TW201636422A - 荷癌哺乳動物模式的製作方法 - Google Patents

Abstract

本發明係提供包含以下步驟，製作荷癌非人類哺乳動物之方法：(1)在含有可將細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中將癌細胞懸浮培養及(2)將藉由(1)培養獲得之癌細胞移入非人類哺乳動物。

Description

荷癌哺乳動物模式的製作方法

本發明係有關荷癌哺乳動物之製作方法。更詳細而言，本發明係有關以將在特定培養基組成物中懸浮培養之腫瘤細胞移入非人類哺乳動物為特徵之荷癌哺乳動物之製作方法。

小鼠荷癌模式為在評估抗癌劑的活體內藥效評估、評估從癌組織單離之癌細胞或以基因操作等創建之癌細胞在生體內之成育能或轉移能等特性上佔重要位置之實驗系。又，樹立新的人類癌細胞株係為將從患者癌組織調製之初代癌細胞在荷癌模式中藉由繼代培養進行。在人類腫瘤之小鼠荷癌模式中，由於將人類之細胞移殖到小鼠生體內，被移殖之人類癌細胞受到小鼠之免疫攻撃。因此，作為宿主之小鼠使用免疫不全小鼠。通常，免疫不全小鼠使用裸鼠。生育能低之癌細胞必需藉由與構築為基底膜調製物之基質膠(matrigel)等癌微小環境之細胞外基材一同移殖到小鼠，使存活率上昇。於非專利文獻1、2、3、4、5、6，以將單層培養癌細胞在基質膠存在下進行移殖之 方法製作荷癌模式，從癌組織成長為約100mm³進行抗癌劑之投予。於A549以3x10⁶細胞之移殖快且形成高癌組織，可評估抗癌劑，於MCF7細胞，以4x10⁶至5x10⁶細胞之移殖需要飼養4至8週，於JIMT-1細胞，以7.5x10⁶細胞之移殖需要飼養25日，於MCF-7細胞或SKOV3細胞之抗癌劑評估，癌組織從100mm³成長為500mm³(或為抗癌劑投予前之3至4倍)，各需25至30日(約1個月)或17日。又，由於基質膠源自小鼠癌組織，若將人類癌細胞在基質膠存在下進行移殖，則成為與實際人類癌組織內為不同之環境，從在人類外推性之觀點而言，不是可充分滿足之系。另一方面，在未使用基質膠，將在裸鼠之存活率低之癌細胞移殖時，為了樹立在評估抗癌劑實際上可使用之荷癌小鼠，每1隻需要更大量之細胞及長時間之飼養觀察，導致產生實驗結果之精確度零亂、對實驗者造成物理性負擔之問題。又，於免疫耐性低之癌細胞、免疫耐性不明之新穎癌細胞或生育能低之癌細胞，在樹立荷癌小鼠使用更嚴格之免疫不全小鼠，例如NOD-scid小鼠。惟，NOD-scid小鼠對於壓力或病原菌感染之扺抗力弱，在飼養上需細心、注意，作為評估抗癌劑之模式動物之廣用性低。又，最近在開發癌免疫療法及抗腫瘤免疫藥，尋求開發使用非免疫不全之正常小鼠之模式。

以往，為了製作荷癌模式之移殖中使用之癌細胞為在細胞黏著性盤上單層培養後將細胞以胰蛋白酶進行酵素處理、回收使用。又，在將癌組織以膠原酶等進 行酵素處理獲得之細胞分散液中添加基質膠，混合之，用於移殖。於該等方法中，錨定依賴性(anchorage dependence)增殖成為細胞增殖之基幹，導致本來將錨定非依賴性增殖作為基本之癌細胞本來在生體之特性產生變化。另，有在生體內癌組織之生育需要多量之細胞或長時期飼養之情況。因此，以往之荷癌小鼠模式在作為評估抗癌劑模式之廣用性、實驗研究之經濟性、便利性及在臨床之外推性不能獲得滿足。

本發明人等成功的開發實質上不提高液體培養基中之黏度，而是在維持懸浮狀態下，可將細胞或組織以錨定非依賴性培養之培養基組成物(專利文獻1及2)。

[先行技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]WO2014/017513 A1

[專利文獻2]US2014/0106348 A1

[非專利文獻]

[非專利文獻1]Cancer Research, 58, 2825-2831 (1998)

[非專利文獻2]Clinical Cancer Research, 5, 3632-3638 (1999)

[非專利文獻3]Int. J. Cancer, 120, 181-188 (2006)

[非專利文獻4]Clinical Cancer Research, 19, 5413-5422 (2013)

[非專利文獻5]Mol Cancer Ther., 9, 1956-1967 (2010)

[非專利文獻6]Neoplasia, 14, 324-334 (2012)

本發明之目的為提供癌細胞之存活率高，不論有無免疫不全，廣用性高之荷癌哺乳動物之製作方法。又，本發明之目的為提供在臨床上外推性優越之荷癌哺乳動物之製作方法及抗癌劑之篩選方法。

本發明人等發現實質上不提高液體培養基中之黏度，而是在維持懸浮狀態下可培養細胞或組織之培養基組成物中將癌細胞懸浮培養，藉由將其移殖到接收體哺乳動物，可提昇在生體中之存活率及生育能。該結果為以少數癌細胞，可在短時間製作具有大腫瘤組織之荷癌哺乳動物。又，必需與基質膠等細胞外基材一同移殖，否則不會存活之腫瘤未組織化之癌細胞亦可藉由進行上述之懸浮培養，即使在細胞外基材不存在之條件下之移殖，亦可在生體內存活、腫瘤組織化。另，在本液體培養基進行培養，可將癌細胞的細胞凝集塊之大小最適當化，該細胞凝集塊可在不實施胰蛋白酶等酵素處理、不會對細胞造成傷害下回收，使將細胞凝集塊以原狀移殖。

以該等見解為基礎另加以檢討，因而完成本發明。

亦即，本發明為如下所述：

[1]一種荷癌非人類哺乳動物之製作方法，含有下列步驟：(1)在含有可將細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中將癌細胞懸浮培養，及(2)將藉由(1)之培養獲得之癌細胞移入非人類哺乳動物。

[2]如[1]所述之方法，其中，該方法另包含以下之步驟：(3)飼養經移入癌細胞之非人類哺乳動物，從經移入之癌細胞形成腫瘤組織。

[3]如[1]或[2]所述之方法，其中，在(2)中，將經懸濁於含有基底膜調製物之生理水性組成物中之癌細胞移入非人類哺乳動物。

[4]如[1]或[2]所述之方法，其中，在(2)中，將經懸濁於實質上不含基底膜調製物之生理水性組成物中之癌細胞移入非人類哺乳動物。

[5]如[1]至[4]中任一項所述之方法，其中，該非人類哺乳動物為免疫不全非人類哺乳動物。

[6]如[5]所述之方法，其中，該癌細胞對於移入之非人類哺乳動物為同種異系或異種。

[7]如[6]所述之方法，其中，該癌細胞為人類癌細胞。

[8]如[1]至[7]中任一項所述之方法，其中，該癌細胞具有形成固體腫瘤之能力。

[9]如[1]至[8]中任一項所述之方法，其中，上述構造體包含去醯化結蘭膠。

[10]如[9]所述之方法，其中，該培養基組成物中去醯化結 蘭膠之濃度為0.005至0.3%(w/v)。

[11]如[1]至[10]中任一項所述之方法，其中，該培養基組成物於37℃之黏度在8mPa．s以下。

[12]一種抗癌劑之篩選方法，包含下列步驟：(1)於藉由[1]至[11]中任一項所述之方法製作之荷癌非人類哺乳動物中投予被檢化合物；(2)測定於(1)獲得之荷癌非人類哺乳動物中腫瘤組織之大小；(3)將於(2)測定之腫瘤組織大小與未投予被檢化合物之對照荷癌非人類哺乳動物之腫瘤組織大小進行比較。

[13]一種方法，為包含在含有可將細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中將癌細胞懸浮培養，促進該癌細胞在非人類哺乳動物內存活。

藉由本發明可提供廣用性、經濟性、便利性及/或在臨床之外推性優越之荷癌哺乳動物模式。藉由本發明，由於可提昇癌細胞生體內移殖時在生體中之存活率及生育能，可以更少數之癌細胞，在更短時間內製作具有腫瘤組織之荷癌哺乳動物。又，可將必需與基質膠等細胞外基材一同移殖，否則不會存活之未腫瘤組織化之癌細胞在細胞外基材不存在之條件下，在生體內存活、腫瘤組織化。又，實質上不提高液體培養基中之黏度，而是在維持懸浮狀態下可培養細胞或組織之培養基組成物及在含有該組成物之培養基中培養之細胞凝集塊，認為提供與實際生 體中之癌組織內類似之培養環境，可期待更接近實際臨床個案之腫瘤組織再現。又，認為可製作使用非免疫不全動物之荷癌動物模式。藉由本發明之方法製作之荷癌哺乳動物模式可用於癌特性評估、癌個別診斷、抗癌劑評估等。

第1圖表示藉由經移殖之HCT116細胞形成癌組織。縱軸為腫瘤體積。Attach-2D：貼附培養。Low attach：在不含去醯化結蘭膠之培養基中，在細胞非貼附性盤上培養。FP001-3D：在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養。基質膠(Matrigel)：在基質膠存在下移殖。介質(medium)：在基質膠不存在下移殖。

第2圖表示藉由經移殖之HCT116細胞形成癌組織。縱軸表示腫瘤體積。Attach-2D：貼附培養。Low attach：在不含去醯化結蘭膠之培養基中，在細胞非貼附性盤上培養。FP001-3D：在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養。

第3圖表示藉由經移殖之HCT116細胞形成癌組織。縱軸表示腫瘤體積。(FBS)：使用含有FBS之培養基移殖。(-)：使用不含FBS之培養基移殖。二次元：貼附培養。FP001：在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養。

第4圖係在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養後將分散為單一細胞之HCT116細胞在基質膠不存在下進行移殖時抗癌劑對於癌組織形成之效果。縱軸表示腫瘤體積(左圖)及腫瘤組織重量(右圖)。

第5圖係球狀體移殖與單一細胞移殖之間的癌組織形成的比較。將在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之HCT116細胞在基質膠不存在下進行移殖。縱軸表示腫瘤體積。

第6圖係將在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之HCT116細胞以球狀體之狀態，在基質膠不存在下移殖時，曲美替尼(Trametinib)對於癌組織形成之效果。縱軸表示腫瘤體積(左圖)及腫瘤組織重量(右圖)。

第7圖係在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養後將分散為單一細胞之SKOV3細胞在基質膠不存在下進行移殖時之癌組織形成。2D：貼附培養。FP001：在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養。縱軸表示腫瘤體積。

第8圖係在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養後將分散為單一細胞之SKOV3細胞在基質膠不存在下進行移殖時抗癌劑對於癌組織形成之效果。縱軸表示腫瘤體積(左圖)及腫瘤組織重量(右圖)。

第9圖係球狀體移殖及單一細胞移殖之間之癌組織形成的比較。在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之SKOV3細胞在基質膠不存在下進行移殖。縱軸表示腫瘤體積。

第10圖係將在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之SKOV3細胞以球狀體狀態在基質膠不存在下進行移殖時，MK2206對於癌組織形成之效果。縱軸表示腫瘤體積(左圖)及腫瘤組織重量(右圖)。

第11圖係將在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之MCF7細胞以球狀體狀態，在基質膠不存在下進行移殖時，吉非替尼(Gefitinib)對於癌組織形成之效果。

第12圖係將在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之LS123細胞在基質膠存在下(matrigel)或基質膠不存在下(-)進行移殖時之癌組織形成。2D：貼附培養。FP3D：在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養。縱軸表示腫瘤體積。

(1)本發明使用之培養基組成物

本發明提供包含使用可在維持懸浮狀態下培養細胞或組織之培養基組成物，將癌細胞懸浮培養，製作荷癌非人類哺乳動物之技術。該培養基組成物可在維持懸浮狀態下培養為評估對象之癌細胞或含有該癌細胞之組織。該培養基組成物可依照WO2014/017513 A1及US2014/0106348 A1之記載調製。以下，將該培養基組成物稱為培養基組成物I。

細胞為構成動物最基本的單位，其要件為在細胞膜內部具有細胞質及各種細胞小器官。

本發明使用之癌細胞為哺乳動物之癌細胞。哺乳動物可列舉例如小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等齧齒類，兔子等兔子類，豬、牛、山羊、馬、羊等有蹄類，狗、貓等貓類，人類、猴子、短尾小猴、食蟹獼猴、狨、 猩猩屬、黑猩猩等靈長類等。哺乳動物較好為齧齒類(小鼠等)或靈長類，更好為人類。

癌之例不只限於以下之例，可列舉胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、骨髓癌、腎細胞癌、尿道癌、肝癌、膽管癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、精巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、頭蓋咽頭癌、喉頭癌、舌癌、纖維肉瘤、黏膜肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、伊文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、平滑肌肉瘤、横紋肌肉瘤、精原細胞瘤、威爾姆氏腫瘤(Wilms tumor)、神經膠質瘤、星狀細胞瘤、骨髓芽瘤、髓膜瘤、黑色素瘤、神經芽細胞瘤、髓芽瘤、網膜芽細胞瘤、惡性淋巴瘤、源自癌患者之血液等之組織。癌細胞可為從癌患者採取之癌組織以酵素等單離之癌細胞(初代培養)，亦可為經純株化之癌細胞株。癌細胞株之例不只限於以下之例，人類乳癌細胞株可列舉HBC-4、BSY-1、BSY-2、MCF-7、MCF-7/ADR RES、HS578T、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-N、BT-549、T47D，人類子宮頸癌細胞株可列舉HeLa，人類肺癌細胞株可列舉A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522、DMS273、DMS114，人類大腸癌細胞株可列舉Caco-2、COLO-205、HCC-2998、HCT-15、HCT-116、HT-29、KM-12、SW-620、WiDr，人類 前列腺癌細胞株可列舉DU-145、PC-3、LNCaP，人類中樞神經系癌細胞株可列舉U251、SF-295、SF-539、SF-268、SNB-75、SNB-78、SNB-19，人類卵巢癌細胞株可列舉OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3、IGROV-1，人類腎癌細胞株可列舉RXF-631L、ACHN、UO-31、SN-12C、A498、CAKI-1、RXF-393L、786-0、TK-10，人類胃癌細胞株可列舉AGS、MKN45、MKN28、St-4、MKN-1、MKN-7、MKN-74，皮膚癌細胞株可列舉LOX-IMVI、LOX、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、UACC-257、M14，白血病細胞株可列舉CCRF-CRM、K562、MOLT-4、HL-60TB、RPMI8226、SR、UT7/TPO、Jurkat，人類上皮樣癌細胞株可列舉A431，人類黑色素細胞株可列舉A375，人類骨肉瘤細胞株可列舉HOS、MNMG、MNNG/HOS，人類胰臟癌細胞株可列舉BxPC3、COLO-357HPAC、MIAPaCa-2、Panc-1，人類結腸癌細胞株可列舉LS123等。細胞株之例不只限於以下之例，包含HEK293(人類胎兒腎細胞)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、AE-1、3D9、Ns0/1、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(註冊商標)、Vero等。

於本發明，細胞(或細胞凝集塊)及/或組織之懸浮係指細胞(或細胞凝集塊)及/或組織對於培養容器，在底面會接觸但不會附著之狀態(非貼附)。另，於本發明，將細胞(或細胞凝集塊)及/或組織增殖、分化或維持時，對於液體培養基組成物，在不伴隨來自外部之壓力、 振動或在該組成物中之振動、旋轉操作等，將細胞(或細胞凝集塊)及/或組織均一分散於該液體培養基組成物中且呈懸浮狀態之狀態稱為「懸浮靜置」，在該狀態培養細胞(或細胞凝集塊)及/或組織稱為「懸浮靜置培養」。又，於「懸浮靜置」中可懸浮之期間包含在5分鐘以上、1小時以上、24小時以上、48小時以上、7日以上等，惟，只要能保持懸浮狀態，不只限於該等期間。

本發明使用之培養基組成物在可維持或培養細胞或組織之溫度範圍(例如0至40℃)之至少1個點，細胞(或細胞凝集塊)及/或組織可懸浮靜置。本發明使用之培養基組成物較好在25至37℃溫度範圍之至少1個點，最好在37℃，細胞(或細胞凝集塊)及/或組織可懸浮靜置。

是否可懸浮靜置可藉由例如將培養對象細胞以2×10⁴cells/mL之濃度均一分散於評估對象之培養基組成物中，在15mL圓錐管(conical tube)中注入10mL，於37℃靜置至少5分鐘以上(例如1小時以上、24小時以上、48小時以上、7日以上)，觀察該細胞是否維持懸浮狀態進行評估。全細胞中70%以上為懸浮狀態時可結論為維持懸浮狀態。亦可以聚苯乙烯珠(大小500-600μm，Polysciences公司製造)替代細胞進行評估。

本發明使用之培養基組成物為含有可將細胞(或細胞凝集塊)或組織懸浮、培養(較好為懸浮靜置培養)之構造體及培養基之組成物。

本發明使用之培養基組成物較好為在培養時培養基 組成物的交換處理及培養完成後可將細胞(或細胞凝集塊)或組織從培養基組成物回收之組成物，更好為在將細胞(或細胞凝集塊)或組織從培養基組成物中回收時不需任何溫度變化、化學處理、酵素處理、剪切應力之組成物。

本發明之構造體為從特定化合物形成，顯示將細胞(或細胞凝集塊)及/或組織均一懸浮效果者。更詳言之，包含將高分子化合物藉由離子集合者或高分子化合物形成三維網狀結構者等。又，多糖類藉由金屬陽離子形成微凝膠為公知(例如日本專利特開2004-129596號公報)，本發明之構造體作為一態樣，亦包含該微凝膠。

又，作為高分子化合物藉由離子集合者，其一態樣可列舉薄膜狀之構造體。

本發明中構造體之大小在以過濾器過濾時，較好為通過孔徑為0.2μm至200μm之過濾器者。該孔徑之下限更好為超過1μm者，若考慮到將細胞(或細胞凝集塊)或組織安定地懸浮，則更好為超過5μm者。該孔徑之上限更好為在100μm以下者，若考慮到細胞(或細胞凝集塊)或組織之大小，更好為在70μm以下者。

本發明之特定化合物為在將特定化合物與液體培養基混合時形成不定形之構造體，該構造體均一分散於該液體中，具有實質上不提高該液體之黏度，而是將細胞及/或組織實質地保持，防止其沈降效果者。「實質上不提高液體黏度」係指液體之黏度不超過8mPa．s。此時該液體之黏度(亦即，本發明使用之培養基組成物之黏度)於37℃在 8mPa．s以下，較好在4mPa．s以下，更好在2mPa．s以下。另，只要能顯示在液體培養基中形成該構造體，實質上不提高該液體之黏度，而是將細胞(或細胞凝集塊)及/或組織均一懸浮(較好使懸浮靜置)效果者，特定化合物之化學構造、分子量、物性等並無特別限制。

含有構造體之液體之黏度可以例如後述實施例中記載之方法測定。具體而言，為在37℃條件下使用E型黏度計(東機產業(股)公司製造，TV-22型黏度計、機種：TVE-22L、圓錐轉子：標準轉子1°34’×R24、旋轉數100rpm)測定。

本發明使用之培養基組成物為藉由將癌細胞在該培養基組成物中懸浮培養，將此移殖到接收體哺乳動物時可達成提昇在生體之存活率及生育能，不會妨礙藉由特定化合物提高其黏度(液體黏度超過8mPa．s)，較好本發明使用之培養基組成物之黏度實質上不提高(黏度不超過8mPa．s)。本發明使用之培養基組成物之黏度於37℃，在8mPa．s以下，較好在4mPa．s以下，更好在2mPa．s以下。

本發明使用之特定化合物之例並無特別限制，可列舉高分子化合物，較好可列舉具有陰離子性官能基之高分子化合物。

陰離子性官能基可列舉羧基、磺基、磷酸基及該等之鹽，較好為羧基或其鹽。

本發明使用之高分子化合物可使用具有1種或2種以上選自上述陰離子性官能基群者。

本發明使用之高分子化合物之較佳具體例並無特別限制，可列舉10個以上單糖類(例如丙糖、丁糖、戊糖、己糖、庚糖等)聚合之多糖類，更好可列舉具有陰離子性官能基之酸性多糖類。此處所稱之酸性多糖類只要是在其構造中具有陰離子性官能基即可，並無特別限制，例如具有醣醛酸(例如葡萄醣醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸)之多糖類、構造中之一部分具有硫酸基或磷酸基之多糖類或具有該兩方構造之多糖類，不僅為從天然獲得之多糖類，亦包含藉由微生物產生之多糖類、基因工學產生之多糖類或使用酵素，以人工合成之多糖類。更具體而言，可例示由1種或2種以上選自由玻尿酸、結蘭膠、去醯化結蘭膠(以下，亦稱為DAG)、鼠李聚糖膠、大猷坦膠、黃原膠、角叉菜膠、三仙膠、己糖醛酸、褐藻糖膠、果膠、果膠酸、果膠脂酸、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、肝素、硫酸類肝素(heparitin sulfate)、硫酸角質、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸鼠李聚糖及該等之鹽所成群組構成者。多糖類較好為玻尿酸、DAG、大猷坦膠、黃原膠、角叉菜膠或該等之鹽，若考慮到以低濃度使用可將細胞或組織懸浮，且細胞或組織回收容易，則更好為DAG。

此處之鹽可列舉例如為鋰、鈉、鉀之鹼金屬鹽；為鈣、鋇、鎂之鹼土金屬鹽；鋁、鋅、銅、鐵、銨、有機鹼及胺基酸等之鹽。

該等高分子化合物(多糖類等)之重量平均分子量較好為10,000至50,000,000，更好為100,000至20,000,000，最 好為1,000,000至10,000,000。例如，該分子量可由凝膠滲透層析(GPC)，以普路蘭(pullulan)換算測定。

另，DAG可使用經磷酸化者。該磷酸化可以公知之方法進行。

於本發明，可將上述多糖類複數種(較好2種)組合使用。多糖類組合之種類只要可在液體培養基中形成上述構造體，實質上不提高該液體培養基之黏度，而是將細胞(或細胞凝集塊)及/或組織均一懸浮(較好使懸浮靜置)者即可，並無特別限制，該組合較好至少含有DAG或其鹽。亦即，較佳之多糖類組合包含DAG或其鹽及DAG或其鹽以外之多糖類(例如黃原膠、褐藻酸、角叉菜膠、大猷坦膠、甲基纖維素、槐豆膠或該等之鹽)。具體而言，多糖類之組合可列舉DAG與鼠李聚糖膠、DAG與大猷坦膠、DAG與黃原膠、DAG與角叉菜膠、DAG與三仙膠、DAG與槐豆膠、DAG與κ-角叉菜膠、DAG與褐藻酸鈉、DAG與甲基纖維素等，惟，不只限於該等例。

本發明使用之特定化合物更佳之具體例可列舉玻尿酸、去醯化結蘭膠、大猷坦膠、角叉菜膠及黃原膠及該等之鹽，若考慮到可降低培養基組成物之黏度及細胞或組織回收容易度，則更佳之例可列舉去醯化結蘭膠或其鹽。

本發明中之去醯化結蘭膠為將1-3結合之葡萄糖、1-4結合之葡萄醣醛酸、1-4結合之葡萄糖及1-4結合之鼠李糖之4分子的糖作為構成單位之直鏈狀高分子 多糖類，於以下通式(I)中，R₁、R₂同時為氫原子，n表示2以上之整數之多糖類。雖可包含R₁為甘油基、R₂為乙醯基，惟，乙醯基及甘油基之含量較好在10%以下，更好在1%以下。

本發明之構造體根據特定化合物成為種種形態，若對於為去醯化結蘭膠之情況加以記載，則去醯化結蘭膠在與液體培養基混合時取回液體培養基中之金屬離子(例如鈣離子)，藉由該金屬離子形成不定形構造體，將細胞(或細胞凝集塊)及/或組織懸浮。從去醯化結蘭膠調製之本發明使用之培養基組成物之黏度在8mPa．s以下，較好在4mPa．s以下，若考慮到細胞(或細胞凝集塊)或組織回收之容易度，則更好在2mPa．s以下。

本發明之特定化合物亦可以化學合成法獲得，該化合物為天然物時，較好為從含有該化合物之各種植物、各種動物、各種微生物，使用慣用之技術，藉由萃取及分離精製獲得者。於該萃取中，若使用水或超臨界氣體，則可更有效率的萃取該化合物。例如，作為結蘭膠之製造方法，可將生產微生物以發酵培養基培養，將於菌體外生產之黏膜物以通常之精製方法回收、乾燥、粉碎等步 驟後作成粉末狀。又，為去醯化結蘭膠時，只要在將黏膜物回收時施行鹼處理，將結合於1-3結合之葡萄糖殘基之甘油基及乙醯基進行脫醯化後回收即可。精製方法可將例如液體-液體萃取、分別沈澱、結晶化、各種離子交換層析，使用交聯葡聚糖凝膠(sephadex)LH-20等之凝膠過濾層析，藉由活性碳、矽膠等之吸附層析、藉由薄層層析之活性物質吸附解吸附處理或使用逆相管柱之高速液體層析等單獨或以任意順序組合或重複使用，除去不純物精製。作為結蘭膠之生產微生物之例不只限於此，可列舉多沼鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas elodea)及該微生物之基因經改變之微生物。

因此，為去醯化結蘭膠時可使用市售品，例如三晶(股)公司製造之「凱可膠(KELCOGEL)(CP Kelco公司，註冊商標)CG-LA」、三榮源F．F．I(股)公司製造「凱可膠(CP Kelco公司，註冊商標)」等。又，原始型(native type)結蘭膠可使用三榮源F·F．I(股)公司製造之「凱可膠(CP Kelco公司，註冊商標)」HT」等。

培養基中特定化合物之濃度依賴特定化合物之種類，在特定化合物可在液體培養基中形成上述構造體，(較好實質上不提高該液體培養基之黏度)，將細胞(或細胞凝集塊)及/或組織均一懸浮(較好使懸浮靜置)之範圍可適當設定，通常作成0.0005%至1.0%(w/v)，較好為0.001%至0.4%(w/v)，更好為0.005%至0.1%(w/v)，最好為0.005%至0.05%(w/v)即可。例如，為去醯化結蘭膠時，只要在 培養基中添加0.001%至1.0%(w/v)，較好0.003%至0.5%(w/v)，更好0.005%至0.3%(w/v)，更好為0.01%至0.05%(w/v)，最好為0.01%至0.03%(w/v)即可。為黃原膠時，只要在培養基中添加0.001%至5.0%(w/v)，較好0.01%至1.0%(w/v)，更好0.05%至0.5%(w/v)，最好0.1%至0.2%(w/v)即可。為κ-角叉菜膠及槐豆膠混合系時，只要在培養基中添加兩化合物總和為0.001%至5.0%(w/v)，較好0.005%至1.0%(w/v)，更好0.01%至0.1%(w/v)，最好0.03%至0.05%(w/v)即可。為原始型結蘭膠時，只要在培養基中添加0.05%至1.0%(w/v)，較好0.05%至0.1%(w/v)即可。

將上述多糖類複數種(較好2種)組合使用時，該多糖類之濃度可在該多糖類之組合在液體培養基中形成上述構造體(較好實質上不提高該液體培養基之黏度)，將細胞(或細胞凝集塊)及/或組織均一懸浮(較好使懸浮靜置)之範圍適當設定。例如，使用DAG或其鹽與DAG或其鹽以外之多糖類組合時，DAG或其鹽之濃度可例示0.005至0.02%(w/v)，較好0.01至0.02%(w/v)，DAG或其鹽以外之多糖類濃度可例示0.0001至0.4%(w/v)，較好0.005至0.4(w/v)，更好0.1至0.4%(w/v)。

以下例示具體之濃度範圍組合。

DAG或其鹽：0.005至0.02%(較好0.01至0.02%)(w/v)DAG以外之多糖類

黃原膠：0.1至0.4%(w/v)

褐藻酸鈉：0.0001至0.4%(w/v)(較好0.1至0.4%(w/v))

天然結蘭膠：0.0001至0.4%(w/v)

槐豆膠：0.1至0.4%(w/v)

甲基纖維素：0.1至0.4%(w/v)(較好0.2至0.4%(w/v))

角叉菜膠：0.05至0.1%(w/v)

大猷坦膠：0.05至0.1%(w/v)

又，該濃度可以下述之式算出。

濃度[%(w/v)]=特定化合物之重量(g)/培養基組成物之容量(mL)×100

上述化合物可根據化學合成法另轉變為其他衍生物，經由此獲得之該衍生物在本發明中亦可有效地使用。具體而言，為去醯化結蘭膠時，將相當於該通式(I)表示之化合物之R₁及/或R₂之羥基置換為C_1-3烷氧基、C_1-3烷基磺醯基、葡萄糖或果糖等單糖殘基，蔗糖、乳糖等寡糖殘基，甘胺酸、精胺酸等胺基酸殘基等之衍生物亦可於本發明使用。又，可使用1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺(EDC)等交聯劑將該化合物交聯。

本發明使用之特定化合物或其鹽可根據製造條件以任意之結晶形存在，亦可以任意之水合物存在，該等結晶形或水合物及該等之混合物亦包含於本發明之範圍。又，亦有以含有丙酮、乙醇、四氫呋喃等有機溶劑之溶劑化物存在，該等形態都包含於本發明之範圍。

本發明使用之特定化合物亦可以藉由環內或環外異性化生成之互變異構體、幾何異構體、互變異構體或幾何異構體之混合物或該等之混合物形態存在。本發 明之化合物不論是否藉由異構化產生，於具有不對稱中心時，亦可為經分割之光學異構體或將該等以任意比率含有之混合物形態存在。

本發明使用之培養基組成物可存在有金屬離子，例如2價之金屬離子(鈣離子、鎂離子、鋅離子、鐵離子及銅離子等)，較好含有鈣離子。該金屬離子可如例如鈣離子與鎂離子、鈣離子與鋅離子、鈣離子與鐵離子、鈣離子與銅離子方式之將2種以上組合使用。業者可決定適當之組合。於一態樣，藉由在培養基組成物中含有金屬離子(例如鈣離子)，高分子化合物藉由該金屬離子集合；高分子化合物藉由形成三維網狀結構(例如，多糖類藉由金屬離子(例如鈣離子)形成微凝膠)形成本發明之構造體。金屬離子之濃度可在特定化合物在液體培養基中形成上述構造體，(較好實質上不提高該液體培養基之黏度)，將細胞(或細胞凝集塊)及/或組織均一懸浮(較好使懸浮靜置)之範圍適當設定。金屬離子之濃度為0.1mM至300mM，較好為0.5mM至100mM，惟，不只限於此。該金屬離子可與培養基混合或先以其他方法調製鹽溶液，添加於培養基中。本發明使用之培養基組成物亦可含有後述之細胞外基材、貼附分子等。

由本發明使用之特定化合物構成之構造體，在將細胞及/或組織於生體外培養時，顯示將該細胞(或細胞凝集塊)及/或組織懸浮於含有該特定化合物構造體之液體中之效果(較好使懸浮靜置之效果)。藉由該懸浮效 果，與單層培養相比，可增加、培養每一定體積之細胞(或細胞凝集塊)數及/或組織數。又，於以往之懸浮培養方法伴隨旋轉或振動操作時，有由於對細胞(或細胞凝集塊)及/或組織產生剪切應力，導致細胞(或細胞凝集塊)及/或組織之增殖率或回收率降低或細胞之機能受損之情況。惟，藉由使用含有本發明特定化合物構造體之培養基組成物，不進行振動等操作，即可將細胞(或細胞凝集塊)及/或組織均一分散，可容易且大量取得細胞機能無損失之目的細胞(或細胞凝集塊)及/或組織。又，在以往之含有凝膠基材之培養基中將細胞(或細胞凝集塊)及/或組織懸浮培養時，有細胞(或細胞凝集塊)及/或組織之觀察或回收困難、回收時其機能受損之情況。惟，藉由使用含有本發明特定化合物構造體之培養基組成物，可將細胞(或細胞凝集塊)及/或組織懸浮培養，其狀態、機能無受損，可觀察、回收。又，以往之含有凝膠基材之培養基有黏度高、培養基之交換困難之情況。惟，含有本發明特定化合物構造體之培養基組成物由於為低黏度，使用吸管或泵，可容易的將培養基交換。

使用本發明之特定化合物培養細胞(或細胞凝集塊)及/或組織時，可將培養細胞(或細胞凝集塊)及/或組織時使用之培養基與特定化合物混合，調製培養基組成物。根據該等培養基之組成分類可列舉天然培養基、半合成培養基、合成培養基，根據形狀分類可列舉半固體培養基、液體培養基、粉末培養基(以下，亦稱為粉培養基)等。細胞(或細胞凝集塊)及/或組織為源自動物時，只要是培養 動物細胞使用之培養基均可使用。該等培養基可列舉例如達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium；DMEM)、哈姆F12培養基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培養基、麥考伊5A培養基(McCoy’s 5A medium)、伊格爾MEM培養基(Eagles’s Minimum Essential Medium；EMEM)、α MEM培養基(alpha Modified Eagles’s Minimum Essential Medium；α MEM)、MEM培養基(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培養基、伊斯可夫改良達爾伯克培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、MCDB131培養基、威廉培養基E(William’s Medium E)、IPL41培養基、費雪(Fischer’s)培養基、StemPro34(Invitrogen公司製造)、X-VIVO 10(Cambrex公司製造)、X-VIVO 15(Cambrex公司製造)、HPGM(Cambrex公司製造)、StemSpan H3000(Stemcell Technologies公司製造)、StemSpanSFEM(Stemcell Technologies公司製造)、StemlineII(Sigma-Aldrich公司製造)、QBSF-60(Quality Biological公司製造)、StemProhESCSFM(Invitrogen公司製造)、Essential 8(註冊商標)培養基(Gibco公司製造)、mTeSR1或2培養基(Stemcell Technologies公司製造)、利普蘿(Repro)FF或利普蘿FF2(Reprocell公司製造)、PSGro hESC/iPSC培養基(System Biosciences公司製造)、NutriStem(註冊商標)培養基(Biological Industries公司製造)、CSTI-7培養基(細胞科學研究所公司製造)、MesenPRO RS培養基(Gibco公司製造)、MF-Medium(註冊商標)間葉系幹細胞增殖培養基(東洋紡 (股)公司製造)、Sf-900II(Invitrogen公司製造)、Opti-Pro(Invitrogen公司製造)等。

培養癌細胞使用之培養基可在上述培養基中含有細胞貼附因子，其例可列舉基質膠、膠原凝膠、明膠、聚-L-賴胺酸、聚-D-賴胺酸、層黏蛋白、纖維結合素。亦可將2種以上之該等細胞貼附因子組合添加。另，對於培養癌細胞球體使用之培養基，可另將瓜爾膠(guar gum)、褐藻酸丙二醇酯、槐豆膠、阿拉伯樹膠、刺梧桐膠(tara gum)、羅望子膠(tamarind gum)、甲基纖維素等增黏劑混合。

業者可對應目的，自由的在上述培養基中添加鈉、鉀、鈣、鎂、磷、氯、各種胺基酸、各種維生素、抗生物質、血清、脂肪酸、糖等。培養源自動物之細胞(或細胞凝集塊)及/或組織時，業者可對應目的，將一種以上之其他化學成分或生體成分組合添加。

添加於源自動物之細胞(或細胞凝集塊)及/或組織之培養基中之成分可列舉胎牛血清、人類血清、馬血清、胰島素、運鐵蛋白、乳鐵蛋白、膽固醇、乙醇胺、亞硒酸鈉、單硫代甘油、2-巰基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、聚乙二醇、各種維生素、各種胺基酸、瓊脂、瓊脂糖、膠原蛋白、甲基纖維素、各種細胞激素、各種荷爾蒙、各種增殖因子、各種細胞外基材或各種細胞貼附分子等。

添加於培養基中之抗生物質之例可列舉磺胺製劑、盤尼西林(penicillin)、非奈西林(phenethicillin)、甲氧西林(methicillin)、噁唑西林(oxacillin)、氯噁唑西林 (cloxacillin)、雙氯噁唑西林(dicloxacillin)、氟氯噁唑西林(flucloxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、安比西林(ampicillin)、盤尼西林、安莫西林(amoxicillin)、胺環己西林(cyclacillin)、卡苯尼西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、必倍西林(piperacillin)、阿洛西林(azlocillin)、美洛西林(meczlocillin)、美西林(mecillinam)、安迪諾西林(amdinocillin)、頭孢子菌素(cephalosporin)及其衍生物、歐索林酸(oxolinic acid)、氨氟沙星(amifloxacin)、替馬氟沙星(temafloxacin)、萘啶酮酸(nalidixic acid)、吡咯米酸(piromidic acid)、環丙沙星(ciprofloxacin)、西諾沙星(cinoxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、培氟沙星(perfloxacin)、羅索沙星(rosaxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、吡嘧酸(pipemidic acid)、舒巴克坦(sulbactam)、克拉維酸(clavulanic acid)、β-溴青黴烷酸(β-Bromopenicillanic acid)、β-氯青黴烷酸、6-乙醯基亞甲基-青黴烷酸(acetylmethylene-penicillanic acid)、頭孢噁唑(cefoxazole)、舒他西林(sultampicillin)、腺苷(adenosine)及舒巴克坦之甲醛/食品輕質酯(food light ester)、三唑巴坦(tazobactam)、安曲南(aztreonam)、磺胺菌素(sulfazecin)、異磺胺菌素(isosulfazecin)、諾卡殺菌素(nocardicin)、m-羧基苯酚、苯乙醯胺磷酸甲酯、氯四環素(chlortetracycline)、羥四環素(oxytetracycline)、四環素、去甲氯四環(demeclocycline)、多西環素(doxycycline)、美他環素(metacycline)及美諾四環素(minocycline)。

在上述培養基中添加本發明之特定化合物時，首先以適當之溶劑將該特定化合物在用時溶解或分散(將此作為培養基添加劑)。之後，作為培養基中之特定化合物濃度，為如上所述(較好為可實質上不提高該液體培養基之黏度)，可將細胞(或細胞凝集塊)及/或組織均一懸浮(較好使懸浮靜置)之濃度，例如將該培養基添加劑添加於培養基，使成為例如0.0005%至1.0%(w/v)，較好0.001%至0.4%(w/v)，更好0.005%至0.1%(w/v)，最好0.005%至0.05%(w/v)即可。例如，為去醯化結蘭膠時，在培養基中添加0.001%至1.0%(w/v)，較好0.003%至0.5%(w/v)，更好0.005%至0.1%(w/v)、最好0.01%至0.05%(w/v)即可。為黃原膠時，在培養基中添加0.001%至5.0%(w/v)，較好0.01%至1.0%(w/v)，更好0.05%至0.5%(w/v)，最好0.1%至0.2%(w/v)即可。為κ-角叉菜膠及槐豆膠混合系時，在培養基中添加二化合物總和為0.001%至5.0%(w/v)，較好0.005%至1.0%(w/v)，更好0.01%至0.1%，最好0.03%至0.05%(w/v)即可。為去醯化結蘭膠與大猷坦膠之混合系時，在培養基中添加二化合物總和為0.001%至1.0%(w/v)，最好0.005%至0.01%(w/v)即可。為去醯化結蘭膠與甲基纖維素之混合系時，在培養基中添加二化合物總和為0.001%至1.0%(w/v)，最好0.005%至0.2%(w/v)即可。為去醯化結蘭膠與槐豆膠之混合系時，在培養基中添加二化合物總和為0.001%至1.0%(w/v)，最好0.01%至0.1%(w/v)即可。為去醯化結蘭膠與褐藻酸鈉之混合系時，在培 養基中添加二化合物總和為0.001%至1.0%(w/v)，最好0.01%至0.1%(w/v)即可。為去醯化結蘭膠與黃原膠之混合系時，在培養基中添加二化合物總和為0.001%至1.0%(w/v)，最好0.01%至0.1%(w/v)即可。為去醯化結蘭膠與κ-角叉菜膠之混合系時，在培養基中添加二化合物總和為0.001%至1.0%(w/v)，最好0.01%至0.1%(w/v)即可。又，該濃度可以下述之式算出。

濃度[%(w/v)]=特定化合物之重量(g)/培養基組成物之容量(mL)×100

此處，培養基添加劑中使用之適當溶劑之例可列舉水、二甲亞碸(DMSO)、甲醇、乙醇、丁醇、丙醇、丙三醇、丙二醇、丁二醇等各種醇等水性溶劑，惟，不只限於此。此時，特定化合物濃度為0.001%至5.0%(w/v)，較好為0.01%至1.0%(w/v)，更好為0.1%至0.6%(w/v)較佳。此時，可另添加提高該特定化合物之效果同時降低使用時濃度之添加物。該等添加劑之例可添加1種以上之瓜爾膠、褐藻酸丙二醇酯、槐豆膠、阿拉伯樹膠、刺梧桐膠、羅望子膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素、瓊脂糖、羅望籽膠、普路蘭(pullulan)等多糖類。又，該特定化合物在培養時，可在載體表面上固定或擔載於載體內部使用。該特定化合物在提供時或保存時可為任意形狀。該特定化合物可製劑化為如錠劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑之固體，以適當之溶劑及以溶解劑溶解之溶液或如懸濁液之液體或結合於基板或單體之狀態。製劑化時之添加物可列舉對羥基苯甲酸酯 類等防腐劑；乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等賦形劑；硬脂酸鎂、滑石粉等潤滑劑；聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等貼附劑；脂肪酸酯等界面活性劑；丙三醇等可塑劑等。該等添加物不只限於上述者，只要業者可利用者都可自由選擇。又，本發明之特定化合物必要時可施行滅菌處理。滅菌方法並無特別限制，可列舉例如放射線滅菌、環氧乙烷氣體滅菌、高壓釜滅菌、過濾器滅菌等。進行過濾器滅菌(以下，亦稱為過濾滅菌)時過濾器部分之材質並無特別限制，可列舉例如玻璃纖維、尼龍、PES(聚醚碸)、親水性PVDF(聚偏二氟乙烯)、纖維素混合酯、纖維素乙酸酯、聚四氟乙烯等。過濾器細孔之大小並無特別限制，較好為0.1μm至10μm，更好為0.1μm至1μm，最好為0.1μm至0.5μm。該等滅菌處理，特定化合物可為固體形態，亦可為溶液狀態。

藉由上述調製，將特定化合物之溶液或分散液添加於液體培養基，在液體培養基中形成上述構造體，可獲得本發明使用之培養基組成物。培養基通常由於高分子化合物藉由離子集合或高分子化合物為了形成三維網狀結構，含有充分濃度之金屬離子(例如鈣離子等2價金屬離子)，只在液體培養基中添加本發明特定化合物之溶液或分散液，可獲得本發明使用之培養基組成物。或亦可在培養基添加劑(特定化合物之溶液或分散液)中添加培養基。另，本發明使用之培養基組成物可由將特定化合物與培養基成分在水性溶劑(例如含有離子交換水或超純水等 之水)中混合，調製。混合之態樣可列舉(1)將液體培養基與培養基添加劑(溶液)混合、(2)將上述高分子化合物(粉末等固體)在液體培養基中混合、(3)將粉末培養基在培養基添加劑(溶液)中混合、(4)將粉末培養基及上述高分子化合物(粉末等固體)與水性溶劑混合等，惟，不只限於此。為了防止特定化合物在本發明使用之培養基組成物中之分布不均一，較好為(1)或是(4)，或(1)或是(3)之態樣。

將特定化合物溶解於溶劑(例如水、液體培養基等水性溶劑)或在將特定化合物及粉末培養基溶解於溶劑時，為了促進溶解，較好將該混合液加熱。加熱之溫度可列舉例如80℃至130℃，較好為可使加熱滅菌之100℃至125℃(例如121℃)。加熱後將獲得之特定化合物之溶液冷卻至室溫。藉由在該溶液中添加上述之金屬離子(例如鈣離子等2價金屬離子)(例如，將該溶液添加於液體培養基)，形成從該特定化合物構成之上述構造體。或是在將特定化合物溶解於含有上述金屬離子(例如鈣離子等2價金屬離子)之溶劑(例如水、液體培養基等水性溶劑)時，可加熱(例如80℃至130℃，較好100℃至125℃(例如121℃))，將獲得之溶液冷卻至室溫，亦可形成從該特定化合物構成之上述構造體。

雖然例示本發明使用之培養基組成物之調製方法，惟，本發明不只限於該等例。將特定化合物添加於離子交換水或超純水中。如此，在可將該特定化合物溶解之溫度(例如60℃以上、80℃以上，90℃以上)攪拌使溶解至成為透明之狀態。溶解後必要時邊攪拌邊放冷，進行 滅菌(例如於121℃進行20分鐘之高壓釜滅菌)。回到室溫後將在靜置培養中使用之任意培養基邊攪拌(例如均質攪拌機(Homo mixer)等)邊在該培養基中添加上述滅菌後之水溶液，混合至與該培養基成為均一。本水溶液與培養基之混合方法並無特別限制，可列舉例如以吸液等手動之混合，使用電磁攪拌機或機械攪拌器、均質攪拌機、勻漿器等機器之混合。又，亦可於混合後將本發明使用之培養基組成物以過濾器過濾。進行過濾處理時使用之過濾器細孔之大小為5μm至100μm，較好為5μm至70μm，更好為10μm至70μm。

或是將粉末培養基及上述高分子化合物(粉末等固體)與水性溶劑混合，於上述溫度加熱，調製本發明使用之培養基組成物。

例如，調製去醯化結蘭膠時，在離子交換水或超純水中添加去醯化結蘭膠，使成為0.1%至1%(w/v)，較好為0.2%至0.5%(w/v)，更好為0.3%至0.4%(w/v)。又，於另一局面，調製去醯化結蘭膠時，在離子交換水或超純水中添加去醯化結蘭膠，使成為0.1%至1%(w/v)，較好為0.2%至0.8%(w/v)，更好為0.3%至0.6%(w/v)。

如此，只要為可溶解上述去醯化結蘭膠之溫度，在任何溫度均可，例如可在60℃以上，較好在80℃以上，更好在90℃以上(例如80至130℃)邊加熱邊攪拌使溶解至呈透明狀態。溶解後邊攪拌邊放冷，於例如121℃進行高壓釜 滅菌20分鐘。回到室溫後以均質攪拌機等將例如DMEM/F12培養基邊攪拌邊在該培養基中添加本水溶液，使達到所期待之最終濃度(例如最終濃度為0.015%時，0.3%水溶液：培養基之比率為1：19)，均一混合。本水溶液與培養基之混合方法並無特別限制，可列舉例如以吸液等手動之混合、使用電磁攪拌機或機械攪拌器、均質攪拌機、勻漿器等機器之混合。又，亦可於混合後將本發明使用之培養基組成物以過濾器過濾。進行過濾處理時使用之過濾器細孔之大小為5μm至100μm，較好為5μm至70μm，更好為10μm至70μm。

本發明使用之培養基組成物及其製造方法之較佳態樣記載於下。

本發明使用之培養基組成物較好為可將細胞或組織懸浮、培養之培養基組成物，以上述培養基組成物之黏度在8mPa．s以下(37℃條件下)且含有去醯化結蘭膠或其鹽為特徵之培養基組成物。於一態樣，培養基組成物之去醯化結蘭膠或其鹽之濃度為0.01至0.05%(w/v)。於一態樣，該培養基組成物更含有去醯化結蘭膠或其鹽以外之多糖類。於一態樣，該培養基組成物為了去醯化結蘭膠形成可將細胞或組織懸浮、培養之構造體，含有充分濃度之2價金屬離子(例如鈣離子)。該濃度為例如0.1mM至300mM，較好為0.5mM至100mM。

該培養基組成物可藉由將去醯化結蘭膠或其鹽與培養基混合製造之。於一態樣，該培養基為液體培 養基。於一態樣，該液體培養基為了去醯化結蘭膠形成可將細胞或組織懸浮、培養之構造體，含有充分濃度之2價金屬離子(例如鈣離子)。該濃度為例如0.1mM至300mM，較好為0.5mM至100mM。於一態樣，將溶解或分散於溶劑之去醯化結蘭膠或其鹽與培養基混合。於一態樣，溶解或分散於溶劑中之去醯化結蘭膠或其鹽為經滅菌之狀態。於一態樣，滅菌藉由高壓釜滅菌進行，於另一態樣，滅菌藉由過濾滅菌進行。於一態樣，過濾滅菌藉由通過0.1至0.5μm之過濾器實施。

(2)製作荷癌非人類哺乳動物之方法

本發明提供包含以下步驟，製作荷癌非人類哺乳動物之方法：(1)將癌細胞在培養基組成物I中懸浮培養及(2)將藉由(1)之培養獲得之癌細胞移入非人類哺乳動物。

藉由將癌細胞在培養基組成物I中進行懸浮培養，在移入非人類哺乳動物時提昇癌細胞在生體內之存活率或生育率。本發明亦包含促進該等癌細胞在非人類哺乳動物存活之方法。

本發明使用之癌細胞較好為在生體內存活時具有形成固體腫瘤能力之癌細胞。

具有形成固體腫瘤能力之癌細胞可列舉胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、胰臟癌、乳癌、 卵巢癌、前列腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、尿道癌、肝癌、膽管癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、精巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、頭蓋咽頭癌、喉頭癌、舌癌、纖維肉瘤、黏膜肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、伊文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横紋肌肉瘤、精原細胞瘤、威爾姆氏腫瘤、神經膠質瘤、星狀細胞瘤、髓膜瘤、黑色素瘤、神經芽細胞瘤、髓芽瘤、視網膜芽細胞瘤等之細胞，惟，不只限於此，具有形成固體腫瘤能力之癌細胞較好為源自上皮細胞之惡性腫瘤，亦即為癌腫(carcinoma)細胞(例如大腸癌、乳癌、卵巢癌、結腸癌)。

本發明使用之癌細胞對於移入之接收體非人類哺乳動物，可為同種同系(syngenic)、同種異系(allogenic)、異種(xenogenic)中之任一種。若以本發明提昇在生體內不易存活之癌細胞存活率之效果為借鏡，癌細胞對於移入之接收體非人類哺乳動物為同種異系或為異種，更好為異種。於一態樣，本發明使用之癌細胞為人類癌細胞。

於步驟(1)，將癌細胞在上述培養基組成物I中懸浮培養之(較好為靜置懸浮培養)。

將癌細胞懸浮培養時可使用通常培養細胞使用之盤、燒瓶、塑膠袋、鐵氟龍(註冊商標)袋、皿、培養皿、組織培養用培養皿、多皿、微量盤、微孔盤、多盤、 多孔盤、腔式載玻片、細胞培養燒瓶、攪拌瓶、管、托盤、培養袋、滾瓶等培養器材進行培養。該等培養基材以細胞低貼附性者較佳。細胞非貼附性之培養容器可使用培養容器之表面不進行以提昇與細胞貼附性為目的之人工處理(例如藉由細胞外基材等進行塗覆處理)者，或培養容器之表面進行以降低與細胞之貼附性為目的之人工處理者。

上述癌細胞之培養可在機械控制下，在封閉環境下自動實行細胞播種、培養基交換、細胞影像取得、培養細胞回收，在邊控制pH值、溫度、氧濃度等邊藉由可以高密度培養之生物反應器或自動培養裝置進行。

培養之癌細胞之形態或狀態，該業者可任意選擇。其較佳之具體例並無特別之限制，可列舉癌細胞以單一細胞之狀態分散於培養基組成物I中之狀態、癌細胞貼附於載體表面上之狀態、癌細胞包埋於載體內部之狀態、複數個癌細胞集合形成細胞凝集塊(球體)之狀態等。癌細胞較好為以單一細胞之狀態分散於培養基組成物I中之狀態或複數個細胞集合，形成細胞凝集塊(球體)之狀態在培養基組成物I中懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)。亦即，較好不使用將癌細胞貼附或包埋之載體。該等狀態中，形成細胞凝集塊(球體)之狀態為再構築接近生體內環境之細胞-細胞間相互作用及細胞構造體，可在長期維持細胞機能下培養且細胞之回收比較容易，所以較佳。又，球體之大小，作為最大徑之平均值較好在500μm以下，最好在50至100μm。

形成細胞凝集塊(球體)之方法並無特別限制，業者可適當選擇。該等例可列舉使用具有細胞非貼附表面之容器之方法、懸滴法、旋轉培養法、三維支架法(scaffold method)、離心法、藉由電場或磁場凝集之方法等。

可使用培養組成物I形成球體。例如，球體可藉由將作為目的之癌細胞藉由細胞分散用酵素處理，作為單一細胞回收後均一分散於培養組成物I，靜置3日至10日，進行懸浮培養而調製。此處調製之球體可藉由離心或過濾處理回收。

於培養癌細胞時，對於上述培養組成物I可添加其他方法調製之癌細胞，混合，使均一分散。此時之混合方法並無特別限制，可列舉例如吸液等之手動混合、使用攪拌器、渦旋混合器(vortex mixer)、微量盤混合器、振動機等之機器混合。混合後可將獲得之癌細胞懸濁液靜置培養，必要時可將培養液旋轉、振動或攪拌。其旋轉數及頻率可配合業者之目的適當設定。又，在靜置培養期間培養基組成物必需交換時，可藉由進行離心或過濾處理，將癌細胞與培養基組成物分離後在細胞中添加新鮮之培養基組成物I。或可藉由離心或過濾處理，將癌細胞適當濃縮後在該濃縮液中添加新鮮之上述培養基組成物I。

於一態樣，在懸浮培養貼附性癌細胞時，例如將該癌細胞從繼代培養回收，將其分散為單一細胞或至接近單一細胞之狀態。癌細胞之分散使用適當之細胞解離液進行。細胞解離液可將例如EDTA、胰蛋白酶、膠原 酶IV、金屬蛋白酶等蛋白質分解酵素等單獨或適當組合使用。將經分散之貼附性癌細胞懸濁於培養基組成物I，將此懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)。培養物中癌細胞以單一細胞之狀態或以球體之狀態邊懸浮於培養基組成物I中邊進行增殖。於該培養較好使用細胞非貼附性培養器，惟，不只限於此。

在培養基組成物I中培養癌細胞之期間只要能充分提昇該癌細胞在非人類哺乳動物內之存活即可，並無特別限制，通常在1日以上，較好在3日以上，更好在6日以上。培養期間之上限在理論上為無限，惟，從避免導致癌細胞形質產生變化之觀點，較好例如在約30日以內，較好停留在約10日以內。

培養癌細胞時之溫度通常為25至39℃，較好為37℃。CO₂濃度通常在培養之大氣中為4至10體積%，較好為5體積%。氧濃度在培養之大氣中為15至50體積%，較好為20體積%。

藉由該等培養操作，可獲得於生體內之存活提昇之癌細胞。

接著，將藉由該培養獲得之癌細胞移入非人類哺乳動物。

非人類哺乳動物的種類並無特別限制，可列舉例如小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等齧齒類，兔子等兔子類，豬、牛、山羊、馬、羊等有蹄類，狗、貓等貓類，猴子、短尾小猴、食蟹獼猴、狨、猩猩屬、黑猩猩等靈長 類等。哺乳動物較好為齧齒類(小鼠、大鼠等)。

於一態樣，非人類哺乳動物較好為免疫不全，惟，不只限於此。藉由使用免疫不全非人類哺乳動物，可迴避將同種異系或異種之癌細胞移入時之排斥反應，促進癌細胞之存活。免疫不全非人類哺乳動物可列舉例如裸鼠、SCID小鼠、IL-2Rg KO小鼠、NOD/Shi小鼠、NOD/Shi-SCID小鼠、NOD/SCID小鼠、NOG小鼠、RAG2 KO小鼠、RAG2 IL-2Rg dKO小鼠等，惟，不只限於此。非免疫不全動物可列舉C57BL/6J小鼠、C3H/HeN小鼠等。

於本發明，由於藉由將癌細胞在培養基組成物I中進行懸浮培養，在移入非人類哺乳動物時，提昇於生體內癌細胞之存活率或生育率，即使對於以往非使用嚴重免疫不全非人類動物(例如NOD/SCID)，否則不能在生體內形成腫瘤組織之癌細胞，使用免疫不全程度比較緩和之免疫不全非人類動物(例如裸鼠)，亦可在生體內形成腫瘤組織。又，藉由將以往以裸鼠製作荷癌小鼠模式之癌細胞移殖到正常免疫非人類動物(例如BALB/c、C57BL/6j)，亦可在生體內形成腫瘤組織。

癌細胞移入非人類哺乳動物通常為將癌細胞懸濁於生理性水性組成物，將獲得之懸濁物移入非人類哺乳動物之體內。可將癌細胞以胰蛋白酶等蛋白質或EDTA等螯合劑處理，分散為單一細胞後懸濁於生理性水性組成物中，移入體內，亦可以球狀體狀態懸濁於生理性水性組成物中，移入體內。以球狀體狀態移入者有癌組織 形成更亢進之傾向，以單一細胞狀態移入者有癌細胞在抗癌劑之感受性提高之傾向。生理性水性組成物包含生理性水溶液及生理性水性凝膠。生理性水溶液可列舉磷酸緩衝液、碳酸鹽緩衝液、檸檬酸緩衝液、Tris緩衝液、硼酸鹽緩衝液之生理性緩衝液或細胞培養用之培養基等。水性凝膠可列舉含有細胞外基材構成因子(蛋白聚醣(Aggrecan)等蛋白多糖(proteoglycan)；透明質酸等糖胺聚多糖；膠原蛋白、彈力素等蛋白質纖維或該等之混合物(例如基底膜調製物)等)、多糖類(瓊脂糖等)之凝膠。基底膜調製物係指將具有基底膜形成能之同種或異種之所期待之細胞在其上面播種/培養時具有控制細胞之形態、分化、增殖、運動、機能表現等機能之經分離之基底膜。基底膜調製物可由例如具有將藉由基底膜貼附於載體上之基底膜形成能之細胞使用具有該細胞脂質溶解能之溶液或鹼性溶液等，從載體除去，製作之。基底膜調製物可列舉基質膠(Corning公司製品)。藉由使用水性凝膠，可抑制移殖到生體內之癌細胞分散。

於一態樣，將移殖到含有細胞外基材構成因子之生理性水性組成物(例如水性凝膠)之癌細胞懸濁。藉由使用細胞外基材構成因子，促進經移殖的癌細胞在生體內之存活。

本發明使用之細胞外基材構成因子較好經單離。「單離」係指進行除去為目的之成分或細胞以外之因子之操作，脫離存在於天然之狀態。「經單離之蛋白質X」 之純度(蛋白質X之重量在總蛋白質重量中占有之百分比)通常在70%以上，較好在80%以上，較好在90%以上，、更好在99%以上，最好為100%。因此，「經單離之細胞外基材構成因子」不包含從移殖之癌細胞產生之該癌細胞或懸濁液中含有之內在性細胞外基材構成因子。於一態樣，本發明包含提供含有經單離之細胞外基材構成因子之生理性水性組成物(例如水性凝膠)之步驟。

使用含有細胞外基材構成因子之生理性水性組成物時，該組成物中之細胞外基材構成因子濃度只要能促進移殖之癌細胞之存活即可，並無特別限制，通常為1至10mg/mL，較好為約2至4mg/mL。將基質膠(商品名，康寧(Corning)公司製造)作為細胞外基材使用時，較好稀釋至約25至50%(v/v)使用。

於一態樣，將經移殖之癌細胞懸濁於實質上不含經單離之細胞外基材構成因子之生理性水性組成物。於本發明，由於藉由將癌細胞在培養基組成物I中進行懸浮培養，在移入非人類哺乳動物時，提昇於生體內癌細胞之存活率或生育率，對於以往非懸濁於含有細胞外基材構成因子之生理性水性組成物而移殖，否則於生體內不能形成腫瘤組織之癌細胞，使用實質上不含細胞外基材構成因子之生理性水性組成物，可於生體內形成腫瘤組織。

「實質上不含經單離之細胞外基材構成因子」係指生理性水性組成物中經單離之細胞外基材構成因子濃度低於促進移殖之癌細胞存活之濃度。更具體而言， 「實質上不含經單離之細胞外基材構成因子之生理性水性組成物」中之經單離之細胞外基材構成因子濃度通常在0.01%(w/v)以下，較好在0.001%(w/v)以下，更好在0.0001%(w/v)以下，最好為0%(w/v)。

又，「實質上不含經單離之細胞外基材構成因子之生理性水性組成物」容許含有從移殖之癌細胞產生之該癌細胞或懸濁液中含有之內在性細胞外基材構成因子。又，「經單離之細胞外基材構成因子濃度」不包含從移殖之癌細胞產生之該癌細胞或懸濁液中含有之內在性的細胞外基材構成因子之濃度。

生理性水性組成物可含亦可不含血清。從形成更大癌組織之觀點而言，較好使用含有血清之生理性水性組成物。含有血清時，其濃度並無特別限制，通常為0.1至20(v/v)%。另一方面，從迴避未決定之成分混入之觀點而言，較好使用不含血清之生理性水性組成物。於本發明，由於藉由將癌細胞在培養基組成物I中進行懸浮培養，在移入非人類哺乳動物時，提昇於生體內癌細胞之存活率或生育率，對於以往不懸濁於含有血清之生理性水性組成物而移殖，否則於生體內不能形成充分大之腫瘤組織之癌細胞，使用不含血清之生理性水性組成物，可於生體內形成腫瘤組織。

於本發明使用之生理性水性組成物包含以下之態樣。

‧含有細胞外基材構成因子及血清。

‧實質上不含經單離之細胞外基材構成因子，含有血清。

‧含有細胞外基材構成因子，不含血清。

‧實質上不含經單離之細胞外基材構成因子，亦不含血清。

將癌細胞懸濁於生理性水性組成物時，懸濁液中癌細胞之濃度可在移入接收體非人類哺乳動物內時可形成腫瘤組織之範圍適當設定，通常為約0.01至1x10⁸cells/mL。

移入接收體非人類哺乳動物內之癌細胞之個數，可在於該非人類哺乳動物內可形成腫瘤組織之範圍適當設定，通常為約0.1至10x10⁶cells/隻。於本發明，由於藉由將癌細胞在培養基組成物I中進行懸浮培養，在移入非人類哺乳動物時，提昇於生體內癌細胞之存活率或生育率，因此，以比不使用培養基組成物I時更少之細胞數即可形成同程度大小之腫瘤組織。

癌細胞移入之部位只要在接收體非人類哺乳動物內可形成腫瘤組織者即可，並無特別限制，可為同位移殖，亦可為異位移殖。異位移殖時癌細胞移入之部位並無特別限制，可列舉皮下、皮內、肌肉內、靜脈內、腹腔內等。由於移殖技術簡便，所形成之腫瘤組織容易以肉眼觀察，癌細胞較好移入皮下。

癌細胞移入後必要時，接收體非人類哺乳動物通常可以SPF或無菌條件下飼養。藉由將接收體非人類哺乳動物在規定期間飼養，從移入之癌細胞形成腫瘤組織。飼養條件並無特別限制，具體而言可例示溫度條件為 20至26℃、濕度條件為30至70%、給餌‧給水條件：自由攝取、照明循環：12小時明暗循環。

飼養期間只要可從移入之癌細胞形成腫瘤組織即可，並無特別限制，通常將接收體非人類哺乳動物飼養從移殖起飼養3日以上，較好3週以上。

藉由本發明之方法製作之荷癌非人類哺乳動物有用於作為抗癌劑之篩選、評估用於治療或預防癌症之醫藥品等。

(3)抗癌劑之篩選方法

本發明提供包含以下步驟之抗癌劑之篩選方法：(1)於藉由上述本發明之方法製作之荷癌非人類哺乳動物投予被檢物質；(2)測定於(1)獲得之荷癌非人類哺乳動物中腫瘤組織之大小；(3)將於(2)測定之腫瘤組織之大小與未投予被檢化合物之對照荷癌非人類哺乳動物之腫瘤組織之大小進行比較。

被檢物質可為任何公知化合物及新穎化合物，可列舉例如核酸、糖質、脂質、蛋白質、肽、有機低分子化合物、使用組合化學(Combinatorial chemistry)技術製作之化合物庫(libray)、隨機肽庫(random peptide library)、隨機核酸庫或源自微生物、動植物、海洋生物等之天然成分等。又，亦可為擔載上述物質之人工高分子。

被檢物質之投予形態為含有甲基纖維素(MC)、或羧甲基纖維素(CMC)、聚乙二醇(PEG)或乙醇(EtOH)等介質之水溶液之溶液或懸濁液等，惟，不只限於此。又，被檢物質之投予路徑有經口、皮下、腹腔內、靜脈內、門靜脈內等，惟，不只限於此。被檢物質之投予期間為用於評估其效果之充分期間，其間，荷癌非人類哺乳動物以業者各個研究機關之實驗動物倫理規定為基礎飼養之。飼養期間通常在3日以上，較好在10日以上，更好在21日以上。

飼養後測定於投予該被檢物質之荷癌非人類哺乳動物中腫瘤組織之大小。腫瘤組織大小之測定方法於業者為周知。

接著，將投予被檢物質之荷癌非人類哺乳動物中腫瘤組織之大小與未投予被檢化合物之對照荷癌非人類哺乳動物腫瘤組織之大小進行比較。腫瘤組織大小之比較較好以有無統計學上顯著差異為基礎進行。又，於未添加被檢物質之對照荷癌非人類哺乳動物腫瘤組織之大小，對於投予被檢物質之荷癌非人類哺乳動物中腫瘤組織之大小之測定可為事前測定者，亦可為同時測定者，從實驗之精確度、再現性之觀點而言，較好為同時測定者。

比較之結果，藉由添加該被檢物質，可選擇使腫瘤組織大小為較小之物質作為抗癌劑之候補物質(尤其是對於移入之癌細胞有效之抗癌劑之候補物質)。

將此處敍述之專利及記載包含專利申請說 明書之所有刊物之內容於此引用，所有與明示同程度的編入本說明書中。

[實施例]

以下，將本發明使用之培養基組成物之分析例、試驗例作為實施例具體陳述，將本發明更詳細的說明，惟，本發明不只限於此。

[參考例1] 製造含有去醯化結蘭膠之培養基

依照WO2014/017513A1記載之製造方法調製細胞懸浮培養中使用之培養基組成物。亦即，將去醯化結蘭膠粉末溶解於純水，使成為0.3%(w/v)。溶解係藉由加熱攪拌器邊加熱攪拌邊使沸騰進行，之後將獲得之去醯化結蘭膠水溶液於一晚回到室溫後以高壓鍋滅菌。在各細胞之推薦培養基中強力注入培養基量20分之1容量之上述0.3%(w/v)去醯化結蘭膠水溶液，馬上強力攪拌使混合分散。

[試驗例1] 細胞培養

將人類大腸癌細胞株之HCT116細胞於含有10% FBS之McCoy’s 5A培養基中進行單層培養。將細胞以胰蛋白酶處理後在含有10% FBS之McCoy’s 5A培養基中以1至5x10⁷cells/mL懸濁。於含有0.015%(w/v)去醯化結蘭膠及10%(v/v)FBS之McCoy’s 5A培養基中添加該細胞懸濁液， 使成為1至5x10⁵cells/mL，均一懸濁。將獲得之細胞懸濁液播種於細胞非貼附培養皿或盤，將細胞懸浮靜置培養。每3日交換1次培養基，培養6日。培養基之交換為將含有細胞之培養液回收於離心管，於McCoy’s 5A培養基稀釋為2-3倍，以1500rpm離心5分鐘，回收下層之10%(v/v)細胞。將含有該細胞之層再懸濁於稀釋前初期量2倍以上之含有0.015%(w/v)去醯化結蘭膠及10%(v/v)FBS之McCoy’s 5A培養基，播種於細胞非貼附培養皿或盤，將細胞繼續懸浮靜置培養。

[試驗例2] 培養後之細胞回收

將含有於試驗例1培養之HCT116細胞之培養液回收於離心管，以500rpm離心1分鐘。回收非沈降上清分液，於McCoy’s 5A培養基或PBS稀釋為2至3倍，以1500rpm離心5分鐘，回收下層之10%(v/v)細胞。另，懸濁於殘渣5至10倍容量之McCoy’s 5A培養基或PBS，再次以1500rpm離心5分鐘，回收沈降之細胞。將細胞再懸濁於少量之McCoy’s 5A培養基，獲得球體細胞懸濁液。將胰蛋白酶溶液以1：1(v/v)添加於本細胞液中，於37℃處理5分鐘後添加含有10%(v/v)FBS之McCoy’s 5A培養基使FBS最終濃度為1%(v/v)，以1000rpm離心分離3分鐘，將沈降之細胞再次懸濁於少量之McCoy’s 5A培養基，獲得單一化細胞懸濁液。

[試驗例3] 細胞培養

將人類卵巢癌細胞株之SKOV3細胞於含有10%(v/v)FBS之McCoy’s 5A培養基中進行單層培養。將細胞以胰蛋白酶處理後以1至5x10⁷cells/mL懸濁於含有15%(v/v)FBS之McCoy’s 5A培養基。於含有0.015%(w/v)去醯化結蘭膠及15%(v/v)FBS之McCoy’s 5A培養基中添加細胞懸濁液，使成為1至5x10⁵cells/mL，均一懸濁。將獲得之細胞懸濁液播種於細胞非貼附培養皿或盤，將細胞懸浮靜置培養。每3日交換1次培養基，將細胞培養6日。培養基之交換為將含有細胞之培養液回收於離心管，於McCoy’s 5A培養基稀釋為2至3倍，以1500rpm離心5分鐘，回收下層之10%(v/v)細胞。將含有該細胞之層再懸濁於稀釋前初期量2倍以上之含有0.015%(w/v)去醯化結蘭膠及15%(v/v)FBS之McCoy’s 5A培養基，播種於細胞非貼附培養皿或盤，將細胞繼續懸浮靜置培養。

[試驗例4] 培養後之細胞回收

將含有於試驗例3培養之SKOV3細胞之培養液回收於離心管，以500rpm離心1分鐘。回收非沈降上清分液，於McCoy’s 5A培養基或PBS稀釋為2至3倍，以1500rpm離心5分鐘，回收下層之10%(v/v)細胞。另，懸濁於殘渣5 至10倍容量之McCoy’s 5A培養基或PBS，再次以1500rpm離心5分鐘，回收沈降之細胞。將細胞再懸濁於少量之McCoy’s 5A培養基，獲得球體細胞懸濁液。將胰蛋白酶溶液以1：1(v/v)添加於本細胞液中，於37℃處理5分鐘後添加含有10%(v/v)FBS之McCoy’s 5A培養基使FBS最終濃度為1%，以1000rpm離心分離3分鐘，將沈降之細胞再次懸濁於少量之McCoy’s 5A培養基，獲得單一化細胞懸濁液。

[試驗例5] 細胞培養

將人類乳癌細胞株之MCF7細胞於10%(v/v)FBS、含有1%非必需胺基酸(non-essential amino acid(NEAA))之E-MEM培養基中進行單層培養。將細胞以胰蛋白酶處理後以1至5x10⁷cells/mL懸濁於含有10%(v/v)FBS、含有1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基。於含有0.015%(w/v)去醯化結蘭膠、10%(v/v)FBS及1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基中添加細胞懸濁液，使成為1至5x10⁵cells/mL，均一懸濁。將獲得之細胞懸濁液播種於培養皿或盤，將細胞懸浮靜置培養。每3日交換1次培養基，將細胞培養6日。培養基之交換為將含有細胞之培養液回收於離心管，於含有1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基稀釋為2至5倍，以1500rpm離心5分鐘，回收下層之10%(v/v)細胞。將含有該細胞之層再懸濁於稀釋前初期量2倍以上之含有0.015%(w/v)去 醯化結蘭膠、10%(v/v)FBS及1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基，播種於培養皿或盤，將細胞繼續懸浮靜置培養。

[試驗例6] 培養後之細胞回收

將含有於試驗例5培養之MCF7細胞之培養液回收於離心管，以500rpm離心1分鐘。回收非沈降上清分液，於含有1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基或PBS稀釋為2至3倍，以1500rpm離心5分鐘，回收下層之10%(v/v)細胞。另，懸濁於殘渣5至10倍容量之含有1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基或PBS，再次以1500rpm離心5分鐘，回收沈降之細胞。將細胞再懸濁於少量之含有1% NEAA之E-MEM培養基，獲得球體細胞懸濁液。將胰蛋白酶溶液以1：1(v/v)添加於本細胞液中，於37℃處理5分鐘後添加含有10%(v/v)FBS含有1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基使FBS最終濃度為1%，以1000rpm離心分離3分鐘，將沈降之細胞再次懸濁於少量之含有1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基，獲得單一化細胞懸濁液。

[試驗例7]

將人類結腸癌細胞株之LS123細胞於含有10%(v/v)FBS、1%非必需胺基酸(NEAA)之E-MEM培養基中進行單層培養。將細胞以胰蛋白酶處理後以1至5x10⁷cells/mL懸濁於含有10%(v/v)FBS、含有1%(v/v)NEAA之E-MEM培 養基。於含有0.015%(w/v)去醯化結蘭膠、10%(v/v)FBS及1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基中添加細胞懸濁液，使成為1至5x10⁵cells/mL，均一懸濁。將獲得之細胞懸濁液播種於培養皿或盤，將細胞懸浮靜置培養。每3日交換1次培養基，將細胞培養6日。培養基之交換為將含有細胞之培養液回收於離心管，於含有1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基稀釋為2至5倍，以1500rpm離心5分鐘，回收下層之10%(v/v)細胞。將含有該細胞之層再懸濁於稀釋前初期量2倍以上之含有0.015%(w/v)去醯化結蘭膠、10%(v/v)FBS及1% NEAA之E-MEM培養基，播種於培養皿或盤，將細胞繼續懸浮靜置培養。

[試驗例8] 培養後之細胞回收

將含有於試驗例7培養之LS123細胞之培養液回收於離心管，以500rpm離心1分鐘。回收非沈降上清分液，於含有1% NEAA之E-MEM培養基或PBS稀釋為2至3倍，以1500rpm離心5分鐘，回收下層之10%(v/v)細胞。另，懸濁於殘渣5至10倍容量之含有1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基或PBS，再次以1500rpm離心5分鐘，回收沈降之細胞。將細胞再懸濁於少量之含有1% NEAA之E-MEM培養基，獲得球體細胞懸濁液。將胰蛋白酶溶液以1：1(v/v)添加於本細胞液中，於37℃處理5分鐘後添加含有10%(v/v)FBS、含有1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基使FBS最 終濃度為1%(v/v)，以1000rpm離心分離3分鐘，將沈降之細胞再次懸濁於少量之含有1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基，獲得單一化細胞懸濁液。

[試驗例9] 荷癌模式之製作

將於試驗例2、4、6及8獲得之各癌細胞以含有10% FBS或未含有FBS之培養基(McCoy’s 5A培養基或含有1% NEAA之E-MEM培養基)稀釋，使成為0.5至5x10⁶cells/隻/150μL(或200μL)。於基質膠共存移殖為將細胞懸濁液及基質膠以1：1(v：v)混合，使細胞濃度成為上述之2倍。

從日本克雷亞(CLEA)公司購入7週齡之雌BALB/c-nu/nu(裸鼠)小鼠。在異氟醚麻醉下於動物之肩皮下注入各癌細胞。細胞注入後自由攝取餌及水，以群飼養4至5週。每週觀察癌組織1次，計測其大小(外部尺寸)。癌組織之體積以下述之公式算出。又，於4至5週後摘出癌組織，測定重量。

體積V=4π abc/3(a=横幅、b=縱幅、c=高度)

[試驗例10] 荷癌模式中抗癌劑效果之判定

從移殖第1週起，每2至3日計測1次試驗例9製作之小鼠癌組織之大小，對於癌組織體積達到200至300mm³之個體開始投予被檢物質或溶劑。從投予開始後繼續投予 到對照群(control群)之癌組織充分生育為止。於其間，每2至3日計測1次癌組織之大小。

以下表示荷癌模式之製作試驗及抗癌劑效果判定試驗之結果。

第1圖及第2圖表示將在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養後分散於單一細胞之HCT116細胞在基質膠存在下及基質膠不存在下移殖之結果。於基質膠存在下移殖，顯示在含有去醯化結蘭膠之培養基中以非貼附懸浮培養之細胞與貼附單層培養細胞相比為約110%，非貼附沈降培養細胞(在不含去醯化結蘭膠之培養基中，在細胞非貼附性皿上培養)約210%高的癌細胞存活及癌組織形成能。另一方面，於基質膠不存在下移殖，在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之細胞從移殖第2週起確認顯著之癌組織，於第4週癌組織之體積與貼附單層培養細胞相比為約410%，非貼附沈降培養細胞為約1000%，顯示高的癌細胞存活及癌組織形成能。另，第3圖表示在未含FBS之培養基，在基質膠不存在下移殖之結果。同樣的，在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之細胞與貼附單層培養細胞相比，在小鼠顯示高的存活及癌組織化。

第4圖表示抗癌劑對於在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養後分散於單一細胞之HCT116細胞在基質膠不存在下進行移殖時際癌組織形成之效果。於在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之細胞移殖形成之癌組織之增殖，投予紫杉醇(Paclitaxel)(7mg/kg/day, 3day/week)抑制約74%(癌組織體積)、投予曲美替尼(3mg/kg/day,3day/week)抑制約49%(癌組織體積)。又，於癌重量亦確認同等之抑制。

第5圖表示在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之HCT116細胞於基質膠不存在下移殖，球狀體移殖與單一細胞移殖之比較。於球狀體移殖與同細胞數之單一細胞移殖比較，確認約150%高之存活及癌組織形成。

第6圖表示抗癌劑對於在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之HCT116細胞以球狀體之狀態，在基質膠不存在下進行移殖時癌組織形成之效果。癌組織形成於投予曲美替尼(Trametinib)(3mg/kg/day,3day/week)抑制約35%。該抑制之程度與單一細胞移殖相比，有同等或變弱之傾向。

第7圖表示將在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養後分散於單一細胞之SKOV3細胞在基質膠不存在下進行移殖時癌組織形成之結果。6.8x10⁵細胞之移殖在貼附單層培養細胞，在基質膠不存在下癌的存活及癌的形成極低，即使於第5週，評估仍困難。另一方面，在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之細胞從移殖第3週起即確認顯著之癌組織，於第5週，形成685mm³之癌組織。1x10⁶細胞之移殖在貼附單層培養細胞從第4週起確認形成顯著之癌組織，在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之細胞從移殖第1週起確認形成顯著之癌組織，於第 5週癌組織之體積與貼附單層培養細胞相比，為約490%。

第8圖表示抗癌劑對於在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養後分散於單一細胞之SKOV3細胞在基質膠不存在下進行移殖時癌組織形成之效果。將在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之SKOV3細胞移殖，形成之癌組織之增殖於投予MK2206(120mg/kg/day,3day/week)，抑制約69%(癌組織體積)。又，於癌重量亦確認同等之抑制。

第9圖表示在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之SKOV3細胞於基質膠不存在下移殖，球狀體移殖與單一細胞移殖之比較。於球狀體移殖與同細胞數之單一細胞移殖比較，確認同等存活及癌組織形成。

第10圖表示抗癌劑對於在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之SKOV3細胞以球狀體狀態，在基質膠不存在下進行移殖時癌組織形成之效果。癌組織形成於投予MK2206(120mg/kg/day,3day/week)抑制約57%(癌組織體積)。又，於癌重量亦確認同等之抑制。

第11圖表示將在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之MCF7細胞以球狀體狀態，在基質膠不存在下於裸鼠移殖5x10⁶細胞時，於移殖3週，18隻中有6隻確認形成333±37mm³之癌組織。另一方面，將同數之單層培養細胞在基質膠不存在下進行移殖時，於移殖3週，確認形成癌組織之動物6隻中為0隻。又，抗癌劑對於在含有去醯化結蘭膠之培養基中懸浮培養之MCF7細胞以球 狀體狀態移殖時形成之癌之效果。吉非替尼(Gefitinib)(100mg/kg/day,3day/week)抑制癌組織之肥大。

[試驗例11] 培養後之細胞回收

將含有於試驗例7培養之LS123細胞之培養液回收於離心管，以500rpm離心1分鐘。回收非沈降上清分液，於含有1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基或PBS稀釋為2至3倍，以1500rpm離心5分鐘，回收下層之10%(v/v)細胞。另，懸濁於殘渣5至10倍容量之含有1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基或PBS，再次以1500rpm離心5分鐘，回收沈降之細胞。將細胞再懸濁於少量之含有1%(v/v)NEAA之E-MEM培養基，獲得球體細胞懸濁液。

[試驗例12] 製作荷癌模式

將於試驗例11獲得之癌細胞在含有1% NEAA之E-MEM培養基稀釋使於2D培養為6x10⁶個/隻/200μL，於DAG懸浮培養為3x10⁶個/隻/250μL。於基質膠共存移殖，將細胞懸濁液及基質膠於2D培養以1：1(v：v)混合，於DAG懸浮培養以2.5：1(v：v)混合。

從日本克雷亞(CLEA)公司購入7週齡之雌BALB/c-nu/nu(裸鼠)小鼠。在異氟醚麻醉下於動物之肩皮下注入各癌細胞懸濁液200μL(2D培養細胞：6x10⁶個或3x10⁶個(基質 膠存在下))或250μL(DAG懸浮培養細胞：3x10⁶個)或350μL(DAG懸浮培養細胞：3x10⁶個(基質膠存在下))。細胞注入後自由攝取餌及水，以群飼養4週。每週觀察癌組織1次，計測其大小(外部尺寸)。癌組織之體積以試驗例9記載之公式算出。結果表示於第12圖。

於基質膠不存在下移殖，2D培養細胞、DAG懸浮培養細胞同時於移殖1週後觀察類癌組織的腫瘤。於DAG懸浮培養細胞，細胞數雖然為2D培養細胞之一半，惟，其大小為約2倍。該腫瘤於第2週以後，於2D培養細胞完全消失，於DAG懸浮培養細胞雖然縮小，但仍維持到第4週。於基質膠存在下移殖，與基質膠不存在下移殖相比，於2D培養細胞，形成之腫瘤小，於第2週以後消失，於DAG懸浮培養細胞，未確認腫瘤之形成。

[產業上利用之可能性]

藉由本發明可提供廣用性、經濟性、便利性及/或在臨床之外推性優越之荷癌哺乳動物模式。藉由本發明，由於可提昇癌細胞在生體內之生體中之存活率及生育能，使可以少數之癌細胞，在短時間內製作具有大腫瘤組織之荷癌哺乳動物。又，可將必需與基質膠等細胞外基材一同移殖，否則不會存活、腫瘤未組織化之癌細胞在細胞外基材不存在之條件下，在生體內存活、腫瘤組織化。又，實質上不提高液體培養基中之黏度，而是在以維持懸浮狀態下可培養細胞、細胞凝集塊或組織之培養基組成物及以該培養獲得之細胞或細胞凝集塊提供與實際生體中之 癌組織內類似之培養環境。又，認為可製作使用非免疫不全動物之荷癌動物模式。因此，可期待與實際之臨床案件更類似之腫瘤組織再現。藉由本發明之方法製作之荷癌哺乳動物模式可用於評估癌特性、癌個別診斷、評估抗癌劑等。

將此處敍述之專利、記載包含專利申請說明書、科學文獻之所有刊物之內容於此引用，所有與明示同程度的編入本說明書中。

本專利申請以於日本提出專利申請之特願2015-022585(申請日：2015年2月6日)及特願2015-067781(申請日：2015年3月28日)為基礎，其內容全包含於本說明書中。

Claims (13)

1. 一種荷癌非人類哺乳動物之製作方法，含有下列步驟：(1)在含有可將細胞或組織懸浮而培養之構造體之培養基組成物中將癌細胞懸浮培養，及(2)將藉由(1)之培養獲得之癌細胞移入非人類哺乳動物。
2. 如申請專利範圍第1項所述之製作方法，其中，該製作方法另包含下列步驟：(3)飼養經移入癌細胞之非人類哺乳動物，從經移入之癌細胞形成腫瘤組織。
3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之製作方法，其中，在(2)中，將懸濁於含有基底膜調製物之生理水性組成物中之癌細胞移入非人類哺乳動物。
4. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之製作方法，其中，在(2)中，將懸濁於實質上不含基底膜調製物之生理水性組成物中之癌細胞移入非人類哺乳動物。
5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之製作方法，其中，該非人類哺乳動物為免疫不全非人類哺乳動物。
6. 如申請專利範圍第5項所述之製作方法，其中，該癌細胞對於移入之非人類哺乳動物為同種異系或異種。
7. 如申請專利範圍第6項所述之製作方法，其中，該癌細胞為人類癌細胞。
8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述之製作方 法，其中，該癌細胞具有形成固體腫瘤之能力。
9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述之製作方法，其中，上述構造體包含去醯化結蘭膠。
10. 如申請專利範圍第9項所述之製作方法，其中，該培養基組成物中去醯化結蘭膠之濃度為0.005至0.3%(w/v)。
11. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述之製作方法，其中，該培養基組成物於37℃之黏度為8mPa．s以下。
12. 一種抗癌劑之篩選方法，包含下列步驟：(1)於藉由如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述之製作方法製作之荷癌非人類哺乳動物中投予被檢化合物；(2)測定於(1)獲得之荷癌非人類哺乳動物中腫瘤組織之大小；(3)將於(2)測定之腫瘤組織大小與未投予被檢化合物之對照荷癌非人類哺乳動物之腫瘤組織大小進行比較。
13. 一種促進癌細胞在非人類哺乳動物內存活的方法，包含：在含有可將細胞或組織懸浮而培養之構造體之培養基組成物中將該癌細胞懸浮培養。