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TW201639890A - 結合至ｆｌｔ３蛋白之抗體藥物結合物（ａｄｃ） - Google Patents

結合至ｆｌｔ３蛋白之抗體藥物結合物（ａｄｃ） Download PDF

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Abstract

本文描述結合至FLT3蛋白之抗體藥物結合物(ADC)及其變體。FLT3在正常成人組織中會呈現顯示不同且有限之表現模式，且其於表I所列之癌症中表現異常。因此，本發明之ADC提供用於治療癌症之治療性組合物。

Description

結合至FLT3蛋白之抗體藥物結合物(ADC) 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2015年3月9日申請之美國臨時專利申請案第62/130,476號之優先權。該案之內容係以全文引用之方式併入本文中。
ASCII正文檔案上之序列表之提交
下列ASCII正文檔案上之提交內容係以全文引用之方式併入本文中：序列表之電腦可讀形式(CRF)(檔案名稱：511582009200SeqList.txt，記錄日期：2016年3月7日，大小：44,847個字節)。
在聯邦贊助之研究下對本發明作出權限聲明
不適用。
本文描述之本發明係關於結合稱為FLT3之蛋白質之抗體、其抗原結合片段及其抗體藥物結合物(ADC)。本發明進一步係關於適用於治療表現FLT3之癌症之預後、預防及治療方法及組合物。
據估計，2013年1,660,290名男性及女性(854,790名男性及805,500名女性)經診斷患有各部位癌症及580,350名男性及女性死於各部位癌 症。2006至2010年間，經診斷患有各部位癌症之中值年齡係66歲。年齡調整發病速率係每年每100,000名男性及女性中有463.0名。此等速率係基於在2006至2010年間自18個SEER地理區域(注：SEER=監測(Surveillance)、流行病學(Epidemiology)及最終結果(End Result)計劃，NCI)診斷之案例。在2006至2010年間，死於各部位癌症之中值年齡係72歲。年齡調整死亡速率係每年每100,000名男性及女性中有176.4名。此等速率係基於在美國於2006至2010年間死亡之病患。18個SEER地理區域之2003-2009年間總體5年相對存活率係65.8%。
白血病係起始於造血組織(諸如骨髓)，且會產生異常大量血細胞並進入血流中之癌症。主要白血病包括急性淋巴母細胞性(ALL)、急性骨髓性(AML)、慢性淋巴球性(CLL)、慢性髓系(CML)及毛細胞(CLL)白血病。
就此等白血病群組而言，據估計，2013年有48,610名男性及女性(27,880名男性及20,730名女性)經診斷患有白血病及23,720名男性及女性死於白血病。在2006至2010年間，經診斷患有白血病之中值年齡係66歲。年齡調整發病速率係每年每100,000名男性及女性中有12.8名。此等速率係基於2006至2010年間自18個SEER地理區域診斷之案例。2006至2010年間，死於白血病之中值年齡係75歲。年齡調整死亡速率係每年每100,000名男性及女性中有7.1名。此等速率係基於在美國於2006至2010年間死亡之病患。18個SEER地理區域之2003-2009年間總體5年相對存活率係56.0%。
CLL係成人中第二最常見類型之白血病且其通常會緩慢變惡化。其通常發生在中年期間或中年後，且其極少發生於兒童中。早期CLL之病患未經化學療法治療直至其等呈現症狀或顯示疾病之迅速進展之證據。化學療法之早期開始已無法於CLL中顯示利益且可甚至增加死亡率。當開始化學療法時，核苷類似物氟達拉濱(fludarabine)係CLL 中最常用之一線療法。組合方案在若干臨床試驗中已顯示改善之反應速率且包括以下：氟達拉濱、環磷醯胺及利妥昔單抗(rituximab)(FCR)；噴司他汀(Pentostatin)、環磷醯胺及利妥昔單抗(PCR)；氟達拉濱、環磷醯胺及米托蒽醌(mitoxantrone)(FCM)；環磷醯胺、長春新鹼(vincristine)及強體松(prednisone)(CVP)；環磷醯胺、多柔比星(doxorubicin)、長春新鹼及強體松(CHOP)。據估計，2013年15,680名男性及女性(9,720名男性及5,960女性)經診斷患有慢性淋巴球性白血病及4,580名男性及女性將死於慢性淋巴球性白血病。自2006至2010年間，診斷患有慢性淋巴球性白血病之中值年齡係71歲。年齡調整發病速率係每年每100,000名男性及女性中有4.3名。此等速率係基於2006至2010年自18個SEER地理區域診斷之案例。自2006至2010年間，死於慢性淋巴球性白血病之中值年齡係79歲。年齡調整死亡速率係每年每100,000名男性及女性中有1.4名。此等速率係基於在美國於2006至2010年間死亡之病患。18個SEER地理區域之2003-2009總體5年相對存活率係79.2%。
急性骨髓性白血病(AML)係成人中急性白血病之最常見類型。AML之當前治療應足夠侵略性以達成完全緩解(CR)，因為部分緩解未提供實質性存活利益。成人AML中之緩解速率與年齡呈反比例關係，及針對彼等小於60歲者預期緩解速率大於65%。資料表明一經達成，較年長病患中之緩解之持續時間可較短。表現祖代細胞抗原CD34及/或P-醣蛋白(MDR1基因產物)之病患具有略差之結果。細胞遺傳學分析提供一些可獲得之最強預後資訊，以預測緩解誘導及緩解後治療兩者之結果。指示良好預後之細胞遺傳學異常包括t(8；21)、inv(16)或t(16；16)及t(15；17)。正常細胞遺傳學預示平均-風險AML。患有具有以下特徵之AML病患使用化學療法具有特別差之預後：染色體5或7之長臂或單染色體之缺失；染色體3、t(6；9)、t(9；22)之易 位或倒位；或染色體11q23之異常。據估計2013年14,590名男性及女性(7,820名男性及6,770名女性)經診斷患有急性骨髓性白血病及10,370名男性及女性死於急性骨髓性白血病。自2006至2010年間，診斷患有急性骨髓性白血病之中值年齡係67歲。年齡調整發病速率係每年每100,000名男性及女性中有3.7名。此等速率係基於2006至2010年自18個SEER地理區域診斷之案例。自2006至2010年間，死於急性骨髓性白血病之中值年齡係72歲。年齡調整死亡速率係每年每100,000名男性及女性中有2.8名。此等速率係基於在美國於2006至2010年間死亡之病患。18個SEER地理區域之2003-2009總體5年相對存活率係24.2%。注意，所有常見之癌症資訊獲得自NCI網站(www.cancer.gov)且所有統計學資料係基於SEER發病率及NCHS死亡率統計學資料發現於以下各物中：Howlader N.等人，SEER Cancer Statistics Review,1975-2010,National Cancer Institute.Bethesda,MD,http：//seer.cancer.gov/csr/1975_2010/，基於2012年11月之SEER資料提交，發佈於SEER網站，2013。
急性淋巴母細胞性白血病(「ALL」)表示源自阻斷淋巴分化並驅動異常細胞增殖及存活之基因改變之B/T-前驅物-階段類淋巴細胞惡性腫瘤之群組。在過去數十年間已於治療兒童ALL中獲得顯著進步，及五(5)年存活率現正接近90%。然而高達20%之兒童難以治療或治療後會復發，且此等病患之無事件存活率仍然較差。治療患有ALL之成人病患甚至在現代化學療法顯著進步後因高復發率而亦仍具挑戰性。在近幾十年間，已在ALL之治療結果中達成迅速之改善，其主要基於化學療法之強化及最佳化；幹細胞移植之風險適應性用途；及包括單株抗體之個體化及靶向療法。使用下代測序，評估影響正常淋巴細胞形成之額外突變與協同突變之重要性及後生改變。以此方式獲得之資料將有助於評估個別病患之預後，但重要地，亦有助於併入適用於突 變異常之靶向療法。
此外，意識到單株抗體(mAb)之治療效用(G.Kohler及C.Milstein,Nature 256：495-497(1975))。現已批准單株抗體作為移植、癌症、傳染性疾病、心血管疾病及炎症中之療法。不同同型具有不同效應功能。功能中之此類差異體現於用於各種免疫球蛋白同型之不同三維結構(P.M.Alzari等人，Annual Rev.Immunol.,6：555-580(1988))。
因為小鼠便於免疫化且可將大部分人類抗原識別為外來者，因此具有治療潛力之抗人類標靶之mAb已通常具有鼠類起源。然而，鼠類mAb作為人類療法具有固有缺點。其等需更頻繁給藥，因為mAb相較於人類抗體於人類中具有更短循環半衰期。更精確而言，向人類免疫系統重複投與鼠類抗體會造成人類免疫系統將小鼠蛋白識別為外來者並產生人類抗小鼠抗體(HAMA)反應而產生反應。此HAMA反應可導致過敏反應並自系統中迅速清除鼠類抗體，藉此顯示藉由鼠類抗體治療係無效的。為避免此類影響，已嘗試於小鼠內產生人類免疫系統之嘗試。
希望初始嘗試創造能夠以具有人類序列之抗體對抗原產生反應之基因轉殖小鼠(參見Bruggemann等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 86：6709-6713(1989))，但受到可藉由可利用之選殖載體保持穩定之DNA之數量之限制。使用酵母人造染色體(YAC)選殖載體引導人類Ig基因座之大生殖系片段引入基因轉殖哺乳動物內。基本上大部分人類V、D及J區基因以與人類基因體中發現之相同間隔佈置並人類恆定區使用YAC引入小鼠內。一種此類基因轉殖小鼠品系稱為XenoMouse®小鼠且購買自Amgen Fremont,Inc.(Fremont CA)，前身為Abgenix,Inc。
另外，抗體可使用VelocImmune基因轉殖小鼠製造，在該小鼠中，在免疫球蛋白重鏈(VH、DH及JH區段)及/或κ輕鏈(VK及JK)基因 座處具有內源性小鼠可變區段之基因體序列已全部或部分經具有人類免疫球蛋白重鏈(VH、DH及JH)及/或κ輕鏈(VK及JK)基因座(Regeneron,Tarrytown,NY)之未經重排生殖系可變區段之人類基因體序列置換。參見，例如，美國專利案第6,586,251、6,596,541、7,105,348、6,528,313、6,638,768及6,528,314號。
本發明提供結合至FLT3蛋白及FLT3蛋白之多肽片段之抗體、其抗原結合片段及其抗體藥物結合物(ADC)。在一些實施例中，本發明包含與治療劑結合之完全人類抗體。在某些實施例中，限制條件為圖2A及/或2B之整個核酸序列係未經編碼及/或圖3A及/或3B之整個胺基酸序列係未經製造。在某些實施例中，圖2A及/或2B之整個核酸序列係經編碼及/或圖3A及/或3B之整個胺基酸序列係經製造，其等中之任何一者係呈各自人類單位劑型。
本發明進一步提供各種免疫原性或治療性組合物(諸如抗體藥物結合物)，及用於治療表現FLT3之癌症諸如列於表I中之組織之癌症(例如，AML、ALL，包括B細胞淋巴母細胞性白血病及前驅物B細胞淋巴母細胞性白血病)之策略。
圖1：FLT3之cDNA及胺基酸序列顯示於圖1中。起始甲硫胺酸加下劃線。開讀框自核酸67延伸至3048(包含終止密碼子)。
圖2A：CHv62.21重鏈之cDNA及胺基酸序列。重鏈可變區加雙下劃線及重鏈人類IgG1恆定區加下劃線。
圖2B：CHv62.21輕鏈及CHv62.21pAF輕鏈之cDNA及胺基酸序列。輕鏈可變區加雙下劃線及人類κ恆定區加下劃線。
圖2C：經非天然胺基酸之插入修飾之CHv62.21重鏈之cDNA及胺基酸序列。X標記係用於在核酸殘基371處插入非天然胺基酸 (「nnAA」)對乙醯基苯丙胺酸(pAF)之琥珀密碼子之位置。重鏈可變區加雙下劃線及重鏈人類IgG1恆定區加下劃線。
圖3A：CHv62.21重鏈之胺基酸序列。重鏈可變區加雙下劃線及人類IgG1恆定區加下劃線。
圖3B：CHv62.21輕鏈及CHv62.21pAF輕鏈之胺基酸序列。輕鏈可變區加雙下劃線及人類κ恆定區加下劃線。
圖3C：CHv62.21重鏈之胺基酸序列。X標記之胺基酸位置124係用於插入非天然胺基酸(「nnAA」)對乙醯基苯丙胺酸(pAF)之琥珀密碼子之位置。重鏈可變區加雙下劃線及人類IgG1恆定區加下劃線。
圖4A：CHv62.21重鏈與人類Ig生殖系之比對。
圖4B：CHv62.21輕鏈與人類Ig生殖系之比對。
圖5：CHv62.21pAF-AGL-0182-30於植入CB17/SCID小鼠中之人類B骨髓單核球性白血病細胞系MV4-11之皮下建立之異種移植物模型中之療效及劑量滴定研究。
圖6：CHv62.21pAF-AGL-0182-30(ADC)及CHv62.21pAF(AGS62P)(裸抗體)於植入CB17 SCID小鼠中之人類B骨髓單核球性白血病細胞系MV4-11之皮下建立之異種移植物模型中之療效研究。
圖7：CHv62.21及CHv62.21pAF於活體外EOL-1、SEM及Raji(圖中從左至右)中不介導抗體依賴性細胞毒性活性(ADCC)。分析詳情：1)E：T=100：1；2)抗體濃度=2.5μg/mL；3)培養時間：4H；4)同型對照mAb及ADC：AGS91.1-L363-pAF、AGS91.88-pAF-AGSL-0182-30；5)陽性對照：靶向Raji細胞之利妥昔單抗。
圖8：CHv62.21顯示非配體阻斷活性。在配體結合分析中比較FLT3配體阻斷劑Mab(1b37.1)及CHv62.21證實CHv62.21 Mab係非配體阻斷劑。
圖9：CHv62.21不干擾FL介導之細胞增殖。
圖10：阻斷FLT3配體之1b37.1 Mab之細胞毒性活性在FL之存在下減小。圖10(A)：v62-1b21.1-AGL-0129-08在存在及不存在人類FLT3配體(hFL)之情況下對RS-4-11細胞之活體外細胞毒性之評估。圖10(B)：v62-1b37.1-AGL-0129-08在存在及不存在人類FLT3配體(hFL)之情況下對RS-4-11細胞之活體外細胞毒性之評估。
圖11：FLT3配體不干擾MOLM-13細胞中CHv62.21pAF-AGL-0182-30介導之細胞毒性。圖11(A)：生物素化CHv62.21pAF及v62-1b37.1在MOLM-13細胞上存在人類FLT3配體下之結合評估。圖11(B)：CHv62.21pAF-AGL-0182-30在MOLM-13細胞上存在及不存在人類FLT3配體之情況下之活體外細胞毒性之評估。
圖12：CHv62.21pAF-AGL-0182-30之活體外穩定性。圖12(A)：CHv62.21pAF-AGL-0182-30於人類血清中之穩定性評估。圖12(B)：CHv62-AGL-0301-20於人類血清中之穩定性評估。
圖13：CHv62.21pAF-AGL-0182-30(ADC)及CHv62.21pAF(裸抗體)使用多劑量方案於植入CB17 SCID小鼠中之人類B骨髓單核球性白血病細胞系MV4-11之皮下建立之異種移植物模型中之療效研究。
圖14：CHv62.21pAF-AGL-0182-30於皮下建立之SEM-xcl異種移植物模型中之療效。
段落綱要
I.)定義
II.)FLT3抗體
III.)抗體藥物結合物概述
III(A).美登素類
III(B).奧瑞司他汀(Auristatin)及海兔毒素(dolostatin)
III(C).卡奇黴素(Calicheamicin)
III(D).其他細胞毒性劑
IV.)結合FLT3之抗體藥物結合物
V.)連接子單元
VI.)延伸子單元(Stretcher Unit)
VII.)胺基酸單元
VIII.)間隔子單元
IX.)藥物單元
X.)藥物負載
XI.)測定ADC之細胞毒性效應之方法
XII.)表現FLT3之癌症之治療
XIII.)作為基於抗體之療法之標靶之FLT3
XIV.)FLT3 ADC混合物
XV.)組合療法
XVI.)套組/製品
I.)定義：
除非另有定義，否則本文中所用之所有技術術語、注釋及其他科學術語意欲具有熟習本發明所屬技術者所通常瞭解之含義。在一些情況下，本文出於清楚起見及/或供及時參考而定義具有通常為人瞭解之含義之術語，且本文包括此類定義應不必理解為表示與此項技術中通常所瞭解之定義具有實質性差異。本文所述或所參考之許多技術及程序係經充分理解且由熟習此項技術者使用習知方法來使用，諸如，例如，描述於Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y中之廣泛應用之分子選殖方法論。除非另有說明，否則視情況，涉及使用市售套組及試劑之程序通常根據製造商定義之協議及/或參數進行。
當本文使用商標名時，除非內文另有指示，否則對商標名之提及亦係指產品調配物、學名藥物及商標名產品之活性醫藥成分。
術語「晚期癌症」、「局部晚期癌症」、「晚期疾病」及「局部晚期疾病」意謂已貫穿相關組織被膜之癌症，且意謂包括依據美國泌尿協會(AUA)系統之C期疾病、依據Whitmore-Jewett系統之C1至C2期疾病、依據TNM(腫瘤、結節、轉移)系統之T3至T4期及N+疾病。一般而言，對於患有局部晚期疾病之病患不推薦手術，且此等病患相較於患有臨床局部(局限於器官)癌症之病患具有大體上較不利之結果。
術語「烷基」(其本身或作為另一術語之一部分)係指含有正常、第二、第三或環碳原子之飽和C1-C12烴。特定烷基係彼等具有1至8個碳原子、1至6個碳原子或1至4個碳原子者。烷基之實例包括(但不限於)：甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基(tBu)、正戊基、異戊基、第三戊基及正己基、異己基。在一些實施例中，烷基具有正常、第二或第三碳原子且不具有環碳原子。
術語「烯基」(其本身或作為另一術語之一部分)係指含有正常、第二、第三或環碳原子及至少一個不飽和位點(即，碳碳sp2雙鍵)之C2-C12烴。特定烯基係彼等具有2至8個碳原子、2至6個碳原子或2至4個碳原子者。實例包括(但不限於)：乙烯基(-CH=CH2)、烯丙基(-CH2CH2=CH2)、環戊烯基(-C5H7)及5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH=CH2)。在一些實施例中，烯基具有正常、第二或第三碳原子且不具有環碳原子。
術語「炔基」(其本身或作為另一術語之一部分)係指含有正常、第二、第三或環碳原子及至少一個不飽和位點(即，碳碳sp三鍵)之C2-C12烴。特定炔基係彼等具有2至8個碳原子、2至6個碳原子或2至4個碳原子者。實例包括(但不限於)：乙炔基(-C≡CH)及2-丙炔基(- CH2C≡CH)。在一些實施例中，炔基具有正常、第二或第三碳原子且不具有環碳原子。
術語「烷氧基」係指-O-烷基，其中該O係連接至該分子之剩餘部分之連接點，且烷基係如上文定義。
術語「雜環烷基」係指單環或稠合、橋接或螺接多環結構，其係飽和或部分飽和且每個環結構具有3至12個選自碳原子及至多三個選自氮、氧、硫之雜原子之環原子。特定雜環烷基係彼等每個環結構具有3至8個環原子或5至7個環原子者。該環結構可視需要在碳或硫環成員上含有至多兩個側氧基。呈經適當結合之部分之形式之例示性實體包括：
術語「雜芳基」係指每個雜環具有3至12個環原子之單環、稠合雙環或稠合多環芳族雜環(環結構具有選自碳原子及至多四個選自氮、氧及硫之雜原子之環原子)。特定雜芳基係彼等每個環結構具有3至8個環原子或5至7個環原子者。雜芳基之例示性實例包括下列呈經適當結合之部分之形式之實體：
如本文使用之術語「雜環」、「雜環性」或「雜環基」包含如上文定義之「雜環烷基」及「雜芳基」部分兩者。
熟習此項技術者將知曉上文列舉或繪示之雜環基、雜芳基及雜環烷基之種類不詳盡且亦可選擇在此等經定義之術語之範圍內之額外之種類。
術語「鹵素」表示氯、氟、溴或碘。術語「鹵代」表示氯代、氟代、溴代或碘代。
術語「經取代」意謂指定基團或部分具有一或多個取代基。術語「未經取代」意謂指定基團無取代基。術語「視需要經取代」意謂指定基團未經取代或經一或多個取代基取代。在使用術語「經取代」以描述結構性系統之情況下，該取代意謂發生於系統上之任何價位容許之位置處。
本文給定之任何式旨在表示具有由結構式及某些變化或形式繪示之結構之化合物。特定言之，本文給定之任何式之化合物可具有非對稱中心且因此以不同之鏡像異構物形式存在。具有通式之化合物之所有光學異構物及立體異構物及其混合物視為在該式之範圍內。因此，本文給定之任何式旨在表示外消旋物、一或多種鏡像異構物形式、一或多種非鏡像異構物形式、一或多種阻轉異構物形式 (atropisomeric form)及其混合物。此外，某些結構可呈幾何異構物(即，順式或反式異構物)、呈互變異構物或呈阻轉異構物的形式存在。另外，本文給定之任何式旨在亦係指水合物、溶劑合物及此類化合物之非晶與多晶形式及其混合物中之任何一者，即使未明確列舉此類形式。在一些實施例中，該溶劑係水及該等溶劑合物係水合物。
本文給定之任何式亦旨在表示化合物之未經標記形式及同位素標記形式。同位素標記化合物具有由本文給定之式所繪示之結構，只是一或多個原子經具有選定之原子質量或質量數之原子置換。可併入本文描述之化合物中之同位素之實例包括氫、碳、氮、氧、磷、氟、氯及碘之同位素，諸如分別係2H、3H、11C、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F、36Cl及125I。此類同位素標記化合物適用於新陳代謝研究(較佳用14C)、反應動力學研究(例如用2H或3H)、包括藥物或受質組織分佈分析之偵測或成像技術[諸如正電子發射斷層攝影術(PET)或單光子發射電腦斷層掃描攝影術(SPECT)]或病患之放射性治療中。特定言之，經18F或11C標記之化合物可特別較佳適用於PET或SPECT研究。此外，使用較重同位素(諸如氘(即，2H))之取代可提供某些由於較大之新陳代謝穩定性造成之治療優勢，例如，增加之活體內半衰期或減小之劑量需求。本文描述之同位素標記化合物及其前藥可通常藉由以經容易獲得之同位素標記試劑代替非同位素標記試劑進行下文所述之方案或實例及製法中所揭示之程序來製備。
當提及本文給定之任何式時，自用於指定變量之可能種類之列表中選擇特定部分非旨在定義對用於本文別處出現之變量之種類之相同選擇。換而言之，在變量出現多於一次之情況下，除非另有說明，否則自指定列表中選擇之種類獨立於該式中別處對相同變量之種類之選擇。
當本文應用於一類取代基時，命名法「Ci-j」(j>i)意謂係指本文 所述之其中碳成員(i至j，包括i與j)之數目中之各者及每一個係獨立實現之任何組合物、用途或方法之實施例。例如，術語C1-3獨立地係指具有一個碳成員(C1)之實施例、具有兩個碳成員(C2)之實施例及具有三個碳成員(C3)之實施例。
術語Cn-m烷基係指鏈中具有碳成員總數N且滿足nNm(m>n)之脂族鏈(直鏈或分支鏈)。
使用AutoNOMTM軟體產生本文列舉之化學名稱。若化學結構與針對該結構所列舉之名稱間有矛盾，則以結構為準。
根據針對分配及命名法之前述說明性注意事項，應瞭解本文針對一組其中在化學上有意義且除非另有說明之暗示之明確參考、針對此組之實施例之獨立參考及針對該組之子組之可能實施例中之各者及每一個之參考係指明確性。
「改變天然醣化模式」出於本文之目的旨在意謂刪除天然序列FLT3中發現之一或多個碳水化合物部分(藉由移除標的醣化位點或藉由化學及/或酶促方式刪除醣化)及/或添加一或多個不存在於天然序列FLT3中之醣化位點，其中該「天然醣化模式」係指由於所用FLT-3序列、細胞類型及生長條件之特定組合造成之天然轉譯後醣化模式。另外，該片語包括天然蛋白質之醣化中之定性變化，涉及存在之各種碳水化合物部分之性質及比例之變化。
術語「類似物」係指與另一分子(例如，FLT3相關蛋白)結構類似或共用類似或相應屬性之分子。例如，FLT3蛋白之類似物可被特異性結合至FLT3之抗體或T細胞特異性結合。
除非另有明確指示，否則術語「抗體」係在最廣泛意義上使用。因此，「抗體」可為天然生成或人造，諸如藉由習知融合瘤或基因轉殖小鼠技術產生之單株抗體。FLT3抗體包含單株及多株抗體及含有此等抗體之抗原結合域及/或一或多個互補決定區之片段。如本 文使用，術語「抗體」係指特異性結合FLT3及/或顯示所需生物活性之抗體或其片段之任何形式且明確涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其等特異性結合FLT3及/或顯示所需生物活性即可。任何特異性抗體適用於本文提供之方法及組合物中。因此，在一個實施例中，術語「抗體」涵蓋一種分子，該分子包含至少一個來自輕鏈免疫球蛋白分子之可變區及至少一個來自重鏈分子之可變區且其等組合以形成用於靶抗原之特異性結合位點。在一個實施例中，該抗體係IgG抗體。例如，該抗體係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。適用於本發明方法及組合物中之抗體可於細胞培養物、噬菌體或各種動物包括(但不限於)牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、綿羊、狗、貓、猴、黑猩猩及猿中產生。因此，在一個實施例中，本發明之抗體係哺乳動物抗體。噬菌體技術可用以分離初始抗體或用以產生具有經改變之特異性或結合性特性之變體。此類技術係此項技術中常用及熟知。在一個實施例中，該抗體係藉由此項技術中已知的重組方式產生。例如，重組抗體可藉由用包含編碼該抗體之DNA序列之載體轉染宿主細胞來產生。一或多種載體可用以轉染於宿主細胞中表現至少一個VL及至少一個VH區之DNA序列。抗體產生及製造之重組方式之例示性描述包括Delves,ANTIBODY PRODUCTION：ESSENTIAL TECHNIQUES(Wiley,1997)；Shephard等人，MONOCLONAL ANTIBODIES(Oxford University Press,2000)；Goding,MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE(Academic Press,1993)及CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley & Sons，最新版)。本發明之抗體可藉由重組方式修飾以增加抗體於介導所需功能中之療效。因此，可藉由使用重組方式取代以修飾抗體在本發明之範圍內。通常，該等取代將係保守取代。例如，抗體之恆定區中之至少一個胺基 酸可經不同殘基置換。參見，例如，美國專利案第5,624,821號、美國專利案第6,194,551號、申請案WO 9958572及Angal等人，Mol.Immunol.30：105-08(1993)。胺基酸中之修飾包括胺基酸之刪除、添加及取代。在一些情況下，作出此類變化以減小非所需之活性，例如，補體依賴性細胞毒性。經常地，該等抗體藉由連接(共價或非共價)提供可偵測信號之物質來標記。各種標記及結合技術係已知且廣泛報告於科學文獻與專利文獻中。可針對結合至正常或缺陷性FLT3篩選此等抗體。參見，例如，ANTIBODY ENGINEERING：A PRACTICAL APPROACH(Oxford University Press,1996)。可使用下列活體外分析包括(但不限於)：增殖、遷移、黏著、軟瓊脂生長、血管生成、細胞-細胞通訊、細胞凋亡、運輸、信號轉導，及下列活體內分析(諸如腫瘤生長之抑制)識別具有所需生物活性之合適之抗體。本文提供之抗體亦適用於診斷應用中。就捕獲或非中和抗體而言，可針對結合至特異性抗原而不抑制該抗原之受體結合或生物活性之能力篩選其等。就中和抗體而言，該等抗體適用於競爭性結合分析中。其等亦可用以定量FLT3或其受體。
如本文使用，術語抗體之「抗原結合片段」或「抗體片段」(或簡稱為「抗體部分」)係指FLT3抗體之保留特異性結合至抗原(例如，FLT3及變體；參見圖1)之能力之一或多個片段。已顯示抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體之片段進行。涵蓋於術語抗體之「抗原結合片段」內之結合片段之實例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含兩個藉由雙硫鍵在鉸鏈區連接之Fab片段之二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單臂之VL及VH域組成之Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH域組成；及(vi)分離互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個域VL及VH係藉由單獨的基因編碼，但其等 可使用重組方法，藉由可將其等製造成其中VL及VH區配對以形成單價分子之單一蛋白質鏈之合成連接子而連接(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人，(1988)Science 242：423-426；及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此類單鏈抗體亦旨在涵蓋於術語抗體之「抗原結合片段」之範圍內。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知的習知方法獲得，且該等片段係經篩選得到與完整抗體相同的效用。
如本文使用，術語「Fc」係指包含鉸鏈區、CH2及/或CH3域之區域。
如本文使用，該「抗原」之任何形式可用以產生對FLT3具特異性之抗體。因此，該誘發抗原可為單一抗原決定基、多重抗原決定基、或單獨整個蛋白質或與一或多種此項技術中已知的免疫原性增強劑組合之整個蛋白質。該誘發抗原可為經分離全長蛋白、細胞表面蛋白(例如，利用經抗原之至少一部分轉染之細胞進行免疫)或可溶性蛋白(例如，利用僅蛋白質之細胞外域部分進行免疫)。該抗原可在經基因修飾之細胞中產生。編碼該抗原之DNA可為基因體或非基因體(例如，cDNA)且編碼該細胞外域之至少一部分。如本文使用，術語「部分」在抗原之內文中係指胺基酸或核酸之最小數量，適當地，以構成受關注之抗原之免疫原性抗原決定基。可使用適用於受關注之細胞之轉形之任何基因載體，包括(但不限於)腺病毒載體、質體及非病毒載體，諸如陽離子型脂質。在一個實施例中，本文之方法及組合物之抗體特異性結合受關注之FLT3之細胞外域之至少一部分。
本文提供之抗體或其抗原結合片段可構成「生物活性劑」或可為「生物活性劑」之一部分。如本文使用，術語「生物活性劑」係指結合抗原及/或增強或介導所需生物效應以增強殺死細胞之毒素之任何合成或天然生成之化合物。在一個實施例中，適用於本發明中之結 合片段係生物活性片段。如本文使用，術語「生物活性」係指抗體或抗體片段可結合所需抗原性抗原決定基並直接或間接發揮生物效應。直接效應包括(但不限於)生長信號之調整、刺激及/或抑制；抗凋亡信號之調整、刺激及/或抑制；凋亡或壞死信號之調整、刺激及/或抑制；ADCC級聯反應之調整、刺激及/或抑制；及CDC級聯反應之調整、刺激及/或抑制。
抗原結合蛋白之結合親和力係藉由結合常數(Ka)及解離常數(Kd)(KD=Kd/Ka)測定。該結合親和力可藉由BIACORE量測，例如，藉由將測試抗體捕獲於塗佈蛋白-A之感光表面上並使FLT3在此表面上流動。或者，該結合親和力可藉由FORTEBIO例如以將測試抗體受體捕獲於塗佈蛋白-A之針上並使FLT3在此表面上流動來量測。熟習此項技術者可識別此項技術中已知的其他合適之分析以量測結合親和力。
術語「特異性結合」(如本文使用關於抗原結合)蛋白質意謂該抗原結合蛋白結合至FLT3及FLT3內的離散域或離散胺基酸序列而不結合或非顯著結合至其他(例如，無關)蛋白質。然而，此術語不排除抗體或其結合片段亦可與緊密相關分子交叉反應之事實。本文描述之抗體或其片段及包含此等之抗體藥物結合物可以相較於其等結合至緊密相關分子之親和力大至少2、5、10、50、100或1000倍之親和力特異性結合至FLT3。
本文揭示之任何抗體(無論呈何種形式，例如呈抗體藥物結合物之形式)結合至FLT3可預期阻斷一些或全部FL結合至FLT3。然而，本文係非大體上抑制FL結合至FLT3之抗FLT3抗體。為「大體上抑制」結合，吾人將預期超過最低變化之可偵測量之結合減少；不涵蓋等於不超過將在無規隨機蛋白質蛋白質相互作用或非特異性抗體-抗原相互作用中預期之最低量結合之較小結合變化。量測抗體是否大體上抑制另一分子結合至靶抗原可使用生物物理性量測法或功能性量測法藉 由此項技術中已知的方法完成。例如，兩種蛋白質之相互作用可在物理結合分析(例如，參見實例14，下文)中直接量測或經由量測蛋白質相互作用之下游效應(諸如通過受體發信號或後續細胞效應(諸如細胞生長或細胞生長之抑制))之功能性分析間接量測。因此，本文揭示之非大體上抑制FL結合至FLT3之抗FLT3抗體不引起FL結合至FLT3之顯著減少且通過FLT3之FL結合之發信號係可偵測的。
「雙特異性」抗體亦適用於本發明方法及組合物中。如本文使用，術語「雙特異性抗體」係指對至少兩種不同抗原性抗原決定基具有結合特異性之抗體，其通常係單株抗體。在一個實施例中，該等抗原決定基來自相同抗原。在另一實施例中，該等抗原決定基來自兩種不同抗原。此項技術中已知用於製造雙特異性抗體之方法。例如，雙特異性抗體可使用兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對之共表現來重組產生。參見，例如，Milstein等人，Nature 305：537-39(1983)。或者，雙特異性抗體可使用化學鍵聯來製造。參見，例如，Brennan等人，Science 229：81(1985)。雙特異性抗體包括雙特異性抗體片段。參見，例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48(1993)、Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994)。
本文描述之單株抗體具體包括「嵌合性」抗體，其中重鏈及/或輕鏈之一部分係與衍生自特定種類或屬於特定抗體類別或子類之抗體中之相應序列相同或與衍生自特定種類或屬於特定抗體類別或子類之抗體中之相應序列同源，同時該(等)鏈之剩餘部分係與衍生自其他種類或屬於其他抗體類別或子類之抗體及此類抗體之片段中之相應序列相同或與衍生自其他種類或屬於其他抗體類別或子類之抗體及此類抗體之片段中之相應序列同源，只要其等特異性結合靶抗原及/或顯示所需生物活性(美國專利案第4,816,567號及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
如本文使用，術語「癌症」、「贅瘤」及「腫瘤」(交換使用且呈單數形式或複數形式)係指已經歷惡性轉化使得對宿主生物體產生病理性之細胞。藉由完全確立之技術(特定言之，病理學檢查)可易於區分原發性癌細胞(即，獲得自惡性轉化部位附近之細胞)及非癌性細胞。如本文使用，癌細胞之定義不僅包括原發性癌細胞，且包括衍生自癌細胞祖代之任何細胞。此包括轉移之癌細胞及衍生自癌細胞之活體外培養物及細胞系。當提及一種類型之癌症通常顯示為固體腫瘤時，「臨床可偵測」腫瘤係基於腫瘤質量例如，藉由諸如CAT掃描、MR成像、X射線、超音波或觸診等程序可偵測之腫瘤及/或因獲得自病患之樣品中之一或多種癌症特異性抗原之表現而可偵測之腫瘤。腫瘤可為造血性腫瘤，例如，血細胞之腫瘤或類似物，意謂液體腫瘤。基於此腫瘤之臨床病症之具體實例包括白血病(諸如慢性骨髓細胞性白血病或急性骨髓細胞性白血病)；骨髓瘤(諸如多發性骨髓瘤)；淋巴瘤及類似疾病。
術語「治療劑」係指提供治療利益及/或係如本文定義之治療有效之所有藥劑。治療劑可(例如)逆轉、減輕、緩解、抑制或限制疾病、失調症或病症之發展或減小疾病、失調症或病症之嚴重性，或影響或改善或減輕疾病(諸如癌症)之一或多種症狀。此種藥劑可為細胞毒性或細胞增殖抑制性。該術語包括(但不限於)化學治療劑、抗贅瘤劑及如本文定義之「藥物單元」藥劑。
術語「抗贅瘤劑」係指在贅瘤或癌症之治療中提供如本文定義之治療利益及/或治療有效之所有藥劑。
在採用如本文揭示之任何抗體藥物結合物及其醫藥組合物之一些實施例中，包含治療劑之抗體藥物結合物及其醫藥組合物亦有效治療前癌或至少一種前贅瘤細胞，例如防止惡性轉化為癌性細胞。在其他實施例中，該等一或多種抗贅瘤劑亦有效治療前癌或至少一種前贅 瘤細胞，例如防止惡性轉化為癌性細胞。
術語「化學治療劑」係指有效抑制腫瘤生長之所有化學化合物。化學治療劑之非限制性實例包括烷化劑，例如，氮芥、次乙亞胺化合物及烷基磺酸鹽；抗代謝物，例如，葉酸、嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲分裂抑制劑，例如，抗微管蛋白劑，諸如長春花生物鹼、奧瑞司他汀及鬼臼毒素之衍生物；細胞毒性抗生素；損害或妨礙DNA表現或複製之化合物，例如，DNA小溝結合劑；及生長因子受體拮抗劑。另外，化學治療劑包括細胞毒性劑(如本文定義)、抗體、生物分子及小分子。
術語「化合物」係指且包含化學化合物本身，及無論是否明確說明，且除非內文明確排除以下各物：該化合物之非晶形及晶形(包括多晶形)，其中此等形式可為混合物之一部分或可為孤立的；該化合物之游離酸及游離鹼形式，其等通常係本文提供之結構中顯示之形式；該化合物之異構物，其等係指光學異構物及互變異構性異構物，其中光學異構物包括鏡像異構物及非鏡像異構物、對掌性異構物及非對掌性異構物，及光學異構物包括經分離光學異構物及包括外消旋及非外消旋混合物之光學異構物之混合物；其中異構物可呈分離形式或呈與一或多種其他異構物混合之形式；該化合物之同位素，其等包括含氘-及含氚化合物，且包括含有放射性同位素之化合物，包括治療有效-及診斷有效之放射性同位素；該化合物之多聚形式，包括二聚、三聚等形式；該化合物之鹽，較佳係醫藥上可接受之鹽，包括酸加成鹽及鹼加成鹽，包括具有有機相對離子及無機相對離子之鹽，包括兩性離子形式，其中若化合物係與兩種或更多種相對離子結合，則該等兩種或更多種相對離子可相同或不同；及該化合物之溶劑合物，包括半溶劑合物、單溶劑合物、二溶劑合物等，包括有機溶劑合物及無機溶劑合物，該等無機溶劑合物包括水合物；其中若化合物係與兩 種或更多種溶劑分子結合，則該等兩種或更多種溶劑分子可相同或不同。在一些實例中，本文對本發明之化合物作出之參考將包括對上述形式(例如，鹽及/或溶劑合物)中之一或更多者作出之明確參考；然而，此種參考僅用於強調，且不應理解為排除如上文識別之其他上述形式。
此項技術中已知術語「互補決定區」及「CDR」係指抗體可變區內之胺基酸之非鄰接序列，其等賦予抗原特異性及結合親和力。一般而言，各重鏈可變區中具有三(3)個CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)及各輕鏈可變區中具有三(3)個CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。
給定CDR之精確胺基酸序列邊界可使用許多熟知方案中之任何一者易於測定，該等方案包括彼等以下描述者：Kabat等人，(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(「Kabat」編號方案)；Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948(「Chothia」編號方案)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996),「Antibody-antigen interactions：Contact analysis and binding site topography」，J.Mol.Biol.262,732-745.(「Contact」編號方案)；Lefranc MP等人，「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains」，Dev Comp Immunol,2003 Jan；27(1)：55-77(「IMGT」編號方案)及Honegger A與Plückthun A,「Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains：an automatic modeling and analysis tool」，J Mol Biol,2001 Jun 8；309(3)：657-70,(AHo編號方案)。
給定CDR之邊界可取決於用於識別之方案而變化。例如，Kabat方案係基於結構比對，而Chothia方案係基於結構資訊。用於Kabat及 Chothia方案兩者之編號係基於最常用之抗體區序列長度，及藉由插入字母調適插入物(例如，「30a」)及一些抗體中呈現刪除部分。兩種方案在不同位置放置某些插入物及刪除部分(「插入缺失(indel)」)導致差異性編號。Contact方案係基於對複合物結晶結構之分析且在許多態樣中類似於Chothia編號方案。下文表V列舉如分別藉由Kabat、Chothia及Contact方案識別之CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3之位置。就CDR-H1而言，殘基編號係使用Kabat及Chothia編號方案給定列表。
因此，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區(諸如可變區)之「CDR」及「互補決定區」及該抗體或其區之個別CDR(例如，「CDR-H1、CDR-H2)應瞭解為涵蓋如藉由本文描述之上述已知方案中之任何一者界定之互補決定區。在一些實例中，規定用於識別一或多個特定CDR之方案，諸如如藉由Kabat、Chothia或Contact方法界定之CDR。在其他情況下，給定CDR之特定胺基酸序列。參見，例如表V。
如本文使用，術語「保守取代」係指熟習此項技術者已知的胺基酸及/或胺基酸序列之取代且通常可經作出而不改變所得分子之生物活性。熟習此項技術者知曉(一般而言)多肽之非必需區域中之單一胺基酸取代不大體上改變生物活性(參見，例如，Watson等人，MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁(1987年第4版))。此類例示性取代係較佳根據彼等列舉於表II及表III(a至b)中者作出。例如，此類變化包括以異白胺酸(I)、纈胺酸(V)及白胺酸(L)中之任何一者取代此等疏水性胺基酸中之任何另一者；以天冬胺酸(D)取代麩胺酸(E)且反之亦然；以麩醯胺酸(Q)取代天冬醯胺酸(N)且反之亦然；及以絲胺酸(S)取代蘇胺酸(T)且反之亦然。其他取代亦可視為保守的，視特定胺基酸之環境及其於蛋 白質之三維結構中之作用而定。例如，甘胺酸(G)及丙胺酸(A)可經常交換使用，如丙胺酸(A)及纈胺酸(V)可經常交換使用。相對疏水之甲硫胺酸(M)可經常與白胺酸及異白胺酸交換使用，且有時可與纈胺酸交換使用。離胺酸(K)及精胺酸(R)在其中胺基酸殘基之顯著特徵係其電荷及此等兩種胺基酸殘基之相異pK不顯著之位置中可經常交換使用。在特定環境中，其他變化可視為「保守」(參見，例如本文之表III(a)，第13至15頁，「Biochemistry」，第2版，Lubert Stryer編，(Stanford University)；Henikoff等人，PNAS 1992，第89卷，第10915至10919頁；Lei等人，J Biol Chem，1995年5月19日；270(20)：11882-6)。其他取代亦容許且可根據經驗或根據已知保守取代判定。
術語「細胞毒性劑」係指抑制或預防細胞之表現活性、細胞之功能及/或引起細胞之破壞之物質。該術語意欲包括放射性同位素、化學治療劑及毒素(諸如細菌、真菌、植物或動物起源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/或變體)。細胞毒性劑之實例包括(但不限於)奧瑞司他汀(例如，奧瑞司他汀E、奧瑞司他汀F、MMAE及MMAF)、金黴素(auromycin)、美登素類、蓖麻毒蛋白(ricin)、蓖麻毒蛋白A鏈、考布他汀(combrestatin)、多卡米新(duocarmycin)、海兔毒素、多柔比星、道諾黴素(daunorubicin)、紫杉醇、順鉑、cc1065、溴化乙錠(ethidium bromide)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼、長春花鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicine)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、放線菌素(actinomycin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、假單胞菌屬外毒素(Pseudomonas exotoxin)(PE)A、PE40、相思子素(abrin)、相思子素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈(modeccin A chain)、α-八疊球菌(alpha-sarcin)、白樹毒素(gelonin)、絲林黴素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素 (enomycin)、麻風樹毒蛋白(curicin)、巴豆毒蛋白(crotin)、卡奇黴素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制劑及糖皮質素(glucocorticoid)及其他化學治療劑，及放射性同位素，諸如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或213、P32、Lu之放射性同位素(包括Lu177)且本發明之毒素表示為AGD-0182。
抗體(包括本發明之抗體)亦可結合至前述細胞毒性劑中之任何一者且亦可結合至可使前藥轉化為其活性形式之抗癌前藥活化酶。
如本文使用，術語「雙功能抗體」係指具有兩種抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含在相同多肽鏈(VH-VL)中連接至輕鏈可變域(VL)之重鏈可變域(VH)。藉由使用太短以至於無法在相同鏈上之兩個域間配對之連接子，迫使該等域與另一鏈之互補域配對並產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更完整地描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-48(1993)中。
術語「耗盡」在FLT3結合劑對FLT3表現細胞之效應之內文中係指減少FLT3表現細胞之數量或消除FLT3表現細胞。出於本發明之目的，FLT3(a.k.a.、Fms樣酪胺酸激酶3受體，亦稱為Flk2(胎肝激酶2)、STK1(幹細胞酪胺酸激酶1)及CD135)係III型受體酪胺酸激酶(RTK)中之一員。人類FLT3編碼具有993個胺基酸長度之RTK，其包含具有五個類免疫球蛋白細胞外域及兩個藉由激酶插入域連接之細胞內酪胺酸激酶域(TKD)之膜結合受體(Stirewalt D L等人；Nat Rev Cancer；650-665(2003)。人類FLT3基因(Gene ID No.：2322(國家生物技術資訊中心))位於染色體13q12上並與小鼠FLT3共用85%之胺基酸序列同源性(Rosnet O等人；Oncogene 8：173-179(1993)。FLT3表現於正常骨髓性及類淋巴性祖代細胞中且70-90% AML病患之白血病性細胞亦表現(Carow,C.E等人；Blood 87：1089-1096(1996)；Rosnet O等 人；Leukemia 10：238-248(1996)且亦表現於ALL中。
本文使用術語「基因產物」以指示肽/蛋白質或mRNA。例如，本文中「本發明之基因產物」有時係指「癌症胺基酸序列」、「癌症蛋白質」、「表I中所列癌症之蛋白質」、「癌症mRNA」、「表I中所列癌症之mRNA」等。在一個實施例中，該癌症蛋白質係藉由圖1之核酸編碼。該癌症蛋白質可為片段，或者可為藉由圖1之核酸編碼之全長蛋白質。在一個實施例中，癌症胺基酸序列係用以測定序列同一性或相似性。在另一實施例中，該等序列係藉由圖1之核酸編碼之蛋白質之天然生成之對偶基因變體。在另一實施例中，該等序列係如本文進一步描述之序列變體。
「雜結合物」抗體適用於本發明方法及組合物中。如本文使用，術語「雜結合物抗體」係指兩個共價連接之抗體。此類抗體可使用合成蛋白化學中之已知方法製得，包括使用交聯劑。參見，例如，美國專利案第4,676,980號。
術語「同源物」係指藉由例如在相應位置具有相同或類似之化學殘基之序列而對另一分子顯示同源性之分子。
術語「相同」或「序列一致性」指示當經最佳化比對且與適當之插入或刪除相比時，兩個核酸或兩個胺基酸序列間之一致性程度。
兩個序列間之「一致性百分率」係由該等序列共用之相同位置之數量之函數(即，一致性%=相同位置之數量/總位置數量乘以100)，需考慮間隙之數量，及各間隙之長度，其等需引入以用於兩個序列之最佳化比對。序列之比較及兩個序列間之一致性百分率之測定可使用如下文描述之數學演算法完成。
兩個核苷酸序列間之一致性百分率可使用GCG軟體程式包中之GAP程式，使用NWSgapdna測定。CMP矩陣及間隙權重40、50、60、70或80且長度權重1、2、3、4、5或6。兩個核苷酸或胺基酸序列間之 一致性百分率亦可使用Meyers等人，Comput.Appi.Biosci.,4：11-17(1988)之演算法測定，該演算法已併入ALIGN程式(版本2.0)中，該程式使用PAM120重量殘差表、間隙長度罰分12及間隙罰分4。另外，兩個胺基酸序列間之一致性百分率可使用Needleman等人，J.Mol.Biol.48：444-453(1970)演算法測定，該演算法已併入GCG軟體程式包之GAP程式中，該程式使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣及間隙權重16、14、12、10、8、6或4及長度權重1、2、3、4、5或6。
例如，多核苷酸序列可與參考多核苷酸序列相同(即，100%相同於參考序列)，或其相較於參考序列可包括多達某一整數量之核苷酸改變，諸如至少50、60、70、75、80、85、90、95、98或99%一致性。此類改變係選自至少一種核苷酸刪除、取代(包括轉化及顛換)或插入，且其中該等改變可發生於參考核苷酸序列之5'或3'端位置或發生於彼等端位置者間之任何位置，或者個別地穿插於參考序列中之核苷酸間或參考序列內之一或多個連續性基團間。核苷酸改變之數量係藉由將如本文描述之參考多核苷酸序列中之核苷酸之總數乘以各自一致性百分率(除以100)之數值百分率並自參考多核苷酸序列中之核苷酸之該總數減去該乘積測得，或：n.sub.n.ltoreq.x.sub.n-(x.sub.ny)，其中n.sub.n係核苷酸改變之數量，x.sub.n係如本文描述之參考多核苷酸序列中之核苷酸之總數(參見用於例示性參考多核苷酸序列之「序列表」中之核酸序列)，且y針對50%係0.50；針對60%係0.60；針對70%係0.70；針對75%係0.75；針對80%係0.80；針對85%係0.85；針對90%係0.90；針對95%係0.95；針對98%係0.98；針對99%係0.99或針對100%係1.00，y係用於乘法運算子之標誌，且其中x.sub.n與y之任何非整數乘積四捨五入為最接近之整數，接著將其自x.sub.n中減去。
類似地，多肽序列可與如本文描述之多肽參考序列相同(參見用於例示性參考多肽序列之「序列表」中之胺基酸序列)(即，100%相 同)，或其相較於參考序列可包括多達某一整數量之胺基酸改變以使得該一致性%小於100%，諸如至少50、60、70、75、80、85、90、95、98或99%相同。此類改變係選自由以下各物組成之群：至少一種胺基酸刪除、取代(包括保守取代或非保守取代)或插入，且其中該等改變可發生於參考多肽序列之胺基端或羧基端位置或發生於彼等端位置者間之任何位置，或個別地穿插於參考序列中之胺基酸間或參考序列內之一或多個連續性基團間。給定一致性%之胺基酸改變之數量係藉由將由多肽參考序列編碼之多肽序列中之胺基酸之總數乘以各自一致性百分率(除以100)之數值百分率及然後自如本文描述之多肽參考序列(參見，例如SEQ ID NO：1至21)中之胺基酸之該總數中減去該乘積來測定，或：n.sub.a.ltoreq.x.sub.a-(x.sub.ay)，其中n.sub.a係胺基酸改變之數量，x.sub.a係參考多肽序列中之胺基酸之總數，及y針對50%係0.50；針對60%係0.60；針對70%係0.70；針對75%係0.75；針對80%係0.80；針對85%係0.85；針對90%係0.90；針對95%係0.95；針對98%係0.98；針對99%係0.99或針對100%係1.00，y係用於乘法運算子之標誌，且其中x.sub.a與y之任何非整數乘積在將其自x.sub.a中減去前四捨五入為最接近之整數。
一致性百分率可跨過序列長度測定。如本文定義，術語「超過75%一致性」包括超過75%、80%、85%、95%及99%一致性及所有離散值及離散子範圍在此範圍中。
在一個實施例中，本文提供之抗體係「人類抗體」。如本文使用，術語「人類抗體」係指其中基本上輕鏈及重鏈序列之全部序列(包括互補決定區(CDR))來自人類基因之抗體。在一個實施例中，人類單株抗體係藉由三源雜交瘤(trioma)技術、人類B細胞技術(參見，例如，Kozbor等人，Immunol.Today 4：72(1983)、EBV轉形技術(參見，例如，Cole等人，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY 77-96(1985))或使用噬菌體顯示(參見，例如，Marks等人，J.Mol.Biol.222：581(1991))製得。在一具體實例中，該人類抗體產生於基因轉殖小鼠中。用於製造此類部分至完全人類抗體之技術係此項技術中已知且可使用任何此類技術。根據一項特別佳實施例，完全人類抗體序列係在經改造以表現人類重鏈及輕鏈抗體基因之基因轉殖小鼠中製造。製造產生人類抗體之基因轉殖小鼠及其子代之例示性描述參見申請案第WO 02/43478號及美國專利案6,657,103(Abgenix)。產生所需抗體之基因轉殖小鼠之B細胞然後可經融合以製造用於該抗體之連續產生之融合瘤細胞系。參見，例如，美國專利案第5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016及5,545,806號及Jakobovits,Adv.Drug Del.Rev.31：33-42(1998)、Green等人，J.Exp.Med.188：483-95(1998)。
如本文使用，術語「人類化抗體」係指含有來自非人類(例如，鼠類)抗體及人類抗體之序列之抗體之形式。此類抗體係含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列之嵌合性抗體。一般而言，該人類化抗體將包含大體上所有至少一個及通常兩個可變域，其中所有或大體上所有高可變環對應於非人類免疫球蛋白之高可變環且所有或大體上所有FR區係人類免疫球蛋白序列之FR區。該人類化抗體視需要亦將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常係人類免疫球蛋白之免疫球蛋白恆定區。參見，例如，Cabilly美國專利案第4,816,567號；Queen等人，(1989)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033；及ANTIBODY ENGINEERING：A PRACTICAL APPROACH(Oxford University Press 1996)。
如本文使用之術語「抑制」意謂以可量測之量減少或徹底預防。
片語「分離」或「生物上純正」係指材料大體上或基本上不含 當該材料以天然狀態發現時通常伴隨該材料之組分。因此，本發明之經分離肽較佳不含有在其等原位環境中通常與該等肽結合之材料。例如，當多核苷酸大體上與對應於或互補於除FLT3基因外之基因或編碼除FLT3基因產物或其片段外之多肽之污染物多核苷酸分離時，認為該多核苷酸經「分離」。熟習技工可易於採用核酸分離程序以獲得經分離FLT3多核苷酸。例如，當採用物理、機械或化學方法以自通常與蛋白質結合之細胞成分中移除FLT3蛋白時，認為該蛋白質經「分離」。熟習技工可易於採用標準純化方法以獲得經分離FLT3蛋白。或者，可藉由化學方式製得經分離蛋白。
合適之「標記」包括放射性核素、酶、受質、輔助因子、抑制劑、螢光部分、化學發光部分、磁粒子及類似物。教示此類標記之用途之專利案包括美國專利案第3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149及4,366,241號。另外，本文提供之抗體可用作含氟體之抗原結合組分。參見，例如，Zeytun等人，Nat.Biotechnol.21：1473-79(2003)。
術語「哺乳動物」係指歸類為哺乳動物之任何生物體，包括小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、馬及人類。在本發明之一個實施例中，該哺乳動物係小鼠。在本發明之另一實施例中，該哺乳動物係人類。
術語「轉移性癌症」及「轉移性疾病」意謂已擴散至區域性淋巴結或擴散至較遠部位之癌症，且其等意謂包括在根據AUA系統之D期疾病及在根據TNM系統之TxNxM+期。
如本文使用之術語「經修飾」係指存在對天然胺基酸、非天然胺基酸、天然胺基酸多肽或非天然胺基酸多肽之改變。此類改變或修飾可藉由天然胺基酸、非天然胺基酸、天然胺基酸多肽或非天然胺基酸多肽之合成後修飾或藉由天然胺基酸、非天然胺基酸、天然胺基酸多肽或非天然胺基酸多肽之轉譯後修飾獲得。
如本文使用之術語「調節劑」或「測試化合物」或「藥物候選者」或語法性等同物描述待用於測試直接或間接改變癌症表型或癌症序列(例如，核酸或蛋白質序列)之表現或癌症序列之效應(例如，發信號、基因表現、蛋白質相互作用等)之能力之任何分子(例如，蛋白質、寡肽、有機小分子、多醣、多核苷酸等)。在一個態樣中，調節劑將中和本發明之癌症蛋白質之效應。關於「中和」，其意謂抑制或阻斷蛋白質之活性及對該細胞之後續效應。在另一態樣中，調節劑將藉由標準化該蛋白質之含量來中和本發明之基因及其相應蛋白質之效應。在較佳實施例中，調節劑改變表現分佈或本文提供之表現分佈核酸或蛋白質或下游效應路徑。在一個實施例中，該調節劑將癌症表型抑制(例如)至正常組織指紋。在另一實施例中，調節劑誘發癌症表型。通常，複數種分析混合物以不同藥劑濃度平行操作以獲得對各種濃度之差異反應。通常，此等濃度中之一者充當陰性對照，即，以零濃度或低於偵測之濃度。
調節劑、藥物候選者或測試化合物涵蓋許多化學類別，然而通常其等係有機分子，較佳係具有大於100並小於約2,500道爾頓之分子量之小有機化合物。較佳之小分子係小於2000或小於1500或小於1000或小於500 D。候選者藥劑包含與蛋白質進行結構性相互作用(特定言之，氫鍵結合)所必需之官能基且通常包括至少一個胺基、羰基、羥基或羧基，較佳該等化學官能基中之至少兩者。該等候選者藥劑通常包含環碳或雜環結構及/或經上述官能基中之一或多者取代之芳族或聚芳族結構。調節劑亦包含生物分子，諸如肽、醣、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結構性類似物或其組合。特別佳係肽。調節劑之一種類別係肽，例如具有約5個至約35個胺基酸，具有約5個至約20個胺基酸較佳，且具有約7個至約15個胺基酸特別佳。較佳地，該癌症調節蛋白係可溶，包括非跨膜區，及/或具有N端Cys以有助於 溶解度。在一個實施例中，該片段之C端保持為游離酸及N端係游離胺以有助於偶合，即，偶合至半胱胺酸。在一個實施例中，本發明之癌症蛋白質結合至如本文討論之免疫原性藥劑。在一個實施例中，該癌症蛋白質結合至BSA。本發明之肽(例如，具有較佳長度之肽)可彼此相連或連接至其他胺基酸以產生較長之肽/蛋白質。該等調節肽可為如上文概述之天然生成蛋白質之消化物、隨機肽或「偏向性」隨機肽。在一較佳實施例中，基於肽/蛋白質之調節劑係如本文定義之抗體及其片段。
如本文使用，術語「單株抗體」係指獲得自大體上同源性抗體之群體之抗體，即，包含除可少量存在之可能天然生成突變外相同之群體之個別抗體。單株抗體係高度特異性的、導向單一抗原性抗原決定基。對比之下，習知(多株)抗體製劑通常包括大量導向不同抗原決定基(或對不同抗原決定基具有特異性)之抗體。在一個實施例中，該多株抗體含有複數種在含有多種抗原性抗原決定基之單一抗原內具有不同抗原決定基特異性、親和力或結合性之單株抗體。修飾詞「單株」指示抗體之特徵為獲得自抗體之大體上同源性群體，且不應理解為需藉由任何特定方法產生該抗體。例如，待根據本發明使用之單株抗體可首先藉由Kohler等人，Nature 256：495(1975)描述之融合瘤方法製得，或可藉由重組DNA方法(參見，例如，美國專利案第4,816,567號)製得。該等「單株抗體」亦可(例如)使用Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中描述之技術分離自噬菌體抗體庫。此等單株抗體將通常以至少約1μM，更通常至少約300nM，通常至少約30nM，較佳至少約10nM，更佳至少約3nM或更大之Kd結合，該Kd通常藉由ELISA測得。
如本文使用，術語「單株抗體」係指獲得自大體上同源性抗體之群體之抗體，即，包含除可少量存在之可能天然生成突變外相同之 群體之個別抗體。單株抗體係高度特異性的、導向單一抗原性抗原決定基。對比之下，習知(多株)抗體製劑通常包括大量導向不同抗原決定基(或對不同抗原決定基具有特異性)之抗體。在一個實施例中，該多株抗體含有複數種在含有多種抗原性抗原決定基之單一抗原內具有不同抗原決定基特異性、親和力或結合性之單株抗體。修飾詞「單株」指示抗體之特徵為獲得自抗體之大體上同源性群體，且不應理解為需藉由任何特定方法產生該抗體。例如，待根據本發明使用之單株抗體可首先藉由Kohler等人，Nature 256：495(1975)描述之融合瘤方法製得，或可藉由重組DNA方法(參見，例如，美國專利案第4,816,567號)製得。該等「單株抗體」亦可(例如)使用Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中描述之技術分離自噬菌體抗體庫。此等單株抗體將通常以至少約1μM，更通常至少約300nM，通常至少約30nM，較佳至少約10nM，更佳至少約3nM或更大之Kd結合，該Kd通常藉由ELISA測得。
「非天然胺基酸」或另外寫為「nnAA」係指非二十(20)種常見胺基酸或焦離胺酸或硒半胱胺酸中之一者之胺基酸。可與術語nnAA同義使用之其他術語係「非天然編碼之胺基酸」、「非天然胺基酸」、「非天然生成之胺基酸」。另外，術語nnAA包括(但不限於)非天然生成之胺基酸且可合成獲得或可藉由非天然胺基酸之修飾獲得之胺基酸。例如，出於本發明之目的，對乙醯基苯丙胺酸視為nnAA。
術語「對乙醯基苯丙胺酸」或「pAF」意謂如藉由以下化學結構表示之3-(4-乙醯基苯基)-2-胺基丙酸：
「醫藥賦形劑」包含諸如輔助劑、載劑、pH調節劑及緩衝劑、 張力調節劑、潤濕劑、防腐劑等材料。
「醫藥上可接受」係指非毒性、惰性的及/或與人類或哺乳動物可生理性相容之組合物。
術語「多核苷酸」意謂具有至少10個鹼基或鹼基對長度之核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)之聚合形式或任一類型核苷酸之經修飾形式，且其意謂包括DNA及/或RNA之單股及雙股形式。在此項技術中，此術語通常與「寡核苷酸」交換使用。多核苷酸可包含本文揭示之核苷酸序列，其中如圖1中之實例顯示之胸苷(T)亦可為尿嘧啶(U)；此定義適用於在DNA與RNA之化學結構間之差異，特定言之，經觀察，RNA中之四個主要鹼基中之一者係尿嘧啶(U)而非胸苷(T)。
術語「多肽」意謂具有至少約4、5、6、7或8個胺基酸之聚合物。在整個說明書中，使用用於胺基酸之標準三個字母(參見，表III)或單一字母命名。在此項技術中，此術語通常與「肽」或「蛋白質」交換使用。
「重組」DNA或RNA分子係已經受活體外分子操作之DNA或RNA分子。
如本文使用，術語「單鏈Fv」或「scFv」或「單鏈」抗體係指包含抗體之VH及VL域之抗體片段，其中此等域存在於單一多肽鏈中。通常，該Fv多肽進一步包含在VH與VL域間之多肽連接子，其使得sFv形成用於抗原結合所需之結構。回顧sFv，參見THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269至315頁(1994)。
如本文使用，術語「特異性」、「特異性結合(specifically bind及bind specifically)」係指抗體選擇性結合至靶抗原抗原決定基。可藉由在一組給定條件下比較結合至適當之抗原與結合至無關抗原或抗原 混合物測試抗體之結合特異性。若該抗體結合至適當之抗原至少2、5、7及較佳10倍於結合至無關抗原或抗原混合物，則認為該抗體係特異性的。在一個實施例中，特異性抗體係僅結合FLT3抗原但不結合至無關抗原之抗體。在另一實施例中，特異性抗體係結合人類FLT3抗原但不結合與FLT3抗原具有70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大之胺基酸同源性之非人類FLT3抗原之抗體。在另一實施例中，特異性抗體係結合人類FLT3抗原但不結合與FLT3抗原之胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大一致性百分率之非人類FLT3抗原之抗體。在另一實施例中，特異性抗體係結合人類FLT3抗原及結合鼠類FLT3抗原，但結合人類抗原之程度更大之抗體。在另一實施例中，特異性抗體係結合人類FLT3抗原及結合靈長類動物FLT3抗原，但結合人類抗原之程度更大之抗體。在另一實施例中，該特異性抗體結合至人類FLT3抗原及任何非人類FLT3抗原，但結合人類抗原或其任何組合之程度更大。
如本文使用，「以治療」或「治療性」及語法相關術語係指疾病之任何結果之任何改善，諸如延長之存活率、較小之發病率及/或作為替代治療方法之副產物之副作用降低；如此項技術中易於瞭解，完全根除疾病雖非治療行為之要求，但較佳。
術語「變體」係指顯示自所述類型或正常型變異之分子，諸如在明確描述之蛋白質(例如，顯示於圖1中之FLT3蛋白)之相應位置具有一或多個不同胺基酸殘基之蛋白質。類似物係變體蛋白之實例。接合異型體及單核苷酸多態型(SNP)係變體之其他實例。
本發明之「FLT3蛋白」及/或「FLT3相關蛋白」包括彼等本文明確識別者(參見，圖1)及遵循本文概述之方法或此項技術中易於獲得 之方法不經過度實驗下即可分離/產生及表徵之對偶基因變體、保守取代變體、類似物及同源物。亦包括組合不同FLT3蛋白或其片段之部分之融合蛋白，以及FLT3蛋白與異源性多肽之融合蛋白。此類FLT3蛋白共同稱為FLT3相關蛋白、本發明之蛋白質或FLT3。術語「FLT3相關蛋白」係指具有以下數目胺基酸之多肽片段或FLT3蛋白序列：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或多於25個胺基酸；或至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、991、992或993或更多個胺基酸。
II.)FLT3抗體
本發明之另一態樣提供結合至FLT3相關蛋白(參見圖1)之抗體。在一個實施例中，該結合至FLT3相關蛋白之抗體係特異性結合至包含SEQ ID NO.：2之胺基酸序列之FLT3蛋白之抗體。該特異性結合至包含SEQ ID NO.：2之胺基酸序列之FLT3蛋白之抗體包括可結合至其他FLT3相關蛋白之抗體。例如，結合包含SEQ ID NO.：2之胺基酸序列之FLT3蛋白之抗體可結合諸如FLT3變體及其同源物或類似物等FLT3相關蛋白。
本發明之FLT3抗體尤其適用於癌症(參見，例如，表I)預後分析、成像、診斷及治療方法。在一個實施例中，本文揭示之FLT3結合分析用於癌症之偵測中，例如，用於免疫分析中。類似地，此類抗體(例如，當與治療劑組合於ADC中時)適用於急性骨髓性白血病 (「AML」)及急性淋巴母細胞性白血病(ALL)及其他癌症之治療及/或預後，達FLT3亦於此等其他癌症中表現或過表現之程度。此外，細胞內表現之抗體(例如，單鏈抗體)在治療上適用於治療其中涉及FLT3表現之癌症，諸如晚期或轉移性AML或ALL癌症或其他晚期或轉移性癌症。
此項技術中熟知用於製造抗體(具體言之，單株抗體)之各種方法。例如，抗體可藉由使用FLT3相關蛋白、肽或片段(呈經分離或免疫結合形式)，使合適之哺乳動物宿主免疫化來製備(Antibodies：A Laboratory Manual,CSH Press編，Harlow與Lane(1988)；Harlow,Antibodies,Cold Spring Harbor Press,NY(1989))。另外，亦可使用FLT3之融合蛋白，諸如FLT3 GST-融合蛋白。在一特定之實施例中，產生包含圖1之胺基酸序列之全部或大部分之GST融合蛋白，且然後用作免疫原以產生適當之抗體。在另一實施例中，合成FLT3相關蛋白並用作免疫原。
另外，使用此項技術中已知的裸DNA免疫技術(有或無經純化之FLT3相關蛋白或FLT3表現細胞)以產生對經編碼之免疫原之免疫反應(檢視，參考Donnelly等人，1997,Ann.Rev.Immunol.15：617-648)。
可分析如顯示於圖1中之FLT3蛋白之胺基酸序列以選擇FLT3蛋白之特異性區以用於產生抗體。例如，FLT3胺基酸序列之疏水性及親水性分析用以識別FLT3結構中之親水性區。FLT3蛋白之顯示免疫原性結構之區及其他區與域可使用此項技術中已知的各種其他方法諸如Chou-Fasman、Garnier-Robson、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-Schultz或Jameson-Wolf分析易於識別。親水性概況可使用Hopp,T.P.及Woods,K.R.,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828之方法產生。水療性(Hydropathicity)概況可使用Kyte,J.及Doolittle,R.F.,1982,J.Mol.Biol.157：105-132之方法產生。可及殘基百分率(%)概況 可使用Janin J.,1979,Nature 277：491-492之方法產生。平均可撓性概況可使用Bhaskaran R.,Ponnuswamy P.K.,1988,Int.J.Pept.Protein Res.32：242-255之方法產生。β-轉角概況可使用Deleage,G.,Roux B.,1987,Protein Engineering 1：289-294之方法產生。因此，藉由此等程序或方法中之任何一者所識別之各區域在本發明之範圍內。用於產生FLT3抗體之較佳方法係以文中提供的實例方式進一步說明。此項技術中熟知用於製造作為免疫原使用之蛋白質或多肽之方法。此項技術中亦熟知用於製造具有蛋白質與載劑(諸如BSA、KLH或其他載體蛋白)之免疫原性結合物之方法。在一些情況下，使用直接結合，使用例如碳二亞胺試劑；在其他情況下，連接試劑(諸如彼等由Pierce Chemical Co.,Rockford,IL供應者)係有效的。如此項技術中瞭解，FLT3免疫原之投與通常藉由注射一段合適之時間並使用合適之輔助劑進行。在免疫時間表期間，可獲得抗體之效價以測定抗體形成之充分性。
FLT3單株抗體可藉由此項技術中熟知之各種方式製造。例如，分泌所需單株抗體之永生化細胞系係使用產生抗體之B細胞永生化之Kohler及Milstein之標準融合瘤技術或修飾來製造，如通常已知。藉由其中抗原係FLT3相關蛋白之免疫分析篩選分泌所需抗體之永生化細胞系。當識別經適當永生化細胞培養物時，該等細胞可擴增且自活體外培養物或自腹水流體產生抗體。
本發明之抗體或片段亦可藉由重組方式產生。特異性結合至FLT3蛋白之所需區域之區域亦可產生於多物種起源之嵌合性或互補決定區(CDR)接枝抗體之情況。亦可產生人類化或人類FLT3抗體且較佳用於治療性情況。藉由以一或多種非人類抗體CDR取代相應人類抗體序列而使鼠類及其他非人類抗體人類化之方法係熟知(參見，例如，Jones等人，1986,Nature 321：522-525；Riechmann等人，1988, Nature 332：323-327；Verhoeyen等人，1988,Science 239：1534-1536)。亦參見Carter等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285及Sims等人，1993,J.Immunol.151：2296。
在一較佳實施例中，本發明之人類單株抗體可使用VelocImmune小鼠製造，在該小鼠中，在免疫球蛋白重鏈(VH、DH及JH區段)及/或κ輕鏈(VK及JK)基因座處具有內源性小鼠可變區段之基因體序列已全部或部分經具有人類免疫球蛋白重鏈(VH、DH及JH)及/或κ輕鏈(VK及JK)基因座(Regeneron,Tarrytown,NY)之未經重排之生殖系可變嵌段之人類基因體序列置換。參見，例如，美國專利案第6,586,251、6,596,541、7,105,348、6,528,313、6,638,768及6,528,314號。
另外，本發明之人類抗體可使用HuMAb小鼠(Medarex,Inc.)產生，該HuMAb小鼠含有編碼未經重排之人類重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因迷你基因座，以及使內源性μ及κ鏈基因座失活之靶向突變(參見，例如，Lonberg等人，(1994)Nature 368(6474)：856-859)。
在另一實施例中，本發明之完全人類抗體可使用於轉基因及轉染色體上攜載人類免疫球蛋白序列之小鼠(諸如攜載人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠)來培育。本文將此類小鼠稱為「KM小鼠」，此類小鼠描述於Tomizuka等人，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727及Tomizuka等人之PCT公開案WO 02/43478中。
本發明之人類單株抗體亦可使用用於篩選人類免疫球蛋白基因庫之噬菌體顯示方法製造。此項技術中建立用於分離人類抗體之此類噬菌體顯示方法。參見，例如Ladner等人之美國專利案第5,223,409；5,403,484及5,571,698號；Dower等人之美國專利案第5,427,908及5,580,717號；McCafferty等人之美國專利案第5,969,108及6,172,197號及Griffiths等人之美國專利案第5,885,793；6,521,404；6,544,731； 6,555,313；6,582,915及6,593,081號。
本發明之人類單株抗體亦可使用已將人類免疫細胞重新組構於其中以使得可在免疫作用後產生人類抗體反應之SCID小鼠來製造。此類小鼠描述於(例如)Wilson等人之美國專利案第5,476,996及5,698,767號中。
另外，本發明之人類抗體可以使用針對抗體產生失活、用稱為Xenomouse(Amgen Fremont,Inc.,formerly Abgenix,Inc.)之人類重鏈及輕鏈基因座改造之基因轉殖小鼠之技術來製造。製造產生人類抗體之基因轉殖小鼠之例示性描述可參見U.S.6,657,103。亦參見美國專利案第5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016及5,545,806號；及Mendez等人，Nature Genetics,15：146-156(1998)；Kellerman,S.A.& Green,L.L.,Curr.Opin.Biotechnol 13,593-597(2002)。
上述產生方法中之任何一者導致具有一定結合FLT3、或相對於FLT3具有85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%之序列一致性之同源物或片段或多肽序列之能力之抗體。該等抗體、其結合片段及包含其之抗體藥物結合物針對FLT3之結合親和力(KD)可為1mM或更小、100nM或更小、10nM或更小、2nM或更小或1nM或更小。或者，該KD可為5至10nM；或1至2nM。該KD可為1微莫耳至500微莫耳或可為500微莫耳至1nM。
該抗原結合蛋白之結合親和力係藉由結合常數(Ka)及解離常數(Kd)(KD=Kd/Ka)測定。該結合親和力可藉由BIACORE例如藉由將測試抗體捕獲於經蛋白A塗佈之感光表面上並使FLT3在此表面上流動來量測。或者，該結合親和力可藉由FORTEBIO例如以將測試抗體受體捕獲於經塗佈蛋白A之針上並使FLT3在此表面上流動來量測。熟習此項技術者可識別此項技術中已知的其他合適之分析以量測結合親和力。
術語「特異性結合」(如本文使用關於抗原結合)蛋白質意謂該抗原結合蛋白結合至FLT3及FLT3內的離散域或離散胺基酸序列而不結合或非顯著結合至其他(例如，無關)蛋白質。然而，此術語不排除抗體或其結合片段亦可與緊密相關分子交叉反應之事實。本文描述之抗體及其片段及包含此等抗體之抗體藥物結合物可以相較於其等結合至緊密相關分子之親和力大至少2、5、10、50、100或1000倍之親和力特異性結合至FLT3。
在一較佳實施例中，本發明之FLT3 MAb包含藉由根據美國菌種保存中心(ATCC)登錄號：PTA-121831(參見，圖3A及/或3B)存放之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生之命名為CHv62.21之抗體之重鏈及輕鏈可變區，或包含與CHv62.21之重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列同源之胺基酸序列之重鏈及輕鏈可變區，且其中該等抗體保留本發明之FLT3 MAb之所需功能性質。CHv62.21之重鏈可變區由自SEQ ID NO：9之第1個殘基(E)至第123個殘基(S)範圍內之胺基酸序列組成，及CHv62.21之輕鏈可變區由SEQ ID NO：10之第1個殘基(D)至第108個殘基(R)範圍內之胺基酸序列組成。CHv62.21之重鏈可變區之CDR1-3(Kabat)由分別自SEQ ID NO：9之31至35範圍內；自50至65範圍內及自95至102範圍內之胺基酸序列組成，及CHv62.21之輕鏈可變區之CDR1-3(Kabat或Chothia)由分別自SEQ ID NO：10之24至34範圍內；自50至56範圍內及自89至97範圍內之胺基酸序列組成(參見，圖4及表V)。就本發明之抗體之恆定區而言，可選擇恆定區之任何子類別。在一個實施例中，可使用人類IgG1恆定區作為該重鏈恆定區及人類Ig κ恆定區作為該輕鏈恆定區。
例如，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中：(a)該重鏈可變區包含與如圖3A及/或3B中闡述之重鏈可變區胺基 酸序列相同至少80%之胺基酸序列；及(b)該輕鏈可變區包含與如圖3A及/或3B中闡述之輕鏈可變區胺基酸序列相同至少80%之胺基酸序列。
在其他實施例中，該等VH及/或VL胺基酸序列與圖3A及/或3B中闡述之VH及VL序列相同至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。本發明亦提供編碼a或b或圖3A及/或3B中闡述之VH或VL序列之多核苷酸或核酸及與此等相同85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之多核苷酸或核酸。
在另一實施例中，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含人類化重鏈可變區及人類化輕鏈可變區，其中：(a)該重鏈可變區包含具有圖3A及/或3B中闡述之重鏈可變區CDR之胺基酸序列之互補決定區(CDR)；(b)該輕鏈可變區包含具有圖3A及/或3B中闡述之輕鏈可變區CDR之胺基酸序列之CDR。
本發明之經改造之抗體包括彼等其中已對VH及/或VL內之框架殘基作出修飾(例如，以改善抗體之性質)者。通常作出此類框架修飾以減小抗體之免疫原性。例如，一種方法係將一或多個框架殘基「突變回(backmutate)」至相應之生殖系序列。更具體言之，已經歷體細胞突變之抗體可含有不同於衍生該抗體之生殖系序列之框架殘基。此類殘基可藉由比較抗體框架序列與衍生該抗體之生殖系序列識別。為使框架區序列返回至其等生殖系組態，該等體細胞突變可藉由(例如)定點突變形成或PCR介導之突變形成「突變回」至生殖系序列(例如，自白胺酸「突變回」至甲硫胺酸)。此類經「突變回」之抗體亦旨在包含於本發明內。
另一類型之框架修飾涉及在框架區內或甚至在一或多個CDR區內 突變一或多個殘基，以移除T細胞抗原決定基，藉此減小抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫化(deimmunization)」並詳細描述於Carr等人之美國專利公開案第2003/0153043號中。
另外或或者為在框架或CDR區內作出修飾，本發明之抗體可經改造以包括Fc區內之修飾，通常改變抗體之一或多種功能性質，諸如血清半衰期、補體固定(complement fixation)、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本發明之FLT3 MAb可經化學修飾(例如，可將一或多個化學部分結合至抗體)或經修飾以改變其醣化，再改變MAb之一或多種功能性質。此等實施例中之各者詳細描述於下文中。
在一個實施例中，CH1之鉸鏈區係經修飾以使得該鉸鏈區中之半胱胺酸殘基之數量得到改變(例如，增加或減少)。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利案第5,677,425號中。CH1之鉸鏈區中之半胱胺酸殘基之數量係經改變(例如)以促進輕鏈及重鏈之組裝或增加或減小FLT3 MAb之穩定性。
在另一實施例中，抗體之Fc鉸鏈區係經突變以減小FLT3 MAb之生物半衰期。更具體言之，將一或多種胺基酸突變引入Fc鉸鏈片段之CH2-CH3域介面區內以使得該抗體相對於天然Fc鉸鏈域SpA結合已損害葡萄球菌蛋白A(Staphylococcyl protein A)(SpA)結合。此方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利案第6,165,745號。
在另一實施例中，該FLT3 MAb係經修飾以增加其生物半衰期。各種方法係可能的。例如，突變可根據Ward之美國專利案第6,277,375號中描述來引入。或者，為增加生物半衰期，該抗體可於CH1或CL區內經改變以含有取自IgG之Fc區之CH2域之兩個環之補救受體結合抗原決定基，如Presta等人之美國專利案第5,869,046及6,121,022號中描述。
在又其他實施例中，該Fc區係藉由以不同胺基酸殘基置換至少 一個胺基酸殘基以改變FLT3 MAb之效應功能而加以改變。例如，一或多個選自胺基酸特異性殘基之胺基酸可經不同胺基酸殘基置換以使得該抗體對效應配體具有經改變之親和力但保留親代抗體之抗原結合能力。親和力經改變之效應配體可為(例如)Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細描述於Winter等人之美國專利案第5,624,821及5,648,260號中。
在另一實施例中，重鏈係通過由Ambrx(La Jolla,CA)開發之ReCODE技術以非天然胺基酸置換至少一個胺基酸殘基而加以改變。非天然胺基酸之一個實例係對乙醯基苯丙胺酸。
FLT3抗體與FLT3相關蛋白之反應性可藉由許多熟知方法(包括西方墨點轉漬法、免疫沈澱法、ELISA及FACS分析)適當時使用FLT3相關蛋白、FLT3表現細胞或其萃取物建立。FLT3抗體或其片段可用可偵測標記標記或結合至第二分子。合適之可偵測標記包括(但不限於)放射性同位素、螢光化合物、生物發光化合物、化學發光化合物、金屬螯合劑或酶。此外，對兩種或更多種FLT3抗原決定基具有特異性之雙特異性抗體係使用此項技術中通常已知之方法產生。同源二聚抗體亦可使用此項技術中已知之交聯技術產生(例如，Wolff等人，Cancer Res.53：2560-2565)。
在又另一較佳實施例中，本發明之FLT3 MAb係包含命名為CHv62.21之抗體之重鏈及輕鏈之抗體。CHv62.21之重鏈由自SEQ ID NO：9之第1個殘基(E)至第453個殘基(K)範圍內之胺基酸序列組成及CHv62.21之輕鏈由自SEQ ID NO：10序列之第1個殘基(D)至第214個殘基(C)範圍內之胺基酸序列組成。其序列闡述於圖2A及/或2B及圖3A及/或3B中。在一較佳實施例中，CHv62.21係以非天然胺基酸(「nnAA」)修飾並結合至細胞毒性劑。在一個實施例中，該nnAA係pAF。在一較佳實施例中，該細胞毒性劑係特異性結合在nnAA。
在又另一實施例中，本發明之FLT3 Mab係藉由產生抗體或抗原結合片段之方法來產生，該方法包括培養宿主細胞以容許抗體或抗原結合片段之表現，其中該宿主細胞係選自由以下(a)至(c)組成之群：(a)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：9之第1個E至第123個S範圍內之胺基酸序列組成之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸及含有編碼由自SEQ ID NO：10之第1個D至第108個R範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉染宿主細胞；(b)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：9之第1個E至第123個S範圍內之胺基酸序列組成之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體及包含含有編碼由自SEQ ID NO：10之第1個D至第108個R範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉染之宿主細胞；及(c)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：9之第1個E至第123個S範圍內之胺基酸序列組成之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉染之宿主細胞及經包含含有編碼由自SEQ ID NO：10之第1個D至第108個R範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉染之宿主細胞。
在又另一實施例中，本發明之FLT3 MAb係藉由產生抗體之方法來產生，該方法包括培養宿主細胞以容許抗體之表現，其中該宿主細胞係選自由以下(a)至(c)組成之群：(a)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：9之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈之鹼基序列之多核苷酸及包含含有編碼由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉染之宿主細胞；(b)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：9之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體及包含 含有編碼由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉染之宿主細胞；及(c)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：9之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉染之宿主細胞及經包含含有編碼由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉染之宿主細胞。
產生命名為CHv62.21之抗體之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞在2014年12月9日送(經由聯邦快遞)至美國菌種保存中心(ATCC),P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108且指定登錄號為PTA-121831。
或者或另外，在本發明之另一實施例中，結合FLT3之Mab(在此情況下，為MAb CHv62.21)可經受如此項技術中已知的轉譯後修飾。轉譯後修飾之實例包括(但不限於)化學修飾(諸如雙硫鍵)、寡醣、N端焦麩胺酸鹽形成、C端離胺酸處理、脫醯胺作用、異構化作用、氧化、醣化、肽鍵裂解、非還原交聯、截斷及此項技術中已知的其他修飾。參見，Liu等人，Heterogeneity of Monoclonal Antibodies,J.Pharma.Sci.，第97卷，第7期，第2426至2447頁(2008年7月)。其他類型之修飾包括非共價相互作用、構形異質性、及聚集，同上。
在另一實施例中，該CHv62.21 MAb包括N端重鏈麩胺酸鹽在殘基1處環化為焦麩胺酸鹽。熟習此項技術者將瞭解並知曉此種環化應瞭解為自發出現。參見，Dick等人，Determination of the Origin of the N-Terminal Pyro-Glutamtate Variation in Monoclonal Antibodies Using Model Peptides,Biotechnology and Bioengineering，第97卷，第3期，第544至553頁(2007年6月15日)。
另外或或者，該CHv62.21 MAb之胺基酸可經受其他轉譯後修飾，包括(但不限於)脫醯胺作用、異構化作用、醣化及/或氧化。本發 明之多肽或其片段可經受額外之轉譯後修飾，包括醣化，例如此項技術中熟知之N連接型或O連接型醣化位點。如先前描述，可於多肽之胺基酸序列或處理條件中作出變化(諸如於培養、純化及/或儲存條件之變化)以排除或最小化此類改變或以於其中此種處理有利之情況中促進其等。此外，此類製劑可包含具有不同程度的多於一種類型之處理相關修飾之多肽，例如，多肽之一些、大部分或大體上全部之C端離胺酸可經移除及/或一些、大部分或大體上全部之N端胺基酸可經轉化為焦麩胺酸(例如，顯示於圖2A及/或2B或圖3A及/或3B中或一致序列或抗原結合片段中之多肽)。諸如不同緩衝組合物及溫度之處理條件可對此類修飾之程度具有顯著影響。
在另一實施例中，該CHv62.21 MAb包含SEQ ID NO：9之殘基453處之C端重鏈離胺酸之截斷。
在另一實施例中，該CHv62.21 MAb包含向殘基303處之重鏈天冬醯胺酸添加醣化，包括(但不限於)G0(唾液酸基-、去半乳糖、去岩藻醣化二觸角複合物-N型-聚醣；G0F(唾液酸基-、去半乳糖、核-岩藻醣化二觸角複合物-N型-聚醣)；甘露糖-5(N-連接型寡聚甘露糖-5)；G1F(唾液酸基-、單半乳糖、核-岩藻醣化二觸角複合物-N型-聚醣)；G2(唾液酸基-、雙半乳糖、岩藻醣化二觸角複合物-N型-聚醣)；G2F(唾液酸基-、雙半乳糖、核-岩藻醣化二觸角複合物-N型-聚醣)；A1(單唾液酸化二觸角N-連接型寡聚醣，Neu5Acid)；及/或A2(二唾液酸化二觸角N-連接型寡聚醣，Neu5Acid)。
另外或或者，在另一實施例中，該CHv62.21 MAb包括向輕鏈之一或多個絲胺酸殘基添加醣化。通常，醣化產生自在還原糖與N端原發性胺或離胺酸側鏈之胺基間之非酶反應。熟習此項技術者將瞭解及知曉醣化可掩蔽N端原發性胺基酸基團或離胺酸殘基之側鏈上之正電荷，從而使該抗體更具酸性。
本發明之多肽之胺基酸序列可藉由此項技術中已知的任何方式(例如，質譜法)證實且可與本文揭示之序列(參見，圖2A及/或2B及圖3A及/或3B)相同或可由於轉譯後修飾加工而在一或多個胺基酸殘基處不同於彼等序列。藉助於非限制性實例，在全部或部分大體上同源性多肽上，輕鏈或重鏈之C端胺基酸可藉由發生於培養期間之蛋白水解處理或其他處理而加以移除。類似地，可缺乏N端胺基酸，例如，可缺乏一(1)、二(2)、三(3)、四(4)或五(5)個N端胺基酸。
在另一實施例中，CHv62.21 MAb之重鏈可變區係選自由以下組成之群：自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基123(S)範圍內之胺基酸序列及自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基123(S)範圍內之胺基酸序列，其中該N端殘基1(E)轉化為焦麩胺酸。
在另一實施例中，CHv62.21 MAb之重鏈係選自由以下組成之群：自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列；自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列，其中該N端殘基1(E)轉化為焦麩胺酸；自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列，其中移除該C端殘基453(K)；及自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列，其中該N端殘基1(E)轉化為焦麩胺酸並移除該C端殘基453(K)。
在另一實施例中，CHv62.21 MAb或其抗原結合片段係藉由於宿主細胞中表現所獲得之蛋白質之重組產生混合物，其中該抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區係選自由以下組成之群：自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基123(S)範圍內之胺基酸序列及自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基123(S)範圍內之胺基酸序列，其中該N端殘基1(E)轉化為焦麩胺酸。
在另一實施例中，CHv62.21 MAb係藉由於宿主細胞中表現所獲得之蛋白質之重組產生混合物，其中該抗體之重鏈係選自由以下組成 之群：自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列；自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列，其中該N端殘基1(E)轉化為焦麩胺酸；自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列，其中移除該C端殘基453(K)；自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列，其中該N端殘基1(E)轉化為焦麩胺酸並移除該C端殘基453(K)。
在另一實施例中，CHv62.21 MAb包含由自SEQ ID NO：9之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈(其中將第1個E修飾為焦麩胺酸鹽)及由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。
在另一實施例中，CHv62.21 MAb包含由自SEQ ID NO：9之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈及由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。
在另一實施例中，CHv62.21 MAb包含由自SEQ ID NO：9之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈，其中將該第1個E修飾為焦麩胺酸鹽並移除該C端殘基第453個K，及包含由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。
在另一實施例中，CHv62.21 MAb包含由自SEQ ID NO：9之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈，其中移除該C端殘基第453個K，及包含由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。
在本發明之另一較佳實施例中，本發明之FLT3 MAb及(特定言之)表示為CHv62.21的Mab係於重鏈中經非天然胺基酸(「nnAA」)修飾。在一較佳實施例中，琥珀密碼子係位於SEQ ID NO：11之胺基酸位置124以用於插入表示為對乙醯基苯丙胺酸(圖3C)之nnAA。出於本發明之目的，以CHv62.21pAF表示經修飾之CHv62.21。
因此，在本發明之一較佳實施例中，CHv62.21pAF包含以下：
重鏈可變區由自SEQ ID NO：11之第1個殘基(E)至第123個殘基(S)殘基範圍內之胺基酸序列組成，及輕鏈可變區由自SEQ ID NO：10之第1個殘基(D)至第108個殘基(R)殘基範圍內之胺基酸序列組成。重鏈可變區之CDR1-3(Kabat)由分別自SEQ ID NO：11之31至35；自50至65及自95至102範圍內之胺基酸序列組成，及輕鏈可變區之CDR1-3(Kabat或Chothia)由分別自SEQ ID NO：10之24至34；自50至56及自89至97範圍內之胺基酸序列組成(參見，圖3B、圖3C及表V)。
重鏈由自SEQ ID NO：11之第1個殘基(E)至第453個殘基(K)範圍內之胺基酸序列及插入於SEQ ID NO：11之殘基124處之對乙醯基苯丙胺酸之nnAA組成及CHv62.21之輕鏈由自SEQ ID NO：10之第1個殘基(D)至第214個殘基(C)範圍內之胺基酸序列組成。其等序列闡述於圖2B及/或2C及圖3B及/或3C中。在一較佳實施例中，CHv62.21pAF結合至細胞毒性劑。
在又另一實施例中，本發明之FLT3 MAb係藉由產生抗體或抗原結合片段之方法產生，該方法包括培養宿主細胞以容許抗體或抗原結合片段之表現，其中該宿主細胞係選自由以下(a)至(c)組成之群：(a)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：11之第1個E至第123個S範圍內之胺基酸序列組成之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸及包含編碼包含自SEQ ID NO：10之第1個D至第108個R範圍內之胺基酸序列之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉染之宿主細胞；(b)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：11之第1個E至第123個S範圍內之胺基酸序列組成之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體及經包含含有編碼包含自SEQ ID NO：10之第1個D至第108個R範圍內之胺基酸序列之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉染之宿主細胞；及 (c)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：11之第1個E至第123個S範圍內之胺基酸序列組成之重鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉染之宿主細胞及經包含含有編碼包含自SEQ ID NO：10之第1個D至第108個R範圍內之胺基酸序列之輕鏈可變區之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉染之宿主細胞。
在又另一實施例中，本發明之FLT3 MAb係藉由產生抗體之方法產生，該方法包括培養宿主細胞以容許抗體之表現，其中該宿主細胞係選自由以下(a)至(c)組成之群：(a)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：11之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈之鹼基序列之多核苷酸及包含編碼由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞；(b)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：11之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體及包含含有編碼由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞；及(c)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：11之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞及經包含含有編碼由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞；在又另一實施例中，本發明之FLT3 MAb係藉由產生抗體之方法產生，該方法包括培養宿主細胞以容許抗體之表現，其中該宿主細胞係選自由以下(a)至(d)組成之群：(a)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：11之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈之鹼基序列之多核苷酸及包含編碼由自 SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞；(b)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：11之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體及包含含有編碼由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞；(c)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：11之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞及經包含含有編碼由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞；及(d)經包含含有編碼由自SEQ ID NO：11之第1個E至第452個G範圍內之胺基酸序列組成之重鏈及由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之鹼基序列之多核苷酸之表現載體轉形之宿主細胞，其中該第1個E修飾為焦麩胺酸鹽。
在另一實施例中，CHv62.21pAF MAb之重鏈可變區係選自由以下組成之群：自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基123(S)範圍內之胺基酸序列及自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基123(S)範圍內之胺基酸序列，其中該N端殘基1(E)轉化為焦麩胺酸。
在另一實施例中，CHv62.21pAF MAb之重鏈係選自由以下組成之群：自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列；自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列，其中該N端殘基1(E)轉化為焦麩胺酸；自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基453(K)之胺基酸序列，其中將該C端殘基453(K)移除；及自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列，其中該N端殘基1(E)轉化為焦麩胺酸並將該C端殘基453(K)移除。
在另一實施例中，CHv62.21pAF MAb或其抗原結合片段係藉由於宿主細胞中表現所獲得之蛋白質之重組產生混合物，其中該抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區係選自由以下組成之群：自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基123(S)範圍內之胺基酸序列及自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基123(S)範圍內之胺基酸序列，其中該N端殘基1(E)轉化為焦麩胺酸。
在另一實施例中，CHv62.21pAF MAb係藉由於宿主細胞中表現所獲得之蛋白質之重組產生混合物，其中該重鏈係選自由以下組成之群：自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列；自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列，其中該N端殘基1(E)轉化為焦麩胺酸；自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列，其中將該C端殘基453(K)移除；及自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列，其中該N端殘基1(E)轉化為焦麩胺酸並將該C端殘基453(K)移除。
在另一實施例中，CHv62.21pAF MAb包含由自SEQ ID NO：11之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈及由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。
在另一實施例中，CHv62.21pAF MAb包含由自SEQ ID NO：11之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈，其中將該第1個E修飾為焦麩胺酸鹽，及包含由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。
在另一實施例中，CHv62.21pAF MAb包含由自SEQ ID NO：11之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈，其中將該第1個E修飾為焦麩胺酸鹽並移除該C端殘基第453個K，及包含由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。
在另一實施例中，CHv62.21pAF MAb包含由自SEQ ID NO：11之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈，其中將該C端殘基第453個K移除，及包含由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。
產生命名為CHv62.21pAF之抗體之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞於2014年12月9日送(經由聯邦快遞)至美國菌種保存中心(ATCC),P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108且登錄號指定為PTA-121836。
III.)抗體-藥物結合物概述
在另一態樣中，本發明提供抗體-藥物結合物(ADC)，其等包含結合至治療劑之抗體。該治療劑可為細胞毒性劑、細胞增殖抑制劑、化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物起源之酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性結合物)。在另一態樣中，本發明進一步提供使用ADC之方法。在一個態樣中，ADC包含上文共價結合或經由肟鍵結合至細胞毒性劑或偵測劑之FLT3 MAb中之任何一者。
抗體-藥物結合物於局部遞送細胞毒性或細胞增殖抑制劑，即在癌症治療中殺死或抑制腫瘤細胞之藥物(Syrigos及Epenetos(1999)Anticancer Research 19：605-614；Niculescu-Duvaz及Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26：151-172；美國專利案4,975,278)之使用容許將藥物部分靶向遞送至腫瘤及於其中細胞內聚集，其中此等未經結合之藥物之全身性投與可對正常細胞導致不可接受之毒性水平並設法消除腫瘤細胞(Baldwin等人，(1986)Lancet pp.(Mar.15,1986)：603-05；Thorpe,(1985)「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」，Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等人(編)，第475至506頁)。從而尋求以最小毒性達成最大療效。多株抗體及單株抗體均已報告為於此等 策略中有用(Rowland等人，(1986)Cancer Immunol.Immunother.,21：183-87)。此等方法中使用之藥物包括道諾黴素(daunomycin)、多柔比星、胺甲喋呤及長春地辛(Rowland等人，(1986)同上)。抗體-毒素結合物中使用之毒素包括細菌毒素(諸如白喉毒素)、植物毒素(諸如蓖麻毒蛋白)、小分子毒素(諸如格爾德黴素(geldanamycin))(Mandler等人(2000)Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等人，(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等人，(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)、美登素類(EP 1391213；Liu等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623)及卡奇黴素(Lode等人，(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman等人，(1993)Cancer Res.53：3336-3342)。該等毒素可藉由機制(包括微管蛋白結合、DNA結合或拓樸異構酶抑制)影響其等細胞毒性及細胞增殖抑制效應。一些細胞毒性藥物在結合至大抗體或蛋白質受體配體時趨於失活或活性減小。
抗體藥物結合物之實例係ZEVALIN®(替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen/Idec)，其係由針對發現於正常及惡性B淋巴球之表面上之CD20抗原之鼠類IgG1 κ單株抗體及藉由硫脲連接子-螯合劑結合之111In或90Y放射性同位素組成之抗體-放射性同位素結合物(Wiseman等人，(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77；Wiseman等人，(2002)Blood 99(12)：4336-42；Witzig等人，(2002)J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63；Witzig等人，(2002)J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69)。
另外，MYLOTARGTM(吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)(由連接至卡奇黴素之hu CD33抗體組成之抗體藥物結合物)於2000年經批准用於急性骨髓性白血病之注射治療中(Drugs of the Future(2000)25(7)：686；美國專利案第 4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001號)。
另外，早期已將抗人類FLT3抗體評定為用於骨髓性白血病之潛在治療。例如，IMC-EB10(抗FLT3之抗體)由Imclone開發。此抗體係配體阻斷劑，其抑制下游激酶(MAPK、Akt及Stat5)之FLT3介導之活化。該抗體亦抑制活體外白血病細胞之增殖；且已知經由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)發揮作用。當單獨治療及與胺甲喋呤組合治療時，EB10已引起白血病異種移植物之延長之存活(參見，WO2009/155015及US2011/0008355)。亦於人類臨床試驗(NCT00887926)中評估此抗體，但因缺乏療效而終止。亦參見，由ImClone開發結合至MMAF之EB10(參見，Proc Amer Assoc Cancer Res，第46卷，2005)。
此項技術中已知針對FLT3開發之激動抗體可增強原始造血細胞之增殖及/分化(參見，WO 95/27062)。
除生物製劑外，已開發許多小分子抑制劑並於人類臨床試驗中測試。此等抑制劑中之大部分靶向FLT3及其他激酶且因此對FLT3激酶本身不具有特異性。在大多數情況下，此等抑制劑靶向FLT3-ITD及可能的FLT-TKD。因此，無抑制劑可單獨靶向野生型FLT3。已知已進入人類臨床試驗中之小分子抑制劑係：
米哚妥林(Midostaurin)或PKC-412(Novartis)、奎扎替尼(Quizartinib)或AC220(Ambit)、蕾莎瓦(Nexavar)(Onyx/Bayer)、AZD1152或巴拉塞替(Barasertib)(Astrazeneca)、克萊拉尼(Crenolanib)(Arog)、Plexxicon(Daichii Sankyo)及ASP2215(Astellas)。通常，大多數人類臨床試驗仍在進行中。在大多數情況下，已觀察到作為副作用之血小板減少症、中性粒細胞減少症、貧血症。
另外，莫坎妥珠單抗(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)(由經由二硫連接子SPP連接至美登素類藥物部分(DM1)之huC242抗體組成之抗體藥物結合物)進展至用於治療表現CanAg之癌症(諸如結腸、胰、胃及其他)之II期試驗。
另外，MLN-2704(Millennium Pharm.,BZL Biologics,Immunogen Inc.)(由連接至美登素類藥物部分(DM1)之抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)單株抗體組成之抗體藥物結合物)係處於開發中以用於前列腺腫瘤之潛在治療。
最後，奧瑞司他汀肽、奧瑞司他汀E(AE)及單甲基奧瑞司他汀(MMAE)、海兔毒素之合成類似物結合至嵌合性單株抗體cBR96(對癌上之Lewis Y具有特異性)及cAC10(對血液惡性腫瘤上之CD30具有特異性)(Doronina等人，(2003)Nature Biotechnology 21(7)：778-784)。
結合至MMAE之CD30 MAb係現作為ADCETRIS(Seattle Genetics,Bothell,WA)購得。ADCETRIS(貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin))係導向CD-30之抗體藥物結合物，其由三種組分組成：1)表示為cAC10之嵌合性IgG1抗體，其對人類CD30具有特異性；2)微管破壞劑MMAE；及3)將MMAE共價連接至caC10之蛋白酶可裂解連接子。參見，ADCENTRIS處方資訊。
此外，本文描述治療劑，其等包括(但不限於)在ADC之產生中有用之化學治療劑。可使用之酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自假單胞菌屬綠膿桿菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思子素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、桐油樹蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸毒蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻風樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制劑、白樹毒素、絲林黴素、局限曲菌素、酚黴素、伊諾黴素及單端孢菌素。參見，例如，1993年10月28日公開之WO 93/21232。各種放射性核素適用於產生放射性結合之抗體。實例包括212Bi、131I、131In、90Y及186Re。抗體 及細胞毒性劑之結合物係使用各種雙功能性蛋白-偶合劑諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸鹽(SPDP)、亞胺基硫烷(IT)、亞胺基酯之雙功能性衍生物(諸如二甲基己二醯亚胺HCl)、活性酯(諸如二琥珀醯亞胺基辛二酸鹽)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮化衍生物(諸如雙-(對重氮化苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸鹽(諸如2,6-二異氰酸甲苯酯)及雙-活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)加以製造。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等人(1987)Science,238：1098中描述加以製造。經碳-14標記之1-異硫氰氧基苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於將放射性核苷酸結合至抗體之例示性螯合劑(WO94/11026)。
本文亦預期抗體及一或多種小分子毒素(諸如卡奇黴素、美登素類、海兔毒素、奧瑞司他汀、單端孢菌素及CC1065)及此等毒素之具有毒素活性之衍生物之結合物。
III(A).美登素類
適用作美登素類藥物部分之美登素類化合物係此項技術中熟知，且可根據已知方法分離自天然來源，使用基因工程技術製造(參見Yu等人，(2002)PNAS 99：7968-7973)，或根據已知方法合成製造美登醇及美登醇類似物。
例示性美登素類化合物藥物部分包括彼等具有經修飾之芳環者，諸如：C-19-脫氯(US 4256746)(藉由安絲菌素(ansamytocin)P2之氫化鋰鋁還原製得)；C-20-羥基(或C-20-脫甲基)+/-C-19-脫氯(美國專利案第4,361,650及4,307,016號)(藉由使用鏈黴菌屬(Streptomyces)或放線菌屬(Actinomyces)之脫甲基化或使用LAH之脫氯化製得)；及C-20-脫甲氧基、C-20-醯氧基(-OCOR)、+/-脫氯(美國專利案第4,294,757號)(藉由使用醯基氯化物之醯化製得)，及彼等在其他位置具有修飾者。
例示性美登素類藥物部分亦包括彼等具有諸如以下之修飾者：C-9-SH(US 4,424,219)(藉由美登醇與H2S或P2S5之反應製得)；C-14-烷氧基甲基(脫甲氧基/CH2OR)(US 4331598)；C-14-羥基甲基或醯氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(US 4450254)(自土壤絲菌屬(Nocardia)製得)；C-15-羥基/醯氧基(US 4,364,866)(藉由以鏈黴菌屬轉化美登醇製得)；C-15-甲氧基(美國專利案第4,313,946及4,315,929號)(分離自滑桃樹屬(Trewia nudlflora))；C-18-N-脫甲基(美國專利案第4,362,663及4,322,348號)(藉由以鏈黴菌屬脫甲基化美登醇製得)；及4,5-脫氧基(US 4,371,533)(藉由美登醇之三氯化鈦/LAH還原製得)。
含有美登素類之ADC、其製造方法及其等治療性用途揭示例如於美國專利案第5,208,020；5,416,064；6,441,163號及歐洲專利EP 0 425 235 B1中，該等案件之揭示內容以明確引入之方式併入本文中。Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)描述包含連接至針對人類結腸直腸癌之單株抗體C242之命名為DM1之美登素類之ADC。發現該結合物對經培養之結腸癌細胞具有高度細胞毒性，且在活體內腫瘤生長分析中顯示抗腫瘤活性。Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)描述其中美登素類經由二硫連接子結合至結合人類結腸癌細胞系上之抗原之鼠類抗體A7或結合至結合HER-2/neu癌基因之另一鼠類單株抗體TA.1之ADC。活體外測試TA.1-美登素類結合物對人類乳癌細胞系SK-BR-3之細胞毒性，人類乳癌細胞系SK-BR-3每個細胞表現3 x 105個HER-2表面抗原。藥物結合物達成與游離美登素類藥物類似之細胞毒性程度，其可藉由增加每個抗體分子中之美登素類分子之數量而增加。該A7-美登素類結合物於小鼠中顯示低全身性細胞毒性。
III(B).奧瑞司他汀及海兔毒素
在一些實施例中，該ADC包含結合至海兔毒素或海兔毒素肽類 似物及衍生物、奧瑞司他汀之本發明之抗體(美國專利案第5,635,483；5,780,588號)。海兔毒素及奧瑞司他汀已顯示干擾微管動態、GTP水解及細胞核及細胞分裂(Woyke等人，(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(US 5,663,149)及抗真菌活性(Pettit等人，(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。海兔毒素或奧瑞司他汀藥物部分可通過肽藥物部分之N(胺基)端或C(羧基)端結合至抗體(WO 02/088172)。
例示性奧瑞司他汀實施例包括N端連接型單甲基奧瑞司他汀藥物部分DE及DF，其等揭示於「2004年3月28日呈遞之Senter等人，Proceedings of the American Association for Cancer Research，第45卷，文摘號623中並描述於美國專利公開案第2005/0238649號中，該等案件之揭示內容以全文引用之方式明確併入本文中。
通常，基於肽之藥物部分可藉由在兩種或更多種胺基酸與/或肽片段間形成肽鍵製造。此類肽鍵可(例如)根據肽化學領域中熟知的液相合成方法製造(參見E.Schröder及K.Lübke,「The Peptides」，第1卷，第76至136頁，1965,Academic Press)。奧瑞司他汀/海兔毒素藥物部分可根據以下方法製造：US 5635483；US 5780588；Pettit等人，(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等人，(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit,G.R.等人，Synthesis,1996,719-725；Pettit等人，(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5：859-863；及Doronina(2003)Nat Biotechnol 21(7)：778-784。
III(C).卡奇黴素
在其他實施例中，該ADC包含結合至一或多個卡奇黴素分子之本發明之抗體。抗生素之卡奇黴素家族可在子皮莫尓濃度下產生斷裂之雙股DNA。為製造卡奇黴素家族之結合物，參見美國專利5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、 5,770,710、5,773,001、5,877,296(全部屬於American Cyanamid公司)。可使用之卡奇黴素之結構性類似物包括(但不限於)γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙醯基-γ1 I、PSAG及θI 1(Hinman等人，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode等人，Cancer Research 58：2925-2928(1998)及上述屬於American Cyanamid之美國專利)。可結合抗體之另一抗腫瘤藥物係QFA，其為抗葉酸劑。卡奇黴素及QFA均具有細胞內作用位點且不容易跨越漿膜。因此，此等藥劑通過抗體介導之內化之細胞吸收極大地增強其等細胞毒性效應。
III(D).其他細胞毒性劑
其他可結合至本發明之抗體之抗贅瘤劑包括BCNU、鏈脲佐菌素、長春新鹼及5-氟尿嘧啶、描述於美國專利案第5,053,394、5,770,710號中之統稱為LL-E33288複合物之藥劑家族、及埃斯培拉黴素(esperamicin)(美國專利5,877,296)。
可使用之酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自假單胞菌屬綠膿桿菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思子素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、桐油樹蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸毒蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻風樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制劑、白樹毒素、絲林黴素、局限曲菌素、酚黴素、伊諾黴素及單端孢菌素。參見，例如，WO 93/21232(1993年10月28日公開)。
本發明進一步預期抗體與具有核分解活性之化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸內切酶，諸如脫氧核糖核酸酶；DNase)所形成之ADC。
就腫瘤之選擇性破壞而言，該抗體可包含高度放射性原子。各種放射性同位素適用於產生放射性結合之抗體。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射 性同位素。當結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍研究之放射性原子(例如tc99m或I123)或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁振造影，mri)之自旋標記(諸如碘-123再次、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵)。
該等放射性標記或其他標記可用已知方法併入結合物中。例如，該肽可生物合成或可藉由使用涉及(例如)以氟-19代替氫之合適之胺基酸前驅物之化學胺基酸合成合成。諸如tc99m或I123、Re186、Re188及In111之標記可經由半胱胺酸殘基結合於肽中。釔-90可經由離胺酸殘基結合。IODOGEN方法(Fraker等人，(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57可用以併入碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal,CRC Press 1989)詳細描述其他方法。
IV.)結合FLT3之抗體-藥物結合物化合物
本發明尤其提供用於治療劑之靶向遞送之抗體-藥物結合物化合物。發明人已發現該等抗體-藥物結合物化合物具有抗表現FLT3之細胞之強效細胞毒性及/或細胞增殖抑制活性。
此類抗體藥物結合物不阻斷FL結合至FLT3，以使得FL甚至在結合抗體時可透過FLT3發信號。此類抗體證實細胞毒性活性在FL之存在下不減小(其中不阻斷FL結合至FLT3之抗FLT3抗體藥物結合物在FL之存在下顯示減小之細胞毒性)。在較佳實施例中，本文描述之抗FLT3藥物結合物不大體上抑制FL結合至FLT3。
該等抗體-藥物結合物化合物包含共價連接至至少一個藥物單元之抗體單元。該等藥物單元可直接共價結合至抗體單元或經由連接子單元(-LU-)。
在一些實施例中，該抗體藥物結合物化合物具有下式：L-(LU-D)p (I)
或其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物；其中：L係抗體單元，例如，本發明之FLT3 MAb，諸如CHv62.21或CHv62.21pAF，及(LU-D)係連接子單元-藥物單元部分，其中：LU-係連接子單元，及-D係具有抗目標細胞之細胞增殖抑制或細胞毒性活性之藥物單元；及P在自1至20範圍內。
在一些實施例中，p在自1至10範圍內；自1至9範圍內；自1至8範圍內；自1至7範圍內；自1至6範圍內；自1至5範圍內；自1至4範圍內；自1至3範圍內或自1至2範圍內。在一些實施例中，p在自2至10範圍內；自2至9範圍內；自2至8範圍內；自2至7範圍內；自2至6範圍內；自2至5範圍內；自2至4範圍內或自2至3範圍內。在其他實施例中，p係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，p係2或4。在一些實施例中，p係整數。在其他實施例中，p係量測為平均藥物對抗體之比率且可為整數或非整數。
在一些實施例中，該抗體藥物結合物化合物具有下式：L-(Aa-Ww-Yy-D)p (II)
或其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物，其中：L係抗體單元，例如，FLT3 MAb，諸如CHv62.21或CHv62.21pAF；及-Aa-Ww-Yy-係連接子單元(LU)，其中：-A-係延伸子單元，a係0或1或2或3，各-W-獨立地係胺基酸單元，w係0至12之整數， -Y-係自我分解型間隔子單元，y係0、1或2；-D係具有抗靶細胞之細胞增殖抑制或細胞毒性活性之藥物單元；及p係1至20之整數。
在一些實施例中，a係0或1，w係0或1，及y係0、1或2。在一些實施例中，a係0或1，w係0或1，及y係0或1。在一些實施例中，p在自1至10範圍內；自1至9範圍內；自1至8範圍內；自1至7範圍內；自1至6範圍內；自1至5範圍內；自1至4範圍內；自1至3範圍內或自1至2範圍內。在一些實施例中，p在自2至8範圍內；自2至7範圍內；自2至6範圍內；自2至5範圍內；自2至4範圍內或自2至3範圍內。在其他實施例中，p係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，p係2或4。在一些實施例中，當w不為0時，y係1或2。在一些實施例中，當w係1至12時，y係1或2。在一些實施例中，w係2至12及y係1或2。在一些實施例中，a係1及w與y係0。
就包含複數個抗體之組合物而言，藥物負載由p(每個抗體中藥物分子之平均數量)表示。藥物負載可在自每個抗體中1至20個藥物(D)範圍內。在結合物反應之製造中每個抗體之藥物平均數量可藉由習知方式(諸如質譜法、ELISA分析及HPLC)表徵。亦可測定抗體-藥物-結合物之p之定量分佈。在一些實例中，均質抗體-藥物-結合物(其中p係具有其他藥物負載之抗體-藥物-結合物之某一值)之分離、純化及表徵可藉由諸如逆相HPLC或電泳等方式達成。在例示性實施例中，p係2至8。
抗體-藥物結合物化合物之產生可藉由熟習技工已知的任何技術完成。簡而言之，該等抗體-藥物結合物化合物包含作為抗體單元之本發明FLT3 MAb、藥物及視需要連接該藥物與該結合劑之連接子。 在一較佳實施例中，該抗體係包含上文描述之命名為CHv62.21之抗體之重鏈及輕鏈可變區之FLT3 MAb。在一更佳實施例中，該抗體係包含上文描述之命名為CHv62.21pAF之抗體之重鏈及輕鏈之FLT3 MAb(參見，式(I))。
許多不同之反應適用於將藥物及/或連接子共價結合至結合劑。此通常藉由結合劑(例如，抗體分子)之胺基酸殘基(包括離胺酸之胺基、麩胺酸及天冬胺酸之游離羧酸基團、半胱胺酸之巰基及芳族胺基酸之各種部分)之反應完成。共價結合之最常用非特異性方法中之一者係碳二亞胺反應，以將化合物之羧基(或胺基)連接至抗體之胺基(或羧基)。另外，雙功能性劑(諸如二醛或亞胺基酯)已用以將化合物之胺基連接至抗體分子之胺基。亦適用於將藥物連接至結合劑之反應係希夫鹼反應(Schiff base reaction)。此方法涉及含有二醇或羥基之藥物之過碘酸氧化，因此形成醛，其然後與結合劑反應。經由希夫鹼及結合劑之胺基之形成發生連接。可使用異構硫氰酸鹽作為偶合劑以將藥物共價連接至結合劑。其他技術係為熟習技工已知且在本發明之範圍內。
在某些實施例中，中間物(其係連接子之前驅物)在適當之條件下與藥物反應。在某些實施例中，反應性基團用於藥物及/或中間物上。藥物與中間物或衍生化藥物之間之反應產物隨後在適當之條件下與FLT3 MAb反應。
V.)連接子單元
通常，該等抗體-藥物結合物化合物包含在藥物單元與抗體單元間之連接子單元。在一些實施例中，該連接子係在細胞內條件下可裂解，以使得該連接子之裂解自抗體釋放藥物單元於細胞內環境中。在又其他實施例中，該連接子單元係不可裂解且該藥物係(例如)藉由抗體降解釋放。
在一些實施例中，該連接子係可藉由存在於細胞內環境(例如，在溶酶體或胞內體或胞膜窖(caveolea)內)中之裂解劑裂解。該連接子可為(例如)肽基連接子，其藉由細胞內肽酶或蛋白酶(包括(但不限於)溶酶體或胞內體蛋白酶)裂解。該連接子亦可藉由存在於細胞外環境(例如，在細胞膜或組織間隔周圍)中之裂解劑裂解。該連接子可為(例如)肽基連接子，其藉由細胞外肽酶或蛋白酶(包括(但不限於)組織蛋白酶家族酶或基質金屬蛋白酶))裂解。在一些實施例中，該肽基連接子係至少兩個胺基酸長度或至少三個胺基酸長度。在一較佳實施例中，該肽基連接子含有至少一個胺氧基酸單元(Ambrx,Inc.,La Jolla,CA)。裂解劑可包括彼等此項技術中已知之藥劑(參見，例如，Dubowchik and Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83：67-123及美國專利案第6,214,345號)。使用治療劑之細胞內蛋白水解釋放之一項優點係當結合時該藥劑通常經衰減且結合物之血清穩定性通常較高。
在其他實施例中，該可裂解之連接子係pH敏感型，即，在某些pH值下對水解敏感。通常，該pH敏感型連接子在酸性條件下可水解。例如，可使用可於溶酶體中水解之酸不穩定性連接子(例如，肟、腙、半卡腺、硫半卡腺、順式烏頭醯胺、原酸酯、縮醛、縮酮或類似物)。(參見，例如，美國專利案第5,122,368；5,824,805；5,622,929號；Dubowchik及Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83：67-123；Neville等人，1989,Biol.Chem.264：14653-14661)。此類連接子在中性pH條件下(諸如彼等在血液中)相對穩定，但在低於pH 5.5或5.0(溶酶體之近似pH)下不穩定或較不穩定。在某些實施例中，該可水解之連接子係硫醚連接子(諸如，例如，經由醯腙鍵連接至治療劑之硫醚(參見，例如，美國專利案第5,622,929號)。
在又其他實施例中，該連接子係在此項技術中已知的還原條件下可裂解。(參見，例如，Thorpe等人，1987,Cancer Res.47：5924- 5931；Wawrzynczak等人，In Immunoconjugates：Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel編，Oxford U.Press,1987.亦參見美國專利案第4,880,935號)。該連接子亦可在細胞內(或細胞外)發現之還原條件下裂解。例如，在一較佳實施例中，該特異性連接子N-O鍵可形式上還原並破壞以導致連接子之裂解。
在又其他實施例中，該連接子單元係不可裂解且該藥物係藉由抗體降解釋放。(參見以全文引用之方式併入本文中且用於所有目的之PCT公開案第WO2012/166560號(Ambrx,Inc.))。
在其他非互相排他性之實施例中，如此項技術中已知，連接子促進細胞內化。
各種可與本發明之組合物及方法一起使用之例示性連接子係描述於WO 2004/010957、美國公開案第2006/0074008號、美國公開案第20050238649號及美國公開案第2006/0024317號(其各以全文引用之方式併入本文中且用於所有目的)中。
在一較佳實施例中，本發明之LU表示AGL且常稱為2-(胺氧基)乙酸或C2H5NO3。
VI.)延伸子單元
延伸子單元(A)(當存在時)可將抗體單元連接至胺基酸單元(-W-)(若存在)連接至間隔子單元(-Y-)(若存在)；或連接至藥物單元(-D)。可天然或經由化學操作存在於FLT3 MAb(例如，CHv62.21或CHv62.21pAF)上之有用之官能基包括(但不限於)酮基、醛基、巯基、胺基、羥基、碳水化合物之變旋異構羥基、及羧基。合適之官能基係酮基、醛基、巯基及胺基。在一個實例中，該酮基係在併入本發明之MAb內之非天然胺基酸(nnAA)上。在另一實例中，該醛基係在併入本發明之MAb內之nnAA上。在另一實例中，巰基可藉由FLT3 MAb之分子內雙硫鍵之還原產生。在另一實施例中，巰基可藉由FLT3 MAb 之離胺酸部分之胺基與2-亞胺基硫烷(Traut試劑)或其他產生巯基之試劑反應產生。在某些實施例中，該FLT3 MAb係重組抗體且經改造以攜載一或多個離胺酸。在某些其他實施例中，該重組FLT3 MAb係經改造以攜載額外之巰基(例如，額外之半胱胺酸)。
在一個實施例中，該延伸子單元與抗體單元之酮基形成肟鍵。該酮基存在於併入MAb中之nnAA上。
已自甚至其中未明確指示之所有例示性實施例中瞭解，1至20個藥物部分可連接至抗體(p=1至20)。
胺基酸單元
胺基酸單元(-W-)當存在時將延伸子單元連接至間隔子單元(若該間隔子單元存在)，將延伸子單元連接至藥物部分(若缺乏間隔子單元)，及將抗體單元連接至藥物單元(若缺乏延伸子單元及間隔子單元)。
Ww-可為(例如)單肽、二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽單元。各-W-單元獨立地具有下文方括號中指示之式且w係0至12之整數：
其中R19包括(但不限於)氫、甲基、異丙基、異丁基、第二丁基、苄基、對羥基苄基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、- (CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、環己基。為進一步參考，參見(US2014/0072586及WO2012/047724，其等以引用之方式完全併入本文中)。
在某些實施例中，該胺基酸單元可包含天然胺基酸。在其他實施例中，該胺基酸單元可包含非天然胺基酸。
在一些實施例中，該胺基酸單元可藉由一或多種酶(包括與癌症或腫瘤相關聯之蛋白酶)酶促裂解，以釋放藥物單元(-D)，其在一個實施例中一經釋放即經活體內質子化以提供藥物(D)。
在胺基酸單元之一個態樣中，該胺基酸單元係纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)。在另一態樣中，該胺基酸單元係苯丙胺酸-離胺酸(即，fk)。在胺基酸單元之又另一態樣中，該胺基酸單元係N-甲基纈胺酸-瓜胺酸。
VII.)間隔子單元
間隔子單元(-Y-)當存在時將胺基酸單元連接至藥物單元(當胺基酸單元存在時)。或者，該間隔子單元將延伸子單元連接至藥物單元(當缺乏胺基酸單元時)。當胺基酸單元及延伸子單元皆不存在時，該間隔子單元亦將藥物單元連接至抗體單元。間隔子單元具有兩種一般類型：非自我分解型或自我分解型。此項技術中已知本發明之可能之間隔子單元之實例。參見，Toki等人，2002,J.Org.Chem.67：1866-1872 and Nature Biotechnology 21(7)：778-784)。
自我分解型間隔子單元之其他實例包括(但不限於)電子類似於PAB基團之芳族化合物，諸如2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等人，1999,Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)及鄰位或對位胺基苄基縮醛。可使用醯胺鍵一經水解即經受環化之間隔子單元，諸如經取代或未經取代之4-胺基丁酸醯胺(Rodrigues等人，1995,Chemistry Biology 2：223)、經適當取代之雙環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環系統(Storm等人，1972,J.Amer.Chem.Soc.94：5815)及2-胺基苯基丙酸醯胺(Amsberry等人，1990,J.Org.Chem.55：5867)。在甘胺酸之α-位置經取代之含胺藥物之消除(Kingsbury等人，1984,J.Med.Chem.27：1447)亦係自我分解型間隔子單元之實例。
VIII.)藥物單元
藥物單元(D)可為任何治療劑。例如，該藥物單元可為部分，其係細胞毒性、細胞增殖抑制或免疫調節(例如，免疫抑制)或化學治療劑。D係具有可與間隔子單元(若存在)；與胺基酸單元(若存在)；與延伸子單元(若存在)或與抗體單元成鍵之原子之藥物單元(部分)。在一些實施例中，該藥物單元D具有可與間隔子單元(若使用)成鍵之氮原子。如本文使用，術語「藥物單元」及「藥物部分」係同義詞且可交換使用。
細胞毒性或免疫調節劑之有用類別包括(例如)抗微管蛋白劑、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑及烷化劑。在一些實施例中，該藥物係奧瑞司他汀，諸如奧瑞司他汀E(此項技術中亦稱為海兔毒素-10之衍生物)或其衍生物。其他典型之奧瑞司他汀包括AFP、MMAF及MMAE。例示性奧瑞司他汀之合成及結構描述於美國專利案第6,323,315；6,239,104；6,034,065；5,780,588；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,816,444及4,486,414號中，該等案件各以全文引用之方式併入本文中且用於所有目的。
在一些實施例中，該藥物單元係卡奇黴素、喜樹鹼(camptothecin)、美登素類或蒽環黴素(anthracyclinc)。在一些實施例中，該藥物係紫杉烷、拓樸異構酶抑制劑、長春花生物鹼或類似物。
在一些典型實施例中，合適之細胞毒性劑包括(例如)DNA小溝結合劑(例如，烯二炔及雷西曲星(lexitropsin)、CBI化合物；亦參見美國專利案第6,130,237號)、多卡米新、紫杉烷(例如，太平洋紫杉醇及多西他賽)、嘌呤黴素及長春花生物鹼。其他細胞毒性劑包括(例如)CC-1065、SN-38、拓撲替康、嗎啉基-多柔比星、根黴素、氰基嗎啉基-多柔比星、棘黴素、考布他汀(combretastatin)、紡錘菌素、埃博黴素A及B、雌莫司汀、念珠藻素、西馬多汀、美登素類、海綿內酯、軟珊瑚醇(eleutherobin)及米托蒽醌。
在一些實施例中，該藥物係抗微管蛋白劑。抗微管蛋白劑之實例包括奧瑞司他汀、紫杉烷(例如，Taxol®(太平洋紫杉醇)、Taxotere®(多西他賽))、T67(Tularik)及長春花生物鹼(例如，長春新鹼、長春花鹼、長春地辛及長春瑞濱)。其他抗微管蛋白劑包括(例如)漿果赤黴素衍生物、紫杉烷類似物(例如，埃博黴素A與B)、諾考達唑、秋水仙鹼及秋水仙醯胺、雌莫司汀、隱藻素(cryptophycin)、西馬多汀、美登素類、考布他汀、海綿內酯及軟珊瑚醇。
在某些實施例中，該細胞毒性劑係美登素類(抗微管蛋白劑之另一組)。例如，在具體實施例中，該美登素類係美登素或DM-1(ImmunoGen,Inc.；亦參見Chari等人，1992,Cancer Res.52：127-131)。
在某些實施例中，該細胞毒性或細胞增殖抑制劑係海兔毒素。在某些實施例中，該細胞毒性或細胞增殖抑制劑係奧瑞司他汀類別。
在另一實施例中，藥物單元係新穎多拉脯胺酸-多拉異白胺酸(dolaproine-dolaisoleuine)肽類似物。因此，本文提供式(I)化合物：
其中R1及R2各獨立地係-H或烷基；X係-O-、-NRz-、-S-或不存在；其中Rz係-H或烷基； R3係具有下式之基團：；其中R15及R16各獨立地係-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、烷基、烯基、炔基、-烷基-OH、-烷基-NH2、-烷基-SH或-烷基-N3； R4係具有下式之基團：；其中R17及R18各獨立地係-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、烷基、烯基、炔基、-烷基-OH、-烷基-NH2、-烷基-SH、-烷基-N3或-烷基-CO2H；R5係第二丁基或異丁基；R6係-H或烷基；R7及R8各獨立地係-H、烷基、-CO2Ra、CONRbRc、經取代或未經取代之苯基或經取代或未經取代之雜環；其中Ra係-H或烷基；Rb及Rc各獨立地係H或烷基；R9係-H或烷基；或R9連同R4及其等連接之原子形成經取代或未經取代之雜環烷基環；R10係-H或烷基；R11係-H或烷基；R12係-H或烷基；R13係-H或烷基；及R14係-H、-OH或烷基； 限制條件為當X不存在且R15、R16、R17及R18各係甲基時，則R8非係經取代或未經取代之苯基或經取代或未經取代之雜環；或其醫藥上可接受之鹽。
在一些實施例中，R1及R2各獨立地係-H或烷基，例如C1-6烷基。在一些實施例中，R1及R2各獨立地係-H或甲基。在一些實施例中，R1及R2各獨立地係烷基。在一些實施例中，R1及R2皆為甲基。在一些實施例中，R1及R2皆為-H。
在一些實施例中，X係不存在的。在其他實施例中，X係-O-。在一些實施例中，R1及R2各獨立地係烷基，且X係不存在的。在一些實施例中，R1及R2皆為甲基，及X係不存在的。在其他實施例中，R1及R2皆為-H，且X係-O-。在一些實施例中，X係-NRz-，其中Rz係-H或烷基。在一些實施例中，Rz係-H。在一些實施例中，X係Rz係烷基，例如C1-6烷基或甲基。
在某些實施例中，R3係，其中R15及R16各獨立地係-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、烷基、烯基、炔基、-烷基-OH、-烷基-NH2、-烷基-SH或-烷基-N3。在又其他實施例中，R15及R16各獨立地係-H、烷基、-(CH2)0-6C≡CH、-(CH2)0-6CH=CH2、-(CH2)0-6OH、-(CH2)0-6NH2、-(CH2)0-6SH或-(CH2)0-6N3。在一些實施例中，R15及R16各獨立地係-H、-OH或烷基。在一些實施例中，R15及R16各獨立地係-H、-OH或甲基。在一些實施例中，R15係-OH且R16係氫。在一些實施例中，R15係-OH且R16係甲基。
在某些實施例中，R3係相對於分子之剩餘部分呈R立體化學組態。在其他實施例中，R3係相對於分子之剩餘部分呈S立體化學組態。在某些實施例中，該R3基團本身含有一或多個對掌性中心，且彼等立體中心各獨立地呈R或S組態。
在某些實施例中，R4係，其中R17及R18各獨立地係-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、烷基、烯基、炔基、-烷基-OH、-烷基-NH2、-烷基-SH、-烷基-N3或-烷基-CO2H。在其他實施例中，R4係，其中R17係-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、烷基、烯基、炔基、-烷基-OH、-烷基-NH2、-烷基-SH、-烷基-N3或-烷基-CO2H，且R18係-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、烯基、炔基、-烷基-OH、-烷基-NH2、-烷基-SH、-烷基-N3或-烷基-CO2H。在又其他實施例中，R17及R18各獨立地係-H、烷基、-(CH2)0-6C≡CH、-(CH2)0-6CH=CH2、-(CH2)0-6OH、-(CH2)0-6NH2、-(CH2)0-6SH或-(CH2)0-6N3。在一些實施例中，R17及R18各獨立地係-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、烷基、-烷基-NH2或-烷基-N3。在一些實施例中，R17及R18各獨立地係-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、甲基、-CH2NH2或-CH2N3。
在某些實施例中，R4連同R9及其等連接之原子形成經取代或未經取代之雜環烷基環。在某些實施例中，R4連同R9及其等連接之原子形成5員至7員雜環烷基環，其可未經取代或經一或多個選自-OH、-NH2、-SH及-N3之基團取代。在某些實施例中，該雜環烷基環係吡咯啶環，其可未經取代或經一或多個選自-OH、-NH2、-SH及-N3之基團取代。
在某些實施例中，R4係相對於分子之剩餘部分呈R立體化學組態。在其他實施例中，R4係相對於分子之剩餘部分呈S立體化學組態。在某些實施例中，該R4基團本身含有一或多個對掌性中心，且彼等立體中心各獨立地呈R或S組態。
在某些實施例中，R5係第二丁基。在其他實施例中，R5係異丁基。在某些實施例中，R5係相對於分子之剩餘部分呈R立體化學組 態。在其他實施例中，R5係相對於分子之剩餘部分呈S立體化學組態。在一些實施例中，R5基團內之對掌性中心係呈R組態，及在其他實施例中，該中心係呈S組態。
在某些實施例中，R6係-H。在其他實施例中，R6係烷基，例如C1-8烷基、C1-4烷基、甲基或乙基。
在一些實施例中，R7及R8各獨立地係-H、烷基、-CO2Ra或-CONRbRc；其中Ra係-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；及Rb及Rc各獨立地係-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基。
在某些實施例中，R7及R8各獨立地係經取代或未經取代之苯基或經取代或未經取代之雜環，其中該苯基或雜環可經一或多個選自鹵素、側氧基、羥基、胺基、烷基及烷氧基之基團取代。在某些其他實施例中，R7係未經取代之3員至8員雜環。在某些其他實施例中，R7係經取代之3員至8員雜環。在某些其他實施例中，R8係視需要經鹵素取代之苯基。
在某些實施例中，R7係相對於分子之剩餘部分呈R立體化學組態。在其他實施例中，R7係相對於分子之剩餘部分呈S立體化學組態。
在某些實施例中，R8係相對於分子之剩餘部分呈R立體化學組態。在其他實施例中，R8係相對於分子之剩餘部分呈S立體化學組態。
在一些實施例中，R7係-CO2Ra-CONRbRc；四唑基或噻唑基，其中Ra係-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；且Rb及Rc各獨立地係-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；且R8係視需要經鹵素取代之苯基。
在一些實施例中，R9係-H。在其他實施例中，R9係烷基，例如C1-8烷基、C1-4烷基、甲基或乙基。在一些實施例中，R9係-H或甲基。在一些實施例中，R9係甲基。
在一些實施例中，R10係-H。在其他實施例中，R10係烷基，例如C1-8烷基、C1-4烷基、甲基或乙基。在一些實施例中，R10係-H或甲基。在一些實施例中，R10係甲基。
在一些實施例中，R11係-H。在其他實施例中，R11係烷基，例如C1-8烷基、C1-4烷基、甲基或乙基。在一些實施例中，R11係-H或甲基。在一些實施例中，R11係甲基。
在一些實施例中，R12係-H。在其他實施例中，R12係烷基，例如C1-8烷基、C1-4烷基、甲基或乙基。在一些實施例中，R12係-H或甲基。在一些實施例中，R12係甲基。
在一些實施例中，R13係-H。在其他實施例中，R13係烷基，例如C1-8烷基、C1-4烷基、甲基或乙基。在一些實施例中，R13係-H或甲基。在一些實施例中，R13係甲基。
在一些實施例中，R14係-H。在一些實施例中，R14係烷基，例如C1-6烷基、甲基或乙基。在一些實施例中，R14係-OH。
在某些實施例中，R14係相對於分子之剩餘部分呈R立體化學組態。在其他實施例中，R14係相對於分子之剩餘部分呈S立體化學組態。
在一些實施例中，R7係-CO2Ra，其中Ra係-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；R8係苯基；且R14係-H。在一些實施例中，R7係-CONRbRc，其中Rb及Rc各獨立地係-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；R8係苯基；且R14係-H。在一些實施例中，R7係烷基，例如C1-6烷基或甲基；R8係苯基；且R14係-OH。在一些實施例中，R7係甲基，R8係苯基，且R14係-OH。在一些實施例中，R7及R14皆為-H，且R8係吡啶基、哌啶基、未經取代之苯基或經鹵素(例如氟、氯或溴)取代之苯基。在一些實施例中，R7係-CO2Ra，其中Ra係-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；R8係-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；且R14係烷基，例如 C1-6烷基、甲基或乙基。在一些實施例中，R7係-CO2Ra，其中Ra係-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；R8係-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；且R14係-OH。
在某些實施例中，R1及R2各獨立地係-H或C1-6烷基；X係-O-或不存在；R3係；其中R15及R16各獨立地係-H、-OH或C1-6烷基； R4係；其中R17係-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、-C1-6烷基-NH2、炔基、烯基或-C1-6烷基-N3；且R18係-H或C1-6烷基；R5係第二丁基；R6係-H；R7係-H、C1-6烷基、-CO2Ra、-CONRbRc、四唑基或噻唑基；其中Ra係-H或C1-6烷基；且Rb及Rc各係-H或C1-6烷基；R8係-H、C1-6烷基、經取代或未經取代之苯基或經取代或未經取代之雜環；R9係-H；R10、R11、R12及R13各獨立地係C1-6烷基；及R14係-H、C1-6烷基或-OH。
在某些實施例中，R1及R2各獨立地係-H或甲基；X係-O-或不存在；R3係；其中R15及R16各獨立地係-H、-OH或甲基； R4係；其中R17係-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、胺基甲基、炔基、烯基或疊氮基甲基；且R18係-H或甲基； R5係第二丁基；R6係-H；R7係-H、甲基、-CO2Ra或-CONRbRc；其中Ra係-H或甲基；且Rb及Rc各係-H或甲基；R8係-H、甲基、乙基、吡啶基、哌啶基、未經取代之苯基、經鹵素取代之苯基；R9係-H；R10、R11、R12及R13各係甲基；及R14係-H、甲基或-OH。
在某些實施例中，R1及R2各獨立地係-H或C1-6烷基；X係不存在的； R3係；其中R15及R16各獨立地係-H、-OH或C1-6烷基； R4係；其中R17係-N3，且R18係-H或甲基；R5係第二丁基；R6係-H；R7係-H、C1-6烷基、-CO2Ra、-CONRbRc、四唑基或噻唑基；其中Ra係-H或C1-6烷基；且Rb及Rc各係-H或C1-6烷基；R8係-H、C1-6烷基、經取代或未經取代之苯基或經取代或未經取代之雜環；R9係-H；R10、R11、R12及R13各獨立地係C1-6烷基；及R14係-H、C1-6烷基或-OH。
在某些實施例中， R1及R2各獨立地係-H或C1-6烷基；X係-O-；R3係；其中R15及R16各獨立地係-H、-OH或C1-6烷基；R4係；其中R17係-N3，及R18係-H或甲基；R5係第二丁基；R6係-H；R7係-H、C1-6烷基、-CO2Ra、-CONRbRc、四唑基或噻唑基；其中Ra係-H或C1-6烷基；且Rb及Rc各係-H或C1-6烷基；R8係-H、C1-6烷基、經取代或未經取代之苯基或經取代或未經取代之雜環；R9係-H；R10、R11、R12及R13各獨立地係C1-6烷基；及R14係-H、C1-6烷基或-OH。
在式(I)之一些實施例中，其中，R1及R2各係甲基；X係不存在的； R3係具有下式之基團：其中R15及R16各係甲基； R4係具有下式之基團：；其中R17係-N3、-NH2、-OH、-SH且R18係-H或甲基；R5係第二丁基；R6係-H；R7係-CO2Ra或CONRbRc，其中Ra係-H或C1-6烷基； Rb及Rc各獨立地係H或C1-6烷基；R8係苯基；R9係-H；R10、R11、R12及R13各獨立地係甲基；及R14係-H。
在式(I)之一些實施例中，其中，R1及R2各係-H；X係-O-； R3係具有下式之基團：其中R15及R16各係甲基； R4係具有下式之基團：；其中R17係-N3且R18係-H或甲基；R5係第二丁基；R6係-H；R7係-CO2Ra或CONRbRc，其中Ra係-H或C1-6烷基；Rb及Rc各獨立地係H或C1-6烷基；R8係苯基；R9係-H；R10、R11、R12及R13各獨立地係甲基；及R14係-H。
應瞭解本文提供之任何可變基團定義可與本文提供之任何其他可變基團組合使用，以使得預期本文提供之可變基團之所有可能之組合及置換(其中化學可行)。
在某些實施例中，式(I)化合物係選自由以下組成之群： (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-3-羥基-N-甲基丙醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3R)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-3-羥基-N-甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-(二甲基胺基)-N-((S)-3-羥基-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-((2-(吡啶-2-基)乙基)胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-3-甲基丁醯胺；(2S,3R)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-3-羥基-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-((2-(吡啶-2-基)乙基)胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基丁醯胺；(2S)-2-(二甲基胺基)-N-((2S)-3-羥基-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((2S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-((2-(哌啶-2-基)乙基)胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-3-甲基丁醯胺；(2S,3R)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-3-羥基-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((2S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-((2-(哌啶-2-基)乙基)胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基丁醯胺；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-疊氮基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-3-胺基-2-((S)-2-(二甲 基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丙醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-N-((S)-3-胺基-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-((2-(吡啶-2-基)乙基)胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-3-疊氮基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丙醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-4-疊氮基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-4-胺基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((S)-2-(胺氧基)-3-甲基丁醯胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-((2-(吡啶-2-基)乙基)胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N,3-二甲基丁醯胺；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-羥基丙醯胺基)-N,3-二甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-L-苯丙胺酸；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((2S,3R)-2-(二甲基胺基)-3-羥基丁醯胺基)-N,3-二甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-L-苯丙胺酸；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-疊氮基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚 醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸；(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-胺基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-2-((2S,3R)-2-(二甲基胺基)-3-羥基丁醯胺基)-N,3-二甲基丁醯胺；(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-胺基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-羥基丙醯胺基)-N,3-二甲基丁醯胺；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((R)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-3-巰基-N-甲基丙醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((R)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-3-巰基-N-甲基丙醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-3-羥基-N-甲基丙醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3R)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-3-羥基-N-甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-羥基丙醯胺基)-N,3-二甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((2S,3R)-2-(二甲基胺基)-3-羥基丁醯胺基)-N,3-二甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯 基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-胺基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-胺基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸；(2S,3S)-3-疊氮基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-(苯乙基胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基丁醯胺；(2S,3S)-3-疊氮基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基丁醯胺；(2S,3S)-3-疊氮基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-氯苯乙基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺；(2S,3S)-3-疊氮基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((2-氯苯乙基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺；(2S,3S)-3-胺基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-(苯乙基胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基丁醯 胺；(2S,3S)-3-胺基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基丁醯胺；(2S,3S)-3-胺基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-氯苯乙基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺；(2S,3S)-3-胺基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((2-氯苯乙基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺；(S)-4-胺基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-(苯乙基胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基丁醯胺；(S)-4-胺基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基丁醯胺；(S)-4-胺基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-氯苯乙基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺；(S)-4-胺基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((2-氯苯乙基)胺 基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基戊-4-炔醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-L-苯基丙胺酸甲酯；(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-胺基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-3-疊氮基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺；(2S,3S)-3-疊氮基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-((2-(吡啶-2-基)乙基)胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基丁醯胺；(2S,3S)-3-疊氮基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁基胺基)-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-疊氮基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-L-纈胺酸甲酯；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-6-胺基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基己醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-L-苯基丙胺酸甲酯；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,4S)-4-疊氮基-1-(二甲基-L-纈胺醯基)-N-甲基吡咯啶-2-羧醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶 -2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-L-苯基丙胺酸甲酯；(S)-3-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-4-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)胺基)-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)(甲基)胺基)-4-側氧基丁酸；(2S,3R)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-3-羥基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基丁醯胺；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N,3-二甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-L-絲胺酸甲酯；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-疊氮基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-L-異白胺酸甲酯；(2S,3S)-3-胺基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-胺基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺；(2S,3S)-3-胺基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁基胺基)-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-3-疊氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺基)丙醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-L-苯基丙胺酸甲酯； ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-疊氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-L-苯基丙胺酸甲酯；(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-胺基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-3-疊氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺基)丁醯胺；((2S,3S)-3-疊氮基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁基胺基)-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺基)丁醯胺；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-疊氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-L-苯基丙胺酸第三丁酯；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-疊氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-L-苯丙胺酸；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-疊氮基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-L-苯基丙胺酸第三丁酯；(2S,3S)-3-疊氮基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基丁醯胺；(2S,3S)-3-疊氮基-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)胺基)丙 基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺基)丁醯胺；(2S,3S)-3-疊氮基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基丁醯胺；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-胺基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-甲基丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯基)-L-苯基丙胺酸第三丁酯；(2S,3S)-3-胺基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基丁醯胺；及(2S,3S)-3-胺基-2-((S)-2-(二甲基胺基)-3-甲基丁醯胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)胺基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N-甲基丁醯胺；及其醫藥上可接受之鹽。
本文亦提供式(I)化合物之醫藥上可接受之鹽(較佳係彼等上文描述者及本文例示之特定化合物之醫藥上可接受之鹽)、包含此類鹽之醫藥組合物及使用此類鹽之方法。
「醫藥上可接受之鹽」旨在意謂本文表示之化合物之游離酸或游離鹼之鹽，其係無毒、生物可容許或另外在生物上適用於向個體投與。參見通常S.M.Berge等人，「Pharmaceutical Salts」，J.Pharm.Sci.1977,66,1-19。較佳之醫藥上可接受之鹽係彼等藥理上有效且適用於與個體之組織接觸而無異常毒性、刺激性或過敏反應者。本文描述之 化合物可具有足夠酸性之基團、足夠鹼性之基團或該等兩種類型之官能基並因此與許多無機鹼或有機鹼及無機酸及有機酸反應以形成醫藥上可接受之鹽。醫藥上可接受之鹽之實例包括：酸加成鹽，諸如硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、一氫磷酸鹽、二氫磷酸鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、丁炔-1,4-二酸鹽、己炔-1,6-二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、酞酸鹽、磺酸鹽、甲基磺酸鹽、丙基磺酸鹽、苯磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、苯基乙酸鹽、苯基丙酸鹽、苯基丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥基丁酸鹽、甘醇酸鹽、酒石酸鹽及杏仁酸鹽；及與無機鹼(諸如鈉、鉀、鎂、鈣、鋁及類似物)或有機鹼(諸如甲胺、乙胺、乙醇胺、離胺酸、鳥胺酸及類似物)形成之鹽；與各種胺基酸或胺基酸衍生物諸如乙醯基白胺酸及類似物)形成之鹽；銨鹽等。
出於治療目的，包含本文描述之化合物之醫藥組合物可進一步包含一或多種醫藥上可接受之賦形劑。醫藥上可接受之賦形劑係非毒性且另外在生物上適用於向個體投與之物質。此類賦形劑促進本文描述之化合物之調配及投與且與活性成分相容。醫藥上可接受之賦形劑之實例包括穩定劑、潤滑劑、表面活性劑、稀釋劑、抗氧化劑、黏合劑、著色劑、乳化劑或口味改良劑。在較佳實施例中，醫藥組合物係無菌組合物。
本文描述之醫藥組合物可根據此項技術中已知的用於製備各種劑型之習知方法調配成含於合適之醫藥溶劑或載劑中之溶液、乳液、懸浮液或分散液或調配成丸劑、錠劑、菱形糖、栓劑、用於復原之粉 劑或攜載固體載劑之膠囊。就局部應用而言，本文描述之化合物較佳調配成適用於局部投與之霜劑或軟膏或類似載體。本文描述之醫藥組合物及化合物可在本發明方法中藉由合適之遞送路徑(例如，經口、經鼻、非經腸、經直腸、局部、經眼睛或經吸入)投與。
如本文使用之術語「治療(treat或treating)」旨在係指出於產生治療利益之目的向個體投與本文描述之化合物。治療包括逆轉、減輕、緩解、抑制疾病、失調症或病症或癌症之一或多種症狀之發展或減小疾病、失調症或病症或癌症之一或多種症狀之嚴重性。術語「個體」係指需此種治療之哺乳動物病患(諸如人類)。
在本文提供之治療方法中，「有效量」意謂足以通常在需此種治療之個體中產生所需治療利益之量或劑量。此外，術語「治療有效量」意謂相較於未接受此種量之相應之個體，導致(但不限於)疾病、失調症或副作用之治癒、預防或減輕或減小疾病或失調症之發展速率之任何量。該術語亦將有效增強正常生理功能之量及有效引起個體(例如人類)中之生理功能之量包括在其範圍內，其增強或有助於第二醫藥劑之治療性效應。本文描述之化合物之有效量(包括治療有效量)或劑量可藉由例行方法(諸如建模、劑量遞增或臨床試驗)，將例行因素例如，投與或藥物遞送之模式或途徑；藥劑之藥物動力學；感染之嚴重性及病程；個體之健康狀態、病症與體重及治療醫師之判斷考慮在內來確定。用於本文揭示之抗體藥物結合物之例示性劑量係在每公斤個體體重每天約1ug至2mg活性化合物之範圍內；較佳約0.05至100mg/kg/day或約1至35mg/kg/day或約0.1至10mg/kg/day。總劑量可以單一或分開之劑量單元(例如，BID、TID、QID)給定。
本文描述之化合物可在癌症之治療中與額外活性成分組合用於醫藥組合物或方法中。該等額外活性成分可獨立於本文描述之化合物投與或可與本文描述之化合物一起包含於本文提供之醫藥組合物中。 例如，額外活性成分係彼等已知或已發現可有效治療癌症者，包括彼等針對與癌症相關聯之另一目標之活性者，諸如(但不限於)維卡德(Velcade)、利妥昔單抗、胺甲喋呤、Herceptin、長春新鹼、強體松、伊立替康(Irinotecan)或類似物或其組合。此種組合可有助於增加所揭示化合物之療效；減少一或多種副作用或減小所需劑量。
現將藉由參考下文用於式(I)化合物之一般製法之繪示性合成方案及後續具體實例描述式(I)化合物。技工將知曉為獲得本文之各種化合物，可適當選擇起始材料以使得最終所需取代基將通過視需要具有或不具有保護之反應方案攜載以產生所需產品。或者，可必需或需要採用可通過反應方案攜載且視需要經所需取代基置換之合適基團代替最終所需取代基。另外，熟習此項技術者將知曉保護基團可用以自反應條件下保護某些官能基(胺基、羧基或側鏈基團)，且在適當時於標準條件下移除此類基團。繪示於方案A中之反應中之各者較佳在自約室溫至所用有機溶劑之回流溫度之溫度下進行。除非另有規定，否則變量係如上文參考式(I)所定義。
參考方案A，式(I)化合物之製法起始於標記為(A)之多拉異白胺酸(Dil)之經保護之酸形式(參見Pettit等人，(1994)J.Org.Chem.59：1796-1800)。化合物(A)係以第三丁基酯保護基團繪示，但熟習此項技術者可選擇適當之替代者。與氮受保護之纈胺酸或異白胺酸衍生物(B)(其中PG係合適之胺基保護基團，諸如Boc(第三丁氧基羰基)或茀基甲氧基羰基(Fmoc)基團)之偶合係在標準肽偶合條件下實現。例如，反應係在以下各物之存在下進行：氰基膦酸二乙酯(DEPC)、PyBrOP、PyBOP、BOP、二異丙基碳二亞胺(DIC)、二環己基碳二亞胺(DCC)、1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、1-羥基-7-氮雜-苯并三唑(HOAt)、HBTU(六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓)、HATU(六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓)及類似物或其組合。反應通常在三級胺鹼(諸如二異丙基乙胺)之存在下進行。合適之溶劑包括二氯甲烷、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基亞碸(DMSO)、乙酸乙酯及類似物。所得之二肽(C)上之胺基保護基團係藉由在合適條件下之去保護來移除。例如，在PG係Boc基團之情況下，化合物(C)係經三氟乙酸處理以形成游離胺(D)。在PG係Fmoc基團之情況下，化合物(C)係經哌啶或二乙胺處理以產生化合物(D)。然後化合物(D)在如上文描述之肽偶合條件下偶合至胺基酸衍生物(E)(若必要可呈受保護之形式)，以產生三肽(F)。用酸處理以移除羧基保護基團以提供游離酸(G)。
方案B
參考方案B，使命名為(H)之胺基受保護之多拉脯胺酸(Dap)(參見Pettit等人，(1994)J.Org.Chem.59：6287-6295)與胺(J)(使用熟習此項技術者已知的方法製得)在如上文描述之肽偶合條件下偶合。所得之二肽(K)係如針對方案A討論去保護以提供化合物(L)。
參考方案C，酸(G)及胺(L)係在如上文討論之肽偶合條件下偶合以提供式(I)化合物。其中反應結果係式(I)之受保護形式，採用合適之去保護條件以產生目標化合物。
本文亦提供包含有效量之至少一種式(I)化合物或其醫藥上可接受之鹽及醫藥上可接受之賦形劑之醫藥組合物。
本文亦提供治療罹患癌症或經診斷患有癌症之個體之方法，該方法包括向需此種治療之個體投與有效量之至少一種式(I)化合物或其醫藥上可接受之鹽。
本文亦提供至少一種式(I)化合物或其醫藥上可接受之鹽於治療需此種治療之個體中之癌症之用途。
本文亦提供至少一種式(I)化合物或其醫藥上可接受之鹽於製造用於治療需此種治療之個體中之癌症之藥劑之用途。
本文亦提供含有至少一種式(I)化合物或其醫藥上可接受之鹽之 套組(其用於治療需此種治療之個體中之癌症)及使用說明。
本文亦提供包含至少一種式(I)化合物或其醫藥上可接受之鹽之製造之物件，其用於治療需此種治療之個體中之癌症。
本文亦提供抗體藥物結合物(ADC)，其中式(I)化合物結合至抗體。
利用式(I)之例示性ADC具有下列結構，其中「L」或「mAb-s-」表示命名為本文闡述之CHv62.21之FLT3 MAb。
另外，利用式(I)之其他例示性ADC具有下列結構，其中「L」或「mAb-s-」表示命名為本文闡述之CHv62.21pAF之FLT3 MAb。
在一較佳實施例中，式(I)化合物包含藥物單元，該等藥物單元包含表示為(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-胺基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-3-疊氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺基)丁醯胺之化合物。
在一較佳實施例中，式(I)化合物包含藥物單元，該等藥物單元包含下文闡述為式(II)之化合物：
IX.)藥物負載
藥物負載由p表示且係分子中每個抗體之藥物部分之平均數量。藥物負載可在每個抗體1至20個藥物部分(D)之範圍內。本發明之ADC包括與自1至20個藥物部分結合之抗體之集合。在由結合反應製備ADC中每個抗體之藥物部分之平均數量可藉由習知方式諸如質譜法及ELISA分析來表徵。亦可測定ADC中p之定量分佈。在一些實例中， 其中p係具有其他藥物負載之ADC之某一值之均質ADC之分離、純化及表徵可藉由諸如電泳之方式達成。
就一些抗體-藥物結合物而言，p可受抗體上之連接位點之數量限制。例如，在該連接係半胱胺酸硫醇之情況下，抗體可具有僅一個或數個半胱胺酸硫醇基團，或可具有僅一個或數個足夠反應性硫醇基團，連接子可通過該等基團連接。在某些實施例中，較高藥物負載(例如，p>5)可引起某些抗體-藥物結合物聚集、不溶、具毒性或損失細胞滲透性。在某些實施例中，本發明之ADC之藥物負載在自1至約8之範圍內；自約2至約6之範圍內；自約3至約5之範圍內；自約3至約4之範圍內；自約3.1至約3.9之範圍內；自約3.2至約3.8之範圍內；自約3.2至約3.7之範圍內；自約3.2至約3.6之範圍內；自約3.3至約3.8之範圍內或自約3.3至約3.7之範圍內。事實上，已顯示針對某些ADC而言，每個抗體之藥物部分之最佳比率可小於8且可約2至約5。
在某些實施例中，小於理論最大值之藥物部分在結合反應期間結合至抗體。如下文討論，抗體可含有(例如)不與藥物-連接子中間物或連接子試劑反應之離胺酸殘基。通常，抗體不含有可連接至藥物部分之許多游離及反應性半胱胺酸硫醇基團；事實上抗體中大多數半胱胺酸硫醇殘基以雙硫橋形式存在。在某些實施例中，抗體可用還原劑諸如二硫蘇糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)在部分或完全還原條件下還原，以產生反應性半胱胺酸硫醇基團。在某些實施例中，使抗體經受變性條件以暴露反應性親核基團(諸如離胺酸或半胱胺酸)。
ADC之負載(藥物/抗體比率)可用不同方式進行控制，例如，藉由：(i)相對於抗體限制藥物-連接子中間物或連接子試劑之莫耳過量；(ii)限制結合反應時間或溫度；(iii)部分限制或限制用於半胱胺酸硫醇修飾之還原條件；(iv)藉由重組技術改造抗體之胺基酸序列以使得半胱胺酸殘基之數量及位置經修飾以控制連接子-藥物結合之數 量及/或位置(諸如如本文及WO2006/034488(以全文引用之方式併入本文中)中所揭示製得之thioMab或thioFab)。
應瞭解當多於一個親核基團與藥物-連接子中間物或連接子試劑、接著藥物部分試劑反應時，然後所得產物係具有一或多個藥物部分連接至抗體之分佈之ADC化合物之混合物。每個抗體之藥物平均數量可自混合物藉由雙ELISA抗體分析計算，該分析對抗體具有特異性且對藥物具有特異性。個別ADC分子可藉由質譜法於混合物中識別出並藉由HPLC例如疏水性相互作用層析法分離(參見，例如，Hamblett,K.J.等人，「Effect of drug loading on the pharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate」，摘要編號624，American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting,March 27-31,2004,Proceedings of the AACR，第45卷，March 2004；Alley,S.C.等人，「Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates」，摘要編號627，American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting,March 27-31,2004,Proceedings of the AACR，第45卷，March 2004)。在某些實施例中，具有單一負載值之均質ADC可藉由電泳或層析法自結合混合物分離。
X.)測定ADC之細胞毒性效應之方法
判定藥物或抗體-藥物結合物是否對細胞發揮細胞增殖抑制及/或細胞毒性效應之方法係已知的。通常，抗體藥物結合物之細胞毒性或細胞增殖抑制活性可藉由以下量測：將表現抗體藥物結合物之靶蛋白之哺乳動物細胞曝露於細胞培養基中；培養該等細胞約6小時至約5天之時段；及量測細胞存活率。可使用基於細胞之活體外分析以量測抗體藥物結合物之存活率(增殖)、細胞毒性及細胞凋亡之誘發(卡斯蛋白酶(caspase)活化)。
為判定抗體藥物結合物是否發揮細胞增殖抑制效應，可使用胸苷併入分析。例如，可於96孔板上以每孔5,000個細胞之密度接種表現靶抗原之癌細胞培養72小時時段並在72小時時段之最終8小時期間曝露於0.5μCi 3H-胸苷。在存在或缺乏抗體藥物結合物之情況下量測培養物之細胞中3H-胸苷之併入。
為測定細胞毒性，可量測細胞壞死或細胞凋亡(程序化細胞死亡)。壞死通常伴隨漿膜之滲透性增加；細胞膨脹及漿膜破裂。細胞凋亡之特徵通常為膜起泡、細胞質凝縮及內源性核酸內切酶之活化。對癌細胞之任一此等效應之測定指示抗體藥物結合物適用於癌症治療。
細胞存活率可藉由測定細胞中染料(諸如中性紅、台盼藍或ALAMARTM藍)之吸收來量測(參見，例如，Page等人，1993,Intl.J.Oncology 3：473-476)。在此種分析中，該等細胞可培養在含有該染料之培養基中，清洗該等細胞並藉由分光光度計量測剩餘之染料(其反映細胞對染料之吸收)。亦可使用結合蛋白質之染料磺醯羅丹明B(SRB)以量測細胞毒性(Skehan等人，1990,J.Natl.Cancer Inst.82：1107-12)。
或者，在用於藉由偵測活細胞而非死細胞來測定哺乳動物細胞存活及增殖之定量比色分析中使用四唑鎓鹽(諸如MTT)(參見，例如，Mosmann,1983,J.Immunol.Methods 65：55-63)。
細胞凋亡可藉由量測例如DNA斷裂來定量。可利用用於DNA斷裂之定量活體外測定之市售光度計方法。此類分析之實例(包括基於TUNEL(其偵測斷裂DNA中經標記之核苷酸之併入)及ELISA之分析)描述於Biochemica,1999，第2期，第34至37頁(Roche Molecular Biochemicals)中。
細胞凋亡亦可藉由量測細胞中之形態學變化測定。例如，與細 胞壞死一樣，漿膜完整性之損失可藉由量測某些染料(例如，螢光染料，諸如，例如，吖啶橙或溴化乙錠)之吸收確定。用於量測凋亡細胞數量之方法已由Duke及Cohen,Current Protocols in Immunology(Coligan等人編，1992，第3.17.1至3.17.16頁)描述。細胞亦可經DNA染料(例如，吖啶橙、溴化乙錠或碘化丙啶)標記且觀察細胞之染色質凝縮及沿內核膜之蝕邊現象。可經量測以確定細胞凋亡之其他形態學變化包括(例如)細胞質凝縮；膜起泡增加及細胞收縮。
凋亡細胞之存在可於培養物之附著及「漂浮」部分中量測。例如，兩部分可藉由移除上清液收集；胰蛋白酶消化附著細胞；在離心清洗步驟(例如，以2000rpm進行10分鐘)後合併製備物及偵測凋亡(例如，藉由量測DNA斷裂)。(參見，例如，Piazza等人，1995,Cancer Research 55：3110-16)。
FLT3治療性組合物之活體內效應可於合適之動物模型中評估。例如，可使用異種移植癌症模型，其中將癌症外植體(explant)或繼代異種移植組織引入免疫受損動物諸如裸小鼠或SCID小鼠中(Klein等人，1997,Nature Medicine 3：402-408)。例如，PCT專利申請案WO98/16628及美國專利案6,107,540描述人類前列腺癌之各種異種移植物模型，該等模型可再現原發性腫瘤之發展、微轉移及晚期疾病之特徵成骨性轉移之形成。可使用量測腫瘤形成之抑制、腫瘤消退或轉移及類似過程之分析預測療效。
評估細胞凋亡促進之活體內分析適用於評估治療性組合物。在一個實施例中，可檢查經該治療性組合物治療之攜帶腫瘤之小鼠之異種移植物中細胞凋亡中心之存在並與未經治療之攜帶異種移植物之對照小鼠比較。經治療之小鼠之腫瘤中存在凋亡中心之程度指示該組合物之治療性療效。
用於實施前述方法之治療性組合物可調配成包含適用於所需遞 送方法之載劑之醫藥組合物。合適之載劑包括當與該治療性組合物組合時保留該治療性組合物之抗腫瘤功能且通常不與病患之免疫系統反應之任何材料。實例包括(但不限於)許多標準醫藥載劑諸如無菌磷酸鹽緩衝生理鹽水溶液、抑菌水及類似物中之任何一者(參見，通常，Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，A.Osal.編，1980)。
治療性調配物可經溶解並經由任何可將治療性組合物遞送至腫瘤部位之途徑來投與。潛在有效投與途徑包括(但不限於)靜脈內、非經腸、腹膜內、肌肉內、腫瘤內、皮膚內、器官內、原位及類似途徑。用於靜脈內注射之較佳調配物包含於經防腐處理之抑菌水、未經防腐處理之無菌水之溶液中及/或稀釋於含有0.9%注射用無菌氯化鈉(USP)之聚氯乙烯或聚乙烯包中之治療性組合物。治療性蛋白質製劑可經凍乾並以無菌粉末形式儲存，較佳在真空下儲存，然後於抑菌水(含有例如苄醇防腐劑)或復無菌水中復原後再注射。
使用前述方法治療癌症之劑量及投與方案將隨方法及靶癌症而變化，且將通常取決於此項技術中瞭解之許多其他因素。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合物可因CHv62.21 MAb或CHv62.21pAF MAb之修飾而包含多於一種本發明ADC。例如，本發明包括包含本發明ADC之醫藥組合物，其中該CHv62.21 MAb係缺乏重鏈C端離胺酸之抗體、具有N端轉譯後修飾之抗體、缺乏重鏈C端離胺酸且具有N端轉譯後修飾之抗體及/或具有重鏈C端離胺酸且不具有N端轉譯後修飾之抗體。
例如，本發明之醫藥組合物包括包含兩種或更多種本發明ADC之醫藥組合物，其中ADC之CHv62.21 MAb選自由下列1)至4)組成之群：1)包含重鏈及輕鏈之CHv62.21 MAb，該重鏈由自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成且該輕鏈由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成；2)包含重鏈及輕鏈之CHv62.21 MAb，該重鏈由自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成，其中該N端殘基1(E)轉化成焦麩胺酸，且該輕鏈由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成；3)包含重鏈及輕鏈之CHv62.21 MAb，該重鏈由自SEQ ID NO：9之殘基1(Q)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成，其中將該C端殘基453(K)移除，且該輕鏈由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成；及4)包含重鏈及輕鏈之CHv62.21 MAb，該重鏈由自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成，其中該N端殘基1(E)轉化成焦麩胺酸並將該C端殘基453(K)移除，且該輕鏈由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合物包括包含含有由自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成之重鏈及由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之CHv62.21 MAb及含有由自SEQ ID NO：9之殘基1(Q)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成之重鏈，其中將該C端殘基453(K)移除，及由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之CHv62.21 MAb之醫藥組合物。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合物包括包含含有由自SEQ ID NO：9之殘基1(Q)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成之重鏈，其中將該C端殘基453(K)移除，及由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之CHv62.21 MAb及含有由自SEQ ID NO：9之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成之重鏈，其中該N端殘基1(E)轉化成焦麩胺酸並將該C端殘基 453(K)移除及由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之CHv62.21 MAb之醫藥組合物。
在一較佳實施例中，本發明之醫藥組合物包括包含兩種或更多種本發明ADC之醫藥組合物，其中該ADC之CHv62.21pAF MAb係選自由下列1)至4)組成之群：1)包含重鏈及輕鏈之CHv62.21pAF MAb，該重鏈由自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成且該輕鏈由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成；2)包含重鏈及輕鏈之CHv62.21pAF MAb，該重鏈由自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成，其中該N端殘基1(E)轉化成焦麩胺酸，且該輕鏈由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成；3)包含重鏈及輕鏈之CHv62.21pAF MAb，該重鏈由自SEQ ID NO：11之殘基1(Q)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成，其中將該C端殘基443(T)移除，且該輕鏈由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成；及4)包含重鏈及輕鏈之CHv62.21pAF MAb，該重鏈由自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成，其中該N端殘基1(E)轉化成焦麩胺酸並將該C端殘基443(T)移除，且該輕鏈由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合物包括包含含有由自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成之重鏈及由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之CHv62.21pAF MAb及含有由自SEQ ID NO：11之殘基1 (Q)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成之重鏈，其中將該C端殘基443(T)移除，及由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之CHv62.21pAF MAb之醫藥組合物。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合物包括包含含有自SEQ ID NO：11之殘基1(Q)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成之重鏈，其中將該C端殘基443(T)移除，及由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之CHv62.21pAF MAb及含有由自SEQ ID NO：11之殘基1(E)至殘基453(K)範圍內之胺基酸序列組成之重鏈，其中該N端殘基1(E)轉化成焦麩胺酸並將該C端殘基443(T)移除，及由自SEQ ID NO：10之殘基1(D)至殘基214(C)範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈之CHv62.21pAF MAb之醫藥組合物。
XI.)表現FLT3之癌症之治療
識別FLT3為一組有限組織或細胞中正常表現，但亦於癌症(諸如彼等列於表I中者)中表現之蛋白質為此類癌症之治療開闢許多治療方法。
注意，靶抗腫瘤治療已係有用的，甚至當靶蛋白表現於正常組織或細胞上，甚至表現於正常生命器官組織上。生命器官係維持生命所必需之器官，諸如心臟或結腸。非生命器官係可移除且在移除後個體仍可存活之器官。非生命器官之實例係卵巢、乳房及前列腺。
靶蛋白在正常組織(甚至正常生命組織)中之表現不能阻撓該蛋白質之靶向劑作為某些其中該蛋白質亦過表現之腫瘤之治療劑之效用。例如，在生命器官中之表現本身並不有害。另外，可移除認為不必要之器官(諸如前列腺及卵巢)而不影響壽命。最後，一些生命器官因免疫赦免(immunoprivilege)而不受正常器官表現之影響。免疫赦免器官係受血液器官屏障保護而與血液隔離之器官且因此無法獲得免疫療法。免疫赦免器官之實例係腦及睪丸。
因此，抑制FLT3蛋白活性之治療方法適用於罹患表現FLT3之癌症(諸如，例如，彼等闡述於表I中之癌症)之病患。此等治療方法通常分為三類。第一類調節FLT3功能，因為其與腫瘤細胞生長有關，從而導致腫瘤細胞生長之抑制或延遲或誘發將其殺死。第二類包含抑制FLT3蛋白與其結合配偶體或與其他蛋白質之結合或締合之各種方法。第三類包含抑制FLT3基因之轉錄或FLT3 mRNA之轉譯之各種方法。
因此，可評估癌症病患之FLT3表現之存在及程度，較佳使用腫瘤組織之免疫組織化學評定；定量FLT3成像；或其他可靠地指示FLT3表現之存在及程度之技術。若適用，則腫瘤切片或手術樣本之免疫組織化學分析較佳用於此目的。此項技術中熟知用於腫瘤組織之免疫組織化學分析之方法。
XIII.)FLT3作為基於抗體之療法之標靶
FLT3係用於基於抗體之治療性策略之具吸引力之標靶。此項技術中已知多種用於靶向細胞外及細胞內分子之抗體策略(參見，例如，補體及ADCC介導之殺死及胞內抗體之使用)。因為相對於相應正常細胞，FLT3係由各種譜系之癌細胞表現，所以製備FLT3-免疫反應性組合物之全身性投與，從而顯示極佳敏感性且不會因免疫反應性組合物結合至非靶器官及組織引起之毒性、非特異性及/或非靶效應。與FLT3之結構域特異性反應之抗體適用於全身性治療表現FLT3之癌症，較佳以抗體藥物結合物(即ADC)形式，其中該結合物具有毒素或治療劑。
熟習此項技術者瞭解抗體可用以特異性靶向及結合免疫原性分子(諸如顯示於圖1中之FLT3序列之免疫原性區)。另外，熟習技工瞭解將抗體結合至細胞毒性劑為慣例(參見，例如，Slevers等人，Blood 93：11 3678-3684(June 1,1999))。當將細胞毒性及/或治療劑直接遞送 至細胞時，諸如藉由將其等結合至對由細胞表示之分子(例如，FLT3)具有特異性之抗體，該細胞毒性劑將發揮其對彼等細胞之已知生物效應(即，細胞毒性)。
此項技術中已知用於使用抗體-細胞毒性劑結合物以殺死細胞之各種組合物及方法。在癌症之內文中，典型方法需要向罹患腫瘤之哺乳動物投與生物有效量之結合物，該結合物包含選定之細胞毒性及/或治療劑連接至靶向劑(例如，FLT3 MAb，較佳CHv62.21或CHv62.21pAF)，該靶向劑結合所表現、易結合或定位於細胞表面上之抗原(例如，FLT3)。典型之實施例係將細胞毒性及/或治療劑遞送至表現FLT3之細胞之方法，該方法包括將該細胞毒性劑結合至免疫特異性結合至FLT3抗原決定基之抗體，並將該細胞曝露於抗體藥物結合物(ADC)。另一說明性實施例係治療懷疑罹患轉移性癌症之個體之方法，該方法包括向該個體非經腸投與包含治療有效量之結合至細胞毒性及/或治療劑之抗體之醫藥組合物之步驟。
使用FLT3抗體之癌症免疫療法可根據已成功應用於其他類型癌症之治療中之各種方法完成，其他類型癌症包括(但不限於)結腸癌(Arlen等人，1998,Crit.Rev.Immunol.18：133-138)、多發性骨髓瘤(Ozaki等人，1997,Blood 90：3179-3186；Tsunenari等人，1997,Blood 90：2437-2444)、胃癌(Kasprzyk等人，1992,Cancer Res.52：2771-2776)、B細胞淋巴瘤(Funakoshi等人，1996,J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.19：93-101)、白血病(Zhong等人，1996,Leuk.Res.20：581-589)、結腸直腸癌(Moun等人，1994,Cancer Res.54：6160-6166；Velders等人，1995,Cancer Res.55：4398-4403)及乳癌(Shepard等人，1991,J.Clin.Immunol.11：117-127)。一些治療方法涉及裸抗體結合至毒素或放射性同位素，諸如Y91或I131分別結合至抗CD20抗體(例如，ZevalinTM,IDEC Pharmaceuticals Corp.或BexxarTM,Coulter Pharmaceuticals)，同時其他治療方法涉及抗體及其他治療劑之共投與，諸如HerceptinTM(曲妥珠單抗)及太平洋紫杉醇(Genentech,Inc.)。在一較佳實施例中，該等抗體將結合細胞毒性劑(同上)，較佳命名為MMAE之奧瑞司他汀衍生物(Seattle Genetics)。
儘管FLT3抗體療法適用於癌症之所有階段，但抗體療法可尤其適用於晚期或轉移性癌症中。使用本發明之抗體療法之治療適用於已接受一或多輪化學療法之病患中。或者，將本發明之抗體療法與化學療法或放射方案組合用於尚未接受化學療法治療之病患中。另外，抗體療法可容許使用劑量減少之伴隨化學療法，特別就無法良好耐受化學治療劑之毒性之病患而言。Fan等人，(Cancer Res.53：4637-4642,1993)；Prewett等人，(International J.of Onco.9：217-224,1996)及Hancock等人，(Cancer Res.51：4575-4580,1991)描述各種抗體連同化學治療劑之使用。
治療表I中所述之癌症之FLT3單株抗體包括彼等啟動強效抗腫瘤免疫反應者或彼等具有直接細胞毒性者。在這方面，FLT3單株抗體(MAb)可藉由補體介導或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)機制引起腫瘤細胞溶解，其等皆需要免疫球蛋白分子之完整之Fc部分與補體蛋白上之效應細胞Fc受體位點相互作用。另外，對腫瘤生長發揮直接生物效應之FLT3 MAb適用於治療表現FLT3之癌症。細胞毒性MAb直接起作用之機制包括：細胞生長之抑制；細胞分化之調節；腫瘤血管形成因子概況之調節及細胞凋亡之誘發。特定FLT3 MAb發揮抗腫瘤效應之機制係使用任何數量之評估細胞死亡之活體外分析，諸如ADCC、補體介導之細胞溶解等等分析評估，如此項技術中通常已知。
因此，本發明之治療方法中使用之較佳單株抗體係彼等完全人類者或彼等以高親和力特異性結合至目標FLT3抗原者。
XIV.)FLT3 ADC混合物
本發明之治療方法涵蓋投與單一FLT3 ADC及不同MAb(即，FLT3 MAb或結合另一蛋白質之MAb)之組合或混合物。此類MAb混合物由於含有靶向不同抗原決定基之MAb、利用不同效應機制或將直接細胞毒性Mab與依賴於免疫效應功能之MAb組合而可具有某些優點。組合之此種MAb可顯示協同治療效應。另外，FLT3 MAb可伴隨其他治療性方式，包括(但不限於)各種化學治療劑及生物藥劑、雄激素阻斷劑、免疫調節劑(例如，IL-2、GM-CSF)、手術或放射投與。在一較佳實施例中，該等FLT3 MAb以結合形式投與。
FLT3 ADC調配物係經由可將抗體遞送至腫瘤細胞之任何途徑投與。投與途徑包括(但不限於)靜脈內、腹膜內、肌肉內、腫瘤內、皮膚內等。治療通常涉及經由可接受之投與途徑(諸如靜脈內注射(IV))重複投與FLT3 ADC製劑，其劑量範圍通常包括(但不限於)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25mg/kg體重。一般而言，每週10至1000mg MAb之劑量範圍係有效的且耐受性良好。
基於利用Herceptin®(曲妥珠單抗)治療轉移性乳癌之臨床經驗，MAb製劑之每kg病患體重約4mg的IV初始裝載劑量且接著每週每kg約2mg的IV劑量表示可接受之給藥方案。較佳地，該初始裝載劑量以90分鐘或更長時間之輸注形式投與。該定期維持劑量以30分鐘或更長時間之輸注形式投與，其限制條件為初始劑量耐受良好。如熟習此項技術者知曉，在特定情況下，各種因素可影響理想劑量方案。此類因素包括(例如)所用MAb之結合親和力及半衰期；病患中之FLT3表現程度；循環排出FLT3抗原之程度；所需穩態抗體濃度水平；治療頻率；及化學治療或其他藥劑與本發明之治療方法組合使用之影響及特定病患之健康狀態。
視需要，應於給定樣品中評估病患之FLT3含量(例如，循環FLT3 抗原及/或FLT3表現細胞之含量)以幫助判定最有效給藥方案等。此類評估亦用於整個治療中的監測目的及適用於結合評估其他參數(例如，膀胱癌治療中之尿細胞學及/或ImmunoCyt含量，或以此類推，前列腺癌療法中之血清PSA含量)估量治療成果。
本發明之一目的在於提供FLT3 ADC，其抑制或延遲表現FLT3之腫瘤細胞之生長。本發明之另一目的在於提供使用此類FLT3 ADC及(特定言之)使用此類FLT3 ADC與其他藥物或免疫活性治療之組合來抑制血管形成及其他生物功能並藉此減少哺乳動物(較佳人類)之腫瘤生長之方法。
XV.)組合療法
在一個實施例中，當腫瘤(包括人類腫瘤)經FLT3 ADC結合化學治療劑或放射或其組合治療時產生協同作用。換而言之，藉由FLT3 ADC對腫瘤生長之抑制相較於當組合化學治療劑或放射或其組合時增強超過預期。可例如藉由組合治療對腫瘤生長之抑制超過僅FLT3 ADC之治療所預期之效應或使用FLT3 ADC及化學治療劑或放射之治療之累加效應來顯示協同作用。較佳地，藉由癌症之緩解證實協同作用，其中自FLT3 ADC之治療或使用FLT3 ADC及化學治療劑或放射之累加組合之治療未預期緩解。
使用FLT3 ADC及化學療法或放射或兩者之組合抑制腫瘤細胞之生長之方法包括在開始化學療法或放射療法之前、期間或之後以及其任何組合(即，在開始化學療法及/或放射療法之前及期間、之前及之後、期間及之後或之前、期間及之後)投與FLT3 ADC。例如，FLT3 ADC通常在開始放射療法及/或化學療法前1至60天，較佳3至40天，更佳5至12天投與。然而，取決於治療方案及具體病患需求，該方法可以提供最有效治療並最終延長病患生命之方式進行。
化學治療劑之投與可以各種方式完成，包括藉由非經腸及經腸 途徑全身性投與。在一個實施例中，該等FLT3 ADC及化學治療劑作為獨立分子進行投與。化學治療劑或化學療法之特定實例包括順鉑、達卡巴嗪(dacarbazine，DTIC)、放線菌素(dactinomycin)、二氯甲二乙胺(氮芥)、鏈脲菌素(streptozocin)、環磷醯胺、卡莫司汀(carmustine，BCNU)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)、多柔比星(阿黴素)、道諾黴素、丙卡巴肼(procarbazine)、絲裂黴素、阿糖胞苷(cytarabine)、依託泊苷、胺甲喋呤、5-氟尿嘧啶、長春花鹼、長春新鹼、博來黴素(bleomycin)、太平洋紫杉醇(紫杉醇)、多西他賽(紫杉德(taxotere))、阿地白介素(aldesleukin)、天冬醯胺酶、白消安(busulfan)、卡鉑、克拉屈濱(cladribine)、達卡巴嗪、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱、羥基脲、依弗醯胺(ifosfamide)、干擾素α、亮丙瑞林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、黴法蘭(melphalan)、巰嘌呤(mercaptopurine)、普卡黴素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培加帕酶(pegaspargase)、噴司他汀、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡黴素、鏈脲菌素、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、睪內酯(testolactone)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、尿嘧啶芥(uracil mustard)、長春瑞濱、吉西他濱(gemcitabine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、紫杉醇及其組合。
組合FLT3 ADC使用之放射源可在所治療病患外部或內部。當該放射源在病患外部時，該療法稱為外粒子束放射療法(EBRT)。當該放射源在病患內部時，該療法稱為近程放射療法(BT)。
上文描述之治療性方案可進一步與額外癌症治療劑及/或方案(例如額外化學療法、癌症疫苗、信號轉導抑制劑、對治療異常細胞生長或癌症有用之藥劑、抗體(例如，如描述於WO/2005/092380(Pfizer)中之抗CTLA-4抗體)或藉由結合至IGF-1R及細胞因子來抑制腫瘤生長之其他配體)組合。
當哺乳動物經受額外化學療法時，可使用上文描述之化學治療劑。另外，可使用生長因子抑制劑、生物反應調節劑、抗激素療法、選擇性雌激素受體調節劑(SERM)、血管形成抑制劑及抗雄激素劑。例如，可使用抗激素劑，例如抗雌激素劑，諸如Nolvadex(他莫昔芬)，或抗雄激素劑，諸如Casodex(4'-氰基-3-(4-氟苯基磺醯基)-2-羥基-2-甲基-3-'-(三氟甲基)丙醯苯胺)。
上文治療方法可與各種手術、化學療法或放射療法方案中之任何一者組合。本發明之治療方法可使用低劑量之化學療法(或其他療法)及/或頻率較低之投與，此針對所有病患且尤其針對彼等無法良好耐受化學治療劑毒性者為一優點。
XVI.)套組/製品
用於本文描述之實驗室、預後、預防、診斷及治療性應用之套組在本發明之範圍內。此類套組可包含分成各區室以容納一或多個容器(諸如小瓶、管及類似物)之載器、包裝或容器，各容器包含本方法中欲使用之各別要素之一以及包含使用(諸如本文描述之使用)說明書之標籤或插頁。例如，該(等)容器可包含經或可經可偵測物標記之抗體。套組可包含含有藥物單元之容器。該套組可包括圖2A、2B及/或2C或圖3A、3B及/或3C中之胺基酸序列之全部或部分或其類似物或編碼此類胺基酸序列之核酸分子。
本發明之套組將通常包含上文描述之容器及一或多個與其相關之其他容器，該等其他容器包含商業及使用者立場所需之材料(包括緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器)；列有內含物及/或使用說明書之載器、包裝、容器、小瓶及/或管標籤及具有使用說明書之包裝插頁。
標籤可存在於容器上或可與容器一起存在以指示組合物用於特定療法或非治療性應用，諸如預後、預防、診斷或實驗室應用，且亦 可指示針對活體內或活體外使用指導(諸如彼等本文描述者)。與套組一起包括在內或包括於套組上之插頁或標籤亦可包括指導及或其他資訊。該標籤可位於容器上或伴隨容器。當形成標籤之字母、數字或其他字符模製或蝕刻於容器本身中時，標籤可位於容器上；當標籤存在於亦容納容器之貯器或載器內時，標籤可伴隨容器，例如，作為包裝插頁。該標籤可指示組合物用於診斷、治療、預防或預後病症，諸如闡述於表I中之組織癌症。
術語「套組」及「製品」可作為同義詞使用。
在本發明之另一實施例中，提供含有組合物(諸如抗體或抗體藥物結合物(ADC)，例如適用於組織癌症(諸如彼等闡述於表I中者)之診斷、預後、預防及/或治療之材料)之製品。該製品通常包含至少一個容器及至少一個標籤。合適之容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器及試管。該等容器可由各種材料諸如玻璃、金屬或塑膠形成。該容器可容納胺基酸序列、小分子、核酸序列、細胞群體及/或抗體。在另一實施例中，容器包含用於評估細胞及組織中之FLT3蛋白表現或用於相關實驗室、預後、診斷、預防及治療目的之抗體、其結合片段或特異性結合蛋白；關於此類用途之指示及/或指導可包括於此種容器上或與此種容器一起包括在內，用於此等目的之試劑及其他組合物或工具亦可包括於此種容器上或與此種容器一起包括在內。
容器可或者容納有效治療、診斷、預後或預防病症之組合物且可具有無菌存取口(例如，該容器可為靜脈內溶液包或具有可藉由皮下注射針刺破之塞子之小瓶)。組合物中之活性劑可為可特異性結合FLT3之抗體或特異性結合FLT3之抗體藥物結合物。
製品可進一步包含第二容器，該第二容器包含醫藥上可接受之緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝生理鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及/或右旋糖溶液。其可進一步包括依據商業及使用者立場所需之其他材 料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、攪拌器、針、注射器及/或具有使用指示及/或說明之包裝插頁。
本文揭示內容之其他實施例包括描述於下列項目(clause)中之實施例：
項目1係抗體之實施例，其中該抗體包含具有SEQ ID NO：23之胺基酸序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列之CDRH2、具有SEQ ID NO：32之胺基酸序列之CDRH3、具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列之CDRL2及具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列之CDRL3。在一替代實施例中，該抗體包含如藉由Chothia方法測定之如表V中所示之CDR。在另一替代實施例中，該抗體包含如藉由Contact方法測定之如表V中所示之CDR。
項目2係另一實施例，其中該抗體係項目1之抗體，且其中該抗體包含自SEQ ID NO：11之第1個E至第123個S範圍內之胺基酸序列組成之重鏈可變區且包含由自SEQ ID NO：10之第1個D至第108個R範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈可變區。
項目3係另一實施例，其中該抗體係前述項目中任一項之抗體，且其中該抗體包含由藉由依據ATCC登錄號PTA-121831存放之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生之抗體之重鏈可變區之胺基酸序列組成之重鏈可變區且包含由藉由依據ATCC登錄號PTA-121831存放之中國倉鼠卵巢(CHO)產生之抗體之輕鏈之胺基酸序列組成之輕鏈可變區；或其中該抗體包含由藉由依據ATCC登錄號PTA-121836存放之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生之抗體之重鏈可變區之胺基酸序列組成之重鏈可變區且包含由藉由依據ATCC登錄號PTA-121836存放之中國倉鼠卵巢(CHO)產生之抗體之輕鏈之胺基酸序列組成之輕鏈可變區。
項目4係另一實施例，其中該抗體係前述項目中任一項之抗體，且其中該抗體包含係IgG亞型之Fc區。
項目5係另一實施例，其中該抗體係前述項目之抗體，且其中該Fc區包含在重鏈之胺基酸位置124之非天然胺基酸之取代，且其中該非天然胺基酸係對乙醯基苯丙胺酸(pAF)。
項目6係另一實施例，其中該抗體係前述項目中任一項之抗體，且其中該抗體包含由SEQ ID NO：11之胺基酸編號1至452之胺基酸序列組成之重鏈且包含由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。在項目6之替代實施例中，該抗體係項目1或項目2之抗體，其中該抗體包含由SEQ ID NO：11之胺基酸編號1至452之胺基酸序列組成之重鏈且包含由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。
項目7係另一實施例，其中該抗體係前述項目中任一項之抗體，且其中該抗體包含由自SEQ ID NO：11之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈且包含由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。在項目7之一替代實施例中，該抗體係項目1或項目2之抗體，其中該抗體包含由自SEQ ID NO：11之第1個E至第453個K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈且包含由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。
項目8係另一實施例，其中該抗體係前述項目中任一項之抗體，且其中該抗體包含由藉由依據美國菌種保存中心(ATCC)登錄號PTA-121831存放之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生之抗體之重鏈之胺基酸序列組成之重鏈，且包含由藉由依據ATCC登錄號PTA-121831存放之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生之抗體之輕鏈之胺基酸序列組成之輕鏈。項目8之一替代實施例係項目5之抗體，其中該抗體包含由藉由依據美國菌種保存中心(ATCC)登錄號PTA-121831存放之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生之抗體之重鏈之胺基酸序列組成之重鏈，且包含由藉 由依據ATCC登錄號PTA-121831存放之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生之抗體之輕鏈之胺基酸序列組成之輕鏈。
項目9係另一實施例，其中該抗體係前述項目中任一項之抗體，且其中該抗體包含由藉由依據ATCC登錄號PTA-121836存放之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生之抗體之重鏈之胺基酸序列組成之重鏈，且包含由藉由依據ATCC登錄號PTA-121836存放之中國倉鼠卵巢(CHO)產生之抗體之輕鏈之胺基酸序列組成之輕鏈。項目9之一替代實施例係項目1至5中任一項之抗體，其中該抗體包含由藉由依據ATCC登錄號PTA-121836存放之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生之抗體之重鏈之胺基酸序列組成之重鏈，且包含由藉由依據ATCC登錄號PTA-121836存放之中國倉鼠卵巢(CHO)產生之抗體之輕鏈之胺基酸序列組成之輕鏈。
項目10係另一實施例，其中該抗體係前述項目中任一項之抗體，且其中該重鏈可變區或該重鏈之第1個E係經焦麩胺酸鹽取代。
項目11係另一實施例，其中該抗體係項目1至5中任一項之抗體，且其中該抗體包含由自SEQ ID NO：11之第1個E至第452個G範圍內之胺基酸序列組成之重鏈，且其中將該重鏈可變區或該重鏈之第1個E修飾為焦麩胺酸鹽，且其中該抗體包含由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。項目11之一替代實施例係項目1至6中任一項之抗體，其中該抗體包含由自SEQ ID NO：11之第1個E至第452個G範圍內之胺基酸序列組成之重鏈，且其中將該重鏈可變區或該重鏈之第1個E修飾為焦麩胺酸鹽，且其中該抗體包含由自SEQ ID NO：10之第1個D至第214個C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。
項目12係另一實施例，其係包含前述項目中任一項之抗體之CDR之抗原結合片段，且其中該抗原結合片段結合FLT-3。
項目13係另一實施例，其係前述項目之抗原結合片段，其中該 抗原結合片段係選自由以下組成之群：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、經分離VH及經分離VL。
項目14係抗體，其包含項目12或項目13之抗原結合片段。
項目15係另一實施例，其係與前述項目1至10或14中任一項之抗體具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之抗體，且其中該抗體包含前述項目中任一項之抗體之CDR。
項目16係另一實施例，其係項目15之抗體，該抗體以與項目15之相應抗體相同之親和力結合FLT3之，且不大體上抑制FL結合至FLT3。
項目17係另一實施例，其係一或多種編碼項目1至10或14中任一項之抗體之經分核酸。
項目18係另一實施例，其係一或多種編碼項目12或13之抗體或片段之經分離核酸。
項目19係項目17或18之核酸之另一實施例，其與相應項目之核酸具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
項目20係另一實施例，其係一或多種包含項目17或項目18或項目19之一或多種經分離核酸之表現載體。在項目20之一個實施例中，具有一種表現前述項目中任一項之抗體之重鏈及輕鏈之表現載體。在另一實施例中，項目20之表現載體包含兩個啟動子。在一替代實施例中，項目20之表現載體包含一個啟動子。在項目20之一不同實施例中，具有兩種表現載體，其等中之一者表現重鏈，且其等中之另一者表現輕鏈。在另一實施例中，項目20之各表現載體包含相同啟動子。在又另一實施例中，項目20之各表現載體包含不同啟動子。
項目21係另一實施例，其係包含前述項目(項目20)之一或多種表 現載體之重組宿主細胞。
項目22係另一實施例，其係藉由培養前述項目(項目21)之重組宿主細胞產生之抗體。
項目23係另一實施例，其係包含前述項目(項目22)之抗體及治療劑之抗體藥物結合物。
項目24係一實施例，其係包含結合FLT3之抗體及治療劑之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物不大體上抑制FLT3結合至FLT3配體(FL)。
項目25係另一實施例，其係項目23或項目24之抗體藥物結合物，其進一步包含連接該抗體及該治療劑之連接子。
項目26係另一實施例，其係項目25之抗體藥物結合物，其中該連接子係非可裂解之連接子。
項目27係另一實施例，其係項目26之抗體藥物結合物，其中該連接子係2-(胺氧基)乙酸。
項目28係另一實施例，其係項目23至27中任一項之抗體藥物結合物，其中該治療劑係細胞毒性或細胞增殖抑制劑。
項目29係另一實施例，其係項目23至28中任一項之抗體藥物結合物，其中該治療劑係(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-胺基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-3-疊氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺基)丁醯胺。
項目30係另一實施例，其係抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物係項目23至29中任一項，且其中該抗體藥物結合物具有下式：抗體-(連接子-治療劑)p，其中該連接子係2-(胺氧基)乙酸，且其中該治療劑係(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-胺基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基) 胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-3-疊氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺基)丁醯胺且其中p係選自由以下組成之群：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3。
項目31係另一實施例，其係項目30之抗體藥物結合物，其中p係選自由以下組成之群：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3。
項目32係另一實施例，其係項目31之抗體藥物結合物，其中p係選自由以下組成之群：1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5。
項目33係另一實施例，其係項目32之抗體藥物結合物，其中p係選自由以下組成之群：1.8、1.9及2。
項目34係另一實施例，其係醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含治療有效量之如項目23至33中任一項之抗體藥物結合物。
項目35係另一實施例，其係項目34之醫藥組合物，其用於治療中。
項目36係另一實施例，其係醫藥組合物，其中該醫藥組合物係根據前述項目(項目35)，其中該治療用途係治療癌症。
項目37係另一實施例，其係醫藥組合物，其中該醫藥組合物係根據項目34至36中任一項，其與一或多種抗贅瘤劑組合。
項目38係另一實施例，其係治療個體之癌症之方法，其中該治療個體之癌症之方法包括向該個體投與治療有效量之如技術方案23至33中任一項之抗體藥物結合物或其醫藥組合物。項目37之另一實施例係治療個體之癌症之方法之一實施例，其中該治療個體之癌症之方法包括向該個體投與治療有效量之如技術方案33至37中任一項之醫藥組 合物。
項目39係另一實施例，其係項目33至37中任一項之醫藥組合物或項目38之方法，其中該癌症包含如相較於非癌性細胞以高水準表現FLT3之一或多個細胞。
實例
藉助於以下數個實例進一步描述及闡述本發明之各種態樣，其等均無意限制本發明之範圍。
實例1
FLT3抗原
FLT3(Fms樣酪胺酸激酶3受體，亦稱為Flk2(胎肝激酶2)、STK1(幹細胞酪胺酸激酶1)及CD135)係III型受體酪胺酸激酶(RTK)中之一員。人類FLT3編碼具有993個胺基酸長度之RTK，其包含具有五個類免疫球蛋白細胞外域及兩個藉由激酶插入域連接之細胞內酪胺酸激酶域(TKD)之膜結合受體(Stirewalt D L等人；Nat Rev Cancer；650-665(2003)。人類FLT3基因(Gene ID No.：2322(國家生物技術資訊中心))位於染色體13q12上並與小鼠FLT3共用85%之胺基酸序列同源性(Rosnet O等人；Oncogene 8：173-179(1993)。FLT3表現於正常骨髓性及類淋巴性祖代細胞中且70-90% AML病患之白血病性細胞亦表現(Carow,C.E等人；Blood 87：1089-1096(1996)；Rosnet O等人；Leukemia 10：238-248(1996)且亦表現於ALL中。已知FLT3涉及造血細胞之增殖、分化及凋亡。許多造血細胞產生FLT3配體(FLT3L)，其促進受體二聚化及活化，因此經由PI3激酶及MAPK路徑誘發發信號級聯反應(Stirewalt D L等人；Nat Rev Cancer；650-665(2003)。近似地，30% AML病患具有FLT3內部串聯複製(ITD)突變，該等突變驅動受體之組成性活化及下游發信號級聯反應，其等與較差疾病結果相關聯(Gunawardane R N等人；Mom Cancer Ther 12：438-447(2013)。就 FLT3抗原之例示性實施例而言，參見圖1。
實例2
FLT3單株抗體(MAb)之產生
在一個實施例中，對FLT3具有治療性之單株抗體(「MAb」)包括彼等將結合至表現於細胞上之FLT3之與FLT3特異性抗原決定基反應者。用於產生此種MAb之免疫原包括彼等經設計以編碼或含有細胞外域或整個FLT3蛋白序列者；預期含有功能性模體之區域及FLT3之藉由胺基酸序列之電腦分析預期具有抗原性之區域。免疫原包括肽、重組蛋白及細胞(其等內源性表現FLT3或已經改造以表現FLT3)。
使用VelocImmune®技術(Regeneron,Tarrytown,NY)產生針對FLT3之MAb，其中經基因改造之小鼠製造具有完全人類可變區及小鼠恆定區之抗體。用重組人類FLT3蛋白免疫化VelocImmune®小鼠後產生命名為v62-1b21(亦稱為AGS62.21)之MAb。該FLT3 MAb(v62-1b21)特異性結合至F1T3蛋白及FlT3表現細胞(重組及內源性)。
選擇後，v62-1b21(由融合瘤細胞系天然產生)藉由將VelocImmune®抗體之人類可變序列與根據由Ambrx(La Jolla,CA)開發之ReCODE技術(參見，實例4-使用重組DNA技術表現人類CHv62.21pAF)在重鏈之位置124併入非天然胺基酸之人類恆定區組合而轉化為經CHO表現之完全人類天然抗體(參見，實例3-使用重組DNA方法表現CHv62.21)。
自產生v62-1b21之融合瘤細胞中分離mRNA後測定編碼v62-1b21之序列之DNA。抗Flt3之v62-1b21重鏈及輕鏈可變核酸序列係使用下列方案衍生自融合瘤細胞。用Trizol試劑(Life Technologies,Gibco BRL)溶解分泌v62-1b21之融合瘤細胞。純化全部RNA且第一股cDNA係使用Gibco-BRL Superscript預擴增系統用寡聚(dT)12-18激活自總RNA產生。第一股cDNA然後使用人類免疫球蛋白可變重鏈引子及人 類免疫球蛋白可變輕鏈引子擴增。測序PCR產物並測定可變重鏈及輕鏈區。
可變重鏈區及輕鏈區之核酸及胺基酸序列列於圖2A及/或2B及圖3A及/或3B中。CHv62.21 MAb與人類Ig生殖系之比對闡述於圖4A至4B中。
實例3
使用重組DNA方法表現CHv62.21
為於經轉染之細胞中重組表現CHv62.21 MAb，v62.21融合瘤MAb可變重鏈及輕鏈序列係分別自人類重鏈IgG1及人類輕鏈Igκ恆定區之上游進行選殖。完整CHv62.21 MAb人類重鏈及輕鏈匣係自選殖載體中CMV啟動子/強化子之下游進行選殖。將表現重組CHv62.21 MAb之構築體轉染至CHO細胞中以於Lonza GS系統中穩定表現(Lonza,Basel,Switzerland)。將自重組CHO細胞分泌之CHv62.21 Mab純化並藉由流動式細胞量測術評估對細胞表面FLT3之結合。結果顯示表現於CHO細胞中之重組CHv62.21抗體結合至細胞表面上之FLT3。
結果進一步顯示與自融合瘤純化之v62.21類似，表現於CHO細胞中之重組表現之v62.21結合FLT3。亦藉由ELISA評估自重組細胞分泌之CHv62.21 MAb對FLT3重組蛋白之結合。CHv62.21對FLT3蛋白之結合在衍生自CHO之MAb材料與衍生自融合瘤細胞之MAb材料間係一致的。
於2014年12月9日將產生命名為CHv62.21之抗體之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞送(經由聯邦快遞)至美國菌種保存中心(ATCC),P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108並分配登錄號PTA-121831。
可變重鏈區及輕鏈區之核酸及胺基酸序列列於圖2A及/或2B及圖3A及/或3B中。
經過使用此項技術中已知之方法(例如，蛋白酶消化、LCMS分析等)進行的實驗分析，衍生自CHO細胞之CHv62.21 MAb之胺基酸修飾顯示：重鏈之C端之離胺酸之刪除發生於大部分經純化之CHv62.21 MAb中及重鏈之N端之焦穀醯胺化與重鏈之C端之離胺酸之刪除發生於部分經純化之CHv62.21 MAb中。
實例4
使用重組DNA方法表現人類CHv62.21pAF
為於經轉染之細胞中重組表現CHv62.21pAF，v62-1b21融合瘤MAb可變重鏈及輕鏈序列係分別自人類重鏈IgG1及人類輕鏈Igκ恆定區之上游進行選殖。完整CHv62.21 MAb人類重鏈及輕鏈匣係自選殖載體中CMV啟動子/強化子之下游進行選殖。將表現重組CHv62.21 MAb之構築體轉染至CHO pAFsup1-4E2細胞(Ambrx,La Jolla,CA)中，該等細胞穩定表現琥珀抑制因子tRNA及pAF特異性胺醯tRNA合成酶，用於產生穩定純系。該等穩定純系藉由將pAF併入MAb中產生CHv62.21pAF。該等穩定純系經受基因擴增，接著經受子選殖。將自穩定子純系分泌之CHv62.21pAF純化並藉由流動式細胞量測術評估對細胞表面FLT3之結合。結果顯示表現自CHO細胞之重組CHv62.21pAF抗體結合至細胞表面上之FLT3。
於2014年12月9日將產生命名為CHv62.21pAF之抗體之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞送(經由聯邦快遞)至美國菌種保存中心(ATCC),P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108並分配登錄號PTA-121836。
可變重鏈區及輕鏈區之核酸及胺基酸序列列於圖2C及/或2B及圖3C及/或3B中。
經過使用此項技術中已知之方法(例如，蛋白酶消化、LCMS分析等)進行的實驗分析，衍生自CHO細胞之CHv62.21pAF MAb之胺基酸修飾顯示：重鏈之C端之離胺酸之刪除發生於大部分經純化之 CHv62.21 pAF MAb中及重鏈之N端之焦穀醯胺化與重鏈之C端之離胺酸之刪除發生於部分經純化之CHv62.21 pAF MAb中。
實例5
連接子單元AGL之產生
在一較佳實施例中，用以連接本發明之FLT3 MAb(較佳CHv62.21pAF)及本發明之藥物單元(較佳AGD-0182)之本發明之連接子單元(指示AGL)通常稱為2-(胺氧基)乙酸(Chem-Impex International,Inc.,Wood Dale,IL)。
在另一實施例中，本發明之AGL連接子單元具有下式：
化學式：C2H5NO3
精確質量：91.0269
分子量：91.0660
m/z；91.0269(100.0%),92.0303(2.2%)
實例6
AGD-0182藥物單元之產生及合成
使用下列方法產生列於式(II)中之藥物單元。首先，向於CH2Cl2(20.0mL)中之Boc-Dap-OH二環己胺(10.0g,21.3mmol)及H-Phe-NH2HCl鹽(6.42g,32.0mmol)之23℃攪拌懸浮液中添加DIEA(11.0g,14.9mL,85.3mmol)，接著添加DEPC(5.19g,4.80mL,0.032mol)。10h後，藉由LCMS分析顯示反應完成。粗反應產物用H2O(25mL x 2)清洗，接著用鹽水(25mL x 2)清洗。有機部分在硫酸鎂墊上乾燥，過濾並在真空中濃縮。粗橙色油藉由使用含於CH2Cl2中之2%至10%甲醇作為溶離劑之急速層析法(矽膠40μm,60Å，尺寸)純化。獲得呈黃色油狀之總計7.25g之Boc-Dap-Phe-NH2(16.7mmol,78%)。LCMS RT= 1.28min(方法B)；ESI-MS m/z 434.19[M+H]+。
其次，向於CH2Cl2(10mL)中之Boc-Dap-Phe-NH2(7.25g,16.7mmol)之23℃攪拌懸浮液中添加TFA(10mL)。5h後，藉由LCMS分析顯示反應完成。在真空中蒸發揮發性有機物以產生粗產物，其無需進一步純化即可直接使用。獲得呈橙色固體(13.4mmol,80%)之總計6.00g之H-Dap-Phe-NH2。LCMS RT=0.691min(方法B)；ESI-MS m/z 334.17[M+H]+。
然後向於DMF(10mL)中之Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-OH TFA鹽(456mg,0.586mmol)及H-Dap-Phe-NH2 TFA鹽(457mg,1.02mmol)之23℃攪拌懸浮液中添加DIEA(0.350g,0.500mL,2.74mmol)，接著添加HATU(0.520g,1.37mmol)。10h後，藉由LCMS分析顯示反應完成。粗反應產物藉由使用含於0.1%水性蟻酸中之10%至90%MeCN作為溶離劑之具有Phenomenex Gemini NX-C18 10μ 110Å管柱(150 x 30mm)之製備型RP-HPLC純化。獲得呈蟻酸鹽(0.513mmol,75%)之總計526mg之Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2。LCMS RT=1.81min(方法B)；ESI-MS m/z 980.39[M+H]+。
最後，向於乙腈(10mL)中之Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2(525mg,0.513mmol)之23℃攪拌溶液中添加哌啶(5mL)。2h後，藉由LCMS分析顯示反應完成。向粗反應溶液中添加己烷(15mL x 3)。在真空中濃縮乙腈層。粗油藉由使用含於0.1%水性TFA中之5%至95%MeCN作為溶離劑之具有Phenomenex Gemini NX-C18 10μ 110Å管柱(150 x 30mm)之製備型RP-HPLC純化。獲得呈TFA鹽(0.406mmol,79%)之總計354mg之標題化合物。LCMS RT=1.15min(方法B)；ESI-MS m/z 758.24[M+H]+；HRMS m/z 758.4915[C38H63N9O7+H]+。
前述合成產生命名為(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3- (((S)-1-胺基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-3-疊氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺基)丁醯胺之下列藥物單元，其如式(II)闡述：
實例7
藥物連接子AGL及AGD-0182藥物單元之合成
以下列方式完成AGL連接子單元及AGD-0182藥物單元之合成。
使用下列程序及協議描述方法A：
0-0.50min：等度80水/10乙腈/10 1%蟻酸的水溶液；0.50-3.50min：線性梯度80水/10乙腈/10 1%蟻酸的水溶液至0水/90乙腈/10 1%蟻酸的水溶液；3.50-3.99min：等度0水/90乙腈/10 1%蟻酸的水溶液；3.99-4.00min：線性梯度0水/90乙腈/10 1%蟻酸的水溶液至80水/10乙腈/10 1%蟻酸的水溶液。
使用下列製程及協議描述方法B：
0-0.50min：等度85水/5乙腈/10 1%蟻酸的水溶液；0.50-1.60min：線性梯度85水/5乙腈/10 1%蟻酸的水溶液至0水/98乙腈/2 1%蟻酸的水溶液；1.60-1.80min：等度0水/98乙腈/2 1%蟻酸的水溶液；1.80-1.90min：線性梯度0水/98乙腈/2 1%蟻酸的水溶液至85水/5乙腈/10 1%蟻酸的水溶液；1.90-2.00min：等度85水/5乙腈/10 1%蟻酸的水溶液。
使用上述方法，合成如下：
向於CH2Cl2(20.0mL)中之Boc-Dap-OH二環己胺(10.0g,21.3 mmol)及H-Phe-NH2 HCl鹽(6.42g,32.0mmol)之23℃攪拌懸浮液中添加DIEA(11.0g,14.9mL,85.3mmol)，接著添加DEPC(5.19g,4.80mL,0.032mol)。10h後，藉由LCMS分析顯示反應完成。粗反應產物用H2O(25mL x 2)清洗，接著用鹽水(25mL x 2)清洗。有機溶離份在硫酸鎂墊上乾燥，過濾並在真空中濃縮。粗橙色油藉由使用含於CH2Cl2中之2%至10%甲醇作為溶離劑之急速層析法(矽膠40μm,60Å，尺寸)純化。獲得呈黃色油狀(16.7mmol,78%)之總計7.25g之Boc-Dap-Phe-NH2。LCMS RT=1.28min(方法B)；ESI-MS m/z 434.19[M+H]+。
向於CH2Cl2(10mL)中之Boc-Dap-Phe-NH2(7.25g,16.7mmol)之23℃攪拌懸浮液中添加TFA(10mL)。5h後，藉由LCMS分析顯示反應完成。在真空中蒸發揮發性有機物以產生粗產物，其無需進一步純化即可直接使用。獲得呈橙色固體(13.4mmol,80%)之總計6.00g之H-Dap-Phe-NH2。LCMS RT=0.691min(方法B)；ESI-MS m/z 334.17[M+H]+。
向於DMF(10mL)中之Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-OH TFA鹽(456mg,0.586mmol)及H-Dap-Phe-NH2 TFA鹽(457mg,1.02mmol)之23℃攪拌懸浮液中添加DIEA(0.350g,0.500mL,2.74mmol)，接著添加HATU(0.520g,1.37mmol)。10h後，藉由LCMS分析顯示反應完成。粗反應產物藉由使用含於0.1%水性蟻酸中之10%至90%MeCN作為溶離劑之具有Phenomenex Gemini NX-C18 10μ 110Å管柱(150 x 30mm)之製備型RP-HPLC純化。獲得呈蟻酸鹽(0.513mmol,75%)之總計526mg之Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2。LCMS RT=1.81min(方法B)；ESI-MS m/z 980.39[M+H]+。
向於乙腈(10mL)中之Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2(525mg,0.513mmol)之23℃攪拌溶液中添加哌啶(5mL)。2h後，藉 由LCMS分析顯示反應完成。向粗反應溶液中添加己烷(15mL x 3)。在真空中濃縮乙腈層。粗油藉由使用含於0.1%水性TFA中之5%至95%MeCN作為溶離劑之具有Phenomenex Gemini NX-C18 10μ 110Å管柱(150 x 30mm)之製備型RP-HPLC純化。獲得呈TFA鹽(0.406mmol,79%)之總計354mg之所得化合物(MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2)。LCMS RT=1.15min(方法B)；ESI-MS m/z 758.24[M+H]+；HRMS m/z 758.4915[C38H63N9O7+H]+。
向於DMF(7.0mL)及DCM(15.0mL)中之MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2(2.0g,2.64mmol)及Boc-Aoa(0.53g,2.77mmol)之23℃攪拌溶液中添加HATU(1.05g,2.77mmol)，接著添加DIPEA(0.51mL,2.92mmol)。1h後，在真空中濃縮反應混合物以產生粗DMF溶液，其用150mL EtOAc進一步稀釋。粗反應混合物用100mL飽和NaHCO3清洗，接著用100mL鹽水清洗。有機溶離份在硫酸鎂墊上乾燥，過濾並在真空中濃縮。粗Boc-Aoa-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2藉由使用含於CH2Cl2中之0%至5%甲醇作為溶離劑之急速層析法(矽膠40μm,60Å，尺寸)純化。獲得呈米黃色固體之總計2.13g Boc-Aoa-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2(2.29mmol,87%)。LCMS RT=1.46min(方法A)；ESI-MS m/z 931.46[M+H]+。
向於二噁烷(15.0mL)中之Boc-Aoa-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2(2.1g,2.26mmol)之23℃攪拌溶液中添加於二噁烷(10.0mL,40.0mmol)中之4M HCl。0.5h後，在真空中濃縮反應混合物以產生粗淺黃色油。將粗淺黃色油溶解於6mL甲醇中並緩慢添加(逐滴)至經劇烈攪拌之150mL EtOAc溶液中。自該溶液中獲得白色沈澱。該白色沈澱藉由過濾收集並將上清液濃縮至固體。白色沈澱及經濃縮之上清液均分多個部分藉由使用含於0.001M鹽酸中之5%至95%MeCN作為溶離劑之具有Phenomenex Gemini 10μ,C18 110Å管柱(150 x 30mm)之 製備型RP-HPLC純化。
所得產物溶離份經組合，濃縮且在真空中乾燥18h以產生白色固體。獲得總計1.31g AGL-0182-30．HCl(1.51mmol,67%)。LCMS RT=1.16min(方法A)；ESI-MS m/z 831.27[M+H]+。(參見，通常表IV)。
在一較佳實施例中，AGL-0182-30具有下式：
實例8
CHv62.21pAF MAb之抗體藥物結合
使用下列方案使用本文描述之烷氧基胺連接子將CHv62.21pAF MAb結合至命名為AGL-0182-30之含有多拉異白胺酸-多拉脯胺酸之肽以產生命名為CHv62.21pAF-AGL-0182-30之本發明抗體藥物結合物(ADC)。
使用描述於標題為「藥物連接子AGL及AGD-0182藥物單元之合成」之實例7中之方法完成AGL-0182-30藥物連接子之合成。
接著，使用下列方案製造命名為cHv62.21pAF-AGL-0182-30之本發明抗體藥物結合物(ADC)。
簡而言之，將215.5mL以17.17mg/mL之濃度調配於最終pH為4.0之含有500mM NaCl之50mM檸檬酸鹽緩衝液中之CHv62.21pAF MAb添加至9.7mL最終pH為4.0之含有500mM NaCl之50mM檸檬酸鹽緩衝液、9.1mL 1.35M乙酸醯肼(溶解於水中)、7.26mL DMSO及5.08mL 50mM AGL-0182-30(溶解於DMSO中)溶液中。容許結合在28℃下進行16至24小時。過量AGL-0182-30及其他小分子反應組分藉由超濾/滲濾用12倍置換體積之含有5%海藻糖之20mM組胺酸(pH 6.0)移除。
所得抗體藥物結合物(ADC)命名為CHv62.21pAF-AGL-0182-30且具有下式：
其中該Mab係CHv62.21pAF且p係1.8至2.0。闡述於此實例中之抗體藥物結合物之平均p值藉由質譜分析係約1.9。在本發明之一個實施例中，該p值在1.5與2.5之間。
所得之本發明ADC將nnAA併入該ADC之抗體組分中，藉此該藥物連接子經由肟鍵結合且用於闡述於表I中之癌症之治療性治療。
實例9
CHv62.21 MAb之表徵
結合FLT3之MAb係使用闡述於標題為「FLT3單株抗體(MAb)之產生」之實例中之程序產生並使用此項技術中已知的分析之組合進行篩選、識別及表徵。
A：FACS結合
測試CHv62.21對活體外生長之AML及B-ALL細胞系之結合。(參見，表VII)。簡而言之，使用NHS LC生物素將CHv62.21及同型匹配對照抗體生物素化。活體外指數方式生長之癌細胞系用於所有實驗中。藉由離心獲得並清洗細胞。用Fc阻斷細胞以減少非特異性結合。將抗體稀釋至10ug/ml最終濃度且與細胞在4℃下共培養1小時。培養結束時，清洗細胞並在4℃下用第二偵測物鏈霉親和素-PE抗體以最終1：200(2.5ug/ml)稀釋培養1小時。清洗未結合之第二抗體後，藉由FACS分析細胞且測定並記錄幾何平均螢光。如下計算螢光比率：Geo平均cHv62.21/Geo平均同型對照=MFR(高於同型對照之倍數表現之量 度)。
獲得幾何平均值及平均螢光比率(MFR)值(表VI)並顯示直方圖(表VII)。結果顯示該CHv62.21結合表現AML及B-ALL之數種人類癌細胞系。
B：ADCC活性
測試CHv62.21及CHv62.21pAF之活體外ADCC活性。簡而言之，使用靶細胞系EOL-1及SEM在效應細胞正常人類PBMC之存在下使用CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析測試裸及ADC抗FLT3單株抗體CHv62.21及CHv62.21pAF介導抗體依賴性細胞毒性活性(ADCC)之能力。(Promega,G1780)。
進行該分析之前一(1)天，將三(3)小瓶之效應細胞正常人類PBMC(Hemacare,Donor ID：1888)解凍、清洗並接種於T-175細胞培養燒瓶中之以10%熱滅活胎牛血清補充之RPMI-1640中。將該等培養瓶在37℃及5% CO2下於培養器中儲存整夜。隔天，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco)自培養瓶中獲得PBMC並清洗且以1.0e6個細胞/孔之濃度接種於分析緩衝劑(RPMI1640+0.1%FBS)中。獲得靶細胞SEM及EOL-1連同陽性對照細胞系(Raji)，清洗並以2.0e5個細胞/孔之濃度使用分析緩衝劑接種。
將測試樣品於分析緩衝劑中各稀釋至2.5μg/mL之最終濃度。將相等體積之靶細胞、測試樣品及效應細胞一式三份添加至96孔圓底板之孔中。該板經輕微離心並於37℃增濕培養器中培養4小時。四(4)小時培養後，該等分析板經離心並獲得體積為50μL之上清液且將其轉移至新鮮96孔板中。藉由使用比色LDH偵測套組；CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega)及於490nm下讀取之吸光度讀數測定該上清液中乳酸鹽脫氫酶之活性。
該資料藉由首先自實驗、效應自發性、目標自發性及目標最大 值孔之所有吸光度值中減去培養基背景孔之吸光度值之平均值進行分析。接著，標準化經修正之吸光度讀數之平均值並藉由使用下式計算ADCC活性：
圖7中之結果顯示CHv62.21及CHv62.21pAF MAb不顯示ADCC活性。然而，陽性對照(利妥昔單抗)證實Raji細胞系中之ADCC活性。
實例10
CHv62.21pAF-AGL-0182-30抑制活體內腫瘤之生長
FLT3於腫瘤細胞中之顯著表現，連同其於正常細胞中之限制性表現使得FLT3成為用於抗體療法及(類似地)ADC療法之良好標靶。因此，評估CHv62.21pAF-AGL-0182-30於人類ALL、AML及B-LL癌症異種移植小鼠模型中之治療性療效。
抗體藥物結合物對腫瘤生長及轉移形成之療效係於小鼠癌症異種移植物模型(例如，皮下及原位移植)中研究。
藉由在雄性SCID小鼠之右側腹中注射與基底膜(合作研究)以1：1稀釋混合之5 x 104至106個癌細胞而產生皮下(s.c.)腫瘤。為測試ADC對腫瘤形成之療效，即在與腫瘤細胞注射之同一天開始注射ADC。作為對照，向小鼠注射經純化之人類IgG或PBS；或識別不表現於人類細胞中之無關抗原之經純化之MAb。在初步研究中，未在對照IgG或PBS間發現對腫瘤生長之差異。藉由測徑器量測測定腫瘤尺寸且腫瘤體積計算為寬度2 x長度/2，其中寬度係最小尺寸及長度係最大尺寸。犧牲具有大於1.5cm直徑之皮下腫瘤之小鼠。
異種移植癌症模型之優點係研究新血管形成及血管形成之能力。腫瘤生長部分依賴於新血管發育。儘管毛細管系統及正發育之血 網係宿主起源，但藉由異種移植腫瘤調節新血管分佈之啟動及架構(Davidoff等人，Clin Cancer Res.(2001)7：2870；Solesvik等人，Eur J Cancer Clin Oncol.(1984)20：1295)。根據此項技術中已知的程序研究抗體及小分子對新血管形成之影響，諸如藉由腫瘤組織之IHC分析及其等周圍環境。
CHv62.21pAF-AGL-0182-30 ADC抑制於表示為MV4-11之癌細胞系皮下建立之癌症異種移植物之形成。此等結果指示CHv62.21pAF-AGL-0182-30於癌症及較佳彼等闡述於表I中之癌症之局部及晚期階段之治療中之療效。
FLT3 ADC：
如描述於標題為「FLT3單株抗體(MAb)之產生」之實例中般培養針對FLT3之單株抗體。另外，該等MAb如描述於標題為「CHv62.21pAF MAb之抗體藥物結合」之實例中般結合至毒素以形成CHv62.21pAF-AGL-0182-30。藉由FACS及此項技術中已知的其他方法表徵CHv62.21pAF及CHv62.21pAF-AGL-0182-30以測定其結合FLT3之能力。
細胞系及異種移植物：
如此項技術中已知，將細胞保持於以L-麩醯胺酸及10% FBS補充之DMEM中。藉由SCID小鼠中之連續繁殖保持MV4-11異種移植物。
CHv62.21pAF-AGL-0182-30於植入CB17/SCID小鼠中之人類B骨髓單核球性白血病細胞系MV4-11之皮下建立之異種移植物模型中之療效及劑量滴定。
在此實驗中，將人類B骨髓單核球性白血病MV4-11細胞(每隻小鼠3.0x106個細胞)注射於個別SCID小鼠之側腹中並容許腫瘤生長。當平均腫瘤體積達成既定尺寸(200mm3)時，動物經腫瘤尺寸匹配並使用Study Director軟體(v.2.1；Studylog Systems,Inc.,South San Francisco,CA)將該等動物以相似平均腫瘤尺寸及各組中之變異而隨機分為治療組及對照組。在藥物投與當天前之下午藉由腹膜內注射以20mg/kg向所有研究小鼠預裝入Fc阻斷劑(mLYS-1c3.1-hIgG1)。
以3個不同給藥濃度(0.5、1.0及2.0mg/kg)作為單一大丸劑藉由靜脈內注射給藥CHv62.21pAF-AGL-0182-30。使用20mM組胺酸/5%海藻糖(pH 6.0)及91.1-AGL-0182-30作為載體及ADC對照。基於在各給藥前立即獲得之各動物之個別體重投與所有藥劑。使用測徑器量測每週兩次監測各組中之腫瘤生長直至研究終止。使用Kruskal-Wallis測試進行動物犧牲前最後一天之腫瘤體積資料之統計學分析。使用Tukey測試程式(雙側)作出成對比較以保護實驗誤差率。
此研究評估CHv62.21pAF-AGL-0182-30之療效並在皮下建立於CB17/SCID小鼠中之MV4-11人類B骨髓單核球性白血病異種移植物模型中比較其與其ADC對照(91.1-AGL-0182-30)。CHv62.21pAF-AGL-0182-30係以3個不同劑量濃度(0.5、1.0及2.0mg/kg)作為單一劑量藉由靜脈內(i.v.)推注投與。91.1-AGL-0182-30係作為ADC對照以2mg/kg藉由靜脈內注射給藥。且使用20mM組胺酸/5%海藻糖(pH 6.0)作為載體對照。
結果指示在載體與ACD對照之治療間無統計學差異(p>0.9999)。當在給藥開始時相較於起始腫瘤尺寸時，2.0mg/kg之CHv62.21pAF-AGL-0182-30統計學顯著地消退腫瘤達100%(p<0.0001)。相較於載體對照，1.0mg/kg之CHv62.21pAF-AGL-0182-30統計學顯著地抑制腫瘤生長達78.1%(p<0.0001)。CHv62.21pAF-AGL-0182-30在0.5mg/kg之劑量下於此模型中不顯示任何療效(p=0.5344)。(圖5)。
CHv62.21pAF-AGL-0182-30(ADC)及CHv62.21pAF(裸抗體)於植入CB17 SCID小鼠中之人類B骨髓單核球性白血病細胞系MV4-11之皮下建立之異種移植物模型中之療效。
在另一實驗中，將人類B骨髓單核球性白血病MV4-11細胞(每隻小鼠3.0x106個細胞)注射於個別SCID小鼠之側腹中並容許腫瘤生長。當平均腫瘤體積達成既定尺寸(200mm3)時，動物經腫瘤尺寸匹配並使用Study Director軟體(v.2.1；Studylog Systems,Inc.,South San Francisco,CA)將該等動物以相似平均腫瘤尺寸及各組中之變異而隨機分為治療組及對照組。在藥物投與當天前之下午藉由腹膜內注射以20mg/kg向所有研究小鼠預裝入Fc阻斷劑(mLYS-1c3.1-hIgG1)。CHv62.21pAF-AGL-0182-30及ADC對照(91.1-AGL-0182-30)係作為單一大丸劑藉由靜脈內注射以1mg/kg給藥。AGS62P(a.k.a.CHv62.21pAF)及裸抗體對照(91.1-pAF)係以2mg/kg作為單一大丸劑藉由靜脈內注射給藥。基於在各給藥前立即獲得之各動物之個別體重投與所有藥劑。使用測徑器量測每週兩次監測各組中之腫瘤生長直至研究終止。使用Kruskal-Wallis測試進行動物犧牲前最後一天之腫瘤體積資料之統計學分析。使用Tukey測試程序(雙側)作出成對比較以保護實驗誤差率。
此研究評估CHv62.21pAF-AGL-0182-30(ADC)及CHv62.21pAF(裸抗體)之療效。
結果顯示相較於ADC對照(91.1-AGL-0182.30)，CHv62.21pAF-AGL-0182-30以1.0mg/kg作為單一劑量藉由靜脈內注射統計學顯著地抑制腫瘤生長達51.4%(p=0.0010)。相較於裸抗體對照(91.1-pAF)，CHv62.21pAF以2.0mg/kg作為單一劑量藉由靜脈內注射顯示無統計學差異(p=0.6570)。此外，當相較於2.0mg/kg之CHv62.21pAF(p=0.0134)時，該等結果指示1.0mg/kg之CHv62.21pAF-AGL-0182-30統計學顯著地抑制腫瘤生長達54.3%。(圖6)。
CHv62.21pAF-AGL-0182-30(ADC)及CHv62.21pAF(裸抗體)於植入CB17 SCID小鼠中之人類B骨髓單核球性白血病細胞系MV4-11 之皮下建立之異種移植物模型中之療效。
在另一實驗中，將人類B骨髓單核球性白血病MV4-11細胞(每隻小鼠3.0x106個細胞)注射於個別SCID小鼠之側腹中並容許腫瘤生長。當平均腫瘤體積達成既定尺寸(200mm3)時，動物經腫瘤尺寸匹配並使用Study Director軟體(v.2.1；Studylog Systems Inc.,South San Francisco,CA)將該等動物以相似平均腫瘤尺寸及各組中之變異而隨機分為治療組及對照組。在藥物投與當天前之下午藉由腹膜內注射以20mg/kg向所有研究小鼠預裝入Fc阻斷劑(mLYS-1c3.1-hIgG1)。CHv62.21pAF-AGL-0182-30及ADC對照(91.1-AGL-0182-30)係藉由靜脈內注射以2mg/kg QW給藥2週。AGS62P(a.k.a.CHv62.21pAF)及裸抗體對照(91.1-pAF)係藉由靜脈內注射以2mg/kg QW給藥數週。基於在各給藥前立即獲得之各動物之個別體重投與所有藥劑。使用測徑器量測每週兩次監測各組中之腫瘤生長直至研究終止。使用Kruskal-Wallis測試進行動物犧牲前最後一天之腫瘤體積資料之統計學分析。使用Tukey測試程序(雙側)作出成對比較以保護實驗誤差率。
此研究使用多劑量方案在2週時間段內評估CHv62.21pAF-AGL-0182-30(ADC)及Chv62.21pAF(裸抗體)之療效。
結果顯示相較於ADC對照(91.1-AGL-0182.30)，CHv62.21pAF-AGL-0182-30以2.0mg/kg作為多劑量藉由靜脈內注射在第17天統計學顯著地抑制腫瘤生長達100%腫瘤消退(p=0.0001)。相較於裸抗體對照(91.1-pAF)，CHv62.21pAF以2.0mg/kg作為多劑量藉由靜脈內注射顯示無統計學差異。(圖13)。
CHv62.21pAF-AGL-0182-30於CB17 SCID小鼠中之皮下建立之SEM-xcl異種移植物模型中之療效。
在另一實驗中，將人類急性淋巴母細胞性白血病SEM-xcl細胞(每隻小鼠1.0x106個細胞)注射於個別SCID小鼠之側腹中並容許腫瘤生 長。當平均腫瘤體積達成既定尺寸(200mm3)時，動物經腫瘤尺寸匹配並使用Study Director軟體(v.2.1；Studylog System Inc.,South San Francisco,CA)將該等動物以相似平均腫瘤尺寸及各組中之變異而隨機分為治療組及對照組。
藉由靜脈內注射在第0天以5.0mg/kg、2.0mg/kg或1.0mg/kg作為單一大丸劑劑量給藥CHv62.21pAF-AGL-0182-30。使用相同路徑及給藥時間表以5.0mg/kg給藥對照ADC(AGS91.1-pAF-AGL-0182-30)。使用20mM組胺酸/5%海藻糖(pH 5.2)作為載體。基於在各給藥前立即獲得之各動物之個別體重投與所有藥劑。使用測徑器量測每週兩次監測各組中之腫瘤生長直至研究終止。使用Kruskal-Wallis測試進行動物犧牲前最後一天之腫瘤體積資料之統計學分析。使用Tukey測試程式(雙側)作出成對比較以保護實驗誤差率。
結果顯示當相較於對照ADC(AGS91.1-pAF-AGL-0182-30)或相較於載體對照時，所有三個劑量濃度(5.0、2.0及1.0mg/kg)之CHv62.21pAF-AGL-0182-30證實潛在抗腫瘤活性(p<0.0001)，一般而言導致大於75%之腫瘤生長抑制。此外，當以5.0mg/kg給藥時，CHv62.21pAF-AGL-0182-30在相較於其初始起始腫瘤體積時顯著消退腫瘤57.3%。在5.0mg/kg與2.0mg/kg或1.0mg/kg間觀察到統計學顯著差異。(圖14)。
結論
總而言之，圖5、6、13及14顯示當相較於對照ADC及結合FLT3之裸抗體時，名為CHv62.21pAF-AGL-0182-30之FLT3 ADC顯著抑制表現FLT3之腫瘤細胞之生長。因此，CHv62.21pAF-AGL-0182-30可出於治療性目的用於治療及控制闡述於表I中之癌症。
實例11
用於通過使用FLT3 ADC治療及診斷人類癌之人類臨床試驗
FLT3 ADC係根據本發明用於特異性結合至FLT3且用於某些腫瘤(較佳彼等列於表I中者)之治療中。聯繫此等適應症中之各者，順利進行兩種臨床方法。
I.)輔助療法：在輔助療法中，以FLT3 ADC組合化學治療劑或抗贅瘤劑及/或放射療法或其組合治療病患。原發性癌症目標(諸如彼等列於表I中者)在標準方案下藉由向標準一線及二線療法添加FLT3 ADC加以治療。方案設計解決如藉由下列實例評估之有效性，包括(但不限於)減小原發性或轉移性病灶之腫瘤質量；增加無進展存活期(progression free survival)；總體存活期；病患健康之改善；疾病穩定化及減小標準化學療法及其他生物劑之常用劑量之能力。此等劑量減小容許藉由減小化學治療劑或生物劑之劑量相關毒性之額外及/或經延長之療法。FLT3 ADC組合化學治療劑或抗贅瘤劑用於數個輔助臨床試驗中。
II.)單一療法：在腫瘤之單一療法中結合使用FLT3 ADC，向病患投與FLT3 ADC而無化學治療劑或抗贅瘤劑。在一個實施例中，單一療法係於罹患大量轉移性疾病之末期癌症病患中以臨床方式進行。方案設計解決如藉由下列實例評估之有效性，包括(但不限於)減小原發性或轉移性病灶之腫瘤質量；增加無進展存活期；總體存活期；病患健康之改善；疾病穩定化及減小標準化學療法及其他生物劑之常用劑量之能力。
劑量
劑量方案可經調整以提供最佳化所需反應。例如，可投與單一大丸劑，可在一段時間內投與數個分劑量或如藉由治療性情況之緊急狀態指示可成比例減小或增加該劑量。針對易於投與及劑量之均勻性將非經腸組合物調配成劑量單元形式尤其有利。如本文使用之劑量單元形式係指適合作為用於待治療之哺乳動物個體之單一劑量之物理離散單元；各單元含有經計算以產生與所需醫藥載劑相關聯之所需治療 效應之既定量活性化合物。用於本發明之劑量單元形式之說明書藉由以下決定及直接取決於：(a)抗體及/或ADC之獨特特性及待達成之特定治療性或預防性效應，及(b)針對治療個體中之過敏而化合此種活性化合物之技術中所固有之限制性。
用於根據本發明組合投與之FLT3 ADC之治療有效量之例示性非限制性範圍係約0.5至約10mg/kg；約1至約5mg/kg；至少1mg/kg；至少2mg/kg；至少3mg/kg或至少4mg/kg。其他例示性非限制性範圍係(例如)約0.5至約5mg/kg或(例如)約0.8至約5mg/kg或(例如)約1至約7.5mg/kg。本發明之高劑量實施例係關於大於10mg/kg之劑量。應注意劑量值可隨待緩解之病症之類型及嚴重性變化且可包括單一劑量或多個劑量。應進一步瞭解就任何特定個體而言，應根據投與或監控組合物之投與者之個別需求及專業判斷隨時間調整具體劑量方案且本文闡述之劑量範圍僅例示性且無意限制所主張組合物之範圍或實務。
臨床發展計劃(CDP)
CDP遵循並發展FLT3 ADC結合輔助療法或單一療法之治療。試驗最初證明安全性及其後確定重複劑量之療效。試驗係比較標準化學療法及標準療法加FLT3 ADC之開放標記。如將瞭解，可結合病患之登記利用之一項非限制性準則係如藉由生檢測定之其等腫瘤中之FLT3表現程度。
與基於任何蛋白質或抗體輸注之治療一樣，安全顧慮主要係關於(i)細胞介素釋放症候群，即，低血壓症、發燒、震顫、寒顫；(ii)對材料發展免疫原性反應(即，病患對抗體治療發展人類抗體或HAMA反應)；及(iii)對表現FLT3之正常細胞之毒性。利用標準測試及隨訪以監測此等安全顧慮中之各者。當人類投與後，發現FLT3 ADC係安全的。
實例12
正常及癌症病患衍生之樣本中之FLT3蛋白之偵測
使用抗FLT3抗體偵測癌症中之FLT3蛋白係於骨髓性(AML)細胞群體中患有急性淋巴球性白血病之病患之末梢血液之PBMC樣品中進行評定。
A. FACS結合材料及方法
在此實驗中，樣品用CD45、CD33、CD34、CD3、CD20、CD38及抗Flt3生物素或同型生物素mAb之混合物培養。用於生物素化mAb之第二偵測物係鏈霉親和素-PE。用鏈霉親和素-PE(SAv-PE)偵測試劑製造螢光減一(FMO)對照混合物且用於閘控細胞群體。An LSRII流式細胞儀(BD生物科學)用於獲取資料。
淋巴球閘控於CD45+群體上，其中識別四種不同群體，CD33+/3-/20-(骨髓性原始細胞)、CD33+/3-/34+/38-(幹細胞)、CD33-/3+(T細胞)及CD33-/20+(B細胞)。用Flowjo軟體9.5.4版(Tri-Star,Ashland,OR)完成分析。將螢光值記錄為幾何平均值(MFI)。
B. 結果
針對AML病患樣品闡述於表VIII中之結果顯示抗FLT3 MAb結合至所有經測試之樣品之骨髓性、幹細胞、T及B細胞群體。
此外，如顯示於表VIII中，針對所有經測試之樣品之MFIR分佈圖顯示骨髓性、幹細胞及B細胞群體中之中等變異性，而T細胞在MFIR中具有較少變異性。針對骨髓性原始細胞之平均MFIR約963.1,而針對幹細胞之平均MFIR係318.2，而針對T細胞之平均MFIR係9.842，而針對B細胞之MFIR在AML中係72.60。針對正常樣品之平均MFIR在骨髓性中係642.4，針對幹細胞係68.29，針對T細胞係11.66及針對B細胞係13.73。
表VIII中闡述之結果之總體顯示抗FLT3 MAb(諸如本發明之CHv62.21 MAb及Chv62.21pAF MAb)可偵測過表現於AML中之FLT3蛋 白。
實例13
藉由CHv62.21pAF及CHv62.21pAF-AGL-0182-30介導之活體外細胞毒性
FLT3抗體(CHv62.21pAF)及FLT3 ADC(CHv62.21pAF-AGL-0182-30)介導FLT3依賴性細胞毒性之能力係使用內源性表現FLT3之人類白血病MV-4-11及MOLM-13細胞系及不表現FLT3之人類白血病細胞系Karpas299評估。
簡而言之，在37℃及5% CO2下將MV-4-11、MOLM-13及Karpas299細胞分別以1500、2000及3000個細胞/孔之密度接種於96孔板上的50μl完全培養基中並放置於組織培養培養器中。隔天，以每孔25μl體積的Fc阻斷細胞以減少非特異性結合及於完全培養基中製備cHv62.21pAF-AGL-0182-30、同型對照抗體-AGD-0182結合物(91.1pAF-AGL-0182-30)、cHv62.21pAF及同型對照抗體(91.1pAF)之4x原液並將該等ADC及抗體之25μl連續稀釋液添加至適當孔中。在37℃及5% CO2下於組織培養培養器中用cHv62.21pAF-AGL-0182-30、91.1pAF-AGL-0182-30、cHv62.21pAF及91.1pAF處理細胞5天。培養週期結束時，將20μl Presto Blue添加至每孔中並培養2小時。使用BioTek Synergy H4板讀數器使用540激發波長及590發射波長對該等板進行閱讀。
表IX中之結果顯示抗FLT3 ADC(CHv62.21pAF-AGL-0182-30)可選擇性誘發表現FLT3之MOLM-13及MV-4-11細胞系之細胞毒性，同時其無法誘發非表現FLT3之Karpas299細胞系之細胞毒性。該抗FLT3抗體(CHv62.21pAF)無法誘發MOLM-13及MV-4-11細胞系之細胞毒性。因此，此等資料證實單獨FLT3 MAb CHv62.21pAF無法誘發細胞之細胞毒性。相反，僅FLT3 ADC CHv62.21pAF-AGL-0182-30可選擇 性殺死表現FLT3之MOLM-13及MV-4-11細胞同時其對非表現FLT3之Karpas299細胞無影響。
實例14
CHv62.21pAF優於先前技術FLT3 MAb之優點
本發明之CHv62.21pAF MAb呈現優於其他結合FLT3之MAb之數個優點。尤其當鑒於本發明之ADC之治療性效用而言時。例如，先前技術教示在AML病患已經化學療法治療後，血漿FLT3配體(「FL」)之表現增加。參見，Takashi等人，Blood vol.117(12)(March 2011)。此外，已顯示經增加之FL顯著減小FLT抑制劑之活性。同上，與單甲基奧瑞司他汀F(EB10-MMAF)結合之EB10已記錄為包含抗人類FLT3抗體之ADC。(參見，Proc Amer Assoc Cancer Res，第46卷，2005)。該EB10已顯示阻斷FL。參見，美國專利案第8,071,099(Imclone)號。因此，本發明之目標係設計結合FLT3抗原但不結合FL之MAb。
在一項實驗中，證實本發明之CHv62.21 MAb不阻斷FL。簡而言之，重組人類FLT3-Fc購買自R及D系統。根據由Luminex提供之程序使用標準磺基-NHS/EDC化學將此蛋白質固定於經活化之Luminex微球之表面上。將該蛋白質之經His標記形式連同數種其他蛋白質結合至Luminex微球並充當此程序中之對照。
另外，FLT3配體亦購買自R及D系統。該配體使用Thermo Scientific EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素(無權重式)，根據製造商之推薦而生物素化。蛋白質與磺基-NHS-LC-生物素反應兩(2)小時後，藉由針對DPBS之滲析移除未經併入之生物素。
固定於微球表面上之FLT3結合至其生物素化配體之能力係藉由使微球與各種濃度之生物素化配體(其係於含有PBS、2% BSA、0.05%吐溫20及0.1%疊氮化鈉之緩衝液中製得)在RT下反應120分鐘並輕微振盪來評定。在培養結束時，吸出該等微球並清洗。結合至固定 化受體之生物素化FLT3配體以鏈霉親和素-R-藻紅素(Moss,Inc.)偵測。與微球結合之螢光用Luminex儀器量測。此評定顯示5ng/mL濃度之生物素化FLT3配體足以產生穩健信號，但無法浸透與微球結合之FLT3。
最後，為評定FLT3抗體潛在阻斷配體之能力，製備含有5ng/mL之生物素化FLT3配體加在研究下之10μg/mL各種抗體之混合物。將此等混合物應用於固定於微球上之FLT3並培養60分鐘。在培養結束時，吸出該等微球並清洗。結合至固定化受體之生物素化FLT3配體用鏈霉親和素-R-藻紅素(Moss,Inc.)偵測。與微球結合之螢光用Luminex儀器量測。藉由MFI(中值螢光強度)之減小觀察具有阻斷配體之能力之抗體。
圖8之結果證實FLT3 MAb CHv62.21係非FL阻斷劑且表示為v62-1b37.1之另一FLT3 MAb(表X)係FL阻斷劑，類似於表示為EB10之先前技術FLT3 MAb(參見，美國專利案第8,071,099號)。
FLT3抗體(CHv62.21及v62-1b37.1)介導人類FLT3配體之影響之能力係使用內源性表現FLT3之人類白血病EOL-1細胞系評估。亦使用同型對照抗體(mLys-1c3.1)。在37℃及5% CO2下，將該等EOL-1細胞接種於50μl完全培養基中，以每孔2000個細胞之密度接種於96孔板上並放置於組織培養培養器中。隔天，用50、10或5ng/mL人類FLT3配體(於25μl完全培養基中)及10、1、0.1及0μg/mL測試抗體(於25μl完全培養基中)處理細胞。培養基單獨用作未經處理之對照。在37℃及5% CO2下於組織培養培養器中將該等細胞處理5天。在培養週期結束時，在室溫下將100μl Cell Titer Glo添加至各孔中並培養30分鐘，振盪。該等板使用使用發光之BioTek Synergy H4板讀數器進行閱讀並使用Graphpad Prism軟體作圖。
圖9中之結果顯示v62-1b37.1在FLT3配體之存在下在高濃度下抑 制生長，但CHv62.21對生長無任何影響。人類FLT3配體單獨對EOL-1細胞系之生長無影響。
基於在用於癌症治療之化學療法後，血漿中之FL濃度增加之教示(參見，Takashi等人，同上)，顯示當本發明之FLT3 MAb不阻斷FL時存在優點。為證實此點，顯示雖然阻斷MAb之配體之細胞毒性活性在FL之存在下減小，但阻斷MAb之非配體之細胞毒性活性在FL之存在下未減小。
FLT3 ADC(cHv62.21pAF-AGL-0182-30及v62-1b21.1-AGL-0129-08)在缺乏及存在人類FLT3配體(hFL)之情況下介導FLT3依賴性細胞毒性之能力係使用內源性表現FLT3之人類白血病RS-4-11細胞系評估。
簡而言之，在37℃及5% CO2下以每孔3000個細胞之密度將RS-4-11細胞接種於96孔板上的50μl完全培養基中並放置於組織培養培養器中。隔天，該等ADC以10μg/mL製造於完全培養基中並1：5連續稀釋以得到總計9個點。將ADC之25μl連續稀釋液添加至含有及缺乏人類FLT3配體之適當孔中(以100ng/mL每孔添加25μl)。該等細胞在37℃及5% CO2下用v62-1b21.1-AGL-0129-08(表XI，參見，WO2015/183978,Agensys,Inc.)及v62-1b37.1-AGL-0129-08加上及不加人類FLT3配體於組織培養培養器中處理5天。在培養週期結束時，向各孔添加20μl Presto Blue並培養2小時。該等板使用BioTek Synergy H4板讀數器使用540激發波長及590發射波長進行閱讀並使用Graphpad Prism軟體作圖。
圖10(A)及10(B)中之結果顯示抗FLT3 ADC(v62-1b21.1-AGL-0129-08及v62-1b37.1-AGL-0129-08)可誘發表現FLT3之RS-4-11細胞系之細胞毒性。抗FLT3 ADC(v62-1b21.1-AGL-0129-08)在存在及缺乏人類FLT3配體之情況下具有相似細胞毒性水平。然而，與在缺乏配體存在下進行的ADC治療相比，抗FLT3 ADC(v62-1b37.1-AGL-0129-08) 之細胞毒性活性在人類FLT3配體之存在下有所減小。
在另一實驗中，抗FLT3抗體(CHv62.21及v62-1b37.1)結合至表現於人類白血病MOLM-13細胞系之表面上之FLT3之能力係在人類FLT3配體(hFL)之存在下評估。使用同型對照抗體(AGS91.1-pAF)作為陰性對照。
簡而言之，以每孔50,000個細胞之密度將MOLM-13細胞接種於圓底96孔板上。用每孔150μl PBS清洗該等板一次。以每孔50μl體積之Fc於FACS緩衝液(PBS+2% FBS+0.1%疊氮化鈉)中阻斷細胞(20μg/mL)以減少非特異性結合。在4℃下將細胞培養15分鐘。以100ng/mL將人類FLT3配體添加至適當之孔中並跨板1：2連續稀釋以得到總計11個點。在添加生物素化FLT3抗體前在4℃下將細胞培養30分鐘。培養後，以10μg/mL及1μg/mL於FACS緩衝液中製造生物素化抗FLT3抗體及同型對照抗體並將25μl添加至孔中且在4℃下培養1小時。細胞用FACS緩衝液清洗兩次並每孔100μl添加鏈霉親和素-PE(Jackson免疫)且在4℃下培養1小時。細胞用FACS緩衝液清洗兩次並在Attune細胞計數器(Life technologies)上閱讀數且於FlowJo(Tree Star)軟體中分析。
圖11(A)中之結果顯示人類FLT3配體不干擾抗FLT3抗體(AGS62P)結合至MOLM-13細胞。然而，人類FLT3配體確實以劑量依賴性方式干擾抗FLT3抗體(cHv62-1b37.1)結合至MOLM-13細胞。
最後，FLT3 ADC(AGS62P1)在缺乏及存在人類FLT3配體(hFL)之情況下介導FLT3依賴性細胞毒性之能力係使用內源性表現FLT3之人類白血病MOLM-13細胞系評估。使用同型對照ADC(AGS91.1.88-pAF-AGL-0182-30)作為陰性對照。
簡而言之，在37℃及5% CO2下以每孔2000個細胞之密度將MOLM-13細胞接種於96孔板上之50μl完全培養基中並放置於組織培 養培養器中。隔天，以每孔25μl體積的Fc阻斷細胞以減少非特異性結合。將ADC於完全培養基中製備成10μg/mL最終濃度並1：5連續稀釋以得到總計9個點。將ADC之12.5μl連續稀釋液添加至含有及缺乏人類FLT3配體(100ng/mL，每孔添加12.5μl)之適當孔中。在37℃及5% CO2下於組織培養培養器中用AGS62P1及AGS91.1.88-pAF-AGL-0182-30加上及不加人類FLT3配體將該等細胞處理5天。在培養週期結束時，將20μl Presto Blue添加至各孔中並培養2小時。使用BioTek Synergy H4板讀數器使用540激發波長及590發射波長對該等板閱讀並使用Graphpad Prism軟體作圖。
圖11(B)中之結果顯示人類FLT3配體不干擾抗FLT3 ADC(CHv62.21pAF-AGL-0182-30)介導之MOLM-13細胞毒性。
因此，雖然FLT3 MAb可用於治療性情況中，但非所有FLT3 MAb皆係相同的。圖8至11中之結果顯示不結合FL之FLT3 MAb呈現優於顯示結合FL之FLT3 MAb之顯著優點。此外，鑒於本發明之ADC之治療效用，結果顯示包含非配體阻斷劑FLT3 MAb之ADC(諸如CHv62.21pAF-AGL-0182-30)相較於包含配體阻斷劑FLT3 MAb之ADC在FL之存在下保留抗腫瘤效應。一般技術者瞭解已知FL之存在在化學治療性治療後增加。另外，已知FL之存在增加已顯示減小FLT3抑制劑之活性。因此，圖8至11中之結果表明在癌症病患中，包含非配體阻斷劑FLT3 MAb之ADC當相較於包含配體阻斷劑FLT3 MAb之ADC時具有更好治療指數及抗腫瘤效應。
實例15
CHv62.21pAF-AGL-0182-30之穩定性測試
FLT3 ADC CHv62.21pAF-AGL-0182-30及使用另一細胞毒性化合物AGL-0301-20(參見，WO2014/043403,Agensys,Inc.)之另一FLT3 ADC之穩定性係經活體外評估。在此實驗中，人類血清(Millipore)係 加料0.4mg/mL各ADC及50mM最終濃度之磷酸鹽pH 7.3並在37℃下於經潤濕之培養器中培養。收集100μL等分試樣並在-80℃下冷凍5分鐘、3小時、25.25小時、51.25小時及171.2小時。收集所有樣品後，進行ELISA以定量各ADC之抗體及藥物組分。
結果顯示CHv62.21pAF-AGL-0182-30藥物抗體連接係在實驗之時間過程中穩定，圖12(A)。然而，圖12(B)顯示用於v62-1b21-AGL-0301-20之藥物-抗體連接不穩定，導致在實驗之時間過程中顯著去結合。
在整個本申請案中，參考各種網站資料內容、申請案、專利申請案及專利案。(網站藉由地址位於全球資訊網上之其等全球資源定址器或URL參考)。此等參考文獻中之各者之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
本發明之範疇不受限於本文所揭示之欲作為本發明之個別態樣的單個示例之實施例，及功能上等效之任何者係屬於本發明範疇。除彼等本文描述者外，熟習此項技術者自前述描述及教示中將明瞭對本發明之模型及方法所作之各種修改，且同樣意欲落於本發明之範圍內。可實踐此類修改性或其他實施例而不背離本發明之範圍及精神。
表格
表III：胺基酸取代矩陣調適自GCG軟體9.0 BLOSUM62胺基酸取代矩陣(阻斷取代矩
表IV：用於合成AGL-0182-30之一般方法
表V：如分別藉由Kabat、Chothia及Contact方案識別位置CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3。就CDR-H1而言，使用Kabat及Chothia編號方案以清單方式給定殘基編號。
表VIII：原發性AML及正常樣品中之FLT3表現AML樣品中之表現
表X：v62-1b37.1之抗體序列。v62-1b37.1重鏈之胺基酸序列。(SEQ ID NO：12)。
【生物材料寄存】
國內寄存資料【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
1.財團法人食品工業發展研究所、2016年6月2日、BCRC 960510
2.財團法人食品工業發展研究所、2016年6月2日、BCRC 960511
國外寄存資料【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
1.美國、美國菌種保存中心(ATCC)、2014年12月9日、PTA-121831
2.美國、美國菌種保存中心(ATCC)、2014年12月9日、PTA-121836
<110> 美商艾澤西公司
<120> 結合至FLT3蛋白之抗體藥物結合物(ADC)
<130> 511582009200
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 62/130,476
<151> 2015-03-09
<160> 34
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 3307
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 人類FLT3
<400> 1
<210> 2
<211> 993
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人類FLT3
<400> 2
<210> 3
<211> 1362
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CHv62.21重鏈
<400> 3
<210> 4
<211> 453
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CHv62.21重鏈
<400> 4
<210> 5
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CHv62.21輕鏈
<400> 5
<210> 6
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CHv62.21輕鏈
<400> 6
<210> 7
<211> 1362
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> CHv62.21重鏈
<400> 7
<210> 8
<211> 453
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CHv62.21重鏈
<220>
<221> 變體
<222> 124
<223> Xaa=對乙醯基苯丙胺酸(pAF)
<400> 8
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<211> 453
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CHv62.21重鏈
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<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CHv62.21輕鏈
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<210> 11
<211> 453
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CHv62.21重鏈
<220>
<221> 變體
<222> 124
<223> Xaa=對乙醯基苯丙胺酸(pAF)
<400> 11
<210> 12
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> v62-1b37.1重鏈
<400> 12
<210> 13
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> v62-1b37.1輕鏈
<400> 13
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<212> PRT
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<400> 33
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34

Claims (33)

  1. 一種抗體，其包含以下：具有SEQ ID NO：23之胺基酸序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列之CDRH2、具有SEQ ID NO：32之胺基酸序列之CDRH3、具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列之CDRL2，及具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列之CDRL3。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含由自SEQ ID NO：11之第1 E至第123 S範圍內之胺基酸序列組成之重鏈可變區及包含由自SEQ ID NO：10之第1 D至第108 R範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈可變區。
  3. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含由根據ATCC登錄號PTA-121831存放之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生之抗體之重鏈可變區之胺基酸序列組成之重鏈可變區及包含由根據ATCC登錄號PTA-121831存放之中國倉鼠卵巢(CHO)產生之抗體之輕鏈之胺基酸序列組成之輕鏈可變區。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含Fc區，其係IgG亞型。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體，其中該Fc區包含在該重鏈之胺基酸位置124處之非天然胺基酸之取代，且其中該非天然胺基酸係對乙醯基苯丙胺酸(pAF)。
  6. 如請求項1至2中任一項之抗體，其中該抗體包含由自SEQ ID NO：11之胺基酸編號第1 E至第452 G範圍內之胺基酸序列組成之重鏈及包含由自SEQ ID NO：10之第1 D至第214 C範圍內之胺基 酸序列組成之輕鏈。
  7. 如請求項1至2中任一項之抗體，其中該抗體包含由自SEQ ID NO：11之第1 E至該第453 K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈及包含由自SEQ ID NO：10之第1 D至第214 C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。
  8. 如請求項5之抗體，其中該抗體包含由根據ATCC登錄號PTA-121836存放之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生之抗體之重鏈之胺基酸序列組成之重鏈，及包含由根據ATCC登錄號PTA-121836存放之中國倉鼠卵巢(CHO)產生之抗體之輕鏈之胺基酸序列組成之輕鏈。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體，其中該重鏈可變區或該重鏈之第1 E係經焦麩胺酸鹽取代。
  10. 如請求項6之抗體，其中該抗體包含由自SEQ ID NO：11之第1 E至第452 G範圍內之胺基酸序列組成之重鏈，且其中該重鏈可變區或該重鏈之第1 E係修飾成焦麩胺酸鹽，及其中該抗體包含由自SEQ ID NO：10之第1 D至第214 C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈。
  11. 一種抗原結合片段，其包含如請求項1至10中任一項之抗體之CDR，其中該抗原結合片段結合FLT-3。
  12. 如請求項11之抗原結合片段，其中該抗原結合片段係選自由以下組成之群：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、經分離VH及經分離VL。
  13. 一或多種經分離核酸，其等編碼如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段。
  14. 一或多種表現載體，其等包含如請求項13之一或多種經分離核酸。
  15. 一種重組宿主細胞，其包含如請求項14之一或多種表現載體。
  16. 一種抗體或抗原結合片段，其係藉由培養如請求項15之重組宿主細胞產生。
  17. 一種抗體藥物結合物，其包含如請求項16之抗體或抗原結合片段及治療劑。
  18. 一種抗體藥物結合物，其包含結合FLT3但大體上不抑制FLT3結合至FLT3配體(FL)之抗體或抗原結合片段及治療劑。
  19. 一種抗體藥物結合物，其包含如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段及治療劑。
  20. 如請求項17至19中任一項之抗體藥物結合物，其進一步包含連接該抗體或該抗原結合片段及該治療劑之連接子。
  21. 如請求項20之抗體藥物結合物，其中該連接子係非可裂解之連接子。
  22. 如請求項21之抗體藥物結合物，其中該連接子係2-(胺氧基)乙酸。
  23. 如請求項17至22中任一項之抗體藥物結合物，其中該治療劑係(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-胺基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-3-疊氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺基)丁醯胺。
  24. 如請求項17至23中任一項之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物具有下式：抗體-(連接子-治療劑)p，其中該連接子係2-(胺氧基)乙酸，且其中該治療劑係(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-胺基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲 氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-3-疊氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺基)丁醯胺，其中p係選自由以下組成之群：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3。
  25. 如請求項24之抗體藥物結合物，其中p係選自由以下組成之群：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3。
  26. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項17至25中任一項之抗體藥物結合物。
  27. 如請求項26之醫藥組合物，其用於治療中。
  28. 如請求項27之醫藥組合物，其中該治療用途係治療癌症。
  29. 如請求項26至28中任一項之醫藥組合物，其進一步包含一或多種抗贅瘤劑(anti-neoplastic agent)。
  30. 如請求項26至29中任一項之醫藥組合物，其中該癌症包含一或多種相較於非癌性細胞係以經增加之程度表現FLT3之細胞。
  31. 如請求項26至30中任一項之醫藥組合物，其中該癌症係選自由以下組成之群：急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、B細胞淋巴母細胞性白血病及前驅物B細胞淋巴母細胞性白血病。
  32. 一種治療個體癌症之方法，其包括向該個體投與治療有效量之如請求項17至25中任一項之抗體藥物結合物或如請求項26至30中任一項之醫藥組合物。
  33. 如請求項32之治療個體癌症之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、B細胞淋巴母細胞性白血病及前驅物B細胞淋巴母細胞性白血病。
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