TW201620517A - 用於治療及／或預防腦澱粉樣變性（Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｅｓ）之給藥方案 - Google Patents

Abstract

本文中描述的是用於治療及/或預防腦澱粉樣變性例如阿茲海默症(AD)及/或腦澱粉樣血管病(CAA)的給藥方案及套組。

Description

用於治療及/或預防腦澱粉樣變性(Cerebral Amyloidoses)之給藥 方案

本發明大體而言係關於人類腦澱粉樣變性(例如阿茲海默症)及/或腦澱粉樣血管病的治療。

阿茲海默症是最大的社會經濟保健負擔之一。阿茲海默症的特徵在於存在神經纖維纏結(NFTs)和神經炎(老年)斑的進行性癡呆和組織病理學。斑是由名為β-澱粉樣蛋白(Aβ)的蛋白所組成，而纏結是由名為tau的蛋白所組成的。

澱粉樣蛋白斑和NFTs是阿茲海默症(AD)的兩個特徵。澱粉樣前驅蛋白(APP)中的突變和早老導致早發型阿茲海默症，並支持APP的處理也可能在偶發性AD的發病機制中扮演重要角色的假說。此外，「澱粉樣蛋白假說」預言一些有毒形式Aβ的積累對大腦是有害的。APP可以由α-和β分泌酶途徑進行處理。迄今，多數研究致力於發展AD療法，其中延緩疾病的進展集中在抑制γ分泌酶和β分泌酶及APP的代謝，以形成Aβ肽或活化α分泌酶的處理，以增加神經保護sAPPα肽的產生，同時減少Aβ 的產生。開發特異性β分泌酶抑制劑是困難的，部分是因為在體內的β分泌酶活性降低與腦中的Aβ肽減少之間似乎有非線性的關係。進一步的困難是大多數抑制劑的低腦滲透，γ分泌酶抑制劑受到了與刻痕抑制相關的嚴重GI副作用的進一步困擾，因為除了APP之外，γ分泌酶還處理許多其他的受質，包括刻痕受體。此外，γ分泌酶活性的缺陷已顯示導致神經退化，而且可能與早老1(γ分泌酶複合物的一種成分，其中含有γ分泌酶複合物的活性位點)突變所引起的常染色體顯性早發性阿茲海默症相關。

大多數針對治療阿茲海默症的努力是聚焦在減少AD的症狀。特別是，確認在AD患者前腦的受影響神經元中有較低濃度的膽鹼乙醯轉化酶產生了針對抑制突觸間隙中的乙醯膽鹼水解及延長在突觸的乙醯膽鹼水平的治療。雖然這個策略已導致神經傳導物質水平的至少部分校正，但治療效益一直很小。

另外，AD被分類為tau蛋白病變(tauopathy)。Tau蛋白病變是由tau蛋白的異常過度磷酸化從而促進tau蛋白的聚集和NFTs形成所引起的。由於tau和APP的突變都導致癡呆，故其中一者或兩者皆可能有助於AD的疾病進展。清楚理解的是，導致APP變異處理的突變會造成AD。目前，還沒有用於減緩阿茲海默症進展的許可療法。因此， 仍需要更有效益的AD治療。雖然大多數發展中的療法都聚焦在改變APP的代謝(例如β分泌酶和γ分泌酶抑制)或阻斷tau聚集，但本發明提供了使用藥理伴護蛋白(pharmacological chaperones)的治療，該藥理伴護蛋白結合於一個或更多個神經節苷脂酶及/或唾液酸酶，藉以增加sAPPα的產生，並減少Aβ及過度磷酸化tau蛋白的產生。

同樣地，腦澱粉樣血管病(CAA)是一種特徵在於中樞神經系統的血管壁中、特別是在軟腦膜和皮質動脈中有澱粉樣蛋白沉積的疾病。CAA大多以偶發症狀發生在老年人身上，且CAA的發病率與年齡的增長有關。這些偶發的CAA病例是由於源自APP的溶蛋白性裂解的Aβ沉積。CAA的遺傳形式一般都是家族性的，比偶發的CAA更嚴重而且更早發病。CAA最近也被認為是AD發展的潛在貢獻者。

本文中的所有引證皆以引用方式全部併入。

已經發現的是，目標為β-己醣胺酶(β-hex)的藥理伴護蛋白可以具有許多與腦澱粉樣變性的治療及/或預防相關的益處。特定言之，已發現藥理伴護蛋白2-乙醯胺基-1,2-二脫氧野尻黴素(AdDNJ)在荷蘭APP^E693Q轉殖基因小鼠身上可減少GAβ病變，並以劑量依賴的方式校正那些小鼠的 行為表型。AdDNJ具有良好的醫藥品質，包括良好的口服生物利用性、腦滲透、耐受性、選擇性及低毒性。因此，預期AdDNJ及其他用於提高β-hex活性的策略將有助於管理人類腦澱粉樣變性，例如阿茲海默症(AD)及/或腦澱粉樣血管病(CAA)。

因此，本發明的一個態樣係關於藉由投予有效量的2-乙醯胺基-1,2-二脫氧野尻黴素(AdDNJ)而在處於發展阿茲海默症及/或腦澱粉樣血管病的風險或被診斷患有阿茲海默症及/或腦澱粉樣血管病的患者身上預防及/或治療阿茲海默症及/或腦澱粉樣血管病的方法。在此態樣的一個或更多個實施例中，該方法包含在第一酶增強期間對該患者投予有效量的AdDNJ；在受質轉換期間不投予AdDNJ；然後在第二酶增強期間對該患者投予有效量的AdDNJ。

該第一酶增強期間和該第二酶增強期間可以具有相同的持續時間，或者該第一酶增強期間和該第二酶增強期間可以具有不同的持續時間。在各種實施例中，該第一酶增強期間和該第二酶增強期間中之一者或更多者為約1天至約8天的期間，例如約4天至約6天的期間。AdDNJ可以在該第一酶增強期間和該第二酶增強期間中之一者或更多者期間每天投藥。

在一個或更多個實施例中，AdDNJ係口服投藥。其他的投藥途徑包括、但不限於鼻內投藥。

依據一個或更多個實施例，AdDNJ的投藥劑量在約3mg/kg/天至約300mg/kg/天的範圍中，例如約100mg/kg/天。

在一個或更多個實施例中，在受質轉換期間不投予AdDNJ包含在約48小時至約96小時的期間、例如約72小時的期間不投予AdDNJ。其他的例示性受質轉換期間包括約24小時不投予AdDNJ或約48小時不投予AdDNJ。

酶增強期間和受質轉換期間的各種組合都是可能的。在一個例示性的時間表中，第一酶增強期間為約5天，而且在受質轉換期間不投予AdDNJ包含在約72小時的期間不投予AdDNJ。

另一例示性的時間表包括在第1天對該患者投予有效量的AdDNJ；在第2天不投予AdDNJ；在第3天對該患者投予有效量的AdDNJ；在第4天不投予AdDNJ；在第5天對該患者投予有效量的AdDNJ；然後在約72小時的期間不投予AdDNJ。

在又另一個例示性的時間表中包括1，該第一酶增強期間為約3天，而且在受質轉換期間不投予AdDNJ包含在約120小時的期間不投予AdDNJ。

該方法可以包含額外的受質轉換期間及/或額外的酶增強期間。在一個或更多個實施例中，該方法包含在酶增強期間和受質轉換期間之間交替 進行一定的總治療時間，例如至少1個月的治療時間。總治療時間可以是進行治療的任何適當時段，例如至少1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或12個月或是1年、2年、3年或4年。在各種實施例中，AdDNJ被投予一段未限定的時間。每個酶增強期間或每個受質轉換期間可以分別與另一個酶增強期間或受質轉換期間相同或不同。

本發明的另一個態樣包含用於治療及/或預防阿茲海默症及/或CAA的套組。在一個或更多個實施例中，該套組包含一種或更多種包含有效量的AdDNJ的劑型及依據本文所述的任何方法投予該劑型的指示。例如，該套組可以包含指示用以在第一酶增強期間投予該劑型；在受質轉換期間不投予該劑型；然後在第二酶增強期間投予該劑型。

該套組可以包含一種或一種或更多種不包含有效量AdDNJ的非活性劑型。該套組可以包括指示用以在第一酶增強期間投予該活性劑型；在受質轉換期間投予該非活性劑型；然後在第二酶增強期間投予該活性劑型。

酶增強期間和受質還原期間可以具有本文所述的任何特徵。

第1a圖至第1g圖圖示針對β-hex藥理伴護蛋白AdDNJ的效力、選擇性及細胞毒性總結之總結。AdDNJ是β-hex的特異性抑制劑(a)，而且在100μM或是溶酶體酶β-葡糖腦苷脂酶(GCase)、α-半乳糖苷酶(α-Gal)、或β-半乳糖苷酶(β-Gal)在10μM不會抑制O-GlcNAcase(c-d)，測試的最高濃度(e)。此外，AdDNJ對於人類皮膚纖維母細胞(f)和使用濃度高達1mM的AdDNJ處理長達120小時的SH-SY5Y(g)之細胞存活力具有極少的影響或沒有影響。AdDNJ在纖維母細胞中增加β-Hex水平3倍。使用AdDNJ(95-780nM)處理健康人衍生的纖維母細胞5天在總的野生型β-hex水平中產生劑量依賴的增加高達3倍(b)。數據被表示為平均值±標準差。

第2a圖至第2b圖圖示在C57BL/J6小鼠的單劑量AdDNJ藥物動力學研究。給予5週齡雄性C57BL/J6小鼠單次100mg/kg劑量的β-hex針對性藥理伴護蛋白AdDNJ。血漿(a)和大腦(b)AdDNJ曲線。100mg/kg的AdDNJ穿過血腦屏障，並在腦中達到預期足以結合的水平並增加β-hex的水平(>342nM)，而且在16小時內對於β-hex下降到低於Ki(在pH5為253nM)的水平(每個時間點n=5隻小鼠)。將數據表示為平均值±標準差。

第3a圖至第3b圖圖示在C57BL/J6小鼠的AdDNJ重複劑量和劑量-反應研究。5週齡雄性C57BL/6小鼠每天被口服強飼載體(vehicle)、30、100或300mg/kg的β-hex針對性藥理伴護蛋白AdDNJ，長達14天。全腦Hex A&S(a)和Hex B(b)活性(每個時間點n=5隻小鼠)。數據被表示為平均值±標準差。

第4a圖至第4c圖圖示在荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠身上以AdDNJ處理之後增加的大腦β-hex水平。3個月大的雄性荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠不進行處理、或口服載體或AdDNJ三個月。AdDNJ的處理以劑量依賴的方式增加β-hex B(a)、β-hex A&S(b)及總β-hex水平(未處理的；n=3，載體；n=6，3及10mg/kg的AdDNJ；n=7，30和100mg/kg的AdDNJ；n=6)。數據被表示為平均值±標準差。單向ANOVA具有Bonferroni因果關係分析，*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

第5a圖至第5b圖圖示在荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠身上以AdDNJ治療之後焦慮減少並防止學習行為障礙發病。3月大的雄性荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠不進行治療(n=15)、或口服給予載體(n=15)或AdDNJ(3、10、30或100mg/kg的AdDNJ；n=13/治療組)進 行三個月。在高架十字迷宮中，6個月大載體治療的荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠表現出比3個月大未經治療的小鼠增加的焦慮，這在使用所有劑量的AdDNJ測試的以下治療中相反(a)。3月大未經治療的小鼠表現出完整的記憶、探索新穎的(新的)物體比熟悉的(舊的)物體更多，而6個月大載體治療的荷蘭基因轉殖小鼠在新穎物體識別(NOR)中表現出學習行為障礙，在NOR測試中AdDNJ以劑量依賴的方式防止學習障礙發病(b)。數據被表示為平均值±標準差。*P<0.05，***P<0.001。

第6圖圖示在以AdDNJ治療荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠之後，與環境有關的和線索的恐懼條件學習行為。3個月大的雄性荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠不進行治療(n=15)、或口服給予載體(n=15)或AdDNJ(3、10、30或100mg/kg的AdDNJ；治療過的n=13/組)進行三個月。AdDNJ對於與環境有關的或線索的學習行為沒有影響。數據被表示為平均值±標準差。

第7a圖至第7o圖圖示以AdDNJ處理荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠3個月之後Aβ和寡聚體的水平。3個月大的雄性荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠不進行治療、或者口服給予載體或AdDNJ(3、10、30或100mg/kg的AdDNJ；治療後的n=13/組)進行三個月。AdDNJ對於Aβ40(a-d)、Aβ42 (e-h)、Aβ42/40比例(i-l)或A11預原纖Aβ(m)或使用抗體(OC或NU-4，n-o)的寡聚體沒有影響(n=5/組)。數據被表示為平均值±標準差。

第8a圖至第8f圖圖示在以AdDNJ治療荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠之後Aβ免疫反應減少。將來自口服投予載體(a、c、e)或100mg/kg AdDNJ(b、d、f)三個月的雄性荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠之矢狀大腦切片以抗體6E10染色(載體；n=4，100mg/kg AdDNJ；n=4)。Aβ免疫反應在下腳較不激烈(a、b)，但經AdDNJ治療的荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠之視覺皮層(c、d)或海馬CA1區(e、f)則不然。比例尺a-f200μM；以及第9a圖至第9p圖圖示在以AdDNJ治療荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠之後，結合神經節苷脂的Aβ(GAβ)免疫反應性降低。來自服用載體(a、c、e、g、i)或AdDNJ(b、d、f、h、j)三個月的雄性荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠之大腦矢狀切片以GAβ(43696C)染色(載體；n=4，100mg/kg AdDNJ；n=4)。在下腳和嗅緣皮質(k、i)，藉由43696C抗體檢測的GAβ免疫反應性降低。在視覺皮層、側邊內嗅皮質及海馬CA1區的GAβ未改變(m、n、o)。比例尺a-j 200μM。在皮層 區域在血管以Gaβ染色是可檢測的(p)。數據被表示為平均值±標準差。*P<0.05。

第10a圖至第10d圖圖示AdDNJ治療的荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠對於TLC評估的神經節苷脂分佈沒有可檢測到的影響。3個月大的雄性荷蘭基因轉殖小鼠不進行治療、或口服給予載體或AdDNJ三個月。整個前腦的薄層層析分析顯示，AdDNJ治療並未明顯改變GM1、GM2及GM3神經節苷脂水平(a-d)(載體；n=6，100mg/kgAdDNJ；n=7)。

Aβ是疏水性的38-至43-胺基酸肽，可在所有的生物流體中找到，並衍生自較大的I型膜蛋白-澱粉樣前驅蛋白(APP)之酶裂解。家族性AD患者的連鎖研究確定了兩個基因(APP和早老)中的數個突變與APP的異常代謝與增加的聚合形式Aβ產生有關。據認為，Aβ形成的有毒寡聚體可能在阿茲海默症的病變中扮演重要角色(Shankar等人，2008)。

神經節苷脂促進神經毒性形式的Aβ在腦中產生(即寡聚體)。神經節苷脂是在細胞膜的外部小葉中發現的含唾液酸鞘糖脂，而且在神經元的細胞表面上尤其豐富。習知神經節苷脂以團簇存在並在質膜的表面上形成微域。神經節苷脂的這種特異性定 位使它們能夠與各種生物效應器相互作用，包括糖蛋白、肽類激素及生長因子。此外，神經節苷脂(例如神經節苷脂GM1)可以促進細胞分化，防止神經生成的損失，並在神經元損傷的體外和體內模型中扮演神經保護的角色。

神經節苷脂在神經系統中最豐富，並參與各種功能，包括訊號轉導的調解、細胞黏附及細胞分化。雖然超過200種神經節苷脂已被識別出，但神經元中的大多數神經節苷脂是由一種或更多種神經節苷脂酶及/或唾液酸酶分解代謝的。

α分泌酶活性、可溶性APPα(sAPPα)與β分泌酶活性、可溶性APPβ(βAPPβ)的產物之差異在於sAPPa中包括Aβ的前16個殘基。由於被α分泌酶裂解的APP切割平分Aβ域，所以沒有反應產物可以產生澱粉樣蛋白。因此，假設α分泌酶的活性活化或上調可防止或減少有毒Aβ寡聚體和澱粉樣蛋白斑形成，同時增加神經營養和神經保護sAPPa的脫落。有趣的是，抑制鞘糖脂和神經節苷脂的合成已經顯示可活化sAPPα的脫落(Sawamura等人，2004)。

APP的突變也導致家族性阿茲海默症及/或腦澱粉樣血管病(CAA)。神經節苷脂GM2、GM3及GD3可以調節區域性的Aβ沉積，因為該等神經節苷脂在腦中被以區域特定的方式表現 (Yamamoto等人，2006)。遺傳變異的荷蘭和義大利型Aββ的組合與法蘭德斯型Aβ分別被神經節苷脂GM3和神經節苷脂GD3加速。值得注意的是，組成腦血管壁(荷蘭和義大利型Aββ沉積之處)的腦血管平滑肌細胞只表達GM2和GM3(Yamamoto等人，2006年)。因此，遺傳性Aβ變體的組合可以藉由局部的環境因素來加速，例如大腦中存在特定的神經節苷脂。

近來鞘糖脂和神經節苷脂已被牽連在神經退化相關蛋白的錯誤折疊和聚集中(例如，帕金森氏症對葡糖腦苷脂酶突變的基因連鎖)(Alcalay等人，2012年；Daniele等人，2012年)。越來越多的證據指出，神經節苷脂代謝的異常可能會藉由加速神經毒性形式的Aβ在腦和血管中產生而促進阿茲海默症(AD)的發病機制和腦澱粉樣血管病(CAA)。在老化和神經退化的過程中，膜的物理化學性質發生變化，從而導致膜中脂質的比例不平衡及/或膜脂質的比率改變，這可能會促進AD發病(Yanagisawa，2007年；Mutoh等人，2006年；Hayashi等人，2004年；Karcun等人，1991年；Brooksbank等人，1989年；Matsuzaki，2007年)。與此想法一致的是，升高的單唾液酸神經節苷脂(GM1、GM2及GM3)水平已被報導在AD腦的皮質中(Gylys等人，2007年)，其中單 唾液酸神經節苷脂顯然局部化到受影響大腦的額葉、顳及頂葉皮層中的膜微域(耐清潔劑膜)(Kracun等人，1991年；Molander-Melin等人，2005年)。同時，已在大腦檢測到結合神經節苷脂的Aβ(GAβ)肽只表現出非常早期階段的AD病變(Yanagisawa等人，1995年；Yanagisawa等人，1997年；Yanagisawa等人，1998年)，表示神經節苷脂可能在AD的早期發病機制中發揮一些作用，例如Aβ纖絲的播種(Yanagisawa等人，2007年；Yamamoto等人，2005年；Selkoe，1995年)。值得注意的是，Aβ的一些突變體形式(特別是那些有利於寡聚的突變)對GM2和GM3的親聚集性質表現出特定的易感性(Yamamoto等人，2005年；Yamamoto等人，2006年)。

β-己醣胺酶(β-Hex)分解代謝GM2神經節苷脂，而且β己醣胺酶的缺乏導致常染色體隱性溶酶體貯積失調、泰-薩克斯(Tay-Sachs)症及桑德霍夫(Sandhoff)症(Mahuran，1999年)。已經發現神經元內累積的類抗Aβ免疫反應性在HEXB KO小鼠的腦中使用抗體4G8、類抗α-synuclein免疫反應性、及類抗pTau免疫反應性(Keilani等人，2012年)。生物化學和免疫組織化學分析證實，神經元內4G8免疫反應性表示APP-CTFs及/或Aβ但不是全長的APP。此外，在 脂質相關部分中發現水平增加的Aβ40和Aβ42肽(與從野生型大腦回收的相比)。也在HEXB KO小鼠的大腦和人類受試者的大腦中觀察到結合神經節苷脂的Aβ免疫反應性積累帶有GM1和GM2神經節苷脂酶。綜合在一起，這些結果描繪出神經節苷脂積累與Aβ積累之間的關聯。

GM2和GM3神經節苷脂已經顯示在體外促進特別容易寡聚的荷蘭、愛荷華及義大利型突變Aβ肽組裝(Yamamoto等人，2005年；Yamamoto等人，2006年)。已經顯示荷蘭APPE693Q基因轉殖小鼠的世代和表徵是在腦(特別是在海馬下腳、視覺皮層及海馬的CA1區中的神經元內)中積聚Aβ寡聚體及發展出焦慮和學習行為缺陷，但他們從來沒有發展出澱粉樣蛋白斑(甘迪等人，2010年)。據推測，使用針對β-hex的「藥理伴護蛋白」來提高β-hex的活性以降低GM2的水平將會減少Aβ的寡聚並防止荷蘭APPE693Q基因轉殖小鼠的行為變化。藥理伴護蛋白表示新的治療策略是在行為中作為選擇性結合和穩定的目標蛋白的小分子，以促進正確折疊並減少過早降解(Tropak等人，2007年；Maegawa等人，2007年；Tropak等人，2004年；Rountree等人，2009年)。這些藥理伴護蛋白是可逆結合蛋白質的小分子，從而穩定蛋白標靶並增加半衰期。藥理伴護蛋白療法囊性纖維化和幾個溶酶體貯積症，包 括法布里(Fabry)症、戈謝(Gaucher)症、龐貝氏(Pompe)症、桑德霍夫症及泰-薩克斯症，已被或持續被進行臨床試驗評估(Boyd等人，2013年；Wustman等人，2012年；Osher等人，2011年；Clarke等人，2011年)。

本發明的一個態樣提供使用針對β-Hex的藥理伴護蛋白治療及/或預防腦澱粉樣變性例如阿茲海默症及/或腦澱粉樣血管病的給藥方案。在該態樣的一個或更多個實施例中，該藥理伴護蛋白為2-乙醯胺基-1,2-二脫氧野尻黴素(AdDNJ)。

AdDNJ，也稱為2-乙醯胺基-1,2,5-三脫氧-1,5-亞胺基-D-山梨醇，是一種具有以下結構的化合物：

AdDNJ可被以如上所示的游離形式投藥，或者可以被以醫藥上可接受的鹽、溶劑合物或前藥的形式投藥。

在一個或更多個實施例中，AdDNJ被以平衡AdDNJ的陪伴和抑制作用的獨特給藥方案投藥。例如，可以在酶增強期間投予AdDNJ，其中AdDNJ藉由促進正確折疊、輸送、不聚集等來增強β-hex活性。在酶增強期間之後，可以在受質轉換期 間不投予AdDNJ，以允許AdDNJ濃度下降到抑制濃度以下，而使AdDNJ能夠從β-hex解離。該給藥方案可以包括第二酶增強期間，該第二酶增強期間可與該第一酶增強期間相同或不同。該給藥方案可以包括第二受質轉換期間，該第二受質轉換期間可以與該第一受質轉換期間相同或不同。該給藥方案也可包括在酶增強期間和受質轉換期間之間循環。

例示性的酶增強期間可以在數小時至數天的範圍中。例如，AdDNJ可以在1天至10天的期間一天投藥1次或一天投藥多次(2次、3次、4次等)。在各種實施例中，酶增強期間為約1、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36、48、60、72、96、120小時、或約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。

例示性的受質轉換期間也可以在數小時至數天的範圍中。受質轉換期間被定義為連續的酶增強期間之間的時間。在各種實施例中，酶增強期間為約1、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36、48、60、72、96、120小時、或約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。例如，假使受質轉換期間為約24小時並且酶增強期間是由單次AdDNJ投藥所組成，則連續AdDNJ投藥之間的時間為約24小時(即一天1次)。同樣地，假使受質轉換期間為約48小時並且酶增強期間是由單次AdDNJ投藥所組成，則連續AdDNJ投藥之間的時間為約48小時(即每隔一 天)。進一步的實例包括約72小時的受質轉換期間(例如在週一和週四但不在週二和週三投藥)。用語「約24小時」、「約48小時」、及「約72小時」不要求投藥是在每個投藥日的同一時間，而僅僅表示投藥發生在不同的日子。

適當的給藥方案之實例包括、但不限於以下的投藥：a.每週連續五天(例如週一至週五)，每天1次、2次或3次；b.每週七天(例如週一至週日)，每天1次、2次或3次；c.每週連續三天(例如週一至週三)，每天1次、2次或3次；d.每週三個不連續日(例如週一、週三、週五)，每天1次、2次或3次；及e.每隔一天，每天1次、2次或3次。

每次單獨投藥可以包括治療有效量的AdDNJ或AdDNJ之鹽、溶劑合物或前藥。每次投藥可以包括量的範圍從1mg/kg至約1,000mg/kg的AdDNJ或AdDNJ之鹽、溶劑合物或前藥。例示性的量包括1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、 40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、225mg/kg、250mg/kg、275mg/kg、300mg/kg、325mg/kg、350mg/kg、375mg/kg、400mg/kg、425mg/kg、450mg/kg、475mg/kg、500mg/kg、550mg/kg、600mg/kg、650mg/kg、700mg/kg、750mg/kg、800mg/kg、850mg/kg、900mg/kg、950mg/kg及1,000mg/kg。例示性的量還包括25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、250mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1,000mg、1,100mg、1,200mg、1,300mg、1,400mg、1,500mg、1,600mg、1,700mg、1,800mg、1,900mg、2,000mg、2,500mg、3,000mg、3,500mg、4,000mg、4,500mg、5g、6g、7g、8g、9g、10g、11g、12g、13g、14g、15g、16g、17g、18g、19g及20g。在不同投藥期間的投藥量可以相同或投藥的量可以改變。

本發明的另一個態樣提供使用針對β-Hex的藥理伴護蛋白治療及/或預防腦澱粉樣變性 例如阿茲海默症及/或CAA的套組。在該態樣的一個或更多個實施例中，藥理伴護蛋白為2-乙醯胺基-1,2-二脫氧野尻黴素(AdDNJ)。該套組包括一種或更多種包含有效量的藥理伴護蛋白的劑型。該套組可以包括依據本文所述的任何給藥方案投予藥理伴護蛋白的指示。該套組還可以包括不包括藥理伴護蛋白的非活性劑型。無論是活性及/或非活性劑型都可以包括其他的治療劑，例如適用於組合治療的那些。

藥理伴護蛋白可以被配製為適用於任何投藥途徑，包括例如以片劑或膠囊或液體的形式口服、或以無菌水溶液注射。當藥理伴護蛋白被配製用於口服投藥時，片劑或膠囊可以藉由傳統的方式使用醫藥上可接受的賦形劑製備，該賦形劑例如黏結劑(例如預膠化玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或矽石)；崩解劑(例如馬鈴薯澱粉或澱粉羥乙酸鈉)；或潤濕劑(例如月桂硫酸鈉)。片劑可以藉由所屬技術領域中熟知的方法包覆。口服投藥的液體製劑可以採用例如溶液、糖漿或懸浮液的形式，或者可以作為乾燥產品存在，用於在使用前與水或另一種適當的載體組合。這種液體製劑可以藉由傳統方式使用醫藥上可接受的添加劑製備，該添加劑例如懸浮劑(例如山梨醇糖 漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性載體(例如杏仁油、油酯、乙醇或分餾植物油)；或防腐劑(例如甲基-對-羥基苯甲酸酯或丙基-對-羥基苯甲酸酯或山梨酸)。液體製劑還可以適當地含有緩衝鹽、調味劑、著色劑或甜味劑。口服投藥的製劑可以被適當地配製，以提供受控或持續的化合物釋放。

在本發明的一個或更多個實施例中，化合物是以允許全身分佈或吸收的劑型投藥，使得該化合物可以穿過血-腦屏障，以便對神經元細胞發揮作用。這種允許全身分佈或吸收的劑型可以是口服或非口服的。在一些實施例中，該化合物可以分佈全身，包括穿過血-腦屏障。例如，適用於非口服/注射使用的化合物之藥物製劑通常包括無菌水溶液(在水溶性的情況下)、或用於臨時製備無菌注射溶液或分散液的分散液與無菌粉末。在所有情況下，劑形必須是無菌的，並且必須以存在易注射性的程度流動。劑形在製造和儲存條件下必須是穩定的，並且必須被保存為可對抗諸如細菌和真菌的微生物之污染作用。載劑可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、及類似物)、上述介質之適當混合物、或植物油的溶劑或分散介質。可以例如藉由使用諸如卵磷脂的包衣、在分散液的情況下藉由保持所需的粒徑、及藉由使用界面活性劑來保持適當的流動性。預 防微生物的作用可以藉由各種抗菌劑和抗真菌劑來實現，例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、芣醇、山梨酸、及類似物。在許多情況下，包括等滲劑將是合理的，該等滲劑例如糖或氯化鈉。注射組成物的延長吸收可以藉由在組成物中使用延遲吸收劑來實現，該延遲吸收劑例如單硬脂酸鋁或明膠。

無菌注射溶液是藉由將該化合物以所需量摻入視需要具有上面列舉的各種其他成分的適當溶劑中、隨後進行過濾或最終滅菌來製備。一般來說，分散液是藉由將各種滅菌的活性成分摻入無菌載體中來製備，該無菌載劑含有基本分散介質及來自以上列舉的其他所需成分。在用於製備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，較佳的製備方法是產生活性成分粉末的真空乾燥和冷凍乾燥技術加上任何來自該活性成分粉末之先前無菌過濾溶液的額外需要成分。

製劑可以含有賦形劑。製劑中可以包括的醫藥上可接受賦形劑是緩衝液，例如檸檬酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液、及碳酸氫鹽緩衝液、胺基酸、尿素、醇、抗壞血酸、磷脂質；蛋白質，例如血清白蛋白、膠原蛋白及明膠；鹽，例如EDTA或EGTA、及氯化鈉；脂質體；聚乙烯吡咯烷酮；糖類，例如葡萄聚糖、甘露醇、山梨醇及甘油；丙二醇和聚乙二醇(例如PEG-4000、PEG-6000)；甘油；甘胺酸或其他胺基酸；以及脂質。用於製劑的緩 衝液系統包括檸檬酸鹽；醋酸；碳酸氫鹽；及磷酸鹽緩衝液。磷酸鹽緩衝液是常用的賦形劑。

製劑也可以含有非離子型清潔劑。非離子型清潔劑的實例包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Triton X-100、Triton X-114、Nonidet P-40、辛基α葡萄糖苷、辛基β葡萄糖苷、Brij 35、Pluronic、及Tween 20。

治療劑可以口服或非口服地投藥，包括靜脈內、皮下、動脈內、腹膜內、眼內、肌內、經頰、經直腸、經陰道、眶內、腦內、皮內、顱內、脊柱內、心室內、鞘內、腦池內、囊內、肺內、鼻內、經黏膜、經皮、或經由吸入投藥。在一個較佳的實施例中，治療劑是口服投藥。

治療劑的投藥可以藉由定期注射製劑的丸藥，或者可以藉由從外部儲存器(例如靜脈注射袋)或內部儲存器(例如生物可降解植入物)靜脈內或腹膜內投藥。參見例如美國專利第4,407,957號和第5,798,113號，每件專利皆以引用方式併入本文中。肺內遞送方法和裝置被描述在例如美國專利第5,654,007號、第5,780,014號、及第5,814,607號，每件專利皆以引用方式併入本文中。其他有用的腸胃外遞送系統包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入輸注系統、泵遞送、膠囊封裝細胞遞送、脂質體遞送、針遞送注射、無針 注射、噴霧器、煙霧器、電穿孔、及經皮貼劑。無針注射器裝置被描述在美國專利第5,879,327號、第5,520,639號、第5,846,233號、及第5,704,911號中，將該等專利之說明書以引用方式併入本文中。任何上述製劑皆可以使用這些方法來投藥。

皮下注射具有允許自身投藥的優點，同時與靜脈內投藥相比還產生了延長的血漿半衰期。此外，各種為了患者的方便所設計的裝置，例如可填充注射筆及無針注射裝置，皆可與本文討論的本發明製劑一起使用。

適當的醫藥製劑是處於單位劑型。在這樣的劑型中，製劑被細分為含有適量(例如實現所需目的的有效量)活性成分的適當大小單位劑量。在某些實施例中，治療劑是以一個或更多個日劑量投藥(例如一天一次、一天兩次、一天三次)。在某些實施例中，治療劑被間歇性地投藥。

依據本發明的一個或更多個實施例，被治療的個體可具有任何腦澱粉樣變性或處於發展任何腦澱粉樣變性的風險。這樣的腦澱粉樣變性包括、但不限於阿茲海默症和腦澱粉樣血管病(CAA)。例如，腦澱粉樣變性可以是任何形式的阿茲海默症，包括早發家族性阿茲海默症。腦澱粉樣變性也可以是任何形式的CAA，包括遺傳型CAA與具有阿茲海默症 的CAA。個體可能具有腦澱粉樣變性的風險因子或處於發展腦澱粉樣變性的風險。這樣的風險因子包括、但不限於與發展阿茲海默症和CAA的風險增加相關的脂蛋白元E之ApoE4等位基因。個體可能已被診斷患有腦澱粉樣變性。另外，個體可能尚未被診斷患有腦澱粉樣變性，但表現出其中一個疾病的特徵。在進一步的實施例中，阿茲海默症是由唐氏症所引起或與唐氏症相關聯。

另外，治療可以包括一種或更多種藥理伴護蛋白的組合，而且還可以與其他習知的阿茲海默症治療或其他腦澱粉樣變性結合。治療還可以包括一種、兩種、三種或更多種藥理伴護蛋白的組合或一種、兩種、三種或更多種伴護蛋白分子與一種或更多種葡苷基神經醯胺合成酶抑制劑的組合。包括一種或更多種伴護蛋白分子與一種或更多種葡苷基神經醯胺合成酶抑制劑的組合療法可以提高神經節苷脂酶的活性並降低葡苷基神經醯胺合成酶的活性。

定義

本說明書中使用的術語通常在本發明的上下文中以及在使用每個術語的特定上下文中具有所屬技術領域中的普通意義。某些術語將在下面或在說明書中的其他地方討論，以在描述本發明及如何製造和使用本發明中對實施者提供額外的指導。

本文中使用的術語「藥理伴護蛋白」是指特異結合於一個或更多個神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的分子，並具有一個或更多個以下的效果：(i)增強蛋白質的穩定分子構形的形成；(ii)增強蛋白質從ER到另一個細胞位置(較佳是原生細胞位置)的正常輸送，即防止蛋白質的ER相關降解；(iii)防止構形不穩定的(即錯誤折疊的)蛋白質聚集；(iv)恢復或增強蛋白質的至少部分野生型功能、穩定性、及/或活性；及/或(v)改良細胞的表型或功能。因此，神經節苷脂酶或唾液酸酶的藥理伴護蛋白是一種結合到一個或更多個神經節苷脂酶及/或唾液酸酶從而產生正確折疊、運輸、不聚集、及活性增加的神經節苷脂酶及/或唾液酸酶的分子。該分子包括特異結合分子，例如活性位點特異的伴護蛋白分子、抑制劑、異位結合劑、增強蛋白質穩定性的非活性位點結合劑。在一個或更多個實施例中，藥理伴護蛋白對β-Hex例如AdDNJ特異。

術語「藥理伴護蛋白」(PC)是指選擇性結合並穩定標靶蛋白質以促進正確折疊、減少過早降解及提高ER輸出效率的小分子。小分子被稱為「伴護蛋白分子」，因為小分子幫助蛋白質從被合成之處(ER)到達預定的位置(例如溶酶體或細胞表面)。分子是結合並穩定蛋白質標靶、幫助恢復適當輸送、然後離解使得蛋白質可以進行正常功能的可逆結合 劑。「藥理」修飾詞表示分子特異性：分子被設計來只與單一預定蛋白質標靶相互作用並且只穩定單一預定蛋白質標靶，而且PC通常不影響多個蛋白質或細胞處理，例如蛋白質輸送、ER品質控制、蛋白酶體功能、或生物伴護蛋白分子(例如熱休克蛋白質)的活性。這種方法可廣泛應用於其中預期增強特定蛋白質(突變或野生型)的功能將提供治療效益的疾病。

不正確折疊蛋白質的保留和過早降解並不限於突變蛋白質。已經顯示的是，所有新合成的蛋白質中大部分(高達30%)是針對蛋白酶體造成的過早降解。後續的研究已顯示，藥理伴護蛋白可以藉由促進蛋白質折疊、穩定性及ER輸出來對許多野生型蛋白質提高細胞水平。

分子伴護蛋白穩定蛋白質構形。在人體內，蛋白質參與幾乎細胞功能的每個方面。某些人類疾病是由導致蛋白質的胺基酸序列改變的突變所造成的，該突變降低蛋白質的穩定性，而且可能防止蛋白質適當折疊。大多數導致較不穩定或錯誤折疊蛋白質產生的基因突變被稱為誤義突變。這些突變導致蛋白質中的單個胺基酸被取代為另一個胺基酸。由於此錯誤，誤義突變往往產生生物活性水平降低的蛋白質。除了誤義突變之外，也有會產生生物活性降低的蛋白質的其他類型突變。

蛋白質通常在習知為內質網或ER的細胞特定區域中折疊。細胞具有確保蛋白質在細胞中從ER移動到適當目的地(通常被稱為蛋白質輸送的過程)之前折疊成正確三維形狀的目標品質控制機制。最初被保留在ER之後，錯誤折疊及/或不穩定的蛋白質往往被品質控制機制消除。在某些情況下，錯誤折疊的蛋白質在被消除之前會在ER累積。

保留在ER的錯誤折疊蛋白質會中斷錯誤折疊蛋白質的正常輸送，而且產生的降低生物活性會導致受損的細胞功能，並於最終產生疾病。此外，在ER累積的錯誤折疊蛋白質可能在細胞上產生各種類型的應力，從而也可能導致細胞功能障礙和疾病。

內源性分子伴護蛋白存在於幾乎所有類型的細胞中及多數的細胞腔隙中。一些內源性分子伴護蛋白參與蛋白質的輸送並允許細胞在諸如熱休克和葡萄糖飢餓的壓力下存活。在內源性伴護蛋白分子(分子伴護蛋白)之間，BiP(免疫球蛋白重鏈結合蛋白，Grp78)是ER的最佳表徵伴護蛋白分子。就像其他的伴護蛋白分子，BiP的整個成熟期皆在ER內與許多分泌蛋白和膜蛋白相互作用。當初生蛋白質的折疊順利進展時，這種相互作用通常是微弱而短暫的。一旦實現了原生蛋白質構形，則分子伴護蛋白不再與蛋白質相互作用。結合到無法折疊、組裝、或被適當醣苷基化的蛋白質的BiP變得穩定，而且通常導 致蛋白質通過ER相關的降解途徑降解。這個過程在ER中作為「品質控制」系統，從而確保只有那些正確折疊和組裝的蛋白質被輸出ER以進一步成熟，並且不當折疊的蛋白質或不穩定的蛋白質被保留進行後續的降解。由於低效率的熱力學蛋白質折疊過程和ER品質控制系統的組合作用，只有一部分的一些野生型蛋白質變為折疊成穩定的構形，並成功地離開ER。

衍生自特定酶抑制劑的藥理伴護蛋白挽救變異酶和增強野生型酶。例如，與溶酶體貯積症(LSDs)相關的酶與小分子抑制劑的結合可以提高變異酶和相應的野生型酶兩者之穩定性(參見美國專利第6,274,597號；第6,583,158號；第6,589,964號；第6,599,919號；第6,916,829號；及第7,141,582號，全部皆以引用方式併入本文中)。特別是，在體外實驗發現到，投予葡萄糖和半乳糖的小分子衍生物(為數種標靶溶酶體酶的特異、選擇性競爭抑制劑)可有效提高細胞中的酶之穩定性，因而增加酶到溶酶體的輸送。因此，藉由增加溶酶體中的酶量，預期酶受質的水解會增加。由於變異酶蛋白質在ER是不穩定的，所以酶蛋白質在正常的輸送路徑(ER→高基氏體→核內體→溶酶體)中受到阻礙並過早降解。因此，某些結合到變異酶並提 高變異酶之穩定性的化合物可以作為酶的「伴護蛋白分子」並增加可以離開ER和移到溶酶體的量。

由於已知某些酶抑制劑是特異結合於酶的催化中心(「活性位點」)，從而在體外產生穩定化的酶構形，所以這些抑制劑被提出而有些矛盾地作為可幫助恢復從ER離開、輸送到溶酶體、水解活性的有效伴護蛋白。這些特定的藥理伴護蛋白被稱為「活性位點特異伴護蛋白(ASSCs)」或「特定藥理伴護蛋白」，因為這些特定的藥理伴護蛋白在酶的活性位點以特定的方式結合。藥理伴護蛋白療法具有優於酶替代療法(ERT)的潛在優點，因為小分子可以被口服投藥，而且與基於蛋白質的療法相比可以具有優異的生物分佈。

除了挽救變異酶，藥理伴護蛋白還增強ER分泌和野生型酶的活性。因此，在折疊過程中誘導酶的穩定分子構形的化合物作為「伴護蛋白分子」來穩定處於適當構形的酶以從ER離開。

術語「神經節苷脂」或「唾液酸神經節苷酯(sialoganglisides)」是指由N-醯基鞘氨醇和帶有一個或更多個N-乙醯神經胺酸(唾液酸，NeuAc)殘基的寡醣鏈所組成的鞘糖脂(glycosphingo lipids)。

術語「無唾液酸神經節苷脂(asialogangliosides)」是指沒有N-乙醯神經 胺酸(唾液酸，NeuAc)殘基並且包括LacCer、GA2及GA1的神經節苷脂(Ariga等人)。

術語「神經節苷脂酶」是指從神經節苷脂和無唾液酸神經節苷脂的非還原末端單元依序移除單個N-乙醯神經胺酸(唾液酸，NeuAc)和糖殘基的唾液酸酶和外糖水解酶(exoglycohydrolases)。這種降解主要通過胞吞作用-核內體-溶酶體途徑發生。神經節苷脂酶的實例包括唾液酸酶2(神經胺酸苷酶2；NEU2)、唾液酸酶3(神經胺酸苷酶3；NEU3)、唾液酸酶4(神經胺酸苷酶4；NEU4)、β-半乳糖苷酶(GLB1)、β-己醣胺酶A(HEXA/HEXB)、β-己醣胺酶B(HEXB)、及β-己醣胺酶S(HEXS)。

術語「唾液酸酶」是指從神經節苷脂、寡醣及糖蛋白的非還原末端單元移除單個N-乙醯神經胺酸(唾液酸，NeuAc)殘基的酶。術語「唾液酸酶」包括從神經節苷脂以核內體-溶酶體的途徑移除單個N-乙醯神經胺酸殘基的唾液酸酶2(神經胺酸苷酶2)、唾液酸酶3(神經胺酸苷酶3)及唾液酸酶4(神經胺酸苷酶4)及從寡醣和糖蛋白移除單個N-乙醯神經胺酸殘基的唾液酸酶1等酶。神經節苷脂上的N-乙醯神經胺酸殘基已經顯示增加Aβ結合親和力和增加誘導β片構形的傾向。據最近報導，在APP/PSEN小鼠(APPswe+PSEN1 AE9)敲 出的雙唾液酸神經節苷脂合成酶(GD3S)防止Aβ累積及後續的記憶缺陷發展，記憶缺陷是APP/PSEN小鼠的特徵。Bernardo等人，Neurobiology of Aging.In Press,Corrected Proof，「消除GD3合成酶在基因轉殖小鼠改善記憶並減少β澱粉樣斑載量(Elimination of GD3 synthase improves memory and reduces amyloid-[beta]plaque load in transgenic mice.)」。GD3S通過α-2,8-鏈接鏈結唾液酸到唾液酸，並且為合成b和c系列神經節苷脂所需。這些結果表示，在治療AD時減少神經節苷脂上的唾液酸含量會是有利的。

溶酶體酶「β-半乳糖苷酶」是從無唾液酸神經節苷脂和唾液酸神經節苷脂的非還原端去除β1,3-半乳糖的外水解酶。編碼β-半乳糖苷酶的基因GLB1中的突變導致溶酶體貯積症GM1神經節苷脂，這是從在β-半乳糖苷酶活性的缺乏和GA1和GM1神經節苷脂的累積產生的。Beutler,E.等人，Biol.Chem.247(22)：7195-200(1972)。GM1神經節苷脂是在細胞培養中促進Aβ產生和組裝的微區之主要成分，而且已經發現Aβ結合GM1( Aβ)在大腦中表現出AD病變的早期階段。

溶酶體酶β-己醣胺酶A和B從無唾液酸神經節苷脂和唾液酸神經節苷脂的非還原端水解β- 鏈結的N-乙醯半乳胺糖(GalNAc)。雖然GM1神經節苷脂接收到了最多的關注，但在體外其他的a系列神經節苷脂(GD1A、GM2及GM3)也結合並促進Aβ的組裝。

有兩種β-己醣胺酶的同工異構酶，HEXA和HEXB。HEXA由α次單元和β次單元(αβ)所組成，而HEXB由兩個β次單元(ββ)所組成。HEXA編碼HEXA的α次單元，而HEXB編碼HEXA和HEXB的β次單元。HEXA的突變導致溶酶體貯積症泰-薩克斯症，泰-薩克斯症是起因於缺乏HEXA的活性及GM2累積。HEXB的突變導致溶酶體貯積症桑德霍夫症，桑德霍夫症是起因於缺乏HEXA和HEXB的活性及GM2和GA2累積。

本文中使用的術語「特異性結合」是指藥理伴護蛋白與神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的相互作用，具體來說是與直接參與接觸藥理伴護蛋白的神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶之胺基酸殘基的相互作用。藥理伴護蛋白特異性結合標靶蛋白質，例如β-己醣胺酶B，以對酶施加伴護蛋白作用而不是相關或不相關蛋白質的通用組。與任何給定的藥理伴護蛋白相互作用的β-己醣胺酶胺基酸殘基可能在也可能不在蛋白質的「活性位點」內。特異結合可以通過例行的結合試驗(例如抑 制、熱穩定性)來評估，或通過結構研究，例如共結晶、核磁共振等來評估。

本文中使用的術語「增強穩定性」或「提高穩定性」是指在體外或在與特異性針對神經節苷脂酶及/或唾液酸酶、或葡糖腦苷脂酶的藥理伴護蛋白接觸的細胞中、相對於未與藥理伴護蛋白接觸的神經節苷脂酶及/或唾液酸酶(較佳為相同細胞類型或相同的細胞，例如在較早的時間)、或葡糖腦苷脂酶提高酶對不可逆失活的抗性。提高蛋白質穩定性增長了蛋白質在ER的半衰期及從ER輸送的功能性蛋白質之量。在本發明的一個態樣中，野生型神經節苷脂酶或唾液酸酶、或葡糖腦苷脂酶的穩定性被增強或提高了。在本發明的另一個態樣中，突變神經節苷脂酶或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的構形穩定性被增強或提高了。

本文中使用的術語「增強輸送」或「增加輸送」是指相對於在不與特異於神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的藥理伴護蛋白接觸的細胞中(較佳為相同的細胞類型或相同的細胞，例如在較早的時間)神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的輸送效率，提高了神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶到與特異於一個或更多個神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的藥理伴 護蛋白接觸的細胞之細胞質液(唾液酸酶2)或核內體和溶酶體的輸送效率。

本文中使用的術語「增強活性」或「提高活性」是指相對於在不與特異於一個或更多個神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的藥理伴護蛋白接觸的細胞中(較佳為相同的細胞類型或相同的細胞，例如在較早的時間)神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的活性，如本文所述，在與特異於一個或更多個神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的藥理伴護蛋白接觸的細胞中提高了神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的活性。本發明的藥理伴護蛋白也可以藉由增加細胞中酶的總量及/或藉由提高酶的比活性來提高酶的活性。

術語「比活性」是指每單位時間在酶的製劑中每毫克的蛋白質酶轉化的受質量。

本文中使用的術語「增強的水平」或「增加的水平」是指相對於在不與特異於一個或更多個神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的藥理伴護蛋白接觸的細胞中(較佳為相同的細胞類型或相同的細胞，例如在較早的時間)神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的水平，在與特異於一個或更多個神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的藥理伴護蛋白接觸的細胞中增加了一個或更多個神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的水平。

術語「穩定適當的構形」是指神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶藥理伴護蛋白誘導或穩定與執行預定功能的野生型神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶之構形功能上相同的突變或野生型神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶之構形的能力。

術語「功能上相同」意指雖然構形可能有微小的變化(幾乎所有的蛋白質皆在生理狀態表現出一些構形靈活性)，但構形靈活性不會導致(1)蛋白質聚集，(2)通過內質網相關的降解途徑去除，(3)蛋白質的功能例如APP代謝活性受損，及/或(4)細胞內的不當輸送，例如局部化到細胞質、到比野生型蛋白質更大或更小的程度。

術語「穩定的分子構形」是指被在細胞提供至少部分野生型功能或增強野生型功能的藥理伴護蛋白誘導的蛋白質構形，即神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的構形。例如，神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的穩定分子構形將是其中神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶離開ER和輸送到細胞質的構形，而不是錯誤折疊和被降解及/或不執行其預定功能的構形。此外，突變的神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的穩定分子構形也可以具有全部或部分的活性。然而，穩 定分子構形沒有必要具有全部的野生型蛋白質功能屬性。

術語「活性」是指細胞中野生型神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的正常預定生理功能。例如，神經節苷脂酶及/或唾液酸酶活性包括神經節苷脂的分解代謝，而葡糖腦苷脂酶活性包括鞘糖脂葡苷基神經醯胺的分解代謝。這樣的功能性可以藉由任何習知用以建立功能性的方式進行測試。

術語「神經節苷脂分解代謝」是指藉由唾液酸酶和外糖水解酶與神經醯胺的形成依序從無唾液酸神經節苷脂和唾液酸神經節苷脂的非還原末端單元去除單獨的唾液酸和糖殘基。這種降解主要是通過胞吞作用-核內體-溶酶體途徑發生，且位於細胞質液的唾液酸酶2除外。

在一個非限制性實施例中，可以藉由任何對編碼野生型神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的核酸分子表現出50%、60%、70%>、80%>及高達100%同源性的核酸分子及任何在標準條件下雜交的序列編碼神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶多肽。在另一個非限制性實施例中，任何編碼神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶多肽(具有與前述多肽序列相同的功能特性和結合親和力)的其他核苷酸序列，例如在正常個體的 對偶變異體，具有在ER實現功能構形、在細胞內實現正確定位、及表現出野生型活性的能力。

本文中使用的術語「突變」神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶是指從含有基因突變的基因轉譯的神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶多肽，該基因突變產生改變的神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶胺基酸序列。在一個實施例中，突變產生當與野生型神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶相比時、在正常存在於ER的條件下不實現原生構形、或與野生型神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶相比表現出降低的穩定性或活性的神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶蛋白質。這種類型的突變在本文中被稱為「構形突變」，而且帶有該突變的蛋白質被稱為「構形變異體」。無法實現此構形導致神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶蛋白質被降解或聚集，而不是在蛋白質輸送系統中通過正常途徑被輸送到在細胞中的原生位置或進入細胞外的環境。在一些實施例中，突變可能發生在編碼神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的基因之非編碼部分，從而導致蛋白質的表達效率較低，例如影響轉錄效率、剪接效率、mRNA穩定性等的突變。藉由增強野生型的表達水平以及神經節苷脂酶及/或唾液酸酶及/或葡糖腦苷脂酶的構形突變變異體，投予神經節苷脂酶及/或 唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶藥理伴護蛋白可以改良由這種低效率的蛋白質表達所造成的缺陷。

某些測試可以評估蛋白質的屬性，該等屬性可能會或可能不會與實際的體內活性相當，但仍然是蛋白質功能性的適當代替，而且這種測試中的野生型行為證明支持本發明的蛋白質折疊挽救或增強技術的證據。依據本發明的一個這種活性是從內質網適當輸送功能性神經節苷脂酶及/或唾液酸酶到細胞質液。

術語「內源性表達」和「內源性表達的」是指在不患有或疑似患有與神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶缺乏、顯性負突變體的過度表達、或其他缺陷(例如在改變(例如抑制)表達、活性、或穩定性的神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶核酸或多肽序列中的突變)相關的疾病或失調的個體中細胞中的神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的正常生理表達。此術語也指在細胞或健康個體正常表達的細胞類型中神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的表達，而且不包括在細胞或其中健康個體不表達神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的細胞類型(例如腫瘤細胞)中神經節苷脂酶及/或唾液酸酶或葡糖腦苷脂酶的表達。

本文中使用的術語「升高的神經節苷脂」是指在腦中具有增加的神經節苷脂水平的個人、患者 或患者族群。神經節苷脂水平可以在整個細胞中在膜中升高而且也在微域內。術語「微域」或「脂質筏」是指在細胞膜中發現的、富含膽固醇、鞘糖脂及神經節苷脂的耐清潔劑區。在本發明的一個態樣中，藥理伴護蛋白被用於藉由提高習知在大腦中分解代謝神經節苷脂的酶之活性來降低微域或脂質筏中的神經節苷脂水平。

本文中使用的術語「輸送效率」是指蛋白質被從內質網輸出到達細胞內的原生位置、細胞膜、或進入細胞外環境的能力。

酶的「競爭性抑制劑」可以指結構上類似酶受質的化學結構和分子幾何形狀而以與受質大致相同的位置與酶結合的化合物。因此，抑制劑與受質分子競爭相同的活性位點，從而增加了Km。假使有足夠的受質分子可置換抑制劑，則競爭性抑制通常是可逆的，即競爭性抑制劑可以可逆地結合。因此，酶抑制的量取決於抑制劑濃度、受質濃度、及抑制劑和受質對於活性位點的相對親和力。

當抑制劑遠端結合於酶的活性位點、在酶中創造了構形變化使得受質不再能與酶結合時即發生非經典競爭性抑制。在非經典競爭性抑制中，受質在活性位點的結合防止抑制劑在單獨位點結合，反之亦然。這包括異位抑制。

酶的「線性混合型抑制劑」是一種競爭性抑制劑的類型，該抑制劑允許受質結合、但降低親和力，所以Km提高並且Vmax降低。

「非競爭性抑制劑」是指與酶形成強鍵結而且可以不因加入過量受質而被置換的化合物，即非競爭性抑制劑可以是不可逆的。非競爭性抑制劑可以在酶或蛋白質的活性位點、附近或遠端結合，而且與酶連接對Km沒有影響但降低Vmax。非競爭性抑制劑是指其中抑制劑僅結合於酶-受質(ES)複合物的情況。當抑制劑結合時，酶變成失活。這不同於非經典競爭性抑制劑，該非經典競爭性抑制劑可以在受質不存在下與酶結合。

術語「Vmax」是指酶催化反應的最大初始速度，即在飽和的受質水平下。術語「Km」是實現½ Vmax所需的受質濃度。

酶「增強劑」是結合於神經節苷脂酶及/或唾液酸酶並提高酶反應速率的化合物。

術語「治療有效劑量」和「有效量」是指足以在ER增強蛋白質處理(允許功能構形)而不抑制已經在適當的細胞位置表達的蛋白質(在拮抗劑的情況下)、或不誘導來自適當細胞位置的蛋白質之配體介導受體內化(在致效劑的情況下)、並增強標靶蛋白質之活性、從而在受試者產生治療反應的量。治療反應可以是使用者(例如臨床醫師)將識別為對 療法有效的反應之任何反應，包括前述症狀和替代的臨床指標。因此，治療反應通常將是疾病或失調(例如阿茲海默症)之一種或更多種症狀的改善或抑制。

片語「醫藥上可接受的」是指當被投藥給人類時生理上可耐受的並且通常不會產生不良反應的分子實體和組成物。較佳的是，本文中使用的術語「醫藥上可接受的」意指由聯邦或州政府的管理機構核准或被列在美國藥典或其他一般公認用於動物、而且更特別是用於人類的藥典中。術語「載劑」是指稀釋劑、佐劑、賦形劑、或任何用以投予化合物的載體。例如，這樣的藥物載劑可以是無菌液體，例如水和油。較佳採用水或水溶液鹽溶液及葡萄糖水溶液和甘油溶液作為載劑，特別是用於注射溶液。適當的藥物載劑被描述在由E.W.Martin所著的「雷明頓的製藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)」第18版或其他版本中。

術語「約」和「大約」一般應指在給定量測的性質或精度下，量測的量之可接受誤差程度。典型上，誤差的例示性程度是在給定值或值的範圍的20百分比(%)以內，較佳在10%以內，更佳在5%以內。或者，而且特別是在生物系統中，術語「約」和「大約」可以指在數量級以內的值，較佳在給定值的5倍以內，而且更佳在給定值的2倍以內。除非另有 說明，否則本文給出的數值量都是近似值，這意味著當未明確陳述時，術語「約」或「大約」可以被推斷。

本文中使用的術語「分離的」意指所引用的材料被從通常發現該材料的環境中去除。因此，分離的生物材料可以不含細胞成分，即其中發現或產生該材料的細胞之成分。在核酸分子的情況下，分離的核酸包括PCR產物、在凝膠上的mRNA帶、cDNA、或限制性片段。在另一個實施例中，分離的核酸較佳被從其中發現該核酸的染色體切除，而且更佳不再被接合到非調節性、非編碼區、或到其他當在染色體中發現時位於分離的核酸分子包含的基因之上游或下游的基因。在又另一個實施例中，分離的核酸缺少一個或更多個內含子。分離的核酸包括插入質體、黏接質體、人工染色體及類似物的序列。因此，在具體的實施例中，重組核酸是分離的核酸。分離的蛋白質可與其他蛋白質或核酸、或蛋白質和核酸兩者、與該分離的蛋白質在細胞中關聯者、或若該分離的蛋白質為膜相關的蛋白質時與細胞膜相關聯。分離的胞器、細胞、或組織被從在生物體中發現的解剖位點去除。分離的材料可以是、但不必是純化的。

本文中使用的術語「純化的」是指材料，例如已經在減少或消除無關材料(即污染物)的條件下被分離的神經節苷脂酶及/或唾液酸酶核酸或多肽。例如，純化的蛋白質較佳大致上不含在細胞中相 關聯的其他蛋白質或核酸。本文中使用的術語「大致上不含」在材料的分析測試上下文中被操作性地使用。較佳的是，大致上不含污染物的純化材料為至少50%純的；更佳的是，至少90%純的，而且還更佳的是至少99%純的。純度可以藉由傳統的方式評估，例如層析、凝膠電泳、免疫測定、組成分析、生物測定、及所屬技術領域中習知的其他方法。

術語「tau蛋白病變」是指在人腦中由形成神經纖維纏結(NFT)的tau蛋白之病理聚集所引起的任何症狀，包括(但不限於)諸如額顳癡呆、阿茲海默症、進行性核上神經麻痺症、大腦皮質退化症及額顳葉型失智症(匹克症)等疾病。

術語「腦澱粉樣變性」是指其中有澱粉樣蛋白在腦中或在腦的血管中沉積或累積的狀態。腦澱粉樣變性的實例包括、但不限於阿茲海默症和腦澱粉樣血管病(CAA)。

術語「阿茲海默症」或「AD」是指特徵為緩慢進行性癡呆和嚴重大腦皮質萎縮的症狀。β-澱粉樣蛋白神經斑塊、內神經元神經纖維纏結、及澱粉樣血管病的存在是AD的特徵，並在驗屍檢查時觀察到。AD可能以家族表現遺傳，或可能是偶發性的。本文中，AD包括家族的、偶發的、以及上述基於表型表現的中間狀況及子群組。家族性AD通常具有早發性(65歲之前)，而偶發的AD通常是晚發的(65 歲及之後)。在非限制性實施例中，家族性AD可能與一個或更多個基因中的突變相關，該一個或更多個基因是選自包含早老1(人類早老素1，GenBank登錄號NM_000021、NM_007318、及NM_007319；鼠早老素1，GenBank登錄號NM 008943；及大鼠早老素1，GenBank登錄號NM_019163)、早老素2(人類早老素2，GenBank登錄號NM_000447和NM_012486；鼠早老素2，GenBank登錄號NM_011183；及大鼠早老素2，GenBank登錄號NM 031087)、及澱粉樣前驅蛋白(APP)(人類APP，GenBank登錄號NM_201414、NM_201413、及NM 000484；鼠APP，GenBank登錄號NM 007471；及大鼠APP，GenBank登錄號NM_019288)的群組。偶發性AD不能直接測試，但某些風險因素可能會提高個人對於發展偶發性AD的易感性。在一個非限制性實施例中，具有至少一份脂蛋白元E(APOE)(人類APOE，GenBank登錄號NM 000041；鼠APOE，GenBank登錄號NM 009696；及大鼠APOE，GenBank登錄號NM_138828)的e4對偶基因複製的個體處於發展晚發性偶發AD的風險。

此術語還包括具有三染色體症21或唐氏症(DS)的個體，並發展等同於AD的臨床和神經病理學特徵(在他們的第三或第四個十年)的癡呆， 包括腦澱粉樣蛋白(Aβ)斑塊和神經纖維纏結(NFTs)，為阿茲海默症(AD)的特徵性損害。最近的研究顯示，Aβ42是沉積在唐氏症大腦中的這種蛋白質之最早形式，而且可以在年僅12歲的受試者身上看到，而可溶性Aβ可以在孕齡僅21週的DS受試者的大腦中檢測到，遠早於Aβ斑塊的形成。Gyure等人所著的病理學及實驗室醫學檔案(Archives of Pathology and Laboratory Medicine)125：489-492(2000年)。

為了本發明的目的，「神經系統失調」是指與澱粉樣前驅蛋白(APP)的β-澱粉樣蛋白處理相關的任何中樞神經系統(CNS)或週邊神經系統(PNS)疾病。這可能會導致神經元或神經膠細胞缺陷，包括但不限於神經元損失、神經元退化、神經元脫髓鞘、神經膠質增生{即星形膠質增生)、或異常蛋白質或毒素{例如澱粉樣蛋白β)的神經元或外神經元累積。

一個例示性的神經系統失調是腦澱粉樣血管病(CAA)，也稱為動脈血管澱粉樣變性(congophilic angiopathy)。這種失調是血管病的一種形式，其中與阿茲海默症、澱粉樣蛋白-β(Aβ)相關聯的相同澱粉樣蛋白沉積在大腦的軟腦膜和腦淺表皮層血管的壁上。澱粉樣蛋白的沉積使這些血管易於衰竭，從而提高出血性中風的風險。因為 是與阿茲海默症癡呆相關的相同澱粉樣蛋白，所以這樣的腦出血在患有阿茲海默症的人身上更常見，然而也可以發生在沒有癡呆歷史的人身上。大腦內的出血通常限於特定的腦葉，這與腦出血相比稍有不同，腦出血的發生是由於高血壓(hypertension)-出血性中風(或腦出血)更常見的原因。CAA也與短暫性缺血發作、蛛膜下出血、唐氏症、照射後壞死、多發性硬化症、腦白質病變、海綿狀腦病變、及拳擊手型失智症有關。可以依據本發明的實施例治療的CAA之例示性形式包括遺傳性CAA(也稱為家族性CAA)和伴隨澱粉樣變性的遺傳性腦出血-荷蘭型(HCHWA-D)。在一些實施例中，遺傳性CAA是由APP中的突變所引起。

術語「個體」、「患者」、或「患者族群」是指被診斷患有本文所述的各種疾病之一或處於發展本文所述的各種疾病之一的風險之人士(多位人士)。例如，個體可能被診斷患有家族性AD或處於發展家族性AD的風險。在另一個實例中，個體被診斷患有偶發性AD或處於發展偶發性AD的風險。AD的診斷可以基於個體表現的基因型或表型特徵來進行。例如，帶有早老素1、早老素2、或APP的突變變異體的個體處於發展家族性AD的風險。在另一個非限制性實例中，帶有APOE的E4變異體的個體處於發展偶發性AD的風險。

個體可以藉由表現出與AD相關的表型而被診斷為患有AD或處於發展AD的風險。與AD相關的表型可能是認知或精神上的。認知表型的實例包括、但不限於健忘症、失語症、失用症、及失識症。精神症狀的實例包括、但不限於性格改變、抑鬱、幻覺及妄想。作為一個非限制性的實例，精神障礙的診斷和統計手冊(Diagnostic and Statistical Manual of Mental disorders)第4版(DSM-IV-TR)(由美國精神病學協會(American Psychiatric Association)出版)中包含以下對於阿茲海默型癡呆症的設定標準：A.由記憶障礙及失語症、失用症、失識症及執行功能紊亂中之一者或更多者表現的多種認知缺陷之發展；B.認知缺陷表現為從先前的功能衰退並在社交或職業功能上造成明顯障礙；C.過程的特徵是緩慢發病並持續衰退；D.認知缺陷不是由於導致記憶和認知產生漸進缺陷的其他中樞神經系統、全身性、或物質誘導條件；以及E.另一種精神障礙無法更好地解釋紊亂。

另一個非限制性實例是對於阿茲海默症的國家神經和語言障礙和中風-阿茲海默症及相關障礙協會(The National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-Alzheimer’s disease and Related Disorder Association,NINDS-ADRDA)標準如下：

A.明確的阿茲海默症：符合可能阿茲海默症的標準並經由屍體解剖或活體組織檢查而具有阿茲海默症的病理證據。

B.可能的阿茲海默症：由臨床和神經心理學檢查而確定的失智症，並涉及(a)在兩個或更多個認知區域的漸進缺陷，包括記憶，(b)在40歲和90歲之間發病，及(c)無能夠產生失智症的全身性或其他腦部疾病，包括妄想症

C.可能的阿茲海默症：具有非典型發病、表現、或進展的失智症，且沒有已知病因；任何能夠產生失智症的共同病理疾病不被認為是病因

D.不太可能的阿茲海默症：具有以下任一者的失智症狀：突然發病、局部性神經系統徵兆、或在病程早期癲癇發作或步伐紊亂。

指示的表型表現也可以是物理的，例如藉由直接(攝像)或間接(生物化學)檢測澱粉樣-β斑塊。已連接質譜儀的使用高效液相層析以線性離子阱演示外周血液中的澱粉樣蛋白-β(1-40)定量(Du 等人，J Biomol Tech.16(4)：356-63(2005))。在阿茲海默症患者的腦脊髓液中藉由螢光相關光譜檢測單β-澱粉樣蛋白聚集體也已被描述出(Pitschke等人，Nature Medicine 4：832-834(1998))。美國專利第5,593,846號描述了一種用於檢測可溶性澱粉樣-β的方法。使用抗體對糖化終產物(RAGE)間接檢測澱粉樣-β肽和受體也已被描述出。近來，使用顯色受質進行腦脊液中提高的BACE-1活性之生化檢測也已被視為AD的診斷或預後指標(Verheijen等人，Clin Chem.Apr 13[Epub.](2006))。

β-澱粉樣蛋白的體內成像可以使用放射性碘化黃酮衍生物作為成像劑來實現，Ono等人，J Med Chem.48(23)：7253-60(2005)，並使用結合澱粉樣蛋白的染料，例如結合至40-殘基放射性碘化A肽的腐胺(putrescein)(產生¹²⁵I-PUT-A 1-40)，並顯示可穿過血腦屏障及結合到αβ斑塊。Wengenack等人，Nature Biotechnology.18(8)：868-72(2000)。還使用芪SB-13和苯併噻唑6-OH-BTA-1(也稱為PIB)來顯示β-澱粉樣蛋白的成像。Nicholaas等人，Am J Geriatr Psychiatry,12：584-595(2004)。

實例

藉由以下提出的實例來進一步描述本發明。這種實例的用途只是說明性的，而且絕不限制本發明或任何例示性術語的範圍和含義。同樣地，本發明並不限於本文所述的任何特定較佳實施例。事實上，對於所屬技術領域中具有通常知識者而言，在閱讀本說明書之後，本發明的許多修改和變化將是顯而易見的。因此，本發明只由所附申請專利範圍的條款以及申請專利範圍賦予的均等物之全部範圍所限制。

實例1：AdDNJ穿過血腦屏障並增加β-hex而不影響存活力

為了評估β-hex標靶藥理伴護蛋白AdDNJ作為治療策略來治療荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠，我們首先進行研究來評估標靶接合及對細胞存活力的影響。同時，為了決定在我們的荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠概念驗證(POC)研究中使用的適當劑量和給藥方案，我們使用C57Bl6小鼠為AdDNJ完成了藥物動力學和劑量反應/時間進程研究。藥物動力學和劑量反應/時間進程研究的目的是確認AdDNJ穿過血腦屏障(BBB)並決定最低劑量和每日劑量的最短持續時間，以在C57BL/J6小鼠身上在大腦層次提供增加最多的內源野生型β-hex，同時允許AdDNJ間歇性地降到低於抑菌濃度，以便能夠從β-hex解離及受質的轉換。

材料和方法

AdDNJ對細胞存活力的效果。在長時間曝露於不同濃度的AdDNJ之後測試人類纖維母細胞(CRL2076)和人類神經母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞的存活力。在濕潤的8%CO₂培養箱中，在37℃下，在96孔盤中、在含有濃度增加到高達1mM的AdDNJ的完全媒質中培育纖維母細胞72或120小時。依照製造商的指示(Promega Non-Radioactive 96-well Titer assay,TB112)使用四唑-甲[月+潛(之右)](tetrazoliuim-formazan)轉化方法定量活細胞。以相同的方式測試作為纖維母細胞的SH-SY5Y細胞，但接種在膠原包覆的盤中(Nunc# 152036)。在曝露於AdDNJ 24小時、48小時及120小時之後，如上所述定量活的SH-SY5Y細胞。所有劑量濃度都以一式三份進行。

酶的活性和AdDNJ的選擇性。藉由量測對己醣胺酶(Total Hex、Hex A/S及Hex B)及3種其他的溶酶體水解酶：α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶及葡糖腦苷脂酶之酶活性的影響來評估AdDNJ的選擇性。對於酶試驗，使用200μl的pH 5溶解緩衝液(磷酸鹽/檸檬酸鹽，0.25%牛膽酸鹽(tauorocholate)，0.1%TX100)來溶解野生型纖維母細胞(CRL2076)顆粒(~2.5e6個細胞/丸粒)。以pH 5、含有2mM適當4-甲基傘酮 (4-methylumbelliferyl,4-MU)受質的反應緩衝液(不含TX100的溶解緩衝液)將纖維母細胞溶解物稀釋為1：200、在37℃下培育1小時、並使用0.5M碳酸鈉停止。使用Perkin Elmer Victor 5x螢光盤讀取器(ex355/em460)量測釋放的4MU。使用4-甲基傘酮β-N-乙醯葡萄胺糖苷(MUG)進行Total Hex的活性量測；對於Hex A/S活性4MU-β-N-乙醯葡萄糖胺-6-硫酸鹽(MUGS)；計算Hex B活性作為Total Hex和Hex A/S活性之間的差異；對於α-半乳糖苷酶活性4MU-α-D-吡喃葡糖苷；對於β-半乳糖苷酶活性4-MU β-D-半乳糖苷；對於葡糖腦苷脂酶活性4MU β-D-吡喃葡糖苷。對於酶抑制，使用100μM的以下化合物作為正對照：對於α-半乳糖苷酶，1-脫氧半乳糖野尻黴素(1-deoxygalactonojirimycin)；對於β-半乳糖苷酶，N-丁基-1-脫氧半乳糖野尻黴素；對於葡糖腦苷脂酶，異法戈明(isofagomine)。對於β-己醣胺酶增強試驗，使纖維母細胞曝露於0、95、390及780nM的AdDNJ 5天，之後進行β-己醣胺酶活性量測。酶活性量測以一式兩份進行。

AdDNJ對O-GlcNAcase活性的影響。在野生型纖維母細胞(AG07059，Coriell)和SH-SY5Y細胞測試AdDNJ對細胞 O-GlcNAcase活性的影響。在濕潤的8%CO₂培養箱中，在37℃下，在完全媒質中使用或不用10μM AdDNJ或Thiamet G培育纖維母細胞24小時。對於SH-SY5Y細胞，使用多種濃度(0μM至100μM)的AdDNJ和ThiametG。在RIPA緩衝液中溶解細胞沉澱物，並使用西方墨點轉漬法量測蛋白質相關的總O-GlcNAc水平。簡言之，總共40μg的蛋白質被分離出並轉移到PVDF，並使用抗O-GlcNAc抗體(18B10.C7，Pierce)探測。使用Alpha Innotech FluoroChem Q攝像機將化學發光成像，並使用AlphaView SA軟體(Alpha Innotech)藉由密度量測定量。將印跡剝除並使用抗鈣連伴護蛋白抗體(ab22595，Abcam)重新探測。對於O-GlcNAc定量，將整路的O-GlcNAc密度量測作為背景扣除並標準化到鈣連伴護蛋白負載對照帶。

AdDNJ重複劑量/劑量-反應及PK研究。每天對5週齡的C57BL/J6小鼠(n=5隻小鼠/組，紐約州Germantown的Taconic農場)經口強飼投予載體(水)或AdDNJ(30、100或300mg/kg)持續14天。在第15天將小鼠安樂死並收集腦/血漿用於分析。對於單一劑量的PK研究，5週齡的C57BL/J6小鼠(n=5隻小鼠/組，紐約州Germantown的Taconic農場)接受單一劑量的 100mg/kg(口服強飼)AdDNJ，並使各組在服藥0.5、1、2、4、8、16、24及48小時後安樂死，以進行腦和血漿分析。將全腦組織(10-15mg)在1mL的pH 5溶解緩衝液中均質化，以如上所述量測β-己醣胺酶活性。在血漿和腦的樣品中使用LC-MS/MS量測AdDNJ水平。

結果

AdDNJ是β-hex的有效特異性抑制劑(在pH 5下Ki=253.4nM；在pH 7下Ki=342.3nM；第1a圖)，而且在高達100μM的濃度下不會抑制O-GlcNAcase(第1c圖至第1d圖)或溶酶體酶β-葡糖腦苷脂酶(GCase)、α半乳糖苷酶(α-Gal)、或β半乳糖苷酶(β-Gal)在10μM，測試的最高濃度(第1e圖)。此外，AdDNJ對於SH-SY5Y和使用高達1mM的AdDNJ濃度處理長達120小時的人類皮膚纖維母細胞之細胞存活力幾乎沒有或沒有影響(第1f圖至第1g圖)。使用95、390、或780nM的AdDNJ處理健康的人類皮膚纖維母細胞5天以劑量依賴的方式增加了β-hex水平多達3倍(第1b圖)，證實AdDNJ接合目標β-hex的能力。

在單劑量(口服強飼)藥物動力學研究中，我們發現，劑量100mg/kg的AdDNJ穿過血腦屏障，並在腦中達到預期足以利於β-hex在中性 pH的ER環境中結合的水平(342nM，AdDNJ在pH 7下用於β-hex抑制的Ki)，而且在16小時內降到低於預期可抑制溶酶體β-hex的水平(即253nM，AdDNJ在pH 5下用於β-hex抑制的Ki)(第2a圖至第2b圖)。此外，每日經由強飼服藥30、100、及300mg/kg的AdDNJ持續14天表現出劑量依賴性增加的β-hex水平(第3a圖至第3b圖)，而不增加整個腦提取物的GM2水平(第10a圖和第10c圖)。在這些劑量下，β-hex水平增加最多發生在~5天的治療(第3a圖至第3b圖)。因為在腦中升高的β-hex水平之半衰期為~2天(數據未顯示)，所以我們選擇每天治療小鼠一次持續5天的治療策略，以最大化β-Hex增強，之後2天沒有藥物(以在沒有AdDNJ下最大化受質轉換。所有的劑量小鼠都可良好承受。

實例2：AdDNJ的概念證明研究

接下來，我們進行POC研究來評估AdDNJ是否在荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠身上減少結合神經節苷脂的Aβ病變。

動物和研究設計。荷蘭APPE693Q小鼠基因轉殖小鼠的產生和特徵被描述在Gandy,S.等人的天數對於作為與人類阿茲海默澱粉樣蛋白-β寡聚體相關的毒性之指標的標準，神經學年鑑68，220-230(2010)(Days to criterion as an indicator of toxicity associated with human Alzheimer amyloid-beta oligomers.Annals of neurology 68,220-230(2010))中。每週5天口服強飼3個月大的雄性荷蘭APP^E693Q小鼠轉殖基因小鼠載體(水)(n=15)或3、10、30或100mg/kg的AdDNJ持續3個月(n=13)。所有的動物研究都經許可，並遵照機構動物照顧和使用委員會進行。將小鼠保持在無病原體的環境中，在12小時的光照/黑暗循環，並給予隨意可得的食物和水。在6個月大時，將治療組和3個月大的未治療基準組(n=15)以NOR、EPM和FC測試進行認知評定。在最後服藥48小時之後，使用冰冷的1x PBS灌注小鼠。將大腦取出並分解為兩個半球。一半在乾冰上迅速冷凍並儲存在-80℃用於生化；另一半後固定在4%聚甲醛中，然後在切片機上矢狀切片成30μm的切片，並儲存在4℃的存儲緩衝液中，直到進行組織學分析。

行為測試。在測試之前將小鼠放在測試室1小時，以使小鼠適應房間。所有測試都在最後服用AdDNJ之前兩週的週二至週五8 am-3pm完成。清洗動物之間的所有設備。

新物體識別(NOR)。在第1天，將小鼠放在NOR活動場(直徑20cm)中10分鐘適應。第2天，小鼠進行測試階段，由兩個時期構成。在測 試階段1，將小鼠放在活動場中，並允許探索兩個相同的陌生物體10分鐘。然後使小鼠返回他們的家籠1小時的間隔期間。在此期間，將先前允許小鼠探索的兩個物體中的一個移除並使用新的物體取代。在測試階段2，將小鼠放回活動場中，並允許小鼠探索熟悉的物體和新物體4分鐘。試驗使用高架相機錄影。然後使用ANY-maze(Stoelting,Wood Dale,IL)量測花在探索物體的持續時間。

高架十字迷宮(EPM)。迷宮處於一個+的配置，並包括兩個穿過彼此並垂直於兩個封閉臂(35 x 5 x 16cm)的開放臂(35 x 5 x 0cm)，具有中央中性區(Stoelting,Wood Dale,IL)。將小鼠放在中性區中並允許探索8分鐘。每個試驗都被高架錄影，並使用ANY-maze(Stoelting,Wood Dale,IL)評分花在開放和封閉臂的時間量。進入臂被定義為使頭部和兩個爪進入臂中。

恐懼條件。如先前在Steele,J.W.等人的在TgCRND8阿茲海默症小鼠模型中早期的恐懼記憶缺陷與改變突觸可塑性和分子結構相關、比較神經學期刊(2014年)(Early fear memory defects are associated with altered synaptic plasticity and molecular architecture in the TgCRND8 Alzheimer's disease mouse model.The Journal of comparative neurology(2014))中描述的，使用ANY-Maze恐懼條件系統(Stoelting Co.,Wood Dale,IL,USA)評估與環境有關的和線索的恐懼條件。

Aβ試驗。按照Kawarabayashi,T.等人的在阿茲海默症的Tg2576基因轉殖小鼠模型中，在腦、CSF及血漿澱粉樣(β)蛋白中年齡相關的變化，神經科學21，372-381(2001年)(Age-dependent changes in brain,CSF,and plasma amyloid(beta)protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.J Neurosci 21,372-381(2001))經由差別的清潔劑溶解作用處理右半腦。對於天然寡聚Aβ蛋白質結構的分析，將來自TBS可溶解的2-4μL天然蛋白質樣品點到活化/預潤濕PVDF膜(0.22μm；微孔)上，並使之乾燥。在點好蛋白質之後，在室溫下、在含有0.1%v/v Tween-20的TBS中(Fisher Scientific；TBS-T)、在5%w/v脫脂牛奶(Santa Cruz)中將膜封閉1小時。然後在4℃下將膜在指定的主要抗體(在5%的牛奶/TBS-T中)中培育過夜、在TBS-T中洗滌4次、在室溫下在物種特異的HRP結合次要抗體(在5%的牛奶/TBS-T中)中培育1小時、然後在TBS-T中洗滌4次。隨後使用富士 LAS-3000顯影機以ECL西式印漬受質(Pierce)將膜顯影。然後將膜在TBS-T中洗滌1次，並在低pH剝離緩衝液[25mM甘胺酸鹽酸，pH 2.0及1%w/v SDS]中以劇烈振盪剝離，以去除主要和次要抗體、在TBS-T中洗滌3次、及在室溫下封閉1小時(在5%的牛奶/TBS-T中)，然後使用下一個主要抗體探測。使用MultiGauge軟體(富士軟片)量測免疫反應斑點的整合密度，並標準化為對照%(載體)。兔pAβ A11(抗預原纖寡聚體，0.5μg/ml)、兔pAβ OC(抗原纖寡聚體和纖絲；0.25μg/ml)及小鼠mAβ Nu-4(抗寡聚體；1μg/ml)的產生、純化及特徵化先前已被描述出(Tomic,J.L.、Pensalfini,A.、Head,E.及Glabe,C.G.的阿茲海默症腦中可溶原纖寡聚體水平升高並與認知官能障礙相關，疾病的神經生物學35,352-358(2009年)(Soluble fibrillar oligomer levels are elevated in Alzheimer's disease brain and correlate with cognitive dysfunction.Neurobiology of disease 35,352-358(2009))；Lambert,M.P.等人的針對Aβ的病理組裝的單細胞繁殖抗體，神經化學期刊100,23-35(2007年)(Lambert,M.P.,et al.Monoclonal antibodies that target pathological assemblies of Abeta.Journal of neurochemistry 100,23-35(2007))。藉由使用小鼠mAb 6E10(1：1000；Covance)檢測人類APP轉基因代謝物來實現到總APP/Aβ訊號的標準化。使用結合過氧化物酶的山羊抗兔IgG(H+L；1：20,000；向量實驗室)或山羊抗小鼠IgG(H+L；1：20,000；向量實驗室)進行檢測。為了量化單體Aβ的水平，按照製造商的指示使用人類/大鼠Aβ 1-40/1-42 ELISA套組(Wako)。將單體或寡聚Aβ的絕對濃度標準化為分析之前的初始組織重量。

組織學。如先前所述20經由自由浮動免疫組織化學使用mAb 6E10(1：1000，Covance)評估Aβ。如先前所述19經由自由浮動免疫組織化學使用小鼠抗-GAβ克隆4396C(1：100)，來自Katsuhiko Yanagisawa博士的禮物評估GAβ。在Olympus BX61正置顯微鏡上使用附加的Olympus DP71相機擷取影像。使用Image J(National Institute of Health,Bethesda,Maryland)量測GAβ色斑的整合密度。

行為、生化及組織學成果的統計分析。所有數據皆表示為平均值±標準差。使用學生測試或具有Bonferroni因果關係分析(GraphPad Prism,San Diego,CA)的單向ANOVA測定統計意義(P<0.05)。

結果 AdDNJ在荷蘭APP ^E693Q 基因轉殖小鼠身上提高β-hex水平

我們想評估AdDNJ是否在荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠身上接合目標的β-hex。我們觀察到，3個月進程的AdDNJ以劑量依賴的方式在最高劑量下增加達3倍的總腦β-hex(第4c圖)。AdDNJ還以劑量依賴的方式增加了β-hex B(第4a圖)和β-hex A&S(第4b圖)。全腦提取物的TLC分析沒有顯示在神經節苷脂水平的任何改變，這表示β-hex通常不會在整個大腦被抑制，即使是在投予100mg/kg的AdDNJ之後3個月(第10a圖至第10d圖)。基於對AdDNJ的作用所提出的藥理伴護蛋白機制，我們希望觀察到GM2神經節苷脂減少。然而，第10a圖至第10d圖的TLC分析不夠敏感，而無法在神經節苷脂水平表現出相對較小的變化，雖然TLC分析將預期在神經節苷脂水平顯示數量級的增加，這是持續抑制β-hex所期望的。此外，區域變化可以被掩蓋，因為只有全腦勻漿被進行評估。在海馬下腳和嗅緣皮質區域觀察到最明顯的GAβ減少，這可說明非常少的百分比的總腦體積用以產生勻漿。

AdDNJ校正荷蘭APP ^E693Q 基因轉殖小鼠的行為表型

我們以高架十字迷宮(EPM)評估焦慮並觀察到6個月大載體處理的荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠比3個月大未經處理的小鼠更焦慮(第5a圖)。我們觀察到，在所有測試的劑量下，3個月進程的AdDNJ與減少焦慮有關(第5a圖)。

我們藉由採用新物體識別(NOR)測試來評估學習行為。三個月大未經處理的荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠表現出完整的學習行為，如他們明顯花費比熟悉的物體更多的時間去探索新的物體所證明的，而6個月大載體處理的小鼠表現出學習行為障礙(第5b圖)。在3個月進程的AdDNJ中，我們在高劑量的NOR測試中觀察到，表現出降低焦慮的相同小鼠(現在6個月大)也表現出來自典型老年化相關的學習行為障礙的保護(第5b圖)。使用劑量為30或100mg/kg的AdDNJ處理的六個月大荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠表現出在一半年齡時的學習行為。相反的，AdDNJ對於與環境有關的或線索的恐懼條件沒有影響(第6圖)。

AdDNJ在荷蘭APP ^E693Q 基因轉殖小鼠身上減少Aβ和結合神經節苷脂的Aβ病變

接著，在3個月的AdDNJ處理之後，我們在荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠身上評估Aβ和結 合神經節苷脂的Aβ(GAβ)。我們發現在任何的AdDNJ測試劑量下，Aβ40(第7a圖至第7d圖)、Aβ42(第7e圖至第7h圖)、Aβ42/40比例(第7i圖至第71圖)、預原纖Aβ(第7m圖)、或Aβ寡聚體的水平(第7n圖、第7o圖)都沒有變化。然後，我們繼續尋找在Aβ及/或GAβ的區域變化。免疫組織化學分析顯示定性區域特異減少的Aβ累積，特別是在下腳內(第8a圖、第8b圖)，然而，在服用100mg/kg AdDNJ的荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠之視覺皮層(第8c圖、第8d圖)或CA1海馬區(第8e圖、第8f圖)都沒有觀察到差異。

區域特異減少的Aβ伴隨著在下腳內(第9a圖、第9b圖、第9k圖)和嗅緣皮質(第9c圖、第9d圖、第9i圖)(在腦中涉及NOR的區域)明顯定量減少的GAβ。在另一個涉及NOR的腦區外側內嗅皮層觀察到朝向GAβ減少的趨勢(第9e圖、第9f圖、第9m圖)。在視覺皮層(第9g圖、第9h圖、第9n圖)或在海馬的CA1區(第9l圖、第9j圖、第9o圖)GAβ的減少沒有達到明顯。也可在皮層血管中輕易檢測到GAβ樣免疫反應(第9p圖)。

討論

GM2和GM3神經節苷脂促進突變形式Aβ(荷蘭Aβ)的組裝，在體外該組裝對於寡聚是高度敏感的(Yamamoto等人，2005年)。GM2和 GM3神經節苷脂在腦血管疾病中被選擇性表達，並且已被證明不僅可促進荷蘭突變體Aβ的組裝，而且也可促進愛荷華型和義大利型突變Aβ肽的組裝，所有這些都在家族型CAA之下(Yamamoto等人，2005年；Yamamoto等人，2006年)。神經節苷脂局部化的收斂和易感於神經節苷脂加速聚集的突變肽之區域特異累積提高了這些數據對於家族性CAA和AD具有特別牽連的可能性。荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠累積內神經元Aβ，這可在AD的早期階段觀察到。

在本研究中，我們證明了藥理伴護蛋白AdDNJ穿過血腦屏障，並在野生型C57BL/J6小鼠的腦中導致野生型β-hex的水平提高。然後，我們在荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠身上繼續評估AdDNJ對Aβ和GAβ沉積和焦慮發病及學習行為障礙的影響。我們證實了，荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠在焦慮和學習行為上表現出老化相關的缺陷，且記憶障礙的發病年齡在6個月的年齡。3個月大的荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠在NOR測試中具有完整的學習行為，而6個月大載體處理的小鼠表現出受損的學習行為。在6個月大的荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠身上觀察到的功能障礙與Aβ累積相關，特別是在下腳、視覺皮層及海馬CA1區的神經元內。這些都是我們以前證明荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠累積最 明顯老化相關的Aβ沉積的大腦區域。在下腳中觀察到最強的Aβ樣免疫反應。最近的研究已涉及記憶中的下腳，特別是在小鼠的NOR測試中，其中我們在荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠身上看到缺陷(Chang等人，2012年)。

我們還觀察到，針對β-hex的藥物伴護蛋白在關聯明顯減少的Aβ和GAβ累積中修正荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠的行為表型的兩個特徵。3個月進程的AdDNJ與荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠的大腦中β-hex水平增加3倍相關，表示AdDNJ與它的標靶接合。在下腳和外周皮層(涉及NOR的腦區)內觀察到GAβ明顯定量減少。還在外側內嗅皮層、視覺皮層及海馬CA1區中觀察到GAβ下降，但沒有達到統計意義。

我們的研究提供針對β-hex的藥理伴護蛋白提高β-hex水平的首要證據，同時在展示最高量Aβ免疫反應性的區域中減少GAβ病變。。這些分子和組織性變化的發生與校正行為表型的兩個方面(即焦慮、學習行為)相關。這些數據彰顯使用有針對性的藥理伴護蛋白來提高β-hex活性的潛在益處。這類化合物表現出減輕腦澱粉樣變性的希望，，並被預期有利於人類腦澱粉樣變性的管理，特別是那些與澱粉樣血管病和APP/Aβ突變相關者。AdDNJ具有良好的生物利用性、BBB滲透、對於β-hex的高選擇性 及低毒性，使得AdDNJ成為優異的候選藥物，而可能會被迅速發展用於具有荷蘭APP突變的患者族群之臨床試驗，使得在荷蘭APP^E693Q基因轉殖小鼠身上觀察到的結果尤其相關。

Claims (26)

1. 2-乙醯胺基-1,2-二脫氧野尻黴素(AdDNJ)在製造一用於在處於發展阿茲海默症及/或腦澱粉樣血管病的風險或被診斷患有阿茲海默症及/或腦澱粉樣血管病的患者身上預防及/或治療阿茲海默症及/或腦澱粉樣血管病的藥劑之用途，其中在一第一酶增強期間對該患者投予一有效量的該藥劑；在一受質轉換期間不對該患者投予該藥劑；然後在一第二酶增強期間對該患者投予一有效量的該藥劑。
2. 如請求項1所述之用途，其中該第一酶增強期間和該第二酶增強期間具有相同的持續時間。
3. 如請求項1所述之用途，其中該第一酶增強期間和該第二酶增強期間中之一者或更多者為一約1天至約8天的期間。
4. 如請求項2所述之用途，其中該第一酶增強期間和該第二酶增強期間中之一者或更多者為一約4天至約6天的期間。
5. 如請求項1所述之用途，其中在該第一 酶增強期間和該第二酶增強期間每天投予該藥劑。
6. 如請求項1所述之用途，其中該藥劑係口服投藥。
7. 如請求項1所述之用途，其中該藥劑係以一在約3mg/kg/天至約300mg/kg/天範圍中的劑量投藥。
8. 如請求項7所述之用途，其中該藥劑係以一約100mg/kg/天的劑量投藥。
9. 如請求項1所述之用途，其中在該受質轉換期間不投予該藥劑包含在約48小時至約96小時的期間不投予該藥劑。
10. 如請求項9所述之用途，其中在該受質轉換期間不投予該藥劑包含在約72小時的期間不投予該藥劑。
11. 如請求項1所述之用途，其中該第一酶增強期間為約5天，而且在該受質轉換期間不投予該藥劑包含在約72小時的期間不投予該藥劑。
12. 如請求項1所述之用途，包含：在第1天對該患者投予有效量的該藥劑；在第2天不投予該藥劑；在第3天對該患者投予有效量的該藥劑；在第4天不投予該藥劑； 在第5天對該患者投予有效量的該藥劑；然後在約72小時的期間不投予該藥劑。
13. 如請求項1所述之用途，其中在一受質轉換期間不投予該藥劑包含在約24小時的期間不投予該藥劑。
14. 如請求項1所述之用途，其中在一受質轉換期間不投予該藥劑包含在約48小時的期間不投予該藥劑。
15. 如請求項1所述之用途，其中該第一酶增強期間為約3天，而且在該受質轉換期間不投予該藥劑包含在約120小時的期間不投予該藥劑。
16. 如請求項1所述之用途，包含在酶增強期間和受質轉換期間之間交替進行一至少1個月的總治療時間。
17. 如請求項16所述之用途，其中該總治療時間為至少3個月。
18. 如請求項16所述之用途，其中至少一段受質轉換期間具有與至少一段其他的受質轉換期間不同的一持續時間。
19. 一種套組，包含：一種或更多種包含一有效量的2-乙醯胺基-1,2-二脫氧野尻黴素(AdDNJ)的劑型；以及 指示用於：在一第一酶增強期間投予該劑型；在一受質轉換期間不投予該劑型；然後在一第二酶增強期間投予該劑型。
20. 如請求項19所述之套組，其中該第一酶增強期間和該第二酶增強期間具有相同的持續時間。
21. 如請求項19所述之套組，其中該第一酶增強期間和該第二酶增強期間中之一者或更多者為一約1天至約8天的期間。
22. 如請求項19所述之套組，其中在該受質轉換期間不投予AdDNJ包含在約48小時至約96小時的期間不投予AdDNJ。
23. 一種套組，包含：一種或更多種包含一有效量的2-乙醯胺基-1,2-二脫氧野尻黴素(AdDNJ)的活性劑型；一種或更多種不包含一有效量的AdDNJ的非活性劑型；以及指示用於：在一第一酶增強期間投予該活性劑型；在一受質轉換期間投予該非活性劑型；然後在一第二酶增強期間投予該活性劑型。
24. 如請求項23所述之套組，其中該第一 酶增強期間和該第二酶增強期間具有相同的持續時間。
25. 如請求項23所述之套組，其中該第一酶增強期間和該第二酶增強期間中之一者或更多者為一約1天至約8天的期間。
26. 如請求項23所述之套組，其中在該受質轉換期間不投予AdDNJ包含在約48小時至約96小時的期間不投予AdDNJ。