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TW201628648A - 纖維變性疾病之治療 - Google Patents

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TW201628648A
TW201628648A TW104130440A TW104130440A TW201628648A TW 201628648 A TW201628648 A TW 201628648A TW 104130440 A TW104130440 A TW 104130440A TW 104130440 A TW104130440 A TW 104130440A TW 201628648 A TW201628648 A TW 201628648A
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珍妮佛 肯恩
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安可美德藥物股份有限公司
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Abstract

本發明關於RSPO結合劑，特別是抗RSPO抗體，以及使用該等劑以治療或預防纖維變性疾病之方法。

Description

纖維變性疾病之治療 〔相關申請案的交互參照〕
本申請案主張美國臨時專利申請案62/051,026(2014年9月16日提出申請)之優先權，其以參照方式整體納入本文。
本發明之領域大抵關於與R-脊椎蛋白(RSPO)(特別是人R-脊椎蛋白RSPO1、RSPO2及RSPO3)結合之抗體及其他劑，以及使用該等抗體或其他劑以治療纖維變性疾病之方法。
據估計在已開發國家中，纖維化疾病(fibrosis)直接或間接造成將近45%的死亡案例。纖維變性疾病(fibrotic diseases)的特徵在於細胞外基質成份的過度累積，該過度累積擾亂生理組織結構，導致受影響器官的功能失調。在一些情況中，纖維化被認為是慢性組織刺激或慢性發炎的結果。在一些情況中，纖維化被認為 是體內自體免疫反應的結果。在纖維變性疾病諸如硬皮症、肺纖維化及肝硬化中，觀察到實質組織逐漸被細胞外基質成分取代。然而，維持纖維變性級聯的細胞性及分子性因子仍不明。
已知Wnt傳訊與數種人纖維變性疾病有關。在一些類型的纖維變性疾病中，經活化的Wnt傳訊可藉由β-連環蛋白之累積、Wnt途徑配體諸如Wnt1及Wnt10B之上調、及Wnt途徑負調節子諸如Dkk1之下調加以識別(Akhmetshina et al.,2012,Nature Communications,3：735；Guo et al.,2012,Physiol.Res.,61：337-346)。Wnt傳訊途徑是胚胎模式形成、後胚胎組織維持及幹細胞生物學的重要調節因子之一。未經調節的Wnt途徑活化與多種人疾病有關，其中致病機轉藉由破壞控制正常發育及組織修復之恆定機轉進行。
Wnt配體及R-脊椎蛋白(RSPO)已顯示協同作用以活化典型Wnt途徑。已知RSPO蛋白活化類似Wnt傳訊之β-連環蛋白傳訊，然而RSPO蛋白與Wnt傳訊之間的關係仍在研究當中。報告指出RSPO蛋白對Wnt配體具有陽性調節活性(Nam et al.,2006,JBC 281：13247-57)。此研究亦指出RSPO蛋白可作為Frizzled8及LRP6受體配體及誘導β-連環蛋白傳訊(Nam et al.,2006,JBC 281：13247-57)。最近研究已發現RSPO蛋白與LGR(富含白胺酸重複之G蛋白偶合受體)蛋白如LGR5之間有交互作用(美國專利公開號2009/0074782及 2009/0191205)，這些資料呈現活化β-連環蛋白傳訊之替代途徑。
R-脊椎蛋白(RSPO)家族之蛋白在脊椎動物之間具保守性，包含四個成員RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4。這些蛋白有許多不同的名稱，包括頂板特異性脊椎蛋白(roof plate-specific spondin)、hPWTSR(hRSPO3)、THS2D(RSPO3)、Cristin 1-4及Futrin 1-4。RSPO為小型分泌蛋白，所有RSPO共享大約40至60%之序列同源性及結構域組織。所有RSPO蛋白包含在N端的二個類似三呋喃基二氫咪唑(furin)之多半胱胺酸區、之後為血小板反應素結構域及鹼性帶電C端尾(Kim et al.,2006,Cell Cycle,5：23-26)。
研究顯示，RSPO蛋白在脊椎動物發育期間(Kamata et al.,2004,Biochim.Biophys Acta,1676：51-62)與爪蟾(Xenopus)的肌肉發育(Kazanskaya et al.,2004,Dev.Cell,7：525-534)方面具有功能。研究也顯示RSPO1為胃腸上皮細胞之強效致裂物質(Kim et al.,2005,Science,309：1256-1259)。報告指出RSPO3主要表現於爪蟾及小鼠的內皮細胞及內皮前驅細胞之中或附近。另外，研究指出RSPO3可能在胚胎發生時作為血管生成因子(Kazanskaya et al.,2008,Development,135：3655-3664)。
經診斷罹患纖維變性疾病之病患的藥物治療選擇非常有限。需要針對纖維化以及纖維化中之相關傳訊 途徑的新穎藥劑。因此，擾亂纖維化中之相關傳訊途徑的生物分子諸如RSPO結合劑係新穎治療劑之潛在來源。
本發明提供治療或預防個體之纖維變性疾病之方法，該方法包含對該個體投予治療有效量之RSPO結合劑，包括該些於本說明書中所述之任一者。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係與人RSPO蛋白特異性結合之抗體。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係與人RSPO1特異性結合之抗體。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係與人RSPO2特異性結合之抗體。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係與人RSPO3特異性結合之抗體。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係與人RSPO4特異性結合之抗體。在一些實施態樣中，治療或預防個體之纖維變性疾病之方法包含對該個體投予治療有效量之與人RSPO1特異性結合之抗體。在一些實施態樣中，治療或預防個體之纖維變性疾病之方法包含對該個體投予治療有效量之與人RSPO2特異性結合之抗體。在一些實施態樣中，治療或預防個體之纖維變性疾病之方法包含對該個體投予治療有效量之與人RSPO3特異性結合之抗體。在一些實施態樣中，治療或預防個體之纖維變性疾病之方法包含對該個體投予治療有效量之與人RSPO1特異性結合之抗體以及治療有效量之與人RSPO2特異性結合之抗體。在一些實施態樣中，治療或預防個體之纖維變性疾病之方法包含對 該個體投予治療有效量之與人RSPO1特異性結合之抗體以及治療有效量之與人RSPO3特異性結合之抗體。在一些實施態樣中，治療或預防個體之纖維變性疾病之方法包含對該個體投予治療有效量之與人RSPO2特異性結合之抗體以及治療有效量之與人RSPO3特異性結合之抗體。
在該等方法之一些實施態樣中，該纖維變性疾病係選自：肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、心纖維化及粘連(adhesion)形成。在一些實施態樣中，該纖維變性疾病係皮膚纖維化。在一些實施態樣中，該皮膚纖維化包括但不限於硬皮症、全身性硬化症、類硬皮症疾病、無皮膚硬化的硬皮症、蟹足腫形成及肥厚性瘢痕形成。在一些實施態樣中，該纖維變性疾病係腎纖維化。在一些實施態樣中，該腎纖維化包括但不限於慢性腎疾病。在一些實施態樣中，該纖維變性疾病係肺纖維化。在一些實施態樣中，該肺纖維化包括但不限於自發性肺纖維化、間質肺纖維化、肺纖維化、縱膈纖維化及胸膜纖維化。在一些實施態樣中，該肺纖維化係原發性肺纖維化。在一些實施態樣中，該肺纖維化係繼發性肺纖維化。在一些實施態樣中，該纖維變性疾病係肝纖維化。在一些實施態樣中，該肝纖維化包括但不限於肝硬化。在一些實施態樣中，該纖維變性疾病係心纖維化。在一些實施態樣中，該心纖維化包括但不限於心肌纖維化、心瓣膜纖維化、心內膜心肌纖維化及動脈粥樣硬化。在一些實施態樣中，該纖維變性疾病不是肺纖維化。在一些實施態樣中，該纖維 變性疾病不是肝纖維化。在一些實施態樣中，該心纖維化不是動脈粥樣硬化。
在一些實施態樣中，該方法包含投予至少一種額外治療劑。在一些實施態樣中，該額外治療劑係抗第二抗體。在一些實施態樣中，該額外治療劑係抗發炎劑。
在本文所述之方法的某些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO1特異性結合之RSPO1結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO1結合劑(例如抗體)包含抗體89M5之一、二、三、四、五及/或六個CDR(見本文之表1)。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO1特異性結合之RSPO1結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO1結合劑包含：(a)重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TGYTMH(SEQ ID NO：5)，該重鏈CDR2包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO：6)且該重鏈CDR3包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO：7)；以及(b)輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO：8)，該輕鏈CDR2包含WASTRHT(SEQ ID NO：9)且該輕鏈CDR3包含QQHYSTPW(SEQ ID NO：10)。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與RSPO1特異性結合之RSPO1結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO1結合劑包含：與SEQ ID NO：11或 SEQ ID NO：56具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、或至少約99序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含與SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：57具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：包含SEQ ID NO：11之重鏈可變區及/或包含SEQ ID NO：12之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：包含SEQ ID NO：56之重鏈可變區及/或包含SEQ ID NO：57之輕鏈可變區。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與RSPO1特異性結合之RSPO1結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO1結合劑包含：與SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14具有至少90%序列一致性之重鏈，及/或與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16具有至少90%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：與SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14具有至少95%序列一致性之重鏈，及/或與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16具有至少95%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：包含SEQ ID NO：14之重鏈及/或包含SEQ ID NO：16之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：包含SEQ ID NO：14之重鏈及包含SEQ ID NO：16之輕鏈。在一些實施態樣中，抗 RSPO1抗體係h89M5-H8L5。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與RSPO1特異性結合之RSPO1結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO1結合劑包含：與SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59具有至少90%序列一致性之重鏈，及/或與SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61具有至少90%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：與SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59具有至少95%序列一致性之重鏈，及/或與SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61具有至少95%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：包含SEQ ID NO：59之重鏈及/或包含SEQ ID NO：61之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：包含SEQ ID NO：59之重鏈及包含SEQ ID NO：61之輕鏈。在一些實施態樣中，抗RSPO1抗體係h89M5-H2L2。
在本文所述之方法的某些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO2特異性結合之RSPO2結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO2結合劑(例如抗體)包含抗體130M23之一、二、三、四、五及/或六個CDR(見本文之表1)。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO2特異性結合之RSPO2結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO2結合劑包含：(a)重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含SSYAMS(SEQ ID NO：21)，該重鏈CDR2包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO：22)且該重鏈CDR3包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO：23)；以及(b)輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO：24)，該輕鏈CDR2包含WASTRHT(SEQ ID NO：25)且該輕鏈CDR3包含QQHYSTP(SEQ ID NO：26)。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與RSPO2特異性結合之RSPO2結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO2結合劑包含與SEQ ID NO：27具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、或至少約99序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含與SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：66具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：包含SEQ ID NO：27之重鏈可變區及/或包含SEQ ID NO：28之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：包含SEQ ID NO：27之重鏈可變區及/或包含SEQ ID NO：66之輕鏈可變區。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與RSPO2特異性結合之RSPO2結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO2結合劑包含：與SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30具有至少90%序列一致性之重鏈，及/或 與SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32具有至少90%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：與SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30具有至少95%序列一致性之重鏈，及/或與SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32具有至少95%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：包含SEQ ID NO：30之重鏈及/或包含SEQ ID NO：32之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：包含SEQ ID NO：30之重鏈及包含SEQ ID NO：32之輕鏈。在一些實施態樣中，抗RSPO2抗體係h130M23-HIL6。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與RSPO2特異性結合之RSPO2結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO2結合劑包含：與SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30具有至少90%序列一致性之重鏈，及/或與SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：68具有至少90%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：與SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30具有至少95%序列一致性之重鏈，及/或與SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：68具有至少95%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：包含SEQ ID NO：30之重鏈及/或包含SEQ ID NO：68之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：包含SEQ ID NO：30之重鏈及包含SEQ ID NO：68之輕鏈。在一些實施態樣中，抗RSPO2抗體係h130M23-H1L2。
在本文所述之方法的某些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO3特異性結合之RSPO3結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO3結合劑(例如抗體)包含抗體131R011之一、二、三、四、五及/或六個CDR(見本文之表1)。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO3特異性結合之RSPO3結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO3結合劑包含：(a)重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含DYSIH(SEQ ID NO：37)，該重鏈CDR2包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：38)且該重鏈CDR3包含TYFANNFD(SEQ ID NO：39)或ATYFANNFDY(SEQ ID NO：40)；以及(b)輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：41)，該輕鏈CDR2包含AASNLES(SEQ ID NO：42)或AAS(SEQ ID NO：43)且該輕鏈CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：44)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：45)。
在某些實施態樣中，本發明提供與RSPO3特異性結合之RSPO3結合劑(例如抗體)，其中該RSPO3結合劑包含與SEQ ID NO：46具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、或至少約99序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含與SEQ ID NO：47具有至少約80%、 至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含SEQ ID NO：46之重鏈可變區，及/或包含SEQ ID NO：47之輕鏈可變區。
在某些實施態樣中，本發明提供與RSPO3特異性結合之RSPO3結合劑(例如抗體)，其中該RSPO3結合劑包含：與SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49具有至少90%序列一致性之重鏈，及/或與SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：51具有至少90%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：與SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49具有至少95%序列一致性之重鏈，及/或與SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：51具有至少95%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含SEQ ID NO：49之重鏈及/或包含SEQ ID NO：51之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含SEQ ID NO：49之重鏈及包含SEQ ID NO：51之輕鏈。在一些實施態樣中，抗RSPO3抗體係131R010。
在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係單株抗體。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係重組抗體。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係嵌合抗體。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係人化抗體。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係人抗體。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係IgG1抗體。在一些實施態樣中，該RSPO 結合劑係IgG2抗體。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係單價抗體。
在本文所述之方法的一些實施態樣中，一種方法包含與本發明之抗RSPO1抗體競爭與人RSPO1特異性結合之RSPO1結合劑。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑與一抗體競爭與人RSPO1之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：11之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：12之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑與一抗體競爭與人RSPO1之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：56之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：57之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，與該RSPO1結合劑競爭之該抗體係包含抗體89M5之CDR的抗體。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑與本發明之抗RSPO1抗體在試管內競爭性結合測定中競爭與RSPO1之特異性結合。
在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑係與本發明之抗RSPO1抗體(例如89M5、h89M5-H8L5、或h89M5-H2L2)所結合之RSPO1上的相同表位或實質上相同表位結合之抗體。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑係與RSPO1上之與本發明之抗RSPO1抗體(例如89M5、h89M5-H8L5、或h89M5-H2L2)所結合的RSPO1表位重疊之表位結合之抗體。
在本文所述之方法的一些實施態樣中，一種 方法包含與本發明之抗RSPO2抗體競爭與人RSPO2特異性結合之RSPO2結合劑。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑與一抗體競爭與人RSPO2之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：27之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：28之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑與一抗體競爭與人RSPO2之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：27之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：66之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，與該RSPO2結合劑競爭之該抗體係包含抗體130M23之CDR的抗體。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑與本發明之抗RSPO2抗體在試管內競爭性結合測定中競爭與RSPO2之特異性結合。
在某些實施態樣中，該RSPO2結合劑係與本發明之抗RSPO2抗體(例如130M23、h130M23-H1L6、或h130M23-H1L2)所結合之RSPO2上的相同表位或實質上相同表位結合之抗體。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑係與RSPO2上之與本發明之抗RSPO2抗體(例如130M23、h130M23-H1L6、h130M23-H1L2)所結合的RSPO2表位重疊之表位結合之抗體。
在本文所述之方法的一些實施態樣中，一種方法包含與本發明之抗RSPO3抗體競爭與人RSPO3特異性結合之RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑與一抗體競爭與人RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：46之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：47之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，與該RSPO3結合劑競爭之該抗體係包含抗體131R010之CDR的抗體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑與本發明之抗RSPO3抗體在試管內競爭性結合測定中競爭與RSPO3之特異性結合。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與本發明之抗RSPO3抗體(例如131R010)所結合之RSPO3上的相同表位或實質上相同表位結合之抗體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與RSPO3上之與本發明之抗RSPO3抗體(例如131R010)所結合的RSPO3表位重疊之表位結合之抗體。
在本文所述之任何方法的某些實施態樣中，該RSPO結合劑或抗體係經分離。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑或抗體係實質上純的。
在另一態樣中，本發明提供一種抑制細胞中Wnt傳訊之方法，該方法包含使該細胞與有效量之RSPO結合劑(包括本文所述之各者)接觸。在一些實施態樣中，該細胞表現升高量之至少一種RSPO蛋白。在一些實施態樣中，該細胞表現升高量之RSPO1。在一些實施態樣中，該細胞表現升高量之RSPO2。在一些實施態樣中，該細胞表現升高量之RSPO3。在一些實施態樣中，該細胞表現高量之至少一種RSPO蛋白。在一些實施態樣中，該細胞表現高量之RSPO1。在一些實施態樣中，該細胞表現高量之RSPO2。在一些實施態樣中，該細胞表現高量之 RSPO3。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制纖維變性組織之形成。
在本文所述之任何方法的某些實施態樣中，該方法另包含測定至少一種RSPO蛋白於細胞中之表現量之步驟。在一些實施態樣中，該細胞係來自纖維變性組織。
在本文所述之任何方法的某些實施態樣中，該方法包含對該個體投予RSPO結合劑及至少一種其他治療劑。
包含本文所述之RSPO結合劑或抗體之組成物係經提供。包含本文所述之RSPO結合劑或抗體及醫藥上可接受之之載劑的醫藥組成物係經提供。亦提供於個體(例如人)中治療纖維變性疾病之方法，該方法包含對該個體投予有效量之包含RSPO結合劑之醫藥組成物。亦提供RSPO結合劑用於治療纖維變性疾病之用途。
本發明之態樣或實施態樣係以馬庫西群組或其他替代物之群組描述，本發明不僅包含被標示為整體之整個群組，但亦包含該群組之個別成員及該主要群組中所有可能之亞群，且亦包含不含其中一或多個群組成員之主要群組。本發明亦設想明確排除該申請專利之發明中任何群組成員之一或多者。
圖l：在博來黴素(bleomycin)誘導之肺纖 維化模型中的RSPO表現。
圖2：在博來黴素(bleomycin)誘導之皮膚纖維化模型中的RSPO表現。
圖3：由RSPO抗體抑制博來黴素(bleomycin)誘導之皮膚病灶。
圖4：博來黴素(bleomycin)誘導之皮膚病灶組織中的基因表現。組織樣本係自第12天採集。
圖5：來自博來黴素(bleomycin)誘導之皮膚病灶的干擾素γ之基因表現。組織樣本係於投予單劑量之博來黴素(bleomycin)及單劑量之抗RSPO抗體之後24小時採集。
本發明提供來自治療纖維變性疾病及用於減少因傷口癒合所導致之瘢痕形成的新穎方法。該等方法包含投予RSPO結合劑(特別是抗RSPO1抗體、抗RSPO2抗體、及/或抗RSPO3抗體)至有需要之個體。RSPO結合劑包括但不限於RSPO3與LGR蛋白交互作用之抑制劑。
I.定義
為了促進對本發明之了解，以下定義一些用語及用詞。
本文所使用之用語「纖維變性疾病(fibrotic diseases)」包括但不限於結締組織疾病。該領域之技藝人士通常認為纖維化(fibrosis)係過多纖維結締組織在器官或組織中的形成或發展。在一些實施態樣中，纖維化的發生係作為修復性(reparative)或反應性(reactive)過程。在一些實施態樣中，纖維化因應受損或傷害而發生。用語「纖維化」應被理解為過多纖維結締組織在器官或組織中作為修復性或反應性過程的形成或發展，並非形成作為器官或組織之正常構成分的纖維組織。
本文所使用之用語「拮抗劑」及「拮抗性」，係指部分或完全阻斷、抑制、減少、或中和標靶及/或傳訊途徑之生物活性之任何分子。本文所使用之用語「拮抗劑」包括部分或完全阻斷、抑制、減少或中和蛋白(例如RSPO蛋白)之活性的任何分子。適當之拮抗劑分子特別包括但不限於拮抗抗體或抗體片段。
本文所使用之用語「調節」係指生物活性之改變或變化。調節包括但不限於刺激或抑制活性。調節可為增加或減少活性、改變結合特性，或任何其他與蛋白、途徑、或其他生物性關注點之活性有關之生物性、功能性或免疫性特性之改變。
本文所使用之用語「抗體」係指免疫球蛋白分子，該免疫球蛋白分子藉由彼之可變區內之至少一個抗原結合部位，辨識標靶(例如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質、或前述之組合)且與之特異性結合。如本文所使用，該用語包含完整多株抗體、完整單株 抗體、單鏈抗體、抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、及Fv片段)、單鏈Fv(scFv)抗體、多特異性抗體諸如雙特異性抗體、單特異性抗體、單價抗體、嵌合抗體、人化抗體、人抗體、包含抗體之抗原結合部位之融合蛋白，及任何其他包含抗原辨識區(即抗原結合部位)之經修飾之免疫球蛋白分子，只要該等抗體展現所欲之生物活性。抗體可為下列五種主要免疫球蛋白類型中之任一者：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM或彼等之亞型(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)，此係根據彼等分別被稱為α、δ、ε、γ、及μ之重鏈恆定結構域命名。不同類型之免疫球蛋白具有不同且廣為周知之次單位結構及三維組態。抗體可為裸(naked)抗體或與其他分子共軛，該等其他分子包括但不限於毒素及放射性同位素。
用語「抗體片段」係指完整抗體之一部分且係指完整抗體之抗原性決定可變區。抗原片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體及自抗體片段形成之多特異性抗體。本文所使用之「抗體片段」包含抗原結合部位或表位結合部位。
抗體之「可變區」用語係指抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區(不論單獨或組合指稱)。各重鏈及輕鏈之可變區係由四個架構區(FR)及連接該四個架構區之三個互補決定區(CDR)組成，該三個CDR又名「超變異區」。各鏈中之CDR被架構區拉近，並與來自 其他鏈中之CDR一起形成該抗體之抗原結合部位。至少有兩種技術用於測定CDR：(1)基於跨種序列變異性之方法(即Kabat et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Edition,National Institutes of Health,Bethesda,MD)；及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶學研究之方法(Al-Lazikani et al.,1997,J.Mol.Biol.,273：927-948)。此外，本領域中可使用這兩種方法之組合以測定CDR。
本文所使用之用語「單株抗體」係指同質性抗體群，其涉及高度特異性辨識及結合單一抗原性決定簇或表位。此與多株抗體相反，多株抗體通常包括多種以不同抗原決定簇為目標之不同抗體之混合。用語「單株抗體」包含完整及全長單株抗體，也包含抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)抗體、雙特異性抗體、包含抗體部分之融合蛋白、及任何其他包含抗原辨識區(抗原結合部位)之經修飾之免疫球蛋白分子。另外，「單株抗體」係指由許多技術製備之該等抗體，該等技術包括但不限於雜交瘤產製、噬菌體選擇、重組表現及基因轉殖動物。
本文所使用之用語「人化抗體」係指包含最少非人序列之特異性免疫球蛋白鏈、嵌合性免疫球蛋白或彼等之片段之抗體形式。通常，人化抗體係其中CDR之胺基酸殘基經源自具有所欲特異性、親和性及/或結合能力之非人物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠)之CDR的 胺基酸殘基取代之人免疫球蛋白。在一些情況中，人免疫球蛋白之架構區胺基酸殘基係由來自非人物種之抗體中的對應胺基酸殘基取代。人化抗體可進一步藉由取代架構區及/或經取代之非人胺基酸殘基內之額外胺基酸殘基加以修飾，以精進優化抗體特異性、親和性、結構及/或結合能力。通常，人化抗體將包含實質上所有對應該非人免疫球蛋白之至少一個且通常兩或三個CDR，然而所有或實質上所有之架構區係具有人免疫球蛋白序列之架構區。人化抗體亦可包含至少一部分之免疫球蛋白恆定區或結構域(Fc)，通常為人免疫球蛋白之該部分。
如本文所使用之用語「人抗體」係指由人產製之抗體或具有對應由人產製之抗體的胺基酸序列之抗體。人抗體可利用任何該領域已知之技術製備。
本文所使用之用語「嵌合抗體」係指其中免疫球蛋白分子之胺基酸序列係源自二或更多個物種之抗體。通常，輕鏈及重鏈之可變區皆對應源自一個哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)之具有所欲特異性、親和性及/或結合能力之抗體的可變區，然而恆定區對應源自另一個物種(通常是人)之抗體中的序列。
本文所使用之用詞「親和性成熟抗體」係指在彼之一或多個CDR中具有一或多個改變之抗體，該一或多個改變導致該抗體相較於不具有該(等)改變之親代抗體對抗原之親和性增加。該定義亦包括與CDR胺基酸殘基改變一起發生之非CDR胺基酸殘基之改變。較佳之 親和性成熟抗體通常具有奈莫耳或甚至皮莫耳程度之對標靶抗原之親和性。親和性成熟抗體係由該領域已知之程序產製，包括但不限於重鏈及輕鏈可變結構域替換、CDR及/或架構胺基酸殘基之隨機突變形成、或CDR及/或架構胺基酸殘基之定點突變形成。
用語「表位」及「抗原決定簇」在本文可交換使用，係指可被特定抗體辨識且特異性結合之抗原部分。當抗原係多肽時，表位可自連續胺基酸或藉由蛋白之三級摺疊並列之非連續胺基酸形成。自連續胺基酸形成之表位(又稱為線性表位)通常在蛋白變性時仍被保留，然而藉由三級摺疊形成之表位(又稱為構形表位)通常在蛋白變性時喪失。表位通常包括至少3個及更常地至少5或8至10個呈獨特空間構形之胺基酸。
用語「選擇性結合」或「特異性結合」係指結合劑或抗體相較於替代性物質(包括非相關或相關蛋白)更頻繁、更快速、更長期間地、以更高親和性或上述條件之某些組合與表位、蛋白或標靶分子反應或結合。在某些實施態樣中，「特異性結合」係指例如抗體以大約0.1mM或更低，但通常低於大約1μM之KD與蛋白結合。在某些實施態樣中，「特異性結合」係指抗體有時以至少約0.1μM或更低，有時以至少約0.01μM或更低，且有時以至少約1nM或更低之KD與標靶結合。由於不同物種的同源性蛋白之間具有序列一致性，因此特異性結合可包括辨識超過一個物種之蛋白(例如人RSPO3及小鼠 RSPO3)之抗體。同樣地，由於不同蛋白之多肽序列的某些區域內具有同源性，因此特異性結合可包括辨識超過一種蛋白(例如人RSPO3及人RSPO1)之抗體(或其他多肽或結合劑)。應了解的是，在某些實施態樣中，與第一標靶特異性結合之抗體或結合基團可能或可能不與第二標靶特異性結合。因此，「特異性結合」不一定需要(雖然可包括)排他性結合(即與單一標靶結合)。因此，在某些實施態樣中，抗體與一種以上之標靶特異性結合。在某些實施態樣中，多重標靶可能由抗體上之相同的抗原結合部位結合。舉例來說，在某些情況下，抗體可能包含二個完全相同之抗原結合部位，該二個抗原結合部位各自與二或更多個蛋白(例如RSPO3及RSPO1)上之相同表位特異性結合。在某些替代性實施態樣中，抗體可能為多特異性且包含至少二個具有不同特異性之抗原結合部位。以非限制性實例而言，雙特異性抗體可包含辨識一種蛋白(例如人RSPO3)上之表位的一抗原結合部位，另包含辨識第二蛋白上之不同表位的第二、不同抗原結合部位。一般來說(但不必然)，所謂的結合係指特異性結合。
用語「多肽」和「肽」以及「蛋白」在本文可交換使用，這些用語係指任何長度之胺基酸的聚合物。該聚合物可為線性或分支，其可能包含經修飾之胺基酸，且其可能被非胺基酸中斷。該等用語亦包含經天然或人為干預修飾之胺基酸聚合物；例如雙硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，諸如與標記 成份共軛。該定義亦包括例如包含一或多個胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸)之多肽，以及包含該領域習知之其他修飾之多肽。應了解的是，由於本發明之多肽可能以抗體為主，因此在某些實施態樣中，該多肽可能為單鏈或相連之鏈。
用語「多核苷酸」及「核酸」在本文可交換使用，係指任何長度之核苷酸之聚合物，包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或彼等之類似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶被納入聚合物中之底物。
「高嚴謹度之條件」可識別為下列條件：(1)採用低離子張力及高溫清洗，例如50℃之15mM NaCl/1.5mM檸檬酸鈉/0.1%十二基硫酸鈉；(2)在雜交期間採用變性劑，諸如甲醯胺，例如42℃之具有0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯基吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩衝液之於pH 6.5之5x SSC(0.75M NaCl，75mM檸檬酸鈉)中之50%(體積/體積)甲醯胺；或(3)於雜交期間採用42℃於5x SSC中之50%甲醯胺、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5x丹哈德(Denhardt’s)溶液、經超音波化之鮭魚精子DNA(50μg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，於42℃以0.2x SSC及50%甲醯胺清洗，之後於55℃以含有EDTA之0.1x SSC進行高嚴謹度清洗。
在提及二或多個核酸或多肽時，用語「一致 (identical)」或百分比「一致性(identity)」係指當二或更多個序列或子序列經比較及排比(需要時導入間格)以達最高對應性且不把任何保守性胺基酸取代當作序列一致性之部分時，該二或多個序列或子序列係相同或具有相同之特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基。百分比一致性可利用序列比較軟體或演算法測量，或藉由目視檢查測量。多種可被用於取得胺基酸或核苷酸序列排比之演算法及軟體係該領域所廣為周知。該等演算法及軟體包括但不限於BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin套裝軟體及彼等之變化性產品。在一些實施態樣中，本發明之二個核酸或多肽係實質上一致，表示當彼等經比較或排比以達最高對應性時，利用序列比較演算法或目視檢查得知彼等具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%且在一些實施態樣中至少95%、96%、97%、98%、99%之核苷酸或胺基酸殘基一致性。在一些實施態樣中，一致性存在於至少約10個、至少約20個、至少約40至60個殘基、至少約60至80個殘基長度或介於之間的任何整數長度之序列區域。在一些實施態樣中，一致性存在於60至80個殘基以上之更長區域，諸如至少約80至100個殘基，且在一些實施態樣中該等序列係與經比較之全長序列諸如核苷酸序列之編碼區域實質上一致。
「保守性胺基酸取代」係指其中一個胺基酸殘基被另一個具有類似側鏈之胺基酸殘基取代之取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基群係於該領域中定義，包括鹼性 側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。舉例來說，以苯丙胺酸取代酪胺酸係保守性取代。較佳地，本發明之多肽及抗體之序列中的保守性取代不廢除含有該胺基酸序列之多肽或抗體與該多肽或抗體原本所結合之抗原(即該一或多種RSPO蛋白)之結合。識別不消除抗原結合性之核苷酸及胺基酸保守性取代之方法係該領域所廣為周知。
本文所使用之用語「載體(vector)」係指建構物，該建構物能在宿主細胞中遞送及通常表現一或多種感興趣之基因或序列。載體之實例包括但不限於病毒性載體、裸DNA或RNA表現載體、質體載體、黏質體載體、噬菌體載體、與陽離子縮合劑有關之DNA或RNA表現載體，及包封於脂質體中之DNA或RNA表現載體。
經「分離」之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物係呈現未見於天然中之形式之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物。經分離之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物包括該些經純化至一定程度而使彼等不再以見於天然中之形式存在者。在一些 實施態樣中，經純化之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物係實質上純的。
本文所使用之用語「實質上純的」係指其為至少50%純的(即不含汙染物)、至少90%純的、至少95%純的、至少98%純的或至少99%純的物質。
用語「個體」係指任何動物(例如哺乳動物)，包括但不限於人、非人靈長動物、犬、貓、囓齒動物及該類似動物，該動物將成為特定治療之接受者。通常，關於人個體之用語「個體」及「病患」在本文可交換使用。
用語「醫藥上可接受」係指經美國聯邦政府之管理機關或州政府核准(或可核准)或經明列於美國藥典或其他普遍公認之藥典中以用於動物(包括人)之產品或化合物。
用語「醫藥上可接受之賦形劑、載劑或佐劑」或「可接受之醫藥載劑」係指可與本發明之至少一種結合劑(例如抗體)一起投予至個體之賦形劑、載劑或佐劑，且該賦形劑、載劑或佐劑不破壞該結合劑之活性。該賦形劑、載劑或佐劑當與足以達到治療效應之劑量之結合劑一起投予時應不具毒性。一般來說，該領域之技藝人士及美國FDA認為醫藥上可接受之賦形劑、載劑或佐劑為任何調製劑之非活性成分。
用語「有效量」或「治療有效量」或「治療效應」係指有效「治療」個體或哺乳動物之疾病或疾患之 結合劑、抗體、多肽、多核苷酸、小型有機分子或其他藥物之量。以纖維變性疾病為例，劑(例如抗體)之治療有效量具有治療效應，且因此可預防纖維變性疾病之發展；減緩纖維變性疾病之發展；減緩纖維變性疾病之進展；減少疾病中纖維化之量；減少纖維變性材料於器官中之病理性沉積；減少結締組織或細胞外基質於器官中之病理性沉積；緩解與纖維變性疾病相關之一或多種症狀至某些程度；減少發病率及死亡率；改善生活品質；或該等效應之組合。
用語「治療」或「緩和」係指1)治療性措施，該措施治癒、減緩、減輕經診斷之病理狀況或疾患之症狀及/或停止該經診斷之病理狀況或疾患之進展及2)預防性或防範性措施，該措施預防或減緩標靶病理狀況或疾患之發展。因此該些需要治療者包括該些已罹患該疾患者、該些易於罹患該疾患者，以及該些欲預防該疾患者。在一些實施態樣中，個體係經本發明之方法成功「治療」，若該病患顯示下列一或多項：預防纖維變性疾病之發展；減緩纖維變性疾病之發展；減緩纖維變性疾病之進展；減少疾病中纖維化之量；減少纖維變性材料於器官中之病理性沉積；減少結締組織或細胞外基質於器官中之病理性沉積；緩解與纖維變性疾病相關之一或多種症狀至某些程度；減少發病率及死亡率；改善生活品質；或該等效應之組合。
如本揭示內容及申請專利範圍中所使用者， 單數形式之「一」(a,an)及「該」(the)包含複數形式除非上下文另外清楚地說明。
應了解的是，只要本文之實施態樣係以用語「包含」描述，其亦提供其他以「由...組成」及/或「實質上由...組成」之用語所描述之類似實施態樣。也應了解的是，只要本文之實施態樣係以用語「實質上由...組成」描述，其亦提供其他以「由...組成」之用語所描述之類似實施態樣。
當使用於本文諸如「A及/或B」之用詞中，用語「及/或」係意圖包括A及B兩者、A或B、A(單獨)及B(單獨)。同樣地，當使用於本文諸如「A、B及/或C」之用詞中，用語「及/或」係意圖包含下列實施態樣之各者：A、B、及C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。
II.使用方法及醫藥組成物
本發明提供用於預防及/或治療纖維變性疾病之方法。在一些實施態樣中，方法包含使用本文所述之RSPO結合劑(例如抗體)。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係人RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之拮抗劑。方法可為試管內(in vitro)、活體外(ex vivo)或活體內(in vivo)方法。本發明亦提供本文所述之RSPO結合劑(例如抗體)於製造用於治療纖維變性疾病之藥物 之用途。
本發明提供使用本文所述之RSPO結合劑(例如抗體)治療或預防纖維變性疾病之方法。在某些實施態樣中，治療纖維變性疾病之方法包含於試管內使細胞或組織與RSPO結合劑(例如抗體)接觸。例如，纖維母細胞(來自受到關注之器官的細胞系或初代細胞)係與受到關注之劑(例如RSPO結合劑)接觸。受到關注之劑的效應可藉由評估肌纖維母細胞/間葉分化，包括但不限於α-平滑肌肌動蛋白、轉化生長因子β1、及/或纖維粘連蛋白(fibronectin)之上調；細胞外基質沉積；及膠原蛋白/羥基脯胺酸含量來觀察。
在某些實施態樣中，治療纖維變性疾病之方法包含於活體內使細胞或組織與RSPO結合劑(例如抗體)接觸。在某些實施態樣中，使細胞或組織接觸RSPO結合劑係於動物模型中進行。例如，RSPO結合劑可被投予至具有纖維變性疾病之小鼠。在一些實施態樣中，RSPO結合劑可被投予至基因轉殖小鼠。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係經投予至動物。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係於投予纖維化誘導劑至動物之同時或投予後短時間內投予以預防纖維化之發展(「預防模型」)。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係於腫纖維化已經誘導後投予以作為治療劑(「治療模型」)。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係抗體。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係抗RSPO1抗體。在一些實施態樣中，RSPO結合劑 係抗RSPO2抗體。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係抗RSPO3抗體。
在動物中誘導纖維化之模型係該領域之技藝人士所廣為周知。例如，肺纖維化可藉由在小鼠腹膜內注射博來黴素(bleomycin)來誘導。肺纖維化亦可藉由氣管內滴入博來黴素、螢光素異硫氰酸酯或顆粒物質，諸如矽石及石綿來誘導。肝纖維化可藉由在小鼠腹膜內注射四氯化碳來誘導。皮膚纖維化可藉由在小鼠局部注射博來黴素來誘導。
在某些實施態樣中，治療或預防纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之RSPO結合劑。在某些實施態樣中，治療或預防纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之抗RSPO抗體。
在某些實施態樣中，治療或預防纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之抗RSPO1抗體。在某些實施態樣中，治療或預防纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之抗RSPO1抗體，其中該抗RSPO1抗體包含：包含TGYTMH(SEQ ID NO：5)之重鏈CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO：6)之重鏈CDR2、及包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO：7)之重鏈CDR3；以及包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO：8)之輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO：9)之輕鏈CDR2、及包含QQHYSTPW(SEQ ID NO：10)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，治療或預防 纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之抗RSPO1抗體，其中該抗RSPO1抗體包含：與SEQ ID NO：11具有至少約90%序列一致性之重鏈可變區及與SEQ ID NO：12具有至少90%序列一致性之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，治療或預防纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之抗RSPO1抗體，其中該抗RSPO1抗體包含：與SEQ ID NO：56具有至少約90%序列一致性之重鏈可變區及與SEQ ID NO：57具有至少90%序列一致性之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，治療或預防纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之抗RSPO1抗體，其中該抗RSPO1抗體包含：SEQ ID NO：11之重鏈可變區及SEQ ID NO：12之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，治療或預防纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之抗RSPO1抗體，其中該抗RSPO1抗體包含：SEQ ID NO：56之重鏈可變區及SEQ ID NO：57之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗RSPO1抗體係人化版本之抗體89M5。在一些實施態樣中，抗RSPO1抗體係抗體h89M5-H8L5。在一些實施態樣中，抗RSPO1抗體係抗體h89M5-H2L2。
在某些實施態樣中，治療或預防纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之抗RSPO2抗體。在某些實施態樣中，治療或預防纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之抗RSPO2抗體，其中該抗RSPO2抗體包含：包含SSYAMS(SEQ ID NO：21)之重 鏈CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO：22)之重鏈CDR2、及包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO：23)之重鏈CDR3；以及包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO：24)之輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO：25)之輕鏈CDR2、及包含QQHYSTP(SEQ ID NO：26)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，治療或預防纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之抗RSPO2抗體，其中該抗RSPO2抗體包含：與SEQ ID NO：27具有至少約90%序列一致性之重鏈可變區及與SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：66具有至少90%序列一致性之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，治療或預防纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之抗RSPO2抗體，其中該抗RSPO2抗體包含：SEQ ID NO：27之重鏈可變區及SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：66之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗RSPO2抗體係人化版本之抗體130M23。在一些實施態樣中，抗RSPO2抗體係抗體h130M23-HIL6。在一些實施態樣中，抗RSPO2抗體係抗體h130M23-H1L2。
在某些實施態樣中，治療或預防纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之抗RSPO3抗體。在某些實施態樣中，治療或預防纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之抗RSPO3抗體，其中該抗RSPO3抗體包含：包含DYSIH(SEQ ID NO：37)之重鏈CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SQ ID NO：38)之 重鏈CDR2、及包含TYFANNFD(SEQ ID NO：39)或ATYFANNFDY(SEQ ID NO：40)之重鏈CDR3；以及包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：41)之輕鏈CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO：42)或AAS(SEQ ID NO：43)之輕鏈CDR2、及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：44)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：45)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，治療或預防纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之抗RSPO3抗體，其中該抗RSPO3抗體包含：與SEQ ID NO：46具有至少約90%序列一致性之重鏈可變區及與SEQ ID NO：47具有至少90%序列一致性之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，治療或預防纖維變性疾病之方法包含對個體投予治療有效量之抗RSPO3抗體，其中該抗RSPO3抗體包含：SEQ ID NO：46之重鏈可變區及SEQ ID NO：47之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗RSPO3抗體係抗體131R010。
在本文所述之方法的一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO1且預防纖維變性疾病之發展。在一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO1且減緩纖維變性疾病之發展。在一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO1且減緩纖維變性疾病之進展。在一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO1且減少疾病中纖維化之量。在一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO1且減少纖維變性材料於器官中之病理性沉積。在一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO1且減少結締組織及/或細胞外基質於器官中 之病理性沉積。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係抗RSPO1抗體。在一些實施態樣中，抗RSPO1抗體係人化版本之抗體89M5。在一些實施態樣中，抗RSPO1抗體係h89M5-H8L5。在一些實施態樣中，抗RSPO1抗體係h89M5-H2L2。
在本文所述之方法的一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO2且預防纖維變性疾病之發展。在一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO2且減緩纖維變性疾病之發展。在一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO2且減緩纖維變性疾病之進展。在一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO2且減少疾病中纖維化之量。在一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO2且減少纖維變性材料於器官中之病理性沉積。在一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO2且減少結締組織及/或細胞外基質於器官中之病理性沉積。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係抗RSPO2抗體。在一些實施態樣中，抗RSPO2抗體係人化版本之抗體130M23。在一些實施態樣中，抗RSPO2抗體係h130M23-H1L6。在一些實施態樣中，抗RSPO2抗體係h130M23-H1L2。
在本文所述之方法的一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO3且預防纖維變性疾病之發展。在一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO3且減緩纖維變性疾病之發展。在一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO3且減緩纖維變性疾病之進展。在一些實施態樣中，RSPO 結合劑結合RSPO3且減少疾病中纖維化之量。在一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO3且減少纖維變性材料於器官中之病理性沉積。在一些實施態樣中，RSPO結合劑結合RSPO3且減少結締組織及/或細胞外基質於器官中之病理性沉積。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係抗RSPO3抗體。在一些實施態樣中，抗RSPO3抗體係131R010。
在該等方法之一些實施態樣中，該纖維變性疾病係選自：肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、心纖維化及粘連(adhesion)形成。在一些實施態樣中，該纖維變性疾病係皮膚纖維化。在一些實施態樣中，該皮膚纖維化包括但不限於硬皮症、全身性硬化症、類硬皮症疾病、無皮膚硬化的硬皮症、蟹足腫形成及肥厚性瘢痕形成。在一些實施態樣中，該纖維變性疾病係腎纖維化。在一些實施態樣中，該腎纖維化包括但不限於慢性腎疾病。在一些實施態樣中，該纖維變性疾病係肺纖維化。在一些實施態樣中，該肺纖維化包括但不限於自發性肺纖維化、間質肺纖維化、肺纖維化、縱膈纖維化及胸膜纖維化。在一些實施態樣中，該肺纖維化係原發性肺纖維化。在一些實施態樣中，該肺纖維化係繼發性肺纖維化。在一些實施態樣中，該纖維變性疾病係肝纖維化。在一些實施態樣中，該肝纖維化包括但不限於肝硬化。在一些實施態樣中，該纖維變性疾病係心纖維化。在一些實施態樣中，該心纖維化包括但不限於心肌纖維化、心瓣膜纖維化、心 內膜心肌纖維化及動脈粥樣硬化。在一些實施態樣中，該纖維變性疾病不是肺纖維化。在一些實施態樣中，該纖維變性疾病不是肝纖維化。在一些實施態樣中，該心纖維化不是動脈粥樣硬化。
在某些實施態樣中，方法另包含測定組織中至少一種RSPO(即蛋白或核酸)之表現量的步驟。在一些實施態樣中，測定組織中RSPO之表現量的步驟包含測定RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量。在一些實施態樣中，組織樣本(例如纖維變性組織)中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量係與參考樣本中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量比較。在一些實施態樣中，組織樣本中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量係與正常組織中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量比較。在一些實施態樣中，組織樣本中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量係與預先測定之RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量比較。在一些實施態樣中，組織樣本中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量係與預先測定之正常組織中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量比較。在一些實施態樣中，該組織具有高表現量之RSPO1。在一些實施態樣中，該組織具有高表現量之RSPO2。在一些實施態樣中，該組織具有高表現量之RSPO3。通常，組織樣本中RSPO(即蛋白或核酸)之表現量係與該相同組織類型之正常組織中的RSPO(即蛋白 或核酸)之表現量比較。然而在一些實施態樣中，RSPO(即蛋白或核酸)之表現量係與一群組織類型內的RSPO(即蛋白或核酸)之平均表現量比較。在一些實施態樣中，組織樣本中RSPO(即蛋白或核酸)之表現量係與該相同組織類型或不同組織類型之其他組織樣本中的RSPO(即蛋白或核酸)之表現量比較。
在一些實施態樣中，測定RSPO之表現量係於治療前進行。在一些實施態樣中，若組織樣本之RSPO的表現量相較於參考樣本(例如正常組織)中相同RSPO之表現量或預先決定之量升高，則對個體投予本文所述之RSPO結合劑或抗體。舉例來說，在一些實施態樣中，若組織樣本之RSPO3(即蛋白或核酸)的表現量相較於正常或對照組織中RSPO3之表現量升高，則對個體投予RSPO3結合劑(例如抗RSPO3抗體)。
此外，本發明提供識別適用於以RSPO結合劑治療人個體之方法，該方法包含測定該個體是否具有相較於正常組織、參考樣本中該相同RSPO(即蛋白或核酸)的表現或預先決定之該RSPO蛋白的量為上升之RSPO(即蛋白或核酸)表現量的組織樣本(纖維變性組織)。
在一些實施態樣中，識別適用於以RSPO1結合劑治療之人個體的方法包含：測定該個體是否具有相較於參考樣本或預先決定之RSPO1的量為上升之RSPO1表現量的纖維變性組織。在一些實施態樣中，識別適用於以 RSPO1結合劑治療之人個體的方法包含：自該個體獲得纖維變性組織之樣本，並測定該纖維變性組織是否具有相較於參考樣本或預先決定之RSPO1的量為上升之RSPO1表現量。在一些實施態樣中，若該纖維變性組織具有上升之RSPO1表現量，則選擇該個體為適用於以特異性結合RSPO1之抗體治療。在一些實施態樣中，若經選擇為適合治療，則對該個體投予本文所述之抗RSPO1抗體。
在一些實施態樣中，識別適用於以RSPO2結合劑治療之人個體的方法包含：測定該個體是否具有相較於參考樣本或預先決定之RSPO2的量為上升之RSPO2表現量的纖維變性組織。在一些實施態樣中，識別適用於以RSPO2結合劑治療之人個體的方法包含：自該個體獲得纖維變性組織之樣本，並測定該纖維變性組織是否具有相較於參考樣本或預先決定之RSPO2的量為上升之RSPO2表現量。在一些實施態樣中，若該纖維變性組織具有上升之RSPO2表現量，則選擇該個體為適用於以特異性結合RSPO2之抗體治療。在一些實施態樣中，若經選擇為適合治療，則對該個體投予本文所述之抗RSPO2抗體。
在一些實施態樣中，識別適用於以RSPO3結合劑治療之人個體的方法包含：測定該個體是否具有相較於參考樣本或預先決定之RSPO3的量為上升之RSPO3表現量的纖維變性組織。在一些實施態樣中，識別適用於以RSPO3結合劑治療之人個體的方法包含：自該個體獲得纖維變性組織之樣本，並測定該纖維變性組織是否具有相較 於參考樣本或預先決定之RSPO3的量為上升之RSPO3表現量。在一些實施態樣中，若該纖維變性組織具有上升之RSPO3表現量，則選擇該個體為適用於以特異性結合RSPO3之抗體治療。在一些實施態樣中，若經選擇為適合治療，則對該個體投予本文所述之抗RSPO3抗體。
在一些實施態樣中，若該纖維變性組織具有上升表現量之超過一種RSPO(即蛋白或核酸)，則對該個體投予與最高表現量之RSPO結合之RSPO結合劑。在一些實施態樣中，測定纖維變性組織中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量，若該纖維變性組織之RSPO1表現量相較於正常組織中RSPO1之量上升，則選擇該個體為適用於以特異性結合RSPO1之抗體治療。若經選擇為適合治療，則對該個體投予如本文所述之抗RSPO1抗體。在一些實施態樣中，RSPO1結合劑係人化版本之抗體89M5。在一些實施態樣中，RSPO1結合劑係抗體h89M5-H8L5。在一些實施態樣中，RSPO1結合劑係抗體h89M5-H2L3。在一些實施態樣中，測定纖維變性組織中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量，若該纖維變性組織之RSPO2表現量相較於正常組織中RSPO2之量上升，則選擇該個體為適用於以特異性結合RSPO2之抗體治療。若經選擇為適合治療，則對該個體投予如本文所述之抗RSPO2抗體。在一些實施態樣中，RSPO2結合劑係人化版本之抗體130M23。在一些實施態樣中，RSPO2結合劑係抗體h130M23-H1L6。在一些實施 態樣中，RSPO2結合劑係抗體h130M23-H1L2。在一些實施態樣中，測定纖維變性組織中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量，若該纖維變性組織之RSPO3表現量相較於正常組織中RSPO3之量上升，則選擇該個體為適用於以特異性結合RSPO3之抗體治療。若經選擇為適合治療，則對該個體投予如本文所述之抗RSPO3抗體。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑係抗體131R011。
本發明亦提供治療人個體之纖維變性疾病之方法，該方法包含：(a)選擇適合治療之個體，該選擇係(至少部分)根據該個體具有上升量之RSPO1的組織樣本，及(b)對該個體投予如本文所述之治療有效量之RSPO1結合劑。在一些實施態樣中，RSPO1結合劑係人化版本之抗體89M5。在一些實施態樣中，RSPO1結合劑係抗體h89M5-H8L5。在一些實施態樣中，RSPO1結合劑係抗體h89M5-H2L2。
本發明亦提供治療人個體之纖維變性疾病之方法，該方法包含：(a)選擇適合治療之個體，該選擇係(至少部分)根據該個體具有上升量之RSPO2的組織樣本，及(b)對該個體投予如本文所述之治療有效量之RSPO2結合劑。在一些實施態樣中，RSPO2結合劑係人化版本之抗體130M23。在一些實施態樣中，RSPO2結合劑係抗體h130M23-H1L6。在一些實施態樣中，RSPO2結合劑係抗體h130M23-H1L2。
本發明亦提供治療人個體之纖維變性疾病之 方法，該方法包含：(a)選擇適合治療之個體，該選擇係(至少部分)根據該個體具有上升量之RSPO3的組織樣本，及(b)對該個體投予如本文所述之治療有效量之RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑係抗體131R010。
用於測定細胞或組織中之RSPO表現量之方法係該領域之技藝人士所知。以核酸表現而言，該等方法包括但不限於PCR基底檢測、微陣列分析及核苷酸定序(例如NextGen定序)。以蛋白表現而言，該等方法包括但不限於西方墨點分析、蛋白陣列、ELISA、免疫組織化學(IHC)試驗及FACS。
測定纖維變性組織是否具有上升之RSPO表現量之方法可使用多種樣本。在一些實施態樣中，該樣本係取自具有纖維變性疾病之個體。在一些實施態樣中，該樣本係新鮮樣本。在一些實施態樣中，該樣本係冷凍樣本。在一些實施態樣中，該樣本係經福馬林固定之石蠟包埋樣本。在一些實施態樣中，該樣本係處理成細胞溶解物。在一些實施態樣中，該樣本係處理成DNA或RNA。
本發明另提供包含本文所述之RSPO結合劑之組成物。在某些實施態樣中，組成物係包含醫藥上可接受載劑之醫藥組成物。在一些實施態樣中，醫藥組成物於個體(例如人病患)中具有治療或預防纖維變性疾病之用途。
供儲存及使用之調製劑係藉由組合本發明之 經純化之抗體或劑與醫藥上可接受之載體(例如載劑或賦形劑)加以製備。該領域之技藝人士通常認為醫藥上可接受之載劑、賦形劑、及/或安定劑為調製劑或醫藥組成物之非活性成分。
適當之醫藥上可接受之載劑包括但不限於非毒性緩衝劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；鹽諸如氯化鈉；抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫胺酸；保存劑諸如十八基二甲基苄基氯化銨、六甲氯胺、氯化苯甲烴銨、氯化苄乙氧銨、酚醇、丁醇、苄醇、烷基對羥苯甲酸酯類諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚；低分子量多肽(例如少於約10個胺基酸殘基)；蛋白質諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯基吡咯烷酮；胺基酸諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；碳水化合物諸如單醣、雙醣、葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑諸如EDTA；糖類諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成反離子諸如鈉；金屬複合物(例如鋅蛋白質複合物)；及非離子性界面活性劑諸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。(Remington：The Science and Practice of Pharmacy,22nd Edition,2012,Pharmaceutical Press,London.)
本發明之醫藥組成物可以任何數量之方式經局部或系統投予。投予可為藉由表皮貼片、經皮貼片、軟膏、乳液、乳膏、膠劑、滴劑、栓劑、噴劑、液劑及粉劑 之外用投予；藉由吸入或噴入粉劑或氣霧劑之經肺投予，包括藉由噴霧器、氣管內或鼻內投予；經口；或非經腸投予包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內、肌肉內(例如注射或輸注)或顱內(例如脊椎鞘內或心室內)投予。在本文所述之方法的一些實施態樣中，RSPO結合劑係經局部投予。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係經皮下投予。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係經肌肉內投予。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係經外用投予。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係經靜脈投予。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係經吸入投予。
治療調製劑可呈單位劑量形式。該等調製劑包括錠劑、丸劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、水或非水性介質之溶液或懸浮液、或栓劑。在固態組成物諸如錠劑中，主要活性成分係與醫藥載劑混合。習用之製錠成分包括玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠、及稀釋劑(例如水)。這些可被用來形成含有本發明之化合物或彼之無毒性、醫藥上可接受之鹽的同質性混合物之固體預調製組成物。固體預調製組成物接著被細分成上述種類之單位劑量形式。錠劑、丸劑等調製劑或組成物可經包覆或經其他方式複合以提供提供具有長效優點之劑型。舉例來說，錠劑或丸劑可包含由外部成份包覆之內部組成物。另外，該兩種成份可以腸溶層分開，該腸溶層用來抵抗崩解，以使該內部成份完整通過胃或被延遲釋放。多種物質可被用於該腸溶層或包覆層，該等物 質包括多種聚合酸及聚合酸與諸如蟲膠、鯨臘醇及醋酸纖維素之物質之混合物。
本文所述之RSPO結合劑或抗體亦可被包封於微膠囊中。該等微膠囊係藉由例如凝聚技術或藉由界面聚合化製備，例如分別於膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳化液、奈米微粒及奈米微囊)或於巨乳化液中之羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,22nd Edition,2012,Pharmaceutical Press,London中所述。
在某些實施態樣中，醫藥調製劑包括與脂質體複合之本發明之RSPO結合劑(例如抗體)。產製脂質體之方法係該領域之技藝人士所知。舉例來說，有些脂質體可利藉由逆相蒸發含有磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG-衍生性磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組成物加以產製。脂質體可被擠壓通過定義孔徑大小之濾網以產生具有所欲直徑之脂質體。
在某些實施態樣中，可產製包含本文所述之RSPO結合劑之持續釋放製劑。持續釋放製劑之適當實例包括含有RSPO3結合劑(例如抗體)之固相疏水性聚合物之半透性基體，其中該基體係呈形狀物件之形式(例如膜或微膠囊)。持續釋放基體之實例包括聚酯、水凝膠(諸如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯、L-麩胺酸及7乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降 解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolide acetate)所組成之注射型微球)、蔗糖乙酸異丁酸酯及聚-D-(-)-3-羥丁酸。
在某些實施態樣中，除了投予RSPO結合劑(例如抗體)之外，該方法或治療另包含投予至少一種額外之治療劑。額外之治療劑可於投予RSPO結合劑之前、之同時及/或之後投予。本發明亦提供包含額外治療劑之醫藥組成物。在一些實施態樣中，至少一種額外治療劑包含1、2、3或更多種額外之治療劑。
含有二或更多種治療劑之組合療法通常使用具有不同作用機轉之劑，雖然並非必要。使用不同作用機轉之劑的組合療法可能導致加成或協同效應。組合療法可能允許相較於單一療法使用較低劑量之各劑，藉以減少該(等)劑之毒性不良反應及/或增加治療指數。
在一些實施態樣中，RSPO結合劑與至少一種額外治療劑之組合導致加成或協同效果。在一些實施態樣中，組合療法導致RSPO結合劑之治療指數增加。在一些實施態樣中，組合療法導致額外劑之治療指數增加。在一些實施態樣中，組合療法導致RSPO結合劑之毒性及/或不良反應減少。在一些實施態樣中，組合療法導致額外劑之毒性及/或不良反應減少。
在一些實施態樣中，額外治療劑係抗發炎劑。在一些實施態樣中，抗發炎劑係類固醇、糖皮質類固 醇或皮質類固醇。類固醇可包括但不限於倍氯米松(beclometasone)、布地奈德(budesonide)、氟尼縮松(flunisolide)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、曲安西龍(triamcinolone)、甲基普賴蘇龍(methylprednisolone)、普賴蘇龍(prednisolone)、及強體松(prednisone)。
在一些實施態樣中，抗發炎劑係非類固醇抗發炎劑(NSAID)。NSAID可包括但不限於那普洛辛鈉(naproxen sodium)、塞來昔布(celecoxib)、舒林達酸(sulindac)、奧沙普秦(oxaprozin)、雙水楊酸酯(salsalate)、二氟尼柳(diflunisal)、匹洛西卡(piroxicam)、吲哚美洒辛(indomethacin)、伊托多雷(etodolac)、美洛昔康(meloxicam)、那普洛辛、萘丁美酮(nabumetone)、酮咯酸胺基丁三醇(ketorolac tromethamine)、那普洛辛/埃索美拉唑(exomeprazole)、雙氯芬酸(diclofenac)、及阿斯匹靈(aspirin)。
在一些實施態樣中，抗發炎劑係小分子。在一些實施態樣中，抗發炎劑係酪胺酸激酶抑制劑，諸如伊馬替尼(imatinib)(GLEEVEC)。
在一些實施態樣中，抗發炎劑係發炎前細胞介素、介白素、淋巴激素、及/或趨化激素之抑制劑。在一些實施態樣中，抗發炎劑係抑制發炎前細胞激素之活性的抗體。在一些實施態樣中，抗發炎劑係結合及/或抑制 下列之抗體：IL-1、IL-18、IL-33、IL36、IL-37、IL-6、IL-11、IL-31、IL-17、IL-25、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素α、干擾素γ、及/或干擾素β。
在一些實施態樣中，額外治療劑係Wnt途徑抑制劑。在一些實施態樣中，該Wnt途徑抑制劑為捲曲(FZD)蛋白結合劑(FZD結合劑)。FZD結合劑之非限制性實例可見於美國專利第7,982,013號。FZD結合劑可包括但不限於抗FZD抗體。在一些實施態樣中，方法包含投予RSPO結合劑與抗FZD抗體之組合。在一些實施態樣中，方法包含投予RSPO結合劑與抗FZD抗體18R5之組合。在一些實施態樣中，該Wnt途徑抑制劑為Wnt蛋白結合劑(Wnt結合劑)。Wnt結合劑之非限制性實例可見於美國專利第7,723,477及7,947,277號、國際專利公開號WO 2011/088127及WO 2011/088123。Wnt結合劑可包括但不限於抗Wnt抗體及FZD-Fc可溶性受體。在一些實施態樣中，方法包含投予RSPO結合劑與FZD-Fc可溶性受體之組合。在一些實施態樣中，方法包含投予RSPO結合劑與FZD8-Fc可溶性受體之組合。在一些實施態樣中，方法包含投予RSPO結合劑與抗FZD抗體之組合。
在一些實施態樣中，本文所述之該等方法包含投予治療有效量之RSPO結合劑與一種以上之額外治療劑之組合。
組合投予可包括於單一醫藥調製劑中共投或利用分開之調製劑共投，或以任何順序連續投予但通常在 一段期間內以使所有活性劑可同步展現彼等之生物活性。
將了解的是，RSPO結合劑與至少一種額外治療劑之組合可以任何順序投予或同時投予。在一些實施態樣中，RSPO結合劑將被投予至已先接受第二治療劑治療之病患。在某些其他實施態樣中，RSPO結合劑與第二治療劑將被實質上同時或同期投予。舉例來說，個體可能在接受第二治療劑(例如化學治療)之療程時被給予RSPO結合劑(例如抗體)。在某些實施態樣中，RSPO結合劑將於接受第二治療劑治療之1年內被投予。在某些替代性實施態樣中，RSPO結合劑將於接受第二治療劑之任何治療的10、8、6、4或2個月內被投予。在某些其他實施態樣中，RSPO結合劑將於接受第二治療劑之任何治療的4、3、2或1周內被投予。在一些實施態樣中，RSPO結合劑將於接受第二治療劑之任何治療的5、4、3、2或1天內被投予。將另外了解的是，該二(或多)種劑或治療可在數小時或數分鐘內(即實質上同步)被投予至個體。
以疾病之治療而言，本發明之RSPO結合劑(例如抗體)之適當劑量取決於所欲治療之疾病類型、該疾病之嚴重性及病程、該疾病之反應性、該RSPO結合劑或抗體係經投予以達治療或預防目的、先前治療、該病患之臨床病史等，所有皆由主治醫師斟酌。RSPO結合劑或抗體可經投予一次或以持續數天至數月之治療系列投予，或持續投予直到達成療效或達到減少之疾病狀態。理想投藥計畫可自藥物累積於病患體內之測量值加以計算，且將 視個別抗體或劑之相對強度而異。主治醫師可輕易地決定理想劑量、投藥方法及重複頻率。在某些實施態樣中，劑量係0.01μg至100mg/kg體重、0.1μg至100mg/kg體重、1μg至100mg/kg體重、1mg至100mg/kg體重、1mg至80mg/kg體重、10mg至100mg/kg體重、10mg至75mg/kg體重、或10mg至50mg/kg體重。在某些實施態樣中，RSPO結合劑之劑量係約0.1mg至約20mg/kg體重。在某些實施態樣中，劑量可於每天、每周、每月或每年給予一次或多次。在某些實施態樣中，RSPO結合劑係每周給予一次、每二周給予一次或每三周給予一次。
如該領域之技藝人士所知，投予任何治療劑可能導致不良反應及/或毒性。在一些情況中，不良反應及/或毒性非常嚴重以至於無法投予治療有效劑量之特定劑。在一些情況中，藥物治療必須中斷，並嘗試其他劑。然而，許多相同治療類別之劑通常展現類似之不良反應及/或毒性，表示病患必須停止治療，或可能的話忍受與該治療劑有關之不適不良反應。
因此，本發明提供治療個體之纖維變性疾病之方法，該等方法包含使用間歇性投予一或多種劑之投藥策略，如此可減少與投予RSPO結合劑、第二劑等相關之不良反應及/或毒性。
III.RSPO結合劑
本發明提供包含與人RSPO蛋白特異性結合 之劑之方法。該等劑在本文被稱為「RSPO結合劑」。RSPO結合劑之非限制性實例可見於美國專利公開號2009/0074782、2009/0191205、2013/0095116、2014/0017253、2013/0337533、2012/0263730、2012/0039912、2009/0220495、2010/0071078、2015/0147333、及國際專利公開號WO 2014/012007。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係抗體。在一些實施態樣中，RSPO結合劑係多肽。在某些實施態樣中，RSPO結合劑與RSPO1結合(「RSPO1結合劑」)。在某些實施態樣中，RSPO結合劑與RSPO2結合(「RSPO2結合劑」)。在某些實施態樣中，RSPO結合劑與RSPO3結合(「RSPO3結合劑」)。在某些實施態樣中，RSPO結合劑與一或多種人RSPO蛋白特異性結合。人RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4之全長胺基酸(aa)序列係該領域已知，在本文中提供為SEQ ID NO：1(RSPO1)、SEQ ID NO：2(RSPO2)、SEQ ID NO：3(RSPO3)及SEQ ID NO：4(RSPO4)。
在某些實施態樣中，本文所述之RSPO結合劑(例如抗體或雙特異性抗體)的抗原結合部位能結合(或結合)一、二、三或四個RSPO。在某些實施態樣中，本文所述之RSPO結合劑(例如抗體或雙特異性抗體)的抗原結合部位能結合(或結合)第一RSPO蛋白(例如RSPO1)以及一、二或三個其他RSPO(例如RSPO2、RSPO3、及/或RSPO4)。在一些實施態樣中， RSPO結合劑(例如抗體)與人RSPO及小鼠RSPO兩者特異性結合。
在本文所述之方法的某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在人RSPO1(SEQ ID NO：1)之胺基酸21至263內之抗體。在某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在人RSPO1(SEQ ID NO：1)之胺基酸31至263內之抗體。在某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在人RSPO1(SEQ ID NO：1)之胺基酸34至135內之抗體。在某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在人RSPO1(SEQ ID NO：1)之胺基酸34至85內之抗體。在某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在人RSPO1(SEQ ID NO：1)之胺基酸91至135內之抗體。在某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在人RSPO1(SEQ ID NO：1)之胺基酸147至207內之抗體。在某些實施態樣中，RSPO結合劑與RSPO1之三呋喃基二氫咪唑樣多半胱胺酸區結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑與RSPO1之三呋喃基二氫咪唑樣多半胱胺酸區內的至少一個胺基酸結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑與RSPO1之血小板反應素結構域結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑與RSPO1之血小板反應素結構域內的至少一個胺基酸結合。
在某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在人RSPO2(SEQ ID NO：2)之胺基酸22至243內之抗體。在某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在 人RSPO2(SEQ ID NO：2)之胺基酸22至205內之抗體。在某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在人RSPO2(SEQ ID NO：2)之胺基酸35至134內之抗體。在某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在人RSPO2(SEQ ID NO：2)之胺基酸34至84內之抗體。在某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在人RSPO2(SEQ ID NO：2)之胺基酸90至134內之抗體。在某些實施態樣中，RSPO結合劑與RSPO2之三呋喃基二氫咪唑樣多半胱胺酸區結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑與RSPO2之三呋喃基二氫咪唑樣多半胱胺酸區內的至少一個胺基酸結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑與RSPO2之血小板反應素結構域結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑與RSPO2之血小板反應素結構域內的至少一個胺基酸結合。
在某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在人RSPO3(SEQ ID NO：3)之胺基酸22至272內之抗體。在某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在人RSPO3(SEQ ID NO：3)之胺基酸22至207內之抗體。在某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在人RSPO3(SEQ ID NO：3)之胺基酸35至135內之抗體。在某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在人RSPO3(SEQ ID NO：3)之胺基酸35至86內之抗體。在某些實施態樣中，RSPO結合劑係特異性結合在人RSPO3(SEQ ID NO：3)之胺基酸92至135內之抗體。在某些 實施態樣中，RSPO結合劑與RSPO3之三呋喃基二氫咪唑樣多半胱胺酸區結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑與RSPO3之三呋喃基二氫咪唑樣多半胱胺酸區內的至少一個胺基酸結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑與RSPO3之血小板反應素結構域結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑與RSPO3之血小板反應素結構域內的至少一個胺基酸結合。
在某些實施態樣中，RSPO結合劑或抗體以大約1μM或更低、大約100nM或更低、大約40nM或更低、大約20nM或更低、大約10nM或更低、大約1nM或更低、或大約0.1nM或更低之解離常數(KD)與至少一種RSPO蛋白結合。在某些實施態樣中，RSPO結合劑或抗體以大約1μM或更低、大約100nM或更低、大約40nM或更低、大約20nM或更低、大約10nM或更低、大約1nM或更低、或大約0.1nM或更低之解離常數(KD)與至少一種RSPO蛋白結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑或抗體以大約20nM或更低之KD與至少一種RSPO蛋白結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑或抗體以大約10nM或更低之KD與至少一種RSPO蛋白結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑或抗體以大約1nM或更低之KD與至少一種RSPO蛋白結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑或抗體以大約0.5nM或更低之KD與至少一種RSPO蛋白結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑或抗體以大約0.1nM或更低之KD與至少一種RSPO蛋白結 合。在某些實施態樣中，本文所述之RSPO結合劑或抗體與至少二種RSPO蛋白結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑以大約10nM或更低之KD與人RSPO及小鼠RSPO兩者結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑以大約1nM或更低之KD與人RSPO及小鼠RSPO兩者結合。在一些實施態樣中，RSPO結合劑以大約0.1nM或更低之KD與人RSPO及小鼠RSPO兩者結合。在一些實施態樣中，結合劑(例如抗體)對RSPO蛋白之解離常數係利用固定於Biacore晶片上之包含至少一部分RSPO蛋白之RSPO融合蛋白所測得之解離常數。在一些實施態樣中，結合劑(例如抗體)對RSPO蛋白之解離常數係利用被Biacore晶片上之抗人IgG抗體所捕捉之結合劑及RSPO蛋白所測定之解離常數。
在某些實施態樣中，RSPO結合劑(例如抗體)以大約1μM或更低、大約100nM或更低、大約40nM或更低、大約20nM或更低、大約10nM或更低、大約1nM或更低、或大約0.1nM或更低之半數最高有效濃度(EC50)與至少一種人RSPO蛋白結合。在某些實施態樣中，RSPO結合劑(例如抗體)以大約1μM或更低、大約100nM或更低、大約40nM或更低、大約20nM或更低、大約10nM或更低、大約1nM或更低、或大約0.1nM或更低之半數最高有效濃度(EC50)與至少一種人RSPO結合。
在某些實施態樣中，RSPO結合劑係抗體。在 一些實施態樣中，該抗體係重組抗體。在一些實施態樣中，該抗體係單株抗體。在一些實施態樣中，該抗體係嵌合抗體。在一些實施態樣中，該抗體係人化抗體。在一些實施態樣中，該抗體係人抗體。在一些實施態樣中，該抗體係IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗體。在某些實施態樣中，該抗體係IgG1抗體。在某些實施態樣中，該抗體係IgG2抗體。在某些實施態樣中，該抗體係包含抗原結合部位之抗體片段。在一些實施態樣中，該抗體係雙特異性抗體或多特異性抗體。在一些實施態樣中，該抗體係單價抗體。在一些實施態樣中，該抗體係單特異性抗體。在一些實施態樣中，該抗體係雙價抗體。在一些實施態樣中，該抗體係與細胞毒性部分共軛。在一些實施態樣中，該抗體係經分離。在一些實施態樣中，該抗體係實質上純的。
本發明之RSPO結合劑(例如抗體)之特異性結合可使用該領域已知之任何方法檢測。可使用之免疫檢測包括但不限於競爭性及非競爭性檢測系統，該等系統利用諸如Biacore分析、FACS分析、免疫螢光、免疫細胞化學、西方墨點分析、放射性免疫測定、ELISA、「三明治式」免疫測定、免疫沉澱分析、沉澱反應、膠體擴散沉澱反應、免疫擴散分析、凝集測定、補體固定測定、免疫放射分析、螢光免疫分析及蛋白質A免疫分析之技術。該等檢測係例行性檢測且為該領域中廣為周知(見例如Ausubel et al.,Editors,1994-present,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York, NY)。
舉例來說，劑與人RSPO蛋白之特異性結合可利用ELISA測定。ELISA測定包含：準備抗原、以抗原包覆96孔微量板之孔槽、添加與可檢測之化合物諸如酶受質(例如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶)共軛之RSPO結合劑至孔槽、培養一段時間、以及檢測與該抗原結合之劑之存在。在一些實施態樣中，RSPO結合劑不與可檢測之化合物共軛，而是將辨識該RSPO結合劑且與可檢測之化合物共軛之第二抗體(例如抗Fc抗體)加入孔槽中。在一些實施態樣中，不以抗原包覆孔槽，反而是以RSPO結合劑包覆孔槽，並於添加抗原至該經包覆之孔槽後加入與可檢測之化合物共軛之第二抗體。該領域之技藝人士將了解可經修改以增加經檢測之信號之參數以及該領域所知之ELISA之其他變數。
在另一實例中，劑與人RSPO蛋白之特異性結合可利用FACS測定。FACS篩選測定可包含：產製cDNA建構物以表現抗原為融合蛋白(例如RSPO-CD4TM)、將該建構物轉染至細胞中、使該抗原表現在細胞表面上、使該RSPO結合劑與該經轉染之細胞混合、以及培養一段時間。經RSPO結合劑結合之細胞可利用與可檢測之化合物共軛之二級抗體(例如與PE共軛之抗Fc抗體)及流式細胞分析識別。該領域之技藝人士將了解可經修改以優化經檢測之信號之參數以及其他可增進篩選(例如篩選阻斷抗體)之FACS變數。
劑對抗原之結合親和性及劑-抗原交互反應之解離速率可藉由競爭性結合測定決定。競爭性結合測定之一實例係放射性免疫測定，其包含在漸增量之未經標示之抗原存在下，培養經標示之抗原(例如以3H或125I標示)或彼之片段或變異體與感興趣之抗體，隨後檢測與該經標示之抗原結合之劑。劑與抗原之親和性及結合解離速率可由斯卡查德(Scatchard)圖分析之資料測定。在一些實施態樣中，Biacore動力學分析係用於測定與抗原結合之劑的結合及解離速率。在一些實施態樣中，Biacore動力學分析包含分析抗體與晶片表面上經固定之抗原的結合及解離。在一些實施態樣中，Biacore動力學分析包含分析抗原與晶片表面上經固定之結合劑的結合及解離。
在本文所述之方法的某些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO1特異性結合之RSPO1結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO1結合劑(例如抗體)包含抗體89M5之一、二、三、四、五及/或六個CDR(見表1)。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO1特異性結合之RSPO1結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO1結合劑包含：包含TGYTMH(SEQ ID NO：5)之重鏈CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO：6)之重鏈CDR2、及包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO：7)之重鏈CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑另包含：包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO：8)之輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO：9)之輕鏈CDR2、及包含QQHYSTPW(SEQ ID NO：10)之輕鏈CDR3。在一些實 施態樣中，該RSPO1結合劑包含：包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO：8)之輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO：9)之輕鏈CDR2、及包含QQHYSTPW(SEQ ID NO：10)之輕鏈CDR3。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：(a)包含TGYTMH(SEQ ID NO：5)之重鏈CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO：6)之重鏈CDR2、及包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO：7)之重鏈CDR3；以及(b)包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO：8)之輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO：9)之輕鏈CDR2、及包含QQHYSTPW(SEQ ID NO：10)之輕鏈CDR3。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO1特異性結合之RSPO1結合劑(例如抗體或雙特異性抗體)之方法，其中該RSPO1結合劑包含：(a)重鏈CDR1，其包含TGYTMH(SEQ ID NO：5)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體；(b)重鏈CDR2，其包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO：6)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體；(c)重鏈CDR3，其包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO：7)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體；(d)輕鏈CDR1，其包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO：8)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體；(e)輕鏈CDR2，其包含WASTRHT(SEQ ID NO：9)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體； 及(f)輕鏈CDR3，其包含QQHYSTPW(SEQ ID NO：10)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體。在某些實施態樣中，胺基酸取代係保守性取代。在一些實施態樣中，該等取代係進行為種系人化過程之一部份。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與RSPO1特異性結合之RSPO1結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO1結合劑包含：與SEQ ID NO：11具有至少約80%序列一致性之重鏈可變區及/或與SEQ ID NO：12具有至少80%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：與SEQ ID NO：11具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、或至少約99%序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：與SEQ ID NO：12具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、或至少約99%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：與SEQ ID NO：11具有至少約95%序列一致性之重鏈可變區及/或與SEQ ID NO：12具有至少約95%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：包含SEQ ID NO：11之重鏈可變區及/或包含SEQ ID NO：12之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：包含SEQ ID NO：11之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：12之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：由SEQ ID NO：11組成之重鏈可變區及由SEQ ID NO：12組成 之輕鏈可變區。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與RSPO1特異性結合之RSPO1結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO1結合劑包含：與SEQ ID NO：56具有至少約80%序列一致性之重鏈可變區及/或與SEQ ID NO：57具有至少80%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：與SEQ ID NO：56具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、或至少約99%序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：與SEQ ID NO：57具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、或至少約99%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：與SEQ ID NO：56具有至少約95%序列一致性之重鏈可變區及/或與SEQ ID NO：57具有至少約95%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：包含SEQ ID NO：56之重鏈可變區及/或包含SEQ ID NO：57之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：包含SEQ ID NO：56之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：57之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：由SEQ ID NO：11組成之重鏈可變區及由SEQ ID NO：57組成之輕鏈可變區。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與RSPO1特異性結合之RSPO1結合劑(例如抗體)之方 法，其中該RSPO1結合劑包含：(a)與SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14具有至少90%序列一致性之重鏈；及/或(b)與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16具有至少90%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：(a)與SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14具有至少95%序列一致性之重鏈；及/或(b)與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16具有至少95%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：包含SEQ ID NO：14之重鏈及/或包含SEQ ID NO：16之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：包含SEQ ID NO：14之重鏈及包含SEQ ID NO：16之輕鏈。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與RSPO1特異性結合之RSPO1結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO1結合劑包含：(a)與SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59具有至少90%序列一致性之重鏈；及/或(b)與SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61具有至少90%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：(a)與SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59具有至少95%序列一致性之重鏈；及/或(b)與SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61具有至少95%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：包含SEQ ID NO：59之重鏈及/或包含SEQ ID NO：61之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：包含SEQ ID NO：59之重鏈及包含SEQ ID NO：61之輕鏈。 在某些實施態樣中，RSPO1結合劑包含抗體h89M5-H8L5之重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO1結合劑包含(有或無前導序列之)抗體h89M5-H8L5之重鏈及輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO1結合劑係抗體h89M5-H8L5。在某些實施態樣中，RSPO1結合劑包含呈嵌合抗體形式之抗體h89M5-H8L5的重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗RSPO1抗體係h89M5-H8L5。
在某些實施態樣中，RSPO1結合劑包含抗體h89M5-H2L2之重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO1結合劑包含(有或無前導序列之)抗體h89M5-H2L2之重鏈及輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO1結合劑係抗體h89M5-H2L2。在某些實施態樣中，RSPO1結合劑包含呈嵌合抗體形式之抗體h89M5-H2L2的重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗RSPO1抗體係h89M5-H2L2。
在本文所述之方法的某些實施態樣中，RSPO1結合劑包含抗體89M5之重鏈CDR及/或輕鏈CDR。產製89M5抗體之雜交瘤細胞系依照布達佩斯條約之規定，於2011年6月30日以ATCC編號PTA-11970寄存於美國菌種保存中心(10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA)。
編碼抗體h89M5-H8L5之重鏈及輕鏈的質體依照布達佩斯條約之規定，於2014年8月15日以ATCC 編號PTA-121494及PTA-121495寄存於美國菌種保存中心(10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA)。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：由寄存於ATCC之質體PTA-121494所編碼之重鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：由寄存於ATCC之質體PTA-121495所編碼之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：由寄存於ATCC之質體PTA-121494所編碼之重鏈可變區及由寄存於ATCC之質體PTA-121495所編碼之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：由寄存於ATCC之質體PTA-121494所編碼之重鏈。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：由寄存於ATCC之質體PTA-121495所編碼之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO1結合劑包含：由寄存於ATCC之質體PTA-121494所編碼之重鏈及由寄存於ATCC之質體PTA-121495所編碼之輕鏈。
在某些實施態樣中，RSPO1結合劑包含抗體h89M5-H8L5、實質上由抗體h89M5-H8L5組成、或由抗體h89M5-H8L5組成。在某些實施態樣中，RSPO1結合劑包含抗體89M5之變異體、實質上由抗體89M5之變異體組成、或由抗體89M5之變異體組成。在某些實施態樣中，RSPO1結合劑包含抗體h89M5-H8L5之變異體、實質上由抗體h89M5-H8L5之變異體組成、或由抗體h89M5-H8L5之變異體組成。
在某些實施態樣中，RSPO1結合劑包含抗體 h89M5-H2L2、實質上由抗體h89M5-H2L2組成、或由抗體h89M5-H2L2組成。在某些實施態樣中，RSPO1結合劑包含抗體89M5之變異體、實質上由抗體89M5之變異體組成、或由抗體89M5之變異體組成。在某些實施態樣中，RSPO1結合劑包含抗體h89M5-H2L2之變異體、實質上由抗體h89M5-H2L2之變異體組成、或由抗體h89M5-H2L2之變異體組成。
在本文所述之方法的某些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO2特異性結合之RSPO2結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO2結合劑(例如抗體)包含抗體130M23之一、二、三、四、五及/或六個CDR(見表1)。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO2特異性結合之RSPO2結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO2結合劑包含：包含SSYAMS(SEQ ID NO：21)之重鏈CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO：22)之重鏈CDR2、及包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO：23)之重鏈CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑另包含：包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO：24)之輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO：25)之輕鏈CDR2、及包含QQHYSTP(SEQ ID NO：26)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO：24)之輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO：25)之輕鏈CDR2、及包含QQHYSTP(SEQ ID NO：26)之輕鏈CDR3。在某些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：(a)包含SSYAMS(SEQ ID NO：21)之重鏈CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO：22)之重鏈CDR2、及包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO：23)之重鏈CDR3；以及(b)包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO：24)之輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO：25)之輕鏈CDR2、及包含QQHYSTP(SEQ ID NO：26)之輕鏈CDR3。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO2特異性結合之RSPO2結合劑(例如抗體或雙特異性抗體)之方法，其中該RSPO2結合劑包含：(a)重鏈CDR1，其包含SSYAMS(SEQ ID NO：21)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體；(b)重鏈CDR2，其包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO：22)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體；(c)重鏈CDR3，其包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO：23)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體；(d)輕鏈CDR1，其包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO：24)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體；(e)輕鏈CDR2，其包含WASTRHT(SEQ ID NO：25)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體；及(f)輕鏈CDR3，其包含QQHYSTP(SEQ ID NO：26)或彼之包含1、2、3、或4 個胺基酸取代之變異體。在某些實施態樣中，胺基酸取代係保守性取代。在一些實施態樣中，該等取代係進行為種系人化過程之一部份。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與RSPO2特異性結合之RSPO2結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO2結合劑包含：與SEQ ID NO：27具有至少約80%序列一致性之重鏈可變區及/或與SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：66具有至少80%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：與SEQ ID NO：27具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、或至少約99%序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：與SEQ ID NO：28具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、或至少約99%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：與SEQ ID NO：66具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、或至少約99%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：與SEQ ID NO：27具有至少約95%序列一致性之重鏈可變區及/或與SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：66具有至少約95%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：包含SEQ ID NO：27之重鏈可變區及/或包含SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：66之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：包含SEQ ID NO：27之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：28之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：包含SEQ ID NO：27之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：66之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：由SEQ ID NO：27組成之重鏈可變區及由SEQ ID NO：28組成之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：由SEQ ID NO：27組成之重鏈可變區及由SEQ ID NO：66組成之輕鏈可變區。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與RSPO2特異性結合之RSPO2結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO2結合劑包含：(a)與SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30具有至少90%序列一致性之重鏈；及/或(b)與SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32具有至少90%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：(a)與SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30具有至少95%序列一致性之重鏈；及/或(b)與SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32具有至少95%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：包含SEQ ID NO：30之重鏈及/或包含SEQ ID NO：32之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：包含SEQ ID NO：30之重鏈及包含SEQ ID NO：32之輕鏈。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與RSPO2特異性結合之RSPO2結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO2結合劑包含：(a)與SEQ ID NO：29 或SEQ ID NO：30具有至少90%序列一致性之重鏈；及/或(b)與SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：68具有至少90%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：(a)與SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30具有至少95%序列一致性之重鏈；及/或(b)與SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：68具有至少95%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：包含SEQ ID NO：30之重鏈及/或包含SEQ ID NO：68之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO2結合劑包含：包含SEQ ID NO：30之重鏈及包含SEQ ID NO：68之輕鏈。
在某些實施態樣中，RSPO2結合劑包含抗體h130M23-H1L6之重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO2結合劑包含(有或無前導序列之)抗體h130M23-H1L6之重鏈及輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO2結合劑係抗體h130M23-H1L6。在某些實施態樣中，RSPO2結合劑包含呈嵌合抗體形式之抗體h130M23-H1L6的重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗RSPO2抗體係h130M23-H1L6。
在某些實施態樣中，RSPO2結合劑包含抗體h130M23-H1L2之重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO2結合劑包含(有或無前導序列之)抗體h130M23-H1L2之重鏈及輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO2結合劑係抗體h130M23-H1L2。在某些實施態樣中，RSPO2結合劑包含呈嵌合抗體形式之抗體h130M23- H1L2的重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗RSPO2抗體係h130M23-H1L2。
在本文所述之方法的某些實施態樣中，RSPO2結合劑包含抗體130M23之重鏈CDR及/或輕鏈CDR。產製130M23抗體之雜交瘤細胞系依照布達佩斯條約之規定，於2011年8月10日以ATCC編號PTA-12021寄存於美國菌種保存中心(10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA)。
在某些實施態樣中，RSPO2結合劑包含抗體h130M23-H1L6、實質上由抗體h130M23-H1L6組成、或由抗體h130M23-H1L6組成。在某些實施態樣中，RSPO2結合劑包含抗體130M23之變異體、實質上由抗體130M23之變異體組成、或由抗體130M23之變異體組成。在某些實施態樣中，RSPO2結合劑包含抗體h130M23-H1L6之變異體、實質上由抗體h130M23-H1L6之變異體組成、或由抗體h130M23-H1L6之變異體組成。
在某些實施態樣中，RSPO2結合劑包含抗體h130M23-H1L2、實質上由抗體h130M23-H1L2組成、或由抗體h130M23-H1L2組成。在某些實施態樣中，RSPO2結合劑包含抗體130M23之變異體、實質上由抗體130M23之變異體組成、或由抗體130M23之變異體組成。在某些實施態樣中，RSPO2結合劑包含抗體h130M23-H1L2之變異體、實質上由抗體h130M23-H1L2之變異體組成、或由抗體h130M23-H1L2之變異體組成。
在本文所述之方法的某些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO3特異性結合之RSPO3結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO3結合劑(例如抗體)包含抗體131R011之一、二、三、四、五及/或六個CDR(見本文之表1)。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO3特異性結合之RSPO3結合劑(例如抗體)之方法，其中該RSPO3結合劑包含：包含DYSIH(SEQ ID NO：37)之重鏈CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：38)之重鏈CDR2、及包含TYFANNFD(SEQ ID NO：39)或ATYFANNFDY(SEQ ID NO：40)之重鏈CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑另包含：包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：41)之輕鏈CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO：42)或AAS(SEQ ID NO：43)之輕鏈CDR2、及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：44)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：45)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：41)之輕鏈CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO：42)或AAS(SEQ ID NO：43)之輕鏈CDR2、及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：44)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：45)之輕鏈CDR3。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：(a)包含DYSIH(SEQ ID NO：37)之重鏈CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：38)之重鏈 CDR2、及包含TYFANNFD(SEQ ID NO：39)之重鏈CDR3；以及(b)包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：41)之輕鏈CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO：42)之輕鏈CDR2、及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：44)之輕鏈CDR3。
在某些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO3特異性結合之RSPO3結合劑(例如抗體或雙特異性抗體)之方法，其中該RSPO3結合劑包含：(a)重鏈CDR1，其包含DYSIH(SEQ ID NO：37)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體；(b)重鏈CDR2，其包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：38)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體；(c)重鏈CDR3，其包含TYFANNFD(SEQ ID NO：39)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO：40)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體；(d)輕鏈CDR1，其包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：41)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體；(e)輕鏈CDR2，其包含AASNLES(SEQ ID NO：42)、AAS(SEQ ID NO：43)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體；及(f)輕鏈CDR3，其包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：44)、QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：45)或彼之包含1、2、3、或4個胺基酸取代之變異體。在某些實施態樣中，胺基酸取代係保守性取代。在一些實施態樣中，該等取代係進行為種系人化過程之一部份。
在某些實施態樣中，本發明提供與RSPO3特異性結合之RSPO3結合劑(例如抗體)，其中該RSPO3結合劑包含：與SEQ ID NO：46具有至少約80%序列一致性之重鏈可變區及/或與SEQ ID NO：47具有至少80%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：與SEQ ID NO：46具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：與SEQ ID NO：47具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：與SEQ ID NO：46具有至少約95%序列一致性之重鏈可變區及/或與SEQ ID NO：47具有至少約95%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含SEQ ID NO：46之重鏈可變區及/或包含SEQ ID NO：47之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：46，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：47。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區由SEQ ID NO：46組成，該輕鏈可變區由SEQ ID NO：47組成。
在某些實施態樣中，本發明提供與RSPO3特異性結合之RSPO3結合劑(例如抗體)，其中該RSPO3結合劑包含：(a)與SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49 具有至少90%序列一致性之重鏈；及/或(b)與SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：51具有至少90%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：(a)與SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49具有至少95%序列一致性之重鏈；及/或(b)與SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：51具有至少95%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含SEQ ID NO：49之重鏈及/或包含SEQ ID NO：51之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含SEQ ID NO：49之重鏈及包含SEQ ID NO：51之輕鏈。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體131R010之重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含(有或無前導序列之)抗體131R010之重鏈及輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑係抗體131R010。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含呈嵌合抗體形式之抗體131R010的重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體131R010之重鏈CDR及/或輕鏈CDR。在一些實施態樣中，抗RSPO3抗體係131R010。
編碼抗體131R010之重鏈及輕鏈的質體依照布達佩斯條約之規定，於2013年6月18日以ATCC編號PTA-120420及PTA-120421寄存於美國菌種保存中心(10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：由寄存於ATCC 之質體PTA-120420所編碼之重鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：由寄存於ATCC之質體PTA-120421所編碼之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：由寄存於ATCC之質體PTA-120420所編碼之重鏈可變區及由寄存於ATCC之質體PTA-120421所編碼之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：由寄存於ATCC之質體PTA-120420所編碼之重鏈。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：由寄存於ATCC之質體PTA-120421所編碼之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：由寄存於ATCC之質體PTA-120420所編碼之重鏈及由寄存於ATCC之質體PTA-120421所編碼之輕鏈。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體131R010、實質上由抗體131R010組成、或由抗體131R010組成。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體130R010之變異體、實質上由抗體130R010之變異體組成、或由抗體130R010之變異體組成。
本發明提供包含與人之至少一種RSPO蛋白特異性結合之多肽(包括但不限於抗體)之方法。在一些實施態樣中，多肽與人RSPO1結合。在一些實施態樣中，多肽與人RSPO2結合。在一些實施態樣中，多肽與人RSPO3結合。
在某些實施態樣中，該多肽包含抗體89M5之一、二、三、四、五、及/或六個CDR(見本文之表 1)。在某些實施態樣中，該多肽包含抗體130M23之一、二、三、四、五、及/或六個CDR(見本文之表1)。在某些實施態樣中，該多肽包含抗體131R010之一、二、三、四、五、及/或六個CDR(見本文之表1)。在一些實施態樣中，該多肽包含每個CDR最多有四個(即0、1、2、3或4個)胺基酸取代之CDR。在某些實施態樣中，該重鏈CDR被包含於重鏈可變區之內。在某些實施態樣中，該輕鏈CDR被包含於輕鏈可變區之內。
在一些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO1特異性結合之多肽之方法，其中該多肽包含：與SEQ ID NO：11及/或與SEQ ID NO：12具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：13具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：15具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：14具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：16具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、或SEQ ID NO：16具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：11具有至少約95%序列一致 性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：12具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：13具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：15具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：14具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：16具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：SEQ ID NO：11之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：12之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：SEQ ID NO：13之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：15之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：SEQ ID NO：14之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：16之胺基酸序列。
在一些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO1特異性結合之多肽之方法，其中該多肽包含：與SEQ ID NO：56及/或與SEQ ID NO：57具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：58具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：60具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：59具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：61具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、或SEQ ID NO：61具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：56具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：57具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：58具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：60具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：59具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：61具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：SEQ ID NO：56之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：57之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：SEQ ID NO：58之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：60之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：SEQ ID NO：59之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：61之胺基酸序列。
在一些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO2特異性結合之多肽之方法，其中該多肽包含：與SEQ ID NO：27及/或與SEQ ID NO：28具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO2特異性結合之多肽之方法，其中該多肽包含：與SEQ ID NO：27及/或與SEQ ID NO：66具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施態樣 中，該多肽包含：與SEQ ID NO：29具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：67具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：30具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：68具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、或SEQ ID NO：68具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：27具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：66具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：29具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：67具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：30具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：68具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：SEQ ID NO：27之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：28之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：SEQ ID NO：27之 胺基酸序列及/或SEQ ID NO：66之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：SEQ ID NO：29之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：31之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：SEQ ID NO：29之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：67之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：SEQ ID NO：30之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：32之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：SEQ ID NO：30之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：68之胺基酸序列。
在一些實施態樣中，本發明提供包含與人RSPO3特異性結合之多肽之方法，其中該多肽包含：與SEQ ID NO：46及/或與SEQ ID NO：47具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：48具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：50具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：49具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：51具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、或SEQ ID NO：51具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：46具有至少約95%序列一致 性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：47具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：48具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：50具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：與SEQ ID NO：49具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：51具有至少約95%序列一致性之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：SEQ ID NO：46之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：47之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：SEQ ID NO：48之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：50之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：SEQ ID NO：49之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：51之胺基酸序列。
許多蛋白(包括抗體)包含引導該蛋白運輸至各處之信號序列。信號序列(又稱信號肽或前導序列)位於新生多肽之N端。它們引導該多肽至內質網且該等蛋白被分類至彼等應該去的地方，例如胞器之內部空間、細胞內部之膜、細胞之外膜或經分泌至細胞外部。大部分信號序列在蛋白被運送至內質網後，藉由信號肽酶與該蛋白切割。自該多肽切割該信號序列通常發生於胺基酸序列的特定位點，且取決於該信號序列內之胺基酸殘基。雖然通常有一個特定的切割位點，但信號肽酶可能識別及/或使用一個以上之切割位點，導致該多肽之非同質性N端。舉例來說，使用信號序列內之不同的切割位點可導致具有不 同N端胺基酸之多肽的表現。因此，在一些實施態樣中，本文所述之多肽可能包含具有不同N端之多肽的混合物。在一些實施態樣中，該N端之長度相差1、2、3、4或5個胺基酸。在一些實施態樣中，該多肽係實質上同質性，即該等多肽具有相同之N端。在一些實施態樣中，該多肽之信號序列相較於「天然」或「親代」信號序列包含一或多個(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、等等)胺基酸取代及/或刪除。在一些實施態樣中，該多肽之信號序列包含讓一個切割位點變成主要切割位點之胺基酸取代及/或刪除，藉此導致具有一種N端之實質上同質性之多肽。在一些實施態樣中，該多肽之信號序列影響該多肽之表現程度，例如增加表現或減少表現。
在某些實施態樣中，本發明提供包含RSPO1結合劑(例如抗體)之方法，該RSPO1結合劑(例如抗體)與包含抗體89M5之CDR之抗體競爭對RSPO1之特異性結合。在某些實施態樣中，本發明提供包含RSPO2結合劑(例如抗體)之方法，該RSPO2結合劑(例如抗體)與包含抗體130M23之CDR之抗體競爭對RSPO2之特異性結合。在某些實施態樣中，本發明提供包含RSPO3結合劑(例如抗體)之方法，該RSPO3結合劑(例如抗體)與包含抗體131R010之CDR之抗體競爭對RSPO3之特異性結合。
在某些實施態樣中，本發明提供包含RSPO1結合劑(例如抗體)之方法，該RSPO1結合劑(例如抗 體)所結合之RSPO1上的表位係與包含抗體89M5之CDR之抗體所結合之表位相同、或實質上相同。在某些實施態樣中，本發明提供包含RSPO2結合劑(例如抗體)之方法，該RSPO2結合劑(例如抗體)所結合之RSPO2上的表位係與包含抗體89M5之CDR之抗體所結合之表位相同、或實質上相同。在某些實施態樣中，本發明提供包含RSPO3結合劑(例如抗體)之方法，該RSPO3結合劑(例如抗體)所結合之RSPO3上的表位係與包含抗體131R010之CDR之抗體所結合之表位相同、或實質上相同。
在某些實施態樣中，本發明提供包含RSPO1結合劑(例如抗體)之方法，該RSPO1結合劑(例如抗體)所結合之RSPO1上的表位係與包含抗體89M5之CDR之抗體所結合之RSPO1上的表位重疊。在某些實施態樣中，本發明提供包含RSPO2結合劑(例如抗體)之方法，該RSPO2結合劑(例如抗體)所結合之RSPO2上的表位係與包含抗體130M23之CDR之抗體所結合之RSPO2上的表位重疊。在某些實施態樣中，本發明提供包含RSPO3結合劑(例如抗體)之方法，該RSPO3結合劑(例如抗體)所結合之RSPO3上的表位係與包含抗體131R010之CDR之抗體所結合之RSPO3上的表位重疊。
在本文所述之方法的某些實施態樣中，本文所述之RSPO結合劑(例如抗體)與至少一種人RSPO蛋白結合且調節RSPO活性。在一些實施態樣中，該RSPO 結合劑係RSPO拮抗劑且降低RSPO活性。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係RSPO拮抗劑且降低β-連環蛋白活性。
在某些實施態樣中，本文所述之RSPO1結合劑(例如抗體)與人RSPO1結合且調節RSPO1活性。在一些實施態樣中，RSPO1結合劑係RSPO1拮抗劑且降低RSPO1活性。在一些實施態樣中，RSPO1結合劑係RSPO1拮抗劑且降低β-連環蛋白活性。在某些實施態樣中，本文所述之RSPO2結合劑(例如抗體)與人RSPO2結合且調節RSPO2活性。在一些實施態樣中，RSPO2結合劑係RSPO2拮抗劑且降低RSPO2活性。在一些實施態樣中，RSPO2結合劑係RSPO2拮抗劑且降低β-連環蛋白活性。在某些實施態樣中，本文所述之RSPO3結合劑(例如抗體)與人RSPO3結合且調節RSPO3活性。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑係RSPO3拮抗劑且降低RSPO3活性。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑係RSPO3拮抗劑且降低β-連環蛋白活性。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑(例如抗體)係至少一種人RSPO蛋白之拮抗劑。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係至少一種RSPO之拮抗劑且抑制RSPO活性。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約50%、至少約75%、至少約90%、或約100%之RSPO活性。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制一、二、三、或四種 RSPO蛋白之活性。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制人RSPO1、RSPO2、RSPO3、及/或RSPO4之活性。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑(例如抗體)係至少一種人RSPO蛋白之拮抗劑。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約50%、至少約75%、至少約90%、或約100%之RSPO傳訊。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制一、二、三、或四種RSPO蛋白之傳訊。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制人RSPO1、RSPO2、RSPO3、及/或RSPO4之傳訊。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑(例如抗體)係β-連環蛋白傳訊之拮抗劑。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約50%、至少約75%、至少約90%、或約100%之β-連環蛋白傳訊。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑(例如抗體)抑制至少一種RSPO蛋白與受體之結合。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制人RSPO蛋白與彼之一或多種受體之結合。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制RSPO蛋白與至少一種LGR蛋白之結合。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制RSPO蛋白與LGR4、LGR5、及/或LGR6之結合。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑與至少一種LGR蛋白之結合係經抑制至少約10%、至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約 90%、或至少約95%。在某些實施態樣中，抑制至少一種RSPO與至少一種LGR蛋白結合之RSPO結合劑另抑制β-連環蛋白傳訊。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑(例如抗體)阻斷至少一種RSPO與受體之結合。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑阻斷人RSPO蛋白與彼之一或多種受體之結合。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑阻斷RSPO與至少一種LGR蛋白之結合。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑阻斷至少一種RSPO蛋白與LGR4、LGR5、及/或LGR6之結合。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑與至少一種LGR蛋白之結合係經阻斷至少約10%、至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約90%、或至少約95%。在某些實施態樣中，阻斷至少一種RSPO蛋白與至少一種LGR蛋白結合之RSPO結合劑另抑制β-連環蛋白傳訊。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑(例如抗體)抑制β-連環蛋白傳訊。應了解的是，抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO結合劑在某些實施態樣中可能抑制β-連環蛋白傳訊途徑中藉由一或多種受體之傳訊，但不一定抑制藉由所有受體之傳訊。在某些替代性實施態樣中，藉由所有人受體之β-連環蛋白傳訊可能皆被抑制。在某些實施態樣中，藉由選自LGR4、LGR5、及LGR6之一或多種受體的β-連環蛋白傳訊係經抑制。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑對β-連環蛋白傳訊之抑制係指減少β-連環蛋 白傳訊量至少約10%、至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或至少約95%。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑(例如抗體)抑制β-連環蛋白之活化。應了解的是，抑制β-連環蛋白之活化的RSPO結合劑在某些實施態樣中可能抑制藉由一或多種受體之β-連環蛋白之活化，但不一定抑制藉由所有受體之β-連環蛋白之活化。在某些替代性實施態樣中，藉由所有人受體之β-連環蛋白活化可能皆被抑制。在某些實施態樣中，藉由選自LGR4、LGR5及LGR6之一或多種受體的β-連環蛋白活化係經抑制。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑對β-連環蛋白活化之抑制係指減少β-連環蛋白活化量至少約10%、至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約90%、或至少約95%。
用於測定RSPO結合劑(或候選RSPO結合劑)是否抑制β-連環蛋白傳訊之活體內及試管內測定係該領域所知。舉例來說，可使用以細胞為基底之螢光素酶報告子檢測來測量試管內之β-連環蛋白傳訊量，其利用含有多份TCF結合結構域與下游螢火蟲螢光素酶報告子基因之TCF/Luc報告子載體進行(Gazit et al.,1999,Oncogene,18；5959-66；TOPflash,Millipore,Billerica MA)。在一或多種Wnt(例如由轉染細胞表現或由Wnt條件培養基提供之Wnt)存在且有或沒有RSPO蛋白或RSPO條件培養基下，RSPO結合劑存在時之β-連環蛋白傳訊量係與無RSPO結合劑存在時之傳訊量比較。除了 TCF/Luc報告子檢測之外，RSPO結合劑(或候選劑)對β-連環蛋白傳訊之影響可於試管內或活體內藉由測量該劑對β-連環蛋白調節基因表現量之影響加以測定，如c-myc(He et al.,1998,Science,281：1509-12)、細胞週期素D1(Tetsu et al.,1999,Nature,398：422-6)及/或纖維粘連蛋白(Gradl et al.1999,Mol.Cell Biol.,19：5576-87)。在某些實施態樣中，RSPO結合劑對β-連環蛋白傳訊之影響亦可能藉由測量該劑對Dishevelled-1、Dishevelled-2、Dishevelled-3、LRP5、LRP6及/或β-連環蛋白之磷酸化狀態的影響檢測。
在某些實施態樣中，本文所述之RSPO結合劑於小鼠、長尾獼猴(cynomolgus monkey)或人體內具有至少約2小時、至少約5小時、至少約10小時、至少約24小時、至少約3天、至少約1週、或至少約2週之循環半衰期。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑係於小鼠、長尾獼猴或人體內具有至少約2小時、至少約5小時、至少約10小時、至少約24小時、至少約3天、至少約1週、或至少約2週之循環半衰期的IgG(例如IgG1或IgG2)抗體。增加(或減少)劑諸如多肽及抗體之半衰期之方法係該領域所知。舉例來說，增加IgG抗體循環半衰期之已知方法包括導入突變至Fc區，此增加pH 6.0時抗體對新生兒Fc受體(FcRn)之pH依賴性結合。增加缺乏Fc區之抗體片段的循環半衰期之已知方法包括像是PEG化之技術。
在一些實施態樣中，RSPO結合劑係多株抗體。多株抗體可利用任何已知之方法製備。在一些實施態樣中，多株抗體係藉由以感興趣之抗原(例如經純化之肽片段、全長重組蛋白或融合蛋白)藉由多重皮下或腹腔內注射之方式免疫動物(例如兔、大鼠、小鼠、山羊、驢)產製。該抗原可任意選擇地與載劑共軛，諸如鑰孔狀帽貝血藍素(KLH)或血清白蛋白。該抗原(不論有無載劑蛋白質)係經無菌鹽水稀釋，且通常與佐劑(例如完全或不完全弗氏(Freund’s)佐劑)組合以形成穩定乳液。在經過足夠時間後，自經免疫之動物(通常是血液或腹水中)回收多株抗體。多株抗體可根據該領域之標準方法自血清或腹水純化，該等方法包括但不限於親和性層析、離子交換層析、膠體電泳及透析。
在一些實施態樣中，RSPO結合劑係單株抗體。單株抗體可利用該領域之技藝人士所知之雜交瘤方法製備。在一些實施態樣中，使用雜交瘤方法係將小鼠、倉鼠或其他適當之宿主動物經上述方法免疫，以誘發產製與該免疫抗原特異性結合之抗體之淋巴細胞。在一些實施態樣中，淋巴細胞可於試管內免疫。在一些實施態樣中，該免疫抗原可為人蛋白質或彼之部分。在一些實施態樣中，該免疫抗原可為小鼠蛋白質或彼之部分。
在免疫後，淋巴細胞係經分離，然後利用例如聚乙二醇與適當之骨髓瘤細胞系融合。雜交瘤細胞係利用該領域已知之特殊培養基篩選，未融合之淋巴細胞及骨 髓瘤細胞在篩選後不會存活。產製特異性拮抗選定抗原之單株抗體之雜交瘤可利用多種方法識別，該等方法包括但不限於免疫沉澱、免疫轉漬及試管內結合檢測(例如流式細胞分析、FACS、ELISA及放射性免疫測定)。雜交瘤可利用標準方法於試管內培養中或作為動物腹水腫瘤於活體內增殖。單株抗體可根據該領域之標準方法自培養基或腹水液體純化，該等方法包括但不限於親和性層析、離子交換層析、膠體電泳及透析。
在某些實施態樣中，單株抗體可利用該領域之技藝人士已知之重組DNA技術製備。編碼單株抗體之多核苷酸係自成熟B細胞或雜交瘤細胞分離，像是藉由使用寡核苷酸引子之RT-PCR以特異性擴增編碼該抗體之重鏈及輕鏈之基因，該等多核苷酸之序列係利用標準技術測定。經分離之編碼重鏈及輕鏈之多核苷酸接著被選殖至適當表現載體，該等載體在轉染至原本不產製免疫球蛋白之宿主細胞諸如大腸桿菌(E.coli)、類人猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞後產製單株抗體。
在某些其他實施態樣中，重組單株抗體或其片段可自表現所欲物種之可變結構域或CDR之噬菌體展示庫分離。
編碼單株抗體之多核苷酸可藉由例如使用重組DNA技術修飾以產製替代性抗體。在一些實施態樣中，例如小鼠單株抗體之輕鏈及重鏈之恆定結構域可被例如人抗體之該些區域取代以產製嵌合抗體，或以非免疫球 蛋白多肽取代以產製融合抗體。在一些實施態樣中，該等恆定區係經截短或移除以產製所欲之單株抗體之抗體片段。可變區之定點或高密度突變形成可被用於最佳化單株抗體之特異性、親和性等。
在本文所述之方法的一些實施態樣中，拮抗人RSPO蛋白之單株抗體係人化抗體。通常，人化抗體係其中源自CDR之殘基係經源自具有所欲特異性、親和性及/或結合能力之非人物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠等)之CDR的殘基取代之人免疫球蛋白，該取代係利用該領域之技藝人士已知之方法進行。在一些實施態樣中，人免疫球蛋白之Fv架構區殘基係由來自非人物種之抗體中的對應殘基取代。在一些實施態樣中，人化抗體可進一步藉由取代Fv架構區及/或該經取代之非人殘基內之額外殘基加以修飾，以精進優化抗體特異性、親和性及/或能力。通常，人化抗體將包含可變結構域區，該等可變結構域區包含所有或實質上所有之對應非人免疫球蛋白之CDR，然而所有或實質上所有之架構區係該些具有人免疫球蛋白序列之架構區。在一些實施態樣中，人化抗體亦可包含至少部分之免疫球蛋白恆定區或恆定結構域(Fc)，通常為人免疫球蛋白之該部分。在某些實施態樣中，該等人化抗體係用於治療用途，因為當投予至人個體時它們可能減少抗原性及HAMA(人抗小鼠抗體)反應。
在本文所述之方法的某些實施態樣中，RSPO結合劑係人抗體。人抗體可利用該領域已知之多種技術直 接製備。在一些實施態樣中，人抗體可自試管內經免疫之永生化人B淋巴細胞產製或自經免疫之個體分離之淋巴細胞產製。在任一情況中，生產以標靶抗原為目標之抗體的細胞可經產製及分離。在一些實施態樣中，人抗體可選自噬菌體庫，其中該噬菌體庫表現人抗體。替代性地，噬菌體展示技術可被用來自未經免疫之捐贈者的免疫球蛋白可變結構域基因貯庫以試管內生產人抗體及抗體片段。用於產製及使用抗體噬菌體庫之技術係廣為周知且噬菌體庫係市售可得。一旦抗體係經識別，該領域已知之親和性成熟策略包括但不限於鏈洗牌(chain shuffling)、結構域洗牌、及定點突變形成，可被用於產製高親和性人抗體。
在一些實施態樣中，人抗體可於包含人免疫球蛋白基因座之基因轉殖小鼠中製備。經免疫後，這些小鼠可產製整套人抗體而不產製內源性免疫球蛋白。
本發明亦包含特異性識別至少一種人RSPO蛋白之雙特異性抗體。雙特異性抗體可特異性辨識及結合至少二種不同抗原或表位。不同表位可位於相同分子內(例如在人RSPO1上的二個表位)或位於不同分子上(例如在RSPO1上的一個表位及在非RSPO蛋白上的一個表位)。在一些實施態樣中，雙特異性抗體相較於個別抗體或超過一種抗體之組合具有增強之效力。在一些實施態樣中，雙特異性抗體相較於個別抗體或超過一種抗體之組合具有減少之毒性。該領域之技藝人士已知的是任何結合劑(例如抗體)可能具有獨特之藥物動力學(PK) (例如循環半衰期)。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有同步兩種活性結合劑之PK之能力，其中該兩種個別結合劑具有不同PK特性。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有將兩種結合劑(例如抗體)之作用集中於共同區域(例如特定組織)之能力。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有將兩種結合劑(例如抗體)之作用集中於共同標靶(例如特定組織)之能力。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有使兩種結合劑(例如抗體)之作用以超過一種生物途徑或功能為標靶之能力。
在一些實施態樣中，雙特異性抗體係單株抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體係人化抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體係人抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體係IgG1抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體係IgG2抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有降低之毒性及/或不良反應。在一些實施態樣中，雙特異性抗體相較於該二種個別抗體之混合物或作為單一劑之該等抗體具有降低之毒性及/或不良反應。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有增加之治療指數。在一些實施態樣中，雙特異性抗體相較於該二種個別抗體之混合物或作為單一劑之該等抗體具有增加之治療指數。
在一些實施態樣中，抗體可特異性辨識及結合第一抗原標靶(例如RSPO2)及第二抗原標靶諸如在淋巴細胞上之效應分子(例如CD2、CD3、CD28、CTLA-4、CD80、或CD86)或Fc受體(例如CD64、CD32、或 CD16)，以使細胞性防禦機制集中於表現及/或產製第一抗原標靶之細胞。在一些實施態樣中，抗體可被用於引導細胞毒性劑至表現特定標靶抗原之細胞。這些抗體具有抗原結合臂及與細胞毒性劑或放射性核種螯合劑諸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA結合之臂。
用於製造雙特異性抗體之技術係該領域之技藝人士所知。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含在兩個重鏈之間的介面部分具有胺基酸修飾之重鏈恆定區。在一些實施態樣中，雙特異性抗體可利用「突點對應孔洞」策略產製。有時候，「突點」及「孔洞」之用語係以「隆突」及「空腔」取代。在一些實施態樣中，雙特異性抗體可能包含無法在重鏈之間形成雙硫鍵接之變異絞鏈區。在一些實施態樣中，修飾可能包含胺基酸之改變，該等胺基酸之改變導致不同之靜電交互作用。在一些實施態樣中，修飾可能包含胺基酸之改變，該等胺基酸之改變導致不同之疏水性/親水性交互作用。
雙特異性抗體可為完整抗體或包含抗原結合部位之抗體片段。本發明亦考慮超過兩價之抗體。因此，在某些實施態樣中，拮抗RSPO蛋白之抗體係多特異性。
在某些實施態樣中，本文描述之抗體(或其他多肽)可為單特異性。在某些實施態樣中，抗體所包含之一或多個抗原結合部位之各者係能結合(或結合)RSPO蛋白上之同源性表位。在某些實施態樣中，本文所述之單特異性抗體的抗原結合部位係能結合(或結合)例 如RSPO2及RSPO3(即在RSPO2及RSPO3兩種蛋白上皆能發現的相同表位)。
在本文所述之方法的某些實施態樣中，RSPO結合劑係抗體片段。抗體片段可具有與完整抗體不同之功能或能力，例如抗體片段可具有增加之組織穿透。已知用於產製抗體片段之各種技術包括但不限於完整抗體之蛋白水解消化。在一些實施態樣中，抗體片段包括由胃蛋白酶消化抗體分子所產製之F(ab')2片段。在一些實施態樣中，抗體片段包括藉由減少F(ab')2片段之雙硫鍵所產製之Fab片段。在其他實施態樣中，抗體片段包括藉由以木瓜酶及還原劑處理抗體分子所產製之Fab片段。在某些實施態樣中，抗體片段係經重組產製。在一些實施態樣中，抗體片段包括Fv或單鏈Fv(scFv)片段。Fab、Fv及scFv抗體片段可在大腸桿菌或其他宿主細胞中表現及分泌，允許大量產製這些片段。在一些實施態樣中，抗體片段係自如本文討論之抗體噬菌體分子庫分離。舉例來說，可利用方法建構Fab表現庫，以允許快速有效地識別對RSPO蛋白或彼之衍生物、片段、類似物或同源物具有所欲特異性之單株Fab片段。在一些實施態樣中，抗體片段係線性抗體片段。在某些實施態樣中，抗體片段係單特異性或雙特異性。在某些實施態樣中，RSPO結合劑係scFv。多種技術可被用於產製對一或多種人RSPO具有特異性之單鏈抗體。
另外尤其以抗體片段來說所欲的是，修飾抗 體以改變(例如增加或減少)彼之血清半衰期。此可藉由例如使抗體片段中之適當區域發生突變以納人救援受體結合表位至抗體片段中達成，或藉由將該表位納入肽標籤中然後使該肽標籤與抗體片段之末端或中間融合(例如藉由DNA或肽合成)達成。
異源共軛抗體亦屬於本發明之範圍內。異源共軛抗體係由二個共價連接之抗體組成。該等抗體被計劃用於例如使免疫細胞以非所欲之細胞為標靶。亦考慮到該等異源共軛抗體可利用已知之合成蛋白質化學方法於試管內製備，包括該些涉及交聯劑之方法。舉例來說，免疫毒素可利用雙硫交換反應或藉由形成硫醚鍵加以建構。為達此目的之適當試劑實例包括亞胺基硫醇鹽及甲基-4-巰基丁亞胺酸酯。
就本發明之目的而言，應了解的是經修飾之抗體可包含任何類型之提供該抗體與標靶(即人RSPO)連接之可變區。在這方面，該可變區可包含或衍生自任何種類之可被誘導以啟動體液性反應及產製拮抗該所欲抗原之免疫球蛋白之哺乳動物。因此，該經修飾之抗體之可變區可為例如人、小鼠、非人靈長動物(例如長尾獼猴(cynomolgus monkey)、獼猴等)或兔來源。在一些實施態樣中，該經修飾之免疫球蛋白之可變區及恆定區皆為人來源。在其他實施態樣中，相容性抗體之可變區(通常源自非人來源)可經工程化或特別改質以促進該分子之結合特性或減少免疫原性。在這方面，可用於本發明之可變 區可經人化或藉由納入輸入胺基酸序列以另行改變。
在某些實施態樣中，重鏈及輕鏈之可變結構域係藉由至少部分取代一或多個CDR及(若需要的話)部分取代架構區及序列修飾及/或改變加以改變。雖然CDR可能源自與架構區來源之抗體相同類型或甚至相同亞型之抗體，一般設想CDR可能源自不同類型之抗體且通常源自不同物種之抗體。要轉移一可變結構域之抗原結合能力至另一可變結構域不一定需要將所有CDR取代成捐贈者可變區之所有CDR。相反地，可能只需要轉移該些維持抗原結合部位之活性所需之殘基即可。
儘管對可變區進行改變，該領域之技藝人士將了解，本發明之經修飾之抗體將包含其中至少部分之一或多個恆定結構域已被刪除或以其他方式改變之抗體(例如全長抗體或彼之免疫反應性片段)以提供所欲之生化特徵，像是相較於包含原始或未經改變之恆定區之大約相同免疫原性之抗體具有增加之組織定位或增加之血清半衰期。在一些實施態樣中，該經修飾之抗體之恆定區將包含人恆定區。與本發明相容之恆定區修飾包含添加、刪除或取代一或多個結構域中之一或多個胺基酸。本文所揭示之經修飾之抗體可能包含對三個重鏈恆定結構域之一或多者(CH1、CH2或CH3)及/或對輕鏈恆定結構域(CL)之改變或修飾。在一些實施態樣中，一或多個結構域係自該經修飾之抗體的恆定區部分或全部刪除。在一些實施態樣中，該經修飾之抗體將包含其中整個CH2結構域被移除 之結構域刪除建構體或變異體(△CH2建構體)。在一些實施態樣中，該缺少之恆定區結構域係由短胺基酸間隔子(例如10個胺基酸殘基)取代，以提供通常由該缺少恆定區授予之一些分子柔韌性。
在一些實施態樣中，該經修飾之抗體係經工程化以直接融合CH3結構域與該抗體之絞鏈區。在其他實施態樣中，肽間隔子被插入絞鏈區與經修飾之CH2及/或CH3結構域之間。舉例來說，其中CH2結構域被刪除且剩餘之CH3結構域(經修飾或未經修飾)係以5至20個胺基酸間隔子與絞鏈區連接之建構體可被表現。該間隔子可被添加以確保恆定區之調節元件維持自由及可接近，或該絞鏈區維持可彎折。然而，應注意胺基酸間隔子在一些情況中可能證實具有免疫原性，且誘發拮抗該建構體之非所欲免疫反應。因此，在某些實施態樣中，任何添加至建構體之間隔子將為相對非免疫原性，以維持該經修飾之抗體之所欲生物性質。
在一些實施態樣中，該經修飾之抗體可能僅具有恆定結構域之部分刪除或取代少數或甚至單一個胺基酸。舉例來說，在CH2結構域之選擇區域中之單一胺基酸突變可能足以實質上減少Fc結合，因此增加細胞定位及/或組織穿透。類似地，可能可行的是單純刪除該一或多個恆定區結構域中控制所欲調節之特定效應功能(例如補體C1q結合)之部分。該恆定區之部分刪除可增進該抗體之選擇特性(血清半衰期)，同時保留其他與該主題恆 定區結構域完整有關之所欲功能。另外，如上所述，該揭示抗體之恆定區可經由一或多個胺基酸之突變或取代修飾以增進該形成建構物之特性。在這方面可能擾亂由保守性結合位點所提供之活性(例如Fc結合)，然而實質上維持該經修飾之抗體的構造及免疫原性特性。在某些實施態樣中，該經修飾之抗體包含添加一或多個胺基酸至恆定區以增進所欲特徵諸如減少或增加效應功能或提供更多細胞毒素或碳水化合物連接位點。
該領域已知的是恆定區媒介數種效應功能。舉例來說，補體之C1成分與(結合至抗原之)IgG或IgM抗體之Fc區結合活化該補體系統。補體活化於細胞病原體之調理作用及溶解中至為重要。補體活化亦刺激發炎反應，且亦與自體免疫超敏性有關。此外，抗體之Fc區可與表現Fc受體(FcR)之細胞結合。有一些Fc受體對不同類型之抗體具有特異性，包括IgG(γ受體)、IgE(ε受體)、IgA(α受體)及IgM(μ受體)。抗體與細胞表面上之Fc受體結合引發多種重要且多變之生物反應，包括吞噬及破壞抗體包覆顆粒、清空免疫複合物、藉由殺手細胞溶解經抗體包覆之標靶細胞(稱為抗體依賴性細胞性細胞毒性或ADCC)、釋放發炎介質、胚胎轉移及控制免疫球蛋白之產製。
在某些實施態樣中，該經改質之抗體具有經改變之效應功能，該經改變之效應功能因此影響該投予抗體之生物特性。舉例來說，在一些實施態樣中，刪除或不 活化(經由點突變或其他方法)恆定區結構域可能減少循環中經修飾之抗體與Fc受體結合，因此增加細胞定位及/或組織穿透。在其他實施態樣中，恆定區修飾增加抗體之血清半衰期。在其他實施態樣中，恆定區修飾減少抗體之血清半衰期。在一些實施態樣中，恆定區係經修飾以消除雙硫鍵或寡糖基團。根據本發明之恆定區修飾可利用廣為周知之生化或分子工程技術輕易進行。
在某些實施態樣中，屬於抗體之RSPO結合劑不具有一或多種效應功能。例如在一些實施態樣中，抗體不具ADCC活性及/或不具補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。在某些實施態樣中，該抗體不與Fc受體及/或補體因子結合。在某些實施態樣中，該抗體不具效應功能。
本發明另包含實質上與本文前述之嵌合抗體、人化抗體、人抗體或彼等之抗體片段同源之變異體及相等物。這些可包含例如保守性取代突變，即以類似胺基酸取代一或多個胺基酸。
在某些實施態樣中，本文所述之抗體係經分離。在某些實施態樣中，本文所述之抗體係實質上純的。
在本發明之一些實施態樣中，RSPO結合劑係多肽。多肽可為包含與至少一種RSPO蛋白結合之抗體或彼之片段之重組多肽、天然多肽或合成多肽。該領域將同意本發明的一些胺基酸序列可變化而不會對該蛋白質之結構或功能造成顯著影響。因此，本發明另包括多肽之變異 體，該等變異體顯示拮抗人RSPO蛋白之抗體或彼之片段的實質活性或包括該抗體或彼之片段的區域。在一些實施態樣中，RSPO結合多肽之胺基酸序列變異體包括刪除、插入、倒位、重複及/或其他類型之取代。
在某些實施態樣中，本文所述之多肽係經分離。在某些實施態樣中，本文所述之多肽係實質上純的。
多肽、類似物及彼等之變異體可另經修飾以包含正常非該多肽之部分的額外化學基團。該等衍生化基團可增進或以其他方式調節該多肽之溶解性、生物半衰期及/或吸收。該等基團亦可減少或消除該多肽及變異體之非所欲之不良反應。有關化學基團之介紹可見Remington：The Science and Practice of Pharmacy,22nd Edition,2012,Pharmaceutical Press,London。
本文所述之多肽可藉由該領域已知之任何適當方法產製。該等方法從直接蛋白質合成方法至建構編碼多肽序列之DNA序列及在適當宿主中表現該等序列皆可。在一些實施態樣中，DNA序列係利用重組技術建構，其藉由分離或合成編碼感興趣之野生型蛋白質之DNA序列。可任意選擇地，該序列可藉由定點突變形成突變以提供彼之功能性類似物。
在一些實施態樣中，編碼感興趣之多肽之DNA序列可藉由化學合成利用寡核苷酸合成器建構。寡核苷酸可根據該所欲多肽之胺基酸序列設計，並選擇該些將產製感興趣重組多肽之宿主細胞所偏好之密碼子。標準 方法可被用於合成編碼經分離之感興趣多肽之多核苷酸序列。舉例來說，完全胺基酸序列可被用於建構反轉譯基因。另外，可合成包含編碼經分離之特定多肽之核苷酸序列之DNA寡聚體。例如，多個編碼該所欲多肽之部分的小型寡核苷酸可被合成然後連接。個別寡核苷酸通常包含5'或3'懸端以用於互補組裝。
一經組裝(藉由合成、定點突變形成或其他方法)，該編碼感興趣之特定多肽之多核苷酸序列可被插入表現載體並可操作性連接適合該蛋白質於所欲宿主內表現之表現控制序列。適當組裝可藉由核苷酸定序、限制酶定位及/或於適當宿主內表現生物活性多肽證實。如該領域所廣為周知，為了在宿主內獲得高表現量之經轉染之基因，該基因必須與在選定之表現宿主內具功能性之轉錄及轉譯表現控制序列可操作性連接。
在某些實施態樣中，重組表現載體被用於擴增及表現拮抗人RSPO蛋白之DNA編碼抗體或彼之片段。舉例來說，重組表現載體可為可複製之DNA建構體，其具有與適當轉錄及/或轉譯調節元件可操作性連接之編碼RSPO結合劑(諸如抗RSPO抗體或彼之片段)之多肽鏈的合成性或cDNA衍生性DNA片段，該調節元件係源自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因。轉錄單位通常包含下列之組合：(1)於基因表現中具有調節作用之基因元件，例如轉錄啟動子或增強子，(2)經轉錄成mRNA然後轉譯成蛋白質之結構或編碼序列，及(3)適 當之轉錄及轉譯啟動及終止序列。調節元件可包括操作子序列以控制轉錄。通常由複製起點授予之於宿主內複製之能力及有利轉形物辨識之選擇基因可被額外納入。DNA區係「可操作性連接」當它們彼此之間係功能性相關。舉例來說，信號肽之DNA(分泌前導序列)係可操作性連接多肽之DNA，若其被表現為參與該多肽分泌之前體；啟動子係可操作性連接編碼序列，若其控制該序列之轉錄；或核糖體結合位點係可操作性連接編碼序列，若其位置係為了允許轉譯。在一些實施態樣中，適用於酵母菌表現系統之結構元件包括使宿主細胞得以胞外分泌經轉譯之蛋白質之前導序列。在其他實施態樣中，當重組蛋白質係於無前導或轉運序列存在時表現之情況中，其可包括N端甲硫胺酸殘基。此殘基之後可任意選擇地與該經表現之重組蛋白質切開以提供最終產物。
表現控制序列及表現載體之選擇取決於宿主選擇。多樣化之表現宿主/載體組合可被採用。可用於真核宿主之表現載體包括例如包含源自SV40、牛乳頭狀瘤病毒、腺病毒及巨細胞病毒之表現控制序列之載體。可用於細菌宿主之表現載體包括已知之細菌質體，像是源自大腸桿菌之質體(包括pCR1、pBR322、pMB9及彼等之衍生物)，及廣泛宿主範圍質體像是M13及其他絲狀單股DNA噬菌體。
本發明之RSPO結合劑(例如多肽或抗體)可由一或多個載體表現。例如在一些實施態樣中，一重鏈 多肽係由一載體表現，第二重鏈多肽係由第二載體表現，且輕鏈多肽係由第三載體表現。在一些實施態樣中，第一重鏈多肽及輕鏈多肽係由一載體表現，且第二重鏈多肽係由第二載體表現。在一些實施態樣中，二條重鏈多肽係由一載體表現，且輕鏈多肽係由第二載體表現。在一些實施態樣中，三條多肽係由一載體表現。因此，在一些實施態樣中，第一重鏈多肽、第二重鏈多肽及輕鏈多肽係由單一載體表現。
用於表現RSPO結合劑(或用來作為抗原之RSPO蛋白)之適當宿主細胞包括原核生物、酵母菌細胞、昆蟲細胞或在適當啟動子控制下之高級真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體，例如大腸桿菌(E.coli)或桿菌(Bacillus)。高級真核細胞包括如下所述之哺乳動物來源之株化細胞系。不含細胞之轉譯系統亦可被採用。用於細菌性、真菌性、酵母菌性及哺乳動物細胞性宿主之適當選殖及表現載體係該領域之技藝人士所知。
多種哺乳動物細胞培養系統可被用於表現重組多肽。於哺乳動物細胞中表現重組蛋白質係為所欲，因為這些蛋白質通常經過正確折疊、適當修飾且具生物功能性。適當哺乳動物宿主細胞系之實例包括但不限於COS-7(猴腎來源)、L-929(小鼠纖維母細胞來源)、C127(小鼠乳房腫瘤來源)、3T3(小鼠纖維母細胞來源)、CHO(中國倉鼠卵巢來源)、HeLa(人子宮頸癌來源)、 BHK(倉鼠腎纖維母細胞來源)、HEK-293(人胚胎腎來源)細胞系及彼等之變異株。哺乳動物表現載體可包含非轉錄元件(諸如複製起點、與所欲表現之基因相連之適當啟動子及增強子，及其他5'或3'側翼非轉錄序列)及5'或3'非轉譯序列(諸如必要之核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供點及受點，及轉錄終止序列)。
於昆蟲細胞培養系統(例如桿狀病毒)中表現重組蛋白質亦提供產製正確摺疊及具生物功能之蛋白質之有效方法。用於在昆蟲細胞中產製異源性蛋白質之桿狀病毒系統係該領域之技藝人士所廣為周知。
由經轉形之宿主產製之蛋白質可根據任何適當方法純化。標準方法包括層析(例如離子交換、親和性及尺寸柱層析)、離心、差別溶解或藉由任何其他用於蛋白質純化之標準技術。親和性標籤諸如六組胺酸、麥芽糖結合結構域、流感外套序列及麩胱甘肽-S-轉移酶可被連接至該蛋白質以允許藉由通過適當親和性管柱之輕易純化。用於純化免疫球蛋白之親和性層析可包括蛋白質A、蛋白質G及蛋白質L層析。經分離之蛋白質可經物理特徵化，使用像是蛋白水解、大小排除層析(SEC)、質譜分析(MS)、核磁共振(NMR)、等電點沉澱(IEF)、高效液相層析(HPLC)及x光結晶之技術。經分離之蛋白質之純度可利用該領域之技藝人士已知之技術測定，該等技術包括但不限於SDS-PAGE、SEC、毛細管膠體電泳、IEF及毛細管等電點沉澱(cIEF)。
在一些實施態樣中，源自分泌重組蛋白質至培養基之表現系統的上清液可利用商用蛋白質濃縮過濾器先行濃縮，例如使用阿密康(Amicon)或密里博(Millipore)Pellicon超過濾單位濃縮。在濃縮步驟之後，該濃縮液可被加至適當純化基材。在一些實施態樣中，可採用陰離子交換樹脂，例如具有二乙基胺基乙基(DEAE)懸掛基團之基材或基質。該基材可為丙烯醯胺、洋菜糖、葡聚糖、纖維素或其他常用於蛋白質純化之基材。在一些實施態樣中，可採用陽離子交換步驟。適當之陽離子交換基材包括包含磺丙基或羧甲基之各種不可溶基材。在一些實施態樣中，可採用羥磷灰石基質，包括但不限於陶瓷羥磷灰石(CHT)。在某些實施態樣中，一或多種應用疏水性逆相HPLC基質(例如具有懸掛甲基或其他脂肪族基團之矽膠)之逆相HPLC步驟可被採用以進一步純化重組蛋白質(例如RSPO3結合劑)。上述之一些或所有純化步驟之各種組合可被應用以提供同質性重組蛋白。
在一些實施態樣中，異二聚體蛋白質諸如雙特異性抗體係根據本文所述之任何方法純化。在一些實施態樣中，抗RSPO雙特異性抗體係利用至少一種層析步驟分離及/或純化。在一些實施態樣中，該至少一種層析步驟包含親和性層析。在一些實施態樣中，該至少一種層析步驟另包含陰離子交換層析。在一些實施態樣中，該經分離及/或純化之抗體產物包含至少90%之異二聚抗體。在 一些實施態樣中，該經分離及/或純化之抗體產物包含至少95%、96%、97%、98%或99%之異二聚抗體。在一些實施態樣中，該經分離及/或純化之抗體產物包含大約100%之異二聚抗體。
在一些實施態樣中，於細菌培養中生產之重組蛋白質可被分離，例如藉由自細胞團塊初步萃取，接著進行一或多次濃縮、鹽析、水性離子交換或大小排除層析步驟。HPLC可被使用於最終純化步驟。用於表現重組蛋白之微生物細胞可藉由任何方便方法破碎，包括冷凍解凍循環、超音波震盪、機械破碎或使用細胞溶解劑。
在某些實施態樣中，RSPO結合劑或抗體可以數種共軛(即免疫共軛物或放射共軛物)或非共軛形式之任一者被使用。在某些實施態樣中，抗體可以非共軛形式被使用以駕馭個體之天然防禦機制，包括補體依賴性細胞毒性及抗體依賴性細胞毒性，以消除過度增生性細胞。
在一些實施態樣中，RSPO結合劑(例如抗體或多肽)係與細胞毒性劑共軛。在一些實施態樣中，該細胞毒性劑係化學治療劑，包括但不限於甲胺喋呤(methotrexate)、甲烯土黴素(adriamicin)、多柔比星(doxorubicin)、黴法蘭(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、正定黴素(daunorubicin)或其他插入劑。在一些實施態樣中，該細胞毒性劑係細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素及彼等之片段，包括但不限於白喉毒素A鏈、白喉毒素 之非結合活性片段、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-次黃嘌呤(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素(curcin)、巴豆素(crotin)、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、絲裂膠素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及新月毒素(trichothecene)。在一些實施態樣中，該細胞毒性劑係放射性同位素以產製放射共軛物或經放射共軛之抗體。多種放射性核種可用於產製經放射共軛之抗體，包括但不限於90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re及212Bi。本發明亦可使用抗體與一或多種小分子毒素之共軛物，該等毒素諸如卡利奇黴素(calicheamicins)、類美坦素(maytansinoids)、新月毒素(trichothenes)、CC1065及具有毒素活性之該些毒素之衍生物。抗體與細胞毒性劑之共軛物可利用各種雙官能性蛋白偶合劑製備，例如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、二亞胺環硫丁烷(IT)、亞胺酸酯之雙官能基衍生物(諸如己二亞胺二甲酯HCl)、活性酯之雙官能基衍生物(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺)、醛之雙官能基衍生物(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如 雙(對-疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸甲苯酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝苯)。
IV.多核苷酸
在某些實施態樣中，本發明包含多核苷酸，該等多核苷酸包含編碼與至少一種人RSPO蛋白特異性結合之多肽(或多肽之片段)的多核苷酸。用語「編碼多肽之多核苷酸」包含僅包括該多肽之編碼序列之多核苷酸，以及包括額外之編碼及/或非編碼序列之多核苷酸。舉例來說，在一些實施態樣中，本發明提供包含編碼抗人RSPO蛋白之抗體或編碼該種抗體之片段(例如包含該抗原結合部位之片段)的多核苷酸序列之多核苷酸。本發明之多核苷酸可為RNA之形式或DNA之形式。DNA包括cDNA、基因組DNA及合成性DNA；可為雙股或單股，若單股可為編碼股或非編碼(反義)股。
在某些實施態樣中，多核苷酸包含編碼多肽之多核苷酸，該多肽包含選自下列之胺基酸序列：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、及SEQ ID NO：68。在一些實施態樣中，多核苷酸包含包含選自下列之多核苷酸序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：69、及SEQ ID NO：70。
在某些實施態樣中，多核苷酸包含具有核苷酸序列之多核苷酸，該核苷酸序列與包含選自下列序列之多核苷酸具有至少約80%一致性、至少約85%一致性、至少約90%一致性、至少約95%一致性、且在一些實施態樣中至少約96%、97%、98%或99%一致性：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、及SEQ ID NO：55。本發明亦提供包含與下列序列雜交之多核苷酸之多核苷酸：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：69、及SEQ ID NO：70。本發明亦提供包含與下列序列的互補物雜交之多核苷酸之多核苷酸：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：69、及SEQ ID NO：70。在某些實施態樣中，該雜交係於高度嚴謹度條件下發生。
在某些實施態樣中，該等多核苷酸包含融合至多核苷酸之相同閱讀框的成熟多肽之編碼序列，該編碼序列有助於例如多肽自宿主細胞之表現及分泌(例如作為分泌序列以控制源自細胞之多肽之運輸的前導序列)。具有前導序列之多肽係前體蛋白，該前導序列可由宿主細胞切割以形成成熟形式之多肽。該等多核苷酸亦可編碼蛋白原，蛋白原係成熟蛋白質加上額外之5'胺基酸殘基。具有原序列(prosequence)之成熟蛋白質係蛋白原，其係不活化形式之蛋白質。一旦原序列被切割後，剩下即為活性成熟蛋白質。
在某些實施態樣中，多核苷酸包含融合至標誌序列之相同閱讀框的成熟多肽之編碼序列，以允許例如用於純化該經編碼之多肽。舉例來說，標誌序列可為由pQE-9載體供應之六組胺酸標籤以提供在細菌宿主之例中用於純化與該標誌融合之成熟多肽，或當使用哺乳動物宿主(例如COS-7細胞)時該標誌序列可為源自流感血球 凝集素蛋白質之血球凝集素(HA)標籤。在一些實施態樣中，標誌序列係FLAG標籤，其可與其他親和性標籤搭配使用。
本發明另關於上述多核苷酸編碼片段、類似物及/或衍生物之變異體。
在某些實施態樣中，本發明提供多核苷酸，該等多核苷酸包含：具有與編碼包含本文所述之RSPO結合劑(例如抗體)或彼之片段之多肽的多核苷酸具有至少約80%一致性、至少約85%一致性、至少約90%一致性、至少約95%一致性、及在一些實施態樣中至少約96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列之多核苷酸。
如本文所使用之用語，具有與參考核苷酸序列至少(例如)95%「一致性」之核苷酸序列之多核苷酸係意圖表示該多核苷酸之核苷酸序列除了可包括該參考核苷酸序列之每100個核苷酸中最多五個點突變以外，該多核苷酸序列係與該參考序列一致。換言之，為了獲得具有與參考核苷酸序列至少95%一致性之核苷酸序列之多核苷酸，在參考序列中最多5%之核苷酸可被刪除或以另一核苷酸取代，或參考序列中總核苷酸數量之最多5%之核苷酸可被插入該參考序列中。這些參考序列之突變可發生在該參考核苷酸序列之5'或3'端位置或該些末端位置之間的任何位置，這些位置個自分散在參考序列之核苷酸之中或在參考序列內以一或多個連續族群存在。
多核苷酸變異體可包含編碼區、非編碼區或 兩區中之改變。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體包含產生靜默取代、添加或刪除之改變，但不改變該經編碼之多肽的性質或活性。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體包含導致該多肽之胺基酸序列無改變之靜默取代(由於基因密碼之簡併)。在一些實施態樣中，核苷酸變異體包含在轉錄層級導致表現差異(例如增加或減少表現)之核苷酸序列。多核苷酸變異體可為了多種原因產製，例如為了最佳化密碼子於特定宿主之表現(例如將人mRNA中之密碼子改變成該些細菌宿主諸如大腸桿菌所偏好之密碼子)。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體在序列之非編碼或編碼區包含至少一個靜默突變。
在一些實施態樣中，多核苷酸變異體係經產製以調節或改變該經編碼之多肽的表現(或表現量)。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體係經產製以增加該經編碼之多肽的表現。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體係經產製以減少該經編碼之多肽的表現。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體相較於親代多核苷酸序列增加該經編碼之多肽之表現。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體相較於親代多核苷酸序列減少該經編碼之多肽之表現。
在一些實施態樣中，至少一種多核苷酸變異體係經產製(不改變該經編碼之多肽的胺基酸序列)以增加異多聚分子之產製。在一些實施態樣中，至少一種多核苷酸變異體係經產製(不改變該經編碼之多肽的胺基酸序列)以增加雙特異性抗體之產製。
在某些實施態樣中，多核苷酸係經分離。在某些實施態樣中，多核苷酸係實質上純的。
本發明亦提供包含本文所述之多核苷酸之載體。本發明亦提供包含本文所述之多核苷酸之細胞。在一些實施態樣中，表現載體包含多核苷酸分子。在一些實施態樣中，宿主細胞包含表現載體，該表現載體包含該多核苷酸分子。在一些實施態樣中，宿主細胞包含多核苷酸分子。
V.包含RSPO結合劑之套組
本發明提供包含本文所述之RSPO結合劑(例如抗體)之套組，其可被用於實施本文所述之方法。在某些實施態樣中，套組包含於一或多個容器中之至少一種經純化之抗至少一種人RSPO蛋白之抗體。在一些實施態樣中，該套組包含所有實施檢測試驗所必需及/或足以實施檢測試驗之成份，包括所有對照物、使用說明及任何必要軟體以供結果分析及表現。該領域之技藝人士將顯而易見的是，本發明所揭示之RSPO結合劑可被輕易納入該領域所廣為周知之已建立之套組格式之一。
本發明另提供包含RSPO結合劑(例如抗RSPO抗體)以及至少一種額外治療劑之套組。在某些實施態樣中，該第二(或更多)治療劑係抗發炎劑。在某些實施態樣中，該第二(或更多)治療劑係Wnt途徑抑制劑。
本發明之實施態樣可藉由參考下列非限制性實施例進一步定義，以下實施例描述本發明之某些抗體之詳細製備及使用本發明之抗體之方法。該領域之技藝人士將顯而易見的是，許多在材料及方法上之調整可加以實施而不背離本發明之範圍。
實例 實例1 肺纖維化模型
誘導小鼠肺纖維化模型係描述於Baran et al.,2011,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,45：999及Marks et al.,2013,J.Mol.Crit.Care Med.,187：397-405，此模型為眾所遵循。簡言之，6至8週齡C57BL/6N小鼠係經腹腔內注射0.035U/g博來黴素(bleomycin)或載體(鹽水)。100μl之溶解於0.9% NaCl中之博來黴素(濃度7U/ml)係於第1、4、9、12、15、18、22、25、29及32天投予至小鼠。在第9、16、22、29及33天，五隻代表性小鼠係經安樂死。採集肺組織片段以進行基因表現分析。剩餘的肺組織係經福馬林灌注並經儲存以供組織學分析。
經博來黴素注射之小鼠的肺組織組織學分析於第16天顯示纖維化之證據，最大纖維化於第29天觀察到。經博來黴素注射之小鼠的肺組織中Rspo1、Rspo2及Rspo3之基因表現係經定量RT-PCR檢測。在給定時間點 經博來黴素注射之小鼠的肺組織中之基因表現係相對於經鹽水注射之小鼠的肺組織中之基因表現加以比較。為了進行分析，使用β-葡萄糖苷酸酶基因(Gusb)進行標準化。
如圖1所示，經博來黴素注射之小鼠的肺組織Rspo2表現係於第9天及第16天上調，隨後於第22、29及33天下調。相反地，Rspo1及Rspo3之基因表現係於第9天下調，且維持下調直至第33天。
於第9天及第16天偵測到的Rspo2基因表現上升與肺組織中浸潤發炎細胞之存在及肺纖維化之開始一致，表示RSPO蛋白特別是RSPO2可能涉及纖維化變性之過程。
實例2 皮膚纖維化模型
使用博來黴素誘導小鼠皮膚纖維化模型係描述於Distler et al.,2007,Arthritis & Rheumatism,56(1)：311-322，此模型為眾所遵循。簡言之，6至8週齡小鼠係經博來黴素皮下注射至上背部限定區域。注射部位區域之大小約1cm2，位於小鼠背部的背側區域(脊柱兩側旁開約2cm)。每隻小鼠有二個注射部位。100μl之溶解於0.9% NaCl中之博來黴素(濃度0.5mg/ml)係於第1、3、5、8及10天投予。在第2、5、8及12天，四隻代表性小鼠係經安樂死。採集注射部位組織片段以進行基 因表現分析，並經福馬林固定以供組織學分析。
在給定時間點經博來黴素注射之小鼠的皮膚組織中之基因表現係相對於未經注射之小鼠的皮膚組織中之基因表現加以比較。為了進行分析，使用β-葡萄糖苷酸酶進行標準化。
如圖2所示，博來黴素注射部位之皮膚組織的Rspo3表現係於第一次注射後24小時(第2天)上調，並於第5天達到尖峰。Rspo3於第8天及第12天仍維持上調，但表現量相較於第5天下降。在此模型中，Rspo1於博來黴素注射部位之表現量似乎不受影響，而Rspo2似乎受到輕微上調。
在第一次注射博來黴素後的24小時即觀察到Rspo3基因表現上升，表示RSPO蛋白可能涉及纖維化的早期事件。Rspo3基因表現於皮膚纖維化模型中之強烈上調，與肺纖維化模型中誘導Rspo2基因表現形成對比。這些結果顯示RSPO蛋白在不同類型的纖維化之開始及進展方面可能具有組織特異性作用。
實例3 抗RSPO抗體對於博來黴素誘導之皮膚病灶的影響
皮膚纖維化係如實例2中所述於小鼠誘導。六至8週齡小鼠係經博來黴素皮下注射至二個上背部限定區域。100μl之溶解於0.9% NaCl中之博來黴素(濃度0.5mg/ml)係於第1、3、5、8及10天投予。對照抗體 1B7.11、抗RSPO2抗體130M23、抗RSPO3抗體131R010、或抗RSPO2抗體130M23與抗RSPO3抗體131R010之組合係於第1及8天以25mg/kg之劑量投予。四隻小鼠係於對照抗體組中治療，八隻小鼠係於各個抗RSPO抗體組中治療。
於第12天，在各對照抗體小鼠之注射部位(共8個注射部位中的8個)顯示可觸知之皮膚病灶，發生率為100%。在以抗RSPO2抗體130M23治療之小鼠中，共16個注射部位中有13個可觸知皮膚病灶，發生率為81%。在以抗RSPO3抗體130R010治療之小鼠中，共16個注射部位中有6個可觸知病灶，發生率為38%。在以抗RSPO2抗體130M23及抗RSPO3抗體131R010之組合治療之小鼠中，共16個注射部位中只有2個可觸知病灶，發生率為13%。這些結果顯示於圖3。
注射部位區域之組織係於第12天收集，該等組織係用於基因表現分析及組織學分析。數個基因之基因表現係藉由定量RT-PCR檢測。這些基因包括趨化激素(C-X-C模體)配體1(Cxcl1)、內皮糖蛋白(Eng)、干擾素γ(Ifng)、介白素16(I116)、腫瘤壞死因子(Tnf)、axin2(Axin2)、富含白胺酸重複之G蛋白偶合受體5(Lgr5)、R-脊椎蛋白1(Rspo1)、R-脊椎蛋白3(Rspo3)、及平滑肌肌動蛋白(Acta2)。
如圖4所示，抗RSPO2抗體130M23及抗RSPO3抗體131R010之組合治療減少與發炎有關之基因 包括干擾素γ、腫瘤壞死因子及內皮糖蛋白之表現(於第12天檢測)。此治療亦減少Wnt途徑相關基因Lgr5之基因表現，Axin2的基因表現也較少。於第12天，以抗RSPO2抗體130M23及抗RSPO3抗體131R010單劑治療不減少這些基因的表現。有趣的是，在投予單一劑量博來黴素及單一劑量抗RSPO抗體24小時之後，干擾素γ之基因表現在單劑抗RSPO抗體以及組合治療中皆顯著減少(圖5)。
這些結果顯示，單獨使用之抗RSPO3抗體或其與抗RSPO2抗體之組合治療皆具有高度抑制博來黴素誘導之皮膚病灶形成之能力。投予抗RSPO2抗體130M23與抗RSPO3抗體131R010之組合而減少可觸知皮膚病灶發生率以及下調與Wnt傳訊及發炎有關之基因，顯示多種RSPO蛋白可能涉及纖維化之開始及發展。這些結果支持抗RSPO拮抗劑(諸如抗RSPO抗體)可能可有效治療纖維變性疾病之假設。
應了解本文所描述之實施例及實施態樣僅供說明示範之目的，各種對於彼等之修飾或改變將由該領域之技藝人士建議且將被納入本申請案之精神與範圍內。
所有本文所提及之公開資料、專利、專利申請案、網站及編號/資料庫序列包括多核苷酸及多肽序列在此係以參照方式整體納入本文以符合所有目的，和特別且獨立指出個別公開資料、專利、專利申請案、網站或編號/資料庫序列各自以參照方式被納入之範圍相同。
本說明書中揭示之序列如下：
含信號序列之人RSPO1胺基酸序列(SEQ ID NO：1)
含信號序列之人RSPO2胺基酸序列(SEQ ID NO：2)
含信號序列之人RSPO3胺基酸序列(SEQ ID NO：3)
含信號序列之人RSPO4胺基酸序列(SEQ ID NO：4)
89M5重鏈CDR1(SEQ ID NO：5)TGYTMH
89M5重鏈CDR2(SEQ ID NO：6)GINPNNGGTTYNQNFKG
89M5重鏈CDR3(SEQ ID NO：7)KEFSDGYYFFAY
89M5輕鏈CDR1(SEQ ID NO：8)KASQDVIFAVA
89M5輕鏈CDR2(SEQ ID NO：9)WASTRHT
89M5輕鏈CDR3(SEQ ID NO：10)QQHYSTPW
h89M5-H8L5重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：11)
h89M5-H8L5輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：12)
含畫底線之預測信號序列的h89M5-H8L5重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：13)
不含預測信號序列的h89M5-H8L5重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：14)
含畫底線之預測信號序列的h89M5-H8L5輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：15)
不含預測信號序列的h89M5-H8L5輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：16)
h89M5-H8L5重鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：17)
h89M5/H8L5輕鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：18)
h89M5-H8L5重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：19)
h89M5-H8L5輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：20)
130M23重鏈CDR1(SEQ ID NO：21)SSYAMS
130M23重鏈CDR2(SEQ ID NO：22)SISSGGSTYYPDSVKG
130M23重鏈CDR3(SEQ ID NO：23)RGGDPGVYNGDYEDAMDY
130M23輕鏈CDR1(SEQ ID NO：24)KASQDVSSAVA
130M23輕鏈CDR2(SEQ ID NO：25)WASTRHT
130M23輕鏈CDR3(SEQ ID NO：26)QQHYSTP
h130M23-H1L6重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：27)
h130M23-H1L6輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：28)
含畫底線之預測信號序列的h130M23-H1L6重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：29)
不含預測信號序列的h130M23-H1L6重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：30)
含畫底線之預測信號序列的h130M23-H1L6輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：31)
不含預測信號序列的h130M23-H1L6輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：32)
h130M23-H1L6重鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：33)
h130M23-H1L6輕鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：34)
h130M23-H1L6重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：35)
h130M23-H1L6輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：36)
131R010重鏈CDR1(SEQ ID NO：37)DYSIH
131R010重鏈CDR2(SEQ ID NO：38)YIYPSNGDSGYNQKFK
131R010重鏈CDR3(SEQ ID NO：39)TYFANNFD
131R010替代性重鏈CDR3(SEQ ID NO：40)ATYFANNFDY
131R010輕鏈CDR1(SEQ ID NO：41)KASQSVDYDGDSYMN
131R010輕鏈CDR2(SEQ ID NO：42) AASNLES
131R010替代性輕鏈CDR2(SEQ ID NO：43)AAS
131R010輕鏈CDR3(SEQ ID NO：44)QQSNEDPLT
131R010替代性輕鏈CDR3(SEQ ID NO：45)QQSNEDPLTF
131R010重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：46)
131R010輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：47)
含畫底線之預測信號序列的131R010重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：48)
不含預測信號序列的131R010重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：49)
含畫底線之預測信號序列的131R010輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：50)
不含預測信號序列的131R010輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：51)
131R010重鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：52)
131R010輕鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：53)
131R010重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：54)
131R010輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：55)
h89M5-H2L2重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：56)
h89M5-H2L2輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：57)
含畫底線之預測信號序列的h89M5-H2L2重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：58)
不含預測信號序列的h89M5-H2L2重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：59)
含畫底線之預測信號序列的h89M5-H2L2輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：60)
不含預測信號序列的h89M5-H2L2輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：61)
h89M5-H2L2重鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：62)
h89M5-H2L2輕鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：63)
h89M5-H2L2重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：64)
h89M5-H2L2輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：65)
h130M23-H1L2輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：66)
含畫底線之預測信號序列的h130M23-H1L2輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：67)
不含畫底線之預測信號序列的h130M23-H1L2輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：68)
h130M23-H1L2輕鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：69)
h130M23-H1L2輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：70)
<110> 安可美德藥物股份有限公司(OncoMed Pharmaceuticals,Inc.) 坎恩珍妮佛安妮(Cain,Jennifer Anne)
<120> 纖維變性疾病之治療(TREATMENT OF FIBROTIC DISEASES)
<130> 2293.127TW01/PAC/MIG/BMB
<140> To Be Assigned
<141> Herewith
<150> 62/051,026
<151> 2014-09-16
<160> 70
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人RSPO1胺基酸序列
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<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人RSPO2胺基酸序列
<400> 2
<210> 3
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人RSPO3胺基酸序列
<400> 3
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<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人RSPO4胺基酸序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 89M5重鏈CDR2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 89M5輕鏈CDR3
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H8L5重鏈可變區
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H8L5輕鏈可變區
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> SIGNAL
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H8L5重鏈胺基酸序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H8L5輕鏈胺基酸序列
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<221> SIGNAL
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H8L5輕鏈胺基酸序列
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<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H8L5重鏈可變區
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H8L5輕鏈可變區
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<211> 1413
<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> h89M5-H8L5輕鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 130M23重鏈CDR1
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 23
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 130M23輕鏈CDR1
<400> 24
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 130M23輕鏈CDR2
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 130M23輕鏈CDR3
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<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h130M23-H1L6重鏈可變區
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h130M23-H1L6輕鏈可變區
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> h130M23-H1L6重鏈胺基酸序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h130M23-H1L6重鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h130M23-H1L6輕鏈
<220>
<221> SIGNAL
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h130M23-H1L6重鏈可變區
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h130M23-H1L6輕鏈可變區
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<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> h130M23-H1L6輕鏈
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010重鏈CDR1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010重鏈CDR2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010重鏈CDR3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010替代性重鏈CDR3
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010輕鏈CDR1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010輕鏈CDR2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010替代性輕鏈CDR2
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010輕鏈CDR3
<400> 44
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010替代性輕鏈CDR3
<400> 45
<210> 46
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010重鏈可變區
<400> 46
<210> 47
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010輕鏈可變區
<400> 47
<210> 48
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010重鏈
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(19)
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010重鏈
<400> 49
<210> 50
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010輕鏈
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(19)
<400> 50
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<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010輕鏈
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<210> 52
<211> 350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010重鏈可變區
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010輕鏈可變區
<400> 53
<210> 54
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010重鏈
<400> 54
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<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 131R010輕鏈
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H2L2重鏈可變區
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H2L2輕鏈可變區
<400> 57
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<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H2L2重鏈
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(19)
<400> 58
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H2L2重鏈
<400> 59
<210> 60
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H2L2輕鏈
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(22)
<400> 60
<210> 61
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H2L2輕鏈
<400> 61
<210> 62
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H2L2重鏈
<400> 62
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H2L2輕鏈可變區
<400> 63
<210> 64
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h89M5-H2L2重鏈
<400> 64
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<211> 711
<212> DNA
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<220>
<223> h89M5-H2L2輕鏈
<400> 65
<210> 66
<211> 107
<212> PRT
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<220>
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<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(22)
<220>
<223> h130M23-H1L2輕鏈胺基酸序列
<400> 67
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<211> 214
<212> PRT
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<220>
<223> h130M23-H1L2輕鏈
<400> 68
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<211> 321
<212> DNA
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<220>
<223> h130M23-H1L2輕鏈可變區
<400> 69
<210> 70
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> h130M23-H1L2輕鏈
<400> 70

Claims (33)

  1. 一種治療或預防個體之纖維變性疾病之方法，其包含對該個體投予治療有效量之與人R-脊椎蛋白(RSPO)特異性結合之抗體。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該抗體與RSPO1特異性結合。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該抗體與RSPO1特異性結合且包含：(a)重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含TGYTMH(SEQ ID NO：5)，該重鏈CDR2包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO：6)且該重鏈CDR3包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO：7)；以及(b)輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO：8)，該輕鏈CDR2包含WASTRHT(SEQ ID NO：9)且該輕鏈CDR3包含QQHYSTPW(SEQ ID NO：10)。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中該抗體與RSPO1特異性結合且包含：(a)與SEQ ID NO：11具有至少90%序列一致性之重鏈可變區及與SEQ ID NO：12具有至少90%序列一致性之輕鏈可變區；或(b)與SEQ ID NO：56具有至少90%序列一致性之重鏈可變區及與SEQ ID NO：57具有至少90%序列一致性之輕鏈可變區。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其中該抗體與RSPO1特異性結合且包含：(a)SEQ ID NO：11之重鏈可變區及SEQ ID NO：12之輕鏈可變區；或(b)SEQ ID NO：56之重鏈可變區及SEQ ID NO：57之輕鏈可變區。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該抗體與RSPO2特異性結合。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該抗體與RSPO2特異性結合且包含：(a)重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含SSYAMS(SEQ ID NO：21)，該重鏈CDR2包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO：22)且該重鏈CDR3包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO：23)；以及(b)輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO：24)，該輕鏈CDR2包含WASTRHT(SEQ ID NO：25)且該輕鏈CDR3包含QQHYSTP(SEQ ID NO：26)。
  8. 如申請專利範圍第1、6或7項中任一項之方法，其中該抗體與RSPO2特異性結合且包含與SEQ ID NO：27具有至少90%序列一致性之重鏈可變區及與SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：66具有至少90%序列一致性之輕鏈可變區。
  9. 如申請專利範圍第1或6至8項中任一項之方法，其中該抗體與RSPO2特異性結合且包含SEQ ID NO：27之重鏈可變區及SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：66之輕鏈可變區。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該抗體與RSPO3特異性結合。
  11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該抗體與RSPO3特異性結合且包含：(a)重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含DYSIH(SEQ ID NO：37)，該重鏈CDR2包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：38)且該重鏈CDR3包含TYFANNFD(SEQ ID NO：39)；以及(b)輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：41)，該輕鏈CDR2包含AASNLES(SEQ ID NO：42)且該輕鏈CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：44)。
  12. 如申請專利範圍第1、10或11項中任一項之方法，其中該抗體與RSPO3特異性結合且包含與SEQ ID NO：46具有至少90%序列一致性之重鏈可變區及與SEQ ID NO：47具有至少90%序列一致性之輕鏈可變區。
  13. 如申請專利範圍第1或10至12項中任一項之方法，其中該抗體與RSPO3特異性結合且包含SEQ ID NO：46之重鏈可變區及SEQ ID NO：47之輕鏈可變區。
  14. 如申請專利範圍第1至13項中任一項之方法， 其中該抗體係重組抗體、單株抗體、嵌合抗體或雙特異性抗體。
  15. 如申請專利範圍第1至14項中任一項之方法，其中該抗體係人化抗體。
  16. 如申請專利範圍第1至14項中任一項之方法，其中該抗體係人抗體。
  17. 如申請專利範圍第1至16項中任一項之方法，其中該抗體係IgG1抗體。
  18. 如申請專利範圍第1至16項中任一項之方法，其中該抗體係IgG2抗體。
  19. 如申請專利範圍第1至16項中任一項之方法，其中該抗體係包含抗原結合部位之抗體片段。
  20. 如申請專利範圍第1至19項中任一項之方法，其包含投予至少一種額外治療劑。
  21. 如申請專利範圍第20項之方法，其中該額外治療劑係第二抗體。
  22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該第二抗體係與第二RSPO蛋白特異性結合之抗體。
  23. 如申請專利範圍第20項之方法，其中該額外治療劑係抗發炎劑。
  24. 一種治療或預防個體之纖維變性疾病之方法，其包含投予治療有效量之與人RSPO2特異性結合之抗體以及投予治療有效量之與人RSPO3特異性結合之抗體。
  25. 如申請專利範圍第1至24項中任一項之方法， 其中該纖維變性疾病係選自：肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、心纖維化及粘連(adhesions)。
  26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該纖維變性疾病係皮膚纖維化。
  27. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該皮膚纖維化係硬皮症、全身性硬化症、類硬皮症疾病、無皮膚硬化的硬皮症(sine scleroderma)、蟹足腫形成或肥厚性瘢痕形成。
  28. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該纖維變性疾病係腎纖維化。
  29. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該腎纖維化係慢性腎疾病。
  30. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該纖維變性疾病係肺纖維化。
  31. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該肺纖維化係自發性肺纖維化、間質性肺纖維化、肺纖維化、縱膈纖維化及胸膜纖維化。
  32. 如申請專利範圍第1至31項中任一項之方法，其中該抗體係經局部投予。
  33. 如申請專利範圍第1至32項中任一項之方法，其中該抗體係經皮下、肌肉內、外用(topically)或靜脈投予。
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