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TW201636360A - 以李斯特菌為主的疫苗與抗ｏｘ４０抗體或抗ｇｉｔｒ抗體之組合 - Google Patents

以李斯特菌為主的疫苗與抗ｏｘ４０抗體或抗ｇｉｔｒ抗體之組合 Download PDF

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TW201636360A
TW201636360A TW104142874A TW104142874A TW201636360A TW 201636360 A TW201636360 A TW 201636360A TW 104142874 A TW104142874 A TW 104142874A TW 104142874 A TW104142874 A TW 104142874A TW 201636360 A TW201636360 A TW 201636360A
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TW
Taiwan
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protein
antigen
fragment
gene
Prior art date
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TW104142874A
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莎米爾 科里夫
密卡爾 艾克崔亞恩
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艾德凡斯有限公司
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Abstract

本文揭示組合物，其包含使用包含活減毒重組李斯特菌(Listeria)菌株之組合物，該菌株包含截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列與異源抗原(包括腫瘤相關抗原)融合的融合蛋白，其中該等組合物進一步包含抗體或其片段或與其共投與。亦揭示組合療法，其包含使用此等包含活減毒重組李斯特菌菌株之組合物聯合抗體或其片段用於治療、防護及/或誘導免疫反應對抗腫瘤，尤其其中該治療、防護及/或誘導免疫反應提高個體之存活百分比。

Description

以李斯特菌為主的疫苗與抗OX40抗體或抗GITR抗體之組合
本文揭示組合物，其包含使用包含活減毒重組李斯特菌菌株之組合物，該菌株包含截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列與異源抗原(包括腫瘤相關抗原)融合的融合蛋白，其中該等組合物進一步包含抗體或其片段或與其共投與。亦揭示組合療法，其包含使用此等包含活減毒重組李斯特菌菌株之組合物聯合抗體或其片段用於治療、防護及/或誘導免疫反應對抗腫瘤，尤其其中該治療、防護及/或誘導免疫反應提高個體之存活百分比。
單核細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogene，Lm)為引起李斯特菌溶解的革蘭氏陽性(Gram-positive)兼性胞內病原體。一旦侵入宿主細胞，Lm可藉由產生造孔蛋白李斯特菌溶胞素O(LLO)溶解血管膜而逃脫吞噬溶菌體，使其進入細胞質，其中其複製且基於肌動蛋白聚合蛋白(ActA)之移動性擴散至相鄰細胞。在細胞質中，Lm分泌之蛋白質藉由蛋白酶體降解且處理成肽與內質網中的I級MHC分子締合。此獨特特徵使其成為極具吸引力之癌症疫苗載體，因為腫瘤抗原可隨I級MHC分子呈現以活化腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。
另外，一旦吞噬，則Lm可在吞噬溶菌體區室中處理且在II級MHC上呈現肽用於活化Lm特異性CD4-T細胞反應。或者，Lm可逃脫 吞噬體且進入胞溶質，其中藉由核寡聚結構域樣受體識別肽聚糖及藉由DNA感測器AIM2識別Lm DNA，活化發炎級聯。發炎反應與抗原高效傳遞至MHC I及MHC II路徑之此組合使Lm成為治療、防護及/或誘導針對腫瘤之免疫反應的有力疫苗載體。
然而，腫瘤細胞通常誘導免疫抑制微環境，其有利於產生免疫細胞之免疫抑制群體，諸如骨髓源抑制細胞(MDSC)及調節性T細胞(Treg)。瞭解腫瘤免疫調節之複雜性對於開發免疫療法是重要的。開發出多種策略來提高抗腫瘤免疫反應及克服『免疫檢查點』。另外，投與組合免疫療法可提供更有效及持久反應。
舉例而言，若干腫瘤介導之免疫抑制機制中之一者為藉由腫瘤表現T細胞輔助抑制分子。當嚙合至其配位體時，此等分子可抑制周邊及腫瘤微環境中的效應淋巴細胞。
當前，仍需要提供可消除腫瘤生長及癌症的腫瘤靶向方法之有效組合療法。本發明藉由提供以李斯特菌為主之疫苗與包括添加抗體或其片段之多種療法的組合解決此需要，其可提高或促進記憶及效應T細胞之增殖，及活化T細胞或抗原呈現細胞上的共刺激受體。認為除了由投與以李斯特菌為主之疫苗產生的抗原呈現之外，共刺激對針對具體腫瘤或癌症產生有效抗腫瘤免疫反應可能至關重要。
靶向免疫調節療法例如藉由使用靶向腫瘤壞死因子受體超家族之成員(包括4-1BB、OX40及GITR(糖皮質素誘導之TNF受體相關))的促效抗體主要致力於共刺激受體之活化。已在抗腫瘤及疫苗環境中證實調節GITR的可能性。促效抗體之另一目標為用於T細胞活化之共刺激信號分子。靶向共刺激信號分子可導致提高T細胞活化及促進更強效免疫反應。共刺激亦可幫助防止檢查點抑制產生的抑制影響及提高抗原特異性T細胞增殖。令人遺憾的是，使用此類促效抗體可產生毒性問題。因此，開發抗腫瘤免疫療法時有必要確定任何促效抗體與所 考慮的以李斯特菌為主之免疫治療組合物組合的安全及有效劑量。
因此，仍需要使投與以李斯特菌為主之免疫治療組合物與任何免疫療法促效抗體組合的劑量及時程最佳化。本發明亦藉由回應於腫瘤產生提供以李斯特菌為主之疫苗與促效抗體的組合解決此需要。
由於特定疾病(包括癌症)之複雜性質，因此需要治療該等疾病之組合方法。如下文【實施方式】中所見，此等組合療法可提高免疫療法之整體抗腫瘤功效。
在一個態樣中，本發明係關於一種包含具有核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中該融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，該組合物進一步包含抗體或其片段。在另一態樣中，抗體或其片段為促效抗體或其片段。在另一態樣中，抗體或其片段結合於包含T細胞受體共刺激分子、結合共刺激分子之抗原呈現細胞受體或TNF受體超家族之成員的抗原或其部分。
在另一態樣中，本發明係關於一種包含具有核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中該融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，該組合物進一步包含抗體或其片段。在另一態樣中，抗體或其片段為促效抗體或其片段。在另一態樣中，抗體或其片段結合於包含T細胞受體共刺激分子、結合共刺激分子之抗原呈現細胞受體或TNF受體超家族之成員的抗原或其部分。在另一相關態樣中，李斯特菌菌株中所包含之核酸分子編碼截斷LLO蛋白。在另一相關態樣中，李斯特菌菌株中所包含之核酸分子編碼截斷LLO蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序 列。
在一相關態樣中，本發明係關於一種在個體體內引起加強之抗腫瘤T細胞反應的方法，該方法包含向該個體投與有效量之包含重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物的步驟，該李斯特菌菌株包含核酸分子，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中該融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該方法進一步包含向該個體投與有效量之包含抗TNF受體抗體或其片段的組合物的步驟。
在另一相關態樣中，本發明係關於用於在個體體內引起加強之抗腫瘤T細胞反應的方法，其包含使用包含核酸分子之重組李斯特菌菌株，該核酸分子包含編碼截斷LLO蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列之第一開放閱讀框架，其中該方法進一步包含向該個體投與有效量的包含抗TNF受體抗體或其片段之組合物的步驟。
在另一相關態樣中，本發明係關於一種在個體體內增加抗原特異性T細胞之方法，該方法包含向該個體投與有效量之包含重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物的步驟，該李斯特菌菌株包含核酸分子，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中該融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該方法進一步包含向該個體投與有效量之包含抗TNF受體抗體或其片段的組合物的步驟。
在另一相關態樣中，本發明係關於一種用於提高個體體內之T細胞反應的方法，其包含使用包含核酸分子之重組李斯特菌菌株，該核酸分子包含編碼截斷LLO蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列之第一開放閱讀框架，其中該方法進一步包含向該個體投與有效量的包含抗TNF受體抗體或其片段之組合物的步驟。
在另一相關態樣中，本發明係關於一種治療個體體內之腫瘤或 癌症的方法，該方法包含向該個體投與有效量之包含重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物的步驟，該李斯特菌菌株包含核酸分子，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中該融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該方法進一步包含向該個體投與有效量之包含抗TNF受體抗體或其片段的組合物的步驟。
在另一相關態樣中，用於治療個體體內之腫瘤或癌症的本發明方法包含使用包含核酸分子之重組李斯特菌菌株，該核酸分子包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列之第一開放閱讀框架，其中該方法進一步包含向該個體投與有效量的包含抗TNF受體抗體或其片段之組合物的步驟。
在另一相關態樣中，本發明係關於一種提高個體之存活率之方法，該方法包含向該個體投與有效量之包含重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物的步驟，該李斯特菌菌株包含核酸分子，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中該融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該方法進一步包含向該個體投與有效量之包含抗TNF受體抗體或其片段的組合物的步驟。在另一相關態樣中，用於提高個體存活率的本發明之方法包含使用包含核酸分子之重組李斯特菌菌株，該核酸分子包含編碼截斷LLO蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列之第一開放閱讀框架，其中該方法進一步包含向該個體投與有效量的包含抗TNF受體抗體或其片段之組合物的步驟。
本發明之其他特徵及優勢將自以下【實施方式】實例及圖式變得顯而易知。然而，應理解，【實施方式】及特定實例雖然指示本發明之較佳實施例，但僅以說明方式給出，因為熟習此項技術者將由此【實施方式】而變得顯而易知本發明的精神及範疇內的各種改變及修 正。
視為本發明的主題被特別地指出且在本說明書的結論部分處清楚地主張。然而，關於操作的組織及方法以及其對象、特徵以及優點兩方面的本發明可以藉由在與隨附圖式一起閱讀時參考以下【實施方式】來最佳地瞭解，在此等隨附圖式中：圖1A及圖1B.Lm-E7及Lm-LLO-E7(ADXS11-001)使用不同表現系統來表現及分泌E7。藉由向單核細胞增多性李斯特菌基因組之orfZ結構域中引入基因卡匣產生Lm-E7(圖1A)。hly啟動子驅動hly信號序列及LLO的前五個胺基酸(AA)，隨後HPV-16 E7之表現。(圖1B)，藉由使用質體pGG-55轉型prfA-菌株XFL-7產生Lm-LLO-E7。pGG-55具有LLO-E7之非溶血性融合物的hly啟動子驅動表現。pGG-55亦含有prfA基因來活體內選擇XFL-7滯留質體。
圖2.Lm-E7及Lm-LLO-E7分泌E7。Lm-Gag(泳道1)、Lm-E7(泳道2)、Lm-LLO-NP(泳道3)、Lm-LLO-E7(泳道4)、XFL-7(泳道5)及10403S(泳道6)在37℃下在魯利亞-伯托尼培養液(Luria-Bertoni broth)中生長隔夜。如藉由OD在600nm吸光度下所測定，將等效數目之細菌球粒化且將各18ml清液層TCA沈澱。藉由西方墨點分析E7表現。使用抗E7 mAb，隨後HRP-結合之抗小鼠(Amersham)探測墨點，接著使用ECL偵測試劑顯色。
圖3.LLO-E7融合物之腫瘤免疫治療功效。顯示腫瘤接種後7、14、21、28及56天時小鼠中以毫米為單位的腫瘤尺寸。未處理小鼠：空心圓；Lm-LLO-E7：實心圓；Lm-E7：正方形；Lm-Gag：空心菱形；以及Lm-LLO-NP：實心三角形。
圖4.來自Lm-LLO-E7免疫小鼠的脾細胞在暴露於TC-1細胞時增殖。C57BL/6小鼠經免疫且使用Lm-LLO-E7、Lm-E7或對照rLm菌株 加打。加打之後6天採集脾細胞且以所示比率用經照射之TC-1細胞塗敷。細胞用3H胸苷脈衝且採集。Cpm定義為(實驗cpm)-(無-TC-1對照)。
圖5A及圖5B.(圖5A)西方墨點證明Lm-ActA-E7分泌E7。泳道1：Lm-LLO-E7；泳道2：Lm-ActA-E7.001；泳道3；Lm-ActA-E7-2.5.3；泳道4：Lm-ActA-E7-2.5.4。(圖5B)投與Lm-ActA-E7(矩形)、Lm-E7(橢圓形)、Lm-LLO-E7(X)之小鼠及未處理小鼠(未經疫苗接種；實心三角形)中的腫瘤尺寸。
圖6A-6C.(圖6A)用於形成4 LM疫苗之質體插入物的示意性圖示。Lm-LLO-E7插入物含有全部所用李斯特菌基因。其含有hly啟動子，hly基因的前1.3kb(其編碼蛋白質LLO)及HPV-16 E7基因。hly的前1.3kb包括信號序列(ss)及PEST區。Lm-PEST-E7包括hly啟動子，信號序列及PEST及E7序列，但不包括截斷LLO基因之剩餘部分。Lm-△PEST-E7不包括PEST區，但含有hly啟動子、信號序列、E7及截斷LLO的剩餘部分。Lm-E7epi僅具有hly啟動子，信號序列及E7。(圖6B)上部圖：含有PEST區的李斯特菌構築體誘發腫瘤消退。下部圖：2個獨立實驗中腫瘤攻擊後第28天的平均腫瘤尺寸。(圖6C)含有PEST區域之李斯特菌構築體在脾臟中誘發較高百分比的E7特異性淋巴細胞。描繪3個實驗的資料的平均值及SE。
圖7A及圖7B.(圖7A)在投與TC-1腫瘤細胞且隨後投與Lm-E7、Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7或無疫苗(未經處理)的小鼠中，脾臟及滲透腫瘤的次數中的E7特異性IFN-γ分泌CD8+ T細胞誘導。(圖7B)針對(圖7A)所述之小鼠的脾臟及腫瘤中E7特異性CD8+細胞的誘導及滲透。
圖8A及圖8B.含有PEST區之李斯特菌構築體在腫瘤內誘發較高百分比之E7特異性淋巴細胞。(圖8A)來自1個實驗的代表性資料。(圖8B)全部3個實驗之資料的平均值及SE。
圖9.來自群1及2之資料指示實例6中提出的臨床試驗中之患者中觀測到的功效。
圖10A及圖10B.(圖10A)klk3整合及actA缺失之後Lmdd-143及LmddA-143之染色體區的示意性圖示；(圖10B)klk3基因整合至Lmdd及LmddA染色體中。使用klk3特異性引子自各構築體製備染色體DNA的PCR擴增對應於klk3基因的714bp之條帶，缺失野生型蛋白質之分泌信號序列。
圖11A-圖11D.(圖11A)pADV134質體之圖譜。(圖11B)使來自LmddA-134培養物清液層之蛋白質沈澱，在SDS-PAGE中分離，且藉由西方墨點法使用抗E7單株抗體偵測LLO-E7蛋白。抗原表現卡匣由hly啟動子、截斷LLO之ORF及人類PSA基因(klk3)組成。(圖11C)pADV142質體之圖譜。(圖11D)西方墨點顯示使用抗PSA及抗LLO抗體的LLO-PSA融合蛋白之表現。
圖12A及圖12B.(圖12A)在具有及不具有選擇壓力(D-丙胺酸)的情況下培養時LmddA-LLO-PSA之活體外質體穩定性。首先列出菌株及培養條件且隨後列出用於CFU測定之培養板。(圖12B)LmddA-LLO-PSA活體內清除率及此時間期間的可能質體損失的評定。靜脈內注射細菌且在指定時間點自脾臟分離。在BHI及BHI+D-丙胺酸培養板上測定CFU。
圖13A及圖13B.(圖13A)在C57BL/6小鼠中投與108CFU之後菌株LmddA-LLO-PSA的活體內清除率。藉由在BHI/str培養板上塗敷來測定CFU數目。此方法之偵測極限為100CFU。(圖13B)使用10403S、LmddA-LLO-PSA及XFL7菌株的J774細胞的細胞感染分析。
圖14A-圖14E.(圖14A)加打劑量之後第6天時，未處理小鼠及LmddA-LLO-PSA免疫小鼠之脾細胞中PSA四聚物特異性細胞。(圖14B)使用PSA肽刺激未處理小鼠及LmddA-LLO-PSA免疫小鼠之脾細 胞中IFN-γ之胞內細胞激素染色5小時。使用基於卡斯蛋白酶之分析法(圖14C)及基於銪之分析法(圖14D)，在不同效應子/目標比率下，來自LmddA-LLO-PSA免疫小鼠及未處理小鼠的活體外刺激效應T細胞對用PSA肽脈衝之EL4細胞的特異性溶解。在PSA肽存在下或無肽存在下刺激24小時後獲得的未處理及經免疫脾細胞中之IFNγ斑點數目(圖14E)。
圖15A-圖15C.用LmddA-142免疫誘發Tramp-C1-PSA(TPSA)腫瘤消退。小鼠未經處理(n=8)(圖15A)或在第7天、第14天及第21天用LmddA-142(1×108CFU/小鼠)(n=8)(圖15B)或Lm-LLO-PSA(n=8)，(圖15C)腹膜內免疫。量測各個別腫瘤之腫瘤尺寸且值表示為以毫米為單位的平均直徑。各線表示個別小鼠。
圖16A及圖16B.(圖16A)未處理小鼠及用Lm對照菌株或LmddA-LLO-PSA(LmddA-142)免疫之小鼠的脾臟及浸潤T-PSA-23腫瘤中的PSA-四聚物+CD8+ T細胞的分析。(圖16B)未處理小鼠及用Lm對照菌株或LmddA-LLO-PSA免疫之小鼠的脾臟及浸潤T-PSA-23腫瘤中的CD4+調節性T細胞(定義為CD25+FoxP3+)的分析。
圖17A及圖17B.(圖17A)klk3整合及actA缺失後Lmdd-143及LmddA-143之染色體區的示意性圖示；(圖17B)klk3基因整合至Lmdd及LmddA染色體中。使用klk3特異性引子自各構築體製備染色體DNA的PCR擴增對應於klk3基因的760bp之條帶。
圖18A-圖18C.(圖18A)Lmdd-143及LmddA-143分泌LLO-PSA蛋白。使來自細菌培養物清液層之蛋白質沈澱，在SDS-PAGE中分離且藉由西方墨點法使用抗LLO及抗PSA抗體偵測LLO及LLO-PSA蛋白；(圖18B)Lmdd-143及LmddA-143產生之LLO保留溶血性活性。綿羊紅血球與細菌培養物清液層之連續稀釋液一起培育且藉由590nm下的吸光度量測溶血性活性；(圖18C)Lmdd-143及LmddA-143在巨噬細胞樣 J774細胞內部生長。J774細胞與細菌一起培育1小時，隨後慶大黴素處理以殺死胞外細菌。藉由塗敷指示時間點獲得的J774溶解物之連續稀釋液量測胞內生長。Lm 10403S在此等實驗中用作對照。
圖19.用Lmdd-143及LmddA-143免疫小鼠誘發PSA特異性免疫反應。C57BL/6小鼠用1×108CFU Lmdd-143、LmddA-143或LmddA-142以1週間隔免疫兩次，且在7天後採集脾臟。在莫能菌素(monensin)存在下用1μM PSA65-74肽刺激脾細胞5小時。細胞針對CD8、CD3、CD62L及胞內IFN-γ染色且在FACS Calibur細胞計數器中分析。
圖20A及圖20B.各圖顯示腫瘤中MDSC及Treg的降低。Lm疫苗接種(LmddA-PSA及LmddA-E7)之後MDSC(圖20B)及Treg(圖20A)的數目。
圖21A-圖21D.各圖顯示表明來自TPSA23腫瘤(PSA表現腫瘤)的單核細胞性MDSC在李斯特菌疫苗接種後較少抑制的抑制因子分析資料。MDSC之抑制能力的改變並非抗原特異性的，因為PSA-抗原特異性T細胞及非特異性刺激T細胞中可見相同抑制降低。在圖21A及圖21B中，佛波醇-肉豆蔻酸酯-乙酸酯及伊屋諾黴素(PMA/I)代表非特異性刺激。在圖21C及圖21D中，術語「肽」表示特異性抗原刺激。CD3+CD8+百分比(%)表示效應(反應)T細胞%。無MDSC組顯示當其保持無刺激時缺乏反應T細胞分裂，且最後一組(添加PMA/I或肽)顯示在無MDSC存在的情況下經刺激之細胞分裂。圖21A及圖21C顯示各組之個別細胞分裂週期。圖21B及圖21D顯示彙聚之分裂週期。
圖22A-圖22D顯示表明李斯特菌對脾臟單核細胞性MDSC無作用且其僅以抗原特異性方式抑制的抑制分析資料。在圖22A及圖22B中，PMA/I表示非特異性刺激。在圖22C及圖22D中，術語「肽」表示特異性抗原刺激。CD3+CD8+百分比(%)表示效應(反應)T細胞%。無MDSC組顯示當其保持無刺激時缺乏反應T細胞分裂，且最後一組 (添加PMA/I或肽)顯示在無MDSC存在的情況下經刺激之細胞分裂。圖22A及圖22C顯示各組之個別細胞分裂週期。圖22B及圖22D顯示彙聚之分裂週期。
圖23A-圖23D顯示表明來自腫瘤之粒細胞性MDSC在李斯特菌疫苗接種之後抑制T細胞的能力降低的抑制分析資料。MDSC之抑制能力的改變並非抗原特異性的，因為PSA-抗原特異性T細胞及非特異性刺激T細胞中可見相同抑制降低。在圖23A及圖23B中，PMA/I表示非特異性刺激。在圖23C及圖23D中，術語「肽」表示特異性抗原刺激。CD3+CD8+百分比(%)表示效應(反應)T細胞%。無MDSC組顯示當其保持無刺激時缺乏反應T細胞分裂，且最後一組(添加PMA/I或肽)顯示在無MDSC存在的情況下經刺激之細胞分裂。圖23A及圖23C顯示各組之個別細胞分裂週期。圖23B及圖23D顯示彙聚之分裂百分比。
圖24A-圖24D顯示表明李斯特菌對脾臟粒細胞性MDSC無作用且其僅以抗原特異性方式抑制的抑制分析資料。在圖24A及圖24B中，PMA/I表示非特異性刺激。在圖24C及圖24D中，術語「肽」表示特異性抗原刺激。CD3+CD8+百分比(%)表示效應(反應)T細胞%。無MDSC組顯示當其保持無刺激時缺乏反應T細胞分裂，且最後一組(添加PMA/I或肽)顯示在無MDSC存在的情況下經刺激之細胞分裂。圖24A及圖24C顯示各組之個別細胞分裂週期。圖24B及圖24D顯示彙聚之分裂百分比。
圖25A-圖25D顯示表明來自腫瘤之Treg仍抑制之抑制分析資料。在此腫瘤模型中，Treg的抑制能力以非抗原特異性方式略微降低。在圖25A及圖25B中，PMA/I表示非特異性刺激。在圖25C及圖25D中，術語「肽」表示特異性抗原刺激。CD3+CD8+百分比(%)表示效應(反應)T細胞%。無Treg組顯示當其保持無刺激時缺乏反應T細胞分裂，且最後一組(添加PMA/I或肽)顯示在無Treg存在的情況下經刺激之細 胞分裂。圖25A及圖25C顯示各組之個別細胞分裂週期。圖25B及圖25D顯示彙聚之分裂百分比。
圖26A-圖26D顯示表明脾臟Treg仍抑制之抑制分析資料。在圖26A及圖26B中，PMA/I表示非特異性刺激。在圖26C及圖26D中，術語「肽」表示特異性抗原刺激。CD3+CD8+百分比(%)表示效應(反應)T細胞%。無Treg組顯示當其保持無刺激時缺乏反應T細胞分裂，且最後一組(添加PMA/I或肽)顯示在無Treg存在的情況下經刺激之細胞分裂。圖26A及圖26C顯示各組之個別細胞分裂週期。圖26B及圖26D顯示彙聚之分裂百分比。
圖27A-圖27D顯示表明習知CD4+ T細胞不管存在於小鼠腫瘤中還是脾臟中對細胞分裂都不具有作用的抑制分析資料。在圖27A及圖27B中，PMA/I表示非特異性刺激。在圖27C及圖27D中，術語「肽」表示特異性抗原刺激。CD3+CD8+百分比(%)表示效應(反應)T細胞%。無Treg組顯示當其保持無刺激時缺乏反應T細胞分裂，且最後一組(添加PMA/I或肽)顯示在無Treg存在的情況下經刺激之細胞分裂。圖27C-圖27D顯示彙聚之分裂百分比的資料。
圖28A-圖28D顯示表明來自4T1腫瘤(Her2表現腫瘤)之單核細胞性MDSC在李斯特菌疫苗接種之後抑制能力降低的抑制分析資料。MDSC之抑制能力的改變並非抗原特異性的，因為Her2/neu抗原特異性T細胞及非特異性刺激T細胞中可見相同抑制降低。在圖28A及圖28B中，PMA/I表示非特異性刺激。在圖28C及圖28D中，術語「肽」表示特異性抗原刺激。CD8+百分比(%)表示效應(反應)T細胞%。無MDSC組顯示當其保持無刺激時缺乏反應T細胞分裂，且最後一組(添加PMA/I或肽)顯示在無MDSC存在的情況下經刺激之細胞分裂。圖28A及圖28C顯示各組之個別細胞分裂週期。圖28B及圖28D顯示彙聚之分裂百分比。
圖29A-圖29D顯示表明對脾臟單核細胞性MDSC不存在李斯特菌特異性作用之抑制分析資料。在圖29A及圖29B中，PMA/I表示非特異性刺激。在圖29C及圖29D中，術語「肽」表示特異性抗原刺激。CD8+百分比(%)表示效應(反應)T細胞%。無MDSC組顯示當其保持無刺激時缺乏反應T細胞分裂，且最後一組(添加PMA/I或肽)顯示在無MDSC存在的情況下經刺激之細胞分裂。圖29A及圖29C顯示各組之個別細胞分裂週期。圖29B及圖29D顯示彙聚之分裂百分比。
圖30A-圖30D顯示表明來自4T1腫瘤(Her2表現腫瘤)之粒細胞性MDSC在李斯特菌疫苗接種之後抑制能力降低的抑制分析資料。MDSC之抑制能力的改變並非抗原特異性的，因為Her2/neu抗原特異性T細胞及非特異性刺激T細胞中可見相同抑制降低。在圖30A及圖30B中，PMA/I表示非特異性刺激。在圖30C及圖30D中，術語「肽」表示特異性抗原刺激。CD8+百分比(%)表示效應(反應)T細胞%。無MDSC組顯示當其保持無刺激時缺乏反應T細胞分裂，且最後一組(添加PMA/I或肽)顯示在無MDSC存在的情況下經刺激之細胞分裂。圖30A及圖30C顯示各組之個別細胞分裂週期。圖30B及圖30D顯示彙聚之分裂百分比。
圖31A-圖31D提出表明對脾臟粒細胞性MDSC不存在李斯特菌特異性作用之抑制分析資料。在圖31A及圖31B中，PMA/I表示非特異性刺激。在圖31C及圖31D中，術語「肽」表示特異性抗原刺激。CD8+百分比(%)表示效應(反應)T細胞%。無MDSC組顯示當其保持無刺激時缺乏反應T細胞分裂，且最後一組(添加PMA/I或肽)顯示在無MDSC存在的情況下經刺激之細胞分裂。圖31A及圖31C顯示各組之個別細胞分裂週期。圖31B及圖31D顯示彙聚之分裂百分比。
圖32A-圖32D提出表明來自4T1腫瘤(Her2表現腫瘤)之Treg在李斯特菌疫苗接種之後抑制能力降低的抑制分析資料。在圖32A及圖32B 中，PMA/I表示非特異性刺激。在圖32C及圖32D中，術語「肽」表示特異性抗原刺激。CD8+百分比(%)表示效應(反應)T細胞%。此降低並非抗原特異性的，因為Her2/neu特異性及非特異性反應T細胞皆可見Treg抑制能力的改變。圖32A及圖32C顯示各組之個別細胞分裂週期。圖32B及圖32D顯示彙聚之分裂百分比。
圖33A-圖33D顯示表明對脾臟Treg不存在李斯特菌特異性作用之抑制分析資料。反應T細胞均能夠分裂，不管其是否為抗原特異性的。在圖33A及圖33B中，PMA/I表示非特異性刺激。在圖33C及圖33D中，術語「肽」表示特異性抗原刺激。CD8+百分比(%)表示效應(反應)T細胞%。圖33A及圖33C顯示各組之個別細胞分裂週期。圖33B及圖33D顯示彙聚之分裂百分比。
圖34A-圖34D顯示表明粒細胞性MDSC之抑制能力是由於過度表現tLLO且與搭檔融合抗原無關的抑制分析資料。左側圖(圖34A及圖34C)顯示各組之個別細胞分裂週期。右側圖(圖34B及圖34D)顯示彙聚之分裂百分比。
圖35A-圖35D顯示亦表明單核細胞性MDSC之抑制能力是由於過度表現tLLO且與搭檔融合抗原無關的抑制分析資料。左側圖(圖35A及圖35C)顯示各組之個別細胞分裂週期。右側圖(圖35B及圖35D)顯示彙聚之分裂百分比。
圖36A-圖36D顯示表明自脾臟純化之粒細胞性MDSC在Lm疫苗接種之後保留其抑制抗原特異性反應T細胞分裂之能力的抑制分析資料(圖36A及圖36B)。然而，非特異性刺激後，活化T細胞(使用PMA/伊屋諾黴素)仍能夠分裂(圖36C及圖36D)。左側圖顯示各組之個別細胞分裂週期。右側圖顯示彙聚之分裂百分比。
圖37A-圖37D顯示表明自脾臟純化之單核細胞性MDSC在Lm疫苗接種之後保留其抑制抗原特異性反應T細胞分裂之能力的抑制分析資 料(圖37A及圖37B)。然而，在非特異性活化(藉由PMA/伊屋諾黴素刺激)之後，T細胞仍能夠分裂(圖37C及圖37D)。左側圖顯示各組之個別細胞分裂週期。右側圖顯示彙聚之分裂百分比。
圖38A-圖38D顯示表明自Lm處理的任何組純化之Treg抑制反應T細胞分裂的能力略微減弱之抑制分析資料，不管反應細胞是經抗原特異性(圖38A及圖38B)還是非特異性(圖38C及圖38D)活化。左側圖顯示各組之個別細胞分裂週期。右側圖顯示彙聚之分裂百分比。
圖39A-圖39D顯示表明自脾臟純化之Treg仍能夠抑制抗原特異性(圖39A-圖39B)及非特異性(圖39C及圖39D)活化之反應T細胞分裂的抑制分析資料。
圖40A-圖40D顯示表明腫瘤Tcon細胞不能抑制T細胞分裂之抑制分析資料，不管反應細胞經抗原特異性(圖40A及圖40B)還是非特異性活化(圖40C及圖40D)。
圖41A-圖41D顯示表明脾臟Tcon細胞不能抑制T細胞分裂之抑制分析資料，不管反應細胞經抗原特異性(圖41A及圖41B)還是非特異性活化(圖41C及圖41D)。
圖42A-圖42C.(圖42A)經歷以李斯特菌為主之疫苗(ADXS11-001，其為Lm-LLO-E7)與抗OX40抗體之組合的小鼠的治療時程的示意圖，其中在整個實驗期間監測腫瘤生長及小鼠存活。(圖42B)經歷以李斯特菌為主之疫苗(ADXS11-001，其為Lm-LLO-E7)與抗GITR抗體之組合的小鼠的治療時程的示意圖，其中在整個實驗期間監測腫瘤生長及小鼠存活。對於第0天的(圖42A)及(圖42B)，向小鼠注射7×105 TC-1腫瘤細胞以起始腫瘤形成。在第10天開始疫苗接種。對照組包括LmddA-LLO及李斯特菌菌株XFL7。(圖42A)顯示在整個實驗期間一週兩次投與抗OX40抗體。(圖42B)顯示一週兩次投與抗GITR抗體，總計三次劑量。(圖42C)識別十二種投與方案，包括無治療(NT)。
圖43A-圖43B.在C57BL/6小鼠的腹面上皮下植入(s.c.)TC-1腫瘤。當腫瘤體積達到約0.06cm3時，以7天之間隔腹膜內給予(i.p.)兩次劑量之以Lm為主的E7特異性腫瘤疫苗(1×108群落形成單位/小鼠)。與疫苗一起開始，一週兩次腹膜內注射GITR(5mg/Kg b.wt.；總計四次劑量)及OX40(1mg/Kg b.wt.；整個實驗期間)抗體。每週兩次量測腫瘤尺寸。顯示腫瘤生長(圖43A)及存活百分比(圖43B)。N=5/組。結果顯示為一個代表性實驗的平均值±SE。實驗重複兩次。*p0.05，**p0.01，****p0.0001。
圖44A-圖44B.在C57BL/6小鼠的腹面上皮下植入(s.c.)TC-1腫瘤。當腫瘤體積達到約0.06cm3時，以7天之間隔腹膜內給予(i.p.)兩次劑量之以Lm為主的E7特異性腫瘤疫苗(1×108群落形成單位/小鼠)。與疫苗一起開始，一週兩次腹膜內注射OX40(1mg/Kg b.wt.；整個實驗期間)抗體。每週兩次量測腫瘤尺寸。顯示腫瘤生長(圖44A)及存活百分比(圖44B)。N=5/組。結果顯示為一個代表性實驗的平均值±SE。實驗重複兩次。*p0.05，**p0.01，****p0.0001。
圖45.抗GITR Ab與以李斯特菌為主之疫苗療法之組合的疫苗投與調查的示意圖。
圖46A及圖46B.圖46A提供顯示取決於不同療法組之腫瘤浸潤CD4+ T細胞數目之條形圖。圖46B提供顯示取決於不同療法組之腫瘤浸潤Treg(CD4+FoxP3+)細胞數目的條形圖。
圖47A及圖47B.圖47A提供顯示取決於不同療法組之腫瘤浸潤總非Treg(CD4+FoxP3-)細胞數目的條形圖。圖47B提供顯示取決於不同療法組之腫瘤浸潤Treg(CD4+FoxP3+)細胞百分比的條形圖。
圖48A及圖48B.圖48A提供顯示取決於不同療法組之腫瘤浸潤CD8+ T細胞數目之條形圖。圖48B提供顯示取決於不同療法組之腫瘤浸潤E7特異性CD8+ T細胞(抗原特異性)數目的條形圖。
圖49A及圖49B.圖49A提供顯示取決於不同療法組的CD8+/Treg細胞之比率的條形圖。圖49B提供顯示取決於不同療法組的E7+CD8+/Treg細胞之比率的條形圖。
圖50A、圖50B及圖50CB.圖50A提供顯示取決於不同療法組之腫瘤浸潤性骨髓源抑制細胞(MDSC)數目的條形圖。圖50B提供顯示取決於不同療法組的腫瘤浸潤CD8/MDSC之比率的條形圖。圖50C提供顯示取決於不同療法組之抗原特異性腫瘤浸潤E7-CD8/MDSC之比率的條形圖。
圖51.抗OX40 Ab與以李斯特菌為主之疫苗療法之組合的疫苗投與調查的示意圖。
圖52A及圖52B.圖52A提供顯示取決於不同療法組之腫瘤浸潤CD4+ T細胞數目之條形圖。圖52B提供顯示取決於不同療法組之腫瘤浸潤Treg(CD4+FoxP3+)細胞數目的條形圖。
圖53A及圖53B.圖53A提供顯示取決於不同療法組之腫瘤浸潤總非Treg(CD4+FoxP3-)細胞數目的條形圖。圖53B提供顯示取決於不同療法組之腫瘤浸潤Treg(CD4+FoxP3+)細胞百分比的條形圖。
圖54A及圖54B.圖54A提供顯示取決於不同療法組之腫瘤浸潤CD8+ T細胞數目之條形圖。圖54B提供顯示取決於不同療法組之腫瘤浸潤E7特異性CD8+ T細胞(抗原特異性)數目的條形圖。
圖55A及圖55B.圖55A提供顯示取決於不同療法組的CD8+/Treg細胞之比率的條形圖。圖55B提供顯示取決於不同療法組的E7+CD8+/Treg細胞之比率的條形圖。
圖56A、圖56B及圖56C.圖56A提供顯示取決於不同療法組之腫瘤浸潤性骨髓源抑制細胞(MDSC)的條形圖。圖56B提供顯示取決於不同療法組的腫瘤浸潤CD8/MDSC之比率的條形圖。圖56C提供顯示取決於不同療法組之抗原特異性腫瘤浸潤E7-CD8/MDSC之比率的條形 圖。
圖57A及圖57B.ADXS31-164之構造。(圖57A)pAdv164之質體圖譜，其在用於補充LmddA菌株中的染色體dal-dat缺失之組成性李斯特菌p60啟動子控制下容納枯草桿菌ddl基因。其亦含有截斷LLO(1-441)與嵌合人類Her2/neu基因之融合物，其藉由直接融合3個片段Her2/neu：EC1(aa 40-170)、EC2(aa 359-518)及ICI(aa 679-808)來建構。(圖57B)藉由對用抗LLO抗體點樣的TCA沈澱之細胞培養物清液層進行西方墨點分析，在Lm-LLO-ChHer2(Lm-LLO-138)及LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)中偵測tLLO-ChHer2之表現及分泌。約104KD之差示條帶對應於tLLO-ChHer2。偵測到內源性LLO為58KD條帶。李斯特菌對照組缺乏ChHer2表現。
圖58A-圖58C.ADXS31-164之免疫原性特性(圖58A)使用NT-2細胞作為刺激劑及3T3/neu細胞作為目標測試來自經免疫小鼠的脾細胞中藉由Her2/neu以李斯特菌為主之疫苗引起的細胞毒性T細胞反應。Lm對照組基於LmddA背景，該背景在各方面均相同，但表現不相關抗原(HPV16-E7)。(圖58B)來自經免疫FVB/N小鼠之脾細胞向細胞培養基中分泌IFN-γ，在使用絲裂黴素C處理之NT-2細胞活體外刺激24小時後，藉由ELISA量測。(圖58C)來自用嵌合疫苗免疫之HLA-A2轉殖基因小鼠之脾細胞回應於與來自不同蛋白質區域的肽一起活體外培育的IFN-γ分泌。如附圖說明中所列，重組ChHer2蛋白用作陽性對照且不相關之肽或無肽組構成陰性對照組。藉由ELISA分析法使用共同培育72小時後採集之細胞培養物清液層偵測IFN-γ分泌。各資料點為三份資料+/-標準誤差之平均值。*P值<0.001。
圖59.李斯特菌-ChHer2/neu疫苗之腫瘤預防研究，Her2/neu轉殖基因小鼠用各重組李斯特菌-ChHer2或對照李斯特菌疫苗注射六次。在6週齡開始免疫且每三週繼續直至第21週。每週監測腫瘤外觀且表 示為無腫瘤小鼠之百分比。*p<0.05，N=9/組。
圖60.ADXS31-164免疫對脾臟中Treg百分比之作用。FVB/N小鼠用1×106個NT-2細胞皮下接種且以一週間隔用各疫苗免疫三次。第二次免疫後7天採集脾臟。分離免疫細胞後，將其染色以用於藉由抗CD3、CD4、CD25及FoxP3抗體偵測Treg。代表性實驗之Treg的點陣圖顯示CD25+/FoxP3+ T細胞之頻率，表示為不同處理組的總CD3+或CD3+CD4+ T細胞之百分比。
圖61A及圖61B.ADXS31-164免疫對NT-2腫瘤中腫瘤浸潤性Treg百分比之作用。FVB/N小鼠用1×106個NT-2細胞皮下接種且以一週間隔用各疫苗免疫三次。第二次免疫後7天採集腫瘤。分離免疫細胞後，將其染色以用於藉由抗CD3、CD4、CD25及FoxP3抗體偵測Treg。(圖61A)。代表性實驗之Treg的點陣圖。(圖61B)。CD25+/FoxP3+ T細胞之頻率，表示為不同處理組的總CD3+或CD3+CD4+ T細胞的百分比(左圖)及瘤內CD8/Treg比率(右圖)。資料顯示為獲自2個獨立實驗之平均值±SEM。
圖62A-圖62C.ADXS31-164疫苗接種可延遲乳癌細胞株在腦中的生長。Balb/c小鼠用ADXS31-164或對照李斯特菌疫苗免疫三次。在麻醉小鼠中顱內注射EMT6-Luc細胞(5,000)。(圖62A)在指定天數使用Xenogen X-100 CCD相機對小鼠進行離體成像。(圖62B)像素強度作為每秒每平方公分表面積的光子數目繪圖；此顯示為平均輻射率。(圖62C)藉由西方墨點使用抗HER2/neu抗體偵測EMT6-Luc細胞、4T1-Luc及NT-2細胞株的Her2/neu表現。J774.A2細胞為鼠類巨噬細胞樣細胞株，將其用作陰性對照。
圖63.顯示預先建立之FVB/N Her2/neu，NT-2腫瘤小鼠模型的治療時程。
應瞭解，為了說明之簡單及清晰起見，圖式中所示之元件未必 按比例繪製。舉例而言，為了清楚起見，可相對於其他元件放大一些元件之尺寸。另外，在認為適當時，已在圖中重複參考編號以指示對應或類似元件。
在以下【實施方式】中，闡述許多具體細節以便提供對本發明之透徹理解。然而，熟習此項技術者應理解，本發明可在無此等特定細節之情況下實踐。在其他情況下，未詳細描述熟知方法、程序及組件，以免混淆本發明。
在一個實施例中，揭示一種包含具有核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中該融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，且其中該組合物進一步包含抗體或其片段。
在一個實施例中，本文揭示之抗體或其片段為促效抗體。在另一實施例中，抗體或其片段為抗TNF受體抗體。在另一實施例中，抗體或其片段為促效抗TNF受體抗體。
在另一實施例中，本文揭示一種包含具有核酸分子之重組李斯特菌菌株的免疫原性組合物，該核酸分子包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列的第一開放閱讀框架，其中該組合物進一步包含促效抗TNF受體抗體或其片段。在另一實施例中，李斯特菌菌株中所包含之核酸分子不編碼融合多肽。
在另一實施例中，本文揭示一種包含促效抗體或其片段及包含核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中該融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列。
在另一實施例中，本文揭示一種包含促效抗TNF受體抗體或其片段及包含核酸分子之重組李斯特菌菌株的免疫原性組合物，該核酸分子包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列的第一開放閱讀框架。在另一實施例中，李斯特菌菌株中所包含之核酸分子不編碼融合多肽。
在一個實施例中，促效抗體或其片段結合於包含T細胞受體共刺激分子的異源抗原或其部分。因此，在另一實施例中，本文揭示一種包含結合T細胞受體共刺激分子之促效抗體或其片段及包含核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中該融合多肽包含截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列。
在另一實施例中，本文揭示一種包含結合T細胞受體共刺激分子之促效抗體或其片段及包含核酸分子之重組李斯特菌菌株的免疫原性組合物，該核酸分子包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列的第一開放閱讀框架。在另一實施例中，李斯特菌菌株中所包含之核酸分子不編碼融合多肽。
在另一實施例中，所揭示之促效抗體或其片段結合於包含結合共刺激分子之抗原呈現細胞受體的抗原或其部分。因此，在另一實施例中，本文揭示一種包含結合會結合共刺激分子之抗原呈現細胞受體之促效抗體或其片段及包含核酸分子之重組李斯特菌菌株，核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列。在另一實施例中，免疫原性組合物包含結合會結合共刺激分子之抗原呈現細胞受體的促效抗體或其片段及包含核酸分子之重組李斯特菌菌株，核酸分子包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列之第一開放閱讀框架。 在另一實施例中，李斯特菌菌株中所包含之核酸分子不編碼融合多肽。
在另一實施例中，促效抗體或其片段結合於包含腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族之成員的抗原或其部分。因此，在另一實施例中，本文揭示一種包含結合TNF受體超家族之促效抗體或其片段及包含核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物，核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列。在另一實施例中，免疫原性組合物包含結合TNF受體超家族之促效抗體或其片段及包含核酸分子之重組李斯特菌菌株，核酸分子包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列之第一開放閱讀框架。在另一實施例中，李斯特菌菌株中所包含之核酸分子不編碼融合多肽。
在一個實施例中，揭示在個體體內引發加強之抗腫瘤T細胞反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含具有核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物的步驟，核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該方法進一步包含向個體投與有效量之包含抗體或其片段的組合物的步驟。在另一實施例中，作為引發加強之抗腫瘤T細胞反應之方法的部分投與之重組李斯特菌菌株包含核酸分子，其包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列之第一開放閱讀框架。在另一實施例中，第一開放閱讀框架不編碼融合多肽。
在另一實施例中，揭示一種在個體體內抑制腫瘤介導之免疫抑制之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含具有核酸分子之重組 李斯特菌菌株之免疫原性組合物的步驟，核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該方法進一步包含向個體投與有效量之包含抗體或其片段的組合物的步驟。在另一實施例中，作為在個體體內抑制腫瘤介導之免疫抑制之方法的部分投與之重組李斯特菌菌株包含核酸分子，其包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列之第一開放閱讀框架。在另一實施例中，第一開放閱讀框架不編碼融合多肽。
在另一實施例中，揭示一種在個體之脾臟及腫瘤中增加T效應細胞比調節性T細胞(Treg)之比率的方法，該方法包含向個體投與包含具有核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物的步驟，核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該方法進一步包含向個體投與有效量之包含抗體或其片段的組合物的步驟。在另一實施例中，作為在個體之脾臟及腫瘤中增加T效應細胞比調節性T細胞(Treg)之比率的方法之部分投與之重組李斯特菌菌株包含核酸分子，其包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列之第一開放閱讀框架。在另一實施例中，第一開放閱讀框架不編碼融合多肽。
在另一實施例中，揭示一種增加個體體內之抗原特異性T細胞之方法，該方法包含向個體投與包含具有核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物的步驟，核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該方法進一步包含向個體投與有效量之包含抗體或其片段的組合物的步驟。 在另一實施例中，作為增加個體體內之T細胞之方法的部分投與的重組李斯特菌菌株包含核酸分子，其包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列之第一開放閱讀框架。在另一實施例中，第一開放閱讀框架不編碼融合多肽。
在另一實施例中，揭示一種提高具有腫瘤或罹患癌症之個體的存活時間之方法，該方法包含向個體投與包含具有核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物的步驟，核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該方法進一步包含向個體投與有效量之包含抗體或其片段的組合物的步驟。在另一實施例中，作為提高具有腫瘤或罹患癌症之個體的存活時間之方法的部分投與的重組李斯特菌菌株包含核酸分子，其包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列之第一開放閱讀框架。在另一實施例中，第一開放閱讀框架不編碼融合多肽。
在另一實施例中，揭示一種治療個體之腫瘤或癌症之方法，該方法包含向個體投與包含具有核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物的步驟，核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該方法進一步包含向個體投與有效量之包含抗體或其片段的組合物的步驟。在另一實施例中，作為治療個體之腫瘤或癌症之方法的部分投與的重組李斯特菌菌株包含核酸分子，其包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列之第一開放閱讀框架。在另一實施例中，第一開放閱讀框架不編碼融合多肽。
重組李斯特菌菌株
在一個實施例中，本發明之重組李斯特菌菌株包含核酸分子，核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列。在另一實施例中，本發明之重組李斯特菌菌株包含核酸分子，核酸分子包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列之第一開放閱讀框架。在一個實施例中，重組李斯特菌菌株經減毒。
在另一實施例中，截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列不融合至異源抗原或其片段。
在一個實施例中，截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白包含PEST序列。在另一實施例中，截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白包含推定PEST序列。在一個實施例中，截斷ActA蛋白包含含有PEST之胺基酸序列。在另一實施例中，截斷ActA蛋白包含含有PEST之推定胺基酸序列。
在一個實施例中，PEST胺基酸(AA)序列包含截斷LLO序列。在另一實施例中，PEST胺基酸序列為KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(SEQ ID NO：1)。在另一實施例中，抗原與來自李斯特菌之其他LM PEST AA序列之融合亦提高抗原之免疫原性。
在另一實施例中，本發明之方法及組合物的N端LLO蛋白片段包含SEQ ID NO：3。在另一實施例中，片段包含LLO信號肽。在另一實施例中，片段包含SEQ ID No：4。在另一實施例中，片段大致由SEQ ID NO：4組成。在另一實施例中，片段基本上由SEQ ID NO：4組成。在另一實施例中，片段對應於SEQ ID NO：4。在另一實施例中，片段與SEQ ID NO：4同源。在另一實施例中，片段與SEQ ID NO：4之片段同源。一些實例中所用之△LLO為416 AA長(排除信號序列)，因為截 斷了包括含有半胱胺酸484之活化結構域的胺基末端的88個殘基。熟習此項技術者應清楚，任何不具有活化結構域且具體而言不具有半胱胺酸484之△LLO均適於本發明之方法及組合物。在另一實施例中，異源抗原與任何包括PEST AA序列SEQ ID NO：1之△LLO融合提高抗原的細胞介導之免疫性及抗腫瘤免疫性。各可能性代表本發明之各別實施例。
熟練技術人員應瞭解，術語「含有PEST序列之肽」可涵蓋PEST序列肽或其LLO蛋白或ActA蛋白之肽片段。PEST序列肽為此項技術中已知且描述於美國專利第7,635,479號及美國專利公開案第2014/0186387號中，其皆以全文引用的方式併入本文中。
在另一實施例中，原核生物之PEST序列可常規地根據諸如Rechsteiner及Roberts(TBS 21：267-271,1996)針對單核細胞增多性李斯特菌所述之方法鑑別。或者，亦可基於此方法鑑別來自其他原核生物之PEST胺基酸序列。預期PEST胺基酸序列之其他原核生物包括(但不限於)其他李斯特菌物種。舉例而言，單核細胞增多性李斯特菌蛋白質ActA含有四種此類序列。此等為KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO：5)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO：6)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO：7)及RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO：8)。鏈球菌屬(Streptococcus sp.)之鏈球菌溶血素O(Streptolysin O)含有PEST序列。舉例而言，化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)鏈球菌溶血素O在胺基酸35-51處包含PEST序列KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO：9)且馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)鏈球菌溶血素O在胺基酸38-54處包含PEST樣序列KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO：10)。另外，咸信PEST序列可包埋於抗原蛋性白質內。因此，出於本發明之目的，當相對於PEST序列融合時，「融合」意謂抗原性蛋白質包含 抗原及連接於抗原之一端或包埋於抗原內之PEST胺基酸序列。在其他實施例中，PEST序列或含有PEST之多肽不為融合蛋白之部分，或多肽不包括異源抗原。
在另一實施例中，構築體或核酸分子自游離型或質體載體表現，具有編碼含有PEST序列之多肽或PEST序列肽的核酸序列。在另一實施例中，質體在無抗生素選擇存在的情況下穩定保持於重組李斯特菌菌株中。在另一實施例中，質體不賦予重組李斯特菌以抗生素耐藥性。在另一實施例中，片段為功能片段。在另一實施例中，片段為免疫原性片段。
在另一實施例中，用於建構本發明之疫苗的LLO蛋白具有序列： (Genbank寄存編號P13128；SEQ ID NO：2；核酸序列 闡述於GenBank寄存編號X15127中)。對應於此序列的前蛋白之前25 AA為信號序列且當由細菌分泌時自LLO裂解。因此，在此實施例中，全長活性LLO蛋白為504個殘基長。在另一實施例中，上述LLO片段用作併入本發明之疫苗中的LLO片段的來源。各可能性代表本發 明之各別實施例。
在另一實施例中，用於本發明之組合物及方法中的LLO蛋白之N端片段具有序列： (SEQ ID NO：3)。
在另一實施例中，LLO片段對應於本文所用之LLO蛋白的約AA 20-442。
在另一實施例中，LLO片段具有序列： (SEQ ID NO：4)。
在另一實施例中，術語「N端LLO片段」、「截斷LLO」、「△LLO」或其語法等效物在本文中可互換地使用且係指非溶血性之LLO片段。在另一實施例中，該等術語係指包含推定PEST序列之LLO片段。
在另一實施例中，LLO片段藉由活化結構域之缺失或突變而呈現非溶血性。在另一實施例中，LLO片段藉由包含半胱胺酸484之區的缺失或突變而呈現非溶血性。在另一實施例中，如以引用的方式併入本文中的美國專利第8,771,702號中詳細描述，LLO藉由膽固醇結合域(CBD)之缺失或突變而呈現非溶血性。
在另一實施例中，LLO片段包含野生型LLO蛋白的前441 AA。在另一實施例中，LLO片段包含野生型LLO的前420 AA。在另一實施例中，LLO片段為野生型LLO蛋白的非溶血性形式。
在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-25組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-50組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-75組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-100組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-125組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-150組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1175組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-200組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-225組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-250組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-275組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-300組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-325組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-350組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-375組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-400組成。在另一實施例中，LLO片段由約殘基1-425組成。
在另一實施例中，LLO片段含有對應於上述AA範圍中之一者的同源LLO蛋白之殘基。在另一實施例中，殘基數目無需與上文列舉之殘基數目精確對應；例如若同源LLO蛋白相對於本文所用之LLO蛋白具有插入或缺失，則殘基數目可據此調整。在另一實施例中，LLO片段為此項技術中已知的任何其他LLO片段。
在另一實施例中，同源LLO係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於70%。在另一實施例中，同源LLO係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於72%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於75%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於78%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO 序列的一致性大於80%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於82%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於83%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於85%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於87%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於88%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於90%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於92%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於93%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於95%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於96%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於97%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於98%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於99%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之LLO序列的一致性大於100%。
在一個實施例中，ActA蛋白包含SEQ ID NO：11中闡述之序列： 。對應於此序列的前蛋白之前29 AA為信號序列且 當由細菌分泌時自ActA蛋白裂解。在一個實施例中，ActA多肽或肽包含信號序列，上述SEQ ID NO：11之AA 1-29。在另一實施例中，ActA多肽或肽不包括信號序列，上述SEQ ID NO：11之AA 1-29。
在一個實施例中，截斷ActA蛋白包含ActA蛋白的N端片段。在另一實施例中，截斷ActA蛋白為ActA蛋白的N端片段。在一個實施例中，截斷ActA蛋白包含SEQ ID NO：12中闡述之序列： 。在另一實施例中，ActA片段包含SEQ ID NO：12中闡述之 序列。
在另一實施例中，截斷ActA蛋白包含SEQ ID NO：13中闡述之序列：
在另一實施例中，ActA片段為此項技術中已知的任何其他ActA片段。各可能性代表本發明之各別實施例。
在另一實施例中，編碼截斷ActA蛋白之重組核苷酸包含SEQ ID NO：14中闡述之序列： 。在 另一實施例中，重組核苷酸具有SEQ ID NO：14中闡述之序列。在另一實施例中，重組核苷酸包含編碼ActA蛋白之片段的任何其他序列。
在另一實施例中，「截斷ActA」或「△ActA」係指包含PEST結構域的ActA片段。在另一實施例中，該等術語係指包含PEST序列之ActA片段。
在另一實施例中，PEST序列為源自原核生物之另一PEST AA序 列。在另一實施例中，PEST序列為此項技術中已知的任何其他PEST序列。
在另一實施例中，ActA片段由ActA蛋白的約前100 AA組成。
在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-25組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-50組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-75組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-100組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-125組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-150組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-175組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-200組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-225組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-250組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-275組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-300組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-325組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-338組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-350組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-375組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-400組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-450組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-500組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-550組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-600組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-639組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-100組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-125組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-150組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-175組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-200組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-225組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-250組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-275組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-300組成。在另一實施例 中，ActA片段由約殘基30-325組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-338組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-350組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-375組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-400組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-450組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-500組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-550組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基1-600組成。在另一實施例中，ActA片段由約殘基30-604組成。各可能性代表本發明之各別實施例。
在另一實施例中，ActA片段含有對應於上述AA範圍中之一者的同源ActA蛋白之殘基。在另一實施例中，殘基數目無需與上文列舉之殘基數目精確對應；例如若同源ActA蛋白相對於本文所用之ActA蛋白具有插入或缺失，則殘基數目可據此調整。在另一實施例中，ActA片段為此項技術中已知的任何其他ActA片段。
在另一實施例中，同源ActA係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於70%。在另一實施例中，同源ActA係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於72%。在另一實施例中，同源ActA係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於75%。在另一實施例中，同源ActA係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於78%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於80%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於82%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於83%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於85%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於87%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於88%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於90%。在另一實施例中，同源係指與SEQ ID No：11中之一者的一致性大於92%。在另一實 施例中，同源係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於93%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於95%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於96%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於97%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於98%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於99%。在另一實施例中，同源係指與本文揭示之ActA序列的一致性大於100%。
熟練技術人員應瞭解，術語「同源」當涉及本文揭示之任何核酸序列時可指候選序列中與相應原生核酸序列之核苷酸相同的核苷酸的百分比。
在一個實施例中，藉由此項技術中充分描述之方法，藉由用於序列比對之電腦算法測定同源性。舉例而言，核酸序列同源性之電腦算法分析可包括利用多種可獲得之軟體套件，諸如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPT及TREMBL套件。
在另一實施例中，「同源」係指與選自本文揭示之序列的序列一致性大於68%。在另一實施例中，「同源」係指與選自本文揭示之序列的序列一致性大於70%。在另一實施例中，「同源」係指與選自本文揭示之序列的序列一致性大於72%。在另一實施例中，一致性大於75%。在另一實施例中，一致性大於78%。在另一實施例中，一致性大於80%。在另一實施例中，一致性大於82%。在另一實施例中，一致性大於83%。在另一實施例中，一致性大於85%。在另一實施例中，一致性大於87%。在另一實施例中，一致性大於88%。在另一實施例中，一致性大於90%。在另一實施例中，一致性大於92%。在另一實施例中，一致性大於93%。在另一實施例中，一致性大於95%。 在另一實施例中，一致性大於96%。在另一實施例中，一致性大於97%。在另一實施例中，一致性大於98%。在另一實施例中，一致性大於99%。在另一實施例中，一致性為100%。
在另一實施例中，經由測定候選序列雜交來測定同源性，其方法在此項技術中充分描述(參看例如「Nucleic Acid Hybridization」Hames,B.D.及Higgins S.J.編.(1985)；Sambrook等人，2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.；以及Ausubel等人，1989,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y)。舉例而言，可在中等至嚴格條件下進行與編碼原生卡斯蛋白酶肽之DNA的補體雜交之方法。雜交條件為例如在42℃下，在包含以下之溶液中培育隔夜：10-20%甲醯胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×登哈特溶液(Denhardt's solution)、10%硫酸葡聚糖及20μg/ml變性修剪鮭魚精子DNA。
在一個實施例中，本文揭示之重組李斯特菌菌株不具有抗生素耐藥性基因。在另一實施例中，本文揭示之重組李斯特菌菌株包含具有編碼抗生素耐藥性基因之核酸的質體。
在一個實施例中，本文揭示之重組李斯特菌能夠自吞噬溶菌體逃脫。
在一個實施例中，異源抗原或抗原多肽與李斯特菌染色體中之LLO同框整合。在另一實施例中，整合之核酸分子與ActA同框整合至actA基因座中。在另一實施例中，編碼ActA之染色體核酸經編碼抗原之核酸分子置換。
在一個實施例中，異源抗原為腫瘤相關抗原。在另一實施例中，腫瘤相關抗原為天然存在之腫瘤相關抗原。在另一實施例中，腫瘤相關抗原為合成腫瘤相關抗原。在另一實施例中，腫瘤相關抗原為 嵌合腫瘤相關抗原。
在一個實施例中，本文揭示之重組李斯特菌包含核酸分子。在另一實施例中，本文揭示之核酸分子包含編碼包含異源抗原或其片段之重組多肽的第一開放閱讀框架。在另一實施例中，重組多肽進一步包含融合至異源抗原之截斷LLO蛋白、截斷ActA蛋白或PEST序列肽。在另一實施例中，截斷LLO蛋白為N端LLO或其片段。在另一實施例中，截斷ActA蛋白為N端ActA蛋白或其片段。
在另一實施例中，本文揭示之核酸分子包含編碼重組多肽之第一開放閱讀框架，該多肽包含截斷LLO蛋白、截斷ActA蛋白或PEST序列肽，其中該截斷LLO蛋白、截斷ActA蛋白或PEST序列肽不融合至異源抗原。在另一實施例中，第一開放閱讀框架編碼包含N端LLO或其片段之截斷LLO蛋白。在另一實施例中，第一開放閱讀框架編碼包含N端ActA蛋白或其片段之截斷ActA蛋白。在另一實施例中，第一開放閱讀框架編碼基本上由N端LLO或其片段組成的截斷LLO蛋白。在另一實施例中，第一開放閱讀框架編碼基本上由N端ActA蛋白或其片段組成的截斷ActA蛋白。在另一實施例中，第一開放閱讀框架編碼由N端LLO或其片段組成的截斷LLO蛋白。在另一實施例中，第一開放閱讀框架編碼由N端ActA蛋白或其片段組成的截斷ActA蛋白。
在一個實施例中，術語「抗原」、「抗原片段」、「抗原部分」、「異源蛋白質」、「異源抗原」、「異源蛋白質抗原」、「蛋白質抗原」、「抗原」、「抗原多肽」或其語法等效物在本文中可互換地使用且欲指經處理且當存在於宿主中時，或在另一實施例中被宿主偵測到時，呈現於個體細胞中存在的I級及/或II級MHC分子上導致形成免疫反應的如本文所述之多肽、肽或重組肽。在一個實施例中，抗原可非宿主所原有。在另一實施例中，抗原可存在於宿主中，但宿主因為免疫耐受性而不會引起對其之免疫反應。
在一個實施例中，本文揭示之核酸分子進一步包含編碼代謝酶之第二開放閱讀框架。在另一實施例中，代謝酶補充重組李斯特菌菌株的染色體中不具有的內源性基因。在另一實施例中，由第二開放閱讀框架編碼之代謝酶為丙胺酸消旋酶(Dal)。在另一實施例中，由第二開放閱讀框架編碼之代謝酶為D-胺基酸轉移酶(Dat)。在另一實施例中，本文揭示之李斯特菌菌株在內源性dal/dat基因中包含突變。在另一實施例中，李斯特菌不具有dal/dat基因。在另一實施例中，李斯特菌染色體中缺失dal/dat基因。在另一實施例中，李斯特菌染色體中截斷dal/dat基因。
在另一實施例中，所揭示方法及組合物之核酸分子與啟動子/調節序列可操作地連接。在另一實施例中，所揭示方法及組合物之第一開放閱讀框架與啟動子/調節序列可操作地連接。在另一實施例中，所揭示方法及組合物之第二開放閱讀框架與啟動子/調節序列可操作地連接。在另一實施例中，各開放閱讀框架與啟動子/調節序列可操作地連接。
在另一實施例中，「代謝酶」係指合成宿主細菌所需營養所涉及的酶。在另一實施例中，術語係指合成宿主細菌所需營養所需的酶。在另一實施例中，術語係指合成宿主細菌所利用營養所涉及的酶。在另一實施例中，術語係指合成維持宿主細菌生長所需之營養所涉及的酶。在另一實施例中，合成營養需要該酶。
在另一實施例中，重組李斯特菌為減毒營養缺陷型菌株。在另一實施例中，重組李斯特菌為美國專利第8,114,414號中所述之Lm-LLO-E7菌株，該案以全文引用的方式併入本文中。
在一個實施例中，減毒菌株為dal(-)dat(-)(Lmdd)。在另一實施例中，減毒菌株為Lm dal(-)dat(-)△actA(LmddA)。LmddA基於由於缺失毒性基因actA而減毒之李斯特菌菌株，且藉由補充dal基因而保留用 於所需異源抗原或活體內及活體外截斷LLO表現的質體。
在另一實施例中，減毒菌株為Lm△actA。在另一實施例中，減毒菌株為Lm△PrfA。在另一實施例中，減毒菌株為Lm△PlcB。在另一實施例中，減毒菌株為Lm△PlcA。在另一實施例中，菌株為任何上述菌株的二次突變體或三次突變體。在另一實施例中，此菌株發揮強輔助作用，此為以李斯特菌為主的疫苗的固有特性。在另一實施例中，此菌株自EGD李斯特菌主鏈建構。在另一實施例中，本發明中所用之菌株為表現非溶血性LLO的李斯特菌菌株。
在另一實施例中，李斯特菌菌株為營養缺陷型突變。在另一實施例中，李斯特菌菌株缺乏編碼維生素合成基因之基因。在另一實施例中，李斯特菌菌株缺乏編碼泛酸合成酶之基因。
在一個實施例中，可例如使用熟習此項技術者熟知的許多方法產生缺乏D-丙胺酸的李斯特菌AA菌株，包括缺失突變誘發、插入突變誘發及導致產生讀框轉移突變的突變誘發、引起蛋白質提前終止之突變或影響基因表現的調節序列突變。在另一實施例中，可使用重組DNA技術或使用利用突變誘發化學物質或輻射且隨後選擇突變體的慣用突變誘發技術實現突變誘發。在另一實施例中，缺失突變體較佳，因為伴隨著營養缺陷型表型逆轉機率低。在另一實施例中，可在簡單實驗室培養分析法中測試根據本文提出之方案產生的D-丙胺酸之突變體在無D-丙胺酸存在下生長的能力。在另一實施例中，選擇不能在無此化合物存在下生長的彼等突變體進行進一步研究。
在另一實施例中，除了上述D-丙胺酸相關基因之外，如本文所揭示合成代謝酶中所涉及的其他基因可用作李斯特菌突變誘發的目標。
在另一實施例中，代謝酶補充重組菌株之染色體的剩餘部分中缺乏的內源性代謝基因。在一個實施例中，染色體中的內源性代謝基 因突變。在另一實施例中，染色體缺失內源性代謝基因。在另一實施例中，代謝酶為胺基酸代謝酶。在另一實施例中，代謝酶催化用於重組李斯特菌菌株中細胞壁合成的胺基酸形成。在另一實施例中，代謝酶為丙胺酸消旋酶。在另一實施例中，代謝酶為D-胺基酸轉移酶。
在一個實施例中，營養缺陷型李斯特菌菌株包含游離型表現載體，其包含補充營養缺陷型李斯特菌菌株之營養缺陷之代謝酶。在另一實施例中，構築體以游離型方式含於李斯特菌菌株中。在另一實施例中，外來抗原由重組李斯特菌菌株容納之載體表現。在另一實施例中，游離型表現載體缺乏抗生素耐性標記物。在一個實施例中，如本文所揭示之方法及組合物的抗原融合至包含PEST序列之多肽。
在另一實施例中，李斯特菌菌株缺乏胺基酸(AA)代謝酶。在另一實施例中，李斯特菌菌株缺乏D-麩胺酸合成酶基因。在另一實施例中，李斯特菌菌株缺乏dal基因。在另一實施例中，李斯特菌菌株缺乏dga基因。在另一實施例中，李斯特菌菌株缺乏合成二胺基庚二酸所涉及之基因CysK。在另一實施例中，該基因為維生素-B12不依賴型甲硫胺酸合成酶。在另一實施例中，基因為trpA。在另一實施例中，基因為trpB。在另一實施例中，基因為trpE。在另一實施例中，基因為asnB。在另一實施例中，基因為gltD。在另一實施例中，基因為gltB。在另一實施例中，基因為leuA。在另一實施例中，基因為argG。在另一實施例中，基因為thrC。在另一實施例中，李斯特菌菌株缺乏上文所述的一或多個基因。
在另一實施例中，李斯特菌菌株缺乏合成酶基因。在另一實施例中，基因為AA合成基因。在另一實施例中，基因為folP。在另一實施例中，基因為二氫尿苷合成酶家族蛋白質。在另一實施例中，基因為ispD。在另一實施例中，基因為ispF。在另一實施例中，基因為磷酸烯醇丙酮酸合成酶。在另一實施例中，基因為hisF。在另一實施例 中，基因為hisH。在另一實施例中，基因為fliI。在另一實施例中，基因為核糖體大子單元假尿苷合成酶。在另一實施例中，基因為ispD。在另一實施例中，基因為雙功能GMP合成酶/麩醯胺酸醯胺轉移酶蛋白質。在另一實施例中，基因為cobS。在另一實施例中，基因為cobB。在另一實施例中，基因為cbiD。在另一實施例中，基因為尿卟啉-III C-甲基轉移酶/尿卟啉原-III合成酶。在另一實施例中，基因為cobQ。在另一實施例中，基因為uppS。在另一實施例中，基因為truB。在另一實施例中，基因為dxs。在另一實施例中，基因為mvaS。在另一實施例中，基因為dapA。在另一實施例中，基因為ispG。在另一實施例中，基因為folC。在另一實施例中，基因為檸檬酸酯合成酶。在另一實施例中，基因為argJ。在另一實施例中，基因為3-去氧-7-磷酸庚酮糖合成酶。在另一實施例中，基因為吲哚-3-丙三醇-磷酸酯合成酶。在另一實施例中，基因為鄰胺基苯甲酸酯合成酶/麩醯胺酸醯胺轉移酶組分。在另一實施例中，基因為menB。在另一實施例中，基因為甲萘醌類特異性異分支酸合成酶。在另一實施例中，基因為磷酸核糖甲醯甘胺脒合成酶I或II。在另一實施例中，基因為磷酸核糖胺基咪唑-琥珀羧胺合成酶。在另一實施例中，基因為carB。在另一實施例中，基因為carA。在另一實施例中，基因為thyA。在另一實施例中，基因為mgsA。在另一實施例中，基因為aroB。在另一實施例中，基因為hepB。在另一實施例中，基因為rluB。在另一實施例中，基因為ilvB。在另一實施例中，基因為ilvN。在另一實施例中，基因為alsS。在另一實施例中，基因為fabF。在另一實施例中，基因為fabH。在另一實施例中，基因為假尿苷合成酶。在另一實施例中，基因為pyrG。在另一實施例中，基因為truA。在另一實施例中，基因為pabB。在另一實施例中，基因為atp合成酶基因(例如atpC、atpD-2、aptG、atpA-2等)。
在另一實施例中，基因為phoP。在另一實施例中，基因為aroA。在另一實施例中，基因為aroC。在另一實施例中，基因為aroD。在另一實施例中，基因為plcB。
在另一實施例中，李斯特菌菌株缺乏肽轉運體。在另一實施例中，基因為ABC轉運體/ATP結合/透性酶蛋白質。在另一實施例中，基因為寡肽ABC轉運體/寡肽-結合蛋白。在另一實施例中，基因為寡肽ABC轉運體/透性酶蛋白質。在另一實施例中，基因為鋅ABC轉運體/鋅結合蛋白。在另一實施例中，基因為糖ABC轉運體。在另一實施例中，基因為磷酸酯轉運體。在另一實施例中，基因為ZIP鋅轉運體。在另一實施例中，基因為EmrB/QacA家族之耐藥性轉運體。在另一實施例中，基因為硫酸酯轉運體。在另一實施例中，基因為質子依賴性寡肽轉運體。在另一實施例中，基因為鎂轉運體。在另一實施例中，基因為甲酸酯/亞硝酸酯轉運體。在另一實施例中，基因為亞精胺/腐胺ABC轉運體。在另一實施例中，基因為Na/Pi-共轉運體。在另一實施例中，基因為糖磷酸酯轉運體。在另一實施例中，基因為麩醯胺酸ABC轉運體。在另一實施例中，基因為主要協助轉運蛋白家族轉運體。在另一實施例中，基因為甘胺酸甜菜鹼/L-脯胺酸ABC轉運體。在另一實施例中，基因為鉬ABC轉運體。在另一實施例中，基因為磷壁酸ABC轉運體。在另一實施例中，基因為鈷ABC轉運體。在另一實施例中，基因為銨轉運體。在另一實施例中，基因為胺基酸ABC轉運體。在另一實施例中，基因為細胞分裂ABC轉運體。在另一實施例中，基因為錳ABC轉運體。在另一實施例中，基因為鐵化合物ABC轉運體。在另一實施例中，基因為麥芽糖/麥芽糊精ABC轉運體。在另一實施例中，基因為Bcr/CflA家族之耐藥性轉運體。在另一實施例中，基因為上述蛋白質中之一者的子單元。
在一個實施例中，本文揭示用於轉型李斯特菌以獲得重組李斯 特菌之核酸分子。在另一實施例中，本文揭示之核酸用於轉型不具有毒性基因之李斯特菌。在另一實施例中，核酸分子整合至李斯特菌基因組中且攜帶非功能性毒性基因。在另一實施例中，重組李斯特菌中的毒性基因發生突變。在另一實施例中，核酸分子用於不活化李斯特菌基因組中存在的內源性基因。在另一實施例中，毒性基因為actA基因、inlA基因及inlB基因、inlC基因、inlJ基因、plbC基因、bsh基因或prfA基因。熟練技術人員應理解，毒性基因可為此項技術中已知與重組李斯特菌之毒性有關的任何基因。
在一個實施例中，李斯特菌菌株包含一或多種內源性基因中的突變。在另一實施例中，李斯特菌菌株為dal突變體、dat突變體、inlA突變體、inlB突變體、inlC突變體、inlJ突變體、prfA突變體、actA突變體、dal/dat突變體、prfA突變體、plcB缺失突變體或plcA及plcB或actA及inlB或dal及dat的二次突變體，或dal/dat及actA的三次突變體。在另一實施例中，本文揭示之李斯特菌包含此等基因中之任一者或與此等基因之組合中的突變。在另一實施例中，本文揭示之李斯特菌不具有此等基因中之每一者。在另一實施例中，本文揭示之李斯特菌不具有本文揭示之任何基因中的至少一者及高達十者，包括actA、prfA及dal/dat基因。
在另一實施例中，包含dal及dat突變之李斯特菌菌株由李斯特菌菌株內之質體中存在的核酸序列中的第二開放閱讀框架編碼之代謝酶。在另一實施例中，包含prfA突變之李斯特菌菌株經包含D133V胺基酸突變之突變PrfA蛋白補充。在另一實施例中，突變D133V PrfA蛋白由李斯特菌菌株內之質體中存在的核酸序列中的第二開放閱讀框架編碼。
在一個實施例中，活減毒李斯特菌為重組李斯特菌。在另一實施例中，重組李斯特菌包含染色體組內化蛋白C(inlC)基因中的突 變。在另一實施例中，重組李斯特菌包含染色體組actA基因及染色體組內化蛋白C基因中的突變。在一個實施例中，藉由過程中涉及的缺失actA基因及/或inlC基因抑制李斯特菌至相鄰細胞的移位，由此導致出乎意料高含量之減毒，提高免疫原性且用作疫苗主鏈。
在一個實施例中，李斯特菌菌株之染色體中不具有代謝基因、毒性基因等。在另一實施例中，李斯特菌菌株之染色體及任何游離型基因元件中不具有代謝基因、毒性基因等。在另一實施例中，毒性菌株之基因組中不具有代謝基因、毒性基因等。在一個實施例中，染色體中的毒性基因突變。在另一實施例中，染色體的毒性基因缺失。
在一個實施例中，本文揭示之重組李斯特菌菌株經減毒。在另一實施例中，重組李斯特菌不具有actA毒性基因。在另一實施例中，重組李斯特菌不具有prfA毒性基因。在另一實施例中，重組李斯特菌不具有inlB基因。在另一實施例中，重組李斯特菌不具有actA及inlB基因。在另一實施例中，本文揭示之重組李斯特菌菌株包含內源性actA基因的不活化突變。在另一實施例中，本文揭示之重組李斯特菌菌株包含內源性inlB基因的不活化突變。在另一實施例中，本文揭示之重組李斯特菌菌株包含內源性inlC基因的不活化突變。在另一實施例中，本文揭示之重組李斯特菌菌株包含內源性actA及inlB基因的不活化突變。在另一實施例中，本文揭示之重組李斯特菌菌株包含內源性actA及inlC基因的不活化突變。在另一實施例中，本文揭示之重組李斯特菌菌株包含內源性actA、inlB及inlC基因的不活化突變。在另一實施例中，本文揭示之重組李斯特菌菌株包含內源性actA、inlB及inlC基因的不活化突變。在另一實施例中，本文揭示之重組李斯特菌菌株包含內源性actA、inlB及inlC基因的不活化突變。在另一實施例中，本文揭示之重組李斯特菌菌株包含以下基因中任何單個基因或組合中的不活化突變：actA、dal、dat、inlB、inlC、prfA、plcA、 plcB。
熟練技術人員應瞭解，術語「突變」及其語法等效物包括序列(核酸或胺基酸序列)的任何類型之突變或修飾，且包括缺失、截斷、不活化、破壞、替代或移位。此項技術中容易已知此等類型之突變。
在一個實施例中，為了選擇包含編碼代謝酶之質體或補充基因之營養缺陷型細菌，諸如營養缺陷型李斯特菌，使經轉型營養缺陷型細菌在將選擇用於表現胺基酸代謝基因或補充基因的培養基上生長。在另一實施例中，用於D-麩胺酸合成之營養缺陷型細菌用包含用於D-麩胺酸合成之基因的質體轉型，且營養缺陷型細菌將在無D-麩胺酸存在下生長，而未使用質體轉型或不表現編碼用於D-麩胺酸合成之蛋白質的質體之營養缺陷型細菌將不生長。在另一實施例中，當經轉型及表現本發明之質體時，若質體包含編碼用於D-丙胺酸合成之胺基酸代謝酶的經分離核酸，則用於D-丙胺酸合成之營養缺陷型細菌將在無D-丙胺酸存在下生長。此類用於製備包含或不具有必要生長因子、補充劑、胺基酸、維生素、抗生素及其類似物的適當培養基之方法為此項技術中所熟知，且市場有售(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。
在另一實施例中，一旦已基於適當培養基選擇包含補充質體之營養缺陷型細菌，則細菌在選擇性壓力存在下繁殖。此類繁殖包含在無營養缺陷型因子之培養基中生長細菌。營養缺陷型細菌中表現胺基酸代謝酶之質體的存在確保質體將與細菌一起複製，因此持續選擇含有質體之細菌。熟練技術人員根據本文的本發明揭示內容及方法將能夠容易地藉由調整生長有包含質體之營養缺陷型細菌的培養基體積來按比例擴大重組李斯特菌菌株的產量。
在另一實施例中，熟練技術人員將瞭解其他營養缺陷型菌株及補充系統用於與本發明一起使用。
在一個實施例中，N端LLO蛋白片段及異源抗原直接彼此融合。 在另一實施例中，編碼N端LLO蛋白片段及異源抗原之基因直接彼此融合。在另一實施例中，N端LLO蛋白片段及異源抗原經連接肽可操作地連接。在另一實施例中，N端LLO蛋白片段及異源抗原經異源肽連接。在另一實施例中，N端LLO蛋白片段為異源抗原之N端。在另一實施例中，N端LLO蛋白片段單獨表現及使用，即以未融合形式。在另一實施例中，N端LLO蛋白片段為融合蛋白的N端大部分。在另一實施例中，截斷LLO在C端截斷以獲得N端LLO。在另一實施例中，截斷LLO為非溶血性LLO。
如本文所揭示，粒細胞性MDSC的抑制能力存在出人意料之改變且此是由於與搭檔融合抗原無關的tLLO過度表現(參看實例19)。
在一個實施例中，N端ActA蛋白片段及異源抗原直接彼此融合。在另一實施例中，編碼N端ActA蛋白片段及異源抗原之基因直接彼此融合。在另一實施例中，N端ActA蛋白片段及異源抗原經連接肽可操作地連接。在另一實施例中，N端ActA蛋白片段及異源抗原經異源肽連接。在另一實施例中，N端ActA蛋白片段為異源抗原之N端。在另一實施例中，N端ActA蛋白片段單獨表現及使用，即以未融合形式。在另一實施例中，N端ActA蛋白片段為融合蛋白的N端大部分。在另一實施例中，截斷ActA在C端截斷以獲得N端ActA。
在一個實施例中，本文揭示之重組李斯特菌菌株表現重組多肽。在另一實施例中，重組李斯特菌菌株包含編碼重組多肽之質體。在另一實施例中，本文揭示之重組核酸在本文揭示之重組李斯特菌菌株中的質體中。在另一實施例中，質體為未整合至重組李斯特菌菌株之染色體中的游離型質體。在另一實施例中，質體為整合至李斯特菌菌株之染色體中的整合性質體。在另一實施例中，質體為多重複制質體。
一個實施例，如本文所揭示之組合物及方法的重組李斯特菌菌 株表現由腫瘤細胞表現的異源抗原多肽。在一個實施例中，腫瘤相關抗原為前列腺特異性抗原(PSA)。在另一實施例中，腫瘤相關抗原為人類乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原。在另一實施例中，腫瘤相關抗原為如美國專利公開案第US2011/014279號中所述的Her2/neu嵌合抗原，該案以全文引用的方式併入本文中。在另一實施例中，腫瘤相關抗原為血管生成抗原。
在一個實施例中，如本文所揭示之組合物及方法的重組李斯特菌菌株包含編碼前列腺特異性抗原(PSA)之第一或第二核酸分子，在一個實施例中，該抗原為前列腺腫瘤高度表現的前列腺癌之標記物。在一個實施例中，PSA為前列腺上皮細胞分泌之血管舒緩素絲胺酸蛋白酶(KLK3)，在一個實施例中，其廣泛用作前列腺癌之標記物。如本文中所使用，術語PSA及KLK3可互換且全部含義及品質均相同。
在一個實施例中，如本文所揭示之重組李斯特菌菌株包含編碼腫瘤相關抗原之核酸分子。在一個實施例中，腫瘤相關抗原包含KLK3多肽或其片段。在一個實施例中，如本文所揭示之重組李斯特菌菌株包含編碼KLK3蛋白之核酸分子。
在另一實施例中，KLK3蛋白具有序列： (SEQ ID No：15； GenBank寄存編號.CAA32915)。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：15之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：15之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：15之異構體。 在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：15之片段。各可能性代表本文揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，KLK3蛋白具有序列： (SEQ ID No：16)。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO： 16之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：16之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：16之異構體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：16之片段。各可能性代表本文揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，KLK3蛋白具有序列： (SEQ ID No：17；GenBank寄存編號.AAA59995.1)。在另一實施例 中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：17之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：17之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：17之異構體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：17之片段。各可能性代表本文揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，KLK3蛋白藉由具有以下序列之核苷酸分子編碼： (SEQ ID No：18；GenBank寄存編號X14810)。在另一實施 例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：18之殘基401..446、1688..1847、3477..3763、3907..4043及5413..5568編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：18之同系物編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：18之變異體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：18之異構體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：18之片段編碼。各可能性代表本文揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，KLK3蛋白具有序列： (SEQ ID No：19；GenBank寄存編號.NP_001019218)。在另一實 施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：19之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：19之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：19之異構體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：19之片段。各可能性代表如本文所揭示之各別實施例。
在另一實施例中，KLK3蛋白藉由具有以下序列之核苷酸分子編碼： (SEQ ID No：20；GenBank寄存 編號.NM_001030047)。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：20之殘基42-758編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：20之同系物編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：20之變異體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：20之異構體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：20之片段編碼。
在另一實施例中，KLK3蛋白具有序列：MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRK(SEQ ID No：21；GenBank寄存編號.NP_001025221)。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：21之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：21之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白之序列包含SEQ ID NO：21。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：21之異構體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：21之片段。各可能性代表如本文所揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，KLK3蛋白藉由具有以下序列之核苷酸分子編碼： (SEQ ID No：22)。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：22之殘基42-758編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：22之同系物編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：22之變異體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：22之異構體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：22之片段編碼。各可能性代表如本文所揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，為KLK3肽之來源的KLK3蛋白具有序列： (SEQ ID No：23)。在 另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：23之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：23之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：23之異構體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：23之片段。
在另一實施例中，KLK3蛋白藉由具有以下序列之核苷酸分子編碼： (SEQ ID No：24)。在另一實施例中，KLK3 蛋白由SEQ ID NO：24之殘基42-758編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：24之同系物編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：24之變異體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：24之異構體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：24之片段編碼。各可能性代表如本文所揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，KLK3蛋白具有序列： (SEQ ID No：25； GenBank寄存編號.NP_001025219)。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：25之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO： 25之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：25之異構體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：25之片段。各可能性代表本文揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，KLK3蛋白藉由具有以下序列之核苷酸分子編碼： (SEQ ID No：26；GenBank寄存編號.NM_001030048)。 在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：26之殘基42-758編碼。在 另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：26之同系物編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：26之變異體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：26之異構體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：26之片段編碼。各可能性代表如本文所揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，KLK3蛋白具有序列： (SEQ ID No：27；GenBank寄存 編號.NP_001639)。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：27之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：27之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：27之異構體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：27之片段。
在另一實施例中，KLK3蛋白藉由具有以下序列之核苷酸分子編碼： (SEQ ID No：28；GenBank寄存編號.NM_001648)。在 另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：28之殘基42-827編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：28之同系物編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：28之變異體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：28之異構體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：28之片段編碼。
在另一實施例中，KLK3蛋白具有序列： (SEQ ID No：29 GenBank寄存編 號.AAX29407.1)。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：29之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：29之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：29之異構體。在另一實施例中，KLK3蛋白之序列包含SEQ ID NO：29。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：29之片段。
在另一實施例中，KLK3蛋白藉由具有以下序列之核苷酸分子編碼： (SEQ ID No：30； GenBank寄存編號.BC056665)。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：30之殘基47-832編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：30之同系物編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：30之變異體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：30之異構體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：30之片段編碼。
在另一實施例中，KLK3蛋白具有序列： (SEQ ID No：31； GenBank寄存編號.AJ459782)。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：31之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：31之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：31之異構體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：31之片段。
在另一實施例中，KLK3蛋白具有序列： (SEQ ID No：32，GenBank寄存編號.AJ512346)。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：32之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：32之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：32之異構體。在另一實施例中，KLK3蛋白之序列包含SEQ ID NO：32。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：32之片段。
在另一實施例中，KLK3蛋白具有序列： (SEQ ID No：33；GenBank寄存編號.AJ459784)。在另一實 施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：33之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：33之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：33之異構體。在另一實施例中，KLK3蛋白之序列包含SEQ ID NO：33。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：33之片段。
在另一實施例中，KLK3蛋白具有序列： (SEQ ID NO：34 GenBank寄存 編號.AJ459783)。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：34之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：34之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：34之異構體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：34之片段。
在另一實施例中，KLK3蛋白藉由具有以下序列之核苷酸分子編碼： (SEQ ID No：35；GenBank寄存編號.X07730)。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：35之殘基67-1088編碼。在另一實施例中， KLK3蛋白由SEQ ID NO：35之同系物編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：35之變異體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：35之異構體編碼。在另一實施例中，KLK3蛋白由SEQ ID NO：35之片段編碼。
在另一實施例中，KLK3蛋白具有序列：MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRK(SEQ ID No：36；GenBank寄存編號.NM_001030050)。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：36之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：36之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：36之異構體。在另一實施例中，KLK3蛋白之序列包含SEQ ID NO：36。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：36之片段。
在另一實施例中，為KLK3肽之來源的KLK3蛋白具有序列： (SEQ ID No：37； GenBank寄存編號.NM_001064049)。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：37之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：37之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：37之異構體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：37之片段。
在另一實施例中，KLK3蛋白具有序列： (SEQ ID No：38； GenBank寄存編號.NM_001030048)。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：38之同系物。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：38之變異體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：38之異構體。在另一實施例中，KLK3蛋白為SEQ ID NO：38之片段。
在另一實施例中，KLK3蛋白由以下GenBank寄存編號中之一者所述的序列編碼：BC005307、AJ310938、AJ310937、AF335478、AF335477、M27274及M26663。在另一實施例中，KLK3蛋白由上述GenBank寄存編號中之一者中所述的序列編碼。
在另一實施例中，KLK3蛋白由以下GenBank寄存編號中之一者所述的序列編碼：NM_001030050、NM_001030049、NM_001030048、NM_001030047、NM_001648、AJ459782、AJ512346或AJ459784。各可能性代表如本文所揭示之方法及組合物的各別實施例。在一個實施例中，KLK3蛋白由本文所述之任何序列的變化形式編碼，其中序列不具有MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSR(SEQ ID NO：39)。
在另一實施例中，KLK3蛋白具有包含以下GenBank寄存編號中之一者中所述之序列的序列：X13943、X13942、X13940、X13941及X13944。
在另一實施例中，KLK3蛋白為此項技術中已知的任何其他KLK3蛋白。
在另一實施例中，KLK3肽為此項技術中已知的任何其他KLK3肽。在另一實施例中，KLK3肽為此項技術中已知的任何其他KLK3肽之片段。各類型之KLK3肽代表本文揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，「KLK3肽」係指全長KLK3蛋白。在另一實施例中，術語係指KLK3蛋白之片段。在另一實施例中，術語係指不具有KLK3信號肽之KLK3蛋白的片段。在另一實施例中，術語係指含有除KLK3信號肽之外的整個KLK3序列的KLK3蛋白。在另一實施例中，「KLK3信號序列」係指自然界中在KLK3蛋白上發現的任何信號序列。在另一實施例中，如本文所揭示之方法及組合物的KLK3蛋白不含任何信號序列。各可能性代表本文揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，為用於如本文所揭示之方法及組合物的KLK3肽之來源的血管舒緩素相關肽酶3(KLK3蛋白)為PSA蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為P-30抗原蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為γ-精漿蛋白蛋白質。在另一實施例中，KLK3蛋白為血管舒緩素3蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為精子素酶蛋白質。在另一實施例中，KLK3蛋白為精子素蛋白質。在另一實施例中，KLK3蛋白為此項技術中已知的任何其他類型之KLK3蛋白。各可能性代表本文揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，KLK3蛋白為剪接變異體1 KLK3蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為剪接變異體2 KLK3蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為剪接變異體3 KLK3蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為轉錄變異體1 KLK3蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為轉錄變異體2 KLK3蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為轉錄變異體3 KLK3蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為轉錄變異體4 KLK3蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為轉錄變異體5 KLK3蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為轉錄變異體6 KLK3蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為剪接變異體RP5 KLK3蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為此項技術中已知的任何其他剪接變異體KLK3蛋白。在另一實施例中，KLK3 蛋白為此項技術中已知的任何其他轉錄變異體KLK3蛋白。各可能性代表本文揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，KLK3蛋白為成熟KLK3蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為原KLK3蛋白。在另一實施例中，已自如本文所揭示之方法及組合物的成熟KLK3蛋白移除前導序列。各可能性代表本文揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，為如本文所揭示之方法及組合物的KLK3肽之來源的KLK3蛋白為人類KLK3蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為靈長類動物KLK3蛋白。在另一實施例中，KLK3蛋白為此項技術中已知的任何其他物種之KLK3蛋白。在另一實施例中，上述KLK3蛋白中之一者在此項技術中稱為「KLK3蛋白」。
在一個實施例中，包含融合至本文揭示之PSA蛋白的截斷LLO之本文揭示之重組多肽由包含以下之序列編碼： (SEQ ID NO：91)。在另一實施例中， 融合蛋白由SEQ ID NO：91之同系物編碼。在另一實施例中，融合蛋白由SEQ ID NO：91之變異體編碼。在另一實施例中，融合蛋白由SEQ ID NO：91之異構體編碼。在一個實施例中，融合蛋白內之「ctcgag」序列表示用於將腫瘤抗原接合至質體中之截斷LLO的Xho I限制位點。
在另一實施例中，包含融合至本文揭示之PSA蛋白的截斷LLO之本文揭示之重組多肽包含以下序列： (PSA序列加了下劃線)(SEQ ID NO： 92)。在另一實施例中，tLLO-PSA融合蛋白為SEQ ID NO：92之同系物。在另一實施例中，tLLO-PSA融合蛋白為SEQ ID NO：92之變異體。在另一實施例中，tLLO-PSA融合蛋白為SEQ ID NO：92之異構 體。在另一實施例中，tLLO-PSA融合蛋白為SEQ ID NO：92之片段。
在一個實施例中，如本文所揭示之重組李斯特菌菌株包含編碼腫瘤相關抗原之核酸分子，其中抗原包含HPV-E7蛋白。在一個實施例中，如本文所揭示之重組李斯特菌菌株包含編碼HPV-E7蛋白之核酸分子。
在一個實施例中，整個E7蛋白或其片段中之任一者融合至LLO蛋白或其截斷物或肽、ActA蛋白或其截斷物或肽，或含有PEST樣序列之肽來產生本發明之組合物及方法的重組多肽或肽。在另一實施例中，所利用之E7蛋白(整個或用作片段之來源)具有序列 (SEQ ID No：40)。在另一實施例中，E7蛋白為SEQ ID NO： 40之同系物。在另一實施例中，E7蛋白為SEQ ID NO：40之變異體。在另一實施例中，E7蛋白為SEQ ID NO：40之異構體。在另一實施例中，E7蛋白為SEQ ID NO：40之片段。在另一實施例中，E7蛋白為SEQ ID NO：40之同系物的片段。在另一實施例中，E7蛋白為SEQ ID NO：40之變異體的片段。在另一實施例中，E7蛋白為SEQ ID NO：40之異構體的片段。各可能性代表本發明之各別實施例。
在另一實施例中，E7蛋白之序列為： (SEQ ID No：41)。在另一實施例中，E6蛋白為 SEQ ID NO：41之同系物。在另一實施例中，E6蛋白為SEQ ID NO：41之變異體。在另一實施例中，E6蛋白為SEQ ID NO：41之異構體。在另一實施例中，E6蛋白為SEQ ID NO：41之片段。在另一實施例中，E6蛋白為SEQ ID NO：41之同系物的片段。在另一實施例中，E6蛋白 為SEQ ID NO：41之變異體的片段。在另一實施例中，E6蛋白為SEQ ID NO：41之異構體的片段。各可能性代表本發明之各別實施例。
在另一實施例中，E7蛋白具有以下GenBank項中任一者所述之序列：M24215、NC_004500、V01116、X62843或M14119。在另一實施例中，E7蛋白為上述GenBank項中之一者的序列的同系物。在另一實施例中，E7蛋白為上述GenBank項中之一者之序列的變異體。在另一實施例中，E7蛋白為上述GenBank項中之一者之序列的異構體。在另一實施例中，E7蛋白為上述GenBank項中之一者之序列的片段。在另一實施例中，E7蛋白為上述GenBank項中之一者之序列之同系物的片段。在另一實施例中，E7蛋白為上述GenBank項中之一者之序列之變異體的片段。在另一實施例中，E7蛋白為上述GenBank項中之一者之序列之異構體的片段。各可能性代表本發明之各別實施例。
在一個實施例中，HPV抗原為HPV 16。在另一實施例中，HPV為HPV-18。在另一實施例中，HPV選自HPV-16及HPV-18。在另一實施例中，HPV為HPV-31。在另一實施例中，HPV為HPV-35。在另一實施例中，HPV為HPV-39。在另一實施例中，HPV為HPV-45。在另一實施例中，HPV為HPV-51。在另一實施例中，HPV為HPV-52。在另一實施例中，HPV為HPV-58。在另一實施例中，HPV為高風險HPV類型。在另一實施例中，HPV為黏膜HPV類型。各可能性代表本發明之各別實施例。
在一個實施例中，HPV E6來自HPV-16。在另一實施例中，HPV E7來自HPV-16。在另一實施例中，HPV-E6來自HPV-18。在另一實施例中，HPV-E7來自HPV-18。在另一實施例中，HPV E6抗原用於代替本發明組合物或方法中的E7抗原或除了本發明組合物或方法中的E7抗原使用HPV E6抗原來治療或改善HPV介導之疾病、病症或症狀。在另一實施例中，HPV-16 E6及E7用於代替HPV-18 E6及E7或與其組 合。在此實施例中，重組李斯特菌可表現來自染色體之HPV-16 E6及E7及來自質體之HPV-18 E6及E7，或反之亦然。在另一實施例中，HPV-16 E6及E7抗原及HPV-18 E6及E7抗原自本文揭示之重組李斯特菌中存在的質體表現。在另一實施例中，HPV-16 E6及E7抗原及HPV-18 E6及E7抗原自本文揭示之重組李斯特菌的染色體表現。在另一實施例中，HPV-16 E6及E7抗原及HPV-18 E6及E7抗原以上文實施例之任何組合表現，包括其中來自各HPV菌株之各E6及E7抗原自質體或染色體中之任一者表現。
在另一實施例中，整個E7蛋白或其片段中之任一者融合至LLO蛋白、ActA蛋白或含有PEST胺基酸序列之肽來產生本文揭示之重組多肽。在一個實施例中，所利用之E7蛋白(整個或作為片段之來源)包含SEQ ID NO：93中所述之胺基酸序列 (SEQ ID NO：93).在另一 實施例中，E7蛋白為SEQ ID NO：93之同系物。在另一實施例中，E7蛋白為SEQ ID NO：93之變異體。在另一實施例中，E7蛋白為SEQ ID NO：93之異構體。在另一實施例中，E7蛋白為SEQ ID NO：93之片段。在另一實施例中，E7蛋白為SEQ ID NO：93之同系物之片段。在另一實施例中，E7蛋白為SEQ ID NO：93之變異體之片段。在另一實施例中，E7蛋白為SEQ ID NO：93之異構體之片段。
在另一實施例中，融合至E7蛋白之截斷LLO的胺基酸序列包含以下胺基酸序列： (SEQ ID NO：94)。在另一實施例中， tLLO-E7之融合蛋白為SEQ ID NO：94之同系物。在另一實施例中，融合蛋白為SEQ ID NO：94之變異體。在另一實施例中，tLLO-E7融合蛋白為SEQ ID NO：94之異構體。在另一實施例中，tLLO-E7融合蛋白為SEQ ID NO：94之片段。在另一實施例中，tLLO-E7融合蛋白為SEQ ID NO：94之同系物的片段。在另一實施例中，tLLO-E7融合蛋白為SEQ ID NO：94之變異體的片段。在另一實施例中，tLLO-E7融合蛋白為SEQ ID NO：94之異構體的片段。
在一個實施例中，如本文所揭示之重組李斯特菌菌株包含編碼腫瘤相關抗原之核酸分子，其中腫瘤相關抗原包含Her-2/neu肽。在一個實施例中，腫瘤相關抗原包含Her-2/neu抗原。在一個實施例中，Her-2/neu肽包含嵌合Her-2/neu抗原(cHer-2)。
在一個實施例中，經減毒營養缺陷型李斯特菌菌株是基於李斯特菌疫苗載體，其由於缺失毒性基因actA而減毒且藉由補充dal基因保留用於活體內及活體外Her2/neu表現之質體。在一個實施例中，李斯特菌菌株表現及分泌融合至李斯特菌溶胞素O(LLO)的前441個胺基 酸的嵌合Her2/neu蛋白。在另一實施例中，李斯特菌為在dal、dat及actA內源性基因中具有突變的dal/dat/actA李斯特菌。在另一實施例中，突變為突變基因之缺失、截斷或不活化。在另一實施例中，李斯特菌菌株因打斷轉殖基因動物中對HER2/neu之耐受性的能力而發揮強及抗原特異性抗腫瘤反應。在另一實施例中，dal/dat/actA菌株高度減毒且具有比先前李斯特菌疫苗世代更佳之安全概況，因為其自經免疫小鼠之脾臟更快速清除。在另一實施例中，李斯特菌菌株相較於Lm-LLO-ChHer2導致轉殖基因動物中的腫瘤發作延遲較多，Lm-LLO-ChHer2為此疫苗之抗生素耐藥性及更具毒性型式(參看美國公開案第2011/0142791號，其以全文引用的方式併入本文中)。在另一實施例中，李斯特菌菌株引起腫瘤內T調節性細胞(Treg)顯著減少。在另一實施例中，用LmddA疫苗處理之腫瘤中較低頻率之Treg導致瘤內CD8/Treg比率增加，表明用LmddA疫苗免疫後可獲得更有利之腫瘤微環境。在一個實施例中，本發明提供一種重組多肽，其包含融合至Her-2嵌合蛋白或融合至其片段之LLO蛋白的N端片段。在一個實施例中，本發明提供一種重組多肽，其由融合至Her-2嵌合蛋白或融合至其片段之LLO蛋白的N端片段組成。在實施例中，異源抗原為Her-2嵌合蛋白或其片段。
在另一實施例中，本發明之方法及組合物的Her-2嵌合蛋白為人類Her-2嵌合蛋白。在另一實施例中，Her-2蛋白為小鼠Her-2嵌合蛋白。在另一實施例中，Her-2蛋白為大鼠Her-2嵌合蛋白。在另一實施例中，Her-2蛋白為靈長類動物Her-2嵌合蛋白。在另一實施例中，Her-2蛋白為人類或任何其他動物物種的Her-2嵌合蛋白或此項技術中已知的其組合。各可能性代表本發明之各別實施例。
在另一實施例中，Her-2蛋白為稱為「HER-2/neu」、「Erbb2」、「v-erb-b2」、「c-erb-b2」、「neu」或「cNeu」之蛋白質。各可能性代 表本發明之各別實施例。
在一個實施例中，Her2-neu嵌合蛋白容納顯示致癌基因之MHC-I級抗原決定基簇的Her2/neu抗原之兩個胞外及一個胞內片段，其中在另一實施例中，嵌合蛋白質容納Her2/neu抗原的3個H2Dq及至少17個映射人類MHC-I級抗原決定基(片段EC1、EC2及IC1)(圖45)。在另一實施例中，嵌合蛋白質容納至少13個映射人類MHC-I級抗原決定基(片段EC2及IC1)。在另一實施例中，嵌合蛋白質容納至少14個映射人類MHC-I級抗原決定基(片段EC1及IC1)。在另一實施例中，嵌合蛋白質容納至少9個映射人類MHC-I級抗原決定基(片段EC1及IC2)。在另一實施例中，Her2-neu嵌合蛋白融合至非溶血性李斯特菌溶胞素O(LLO)。在另一實施例中，Her2-neu嵌合蛋白融合至單核細胞增多性李斯特菌李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白的前441個胺基酸且由單核細胞增多性李斯特菌減毒營養缺陷型菌株LmddA表現及分泌。在另一實施例中，來自表現嵌合Her2/neu抗原/LLO融合蛋白的本文揭示之減毒營養缺陷型菌株的融合蛋白tLLO-ChHer2之表現及分泌與活體外生長8小時後TCA沈澱之細胞培養物清液層中的Lm-LLO-ChHer2相當(圖45B)。
在一個實施例中，未經處理之動物或用不相關李斯特菌疫苗注射之小鼠中未偵測到CTL活性(圖46A)。然而在另一實施例中，本文揭示之減毒營養缺陷型菌株能夠刺激來自野生型FVB/N小鼠之脾細胞的IFN-γ分泌(圖46B)。
在另一實施例中，Her-2嵌合蛋白由SEQ ID NO：95中所述之以下核酸序列編碼 (SEQ ID NO：95)。
在另一實施例中，Her-2嵌合蛋白包含序列： (SEQ ID NO：96)。
在一個實施例中，本文揭示之方法及組合物的Her2嵌合蛋白或其片段不包括其信號序列。在另一實施例中，因為信號序列之高疏水性，所以省略信號序列使Her2片段能夠在李斯特菌中成功地表現。各可能性代表本發明之各別實施例。
在另一實施例中，本發明之方法及組合物的Her2嵌合蛋白之片段不包括其跨膜結構域(TM)。在一個實施例中，由於TM之高疏水性，因此省略TM使Her-2片段能夠在李斯特菌中成功地表現。各可能性代表本發明之各別實施例。
在一個實施例中，LmddA164包含具有開放閱讀框架且編碼融合至cHER2之tLLO的核酸序列，其中該核酸序列包含SEQ ID NO：97： (SEQ ID NO：97)，其中UPPERCASE 序列編碼cHER2，小寫字母序列編碼tLLO且帶下劃線的「ctcgag」序列表示用於將腫瘤抗原接合至質體中的截斷LLO的Xho I限制位點。在另一實施例中，質體pAdv168包含SEQ ID NO：97。在一個實施例中，截斷LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：97之同系物。在另一實施例中，截斷LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：97之變異體。在另一實施例中，截斷LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：97之異構體。
在一個實施例中，重組蛋白質的包含融合至cHER2之tLLO的胺基酸序列包含SEQ ID NO：98： (SEQ ID NO：98)。在一個實施例中，截斷LLO-cHER2 融合物為SEQ ID NO：98之同系物。在另一實施例中，截斷LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：98之變異體。在另一實施例中，截斷LLO-cHER2融合物為SEQ ID NO：98之異構體。
已報導當耐藥性腫瘤已由以小片段李斯特菌為主之疫苗或曲妥珠單抗(針對位於Her2/neu抗原之胞外域的抗原決定基的單株抗體)靶向時，致癌蛋白Her2/neu中之點突變或胺基酸缺失會介導此等耐藥性腫瘤細胞之處理。在一個實施例中，揭示以嵌合Her2/neu為主之組合物，其容納顯示致癌基因之MHC-I級抗原決定基簇的Her2/neu抗原之兩個胞外及一個胞內片段。此容納Her2/neu抗原之3個H2Dq及至少17個映射人類MHC-I級抗原決定基的嵌合蛋白融合至單核細胞增多性李斯特菌李斯特菌溶胞素O蛋白的前441個胺基酸且由單核細胞增多性李斯特菌減毒菌株LmddA表現及分泌。
在另一實施例中，所關注的抗原為KLK9多肽。
在另一實施例中，腫瘤相關抗原為HPV-E7。在另一實施例中，抗原為HPV-E6。在另一實施例中，抗原為Her-2。在另一實施例中，抗原為NY-ESO-1。在另一實施例中，抗原為端粒酶。在另一實施例中，抗原為SCCE。在另一實施例中，抗原為WT-1。在另一實施例中，抗原為HIV-1 Gag。在另一實施例中，抗原為蛋白酶3。在另一實施例中，抗原為酪胺酸酶相關蛋白2。在另一實施例中，抗原為PSA(前列腺特異性抗原)。在另一實施例中，抗原選自E7、E6、Her-2、NY-ESO-1、端粒酶、SCCE、WT-1、HIV-1 Gag、蛋白酶3、酪胺酸酶相關蛋白2、PSA(前列腺特異性抗原)。在另一實施例中，抗原為腫瘤相關抗原。在另一實施例中，抗原為傳染病抗原。
在另一實施例中，腫瘤相關抗原為血管生成抗原。在另一實施 例中，血管生成抗原在腫瘤血管生成血管中的活化外被細胞及外被細胞上表現，在另一實施例中，其與活體內新血管生成有關。在另一實施例中，血管生成抗原為HMW-MAA。在另一實施例中，血管生成抗原為此項技術中已知之抗原且揭示於WO2010/102140中，其以引用的方式併入本文中。
在其他實施例中，抗原源自真菌病原體、細菌、寄生物、蠕蟲或病毒。在其他實施例中，抗原選自破傷風類毒素、來自流感病毒之紅血球凝集素分子、白喉類毒素、HIV gp120、HIV gag蛋白、IgA蛋白酶、胰島素肽B、馬鈴薯粉痂菌(Spongospora subterranea)抗原、弧菌(vibriose)抗原、沙門氏菌(Salmonella)抗原、肺炎球菌(pneumococcus)抗原、呼吸道合胞病毒抗原、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)外膜蛋白、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶、奈瑟氏腦膜炎菌(Neisseria meningitidis)菌毛蛋白、淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)菌毛蛋白、黑素瘤相關抗原(TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、gp-100、酪胺酸酶、MART-1、HSP-70、β-HCG)、來自HPV-16、-18、-31、-33、-35或-45型人類乳頭狀瘤病毒之人類乳頭狀瘤病毒抗原E1及E2、腫瘤抗原CEA、突變或其他ras蛋白、突變或其他p53蛋白、Muc1、間皮素、EGFRVIII或PSA。
在其他實施例中，抗原與以下疾病中之一者有關：霍亂、白喉、嗜血桿菌屬、A型肝炎、B型肝炎、流感、麻疹、腦膜炎、流行性腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌肺炎、脊髓灰質炎、狂犬病、風疹、破傷風、肺結核、傷寒、水痘-帶狀疱疹、百日咳、黃熱病、來自艾迪森氏病之免疫原及抗原、過敏、全身性過敏反應、布魯頓氏症候群(Bruton's syndrome)、癌症(包括實體腫瘤及血源性腫瘤)、濕疹、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、多發性肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、後天性免疫不全症候群、移植排斥(諸如腎臟、心臟、胰 臟、肺、骨骼及肝臟移植)、格雷夫斯氏病(Graves' disease)、多內分泌自體免疫疾病、肝炎、顯微鏡下多動脈炎、結節性多動脈炎、天疱瘡、原發性膽汁性肝硬化、惡性貧血、腹腔病、抗體介導之腎炎、絲球體腎炎、風濕疾病、全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、血清反應陰性脊椎性關節炎、鼻炎、休格連氏症候群(sjogren's syndrome)、全身性硬化症、硬化性膽管炎、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、疱疹樣皮炎(dermatitis herpetiformis)、牛皮癬、白斑病、多發性硬化症、腦脊髓炎、格-巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、重症肌無力、蘭伯特-伊頓症候群(Lambert-Eaton syndrome)、鞏膜、鞏膜外層、葡萄膜炎、慢性黏膜皮膚念珠菌病、風疹、嬰兒臨時性低丙種球蛋白血症、骨髓瘤、X連鎖高IgM症候群、維斯科特-奧爾德里奇症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、共濟失調毛細管擴張、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫血小板減少症、自體免疫嗜中性白細胞減少症、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、澱粉樣變性、慢性淋巴球性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、瘧疾環子孢子蛋白、微生物抗原、病毒抗原、自身抗原及利斯特氏菌病(lesteriosis)。各抗原代表如本文所揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，本文揭示之異源抗原為腫瘤相關抗原，在一個實施例中，其為以下腫瘤抗原中之一者：MAGE(黑素瘤相關抗原E)蛋白，例如MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE 4、酪胺酸酶；突變ras蛋白；突變p53蛋白；p97黑素瘤抗原，與晚期癌症有關之ras肽或p53肽；與子宮頸癌有關之HPV 16/18抗原、與乳癌有關之KLH抗原、與結腸直腸癌有關之CEA(癌胚抗原)、gp100、與黑素瘤有關之MART1抗原或與前列腺癌有關之PSA抗原。在另一實施例中，用於如本文所揭示之組合物及方法的抗原為黑素瘤相關抗原，在一個實施例 中，其為TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、gp-100、酪胺酸酶、HSP-70、β-HCG或其組合。在另一實施例中，腫瘤相關抗原為血管生成抗原。
在一個實施例中，抗原為美國專利申請公開案US2011/0142791中所述之嵌合Her2抗原，該案以全文引用的方式併入本文中。
在另一實施例中，異源抗原為傳染病抗原。在一個實施例中，抗原為自抗原或自身抗原。
在另一實施例中，異源抗原源自真菌病原體、細菌、寄生物、蠕蟲或病毒。在其他實施例中，抗原選自破傷風類毒素、來自流感病毒之紅血球凝集素分子、白喉類毒素、HIV gp120、HIV gag蛋白、IgA蛋白酶、胰島素肽B、馬鈴薯粉痂菌抗原、弧菌抗原、沙門氏菌抗原、肺炎球菌抗原、呼吸道合胞病毒抗原、流感嗜血桿菌外膜蛋白、幽門螺旋桿菌尿素酶、奈瑟氏腦膜炎菌菌毛蛋白、淋病奈瑟菌菌毛蛋白、來自HPV-16、-18、-31、-33、-35或-45型人類乳頭狀瘤病毒之人類乳頭狀瘤病毒抗原E1及E2或其組合。
在如本文所揭示之方法及組合物的另一實施例中，「核酸」或「核苷酸」係指至少兩種鹼基-糖-磷酸酯組合的條帶。在一個實施例中，術語包括DNA及RNA。在一個實施例中，「核苷酸」係指核酸聚合物之單體單元。在一個實施例中，RNA可呈tRNA(轉移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖體RNA)、mRNA(信使RNA)、反義RNA、小抑制RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)及核糖核酸酶形式。已描述siRNA及miRNA之用途(Caudy AA等人，Genes & Devel 16：2491-96及其中引用之參考文獻)。DNA可呈質體DNA、病毒DNA、線性DNA或染色體DNA或此等基團之衍生物形式。另外，此等形式之DNA及RNA可呈單股、雙股、三股或四股。在另一實施例中，術語亦包括可含有其他類型之主鏈但具有相同鹼基之人工核酸。在一個實施例中，人工核酸為PNA(肽核酸)。PNA含有肽主鏈及核苷酸鹼基且在 一個實施例中能夠結合DNA及RNA分子兩者。在另一實施例中，核苷酸經氧雜環丁烷修飾。在另一實施例中，核苷酸藉由用一個硫代磷酸酯鍵置換一或多個磷酸二酯鍵來修飾。在另一實施例中，人工核酸含有此項技術中已知之原生核酸之磷酸酯主鏈的任何其他變異體。硫代磷酸酯核酸及PNA之用途為熟習此項技術者已知且描述於例如Neilsen PE,Curr Opin Struct Biol 9：353-57；及Raz NK等人Biochem Biophys Res Commun.297：1075-84中。核酸之製造及用途為熟習此項技術者所已知且描述於例如Molecular Cloning,(2001),Sambrook及Russell編以及Methods in Enzymology：Methods for molecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio及G.C.Fareed中。各核酸衍生物代表如本文所揭示之各別實施例。
在一個實施例中，術語「寡核苷酸」與術語「核酸」可互換，且可指包括(但不限於)以下之分子：原核序列、真核mRNA、來自真核mRNA之cDNA、來自真核(例如哺乳動物)DNA之染色體組DNA序列及甚至合成DNA序列。術語亦指包括DNA及RNA之任何已知鹼基類似物的序列。
在另一實施例中，本文揭示之構築體或核酸分子使用同源重組整合至李斯特菌染色體中。用於同源重組之技術為此項技術所熟知，且描述於例如Baloglu S,Boyle SM等人，(Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing either Listeria monocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortus ribosomal L7/L12 protein.Vet Microbiol 2005,109(1-2)：11-7)；及Jiang LL,Song HH等人，(Characterization of a mutant Listeria monocytogenes strain expressing green fluorescent protein.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2005,37(1)：19-24)中。在另一實施例中，如美國專利第6,855,320號中所述進行同源重組。在此情形下，表現E7之重組Lm菌株藉由在hly啟動子 控制下E7基因之染色體整合而製備且納入hly信號序列以確保分泌基因產物，產生稱為Lm-AZ/E7之重組物。在另一實施例中，使用溫度敏感性質體選擇重組物。各技術代表本發明之各別實施例。
在另一實施例中，構築體或核酸分子使用轉座子插入整合至李斯特菌染色體中。轉座子插入技術為此項技術中所熟知，且在建構DP-L967時尤其由Sun等人.(Infection and Immunity 1990,58：3770-3778)描述。在另一實施例中，轉座子突變誘發具有可形成穩定染色體組插入突變體的優勢但不足之處在於基因組中的外來基因插入位置未知。
在另一實施例中，構築體或核酸分子使用噬菌體整合位點整合至李斯特菌染色體中(Lauer P,Chow MY等人，Construction,characterization,and use of two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors.J Bacteriol 2002；184(15)：4177-86)。在此方法之某些實施例中，細菌噬菌體(例如U153或PSA李斯特菌噬菌體)的整合酶基因及連接位點用於將異源基因插入至相應連接位點，該位點可為基因組中之任何適當位點(例如arg tRNA基因之comK或3'端)。在另一實施例中，內源性原噬菌體在整合構築體或異源基因之前從所利用的連接位點固化。在另一實施例中，此方法產生單拷貝整合體。在另一實施例中，本發明進一步包含用於臨床應用之以噬菌體為主之染色體整合系統，其中可使用對於必需酶而言為營養缺陷型之宿主菌株(包括(但不限於)d-丙胺酸消旋酶)，例如Lmdal(-)dat(-)。在另一實施例中，為了避免「噬菌體固化步驟」，使用基於PSA之噬菌體整合系統。在另一實施例中，此需要藉由抗生素連續選擇以維持整合基因。因此，在另一實施例中，本發明使能夠不需要使用抗生素選擇即形成以噬菌體為主之染色體整合系統。實際上，可補充營養缺陷型宿主菌株。各可能性代表本發明之各別實施例。
在如本文所揭示之方法及組合物的一個實施例中，術語「重組位點」或「定點重組位點」係指核酸分子中由介導側接重組位點之核酸區段的交換或切除的重組酶(在一些情況下，與相關蛋白質一起)識別的之鹼基序列。重組酶及相關蛋白質統稱為「重組蛋白」，參見例如Landy,A.,(Current Opinion in Genetics & Development)3：699-707；1993)。
「噬菌體表現載體」或「噬菌粒」係指任何以噬菌體為主之重組表現系統，其用於在任何細胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞)中活體外或活體內組成性或誘導性表現如本文所揭示之方法及組合物的核酸序列。噬菌體表現載體通常可在細菌細胞中再生且在適當條件下產生噬菌體粒子。術語包括線性或圓形表現系統且涵蓋保持游離型或整合至宿主細胞基因組中的以噬菌體為主之表現載體。
在一個實施例中，如本文所用之術語「可操作地連接」意謂轉錄及轉譯調節核酸以起始轉錄之方式相對於任何編碼序列定位。一般而言，此將意謂啟動子及轉錄引發或開始序列定位於編碼區之5'。
在一個實施例中，「開放閱讀框架」或「ORF」為含有可潛在地編碼蛋白質之鹼基序列的生物體基因組的一部分。在另一實施例中，ORF之開始及停止端不等效於mRNA之端，但其通常含於mRNA內。在一個實施例中，ORF位於基因的開始編碼序列(起始密碼子)與停止密碼子序列(終止密碼子)之間。因此，在一個實施例中，作為具有內源性多肽之開放閱讀框架可操作地整合至基因組中的核酸分子為與內源性多肽整合至基因組中的同一開放閱讀框架的核酸分子。
在一個實施例中，本發明提供包含連接序列之融合多肽。在一個實施例中，「連接序列」係指接合兩種異源多肽的胺基酸序列或其片段或結構域。一般而言，如本文中所使用，連接子為共價連接多肽 形成融合多肽之胺基酸序列。連接子通常包括自呈現載體移除報導基因之後自剩餘重組信號轉譯以形成包含由開放閱讀框架編碼之胺基酸序列及呈現蛋白的融合蛋白的胺基酸。如熟習此項技術者所瞭解，連接子可包含額外胺基酸，諸如甘胺酸及其他中性小胺基酸。
在一個實施例中，「內源性」係指參考生物內產生或起源或來自參考生物內之起因的項目。在另一實施例中，內源性係指原生的。
在另一實施例中，「穩定保持」係指在無選擇(例如抗生素選擇)存在下維持核酸分子或質體持續10代且不具有可偵測之損失。在另一實施例中，時間段為15代。在另一實施例中，時間段為20代。在另一實施例中，時間段為25代。在另一實施例中，時間段為30代。在另一實施例中，時間段為40代。在另一實施例中，時間段為50代。在另一實施例中，時間段為60代。在另一實施例中，時間段為80代。在另一實施例中，時間段為100代。在另一實施例中，時間段為150代。在另一實施例中，時間段為200代。在另一實施例中，時間段為300代。在另一實施例中，時間段為500代。在另一實施例中，時間段超過世代。在另一實施例中，核酸分子或質體保持活體外穩定(例如在培養物中)。在另一實施例中，核酸分子或質體保持活體內穩定。在另一實施例中，核酸分子或質體活體外及活體內皆保持穩定。
在另一實施例中，如本文所揭示之方法及組合物的重組李斯特菌菌株包含作為具有內源性ActA序列之開放閱讀框架可操作地整合至李斯特菌基因組中的核酸分子。在另一實施例中，如本文所揭示之方法及組合物的重組李斯特菌菌株包含具有編碼融合蛋白之核酸分子的游離型表現載體，該融合蛋白包含融合至ActA或截斷ActA之抗原。在一個實施例中，抗原在actA啟動子及ActA信號序列控制下表現及分泌且表現為融合至ActA(截斷ActA或tActA)的1-233個胺基酸。在另一實施例中，截斷ActA由如美國專利第7,655,238號中所述的野生 型ActA蛋白的前390個胺基酸組成，該案以全文引用的方式併入本文中。在另一實施例中，截斷ActA為ActA-N100或其經修飾型式(稱為ActA-N100*)，其中PEST基元已缺失且含有非保守QDNKR取代，如美國專利公開案第2014/0186387號中所述。
在另一實施例中，「功能片段」為免疫原性片段且在單獨或在本文揭示之疫苗組合物中向個體投與時引起免疫反應。在另一實施例中，功能片段具有熟練技術人員將理解且如本文進一步揭示之生物活性。
在另一實施例中，本文揭示之方法及組合物的重組李斯特菌菌株為重組單核細胞增多性李斯特菌菌株。在另一實施例中，李斯特菌菌株為重組斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)菌株。在另一實施例中，李斯特菌菌株為重組格氏李斯特菌(Listeria grayi)菌株。在另一實施例中，李斯特菌菌株為重組依氏李斯特菌(Listeria ivanovii)菌株。在另一實施例中，李斯特菌菌株為重組默氏李斯特菌(Listeria murrayi)菌株。在另一實施例中，李斯特菌菌株為重組威氏李斯特菌(Listeria welshimeri)菌株。在另一實施例中，李斯特菌菌株為此項技術中已知的任何其他李斯特菌物種之重組菌株。
在另一實施例中，本文揭示之重組李斯特菌菌株已經動物宿主傳代。在另一實施例中，繼代使菌株作為疫苗載體之功效最大。在另一實施例中，繼代使李斯特菌菌株之免疫原性穩定。在另一實施例中，繼代使李斯特菌菌株之毒性穩定。在另一實施例中，繼代使李斯特菌菌株之免疫原性提高。在另一實施例中，繼代使李斯特菌菌株之毒性提高。在另一實施例中，繼代移除李斯特菌菌株之不穩定亞菌株。在另一實施例中，繼代降低李斯特菌菌株之不穩定亞菌株的發生率。在另一實施例中，李斯特菌菌株含有編碼含有抗原之重組肽的基因的染色體組插入。在另一實施例中，李斯特菌菌株攜帶包含編碼含 有抗原之重組肽的基因的質體。在另一實施例中，如本文所述進行繼代。在另一實施例中，藉由此項技術中已知的任何其他方法進行繼代。在另一實施例中，本文揭示之重組李斯特菌菌株尚未經動物宿主傳代。
在另一實施例中，本文揭示之重組核酸與驅使李斯特菌菌株中的編碼肽表現的啟動子/調節序列可操作地連接。適用於驅動基因之組成性表現的啟動子/調節序列為此項技術中所熟知且包括(但不限於)例如李斯特菌之PhlyA、PActA及p60啟動子、鏈球菌bac啟動子、灰色鏈黴菌sgiA啟動子及蘇雲金芽孢桿菌phaZ啟動子。
在另一實施例中，編碼本文揭示之肽的核酸的誘導型及組織特異性表現藉由在誘導型或組織特異性啟動子/調節序列控制下放置編碼肽之核酸來實現。適用於其目的之組織特異性或誘導型啟動子/調節序列的實例包括(但不限於)MMTV LTR誘導型啟動子及SV40晚期強化子/啟動子。在另一實施例中，使用回應於誘導劑(諸如金屬、糖皮質素及其類似物)誘導之啟動子。因此，應瞭解本發明包括使用任何啟動子/調節序列，其已知或未知且能夠驅動與其可操作地連接之所要蛋白質的表現。熟練技術人員應瞭解，術語「異源」涵蓋源自與參考物種不同之物種的核酸、胺基酸、肽、多肽或蛋白質。因此，例如，表現異源多肽之李斯特菌菌株在一個實施例中將表現並非李斯特菌菌株原生或內源之多肽，或在另一實施例中，李斯特菌菌株通常不表現之多肽，或在另一實施例中，來自除李斯特菌菌株之外的來源的多肽。在另一實施例中，異源可用於描述某物源自同一物種內之不同生物。在另一實施例中，異源抗原由李斯特菌之重組菌株表現，且當藉由重組菌株感染哺乳動物細胞時經處理及呈現為細胞毒性T細胞。在另一實施例中，李斯特菌物種表現之異源抗原無需精確匹配腫瘤細胞或感染物中的相應未經修飾之抗原或蛋白質，只要其產生識別哺乳 動物中天然表現之未經修飾之抗原或蛋白質的T細胞反應。
熟練技術人員應瞭解，術語「游離型表現載體」涵蓋可呈線性或圓形之核酸載體，且其通常為雙股形式且染色體外的，因為與整合至細菌或細胞的基因組中相對，其存在於宿主細菌或細胞的細胞質中。在一個實施例中，游離型表現載體包含所關注的基因。在另一實施例中，游離型載體在細菌細胞質中保持多個複本，導致所關注的基因擴增，且在另一實施例中，必要時提供病毒反式作用因子。在另一實施例中，游離型表現載體在本文可稱為質體。在另一實施例中，「整合性質體」包含靶向進入宿主基因組的其插入或所關注基因之插入的序列。在另一實施例中，所關注的插入基因不中斷或經受通常由整合至細胞DNA引起的調節限制。在另一實施例中，插入之異源基因的存在不導致細胞自身重要區域的重排或中斷。在另一實施例中，在穩定轉染程序中，使用游離型載體通常導致比使用染色體整合質體高的轉染效率(Belt,P.B.G.M.等人，(1991)Efficient cDNA cloning by direct phenotypic correction of a mutant human cell line(HPRT2)using an Epstein-Barr virus-derived cDNA expression vector.Nucleic Acids Res.19,4861-4866；Mazda,O.等人，(1997)Extremely efficient gene transfection into lympho-hematopoietic cell lines by Epstein-Barr virus-based vectors.J.Immunol.Methods 204,143-151)。在一個實施例中，如本文所揭示之方法及組合物的游離型表現載體可藉由用於將DNA分子傳遞至細胞的任何多種方法活體內、離體或活體外傳遞至細胞。載體亦可單獨傳遞或以提高至個體細胞之傳遞的醫藥組合物形式傳遞。
在一個實施例中，術語「融合」係指藉由共價鍵可操作連接。在一個實施例中，術語包括重組融合(核酸序列或其開放閱讀框架)。在另一實施例中，該術語包括化學結合。
在一個實施例中，「轉型」係指工程改造細菌細胞以接受質體或 其他異源DNA分子。在另一實施例中，「轉型」係指工程改造細菌細胞以表現質體之基因或其他異源DNA分子。各可能性代表本文揭示之方法及組合物的各別實施例。
在另一實施例中，結合用於將遺傳物質及/或質體引入至細菌中。結合方法為此項技術中熟知且描述於例如Nikodinovic J.等人，(A second generation snp-derived Escherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation. Plasmid.2006年11月；56(3)：223-7)及Auchtung JM等人(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005年8月30日；102(35)：12554-9)中。各方法代表如本文所揭示之方法及組合物的各別實施例。
在一個實施例中，術語「減毒」係指減弱細菌在動物體內引起疾病的能力。換言之，減毒李斯特菌菌株之病原性特徵已相較於野生型李斯特菌減少，但減毒李斯特菌能夠在培養物中生長及維持。舉例而言，用減毒李斯特菌靜脈內接種Balb/c小鼠，50%接種動物存活的致死劑量(LD50)較佳比野生型李斯特菌的LD50高至少約10倍，更佳至少約100倍，更佳至少約1,000倍，甚至更佳至少約10,000倍且最佳至少約100,000倍。減毒李斯特菌菌株因此為不殺死投與其之動物的菌株，或為僅當所投與細菌的數目極大地大於殺死同一動物所需的野生型非減毒細菌的數目時殺死動物的菌株。減毒細菌亦應認為意謂在通用環境中不能複製之細菌，因為該環境中不存在其生長所需的營養。因此，細菌限於在提供所需營養之受控環境中複製。本發明之減毒菌株因此為環境安全的，因為其不能不受控複製。
組合物
在一個實施例中，本發明之組合物為免疫原性組合物。在一個 實施例中，本發明之組合物誘發干擾素-γ的強先天性刺激，其在一個實施例中具有抗血管生成特性。在一個實施例中，本文揭示之李斯特菌誘導干擾素-γ的強先天性刺激，其在一個實施例中具有抗血管生成特性(Dominiecki等人，Cancer Immunol Immunother.2005年5月；54(5)：477-88.Epub 2004年10月6日，其以全文引用的方式併入本文中；Beatty及Paterson,J.Immunol.2001年2月15日；166(4)：2276-82，其以全文引用的方式併入本文中)。在一個實施例中，李斯特菌之抗血管生成特性由CD4+ T細胞介導(Beatty及Paterson,2001)。在另一實施例中，李斯特菌之抗血管生成特性由CD8+ T細胞介導。在另一實施例中，李斯特菌疫苗接種引起的IFN-γ分泌由NK細胞、NKT細胞、Th1 CD4+ T細胞、TC1 CD8+ T細胞或其組合介導。
在另一實施例中，投與本文揭示之組合物誘發產生一或多種抗血管生成蛋白質或因子。在一個實施例中，抗血管生成蛋白質為IFN-γ。在另一實施例中，抗血管生成蛋白質為色素上皮細胞源因子(PEDF)；血管生長抑素；內皮生長抑素；fms樣酪胺酸激酶(sFlt)-1；或可溶性內皮因子(sEng)。在一個實施例中，本發明之李斯特菌涉及於抗血管生成因子的釋放中，且因此，在一個實施例中，除了其作為向個體引入抗原的載體作用之外具有治療性作用。各李斯特菌菌株及其類型代表本發明之各別實施例。
在另一實施例中，如本文所揭示之方法及組合物誘導的免疫反應為T細胞反應。在另一實施例中，免疫反應包含T細胞反應。在另一實施例中，反應為CD8+ T細胞反應。在另一實施例中，反應包含CD8+ T細胞反應。各可能性代表如本文所揭示之各別實施例。
在另一實施例中，投與本文揭示之組合物會增加抗原特異性T細胞的數目。在另一實施例中，投與組合物會活化T細胞上的共刺激受體。在另一實施例中，投與組合物誘導記憶及/或效應子T細胞的增 殖。在另一實施例中，投與組合物提高T細胞的增殖。
如全文所用，術語「組合物」及「免疫原性組合物」可互換，含義及品質均相同。在一個實施例中，本文揭示之免疫原性組合物包含重組李斯特菌菌株且進一步包含與各組分相伴或依序投與的抗體的亦稱為「組合療法」。在另一實施例中，本文揭示的包含重組李斯特菌菌株且進一步包含與各組分相伴或依序投與之抗體的免疫原性組合物亦稱為「組合療法」。熟練技術人員應理解組合療法亦可包含額外組分、抗體、療法等。在一些實施例中，術語「醫藥組合物」係指適於醫藥用途(例如向有需要之個體投與)的組合物。
本發明之組合物可用於本發明之方法中以在個體體內引起加強之抗腫瘤T細胞反應，以在個體體內抑制腫瘤介導之免疫抑制，或提高個體脾臟及腫瘤中比率或T效應細胞比調節性T細胞(Treg)，或其任何組合。
在另一實施例中，本文揭示的包含李斯特菌菌株之組合物進一步包含佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物進一步包含佐劑。在另一實施例中，本發明方法及組合物中所用之佐劑為粒細胞/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白。在另一實施例中，佐劑包含GM-CSF蛋白質。在另一實施例中，佐劑為編碼GM-CSF之核苷酸分子。在另一實施例中，佐劑包含編碼GM-CSF之核苷酸分子。在另一實施例中，佐劑為皂素QS21。在另一實施例中，佐劑包含皂素QS21。在另一實施例中，佐劑為單磷醯基脂質A。在另一實施例中，佐劑包含單磷醯基脂質A。在另一實施例中，佐劑為SBAS2。在另一實施例中，佐劑包含SBAS2。在另一實施例中，佐劑為含有未甲基化CpG之寡核苷酸。在另一實施例中，佐劑包含含有未甲基化CpG之寡核苷酸。在另一實施例中，佐劑為免疫刺激細胞激素。在另一實施例中，佐劑包含免疫刺激細胞激素。在另一實施例中，佐劑為編碼免疫刺激細胞激 素之核苷酸分子。在另一實施例中，佐劑包含編碼免疫刺激細胞激素的核苷酸分子。在另一實施例中，佐劑為quill醣苷或包含quill醣苷。在另一實施例中，佐劑為細菌有絲分裂原或包含細菌有絲分裂原。在另一實施例中，佐劑為細菌毒素或包含細菌毒素。在另一實施例中，佐劑為此項技術中已知的任何其他佐劑或包含此項技術中已知的任何其他佐劑。各可能性代表本發明之各別實施例。
在一個實施例中，本文揭示之免疫原性組合物包含具有核酸分子之重組李斯特菌菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中該融合多肽包含融合至異源抗原或其片段的截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列。在另一實施例中，本文揭示之免疫原性組合物包含具有核酸分子之重組李斯特菌菌株，該核酸分子包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列的第一開放閱讀框架。
在一個實施例中，本文揭示之免疫原性組合物包含具有核酸分子之重組李斯特菌菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中該融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，該組合物進一步包含抗體或其片段。在另一實施例中，該抗體或其片段包含多株抗體、單株抗體、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、單鏈抗體或其任何組合。
在另一實施例中，本文揭示之免疫原性組合物包含具有核酸分子之重組李斯特菌菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中該融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，該組合物進一步包含抗體或其片段。在另一實施例中，該抗體或其片段包含多株抗體、單株抗體、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、單鏈抗體或其 任何組合。
在一些實施例中，術語「抗體」係指完整分子以及其功能片段，在本文中亦稱為「抗原結合片段」，諸如能夠與如本文所述之所要目標特異性相互作用的Fab、F(ab')2及Fv，該目標例如結合於TNF受體超家族成員或T細胞受體共刺激分子，或結合共刺激分子的抗原呈現細胞受體。
在一些實施例中，抗體片段包含：(1)Fab，含有抗體分子之單價抗原結合片段的片段，其可藉由用番木瓜蛋白酶消化整個抗體獲得完整輕鏈及一條重鏈的一部分來產生；(2)Fab'，可藉由用胃蛋白酶處理整個抗體，隨後還原產生完整輕鏈及重鏈的一部分來獲得的抗體分子之片段；每個抗體分子獲得兩個Fab'片段；(3)(Fab')2，可藉由無隨後還原的用胃蛋白酶處理整個抗體獲得的抗體片段；F(ab')2為兩個Fab'片段藉由兩個二硫鍵結合在一起的二聚體；(4)Fv，含有輕鏈可變區及重鏈可變區且表現為兩條鏈的基因工程改造片段；或(5)單鏈抗體(「SCA」)，含有輕鏈可變區及重鏈可變區的基因工程改造分子，其中可變區藉由適合多肽連接子連接成基因融合單鏈分子。各可能性代表本發明之各別實施例。
製備此等片段之方法為此項技術中已知。(參看例如Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988，以引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，抗體片段可藉由抗體蛋白分解或藉由在大腸桿菌或哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞培養物或其他蛋白質表現系統)中表現編碼片段之DNA來製備。
在一些實施例中，抗體片段可藉由習知方法使用胃蛋白酶或番木瓜蛋白酶消化整個抗體來獲得。舉例而言，抗體片段可藉由用胃蛋白酶酶促裂解抗體獲得表示成F(ab')2的5S片段來產生。此片段可使用 硫醇還原劑及視情況存在的由裂解雙硫鍵產生的硫氫基之阻隔基進一步裂解，產生3.5S Fab'單價片段。或者，使用胃蛋白酶的酶促裂解直接產生兩個單價Fab'片段及一個Fc片段。此等方法例如由Goldenberg，美國專利第4,036,945號及第4,331,647號及其中所含之參考文獻描述，該等專利以全文引用的方式併入本文中。亦參看Porter,R.R.,Biochem.J.,73：119-126,1959。裂解抗體之其他方法(諸如分離重鏈形成單價輕鏈-重鏈片段)進一步裂解片段，或亦可使用其他酶促、化學或遺傳學技術，只要片段結合於完整抗體識別的抗原。
Fv片段包含VH及VL鏈的締合。此締合可為非共價的，如Inbar等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 69：2659-62,1972中所述。或者，可變鏈可藉由分子間二硫鍵連接或藉由諸如戊二醛之化學物質交聯。較佳地，Fv片段包含藉由肽連接子連接的VH及VL鏈。此等單鏈抗原結合蛋白(sFv)藉由構築包含編碼藉由寡核苷酸連接的VH及VL結構域的DNA序列之結構基因來製備。結構基因插入至表現載體中，所述表現載體隨後引入至諸如大腸桿菌的宿主細胞中。重組宿主細胞合成單個多肽鏈，其中連接肽橋接兩個V結構域。用於製造sFv之方法例如由Whitlow及Filpula,Methods,2：97-105,1991；Bird等人，Science 242：423-426,1988；Pack等人，Bio/Technology 11：1271-77,1993；及Ladner等人，美國專利第4,946,778號描述，其以全文引用的方式併入本文中。
抗體片段之另一形式為編碼單個互補決定區(CDR)之肽。CDR肽(「最小識別單位」)可藉由構築編碼所關注抗體的CDR的基因來獲得。此類基因例如藉由使用聚合酶鏈反應合成來自產生抗體的細胞的RNA的可變區來製備。參看例如Larrick及Fry,Methods,2：106-10,1991。
在一些實施例中，如本文所述之抗體或片段可包含抗體的「人 類化形式」。在一些實施例中，術語「抗體的人類化形成」係指非人類(例如鼠類)抗體，其為免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其他抗原結合子序列)的含有源自非人類免疫球蛋白的最小序列的嵌合分子。人類化抗體包括人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中接受者之互補決定區(CDR)的殘基形式經具有所要特異性、親和力及能力的來自非人類物種(諸如小鼠、大鼠或兔)(供體抗體)之CDR的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架殘基置換為相應非人類殘基。人類化抗體亦可包含在接受者抗體中及在所引入之CDR或構架序列中均不存在之殘基。一般而言，人類化抗體將包含實質上所有至少一個及通常兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區與非人類免疫球蛋白之彼等域相對應且所有或實質上所有FR區為人類免疫球蛋白共同序列之彼等區。人類化抗體最佳亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(通常為人類免疫球蛋白之恆定區)的至少一部分[Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596(1992)]。
人類化非人類抗體的方法為此項技術中所熟知。一般而言，人類化抗體具有一或多個從非人類來源引入到其中的胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為輸入殘基，其典型地取自輸入可變域。人類化可基本上遵循Winter及同事之方法[Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536(1988)]，藉由用嚙齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之對應序列來進行。因此，此類人類化抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上少於完整人類可變域已經來自非人類物種之相應序列取代。實際上，人類化抗體通常為一些CDR殘基及可能一些FR殘基經來自嚙齒動物抗體中之類似位點的殘基取代 之人類抗體。
人類抗體亦可使用此項技術中已知的不同技術產生，包括噬菌體呈現庫[Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581(1991)]。Cole等人及Boerner等人之技術亦可用於製備人類單株抗體(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)及Boerner等人，J.Immunol.,147(1)：86-95(1991)]。類似地，可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入轉殖基因動物(例如內源免疫球蛋白基因已部分或完全不活化的小鼠)來製備人類抗體。攻毒之後，觀測人類抗體產生，其在所有方面與在人類中所見極其類似，包括基因重排、組裝及抗體譜系。此方法描述於例如美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,661,016號，及以下科學公開案中：Marks等人，Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368 856-859(1994)；Morrison,Nature 368 812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14,845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14,826(1996)；Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)。
在一個實施例中，抗體或其功能片段結合於包含T細胞受體共刺激分子、結合共刺激分子之抗原呈現細胞受體或TNF受體超家族之成員的抗原或其部分。在另一實施例中，抗原或其部分包含具有CD28、ICOS之T細胞受體共刺激分子。在另一實施例中，抗原或其部分包含結合共刺激分子之抗原呈現細胞受體，該受體包含CD80受體、CD86受體或CD46受體。在另一實施例中，抗原或其部分包含TNF受體超家族成員，包含糖皮質素誘導之TNF受體(GITR)、OX40(CD134受體)、4-1BB(CD137受體)或TNFR25。
在一個實施例中，抗體或功能片段包含T細胞受體共刺激分子結 合區、結合共刺激分子結合區之抗原呈現細胞受體或TNF受體超家族結合區的成員。在另一實施例中，本文揭示之抗體為CD28抗體、ICOS抗體或針對迄今為止未命名之共刺激受體的抗體。在另一實施例中，抗體為CD80受體抗體、CD86受體抗體或CD46受體抗體。在另一實施例中，抗體為TNF受體超家族成員-結合抗體，其包含糖皮質素誘導之TNF受體(GITR)抗體、OX40(CD134受體)抗體、4-1BB(CD137受體)抗體或TNFR25抗體。抗體之形式可為源自非人類動物物種的單株、多株、人類或人類化抗體。抗體可為完整或部分抗體，其中一條或兩條抗體鏈的可變部分具有用作共刺激受體結合位點之促效劑的特異性。
在另一實施例中，本文揭示之抗體為抗OX40抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，抗體為抗GITR抗體或其抗原結合片段。
在另一實施例中，揭示一種治療個體體內之癌症或傳染病的方法，該方法包含以下步驟：獲得效應T細胞群體，使用選自由以下組成之群的GITR促效劑治療該群體：GITRL、GITRL之活性片段、含有GITRL之融合蛋白、含有GITRL之活性片段的融合蛋白、促效小分子及促效抗抗體。在另一實施例中，個體罹患癌症。
在另一實施例中，揭示一種組合療法，其包含重組李斯特菌菌株及選自由以下組成之群的GITR促效劑：GITRL、GITRL之活性片段、含有GITRL之融合蛋白、含有GITRL之活性片段的融合蛋白、促效小分子及促效抗抗體，其中該組合療法用於治療患有腫瘤或癌症之個體。
在一個實施例中，本發明提供結合於人類CD134之經分離結合分子(包括抗CD134抗體及抗CD134之衍生物)。
在本發明之另一實施例中提供結合於人類CD134之結合分子，其中該結合分子不防止人類CD134(OX40配位體(OX40L)且其中該結合 分子進一步不阻礙人類OX40L對人類CD134表現T-效應細胞的免疫刺激及/或增殖反應。
在另一實施例中，本發明提供結合於人類CD134之結合分子，其中對OX40L結合至人類CD134表現T細胞上之CD134之作用減小不超過約70%，或約60%，或約50%，或約40%，或約30%，或約20%，或約10%或更低，且其中該結合分子提高人類OX40L對人類CD134表現T-效應細胞的免疫刺激及/或增殖反應。
在另一實施例中，本發明提供結合於人類CD134之結合分子，其中該結合分子不防止人類CD134(OX40配位體(OX40L)且其中該結合分子提高人類OX40L對人類CD134表現T-效應細胞的免疫刺激及/或增殖反應。
在一個實施例中，本文揭示之疾病為癌症或腫瘤。在一個實施例中，藉由本發明之方法治療的癌症為乳癌。在另一實施例中，癌症為宮頸癌。在另一實施例中，癌症為含有Her2之癌症。在另一實施例中，癌症為黑素瘤。在另一實施例中，癌症為胰臟癌。在另一實施例中，癌症為卵巢癌。在另一實施例中，癌症為胃癌。在另一實施例中，癌症為胰臟的癌性病灶。在另一實施例中，癌症為肺腺癌。在另一實施例中，癌症為肺腺癌。在另一實施例中，其為多形性膠質母細胞瘤。在另一實施例中，癌症為結腸直腸腺癌。在另一實施例中，癌症為肺鱗狀腺癌。在另一實施例中，癌症為胃腺癌。在另一實施例中，癌症為卵巢表面上皮細胞贅瘤(例如其良性、增生或惡性變體)。在另一實施例中，癌症為口腔鱗狀細胞癌。在另一實施例中，癌症為非小細胞肺癌。在另一實施例中，癌症為子宮內膜癌。在另一實施例中，癌症為膀胱癌。在另一實施例中，癌症為頭部及頸部癌。在另一實施例中，癌症為前列腺癌。在另一實施例中，癌症為口咽癌。在另一實施例中，癌症為肺癌。在另一實施例中，癌症為肛門癌。在另一 實施例中，癌症為結腸直腸癌。在另一實施例中，癌症為食道癌。在另一實施例中，癌症為間皮瘤。
在一個實施例中，本文揭示之異源抗原為HPV-E7。在另一實施例中，抗原為HPV-E6。在另一實施例中，HPV-E7來自HPV菌株16。在另一實施例中，HPV-E7來自HPV菌株18。在另一實施例中，HPV-E6來自HPV菌株16。在另一實施例中，HPV-E7來自HPV菌株18。在另一實施例中，本發明亦涵蓋本文揭示之異源抗原之片段。
在另一實施例中，抗原為Her-2/neu。在另一實施例中，抗原為NY-ESO-1。在另一實施例中，抗原為端粒酶(TERT)。在另一實施例中，抗原為SCCE。在另一實施例中，抗原為CEA。在另一實施例中，抗原為LMP-1。在另一實施例中，抗原為p53。在另一實施例中，抗原為碳脫水酶IX(CAIX)。在另一實施例中，抗原為PSMA。在另一實施例中，抗原為前列腺幹細胞抗原(PSCA)。在另一實施例中，抗原為HMW-MAA。在另一實施例中，抗原為WT-1。在另一實施例中，抗原為HIV-1 Gag。在另一實施例中，抗原為蛋白酶3。在另一實施例中，抗原為酪胺酸酶相關蛋白2。在另一實施例中，抗原為PSA(前列腺特異性抗原)。在另一實施例中，抗原選自HPV-E7、HPV-E6、Her-2、NY-ESO-1、端粒酶(TERT)、SCCE、HMW-MAA、EGFR-III、存活素、含有5的桿狀病毒細胞凋亡抑制因子重複序列(BIRC5)、WT-1、HIV-1 Gag、CEA、LMP-1、p53、PSMA、PSCA、蛋白酶3、酪胺酸酶相關蛋白2、Muc1、PSA(前列腺特異性抗原)或其組合。
在另一實施例中，「免疫原性片段」為當單獨或在本文揭示之疫苗組合物中向個體投與時引起免疫反應的片段。在另一實施例中，此類片段含有必要抗原決定基以引起體液免疫反應及/或適應性免疫反應。
在一個實施例中，本文揭示之組合物包含抗體或其功能片段。在另一實施例中，組合物包含至少一個抗體或其功能片段。在另一實施例中，組合物可包含2種抗體、3種抗體、4種抗體或超過4種抗體。在另一實施例中，本發明之組合物包含Lm菌株及抗體或其功能片段。在另一實施例中，本文揭示之組合物包含Lm菌株及至少一種抗體或其功能片段。在另一實施例中，本文揭示之組合物包含Lm菌株及2種抗體、3種抗體、4種抗體或超過4種抗體。在另一實施例中，本文揭示之組合物包含抗體或其功能片段。相同或不同組合物中存在之不同抗體無需具有相同形式，例如一種抗體可為單株抗體且另一種可為FAb片段。
在一個實施例中，本文揭示之組合物包含抗體或其功能片段，其特異性結合GITR或其部分。在另一實施例中，本文揭示之組合物包含抗體或其功能片段，其特異性結合OX40或其部分。在另一實施例中，組合物可包含特異性結合GITR或其部分之抗體，及特異性結合OX40之抗體。在另一實施例中，本發明之組合物包含Lm菌株及特異性結合GITR之抗體或其功能片段。在另一實施例中，本發明之組合物包含Lm菌株及特異性結合OX40之抗體或其功能片段。在另一實施例中，本發明之組合物包含Lm菌株及特異性結合GITR或其部分之抗體，及特異性結合OX40或其部分之抗體。在另一實施例中，本發明之組合物包含特異性結合GITR之抗體或其功能片段，其中組合物不包括本文揭示之李斯特菌菌株。在另一實施例中，本發明之組合物包含特異性結合OX40之抗體或其功能片段，其中組合物不包括本文揭示之李斯特菌菌株。在另一實施例中，本發明之組合物包含特異性結合GITR之抗體或其功能片段，及特異性結合GITR之抗體，其中組合物不包括本文揭示之李斯特菌菌株。相同或不同組合物中存在之不同抗體無需具有相同形式，例如一種抗體可為單株抗體且另一種可為 FAb片段。各可能性代表本發明之不同實施例。
術語「抗體功能片段」係指能夠特異性結合於抗原以引起本發明預期之生物學作用的完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、線性抗體、scFv抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。
如本文中所使用，「抗體重鏈」係指天然存在構形的全部抗體分子中存在的兩種類型多肽鏈中較大一者。
如本文中所使用，「抗體輕鏈」係指天然存在構形的全部抗體分子中存在的兩種類型多肽鏈中較小一者，κ及λ輕鏈係指兩種主要抗體輕鏈同型。
熟練技術人員應理解，術語「合成抗體」可涵蓋使用重組DNA技術產生的抗體，諸如如本文所述之細菌噬菌體表現的抗體。該術語亦應理解為意謂已藉由合成編碼抗體之DNA分子(且該DNA分子表現抗體蛋白)或指定抗體之胺基酸序列所產生之抗體，其中該DNA或胺基酸序列已使用在此項技術中可獲得且熟知之合成DNA或胺基酸序列技術獲得。
在一個實施例中，抗體或其功能片段包含抗原結合區。在一個實施例中，抗原結合區為抗體或其抗原結合域。在一個實施例中，其抗原結合域為Fab或scFv。
熟練技術人員應瞭解，關於抗體之術語「結合」或「特異性結合」涵蓋抗體或其功能片段，其識別特異性抗原，但實質上不識別或結合樣品中的其它分子。舉例而言，特異性結合於來自一個物種之抗原的抗體亦可結合於來自一或多種物種之彼抗原，但此類種間交叉反應性本身不改變抗體的特異性分類。在另一實例中，特異性結合於抗原之抗體亦可結合於抗原的不同等位基因形式。然而，此類交叉反應性本身不改變抗體特異性分類。在一些情況下，術語「特異性結合 (specific binding)」或「特異性結合(specifically binding)」可用於指抗體、蛋白質或肽與第二化學物質的相互作用，意謂著相互作用取決於化學物質上具體結構(例如抗原決定子或抗原決定基)之存在；例如，抗體識別及結合於特異性蛋白質結構而非特異性胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明之組合物包含重組單核細胞增多性李斯特菌(Lm)菌株。在另一實施例中，本文揭示之組合物包含如本文所述之抗體或其功能片段。
在一個實施例中，免疫原性組合物包含本文揭示之抗體或其功能片段及本文揭示之重組減毒李斯特菌。在另一實施例中，本文揭示之免疫原性組合物的各組分在本文揭示之免疫原性組合物的另一組分之前、同時或之後投與。在一個實施例中，即使在同時投與時，Lm組合物及抗體或其功能片段可作為兩種各別組合物投與。或者，在另一實施例中，Lm組合物可包含抗體或其功能片段。
在另一實施例中，本文揭示之組合物藉由熟習此項技術者已知之任何方法向個體投與，，諸如腸胃外、癌旁、經黏膜、經皮、肌肉內、靜脈內、皮內、皮下、腹膜內、心室內、顱內、陰道內或瘤內。
在另一實施例中，經口投與組合物，且因此調配成適於經口投與之形式，即固體或液體製劑形式。適合固體經口調配物包括錠劑、膠囊、丸劑、顆粒、團塊及其類似物。適合液體經口調配物包括溶液、懸浮液、分散液、乳液、油及其類似物。在本發明之另一實施例中，活性成分調配成膠囊。根據此實施例，本發明之組合物除了活性化合物及惰性載劑或稀釋劑之外亦包含硬明膠膠囊。
在另一實施例中，藉由靜脈內、動脈內或肌肉內注射液體製劑投與組合物。適合液體調配物包括溶液、懸浮液、分散液、乳液、油及其類似物。在一個實施例中，藥物組合物靜脈內投與，且因此以適用於靜脈內投與的形式調配。在另一實施例中，醫藥組合物動脈內投 與，且因此以適用於動脈內投與的形式調配。在另一實施例中，醫藥組合物肌肉內投與，且因此以適用於肌肉內投與的形式調配。
在一些實施例中，當抗體或其功能片段各別地自包含重組Lm菌株之組合物投與時，抗體可靜脈內、皮下注射或直接注射至腫瘤或腫瘤床中。在一個實施例中，包含抗體之組合物注射至以手術方式移除腫瘤後留下的空間中，例如移除前列腺腫瘤之後前列腺中的空間。
在一個實施例中，術語「免疫原性組合物」可涵蓋本文揭示之重組李斯特菌，及佐劑及其抗體或功能片段，或其任何組合。在另一實施例中，免疫原性組合物包含本文揭示之重組李斯特菌。在另一實施例中，免疫原性組合物包含此項技術中已知或如本文所揭示之佐劑。亦應理解，如本文進一步揭示，此類組合物之投與提高免疫反應，或提高調節T細胞比率之T效應細胞或引起抗腫瘤免疫反應。
在一個實施例中，本發明提供包含投與包含所述李斯特菌菌株，且進一步包含抗體或其功能片段之組合物的使用方法。在另一實施例中，使用方法包含投與一種以上本文揭示之抗體，其可存在於相同或不同組合物中，且其可與李斯特菌存在於同一組合物中或存在於各別組合物中。
在一個實施例中，術語「醫藥組合物」涵蓋治療有效量之活性成分或包括李斯特菌菌株之成分，及至少一種抗體或其功能片段，以及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。應理解，術語「治療有效量」係指對既定病狀及投與方案提供治療作用之量。
熟練技術人員應理解，術語「投與」涵蓋使個體與本發明組合物接觸。在一個實施例中，投與可活體外實現，即在試管中，或活體內實現，即在活有機體(例如人類)之細胞或組織中。在一個實施例中，本發明涵蓋向個體投與本發明之李斯特菌菌株及其組合物。
如本文所用之術語「約」意謂定量術語加或減5%，或在另一實 施例中，加或減10%，或在另一實施例中，加或減15%，或在另一實施例中，加或減20%。熟練技術人員應理解，術語「個體」可涵蓋需要治療病狀或其後遺症之療法或對病狀或其後遺症敏感的包括成人或人類兒童、少年或青年之哺乳動物，且亦可包括非人類哺乳動物，諸如犬、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、大鼠及小鼠。亦應瞭解術語可涵蓋家畜。術語「個體」不排除所有方面均正常之個體。
在投與本文揭示之免疫原性組合物之後，本文所揭示之方法誘發T效應細胞在周邊淋巴器官中擴展，導致腫瘤部位的T效應細胞之存在增加。在另一實施例中，本文所揭示之方法誘導T效應細胞在周邊淋巴器官中擴展，導致周邊的T效應細胞之存在增加。T效應細胞之此類擴展導致周邊及腫瘤部位之T效應細胞比調節性T細胞的比率增加而不影響Treg之數目。熟練技術人員應瞭解，周邊淋巴器官包括(但不限於)脾臟、派伊爾結(peyer's patches)、淋巴結、腺樣體等。在一個實施例中，周邊的T效應細胞比調節性T細胞之比率增加而不影響Treg之數目。在另一實施例中，周邊、淋巴器官及腫瘤部位的T效應細胞比調節性T細胞之比率增加，而不影響此等部位之Treg數目。在另一實施例中，T效應細胞之比率增加降低Treg之頻率，但不減少此等部位之Treg的總數。
組合療法及其使用方法
在一個實施例中，揭示提供在個體體內引發加強之抗腫瘤T細胞反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含具有核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物的步驟，核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中融合多肽包含融合至異源抗原或其片段之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該方法進一步包含向該個體投與有效量之包含抗體或其片段的組合物的步驟。在另一實施例中，抗體為促效抗體或其抗原結合片 段。在另一實施例中，抗體為抗TNF受體抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，抗體為抗OX40抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，抗體為抗GITR抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，該方法進一步包含投與額外抗體，其可包含於包含該重組李斯特菌菌株之組合物中或可包含於各別組合物中。
在另一實施例中，揭示一種在個體體內引發加強之抗腫瘤T細胞反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含具有核酸分子之重組李斯特菌菌株的免疫原性組合物，核酸分子包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列之第一開放閱讀框架，其中該方法進一步包含向該個體投與有效量的包含抗體或其片段之組合物的步驟。在另一實施例中，抗體為促效抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，抗體為抗TNF受體抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，抗體為抗OX40抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，抗體為抗GITR抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，該方法進一步包含投與額外抗體，其可包含於包含該重組李斯特菌菌株之組合物中或可包含於各別組合物中。
在一個實施例中，包含本文所述之李斯特菌菌株的任何組合物可用於本文所揭示之方法中。在一個實施例中，如本文所述之包含李斯特菌菌株及抗體或其片段(例如結合TNF受體超家族成員之抗體，或結合於T細胞受體共刺激分子之抗體或結合於與共刺激分子結合之抗原呈現細胞受體之抗體)的任何組合物可用於本發明之方法中。在一個實施例中，本文所述的包含抗體或其功能片段之任何組合物可用於本文所揭示之方法中。上文已詳細描述包含李斯特菌菌株且具有及不具有抗體之組合物。上文亦詳細描述具有抗體之組合物。在一些實施例中，在本發明之方法中，包含抗體或其片段(例如結合於TNF受體超家族成員之抗體，或結合於T細胞受體共刺激分子之抗體或結合 於與共刺激分子結合之抗原呈現細胞受體之抗體)的組合物可在包含李斯特菌菌株之組合物之前、同時或之後投與。
在一個實施例中，本文揭示之組合物的重複投與(劑量)可緊隨第一治療時程進行或在數天、數週或數月之間隔之後進行以實現腫瘤消退。在另一實施例中，重複劑量可緊隨第一治療時程進行或在數天、數週或數月的間隔之後進行以實現腫瘤生長抑制。評定可藉由此項技術中已知的任何技術測定，包括診斷方法，諸如成像技術、血清腫瘤標記分析、活體檢查，或腫瘤相關症狀的存在、不存在或改善。
在一個實施例中，本文揭示用於預防、治療及接種異源抗原表現腫瘤及誘導針對異源抗原之亞顯性抗原決定基的免疫反應，同時防止腫瘤逃脫突變的方法及組合物。
在一個實施例中，用於預防、治療及接種異源抗原表現腫瘤的方法及組合物包含使用截斷李斯特菌溶胞素(tLLO)蛋白。在另一實施例中，本文揭示之方法及組合物包含過度表現tLLO之重組李斯特菌。在另一實施例中，tLLO由李斯特菌內之質體表現。
在另一實施例中，本文揭示一種預防或治療個體體內之腫瘤生長或癌症的方法，該方法包含向個體投與包含如本文所述的抗體或其功能片段及包含核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物的步驟，核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中融合多肽包含融合至異源抗原或其片段的截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列。在另一實施例中，本文揭示一種預防或治療個體體內之腫瘤生長或癌症的方法，該方法包含向個體投與包含如本文所述之抗體或其功能片段及包含核酸分子之重組李斯特菌菌株的免疫原性組合物的步驟，核酸分子包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列的第一開放閱讀框架。
在一個實施例中，術語「治療」係指治癒疾病。在另一實施例中，「治療」係指預防疾病。在另一實施例中，「治療」係指降低疾病發生率。在另一實施例中，「治療」係指改善疾病症狀。在另一實施例中，「治療」係指提高患者之無效能存活率或整體存活率。在另一實施例中，「治療」係指穩定疾病進展。在另一實施例中，「治療」係指誘發緩解。在另一實施例中，「治療」係指減緩疾病進展。在另一實施例中，術語「減少」、「抑止」及「抑制」係指減輕或降低。
在一個實施例中，本文揭示一種提高個體之脾臟及腫瘤微環境中的T效應細胞比調節性T細胞(Treg)之比率的方法，包含投與本文揭示之免疫原性組合物。在另一實施例中，提高個體之脾臟及腫瘤微環境中的T效應細胞比調節性T細胞(Treg)之比率允許個體中的更深入抗腫瘤反應。
在另一實施例中，T效應細胞包含CD4+FoxP3- T細胞。在另一實施例中，T效應細胞為CD4+FoxP3- T細胞。在另一實施例中，T效應細胞包含CD4+FoxP3-T細胞及CD8+ T細胞。在另一實施例中，T效應細胞為CD4+FoxP3-T細胞及CD8+ T細胞。在另一實施例中，調節性T細胞為CD4+FoxP3+ T細胞。
在一個實施例中，本發明提供治療、防護及誘導針對腫瘤或癌症之免疫反應的方法，包含向個體投與本文揭示之免疫原性組合物的步驟。
在一個實施例中，本發明提供一種預防或治療人類個體之腫瘤或癌症的方法，包含向個體投與本文揭示之免疫原性組合物菌株、包含具有LLO蛋白之N端片段的重組多肽的重組李斯特菌菌株及腫瘤相關抗原的步驟，藉此重組李斯特菌菌株誘導針對腫瘤相關抗原之免疫反應，由此治療人類個體之腫瘤或癌症。在另一實施例中，免疫反應為T細胞反應。在另一實施例中，T細胞反應為CD4+FoxP3- T細胞 反應。在另一實施例中，T細胞反應為CD8+ T細胞反應。在另一實施例中，T細胞反應為CD4+FoxP3-及CD8+ T細胞反應。在另一實施例中，本發明提供一種保護個體免於腫瘤或癌症之方法，包含向個體投與本文揭示之免疫原性組合物的步驟。在另一實施例中，本發明提供一種誘導個體體內之腫瘤消退的方法，包含向個體投與本文揭示之免疫原性組合物的步驟。在另一實施例中，本文揭示一種降低腫瘤或癌症之發生率或復發的方法，包含向個體投與本文揭示之免疫原性組合物的步驟。在另一實施例中，本文揭示一種抑制個體體內腫瘤形成之方法，包含向個體投與本文揭示之免疫原性組合物的步驟。在另一實施例中，本文揭示一種誘導個體體內之癌症緩解的方法，包含向個體投與本文揭示之免疫原性組合物的步驟。在一個實施例中，包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架的核酸分子整合至李斯特菌基因組中。在另一實施例中，核酸在重組李斯特菌疫苗菌株中的質體中。
在一個實施例中，該方法包含共投與重組李斯特菌與額外療法之步驟。在另一實施例中，額外療法為手術、化學療法、免疫療法、放射療法、以抗體為主之免疫療法或其組合。在另一實施例中，額外療法在投與重組李斯特菌之前。在另一實施例中，額外療法在投與重組李斯特菌之後。在另一實施例中，額外療法為抗體療法。在另一實施例中，重組李斯特菌以增加之劑量投與以提高T-效應細胞比調節T細胞比率及產生更強效抗腫瘤免疫反應。熟練技術人員應瞭解抗腫瘤免疫反應可藉由向具有腫瘤之個體提供包括(但不限於)IFN-γ、TNF-α及此項技術中已知的其他細胞激素的細胞激素提高細胞免疫反應來進一步加強，其中一些可見於以引用的方式併入本文中的美國專利第6,991,785號。
在一個實施例中，本文所揭示之方法進一步包含共投與本文揭示之免疫原性組合物與抗體或其功能片段以提高該個體中的抗腫瘤免 疫反應之步驟。
在一個實施例中，本文所揭示之方法進一步包含共投與本文揭示之免疫原性組合物與吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)路徑抑制劑的步驟。用於本發明之IDO路徑抑制劑包括此項技術中已知的任何IDO路徑，包括(但不限於)1-甲基色胺酸(1MT)、1-甲基色胺酸(1MT)、壞死穩定素-1、吡哆醛異菸鹼醯基腙、依布硒啉(Ebselen)、5-甲基吲哚-3-甲醛、CAY10581、抗IDO抗體或小分子IDO抑制劑。在另一實施例中，本文揭示之組合物及方法亦與化學治療或放射冶療方案結合使用，在其之前或在其之後使用。在另一實施例中，IDO抑制提高化學治療劑之效率。
在另一實施例中，本文揭示一種提高罹患癌症或具有腫瘤之患有的存活率的方法，該方法包含向個體投與包含如本文所述的抗體或其功能片段及包含核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物的步驟，核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中融合多肽包含融合至異源抗原或其片段的截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列。
在另一實施例中，本文揭示一種增加罹患癌症或具有腫瘤之個體體內的抗原特異性T細胞之方法，該方法包含向個體投與包含如本文所述的抗體或其功能片段及包含核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物的步驟，核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中融合多肽包含融合至異源抗原或其片段的截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列。在另一實施例中，本文揭示一種增加罹患癌症或具有腫瘤之個體的T細胞之方法，該方法包含向個體投與包含如本文所述之抗體或其功能片段及包含核酸分子之重組李斯特菌菌株的免疫原性組合物的步驟，核酸分子包含編碼截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸 序列的第一開放閱讀框架。
在另一實施例中，本發明之方法進一步包含向個體加打如本文所揭示之重組李斯特菌菌株或抗體或其功能片段的步驟。在另一實施例中，用於加打接種之重組李斯特菌菌株與初始「初打」接種所用之菌株相同。在另一實施例中，加打菌株與初打菌株不同。在另一實施例中，用於加打接種之抗體與用於初始「初打」接種之抗體結合相同抗原。在另一實施例中，加打抗體與初打抗體不同。在另一實施例中，初打及加打接種使用相同劑量。在另一實施例中，加打使用較大劑量。在另一實施例中，加打使用較小劑量。在另一實施例中，本發明的方法進一步包含向個體投與加打疫苗接種之步驟。在一個實施例中，加打疫苗接種在單次初打疫苗接種之後。在另一實施例中，在初打疫苗接種之後投與單次加打疫苗接種。在另一實施例中，在初打疫苗接種之後投與兩次加打疫苗接種。在另一實施例中，在初打疫苗接種之後投與三次加打疫苗接種。在一個實施例中，初打與加打菌株之間的時間段由熟練技術人員以實驗方式測定。在另一實施例中，初打與加打菌株之間的時間段為1週，在另一實施例中，為2週，在另一實施例中，為3週，在另一實施例中，為4週，在另一實施例中，為5週，在另一實施例中，為6-8週，在另一實施例中，在初打菌株之後8-10週投與加打菌株。
在另一實施例中，本發明之方法進一步包含向個體加打包含本文揭示之減毒李斯特菌菌株之免疫原性組合物。在另一實施例中，本發明之方法包含投與加打之包含本文揭示之減毒李斯特菌菌株的免疫原性組合物的步驟。在另一實施例中，加打為該免疫原性組合物的替代形式。在另一實施例中，本發明的方法進一步包含向個體投與加打免疫原性組合物之步驟。在一個實施例中，在單次初打劑量之該免疫原性組合物之後加打。在另一實施例中，在初打劑量之後投與單次加 打劑量。在另一實施例中，在初打劑量之後投與兩次加打劑量。在另一實施例中，在初打劑量之後投與三次加打劑量。在一個實施例中，包含本文揭示之減毒李斯特菌的免疫原性組合物的初打劑量與加打劑量之間的時間段由熟練技術人員以實驗方式測定。在另一實施例中，劑量由熟練技術人員以實驗方式測定。在另一實施例中，初打劑量與加打劑量之間的時間段為1週，在另一實施例中，為2週，在另一實施例中，為3週，在另一實施例中，為4週，在另一實施例中，為5週，在另一實施例中，為6-8週，在另一實施例中，加打劑量在免疫原性組合物的初打劑量之後8-10週投與。
異源「初打加打」策略已有效提高免疫反應及針對許多病原體提供保護。Schneider等人，Immunol.Rev.170：29-38(1999)；Robinson,H.L.,Nat.Rev.Immunol.2：239-50(2002)；Gonzalo,R.M.等人，Strain 20：1226-31(2002)；Tanghe,A.,Infect.Immun.69：3041-7(2001)。在初打與加打注射中提供不同形式之抗原看起來使對抗原的免疫反應最大化。DNA菌株初打，隨後用佐劑中的蛋白質加打或傳遞編碼抗原之DNA的病毒載體加打，看起來分別為提高抗原特異性抗體及CD4+ T細胞反應或CD8+ T細胞反應的最有效方式。Shiver J.W.等人，Nature 415：331-5(2002)；Gilbert,S.C.等人，Strain 20：1039-45(2002)；Billaut-Mulot,O.等人，Strain 19：95-102(2000)；Sin,J.I.等人，DNA Cell Biol.18：771-9(1999)。來自猴疫苗接種研究的近期資料表明向編碼HIV gag抗原之DNA添加CRL1005泊洛沙姆(poloxamer)(12kDa，5% POE)會提高用HIV gag DNA初打，隨後用表現HIV gag之腺病毒載體(Ad5-gag)加打對猴進行疫苗接種時的T細胞反應。DNA/泊洛沙姆初打繼之以Ad5-gag加打的細胞免疫反應大於用DNA(無泊洛沙姆)初打繼之以Ad5-gag加打或僅Ad5-gag誘導的反應。Shiver,J.W.等人.Nature 415：331-5(2002)美國專利申請公開案第US 2002/0165172 A1號同時描述投與編碼抗原之免疫原性部分的載體構築體及包含抗原之免疫原性部分的蛋白質使得產生免疫反應。文獻限於B型肝炎抗原及HIV抗原。此外，美國專利第6,500,432號係針對藉由同時投與所關注的聚核苷酸及多肽提高核酸疫苗接種之免疫反應的方法。根據專利，同時投與意謂在同一免疫反應期間(較佳彼此在0-10或3-7天內)投與聚核苷酸及多肽。專利涵蓋之抗原尤其包括肝炎(全部形式)、HSV、HIV、CMV、EBV、RSV、VZV、HPV、脊髓灰質炎(polio)、流感、寄生蟲(例如來自瘧原蟲屬)及病原菌(包括(但不限於)結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、麻風分枝桿菌(M.leprae)、衣原體(Chlamydia)、志賀桿菌屬(Shigella)、伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi)、腸毒性大腸桿菌(enterotoxigenic E.coli)、傷寒沙氏桿菌(S.typhosa)、幽門螺旋桿菌(H.pylori)、霍亂弧菌(V.cholerae)、百日咳鮑特菌(B.pertussis)等)之抗原。上述全部參考文獻以全文引用的方式併入本文中。
在一個實施例中，本發明之治療方案為治療性的。在另一實施例中，方案為預防性的。在另一實施例中，本發明之組合物用於保護處於癌症(諸如乳癌或其他類型腫瘤)風險之人，因為家族性遺傳或其他使其易患此等類型病的情況，如熟練技術人員所理解。在另一實施例中，在藉由手術、習知化學療法或輻射治療進行腫瘤生長減積之後，疫苗用作癌症免疫療法。在此治療之後，投與本發明之疫苗，使得疫苗之腫瘤抗原的CTL反應破壞剩餘癌轉移及延長癌症緩解。在另一實施例中，本發明之疫苗用於影響先前已確立腫瘤之生長及殺死現存腫瘤細胞。
在一些實施例中，術語「包含」或其文法形式係指包括指示之活性劑(諸如本發明之Lm菌株)以及包括其他活性劑(諸如抗體或其功能片段)，及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑、潤滑劑、穩定劑等， 如醫藥行業中已知。在一些實施例中，術語「基本上由……組成」係指組合物之唯一活性成分為所指示之活性成分，然而可包括用於穩定、保存該調配物等但不直接涉入所指示活性成分的治療作用的其他化合物。在一些實施例中，術語「基本上由……組成」可指經不同於所指示活性成分的機制發揮治療作用的組分。在一些實施例中，術語「基本上由……組成」可指發揮治療作用且屬於不同於所指示活性成分的化合物類別的組分。在一些實施例中，術語「基本上由……組成」可指發揮治療作用且可能不同於所指示活性成分之治療作用，例如經不同作用機制作用的組分。在一些實施例中，術語「基本上由……組成」可指促進活性成分釋放之組分。在一些實施例中，術語“組成”係指組合物含有活性成分及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
除非上下文另外明確指出，否則如本文所用，單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包括複數個參考物。舉例而言，術語「一種化合物」或「至少一種化合物」可包括複數種化合物，包含其混合物。
在本申請案通篇，本發明之各種實施例可以範圍型式呈現。應理解，範圍型式中之描述僅為了方便及簡潔起見且不應解釋為對本發明範疇的固定限制。因此，範圍之描述應視為已特定揭示所有可能的子範圍以及彼範圍內之個別數值。舉例而言，對諸如1至6之範圍的描述應認為是已經具體地揭示子範圍，諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及所述範圍內之個別數值，例如1、2、3、4、5及6。不管範圍之寬度如何，此均適用。
每當在本文中指示數值範圍時，所述數值範圍均打算包括所指示範圍內的任何引用數值(分數或整數)。短語「在第一指示數字與第二指示數字之間的範圍變化/範圍」以及「自第一指示數字至第二指示數字之範圍變化/範圍」在本文中互換使用且打算包括第一指示數 字及第二指示數字以及其間的所有分數及整數數字。
如本文所用，術語「方法」係指用於實現既定任務之方式、手段、技術及程序，包括(但不限於)化學、藥理學、生物學、生物化學及醫學領域的從業者已知或容易自已知方式、手段、技術及程序發展的那些方式、手段、技術及程序。
在以下實例中，闡述眾多具體細節以便提供對本發明之透徹理解。然而，熟習此項技術者應理解，本發明實施例可在無此等特定細節之情況下實踐。在其他情況下，未詳細描述熟知方法、程序及組件，以免混淆本發明。
實例 材料及實驗方法(實例1-2) 細胞株
C57BL/6同系TC-1腫瘤用HPV-16 E6及E7永生化且用c-Ha-ras致癌基因轉型。T.C.Wu(Johns Hopkins University School of Medicine,Baltimore,MD)提供之TC-1為表現低含量之HPV-16 E6及E7且用c-Ha-ras致癌基因轉型的高度致瘤性肺上皮細胞。TC-1在37°下，在10% CO2下，在RPMI 1640、10% FCS、2mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、100μM非必需胺基酸、1mM丙酮酸鈉、50μmol(mcM)2-ME、400μg(mcg)/ml G418及10%國家典型菌種保藏中心-109培養基中生長。C3為來自用HPV 16之完全基因組永生化且用pEJ-ras轉型的C57BL/6小鼠的小鼠胚芽細胞。EL-4/E7為用E7逆轉錄病毒轉導之胸腺瘤EL-4。
單核細胞增多性李斯特菌菌株及繁殖
所用李斯特菌菌株為Lm-LLO-E7，在本文中亦稱為ADXS11-001(游離型表現系統中之hly-E7融合基因；圖1A)、Lm-E7(整合至李斯特菌基因組中之單複本E7基因卡匣)、Lm-LLO-NP(「DP-L2028」；游離 型表現系統中之hly-NP融合基因)及Lm-Gag(「ZY-18」；整合至染色體中之單複本HIV-1 Gag基因卡匣)。E7藉由PCR使用引子5'-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3'(SEQ ID No：51；XhoI位點加下劃線)及5'-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(SEQ ID No：52；SpeI位點加下劃線)擴增且結合至pCR2.1(Invitrogen,San Diego,CA)中。藉由XhoI/SpeI消化自pCR2.1切除E7且接合至pGG-55中。將hly-E7融合基因及多能轉錄因子prfA選殖至pAM401中產生pGG-55，pAM401為多複本穿梭質體(Wirth R等人，J Bacteriol,165：831,1986)。hly啟動子驅動hly基因產物(不具有溶血性C末端，下文稱為「△LLO」，且具有SEQ ID No：3中所述之序列)的前441 AA表現，其藉由XhoI位點結合至E7基因，獲得作為LLO-E7轉錄及分泌的hly-E7融合基因。用針對質體活體內保留選擇之pGG-55轉型李斯特菌之prfA陰性菌株XFL-7(由Dr.Hao Shen,University of Pennsylvania提供)(圖1A-圖1B)。使用引子5'-GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(SEQ ID No：53；NheI位點加下劃線)及5'-CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC-3'(SEQ ID No：54；XhoI位點加下劃線)產生hly啟動子及基因片段。使用引子5'-GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(SEQ ID No：55；XbaI位點加下劃線)及5'-CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(SEQ ID No：56；SalI位點加下劃線)擴增prfA基因。藉由引入含有hly啟動子及信號序列且驅動E7表現及分泌至LM基因組之orfZ結構域中的表現卡匣產生Lm-E7。藉由PCR使用引子5'-GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC-3'(SEQ ID No：57；BamHI位點加下劃線)及5'-GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG-3'(SEQ ID No：58；XbaI位點加下劃 線)擴增E7。E7接著接合至pZY-21穿梭載體中。LM菌株10403S用所得質體pZY-21-E7轉型，該質體包括插入1.6-kb序列的對應於LM基因組之orfX、Y、Z結構域之中部的表現卡匣。同源結構域允許藉由同源重組將E7基因卡匣插入orfZ結構域中。篩選純系以將E7基因卡匣整合至orfZ結構域中。細菌在具有(Lm-LLO-E7及Lm-LLO-NP)或不具有(Lm-E7及ZY-18)氯黴素(20μg/ml)之腦心浸出液培養基中生長。細菌在-80℃下分成等分試樣冷凍。藉由西方墨點法檢驗表現(圖2)。
西方墨點法
李斯特菌菌株在37℃下在魯利亞-伯托尼培養基中生長且在600nm下量測的相同光學密度下採集。清液層經TCA沈澱且再懸浮於補充有0.1N NaOH之1×樣品緩衝液中。相同量之各細胞團或各TCA沈澱之清液層裝載至4--20%參-甘胺酸SDS-PAGE凝膠(NOVEX,San Diego,CA)上。凝膠轉移至聚偏二氟乙烯且用抗E7單株抗體(mAb)(Zymed Laboratories,South San Francisco,CA)探測，接著與HRP結合的抗小鼠二級Ab(Amersham Pharmacia Biotech,Little Chalfont,U.K.)一起培育，用Amersham ECL偵測試劑顯影且暴露於Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)。
腫瘤生長之量測
每隔一天使用測徑規跨越最短及最長表面直徑對腫瘤進行量測。此等兩次量測之平均值繪製成以毫米為單位的平均腫瘤直徑對多個時間點。當腫瘤直徑達到20mm時處死小鼠。僅顯示存活小鼠的各時間點之腫瘤量測。
李斯特菌重組體對現有腫瘤生長之作用
6至8週大C57BL/6小鼠(Charles River)在左側腹皮下接受2×105個TC-1細胞。腫瘤接種之後一週，腫瘤已達到4--5毫米直徑的可觸尺寸。八隻小鼠的組接著在第7天及第14天用0.1 LD50腹膜內Lm-LLO-E7 (107CFU)、Lm-E7(106CFU)、Lm-LLO-NP(107CFU)或Lm-Gag(5×105CFU)處理。
51 Cr釋放分析法
6--8週大C57BL/6小鼠用0.1LD50 Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag腹膜內免疫。免疫後十天，採集脾臟。脾細胞安置於具有經照射TC-1細胞(100：1，脾細胞：TC-1)作為飼養細胞的培養物中；活體外刺激5天，接著用於使用以下目標之標準51Cr釋放分析法中：用E7 H-2b肽(RAHYNIVTF)脈衝之EL-4、EL-4/E7或EL-4。一式三份進行的E：T細胞比率為80：1、40：1、20：1、10：1、5：1及2.5：1。在37℃下培育4小時之後，將細胞球粒化，且自各孔移除50μl清液層。使用Wallac 1450閃爍計數器(Gaithersburg,MD)分析樣品。根據[(每分鐘實驗計數(cpm)-自發cpm)/(總cpm-自發cpm)]×100測定特異性溶解百分比。
TC-1特異性增殖
C57BL/6小鼠用0.1 LD50免疫且藉由20天後腹膜內注射1 LD50 Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag來加打。加打後六天，自經免疫及未經處理之小鼠採集脾臟。脾細胞以5×105/孔安置於平底96孔培養盤中的培養物中，培養盤具有2.5×104、1.25×104、6×103或3×103經照射TC-1細胞/孔作為E7 Ag之來源，或不具有TC-1細胞或具有10μg/ml Con A。細胞隨後用0.5μCi[3H]胸苷/孔脈衝45小時。18小時後使用Tomtec採集器96(Orange,CT)採集培養盤，且使用Wallac 1450閃爍計數器評定增殖。根據實驗cpm-無Ag cpm計算cpm的改變。
流式細胞檢測分析
C57BL/6小鼠用0.1 LD50 Lm-LLO-E7或Lm-E7靜脈內(i.v.)免疫且在30天後加打。使用FACSCalibur®流式細胞儀使用CellQuest®軟體(Becton Dickinson,Mountain View,CA)進行CD8(53-6.7，PE結合)、 CD62配位體(CD62L；MEL-14，APC結合)及E7 H-2Db四聚體的三色流動式細胞量測術。加打5天後採集之脾細胞在室溫(rt)下用負載有E7肽(RAHYNIVTF)或對照(HIV-Gag)肽之H-2Db四聚體染色。四聚體以1/200倍稀釋使用且由Dr.Larry R.Pease(Mayo Clinic,Rochester,MN)及NIAID Tetramer Core Facility and the NIH AIDS Research and Reference Reagent Program提供。對四聚體+、CD8+、CD62L低細胞進行分析。
B16F0-Ova實驗
24隻C57BL/6小鼠用5×105個B16F0-Ova細胞接種。在第3天、第10天及第17天，8隻小鼠之組用0.1 LD50 Lm-OVA(106cfu)、Lm-LLO-OVA(108cfu)免疫且八隻動物未經處理。
統計
為了比較腫瘤直徑，測定各組之腫瘤尺寸的平均值及SD，且藉由史都登氏t測試測定統計顯著性。p0.05視為顯著。
實例1：LLO-抗原融合物誘導抗腫瘤免疫性 結果
比較Lm-E7及Lm-LLO-E7影響TC-1生長的能力。在C57BL/6小鼠的左側腹建立皮下腫瘤。七天後，腫瘤達到可觸尺寸(4-5mm)。小鼠在第7天及第14天用0.1 LD50 Lm-E7、Lm-LLO-E7或作為對照的Lm-Gag及Lm-LLO-NP接種。Lm-LLO-E7誘導75%之所建立TC-1腫瘤完全消退，同時該組中其他2隻小鼠中的腫瘤生長受到控制(圖3)。相比之下，用Lm-E7及Lm-Gag免疫不誘發腫瘤消退。此實驗重複多次，始終具有極類似結果。另外，Lm-LLO-E7在不同免疫方案下獲得類似結果。在另一實驗中，單次免疫能夠治癒所建立5mm TC-1腫瘤的小鼠。
在其他實驗中，使用2隻其他E7表現腫瘤細胞株C3及EL-4/E7獲 得類似結果。為了確認用Lm-LLO-E7疫苗接種的功效，腫瘤已消除之動物分別在第60天或第40天用TC-1或EL-4/E7腫瘤細胞重新攻擊。用Lm-LLO-E7免疫之動物保持無腫瘤直至實驗終止(在TC-1情形中第124天及EL-4/E7第54天)。
因此，抗原以與△LLO融合之融合蛋白形式表現可提高抗原之免疫原性。
實例2：LM-LLO-E7處理引起TC-1特異性脾細胞增殖
為了量測Lm-E7及Lm-LLO-E7對T細胞之誘導，在經免疫小鼠中量測TC-1特異性增殖反應，其為抗原特異性免疫能力的量度。來自Lm-LLO-E7免疫小鼠之脾細胞在暴露於作為E7之來源的經照射TC-1細胞時以20：1、40：1、80：1及160：1之脾細胞：TC-1比率增殖(圖4)。反之，來自Lm-E7及rLm對照免疫之小鼠的脾細胞僅展現背景增殖程度。
實例3：ActA-E7及PEST-E7融合賦予抗腫瘤免疫性 材料及方法 Lm-ActA-E7之建構
Lm-ActA-E7為LM之重組菌株，包含表現融合至actA蛋白之截斷型式的E7蛋白的質體。藉由將質體載體pDD-1引入至李斯特菌中產生Lm-actA-E7，該載體藉由修飾pDP-2028建構。pDD-1包含表現310bp hly啟動子及hly信號序列(ss)之表現卡匣，其驅使以下之表現及分泌：ActA-E7；包含四個PEST序列的1170bp之actA基因(SEQ ID NO：14)(由分子的前390 AA組成的截斷ActA多肽，SEQ ID NO：12)；300bp HPV E7基因；1019bp prfA基因(控制毒性基因之表現)；及用於選擇經轉型細菌純系之CAT基因(氯黴素耐藥性基因)(Sewell等人.(2004),Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.,130：92-97)。
hly啟動子(pHly)及基因片段使用引子5'- GGGGTCTAGACCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(Xba I位點加下劃線；SEQ ID NO：59)及引子5'-ATCTTCGCTATCTGTCGCCGCGGCGCGTGCTTCAGTTTGTTGCGC-'3(Not I位點加下劃線。前18個核苷酸為ActA基因重疊；SEQ ID NO：60)自pGG55(實例1)PCR擴增。actA基因使用5'-GCGCAACAAACTGAAGCAGCGGCCGCGGCGACAGATAGCGAAGAT-3'(NotI位點加下劃線；SEQ ID NO：61)及引子5'-TGTAGGTGTATCTCCATGCTCGAGAGCTAGGCGATCAATTTC-3'(XhoI位點加下劃線；SEQ ID NO：62)自LM 10403s野生型基因組PCR擴增。E7基因使用引子5'-GGAATTGATCGCCTAGCTCTCGAGCATGGAGATACACCTACA-3'(XhoI位點加下劃線；SEQ ID NO：63)及引子5'-AAACGGATTTATTTAGATCCCGGGTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(XmaI位點加下劃線；SEQ ID NO：64)自pGG55(pLLO-E7)進行PCR擴增。prfA基因使用引子5'-TGTTCTCAGAAACCATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(XmaI位點加下劃線；SEQ ID NO：65)及引子5'-GGGGGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(SalI位點加下劃線；SEQ ID NO：66)自LM 10403s野生型基因組PCR擴增。hly啟動子-actA基因融合物(pHly-actA)使用上游pHly引子(SEQ ID NO：59)及下游actA引子(SEQ ID NO：62)自經純化pHly DNA及經純化actA DNA進行PCR產生及擴增。
融合至prfA基因之E7基因(E7-prfA)使用上游E7引子(SEQ ID NO：63)及下游prfA基因引子(SEQ ID NO：66)自經純化E7 DNA及經純化prfA DNA進行PCR產生及擴增。
融合至E7-prfA融合產物之pHly-actA融合產物使用上游pHly引子 (SEQ ID NO：59)及下游prfA基因引子(SEQ ID NO：66)自經純化融合pHly-actA DNA產物及經純化融合E7-prfA DNA產物進行PCR產生及擴增且接合至pCRII(Invitrogen,La Jolla,Calif.)中。勝任大腸桿菌(TOP10'F,Invitrogen,La Jolla,Calif.)用pCRII-ActAE7轉型。溶解及分離後，藉由使用BamHI(預期片段尺寸770bp及6400bp(或當插入逆轉至載體中時：2500bp及4100bp))及BstXI(預期片段尺寸2800bp及3900bp)之限制分析篩選質體，且亦使用上游pHly引子(SEQ ID NO：59)及下游prfA基因引子(SEQ ID NO：66)之PCR分析篩選。
pHly-actA-E7-prfA DNA插入物藉由使用Xba I及Sal I二重消化自pCRII切除，且接合至pDP-2028中的亦使用Xba I及Sal I消化。用表現系統pActAE7轉型TOP10'F勝任大腸桿菌(Invitrogen,La Jolla,Calif.)之後，藉由使用上游pHly引子(SEQ ID NO：59)及下游PrfA基因引子(SEQ ID NO：66)之PCR分析篩選耐氯黴素純系。包含pActAE7之純系在腦心浸出液培養基(具有氯黴素(20mcg(微克)/ml(毫升)，Difco,Detroit,Mich.)中生長且使用中量提取DNA純化系統套組(Promega,Madison,Wis.)自細菌細胞分離pActAE7。青黴素處理之李斯特菌(菌株XFL-7)的prfA-陰性菌株用表現系統pActAE7轉型，如Ikonomidis等人.(1994,J.Exp.Med.180：2209-2218)中所述，且選擇用於活體內保留質體之純系。在37℃下，在具有氯黴素(20mcg/ml)之腦心浸出液中生長純系。細菌在-80℃下分成等分試樣冷凍。
抗原表現之免疫墨點驗證
為了驗證Lm-ActA-E7分泌ActA-E7(約64kD)，在37℃下在魯利亞-伯托尼(LB)培養基中生長李斯特菌菌株。蛋白質自具有三氯乙酸(TCA)之培養物清液層沈澱且再懸浮於具有0.1N氫氧化鈉的1×樣品緩衝液中。將相同量之各TCA沈澱之清液層裝載至4%至20%參-甘胺酸十二烷基硫酸鈉--聚丙烯醯胺凝膠(NOVEX,San Diego,Calif)上。將 凝膠轉移至聚偏二氟乙烯膜上且用1：2500抗E7單株抗體(Zymed Laboratories,South San Francisco,Calif)探測，接著用1：5000辣根過氧化酶--結合之抗小鼠IgG(Amersham Pharmacia Biotech,Little Chalfont,England)探測。墨點使用Amersham加強之化學發光偵測試劑顯影且暴露於自動放射照像術膠捲(Amersham)(圖5A)。
建構Lm-PEST-E7、Lm-△PEST-E7及Lm-E7epi(圖6A)
Lm-PEST-E7與Lm-LLO-E7一致，但其僅含有hly基因之啟動子及PEST序列，具體而言LLO的前50 AA。為了建構Lm-PEST-E7，hly啟動子及PEST區域使用SOE(藉由重疊擴展基因剪接)PCR技術融合至全長E7基因。E7基因及hly-PEST基因片段自質體pGG-55擴增，其含有LLO的前441 AA，且藉由習知PCR技術剪接在一起。為了產生最終質體pVS16.5，hly-PEST-E7片段及prfA基因次選殖至包括用於活體外選擇之耐氯黴素基因的質體pAM401中，且所得質體用於轉型XFL-7。
Lm-△PEST-E7為與Lm-LLO-E7一致之重組李斯特菌菌株，但其不具有PEST序列。其基本上如針對Lm-PEST-E7所述製備，但使用經設計以自hly-E7融合基因移除含有PEST之區域(bp 333--387)的引子建構游離型表現系統。Lm-E7epi為分泌不具有PEST區之E7或LLO的重組菌株。用於轉型此菌株之質體含有hly啟動子及融合至E7基因之信號序列的基因片段。此構築體不同於初始Lm-E7，其表現整合至染色體中的E7基因之單個複本。Lm-E7epi與Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7及Lm-△PEST-E7完全同基因型，但E7抗原表現之形式不同。
結果
為了比較Lm-ActA-E7對比Lm-LLO-E7誘導之抗腫瘤免疫性，2×105個TC-1腫瘤細胞皮下植入至小鼠中且使其生長至可觸尺寸(約5毫米[mm])。在第7天及第14天，小鼠用一個LD50之Lm-ActA-E7(5× 108CFU)(十字)、Lm-LLO-E7(108CFU)(正方形)或Lm-E7(106CFU)(圓形)腹膜內免疫。第26天，Lm-LLO-E7及Lm-ActA-E7的全部動物均無腫瘤且因此保留，然而未處理動物(三角形)及用Lm-E7免疫之動物全部長出大腫瘤(圖5B)。因此，用ActA-E7融合物疫苗接種引起腫瘤消退。
另外，比較Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7、Lm-△PEST-E7及Lm-E7epi引起E7表現腫瘤消退之能力。在40隻C57BL/6小鼠的左側腹上形成皮下TC-1腫瘤。腫瘤達到4-5mm之後，將小鼠分成5組，每組8隻小鼠。各組用4種重組LM疫苗中1種處理，且1組保持未處理。Lm-LLO-E7及Lm-PEST-E7分別誘導5/8及3/8案例中的現有腫瘤消退。用Lm-PEST-E7或Lm-LLO-E7處理之小鼠在任何時間點的平均腫瘤尺寸之間不存在統計差異。然而，表現不具有PEST序列之E7、Lm-△PEST-E7及Lm-E7epi的疫苗在除一隻小鼠之外的全部小鼠中均未能引起腫瘤消退(圖6B，上部圖)。此代表2個實例，其中用Lm-LLO-E7或Lm-PEST-E7處理之腫瘤與用Lm-E7epi或Lm-△PEST-E7處理之腫瘤之間在第28天的平均腫瘤尺寸中觀測到統計顯著差異；P<0.001，史都登氏t測試；圖6B，底部圖)。另外，經3個實驗在用含有PEST之疫苗接種的小鼠的脾臟中可重現地觀測到四聚體陽性脾細胞百分比增加(圖6C)。因此，用PEST-E7融合物疫苗接種引起腫瘤消退。
實例4：E7融合至LLO、Acta或Pest樣序列會提高E7特異性免疫性及產生腫瘤浸潤E7-特異性CD8+細胞 材料及實驗方法
將包含100mcl在磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中的2×105 TC-1腫瘤細胞加400mcl MATRIGEL®(BD Biosciences,Franklin Lakes,N.J.)的500mcl(微升)MATRIGEL®皮下植入至12隻C57BL/6小鼠(n=3)的左側腹。第7天、第14天及第21天腹膜內免疫小鼠，且在第28 天採集脾臟及腫瘤。自小鼠移除腫瘤MATRIGEL且在4℃下，在冰上，在含有2毫升(ml)RP 10培養基的試管中培育隔夜。使用鑷子絞碎腫瘤，切成2mm塊，且在37℃下與3ml酶混合物(PBS中的0.2mg/ml膠原蛋白酶-p、1mg/ml DNAse-1)一起培育1小時。組織懸浮液經尼龍篩網過濾且用含5%胎牛血清+0.05% NaN3之PBS洗滌四聚體及IFN-γ染色。
脾細胞及腫瘤細胞與1微莫耳(mcm)E7肽一起在佈雷菲爾德菌素A(brefeldin A)存在下在107個細胞/ml下培育5小時。細胞洗滌兩次且在4℃下在50mcl抗小鼠Fc受體清液層(2.4 G2)中培育1小時或隔夜。細胞針對表面分子CD8及CD62L染色，經滲透，使用滲透套組Golgi-stop®或Golgi-Plug®(Pharmingen,San Diego,Calif.)固定且針對IFN-γ染色。使用雙鐳射流式細胞儀FACSCalibur獲得500,000個事件且使用Cellquest軟體(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)分析。計算活化(CD62L低)CD8+ T細胞內IFN-γ分泌細胞的百分比。
對於四聚體染色，H-2Db四聚體負載有藻紅素(PE)結合之E7肽(RAHYNIVTF，SEQ ID NO：67)，在室溫下染色1小時，且在4℃下用抗別藻藍蛋白(APC)結合之MEL-14(CD62L)及FITC結合之CD8染色30分鐘。比較脾臟及腫瘤中之四聚體+CD8+ CD62L低細胞來分析細胞。
結果
為了分析Lm-ActA-E7提高抗原特異性免疫性之能力，向小鼠植入TC-1腫瘤細胞且用Lm-LLO-E7(1×107CFU)、Lm-E7(1×106CFU)或Lm-ActA-E7(2×108CFU)免疫，或未經處理。來自Lm-LLO-E7及Lm-ActA-E7組之小鼠的腫瘤含有的IFN-γ分泌CD8+ T細胞(圖7A)及四聚體特異性CD8+細胞(圖7B)百分比比Lm-E7或未處理小鼠中高。
在另一實驗中，向荷瘤小鼠投與Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7、Lm-△PEST-E7或Lm-E7epi，且量測腫瘤內E7特異性淋巴細胞之含 量。在第7天及第14天用0.1 LD50 4種疫苗處理小鼠。在第21天採集腫瘤且用針對CD62L、CD8之抗體及E7/Db四聚體染色。用Lm-LLO-E7及Lm-PEST-E7接種之小鼠中可見腫瘤內的四聚體陽性淋巴細胞的百分比增加(圖8A)。此結果在三個實驗上可重現(圖8B)。
因此，Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7及Lm-PEST-E7各自有效誘導腫瘤浸潤CD8+ T細胞及腫瘤消退。
實例5：LLO及ActA融合物減輕E6/E7轉殖基因小鼠中的原地(自發)腫瘤
為了測定Lm-LLO-E7及Lm-ActA-E7疫苗對E6/E7轉殖基因小鼠中的原地腫瘤的影響，每月一次用1×108 Lm-LLO-E7或2.5×108 Lm-ActA-E7免疫6至8週大小鼠持續8個月。最後一次免疫後20天處死小鼠且移除其甲狀腺且稱重。此實驗進行兩次(表1)。
兩個實驗的Lm-LLO-E7處理之小鼠與未經處理之小鼠之間以及Lm-LLO-ActA處理之小鼠與未經處理之小鼠之間的甲狀腺重量差異顯著(分別p<0.001及p<0.05)，而Lm-LLO-NP處理之小鼠(不相關抗原對照組)與未經處理之小鼠之間的差異不顯著(史都登氏t測試)，顯示Lm-LLO-E7及Lm-ActA-E7控制自發腫瘤生長。因此，本發明之疫苗防止 形成新E7表現腫瘤。
為了概述上述實例中的發現，LLO抗原及ActA抗原融合物(a)誘發包括腫瘤浸潤抗原特異性T細胞之腫瘤特異性免疫反應；以及對於正常及具體而言侵襲性腫瘤能夠誘發腫瘤消退及控制腫瘤生長；(b)克服對自身抗原之耐受性；以及(c)防止自發腫瘤生長。如其與多種不同抗原、PEST樣序列及腫瘤類型成功實施所證明，此等發現可適用於大多數抗原、PEST樣序列及腫瘤類型。
實例6：LM-LLO-E7疫苗安全且提高宮頸癌患者的臨床指示 材料及實驗方法
入選準則。試驗中的全部患者均診斷為「晚期進行性或復發性宮頸癌」且入選時的評定指示全部分級為患有IVB期疾病。全部患者均表明對含有選自製念珠菌素、流行性腮腺炎、破傷風或結核菌素純化蛋白衍生物(PPD)的3個記憶抗原的失能組具有陽性免疫反應；未懷孕或HIV陽性，在4週內未服用研究性藥物且未接受類固醇。
方案：以3週間隔以250ml標準生理食鹽水中的30分鐘靜脈內(IV)輸注形式向患者(住院病人)投與2次疫苗接種。5天後，患者接受單次時程之IV安比西林且出院，額外10天口服安比西林。卡諾斯基效能指數為整體活力及生活品質(諸如食慾、完成每日任務之能力、平靜睡眠等)之量度，其用於測定整體健康。另外，測定以下安全性及一般安樂指示：鹼性磷酸酶；直接膽紅素及總膽紅素；γ麩胺醯基轉肽酶(ggt)；膽固醇；心臟收縮、心臟舒張及心跳速率；用於評定疾病進展的Eastern Collaborative Oncology Group(ECOG)的準則-卡諾斯基樣生活品質指示；血容比；血紅蛋白；血小板含量；淋巴細胞含量；AST(天冬胺酸轉胺酶)；ALT(丙胺酸轉胺酶)；以及LDH(乳酸脫氫酶)。在第二次給藥之後的3週及3個月對患者進行隨訪，此時測定患者的實體腫瘤中反應評估準則(RECIST)評分，進行掃描以測定腫瘤尺 寸，且收集血液樣品用於在試驗結束時進行免疫分析，其包括評估IFN-γ、IL-4、CD4+及CD8+細胞群。
李斯特菌菌株：實例1中描述LM-LLO-E7之形成。
結果
在臨床試驗之前，進行臨床前實驗以測定靜脈內(i.v.)對比腹膜內投與LM-LLO-E7之抗腫瘤功效。皮下形成含有1×104個TC-1細胞之腫瘤。在第7天及第14天，小鼠用108、107、106或105劑量之108 LM-LLO-E7 i.p.或LM-LLO-E7 i.v.免疫。在第35天，接受108任一途徑之LM-LLO-E7或107 LM-LLO-E7 i.v的5/8小鼠及接受106 LM-LLO-E7 i.v的4/8小鼠經治癒。相比之下，低於107或在一些情況下甚至108 i.p.投與之LM-LLO-E7的劑量對腫瘤生長控制無效。因此，i.v.投與LM-LLO-E7比i.p.投與更有效。
臨床試驗
進行I/II階段臨床試驗來評定晚期進行性或復發性宮頸癌患者中LM-LLO-E7疫苗的安全性及功效。5名患者各自分到群1-2，其分別接受1×109或3.3×109CFU。另外5名患者將各自分到群3-4，其將分別接受1×1010或3.31×1010CFU。
安全性資料 第一群
第一群中的全部患者在輸注開始後1-2小時內均報導發作輕度至中等發熱及發冷。一些患者顯現噁心或不噁心的嘔吐。1個例外(下文描述)，單次劑量之非類固醇劑(諸如撲熱息痛)足以解決此等症狀。觀測到適度短暫心血管作用，與發熱相符且與發熱同時。未報導其他不良作用。
在此宮頸癌的晚期，1年存活率通常為10-15%患者且沒有腫瘤療法有效。實際上，患者2為患有極侵襲性疾病之年輕患者，其在完成 試驗之後不久去世。
在投與後第2天、第3天及第5天評定定量血液培養物。此群中的5名可評估患者中，4名在任何時間均展現無血清李斯特菌且1名在第2天具有極少量(35cfu)流行李斯特菌，在第3天或第5天具有不可偵測之李斯特菌。
對初始疫苗接種起反應的患者5在投與之後48小時具有輕度發熱，且用消炎劑治療。在1個場合，發熱升高至中等嚴重程度(任何時間均不超過38.4℃)，此後向其給予安比西林時程，且發熱消退。在抗生素投與期間，其經歷輕度風疹，在抗生素投與後結束。血液培養物全部無菌，心血管資料在針對其他患者觀測到的範圍內，且血清化學值正常，顯示此患者不具有李斯特菌疾病。另外，失能組指示對1/3記憶抗原穩定反應，指示存在功能性免疫性(類似於其他患者)。患者5隨後證明類似於全部其他患者在接受加打時的反應。
第二群及整體安全性觀測
在兩個群中，在輸注後觀測到肝功能測試中的次要及短暫改變。此等改變由監測試驗之主治醫師判斷為不具有臨床意義，且預期短暫感染自全身循環快速移除至肝臟及脾臟的細菌。一般而言，上文方法部分中所述的全部安全性指示幾乎不展現或不展現變化，表明極佳安全概況。此群中的副作用概況與初始群中所見實際上相同且看起來為與細胞激素及類似試劑的後果相關的一系列劑量獨立性症狀，其由誘發醫原性感染而產生。在任何時間均未觀測到血清李斯特菌且任一群中均未觀測到劑量限制性毒性。
功效-第一群
在完成試驗的第一群中的3名患者中觀測到以下功效適應症：(圖9)。
入選試驗的患者1具有2個各20mm之腫瘤，其經試驗時程縮小至 18及14mm，指示疫苗的治療功效。另外，入選試驗之患者1的卡諾斯基效能指數為70，其在給藥後升高至90。在安全性審查小組會議中，塞爾維亞，貝爾格萊德的腫瘤學及放射學研究所腫瘤科(the Department of Oncology,Institute for Oncology and Radiology,Belgrade,Serbia)主任Sinisa Radulovic提出代表進行試驗之單位的結果；作為單位之顧問工作的獨立腫瘤學家Michael Kurman；艾莫利大學的理論婦科腫瘤學家Kevin Ault，其為Merck進行III期Gardasil試驗且為Glaxo SmithKline進行Cervarix試驗；以及Tate Thigpen，NCI婦科腫瘤學小組創始人及密西西比大學婦科腫瘤學教授。在Radulovic博士的觀點中，患者1展現來自用疫苗治療的臨床益處。
在去世之前，患者2展現混合反應，腫瘤縮小1/2。
入選之患者3患有副腫瘤疾病(癌症偶發現向，其中患者之整體虛弱狀態具有繼發於癌症的其他後遺症)，包括血小板數升高至936×109/ml。在第一劑量之後，計數降低至405×109/ml，大致正常含量。
入選試驗的患者4具有2個各20mm之腫瘤，其經試驗時程縮小至18及14mm，指示疫苗的治療功效。患者4在第一及第二劑量之間展現1.6Kg體重增加且約10%的血紅蛋白數增加。
功效-第二群及通用觀測
在最低劑量群中，2名患者證實腫瘤縮小。此作用之時間安排與免疫反應中觀測到的相符，因為其遵照免疫反應之時間順序發展。第二群中迄今為止評估腫瘤負荷的2名患者中的一名在疫苗接種時間點後展現顯著腫瘤負荷降低。在試驗開始時，此患者具有13、13及14mm的3個腫瘤。2次劑量之疫苗後，2個腫瘤縮小至9.4及12mm，且第三個不再可偵測。
圖13B中描繪2個群的腫瘤負荷。總體而言，即使在含有初打注射及單次加打的治療方案中投與的相對低劑量之LM-LLO-E7亦在6名 已收集資料的患者中獲得3個目標反應。
論述
在此宮頸癌的晚期，1年存活率通常為10-15%患者且沒有腫瘤療法有效。沒有治療顯示有效逆轉IVB期宮頸癌。儘管治療此階段之宮頸癌有困難，但在2/6名患者中觀測到抗腫瘤作用。另外，如上文所述，在完成試驗的患者中觀測功效之其他適應症。
因此，LM-LLO-E7在人類個體中是安全的且即使在相對低劑量下投與時亦改良宮頸癌患者之臨床指示。當加打疫苗接種的劑量及數目增加時；及/或當投與較小劑量之抗生素時激活在輸注後的稍後時間點，觀測到額外陽性結果。臨床前研究已顯示單個數量級的劑量增加可引起反應速率的顯著改變(例如0%反應速率變為50-100%完全緩解速率。額外加打劑量亦極可能進一步提高所獲得之免疫反應。此外，所觀測之治療性免疫反應的陽性作用可能隨著額外時間的推移而繼續，因為免疫系統繼續攻擊癌症。
實例7：建構減毒李斯特菌菌株-Lmdd△actA及將人類klk3基因同框插入至Lmdd及Lmdda菌株中的hly基因. 材料及方法
產生分泌融合至tLLO之PSA的重組Lm(Lm-LLO-PSA)，其引起與前列腺癌小鼠模型中的腫瘤消退有關的強效PSA特異性免疫反應，其中tLLO-PSA之表現源自基於pGG55之質體(表2)，其賦予載體以抗生素耐藥性。吾人最近開發出用於基於pADV142質體的PSA疫苗的新菌株，其不具有抗生素耐藥性標記且稱為LmddA-142(表3)。此新菌株比Lm-LLO-PSA減毒10倍。另外，LmddA-142比Lm-LLO-PSA略微更具免疫原性且顯著更有效消退PSA表現腫瘤。
質體pAdv142(6523bp)之序列如下： (SEQ ID NO：68)。此質體在2-20-08時在Genewiz facility 自大腸桿菌菌株定序。
菌株Lm dal dat(Lmdd)藉由毒性因子ActA不可逆缺失而減毒。建構Lmdaldat(Lmdd)背景中同框缺失actA以避免對下游基因表現的任何極性作用。Lm dal dat△actA在N端含有前19個胺基酸且在C端含有28個胺基酸殘基，缺失591個ActA胺基酸。
藉由擴增對應於actA之上游(657bp-寡's Adv 271/272)及下游(625bp-寡's Adv 273/274)部分的染色體區且藉由PCR接合產生actA缺失突變體。用於此擴增之引子序列在表1中給出。actA之上游及下游DNA區在EcoRI/PstI限制位點選殖至pNEB193中且來自此質體，EcoRI/PstI進一步選殖至溫度敏感性質體pKSV7中，產生△actA/pKSV7(pAdv120)。
使用外部結合至actA缺失區的引子檢驗自其染色體位置的基因缺失，該等引子在圖10(A及B)中顯示為引子3(Adv 305-tgggatggccaagaaattc，SEQ ID NO：73)及引子4(Adv304-ctaccatgtcttccgttgcttg；SEQ ID NO：74)。對自Lmdd及Lmdd△actA分離之染色體DNA進行PCR分析。Lmdd染色體DNA中用兩種不同引子對組1/2及3/4擴增後的DNA片段的尺寸預期為3.0Kb及3.4Kb。另一方 面，Lmdd△actA的使用引子對1/2及3/4之PCR的預期尺寸為1.2Kb及1.6Kb。因此，圖10(A及B)中的PCR分析確認Lmdd△actA菌株中缺失actA的1.8kb區。亦對PCR產物進行DNA定序以確認菌株Lmdd△actA中含有actA之區的缺失。
實例8：建構用於Lm載體之抗原傳遞的與抗生素無關的游離型表現系統.
用於Lm載體之抗原傳遞的與抗生素無關的游離型表現系統(pAdv142)為無抗生素之質體pTV3的次世代(Verch等人，Infect Immun,2004.72(11)：6418-25，以引用的方式併入本文中)。用於毒性基因轉錄活化因子之基因prfA自pTV3缺失，因為李斯特菌菌株Lmdd在染色體中含有prfA基因之複本。此外，NheI/PacI限制位點之p60-李斯特菌dal之卡匣置換為p60-枯草桿菌dal，產生質體pAdv134(圖11A)。李斯特菌及芽孢桿菌dal基因的相似性為約30%，實際上消除質體與Lmdd染色體中之dal基因的剩餘片段之間重組的機會。質體pAdv134含有抗原表現卡匣tLLO-E7。LmddA菌株用pADV134質體轉型且藉由西方墨點確認來自所選純系之LLO-E7蛋白的表現(圖11B)。源自10403S野生型菌株之Lmdd系統不具有抗生素耐藥性標記，但具有Lmdd鏈黴素耐藥性。
另外，pAdv134用XhoI/XmaI限制於人類PSA,klk3純系產生質體pAdv142。新質體pAdv142(圖11C，表2)含有在李斯特菌p60啟動子控制下的芽孢桿菌dal(B-Dal)。穿梭質體pAdv142在無外源性D-丙胺酸存在下補充大腸桿菌ala drx MB2159以及單核細胞增多性李斯特菌菌株Lmdd的生長。質體pAdv142中的抗原表現卡匣由hly啟動子及LLO-PSA融合蛋白組成(圖11C)。
質體pAdv142轉型至李斯特菌背景菌株LmddactA菌株產生Lm-ddA-LLO-PSA。LLO-PSA融合蛋白經菌株Lm-ddA-LLO-PSA之表現及 分泌藉由西方墨點使用抗LLO及抗PSA抗體確認(圖11D)。兩次活體內繼代後，菌株Lm-ddA-LLO-PSA穩定表現及分泌LLO-PSA融合蛋白。
實例9：菌株LmddA-LLO-PSA之活體外及活體內穩定性
藉由在選擇性壓力存在或不存在下培養LmddA-LLO-PSA李斯特菌菌株八天檢驗質體之活體外穩定性。菌株LmddA-LLO-PSA之選擇性壓力為D-丙胺酸。因此，菌株LmddA-LLO-PSA在腦-心臟輸注(BHI)及BHI+100μg/ml D-丙胺酸中繼代。在塗敷於選擇性(BHI)及非選擇性(BHI+D-丙胺酸)培養基上之後測定每天之CFU。預期質體損失將導致塗敷於非選擇性培養基(BHI+D-丙胺酸)上之後CFU較高。如圖12A中所描繪，選擇性及非選擇性培養基中的CFU數目之間不存在差異。此表明當實驗終止時，質體pAdv142穩定至少50代。
藉由在C57BL/6小鼠中靜脈內注射5×107CFU LmddA-LLO-PSA測定質體活體內維持。在24小時及48小時自在PBS中均質化之脾臟分離有活力的細菌。在BHI培養盤及BHI+100mg/ml D-丙胺酸上測定各時間點的各樣品之CFU。將脾細胞塗敷於選擇性及非選擇性培養基之後，在24小時後回收群落。因為此菌株高度減毒，所以24小時內活體內清除細菌負荷。選擇性及非選擇性培養盤上未偵測到顯著CFU差異，指示全部經分離細菌中穩定存在重組質體(圖12B)。
實例10：菌株LmddA-142(LmddA-LLO-PSA)之活體內繼代、毒性及清除率
LmddA-142為分泌游離表現之tLLO-PSA融合蛋白的重組李斯特菌菌株。為了測定安全劑量，小鼠用多種劑量之LmddA-LLO-PSA免疫且測定毒性作用。LmddA-LLO-PSA引起最小毒性作用(資料未圖示)。結果表明小鼠良好耐受LmddA-LLO-PSA的108CFU之劑量。毒性研究指示菌株LmddA-LLO-PSA高度減毒。
測定在C57BL/6小鼠中腹膜內投與安全劑量108CFU LmddA- LLO-PSA的活體內清除率。第2天後，經LmddA-LLO-PSA免疫之小鼠的肝臟及脾臟中不存在可偵測之群落。因為此菌株高度減毒，所以其在48小時內完全活體內清除(圖13A)。
進行細胞感染分析法來測定LmddA-LLO-PSA之減毒是否會減弱菌株LmddA-LLO-PSA感染巨噬細胞及胞內生長的能力。諸如J774A.1之小鼠巨噬細胞樣細胞株用李斯特菌構築體活體外感染且定量胞內生長。陽性對照菌株野生型李斯特菌菌株10403S胞內生長，且prfA突變體陰性對照XFL7不能逃脫吞噬溶菌體且因此在J774細胞中不生長。LmddA-LLO-PSA的胞質內生長比10403S緩慢，因為此菌株失去自細胞擴散至細胞的能力(圖13B)。結果指示LmddA-LLO-PSA有能力感染巨噬細胞及細胞質內生長。
實例11：菌株-LmddA-LLO-PSA於C57BL/6小鼠中的免疫原性
使用PSA四聚體染色測定C57BL/6小鼠中由構築體LmddA-LLO-PSA引起的PSA-特異性免疫反應。小鼠以一週間隔用LmddA-LLO-PSA免疫兩次且在加打後第6天上脾細胞針對PSA四聚體染色。用PSA特異性四聚體染色脾細胞顯示LmddA-LLO-PSA引起23% PSA四聚體+CD8+CD62L低細胞(圖14A)。使用胞內細胞激素染色檢驗PSA特異性T細胞在用PSA肽刺激5小時後分泌IFN-γ之功能性能力。LmddA-LLO-PSA組相較於未經處理之小鼠，用PSA肽刺激的CD8+CD62L低IFN-γ分泌細胞之百分比提高200倍(圖14B)，指示LmddA-LLO-PSA菌株極具免疫原性且在脾臟中對PSA引起高水準之功能活性PSA CD8+ T細胞反應。
為了測定用LmddA-LLO-PSA免疫小鼠後針對PSA產生的細胞毒性T細胞的功能性活性，吾人在活體外分析法中測試PSA特異性CTL溶解用H-2Db肽脈衝細胞EL4細胞的能力。使用基於FACS之卡斯蛋白酶分析法(圖14C)及銪釋放(圖14D)量測細胞溶解。用LmddA-LLO- PSA免疫之小鼠的脾細胞含有對呈現PSA肽作為目標抗原之細胞具有高細胞溶解活性的CTL。
進行Elispot來測定效應性T細胞在用抗原刺激24小時後分泌IFN-γ之能力。使用ELISpot，觀測到來自用特異性肽刺激之LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠的脾細胞中的IFN-γ斑點數相較於未經處理之小鼠的脾細胞提高20倍(圖14E)。
實例12：用LmddA-142菌株免疫誘發表現PSA之腫瘤的消退及腫瘤被PSA特異性CTL浸潤.
使用工程改造以表現PSA的前列腺腺癌細胞株測定構築體LmddA-142(LmddA-LLO-PSA)之治療功效(Tramp-C1-PSA(TPSA)；Shahabi等人，2008)。向小鼠皮下植入2×106個TPSA細胞。當腫瘤在腫瘤接種後第6天達到4-6mm可觸尺寸時，小鼠以一週間隔用108CFU LmddA-142、107CFU Lm-LLO-PSA(陽性對照)免疫三次或未經處理。未經處理之小鼠逐漸產生腫瘤(圖15A)。用LmddA-142免疫之小鼠直至第35天全部無腫瘤且8隻小鼠中的3隻逐漸產生腫瘤，其相較於未經處理之小鼠以緩慢得多的速率生長(圖15B)。八隻小鼠中的五隻70天仍無腫瘤。正如預期，Lm-LLO-PSA接種之小鼠的腫瘤比未經處理之對照組小且腫瘤產生比對照組中緩慢(圖15C)。因此，構築體LmddA-LLO-PSA可消退TPSA細胞株形成的60%腫瘤且減緩其他小鼠中的腫瘤生長。仍無腫瘤之治癒小鼠在第68天用TPSA腫瘤再攻擊。
用LmddA-142免疫小鼠可控制7天形成之Tramp-C1腫瘤的生長及誘發其消退，相較於未經處理之組中的無結果(圖15A)，該等腫瘤經工程改造以在超過60%實驗動物中表現PSA(圖15B)。LmddA-142使用高度減毒載體(LmddA)及質體pADV142建構(表2)。
另外，研究LmddA-LLO-PSA構築體產生的PSA特異性CD8淋巴細胞浸潤腫瘤之能力。用腫瘤及基質膠之混合物皮下植入小鼠，隨後 以七天間隔用未經處理或對照(Lm-LLO-E7)李斯特菌或LmddA-LLO-PSA免疫兩次。在第21天切除腫瘤且分析腫瘤中浸潤的CD8+CD62L低PSA四聚體+及CD4+ CD25+FoxP3+調節性T細胞群體。
觀測到極低數目之CD8+CD62L低PSA四聚體+腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)對未經處理及Lm-LLO-E7對照免疫小鼠中存在的PSA具有特異性。然而，用LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠中PSA特異性CD8+CD62L低PSA四聚體+ TIL百分比增加10-30倍(圖7A)。有趣的是，脾臟中的CD8+CD62L低PSA四聚體+細胞群體比腫瘤中低7.5倍(圖16A)。
另外，測定未經處理之小鼠及李斯特菌免疫小鼠的腫瘤中CD4+/CD25+/Foxp3+ T調節細胞(Treg)之存在。有趣的是，用李斯特菌免疫導致腫瘤而非脾臟中的CD4+ CD25+FoxP3+ T-reg數目顯著降低(圖16B)。然而，構築體LmddA-LLO-PSA對降低腫瘤中的CD4+ CD25+FoxP3+ T-reg的頻率的影響比未經處理及Lm-LLO-E7免疫組強(圖16B)。
因此，LmddA-142疫苗可誘發能夠浸潤腫瘤部位之PSA特異性CD8+ T細胞(圖16A)。有趣的是，用LmddA-142免疫於腫瘤中的調節性T細胞數目減少有關(圖16B)，可能形成對高效抗腫瘤CTL活性更有利的環境。
實例13：儘管PSA融合，但Lmdd-143及LmddA-143分泌功能性LLO.
Lmdd-143及LmddA-143含有全長人類klk3基因，其編碼PSA蛋白，該蛋白質被同源重組下游物插入且與染色體中的hly基因同框。此等構築體使用pKSV7質體(Smith及Youngman,Biochimie.1992；74(7-8)第705-711頁)藉由同源重組製備，該質體為溫度敏感複製子，攜帶hly-klk3-mpl重組卡匣。因為第二重組事件之後切除質體，所以失去用於整合選擇之所以抗生素耐藥性標記物。此外，LmddA-143菌株中的actA基因缺失(圖17A)。藉由兩個構築體中的PCR(圖17B)及定 序(資料未圖示)檢驗klk3與hly至染色體中的同框插入。
此等染色體構築體的一個重要態樣為LLO-PSA的產生將不會完全消除LLO之功能，LLO之功能為李斯特菌自單核細胞增多性李斯特菌產生的吞噬體、胞溶質侵犯及高效免疫性逃脫所需。Lmdd-143及LmddA-143培養物清液層分泌之蛋白質的西方墨點分析揭露對應於LLO-PSA融合蛋白的約81kDa條帶及約60kDa條帶(此為LLO的預期尺寸)(圖18A)，指示LLO自LLO-PSA融合物裂解或仍作為單個蛋白質由單核細胞增多性李斯特菌產生，而不管染色體中的融合基因。Lmdd-143及LmddA-143分泌之LLO相較於野生型單核細胞增多性李斯特菌10403S保持50%溶血性活性(圖18B)。與此等結果一致，Lmdd-143及LmddA-143能夠在巨噬細胞樣J774細胞株中胞內複製(圖18C)。
實例14：Lmdd-143及LmddA-143引起針對PSA抗原的細胞介導之免疫反應.
顯示Lmdd-143及LmddA-143皆能夠分泌融合至LLO的PSA之後，研究此等菌株是否可活體內引起PSA特異性免疫反應的問題。C57BL/6小鼠未經處理或用Lmdd-143、LmddA-143或LmddA-142免疫兩次。藉由用PSA65-74肽刺激脾細胞及針對IFN-γ胞內染色來量測PSA特異性CD8+ T細胞反應。如圖19中示出，染色體及以質體為主之載體誘導的免疫反應類似。
材料及方法(實例15-19) MDSC及Treg功能
視腫瘤模型而定，將腫瘤植入小鼠的側腹或生理學部位。7天後，小鼠接著接種疫苗，初始疫苗接種天視所用腫瘤模型而定。給予疫苗一週後，接著向小鼠投與加打疫苗。
在加打1週後，在侵襲性腫瘤模型的情況中，加打後3-4天，接著處死小鼠且採集腫瘤及脾臟。捕獲腫瘤之前五天，未攜帶腫瘤之小鼠 針對反應T細胞接種疫苗。使用標準方法製備脾細胞。
簡言之，製備腫瘤及脾臟的單細胞懸浮液。手動壓碎脾臟且溶解紅血球。絞碎腫瘤且與膠原蛋白酶/DNase一起培育。或者，GENTLEMACSTM解離劑與腫瘤解離套組一起使用。
使用Miltenyi套組及管柱或autoMAC分離器自腫瘤及脾臟純化MDSC或Treg。接著計數細胞。
製備單細胞懸浮液且溶解紅血球。接著用CFSE標記反應T細胞。
接著將細胞與反應T細胞一起以2：1之比率以每孔1×105個T細胞的密度塗敷至96孔培養盤中的MDSC或Treg中。接著用適當肽(PSA或CA9)或不專門用PMA/離子黴素刺激反應T細胞。在37℃下，在5% CO2下，在暗處培育細胞2天。兩天後，細胞針對FACS染色且在FACS機上分析。
分析T細胞反應
對於藉由ELISA進行的細胞激素分析，採集脾細胞且在培養基、SEA或conA(作為陽性對照)存在下以每孔1,500,000個細胞塗敷於48孔培養盤中。培育72小時後，採集清液層且藉由ELISA(BD)分析細胞激素含量。對於抗原特異性IFN-γ ELISpot，採集脾細胞且在培養基、特異性CTL肽、不相關肽、特異性輔助肽或conA(作為陽性對照)存在下，以每孔300K及150K細胞塗敷於IFN-γ ELISpot培養盤中。培育20小時後，進行ELISpot(BD)且藉由Immunospot分析器(C.T.L.)計數斑點。用圖表示每百萬脾細胞的斑點數。
使用Coulter計數器Z1計數脾細胞。使用標準基於IFN-γ之ELISPOT分析法測定用gag-CTL、gag-輔助細胞、培養基、不相關抗原及con A(陽性對照)再刺激之後產生IFN-γ之CD8+ T細胞的頻率。
簡言之，使用5mg/ml之mAb R40-A2及以最佳稀釋率使用之多株兔抗IFN-γ(由Dr.Phillip Scott,University of Pennsylvania, Philadelphia,PA友情提供)偵測IFN-γ。藉由與使用鼠類rIFN-γ(Life Technologies,Gaithersburg,MD)之標準曲線比較來計算IFN-γ含量。使用過氧化酶結合之山羊抗兔IgG Ab(IFN-γ)顯影培養盤。接著在405nm下讀取培養盤。分析法之偵測下限為30pg/ml。
實例15：李斯特菌疫苗治療後的抑制細胞功能
在第0天，將腫瘤植入小鼠中。在第7天，用Lmdda-E7或LmddA-PSA接種小鼠。在第14天採集腫瘤且量測接種組及未經處理組的浸潤MDSC及Treg的數目及百分比。發現李斯特菌處理之小鼠的腫瘤中MDSC及Treg百分比降低，且MDSC絕對數目降低，而脾臟或引流淋巴結(TLDN)中未觀測到相同作用(圖20)。
在上述實驗中自荷瘤小鼠萃取的經分離脾細胞及腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)彙聚在一起且針對CD3及CD8染色以說明用Lm-LLO-E7、Lm--LLO--PSA及Lm-LLO-CA9、Lm-LLO-Her2免疫(圖21-圖23)對腫瘤中MDSC及Treg(脾臟及腫瘤MDSC及Treg)之存在的作用。各欄表示具體細胞分裂期之T細胞群%且在具體治療組(未經處理、肽--CA9或PSA-處理，無MDSC/Treg及無MDSC+PMA/伊屋諾黴素)(圖21-圖23)細分組。
分析荷瘤小鼠之血液中存在的Treg及MDSC百分比。Lm疫苗接種後，小鼠血液中MDSC及Treg皆降低。
實例16：來自TPSA23腫瘤而非脾臟的MDSCS在李斯特菌疫苗接種後較少抑制.
使用自具有非特異性活化之未經處理之鼠類細胞及特異性活化細胞(PSA、CA9、PMA/離子黴素)的TPSA23腫瘤分離之單核細胞性及粒細胞性MDSC進行抑制劑分析法。結果證實自Lm接種組之腫瘤分離的MDSC相較於來自未經處理小鼠之腫瘤的MDSC抑制經活化T細胞分裂的能力減弱。(參看圖21及圖23中Lm-LLO-PSA及Lm-LLO處理 組，圖中的右側圖表示來自左側圖的經彙聚之細胞分裂資料)。另外，來自未經處理之小鼠(其中不存在MDSC且其中細胞未經刺激/活化)的T反應細胞仍保持其親本(休眠)狀態(圖21及圖23)，然而觀測到用PMA或伊屋諾黴素刺激的T細胞複製(圖21及圖23)。另外，觀測到Gr+Ly6G+及GrdimLy6G-MDSC在用李斯特菌疫苗處理後較少抑制。此適用於其抑制活化PSA特異性T細胞及非特異性(PMA/伊屋諾黴素刺激)T細胞分裂的能力降低。
此外，使用自具有非特異性活化之未經處理鼠類細胞的TPSA23腫瘤分離的MDSC進行的抑制分析法證實自Lm疫苗接種組之腫瘤分離的MDSC相較於來自未經處理小鼠之腫瘤的MDSC抑制活化T細胞的能力減弱。
(圖21及圖23)。
另外，當使用脾臟MDSC時未觀測到上文剛剛關於圖21及圖27所述的觀測。在下文中，來自未經處理組、李斯特菌處理組(PSA，CA9)及PMA/伊屋諾黴素刺激組(陽性對照)的脾細胞/T細胞全部證實相同水準之複製(圖22及圖24)。因此，此等結果顯示腫瘤中之抑制細胞的李斯特菌介導之抑制以抗原特異性及非特異性方式起作用，而李斯特菌對脾臟粒細胞性MDSC不具有作用，因為其僅以抗原特異性方式抑制。
實例17：腫瘤T調節細胞降低之抑制
使用李斯特菌處理後來自TPSA23腫瘤分離之Treg進行抑制劑分析法。用李斯特菌處理後觀測到來自腫瘤之Treg的抑制能力降低(圖25)，然而，發現脾臟Treg仍抑制(圖26)。
作為對照，使用習知CD4+ T細胞代替MDSC或Treg且發現對細胞分裂不具作用(圖27)。
實例18：來自4t1腫瘤而非脾臟的MDSCS及Treg在李斯特菌疫苗接種 後較少抑制.
如上文中，使用4T1腫瘤進行相同實驗且獲得相同觀測結果，即MDSC在李斯特菌疫苗接種後較少抑制(圖28及圖30)，李斯特菌對脾臟單核細胞性MDSC不具有特異性作用(圖29及圖31)，李斯特菌疫苗接種後來自4T1腫瘤之Treg的抑制能力降低(圖32)，及李斯特菌對脾臟Treg的抑制能力不具作用(圖33)。
最終，觀測到李斯特菌對脾臟Treg的抑制能力不具作用。
實例19：由於過度表現tLLO引起的粒細胞性及單核細胞性MDSC抑制能力的改變
LLO質體顯示與具有TAA或不相關抗原之李斯特菌疫苗類似的結果(圖34)。此意謂粒細胞性MDSC抑制能力的改變是由於過度表現tLLO且與搭檔融合抗原無關。單獨的空質體構築體亦導致MDSC抑制能力改變，但與質體上含有截斷LLO之任何疫苗的程度不精確相同。3個獨立實驗的平均值顯示空質體與具有tLLO的另一質體(具有及不具有腫瘤抗原)之間的抑制差異顯著。MDSC抑制能力的降低相同，而與是否使用抗原特異性或非特異性刺激之反應T細胞的情況無關。
類似於粒細胞性MDSC，3個獨立實驗之平均值顯示用Lm-空質體疫苗疫苗接種後觀測到的自腫瘤純化之單核細胞性MDSC的抑制能力差異相較於其他疫苗構築體顯著(圖35)。
類似於上述觀測，自脾臟純化的粒細胞性MDSC在Lm疫苗接種後保持其抑制抗原特異性反應T細胞分裂的能力(圖36)。然而，非特異性刺激後，經活化T細胞(使用PMA/伊屋諾黴素)仍能分離。使用僅LLO或空質體疫苗未改變此等結果顯示以Lm為主之疫苗不影響脾臟粒細胞性MDSC(圖35)。
類似地，自脾臟純化之單核細胞性MDSC在Lm疫苗接種後保持其抑制抗原特異性反應T細胞分裂的能力。然而，非特異性活化(藉由 PMA/伊屋諾黴素刺激)後，T細胞仍能夠分裂。使用僅LLO或空質體疫苗未改變此等結果顯示Lm疫苗不影響脾臟單核細胞性MDSC(圖37)。
自任何Lm處理組之腫瘤純化的Treg抑制反應T細胞分裂的能力略微減弱，而不管反應細胞為抗原特異性還是非特異性活化。尤其對於非特異性活化之反應T細胞，看起來如同具有空質體之疫苗顯示與質體上含有活化之全部疫苗相同的結果。對此使用其它材料的實驗取平均值顯示差異不顯著(圖38)。
自脾臟純化之Treg仍能夠抑制抗原特異性及非特異性活化反應T細胞的分裂。Lm處理對脾臟Treg的抑制能力無作用(圖39)。
不管反應細胞經抗原特異性還是非特異性活化，Tcon細胞都不能抑制T細胞分裂，此與此等細胞非抑制性的情況相符。若細胞自小鼠之腫瘤或脾臟純化，則Lm對此等細胞無作用且無差異(圖40-圖41)。
實例20：投與以李斯特菌為主之疫苗與抗OX40或抗GITR Ab之組合的小鼠中的存活率增加 材料及方法 動物、細胞株、疫苗及其他試劑
六至八週齡雌性C57BL6小鼠購自傑克遜實驗室(Jackson Laboratories)且保持於無病原體條件下。根據GRU Animal Care and Use Committee批准的方案根據NIH指導原則護理小鼠。藉由共轉染人類乳突狀瘤病毒菌株16(HPV16)早期蛋白6及7(E6及E7)及原生C57BL/6小鼠肺上皮細胞的經活化ras致癌基因產生之TC-1細胞獲自ATCC(Manassas,VA)，且在37℃及5% CO2下，在補充有10% FBS、青黴素及鏈黴素(各100U/ml)及L-麩醯胺酸(2mM)之RPMI 1640中生長細胞。Advaxis Inc.提供的具有或不具有人類乳頭狀瘤病毒-16(HPV-16)E7的李斯特菌疫苗載體(Lm-LLO-E7、LmddA-LLO及XFL7) 如上文在實例1中所述及如上文在【實施方式】中所揭示產生。
Lm-LLO-E7、LmddA-LLO及XFL7以1×108CFU/小鼠之劑量腹膜內(i.p.)注射。GITR及OX40抗體獲自Astra Zeneca/Medimmune且以50μg/小鼠(針對抗OX40Ab)及250μg/小鼠(針對抗GITR Ab)之劑量靜脈內(i.v.)注射，如圖42A及圖42B中所示。
腫瘤植入及治療
如下進行旨在分析腫瘤生長及存活率之治療性實驗。簡言之，在第0天在小鼠右側腹皮下(s.c.)植入70,000 TC-1腫瘤細胞/小鼠。在第10天(腫瘤尺寸為直徑約4-5mm)，來自適當組(每組10隻小鼠)的動物用具有或不具有抗GITR Ab或抗OX40 Ab之Lm-LLO-E7、LmddA-LLO及XFL7腹膜內注射或使其未經處理(NT)。(圖42C)在整個實驗長度，接受抗OX40 Ab之小鼠一週兩次用疫苗及抗OX40 Ab處理(圖42，第10天、第13天、第17天、第20天等)。接受抗GITR Ab之小鼠一週兩次用總共3次劑量處理(圖42B，第10天、第13天及第17天)。另一組小鼠未處理。
結果
圖43A-圖43B顯示投與單獨的以李斯特菌為主之疫苗ADXS11-001時，經處理小鼠的存活時間比未經處理或對照組處理小鼠延長至少兩倍，用ADXS11-001處理及投與抗GITR Ab的組合不僅延長該群體的存活時間而且提高存活百分比。百分比增加約40%。ADXS11-001與抗GITR Ab之組合導致60%經處理小鼠中現有腫瘤完全消退(圖43A)。有趣的是，抗GITR抗體亦顯示用LmddA-LLO/抗GITR處理的小鼠相較於僅接受LmddA-LLO之小鼠存活時間增加(圖43B)。
圖44A-圖44B顯示投與單獨的以李斯特菌為主之疫苗ADXS11-001時，經處理小鼠的存活時間比未經處理或對照組處理小鼠延長至少兩倍，用ADXS11-001處理及投與抗OX40 Ab的組合不僅延長該群 體的存活時間而且提高存活百分比(圖44B)。百分比增加約20%。因此，ADXS11-001與抗OX40 Ab之組合導致40%經處理小鼠中現有腫瘤完全消退(圖44A)。
此等結果顯示使用抗OX40及抗GITR抗體提高以李斯特菌為主之疫苗的治療功效。
實例21：使用針對共刺激分子GITR及OX40的促效抗體顯著提高以李斯特菌為主之免疫療法的抗腫瘤功效
在實例20中提出之結果顯示促效抗體抗OX40及抗GITR提高以李斯特菌為主的疫苗提高治療功效之後，分析針對此提高之存活率的免疫反應。
材料及方法
動物、細胞株、疫苗及其他試劑 六至八週齡雌性C57BL6小鼠購自傑克遜實驗室(Jackson Laboratories)且保持於無病原體條件下。根據GRU Animal Care and Use Committee批准的方案根據NIH指導原則護理小鼠。藉由共轉染人類乳突狀瘤病毒菌株16(HPV16)早期蛋白6及7(E6及E7)及原生C57BL/6小鼠肺上皮細胞的經活化ras致癌基因產生之TC-1細胞獲自ATCC(Manassas,VA)，且在37℃及5% CO2下，在補充有10% FBS、青黴素及鏈黴素(各100U/ml)及L-麩醯胺酸(2mM)之RPMI 1640中生長細胞。由Advaxis Inc.提供的具有或不具有人類乳頭狀瘤病毒-16(HPV-16)E7、Lm[XFL7]、Lm-LLO[LmddA-LLO]、Lm-LLO-E7[ADXS11-001])的李斯特菌疫苗載體如上文在實例1中所述及如上文在【實施方式】中揭示產生。以李斯特菌為主之療法於對照組一起顯示於表3中。
第13天開始，Lm、LM-LLO及Lm-LLO-E7以1×108CFU/小鼠劑量每7天腹膜內(i.p.)注射(圖45及圖51A)。GITR及OX40抗體獲自Astra Zeneca/Medimmune且以靜脈內(i.v.)方式注射，如圖45、圖51中所示。
腫瘤植入及治療
治療實驗分析腫瘤生長及免疫反應且如下進行。簡言之，第0天在小鼠右側腹皮下(s.c.)植入70,000個TC-1腫瘤細胞/小鼠。第13天(腫瘤尺寸直徑約4-5mm)，適當組(每組5隻小鼠)的動物腹膜內注射具有或不具有抗GITR Ab(圖45；表4)或抗OX40 Ab(圖51；表5)的LM、LM-LLO或Lm-LLO-E7，或未經處理(NT)。第13天(D13)開始，接受抗OX40 Ab的小鼠以3-4天間隔用疫苗及抗OX40 Ab處理，總共四次1mg/kg小鼠體重(mpk)劑量(圖51)。第13天(D13)開始，接受抗GITR Ab的小鼠以3-4天間隔用疫苗及抗GITR Ab處理，總共四次5mg/kg小鼠體重(mpk)劑量(圖45)。另一組小鼠保持未經促效抗體處理(PBS列，如圖42C中所述)。
在小鼠子組中，每3--4天使用數位測徑規量測腫瘤，且將使用等式V=(W2×L)/2計算腫瘤體積，藉此V為體積，L為長度(較長直徑)且W為寬度(較短直徑)。在此等實驗中，當小鼠瀕死、腫瘤潰爛或腫瘤體積達到1.5cm3時將處死小鼠。
總共有8個測試組。第26天(D26)，處死全部動物，採集脾臟及腫瘤且篩選浸潤總CD4、Tregs(CD4+FoxP3+)、非Treg(CD4+FOXP3-)、CD8+、CD8+E7+、骨髓源抑制細胞(MDSC)、CD8+/Treg、CD8+E7+/Treg、CD8+/MDSC、CD8+E7+/MDSC。
分析周邊及腫瘤中的抗原特異性細胞免疫反應(ASIR)、Treg、MDSC
如製造商(BD Biosciences,San Jose,CA)所建議，使用ELISPOT偵測來自處理及對照小鼠的E7再刺激(10μg/ml)脾細胞培養物中的 IFNγ產量。CTL Immunospot分析器(Cellular Technology Ltd.,Shaker Heights,OH)將用於分析斑點。不相關肽(hgp 10025--33-KVPRNQDWL-Celtek Bioscience,Nashville,TN)再刺激脾細胞的斑點數目將減去E7再刺激培養物的斑點數目。另外，腫瘤內的ASIR在圖48B及圖54B中表示為抗原特異性腫瘤浸潤CD8+ T細胞(CD8+E7+細胞)的數目。
如製造商(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)所建議，使用GentleMACS解離劑及實體腫瘤均質化方案處理腫瘤樣品。使用流動式細胞量測分析法分析CD45+造血細胞群內的腫瘤浸潤CD8+、CD4+Foxp3+(Treg)及CD11b+Gr-1+(MDSC)細胞的數目。使用相同流動式細胞量測分析法評估經處理及對照組荷瘤小鼠中Treg細胞及MDSC的含量。
統計分析
全部統計參數均使用GraphPad Prism軟件(San Diego,CA)計算。使用杜凱氏多重比較後測試藉由單因子變異數分析測定各組之間的統計顯著性(P<0.05視為統計顯著)。
結果 與GITR促效抗體之組合
組合療法後，浸潤CD4+ T細胞的總數增加。圖46A顯示投與Lm-LLO-E7與GITR促效抗體的組合甚至相較於單獨單一療法顯著增加腫瘤浸潤性總CD4+ T細胞。重要的是，投與LM-LLO-E7與GITR促效抗體之組合對Treg細胞(CD4+Foxp3+)總數不具有顯著作用(圖46B)。
組合療法後，非Treg CD4+ T細胞的總數增加。圖47A顯示投與Lm-LLO-E7與GITR促效抗體的組合顯著增加非Treg(CD4+Foxp3-)CD4+ T細胞的總數。有趣的是，投與以李斯特菌為主的疫苗本身顯著降低總CD4及與FITR促效抗體組合中的Foxp3細胞的整體百分比， 該降低甚至顯著高於單獨PBS或促效劑組(圖47B)。
組合療法亦導致總CD8+ T細胞的加強的腫瘤浸潤。觀測到投與LM-LLO及LM-LLO-E7與抗GITR促效抗體(Ab)的組合顯著增加腫瘤浸潤性CD8+ T細胞。(圖48A)有趣的是，觀測到LM-LLO-E7顯著增加具有抗GITR Ab之腫瘤浸潤性抗原特異性CD8+E7+ T細胞。(圖48B)
組合療法提高腫瘤中的CD8/Treg比率。發現組合GITR Ab組中的腫瘤中的CD8/Treg比率相較於單獨PBS或抗體組顯著提高。(圖49A)觀測到LM-LLO-E7及抗GITR組合組中的E7-CD8/Treg比率未顯著提高。(圖49B)
藉由促效GITR抗體誘導MDSC。觀測到針對GITR之促效Ab相較於PBS組顯著誘發MDSC。(圖50A)此外，使用抗GITR Ab與LM-LLO-E7之組合顯著提高CD8/MDSC比率。(圖50B)有趣的是，抗GITR Ab與LM-LLO-E7的組合顯著提高E7+CD8+/MDSC比率。(圖50C)
與OX40促效抗體之組合
有趣的是，OX40促效劑Ab本身相較於PBS組顯著增加總CD4+T細胞。以李斯特菌為主的LM-LLO-E7與OX40促效Ab的組合僅比PBS組但不比單獨之單一療法顯著增加腫瘤浸潤性總CD4+T細胞。(圖52A)與以李斯特菌為主的LM-LLO及LM-LLO-E7之組合顯著減少OX40 Ab誘導之Treg細胞(CD4+Foxp3+)。(圖52B)
分析腫瘤浸潤性總非Treg(CD4+FoxP3-)數目及總CD4+ T細胞的Treg百分比。以李斯特菌為主的E7疫苗與OX40促效Ab之組合顯著增加非Treg(CD4+Foxp3-)T細胞的總數。(圖53A)以李斯特菌為主的疫苗本身顯著降低總CD4中Foxp3細胞的整體百分比，且與OX40促效Ab組合，該降低比全部組甚至顯著更高。(圖53B)
組合療法之後，總CD8+ T細胞以及抗原特異性CD8+E7+細胞的數目增加。LM-LLO-E7與抗OX40組合導致CD8+T細胞總數相較於 PBS組顯著提高。(圖54A)另外，當與抗OX40促效Ab之投與組合時，觀測到LM-LLO-E7顯著增加腫瘤浸潤性抗原特異性CD8+E7+ T細胞。(圖54B)
組合療法後，CD8/Treg及E7CD8/Treg的比率提高。發現抗OX40促效Ab及LM-LLO-E7組合組中相較於全部組，腫瘤中的CD8/Treg比率顯著提高。(圖55A)發現抗OX40促效Ab及LM-LLO-E7組合組中相較於全部組，腫瘤中的E7CD8/Treg比率提高。(圖55B)
組合療法後誘發MDSC。觀測到促效OX40 Ab非顯著提高MDSC且與LM-LLO-E7組合顯著降低此免疫抑制MDSC。(圖56A)抗OX40 Ab與LM-LLO-E7之組合顯著提高CD8/MDSC比率。(圖56B)且，抗OX40 Ab與LM-LLO-E7之組合顯著提高E7+CD8+/MDSC比率。(圖56C)
結論
本文中呈現之結果顯示與以李斯特菌為主的E7疫苗組合抑制共刺激GITR及OX40路徑的抗腫瘤及免疫反應。在LM-LLO-E7腫瘤疫苗存在下共刺激GITR或OX40路徑展現提高的抗腫瘤活性及提高的存活率(實例20)。儘管抗GITR或抗OX40與以肽為主的E7疫苗之組合顯著增加總CD8以及抗原特異性CD8，但其對Treg或MDSC群無作用。而發現使用此等促效抗體之療法本身或與以肽為主的E7疫苗之組合在TC1腫瘤模型中增加腫瘤中的免疫抑制細胞。
已知以李斯特菌為主的疫苗減少免疫抑制細胞，包括Treg及MDSC。此處觀測到在以李斯特菌為主的疫苗存在下共刺激GITR或OX40路徑提高CD8 T細胞比MDSC群之比率且增加CD8及抗原特異性CD8，因此整體提高與改善抗腫瘤活性及存活率相關的效應細胞/免疫抑制細胞比率。
材料及方法(實例22-27)
寡核苷酸由Invitrogen(Carlsbad,CA)合成且由Genewiz Inc,South Plainfield,NJ進行DNA定序。流動式細胞量測試劑購自Becton Dickinson Biosciences(BD,San Diego,CA)。除非指出，否則細胞培養基、補充劑及全部其他試劑來自Sigma(St.Louise,MO)。Her2/neu HLA-A2肽由EZbiolabs(Westfield,IN)合成。完全RPMI 1640(C-RPMI)培養基含有2mM麩醯胺酸、0.1mM非必需胺基酸及1mM丙酮酸鈉、10%胎牛血清、青黴素/鏈黴素、Hepes(25mM)。多株抗LLO抗體在上文描述且抗Her2/neu抗體購自Sigma。
小鼠及細胞株
全部動物實驗根據University of Pennsylvania或Rutgers University的IACUC批准的方案進行。FVB/N小鼠購自傑克遜實驗室(Bar Harbor,ME)。過度表現大鼠Her2/neu onco-蛋白的FVB/N Her2/neu轉殖基因小鼠在University of Pennsylvania的動物核心設施圈養及飼養。表現高含量大鼠Her2/neu蛋白的NT-2腫瘤細胞株源自此等小鼠中的自發乳房腫瘤且如上文所述生長。DHFR-G8(3T3/neu)細胞獲自ATCC且根據ATCC建議生長。EMT6-Luc細胞株為John Ohlfest博士(University of Minnesota,MN)大方贈予的禮物且在完全C-RPMI培養基中生長。在University of Pennsylvania(Philadelphia,PA)的Small Animal Imaging Facility(SAIF)指導下進行生物發光作用。
李斯特菌構築體及抗原表現
Her2/neu-pGEM7Z由University of Pennsylvania的Mark Greene博士友情提供且含有選殖至pGEM7Z質體(Promega,Madison WI)中的全長人類Her2/neu(hHer2)基因。此質體用作藉由PCR使用表6中指示的pfx DNA聚合酶(Invitrogen)及寡核苷酸擴增hHer-2/neu的三個區段(即EC1、EC2及IC1)的模板。
藉由SOEing PCR方法直接融合且各獨立hHer-2/neu區段作為模板產生Her-2/neu嵌合體構築體。引子顯示於表7中。
用於擴增不同區段人類Her2區域的引子序列
使用XhoI及SpeI限制酶自pAdv138切除ChHer2基因，且與Lmdd穿梭載體pAdv134中的LLO的截斷非溶血性片段同框選殖。藉由DNA定序分析確認插入物LLO及hly啟動子的序列。此質體電穿孔至電勝任actA、dal、dat突變體單核細胞增多性李斯特菌菌株中，在含有鏈黴 素的腦心浸出液(BHI)瓊脂培養盤上選擇LmddA及陽性純系(250μg/ml)。在一些實驗中，表現hHer2/neu(Lm-hHer2)片段的類似李斯特菌菌株用於比較目的。在全部研究中，包括不相關李斯特菌構築體(Lm對照組)來解釋李斯特菌對免疫系統的與抗原無關之作用。Lm對照組基於與ADXS31-164相同的李斯特菌平台(LmddA-ChHer2)，但表現不同抗原，諸如HPV16-E7或NY-ESO-1。測試李斯特菌對融合蛋白之表現及分泌。各構築體活體內繼代兩次。
細胞毒性分析
3-5隻FVB/N小鼠的組以一週間隔用1×108群落形成單位(CFU)之Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164、Lm-hHer2 ICI或Lm-對照組(表現不相關抗原)免疫三次或保持未經處理。NT-2細胞活體外生長，藉由胰蛋白酶剝落且在37℃下用絲裂黴素C(無血清C-RPMI培養基中250mg/ml)處理45分鐘。洗滌5次後，其與自經免疫或未經處理動物採集的脾細胞以1：5之比率(刺激劑：反應劑)一起在37℃及5% CO2下培育5天。根據上述方法使用銪標記的3T3/neu(DHFR-G8)細胞作為目標進行標準細胞毒性分析法。在4小時培育後使用分光光度計(Perkin Elmer,Victor2)在590nm下量測自殺死之目標細胞釋放的銪。特異性溶解百分比定義為(實驗組中的溶解-自發溶解)/(最大溶解-自發溶解)。
來自經免疫小鼠之脾細胞的干擾素-γ分泌
3-5隻FVB/N或HLA-A2轉殖基因小鼠組以一週間隔用1×108CFU之ADXS31-164(陰性李斯特菌對照組，表現不相關抗原)免疫三次或保持未經處理。在最後一次免疫之後一週自FVB/N小鼠分離脾細胞且在24孔培養盤中在絲裂黴素C處理之NT-2細胞存在下在C-RPMI培養基中以5×106個細胞/孔共同培養。來自HLA-A2轉殖基因小鼠的脾細胞在1μM HLA-A2特異性肽或1μg/ml重組His標記之ChHer2蛋白存在下 培育，該ChHer2蛋白在大腸桿菌中產生且藉由基於鎳的親和性層析系統純化。24或72小時後自清液層獲得樣品且根據製造商的建議使用小鼠干擾素-γ(IFN-γ)酶聯結免疫吸附分析法(ELISA)套組測試IFN-γ之存在。
Her2轉殖基因動物中的腫瘤研究
六週齡FVB/N大鼠Her2/neu轉殖基因小鼠(9-14隻/組)用5×108CFU Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164或Lm-對照組免疫6次。一週兩次觀測其自發性乳房腫瘤的出現，使用電子測徑規量測達52週。當腫瘤的平均直徑達到1cm2之尺寸時切除逃脫之腫瘤且在-20℃下保存於RNAlater中。為了判斷Her2/neu蛋白中之突變對此等腫瘤逃脫之作用，使用染色體組DNA分離套組提取染色體組DNA且定序。
ADXS31-164對脾臟及腫瘤中的調節性T細胞的作用
向小鼠皮下植入(s.c.)1×106 NT-2細胞。在第7天、第14天及第21天，將其用1×108CFU ADXS31-164、LmddA-對照組免疫或保持未經處理。在第28天提取腫瘤及脾臟且藉由FACS分析測試CD3+/CD4+/FoxP3+ Treg之存在。簡言之，藉由在C-RPMI培養基中的兩個蓋玻片之間均質化脾臟來分離脾細胞。使用無菌剃刀片絞碎腫瘤且用含有PBS中的DNase(12U/ml)及膠原蛋白酶(2mg/ml)之緩衝液消化。在室溫下在攪拌下培育60分鐘後，藉由劇烈吸液分離細胞。藉由RBC溶解緩衝液溶解紅血球，隨後用含有10% FBS之完全RPMI-1640培養基洗滌若干次。經尼龍篩網過濾後，將腫瘤細胞及脾細胞再懸浮於FACS緩衝液(2% FBS/PBS)中且用抗CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD25-APC抗體染色，隨後滲透及用抗Foxp3-PE染色。使用4色FACS calibur(BD)進行流式細胞儀分析且使用細胞探索軟體(BD)分析資料。
統計分析
存活資料使用對數秩卡方測試(log-rank Chi-Squared test)且CTL及ELISA分析使用史都登氏t測試，CTL及ELISA分析重複進行三次。小於0.05的p值(標記為*)在此等分析中視為統計顯著。全部統計分析均使用Prism軟體，V.4.0a(2006)或SPSS軟體，V.15.0(2006)進行。除非另外規定，否則對於全部FVB/N大鼠Her2/neu轉殖基因研究，吾人使用每組8-14隻小鼠，對於全部野生型FVB/N研究，吾人使用每組至少8隻小鼠。全部研究重複至少一次，但Her2/neu轉殖基因小鼠模型中進行長期腫瘤研究。
實例21：分泌融合至Her-2片段的LLO片段的單核細胞增多性李斯特菌菌株的繼代：建構ADXS31-164
嵌合Her2/neu基因(ChHer2)的建構如下。簡言之，藉由SOEing PCR方法直接融合Her2/neu蛋白的兩個胞外(aa 40-170及aa 359-433)及一個胞內片段(aa 678-808)產生ChHer2基因。嵌合蛋白容納蛋白的大部分已知人類MHC I級抗原決定基。ChHer2基因自質體pAdv138(用於建構構築體Lm-LLO-ChHer2)切除且選殖至LmddA穿梭質體中，產生質體pAdv164(圖57A)。此等兩種質體主鏈之間存在兩種主要差異。1)而pAdv138使用氯黴素耐藥性標記物(cat)活體外選擇重組細菌，pAdv164容納來自枯草桿菌之D-丙胺酸消旋酶基因(dal)，其在不具有dal-dat基因的LmddA菌株中使用代謝補充路徑活體外選擇及活體內質體保留。此疫苗平台經設計及開發以解決關於工程改造之李斯特菌疫苗菌株的抗生素耐藥性的FDA問題。2)不同於pAdv138，pAdv164不在質體中容納prfA基因的複本(參看下文及圖57A中的序列)，因為次對於Lmdd菌株的活體內補充並非必要。LmddA疫苗菌株亦不具有actA基因(負責李斯特菌的胞內移動及單元至單元擴散)，因此源自此主鏈之重組疫苗菌株的毒性比源自其親本菌株Lmdd的毒性低100倍。以LmddA為主的疫苗比以Lmdd為主的疫苗從經免疫小鼠之 脾臟清除起來亦快得多(小於48小時)。活體外生長8小時後，來自此菌株的融合蛋白tLLO-ChHer2之表現及分泌與TCA沈澱之細胞培養物清液層中的Lm-LLO-ChHer2相當(圖57B)，因為使用西方墨點分析藉由抗LLO抗體偵測到約104KD的條帶。僅表現tLLO的李斯特菌主鏈菌株用作陰性對照。
pAdv164序列(7075個基質對)(參看圖57A及圖57B)： (SED ID NO：87)
實例22：ADXS31-164的免疫原性與Lm-LLO-ChHER2一樣
在標準CTL分析法中，產生抗HER2/neu特異性細胞毒性T細胞中的ADXS31-164的免疫原性特性與Lm-LLO-ChHer2疫苗比較。兩種疫苗皆引起強但相當的對3T3/neu目標細胞表現的Her2/neu抗原的細胞毒性T細胞反應。因此，用僅表現融合至LLO之Her2-的一個胞內片段的李斯特菌免疫之小鼠顯示的溶解活性比含有較多MHC I級抗原決定基的嵌合體低。未經處理動物或注射不相關李斯特菌疫苗之小鼠中的未偵測到CTL活性(圖58A)。ADXS31-164亦能夠刺激來自野生型FVB/N小鼠的脾細胞的IFN-γ的分泌(圖58B)。此在與絲裂黴素C處理之NT-2細胞共同培養的此等細胞之培養物清液層中的偵測到，該等絲裂黴素C處理之NT-2細胞表現高含量之Her2/neu抗原(圖58C)。
在HLA-A2小鼠中測試用ADXS31-164免疫後人類MHC I級抗原決定基的適當處理及呈現。來自經免疫HLA-A2轉殖基因的脾細胞與位於Her2/neu分子的胞外(HLYQGCQVV SEQ ID NO：88或KIFGSLAFL SEQ ID NO：89)或胞內(RLLQETELV SEQ ID NO：90)結構域的對應於映射HLA-A2限制抗原決定基的肽共同培育72小時(圖58C)。重組ChHer2蛋白用作陽性對照且不相關肽或無肽用作陰性對照。此實驗之資料顯示ADXS31-164能夠引起位於目標抗原之不同結構域的人類抗原決定基的抗HER2/neu特異性免疫反應。
實例23：ADXS31-164比Lm-LLO-ChHER2更有效防止自發性乳房腫瘤發作
在20-25週齡時產生緩慢生長之自發性乳房腫瘤的Her2/neu轉殖基因動物中比較ADXS31-164之抗腫瘤作用與Lm-LLO-ChHer2之抗腫瘤作用。使用不相關李斯特菌對照疫苗免疫的全部動物均在第21週-第25週內產生乳房腫瘤且在第33週之前處死。相比之下，李斯特菌-Her2/neu重組疫苗引起乳房腫瘤形成的顯著延遲。在第45週，相較於用Lm-LLO-ChHer2免疫之小鼠的25%，超過50% ADXS31-164免疫接種小鼠(9隻中5隻)仍無腫瘤。第52週時，8隻用ADXS31-164免疫的小鼠中的2隻仍無腫瘤，而其他實驗組的全部小鼠已罹患其疾病(圖59)。此等結果指示儘管減毒更多，但ADXS31-164比Lm-LLO-ChHer2更有效防止Her2/neu轉殖基因動物中的自發性乳房腫瘤發作。
實例24：用ADXS31-164免疫時的HER2/Neu基因突變
Her2/neu之MHC I級抗原決定基的突變已視為當用小片段疫苗或曲妥珠單抗(Herceptin)免疫時造成腫瘤逃脫，曲妥珠單抗為靶向Her2/neu之胞外域中的抗原決定基的單株抗體。為了對此進行評定，自轉殖基因動物中的逃脫腫瘤提取染色體組物質且定序用嵌合或對照疫苗免疫的腫瘤中之neu基因的相應片段。任何疫苗接種樣品的Her- 2/neu基因內未觀測到突變表明替代逃脫機制(資料未顯示)。
實例25：ADXS31-164引起腫瘤內T調節細胞顯著減少
為了說明ADXS31-164對脾臟及腫瘤中的調節性T細胞頻率的作用，向小鼠植入NT-2腫瘤細胞。在免疫三次後分離脾細胞及腫瘤內淋巴細胞且針對Treg染色，Treg定義為CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+細胞，但各別分析時使用FoxP3或CD25標記物獲得相當結果。結果指示與不相關李斯特菌疫苗或未經處理動物相比，用ADXS31-164免疫對脾臟中的Treg之頻率無作用(圖60)。相比之下，用李斯特菌疫苗免疫對腫瘤中Treg之存在產生顯著影響(圖61A)。而未經處理之腫瘤中的全部CD3+ T細胞中平均19.0%為Treg，不相關疫苗的此頻率降低至4.2%且ADXS31-164降低至3.4%，腫瘤內Treg之頻率降低5倍(圖61B)。用任一LmddA疫苗處理之小鼠的腫瘤內Treg頻率之降低可能不歸因於腫瘤尺寸的差異。在代表性實驗中，來自用ADXS31-164免疫之小鼠的腫瘤顯著小於[平均直徑(mm)±SD，6.71±0.43，n=5]來自未經處理之小鼠的腫瘤(8.69±0.98，n=5，p<0.01)或用不相關疫苗處理之小鼠的腫瘤(8.41±1.47，n=5，p=0.04)，而此等後兩組之比較顯示腫瘤尺寸無統計顯著差異(p=0.73)。用LmddA疫苗處理之腫瘤中Treg的較低頻率導致瘤內CD8/Treg比率增加，表明用LmddA疫苗免疫後可獲得更有利的腫瘤微環境。然而，僅表現目標抗原HER2/neu之疫苗(ADXS31-164)能夠降低腫瘤生長，指示Treg中之降低僅在存在下對腫瘤中的抗原特異性反應有作用。
實例26：用ADXS31-164周邊免疫可延遲轉移性乳癌細胞株在腦中的生長
小鼠用ADXS31-164或不相關Lm對照疫苗IP免疫且接著顱側內植入5,000個表現螢光素酶及低含量Her2/neu的EMT6-Luc腫瘤細胞(圖62A)。接種後不同時間藉由麻醉小鼠離體成像監測腫瘤。腫瘤接種後 第8天，偵測全部對照動物中的腫瘤，但ADXS31-164組中的小鼠均未顯示任何可偵測腫瘤(圖62A及圖62B)。ADXS31-164可明確延遲此等腫瘤之發作，因為在腫瘤接種後第11天，陰性對照組中的全部小鼠均已罹患其腫瘤，但ADXS31-164組中的全部小鼠仍存活且僅顯示腫瘤生長的小跡象。此等結果有力表明周邊投與ADXS31-164獲得的免疫反應可能到達中樞神經系統且以LmddA為主的疫苗可具有用於治療CNS腫瘤的可能性。
實例27：以Lm為主的HER2/neu疫苗、GITR促效抗體及檢查點抑制劑PD-1 Ab的三重組合在Her2/neu陽性BC小鼠模型中的治療功效及免疫調節作用
實驗設計：小鼠腫瘤模型：使用兩種小鼠腫瘤模型：大鼠Her-2/FVB/N小鼠模型及FVB/N Her-2/neu轉殖基因小鼠模型。
抗體：抗PD1(RMP-14純系，大鼠IgG2a)及抗GITR(DTA-1純系)。兩種抗體皆一週兩次i.p注射。抗PD-1 Ab在整個實驗期間以1mg/Kg b.wt之劑量給予。對於促效GITR Ab，以5mg/Kg b.wt.之劑量給予4次總劑量。
使用大鼠Her-2/FVB/N小鼠模型的實驗：因為大鼠及人類Her-2/neu蛋白質高度同源，所以使用大鼠Her-2/FVB/N小鼠模型測試以Lm為主的Her-2/neu疫苗與GITR促效劑及抗PD-1 Ab的組合的治療性腫瘤作用。藉由在右側腹注射1×106個表現高含量之大鼠HER2/neu蛋白的NT-2腫瘤細胞在雌性FVB/N小鼠(8-10週大；5/組)中皮下植入腫瘤。當腫瘤體積達到約0.5cm3時，小鼠隨機分成16組(表8)且用高度減毒的以Lm為主的疫苗載體處理(i.p.；藉由活體內毒性分析法測定1至5×108群落形成單位)，該等載體具有或不具有LLO及HER2/neu(Lm、Lm-LLO及ADXS31-164)、抗PD1 Ab及促效抗GITR Ab。疫苗的初打劑量之後為間隔7天的兩次加打。
在與疫苗同一天開始投與促效GITR Ab持續總共4次劑量。因為PD1在早期活化及T細胞耗盡中起作用，所以在疫苗後投與抗PD-1可使T細胞排出復興。因此，第二次疫苗接種後3天注射抗PD1 Ab以判斷是否可進一步加強抗原特異性反應。在對照組中，小鼠接受PBS。量測腫瘤生長及存活率。每週兩次使用數位測徑規量測腫瘤，且使用等式V=(W2*L)/2計算腫瘤體積，其中V為體積，L為長度(較長直徑)且W為寬度(較短直徑)。當瀕死或若腫瘤體積達到1.5cm3時處死小鼠。通用治療時程顯示於圖63中。實驗重複兩次。
使用FVB/N Her-2/neu轉殖基因小鼠模型的實驗：使用NT-2細胞株的可移植腫瘤鼠類模型為對Her-2/neu抗原具有極少耐受性的快速生長腫瘤模型。對Her-2/neu抗原之耐受性在緩解疫苗的免疫治療功效中可起顯著作用的更具攻擊性腫瘤模型為大鼠Her-2/neu轉殖基因小鼠模型。在此模型中，小鼠在20-25週齡之間產生自發性緩慢生長乳房腫瘤。藉由使用此小鼠菌株，因此吾人能夠測試以Lm為主的Her2/neu疫苗是否能克服對Her-2/neu自身抗原的耐受性。此等小鼠之育種對由Advaxis,Inc友情提供。
如表8中所示將小鼠分成16組。小鼠自第6週開始以3週間隔總共免疫六次劑量(1至5×108群落形成單位)。相較於上文闡述之快速生長模型，疫苗在此模型中可能更具免疫性，因為此為預防性模型且自發性腫瘤直至約第20週才開始呈現。促效GITR Ab與總計6次劑量之疫苗在同一天開始投與且與疫苗的每次劑量一起給予。在最後一次疫 苗接種後3-4天開始用抗PD1 Ab處理且在整個實驗期間繼續。一週兩次觀測小鼠的自發性乳房腫瘤之出現及生長持續長達52週。藉由觸診上部及下部小鼠乳房腺體來偵測自發性腫瘤形成，此將識別出直徑小至1至2mm的腫瘤。通用治療時程顯示於圖5中。
免疫反應及調節研究：另外，在腫瘤、脾臟及腫瘤引流淋巴結(TDLN)中研究負責對腫瘤生長及存活率起作用的免疫調節的具體機制。對於此等實驗，將小鼠分組(4隻小鼠/組)且與上文類似地處理且在第二次免疫後六天及第三次免疫後一週時處死。採集腫瘤、脾臟、TDLN且進行以下分析法：儘管已在本文中說明及描述本發明之某些特徵，但一般技術者現將想到多種修改、取代、變化及等效物。因此，應理解，隨附申請專利範圍意欲涵蓋如屬於本發明之真實精神內的所有此等修改及變化。
<110> 美商艾德凡斯有限公司 科里夫，莎米爾 艾克崔亞恩，密卡爾
<120> 以李斯特菌為主的疫苗與抗OX40抗體或抗GITR抗體之組合
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<210> 32
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 32
<210> 33
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 33
<210> 34
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 34
<210> 35
<211> 1729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼KLK3蛋白之核苷酸
<400> 35
<210> 36
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 36
<210> 37
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 作為KLK3肽源的KLK3蛋白
<400> 37
<210> 38
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白
<400> 38
<210> 39
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KLK3蛋白中缺乏之序列
<400> 39
<210> 40
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E7蛋白
<400> 40
<210> 41
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E7蛋白
<400> 41
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 42
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 43
<210> 44
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 44
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 45
<210> 46
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 46
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 47
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 48
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 49
<210> 50
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 50
<210> 51
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<200> 51
<210> 52
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 52
<210> 53
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 53
<210> 54
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 54
<210> 55
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 55
<210> 56
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 56
<210> 57
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 57
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 藻紅蛋白(PE)結合之E7蛋白
<400> 58
<210> 59
<211> 6523
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pAdv142
<400> 59
<210> 60
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Adv271-actAF1
<400> 60
<210> 61
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Adv272-actAR1
<400> 61
<210> 62
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Adv273-actAF2
<400> 62
<210> 63
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Adv274-actAR2
<400> 63
<210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子3
<400> 64
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子4
<400> 65
<210> 66
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-嵌合體(F)
<400> 66
<210> 67
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC1-EC2F(接合)
<400> 67
<210> 68
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC1-EC2R(接合)
<400> 68
<210> 69
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC2-ICIF(接合)
<400> 69
<210> 70
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC2-ICIR(接合)
<400> 70
<210> 71
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-嵌合體(R)
<400> 71
<210> 72
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-EC1(F)
<400> 72
<210> 73
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-EC1(R)
<400> 73
<210> 74
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-EC2(F)
<400> 74
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-EC2R)
<400> 75
<210> 76
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-Her-2-IC1(F)
<400> 76
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-IC1(R)
<400> 77
<210> 78
<211> 7075
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAdv164序列
<400> 78
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2限制抗原決定基
<400> 79
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2限制抗原決定基
<400> 80
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2限制抗原決定基
<400> 81
<210> 82
<211> 2040
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼與PSA蛋白融合之LLO的核苷酸
<400> 82
<210> 83
<211> 680
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與PSA蛋白融合之LLO
<400> 83
<210> 84
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E7蛋白
<400> 84
<210> 85
<211> 540
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與E7蛋白融合之截斷LLO
<400> 85
<210> 86
<211> 1263
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼Her-2嵌合蛋白之核酸
<400> 86
<210> 87
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2嵌合蛋白
<400> 87
<210> 88
<211> 2586
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼與cHER2融合之tLLO的開放閱讀框架
<400> 88
<210> 89
<211> 862
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含與cHER2融合之tLLO的重組蛋白
<400> 89

Claims (59)

  1. 一種免疫原性組合物，其包含含有核酸分子之重組李斯特菌(Listeria)菌株，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中該融合多肽包含與異源抗原或其片段融合之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，該組合物進一步包含抗體或其功能片段。
  2. 如請求項1之組合物，其中該抗體或其功能片段包含多株抗體、單株抗體、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、單鏈抗體(SCA)或其任何組合。
  3. 如請求項1至2中任一項之組合物，其中該抗體或其功能片段結合於該異源抗原或其一部分，該異源抗原或其一部分包含T細胞受體共刺激(co-stimulatory)分子、結合共刺激分子之抗原呈現細胞受體，或TNF受體超家族之成員。
  4. 如請求項3之組合物，其中該TNF受體超家族之成員選自由以下組成之群：糖皮質素誘導之TNF受體(GITR)、OX40(CD134受體)、4-1BB(CD137受體)及TNFR25。
  5. 如請求項4之組合物，其中該結合共刺激分子之抗原呈現細胞受體選自由以下組成之群：CD80受體、CD86受體及CD40受體。
  6. 如請求項1之組合物，其中該包含第一開放閱讀框架之核酸分子整合至李斯特菌基因組中。
  7. 如請求項1之組合物，其中該包含第一開放閱讀框架之核酸分子係在該重組李斯特菌菌株中的質體中。
  8. 如請求項7之組合物，其中該質體在抗生素選擇不存在下穩定保持於該重組李斯特菌菌株中。
  9. 如請求項7之組合物，其中該質體不賦予該重組李斯特菌抗生素 耐性。
  10. 如請求項1之組合物，其中該異源抗原為腫瘤相關抗原。
  11. 如請求項10之組合物，其中該腫瘤相關抗原為前列腺特異性抗原(PSA)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原或嵌合Her2/neu抗原。
  12. 如請求項1之組合物，其中該重組李斯特菌菌株經減毒。
  13. 如請求項12之組合物，其中該減毒李斯特菌的內源性基因包含突變、缺失、破壞、不活化、替代或截斷。
  14. 如請求項13之組合物，其中該內源性基因包含actA毒性基因、prfA毒性基因、dal基因、inlB基因、dat基因或其組合。
  15. 如請求項14之組合物，其中該內源性基因為prfA基因。
  16. 如請求項14之組合物，其中該內源性基因為dal/dat及actA基因。
  17. 如請求項1之組合物，其中該包含第一開放閱讀框架之核酸進一步包含第二開放閱讀框架。
  18. 如請求項17之組合物，其中該第二開放閱讀框架編碼包含D133V突變之PrfA蛋白，且其中該PrfA蛋白補充該prfA基因中的該突變、缺失、破壞、不活化、替代或截斷。
  19. 如請求項17之組合物，其中該第二開放閱讀框架編碼代謝酶且其中該代謝酶補充該dal及dat基因中的該突變、缺失、破壞、不活化、替代或截斷。
  20. 如請求項19之組合物，其中由該第二開放閱讀框架編碼之該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。
  21. 如請求項1之組合物，其進一步包含佐劑。
  22. 如請求項21之組合物，其中該佐劑包含粒細胞/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白、編碼GM-CSF蛋白之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
  23. 如請求項1至22中任一項之組合物，其中該李斯特菌菌株為單核 細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)。
  24. 一種包含含有核酸分子之重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物的用途，其用於製備用以提高個體抗腫瘤T細胞反應之藥劑，其中該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開放閱讀框架，其中該融合多肽包含與異源抗原或其片段融合之截斷李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白、截斷ActA蛋白或PEST胺基酸序列，其中該藥劑係與包含抗體或其片段之組合物組合使用。
  25. 如請求項24之用途，其中該抗體或其功能片段包含多株抗體、單株抗體、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、單鏈抗體(SCA)或其任何組合。
  26. 如請求項24之用途，其中該抗體或其功能片段結合於異源抗原或其一部分，該異源抗原或其一部分包含T細胞受體共刺激分子、結合共刺激分子之抗原呈現細胞受體，或TNF受體超家族之成員。
  27. 如請求項26之用途，其中該TNF受體超家族之該成員選自由以下組成之群：糖皮質素誘導之TNF受體(GITR)、OX40(CD134受體)、4-1BB(CD137受體)及TNFR25。
  28. 如請求項27之用途，其中該結合共刺激分子之抗原呈現細胞受體選自由以下組成之群：CD80受體、CD86受體及CD40受體。
  29. 如請求項24之用途，其中該包含第一開放閱讀框架之核酸分子整合至李斯特菌基因組中。
  30. 如請求項24之用途，其中該包含第一開放閱讀框架之核酸分子存在於該重組李斯特菌疫苗株中的質體中。
  31. 如請求項30之用途，其中該質體在抗生素選擇不存在下穩定保持於該重組李斯特菌菌株中。
  32. 如請求項30之用途，其中該質體不賦予該重組李斯特菌抗生素 耐性。
  33. 如請求項24之用途，其中該異源抗原為腫瘤相關抗原。
  34. 如請求項33之用途，其中該腫瘤相關抗原為前列腺特異性抗原(PSA)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原或Her2/neu嵌合抗原。
  35. 如請求項24之用途，其中該重組李斯特菌菌株經減毒。
  36. 如請求項35之用途，其中該減毒李斯特菌的內源性基因包含突變、缺失、破壞、不活化、替代或截斷。
  37. 如請求項36之用途，其中該內源性基因包含actA毒性基因、prfA毒性基因、dal基因、inlB基因、dat基因或其組合。
  38. 如請求項37之用途，其中該內源性基因為prfA基因。
  39. 如請求項37之用途，其中該內源性基因為該dal/dat及actA基因。
  40. 如請求項24之用途，其中該包含第一開放閱讀框架之核酸進一步包含第二開放閱讀框架。
  41. 如請求項40之用途，其中該第二開放閱讀框架編碼包含D133V突變之PrfA蛋白，且其中該PrfA蛋白補充該prfA基因中的該突變、缺失、破壞、不活化、替代或截斷。
  42. 如請求項40之用途，其中該第二開放閱讀框架編碼代謝酶且其中該代謝酶補充該dal及dat基因中的該突變、缺失、破壞、不活化、替代或截斷。
  43. 如請求項42之用途，其中由該第二開放閱讀框架編碼之該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。
  44. 如請求項24之用途，其中該包含重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物進一步包含佐劑。
  45. 如請求項44之用途，其中該佐劑包含粒細胞/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白、編碼GM-CSF蛋白之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
  46. 如請求項24之用途，其中該李斯特菌菌株為單核細胞增多性李斯特菌。
  47. 如請求項24之用途，其中該包含抗體或其片段之組合物係在投與包含該重組減毒李斯特菌菌株之該組合物之前、同時或之後投與。
  48. 如請求項24之用途，其中該抗腫瘤T細胞反應包含提高產生干擾素-γ(INF-γ)之細胞的含量。
  49. 如請求項24之用途，其中該抗腫瘤T細胞反應包含T效應細胞之腫瘤浸潤提高。
  50. 如請求項49之用途，其中該等T效應細胞為CD45+CD8+T細胞或CD4+Fox3P-T細胞。
  51. 如請求項24之用途，其中該抗腫瘤T細胞反應包含脾臟及腫瘤微環境中的調節性T細胞(Tregs)之頻率降低。
  52. 如請求項24之用途，其中該抗腫瘤T細胞反應包含脾臟及腫瘤微環境中的骨髓源抑制細胞(MDSCs)之頻率降低。
  53. 如請求項24之用途，其中投與該藥劑進一步增加該個體之抗原特異性T細胞。
  54. 如請求項24之用途，其中投與該藥劑治療個體之腫瘤或癌症。
  55. 如請求項24之用途，其中投與該藥劑進一步增加患有癌症或腫瘤之個體的存活時間。
  56. 如請求項55之用途，其中該腫瘤為乳房腫瘤、頭部及頸部腫瘤、子宮頸腫瘤、前列腺腫瘤。
  57. 如請求項55之用途，其中該癌症為乳癌、頭頸癌、子宮頸癌、前列腺癌、肛門癌、食道癌、肺癌、黑素瘤、骨肉瘤或卵巢癌。
  58. 如請求項24之用途，其中該包含抗體或其片段之組合物進一步 包含佐劑。
  59. 如請求項58之用途，其中該佐劑包含粒細胞/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白、編碼GM-CSF蛋白之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
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