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TW201620553A - 抗ｃｄ９８抗體－藥物結合物 - Google Patents

抗ｃｄ９８抗體－藥物結合物 Download PDF

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TW201620553A
TW201620553A TW104109474A TW104109474A TW201620553A TW 201620553 A TW201620553 A TW 201620553A TW 104109474 A TW104109474 A TW 104109474A TW 104109474 A TW104109474 A TW 104109474A TW 201620553 A TW201620553 A TW 201620553A
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TW
Taiwan
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amino acid
antibody
acid sequence
seq
heavy chain
Prior art date
Application number
TW104109474A
Other languages
English (en)
Inventor
福地圭介
長谷川淳
橋本步美
Original Assignee
第一三共股份有限公司
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Publication date
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Abstract

本發明係提供一種抗CD98抗體-藥物結合物，其係作為抗腫瘤效果與安全性面優異之具有優異治療效果的抗腫瘤藥，包含抗CD98抗體、連接物及藥物之抗CD98抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中連接物為選自包含-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；及-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-的群組的連接物，藥物為下式所表示的化合物，藥物之1位之胺基之氮原子與連接物的羰基部分結合，抗CD98抗體與連接物的琥珀醯亞胺基部分結合。 □

Description

抗CD98抗體-藥物結合物
本發明係關於使具有抗腫瘤活性之抗CD98抗體與抗腫瘤性藥物介隔連接物(linker)結構部分而結合的抗體-藥物結合物。
使具有細胞毒性的藥物結合於與表現於癌細胞表面且可內在化至細胞中的抗原結合的抗體之抗體-藥物結合物(Antibody-Drug Conjugate；ADC)，因可選擇性地將藥物送達至癌細胞，可期待藥物蓄積於癌細胞內、使癌細胞消滅(參照非專利文獻1~3)。作為ADC，例如有使抗CD33抗體與卡奇黴素(calicheamicin)結合的Mylotarg(註冊商標；吉妥珠單抗-奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin))被認可作為急性骨髓性白血病之治療藥。又，抗CD30抗體與奧利司他汀E(auristatin E)結合的Adcetris(註冊商標；貝倫妥單抗-維多汀(brentuximab vedotin)已被認可作為何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)與未分化大細胞淋巴瘤之治療藥(參照非專利文獻4)。迄今被認可的ADC所含有的藥物係以DNA或微管蛋白(tubulin)作為標的。
就抗腫瘤性之低分子化合物而言，已知有抑 制拓樸異構酶I(topoisomerase I)而表現抗腫瘤作用的化合物的喜樹鹼(camptothecin)衍生物。其中下式
所示的抗腫瘤性化合物(依喜替康(exateca n)，化學名：(1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4'：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮((1S,9S)-1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4'：6,7]indolizino[1,2-b]quinoline-10,13(9H,15H)-dione))為喜樹鹼衍生物(專利文獻1、2)。此化合物係與現在臨床上使用的愛萊諾迪肯(irinotecan)相異，抗腫瘤效果的表現不需要酵素所致之活性化。又，為愛萊諾迪肯的活性本體之SN-38，較同樣於臨床上使用的 拓樸替康(topotecan)有更強的拓樸異構酶I抑制活性，活體外對各種癌細胞具有更強的殺細胞活性。尤其藉由P-糖蛋白之表現，亦對於對SN-38等呈現耐受性的癌細胞顯示效果。又，小鼠之人類腫瘤皮下移植模式中亦呈現強的抗腫瘤效果，雖然已進行臨床試驗，但迄今尚未上市(參照非專利文獻5~10)。依喜替康作為ADC是否有效地作用係不清楚。
DE-310係使依喜替康介隔GGFG胜肽間隔 物結合於生物分解性的羧基甲基葡聚糖多元醇聚合物之複合體(專利文獻3)。藉由將依喜替康高分子前藥化，使保持高血中滯留性，進一步利用腫瘤新生血管之通透性的亢進及腫瘤組織滯留性，被動地提高對腫瘤部位的指向性。DE-310係藉由酵素所致的胜肽間隔物之切斷，為活性本體之依喜替康、及甘胺酸與胺基結合的依喜替康為持續地游離。其結果為藥物動力學被改善，於非臨床試驗中的各種腫瘤之評價模式，DE-310係即使是其所含的依喜替康之總量較依喜替康單劑之投予量為減少，亦呈現較依喜替康單劑之投予時更高的有效性。關於DE-310，經實施臨床試驗亦確認有效例，已有確認相較於正常組織，活性本體更集積於腫瘤的報告。另一方面，亦有DE-310及活性本體向腫瘤之集積與向正常組織之集積無顯著差異，於人類未見被動標的(passive targeting)的報告(參照非專利文獻11~14)。結果，DE-310亦未達成上市，依喜替康是否有效地發揮作為此種指向標的之藥物的作用並不清楚。
作為DE-310之關連化合物，雖亦已知有將 -NH-(CH2)4-C(=O)-所示的結構部分插入-GGFG-間隔物與依喜替康之間，將-GGFG-NH-(CH2)4-C(=O)-作為間隔物結構的複合體(專利文獻4)，但相同複合體之抗腫瘤效果則完全未知。
CD98係包含約40kDa之多道(multi-pass)輕 鏈與雙硫鍵的約80~85kDa之第II型單道(single-pass)跨膜重鏈的雜二聚物(非專利文獻15)。CD98重鏈(以CD98hc、4F2或FRP-1為周知)係於小鼠經Slc3a2基因編碼，於人類經SLC3A2基因編碼。CD98hc係第II型跨膜蛋白質，具有細胞外區域、跨膜區域及細胞質尾部。 CD98係至少在6個存在的CD98輕鏈(胺基酸運輸蛋白、LAT-1、LAT-2等)之一者與CD98hc細胞外區域之間藉由雙硫鍵形成雜二聚物。已知將此CD98作為標的的抗CD98抗體具有抗腫瘤活性、免疫抑制活性(專利文獻5~11)。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1 特開平5-59061號公報
專利文獻2 特開平8-337584號公報
專利文獻3 國際公開WO1997/46260小冊
專利文獻4 國際公開WO2000/25825小冊
專利文獻5 國際公開WO2007/114496小冊
專利文獻6 國際公開WO2008/017828小冊
專利文獻7 國際公開WO2009/043922小冊
專利文獻8 國際公開WO2009/090553小冊
專利文獻9 特開2012-092068號公報
專利文獻10 國際公開WO2011/118804小冊
專利文獻11 國際公開WO2013/078377小冊
非專利文獻
非專利文獻1 Ducry, L., et al., Bioconjugate Chemw(2010)21, 5-13.
非專利文獻2 Alley, S. C., et al., Current Opinion in Chemical Biology (2010)14, 529-537.
非專利文獻3 Damle N.K., Expert Opin. Biol. Ther. (2004)4, 1445-1452.
非專利文獻4 Senter P. D., et al., Nature Biotechnology (2012)30, 631-637.
非專利文獻5 Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998)7, 625-632.
非專利文獻6 Mitsui, I., Kumazawa, E., Hirota, Y., et al., Jpn J. Cancer Res. (1995)86, 776-786.
非專利文獻7 Takiguchi, S., Tohgo, A., et al., Jpn J. Cancer Res. (1997)88, 760-769.
非專利文獻8 Joto, N. et al., Int J Cancer (1997)72, 680-686.
非專利文獻9 Kumazawa, E. et al., Cancer Chemother. Pharmacol. (1998)42, 210-220.
非專利文獻10 De Jager, R., et al., Ann N Y Acad Sci (2000)922, 260-273.
非專利文獻11 Inoue, K. et al., Polymer Drugs in the Clinical Stage, Edited by Maeda et al. (2003), 145-153.
非專利文獻12 Kumazawa, E. et al., Cancer Sci (2004)95, 168-175.
非專利文獻13 Soepenberg、O. et al., Clinical Cancer Research, (2005)11, 703-711.
非專利文獻14 Wente M. N. et al., Investigational New Drugs (2005)23, 339-347.
非專利文獻15 Joseph M. Cantor et al., Jornal of Cell Science (2012)125, 1373-1382.
[發明概要]
於藉由抗體的腫瘤治療，亦有觀察到即使抗體辨識抗原而與腫瘤細胞結合，抗腫瘤效果亦不充分的情形，有需要更高效果的抗腫瘤抗體的情形。又，於抗腫瘤性之低分子化合物，即使抗腫瘤效果優異，大多具有副作用或毒性面等之安全性上之問題，更提高安全性而獲得更優異的治療效果亦為課題。即，本發明之課題係獲得並提供抗腫瘤效果及安全性面為優異之具有優異治療效果的抗腫瘤劑。
由抗CD98抗體係可以腫瘤細胞為標的之抗 體，即，因具備可辨識腫瘤細胞的特性、可與腫瘤細胞結合的特性、或可內在化至腫瘤細胞中的特性等之抗體，故藉由將抗腫瘤性化合物依喜替康，變換為介隔連接物結構部分而與相同抗體結合的抗體-藥物結合物，本發明者們認為係可能可達成下列效果：(1)可將依喜替康衍生物搬運至腫瘤細胞而使依喜替康衍生物之抗腫瘤效果於腫瘤細胞中特異性地發揮、(2)可在抗腫瘤效果之確實發揮的同時，使依喜替康衍生物之投予量較單體投予時更為減少、(3)因可緩和依喜替康衍生物對通常細胞之影響，故可達成較高安全性。
因此，本發明者們創造特定結構之連接物， 成功獲得介隔此連接物而使抗CD98抗體與依喜替康結合的抗CD98抗體-藥物結合物，而且發現此化合物發揮優異的抗腫瘤效果，遂而完成本發明。
即，本發明係關於：(1)一種抗CD98抗體-藥物結合物，其係包含抗CD98抗體、連接物及藥物的抗CD98抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中，連接物係選自包含下式的群組的連接物：-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；及 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-； 藥物係下式所表示的化合物：
藥物之1位之胺基之氮原子係與連接物之羰基部分結合，抗CD98抗體係與連接物之琥珀醯亞胺基部分結合；(2)如前述(1)記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其每1抗體之藥物平均結合數為2~8個之範圍； (3)如前述(1)記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其每1抗體之藥物平均結合數為3~6個之範圍；(4)如前述(2)或(3)記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中每1抗體之藥物平均結合數係藉由逆相層析(RPC)法所測定；(5)如前述(1)記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中每1抗體之藥物結合數為2、4、6或8個；(6)如前述(1)~(5)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中連接物為下式：-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；(7)如前述(1)~(5)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中連接物為下式：-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；(8)如前述(1)~(5)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中連接物為下式：-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；(9)如前述(1)~(8)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體係與序列識別號38之第462~541號的胺基酸殘基所構成的部位結合； (10)如前述(1)~(9)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體係包含：序列識別號19所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRH1；序列識別號20所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRH2；序列識別號21所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRH3；序列識別號22所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRL1；序列識別號23所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRL2；及序列識別號24所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRL3；且與CD98重鏈結合；(11)如前述(1)~(9)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：序列識別號19所表示的胺基酸序列所構成的CDRH1； 序列識別號20所表示的胺基酸序列所構成的CDRH2；序列識別號21所表示的胺基酸序列所構成的CDRH3；序列識別號22所表示的胺基酸序列所構成的CDRL1；序列識別號23所表示的胺基酸序列所構成的CDRL2；及序列識別號24所表示的胺基酸序列所構成的CDRL3；且，與CD98重鏈結合；(12)如前述(1)~(11)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體係包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該重鏈可變區係相對於序列識別號8之第20~135號胺基酸殘基所構成的胺基酸序列，具有至少90%之相同性，該輕鏈可變區係相對於序列識別號10之第21~135號胺基酸殘基所構成的胺基酸序列，具有90%之相同性；(13)如前述(1)~(11)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體係包含：含有選自包含下列群組的重鏈可變區的重鏈：(1)序列識別號12或14之第20~135號胺基酸殘基所構成的胺基酸序列；(2)相對於(1)之胺基酸序列，具有至少95%以上之相同性的胺基酸序列；及 (3)於(1)之胺基酸序列有1或數個胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列；以及含有選自包含下列群組的輕鏈可變區的輕鏈：(4)序列識別號16或18之第21~135號胺基酸殘基所構成的胺基酸序列；(5)相對於(4)之胺基酸序列，具有至少95%以上之相同性的胺基酸序列；及(6)於(4)之胺基酸序列，有1或數個胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列；(14)如前述(1)~(11)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：包含序列識別號12之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及包含序列識別號16之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈；(15)如前述(1)~(11)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：包含序列識別號12之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及包含序列識別號18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈；(16)如前述(1)~(11)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：包含序列識別號14之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及包含序列識 別號18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈；(17)如前述(1)~(11)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：包含序列識別號12之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及包含序列識別號1之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈；(18)如前述(1)~(11)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：包含序列識別號12之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及包含序列識別號18之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈；(19)如前述(1)~(11)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：包含序列識別號14之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及包含序列識別號18之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈；(20)一種抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其與序列識別號38之第462~541號之胺基酸殘基所構成的部位結合；(21)如前述(20)記載之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含： 序列識別號19所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRH1；序列識別號20所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRH2；序列識別號21所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRH3；序列識別號22所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRL1；序列識別號23所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRL2；及序列識別號24所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRL3
(22)如前述(20)或(21)記載之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：序列識別號19所表示的胺基酸序列所構成的CDRH1；序列識別號20所表示的胺基酸序列所構成的CDRH2； 序列識別號21所表示的胺基酸序列所構成的CDRH3；序列識別號22所表示的胺基酸序列所構成的CDRL1；序列識別號23所表示的胺基酸序列所構成的CDRL2；及序列識別號24所表示的胺基酸序列所構成的CDRL3；(23)如前述(20)~(22)中任1項記載之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含相對於序列識別號8之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列，具有至少90%之相同性的重鏈可變區及/或相對於序列識別號410之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列，具有至少90%之相同性的輕鏈可變區；(24)如前述(20)~(22)中任1項記載之抗CD98抗體或該抗體的抗原結合片段，其包含選自包含下列組成的群組的重鏈可變區的重鏈：(1)序列識別號12或14之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列；(2)相對於(1)之胺基酸序列，具有至少95%以上之相同性的胺基酸序列；及(3)於(1)之胺基酸序列，有1或數個胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列；以及包含選自包含下列組成的群組的輕鏈可變區的輕鏈： (4)序列識別號16或18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列；(5)相對於(4)之胺基酸序列，具有至少95%以上之相同性的胺基酸序列；及(6)於(4)之胺基酸序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列；(25)如前述(20)~(22)中任1項記載之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：含有序列識別號12之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號16之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈；(26)如前述(20)~(22)中任1項記載之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：含有序列識別號12之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈；(27)如前述(20)~(22)中任1項記載之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：含有序列識別號14之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈； (28)如前述(20)~(22)中任1項記載之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：含有序列識別號12之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號16之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈；(29)如前述(20)~(22)中任1項記載之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：含有序列識別號12之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號18之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈；(30)如前述(20)~(22)中任1項記載之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：含有序列識別號14之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號18之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈；(31)一種抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其含有前述(20)~(30)中任1項記載之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段；(32)一種醫藥組成物，其含有如前述(1)~(19)及(31)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽或者如前述(20)~(30)中任1項記載之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段作為活性成分； (33)如前述(32)記載之醫藥組成物，其用於抗腫瘤或抗癌；(34)如前述(33)記載之醫藥組成物，其中腫瘤或癌為肺癌、腎癌、尿道上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme)、卵巢癌、胰癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、淋巴瘤、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病或者多發性骨髓瘤；(35)一種如前述(1)~(19)及(31)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥學上可容許的鹽、或者如前述(20)~(30)中任1項記載之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段之用途，其用於製造醫藥組成物；(36)一種如前述(1)~(19)及(31)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥學上可容許的鹽、或者如前述(20)~(30)中任1項記載之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其用於腫瘤及/或癌之治療中的用途。
(37)一種腫瘤及/或癌之治療方法，其包含將如前述(1)~(19)及(31)中任1項記載之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽或前述(20)~(30)中任1項記載之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段之治療有效量投予哺乳類動物；(38)一種多核苷酸，其係編碼如前述(20)~(30)中任1項記載之抗體； (39)一種多核苷酸，其係如前述(38)記載之多核苷酸，其包含選自包含下列群組的多核苷酸，(1)序列識別號11或13之第58~405號之核苷酸所構成的核苷酸序列；(2)相對於(1)之核苷酸序列，具有至少95%以上之相同性的核苷酸序列；(3)和與(1)之核苷酸序列互補的核苷酸序列所構成的多核苷酸以嚴格條件雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列；及(4)於(1)之核苷酸序列，有1或數個之核苷酸被刪除、取代或添加的核苷酸序列；以及包含選自包含下列群組的多核苷酸，(5)序列識別號15或17之第61~405號之核苷酸所構成的核苷酸序列；(6)相對於(5)之核苷酸序列，具有至少95%以上之相同性的核苷酸序列；(7)和與(5)之核苷酸序列互補的核苷酸序列所構成的多核苷酸以嚴格條件雜交的多核苷酸所保有的核苷酸序列；及(8)於(5)之核苷酸序列，有1或數個核苷酸被刪除、取代或添加的核苷酸序列；(40)如前述(39)記載之多核苷酸，其包含：序列識別號11之第58~405號之核苷酸所構成的核苷酸序列所構成的多核苷酸及序列識別號15之第61~405號之核苷酸所構成的核苷酸序列所構成的多核苷酸； (41)如前述(39)記載之多核苷酸，其包含：序列識別號11之第58~405號之核苷酸所構成的核苷酸序列所構成的多核苷酸及序列識別號17之第61~405號之核苷酸所構成的核苷酸序列所構成的多核苷酸；(42)如前述(39)記載之多核苷酸，其包含：序列識別號13之第58~405號之核苷酸所構成的核苷酸序列所構成的多核苷酸及序列識別號17之第61~405號之核苷酸所構成的核苷酸序列所構成的多核苷酸；(43)一種載體，其包含如前述(38)~(42)中任1項記載之多核苷酸；(44)一種轉形宿主細胞，其包含如前述(38)~(42)中任1項記載之多核苷酸；(45)一種轉形宿主細胞，其包含如前述(43)記載之載體；以及(46)一種如前述(20)~(30)中任1項記載之抗體之生產方法，其包含培養如前述(44)或(45)記載之宿主細胞，自培養產物將抗體純化的步驟。
藉由介隔特定結構的連接物而使依喜替康與抗CD98抗體結合的抗CD98抗體-藥物結合物，可達成優異的抗腫瘤效果及安全性。
第1圖係呈示嵌合M23抗體重鏈之核苷酸序列(序列識別號7)及胺基酸序列(序列識別號8)。
第2圖係呈示嵌合M23抗體輕鏈之核苷酸序列(序列識別號9)及胺基酸序列(序列識別號10)。
第3圖係呈示hM23-H1型重鏈之核苷酸序列(序列識別號11)及胺基酸序列(序列識別號12)。
第4圖係呈示hM23-H2型重鏈之核苷酸序列(序列識別號13)及胺基酸序列(序列識別號14)。
第5圖係呈示hM23-L1型輕鏈之核苷酸序列(序列識別號15)及胺基酸序列(序列識別號16)。
第6圖係呈示hM23-L2型輕鏈之核苷酸序列(序列識別號17)及胺基酸序列(序列識別號18)。
第7圖係呈示M23抗體之CDRH1之胺基酸序列(序列識別號19)、CDRH2之胺基酸序列(序列識別號20)、CDRH3之胺基酸序列(序列識別號21)、CDRL1之胺基酸序列(序列識別號22)、CDRL2之胺基酸序列(序列識別號23)及CDRL3之胺基酸序列(序列識別號24)。
第8圖係呈示M23抗體之細胞內在化能力。
第9圖係呈示hM23-H1L1-藥物結合物對人類伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)移植小鼠所顯示的抗腫瘤效果。
第10圖係呈示hM23-H1L2-藥物結合物對人類伯基特氏淋巴瘤移植小鼠所顯示的抗腫瘤效果。
第11圖係呈示hM23-H2L2-藥物結合物對人類伯基特氏淋巴瘤移植小鼠所顯示的抗腫瘤效果。
第12圖係呈示hM23-H1L1-藥物結合物對人類伯基特氏淋巴瘤移植小鼠所顯示的抗腫瘤效果。
第13圖係呈示使用使一部分胺基酸序列取代為小鼠之序列的人類CD98與FLAG的融合蛋白質表現的細胞，而解析M23抗體之抗原決定位的結果。
第14圖係呈示確認於使一部分胺基酸序列取代為小鼠之序列的人類CD98與FLAG的融合蛋白質表現的細胞之細胞膜上之該融合蛋白質的表現的結果。
[用以實施發明之形態]
於本說明書，「癌」與「腫瘤」係以相同意義被使用。
於本說明書，「基因」一詞不僅包含DNA，亦包含其mRNA、cDNA、及其cRNA。
於本說明書，「多核苷酸」一詞係與核酸相同的意義使用，包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子。
於本說明書，「多肽」與「蛋白質」係以相同意義使用。
於本說明書，「細胞」包含動物個體內之細胞、培養細胞。
於本說明書，「CD98」係以與CD98蛋白質相同意義使用。由於CD98包含重鏈與輕鏈，故「CD98重鏈」及「CD98輕鏈」係各自以與CD98重鏈蛋白質及CD98輕鏈蛋白質相同意義使用。再者，於本說明書，只要未特別指明，「CD98」係可與「CD98重鏈」及「CD98輕鏈」、或、「CD98重鏈」或「CD98輕鏈」之任一者相互變換地使用。
於本說明書，「抗CD98抗體」係指可與CD98 重鏈結合的抗體。
於本說明書，「細胞傷害」係指以任何形式 對細胞帶來病理性變化者，未限於直接性外傷，亦指DNA的切斷、鹼基之二聚體的形成、染色體的切斷、細胞分裂裝置的損傷、各種酵素活性的降低等所有細胞之構造或機能上的損傷。
於本說明書，「細胞傷害活性」係指引起上 述細胞傷害者。
於本說明書，「抗體依賴性細胞傷害活性」 係意指「antibody dependent cellular cytotoxicity(ADCC)活性」，NK細胞藉由抗體而傷害腫瘤細胞等之標的細胞的作用活性。
於本說明書，「補體依賴性細胞傷害作用活 性」係意指「complement dependent cytotoxicity(CDC)活性」，補體藉由抗體而傷害腫瘤細胞等之標的細胞的作用活性。
於本說明書，「抗體之抗原結合片段」亦稱 為「抗體之機能性片段」，意指具有與抗原結合的活性的抗體之部分片段，包含Fab、F(ab’)2、scFv等。又，F(ab’)2於還原條件下處理的抗體之可變區之一價的片段的Fab’亦包含於抗體之抗原結合片段。惟，只要具有與抗原之結合能力即可，並未限定於此等分子。又，此等之抗原結合片段不僅包含抗體蛋白質之全長分子以適當酵素處理者，亦包含使用經基因工程改變的抗體基因而於適當宿主細胞所產生的蛋白質。
於本說明書，「Fab’」係如上述，將F(ab’)2 於還原條件下處理的抗體之可變區之一價的片段。惟，使用經基因工程改變的抗體基因而產生的Fab’亦包含於本發明中的Fab’。
於本說明書，「抗原決定位」係意指特定之抗CD98抗體結合的CD98之部分胜肽或部分立體結構。CD98之部分胜肽的抗原決定位係可藉由免疫分析法等本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知的方法，例如以下之方法而加以決定。首先，製作抗原之各式各樣的部分結構。於部分結構之製作時，可使用周知之寡肽合成技術。例如，自CD98之C末端或N末端，以適當長度依次縮短的一連串多肽，使用本發明所屬技術領域中具通常知識者所周知之基因重組技術而製作後，檢討抗彼等的抗體之反應性，決定大略的辨識部位後，再合成短胜肽而藉由檢討與彼等胜肽的反應性，可決定抗原決定位。又，特定抗體之結合抗原之部分立體結構的抗原決定位係可藉由X射線結構解析，藉由特定與前述抗體鄰接的抗原之胺基酸殘基，可加以決定。
於本說明書，「與同一抗原決定位結合的抗體」係意指與共通之抗原決定位結合的相異抗體。若於第一抗體之結合的部分胜肽或部分立體結構有第二抗體結合，則可判定第一抗體與第二抗體係結合於同一之抗原決定位。又，藉由確認第二抗體對於第一抗體之對抗原的結合為競爭(即，第二抗體妨礙第一抗體與抗原之結合)，即使未決定具體的抗原決定位之序列或結構，亦可 判定第一抗體與第二抗體係與同一抗原決定位結合。再者，第一抗體與第二抗體與同一抗原決定位結合，且第一抗體具有抗腫瘤活性等之特殊效果的情形，可期待第二抗體亦具有同樣的活性。據此，若第一抗CD98抗體之結合的部分胜肽與第二抗CD98抗體結合，則可判定第一抗體與第二抗體結合CD98之同一抗原決定位。又，藉由確認相對於第一抗CD98抗體之對CD98的結合，第二抗CD98抗體為競爭，可判定第一抗體與第二抗體係結合於CD98之同一抗原決定位的抗體。
於本說明書，「CDR」係指互補決定區(CDR： Complemetarity detemining region)。已知於抗體分子之重鏈及輕鏈各自有3處所之CDR。CDR亦稱為高度變異區(hypervariable domain)，於抗體之重鏈及輕鏈之可變區內，一級結構的變異性為特高的部位，於重鏈及輕鏈之多肽鏈之一級結構上，各自分離於3個處所。於本說明書，關於抗體之CDR，將重鏈之CDR自重鏈胺基酸序列之N末端側標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈之CDR自輕鏈胺基酸序列之N末端側標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等之部位係於立體結構上相互接近，而決定對結合的抗原的特異性。
於本說明書，「數個」係意指2~10個、2~9個、2~8個、2~7個、2~6個、2~5個、2~4個、2~3個、或2個，較佳為2個。
於本說明書，「藥物平均結合數」亦稱為藥物抗體比(Drug-to-Antibody Ratio(DAR))，意指對抗體1分子所結合的藥物的平均數。 於本說明書，「相同性」與「同源性」係以相同意義使用。
(CD98)
CD98係約40kDa之多道(multi-pass)輕鏈與雙硫鍵鍵結的約80~85kDa之第II型單道(single-pass)跨膜重鏈所構成的雜二聚體(非專利文獻15)。CD98重鏈(周知為CD98hc、4F2、或FRP-1)係於小鼠由Slc3a2基因編碼，於人類由SLC3A2基因編碼。CD98hc係第II型跨膜蛋白質，具有細胞外區域、跨膜區域及細胞質尾部。CD98係至少存有6個CD98輕鏈(LAT-1、LAT-2等)之一者與CD98hc細胞外區域之間藉由雙硫鍵而形成雜二聚體。CD98重鏈係參與整聯蛋白(integrin)之訊息傳達，CD98輕鏈係參與胺基酸輸送。
CD98重鏈之核苷酸序列及胺基酸序列係已公開於公共的資料庫，例如，就核苷酸序列而言，可參照NM_001012662、NM_001013251(GenBank)，就胺基酸序列而言，可參照NP_001012680、NP_001013269(GenBank)等。於本說明書中亦已揭示核苷酸序列NM_001012662為序列識別號37，胺基酸序列NP_001012680為序列識別號38。
CD98係可自人類、非人類哺乳類動物(大鼠、小鼠等)之CD98表現細胞直接純化而使用、或者可調製該細胞之細胞膜劃份(fraction)而使用，又，CD98可於活體外合成、或可藉由基因操作使於宿主細胞產生而獲得。於基因操作，具體而言，將CD98 cDNA併入可 表現的載體後，於含有轉錄及轉譯所必要的酵素、基質及能量物質的溶液中合成、或者藉由使其他原核生物、或真核生物之宿主細胞轉形而藉由使CD98表現，可獲得該蛋白質。又，亦可使用前述之基因操作所致的CD98表現細胞、或將表現CD98的細胞株作為CD98使用。
又，上述CD98重鏈的胺基酸序列中，1或 數個胺基酸被取代、刪除及/或添加的胺基酸序列而成且具有與該蛋白質同等之生物活性的蛋白質亦包含於CD98重鏈中。
(抗CD98抗體)
本發明使用的抗CD98抗體若為可與CD98重鏈結合的抗體，則未特別限定。該抗體係具有可辨識表現CD98的腫瘤細胞的特性、可與該腫瘤細胞結合的特性、及併入於腫瘤細胞內而內在化的特性。
本發明使用的抗CD98抗體係可藉由使用此領域通常實施的方法，將選自CD98重鏈或CD98重鏈之胺基酸序列的任意多肽對動物免疫，採取活體內產生的抗體，進行純化而獲得。成為抗原的CD98之生物種類並未限於人類，亦可將來自小鼠、大鼠等之人類以外之動物的CD98對動物免疫。於此情形，藉由試驗與取得的異種CD98結合的抗體與人類CD98之交叉性，可選別可適用於人類疾病的抗體。
又，依據周知之方法(例如，Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497；Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibodies,p.365-367,Plenum Press, N.Y.(1980))，藉由使產生抗CD98抗體的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合而建立融合瘤，亦可獲得單株抗體。
又，成為抗原的CD98重鏈係可藉由使CD98重鏈之基因經由基因操作而於宿主細胞產生而獲得。
具體而言，製作可表現CD98重鏈之基因的載體，將其導入宿主細胞而使該基因表現，純化表現的CD98重鏈即可。以下，具體地說明抗CD98抗體之取得方法。
(1)抗原之調製
就用以製作抗CD98抗體之抗原而言，可列舉CD98重鏈或其至少6個連續的部分胺基酸序列所構成的多肽、此等任意之胺基酸序列或附加擔體的衍生物、表現CD98重鏈的細胞等。
CD98係可自人類之腫瘤組織或腫瘤細胞直接純化而使用，又，可將CD98於活體外合成、或藉由基因操作使於宿主細胞中產生而獲得。
於基因操作，具體而言，將CD98之cDNA併入可表現的載體後，於含有轉錄及轉譯所必要的酵素、基質及能量物質的溶液中來合成、或藉由使其他原核生物、或真核生物之宿主細胞轉形，而藉由使CD98表現，可獲得抗原。
又，藉由使為膜蛋白質的CD98之細胞外區域與抗體之恆定區連結的融合蛋白質於適當宿主、載體系統中表現，亦可能獲得呈分泌蛋白質之抗原。
CD98之cDNA係可例如，將表現CD98之 cDNA的cDNA庫作為模板，藉由使用特異性放大CD98之cDNA的引子而進行聚合酶連鎖反應(以下稱為「PCR」)(參照Saiki,R.K.,et al.,Science(1988)239,p.487-489)之所謂的PCR法而取得。
就多肽之活體外合成而言，例如，可列舉 Roche Diagnostics公司製之快速轉譯系統(Rapid Translation System)(RTS)，但未限定於此。
就原核細胞之宿主而言，例如，可列舉大腸 桿菌(Escherichia coli)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)等。使目的基因於此等之宿主細胞內轉形，於含有來自可適合作為宿主種之複製單元(replicon)，即複製起點、及調節序列的質體載體中使宿主細胞轉形。又，就載體而言，於轉形細胞具有可賦予表型(表現型)之選擇性的序列者為較佳。
真核細胞之宿主細胞包含脊椎動物、昆蟲、 酵母等之細胞，就脊椎動物細胞而言，例如，常使用猴之細胞的COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182、ATCC CRL-1650；ATCC：American Type Culture Collection)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)等，但未限定於此等。
如上述獲得的轉形體可依據此領域通常實施 的方法加以培養，藉由該培養，於細胞內或細胞外產生目的多肽。
就該培養所使用的培養基而言，可因應採用 的宿主細胞而適當選擇慣用的各種培養基，若為大腸桿菌，例如，因應必要可於LB培養基添加安比西林(ampicillin)等之抗生素或IPMG而使用。
藉由上述培養，轉形體之細胞內或細胞外所 產生的重組蛋白質可藉由利用該蛋白質之物理性質或化學性質等的各種周知分離操作法而分離、純化。
就該方法而言，具體而言，例如，可舉例說 明通常之蛋白質沉澱劑的處理、超過濾、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、親和性層析等之各種液體層析、透析法、此等之組合等。
又，藉由於經表現的重組蛋白質連接6個殘 基所構成的組胺酸標籤，可以鎳親和性管柱有效率地純化。或者，藉由於經表現的重組蛋白質連接IgG之Fc區域，可以蛋白質A管柱有效率地純化。
藉由組合上述方法，可輕易以高產率、高純度為目的大量製造多肽。
(2)抗CD98單株抗體之製造
就與CD98特異性結合的抗體之例而言，可列舉與CD98特異性結合的單株抗體，但其取得方法係如以下記載。
於單株抗體之製造時，一般而言如下述的作業步驟係有必要的。即，(a)調製抗原的步驟、(b)藉由將抗原注射至動物而免疫後，採取血液而檢查其抗體力價，決定脾臓摘出的時期後，調製抗體產生細胞的步驟、(c)調製骨髓瘤的步驟、(d)使抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合的步驟、(e)選出產生目的抗體的融合瘤群的步驟、(f)分割為單一細胞選殖株(選殖)的步驟、(g)依情形，培養融合瘤而製造單株抗體的步驟、或飼育移植融合瘤的動物而製造單株抗體的步驟、(h)檢討如此製造的單株抗體之生理活性、及其結合特異性、或檢查作為標識試藥之特性的步驟等。
以下，按照上述步驟詳述單株抗體之製作法，但該抗體之製作法並未受限於此等，例如亦可使用脾細胞以外之抗體產生細胞及骨髓瘤。
(a)調製抗原的步驟
就抗原而言，可使用以如前述方法所調製的CD98或其一部分、藉由CD98表現重組體細胞所調製的膜劃份、CD98表現重組體細胞、CD98表現細胞株、使用本發明所屬技術領域中具通常知識者周知之方法而化學合成的CD98之部分胜肽等。
(b)調製抗體產生細胞的步驟
將步驟(a)所獲得的抗原與弗氏完全或不完全佐劑、或鉀礬(potash alum)之類的輔助劑混合，作為免疫原對實驗動物免疫。或將CD98表現細胞作為免疫原對實驗動物免疫。實驗動物係可無阻地使用周知融合瘤製作法所使用的動物。具體而言，例如可使用小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。惟，由與摘出的抗體產生細胞融合的骨髓瘤細胞之取得容易性等之觀點，將小鼠或大鼠作為被免疫動物者為較佳。
又，實際上使用的小鼠及大鼠之品系並未特別限制，於小鼠之情形，例如，各品系A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB、129等，又於大鼠的情形，例如，可使用Wistar、Low、Lewis、Sprague、Dawley、ACI、BN、Fischer等。
此等之小鼠及大鼠係可例如獲自日本CLEA公司、日本Charles River公司等之實驗動物飼育販售業者。
其中，就被免疫動物而言，若考慮與後述之骨髓瘤細胞的融合親合性，小鼠係BALB/c品系為較佳，大鼠係Wistar及Low品系為較佳。
又，考慮抗原之人類與小鼠之相同性，使用去除自體抗體的使生物機制降低的小鼠，亦即，使用自體免疫疾病小鼠為較佳。
又，此等小鼠或大鼠之免疫時之週齡係較佳為3~12週齡，更佳為4~6週齡。
就將動物免疫的方法而言，例如，可使用Weir,D.M.,Handbook of Experimental Immunology Vol.I.II.III.,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987)、Kabat,E.A.and Mayer,M.M.,Experimental Immunochemistry,Charles C Thomas Publisher Springfield,Illinois(1964)等記載的周知方法。
此等免疫法中，將抗原投予至動物之皮下的方法為較佳。為了提高免疫效率，前半進行皮內投予，僅後半或最終次進行靜脈內投予為更佳。
抗原之投予時程係依被免疫動物之種類、個體差異等而異，但一般而言，抗原投予次數3~6次、投予間隔1~3週為較佳，投予次數4~5次、投予間隔1~2週為更佳。
又，抗原之投予量係依動物之種類、個體差異等而異，但一般而言，設為0.05~5mg，較佳為0.1~0.5mg左右。
追加免疫係如以上之抗原投予1~6週後，較佳為1~4週後，更佳為1~3週後進行。免疫原為細胞的情形，使用1×106~1×107個之細胞。
又，進行追加免疫之際的抗原投予量，依動物種類、大小等而異，但一般而言，例如，小鼠的情形設為0.05~5mg，較佳為0.1~0.5mg，更佳為0.1~0.2mg左右。免疫原為細胞的情形，使用1×106~1×107個之細胞。
上述追加免疫後1~10日後，較佳為2~5日 後，更佳為2~3日後，自被免疫動物無菌地取出含抗體產生細胞的脾臓細胞或淋巴球。此時，測量抗體力價，若將抗體力價變的充分高的動物作為抗體產生細胞之供給源使用，則可提高以後操作之效率。
就於此所使用的抗體力價之測定法而言，例如，可列舉RIA法或ELISA法，但未限定於此等方法。ELISA法之情形，可依如以下記載的順序進行。
首先，使純化或部分純化的抗原吸附於ELISA用96孔盤等之固相表面，又將抗原未吸附的固相表面以與抗原無關係的蛋白質覆蓋，例如，藉由牛血清白蛋白(於本說明書，有時稱為BSA)覆蓋，將該表面洗淨後，使與連續稀釋的樣品(例如，小鼠血清)作為第一抗體接觸，使上述抗原與樣品中之抗體結合。
再者作為第二抗體，添加經酵素標識的抗小鼠抗體的抗體使其與小鼠抗體結合，洗淨後添加該酵素之基質，測定基於基質分解而顯色的吸光度變化等，藉此算出抗體力價。
由被免疫動物之脾臓細胞或淋巴球之抗體產生細胞的分離，可依據周知方法(例如，Kohler et al.,Nature(1975)256,p.495、Kohler et al.,Eur.J.Immunol.(1977)6,p.511；Milstein et al.,Nature(1977)266,p.550；Walsh,Nature,(1977)266,p.495)而進行。例如，於脾臓細胞的情形，可採用將脾臓細切而將細胞以不鏽鋼篩網過濾後，使游離於伊格爾氏最低必須培養基 (Eagle’s minimal essential medium,MEM)而將抗體產生細胞加以分離的一般方法。
(c)調製骨髓瘤的步驟
用於細胞融合的骨髓瘤細胞並未特別限定，可適當選擇周知之細胞株來使用。惟，考慮自融合細胞選擇融合瘤之際的便利性，較佳使用其選擇手續已確立的HGPRT(次黃嘌呤鳥糞嘌呤磷酸核糖基轉換酵素，Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損株。
即，來自小鼠之X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1等；來自大鼠之210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等；來自人類之U266AR(SKO-007)、GM1500．GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等。此等之HGPRT缺損株係例如，可獲自ATCC等。
此等之細胞株係以適當培養基，例如8-氮鳥嘌呤培養基(於RPMI-1640培養基中添加麩醯胺酸、2-巰基乙醇、健他黴素(gentamycin)、及胎牛血清(於本說明書，有時稱為「FBS」)的培養基中添加8-氮鳥嘌呤的培養基)、伊斯科夫氏修飾杜爾貝科氏培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、或杜爾貝科氏修飾弋果氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；DMEM)繼代培養，但細胞融合之3至4日前以正常培養 基(例如，含10% FBS的ASF104培養基(味之素公司製))繼代培養，融合當日確保2×107以上之細胞數目。
(d)使細胞融合的步驟
抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合係依據周知之方法(Weir,D.M.,Handbookof Experimental Immunology Vol.I.II.III.,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987)；Kabat,E.A.and Mayer,M.M.,Experimental Immunochemistry,Charles C Thomas Publisher Springfield,Illinois(1964)等)，於使細胞生存率未極度降低的程度的條件下可適當實施。
如此方法係可使用例如，於聚乙二醇等之高濃度聚合物溶液中將抗體產生細胞與骨髓瘤細胞混合的化學方法、利用電刺激的物理方法等。其中，若呈示上述化學方法之具體例係如以下。
即，使用聚乙二醇作為高濃度聚合物溶液的情形，於分子量1500~6000，較佳為2000~4000之聚乙二醇溶液中，於30~40℃，較佳為於35~38℃之溫度下，將抗體產生細胞與骨髓瘤細胞混合1~10分鐘，較佳為5~8分鐘。
(e)選擇融合瘤群的步驟
藉由上述細胞融合獲得的融合瘤之選擇方法並未特別限制，但通常使用HAT(次黃嘌呤．胺基喋呤．胸腺嘧啶)選擇法(Kohler et al.,Nature(1975)256,p.495；Milstein et al.,Nature(1977)266,p.550)。
此方法係於使用於胺基喋呤中無法生存的 HGPRT缺損株之骨髓瘤細胞而獲得融合瘤的情形為有效的。
即，藉由將未融合細胞及融合瘤以HAT培 養基培養，可選擇性地僅使對胺基喋呤有耐受性的融合瘤殘存，且可使增殖。
(f)分割為單一細胞選殖株(選殖)的步驟
就融合瘤之選殖法而言，例如，可使用甲基纖維素法、軟瓊脂糖法、臨界稀釋法等之周知方法(例如參照Barbara,B.M.and Stanley,M.S.：Selected Methods in Cellular Immunology,W.H.Freeman and Company,San Francisco(1980))。此等之方法中，尤其是甲基纖維素法等之三維培養法為較佳。例如，將藉由細胞融合所形成的融合瘤群懸浮於ClonaCell-HY Selection Medium D(StemCell Technologies公司製# 03804)等之甲基纖維素培養基而培養，藉由回收形成的融合瘤選殖株，單株融合瘤之取得為可能的。培養經回收的各融合瘤選殖株，將於獲得的融合瘤培養上清液中安定而被認可抗體力價者，選擇作為CD98單株抗體產生融合瘤株。
就如此樹立的融合瘤株之例而言，可列舉CD98融合瘤M23。又，於本說明書中，將CD98融合瘤M23所產生的抗體記載為「M23抗體」或僅記載為「M23」。
M23抗體之重鏈可變區係具有序列表之序列識別號2所示的胺基酸序列。又，M23抗體之輕鏈可變區係具有序列表之序列識別號4所示的胺基酸序列。
(g)製造單株抗體的步驟
如此選擇的融合瘤，藉由將其培養，可有效率地獲得單株抗體，但培養之前，篩選產生目的單株抗體的融合瘤係所欲的。
此篩選係可採用本身已知之方法。
抗體力價之測定係可依據例如上述(b)之項目所說明的ELISA法來進行。
藉由以上之方法所獲得的融合瘤係可於液態氮中或-80℃以下之冷凍庫中以凍結狀態下保存。
完成選殖的融合瘤係將培養基由HAT培養基換成正常培養基而被培養。
大量培養係以使用大型培養瓶的旋轉培養、或旋轉器(spinner)培養來進行。自此大量培養中的上清液，藉由使用Protein A管柱純化等之本發明所屬技術領域中具通常知識者周知之方法來純化，可獲得與本發明之蛋白質特異性結合的單株抗體。
又，藉由注射融合瘤於同品系之小鼠(例如，上述之BALB/c)、或Nu/Nu小鼠之腹腔內，使該融合瘤增殖，可獲得含大量本發明之單株抗體的腹水。
於腹腔內投予的情形，於事前(3~7日前)，投予2,6,10,14-四甲基十五烷(2,6,10,14-tetramethylpentadecane；姥鮫烷(pristane))等之礦物油時，可獲得較多量之腹水。
例如，於與融合瘤同品系的小鼠腹腔內預先注射免疫抑制劑，使T細胞不活化後，於20日後，使 106~107個之融合瘤．選殖細胞於不含血清的培養基中游離(0.5ml)而投予至腹腔內，通常於腹部膨滿、腹水累積處，自小鼠採取腹水。藉由此方法，與培養液中相比，獲得約100倍以上之濃度之單株抗體。
藉由上述方法所獲得的單株抗體，可以例如Weir,D.M.：Handbook of Experimental Immunology,Vol.I,II,III,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1978)記載的方法加以純化。
因而獲得的單株抗體係對CD98具有高抗原特異性。
(h)單株抗體之檢定
因此獲得的單株抗體之同型及亞型之決定係可如以下方式進行。
首先，可列舉歐氏雙向擴散(Ouchterlony)法、ELISA法、或RIA法作為鑑定法。
歐氏雙向擴散法係為簡便，但單株抗體濃度低的情形，有必要濃縮操作。
另一方面，使用ELISA法或RIA法的情形，使培養上清液直接與抗原吸附固相反應，進一步藉由使用對應各種免疫球蛋白同型、亞型的抗體作為第二次抗體，可鑑定單株抗體之同型、亞型。
又，就更簡便的方法而言，亦可利用市售之鑑定用之套組(例如，Mouse typer kit：Bio-Rad公司製)等。
再者，蛋白質之定量係可由Folin Lowry法 及280nm中的吸光度(1.4(OD280)=免疫球蛋白1mg/ml)算出的方法而進行。
再者，再次實施(2)之(a)至(h)的步驟而另外 獨立取得單株抗體的情形，亦可能取得具有與M23抗體同等之細胞傷害活性的抗體。就如此抗體之一例，可列舉結合於與M23抗體相同抗原決定位的抗體。新製作的單株抗體若與M23抗體之結合的部分胜肽或部分立體結構結合，則可判定該單株抗體結合於與M23抗體相同之抗原決定位。又，藉由確認相對於M23抗體之對CD98的結合，該單株抗體係競爭(即，該單株抗體係妨礙M23抗體與CD98之結合)，即使未決定具體的抗原決定位之序列或結構，亦可判定該單株抗體結合於與CD98抗體相同之抗原決定位。抗原決定位被確認為相同的情形，該單株抗體被強烈地期待具有與M23抗體同等之抗原結合能力或生物活性。
(3)其他抗體
用於本發明之抗體係除了上述抗CD98的單株抗體之外，亦包含以使對人類的異種抗原性降低等為目的而人為地改變的基因重組型抗體，例如，嵌合(Chimeric)抗體、人類化(Humanized)抗體、人類抗體等。此等之抗體可使用已知方法而製造。
就嵌合抗體而言，係抗體之可變區與恆定區彼此為異種的抗體，例如，可列舉將來自小鼠或大鼠的抗體之可變區與來自人類的恆定區接合的嵌合抗體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855(1984))。
來自小鼠抗人類CD98抗體M23之嵌合抗體 係由包含序列識別號2之胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及包含序列識別號4之胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈所構成的抗體，可具有任意之來自人類的恆定區。
就如此嵌合抗體之一例而言，可列舉包含具 有序列識別號8之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列的重鏈及具有序列識別號10之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列的輕鏈的抗體。又，於序列識別號8所示的重鏈序列中，由第1~19號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為訊息序列，由第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為可變區，由第136~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為恆定區。又，於序列表之序列識別號10所示的輕鏈序列中，由第1~20號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為訊息序列，由第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為可變區，由第136~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為恆定區。
序列識別號8所示的重鏈胺基酸序列係由序 列識別號7所示的核苷酸序列編碼。由序列識別號7所示的核苷酸序列之第1~57號之核苷酸所構成的核苷酸序列係編碼抗體之重鏈訊息序列，由第58~405號之核苷酸所構成的核苷酸序列係編碼抗體之重鏈可變區，由第406~1395號之核苷酸所構成的核苷酸序列係編碼抗體之重鏈恆定區。
序列識別號10所示的輕鏈胺基酸序列係經 序列識別號9所示的核苷酸序列所編碼。序列識別號9所示的核苷酸序列之第1~60號之核苷酸所構成的核苷酸序列係編碼抗體之輕鏈訊息序列，第61~405號之核苷酸所構成的核苷酸序列係編碼抗體之輕鏈可變區，第406~720號之核苷酸所構成的核苷酸序列係編碼抗體之輕鏈恆定區。
各自將序列識別號7及8之序列記載於第1 圖，序列識別號9及10之序列記載於第2圖。
就人類化抗體而言，可列舉僅將CDR併入 來自人類的抗體之抗體(參照Nature(1986)321,p.522-525)、藉由CDR移植法而除了CDR之序列外亦將一部分之框架之胺基酸殘基移植於人類抗體之抗體(國際公開小冊WO90/07861)。
就來自M23抗體之人類化抗體而言(於本說 明書，有稱為「人類化M23抗體」、「人類化M23」、「hM23抗體」或「hM23」的情形)，只要保持M23抗體之6種全部的CDR序列，則未限定於特定之人類化抗體。又，M23抗體之重鏈可變區係保有序列識別號19所示的胺基酸序列所構成的CDRH1(NYLIE)、序列識別號20所示的胺基酸序列所構成的CDRH2(VINPGSGVTNYNEKFKG)、及序列識別號21所示的胺基酸序列所構成的CDRH3(AEAWFAY)。又，M23抗體之輕鏈可變區係保有序列表之序列識別號22所示的胺基酸序列所構成的 CDRL1(KSSQSLLYSSNQKNYLA)、序列識別號23所示的胺基酸序列所構成的CDRL2(WASTRES)、及序列識別號24所示的胺基酸序列所構成的CDRL3(QRYYGYPWT)。
就小鼠抗體M23之人類化抗體之例而言，可列舉下列重鏈及輕鏈之任意組合：包含選自包含下列群組的重鏈可變區的重鏈：(1)序列識別號12或14之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列、(2)相對於上述(1)之胺基酸序列，至少具有95%以上之相同性的胺基酸序列、及(3)於上述(1)之胺基酸序列有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列；以及包含選自包含下列群組的輕鏈可變區的輕鏈：(4)序列識別號16或18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列、(5)相對於上述(4)之胺基酸序列，至少具有95%以上之相同性的胺基酸序列、及(6)於上述(4)之胺基酸序列有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列。
又，就胺基酸之取代而言，保存的胺基酸取代為較佳。保存的胺基酸取代係指與胺基酸側鏈有關連的胺基酸基團內產生的取代。較佳胺基酸基團係如以下： 酸性基團=天冬胺酸及麩胺酸；鹼性基團=離胺酸、精胺酸及組胺酸；非極性基團=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸及色胺酸；以及非帶電極性家族=甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及酪胺酸。
其他適合的胺基酸基團係如下：脂肪族羥基基團=絲胺酸及蘇胺酸；含醯胺基基團=天冬醯胺及麩醯胺酸；脂肪族基團=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；以及芳香族基團=苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸。
該胺基酸取代係於不使具有原本胺基酸序列的物質之特性降低的範圍內進行者為較佳。
就上述之重鏈及輕鏈之較佳組合之抗體而言，可列舉以下的抗體：包含具有序列識別號12之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及具有序列識別號16之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體、包含具有序列識別號12之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及具有序列識別號18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體、 包含具有序列識別號14之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及具有序列識別號16之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體、以及 包含具有序列識別號14之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及具有序列識別號18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體。
就更佳的組合之抗體而言，可列舉下列抗體： 包含具有序列識別號12之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及具有序列識別號16之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體、 包含具有序列識別號12之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及具有序列識別號18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體、以及 包含具有序列識別號14之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及具有序列識別號18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體。
又，就其他適合的組合之抗體而言，可列舉下列抗體：包含序列識別號12之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號16之第 21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體、 包含序列識別號12之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號18之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體、 包含序列識別號14之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號16之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體、以及 包含序列識別號14之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號18之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體。
就更適合的組合之抗體而言，可列舉下列抗體：包含序列識別號12之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號16之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體、包含序列識別號12之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號18之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體、以及 包含序列識別號14之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號18之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體。
藉由組合呈現與上述之重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列有高相同性的序列，選擇具有與上述各抗體同等生物活性的抗體係可能的。如此相同性，一般而言為80%以上之相同性，較佳為90%以上之相同性，更佳為95%以上之相同性，最佳為99%以上之相同性。又，藉由組合於重鏈或輕鏈之胺基酸序列有1~數個之胺基酸殘基被取代、刪除或添加的胺基酸序列，亦可選擇具有與上述之各抗體同等生物活性的抗體。
二種類之胺基酸序列間之相同性係可藉由使用Blast algorithm第2.2.2版(Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang、Zheng Zhang、Webb Miller,and David J.Lipman(1997),「Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs」,Nucleic Acids Res.25：3389-3402)之系統內定參數(default parameter)而決定。Blast algorithm亦可藉由例如，存取網際網路www.ncbi.nlm.nih.gov/blast而使用。
又，序列識別號12或14所示的重鏈胺基酸序列中，第1~19號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列係訊息序列，第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列係可變區，第136~465號之胺基酸殘基所構成的胺基 酸序列係恆定區。序列識別號12或14所示的重鏈胺基酸序列係各自經序列識別號11或13所示的核苷酸序列編碼。各核苷酸序列之第1~57號之核苷酸所構成的核苷酸序列係編碼抗體之重鏈訊息序列，第58~405號之核苷酸所構成的核苷酸序列係編碼抗體之重鏈可變區，第406~1395號之核苷酸所構成的核苷酸序列係編碼抗體之重鏈恆定區。各自將序列識別號11及12之序列記載於第3圖，將序列識別號13及14之序列記載於第4圖。
又，序列表之序列識別號16或18所示的輕 鏈胺基酸序列中，第1~20號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列係訊息序列，第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列係可變區，第136~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列係恆定區。序列識別號16或18所示的輕鏈胺基酸序列係各自經序列識別號15或17所示的核苷酸序列編碼。各核苷酸序列之第1~60號之核苷酸所構成的核苷酸序列係編碼抗體之輕鏈訊息序列，第61~405號之核苷酸所構成的核苷酸序列係編碼抗體之輕鏈可變區，第406~720號之核苷酸所構成的核苷酸序列係編碼抗體之輕鏈恆定區。各自將序列識別號15及16之序列記載於第5圖，將序列識別號17及18之序列記載於第6圖。
關於此等之核苷酸序列與其他抗體之核苷酸序列之間的相同性，可藉由Blast algorithm來決定。
就本發明之抗體而言，又可列舉結合於M23抗體相同抗原決定位的人類抗體。抗CD98人類抗體係 意指僅具有來自人類染色體之抗體之基因序列的人類抗體。抗CD98人類抗體係可藉由使用具有含人類抗體之重鏈及輕鏈之基因的人類染色體片段的人類抗體產生小鼠的方法(參照Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics(1997)16,p.133-143；Kuroiwa,Y.et al.,Nucl.Acids Res.(1998)26,p.3447-3448；Yoshida,H.et al.,Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol.10,p.69-73(Kitagawa,Y.,Matsuda,T.and Iijima,S.,eds.),Kluwer Academic Publishers,1999.；Tomizuka,K.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2000)97,p.722-727等)而取得。
如此人類抗體產生小鼠，具體而言，可藉由 將內在性免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座被破壞、用以代之以通過酵母人工染色體(Yeast artificial chromosome，YAC)載體等而導入人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座的基因重組動物，製作基因剔除動物及基因轉殖動物之製作及此等動物彼此交配而作出。
又，亦可藉由基因重組技術，各自編碼如此 人類抗體之重鏈及輕鏈的cDNA，較佳為藉由含該cDNA的載體將真核細胞轉形，培養產生基因重組人類單株抗體的轉形細胞，藉此自培養上清液中獲得此抗體。
其中，作為宿主，例如，可使用真核細胞， 較佳為CHO細胞、淋巴球或骨髓瘤等之哺乳類動物細胞。
又，亦已知取得自人類抗體庫選出的來自噬 菌體顯示的人類抗體的方法(參照Wormstone,I.M.et al,Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7),p.2301-2308；Carmen,S.et al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2),p.189-203；Siriwardena,D.et al.,Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431等)。
例如，可使用將人類抗體之可變區作為單鏈 抗體(scFv)而使於噬菌體表面表現，而選擇與抗原結合的噬菌體的噬菌體顯示法(Nature Biotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)。
藉由解析與抗原結合而選擇的噬菌體之基 因，可決定編碼與抗原結合的人類抗體之可變區的DNA序列。
若與抗原結合的scFv之DNA序列係清楚 的，則可藉由製作具有該序列的表現載體，導入於適當宿主並使表現，而取得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12,p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。
新製作的人類抗體若與M23抗體之結合的 部分胜肽或部分立體結構結合，則可判定該人類抗體結合於與M23抗體相同之抗原決定位。又，藉由確認相對於M23抗體之對CD98的結合，該人類抗體為競爭(即，該人類抗體會妨礙M23抗體與CD98之結合)，即使具體 的抗原決定位之序列或結構未被決定，亦可判定該人類抗體結合於與M23抗體相同之抗原決定位。確認抗原決定位係相同的情形，該人類抗體被強烈地期待具有與M23抗體同等之生物活性。
藉由以上方法所獲得的嵌合抗體、人類化抗 體、或人類抗體係可藉由周知方法等而評價對抗原的結合性，而選出適合的抗體。
就比較抗體性質之際之其他指標之一例而 言，可列舉抗體之安定性。示差掃描熱析儀(DSC)係可快速又正確地測量成為蛋白質之相對性結構安定性之良好指標的熱變性中點(Tm)的裝置。使用DSC測量Tm值，藉由比較其值，可比較熱安定性之不同。已知抗體之保存安定性呈現與抗體之熱安定性有某程度之相關(Lori Burton,et al.,Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,p.265-273)，將熱安定性作為指標，可選擇適合的抗體。就用以選擇抗體的其他指標而言，可列舉適當宿主細胞中的產量為高的、及水溶液中之凝集性為低的。例如，不限於產量之最高抗體呈現最高熱安定性，故有必要基於以上所述指標綜合地判斷，選出最適合對人類投予之抗體。
用於本發明之抗體亦包含抗體之修飾體。該修飾體係意指對抗體施予化學性或生物學性之修飾者。化學性之修飾體包含對胺基酸骨架之化學部分之鍵結、N-鍵結或O-鍵結碳水化物鏈之化學修飾體等。生物學性之修飾體包含轉譯後修飾(例如，對N-鍵結或O-鍵結之 糖鏈附加、N末端或C末端之加工、脫醯胺化、天冬胺酸之異構物化、甲硫胺酸之氧化)者、藉由使用原核生物宿主細胞而使表現，而於N末端附加甲硫胺酸殘基者等。又，為了可進行本發明所使用的抗體或抗原之檢測或單離而被標識者，例如，酵素標識體、螢光標識體、親和性標識體亦包含於該修飾物之意義。如此本發明所使用的抗體之修飾物係有用於原本抗體之安定性及血中滯留性的改善、抗原性的減輕、該抗體或抗原之檢測或單離等。
又，藉由調節與抗體結合的糖鏈修飾(糖苷 基(glycosyl)化、脫岩藻糖(fucose)化等)，可增強抗體依賴性細胞傷害活性。就抗體之糖鏈修飾之調節技術而言，已知WO99/54342、WO00/61739、WO02/31140等，但未限定於此等。本發明所使用的抗體亦包含該糖鏈修飾經調節的抗體。
本發明所使用的抗CD98抗體係亦可於一旦 單離抗體基因後，導入適當宿主而獲得。就抗體基因之具體例而言，可列舉將編碼本說明書記載的抗體之重鏈序列的基因及編碼輕鏈序列的基因加以組合者。將宿主細胞轉形之際，重鏈序列基因與輕鏈序列基因係可能被插入相同表現載體，又亦可能被插入不同表現載體。
將真核細胞作為宿主使用的情形，可使用動 物細胞、植物細胞、真核微生物。尤其就動物細胞而言，可列舉哺乳類細胞，例如，為猴細胞的COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠纖 維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)。
使用原核細胞的情形，例如，可列舉大腸桿菌、枯草桿菌。
將作為目的的抗體基因藉由轉形而導入至此等細胞，藉由將經轉形的細胞於活體外培養，可獲得抗體。於該培養，有依抗體之序列而產量不同的情形，可自具有同等結合活性的抗體之中，以產量作為指標而選出容易作為醫藥生產者。據此，本發明所使用的抗體亦包含藉由下列抗體之製造方法所獲得的抗體，該方法之特徵為包含：培養上述經轉形的宿主細胞的步驟、及自該步驟所獲得的培養物採取目的抗體或該抗體之抗原結合片段的步驟。
又，已知哺乳類培養細胞所生產的抗體之重鏈之羧基末端的離胺酸殘基係缺失(Journal of Chromatography A,705：129-134(1995))，又，已知相同重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸之2個胺基酸殘基係缺失，位於新的羧基末端的脯胺酸殘基經醯胺化(Analytical Biochemistry,360：75-83(2007))。然而，此等重鏈序列之缺失及修飾對於抗體之抗原結合能力及效應子機能(補體之活性化或抗體依賴性細胞傷害作用等)並無影響。據此，本發明亦包含接受該修飾的抗體及該抗體之抗原結合片段，可列舉於重鏈羧基末端有1或2 個之胺基酸被刪除的缺失體、及經醯胺化的該缺失體(例如，羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化的重鏈)等。 惟，只要保有抗原結合能力及效應子機能，則本發明所使用的抗體之重鏈之羧基末端之缺失體未限於上述種類。構成本發明所使用的抗體的2股之重鏈可為選自包含完全長度及上述之缺失體之群組的重鏈之任一種，亦可組合任二種。各缺失體之量比可受產生本發明所使用的抗體的哺乳類培養細胞之種類及培養條件影響，但就本發明所使用的抗體之主成分而言，可列舉於2股重鏈之雙方，羧基末端之一個之胺基酸殘基有缺失的情形。
就本發明所使用的抗體之同型而言，例如可列舉IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)等，但較佳可列舉IgG1或IgG2。
又本發明所使用的抗體係可為具有抗體之抗原結合部的抗體之抗原結合片段或其修飾物。藉由將抗體以木瓜酵素、胃蛋白酶等之蛋白質分解酵素處理、或將抗體基因藉由基因工程的手法而改變並於適當培養細胞使表現，可獲得該抗體之片段。於如此抗體片段之中，可將保持抗體全長分子之具有的機能的全部或一部分的片段稱為抗體之抗原結合片段。例如，就抗體之片段而言，可列舉Fab、F(ab’)2、Fv、或重鏈及輕鏈之Fv以適當連接物使連結的單鏈Fv(scFv)、雙特異性抗體(diabodies)、線狀抗體、及抗體片段所形成的多特異性抗體等。又，F(ab’)2於還原條件下處理的抗體之可變區之一價片段的Fab’亦包含於抗體之片段。
本發明所使用的抗體係可為使抗腫瘤性化合物結合的抗體-藥物結合物。就抗腫瘤性化合物而言，為具有抗腫瘤效果的化合物，只要具有可與連接物結構結合的取代基、部分結構者，則無特別限制。抗腫瘤性化合物係連接物之一部份或全部於腫瘤細胞內被切斷而抗腫瘤性化合物部分游離而表現抗腫瘤效果。若連接物與藥物結合部分被切斷，則抗腫瘤性化合物以本來的結構游離，而其本來之抗腫瘤效果被發揮
就抗腫瘤性化合物而言，例如，可列舉阿黴素(doxorubicin)、柔红黴素(daunorubicin)、絲裂黴素C(mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)、環胞苷(cyclocytidine)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、白金系抗腫瘤劑(順鉑(cisplatin)或其衍生物)、塔克素(Taxol)或其衍生物、喜樹鹼或其衍生物(特開平6-87746號公報記載的抗腫瘤劑)等，較佳為依喜替康。
就本發明所使用的抗CD98抗體之生物活性而言，可列舉抗原結合活性、藉由與抗原結合而內在化至表現該抗原的細胞的活性、中和抗原活性的活性、增強抗原活性的活性、抗體依賴性細胞傷害(ADCC)活性、補體依賴性細胞傷害(CDC)活性及抗體依賴性細胞媒介吞噬作用(ADCP)，但本發明所使用的抗體所具有的機能係對CD98重鏈的結合活性，較佳為藉由與CD98重鏈結合而內在化至CD98表現細胞中的活性。再者，本發明所使用的抗體係除了細胞內在化活性之外，亦可兼具ADCC活性、CDC活性及/或ADCP活性。
抗體之抗原結合活性係可使用流動式細胞測量術(flow cytometry)而確認。
內在化至細胞的活性係可使用下列方法確認：(1)使用與治療抗體結合的二次抗體(螢光標識)而藉由螢光顯微鏡將併入細胞內的抗體進行可視化的試驗法(Cell Death and Differentiation(2008)15,751-761)、(2)使用與治療抗體結合的二次抗體(螢光標識)，測定併入細胞內的螢光量的試驗法(Molecular Biology of the Cell Vol.15,5268-5282,December 2004)、或(3)使用與治療抗體結合的免疫毒素，一旦被併入細胞內則毒素被釋放而細胞增殖被抑制的Mab-ZAP試驗法(BioTechniques 28：162-165,January 2000)。就免疫毒素而言，亦可使用白喉毒素之觸媒區與Protein G之重組複合蛋白質。
獲得的抗體可純化至均一。抗體之分離、純化係可使用通常之蛋白質所使用的分離、純化方法。例如若適當選擇、組合管柱色層分析、過濾器過濾、超過濾、鹽析、透析、調製用聚丙烯醯胺膠體電泳、等電點電泳等，則可將抗體加以分離、純化(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshak et al.,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但未限定於此等。
就色層分析而言，可列舉親和性色層分析、離子交換色層分析、疏水性色層分析、膠體過濾色層分析、逆相色層分析、吸附色層分析等。
此等之色層分析可使用HPLC、FPLC等之液體色層分析來進行。
就親和性色層分析所使用的管柱而言，可列舉Protein A管柱、Protein G管柱。例如就使用Protein A管柱的管柱而言，可列舉Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(GE Healthcare公司)等。
又使用將抗原固定化的擔體，利用對抗原的結合性而純化抗體亦為可能的。
本發明所使用的抗CD98抗體係只要可與CD98重鏈結合的抗體，則無特別限定，但較佳為下列抗體：(1)具有藉由與CD98重鏈結合而內在化至CD98表現細胞中的特性的抗體；(2)CD98為人類CD98的上述(1)記載之抗體或該抗體；(3)具有序列識別號19記載之胺基酸序列所構成的CDRH1、序列識別號20記載之胺基酸序列所構成的CDRH2、及序列識別號21記載之胺基酸序列所構成的CDRH3作為抗體之重鏈中的CDR，以及具有序列識別號22記載之胺基酸序列所構成的CDRL1、序列識別號23記載之胺基酸序列所構成的CDRL2、及、序列識別號24記載之胺基酸序列所構成的CDRL3作為抗體之輕鏈中的CDR的上述(1)或(2)記載之抗體；(4)恆定區為來自人類恆定區的上述(1)~(3)中任1項記載之抗體； (5)經人類化的上述(1)~(4)中任1項記載之抗體；(6)如上述(5)記載之抗體，抗體之重鏈之可變區係由選自包含下列群組的胺基酸序列所構成
(a)序列識別號12中的胺基酸編號20~135記載之胺基酸序列、(b)序列識別號14中的胺基酸編號20~135記載之胺基酸序列、(c)相對於(a)或(b)之序列，至少具有95%以上之相同性的胺基酸序列、及(d)選自於(a)或(b)之序列具有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列所構成的群組的胺基酸序列；抗體之輕鏈之可變區係由選自包含下列群組的胺基酸序列所構成
(e)序列識別號16中的胺基酸編號21~135記載之胺基酸序列、(f)序列識別號18中的胺基酸編號21~135記載之胺基酸序列、(g)相對於(e)或(f)之序列，至少具有95%以上之相同性的胺基酸序列、及(h)於(e)或(f)之序列，具有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列；(7)如上述(6)記載之抗體，抗體之重鏈之可變區及抗體之輕鏈之可變區的組合為選自包含下列的組合： 序列識別號12中的胺基酸編號20~135記載之胺基酸序列所構成的重鏈之可變區及序列識別號16中的胺基酸編號21~135記載之胺基酸序列所構成的輕鏈之可變區之組合、序列識別號12中的胺基酸編號20~135記載之胺基酸序列所構成的重鏈之可變區及序列識別號18中的胺基酸編號21~135記載之胺基酸序列所構成的輕鏈之可變區之組合、序列識別號14中的胺基酸編號20~135記載之胺基酸序列所構成的重鏈之可變區及序列識別號16中的胺基酸編號21~135記載之胺基酸序列所構成的輕鏈之可變區之組合、及序列識別號14中的胺基酸編號20~135記載之胺基酸序列所構成的重鏈之可變區及序列識別號18中的胺基酸編號21~135記載之胺基酸序列所構成的輕鏈之可變區之組合；(8)如上述(6)記載之抗體，抗體之重鏈之可變區及抗體之輕鏈之可變區的組合為下列的組合：序列識別號12中的胺基酸編號20~135記載之胺基酸序列所構成的重鏈之可變區及序列識別號16中的胺基酸編號21~135記載之胺基酸序列所構成的輕鏈之可變區之組合、序列識別號12中的胺基酸編號20~135記載之胺基酸序列所構成的重鏈之可變區及序列識別號18中的胺基酸編號21~135記載之胺基酸序列所構成的輕鏈之可變區之組合、或 序列識別號14中的胺基酸編號20~135記載之胺基酸序列所構成的重鏈之可變區及序列識別號18中的胺基酸編號21~135記載之胺基酸序列所構成的輕鏈之可變區之組合；(9)如上述(6)記載之抗體，重鏈及輕鏈之組合為選自包含下列的組合：序列識別號12中的胺基酸編號20~465記載之胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號16中的胺基酸編號21~240記載之胺基酸序列所構成的輕鏈之組合、序列識別號12中的胺基酸編號20~465記載之胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號18中的胺基酸編號21~240記載之胺基酸序列所構成的輕鏈之組合、序列識別號14中的胺基酸編號20~465記載之胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號16中的胺基酸編號21~240記載之胺基酸序列所構成的輕鏈之組合、及、序列識別號14中的胺基酸編號20~465記載之胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號18中的胺基酸編號21~240記載之胺基酸序列所構成的輕鏈之組合；(10)如上述(6)記載之抗體，重鏈及輕鏈之組合為下列的組合：序列識別號12中的胺基酸編號20~465記載之胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號16中的胺基酸編號21~240記載之胺基酸序列所構成的輕鏈之組合、序列識別號12中的胺基酸編號20~465記載之胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號18中的胺基酸編號21~240記載之胺基酸序列所構成的輕鏈之組合、或 序列識別號14中的胺基酸編號20~465記載之胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號18中的胺基酸編號21~240記載之胺基酸序列所構成的輕鏈之組合；或者(11)一種抗體，其藉由下列抗體之製造方法而獲得，該方法包含培養藉由含有編碼上述(1)~(10)中任1項記載之抗體的多核苷酸的表現載體所轉形的宿主細胞的步驟及自該步驟所獲得的培養物採取目的抗體的步驟。
(藥物)
本發明所使用的藥物係下式所表示的喜樹鹼衍生物之依喜替康((1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4'：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮)：
依喜替康雖具有優異的抗腫瘤活性，但尚未 作為抗腫瘤藥被市售。依喜替康係可以周知方法而容易地取得，可較佳使用1位之胺基作為結合連接物結構之部位。又，依喜替康亦有以連接物之一部份結合的狀態下於腫瘤細胞內游離的情形，但即使為如此狀態亦為發揮優異抗腫瘤效果的優異化合物。
已知依喜替康因具有喜樹鹼結構的緣故，於 酸性水性媒體中(例如，pH3左右)平衡偏向有內酯環形成的結構(閉環體)，另一方面，於鹼性水性媒體中(例如，pH10左右)平衡偏向內酯環為開環的結構(開環體)。導入對應如此閉環結構及開環結構的依喜替康殘基的藥物結合物亦被期待有同等之抗腫瘤效果，不用說，任一者之狀態亦被包含於本發明之範圍。
於抗體-藥物結合物，對抗體1分子之藥物 之結合數係影響其有效性、安全性的重要因子。抗體-藥物結合物之製造係藥物之結合數成為一定的數目的方式，規定使反應的原料．試藥之使用量等之反應條件而實施，但與低分子化合物之化學反應不同，通常為呈相異數目的藥物結合之混合物而獲得。對抗體1分子之藥物結合數係標記平均值，即，被特定為平均藥物結合數。 在本發明中，在不違反原則下，亦即，除了表示具有不同藥物結合數的抗體-藥物結合物混合物中所含之具有特定藥物結合數的抗體-藥物結合物的情形以外，藥物之結合數係意指平均值。依喜替康對抗體分子之結合數係可控制，就每1抗體之藥物平均結合數而言，可使1~10 個左右的依喜替康結合，但較佳為2~8個，更佳為3~8個。又，若為本發明所屬技術領域中具通常知識者，則可自後述之實施例之記載，設計使必要數目的藥物結合於抗體的反應，可取得控制依喜替康之結合數的抗體-藥物結合物。
(連接物)
本發明所使用的連接物係-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-、-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-、或-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
之結構所示的連接物，但為選自此等之任1種之連接物即可。此等中，-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
為特佳。又其中之「-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-」係具有下式所示的結構：
此部分結構中的3位係對抗CD98抗體之結 合部位。於此3位之與該抗體之結合，其特徵為形成硫醚而鍵結。此結構部分之1位之氮原子係與此結構所含的連接物內存在的亞甲基之碳原子結合。即，抗體與連接物之結合部分係下式所示：
(式中，「抗體-S-」係來自抗體，n1為2或5)。
「GGFG」係由甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸所構成的四胜肽。
本發明所使用的連接物係可依據例如，後述實施例記載的方法來調製。
(抗體-藥物結合物)
本發明之抗體-藥物結合物係可藉由對於還原抗CD98抗體而將其鉸鏈區(hinge region)之雙硫鍵變換為氫硫基的抗體，使以實施例記載之方法所獲得的於末端具有順丁烯二醯亞胺基的下列所示藥物-連接物中間體化合物之任一者反應而製造。
具有氫硫基的抗CD98抗體係可以本發明所屬技術領域中具通常知識者周知之方法而獲得(Hermanson,G.T,Bioconjugate Techniques,pp.56-136,pp.456-493,Academic Press(1996))。例如，使Traut’s試藥對抗體之胺基作用的方法；使N-琥珀醯亞胺基S-乙醯基硫烷酸酯類對抗體之胺基作用後，使羥基胺作用的方法；使N-琥珀醯亞胺基3-(吡啶二硫基)丙酸酯作用後，使還原劑作用的方法；使二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇、參(2-羧基乙基) 膦鹽酸鹽(TCEP)等之還原劑對抗體作用而將抗體內鉸鏈區之雙硫鍵還原而使氫硫基生成的方法等，但未限定於此等。
具體而言，將TCEP作為還原劑，對抗體內鉸鏈區雙硫鍵每1個使用0.3~3莫耳當量，於含螯合劑的緩衝液中，使與抗體反應，而可獲得抗體內鉸鏈區雙硫鍵被部分或完全還原的抗體。
就螯合劑而言，例如，可列舉乙二胺四乙酸(EDTA)或二乙三胺5乙酸(DTPA)等。此等以1~20mM之濃度使用為宜。
就緩衝液而言，可使用磷酸鈉或硼酸鈉、乙酸鈉溶液等。具體而言，抗體係於4~37℃使與TCEP反應1~4小時，而可獲得具有部分或完全被還原的氫硫基的抗體。
具有此氫硫基的抗體每1個，使用2至20莫耳當量之藥物-連接物中間體化合物，可製造抗體每1個有2個至8個之藥物結合的抗體-藥物結合物。具體而言，於含有具氫硫基的抗體的緩衝液中，添加使藥物-連接物中間體化合物溶解的溶液而使反應為宜。其中就緩衝液而言，使用乙酸鈉溶液、磷酸鈉或硼酸鈉等為宜。反應時之pH係5至9，更佳為於pH7左右使反應為宜。就使藥物-連接物中間體化合物溶解的溶劑而言，可使用二甲基亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMA)、N-甲基-2-吡啶酮(NMP)等之有機溶劑。
使藥物-連接物中間體化合物溶解的有機溶劑溶液係於含具有氫硫基的抗體的緩衝液中添加1至20%v/v而使反應為宜。反應溫度係0至37℃，較佳為10至25℃，反應時間係0.5至2小時。反應係可將未反應之藥物-連接物中間體化合物之反應性藉由含有硫醇的試藥而使失活而結束。含有硫醇的試藥係例如，半胱胺酸或N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)。更具體而言，相對於使用的藥物-連接物中間體化合物，添加1至2莫耳當量之NAC，並藉由於室溫培養10至30分鐘而可結束反應。
製造的抗體-藥物結合物係藉由以下之共通操作而進行濃縮、緩衝液交換、純化、抗體濃度及抗體每一分子的藥物平均結合數之測定，可進行抗體-藥物結合物之鑑定。
1.抗體或抗體-藥物結合物水溶液之濃縮
於Amicon Ultra(50,000 MWCO，Millipore Corporation)之容器內置入抗體或抗體-藥物結合物溶液，以使用離心機(Allegra X-15R，Beckman Coulter，Inc.)的離心操作(於2000G~3800G離心5~20分鐘)，將抗體或抗體-藥物結合物溶液濃縮。
2.抗體之濃度測定
使用UV測定器(Nanodrop 1000，Thermo Fisher Scientific Inc.)，依據製造商規定之方法，進行抗體濃度之測定。此時，各抗體使用相異的280nm吸光係數(1.3mLmg-1cm-1~1.8mLmg-1cm-1)。
3.抗體之緩衝液交換
將使用Sephadex G-25擔體的NAP-25管柱(Cat.No.17-0852-02，GE Healthcare Japan Corporation)，依據製造商規定之方法，以含氯化鈉(137mM)及乙二胺四乙酸(EDTA，5mM)的磷酸緩衝液(10mM，pH6.0；本說明書中有稱為「PBS6.0/EDTA」的情形)使平衡化。對此NAP-25管柱每一根，放置抗體水溶液2.5mL後，分取以PBS6.0/EDTA3.5mL溶出的劃分(3.5mL)。此劃分藉由共通操作A而濃縮，使用共通操作B而進行抗體濃度之測定後，使用PBS6.0/EDTA而調整抗體濃度為10mg/mL。
4.抗體-藥物結合物之純化
以含山梨糖醇(5%)的乙酸緩衝液(10mM、pH5.5；於本說明書有稱為「ABS」的情形)將NAP-25管柱平衡化。於此NAP-25管柱，置入抗體-藥物結合物反應水溶液(2.5mL)，藉由製造商規定量之緩衝液使溶出，分取抗體劃份。將此分取劃份再次置入NAP-25管柱，以緩衝液使溶出的膠體過濾純化操作重複進行共計2~3次，獲得去除未結合之藥物連接物、低分子化合物(參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)及二甲基亞碸)的抗體-藥物結合物。
5.抗體-藥物結合物中的抗體濃度及抗體每一分子之藥物平均結合數之測定(UV法)
抗體-藥物結合物中的結合藥物濃度係可藉由測定抗體-藥物結合物水溶液之280nm及370nm之二波長中的UV吸光度後，進行下述之計算而算出。
因某波長中的全吸光度係相等於系統內存在的全部的吸收化學物種之吸光度之和(吸光度之加成性)，故於抗體與藥物之結合前後，假設抗體及藥物之莫耳吸光係數未變化時，抗體-藥物結合物中的抗體濃度及藥物濃度係如下述之關係式所示。
A280=AD,280+AA,280=εD,280CD+εA,280CA 式(1)
A370=AD,370+AA,370=εD,370CD+εA,370CA 式(2)
其中，A280表示280nm中的抗體-藥物結合物水溶液之吸光度，A370表示370nm中的抗體-藥物結合物水溶液之吸光度，AA,280表示280nm中的抗體之吸光度，AA,370表示370nm中的抗體之吸光度，AD,280表示280nm中的結合物前驅物之吸光度，AD,370表示370nm中的結合物前驅物之吸光度，εA,280表示280nm中的抗體之莫耳吸光係數，εA,370表示370nm中的抗體之莫耳吸光係數，εD,280表示280nm中的結合物前驅物之莫耳吸光係數，εD,370表示370nm中的結合物前驅物之莫耳吸光係數，CA表示抗體-藥物結合物中的抗體濃度，CD表示抗體-藥物結合物中的藥物濃度。
其中，εA,280、εA,370、εD,280、εD,370係使用事先準備的值(計算推定值或由化合物之UV測定所獲得的實測值)。例如，εA,280係自抗體之胺基酸序列，可藉由已知之計算方法(Protein Science,1995,vol.4,2411-2423)加以推定。εA,370係通常為零。εD,280及εD,370係可藉由測定使用的結合物前驅物溶解於某莫耳濃度的溶液之吸光度，藉由朗伯-比爾定律(Lambert-Beer law)(吸光度=莫 耳濃度×莫耳吸光係數×胞光徑長)而獲得。測定抗體-藥物結合物水溶液之A280及A370，藉由將此等之值代入式(I)及(II)而解出聯立方程式，可求得CA及CD。再者，藉由以CA除CD，可求得每1抗體之藥物平均結合數。
6.抗體-藥物結合物中的抗體每一分子之藥物平均結合數之測定(RPC法)
抗體-藥物結合物中的抗體每一分子之藥物平均結合數係除了前述之UV法外，亦可藉由以下之使用逆相色層分析(ReversedPhaseChromatography(RPC))法的高速液體色層分析(HPLC)分析而求得。
[6-1.HPLC分析用樣品之調製(抗體-藥物結合物之還原)]
將抗體-藥物結合物溶液(約1mg/mL、60μL)與二硫蘇糖醇(DTT)水溶液(100mM、15μL)混合。將混合物於37℃培育30分鐘，將切斷抗體-藥物結合物之L鏈及H鏈間的雙硫鍵的樣品用於HPLC分析。
[6-2.HPLC分析]
HPLC分析以下述之測定條件進行。
HPLC系統：Agilent 1290 HPLC系統(Agilent Technologies)
檢測器：紫外吸光度計(測定波長：280nm)
管柱：PLRP-S(2.1×50mm、8μm、1000Å；Agilent Technologies、P/NPL1912-1802)
管柱溫度：80℃
移動相A：0.04%三氟乙酸(TFA)水溶液
移動相B：含0.04%TFA的乙腈溶液
梯度程式：29%-36%(0分鐘-12.5分鐘)、36%-42%(12.5-15分鐘)、42%-29%(15分鐘-15.1分鐘)、29%-29%(15.1分鐘-25分鐘)
樣品注入量：15μL
[6-3.資料解析]
[6-3-1]相對於未結合藥物之抗體之L鏈(L0)及H鏈(H0)，藥物結合的L鏈(藥物有一個結合的L鏈：L1)及H鏈(藥物有一個結合的H鏈：H1、藥物有二個結合的H鏈：H2、藥物有三個結合的H鏈：H3)係與結合的藥物數成比例地疏水性增加而保持時間變大，故以L0、L1、H0、H1、H2、H3之順序被溶出。藉由L0及H0之保持時間比較，檢出波峰可被分配於L0、L1、H0、H1、H2、H3之任一者。
[6-3-2]因於藥物連接物有UV吸收，因應藥物連接物之結合數，使用L鏈、H鏈及藥物連接物之莫耳吸光係數而依據下式進行波峰面積值之補正。
其中，各抗體中的L鏈及H鏈之莫耳吸光係數(280nm)係可藉由已知之計算方法(Protein Science, 1995,vol.4,2411-2423)，使用自各抗體之L鏈及H鏈之胺基酸序列所推定的值。又，藥物連接物之莫耳吸光係數(280nm)係可使用使各藥物連接物以巰基乙醇或N-乙醯基半胱胺酸反應，將順丁烯二醯亞胺基變換為琥珀醯亞胺硫醚的化合物之實測之莫耳吸光係數(280nm)。
[6-3-3]依據下式計算相對於波峰面積補正值合計之各鏈波峰面積比(%)。
A Li ,A Hi ：L i ,H i 各波峰面積補正值
[6-3-4]依據下式計算抗體-藥物結合物中的抗體每一分子之藥物平均結合數。
藥物平均結合數=(L0波峰面積比×0+L0波峰面積比×1+H0波峰面積比×0+H1波峰面積比×1+H2波峰面積比×2+H3波峰面積比×3)/100×2
本發明之抗體-藥物結合物係於腫瘤細胞內移動後，連接物部分被切斷，NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、NH2-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)、或NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)於腫瘤細胞內游離。其中，「-(NH-DX)」係下式所表示：
1位之胺基之氮原子與連接物之羰基結合。
又，NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)的情形，已確認因同一分子內具有的胺縮醛結構不安定，進一步自體分解而有HO-CH2-C(=O)-(NH-DX)游離。此等化合物亦可較佳使用作為本發明之抗體-藥物結合物之製造中間體。
本發明之抗體-藥物結合物係有藉由放置於大氣中、或進行再結晶、純化操作，而吸收水分、或有吸附水附著等，而成為水合物的情形，如此含水的化合物或藥理學上可容許的鹽亦包含於本發明。
本發明之抗體-藥物結合物具有胺基等之鹼性基的情形，依所欲可形成藥理學上可容許的酸加成鹽。就如此酸加成鹽而言，例如可列舉氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽等之鹵化氫酸鹽；硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等之無機酸鹽；甲烷磺酸鹽、三氟甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽等之低級鏈烷磺酸鹽；苯磺酸鹽、p-甲苯磺酸鹽等之芳基磺酸鹽；甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、蘋果酸鹽、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽等之有機酸鹽；或鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽等之胺基酸鹽等。
本發明之抗體-藥物結合物具有羧基等之酸性基的情，依所欲可形成藥理學上可容許的鹼加成鹽。就如此的鹼加成鹽而言，例如可列舉鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等之鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等之鹼土類金屬鹽；銨鹽等之無機鹽；二苄基胺鹽、啉鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、伸乙基二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺(glucamine)鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、環己基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苄基伸乙基二胺鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-N-(2-苯基乙氧基)胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷鹽等之有機胺鹽等。
本發明又可包含構成抗體-藥物結合物的原 子之1個以上經其原子之同位素取代的抗體-藥物結合物。同位素係存有放射性同位素及安定同位素之2種類，就同位素之例而言，例如，可列舉氫之同位素(2H及3H)、碳之同位素(11C、13C及14C)、氮之同位素(13N 及15N)、氧之同位素(15O、17O及18O)、氟之同位素(18F)等。含有經同位素標識的抗體-藥物結合物的組成物係有用於作為例如，治療劑、預防劑、研究試藥、分析試藥、診斷劑、活體內影像診斷劑等。經同位素標識的抗體-藥物結合物、及經同位素標識的抗體-藥物結合物之任意比率的混合物亦全部包含於本發明。經同位素標識的抗體-藥物結合物係可藉由該領域周知之方法，例如，藉由使用經同位素標識的原料替代後述的本發明之製造方法中的原料，可加以製造。
本發明之抗體-藥物結合物因對癌細胞顯示 細胞傷害活性，故可使用作為抗癌症之治療及/或預防用的醫藥組成物之有效成分。
即本發明之抗CD98抗體-藥物結合物係可選擇作為癌治療之主要治療法的化學療法用之藥劑而使用，就其結果而言，可使癌細胞之成長遲緩、抑制增殖、進而破壞癌細胞。藉由此等，於癌患者，可達成解除癌所致的症狀、QOL之改善，而達成保持癌患者之生命的治療效果。即使未達到癌細胞之破壞的情形，亦可藉由癌細胞之增殖之抑制或控制，而於癌患者達成更高QOL的同時，可達成更長期之生存。
於如此藥物療法之以藥物單獨的使用之外，於輔助療法亦可作為與其他療法組合的藥劑而使用，可與外科手術、放射線療法、荷爾蒙療法等組合。再者，亦可作為新輔助療法(neoadjuvant therapy)中的藥物療法之藥劑使用。
如以上的治療性使用之外，壓抑微細轉移癌細胞之增殖，進一步亦可期待破壞的效果。尤其於原發性之癌細胞，CD98之表現被確認時，藉由投予本發明之抗CD98抗體-藥物結合物而可期待癌轉移之抑制、預防效果。例如，可期待轉移過程中抑制、破壞體液中的癌細胞的效果、對剛著床於任一組織之後之微細癌細胞的抑制、破壞等之效果。據此，尤其可期待於外科的癌去除後之癌轉移之抑制、預防效果。
本發明之抗CD98抗體-藥物結合物對於患者除了作為全身療法而投予之外，可於癌組織局部投予而期待治療效果。
就癌之種類而言，可列舉肺癌、腎癌、尿道 上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、淋巴瘤、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤等。但只要為來自表現CD98的癌細胞的癌則未限定於此等。
本發明所使用的CD98抗體或本發明之抗體 -藥物結合物係可使用作為用以治療自體免疫疾病之醫藥組成物、或用以抑制對移植的排斥反應之醫藥組成物之有效成分。
含有本發明之抗體-藥物結合物的醫藥組成 物係於被投予至哺乳類動物(例如，人類、馬、牛、豬等，較佳為人類)的情形，可全身性或局部性地被投予，較佳為非經口投予。
就非經口之投予路徑而言，可列舉皮內、肌肉內、腹腔內、靜脈內及皮下之路徑，但未限定於此等。就投予方法方法而言，例如，可列舉注入、團式注射等，但較佳為注入。
本發明之醫藥組成物可因應投予方法而選擇適當形態，藉由通常使用的各種製劑之調製法而加以調製。
例如，可混合本發明之抗體-藥物結合物、與E.W.Martin所致的「Remington’s Pharmaceutical Sciences」等記載的滅菌液體(例如，水及油(包含石油、動物、植物、或合成起源之油(例如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等)))、食鹽水溶液、右旋葡萄糖水溶液、甘油水溶液等之溶劑、濕潤劑、乳化劑、pH緩衝化劑等之添加劑等而調製本發明之醫藥組成物。
本發明之醫藥組成物又亦可含有可溶化劑、用以和緩注射部位的疼痛的局部麻酔劑(例如，利卡多因(lignocaine))等。本發明之醫藥組成物亦可以有效成分與溶劑等被置入各別容器的態樣被供給。又，藉由注入本發明之醫藥組成物而投予的情形，例如，可以含有效成分及滅菌之製藥等級的水或食鹽水的注入瓶而被投予。本發明之醫藥組成物經注射被投予的情形，可於投予前將有效成分與注射用滅菌水或食鹽水混合而被投予。
本發明之醫藥組成物係可含有抗CD98抗體-藥物結合物及至少一種之此以外之癌治療劑。本發明之抗體-藥物結合物亦可與其他之癌治療劑共同投予，據此 可使抗癌效果增強。以如此目的使用的其他之抗癌劑可與抗體-藥物結合物同時、各別、或連續被投予至個體，亦可變換各自之投予間隔來投予。就如此癌治療劑而言，可列舉卡鉑定(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、吉西他濱(gemcitabine)、愛萊諾迪肯(irinotecan)(CPT-11)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、蕾莎瓦(sorafenib)、長春鹼(vinblastine)、國際公開第WO2003/038043號小冊記載之藥劑，再者LH-RH類似物(亮丙瑞林(leuprorelin)、戈舍瑞林(goserelin)等)、磷酸雌二醇氮芥(estramustine phosphate)、雌激素(estrogen)拮抗藥(他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)等)、芳香環轉化酵素(aromatase)阻礙劑(阿那曲唑(anastrozole)、利妥唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)等)等，但只要為具有抗腫瘤活性的藥劑則未限定於此等。
本發明之醫藥組成物亦可呈冷凍乾燥製劑或 液狀製劑被提供。呈冷凍乾燥製劑被提供的情形，可為含有於此領域使用的適當製劑添加物的製劑。又於液狀製劑亦同樣地，可為含有此領域使用的適當製劑添加物的製劑。
本發明之醫藥組成物之組成及有效成分之濃 度亦依投予方法而變化，但本發明之醫藥組成物中所含的抗CD98抗體-藥物結合物，於抗體-藥物結合物之對抗原的親和性，即，對抗原的解離常數(Kd值)之點，親和性越高(Kd值越低)，即使少量之投予量亦可使藥效發 揮。據此，於抗體-藥物結合物之投予量之決定時，亦可基於抗體-藥物結合物與抗原之親和性之狀況而設定投予量。將本發明之抗體-藥物結合物對人類投予之際，例如，可將約0.001~100mg/kg以1次或以1~180日1次之間隔作複數次投予。
藉由以下所示實施例而具體說明本發明，但 本發明並未限定於此等例。又，此等在任何的意義上皆未被限定解釋。又，於本說明書，未特別記載之試藥、溶劑及起始材料係可自市售之供給源容易地取得。
[實施例] (實施例1)單株抗體製作及抗體篩選 (1-1)免疫
使用4~6週齡之BALB/cAnNCrlCrlj小鼠(日本Charles River公司)。於第0日、第7日、第15日及第24日，將以Versene(Life Technologies公司)剝離的5×106個之MCF7細胞(ATCCHTB-22)懸浮於PBS，並投予至背部皮下。於第31日將相同細胞以5×106個靜脈投予，於同日採取脾臓而使用於融合瘤製作。
(1-2)融合瘤之製作
將脾臓細胞與小鼠骨髓瘤P3X63Ag8U.1細胞(ATCC CRL-1597)，使用PEG4000(IBL公司)而製作細胞融合的融合瘤。其結果，自MCF7細胞免疫小鼠建立1760個選殖株之融合瘤。使用獲得的融合瘤培養上清液而進行抗體產生融合瘤之CDC分析所致的篩選。
(1-3)融合瘤之篩選(CDC分析)
使用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI培養基(Life Technologies公司)將MCF7細胞稀釋成5000個細胞/80μL，以80μL/孔添加於96孔盤，並培養一晚。將融合瘤培養上清液以20μL/孔添加於接種細胞的盤中，並於4℃靜置1小時。於冰上，於兔子補體之稀釋凍結乾燥品(Cedarlane公司)中每1瓶添加1mL之滅菌水。靜置1分鐘、混合後，與19mL之0.1%BSA/RPMI 1640培養基(BSA Sigma公司)混合。添加融合瘤培養上清液的盤中以20μL/孔添加相同補體稀釋液，並於37℃進行反應1小時。
將平盤於室溫放置30分鐘，而回到室溫。將CellTiter-Glo試藥(Promega公司)添加120μL於各孔，並於室溫反應10分鐘。以平盤讀取器(ARVO HTS Prekin Elmer公司)測定發光量。發光量少的孔判斷為誘導補體依賴性的細胞死亡。選擇產生如此誘導補體依賴性的細胞死亡的培養上清液的融合瘤。其結果，獲得15個選殖株的篩選陽性融合瘤選殖株。
(實施例2)自融合瘤之抗體調製
於將姥鮫烷(Pristane；2,6,10,14-四甲基十五烷；0.5ml)腹腔內投予並事先飼育2週的8~10週齡小鼠或裸鼠(BALB/c裸鼠、雌、日本CLEA公司)，腹腔內注射將實施例1所獲得的單株抗體產生融合瘤1~2×106個細胞懸浮於PBS，於腹腔內注射0.5mL。經10~21日後，於使融合瘤腹水癌化後採取腹水。將獲得的腹水離心分 離而去除固體成分後，添加2倍以上之PBS後，進行Mab Select Sure HiTrap 5ml管柱(GE Healthcare LifeSciences公司)所致的純化，回收於中性區域與管柱結合的IgG劃份，作為純化單株抗體。
(實施例3)融合瘤產生的抗體所結合的抗原之鑑定 (3-1)結合特異性 (3-1-1)抗原基因表現細胞之調整
編碼CD98的SLC3A2基因表現載體使用市售之SLC3A2基因選殖株(IOH-4673、Life Technologies公司)及Gateway表現載體pDEST40(Life Technologies公司)而製作。
將NIH-3T3細胞(ATCC CRL-1658)於含有10%胎牛血清(FBS)之RPMI培養基(Life Technologies公司)中調整成為1×105個細胞/ml，使用FUGENE6(Roche Applied Science公司)將pcDNA-DEST40-SLC3A2轉染至NIH-3T3細胞，並於37℃、5%CO2之條件下進一步培養2晚。以同樣不含質體的FUGEN6處理的細胞作為CD98陰性對照組使用。經轉染的NIH-3T3細胞以胰蛋白酶處理，以含有10%FBS的RPMI將細胞洗淨後，懸浮於含有5%FBS的PBS。將獲得的細胞懸浮液使用於流動式細胞測量術解析。
(3-1-2)流動式細胞測量術解析
將3-1-1所調製的細胞懸浮液離心，去除上清液後，對轉染各載體的NIH-3T3細胞添加融合瘤培養上清液或純化抗體而懸浮，並於4℃靜置0.5~1小時。以 含有5%FBS的PBS洗淨2次後，添加以含有5%FBS的PBS稀釋400倍的Fluorescein-conjugated goat IgG fraction to mouse IgG(完整分子；ICN Pharmaceuticals公司、#55493)而懸浮，並於4℃靜置0.5~1小時。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，再懸浮於含有2μg/ml 7-胺基放線菌素D(Invitrogen(Molecular Probes)公司)的含有5%FBS的PBS，以流動式細胞測量儀(FC500：BeckmanCoulter公司)進行檢測。資料解析係以Flowjo(TreeStar公司)進行。7-胺基放線菌素D陽性之死細胞於閘口去除後，作成活細胞之FITC螢光強度之直方圖。相對於為陰性對照組之未導入質體的NIH-3T3細胞之螢光強度直方圖，將產生CD98表現NIH-3T3細胞之直方圖位移至強螢光強度側的樣品(融合瘤培養上清液或純化抗體)的融合瘤作為抗CD98抗體產生融合瘤而取得。將此融合瘤稱為CD98融合瘤M23，將CD98融合瘤M23產生的抗體稱為M23抗體或M23。
(3-2)抗原決定位之決定 (3-2-1)抗原基因表現細胞之調製
將安定地轉形整聯蛋白αv及整聯蛋白β3於HEK293細胞內的細胞株293α細胞以2.6×106細胞/皿(dish)的方式接種於塗布膠原蛋白的100mm皿(AGC TEC HNO GLASS公司製)，於含有10%FBS的DMEM培養基中，於37℃、5%CO2之條件下培養一晚。翌日，將一部分之序列替換為小鼠者的pcDNA3.1-FLAG-hCD98-mouse206-271、pcDNA3.1-FLAG-hCD98-mouse262-331、pcD NA3.1-FLAG-hCD98-mouse322-401、pcDNA3.1-FLAG-hCD98-mouse392-471、pcDNA3.1-FLAG-hCD98-mouse462-541、pcDNA3.1-FLAG-hCD98-mouse 532-631、為小鼠CD98表現載體的pGEM-T-mouse CD98，各自使用Lipo fectamine 2000轉染試劑導入293α細胞，並於37℃、5%CO2之條件下進一步培養一晚。翌日，將表現載體導入細胞以TrypLE Express(Life Technologies公司製)處理，以含有3% FBS的PBS將細胞洗淨後，懸浮於含有3% FBS的PBS。將獲得的細胞懸浮液使用於流動式細胞測量術解析。
(3-2-2)流動式細胞測量術解析
將3-2-1所調製的細胞懸浮液離心，去除上清液後，對2×105細胞之表現載體導入細胞，各自添加M23抗體、作為陽性對照組的小鼠中產生的單株ANTI-FLAG M2抗體、作為陰性對照組的小鼠IgG2A使成為10μg/mL而懸浮，並於4℃靜置15分鐘。以含有3% FBS的PBS洗淨1次後，添加以含有3% FBS的PBS稀釋500倍的抗-小鼠IgG FITC結合物而懸浮，並於4℃靜置20分鐘。以含有3% FBS的PBS洗淨後，再懸浮於含有3% FBS的PBS，以流動式細胞測量儀(BD FACSC ant II：BD Biosciences公司)進行檢測。資料解析係以Flowjo進行。作成FITC螢光強度之直方圖，為陰性對照組的小鼠IgG2A之螢光強度直方圖相對於未染色者並未位移，M23抗體之直方圖相對於表現載體非導入細胞，於表現載體導入細胞中位移於強螢光強度側的情 形，判斷為結合。其結果M23抗體係於pcDNA3.1-FLAG-hCD98-mouse206-271、pcDNA3.1-FLAG-hCD98-mouse262-331、pcDNA3.1-FLAG-hCD98-mouse322-401、pcDNA3.1-FLAG-hCD98-mouse392-471或pcDNA3.1-FLAG-hCD98-mouse532-631導入細胞為結合，於pcDNA3.1-FLAG-hCD98-mouse462-541導入細胞為未結合。據此，M23抗體係顯示序列表之序列識別號38所示的人類CD98之第462至541號之胺基酸序列中，辨識與小鼠CD98相異的序列(第13圖)。又，各抗原於細胞膜上表現者係使用陽性對照組之抗FLAG抗體而被確認(第14圖)，M23亦被確認未與小鼠CD98結合(第13圖)。
(實施例4)編碼M23抗體基因之可變區的cDNA之核苷酸序列的決定與嵌合M23抗體之製作 (4-1)編碼M23抗體基因之可變區的cDNA之核苷酸序列之決定 (4-1-1)自CD98融合瘤M23之mRNA之調製
為了放大含有M23抗體之可變區的cDNA，自CD98融合瘤M23使用mRNA單離套組(Roche applied science公司)而調製mRNA。
(4-1-2)cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成
cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)之合成係使用4-1-1所調製的mRNA之100ng與SMARTer RACE cDNA放大套組(CLONTECH公司)而實施。
(4-1-3)5’-RACE PCR所致的包含M23抗體之重鏈可變區的cDNA之放大與序列之決定
就將重鏈基因之可變區之cDNA以PCR放大用的引子而言，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMARTer RACE cDNA放大套組)、及具有5’-GGCATCCTAGAGTCACCGAGGAGCCAGTTG-3’(序列識別號25：引子mG2aVR1)之序列的寡核苷酸。UPM係使用附屬於SMARTer RACE cDNA放大套組(CLONTECH公司)者，mG2aVR1係由資料庫之小鼠重鏈(IgG2a)之恆定區的序列設計。
藉由此引子之組合、及將以4-1-2合成的cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模板的5’-RACE PCR，將含M23抗體之重鏈之可變區的cDNA放大。PCR係使用KOD-Plus-(TOYOBO公司)作為聚合酶，依據SMARTer RACE cDNA放大套組(CLONTECH公司)之手冊，以touchdown PCR程式來實施。
將以5’-RACE PCR放大的含有重鏈之可變區的cDNA，使用MinElute PCR純化套組(QIAGEN公司)而純化後，使用Zero Blunt TOPO PCR選殖套組(Invitrogen公司)作選殖，實施含選殖的重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列之序列分析。作為序列引子，使用具有自資料庫之小鼠重鏈之恆定區之序列設計的5’-GGCATCCTAGAGTCACCGAGGAGCCAGTTG-3’(序列識別號25：引子mG2aVR1)之序列的寡核苷酸、及NUP(Nested Universal Primer A：附屬於SMARTer RACE cDNA放大套組)。
序列分析係使用基因序列解析裝置(ABI PRISM 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems公司，或Applied Biosystems 3730xl Analyzer；Applied Biosystems公司)而實施，序列反應係使用GeneAmp 9700(Applied Biosystems公司)。
將編碼經決定的M23抗體之重鏈之可變區 的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號1，將胺基酸序列示於序列識別號2。
(4-1-4)5’-RACE PCR所致的含有M23抗體之輕鏈可變區的cDNA之放大與序列之決定
作為將M23抗體之輕鏈基因之可變區的cDNA以PCR放大用之引子，使用UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMARTer RACE cDNA放大套組)及具有5’-AGTCCAACTGTTCAGGACGCCATTTTGTCG-3’(序列識別號26：引子mKVR2)之序列的寡核苷酸。UPM係使用附屬於SMARTer RACE cDNA放大套組(CLONTECH公司)者，mKVR2係由資料庫的小鼠輕鏈之恆定區之序列所設計。
藉由此引子之組合、及將4-1-2所合成的cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作為模板的5’-RACE PCR，將含M23抗體之輕鏈之可變區的cDNA放大。
PCR係使用KOD-Plus-(TOYOBO公司)作為聚合酶，依據SMARTer RACE cDNA放大套組(CLONTECH公司)之手冊，以touchdown PCR程式來實施。
將以5’-RACE PCR放大的含有輕鏈之可變 區的cDNA，使用MinElute PCR純化套組(QIAGEN公司)而純化後，使用Zero Blunt TOPO PCR選殖套組(Invitrogen公司)作選殖，實施含經選殖的輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列之序列分析。作為序列引子，使用具有自資料庫之小鼠輕鏈之恆定區之序列設計的5’-AGTCCAACTGTTCAGGACGCCATTTTGTCG-3’(序列識別號26：引子mKVR2)之序列的寡核苷酸、及NUP(Nested Universal Primer A：附屬於SMARTer RACE cDNA放大套組)。
序列分析係使用基因序列解析裝置(ABI PRISM 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems公司，或Applied Biosystems 3730xl Analyzer；Applied Biosystems公司)而實施，序列反應係使用GeneAmp 9700(Applied Biosystems公司)。
將編碼經決定的M23抗體之輕鏈之可變區 的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號3，胺基酸序列示於序列識別號4。
(4-2)嵌合M23抗體之製作 (4-2-1)嵌合及人類化抗體輕鏈表現載體pCMA-LK之構築
將質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ(Invitrogen公司)以限制酶XbaI及PmeI消化所獲得的約5.4kb之片段、即含有序列識別號5所示編碼人類κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恆定區的核苷酸序列的DNA片段，使用 In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司)而結合，製作pcDNA3.3/LK。
將pcDNA3.3/LK作為模板，以下述引子組 進行PCR，將獲得的約3.8kb之片段磷酸化後藉由自我連接(self-ligation)而構築於CMV啟動子之下游具有訊息序列、選殖位、及人類κ鏈恆定區之嵌合及人類化抗體輕鏈表現載體pCMA-LK。
引子組
5’-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3’(序列識別號27：引子3.3-F1)
5’-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3’(序列識別號28：引子3.3-R1)
(4-2-2)嵌合及人類化抗體IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1之構築
使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司)將pCMA-LK以XbaI及PmeI消化而去除κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恆定區的DNA片段、與含有編碼序列識別號6所示人類重鏈分泌訊息序列及人類IgG1恆定區的核苷酸序列的DNA片段結合，構築於CMV啟動子之下游具有訊息序列、選殖位及人類IgG1重鏈恆定區的嵌合及人類化抗體IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1。
(4-2-3)嵌合M23抗體重鏈表現載體之構築
藉由將含有4-1-3所獲得的M23抗體之重鏈之可變區的cDNA作為模板，以KOD-Plus-(TOYOBO公 司)與下述之引子組將含有編碼重鏈之可變區的cDNA的DNA片段放大，使用In-Fusion HD PCR選殖套組(CLONTECH公司)，插入於將嵌合及人類化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1以限制酶BlpI切斷處，構築嵌合M23抗體重鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/cM23」。將嵌合M23抗體重鏈之核苷酸序列示於序列識別號7，將胺基酸序列示於序列識別號8。 序列識別號7之核苷酸序列及序列識別號8之胺基酸序列亦被記載於第1圖。
嵌合M23抗體重鏈用引子組
5’-CCAGATGGGTGCTGAGCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAG-3’(序列識別號29：引子M23H-F)
5’-GGGCCCTTGGTGGAGGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCCTTGGCC-3’(序列識別號30：引子M23H-R)
(4-2-4)嵌合M23抗體輕鏈表現載體之構築
藉由將含有4-1-4所獲得的M23抗體之輕鏈之可變區的cDNA作為模板，以KOD-Plus-(TOYOBO公司)與下述之引子組將含有編碼輕鏈之可變區的cDNA的DAN片段放大，使用In-Fusion HD PCR選殖套組(CLONTECH公司)，插入於將嵌合及人類化IgG1型輕鏈表現泛用載體pCMA-LK以限制酶BsiWI切斷處，構築嵌合M23抗體之輕鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-LK/cM23」。將嵌合M23抗體之輕鏈之核苷酸序列示於序列識別號9，將胺基酸序列示於序列識別號10。序列識別號9之核苷酸序列及序列識別號10之胺基酸序列亦被記載於第2圖。
嵌合M23抗體輕鏈用引子組
5’-ATCTCCGGCGCGTACGGCGACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCC-3’(序列識別號31：引子M23L-F)
5’-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC-3’(序列識別號32：引子M23L-R)
(4-2-5)嵌合M23抗體之生產
依據手冊，繼代培養FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)。將對數增殖期之1.2×109個之FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)接種於3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING公司)，以FreeStyle 293 expression medium(Invitrogen公司)稀釋而調製為1.0×106細胞/ml後，於37℃、8%CO2培養箱內，以90rpm震盪培養一小時。將聚伸乙亞胺(Polyscience公司、#24765)3.6mg溶解於Opti-Pro SFM(Invitrogen公司)20ml，接著使用PureLink HiPure Plasmid套組(Invitrogen公司)而調製的輕鏈表現載體(0.8mg)及重鏈表現載體(0.4mg)添加於20ml之Opti-Pro SFM(Invitrogen公司)。於聚伸乙亞胺/Opti-Pro SFM混合液20ml中，添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液20ml而緩緩攪拌，再放置5分鐘後，添加於FreeStyle 293F細胞。於37℃、8%CO2培養箱，以90rpm震盪培養7日而獲得的培養上清液，以Disposable Capsule Filter(ADVANTEC #CCS-045-E1H)過濾。將藉由pCMA-G1/cM23與pCMA-LK/cM23之組合而取得的嵌合M23抗體命名為「cM23抗體」。
(4-2-6)cM23抗體之純化
自4-2-5所獲得的培養上清液，將抗體使用rProtein A親和性色層分析(4-6℃下)與陶瓷氫氧磷灰石(室溫下)而2階段純化。rProtein A親和性色層分析純化後與陶瓷氫氧磷灰石純化後之緩衝液取代步驟係於4~6℃下實施。最初，將培養上清液使用於經PBS平衡化的MabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience公司、HiTrap管柱)。培養上清液全部置入管柱後，以管柱容量2倍以上之PBS將管柱洗淨。其次，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)溶出，收集含有抗體的劃份。其劃份藉由透析(Thermo Scientific公司、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)而取代為PBS後，以5mM磷酸鈉/50mM MES/pH7.0之緩衝液將5倍稀釋的抗體溶液，施用於經5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0之緩衝液平衡化的陶瓷氫氧磷灰石管柱(日本BioRad、Bio-Scale CHT Type-I Hydroxyapatite Column)。實施氯化鈉所致的直線濃度梯度溶出，收集含抗體之劃分。將其劃分藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)，進行向HBSor(25mM組胺酸/5%山梨糖醇、pH6.0)之液取代。最後，以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分劃分子量UF10K，Sartorius公司，4℃)濃縮，作成IgG濃度調製為10mg/ml以上的純化樣品。
(實施例5)小鼠抗CD98單株抗體之人類化抗體之設計 (5-1)M23抗體之人類化變型之設計 (5-1-1)M23抗體之可變區之分子模擬(molecular modeling)
M23之可變區之分子模擬係藉由作為同源性 模擬(homology modeling)之周知方法(Methods in Enzymology,203,121-153(1991))而實行。將於蛋白質資料庫(Protein Data Bank)(Nuc.Acid Res.,35,D301-D303(2007))註冊的人類免疫球蛋白之可變區之1次序列(由X射線結晶結構衍生的三維結構係可能取得的)，與實施例4所決定的M23之可變區做比較。結果，1MJU係相對於M23抗體之重鏈之可變區，於同樣地框架中有缺損的抗體之中，以具有最高序列同源性而被選擇。又，3MBX係相對於M23抗體之輕鏈之可變區，以具有最高序列同源性被選擇。框架區之三維結構係可藉由組合對應M23抗體之重鏈及輕鏈的1MJU及3MBX之座標，獲得「框架模型(frame work model)」而被製作。 其次，於各自之CDR之代表的構形被併入框架模式。
最後，於能量的觀點，為了獲得有M23抗 體之可變區之可能性的分子模型，進行用以除去不利原子間接觸的能量計算。上述順序使用市售之蛋白質立體結構解析程式DiscoveryStudio(Accelrys公司)來進行。
(5-1-2)對人類化M23抗體的胺基酸序列之設計
人類化M23抗體之構築藉由作為CDR接枝(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86,10029-10033(1989))之周知方法而進行。受體抗體(acceptor antiboby)係基於框架區內之胺基酸同源性而被選擇。將M23抗體之框架區之序列，與抗體之胺基酸序列之Kabat資料庫(Nuc.Acid Res., 29,205-206(2001))全部的人類框架作比較，結果，HuMc3抗體起因於框架區之80%之序列同源性，而被選擇作為受體(acceptor)。將於HuMc3之框架區之胺基酸殘基，使與於M23抗體之胺基酸殘基並列，鑑定相異胺基酸被使用的位置。此等之殘基的位置係基於使用以上所構築的M23抗體之三維模型而被分析，而且受體上應被接枝的供體殘基係藉由Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86,10029-10033(1989))所給予的基準而被選擇。藉由將被選擇的幾個供體殘基移入受體抗體，如以下實施例記載的方式構築人類化M23抗體之序列。
(5-2)M23抗體重鏈之人類化 (5-2-1)hM23-H1型重鏈
將伴隨序列識別號8所示的cM23抗體重鏈之胺基酸編號24(麩醯胺酸)取代為纈胺酸，胺基酸編號30(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號31(纈胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號32(精胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號35(蘇胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號57(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號59(精胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號67(異白胺酸)取代為甲硫胺酸、胺基酸編號86(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號87(丙胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號89(白胺酸)取代為異白胺酸、胺基酸編號93(離胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號95(絲胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號101(麩醯胺酸)取代為麩胺酸、胺基酸編號106(蘇胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號108(天冬胺酸)取代為麩胺酸、胺基酸編號110(絲胺酸) 取代為蘇胺酸、胺基酸編號111(絲胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號114(苯丙胺酸)取代為酪胺酸、胺基酸編號135(丙胺酸)取代為絲胺酸的經設計的人類化M23抗體重鏈命名為「hM23-H1型重鏈」。
hM23-H1型重鏈之胺基酸序列係記載於序列 識別號12。序列識別號12之胺基酸序列之第1~19號之胺基殘基所構成的序列、第20~135號之胺基酸殘基所構成的序列、第136~465號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恆定區。編碼序列識別號12之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列識別號11。序列識別號11之核苷酸序列之第1~57號之核苷酸所構成的序列、第58~405號之核苷酸所構成的序列、第406~1395號之核苷酸所構成的序列係各自為編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恆定區序列。序列識別號11之核苷酸序列及序列識別號12之胺基酸序列亦記載於第3圖。
(5-2-2)hM23-H2型重鏈
將伴隨序列識別號8所示的cM23重鏈之胺基酸編號30(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號31(纈胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號32(精胺酸)取代為離胺酸、胺基酸編號35(蘇胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號57(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號59(精胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號67(異白胺酸)取代為甲硫胺酸、胺基酸編號89(白胺酸)取代為異白胺酸、胺基酸編號95(絲胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號101(麩醯胺酸)取 代為麩胺酸、胺基酸編號108(天冬胺酸)取代為麩胺酸、胺基酸編號110(絲胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號111(絲胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號114(苯丙胺酸)取代為酪胺酸、胺基酸編號135(丙胺酸)取代為絲胺酸的經設計的人類化M23抗體重鏈命名為「hM23-H2型重鏈」。
hM23-H2型重鏈之胺基酸序列係記載於序列 識別號14。序列識別號14之胺基酸序列之第1~19號之胺基殘基所構成的序列、第20~135號之胺基酸殘基所構成的序列、第136~465號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、重鏈可變區、重鏈恆定區。編碼序列識別號14之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列識別號13。序列識別號13之核苷酸序列之第1~57號之核苷酸所構成的序列、第58~405號之核苷酸所構成的序列、第406~1395號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、重鏈可變區序列、重鏈恆定區序列。序列識別號13之核苷酸序列及序列識別號14之胺基酸序列亦記載於第4圖。
(5-3)M23抗體輕鏈之人類化 (5-3-1)hM23-L1型輕鏈
將伴隨序列識別號10所示的cM23抗體輕鏈之胺基酸編號25(絲胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號29(絲胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號35(纈胺酸)取代為白胺酸、胺基酸編號38(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號39(纈胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號41(甲硫 胺酸)取代為異白胺酸、胺基酸編號42(蘇胺酸)取代為天冬醯胺、胺基酸編號69(絲胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號89(蘇胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號103(天冬醯胺)取代為絲胺酸、胺基酸編號104(纈胺酸)取代為白胺酸、胺基酸編號109(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號126(甘胺酸)取代為麩醯胺酸、胺基酸編號130(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號135(丙胺酸)取代為蘇胺酸的經設計的人類化M23抗體輕鏈，命名為「hM23-L1型輕鏈」。
hM23-L1型輕鏈之胺基酸序列記載於序列識 別號16。序列識別號16之胺基酸序列之第1~20號之胺基殘基所構成的序列、第21~135號之胺基酸殘基所構成的序列、第136~240號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恆定區。編碼序列識別號16之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列識別號15。序列識別號15之核苷酸序列之第1~60號之核苷酸所構成的序列、第61~405號之核苷酸所構成的序列、第406~720號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恆定區序列。序列識別號15之核苷酸序列及序列識別號16之胺基酸序列亦記載於第5圖。
(5-3-2)hM23-L2型輕鏈
將伴隨序列表之序列識別號10所示的cM23抗體輕鏈之胺基酸編號25(絲胺酸)取代為蘇胺酸、胺基酸編號29(絲胺酸)取代為天冬胺酸、胺基酸編號35(纈胺 酸)取代為白胺酸、胺基酸編號38(離胺酸)取代為精胺酸、胺基酸編號39(纈胺酸)取代為丙胺酸、胺基酸編號41(甲硫胺酸)取代為異白胺酸、胺基酸編號42(蘇胺酸)取代為天冬醯胺、胺基酸編號69(絲胺酸)取代為脯胺酸、胺基酸編號89(蘇胺酸)取代為絲胺酸、胺基酸編號103(天冬醯胺)取代為絲胺酸、胺基酸編號104(纈胺酸)取代為白胺酸、胺基酸編號109(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號130(白胺酸)取代為纈胺酸、胺基酸編號135(丙胺酸)取代為蘇胺酸的經設計的人類化M23抗體輕鏈，命名為「hM23-L2型輕鏈」。
hM23-L2型輕鏈之胺基酸序列係記載於序列 表之序列識別號18。序列識別號18之胺基酸序列之第1~20號之胺基殘基所構成的序列、第21~135號之胺基酸殘基所構成的序列、第136~240號之胺基酸殘基所構成的序列係各自相當於訊息序列、輕鏈可變區、輕鏈恆定區。編碼序列識別號18之胺基酸序列的核苷酸序列係記載於序列表之序列識別號17。序列識別號17之核苷酸序列之第1~60號之核苷酸所構成的序列、第61~405號之核苷酸所構成的序列、第406~720號之核苷酸所構成的序列係各自編碼訊息序列、輕鏈可變區序列、輕鏈恆定區序列。序列識別號17之核苷酸序列及序列識別號18之胺基酸序列亦記載於第6圖。
(實施例6)人類化M23抗體表現載體之構築與抗體之生產 (6-1)人類化M23抗體之重鏈表現載體之構築 (6-1-1)hM23-H1型重鏈表現載體之構築
合成包含序列識別號11所示hM23-H1型重鏈之核苷酸序列之核苷酸編號58~405所示的編碼hM23-H1型重鏈之可變區的DNA序列的DNA片段(核苷酸編號36~422)(GENEART公司，人工基因合成服務)。將合成的DNA片段作為模板，以KOD-Plus-(TOYOBO公司)及下述之引子組將含有編碼hM23-H1型重鏈之可變區的DNA序列的DNA片段放大，藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組(CLONTECH公司)，插入於嵌合及人類化抗體IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1以限制酶BlpI切斷處，而構築hM23-H1型重鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hM23-H1」。
引子組
5’-AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC-3’(序列識別號33：引子EG-Inf-F)
5’-GGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGC-3’(序列識別號34：引子EG1-Inf-R)
(6-1-2)hM23-H2型重鏈表現載體之構築
合成含有序列識別號13所示hM23-H2型重鏈之核苷酸序列之核苷酸編號58~405所示的編碼hM23-H2型重鏈之可變區的DNA序列的DNA片段(核苷酸編號36~422)(GENEART公司，人工基因合成服務)，以與6-1-1同樣之方法，構築hM23-H2型重鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-G1/hM23-H2」。
(6-2)人類化M23抗體之輕鏈表現載體之構築 (6-2-1)hM23-L1型輕鏈表現載體之構築
合成含序列識別號15所示hM23-L1型輕鏈之核苷酸序列之核苷酸編號61~405所示的編碼hM23-L1型輕鏈之可變區的DNA序列的DNA片段(核苷酸編號38~420)(GENEART公司，人工基因合成服務)。將合成的DNA片段作為模板，以KOD-Plus-(TOYOBO公司)及下述引子組，將含編碼hM23-L1型輕鏈之可變區的DNA序列的DNA片段放大，藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組(CLONTECH公司)，插入於將嵌合及人類化抗體輕鏈表現載體pCMA-LK以限制酶BsiWI切斷處，而構築hM23-L1型輕鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-LK/hM23-L1」。
引子組
5’-CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC-3’(序列識別號35：引子CM-LKF)
5’-GGAGGGGGCGGCCACCGTACG-3’(序列識別號36：引子KCL-Inf-R)
(6-2-2)hM23-L2型輕鏈表現載體之構築
合成含序列識別號17所示的hM23-L2型輕鏈之核苷酸序列之核苷酸編號61~405所示的編碼hM23-L2型輕鏈之可變區的DNA序列的DNA片段(核苷酸編號38~420)(GENEART公司，人工基因合成服務)，以與6-2-1同樣之方法，構築hM23-L2型輕鏈表現載體。將獲得的表現載體命名為「pCMA-LK/hM23-L2」。
(6-3)人類化M23抗體之生產與純化 (6-3-1)人類化M23抗體之生產
人類化M23抗體以與4-2-5同樣之方法生產。將藉由pCMA-G1/hM23-H1與pCMA-LK/hM23-L1之組合而取得的人類化M23抗體命名為「hM23-H1L1」，將藉由pCMA-G1/hM23-H1與pCMA-LK/hM23-L2之組合而取得的人類化M23抗體命名為「hM23-H1L2」，及將藉由pCMA-G1/hM23-H2與pCMA-LK/hM23-L2之組合而取得的人類化M23抗體命名為「hM23-H2L2」。
(6-3-2)人類化M23抗體之純化
自6-3-1所獲得的培養上清液，將抗體以與4-2-6同樣之方法加以純化。
(實施例7)hM23-H1L1 ADC(1)之製作
步驟1：(4-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4- 甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-4-側氧基丁基)胺甲酸三級丁酯
將4-(三級丁氧基羰基胺基)丁酸(0.237g、1.13mmoL)溶解於二氯甲烷(10mL)，添加N-羥基琥珀醯亞胺(0.130g、1.13mmoL)及1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(0.216g、1.13mmoL)，而攪拌1小時。將獲得的混合物滴加於添加依喜替康之甲磺酸鹽(0.500g、0.94mmoL)及三乙基胺(0.157mL、1.13mmoL)的N,N-二甲基甲醯胺溶液(10mL)，於室溫攪拌一日。減壓餾除溶劑，獲得的殘留物以矽膠管柱色層分析[氯仿~氯仿：甲醇=8：2(v/v)]純化，獲得標題化合物(0.595g、定量的)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：0.87(3H,t,J=7.2Hz),1.31(9H,s),1.58(1H,t,J=7.2Hz),1.66(2H,t,J=7.2Hz),1.89-1.82(2H,m),2.12-2.21(3H,m),2.39(3H,s),2.92(2H,t,J=6.5Hz),3.17(2H,s),5.16(1H,d,J=19.2Hz),5.24(1H,d,J=18.8Hz),5.42(2H,s),5.59-5.55(1H,m),6.53(1H,s),6.78(1H,t,J=6.3Hz),7.30(1H,s),7.79(1H,d,J=11.0Hz),8.40(1H,d,J=8.6Hz).
MS(APCI)m/z：621(M+H)+.
步驟2：4-胺基-N-[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]丁醯胺三氟乙酸鹽
將上述步驟1所獲得的化合物(0.388g、0.61mmoL)溶解於二氯甲烷(9mL)。添加三氟乙酸(9mL)並攪拌4小時。減壓餾除溶劑，獲得的殘留物以矽膠管柱色層分析 [氯仿~氯仿：甲醇：水=7：3：1(v/v/v)之分配有機層]純化，獲得標題化合物(0.343g、定量的)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：0.87(3H,t,J=9.4Hz),1.90-1.80(4H,m),2.15-2.13(2H,m),2.27(2H,t,J=7.0Hz),2.41(3H,s),2.87-2.82(2H,m),3.18(2H,dd,J=8.0,3.7Hz)5.15(1H,d,J=19.2Hz),5.26(1H,d,J=18.8Hz),5.43(2H,s),5.61-5.56(1H,m),6.57(1H,s),7.32(1H,s),7.72(3H,brs),7.82(1H,d,J=10.9Hz),8.55(1H,d,J=8.6Hz).
MS(APCI)m/z：521(M+H)+.
步驟3：N-(三級丁氧基羰基)甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-(4-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-4-側氧基丁基)甘胺酸醯胺
將N-(三級丁氧基羰基)甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基甘胺酸(0.081g、0.19mmoL)溶解於二氯甲烷(3mL)，添加N-羥基琥珀醯亞胺(0.021g、0.19moL)及1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(0.036g、0.19mmoL)並攪拌3.5小時。將獲得的混合物滴加於添加上述步驟2所獲得的化合物(0.080g、0.15mmoL)的N,N-二甲基甲醯胺溶液(1.5mL)，於室溫攪拌4小時。減壓餾除溶劑，獲得的殘留物以矽膠管柱色層分析[氯仿~氯仿：甲醇=8：2(v/v)]純化，獲得標題化合物(0.106g、73%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：0.87(3H,t,J=7.4Hz),1.36(9H,s),1.71(2H,m),1.86(2H,t,J=7.8Hz),2.15-2.19(4H,m),2.40(3H,s),2.77(1H,dd,J=12.7,8.8Hz),3.02(1H,dd,J=14.1,4.7Hz),3.08-3.11(2H,m),3.16-3.19(2H,m),3.54(2H,d,J=5.9Hz),3.57-3.77(4H,m),4.46-4.48(1H,m),5.16(1H,d,J=19.2Hz),5.25(1H,d,J=18.8Hz),5.42(2H,s),5.55-5.60(1H,m),6.53(1H,s),7.00(1H,t,J=6.3Hz),7.17-7.26(5H,m),7.31(1H,s),7.71(1H,t,J=5.7Hz),7.80(1H,d,J=11.0Hz),7.92(1H,t,J=5.7Hz),8.15(1H,d,J=8.2Hz),8.27(1H,t,J=5.5Hz),8.46(1H,d,J=8.2Hz).
MS(APCI)m/z：939(M+H)+.
步驟4：甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-(4-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-4-側氧基丁基)甘胺酸醯胺三氟乙酸鹽
將上述步驟3所獲得的化合物(1.97g、2.10mmoL)溶解於二氯甲烷(7mL)。於獲得的溶液中添加三氟乙酸(7mL)而攪拌1小時。減壓餾除溶劑，添加甲苯而共沸，獲得的殘留物以矽膠管柱色層分析[氯仿~氯仿：甲醇：水=7：3：1(v/v/v)之分配有機層]純化，獲得標題化合物(1.97g、99%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：0.87(3H,t,J=7.4Hz),1.71-1.73(2H,m),1.82-1.90(2H,m),2.12-2.20(4H,m),2.40(3H,s),2.75(1H,dd,J=13.7,9.4Hz),3.0 3-3.09(3H,m),3.18-3.19(2H,m),3.58-3.60(2H,m),3.64(1H,d,J=5.9Hz),3.69(1H,d,J=5.9Hz),3.72(1H,d,J=5.5Hz),3.87(1H,dd,J=16.8,5.9Hz),4.50-4.56(1H,m),5.16(1H,d,J=19.2Hz),5.25(1H,d,J=18.8Hz),5.42(2H,s),5.55-5.60(1H,m),7.17-7.27(5H,m),7.32(1H,s),7.78-7.81(2H,m),7.95-7.97(3H,m),8.33-8.35(2H,m),8.48-8.51(2H,m).
MS(APCI)m/z：839(M+H)+.
步驟5：N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-(4-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-4-側氧基丁基)甘胺酸醯胺
於上述步驟4所獲得的化合物(100mg、0.119mmoL)之N,N-二甲基甲醯胺(1.20mL)溶液中，添加二異丙基乙基胺(20.8μL、0.119mmoL)及3-(2-(2-(3-丁烯二醯亞胺丙醯胺)乙氧基)乙氧基)丙酸N-琥珀醯亞胺基酯(50.7mg、0.119mmoL)，並於室溫攪拌1小時。減壓餾除溶劑，獲得的殘留物以矽膠管柱色層分析[氯仿~氯仿：甲醇=5：1(v/v)]純化，獲得標題化合物(66.5mg、48%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：0.85(3H,t,J=7.4Hz),1.65-1.74(2H,m),1.77-1.90(2H,m),2.07-2.19(4H,m),2.30(2H,t,J=7.2Hz),2.33-2.36(2H,m),2.38(3H,s),2.76(1H,dd,J=13.7,9.8Hz),2.96-3.18(9H,m),3.42-3 .44(4H,m),3.53-3.76(10H,m),4.43(1H,td,J=8.6,4.7Hz),5.14(1H,d,J=18.8Hz),5.23(1H,d,J=18.8Hz),5.38(1H,d,J=17.2Hz),5.42(1H,d,J=17.2Hz),5.52-5.58(1H,m),6.52(1H,s),6.98(2H,s),7.12-7.17(1H,m),7.18-7.25(4H,m),7.29(1H,s),7.69(1H,t,J=5.5Hz),7.78(1H,d,J=11.3Hz),7.98-8.03(2H,m),8.11(1H,d,J=7.8Hz),8.16(1H,t,J=5.7Hz),8.23(1H,t,J=5.9Hz),8.44(1H,d,J=9.0Hz).
MS(APCI)m/z：1149(M+H)+.
步驟6：hM23-H1L1 ADC(1)
(i)抗體之緩衝液交換及濃度調整
將實施例6製作的hM23-H1L1，使用Sephadex G-25擔體的NAP-25管柱(Cat.No.17-0852-02、GE Healthcare Japan Corporation)，依據製造商規定之方法，以含有氯化鈉(137mM)及伸乙基二胺四乙酸(EDTA、5mM)的磷酸緩衝液(10mM、pH6.0；於本說明書，有稱為「PBS6.0/EDTA」的情形)平衡化。對此NAP-25管柱每一根，放置抗體水溶液2.5mL後，分取以PBS6.0/EDTA3.5mL溶出的劃分(3.5mL)。將此劃份置入Amicon Ultra(50,000 MWCO、Millipore Corporation)之容器內置入抗體或抗體-藥物結合物溶液，以使用離心機(Allegra X-15R、Beckman Coulter,Inc.)的離心操作(以2000G~3800G離心5~20分鐘)，將抗體或抗體-藥物結合物溶液濃縮。使用UV測定器(Nanodrop 1000、Thermo Fisher Scientific Inc.)，依據製造商規定之方法，進行抗體濃度之測定。此時，使用280nm吸光係數 (1.65mLmg-1cm-1)而進行抗體濃度之測定後，使用PBS6.0/EDTA調整抗體濃度為10mg/mL。
(ii)抗體之還原
將本溶液(1.00mL)採取於2mL聚丙烯製管，添加10mM TCEP(東京化成工業股份有限公司)水溶液(0.0315mL；相對於抗體一分子，為4.6當量)及1M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque,Inc.；0.015mL)。確認本溶液之pH為7.0±0.1內後，藉由於37℃培養2小時，將抗體內鉸鏈區之雙硫鍵還原。
(iii)抗體與藥物連接物之結合
將上述溶液於常溫水浴中培養10分鐘後，添加上述步驟5所獲得的化合物之10mM二甲基亞碸溶液(0.0579mL；相對於抗體一分子為9.2當量)，並使用試管混勻器(Tube Rotator)(MTR-103、ASONE股份有限公司)，於室溫攪拌60分鐘，使藥物連接物與抗體結合。其次，添加100mM NAC(Sigma-Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0126mL；相對於抗體一分子為18.4當量)，再於室溫攪拌20分鐘，使藥物連接物之反應停止。
(iv)純化
以含山梨糖醇(5%)的乙酸緩衝液(10mM、pH5.5；於本說明書有稱為「ABS」的情形)將NAP-25管柱平衡化。於此NAP-25管柱，負載抗體-藥物結合物反應水溶液(2.5mL)，以製造商規定之量之緩衝液使溶出，而分取抗體劃份。將此分取劃份再次負載於NAP-25管柱，進行以緩衝液溶出的膠體過濾純化操作共計重複2~3 次，獲得去除未結合之藥物連接物或低分子化合物(參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)及二甲基亞碸)的含有抗體-藥物結合物的溶液6.0mL。
(v)特性評價
共通操作A：抗體-藥物結合物中的抗體濃度及抗體每一分子之藥物平均結合數之測定(1)
抗體-藥物結合物中的結合藥物濃度係測定抗體-藥物結合物水溶液之280nm及370nm之二波長中的UV吸光度後，進行下述之計算。
因某波長中的全吸光度係相等於系統內存在的全部吸收化學物種之吸光度之和(吸光度之加成性)，故於抗體與藥物之結合前後，假設抗體及藥物之莫耳吸光係數未變化時，抗體-藥物結合物中的抗體濃度及藥物濃度係如下述之關係式所示。
A280=AD,280+AA,280=εD,280CD+εA,280CA 式(1)
A370=AD,370+AA,370=εD,370CD+εA,370CA 式(2)
A280表示280nm中的抗體-藥物結合物水溶液之吸光度，A370表示370nm中的抗體-藥物結合物水溶液之吸光度，AA,280表示280nm中的抗體之吸光度，AA,370表示370nm中的抗體之吸光度，AD,280表示280nm中的結合物前驅物之吸光度，AD,370表示370nm中的結合物前驅物之吸光度，εA,280表示280nm中的抗體之莫耳吸光係數，εA,370表示370nm中的抗體之莫耳 吸光係數，εD,280表示280nm中的結合物前驅物之莫耳吸光係數，εD,370表示370nm中的結合物前驅物之莫耳吸光係數，CA表示抗體-藥物結合物中的抗體濃度，CD表示抗體-藥物結合物中的藥物濃度。
其中，εA,280、εA,370、εD,280、εD,370係 被用於事先準備的值(計算推定值或由化合物之UV測定所獲得的實測值)。εA,280係自抗體之胺基酸序列，藉由已知之計算方法(Protein Science,1995,vol.4,2411-2423)可加以推定。hM23-H1L1、hM23-H1L2、hM23-H2L2之情形，依據其胺基酸序列，將240400作為推定值使用。 εA,370作為零。藥物連接物之莫耳吸光係數(280nm、370nm)係可使用將藥物連接物以巰基乙醇反應，將順丁烯二醯亞胺基變換為琥珀醯亞胺硫醚的化合物之實測的莫耳吸光係數(280nm、370nm)(於本實施例，使用εD,280=4964、εD,370=18982)。測定抗體-藥物結合物水溶液之A280及A370，藉由將此等值代入式(1)及(2)而解聯立方程式，而求得CA及CD。進一步將CD除以CA而求得每1抗體之藥物平均結合數。
共通操作B：抗體-藥物結合物中的抗體每一分子之藥物平均結合數之測定(2)
抗體-藥物結合物中的抗體每一分子之藥物平均結合數係除了前述之共通操作A之外，亦可藉由使用以下之方法的高速液體色層分析(HPLC)分析而求得。
[B-1.HPLC分析用樣品之調製(抗體-藥物結合物之還原)]
將抗體-藥物結合物溶液(約1mg/mL、60μL)與二硫蘇糖醇(DTT)水溶液(100mM、15μL)混合。將混合物於37℃培養30分鐘，將切斷抗體-藥物結合物之L鏈及H鏈間的雙硫鍵的樣品用於HPLC分析。
[B-2.HPLC分析]
HPLC分析以下述之測定條件進行。
HPLC系統：Agilent 1290 HPLC系統(Agilent Technologies)
檢測器：紫外吸光度計(測定波長：280nm)
管柱：PLRP-S(2.1×50mm、8μm、1000□；Agilent Technologies、P/N PL1912-1802)
管柱溫度：80℃
移動相A：0.04%三氟乙酸(TFA)水溶液
移動相B：含0.04%TFA的乙腈溶液
梯度程式：29%-36%(0分鐘-12.5分鐘)、36%-42%(12.5-15分鐘)、42%-29%(15分鐘-15.1分鐘)、29%-29%(15.1分鐘-25分鐘)
樣品注入量：15μL
[B-3.資料解析]
[B-3-1]相對於未結合藥物之抗體之L鏈(L0)及H鏈(H0)，藥物結合的L鏈(藥物為一個結合的L鏈：L1)及H鏈(藥物為一個結合的H鏈：H1、藥物為二個結合的H鏈：H2、藥物為三個結合的H鏈：H3)係與結合的藥物的數成比例地疏水性增加而保持時間變大，故以L0、L1、H0、H1、H2、H3之順序被溶出。藉由L0及H0之保持時 間比較，檢出波峰可被分配於L0、L1、H0、H1、H2、H3之任一者。
[B-3-2]因於藥物連接物有UV吸收，因應藥物連接物之結合數，使用L鏈、H鏈及藥物連接物之莫耳吸光係數而依據下式進行波峰面積值之補正。
其中，各抗體中的L鏈及H鏈之莫耳吸光係數(280nm)係可藉由已知之計算方法(Protein Science,1995,vol.4,2411-2423)，使用自各抗體之L鏈及H鏈之胺基酸序列所推定的值。hM23-H1L1、hM23-H1L2、hM23-H2L2之情形，依據其胺基酸序列，將41370作為L鏈之莫耳吸光係數，將77810作為H鏈之莫耳吸光係數之推定值使用。又，藥物連接物之莫耳吸光係數(280nm)係使用前述之共通操作A所求得的實測之莫耳吸光係數(280nm)。
[B-3-3]依據下式計算相對於波峰面積補正值合計之各鏈波峰面積比(%)。
A Li ,A Hi ：L i ,H i 各波峰面積補正值
[B-3-4]依據下式計算抗體-藥物結合物中的抗體每一分子之藥物平均結合數。
藥物平均結合數=(L0波峰面積比×0+L0波峰面積比×1+H0波峰面積比×0+H1波峰面積比×1+H2波峰面積比×2+H3波峰面積比×3)/100×2
使用共通操作A及B而獲得下述之特性值。抗體濃度：1.50mg/mL、抗體產量：9.00mg(90%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.0；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：7.1。
(實施例8)hM23-H1L2 ADC(1)之製作
步驟1：hM23-H1L2 ADC(1)
使用實施例6製作的hM23-H1L2及實施例7步驟5所獲得的化合物，藉由以與實施例7步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。
抗體濃度：1.54mg/mL、抗體產量：9.24mg(92%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.0；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：7.1。
(實施例9)hM23-H2L2 ADC(1)之製作
步驟1：hM23-H2L2 ADC(1)
使用實施例6製作的hM23-H2L2及實施例7步驟5所獲得的化合物，藉由以與實施例7步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。
抗體濃度：1.45mg/mL、抗體產量：8.70mg(87%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.0；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：7.1。
(實施例10)hM23-H1L1 ADC(2)之製作
步驟1：({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲基乙酸酯
於包含N-9-茀基甲氧基羰基甘胺醯基甘胺酸(4.33g、12.2mmol)、四氫呋喃(120ml)及甲苯(40.0ml)的混合物中，添加吡啶(1.16ml、14.7mmol)及四乙酸鉛(6.84g、14.7mmol)，並加熱回流5小時。將反應液冷卻至室溫後，藉由矽藻土過濾將不溶物去除，減壓下濃縮。 將獲得的殘留物溶解於乙酸乙酯，以水及飽和食鹽水洗淨後，有機層以無水硫酸鎂乾燥。減壓下餾除溶劑後，獲得的殘留物以矽膠管柱色層分析[己烷：乙酸乙酯=9：1(v/v)~乙酸乙酯]純化，獲得標題化合物(3.00g、67%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：2.07(3H,s),3.90(2H,d,J=5.1Hz),4.23(1H,t,J=7.0Hz),4.46(2H,d,J=6.6Hz),5.26(2H,d,J=7.0Hz),5.32(1H,brs),6.96(1H,brs),7.32(2H,t,J=7.3Hz),7.41(2H,t,J=7.3Hz),7.59(2H,d,J=7.3Hz),7.77(2H,d,J=7.3Hz).
步驟2：[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸苄酯
於上述步驟1所獲得的化合物(3.68g、10.0mmoL)及乙醇酸苄酯(4.99g、30.0mmoL)之四氫呋喃(40.0mL)溶液中，於0℃添加三級丁醇鉀(2.24g，20.0mmoL)，並於室溫攪拌15分鐘。於0℃，於反應溶液中添加乙酸乙酯、水，並以乙酸乙酯、氯仿萃取，獲得的有機層以硫酸鈉乾燥，並過濾。減壓餾除溶劑，將獲得的殘留物溶解於二烷(40.0mL)、水(10.0mL)，添加碳酸氫鈉(1.01g，12.0mmoL)、氯甲酸9-茀基甲酯(2.59g，10.0mmoL)，於室溫攪拌2小時。於反應溶液中添加水，並以乙酸乙酯萃取，獲得的有機層以硫酸鈉乾燥，並過濾。減壓餾除溶劑，獲得的殘留物以矽膠管柱色層分析[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)~0：100]純化，獲得標題化合物(1.88g、40%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ： 3.84(2H,d,J=5.5Hz),4.24(3H,t,J=6.5Hz),4.49(2H,d,J=6.7Hz),4.88(2H,d,J=6.7Hz),5.15-5.27(1H,m),5.19(2H,s),6.74(1H,brs),7.31-7.39(7H,m),7.43(2H,t,J=7.4Hz),7.61(2H,d,J=7.4Hz),7.79(2H,d,J=7.4Hz).
步驟3：[({N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)甲氧基]乙酸
將上述步驟2所獲得的化合物(1.88g、3.96mmoL)溶解於乙醇(40.0mL)、乙酸乙酯(20.0ml)。添加鈀碳觸媒(376mg)，並於氫氣環境下，於室溫攪拌2小時。藉由矽藻土過濾將不溶物去除，減壓餾除溶劑，獲得標題化合物(1.52g、定量的)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：3.62(2H,d,J=6.3Hz),3.97(2H,s),4.18-4.32(3H,m),4.60(2H,d,J=6.7Hz),7.29-7.46(4H,m),7.58(1H,t,J=5.9Hz),7.72(2H,d,J=7.4Hz),7.90(2H,d,J=7.4Hz),8.71(1H,t,J=6.5Hz).
步驟4：9H-茀-9-基甲基(2-{[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]胺基}-2-側氧基乙基)胺甲酸酯
冰冷下，於依喜替康之甲磺酸鹽(0.283g，0.533mmoL)、N-羥基琥珀醯亞胺(61.4mg，0.533mmoL)、及上述步驟3獲得的化合物(0.205g，0.533mmoL)之N,N-二甲基甲醯胺(10.0mL)溶液中，添加N,N-二異丙基乙基胺(92.9μL，0.533mmoL)及N,N’-二環己基碳二亞胺 (0.143g，0.693mmoL)，並於室溫攪拌3日。減壓餾除溶劑，獲得的殘留物以矽膠管柱色層分析[氯仿~氯仿：甲醇：水=7：3：1(v/v/v)之分配有機層]純化，獲得標題化合物(0.352g、82%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：0.81(3H,t,J=7.4Hz),1.73-1.87(2H,m),2.06-2.20(2H,m),2.34(3H,s),3.01-3.23(2H,m),3.58(2H,d,J=6.7Hz),3.98(2H,s),4.13-4.25(3H,m),4.60(2H,d,J=6.7Hz),5.09-5.22(2H,m),5.32-5.42(2H,m),5.50-5.59(1H,m),6.49(1H,s),7.24-7.30(3H,m),7.36(2H,t,J=7.4Hz),7.53(1H,t,J=6.3Hz),7.66(2H,d,J=7.4Hz),7.75(1H,d,J=11.0Hz),7.84(2H,d,J=7.4Hz),8.47(1H,d,J=8.6Hz),8.77(1H,t,J=6.7Hz).
MS(ESI)m/z：802(M+H)+.
步驟5：N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺酸醯胺
於上述步驟4所獲得的化合物(0.881g、1.10mmoL)之N,N-二甲基甲醯胺(11.0mL)溶液中，添加哌啶(1.1mL)，並於室溫攪拌2小時。減壓餾除溶劑，獲得含標題化合物的混合物。本混合物係不進行進一步的純化而使用於以下的反應。
步驟6：N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫 -1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺酸醯胺
冰冷下，於上述步驟5所獲得的混合物(0.439mmoL)、N-羥基琥珀醯亞胺(0.101g、0.878mmoL)及N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺酸(特開2002-60351號公報記載的化合物；0.440g、0.878mmoL)之N,N-二甲基甲醯胺(50.0mL)溶液中，添加N,N’-二環己基碳二亞胺(0.181g、0.878mmoL)，並於室溫攪拌4日。減壓餾除溶劑，獲得的殘留物以矽膠管柱色層分析[氯仿~氯仿：甲醇=9：1(v/v)]純化，獲得標題化合物(0.269g、58%)。
MS(ESI)m/z：1063(M+H)+.
步驟7：甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺酸醯胺
於上述步驟6所獲得的化合物(0.269g、0.253mmoL)之N,N-二甲基甲醯胺(4.00mL)溶液中，添加哌啶(0.251mL、2.53mmoL)，並於室溫攪拌2小時。減壓餾除溶劑，獲得含標題化合物的混合物。本混合物係不進行進一步的純化而使用於以下的反應。
步驟8：N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側 氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺酸醯胺
於上述步驟7所獲得的化合物(0.253mmoL)之N,N-二甲基甲醯胺(10.0mL)溶液中，添加6-順丁烯二醯亞胺己烷酸N-琥珀醯亞胺基酯(0.156g、0.506mmoL)，並於室溫攪拌3日。減壓餾除溶劑，獲得的殘留物以矽膠管柱色層分析[氯仿~氯仿：甲醇=9：1(v/v)]純化，獲得標題化合物(0.100g、38%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：0.83(3H,t,J=7.2Hz),1.09-1.21(2H,m),1.33-1.47(4H,m),1.75-1.90(2H,m),2.00-2.23(4H,m),2.36(3H,s),2.69-2.81(1H,m),2.94-3.03(1H,m),3.06-3.22(2H,m),3.23-3.74(6H,m),3.98(2H,s),4.39-4.50(1H,m),4.60(2H,d,J=6.7Hz),5.17(2H,s),5.39(2H,s),5.53-5.61(1H,m),6.50(1H,s),6.96(2H,s),7.11-7.24(5H,m),7.28(1H,s),7.75(1H,d,J=11.0Hz),7.97(1H,t,J=5.7Hz),8.03(1H,t,J=5.9Hz),8.09(1H,d,J=7.8Hz),8.27(1H,t,J=6.5Hz),8.48(1H,d,J=9.0Hz),8.60(1H,t,J=6.5Hz).
MS(ESI)m/z：1034(M+H)+.
步驟9：hM23-H1L1 ADC(2)
(i)抗體之緩衝液交換及濃度調整
將實施例6製作的hM23-H1L1，使用Sephadex G-25擔體的NAP-25管柱(Cat.No.17-0852-02、GE Healthcare Japan Corporation)，依據製造商規定之方法，以含氯化鈉(137mM)及伸乙基二胺 四乙酸(EDTA、5mM)的磷酸緩衝液(10mM、pH6.0；於本說明書有稱為「PBS6.0/EDTA」的情形)平衡化。對此NAP-25管柱每一根，放置抗體水溶液2.5mL後，分取以PBS6.0/EDTA3.5mL溶出的劃分(3.5mL)。將此劃份置入Amicon Ultra(50,000 MWCO、Millipore Corporation)之容器內置入抗體或抗體-藥物結合物溶液，以使用離心機(Allegra X-15R、Beckman Coulter,Inc.)的離心操作(2000G~3800G，離心5~20分鐘)，將抗體或抗體-藥物結合物溶液濃縮。使用UV測定器(Nanodrop 1000、Thermo Fisher Scientific Inc.)，依據製造商規定之方法，進行抗體濃度之測定。此時，使用280nm吸光係數(1.65mLmg-1cm-1)進行抗體濃度之測定後，使用PBS6.0/EDTA，將抗體濃度調整為10mg/mL。
(ii)抗體之還原
將本溶液(1.00mL)採取至2mL聚丙烯製管，添加10mM TCEP(東京化成工業股份有限公司)水溶液(0.0158mL；相對於抗體一分子，為2.3當量)及1M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque,Inc.；0.015mL)。確認本溶液之pH為7.0±0.1內後，藉由於37℃培養2小時，將抗體內鉸鏈區之雙硫鍵還原。
(iii)抗體與藥物連接物之結合
將上述溶液於常溫水浴中培養10分鐘後，添加二甲基亞碸(0.0228mL)。其次，添加上述步驟8所獲得的化合物之10mM二甲基亞碸溶液(0.0268mL；相對於抗體一分子為4.6當量)，並使用試管混勻器(Tube Rotator)(MTR-103、ASONE股份有限公司)，於室溫攪拌60分鐘，使藥物連接物與抗體結合。其次，添加100mM NAC(Sigma-Aldrich Co.LLC)水溶液(0.0063mL；相對於抗體一分子為9.2當量)，再於室溫攪拌20分鐘，使藥物連接物之反應停止。
(v)純化
以含山梨糖醇(5%)的乙酸緩衝液(10mM、pH5.5)將NAP-25管柱平衡化。於此NAP-25管柱，負載抗體-藥物結合物反應水溶液(2.5mL)，以製造商規定之量之緩衝液使溶出，而分取抗體劃份。將此分取劃份再次負載於NAP-25管柱，進行以緩衝液溶出的膠體過濾純化操作共計重複2~3次，獲得去除未結合之藥物連接物或低分子化合物(參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)及二甲基亞碸)的含有抗體-藥物結合物的溶液6.0mL。
(v)特性評價
使用共通操作A及B(使用εD,280=5178(實測值)、εD,370=20217(實測值))，獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.53mg/mL、抗體產量：9.18mg(92%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：2.9；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.6。
(實施例11)hM23-H1L1 ADC(3)之製作
步驟1：hM23-H1L1 ADC(3)
使用實施例6製作的hM23-H1L1及實施例10步驟8所獲得的化合物，藉由以與實施例7步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。使用共通操作A及B(使用εD,280=5178(實測值)、εD,370=20217(實測值))，獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.59mg/mL、抗體產量：9.54mg(95%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：5.4；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.7。
(實施例12)hM23-H1L2 ADC(2)之製作
步驟1：hM23-H1L2 ADC(2)
使用實施例6製作的hM23-H1L2及實施例10步驟8所獲得的化合物，藉由以與實施例10步驟9同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。
抗體濃度：1.52mg/mL、抗體產量：9.12mg(91%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.0；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.7。
(實施例13)hM23-H1L2 ADC(3)之製作
步驟1：hM23-H1L2 ADC(3)
使用實施例6製作的hM23-H1L2及實施例10步驟8所獲得的化合物，藉由以與實施例7步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。使用共通操作A及B(使用εD,280=5178(實測值)、εD,370=20217(實測值))，獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.57mg/mL、抗體產量： 9.42mg(94%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：5.7；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：7.1。
(實施例14)hM23-H2L2 ADC(2)之製作
步驟1：hM23-H2L2 ADC(2)
使用實施例6製作的hM23-H2L2及實施例10步驟8所獲得的化合物，藉由以與實施例10步驟9同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。
抗體濃度：1.50mg/mL、抗體產量： 9.00mg(90%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.0；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.8。
(實施例15)hM23-H2L2 ADC(3)之製作
步驟1：hM23-H2L2 ADC(3)
使用實施例6製作的hM23-H2L2及實施例10步驟8所獲得的化合物，藉由以與實施例7步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。使用共通操作A及B(使用εD,280=5178(實測值)、εD,370=20217(實測值))，獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.51mg/mL、抗體產量： 9.06mg(91%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：5.8；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：7.1。
(實施例16)hM23-H1L1 ADC(4)之製作
步驟1：[2-(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基 -4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)乙基]胺甲酸三級丁酯
使用{2-[(三級丁氧基羰基)胺基]乙氧基}乙酸(J.Med.Chem.,1992年，35卷，2928頁；1.55g、6.01mmol) 替代4-(三級丁氧基羰基胺基)丁酸，與實施例7步驟1同樣地，獲得標題化合物(2.56g、73%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：0.87(3H,t,J=7.3Hz),1.26(9H,s),1.81-1.91(2H,m),2.13-2.22(2H,m),2.40(3H,s),3.08-3.26(4H,m),3.43-3.53(2H,m),4.00(1H,d,J=15.1Hz),4.05(1H,d,J=15.1Hz),5.14(1H,d,J=18.7Hz),5.22(1H,d,J=18.7Hz),5.40(1H,d,J=16.6Hz),5.44(1H,d,J=16.6Hz),5.59-5.66(1H,m),6.53(1H,s),6.86(1H,t,J=5.4Hz),7.31(1H,s),7.79(1H,d,J=10.9Hz),8.49(1H,d,J=9.1Hz).
MS(APCI)m/z：637(M+H)+.
步驟2：2-(2-胺基乙氧基)-N-[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]乙醯胺三氟乙酸鹽
將上述步驟1所獲得的化合物(1.50g、2.36mol)，使與實施例7步驟2同樣地反應，獲得標題化合物(1.50g、定量的)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：0.87(3H,t,J=7.5Hz),1.81-1.92(2H,m),2.15-2.23(2H,m),2.41(3H,s),3.05(2H,t,J=5.1Hz),3.15-3.23(2H,m),3.71(2H,t,J=5.1Hz),4.10(2H,s),5.19(1H,d,J=18.7Hz),5.24(1H,d,J=18.7Hz),5.43(2H,s),5.58-5.66(1H,m),6.55(1H,s),7.33(1H,s),7.73-7.84(4H,m),8.55(1H,d,J=9.1Hz).
MS(APCI)m/z：537(M+H)+.
步驟3：N-(三級丁氧基羰基)甘胺醯基甘胺 醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)乙基]甘胺酸醯胺
將上述步驟2所獲得的化合物(554mg、0.85mmol)，使與實施例7步驟3同樣地反應，獲得標題化合物(775mg、95%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：0.85(3H,t,J=7.3Hz),1.36(9H,s),1.78-1.89(2H,m),2.13-2.22(2H,m),2.39(3H,s),2.71(1H,dd,J=13.4,9.8Hz),2.95(1H,dd,J=13.4,4.3Hz),3.09-3.23(1H,m),3.23-3.32(2H,m),3.40-3.62(8H,m),3.73(1H,dd,J=16.5,5.5Hz),4.03(2H,s),4.39-4.47(1H,m),5.17(1H,d,J=18.9Hz),5.25(1H,d,J=18.9Hz),5.41(1H,d,J=16.8Hz),5.45(1H,d,J=16.8Hz),5.57-5.64(1H,m),6.54(1H,s),6.99(1H,t,J=5.8Hz),7.13-7.26(5H,m),7.31(1H,s),7.76-7.82(2H,m),7.90(1H,t,J=5.2Hz),8.13(1H,d,J=7.9Hz),8.27(1H,t,J=5.8Hz),8.49(1H,d,J=8.5Hz).
MS(APCI)m/z：955(M+H)+.
步驟4：甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)乙基]甘胺酸醯胺三氟乙酸鹽
將上述步驟3所獲得的化合物(630mg、0.659mmol)，使與實施例7步驟4同樣地反應，獲得標題化合物(588mg、92%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：0.86(3H,t,J=7.3Hz),1.79-1.90(2H,m),2.13-2.22(2H,m),2.39(3H,s),2.71(1H,dd,J=13.4,10.1Hz),2.99(1H,dd,J=13.4,4.3Hz),3.09-3.23(1H,m),3.24-3.32(3H,m),3.41-3.71(7H,m),3.86(1H,dd,J=16.8,5.8Hz),4.04(2H,s),4.52(1H,td,J=9.0,4.1Hz),5.17(1H,d,J=18.9Hz),5.25(1H,d,J=18.9Hz),5.41(1H,d,J=16.5Hz),5.45(1H,d,J=16.5Hz),5.56-5.65(1H,m),6.55(1H,s),7.13-7.26(5H,m),7.32(1H,s),7.80(1H,d,J=11.0Hz),7.87-8.01(4H,m),8.29-8.36(2H,m),8.46-8.55(2H,m).
MS(APCI)m/z：855(M+H)+.
步驟5：N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3’,4’：6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)乙基]甘胺酸醯胺
使用三乙基胺(31.4μL、0.22mmoL)替代二異丙基乙基胺，使用6-順丁烯二醯亞胺己烷酸N-琥珀醯亞胺基酯(95.3mg、0.31mmoL)替代3-(2-(2-(3-丁烯二醯亞胺丙醯胺)乙氧基)乙氧基)丙酸N-琥珀醯亞胺基酯，使與實施例7步驟5同樣地，獲得標題化合物(162mg、62%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：0.86(3H,t,J=7.6Hz),1.13-1.22(2H,m),1.40-1.51(4H,m),1.78-1.90(2H,m),2.09(2H,t,J=7.6Hz),2.14-2.21(2H,m),2.39(3H,s),2.74(1H,dd,J=13.6,9.7Hz),2.96(1H,dd,J=13.6,4.5Hz),3.08-3.24(1H,m),3.24-3.30(1H,m),3.33-3.40(4H,m),3.47-3.68(7H,m),3.72(1H,dd,J=16.6,5.7Hz),4.03(2H,s),4.42(1H,td,J=8.6,4.2Hz),5.17(1H,d,J=18.7Hz),5.25(1H,d,J=18.7Hz),5.40(1H,d,J=17.2Hz),5.44(1H,d,J=17.2Hz),5.57-5.64(1H,m),6.52(1H,s),6.99(2H,s),7.13-7.25(5H,m),7.31(1H,s),7.74-7.81(2H,m),7.99(1H,t,J=5.7Hz),8.03-8.11(2H,m),8.22(1H,t,J=5.7Hz),8.47(1H,d,J=9.1Hz).
MS(APCI)m/z：1048(M+H)+.
步驟6：hM23-H1L1 ADC(4)
使用實施例6製作的hM23-H1L1及上述步驟5所獲得的化合物，藉由以與實施例10步驟9同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。使用共通操作A及B(使用εD,280=5193(實測值)、εD,370=20347(實測值))，獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.47mg/mL、抗體產量：8.82mg(88%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：2.8；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.6。
(實施例17)hM23-H1L1 ADC(5)之製作
步驟1：hM23-H1L1 ADC(5)
使用實施例6製作的hM23-H1L1及實施例16步驟5所獲得的化合物，藉由以與實施例7步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。使用共通操作A及B(使用εD,280=5193(實測值)、εD,370=20347(實測值))，獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.47mg/mL、抗體產量： 8.82mg(88%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：5.3；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.7。
(實施例18)hM23-H1L2 ADC(4)之製作
步驟1：hM23-H1L2 ADC(4)
使用實施例6製作的hM23-H1L2及實施例16步驟5所獲得的化合物，藉由以與實施例10步驟9同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。使用共通操作A及B(使用εD,280=5193(實測值)、εD,370=20347(實測值))，獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.49mg/mL、抗體產量： 8.94mg(89%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.0；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.4。
(實施例19)hM23-H1L2 ADC(5)之製作
步驟1：hM23-H1L2 ADC(5)
使用實施例6製作的hM23-H1L2及實施例16步驟5所獲得的化合物，藉由以與實施例7步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。使用共通操作A及B(使用εD,280=5193(實測值)、εD,370=20347(實測值))，獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.57mg/mL、抗體產量：9.42mg(94%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：5.8；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.9。
(實施例20)hM23-H2L2 ADC(4)之製作
步驟1：hM23-H2L2 ADC(4)
使用實施例6製作的hM23-H1L1及上述實施例16步驟5所獲得的化合物，藉由以與實施例10步驟9同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。使用共通操作A及B(使用εD,280=5193(實測值)、εD,370=20347(實測值))，獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.48mg/mL、抗體產量： 8.88mg(89%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.1；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.9。
(實施例21)hM23-H2L2 ADC(5)之製作
步驟1：hM23-H2L2 ADC(5)
使用實施例6製作的hM23-H1L1及上述實施例16步驟5所獲得的化合物，藉由以與實施例7步驟6同樣之方法，獲得標題抗體-藥物結合物。使用共通操作A及B(使用εD,280=5193(實測值)、εD,370=20347(實測值))，獲得下述之特性值。
抗體濃度：1.56mg/mL、抗體產量： 9.36mg(94%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：5.9；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：7.1。
(實施例22)hM23-H1L1 ADC(6)之製作
步驟1：hM23-H1L1 ADC(6)
(i)抗體之緩衝液交換及濃度調整
將實施例6製作的hM23-H1L1，使用Sephadex G-25擔體的NAP-25管柱(Cat.No.17-0852-02、GE Healthcare Japan Corporation)，依據製造商規定之方法，以含有氯化鈉(137mM)及伸乙基二胺四乙酸(EDTA、5mM)的磷酸緩衝液(10mM、pH6.0；於本說明書，有稱為「PBS6.0/EDTA」的情形)平衡化。對此NAP-25管柱每一根，放置抗體水溶液2.5mL後，分取以PBS6.0/EDTA3.5mL溶出的劃分(3.5mL)。將此劃份置入Amicon Ultra(50,000 MWCO、Millipore Corporation)之容器內置入抗體或抗體-藥物結合物溶液，以使用離心機(Allegra X-15R、Beckman Coulter,Inc.)的離心操作(以2000G~3800G離心5~20分鐘)，將抗體或抗體-藥物結合物溶液濃縮。使用UV測定器(Nanodrop 1000、Thermo Fisher Scientific Inc.)，依據製造商規定之方法，進行抗體濃度之測定。此時，使用280nm吸光係數(1.65mLmg-1cm-1)而進行抗體濃度之測定後，使用PBS6.0/EDTA調整抗體濃度為10mg/mL。
(ii)抗體之還原
將本溶液(10mL)採取於50mL聚丙烯製管，添加10mM TCEP水溶液(0.377mL；相對於抗體一分子為5.5當量)及1M磷酸氫二鉀水溶液(0.287mL)。確認本溶液之pH為7.2±0.1內後，藉由於37℃培養2小時，將抗體內鉸鏈區之雙硫鍵還原。
(iii)抗體與藥物連接物之結合
將上述溶液於15℃之水浴中培養5分鐘後，添加實施例10步驟8所獲得的化合物之10mM二甲基亞碸溶液(0.617mL；相對於抗體一分子為9.0當量)，並於15℃之水浴中攪拌30分鐘，使藥物連接物與抗體結合。其次，添加100mM NAC水溶液(0.088mL；相對於抗體一分子為12.9當量)，再於室溫攪拌20分鐘，使藥物連接物之反應性停止。
(iv)純化
以含山梨糖醇(5%)的乙酸緩衝液(10mM、pH5.5)將NAP-25管柱平衡化。於此NAP-25管柱，負載抗體-藥物結合物反應水溶液(2.5mL)，以製造商規定之量之緩衝液使溶出，而分取抗體劃份。將此分取劃份再次負載於NAP-25管柱，進行以緩衝液溶出的膠體過濾 純化操作共計重複2~3次，獲得去除未結合之藥物連接物或低分子化合物(參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)及二甲基亞碸)的含有抗體-藥物結合物的溶液35mL。
(v)特性評價
使用共通操作A及B(使用εD,280=5178(實測值)、εD,370=20217(實測值))，獲得下述之特性值。
抗體濃度：2.59mg/mL、抗體產量：90.7mg(91%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：6.4；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：7.8。
(實施例23)hM23-H1L1 ADC(7)之製作
步驟1：hM23-H1L1 ADC(7)
(i)抗體之緩衝液交換及濃度調整
將實施例6製作的hM23-H1L1，使用Sephadex G-25擔體的NAP-25管柱(Cat.No.17-0852-02、GE Healthcare Japan Corporation)，依據製造商規定之方法，以含有氯化鈉(137mM)及伸乙基二胺四乙酸(EDTA、5mM)的磷酸緩衝液(10mM、pH6.0；於本說明書，有稱為「PBS6.0/EDTA」的情形)平衡化。對此NAP-25管柱每一根，放置抗體水溶液2.5mL後，分取以PBS6.0/EDTA3.5mL溶出的劃分(3.5mL)。將此劃份置入Amicon Ultra(50,000 MWCO、Millipore Corporation)之容器內置入抗體或抗體-藥物結合物溶液，以使用離心機(Allegra X-15R、Beckman Coulter,Inc.)的離心操作(以2000G~3800G離心5~20分鐘)，將抗體或抗體-藥物結合物溶液濃縮。使用UV測定器(Nanodrop 1000、Thermo Fisher Scientific Inc.)，依據製造商規定之方法，進行抗體濃度之測定。此時，使用280nm吸光係數(1.65mLmg-1cm-1)而進行抗體濃度之測定後，使用PBS6.0/EDTA調整抗體濃度為10mg/mL。
(ii)抗體之還原
將本溶液(10mL)採取於50mL聚丙烯製管，添加10mM TCEP水溶液(0.178mL；相對於抗體一分子為2.6當量)及1M磷酸氫鉀水溶液(0.287mL)。確認本溶液之pH為7.2±0.1內後，藉由於37℃培養1小時，將抗體內鉸鏈區之雙硫鍵還原。
(iii)抗體與藥物連接物之結合
將上述溶液於15℃之水浴中培養5分鐘後，添加實施例10步驟8所獲得的化合物之10mM二甲基亞碸溶液(0.308mL；相對於抗體一分子為4.5當量)，並於15℃之水浴中攪拌1小時，使藥物連接物與抗體結合。其次，添加100mM NAC水溶液(0.088mL；相對於抗體一分子為12.9當量)，再於室溫攪拌20分鐘，使藥物連接物之反應性停止。
(iv)純化
以含山梨糖醇(5%)的乙酸緩衝液(10mM、pH5.5)將NAP-25管柱平衡化。於此NAP-25管柱，負載抗體-藥物結合物反應水溶液(2.5mL)，以製造商規定之量之緩衝液使溶出，而分取抗體劃份。將此分取劃份再次負載於NAP-25管柱，進行以緩衝液溶出的膠體過濾純化操作共計重複2~3次，獲得去除未結合之藥物連接物或低分子化合物(參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)及二甲基亞碸)的含有抗體-藥物結合物的溶液35mL。
(v)特性評價
使用共通操作A及B(使用εD,280=5178(實測值)、εD,370=20217(實測值))，獲得下述之特性值。
抗體濃度：2.63mg/mL、抗體產量：92.1mg(92%)、以共通操作A測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.3；以共通操作B測定的抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.9。
(試驗例1)cM23抗體之內在化活性
依據Mol Biol Cell.2004；15：5268-5282，調查cM23抗體之內在化活性。
將cM23、抗運鐵蛋白(transferrin)受體抗體(陽性對照組)及對照組hIgG1(陰性對照組)以Alexa488標識。各Alexa488標識抗體以冰冷之添加10% FBS的RPMI 1640調整為2μg/mL，於96-孔U底盤中各分柱50μL。回收半融合的NCI-H322細胞，以冰冷的添加10% FBS的RPMI 1640懸浮成4×106個細胞/mL，於已分注抗體的盤中，各分注細胞50μL。以平盤混合器攪拌後，於4℃培養1小時，添加冰冷洗滌緩衝液(添加3% FBS的PBS)150μL，並離心而去除上清液。再添加冰冷洗滌緩衝液200μL，進行2次去除上清液。
(1)僅4℃培養之樣品：於已經上述洗淨的細胞中，添加冰冷洗滌緩衝液(添加1000倍稀釋LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit(死細胞染料，Invitrogen公司#L10119))或Anti-Alexa-488溶液(25μg/mL抗-Alexa-488抗體、添加1000倍稀釋死細胞染料)75μL，移至新平盤而於冰上培養30分鐘。以150μL/孔添加冰冷固定溶液(添加2%PFA及3% FBS的PBS)，空的孔中各分注150μL之固定溶液及洗滌緩衝液之2：1溶液，添加100μL樣品並以FACS Canto(Becton Dickinson公司)測定螢光。
(2)37℃培養樣品：於上述洗淨的細胞，添加100μL之溫熱至37℃的添加10% FBS之RPMI 1640，以平盤混 合器懸浮，移至96孔V底平盤，於1小時或3小時且於37℃、5%CO2下培養。添加100μL之冰冷洗滌緩衝液，將全量移至96孔圓底平盤而離心。去除上清液後，添加冰冷洗滌緩衝液(添加1000倍稀釋死細胞染料)或Anti-Alexa-488溶液(25μg/mL、添加1000倍稀釋死細胞染料)75μL，移至新平盤並於冰上培養30分鐘。以150μL/孔添加冰冷固定溶液，並於空的孔中各分注150μL之固定溶液與洗滌緩衝液之2：1溶液，添加100μL樣品，並以FACS Canto測定螢光。
如第8圖所示，針對NCI-H322細胞，藉由 使用Alexa488標識cM23的評價，觀察到約16%之cM23之內在化活性。又，第8圖中的TfR Ab係經Alexa488標識的抗運鐵蛋白受體(transferrin receptor)抗體之縮寫。
(試驗例2)hM23抗體之抗原結合活性之測定 (2-1)使用抗體(培養上清液)的抗原結合活性之測定
抗體與抗原(Recombinant Human SLC3A2/MDU1(Sino Biological Inc.))之解離常數測定係使用Biacore T200(GE Healthcare Bio-Sciences)，進行將於固定化的抗人類IgG(Fc)抗體的抗體作為配位體而捕捉(capture)，將抗原作為分析物而測定的捕捉法進行。抗人類IgG(Fc)抗體(Human anibody capture kit、GE Healthcare Bio-Sciences)係對Sensorchip CM5(GE Healthcare Bio-Sciences)以胺偶合法使共價結合約 1000RU。參考細胞亦同樣地固定化。使用作為電泳緩衝液(running buffer)之HBS-EP+(10mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% Surfactant P20、GE Healthcare Bio-Sciences)。於將抗人類IgG(Fc)抗體固定化的測定側細胞，以流速10μL/分鐘，以60秒鐘之添加，成為20-30RU之捕捉的方式，添加含有以HBS-EP+濃度調整的抗體的培養上清液(6-3-1所獲得的培養上清液)。 於參考細胞及測定側細胞以流速30μL/分鐘添加抗原之稀釋系列溶液(0.077-100nM及0nM)300秒鐘，接著監測600秒間之解離相。作為再生溶液，以流速10μL/分鐘添加3M MgCl2 60秒鐘，添加2次。資料之解析係使用分析軟體(Biacore T200 Evaluation Software，1.0版)之1：1Binding模式，算出結合速度常數kon、解離速度常數koff及解離常數(KD；KD=koff/kon)。
(2-2)使用純化抗體的抗原結合活性之測定
使用6-3-2所獲得的抗體，以與上述同樣地算出結合速度常數、解離速度常數及解離常數。
表2 使用純化抗體作為抗體樣品的結合活性
(試驗例3)ADC之細胞傷害活性
自American Type Culture Collection購入人類漿細胞瘤NCI-H929、人類伯基特氏淋巴瘤Ramos、人類黑色素瘤MeWo。NCI-H929細胞及Ramos細胞係以2×103個細胞/孔，MeWo細胞係以1×103個細胞/孔接種於96孔盤，同時添加以培養基作系列稀釋的各抗體及ADC(終濃度：0.1、1、10、100、1000ng/mL，各n=2)。於設定為37℃、5%CO2的培養箱中培養6日，使用Cell Titer Glo(Promega KK)，測定ATP量。藉由下式算出細胞生存率，使用回歸線性，算出50%生存抑制濃度IC50(ng/mL)。其結果示於表中。
細胞生存率(%)=100×(T-B)/(C-B)
T：ADC處理細胞孔之發光量
C：無處理細胞孔之平均發光量(n=2)
B：空白孔之平均發光量(n=2)
hM23H1L1、hM23H1L2及hM23H2L2雖未呈現活體外細胞傷害活性，但彼等之ADC呈現細胞傷害活性。
(試驗例4)ADC之抗腫瘤效果(1)
於實驗使用前，於SPF條件化下，將5週齡之雌SCID小鼠(日本Charles River公司)馴養7日。對小鼠給餌固體飼料(FR-2，Funabashi Farms Co.,Ltd)，並給予添加1~5ppm氯的水。將懸浮於生理食鹽水的Ramos細胞(8×107個細胞/mL)以100μL/小鼠，皮下移植至SCID小鼠之右腋窩部(第0日)。第10日以電子式數位測徑器 (CD-15CX，Mitutoyo Corp.)測定腫瘤之長徑及短徑，基於依據下述式算出的腫瘤體積來實施分組(n=6)。
腫瘤體積(mm3)=1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2
分組當日，將抗體或ADC以ABS稀釋為0.3mg/mL，以10mL/kg尾靜脈內投予(3mg/kg)。之後，每週測定2次腫瘤徑。腫瘤體積之變化示於第9~11圖。
hM23H1L1、hM23H1L2及hM23H2L2雖呈現腫瘤增殖抑制活性，但彼等之ADC較抗體單獨顯示更強的抗腫瘤活性。
(試驗例5)ADC之抗腫瘤效果(2)
於實驗使用前，於SPF條件化下，將5週齡之雌SCID小鼠(日本Charles River公司)馴養9日。對小鼠給餌固體飼料(FR-2，Funabashi Farms Co.,Ltd)，並給予添加1~5ppm氯的水。將懸浮於生理食鹽水的Ramos細胞(5×107個細胞/mL)以100μL/小鼠，皮下移植至SCID小鼠之右腋窩部(第0日)。第11日以電子式數位測徑器(CD-15CX，Mitutoyo Corp.)測定腫瘤之長徑及短徑，基於依據下述式算出的腫瘤體積來實施分組(n=8)。
腫瘤體積(mm3)=1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]2
分組當日，將抗體或ADC以ABS稀釋為0.3mg/mL，以10mL/kg尾靜脈內投予(3mg/kg)。之後，每週測定2次腫瘤徑。腫瘤體積之變化示於第12圖。
hM23-H1L1雖呈現腫瘤增殖抑制活性，但ADC係較抗體單獨顯示更強的抗腫瘤活性。
[序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1：編碼M23抗體之重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列
序列識別號2：M23抗體之重鏈之可變區之胺基酸序列
序列識別號3：編碼M23抗體之輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列
序列識別號4：M23抗體之輕鏈之可變區之胺基酸序列
序列識別號5：編碼人類κ鏈分泌訊息及人類κ鏈恆定區的核苷酸序列
序列識別號6：編碼人類重鏈分泌訊息及人類IgG1恆定區的核苷酸序列
序列識別號7：嵌合M23抗體重鏈之核苷酸序列
序列識別號8：嵌合M23抗體重鏈之胺基酸序列
序列識別號9：嵌合M23抗體輕鏈之核苷酸序列
序列識別號10：嵌合M23抗體輕鏈之胺基酸序列
序列識別號11：hM23-H1型重鏈之核苷酸序列
序列識別號12：hM23-H1型重鏈之胺基酸序列
序列識別號13：hM23-H2型重鏈之核苷酸序列
序列識別號14：hM23-H2型重鏈之胺基酸序列
序列識別號15：hM23-L1型輕鏈之核苷酸序列
序列識別號16：hM23-L1型輕鏈之胺基酸序列
序列識別號17：hM23-L2型輕鏈之核苷酸序列
序列識別號18：hM23-L2型輕鏈之胺基酸序列
序列識別號19：M23抗體之CDRH1之胺基酸序列
序列識別號20：M23抗體之CDRH2之胺基酸序列
序列識別號21：M23抗體之CDRH3之胺基酸序列
序列識別號22：M23抗體之CDRL1之胺基酸序列
序列識別號23：M23抗體之CDRL2之胺基酸序列
序列識別號24：M23抗體之CDRL3之胺基酸序列
序列識別號25：引子mG2aVR1之核苷酸序列
序列識別號26：引子mKVR2之核苷酸序列
序列識別號27：引子3.3-F1之核苷酸序列
序列識別號28：引子3.3-R1之核苷酸序列
序列識別號29：引子M23H-F之核苷酸序列
序列識別號30：引子M23H-R之核苷酸序列
序列識別號31：引子M23L-F之核苷酸序列
序列識別號32：引子M23L-R之核苷酸序列
序列識別號33：引子EG-Inf-F之核苷酸序列
序列識別號34：引子EG1-Inf-R之核苷酸序列
序列識別號35：引子CM-LKF之核苷酸序列
序列識別號36：引子KCL-Inf-R之核苷酸序列
序列識別號37：人類CD98重鏈之核苷酸序列
序列識別號38：人類CD98重鏈之胺基酸序列
<110> 第一三共股份有限公司
<120> 抗CD98抗體-藥物結合物
<130> PD20-9010W0
<150> JP2014-064591
<151> 2014-03-26
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Claims (37)

  1. 一種抗CD98抗體-藥物結合物，其係包含抗CD98抗體、連接物及藥物的抗CD98抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中連接物係選自包含下式的群組的連接物：-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；及-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-，藥物為下式所表示的化合物： 藥物之1位之胺基的氮原子係與連接物之羰基部分結合，抗CD98抗體係與連接物之琥珀醯亞胺基部分結合。
  2. 如請求項1之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中每1抗體之藥物的平均結合數為2~8個的範圍。
  3. 如請求項1之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中每1抗體之藥物的平均結合數為3~6個的範圍。
  4. 如請求項2或3之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中每1抗體之藥物的平均結合數係藉由逆相層析(RPC)法所測定。
  5. 如請求項1之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中每1抗體之藥物的結合數為2、4、6或8個。
  6. 如請求項1至5中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中連接物為下式：-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-。
  7. 如請求項1至5中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中連接物為下式：-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-。
  8. 如請求項1至5中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中連接物為下式： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
  9. 如請求項1至8中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體係與序列識別號38之第462~541號之胺基酸殘基所構成的部位結合。
  10. 如請求項1至9中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：序列識別號19所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRH1；序列識別號20所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRH2；序列識別號21所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRH3；序列識別號22所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRL1；序列識別號23所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRL2；及序列識別號24所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRL3； 且，與CD98重鏈結合。
  11. 如請求項1至9中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：序列識別號19所表示的胺基酸序列所構成的CDRH1；序列識別號20所表示的胺基酸序列所構成的CDRH2；序列識別號21所表示的胺基酸序列所構成的CDRH3；序列識別號22所表示的胺基酸序列所構成的CDRL1；序列識別號23所表示的胺基酸序列所構成的CDRL2；及序列識別號24所表示的胺基酸序列所構成的CDRL3；且與CD98重鏈結合。
  12. 如請求項1至11中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：相對於序列識別號8之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列，至少具有90%之相同性的重鏈可變區及/或相對於序列識別號10之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列，至少具有90%之相同性的輕鏈可變區。
  13. 如請求項1至11中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含： 含有選自包含下列的群組的重鏈可變區的重鏈：(1)序列識別號12或14之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列；(2)相對於(1)之胺基酸序列，至少具有95%以上之相同性的胺基酸序列；及(3)於(1)之胺基酸序列有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列；以及含有選自包含下列的群組的輕鏈可變區的輕鏈：(4)序列識別號16或18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列；(5)相對於(4)之胺基酸序列，至少具有95%以上之相同性的胺基酸序列；及(6)於(4)之胺基酸序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列。
  14. 如請求項1至11中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：含有序列識別號12之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號16之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈。
  15. 如請求項1至11中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：含有序列識別號12之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈。
  16. 如請求項1至11中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：含有序列識別號14之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈。
  17. 如請求項1至11中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：序列識別號12之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號16之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈。
  18. 如請求項1至11中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：序列識別號12之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號18之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈。
  19. 如請求項1至11中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其中抗CD98抗體包含：序列識別號14之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及序列識別號18之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈。
  20. 一種抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其係與包含序列識別號38之第462~541號之胺基酸殘基的部位結合。
  21. 如請求項20之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：序列識別號19所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRH1；序列識別號20所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRH2；序列識別號21所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRH3；序列識別號22所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRL1；序列識別號23所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRL2；及序列識別號24所表示的胺基酸序列或於該胺基酸序列有1或數個胺基酸殘基被添加、刪除或取代的胺基酸序列所構成的CDRL3。
  22. 如請求項20或21之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：序列識別號19所表示的胺基酸序列所構成的CDRH1； 序列識別號20所表示的胺基酸序列所構成的CDRH2；序列識別號21所表示的胺基酸序列所構成的CDRH3；序列識別號22所表示的胺基酸序列所構成的CDRL1；序列識別號23所表示的胺基酸序列所構成的CDRL2；及序列識別號24所表示的胺基酸序列所構成的CDRL3。
  23. 如請求項20至22中任1項之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：相對於序列識別號8之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列，至少具有90%之相同性的重鏈可變區及/或相對於序列識別號10之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列，至少具有90%之相同性的輕鏈可變區。
  24. 如請求項20至22中任1項之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：含有選自包含下列群組的重鏈可變區的重鏈：(1)序列識別號12或14之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列；(2)相對於(1)之胺基酸序列，至少具有95%以上之相同性的胺基酸序列；及(3)於(1)之胺基酸序列有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列；以及 含有選自包含下列群組的輕鏈可變區的輕鏈：(4)序列識別號16或18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列；(5)相對於(4)之胺基酸序列，至少具有95%以上之相同性的胺基酸序列；及(6)於(4)之胺基酸序列，有1或數個之胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列。
  25. 如請求項20至22中任1項之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：含有序列識別號12之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號16之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈。
  26. 如請求項20至22中任1項之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：含有序列識別號12之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈。
  27. 如請求項20至22中任1項之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：含有序列識別號14之第20~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號18之第21~135號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈。
  28. 如請求項20至22中任1項之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：含有序列識別號12之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號16之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈。
  29. 如請求項20至22中任1項之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：含有序列識別號12之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號18之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈。
  30. 如請求項20至22中任1項之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其包含：含有序列識別號14之第20~465號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號18之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區的輕鏈。
  31. 一種抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽，其包含如請求項20至30中任1項之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段。
  32. 一種醫藥組成物，其含有如請求項1至19及31中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽或者如請求項20至30中任1項之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段作為活性成分。
  33. 如請求項32之醫藥組成物，其係用於抗腫瘤或抗癌。
  34. 如請求項33之醫藥組成物，其中腫瘤或癌為肺癌、腎癌、尿道上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸部癌、食道癌、淋巴瘤、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病或多發性骨髓瘤。
  35. 一種如請求項1至19及31中任1項之抗體-藥物結合物或其藥學上可容許的鹽、或者如請求項20至30中任1項之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段之用途，其係用於製造醫藥組成物。
  36. 一種如請求項1至19及31中任1項之抗體-藥物結合物或其藥學上可容許的鹽、或者如請求項20至30中任1項之抗CD98抗體或該抗體之抗原結合片段，其係用於腫瘤及/或癌之治療的用途。
  37. 一種腫瘤及/或癌之治療方法，其包含將如請求項1至19及31中任1項之抗體-藥物結合物或其藥理學上可容許的鹽或者如請求項20至30中任1項之抗CD98抗體或者該抗體之抗原結合片段之治療有效量投予至哺乳類動物。
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