TW201639582A

TW201639582A - 用於抗癌醫療的微型核糖核酸組合

Info

Publication number: TW201639582A
Application number: TW105100792A
Authority: TW
Inventors: 蒂莫西冠塔盧; 兆麟黃; 正姿蔡
Original assignee: 麻省理工學院
Priority date: 2015-01-12
Filing date: 2016-01-12
Publication date: 2016-11-16
Also published as: US20170369878A1; WO2016115033A1

Abstract

本發明係有關一種增進癌細胞對化學治療劑敏感性或減少癌細胞增生之微型核糖核酸組合的方法及組合物。本發明亦有關一種用於辨別產生所需功效之微型核糖核酸組合的方法。

Description

用於抗癌醫療的微型核糖核酸組合

本發明係有關一種用於減少癌細胞增生或增進癌細胞對化學治療劑易感受性之方法及組合物。

組合式基因組之協同作用在調節複雜生物特徵上扮演重要角色(Dixon et al.Annu. Rev. Genet. (2009) 43, 601-625)。舉例而言，將體細胞重新編程為誘導性多能幹細胞或不同系譜如神經元及心肌細胞，需要多個遺傳因子(Vierbuchen et al.Mol. Cell. (2012) 47, 827-838)。組合式藥物治療可達到優於常規單獨療法之功效，係因可以協同方式靶向多重途徑(Al-Lazikani et al.Nat. Biotechnol. (2012) 30, 679-692)。此外，儘管全基因體關聯分析(genome-wide association studies)之推定指出，多因子型人類疾病存在多個個別基因座，彼等基因座僅可解釋疾病遺傳之一小部分(Zuk et al.Proc. Natl. Acad. Sci. (2012) 109, 1193-1198；Eichler et al.Nat. Rev. Genet. (2010) 11, 446-450；Manolio et al.Nature (2009) 461, 747-753)。基因間之交互作用，在此遺傳缺失之計算上可能相當重要，但現有以系統性方式確認高階基因組合功能之技術仍有侷限。

多重基因途徑可獨立作用以促進疾病(如癌症)形成或進展。因此，常規單獨療法之功效可能有限。本文所述之方法及組合物係提供可靶向多個mRNAs之微型核糖核酸組合，其減少或防止其表現，造成細胞增生減少。本文所述之方法及組合物亦提供可使細胞感應化學治療劑之微型核糖核酸組合。亦提供篩選方法，用於辨別可影響細胞增生及/或對藥劑敏感性之新穎微型核糖核酸組合。

本發明之態樣係提供含一或多個重組型表現載體之組合物，其編碼三微型核糖核酸之組合，其係選自於如表7或表10所示之組合。其他態樣係提供含三微型核糖核酸之組合之組合物，其係選自於如表7或表10所示之組合。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合係串接之微型核糖核酸，可視需要地具一或多個連接子及/或間隔子序列；接合至一或多個奈米顆粒、細胞滲透性胜肽、或聚合物；或者含於微脂體內。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-181a、及miR-132。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-451a/451b/144/4732簇、miR-211、及miR-132。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-376a、miR-31、及miR-488。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含mir-128b、mir-212、及let-7i或miR-451a/451b/144/4732簇。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含mir128b、mir-451a/451b/144/4732簇、及miR-132或miR-212。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-128b、let-7i、及mir-212或miR-196。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-132、miR-15b/miR-16-2、及miR-31或let-7i。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-132、miR-451a/451b/144/4732簇、及miR-212或miR-128b。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、let-7i、及miR-373或miR-429。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181a、miR-429、及miR-29a或miR-31。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2、let-7i、及miR-132或miR-181a。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-212、miR-451a/451b/144/4732簇、及miR-132或miR-128b。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-16-1/15a簇、let-7e/miR-99b簇、及miR-128b。

其他態樣係提供含一或多個重組型表現載體之組合物，其編碼二微型核糖核酸之組合，其係選自於如表3所示之組合，或三微型核糖核酸之組合，其係選自於如表5或表10所示之組合。又其他態樣係提供含二微型核糖核酸之組合之組合物，其係選自於如表3所示之組合，或三微型核糖核酸之組合，其係選自於如表5或表10所示之組合。於一些具體實施例，二微型核糖核酸之組合或三微型核糖核酸之組合係串接之微型核糖核酸，可視需要地具一或多個連接子及/或間隔子序列；接合至一或多個奈米顆粒、細胞滲透性胜肽、或聚合物；或者含於微脂體內。於一些具體實施例，組合物進一步包含化學治療劑。於一些具體實施例，化學治療劑係抗有絲分裂劑/抗微管劑。於一些具體實施例，抗有絲分裂劑係多西他賽(docetaxel)。

於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-181a、及miR-132。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-451a/451b/144/4732簇、miR-211、及miR-132。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-376a、miR-31、及miR-488。於一些具體實施例，二微型核糖核酸之組合包含miR-376a及選自於由miR-16-1/15a簇、miR-212、及miR-31所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，二微型核糖核酸之組合包含miR-216及選自於由miR-181c、let-7a、miR-15b/miR-16-2簇、及miR-181a所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，二微型核糖核酸之組合包含miR-31及miR-181a或miR-376a。於一些具體實施例，二微型核糖核酸之組合包含miR-93/106b簇及miR-16-1/15a簇或miR-181a。於一些具體實施例，二微型核糖核酸之組合包含miR-181a及選自於由miR-31、let-7i、miR-93/106b簇、miR-373、miR-216、miR-15b/miR-16-2簇、及miR-16-1/15a簇所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，二微型核糖核酸之組合包含miR-16-1/15a簇及選自於由miR-376a、miR-93/10b簇、let-7a、miR-10b、miR-181a、miR-9-1、及miR-99a所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，二微型核糖核酸之組合包含miR-10b及選自於由miR-16-1/15a簇、miR-212、miR-196、及miR-15b/miR-16-2簇所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，二微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-161-2簇及選自於由miR-216、miR-181a、miR-9-1、及miR-10b所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，二微型核糖核酸之組合包含miR181c及mir-9-1或miR-216。於一些具體實施例，二微型核糖核酸之組合包含miR-212及miR-376a或miR-10b。於一些具體實施例，二微型核糖核酸之組合包含miR-9-1及選自於由miR-15b/miR-16-2簇、miR-16-1/15a簇、miR-324、及miR-181c所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，二微型核糖核酸之組合包含let-7a及miR-16-1/15a簇或miR-216。

於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含let-7c、miR-451a/451b/144/4732簇、及miR-324或miR376a。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含let-7d、miR-181c、及miR-10b或miR-9-1。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含let-7e/miR-99b簇、miR-15b/miR-16-2簇、及miR-181a或miR-16-1/miR-15a簇。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含let-7e/miR-99b簇、miR-16-1/15a簇、及miR-15b/miR-16-2簇或miR-181c。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含let-7e/miR-99b簇、miR-181a、及miR-324或miR-15b/miR-16-2簇。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含let-7e/miR-99b簇、miR-181c、及miR-429或miR-16-1/15a簇。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含let-7e/miR-99b簇、miR-376a、及miR-199b/3154簇或miR-188。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含let-7i、miR-15b/miR-16-2簇、及miR-451a/451b/144/4732簇或let-7c。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含let-7i、miR-199b/3154簇、及miR-10b或miR-29a。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-10b、miR-15b/miR-16-2簇、及選自於由miR-373、miR-211、及miR-126所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-10b、miR-373、及miR-15b/miR-16-2簇或miR-451a/451b/144/4732簇。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-10b、miR-451a/451b/144/4732簇、及miR-373、miR-429、或miR-708。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-126、miR-15b/miR-16-2簇、及miR-10b或miR-181a。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-126、miR-181a、及miR-451a/451b/144/4732簇或miR-15b/miR-16-2簇。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-126、miR-181c、及miR-451a/451b/144/4732簇或miR-29a。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-126、miR-29a、及miR-211或miR-181c。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-126、miR-451a/451b/144/4732簇、及miR-181a或miR-181c。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-128b、mir-16-1/15a簇、及miR-181c或miR-31。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-128b、mir-31、及miR-24-2/27a/23a簇或miR-16-1/15a簇。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-128b、mir-324、及miR-216或miR-188。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-16-1/15a簇、及選自於由miR-216、miR-429、miR-451a/451b/144/4732簇、及let-7e/miR-99b簇所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-181a、及選自於由miR-9-1、miR-126、miR-489、let-7e/miR-99b簇、miR-216、及miR-488所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-181c、及miR-328或miR-488。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-216、及選自於由miR-373、miR-16-1/15a簇、及miR-181a所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-373、及選自於由miR-216、miR-9-1、及miR-10b所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-376a、及miR-24-2/27a/23a簇或miR-324。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-451a/451b/144/4732簇、及選自於由let-7a、miR-16-1/15a簇、miR-708、及let-7i所組成群組之微型核糖核酸之任一者。

於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-488、及miR-181a或miR-181c。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-489、及miR-128b或miR-181a。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-9-1、及miR-181a或miR-373。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-16-1/15a簇、miR-181c、及選自於由miR-489、miR-211、let-7e/miR-99b簇、miR-128b、及miR-29a所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-16-1/15a簇、miR-216、及miR-126或miR-15b/miR-16-2簇。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-16-1/15a簇、miR-451/451b/144/4732簇、及選自於由miR-489、miR-15b/miR-16-2簇、及miR-328所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-16-1/15a簇、miR-489、及miR-181c或miR-451/451b/144/4732簇。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181a、miR-216、及選自於由miR-489、miR-15b/miR-16-2簇、及let-7i所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181a、miR-324、及選自於由miR-708、miR-31、及let-7e/miR-99b簇所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181a、miR-376a、及miR-24-2/27a/23a簇或miR-29c。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181a、miR-451a/451b/144/4732簇、及miR-126或mirR-128b。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181a、miR-488、及miR-15b/miR-16-2簇或miR-29a。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181a、miR-489、及miR-15b/miR-16-2簇或miR-216。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-29a、及miR-126、miR-16-1/15a簇或miR-9-1。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-29c、及miR-31或miR-324。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-31、及選自於由miR-328、miR-29c、及miR-99a所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-324、及miR-129-2或miR-29c。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-328、及miR-15b/miR-16-2簇或miR-31。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-376a、及miR-708或miR-212。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-451a/451b/144/4732簇、及選自於由miR-126、miR-196、及miR-9-1所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-488、及miR-15b/miR-16-2簇或miR-132。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-9-1、及選自於由miR-451a/451b/144/4732簇、let-7d、及miR-29a所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-24-2/27a/23a簇、miR-37a、及選自於由miR-328、miR-181a、及miR-15b/miR-16-2簇所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-29a、miR-199b/3154簇、及let-7i或let-7c。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-29a、miR-9-1、及miR-181c或miR-451a/451b/144/4732簇。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-31、miR-376a、及miR-16-1/15a簇或miR-488。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-328、miR-451a/451b/144/4732簇、及let-7e/miR-99b簇或miR-16-1/15a簇。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-373、miR-451a/451b/144/4732簇、及miR-10b或miR-708。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-376a、miR-451a/451b/144/4732簇、及let-7c或miR-9-1。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-451a/451b/144/4732簇、miR-708、及選自於由miR-10b、miR-15b/miR-16-2簇、及miR-373所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-451a/451b/144/4732簇、miR-9-1、及選自於由miR-181c、miR-29a、及miR-376a所組成群組之微型核糖核酸之任一者。於一些具體實施例，三微型核糖核酸之組合包含miR-16-1/15a簇、let-7e/miR-99b簇、及miR-128b。

本發明之態樣係提供一種增進細胞對化學治療劑敏感性之方法，包含以選自於如表3所示之組合的二微型核糖核酸之組合或選自於如表5或表10所示之組合的三微型核糖核酸之組合接觸細胞。於一些具體實施例，該方法進一步包含以化學治療劑接觸細胞。於一些具體實施例，細胞係癌細胞。於一些具體實施例，微型核糖核酸組合係由一或多個重組型表現載體表現。

其他態樣係提供一種用於治療個體癌症之方法，包含投予個體選自於表3所示組合之二微型核糖核酸之組合或選自於表5或表10所示組合之三微型核糖核酸之組合及一有效量之化學治療劑。於一些具體實施例，投予微型核糖核酸組合包含由一或多個重組型核糖核酸表現載體表現微型核糖核酸組合。於一些具體實施例，伴隨微型核糖核酸組合投予之化學治療劑之有效量係小於未伴隨微型核糖核酸組合投予之化學治療劑之有效量。於一些具體實施例，微型核糖核酸組合包含本文提供之微型核糖核酸組合之任一者。

其他態樣係提供一種用於減少細胞增生之方法，包含以選自於如表7或表10所示之組合的三微型核糖核酸之組合接觸細胞。於一些具體實施例，細胞係癌細胞。於一些具體實施例，微型核糖核酸組合係由一或多個重組型表現載體表現。

其他態樣係提供一種用於治療個體癌症之方法，包含投予個體選自於表7或表10所示之組合的三微型核糖核酸之組合。於一些具體實施例，投予微型核糖核酸組合包含由一或多個重組型表現載體表現三微型核糖核酸之組合。於一些具體實施例，微型核糖核酸組合包含本文提供之微型核糖核酸組合之任一者。

又其他態樣係提供一種用於辨別增進細胞對藥劑敏感性之微型核糖核酸組合之方法，包含以複數個由重組型表現載體表現之二或多個微型核糖核酸之組合接觸第一細胞群及第二細胞群；以藥劑接觸第一細胞群，其中第二細胞群未與該藥劑接觸；辨別第一細胞群中二或多個微型核糖核酸之組合及第二細胞群中二或多個微型核糖核酸之組合；比較第一細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度與第二細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度；辨別第一細胞群中二或多個微型核糖核酸之組合之消失或豐度減少，對比第二細胞群中相同之二或多個微型核糖核酸之組合之豐度，以作為增進細胞對藥劑敏感性之微型核糖核酸組合。

於一些具體實施例，增進細胞對該藥劑敏感性之微型核糖核酸組合係相較於減少細胞增生之微型核糖核酸組合，以辨別增進細胞對藥劑敏感性及減少細胞增生之微型核糖核酸組合。

其他態樣係提供一種用於辨別增進細胞對藥劑抗藥性之微型核糖核酸組合的方法，包含以複數個由重組型表現載體表現之二或多個微型核糖核酸之組合接觸第一細胞群及第二細胞群；以藥劑接觸第一細胞群，其中第二細胞群未與該藥劑接觸；辨別第一細胞群中二或多個微型核糖核酸之組合及第二細胞群中二或多個微型核糖核酸之組合；比較第一細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度與第二細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度；辨別第一細胞群中豐度增加之二或多個微型核糖核酸之組合，其係對比第二細胞群中相同之二或多個微型核糖核酸之組合之豐度而言，以作為增進細胞對藥劑抗藥性之微型核糖核酸組合。

於一些具體實施例，試劑係細胞毒性劑。於一些具體實施例，細胞毒性劑係化學治療劑。於一些具體實施例，化學治療劑係抗有絲分裂劑/抗微管劑。於一些具體實施例，化學治療劑係多西他賽。

其他態樣係提供一種用於辨別減少細胞增生之微型核糖核酸組合的方法，包含以複數個由重組型表現載體表現之二或多個微型核糖核酸之組合接觸第一細胞群及第二細胞群；培養第一細胞群及第二細胞群，使得第二細胞群相較於第一細胞群之培養時間更長；辨別第一細胞群中二或多個微型核糖核酸之組合及第二細胞群中二或多個微型核糖核酸之組合；比較第一細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度與第二細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度；辨別第二細胞群中消失或豐度減少之二或多個微型核糖核酸之組合，但於第一細胞群中存在或豐度增加，以作為減少細胞增生之微型核糖核酸組合。

於一些具體實施例，減少細胞增生之微型核糖核酸組合係相較於增進細胞對藥劑敏感性之微型核糖核酸組合，以辨別減少細胞增生及增進細胞對藥劑敏感性之微型核糖核酸組合。

其他態樣係提供一種用於辨別增進細胞增生之微型核糖核酸組合的方法，包含以複數個由重組型表現載體表現之二或多個微型核糖核酸之組合接觸第一細胞群及第二細胞群；培養第一細胞群及第二細胞群，使得第二細胞群相較於第一細胞群之培養時間更長；辨別第一細胞群中二或多個微型核糖核酸之組合及第二細胞群中二或多個微型核糖核酸之組合；比較第一細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度與第二細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度；辨別第二細胞群中存在或豐度增加之二或多個微型核糖核酸之組合，但於第一細胞群中消失或豐度減少，以作為增進細胞增生之微型核糖核酸組合。

於一些具體實施例，微型核糖核酸表現載體係藉病毒輸送至第一細胞群及/或第二細胞群。於一些具體實施例，病毒係慢病毒。

亦提供一種測定微型核糖核酸組合在細胞對藥劑敏感性之協同或拮抗作用及細胞增生之方法，包含：(1) 以複數個由重組型表現載體表現之二或多個微型核糖核酸之組合接觸第一細胞群、第二細胞群、第三細胞群、及第四細胞群；(2) (a) 以藥劑接觸第一細胞群，其中第二細胞群未與該藥劑接觸；(b) 培養第三細胞群及第四細胞群，使得第四細胞群相較於第三細胞群之培養時間更長；(3) 辨別第一細胞群、第二細胞群、第三細胞群、及第四細胞群中二或多個微型核糖核酸之組合；(4) (a) 比較第一細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度與第二細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度；(b) 比較第三細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度與第四細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度；(5) (a) (1) 辨別第一細胞群中消失或豐度減少之二或多個微型核糖核酸之組合，其係對比第二細胞群中相同之二或多個微型核糖核酸之組合之豐度而言，以作為增進細胞對藥劑敏感性之微型核糖核酸組合；以及(2)辨別第一細胞群中豐度增加之二或多個微型核糖核酸之組合，其係對比第二細胞群中相同之二或多個微型核糖核酸之組合之豐度而言，以作為增進細胞對藥劑抗藥性之微型核糖核酸組合；(b)(1)辨別第四細胞群中消失或豐度減少之二或多個微型核糖核酸之組合，但於第三細胞群中存在或豐度增加，以作為減少細胞增生之微型核糖核酸組合；以及(2)辨別第四細胞群中存在或豐度增加之二或多個微型核糖核酸之組合，但於第三細胞群中消失或豐度減少，以作為增進細胞增生之微型核糖核酸組合；(6)計算各微型核糖核酸組合在細胞對藥劑敏感性及細胞增生等作用之基因作用評分；(7)計算各微型核糖核酸組合在細胞對藥劑敏感性及細胞增生等作用之預期表型值；以及(8)比較各微型核糖核酸組合在細胞對藥劑敏感性及細胞增生等作用之基因作用評分與各微型核糖核酸組合在細胞對藥劑敏感性及細胞增生等作用之預期表型值，其中基因作用評分大於預期表型值，表示組合之微型核糖核酸間之協同作用，或其中基因作用評分小於預期表型值，表示組合之微型核糖核酸間之拮抗作用。

於一些具體實施例，預期表型值係根據加法模型或乘法模型計算。

本發明之彼等及其他態樣，以及其各具體實施例，將因參照本發明之圖示及詳盡說明而更加顯見。

本發明之侷限之每一者可涵蓋本發明之各具體實施例。據此，預期本發明中涉及任一元件或元件組合之侷限之每一者皆可包括於本發明之各態樣。本發明並未侷限其應用在所架構之細節及下列闡述或圖示說明所示之元件編排。本發明能有其他具體實施例且能以各方式實施及進行。

靶向多重細胞途徑或多重因子之治療可具協同疾病發展及演變之獨立角色，其經證實相較於常規單一療法為更有效之方法。然而，辨別多重基因標靶之方法可能非常侷限及費力，係因產生高階基因剔除/靜默組合之難度，尤其是在高通量篩選。本發明係基於新穎微型核糖核酸組合之意外發現，其同時具抗癌效果，如增進癌細胞對化學治療劑之敏感性及減少癌症增生。亦提供產生複雜之組合微型核糖核酸表現庫之方法，用於各種高通量篩選方法。

本文所述之方法及組合物提供二或三微型核糖核酸之組合，以增進癌細胞對化學治療劑敏感性(參見表3及7)。本方法及組合物亦提供三微型核糖核酸之組合，以減少癌細胞增生(參見表7)。本文中使用之「微型核糖核酸」及「微型核糖核酸」等詞可互換使用，且係指於RNA干擾(RNAi)時扮演一角色之小型非編碼RNA分子，具體而言為靜默mRNA (「RNA靜默」)及調節基因表現。微型核糖核酸達到RNA靜默或靜默mRNA意指標靶mRNA未轉譯成蛋白質。不希望受限於任何特定理論，現認為以微型核糖核酸進行RNA靜默，可因數個機轉之任一者而發生，如轉譯抑制作用；mRNA切割、不穩定、或衰減；以及標靶mRNA之脫腺苷酸化。相較於不存在微型核糖核酸之蛋白質表現，「靜默」或「RNA靜默」等詞意指標靶mRNA之完全靜默，其導致無可檢測之蛋白質表現，或者部分靜默，其導致蛋白質表現下降。

微型核糖核酸係互補於至少一標靶mRNA或其部分。於一些具體實施例，微型核糖核酸可互補於mRNA 3’UTR之一部分mRNA。於其他具體實施例，微型核糖核酸可互補於一部分之蛋白質mRNA編碼區。於一些具體實施例，微型核糖核酸之長度係介於15-30個核苷酸、18-28個核苷酸、或21-25個核苷酸之間。於一些具體實施例，微型核糖核酸之長度係15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30個核苷酸。

應理解到，若微型核糖核酸能雜合於標靶mRNA且其程度足以靜默mRNA，則稱該微型核糖核酸互補於細胞之標靶mRNA。於一些具體實施例，微型核糖核酸係至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或至少100%互補於標靶mRNA之一部分。於一些具體實施例，微型核糖核酸之一部分，稱作種子區(seed region)，係互補於標靶mRNA。於一些具體實施例，種子區係介於微型核糖核酸之2-7個核苷酸之間。於一些具體實施例，微型核糖核酸之種子區係至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、或至少100%互補於標靶mRNA之一部分。

於一些具體實施例，微型核糖核酸組合係於細胞(如癌細胞)表現，以作為原微型核糖核酸或前mRNA，之後於細胞核加工為前微型核糖核酸。於一些具體實施例，前微型核糖核酸係進一步於細胞質加工以形成微型核糖核酸，其能雜合至其互補標靶mRNA及靜默表現。

本文所述之方法及組合物可用於減少細胞增生，如癌細胞或其他需減少增生之細胞。於一些具體實施例，以三微型核糖核酸之組合接觸細胞可部分或完全降低細胞增生。於一些具體實施例，相較於未以微型核糖核酸組合接觸之細胞，以三微型核糖核酸之組合接觸細胞可部分或完全降低細胞增生。於一些具體實施例，相較於未以微型核糖核酸組合接觸之細胞，以三微型核糖核酸之組合接觸細胞，細胞增生降低至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、或至少65%。可以本領域習知之任何方法評估及量化細胞增生，如使用細胞存活力試驗或BrdU細胞增生試驗。

本文所述微型核糖核酸組合之方法及組合物亦可用於增進細胞(如癌細胞)對化學治療劑敏感性。於一些具體實施例，以二或三微型核糖核酸之組合接觸細胞導致化學治療劑之最小半抑制濃度(IC₅₀ )減少。於一些具體實施例，相較於未以微型核糖核酸組合接觸之化學治療劑處理細胞之IC₅₀ ，以二或三微型核糖核酸之組合接觸細胞導致化學治療劑之IC₅₀ 減少。於一些具體實施例，以微型核糖核酸組合接觸後，化學治療劑之IC₅₀ 減少至少1.1-、1.2-、1.3-、1.4-、1.5-、1.6-、1.7-、1.8-、1.9-、2.0-、2.1-、2.2-、2.3-、2.4-、2.5-、2.6-、2.7-、2.8-、2.9-、3.0-、4.0-、或至少5.0倍。於一些具體實施例，相較於未以微型核糖核酸組合接觸之化學治療劑處理細胞之IC₅₀ ，以微型核糖核酸組合接觸後，化學治療劑之IC₅₀ 減少至少1.1-、1.2-、1.3-、1.4-、1.5-、1.6-、1.7-、1.8-、1.9-、2.0-、2.1-、2.2-、2.3-、2.4-、2.5-、2.6-、2.7-、2.8-、2.9-、3.0-、4.0-、或至少5.0倍。化學治療劑敏感性及IC₅₀ 值之測定方法將顯見於本領域之技術人員。

本發明涵蓋任何細胞類型，其基因表現可以微型核糖核酸降低或靜默。於一些具體實施例，細胞係真核細胞。於一些具體實施例，細胞係哺乳類動物細胞，包括人類細胞(如人類胚胎腎細胞(如HEK293T細胞)、人類皮膚纖維母細胞、MC7細胞、OVCAR8細胞、OVCAR8-ADR細胞、T1074細胞、HOSE 11-12細胞、或HOSE 17-1細胞)或鼠科細胞。於其他具體實施例，細胞係藻類細胞、植物細胞、或昆蟲細胞。於其他具體實施例，細胞係真菌細胞如酵母菌細胞，如酵母菌屬(Saccharomyces spp.)、裂殖酵母菌屬(Schizosaccharomyces spp.)、畢赤酵母菌屬(Pichia spp.)、紅酵母菌屬(Phaffia spp.)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces spp.)、念珠菌屬(Candida spp.)、籃狀菌屬(Talaromyces spp.)、酒香酵母菌屬(Brettanomyces spp.)、嗜酵母菌屬(Pachysolen spp.)、德巴利酵母菌屬(Debaryomyces spp.)、耶氏酵母菌屬(Yarrowia spp.)、及工業用多倍體酵母菌株。較佳之酵母菌株係啤酒酵母(S. cerevisia e)菌株。真菌之其他實例包括麴菌屬(Aspergillus spp.)、青黴菌屬(Penicillium spp.)、梭菌屬(Fusarium spp.)、黑黴菌屬(Rhizopus spp.)、頂孢黴菌屬(Acremonium spp.)、紅黴菌屬(Neurospora spp.)、糞殼菌屬(Sordaria spp.)、子囊菌屬(Magnaporthe spp.)、異水黴屬(Allomyces spp.)、黑穗菌屬(Ustilago spp.)、灰黴菌屬(Botrytis spp.)、及木黴菌屬(Trichoderma spp.)。於一些具體實施例，細胞係多細胞生物體，如植物或哺乳類動物。於一些具體實施例，哺乳類動物係人類。

本發明之態樣係有關增進癌細胞對化學治療劑敏感性或減少癌細胞增生之方法及組合物。癌症為一疾病，其特徵在於不受控制或異常控制之細胞增生及其他惡性細胞性質。本文中使用之「癌症」乙詞意指本領域習知之任何類型癌症，包括但不侷限於，乳癌、膽道癌、膀胱癌、腦癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、血液學腫瘤、T細胞急性淋巴細胞白血病/淋巴瘤、毛細胞白血病、慢性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤、AIDS相關的白血病及成人T細胞白血病/淋巴瘤、上皮內腫瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、神經母細胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、肉瘤、皮膚癌、睾丸癌、甲狀腺癌、及腎癌。癌細胞可為體內(亦即，有機體)、離體(亦即，自有機體移除並於體外維持)、或體外之癌細胞。

本發明之其他態樣係有關治療個體癌症之方法及組合物。於一些具體實施例，個體係具有、懷疑具有、或發展癌症之風險。於一些具體實施例，個體係哺乳類動物個體，包括但不侷限於，狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、雞、鼠科、或靈長類動物。於一些具體實施例，個體係人類個體，如病患。人類個體可為小兒或成人個體。是否個體視為具有癌症「風險」，可由熟習之醫師確定。

本文中使用之「治療」包括改善、治療、預防其惡化、減緩發病速度、或防止再發性失調(亦即，防止復發)。一有效量之組合物意指組合物之量可造成療效。舉例而言，於治療個體癌症之方法中，一有效量之化學治療劑係提供抗癌效果，如降低或預防癌細胞增生或對癌細胞產生細胞毒性，之任何量。化學治療劑之有效量可以最小半抑制濃度(IC₅₀ )表示。於一些具體實施例，相較於投予不存在微型核糖核酸組合之化學治療劑之有效量，當所投予之化學治療劑伴隨本文所述微型核糖核酸組合之任一者時，化學治療劑之有效量降低。於一些具體實施例，當化學治療劑伴隨微型核糖核酸組合投予時，化學治療劑之有效量降低至少1.1-、1.2-、1.3-、1.4-、1.5-、1.6-、1.7-、1.8-、1.9-、2.0-、2.1-、2.2-、2.3-、2.4-、2.5-、2.6-、2.7-、2.8-、2.9-、3.0-、4.0-、5.0-、10.0-、15.0-、20.0-、25.0-、30.0-、35.0-、40.0-、45.0-、50.0-、55.0-、60.0-、65.0-、70.0-、75.0-、80.0-、85.0-、90.0-、95.0-、100-、200-、300-、400-、或至少500倍或以上(如表3所示之二微型核糖核酸之組合或表5所示之三微型核糖核酸之組合)。於一些具體實施例，當所投予之化學治療劑伴隨本文所述微型核糖核酸組合之任一者時，化學治療劑之IC₅₀ 降低至少1.1-、1.2-、1.3-、1.4-、1.5-、1.6-、1.7-、1.8-、1.9-、2.0-、2.1-、2.2-、2.3-、2.4-、2.5-、2.6-、2.7-、2.8-、2.9-、3.0-、4.0-、5.0-、10.0-、15.0-、20.0-、25.0-、30.0-、35.0-、40.0-、45.0-、50.0-、55.0-、60.0-、65.0-、70.0-、75.0-、80.0-、85.0-、90.0-、95.0-、100-、200-、300-、400-、或至少500倍或以上。

本文中使用之「化學治療劑」乙詞意指任何具抗癌效用之藥劑(如殺死或減少癌細胞增生)。化學治療劑可包括烷化劑，如甲基二氯乙胺(mechlorethamine)、氯芥苯丁酸 (chlorambucil)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、黴法蘭(melphalan)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、卡莫司汀(carmustine；BCNU)、洛莫司汀(lomustine)、白消安(busulfan)、達卡巴嗪(dacarbazine；DTIC)、替莫唑胺(temozolomide)、噻替哌(thiotepa)、及六甲蜜胺(altretamine)(六甲基蜜胺(hexamethylmelamine))；抗有絲分裂劑(有絲分裂抑制劑)，如紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽、伊沙匹隆(izabepilone)、長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春瑞濱(vinoreibine)、及雌莫司汀(estramustine)；抗代謝物，如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巰基嘌呤(6-MP)、卡培他濱(capecitabine)、克拉屈濱(cladribine)、氯伐拉濱(clofarabine)、賽德薩(cytarabine)、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲(hydroxyurea)、胺甲喋呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、噴司他丁(pentostatin)、及硫鳥嘌呤(thioguanine)；抗腫瘤抗生素，如蒽環類(anthracyclines)( 道諾黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin))、放線菌黴素D (actinomycin-D)、博萊黴素(bleomycin)、及絲裂黴素C (mitomycin-C)；拓撲異構酶抑制劑，如拓撲異構酶I型抑制劑 (拓撲替康(topotecan)及伊立替康(irinotecan；CPT-11))及拓撲異構酶II型抑制劑(依托泊苷(etoposide；VP-16)、替尼泊苷(teniposide)、及米托蒽醌(mitoxantrone))；以及皮質類固醇，如普賴松(prednisone)、甲基普賴蘇濃(methylprednisolone)、及地塞米松(dexamethasone)。於一些具體實施例，化學治療劑係抗有絲分裂劑。於一些具體實施例，抗有絲分裂劑係多西他賽。

本發明之範疇亦包括微型核糖核酸組合之細胞群篩選方法，當投予細胞時，造成細胞對藥劑之敏感性增加或減少。於一些具體實施例，試劑係化學治療劑。如圖3A所示，該方法涉及接觸二細胞群與微型核糖核酸組合庫(如以CombiGEM方法產生之條碼化微型核糖核酸庫)。細胞群之一者亦接觸藥劑，如細胞毒性劑(如毒物、化學治療劑)。一段時間後，以定序方法進行微型核糖核酸組合之辨別。以亦接觸細胞毒性劑之第一細胞群之各微型核糖核酸組合之豐度相較於未接觸藥劑之細胞群之各微型核糖核酸組合之豐度。增進細胞對藥劑敏感性之微型核糖核酸組合將使曝露於藥劑之細胞群豐度變低或消失。減少細胞對藥劑敏感性之微型核糖核酸組合將使曝露於藥劑之細胞群豐度變高。可比較增進細胞對藥劑(如化學治療劑)敏感性之微型核糖核酸組合與減少細胞增生之微型核糖核酸組合，以辨別增進細胞對藥劑敏感性及減少細胞增生之微型核糖核酸組合。

本發明提供其他微型核糖核酸組合之細胞群之篩選方法，當投予細胞群時，造成增進或降低細胞增生。如圖4A所示，該方法涉及以微型核糖核酸組合庫(如條碼化微型核糖核酸庫)接觸二細胞群。該二細胞群係培養不同之時間。舉例而言，一細胞群可培養一天且其他細胞群係培養四天。以定序方法進行各細胞群之微型核糖核酸組合之辨別。以較長時間之細胞群之各微型核糖核酸組合之豐度相較於較短時間之細胞群之各微型核糖核酸組合之豐度。可增進細胞增生之微型核糖核酸組合將使培養較長時間之細胞群豐度變高。減少細胞增生之微型核糖核酸組合將使培養較長時間之細胞群豐度變低。可比較減少細胞增生之微型核糖核酸組合與增進細胞對藥劑(如化學治療劑)敏感性之微型核糖核酸組合，以辨別減少細胞增生及增進細胞對藥劑敏感性之微型核糖核酸組合。

本文所述之微型核糖核酸組合可以本領域習知之任何形式投予個體或輸送至或接觸細胞。於一些具體實施例，微型核糖核酸組合係串接之微型核糖核酸。於一些具體實施例，串接之微型核糖核酸亦含有一或多個連接子及/或間隔子序列。於其他具體實施例，微型核糖核酸組合係接合至一或多個奈米顆粒、細胞滲透性胜肽、及/或聚合物。於其他具體實施例，微型核糖核酸組合係含於微脂體內。

本文所述之微型核糖核酸組合可以本領域習知之任何形式投予個體或輸送至或接觸細胞。於一些具體實施例，微型核糖核酸組合係以奈米顆粒、細胞滲透性胜肽、聚合物、微脂體、或重組型表現載體輸送至細胞。

於一些具體實施例，一或多個編碼本發明相關聯之微型核糖核酸基因係以重組型表現載體表現。本文中使用之「載體」可為一些核酸之任一者，其中所需序列或序列等可藉限制酶切割與連接(如利用CombiGEM方法)插入或藉重組而於不同基因環境間運輸或於宿主細胞(如癌細胞)內表現。載體典型上由DNA組成，亦可使用RNA載體。載體包括但不侷限於：質體、黏粒體(fosmids)、嗜粒體(plagemids)、病毒基因組、及人工染色體。於一些具體實施例，載體係慢病毒載體。於一些具體實施例，編碼二或三微型核糖核酸之組合之基因之每一者係以相同重組型表現載體表現。於一些具體實施例，編碼二或三微型核糖核酸之組合之基因係以二重組型表現載體表現。於一些具體實施例，編碼三微型核糖核酸之組合之基因係以三重組型表現載體表現。

重組型表現載體為所需之DNA序列藉限制酶切割與連接或重組而插入者，使其操作上連接至調節序列且可表現為RNA轉錄本。載體可進一步含有一或多個適合作為辨別細胞載體是否轉形或轉染之標記序列。標記基因包括如編碼可增加或減少對抗生素或其他化合物之抗藥性或敏感性之蛋白基因、編碼可以本領域習知之標準試驗(如半乳糖苷酶、螢光、螢光素酶、或鹼性磷酸酶)檢測活性之酵素基因、及明顯影響轉形或轉染細胞、宿主、殖株、或溶菌斑表型之基因(如綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白)。較佳之載體係彼等能自主複製及表現存在於DNA片段且可操作地相連接之結構基因產物。

本文中使用之編碼序列及調節序列意指當共價連接時能「可操作地」連接，如此在調節序列影響或控制下進行編碼序列之表現或轉錄。當編碼序列需轉譯成功能蛋白時，若誘發5’調節序列之啟動子造成編碼序列之轉錄且二DNA序列間連接之本質不會(1)造成導入框移突變(frame-shift mutation)、(2)干擾啟動子區能力以導引編碼序列之轉錄、或(3)干擾相應之RNA轉錄本能力以轉譯成蛋白質，則二DNA序列稱作可操作地連接。因此，若啟動子區能進行編碼序列之轉錄，則稱啟動子區可操作地連接該DNA序列，使所得之轉錄本能轉譯成所需之蛋白質或多胜肽。

當細胞表現核酸分子時，可使用各種轉錄控制序列(如啟動子/增進子序列)以導引其表現。啟動子可為原始啟動子，亦即，基因啟動子係其內源性樣貌，其提供正常調控基因表現。於一些具體實施例，啟動子可為固有組成，亦即，啟動子未經調節，容許持續轉錄其相關聯基因。亦可使用多種條件型啟動子，如存在或不存在控制啟動子之分子。於一些具體實施例，啟動子係人類細胞巨大性病毒啟動子(CMVp)。

基因表現所需調節序列之準確性質於物種或細胞類型間可有所不同，但一般而言應包括，視需求，5’非轉錄及5’非轉譯序列，其分別涉及啟動轉錄及轉譯，如TATA匣、加帽(capping)序列、CAAT序列、及其類似物。具體而言，此類5’非轉錄調節序列將包括一啟動子區，其包括一啟動子序列，以轉錄控制可操作連接基因。調節序列亦可包括所需之增進子序列或上游活化子5序列。本發明之載體可可視需要地包括5'引導子或訊息序列。適當載體之選擇及設計係落於本領域普通技術人員之能力及判斷範圍內。

含所有表現所需元件之重組型表現載體係商業上可購且本領域技術人員熟習。參見，如Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012。細胞係藉導入細胞異源性DNA (RNA)而進行基因工程。該異源性DNA (RNA)係於轉錄元件操控下置放，以容許異源性DNA於宿主細胞中表現。本發明相關聯之核酸分子可利用本領域之標準方法及技術導入細胞或細胞等。舉例而言，核酸分子可藉標準步驟導入，如轉形，包括化學轉形及電穿孔、病毒轉導、粒子轟擊(particle bombardment)等。於一些具體實施例，重組型表現載體係藉病毒轉導而導入。於一些具體實施例，病毒轉導係以慢病毒達成。表現核酸分子亦可藉將核酸分子整合至基因體而達成。

本文亦揭示測定協同或拮抗作用之方法，其係藉計算各微型核糖核酸組合之基因作用評分(參見實施例及圖5D-5F、15、及16)。亦可計算各微型核糖核酸組合之預期表型值，例如，使用加法模型或乘法模型。可比較微型核糖核酸組合基因作用評分與微型核糖核酸組合預期表型值。基因作用評分大於預期表型值代表組合之微型核糖核酸間之協同作用。基因作用評分低於預期表型值代表組合之微型核糖核酸間之拮抗作用。計算基因作用評分之方法係本領域技術人員熟習(參見，如Bassik et al.Cell (2013) 152(4): 909-22及Kampmann et alPNAS (2013) 110(25) E2317-26)。

實施例

人類細胞大規模並行高階組合遺傳學

人類系統集體組合遺傳學 (CombiGEM)

欲探求高通量篩選所產生高階組合庫之常規方法的限制，發展出一技術，以可擴展方式匯集組合人類細胞條碼化高階組合基因庫。此方法稱作集體組合遺傳學(CombiGEM)，使能以次世代定序法高通量追蹤條碼化組合群(圖1)。CombiGEM使用疊代選殖策略，其始於條碼化DNA元件之插入子庫。匯集之插入子庫之限制酶切割及目的載體，之後一鍋化連接反應，產生一基因組合庫。可組合新產生之組合庫及相同之插入子庫，以產生各組合獨特之串接條碼之高階組合，因此能以高通量定序法追蹤。

將最終條碼化組合基因庫編碼於慢病毒，使能有效輸送及穩定基因體整合大範圍之人類細胞類型。慢病毒載體廣泛用於大規模基因篩選之輸送匯集庫(Johannessen et al.Nature (2013) 504, 138-142；Koike-Yusa et al.Nat. Biotecnol . (2014) 32,267-273；Shalem et al.Science (2014) 343, 84-87；Wang et al.Science (2014) 343, 80-84；Bassik et al.Cell (2013) 152, 909-922)。於輸送組合庫至人類細胞後，進行匯集試驗且萃取基因體DNA，以進行組合條碼之不偏擴增。以Illumina HiSeq定序量化相連DNA條碼序列之豐度，其代表匯集群內之各基因組合，並辨別偏移，代表於不同實驗條件下之各組合。應用CombiGEM策略，以辨別感應癌細胞對藥物及/或抑制癌細胞增生之基因組合(本研究為微型核糖核酸)，其最終目標為驗證抗癌治療之新穎及有望之組合效應子。

組合式微型核糖核酸表現系統

先前結果顯示，可藉串接排列前驅物序列以表現多重微型核糖核酸(Yoo et al.Nature (2011) 476, 228-231)。確認慢病毒載體是否表現功能性微型核糖核酸組合組。產生編碼微型核糖核酸前驅物之慢病毒載體，其下游選殖一綠色螢光蛋白(GFP)基因，以監測由細胞巨大性病毒(CMVp)啟動子調控之表現(圖7A)。此外，微型核糖核酸感應子序列，係由其同源微型核糖核酸所標靶(Brown et al.Nat. Rev. Genet. (2009) 10, 578-585)，其係加至紅色螢光蛋白(RFP)基因之3’未轉譯區，其係由泛蛋白C (UBCp)啟動子驅動，以報導微型核糖核酸活性(圖7A)。將微型核糖核酸表現及感應子基因匣放入單一載體，以確保感染細胞二組分間之比率不變。本研究確認了有效輸送慢病毒載體至人類胚胎腎細胞(HEK293T；圖8)及人類皮膚纖維母細胞(未顯示數據)。

可以預見，活性微型核糖核酸可靶向其感應子序列，因此減少RFP螢光程度。流動式細胞測量術分析顯示，表現微型核糖核酸但無感應子之細胞產生GFP及RFP，而彼等表現微型核糖核酸且含同源感應子之細胞喪失RFP螢光，代表受微型核糖核酸抑制(圖7B)。此外，不同之逐二及逐三微型核糖核酸之組合呈現抑制活性(圖7C)，可比擬其個別之逐一單獨微型核糖核酸構築體(圖7B)。此效應未源自微型核糖核酸與非同源感應子間之交叉反應性(圖7D)。彼等結果證實慢病毒載體編碼人類細胞組合微型核糖核酸表現之能力。

產生高覆蓋組合微型核糖核酸庫

鑒於慢病毒組合微型核糖核酸表現系統達成之高效率基因抑制，建構高覆蓋條碼化組合微型核糖核酸庫。彼等研究之目的係系統性評估微型核糖核酸過度表現對抗癌表型之組合效用，係因合理化組合治療可增進治療功效(Al-Lazikani et al.Nat. Biotechnol . (2012) 30, 679-692)，且微型核糖核酸為主之療法於許多動物模式及前臨床與臨床發展中顯示效用(Li et al.Nat. Rev. Drug Discov . (2014) 13, 622-638)。欲建立核酸庫，選擇39個微型核糖核酸，其先前報導於抗藥性癌細胞或呈現改變表現之卵巢癌細胞中向下調節(表1及2)。彼等39個微型核糖核酸於人類卵巢癌(OVCAR8)細胞及其抗藥性衍生株OVCAR8-ADR細胞(Patnaik et al.PLoS One (2012) 7)之表現係顯示於先前之微型核糖核酸分析研究(Creighton et al.Breast Cancer Res. (2010) 12, R40；Gholami et al.Cell Rep. (2008) 4, 609-620；Hsu et al.Nucleic Acid Res. (2014) 42, D78-85)。利用ProteomicsDB (Honma et al.Nat. Med. (2008) 14, 939-948)，發現至少~60% (4532中的2716)之彼等39個微型核糖核酸之實驗驗證標的，其係擷取自miRTarBase (Strezoska et al.PLoS One (2012) 7, e42341)，並表現於OVCAR8-ADR細胞。含39個微型核糖核酸前驅物序列之條碼庫係首先選殖至保存載體。利用CombiGEM，以二連續步驟產生逐二(39 x 39個微型核糖核酸 = 1,521個總組合)及逐三(39 x 39 x 39個微型核糖核酸 = 59,319個總組合)匯集微型核糖核酸庫(圖1)。

特別的是，條碼化微型核糖核酸庫係首先選殖至保存載體，其中BamHI與EcoRI位點介於微型核糖核酸序列與條碼序列之間，且BglII與MfeI位點位於終端(圖1)。欲構築逐一庫，以BglII與MfeI切割匯集之保存載體，產生匯集插入子。以BamHI與EcoRI切割慢病毒目標載體。插入子及慢病毒載體之切割位點具有相容之黏端(亦即，BamHI + BglII & EcoRI + MfeI)並於單一鍋反應中連接，以產生匯集之逐一庫。載體庫隨後再以匯集形式切割，該切割位點BamHI與EcoRI位於微型核糖核酸與其條碼之間，且之後以相同匯集插入子連接，以產生逐二及逐三庫。此過程可疊代重複，以產生愈來愈複雜之庫，其中所有相關條碼位於一端。

隨後產生慢病毒匯集，以輸送組合庫至人類細胞。欲促進單一拷貝慢病毒整入多數感染細胞，慢病毒係滴定至感染重複數(MOI)約0.3至0.5。欲確保高品質篩選含顯著代表多數組合之高覆蓋庫(Bhattacharya et al.Cancer Res. (2009) 69, 9090-9095)，使用比待測組合庫大小高~300倍之細胞進行慢病毒感染。因此，應減少任何給定之隨機整合子(random integrant)造成之任何假性表型，係以群體進行平均。

分離匯集群基因體DNA，並以聚合酶鏈反應(PCR)進行條碼擴增。優化PCR條件以達到不偏擴增，以確保準確量化條碼(圖9)。隨後以Illumina HiSeq定序法量化保存於大腸桿菌質體池及感染之人類細胞池之個別條碼組合代表物(圖2A及2B)。藉由各樣本~5-10百萬讀數，達到質體池與感染細胞池內逐二庫之全覆蓋(圖2A)。十個由miR-16-1/15a簇配對10個不同微型核糖核酸所組成之逐二組合發現，相對於質體池，於感染細胞之代表性不足(於圖2C中以淺灰色凸顯)。此觀察結果可能與報導一致，其指出miR-16-1或miR-15a過度表現可抑制卵巢癌細胞殖株生長及增生(Cheng et al.Proc. Natl. Acad. Sci. (2014) 111, 12462-12467)。

此外，以各樣本~30百萬讀數，達到質體池與感染細胞池內逐三庫之高覆蓋率(分別為~89%及~87%)(圖2B)。先前證實，藉由擴大庫轉形及增加各樣本定序讀值數，可達到更大之庫覆蓋率(Xia et al.Int. J. Cancer (2008) 123, 372-379)。該些努力可有助於增加質體庫中遺失之逐三組合之覆蓋率(總預期組合之~11%)。一小組(~2%)逐三組合經檢測存在於質體庫，但不存在於感染細胞池。彼等組合可能丟失，係因於質體庫之低代表性或對細胞存活/增生之抑制效用。此外，代表質體與感染細胞池之條碼間觀察到高度相關(圖2C及2D)，且感染細胞池內之生物重複間之條碼代表物觀察到高再現性(圖2E and 2F)。因此，可使用CombiGEM以有效組裝及輸送高階組合基因庫至人類細胞。

高通量逐二組合篩選

欲辨別改良化療藥物敏感性之組合微型核糖核酸，以逐二條碼化組合微型核糖核酸庫感染OVCAR8-ADR細胞(圖3A)。半數匯集群係處理化學治療劑藥物多西他賽，而其餘半數暴露於載具對照組。於四天後，由兩細胞群分離基因體DNA以進行不偏擴增且量化組合條碼。比較藥物處理組與對照組間之條碼豐度(標準化之每百萬讀數)，產生log₂ 值(條碼計數比率)，其用於量測藥物敏感性。具有賦予增進之抗藥性或敏感性之微型核糖核酸組合之細胞，預期分別具有正或負log₂ 比率。此篩選係二重複進行，且生物重複間觀察到條碼代表物高再現性(皮爾森相關係數大於0.95)(圖10A)。欲減少變異，將對照組內低於~100絕對讀數之組合濾除，並將各微型核糖核酸對之二潛在排列之log₂ 比率平均(亦即，針對逐二微型核糖核酸之組合：miR-A + miR-B及miR-B + miR-A)(圖11)。微型核糖核酸組合隨即根據其二生物重複平均log₂ 比率排序(圖3B及圖12)。將24個逐二微型核糖核酸之組合定義為藥物敏化劑命中(log₂ 比率＜ -0.42；亦即，相較於對照組，於多西他賽處理細胞，＞25%有較少條碼計數)(表3)，而36個組合視為增進多西他賽抗藥性命中(log₂ 比率大於0.32；亦即，相較於對照組，於多西他賽處理細胞，＞25%有較多條碼計數)(表4)。

以個別藥物敏感性試驗確認由彼等命中選出之微型核糖核酸對之藥敏性或抗藥性增進效用。進一步顯示，微型核糖核酸組合可增進其個別組分之藥物敏感性。先前工作顯示，miR-16/15 前驅物家族之表現可使抗藥性胃癌細胞對化學治療劑致敏(Kastl et al.Breast Cancer Res. Treat. (2012) 131, 445-454)。根據此發現，觀察到miR-16-1/15a 簇之表現可增加OVCAR8-ADR細胞之多西他賽敏感性，其中相較於載體對照組，當共同施加多西他賽時，導致細胞存活力減少~10-20% (圖3C)。有趣的是，當結合miR-93/106b 簇或miR-376a 表現時，miR-16-1/15a 簇之藥物敏感性效用大約增倍。miR-93/106 b簇或miR-376a 本身僅輕微改變多西他賽敏感性，其中當共同處理多西他賽時，造成細胞存活力之下降小於~5-10% (圖3C)。當以miR-16-1/15a 簇結合miR-93/106b 簇或miR-376a 時，多西他賽之半最大抑制濃度(IC₅₀ )降至~2倍(圖3D)，導致幾乎可比擬以相同藥物劑量處理可殺死之親代OVCAR8細胞(圖13)。彼等結果證實CombiGEM辨別有效組合微型核糖核酸之能力，使抗藥性癌細胞對化療致敏。

亦評估微型核糖核酸組合增進OVCAR8-ADR細胞之多西他賽抗藥性。已經證實，miR-34a 之過度表現賦予乳癌細胞多西他賽抗藥性(Krek et al.Nat. Genet. (2005) 37, 495-500)。與此觀察一致的是，miR-34a 常代表增加OVCAR-ADR細胞之多西他賽抗藥性之組合(36個組合中的23個)(表4)。經確認，以miR-34a 結合miR-199b/3154 簇、miR-328 、或miR-429 所表現之細胞對25 nM之多西他賽處理產生明顯抗藥性，導致於藥物存在下，相較於載體對照組時，增加細胞存活力達~1.6至1.9倍(圖3E)。抗藥性增加起因於miR-34a 與彼等三額外微型核糖核酸之每一者間之交互作用，係因miR-34a 表現僅輕微增進多西他賽抗藥性達~1.3倍，而表現miR-199b/3154 簇、miR-328 、或miR-429 本身未明顯影響多西他賽敏感性(圖3E)。彼等結果因此支持了miR-34a 過度表現增加OVCAR8-ADR細胞多西他賽抗藥性之中樞角色，並證實miR-34a 可配合其他微型核糖核酸，以調節重要細胞表型。總之，於此建立及驗證一實驗途徑，以系統性篩選調控生物表型之條碼化逐二微型核糖核酸之組合。

大規模並行之逐三組合篩選

進行高階組合庫之高通量基因篩選，以證實CombiGEM方法之可調能力(scalability) (圖4A)。OVCAR-ADR細胞係以逐三條碼化組合微型核糖核酸庫感染。利用實施例2所述之逐二篩選之相同實驗程序，進行大規模並行之匯集篩選，以分離調控多西他賽敏感性之逐三微型核糖核酸之組合。將感染之細胞池分成兩半，並以多西他賽或載具對照組處理四天。組合條碼隨後以PCR擴增及定量。兩實驗條件之二生物重複間觀察到高度再現之條碼代表物(皮爾森相關係數大於0.97)(圖10B)。欲測定藥物敏感性，測定處理組與對照組之標準化條碼讀值間之log₂ 比率(圖11及12)。以微型核糖核酸組合之二重複平均log₂ 比率排序(圖4B)。有91個及36個逐三微型核糖核酸之組合經辨別分別為多西他賽處理之藥敏性(表5)及抗藥性增進(表6)命中(log2比率小於-0.42或大於0.32)。以個別藥物敏感性試驗確認所選逐三微型核糖核酸之組合之效用(圖4C)。舉例而言，相較於未處理之細胞，同時表現miR-16-1/15a 簇、miR-181c 、及let-7e/miR-99b 簇導致多西他賽之IC50減少~2倍。

利用相同逐三組合微型核糖核酸庫及實驗途徑，可系統性評估組合微型核糖核酸對癌細胞增生之效用(圖4A)。將感染逐三組合微型核糖核酸庫之OVCAR8-ADR細胞培養一或四天，並量化各整合條碼，以取得其第一天與第四天豐度間之log₂ 比率。賦予生長優勢之微型核糖核酸組合預期具有正log₂ 比率，而抑制細胞增生之微型核糖核酸組合則預期產生負log₂ 比率。將各微型核糖核酸組合之二生物重複之log₂ 比率平均(圖11及12)且排序(圖4D)。有27個微型核糖核酸組合顯示發揮相當之抗增生作用(log2比率小於-0.42)(表7)。驗證彼等逐三微型核糖核酸命中，係藉由證實各組合於個別細胞增生試驗中抑制OVCAR8-ADR細胞生長之能力(圖4E)。舉例而言，逐三表現miR-16-1/15a 簇、miR-128b 、及let-7e/miR-99b 簇導致大量減少細胞生長(亦即，第7天存活細胞數之減少＞55%)。總體而言，彼等結果證實， CombiGEM能辨別達到藥物敏感性及抗增生作用之高階微型核糖核酸組合。

微型核糖核酸交互作用控制抗癌表型

結合藥物敏感性及抑制細胞增生之高通量篩選數據，微型核糖核酸組合根據其調控抗藥性及癌細胞生長之能力進行剖析(圖14)。以所篩選之log₂ 比率作為藥物敏感性及增生之指標，建構二維熱圖(圖5A)及三維圖(圖5B、5C、及14)，分別代表逐二及逐三微型核糖核酸之組合賦予之多西他賽敏感性及細胞增生表型。進行分級簇集，將同時具有類似藥物敏感性輪廓之微型核糖核酸組合分類，以增進能見度。

彼等繪圖顯示先前未確定角色之見解，即組合微型核糖核酸扮演調控抗藥性及細胞生長表型之角色。舉例而言，多數含有miR-34a 之逐二及逐三組合賦予細胞多西他賽抗藥性及抗增生作用(圖5A-C)。此外，許多編碼微型核糖核酸之組合，如miR-16-1/15a 簇或miR-15b/16-2 簇，可使細胞對多西他賽敏感(圖5A及5B)，而對增生發揮不同效用(圖5C)。

以前述評分系統確定各逐二及逐三組合之基因作用(GI)評分(Bassik et al.Cell (2013) 152, 909-922)。一般而言，經由個別表型之加成效用，展現比預期更強表型之組合係定義為協同，而根據加法模型，比預期表型更弱之組合則定義為緩衝(參見材料及方法， 及圖15)。建構涵蓋所有逐二微型核糖核酸交互作用GI評分之GI圖(圖5A)，其顯示吾等經驗證之逐二微型核糖核酸之組合，根據其GI評分具協同性。舉例而言，觀察到miR-199b/3154簇 對miR-34a 之協同性表型改良效用，以增進抗藥性(圖5D)。此外，檢測到miR-93/106b 簇對miR-16-1/15a 簇之協同效用，以增加藥物敏感性(圖5D)。進一步計算逐三微型核糖核酸之組合之GI評分，發現加入第三微型核糖核酸元件可與逐二微型核糖核酸之組合交互作用，以改良生物表型(圖5E、5F、及16)。

同時具藥物敏感性及抗增生表型之微型核糖核酸組合

結合藥物敏感性及抑制細胞增生之高通量篩選數據，微型核糖核酸組合根據其同時調控抗藥性及癌細胞生長之能力進行剖析(圖17)。於個別之藥物敏感性及細胞增生試驗中，比較逐三微型核糖核酸之組合與其各自單一及逐二組合之藥物敏感性及抗增生效用(圖6A-6J)。發現到，當共同投予藥物時，表現單獨之miR-16-1/15a 簇或結合let-7e/miR-99b 簇可造成細胞對多西他賽輕微敏感性且減少細胞存活力達＜10% (圖6A-6C)。共表現miR-16-1/15a 簇、let-7e/miR-99b 簇、及miR-15b/16-2 之細胞多西他賽敏感性增加~2倍(圖6C)。不存在miR-16-1/15a 前驅物家族時，微型核糖核酸如let-7e/miR-99b 簇、miR-128b 、 mir-181c 、及miR-132 本身及許多其個別配對之組合未呈現多西他賽敏感性表型(圖6A-6F)。彼等結果因此證實，miR-16/15 前驅物家族於微型核糖核酸組合促進多西他賽敏感性上扮演關鍵角色，且其敏感性能力可藉由共同表現特定微型核糖核酸夥伴而調控。

結果亦確定調節癌細胞生長之交互作用微型核糖核酸。發現到，miR-181c 表現抑制癌細胞生長~30%，且當以miR-181c 結合let-7e/miR-99b 簇(圖6B)、let-7i 、或miR-373 (圖6H)表現時，此抗增生效用可增效至~50-60%，即使彼等微型核糖核酸本身未抑制細胞增生。此外，相較於其個別及配對表現，逐三表現miR-16-1/15a 簇、let-7e/miR-99b 簇、及miR-128b 造成抗增生作用增加＞2.5倍(圖6A)。表10顯示額外之逐三微型核糖核酸之組合，根據匯集篩選，其於OVCAR8-ADR細胞可同時抑制細胞增生及增加多西他賽敏感性。

經由彼等分析，確定及驗證可同時調控藥物敏感性及細胞生長表型之微型核糖核酸組合。彼等微型核糖核酸組合可作為新穎抗癌治療劑候選。舉例而言，相較於載體對照組，miR-16-1/15a簇、let-7e/miR-99b簇、及miR-128b整合之多西他賽敏感性及抗增生功能(圖6A)同時導致明顯增進多西他賽殺死抗藥性OVCAR8-ADR細胞且造成存活細胞減少＞90% (圖6I)。此逐三組合大大地降低經處理之OVCAR8-ADR細胞於藥物處理後形成存活殖株之能力達~99.5% (圖6J及18)，因此凸顯了以組合微型核糖核酸作為新形式有效治療劑之潛力。

方法

構築組合微型核糖核酸表現及感應子載體

所使用之載體(表8)係以標準分子選殖技術構築，包括PCR、限制酶切割、連接、及吉布森組裝(Gibson assembly)。慣用之寡核苷酸及基因片段係購自Integrated DNA Technologies及GenScript。將載體構築體轉形至大腸桿菌株DH5α，並以50 μg/ml之卡本西林(carbenicillin)(Teknova)分離含構築體之殖株。以Qiagen Plasmid Mini或Midi Kit (Qiagen)萃取及純化DNA。以Genewiz’s DNA定序服務驗證載體構築體序列。

欲創建表現雙螢光蛋白報導子之慢病毒載體(pAWp7；pFUGW-UBCp-RFP-CMVp-GFP)，以Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)藉由PCR擴增turboRFP (Addgene #31779)(Yoo et al.Nature (2011) 476, 228-231)及CMV啟動子序列，並利用Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs)選殖至pAWp6載體骨幹(pFUGW-UBCp-GFP)。欲表現微型核糖核酸，以PCR擴增miR-124 (Addgene #31779) (Yoo et al.Nature (2011) 476, 228-231)、miR-128 (Bruno et al.Mol. Cell (2011) 42, 500-510)、及miR-132 (Klein et al.Nat. Neurosci. (2007) 10, 1513-1514)之微型核糖核酸前驅物序列，並利用吉布森組裝選殖至pAWp7載體之GFP下游序列。於PCR期間，將四個限制酶切割位點(BglII、BamHI、EcoRI、及MfeI)加至微型核糖核酸前驅物序列側邊，導致BglII-BamHI-EcoRI-微型核糖核酸前驅物-MfeI構型，其有助於選殖額外之微型核糖核酸前驅物以產生組合微型核糖核酸表現匣。欲構築逐二微型核糖核酸前驅物表現匣，以BamHI及EcoRI (Thermo Scientific)切割單微型核糖核酸前驅物表現載體，並以T4 DNA連接酶(New England Biolabs)連接相容之微型核糖核酸前驅物插入子黏端，其係製自各自PCR產物之BglII及MfeI切割(Thermo Scientific)。同樣地，藉由連接BglII及MfeI切割之逐二微型核糖核酸前驅物表現載體與BamHI及EcoRI切割之微型核糖核酸前驅物插入子，建立逐三微型核糖核酸前驅物表現匣。欲報導微型核糖核酸活性，以PCR自合成之基因片段擴增成熟微型核糖核酸之含四串接重複序列之反向互補序列微型核糖核酸感應子，並利用吉布森組裝經由SbfI切割位點插入pAWp7之RFP之3’ UTR或組合微型核糖核酸前驅物表現載體。

創建條碼化單微型核糖核酸前驅物庫

利用Phusion (New England Biolabs)或Kapa HiFi (Kapa Biosystems) DNA聚合酶及表1所列引子，以PCR自人類基因體DNA (Promega)擴增前述39個微型核糖核酸前驅物序列(其中長度係~261-641個鹼基對)之每一者(Voorhoeve et al.Cell (2007) 131, 102-114)by PCR。於PCR期間，加入各微型核糖核酸前驅物獨特之八鹼基對條碼。條碼序列之彼此差異至少二鹼基。此外，將限制酶位點BglII及MfeI加至終端側邊，並將切割位點BamHI及EcoRI導入微型核糖核酸前驅物語條碼序列之間。於此各PCR產物從而配置成BglII-微型核糖核酸前驅物-BamHI-EcoRI-條碼-MfeI。各條碼化微型核糖核酸前驅物之PCR產物隨即以BglII及MfeI位點連接至pBT264保存載體(Addgene #27428) 57。

匯集之組合微型核糖核酸庫組合以進行高通量篩選

以等莫耳比率混合含39個條碼化微型核糖核酸前驅物之保存載體。匯集之保存載體以BglII與MfeI單鍋酶切割產生匯集插入子。目標慢病毒載體(pAWp11；改良自pAWp7載體)係以BamHI與EcoRI切割。切割之插入子及載體經由其相容之黏端連接(亦即，BamHI + BglII & EcoRI + MfeI)，並以慢病毒載體創建匯集之逐一微型核糖核酸前驅物庫。再次以BamHI與EcoRI切割逐一微型核糖核酸前驅物載體庫，並以相同之39個微型核糖核酸前驅物插入子庫連接，以組裝逐二微型核糖核酸前驅物庫(39 x 39個微型核糖核酸 = 1,521總組合數)。以BamHI與EcoRI切割之逐二微型核糖核酸前驅物載體庫與相同之匯集插入子連接，以產生逐三微型核糖核酸前驅物庫(39 x 39 x 39個微型核糖核酸 = 59,319總組合數)。於各匯集之組裝步驟之後，將微型核糖核酸前驅物置於載體構築體之一端且其相應之條碼則串接於其他端。

產生組合微型核糖核酸載體以進行個別驗證試驗

以相同策略構築含單一、逐二、或逐三微型核糖核酸前驅物之慢病毒載體，產生前述組合微型核糖核酸庫，除了以個別之插入子及載體而非匯集者所進行之組裝以外。

人類細胞培養

HEK293T及MCF7細胞係取自ATCC。T1074細胞係取自Applied Biological Materials。HOSE 11-12及HOSE 17-1細胞係取自G. S. W. Tsao (香港大學，香港)。OVCAR8及OVCAR8-ADR細胞係如先前之描述(Gaj et al.Trends Biotechnol . (2013) 31, 397-405；Patnaik et al.PLoS One (2007) 7)。OVCAR8-ADR細胞之辨別係以細胞株認證測試確認(Genetica DNA Laboratories)。HEK293T細胞培養於37ºC下5% CO₂ 之DMEM，其中補充10%熱失活胎牛血清及1X抗生素-抗真菌劑(Life Technologies)。MCF7、T1074、HOSE 11-12、HOSE 17-1、OVCAR8、及OVCAR8-ADR細胞培養於37ºC下5% CO₂ 之RPMI，其中補充10%熱失活胎牛血清及1X抗生素-抗真菌劑(Life Technologies)。針對藥物敏感性試驗，於指定時間將指定劑量之多西他賽(LC Laboratories)或載具對照組加入細胞培養物。

慢病毒產生及轉導

慢病毒係於6孔培養盤產生，其中每孔250,000個HEK293T細胞。細胞係以FuGENE HD轉染試劑(Promega)轉染，其中將0.5 μg之慢病毒載體、1 μg之pCMV-dR8.2-dvpr載體、及0.5 μg之pCMV-VSV-G載體混合於100 μl之OptiMEM培養基(Life Technologies)中10分鐘。於轉染一天後，培養基以新鮮培養基替換。隨後，於感染後48至96小時之間，每隔24小時收集病毒上清液、匯集於一處、及過濾通過0.45 μm聚醚碸膜(Pall)。在以個別之載體構築體轉染方面，於8 μg/ml聚凝胺(polybrene)(Sigma)存在下，以500 μl之經過濾病毒上清液感染250,000個細胞隔夜。在以匯集庫轉導方面，以相同實驗條件放大慢病毒產量。以Amicon Ultra Centrifugal Filter Unit (Millipore)將經過濾之病毒上清液濃縮50倍，用以感染含~300倍以上細胞而非待測庫大小之起始細胞群。於8 μg/ml聚凝胺存在下，使用MOIs 0.3至0.5，得感染效率約30至40%。於感染一天後，以新鮮培養基清洗細胞，並於實驗前培養三天以上。

樣本製備以進行條碼定序

在組合微型核糖核酸載體庫方面，以Qiagen Plasmid Mini kit (Qiagen)萃取以載體庫轉形之大腸桿菌質體DNA。在以組合微型核糖核酸庫感染之人類細胞池方面，以DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)萃取各實驗條件所收集細胞之基因體DNA。以Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Life Technologies)測定DNA濃度。

以Kapa HiFi Hotstart Ready-mix (Kapa Biosystems)進行含代表匯集載體及感染細胞庫內各組合之獨特CombiGEM條碼之359個鹼基對片段之PCR擴增。於PCR期間，各樣本具有Illumina錨序列及8個鹼基對索引條碼，以進行加諸之多工定序。所使用之正向及反向引子為5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGATCCGCAACGGAATTC-3’(SEQ ID NO:1)及5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGGTTGCGTCAGCAAACACAG-3’ (SEQ ID NO:2)，其中NNNNNNNN代表各實驗樣本指定之特定索引條碼。

於12.5 μl之PCR反應中，加入0.5 ng之質體DNA作為模板，而每50-μl PCR反應使用800 ng之基因體DNA。針對分別以逐二及逐三微型核糖核酸庫感染之人類細胞池，進行8及80個PCR反應，達到各組合至少50倍代表物。欲防止PCR偏誤使族群分佈偏斜，優化PCR條件以確保指數期期間發生擴增。PCR產物於1.5%瓊脂糖凝膠上運行，並以QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)分離359個鹼基對片段。以定量PCR決定PCR產物濃度，其係使用Kapa SYBR Fast qPCR Master Mix (Kapa Biosystems)伴隨Mastercycler Ep Realplex儀器(Eppendorf)。定量PCR所使用之正向及反向引子分別為5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’ (SEQ ID NO:3)及5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’ (SEQ ID NO:4)。隨後，以所需比率匯集量化之PCR產物使樣本多樣，並於Illumina HiSeq運行，其使用CombiGEM條碼引子(5’-CCACCGAGATCTACACGGATCCGCAACGGAATTC-3’ (SEQ ID NO:5))及索引條碼引子(5’-GTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACC-3’ (SEQ ID NO:6))。

數據分析

以二生物重複進行篩選，其中以相同慢病毒庫之單獨感染及平均log₂ 比率測定藥物敏感性或細胞增生。大多數(78-90%)組合顯示生物重複間之log₂ 比率差異小(＜0.3)(圖12)。所有實驗條件之組合皆以平均log₂ 比率排序。最高命中組定義為log₂ 比率大於0.32或小於-0.42 (其中實驗組與對照組具有＞25%以上或以下肢條碼計數)。生物重複間之篩選命中觀察到一致之表型改良效用(皮爾森相關係數 = 0.636-0.788)(圖12)。單獨實驗間測得之表型改良效用差異可肇因於施加之毒性選擇壓力程度之適度差異(Kampmann et al.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2013) 110, E2317-2326)，以及重複使細胞通過群體瓶頸之帕松抽樣誤差(Poisson sampling error)(Pierce et al.Nat. Protoc. (2007) 2, 2958, 2974)。可藉由增加匯集篩選時每一組合之細胞倍數代表，改進生物重複數間之再現性(Bassik et al.Cell (2013) 152, 909-922)。欲增進二維熱圖及三維圖之能見度，進行分級簇集，使組合分組，其根據歐幾里得相關(Euclidean correlation)享有類似log₂ 比率輪廓。

欲決定微型核糖核酸交互作用，應用類似於前述測定基因交互作用之評分系統(Bassik et al.Cell (2013) 152, 909-922)，並計算各逐二及逐三組合之基因作用(GI)評分。各組合根據其GI評分分組，以評估基因交互作用頻率，如圖5D-5F之直方圖所示。一般而言，經由個別表型之加成效用，展現比預期更強表型之組合係定義為協同，而根據加法模型，比預期表型更弱之組合則定義為緩衝。詳細定義如下方及圖15所示。

如前述，正及負表型之標準化條碼讀值平均倍數變化分別為＞1及＜1，而無表型變化造成倍數變化 = 1。針對個別表型“A”與“B”之微型核糖核酸[A]與[B]，根據加法模型，逐二組合[A,B]之預期表型為(“A” + “B” - 1)，其中“A”與“B”係根據分別之組合[A,X]與[B,X]測定之標準化條碼讀值中位數倍數變化計算，且[X]代表所有39個庫之成員。同樣地，逐三組合[A,B,C]之預期表型為(“A,B” + “C” - 1)，其中“A,B”與“C”係分別之組合[A,B,X]與[C,X,X]測定之標準化條碼讀值中位數倍數變化，且[X]代表所有39個庫之成員。【00100】給定之逐二組合之GI評分決定如下(圖15)：偏差之定義 = 觀察表型 – 預期表型， 1) 若表型“A”與“B”兩者皆＞1且偏差大於0，則交互作用定義為協同。GI評分 = | 偏差 | 2) 若表型“A”與“B”兩者皆＞1且偏差小於0，則交互作用定義為緩衝。GI評分 = - | 偏差 | 3) 若表型“A”與“B”兩者皆＜1且偏差大於0，則交互作用定義為緩衝。GI評分 = - | 偏差 | 4) 若表型“A”與“B”兩者皆＜1且偏差小於0，則交互作用定義為協同。GI評分 = | 偏差 | 5) 若表型“A” ＞1且“B” ＜1，或反之亦然，且觀察表型＞ “A”與“B”兩者，則交互作用定義為協同。GI評分 = | 偏差 | 6) 若表型“A” ＞1且“B” ＜1，或反之亦然，且觀察表型＜ “A”與“B”兩者，則交互作用定義為協同。GI評分 = | 偏差 | 7) 若表型“A” ＞1且“B” ＜1，或反之亦然，且觀察表型既未＞ “A”與“B”兩者亦未＜ “A”與“B”兩者，則交互作用定義為緩衝。GI評分 = - | 偏差 | 【00101】以相同方法計算給定之逐三組合之GI評分。針對各逐三組合，決定三可能排列(亦即，“A,B” + “C”、“A,C” + “B”、“B,C” + “A”)之三GI評分。“B,A” + “C”之GI評分與“A,B” + “C”的相同，係因微型核糖核酸之相同配對之不同順序之倍數變化如前述進行平均。於圖5F，標記為(iii)之組合之所有三種排列之GI評分為0.296/0.297/0.330。【00102】欲決定GI之顯著性，GI評分係如前述之Z評分標準化⁶¹ ，且|Z評分|截止值2視為統計上顯著性(P ＜ 0.05)。於逐二微型核糖核酸之組合之藥物敏感性篩選，顯著協同及緩衝交互作用之GI評分經測定分別為＞ .198及＜ -0.186 (圖5D)，於逐三微型核糖核酸之組合之藥物敏感性篩選，分別為＞ 0.199及＜ -0.191 (圖5E)，而於逐三微型核糖核酸之組合之細胞增生篩選，則分別＞ 0.146及＜ -0.110 (圖5F)。欲產生如圖5A及17A-17D之GI熱圖，逐二及逐三組合之經計算GI評分係以相同順序呈現，以作為二維熱圖以易於比較。使用現有評分方法較難呈現標誌上位(sign epistasis)⁵⁹ 。於定義之內，標誌上位稱作協同，而倒數標誌上位(reciprocal sign epistasis)則歸類為緩衝。根據乘法模型產生之預期表型，亦制定各逐二及逐三組合之GIs^1,16 ，且加法模型亦觀察到類似之GIs (未顯示數據)。於匯集篩選時，藉由涵蓋逐一庫，可達到增進GI圖之效用，使能比較基因組合與其單基因成分，並藉由增加各基因組成之代表性，最小化由於有限樣本大小之潛在誤差。【00103】流式細胞測量術【00104】於感染後四天，細胞以補充2%熱失活胎牛血清之1X PBS清洗及再懸浮，並以LSRII Fortessa流式細胞儀(Becton Dickinson)試驗。細胞係經前向及側向散射閘控。於各數據組，每一樣本記錄至少20,000個細胞。【00105】螢光顯微鏡【00106】欲觀察GFP及RFP，於感染四天後，以倒立式螢光顯微鏡(Zeiss)直接觀察細胞。【00107】細胞存活力試驗【00108】在MTT試驗方面，於96孔培養盤中，將100 μl之MTT (3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)溶液(Sigma)加至細胞培養基，並於37ºC之5% CO₂ 下培養2小時。存活之細胞將convert the 可溶性MTT鹽類轉換成不可溶之藍色甲臢(formazan)結晶。於37ºC下，將形成之甲臢結晶溶於100 μl之溶解緩衝液。以光密度(OD) 570 nm測定溶解之甲臢析光度(伴隨參考OD 650 nm)，其係使用Synergy H1微讀盤儀(BioTek)。針對台酚藍排除試驗，細胞以胰蛋白酶脫附，並以0.4%台酚藍染液染色(Sigma)。於顯微鏡下，於細胞計數器之四不同區域計數存活細胞。【00109】集落形成試驗【00110】將10,000個細胞種植於96孔培養盤並處理25 nM之多西他賽。細胞以胰蛋白酶脫附，並移至6孔培養盤。於七天後，細胞以冰冷之100%甲醇固定10分鐘，並以結晶紫溶液染色20分鐘。以ImageJ軟體測定各樣本之集落面積百分比及殖株數目。【00111】 RNA萃取及定量RT-PCR (qRT-PCR) 【00112】以TRIzol Plus RNA Purification Kit (Invitrogen)萃取細胞RNA，並以PureLink DNase Set (Invitrogen)處理DNase，其係根據製造商之步驟，並以Nanodrop Spectrophotometer定量。以GoScript反轉錄酶(Promega)、隨機引子混合物(New England Biolabs)、及RNAse OUT (Invitrogen)反轉錄RNA樣本。以LightCycler480系統(Roche)進行qRT-PCR，其係使用SYBR FAST qPCR Master Mix (KAPA)。LightCycler 480 SW 1.1係用於TM曲線評估及定量。PCR引子列於表9。表1：用於條碼庫選殖之候選微型核糖核酸及引子列表表2：候選微型核糖核酸於癌細胞表現之報導表3：逐二微型核糖核酸命中列表，其增加OVCAR8-ADR細胞之多西他賽敏感性，係根據實驗組與對照組之匯集篩選，其中log₂ 比率＜-0.42且＞25%有較少之條碼計數表4：逐二微型核糖核酸命中列表，其增加OVCAR8-ADR細胞之多西他賽抗藥性，係根據實驗組與對照組之匯集篩選，其中log₂ 比率＜-0.42且＞25%有較少之條碼計數表5：逐三微型核糖核酸命中列表，其增加OVCAR8-ADR細胞之多西他賽敏感性，係根據實驗組與對照組之匯集篩選，其中log₂ 比率＜-0.42且＞25%有較少之條碼計數表6：逐三微型核糖核酸命中列表，其增加OVCAR8-ADR細胞之多西他賽抗藥性，係根據實驗組與對照組之匯集篩選，其中log₂ 比率＜-0.42且＞25%有較少之條碼計數表7：逐三微型核糖核酸命中列表，其抑制OVCAR8-ADR細胞增生，係根據實驗組與對照組之匯集篩選，其中log₂ 比率＜-0.42且＞25%有較少之條碼計數表8：本研究使用之構築體表9：qRT-PCR所使用之引子列表表10：逐三微型核糖核酸命中列表，其同時抑制細胞增生及增加OVCAR8-ADR細胞之多西他賽敏感性，係根據實驗組與對照組之匯集篩選，其中log₂ 比率＜-0.32且＞20%有較少之條碼計數 參考資料 1. Dixon, S. J., Costanzo, M., Baryshnikova, A., Andrews, B. & Boone, C. Systematic mapping of genetic interaction networks.Annu. Rev. Genet. 43, 601–625 (2009). 2. Vierbuchen, T. & Wernig, M. Molecular Roadblocks for Cellular Reprogramming.Mol. Cell. 47, 827–838 (2012). 3. Al-Lazikani, B., Banerji, U. & Workman, P. Combinatorial drug therapy for cancer in the post-genomic era.Nat. Biotechnol. 30, 679–692 (2012). 4. Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R. & Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability.Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 1193–1198 (2012). 5. Eichler, E. E. et al. Missing heritability and strategies for finding the underlying causes of complex disease.Nat. Rev. Genet. 11, 446–450 (2010). 6. Manolio, T. A. et al. Finding the missing heritability of complex diseases.Nature 461, 747– 753 (2009). 7. Johannessen, C. M. et al. A melanocyte lineage program confers resistance to MAP kinase pathway inhibition.Nature 504, 138–42 (2013). 8. Voorhoeve, P. M. et al. A genetic screen implicates miRNA-372 and miRNA-373 as oncogenes in testicular germ cell tumors.Cell 131, 102–114 (2007). 9. Moffat, J. & Sabatini, D. M. Building mammalian signaling pathways with RNAi screens.Nat. Rev. Mol. Cell Biol . 7, 177–187 (2006). 10. Zhou, Y. et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.Nature 509, 487–491 (2014). 11. Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E.-P., Velasco-Herrera, M. D. C. & Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.Nat. Biotechnol. 32, 267–73 (2014). 12. Shalem, O. et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.Science 343, 84–7 (2014). 13. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M. & Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.Science 343, 80–4 (2014). 14. Metzker, M. L. Sequencing technologies - the next generation.Nat. Rev. Genet. 11, 31–46 (2010). 15. Yu, H. et al. Next-generation sequencing to generate interactome datasets.Nat. Methods 8, 478–480 (2011). 16. Bassik, M. C. et al. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility.Cell 152, 909–922 (2013). 17. Engler, C., Kandzia, R. & Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.PLoS One 3, e3647 (2008). 18. Gibson, D. G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nat. Methods 6, 343–345 (2009). 19. Zelcbuch, L. et al. Spanning high-dimensional expression space using ribosome-binding site combinatorics.Nucleic Acids Res. 41, e98 (2013). 20. Yoo, A. S. et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons.Nature 476, 228–231 (2011). 21. Brown, B. D. & Naldini, L. Exploiting and antagonizing microRNA regulation for therapeutic and experimental applications.Nat. Rev. Genet . 10, 578–585 (2009). 22. Li, Z. & Rana, T. M. Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges. Nat. Rev. Drug Discov. 13, 622–638 (2014). 23. Patnaik, S. K. et al. Expression of MicroRNAs in the NCI-60 Cancer Cell-Lines.PLoS One 7, (2012). 24. Creighton, C. J. et al. Proteomic and transcriptomic profiling reveals a link between the PI3K pathway and lower estrogen-receptor (ER) levels and activity in ER+ breast cancer.Breast Cancer Res . 12, R40 (2010). 25. Gholami, A. M. et al. Global proteome analysis of the NCI-60 cell line panel.Cell Rep. 4, 609–620 (2013). 26. Hsu, S. Da et al. MiRTarBase update 2014: An information resource for experimentally validated miRNA-target interactions.Nucleic Acids Res . 42, D78–85 (2014). 27. Honma, K. et al. RPN2 gene confers docetaxel resistance in breast cancer.Nat. Med. 14, 939–948 (2008). 28. Strezoska, Ž. et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens.PLoS One 7, e42341 (2012). 29. Bhattacharya, R. et al. MiR-15a and MiR-16 control Bmi-1 expression in ovarian cancer.Cancer Res. 69, 9090–9095 (2009). 30. Cheng, A. A., Ding, H. & Lu, T. K. Enhanced killing of antibiotic-resistant bacteria enabled by massively parallel combinatorial genetics.Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 12462–7 (2014). 31. Xia, L. et al. miR-15b and miR-16 modulate multidrug resistance by targeting BCL2 in human gastric cancer cells.Int. J. Cancer 123, 372–379 (2008). 32. Kastl, L., Brown, I. & Schofield, A. C. MiRNA-34a is associated with docetaxel resistance in human breast cancer cells.Breast Cancer Res. Treat. 131, 445–454 (2012). 33. Krek, A. et al. Combinatorial microRNA target predictions.Nat. Genet. 37, 495–500 (2005). 34. Jacobsen, A. et al. Analysis of microRNA-target interactions across diverse cancer types.Nat. Struct. Mol. Biol. 20, 1325–32 (2013). 35. Lewis, B. P., Burge, C. B. & Bartel, D. P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets.Cell 120, 15–20 (2005). 37. Guillamot, M. et al. Cdc14b regulates mammalian RNA polymerase II and represses cell cycle transcription.Sci. Rep. 1: 189, (2011). 38. Huntinger, E. & Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.Nat. Rev. Genet. 12, 99-110 (2011). 39. McLornan, D. P., List, A. & Mufti, G. J. Applying Synthetic Lethality for the Selective Targeting of Cancer.N. Engl. J. Med . 371, 1725–35 (2014). 40. Van Rooij, E., Purcell, A. L. & Levin, A. A. Developing MicroRNA therapeutics.Circ. Res. 110, 496–507 (2012). 41. The Cancer Genome Atlas Research Network et al. The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project.Nat. Genet. 45, 1113–20 (2013). 42. Andersson, R. et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.Nature 507, 455–61 (2014). 43. Consortium, T. F., Pmi, R. & Dgt, C. A promoter-level mammalian expression atlas.Nature 507, 462–70 (2014). 44. Gandhi, S. & Wood, N. W. Genome-wide association studies: the key to unlocking neurodegeneration?Nat. Neurosci. 13, 789–794 (2010). 45. Peden, J. F. & Farrall, M. Thirty-five common variants for coronary artery disease: the fruits of much collaborative labour.Hum. Mol. Genet. 20, R198–205 (2011). 46. Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J. & Green, M. R. A genome-wide shRNA screen identifies GAS1 as a novel melanoma metastasis suppressor gene.Genes Dev. 22, 2932–2940 (2008). 47. Park, J. et al. RAS–MAPK–MSK1 pathway modulates ataxin 1 protein levels and toxicity in SCA1.Nature 498, 325–331 (2013). 48. Chia, N.-Y. et al. A genome-wide RNAi screen reveals determinants of human embryonic stem cell identity.Nature 468, 316–320 (2010). 49. Ebert, M. S., Neilson, J. R. & Sharp, P. A. MicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells.Nat. Methods 4, 721–726 (2007). 50. Guttman, M. et al. lincRNAs act in the circuitry controlling pluripotency and differentiation.Nature 477, 295–300 (2011). 51. Gilber, L. A.et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.Cell 159, 647-661 (2014). 52. Hsu, P. D., Lander, E. S. & Zhang, F. Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering.Cell 157, 1262–1278 (2014). 53. Gaj, T., Gersbach, C. A. & Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.Trends Biotechnol. 31, 397–405 (2013). 54. Zhu, F. et al. DICE, an efficient system for iterative genomic editing in human pluripotent stem cells.Nucleic Acids Res. 42, e34 (2013). 55. Bruno, I. G. et al. Identification of a MicroRNA that Activates Gene Expression by Repressing Nonsense-Mediated RNA Decay.Mol. Cell 42, 500–510 (2011). 56. Klein, M. E. et al. Homeostatic regulation of MeCP2 expression by a CREB-induced microRNA.Nat. Neurosci. 10, 1513–1514 (2007). 57. Miyamichi, K. et al. Cortical representations of olfactory input by trans-synaptic tracing.Nature 472, 191–196 (2011). 58. Ren, Y. et al. Targeted Tumor-Penetrating siRNA Nanocomplexes for Credentialing the Ovarian Cancer Oncogene ID4. Sci. Transl. Med. 4, 147ra112–147ra112 (2012). 59. Kampmann, M., Bassik, M. C. & Weissman, J. S. Integrated platform for genome-wide screening and construction of high-density genetic interaction maps in mammalian cells.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E2317–26 (2013). 60. Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C. & Giaever, G. Genome-wide analysis of barcodedSaccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.Nat. Protoc . 2, 2958–2974 (2007). 61. Butland, G. et al. eSGA:E. coli synthetic genetic array analysis.Nat. Methods 5, 789–795 (2008). 62. Kastl, L., Brown, I. & Schofield, A. C. MiRNA-34a is associated with docetaxel resistance in human breast cancer cells.Breast Cancer Res. Treat . 131, 445–454 (2012). 63. Salter, K. H. et al. An integrated approach to the prediction of chemotherapeutic response in patients with breast cancer.PLoS One 3, e1908 (2008). 64. Zhou, M. et al. MicroRNA-125b confers the resistance of breast cancer cells to paclitaxel through suppression of pro-apoptotic Bcl-2 antagonist killer 1 (Bak1) expression.J. Biol. Chem. 285, 21496–21507 (2010). 65. Bitarte, N. et al. MicroRNA-451 is involved in the self-renewal, tumorigenicity, and chemoresistance of colorectal cancer stem cells.Stem Cells 29, 1661–1671 (2011). 66. Chen, G. Q., Zhao, Z. W., Zhou, H. Y., Liu, Y. J. & Yang, H. J. Systematic analysis of microRNA involved in resistance of the MCF-7 human breast cancer cell to doxorubicin.Med. Oncol. 27, 406–415 (2010). 67. Donzelli, S. et al. MicroRNAs: short non-coding players in cancer chemoresistance.Mol. Cell. Ther. 2, 16 (2014). 68. Laios, A. et al. Potential role of miR-9 and miR-223 in recurrent ovarian cancer.Mol. Cancer 7, 35 (2008). 69. Liang, Z. et al. Involvement of miR-326 in chemotherapy resistance of breast cancer through modulating expression of multidrug resistance-associated protein 1.Biochem Pharmacol 79, 817–824 (2010). 70. Mitamura, T. et al. Downregulation of miRNA-31 induces taxane resistance in ovarian cancer cells through increase of receptor tyrosine kinase MET.Oncogenesis 2, e40 (2013). 71. Mosakhani, N., Mustjoki, S. & Knuutila, S. Down-regulation of miR-181c in imatinibresistant chronic myeloid leukemia.Mol. Cytogenet. 6, 27 (2013). 72. Pogribny, I. P. et al. Alterations of microRNAs and their targets are associated with acquired resistance of MCF-7 breast cancer cells to cisplatin.Int. J. Cancer 127, 1785– 1794 (2010). 73. Pogribny, I. P. et al. Alterations of microRNAs and their targets are associated with acquired resistance of MCF-7 breast cancer cells to cisplatin.Int. J. Cancer 127, 1785–1794 (2010). 74. Weidhaas, J. B. et al. MicroRNAs as potential agents to alter resistance to cytotoxic anticancer therapy.Cancer Res. 67, 11111–11116 (2007). 75. Xin, F. et al. Computational analysis of microRNA profiles and their target genes suggests significant involvement in breast cancer antiestrogen resistance.Bioinformatics 25, 430– 434 (2009). 76. Yang, N. et al. MicroRNA microarray identifies Let-7i as a novel biomarker and therapeutic target in human epithelial ovarian cancer.Cancer Res. 68, 10307–10314 (2008). 77. Yu, P. N. et al. Downregulation of miR-29 contributes to cisplatin resistance of ovarian cancer cells.Int. J. Cancer 134, 542–551 (2013). 78. Karaayvaz, M., Zhai, H. & Ju, J. miR-129 promotes apoptosis and enhances chemosensitivity to 5-fluorouracil in colorectal cancer.Cell Death Dis. 4, e659 (2013). 79. Luo, G. et al. Highly lymphatic metastatic pancreatic cancer cells possess stem cell-like properties.Int J Oncol 42, 979–984 (2013). 80. Nam, E. J. et al. MicroRNA expression profiles in serous ovarian carcinoma.Clin. Cancer Res. 14, 2690–2695 (2008). 81. Zhang, L. et al. Genomic and epigenetic alterations deregulate microRNA expression in human epithelial ovarian cancer.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 7004–7009 (2008). 【00113】於本發明至少一具體實施例所述之數個態樣中，應理解到，本領域之技術人員將易於進行各種改變、修正、及改進。此類改變、修正、及改進係旨在本發明揭示一部分，且旨在落入本發明之精神及範疇內。據此，前面之描述及圖示係僅為示例之方式。等同語 【00114】儘管本文說明及描述了數個具體實施例，本領域之技術人員將易於聯想到多種其他方法及/或結構，以執行功能及/或取得結果及/或一或多個本文所述之優勢，且此類變化及/或修正係視為落入本文所述發明具體實施例之範疇內。此外，於二或多個此類特性、系統、物件、材料、套組、及/或方法之任何組合中，若此類特性、系統、物件、材料、套組、及/或方法未相互不一致，則涵蓋於本發明揭示之範疇內。【00115】本文所揭示關於各引用主題之所有參考文獻、專利、及專利申請案皆併入本案以作為參考資料，其在一些情況下可包括文件整體內容。【00116】本說明書及申請專利範圍使用之不定冠詞「一」及「一者」，除非有明確指明，應理解為意指「至少一者」。【00117】本說明書及申請專利範圍使用之片語「及/或」，應理解為意指連體元件之「其一或兩者」，亦即，元件於一些情況下同時存在且於其他情況下未同時存在。以「及/或」列舉之多個元件應以相同方式解釋，亦即，「一或多個」連體元件。除了以「及/或」子句具體確定之元件以外，可任意存在其他元件，不論是否與彼等具體確定之元件相關或不相關。因此，以作為非侷限實例，參照「A及/或B」，當結合開放式語言使用時，如「包含」，於一具體實施例，可指僅有A (可視需要地包括B以外之元件)；於另一具體實施例，可指僅有B (可視需要地包括A以外之元件)；於又另一具體實施例，可指A與B兩者(可視需要地包括其他元件)；等等。【00118】本說明書及申請專利範圍使用之「或」，應理解為具有與前面定義之「及/或」相同之意義。舉例而言，當列表中具有分離之項目，「或」或「及/或」應解釋為包括，亦即，包括至少一者，但亦包括一者以上，之數目或所列元件，以及可視需要地，額外之未列舉項目。僅明確指明之字詞，如「僅~之一者」或「正好~之一者」，或者當用於申請專利範圍時，「由~組成」意指包括一數目或列舉元件之正好一元件。一般而言，本文使用之「或」乙詞應僅解釋為具排他性(亦即，「一或他者但非兩者」)，尤其是當以排他性用詞說明時，如「其一」、「之一者」、「僅~之一者」、或「正好~之一者」。「基本上由~組成」，當用於申請專利範圍時，應具有其在專利法領域中使用之普通含義。【00119】本說明書及申請專利範圍使用之片語「至少一」，參照列舉之一或多個元件，應理解為意指選自於所列元件之任一或多個元件之至少一元件，但毋需包括所列元件內具體列出之各個及每一元件之至少一者，且不排除所列元件之任何元件之組合。此定義亦容許元件可可視需要地存在，除了具體確定該元件為片語「至少一」所指之列舉元件範圍內以外，不論其與彼等具體確定之元件有關或無關。因此，以作為非侷限實例，「A及B之至少一者」(或其等同語，「A或B之至少一者」，或其等同語，「A及/或B之至少一者」) ，於一具體實施例，可指至少一，可視需要地包括一者以上之A，而無B存在(且可視需要地包括B以外之元件)；於另一具體實施例，可指至少一，可視需要地包括一者以上之B，而無A存在(且可視需要地包括A以外之元件)；於又另一具體實施例，可指至少一，可視需要地包括一者以上之A，及至少一，可視需要地包括一者以上之B (且可視需要地包括其他元件)；等等。【00120】亦應理解到，除非另有明確指明，於本文揭露之任何方法所涵蓋之一者以上之步驟或動作中，該方法之步驟或動作之順序未必侷限於該方法所引用之步驟或動作之順序。本文所揭示關於各引用主題之所有參考文獻、專利、及專利申請案皆併入本案以作為參考資料，其在一些情況下可包括文件整體內容。【00121】於申請專利範圍及上述說明書中，所有過渡語，如「包含」、「包括」、「帶有」、「具有」、「含有」、「涉及」、「持有」、「由~組成」、及其類似語，可理解為開放形式，亦即，意指包括但不侷限於此。僅過渡語「由~組成」及「基本上由~組成」分別為封閉或半封閉過渡語，如美國專利局專利審查程序說明書中第2111.03節所述。

無

所附圖示並未旨在按比例繪製。為便於釐清，並非每一圖示中每一組件皆標記。下圖中：圖1顯示組裝組合基因庫及進行組合微型核糖核酸篩選之策略。CombiGEM組合利用疊代一鍋化選殖(iterative one-pot cloning)，將匯集之單基因插入子庫(single-genetic insert library)變成越來越複雜之逐(n)載體庫((n)-wise vector library)。將微型核糖核酸前驅物條碼化(barcoded；BC)，並定位四個限制酶位點(BglII、MfeI、BamHI、EcoRI)，如右側所示。BglII/BamHI及EcoRI/MfeI配對係獨特之限制酶位點，其於配對內產生相容懸垂(overhangs)但與其他配對不相容。匯集之插入子及載體係分別以BglII + MfeI及BamHI + EcoRI切割。一鍋化連接法(one-pot ligation)產生匯集載體庫，其進一步以相同插入子池(insert pool)疊代切割及連接，產生更高階組合。所有條碼皆位於相鄰延伸之DNA上。最終組合庫係於慢病毒中編碼且輸送至標靶人類細胞。代表各基因組合之組合條碼係以無偏差方式由匯集細胞群內之基因體DNA擴增，並以高通量定序法量化，以確定各實驗條件下各代表物之偏移。圖2A-2F顯示高覆蓋組合微型核糖核酸庫可有效產生且輸送至人類細胞。圖2A顯示由大腸桿菌及感染之OVCAR8-ADR細胞池萃取之質體池(plasmid pools)條碼化逐二(two-wise)微型核糖核酸組合庫定序讀值之累積分佈。取得質體與感染細胞池中所有預期逐二組合之完全覆蓋，且2%以下之逐二組合係由小於100組條碼讀值覆蓋。圖2B顯示由大腸桿菌及感染之OVCAR8-ADR細胞池萃取之質體池條碼化逐三微型核糖核酸之組合庫定序讀值之累積分佈。質體及感染細胞池內取得高覆蓋之逐三庫(分別為約89%及約87%)，且約10-15%之組合係由小於100組條碼讀值覆蓋。圖2C顯示質體與感染之OVCAR8-ADR細胞池內條碼代表物(標準化之條碼計數log₂ 值)間之高度相關，表示逐二庫有效之慢病毒輸送至人類細胞。圖2D顯示質體與感染之OVCAR8-ADR細胞池內條碼代表物(標準化之條碼計數log₂ 值)之間高度相關，表示逐三庫有效之慢病毒輸送至人類細胞。當相對於質體庫，細胞之條碼計數倍數變化Z值小於-2時，其係組合所設定之截止值且其中二標準差低於族群平均，則該組合視為代表性不足。代表性不足之組合以淺灰色顯示。圖2E顯示以逐二組合微型核糖核酸庫感染之OVCAR8-ADR細胞二生物重複間條碼代表物之高再現性。圖2F顯示以逐三組合微型核糖核酸庫感染之OVCAR8-ADR細胞二生物重複間條碼代表物之高再現性。R為皮爾森相關係數(Pearson correlation coefficient)。圖3A-3E顯示逐二組合篩選，其產生微型核糖核酸交互作用，以賦予多西他賽之癌細胞抗藥性或敏感性。圖3A係一示意圖，顯示以逐二組合微型核糖核酸庫感染之OVCAR8-ADR細胞係分成二組，並以25 nM之多西他賽或載具對照組處理四天。以無偏差方式藉PCR從細胞池內基因體DNA擴增各組合之微型核糖核酸構築體條碼，並以高通量定序法計數(Illumina HiSeq)。圖3B顯示調控多西他賽敏感性之逐二微型核糖核酸之組合，其係以二生物重複多西他賽(25 nM)處理細胞與載具處理細胞之標準化之條碼計數平均log₂ 比率排序。標記之微型核糖核酸組合係進一步以本文所述實驗驗證。圖3C顯示逐二微型核糖核酸之組合賦予多西他賽敏感性之驗證。OVCAR8-ADR細胞係以單微型核糖核酸、逐二微型核糖核酸、或載體對照組感染，並處理10 nM (淺灰色)或25 nM (深灰色)之多西他賽三天。圖3D顯示逐二微型核糖核酸之組合或載體對照組感染之OVCAR8-ADR細胞於處理多西他賽(0-50 nM)或載具對照組(黑線)三天之存活力。劑量反應分析顯示，OVCAR8-ADR細胞以miR-16-1/15a 簇與miR-93/106b 簇(淺灰色線)或miR-376a (中灰色線)之組合感染，多西他賽之IC50減少約2倍。圖3E顯示逐二微型核糖核酸之組合賦予多西他賽抗藥性之驗證。OVCAR8-ADR細胞係以單微型核糖核酸、逐二微型核糖核酸、或載體對照組感染，並以10 nM (淺灰色)或25 nM (深灰色)之多西他賽處理三天。以MTT (3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)試驗評估細胞存活力。數據代表平均值± SD (n ≥ 10)，且圖3C及3D之數據係取自相同實驗。星號表示P ＜0.05。圖4A-4E顯示逐三組合篩選，其辨別微型核糖核酸組合，以改良多西他賽之癌細胞敏感性或增生。圖4A係一示意圖，顯示以逐三組合微型核糖核酸庫感染之OVCAR8-ADR細胞係分成三組，並以25 nM之多西他賽或載具25處理四天，或以載具培養一天。以無偏差方式藉由PCR從細胞池內基因體DNA擴增各組合之微型核糖核酸構築體條碼，並以高通量定序法計數(Illumina HiSeq)。圖4B顯示調控多西他賽敏感性之逐三微型核糖核酸之組合，其係以多西他賽(25 nM)處理細胞與四天載具處理細胞之標準化之條碼計數平均log₂ 比率排序。標記之微型核糖核酸組合係進一步以本文所述實驗驗證。圖4C顯示逐三微型核糖核酸之組合改變多西他賽敏感性之驗證。OVCAR8-ADR細胞係以所指逐三微型核糖核酸之組合或載體對照組感染，並處理0-50 nM之多西他賽三天。圖4D顯示調控細胞增生之逐三微型核糖核酸之組合，其係以培養四天與一天之細胞之標準化條碼計數平均log₂ 比率排序。標記之微型核糖核酸組合係進一步以本文所述實驗驗證。圖4E顯示逐三微型核糖核酸之組合改變細胞增生之驗證。OVCAR8-ADR細胞係以逐三微型核糖核酸之組合或載體對照組感染，並培養指定之時間。以MTT試驗測定細胞存活力，並相較於無藥物對照組(n ≥ 5)。增生係以析光度測定(OD₅₇₀ - OD₆₅₀ ) (n ≥ 4)確認。數據代表平均值±標準差。圖5A-5F顯示微型核糖核酸組合之高通量輪廓，其顯示調控多西他賽敏感性及/或細胞增生表型之基因交互作用。圖5A顯示二維熱圖(上側)及基因作用圖(下側)，其分別描繪含逐二微型核糖核酸之組合之細胞的多西他賽敏感性及微型核糖核酸對之基因作用(GI)評分。以多西他賽處理與載具處理OVCAR8-ADR細胞之標準化條碼計數log₂ 比率測定多西他賽敏感性。抗藥性及敏感性表型之log₂ 比率分別為大於0及小於0。過濾出對照組樣本中含有小於100組絕對條碼讀值之微型核糖核酸逐二對(two-wise pairs)之數據，並標示成淺灰色。微型核糖核酸根據log₂ 比率相關性分層簇集。計算所有逐二組合之GI評分並以GI圖(下側)呈現。當觀察到組合表型偏離或低於加法模型產生之預期表型時，可定義協同及緩衝交互作用。協同及緩衝交互作用之GI評分分別為大於0及小於0。未測得GIs之微型核糖核酸對係以淺灰色表示。微型核糖核酸呈現於基因作用圖之順序如同二維熱圖。圖5B顯示逐三微型核糖核酸之組合之多西他賽敏感性作用之三維繪圖。測定所有逐三微型核糖核酸之組合之多西他賽處理與四天載具處理之OVCAR8-ADR細胞之標準化條碼計數log₂ 比率。以氣泡形呈現抗藥性(log₂ 比率大於0)及敏感性(log₂ 比率小於0)表型。圖5C顯示逐三微型核糖核酸之組合之增生-調控作用之三維繪圖。測定所有逐三微型核糖核酸之組合之四天與一天培養細胞之標準化條碼計數log₂ 比率。以氣泡形呈現前增生(log₂ 比率大於0)及抗增生(log₂ 比率小於0)表型。參見圖14之所有39x39x39個微型核糖核酸組合面板。各二維平面以相同之分層簇集順序排列，如圖5A所示，並標記額外之第三微型核糖核酸元件。圖5D顯示逐二微型核糖核酸之組合之多西他賽-敏感性篩選所測定之GI評分分佈。圖5E顯示逐三微型核糖核酸之組合之多西他賽-敏感性篩選所測定之GI評分分佈。圖5F顯示逐三微型核糖核酸之組合之細胞增生篩選所測定之GI評分分佈。於圖5D-5F，根據GI評分將微型核糖核酸組合分組，以評估基因交互作用頻率。經驗證之微型核糖核酸組合之GI評分係以箭頭指出且標記。逐三微型核糖核酸之組合之GI評分代表額外之第三微型核糖核酸與改良生物表型之逐二微型核糖核酸之組合間之交互作用。所有顯示之log₂ 比率及GI評分係由二生物重複之平均值確定。圖6A-6J顯示微型核糖核酸以組合方式交互作用，以調控多西他賽敏感性及癌細胞增生。圖6A-6H顯示逐三(三角形)微型核糖核酸組合與個別之單一(正方形)及逐二(菱形)微型核糖核酸組合之藥物敏感性及增生-調控作用之散佈圖。三天之多西他賽(25 nM)處理與載具處理之OVCAR8-ADR細胞之相對細胞存活力繪圖及七天與一天培養細胞之析光度(OD₅₇₀ - OD₆₅₀ )繪圖，其係以MTT試驗測定。以各微型核糖核酸組合測得之相對存活力及析光度除以無微型核糖核酸之空載體對照組，取得藥物敏感性(y軸；n ≥ 5)及細胞增生(x軸；n ≥ 3)指標。由同組實驗取得數據。圖6I顯示OVCAR8-ADR細胞以指定之微型核糖核酸組合感染，並以25 nM之多西他賽處理三天。以台酚藍排除試驗(trypan blue exclusion assay)測定存活細胞數。圖6J顯示 OVCAR8-ADR細胞以指定之微型核糖核酸組合感染，以25 nM之多西他賽處理且另外培養十一天，及以結晶紫染色。定量各樣本之集落面積百分比。數據代表平均值±標準差(n = 3)。星號表示P ＜ 0.05。圖7A-7D顯示慢病毒輸送組合微型核糖核酸表現構築體提供有效之標靶基因抑制作用。圖7A描述慢病毒組合微型核糖核酸之表現及感應子構築體之設計。單一或多重微型核糖核酸前驅物序列係以串接下游GFP基因之方式排列，以監控CMV啟動子驅動之慢病毒載體表現。將含四重複之同源微型核糖核酸標靶序列感應子選殖至RFP基因之3’UTR，其由UBC啟動子表現以報導微型核糖核酸活性。構築體係由慢病毒輸送至HEK293T細胞，之後以流動式細胞測量術(flow cytometry)分析GFP及RFP表現。圖7B顯示微型核糖核酸表現抑制RFP報導子活性。含指定之微型核糖核酸、同源感應子、或兩者之慢病毒構築體係導入HEK293T細胞。圖7C顯示指定之組合微型核糖核酸表現構築體有效抑制含同源微型核糖核酸感應子之RFP報導子。含逐二或逐三微型核糖核酸之組合之慢病毒構築體，其有或無同源感應子，係導入HEK293T細胞，並評估RFP及GFP表現。圖7D顯示微型核糖核酸與非同源感應子之間有侷限之交叉反應性。將配對不同(非同源)感應子之含微型核糖核酸之慢病毒構築體輸送至HEK293T細胞。以流動式細胞測量術測定GFP陽性細胞群內RFP陽性細胞之百分比。數據代表平均值±標準差(n = 3)。圖8A-8C顯示慢病毒有效輸送雙螢光蛋白報導子構築體至人類細胞。圖8A描述測試慢病毒輸送雙螢光蛋白報導子構築體至人類細胞之策略。所產生之慢病毒分別用於輸送含有以CMV或UBC啟動子控制表現之GFP基因載體，或編碼以UBC及CMV啟動子控制之RFP及GFP基因單一載體，其係輸送至HEK293T細胞以分析GFP及RFP表現。圖8B顯示表現於UBCp-RFP-CMVp-GFP病毒感染細胞之RFP及GFP螢光顯微照片，而僅GFP表現於UBCp-GFP及CMVp-GFP慢病毒感染之細胞。比例尺代表400 μm。圖8C顯示流動式細胞測量術分析結果，其量化RFP及GFP螢光呈陽性之細胞群，以評估雙螢光蛋白報導子構築體於人類細胞之輸送及表現。百分之97以上之UBCp-RFP-CMVp-GFP病毒感染HEK293T細胞之RFP及GFP兩者呈陽性，且UBCp-GFP或CMVp-GFP病毒感染細胞之GFP陽性百分比類似。圖9A-9D顯示CombiGEM條碼擴增PCR期間之指數期辨別。圖9A顯示CombiGEM條碼擴增PCR期間由指數期至線性期之轉移點(transition point)辨別程序，其源自逐一微型核糖核酸載體庫，並於大腸桿菌匯集組裝，以作為PCR複製反應之模板。圖9B顯示CombiGEM條碼擴增PCR期間由指數期至線性期之轉移點辨別程序，其源自以逐二庫感染之人類乳癌細胞(MCF7)所分離之基因體DNA，以作為PCR複製反應之模板。於圖9A及9B，以靶向位於條碼區外序列之引子擴增代表各微型核糖核酸組合之條碼。於10至20 (圖9A)或19至28 (圖9B)個循環間停止反應並收集PCR產物，之後稀釋以作為定量PCR反應之模板。測定各週期間閾值週期(Ct)之平均差。誤差線代表三重複之SD值。引子效率據估計分別為102%及100%，如圖9A及圖9B所示。圖9A及9B中箭頭所指之PCR週期數係用於不偏(unbiased)條碼擴增，以進行後續之高通量(Illumina)定序。圖9C顯示圖9A所指週期數之PCR擴增產物染色瓊脂糖凝膠。圖9D顯示圖9B所指週期數之PCR擴增產物染色瓊脂糖凝膠。圖10A及10B顯示組合微型核糖核酸篩選之生物重複條碼量化之高再現性。圖10A顯示多西他賽(25 nM)處理或載具處理之逐二微型核糖核酸之組合庫感染之OVCAR8-ADR細胞二生物重複間之條碼代表物(標準化條碼計數之log₂ 數)間呈高度相關之散佈圖。圖10B顯示多西他賽(25 nM)處理或載具處理之逐三微型核糖核酸之組合庫感染之OVCAR8-ADR細胞二生物重複間之條碼代表物(標準化條碼計數之log₂ 數)間呈高度相關之散佈圖。R為皮爾森相關係數。圖11A-11C顯示表現構築體中以不同順序排列之相同微型核糖核酸組合條碼呈一致性倍數變化。圖11A顯示不同逐二組合排列順序之細胞接受多西他賽(25 nM)與載具對照組處理四天之變異係數。於藥物敏感性篩選中，92%之逐二微型核糖核酸之組合之變異係數小於0.2。圖11B顯示不同逐三組合排列順序之細胞接受多西他賽(25 nM)與載具對照組處理四天之變異係數。於藥物敏感性篩選中，95%之逐三微型核糖核酸之組合之變異係數小於0.2。圖11C顯示培養四天與一天之不同逐三組合排列順序之細胞之變異係數。於增生篩選中，98%之逐三微型核糖核酸之組合之變異係數小於0.2。圖12A-12C顯示匯集篩選之所有個別命中(hits)之生物重複間之一致性。圖12A顯示多西他賽(25 nM)處理與載具處理之各逐二微型核糖核酸之組合之OVCAR8-ADR細胞所辨別之命中之生物重複間一致性。上側顯示以生物重複1之log₂ 倍數變化對重複2的作圖，以得標準化條碼計數平均值。下側顯示格距(bin size) 0.1時二生物重複間之log₂ 倍數變化差異分佈。圖12B顯示多西他賽(25 nM)處理與載具處理之各逐三微型核糖核酸之組合之OVCAR8-ADR細胞所辨別之命中之生物重複間一致性。上側顯示以生物重複1之log₂ 倍數變化對重複2的作圖，以得標準化條碼計數平均值。下側顯示格距0.1時二生物重複間之log₂ 倍數變化差異分佈。圖12C顯示各逐三微型核糖核酸之組合於第4天與第1天之相對細胞存活力所辨別之命中之生物重複間一致性。上側顯示以生物重複1之log₂ 倍數變化對重複2的作圖，以得標準化條碼計數平均值。下側顯示格距0.1時二生物重複間之log₂ 倍數變化差異分佈。以深灰色表示經辨別視為命中之數據點(參見表3-7)。篩選命中顯示較高之皮爾森相關係數(R = 0.636-0.788)。篩選數據之各數據點代表二生物重複之平均值。多數組合(78-90%)具小於0.3之log₂ 倍數變化差異。圖13顯示OVCAR8細胞株及抗多西他賽OVCAR8-ADR細胞株之多西他賽劑量反應曲線。OVCAR8細胞(三角形)及OVCAR8-ADR細胞(正方形)(OVCAR8之抗多西他賽衍生株)係以指定劑量之多西他賽處理三天並進行MTT試驗。比較其與個別無藥物對照組之細胞存活力。OVCAR8-ADR細胞株之IC50高於親代OVCAR8細胞株約3倍。數據代表平均值± SD (n = 3)。圖14A及14B顯示逐三微型核糖核酸之組合之每一者作用之三維繪圖。圖14A顯示逐三微型核糖核酸之組合之每一者之多西他賽敏感性作用。測定所有逐三微型核糖核酸之組合於多西他賽處理與四天載具處理之OVCAR8-ADR細胞之標準化條碼計數之log₂ 比率，並以有色氣泡呈現。具抗藥性之微型核糖核酸組合之log₂ 比率分別為大於0及小於0。圖14B顯示逐三微型核糖核酸之組合之每一者之增生-調控作用。測定所有逐三微型核糖核酸之組合於四天與一天培養之細胞之標準化條碼計數之log₂ 比率，並以有色氣泡呈現。具前增生及抗增生作用之微型核糖核酸組合之log₂ 比率分別為大於0及小於0。各二維平面係以相同分層簇集順序排列，如圖5A-5C所示，並標記額外之第三微型核糖核酸元件。所有顯示之log₂ 比率係由二生物重複之平均值決定。圖15顯示本文所述基因作用(GI)之定義。協同或緩衝交互作用分別具正及負GI評分，如案例1至7所述。正及負表型之標準化條碼讀值倍數變化分別為大於1及小於1，而倍數變化等於1時無表型變化結果。針對具個別表型“A”與“B”之微型核糖核酸[A]與[B]，逐二組合[A,B]之預期表型為(“A” + “B” - 1)，其係根據加法模型。偏差值之計算係以觀察表型減去預期表型(亦即，觀察表型 – 預期表型)。圖16A-16D顯示miR-16-1/15a 簇、miR-128b 、及let-7e/miR-99b 簇間之協同作用，以調控細胞增生表型。圖16A顯示一給定之逐三微型核糖核酸之組合[A,B,C]之GI評分繪圖，並相較於含二相同微型核糖核酸及每一其他微型核糖核酸庫成員(以X表示)之個別組合。GI評分代表額外之第三微型核糖核酸與改良生物表型之逐二微型核糖核酸之組合間之交互作用。測定三可能排列(亦即，[A,B,C]、[B,C,A]、及[A,C,B])之GI評分。具|Z評分|截止值2以外之GI評分之微型核糖核酸組合視為統計上顯著性(P ＜ 0.05)。於此實例中，A、B、及C分別代表miR-16-1/15a 簇、miR-128b 、及let-7e/miR-99b 簇，且X代表所有39庫成員。測定含miR-16-1/15a 簇、miR-128b 、及/或let-7e/miR-99b 簇之逐三組合之細胞增生表型GI評分，並顯示其修改表型之協同作用。圖16B顯示所有涵蓋miR-16-1/15a簇之逐三微型核糖核酸之組合之細胞增生表型GI評分之GI圖。圖16C顯示所有涵蓋miR-128b之逐三微型核糖核酸之組合之細胞增生表型GI評分之GI圖。圖16D顯示所有涵蓋let-7e/miR-99b 簇之逐三微型核糖核酸之組合之細胞增生表型GI評分之GI圖。其中，經測定無GIs之組合以淺灰色表示。圖17顯示逐三微型核糖核酸之組合具不同多西他賽敏感性與抗增生表型。繪製所有逐三微型核糖核酸之組合之多西他賽(25 nM)處理與載具處理之OVCAR8-ADR細胞(y軸)之標準化條碼計數倍數變化及四天與一天培養細胞(x軸)之倍數變化。各數據點代表二生物重複之平均值。圖18A及18B顯示miR-16-1/15a 簇、miR-128b 、及let-7e/miR-99b 簇之組合表現抑制集落形成，其係藉觀察存活之OVCAR8-ADR細胞。圖18A顯示約10,000個以各指定之微型核糖核酸組合感染之OVCAR8-ADR細胞，其以25 nM之多西他賽處理三天且另外培養十一天後之代表影像。細胞以結晶紫染色，以觀察集落形成及定量。圖18B顯示圖18A各樣本之集落數。能可靠計數之分立集落最大數目為每孔約500個，因此，大於500個集落之樣本係以大於500個集落表示。數據代表平均值± SD (n = 3；*P ＜ 0.05)。圖19顯示匯集篩選與個別命中驗證數據間之高度一致性。多西他賽(25 nM)處理與載具處理之OVCAR8-ADR細胞標準化條碼計數之倍數變化，其取自匯集篩選數據，係對其相對細胞存活力作圖，其中進行各藥物敏感性試驗(R = 0.899)並比較各逐二(菱形)及逐三(三角形)微型核糖核酸之組合與載體對照組。四天與一天培養之細胞(圓形)標準化條碼計數之倍數變化，其取自匯集篩選數據，係對其相對細胞存活力作圖，其中分別進行各藥物敏感性或增生試驗(R = 0.899)並比較各逐三微型核糖核酸之組合與載體對照組。篩選數據係二生物重複之平均值，而個別命中驗證數據代表三獨立實驗之平均值。R為皮爾森相關係數。圖20A-20C顯示miR-16/15a 簇、miR-128b 、及let- 7e/miR-99b 簇之組合表現減少OVCAR8-ADR細胞標靶基因之mRNA量。圖20A顯示表現miR-16/15a 或共表現miR-16/15a 簇、miR-128b 、及let-7e/miR-99b 簇之OVCAR8-ADR細胞之相對mRNA量之RT-qPCR定量。標靶mRNA量係以GAPDH標準化，且數據代表平均值 ± SD (n = 3)。經預測或經驗證含有保留位點之mRNA序列，若符合TargetScan及miRTarBase產生之相對應微型核糖核酸種子區域(seed region)，以中灰色陰影表示，如圖中下方表格所示。藉由比較載體對照組感染之細胞，表現miR-16/15a 簇或共表現miR-16/15a 簇、miR-128b 、及let-7e/miR-99b 簇之細胞之CCND1、CCND3、CCNE1、及CHEK1 mRNA量測得顯著差異(# P ＜ 0.05)。星號代表表現miR-16/15a 簇或共表現miR-16/15a 簇、miR-128b 、及let-7e/miR-99b 簇之細胞間mRNA量之統計上顯著差異(P ＜ 0.05)。圖20B顯示表現由無、單一、雙重、或三重miR-16/15a 簇、miR-128b 、及let-7e/miR-99b 簇組成之不同微型核糖核酸組合之細胞之相對CDC14B mRNA量。共表現let-7e/miR-99b 簇與miR-128b ，或三重miR-16/15a 簇、miR-128b 、及let-7e/miR-99b 簇之細胞之CDC14B mRNA量明顯減少。數據代表平均值± SD (n = 9；*P ＜ 0.05)。圖20C顯示miR-16/15a 簇、miR-128b 、及let-7e/miR-99b 簇調節多重下游標靶及反應OVCAR8-ADR細胞之多西他賽抗藥性及/或增生表型表現變化之潛在角色摘要圖。圖21顯示miR-34a與miR-15b/16-2簇之抗增生作用因不同細胞株而改變。以析光度測定(OD570 - OD650)或MTT試驗確認miR-34a (淺灰色線)、miR-15b/16-2 簇(中灰色線)、或載體對照組(黑線)感染之OVCAR8、OVCAR8-ADR、HOSE11-12、HOSE17- 1、T1074、及MCF7細胞之增生速率。數據代表平均值± SD (n = 3；*P ＜ 0.05)。

無

Claims

一種含一或多個重組型表現載體之組合物，其編碼三微型核糖核酸之組合，其選自於如表7或表10所示之組合。
一種含三微型核糖核酸之組合之組合物，其選自於如表7或表10所示之組合。
如請求項2之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合係串接之微型核糖核酸，可視需要地具一或多個連接子及/或間隔子序列；接合至一或多個奈米顆粒、細胞滲透性胜肽、或聚合物；或者含於微脂體內。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-16-1/15a簇、let-7e/miR-99b簇、及miR-128b。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-181a、及miR-132。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-451a/451b/144/4732簇、miR-211、及miR-132。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-376a、miR-31、及miR-488。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含mir-128b、mir-212、及let-7i或miR-451a/451b/144/4732簇。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含mir128b、miR-451a/451b/144/4732簇、及miR-132或miR-212。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-128b、let-7i、及mir-212或miR-196。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-132、miR-15b/miR-16-2、及miR-31或let-7i。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-132、miR-451a/451b/144/4732簇、及miR-212或miR-128b。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、let-7i、及miR-373或miR-429。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181a、miR-429、及miR-29a或miR-31。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2、let-7i、及miR-132或miR-181a。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-212、miR-451a/451b/144/4732簇、及miR-132或miR-128b。
一種含一或多個重組型表現載體之組合物，其編碼二微型核糖核酸之組合，其係選自於如表3所示之組合，或三微型核糖核酸之組合，其係選自於如表5或表10所示之組合。
一種含二微型核糖核酸之組合之組合物，其係選自於如表3所示之組合，或三微型核糖核酸之組合，其係選自於如表5或表10所示之組合。
如請求項18之組合物，其中該二微型核糖核酸之組合或該三微型核糖核酸之組合係串接之微型核糖核酸，可視需要地具一或多個連接子及/或間隔子序列；接合至一或多個奈米顆粒、細胞滲透性胜肽、或聚合物；或者含於微脂體內。
如請求項17至19中任一項之組合物，其更包含化學治療劑。
如請求項20之組合物，其中該化學治療劑係抗有絲分裂劑/抗微管劑。
如請求項21之組合物，其中該抗有絲分裂劑係多西他賽(docetaxel)。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-16-1/15a簇、let-7e/miR-99b簇、及miR-128b。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-181a、及miR-132。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-451a/451b/144/4732簇、miR-211、及miR-132。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-376a、miR-31、及miR-488。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該二微型核糖核酸之組合包含miR-376a及選自於由miR-16-1/15a簇、miR-212、及miR-31所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該二微型核糖核酸之組合包含miR-216及選自於由miR-181c、let-7a、miR-15b/miR-16-2簇、及miR-181a所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該二微型核糖核酸之組合包含miR-31及miR-181a或miR-376a。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該二微型核糖核酸之組合包含miR-93/106b簇及miR-16-1/15a簇或miR-181a。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該二微型核糖核酸之組合包含miR-181a及選自於由miR-31、let-7i、miR-93/106b簇、miR-373、miR-216、miR-15b/miR-16-2簇、及miR-16-1/15a簇所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該二微型核糖核酸之組合包含miR-16-1/15a簇及選自於由miR-376a、miR-93/10b簇、let-7a、miR-10b、miR-181a、miR-9-1、及miR-99a所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該二微型核糖核酸之組合包含miR-10b及選自於由miR-16-1/15a簇、miR-212、miR-196、及miR-15b/miR-16-2簇所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該二微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-161-2簇及選自於由miR-216、miR-181a、miR-9-1、及miR-10b所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該二微型核糖核酸之組合包含miR181c及miR-9-1或miR-216。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該二微型核糖核酸之組合包含miR-212及miR-376a或miR-10b。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該二微型核糖核酸之組合包含miR-9-1及選自於由miR-15b/miR-16-2簇、miR-16-1/15a簇、miR-324、及miR-181c所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該二微型核糖核酸之組合包含let-7a及miR-16-1/15a簇或miR-216。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含let-7c、miR-451a/451b/144/4732簇、及miR-324或miR376a。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含let-7d、miR-181c、及miR-10b或miR-9-1。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含let-7e/miR-99b簇、miR-15b/miR-16-2簇、及miR-181a或miR-16-1/miR-15a簇。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含let-7e/miR-99b簇、miR-16-1/15a簇、及miR-15b/miR-16-2簇或miR-181c。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含let-7e/miR-99b簇、miR-181a、及miR-324或miR-15b/miR-16-2簇。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含let-7e/miR-99b簇、miR-181c、及miR-429或miR-16-1/15a簇。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含let-7e/miR-99b簇、miR-376a、及miR-199b/3154簇或miR-188。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含let-7i、miR-15b/miR-16-2簇、及miR-451a/451b/144/4732簇或let-7c。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含let-7i、miR-199b/3154簇、及miR-10b或miR-29a。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-10b、miR-15b/miR-16-2簇、及選自於由miR-373、miR-211、及miR-126所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-10b、miR-373、及miR-15b/miR-16-2簇或miR-451a/451b/144/4732簇。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-10b、miR-451a/451b/144/4732簇、及選自於由miR-373、miR-429、及miR-708所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-126、miR-15b/miR-16-2簇、及miR-10b或miR-181a。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-126、miR-181a、及miR-451a/451b/144/4732簇或miR-15b/miR-16-2簇。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-126、miR-181c、及miR-451a/451b/144/4732簇或miR-29a。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-126、miR-29a、及miR-211或miR-181c。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-126、miR-451a/451b/144/4732簇、及miR-181a或miR-181c。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-128b、miR-16-1/15a簇、及miR-181c或miR-31。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-128b、miR-31、及miR-24-2/27a/23a簇或miR-16-1/15a簇。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-128b、miR-324、及miR-216或miR-188。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-16-1/15a簇、及選自於由miR-216、miR-429、miR-451a/451b/144/4732簇、及let-7e/miR-99b簇所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-181a、及選自於由miR-9-1、miR-126、miR-489、let-7e/miR-99b簇、miR-216、及miR-488所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-181c、及miR-328或miR-488。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-216、及選自於由miR-373、miR-16-1/15a簇、及miR-181a所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-373、及選自於由miR-216、miR-9-1、及miR-10b所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-376a、及miR-24-2/27a/23a簇或miR-324。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-451a/451b/144/4732簇、及選自於由let-7a、miR-16-1/15a簇、miR-708、及let-7i所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-488、及miR-181a或miR-181c。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-489、及miR-128b或miR-181a。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-15b/miR-16-2簇、miR-9-1、及miR-181a或miR-373。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-16-1/15a簇、miR-181c、及選自於由miR-489、miR-211、let-7e/miR-99b簇、miR-128b、及miR-29a所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-16-1/15a簇、miR-216、及miR-126或miR-15b/miR-16-2簇。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-16-1/15a簇、miR-451/451b/144/4732簇、及選自於由miR-489、miR-15b/miR-16-2簇、及miR-328所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-16-1/15a簇、miR-489、及miR-181c或miR-451/451b/144/4732簇。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181a、miR-216、及選自於由miR-489、miR-15b/miR-16-2簇、及let-7i所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181a、miR-324、及選自於由miR-708、miR-31、及let-7e/miR-99b簇所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181a、miR-376a、及miR-24-2/27a/23a簇或miR-29c。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181a、miR-451a/451b/144/4732簇、及miR-126或mirR-128b。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181a、miR-488、及miR-15b/miR-16-2簇或miR-29a。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181a、miR-489、及miR-15b/miR-16-2簇或miR-216。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-29a、及選自於由miR-126、miR-16-1/15a簇、及miR-9-1所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-29c、及miR-31或miR-324。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-31、及選自於由miR-328、miR-29c、及miR-99a所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-324、及miR-129-2或miR-29c。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-328、及miR-15b/miR-16-2簇或miR-31。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-376a、及miR-708或miR-212。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-451a/451b/144/4732簇、及選自於由miR-126、miR-196、及miR-9-1所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-488、及miR-15b/miR-16-2簇或miR-132。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-181c、miR-9-1、及選自於由miR-451a/451b/144/4732簇、let-7d、及miR-29a所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-24-2/27a/23a簇、miR-37a、及選自於由miR-328、miR-181a、及miR-15b/miR-16-2簇所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-29a、miR-199b/3154簇、及let-7i或let-7c。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-29a、miR-9-1、及miR-181c或miR-451a/451b/144/4732簇。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-31、miR-376a、及miR-16-1/15a簇或miR-488。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-328、miR-451a/451b/144/4732簇、及let-7e/miR-99b簇或miR-16-1/15a簇。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-373、miR-451a/451b/144/4732簇、及miR-10b或miR-708。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-376a、miR-451a/451b/144/4732簇、及let-7c或miR-9-1。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-451a/451b/144/4732簇、miR-708、及選自於由miR-10b、miR-15b/miR-16-2簇、及miR-373所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
如請求項17至19中任一項之組合物，其中該三微型核糖核酸之組合包含miR-451a/451b/144/4732簇、miR-9-1、及選自於由miR-181c、miR-29a、及miR-376a所組成群組之微型核糖核酸之任一者。
一種增進細胞對化學治療劑敏感性之方法，包含以選自於如表3所示之組合的二微型核糖核酸之組合或選自於如表5或表10所示之組合的三微型核糖核酸之組合接觸該細胞。
如請求項97之方法，更包含以該化學治療劑接觸該細胞。
如請求項97或98之方法，其中該細胞係癌細胞。
如請求項97或98之方法，其中該微型核糖核酸組合係由一或多個重組型表現載體表現。
如請求項97或98之方法，其中該微型核糖核酸組合包含如請求項23至96中任一項所示之微型核糖核酸組合。
一種選自於如表3所示之組合的二微型核糖核酸之組合或選自於如表5或表10所示之組合的三微型核糖核酸之組合及化學治療劑之用途，以製造用於治療個體癌症之藥劑。
如請求項102之用途，其中該微型核糖核酸組合係由一或多個重組型核糖核酸表現載體表現。
如請求項102或103之用途，其中該伴隨微型核糖核酸組合投予之化學治療劑之量係比該未伴隨微型核糖核酸組合投予之化學治療劑的小。
如請求項102或103之用途，其中該微型核糖核酸組合包含如請求項23至96中任一項所示之微型核糖核酸組合。
一種減少細胞增生之方法，包含以選自於如表7或表10所示之三微型核糖核酸之組合接觸細胞。
如請求項106之方法，其中該細胞係癌細胞。
如請求項106或107之方法，其中該微型核糖核酸組合係由一或多個重組型表現載體表現。
如請求項106或107之方法，其中該微型核糖核酸組合包含如請求項4至16中任一項所示之微型核糖核酸組合。
一種選自於如表7或表10所示之組合的三微型核糖核酸之組合之用途，以製造用於治療個體癌症之藥劑。
如請求項110之用途，其中該三微型核糖核酸之組合係由一或多個重組型表現載體表現。
如請求項110或111之用途，其中該微型核糖核酸組合包含如請求項4至16中任一項所示之微型核糖核酸組合。
一種用於辨別增進細胞對藥劑敏感性之微型核糖核酸組合的方法，該方法包含：以複數個由重組型表現載體表現之二或多個微型核糖核酸之組合接觸第一細胞群及第二細胞群；以藥劑接觸該第一細胞群，其中該第二細胞群未與該藥劑接觸；辨別該第一細胞群中該二或多個微型核糖核酸之組合及該第二細胞群中該二或多個微型核糖核酸之組合；比較該第一細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度與該第二細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度；辨別該第一細胞群中消失或豐度減少之二或多個微型核糖核酸之組合，其係對比該第二細胞群中相同之二或多個微型核糖核酸之組合之豐度而言，以作為增進細胞對該藥劑敏感性之微型核糖核酸組合。
如請求項113之方法，其中該增進細胞對該藥劑敏感性之微型核糖核酸組合係與減少細胞增生之微型核糖核酸組合相比，以辨別增進細胞對該藥劑敏感性及減少細胞增生之微型核糖核酸組合。
如請求項113之方法，其中該藥劑係細胞毒性劑。
一種用於辨別增進細胞對藥劑抗藥性之微型核糖核酸組合的方法，該方法包含：以複數個由重組型表現載體表現之二或多個微型核糖核酸之組合接觸第一細胞群及第二細胞群；以藥劑接觸該第一細胞群，其中該第二細胞群未與該藥劑接觸；辨別該第一細胞群中該二或多個微型核糖核酸之組合及該第二細胞群中該二或多個微型核糖核酸之組合；比較該第一細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度與該第二細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度；辨別該第一細胞群中豐度增加之二或多個微型核糖核酸之組合之，其係對比該第二細胞群中相同之二或多個微型核糖核酸之組合之豐度而言，以作為增進細胞對該藥劑抗藥性之微型核糖核酸組合。
如請求項116之方法，其中該藥劑係細胞毒性劑。
如請求項117之方法，其中該細胞毒性劑係化學治療劑。
如請求項118之方法，其中該化學治療劑係抗有絲分裂劑/抗微管劑。
如請求項119之方法，其中該化學治療劑係多西他賽。
一種用於辨別減少細胞增生之微型核糖核酸組合的方法，該方法包含：以複數個由重組型表現載體表現之二或多個微型核糖核酸之組合接觸第一細胞群及第二細胞群；培養該第一細胞群及該第二細胞群，使得該第二細胞群相較於該第一細胞群之培養時間更長；辨別該第一細胞群中該二或多個微型核糖核酸之組合及該第二細胞群中該二或多個微型核糖核酸之組合；比較該第一細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度與該第二細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度；辨別該第二細胞群中消失或豐度減少之二或多個微型核糖核酸之組合，但於該第一細胞群中存在或豐度增加，以作為減少細胞增生之微型核糖核酸組合。
如請求項121之方法，其中該減少細胞增生之微型核糖核酸組合係相較於該增進細胞對藥劑敏感性之微型核糖核酸組合，以辨別減少細胞增生及增進細胞對該藥劑敏感性之微型核糖核酸組合。
一種用於辨別增進細胞增生之微型核糖核酸組合的方法，該方法包含：以複數個由重組型表現載體表現之二或多個微型核糖核酸之組合接觸第一細胞群及第二細胞群；培養該第一細胞群及該第二細胞群，使得該第二細胞群相較於該第一細胞群之培養時間更長；辨別該第一細胞群中該二或多個微型核糖核酸之組合及該第二細胞群中該二或多個微型核糖核酸之組合；比較該第一細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度與該第二細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度；辨別該第二細胞群中存在或豐度增加之二或多個微型核糖核酸之組合，但於該第一細胞群中消失或豐度減少，以作為增進細胞增生之微型核糖核酸組合。
如請求項113至123中任一項之方法，其中該微型核糖核酸表現載體係藉病毒輸送至該第一細胞群及/或該第二細胞群。
如請求項124之方法，其中該病毒係慢病毒。
一種測定微型核糖核酸組合在細胞對藥劑敏感性之協同或拮抗作用及細胞增生之方法，包含： (1) 以複數個由重組型表現載體表現之二或多個微型核糖核酸之組合接觸第一細胞群、第二細胞群、第三細胞群、及第四細胞群； (2) (a) 以藥劑接觸該第一細胞群，其中該第二細胞群未與該藥劑接觸； (b) 培養該第三細胞群及該第四細胞群，使得該第四細胞群相較於該第三細胞群之培養時間更長； (3) 辨別該第一細胞群、該第二細胞群、該第三細胞群、及該第四細胞群中該二或多個微型核糖核酸之組合； (4) (a) 比較該第一細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度與該第二細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度； (b) 比較該第三細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度與該第四細胞群中各二或多個微型核糖核酸之組合之豐度； (5) (a) (1) 辨別該第一細胞群中消失或豐度減少之二或多個微型核糖核酸之組合，其係對比該第二細胞群中相同之二或多個微型核糖核酸之組合之豐度而言，以作為增進細胞對該藥劑敏感性之微型核糖核酸組合；以及 (2) 辨別該第一細胞群中豐度增加之二或多個微型核糖核酸之組合，其係對比該第二細胞群中相同之二或多個微型核糖核酸之組合之豐度而言，以作為增進細胞對該藥劑抗藥性之微型核糖核酸組合； (b) (1) 辨別該第四細胞群中消失或豐度減少之二或多個微型核糖核酸之組合，但於該第三細胞群中存在或豐度增加，以作為減少細胞增生之微型核糖核酸組合；以及 (2) 辨別該第四細胞群中存在或豐度增加之二或多個微型核糖核酸之組合，但於該第三細胞群中消失或豐度減少，以作為增進細胞增生之微型核糖核酸組合； (6) 計算各微型核糖核酸組合在細胞對藥劑敏感性及細胞增生等作用之基因作用評分； (7) 計算各微型核糖核酸組合在細胞對藥劑敏感性及細胞增生等作用之預期表型值；以及 (8) 比較該各微型核糖核酸組合對於細胞對藥劑敏感性及細胞增生等作用之基因作用評分與該各微型核糖核酸組合對於細胞對藥劑敏感性及細胞增生等作用之預期表型值，其中該基因作用評分大於該預期表型值，表示該組合之微型核糖核酸間之協同作用，或其中該基因作用評分小於該預期表型值，表示該組合之微型核糖核酸間之拮抗作用。
如請求項126之方法，其中該預期表型值係根據加法模型或乘法模型計算。