分鐘後，以過量之刺激用培養基進行3次洗滌，並洗掉未和HLA分子結合之胜肽。據認為藉由此操作，CTL抗原決定位候選胜肽會結合於抗原呈現細胞上之HLA分子。已實施此操作之抗原呈現細胞稱為胜肽脈衝抗原呈現細胞。為了使胜肽脈衝抗原呈現細胞喪失增殖能力，係進行致死量之X射線照射、或絲裂黴素處理。將其和從同一人物誘導出的含CKAP4專一性CTL之細胞群體混合，於37℃、5% CO₂恆溫箱培養。已有人進行使用之培養基係含有含10%胎牛血清(FCS)之RPMI1640培養基、或含有10%人血清之RPMI1640培養基、或含有1~10%之人血漿RPMI1640培養基等探討，但本方法中，含5%人血漿之RPMI1640培養基獲得良好結果。為了T細胞生存之維持、輔助增殖，以50U/mL添加IL-2(鹽野義製藥公司)。培養開始10~16日後實施CKAP4專一性CTL誘導之評價。能確認CKAP4專一性CTL之誘導時，進一步使用胜肽脈衝抗原呈現細胞加以刺激，並建立CTL株。

[利用細胞內IFNγ產生細胞定量法所為之專一性CTL之機能解析]

將以前述方法誘導而得之含CKAP4專一性CTL之細胞群體之約1/10~全量移到96孔U底細胞培養用微孔盤，添加誘導使用之胜肽，使最終成為0.1~10μg/mL之濃度。再添加細胞內蛋白輸送抑制劑(例如：Brefeldin A、Monensin等)，於5% CO₂恆溫箱於37℃進行5~16小時培養。培養後將細胞洗滌，添加PE標記MHC-四聚物試藥與PC5標記CD8抗體(Beckman Coulter公司)，於室溫放置15~30分。洗滌後以4%甲醛於4℃固定15分鐘後，以過量洗滌液清洗。以0.1%皂素進行透膜處理後，加入FITC標記抗IFNγ抗體(MBL公司製)，於室溫反應15~30分鐘。洗滌後使用流式細胞儀定量T細胞中之IFNγ陽性細胞率或MHC-四聚物試藥陽性細胞中之IFNγ陽性細胞率。

第27圖顯示經誘導之CKAP4專一性CTL利用細胞內IFNγ產生細胞定量法探討之結果。將檢體編號A24-39之PBMC以HLA-A*24：02限制性CKAP4專一性CTL抗原決定位胜肽序列編號：43刺激。係顯示將其使用PE標記MHC-四聚物試藥(MBL公司)、PC5標記CD8抗體、FITC標記IFNγ抗體進行3重染色，並使用流式細胞儀解析之結果。點圖展開圖中之數字代表存在四分割之區域的細胞佔全部活細胞之百分率。第27圖中，只有以專一性胜肽刺激時，在UR出現IFNγ陽性MHC-四聚物試藥陽性細胞，未添加胜肽時，幾乎未出現。但是已添加胜肽與未添加時細胞群體皆存在IYT-t-Tet專一性CTL存在之情事，可由於X軸係將CD8以log尺度表示、Y軸係將對於MHC-四聚物試藥之螢光強度以log尺度表示之點圖展開圖中，UR可見到CD8陽性MHC-四聚物試藥陽性細胞群體而得知。

由此結果，可知，已添加CKAP4專一性CTL抗原決定位胜肽而培養之PBMC中，利用再刺激會誘導產生IFNγ之具細胞毒性之CKAP4專一性CTL，此細胞能以MHC-四聚物試藥染色，故為對於來自HLA-A*24：02限制性CKAP4之胜肽IYTEVRELV(序列編號：43)有專一性之CTL。

[產業利用性]

依本發明，可使用對於艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)有專一性之細胞毒性T淋巴球抗原決定位胜肽治療或預防EBV之感染及同病毒陽性之癌。又，可定量對於EBV有專一性之CTL。又，藉由使用由本發明之IYTEVRELV(序列編號： 43)之序列構成之HLA-A*24：02限制性抗原決定位胜肽，能治療高度表現CKAP4之惡性腫瘤細胞相關的疾病。

<110> 醫學生物學研究所股份有限公司(MEDICAL AND BIOLOGICAL LABORATORIES CO.,LTD.)

<120> 細胞毒性T細胞抗原決定位胜肽及其用途

<130> M3-A1501P

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<170> PatentIn version 3.5

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Claims

一種抗原決定位胜肽，具有對於艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus,EBV)有專一性之細胞毒性T淋巴球之誘導活性，在此，該抗原決定位胜肽係由選自於由序列編號：1、序列編號：2、序列編號：3、序列編號：4、序列編號：5、序列編號：6、序列編號：26、序列編號：27及序列編號：28所構成之群組中的胺基酸序列所構成。
一種抗原決定位胜肽，具有對於艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)有專一性之細胞毒性T淋巴球之誘導活性，在此，該抗原決定位胜肽係在序列編號：1、序列編號：2、序列編號：3、序列編號：4、序列編號：5、序列編號：6、序列編號：26、序列編號：27或序列編號：28記載之胺基酸序列中，1個或多數個胺基酸被取代、缺失、插入及/或加成。
一種核酸，編碼為如申請專利範圍第1~2項之任一項中記載之抗原決定位胜肽。
一種表現載體，包括編碼為如申請專利範圍第1~2項之任一項中記載之抗原決定位胜肽的核酸。
一種用於治療、或預防EBV之感染或EBV陽性之癌的疫苗，包括如申請專利範圍第1~2項之任一項中記載之抗原決定位胜肽作為有效成分。
如申請專利範圍第5項之疫苗，其中，EBV係選自於AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。
一種用於治療、或預防EBV之感染或EBV陽性之癌的疫苗，包括如申請專利範圍第3~4項之任一項中記載之核酸或表現載體作為有效成分。
如申請專利範圍第7項之疫苗，其中，EBV係選自於AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。
一種用於治療、或預防EBV之感染或EBV病毒陽性之癌的疫苗，包括呈現如申請專利範圍第1~2項之任一項中記載之抗原決定位胜肽於HLA的抗原呈現細胞作為有效成分。
如申請專利範圍第9項之疫苗，其中，EBV係選自於AKata株、GD1株、GD2株、HKNPC1株、AG876株、Mutu株及B95.8株。
一種對抗EBV之被動免疫療法劑，包括EBV專一性之細胞毒性T淋巴球，該EBV專一性之細胞毒性T淋巴球係利用如申請專利範圍第1~2項之任一項中記載之抗原決定位胜肽或於HLA呈現該抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞刺激周邊血液淋巴球而得。
一種對抗EBV之被動免疫療法劑，包括細胞毒性T淋巴球，該細胞毒性T淋巴球係使從如申請專利範圍第1~2項之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備之主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物和周邊血液淋巴球接觸，形成細胞毒性T淋巴球結合於該主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物之結合體，並從該結合體單離而得。
一種對於EBV有專一性之細胞毒性T淋巴球之定量方法，包括：以如申請專利範圍第1~2項之任一項中記載之抗原決定位胜肽刺激來自對象之周邊血的步驟；獲得利用前述步驟產生之EBV專一性之細胞毒性T淋巴球的步驟；及測定獲得之細胞毒性T淋巴球所產生之細胞介素及/或趨化介素及/或細胞表面分子的步驟。
一種周邊血中之對於EBV有專一性之細胞毒性T淋巴球之定量方法，包括：使如申請專利範圍第1~2項之任一項中記載之抗原決定位胜肽與主要組織相容性抗原複合體與β2-微球蛋白混合的步驟；及使製備之主要組織相容性抗原複合體-四聚物和來自對象之周邊血接觸的步驟。
一種對於EBV有專一性之細胞毒性T淋巴球之誘導方法，包括使如申請專利範圍第1~2項之任一項中記載之抗原決定位胜肽和抗原呈現細胞接觸的步驟。
一種用於誘導細胞毒性T淋巴球之套組，包括如申請專利範圍第1~2項之任一項中記載之抗原決定位胜肽作為構成要素。
一種生產EBV專一性CTL之方法，包括使如申請專利範圍第1~2項之任一項中記載之抗原決定位胜肽和周邊血單核球於含血漿之培養基中接觸的步驟。
一種對於CKAP4有專一性之CTL抗原決定位胜肽，係由序列編號：43記載之胺基酸序列所構成。
一種對於CKAP4有專一性之CTL抗原決定位胜肽，係在序列編號：43記載之胺基酸序列中，1個或多數個胺基酸被取代、缺失、插入及/或加成。
如申請專利範圍第18~19項之任一項中記載之抗原決定位胜肽，係HLA-A*24：02分子限制性之抗原胜肽，其特徵在於誘導具有專一性地辨識在細胞表面呈現和HLA-A*24：02分子之複合體的細胞的T細胞受體的CTL。
一種核酸，編碼為如申請專利範圍第18~19項之任一項中記載之抗原決定位胜肽。
一種表現載體，包括編碼為如申請專利範圍第18~19項之任一項中記載之抗原決定位胜肽之核酸。
一種用於癌治療或預防之疫苗，包括如申請專利範圍第18~19項之任一項中記載之抗原決定位胜肽作為有效成分。
一種用於癌治療或預防之疫苗，包括如申請專利範圍第21~22項之任一項中記載之核酸或表現載體作為有效成分。
一種用於癌治療或預防之疫苗，包括於HLA呈現如申請專利範圍第18~19項之任一項中記載之抗原決定位胜肽的抗原呈現細胞作為有效成分。
一種用於癌治療之被動免疫療法劑，包括CKAP4專一性之CTL作為有效成分，該CKAP4專一性之CTL係利用如申請專利範圍第18~19項之任一項中記載之抗原決定位胜肽或於HLA呈現該抗原決定位胜肽的抗原呈現細胞刺激周邊血液淋巴球而得。
一種用於癌治療之被動免疫療法劑，包括CTL作為有效成分，該CTL係使從如申請專利範圍第18~19項之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備的主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物和周邊血液淋巴球接觸、形成CTL結合於該主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物之結合體，並從該結合體進行單離而得。
一種對於CKAP4有專一性之CTL之定量方法，包括：以如申請專利範圍第18~19項之任一項中記載之抗原決定位胜肽刺激來自對象之周邊血的步驟；取得對於由前述步驟產生之CKAP4有專一性之CTL的步驟；及測定該取得之CTL所產生之細胞介素及/或趨化介素及/或細胞表面分子的步驟。
一種周邊血中之對於CKAP4有專一性之CTL之定量方法，包括：從如申請專利範圍第18~19項之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備主要組織相容性抗原複合體-四聚物的步驟；及使主要組織相容性抗原複合體-四聚物與來自對象之周邊血接觸的步驟。
一種CKAP4專一性CTL之誘導方法，包括使如申請專利範圍第18~19項之任一項中記載之抗原決定位胜肽和來自對象之周邊血單核球接觸的步驟。
一種用於癌治療之被動免疫療法劑之製造方法，包括：利用如申請專利範圍第18~19項之任一項中記載之抗原決定位胜肽或於HLA呈現該抗原決定位胜肽之抗原呈現細胞刺激周邊血液淋巴球而取得CKAP4專一性之CTL的步驟。
一種用於癌治療之被動免疫療法劑之製造方法，包括：使從如申請專利範圍第18~19項之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備之主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物和周邊血液淋巴球接觸的步驟；形成CTL結合於該主要組織相容性抗原複合體及/或主要組織相容性抗原複合體-四聚物之結合體的步驟；及取得從該結合體單離而得之CTL的步驟。
一種對於主要組織相容性抗原複合體有專一性之抗體，係從如申請專利範圍第18~19項之任一項中記載之抗原決定位胜肽製備。