TW201625675A - 經調配之受體多肽及相關方法 - Google Patents

Abstract

本文揭示一種基於活化素受體IIB的組合物及相關使用方法，例如用於治療實體腫瘤。亦揭示製造化合物及調配物的方法。

Description

經調配之受體多肽及相關方法 相關申請案之交叉參考

本申請案主張2014年6月13日申請之美國臨時申請案第61/012,104號、2014年9月9日申請之美國臨時申請案第62/047,995號、2014年10月2日申請之美國臨時申請案第62/058,789號及2015年4月3日申請之美國臨時申請案第62/142,812號的權益；該等案中之每一者的整個揭示內容均以全文引用的方式併入本文中用於所有目的。

序列表

本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交 且其全部內容以引用的方式併入本文中。該ASCII複本於2015年6月10日產生，命名為29502PCT_CRF_sequencelisting.txt且大小為83,907個位元組。

轉型生長因子β(TGF-β)蛋白質家族包括轉型生長因子-β(TGF-β)、活化素、促骨骼形態形成的蛋白質(BMP)、神經生長因子(NGF)、大腦源神經營養因子(BDNF)及生長/分化因子(GDF)。此等家族成員涉及廣泛範圍之生物過程(包括細胞增殖、分化及其他功能)的調節。

生長/分化因子8(GDF-8)(亦稱為肌肉生長抑制素)為大多數情況下在正發育及成熟之骨骼肌組織之細胞中受到表現的TGF-ß家族成 員。肌肉生長抑制素似乎起著不利地控制骨骼肌生長的主要作用(McPherron等人，Nature(London)387,83-90(1997)；Zimmers等人，Science 296：1486-1488(2002))。拮抗肌肉生長抑制素已顯示可使動物的瘦肌肉質量增加。

TGF-β蛋白質家族中的另一成員為相關生長/分化因子：生長/分化因子11(GDF-11)。GDF-11與肌肉生長抑制素的胺基酸序列具有約90%的序列一致性。GDF-11在正發育之動物中具有軸向模式化的作用(Oh等人，Genes Dev 11：1812-26(1997))，且亦似乎在骨骼肌發育及生長中起作用。

活化素A、B及AB分別為兩種多肽鏈βA及βB的均二聚體及雜二聚體(Vale等人，Nature 321,776-779(1986)；Ling等人，Nature 321,779-782(1986))。最初發現活化素為涉及調節濾泡刺激性激素合成的性腺肽，且現咸信涉及多種生物活性的調節。活化素A為活化素的主要形式。

活化素、肌肉生長抑制素、GDF-11及TGF-β超家族中的其他成員經由活化素II型與活化素IIB型受體之組合來進行結合及傳導信號，活化素II型與活化素IIB型受體均為跨膜絲胺酸/蘇胺酸激酶(Harrison等人，J.Biol.Chem.279,28036-28044(2004))。交聯研究已確定，肌肉生長抑制素能夠活體外結合活化素II型受體ActRIIA及ActRIIB(Lee等人，PNAS USA 98：9306-11(2001))。亦有證據表明，GDF-11結合至ActRIIA與ActRIIB(Oh等人，Genes Dev 16：2749-54(2002))。

TGF-β蛋白質表現已知與多種疾病及病症有關。因此，能夠同時拮抗若干種TGF-β蛋白質的治療性分子可特別有效地治療此等疾病及病症。

相關申請案包括：2009年11月25日申請的美國申請案第12/626,375號；2008年3月5日申請的美國申請案第12/074,877號； 2011年12月19申請的美國申請案第13/329,897號；2006年10月31日申請的美國申請案第11/590,962號；2014年2月3日申請的PCT/US2014/014490；及2015年1月14日申請的PCT/US2015/011396；該等申請案各以全文引用的方式併入本文中用於所有目的。

本文揭示一種包含蛋白質、賦形劑、緩衝劑及界面活性劑之溶液的組合物，其中該組合物包含4-12之pH，其中該蛋白質包含能夠結合肌肉生長抑制素、活化素或GDF-11中之至少一者的多肽，視情況其中該多肽係選自由以下組成之群：(a)由列舉於由SEQ ID NO：4、6、12及14組成之群中的胺基酸序列組成的多肽；(b)與(a)具有至少90%序列一致性的多肽，且該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T；(c)與(a)具有至少95%序列一致性的多肽，其中該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T；及(d)序列與SEQ ID NO：2之胺基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽；且其中相對於時間段開始時(0月)的該組合物中之蛋白質或相對於相同蛋白質在-20℃或-70℃、在其他相同條件下保持大於1個月，該組合物中之蛋白質在溶液中在2-8℃或5℃保存時保持至少80%穩定性大於1個月之時間段；且視情況其中該組合物進一步包含化學治療劑或第二治療劑。

本文亦揭示一種抑制個體之實體腫瘤生長或治療個體之實體腫瘤的方法，其包含向該個體投與至少0.1mg/kg至20mg/kg範圍內之固定劑量的蛋白質，其中該蛋白質包含能夠結合肌肉生長抑制素、活化 素或GDF-11中之至少一者的多肽，視情況其中該多肽係選自由以下組成之群：(a)由列舉於由SEQ ID NO：4、6、12及14組成之群中的胺基酸序列組成的多肽；(b)與(a)具有至少90%序列一致性的多肽，且該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T；(c)與(a)具有至少95%序列一致性的多肽，其中該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T；及(d)序列與SEQ ID NO：2之胺基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的多肽。

本文亦揭示一種抑制、減輕或治療個體之惡病質的方法，其包含向該個體投與至少0.1mg/kg至20mg/kg範圍內之固定劑量的蛋白質，其中該蛋白質包含能夠結合肌肉生長抑制素、活化素或GDF-11中之至少一者的多肽，視情況其中該多肽係選自由以下組成之群：(a)由列舉於中由SEQ ID NO：4、6、12及14組成之群的胺基酸序列組成的多肽；(b)與(a)具有至少90%序列一致性的多肽，且該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T；(c)與(a)具有至少95%序列一致性的多肽，其中該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T，及(d)序列與SEQ ID NO：2之胺基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的多肽。

本文亦揭示一種治療個體之肥胖或肥胖相關性疾病、增加或維 持個體之肌肉質量或減少個體之脂肪質量的方法，其包含：向該個體投與有效劑量的抑制活化素、肌肉生長抑制素及GDF-11中之至少一者的蛋白質，視情況其中肥胖相關性疾病為遺傳性肥胖症候群、普拉德威利症候群(Prader willi syndrome)、下丘腦病症、家族性高膽固醇血症、巴德-畢德氏症候群(Bardet-Biedl syndrome)、普拉德-威利症候群(Prader-willi syndrome)、15q11-13上之印記基因缺失所致的症候群、艾爾斯通症候群(Alstrom syndrome)、柯亨症候群(Cohen syndrome)、艾爾伯拉特遺傳性骨營養不良(Albright's hereditary osteodystrophy)(假副甲狀腺低能症)、卡本特症候群(Carpenter syndrome)、MOMO症候群、魯賓斯坦-泰必症候群(Rubinstein-Taybi syndrome)；6q16、1p36、2q37及9q34中之至少一者缺失所致的症候群；染色體14之母源單親雙染色體症、脆弱X染色體症候群、動脈粥樣硬化、非酒精性脂肝炎、其中內臟脂肪沈積導致一或多種有害結果的疾病、腦血管疾病、脂肪肝及伯吉森-佛斯曼-萊曼症候群(Börjeson-Forssman-Lehman syndrome)，且視情況其中該多肽係選自由以下組成之群：(a)由列舉於由SEQ ID NO：4、6、12及14組成之群中的胺基酸序列組成的多肽；(b)與(a)具有至少90%序列一致性的多肽，且該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T；(c)與(a)具有至少95%序列一致性的多肽，其中該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T；及(d)序列與SEQ ID NO：2之胺基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的多肽。

本文亦揭示一種製備蛋白質的方法，該蛋白質包含能夠肌肉生 長抑制素、活化素或GDF-11中之至少一者的多肽，視情況其中該多肽係選自由以下組成之群：(a)由列舉於中由SEQ ID NO：4、6、12及14組成之群的胺基酸序列組成的多肽；(b)與(a)具有至少90%序列一致性的多肽，且該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T；(c)與(a)具有至少95%序列一致性的多肽，其中該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T，及(d)序列與SEQ ID NO：2之胺基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的多肽，其中該方法包含：在細胞培養液中培養經工程改造可表現該蛋白質的CS9中國倉鼠卵巢細胞株；自培養物中收穫該蛋白質；及純化該蛋白質。

此等及其他特徵、態樣及優點結合以下實施方式及附圖將變得更好理解，其中： 圖1顯示用於製備STM 434之細胞培養方法的概述。

圖2顯示STM 434之純化方法的概述。

圖3顯示製備及封裝STM 434的流程圖。

圖4顯示在投與以0.25mg/kg給予之STM 434之後，3位個體中有2者中的FSH含量降低。

圖5顯示人體中之STM 434的期中PK分析。

圖6顯示基線掃描，其中腫瘤以圓形指示。

圖7顯示第4循環開始時獲得的後續掃描，其中腫瘤再次以圓形指示。

組合物

本文描述一種包含穩定化人類活化素IIB受體(svActRIIB)多肽的經分離之蛋白質及相關調配物。蛋白質及多肽的特徵可為其能夠結合至三種TGF-β蛋白質(肌肉生長抑制素(GDF-8)、活化素A或GDF-11)中之至少一者以抑制此等蛋白質中之至少一者的活性且與其他ActRIIB可溶性受體相比視情況具有改良之可製造性特性。穩定化人類活化素IIB受體多肽的特徵可為相對於ActRIIB之胞外域，位置E28與S44均存在胺基酸取代，如SEQ ID NO：2中所示。在一個實施例中，穩定化人類活化素IIB受體多肽在相對於SEQ ID NO：2的位置64可具有丙胺酸之進一步取代。在一些態樣中，蛋白質為抗體、基於ActRIIB的蛋白質，及/或Fc融合蛋白。在一些態樣中，Fc融合蛋白為ActRIIB Fc融合蛋白。在一些態樣中，ActRIIB蛋白質包含與SEQ ID NO：2之胺基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的序列，視情況其中Fc為IgG，視情況其中IgG為人類IgG。在一些態樣中，ActRIIB蛋白質包含或其組成為SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10中所示序列。在一些態樣中，ActRIIB蛋白質包含與SEQ ID NO：6中所示序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的序列。在一些態樣中，ActRIIB蛋白質包含與SEQ ID NO：6中所示序列不同之處少於1-2、1、2、3、4或5個胺基酸的序列。在一些態樣中，蛋白質抑制活化素、肌肉生長抑制素及GDF-11中的至少兩者。 在一些態樣中，蛋白質抑制活化素、肌肉生長抑制素及GDF-11。在一些態樣中，蛋白質抑制活化素。

如本文所用，術語「TGF-β家族成員」或「TGF-β蛋白質」係指 包括活化素之轉型生長因子家族的結構相關生長因子，以及生長及分化因子(GDF)蛋白質(Kingsley等人，Genes Dev.8：133-146(1994)；McPherron等人，Growth factors and cytokines in health and disease，第1B卷，D.LeRoith及C.Bondy.編，JAI Press Inc.,Greenwich,Conn,USA：pp 357-393)。

GDF-8，亦稱為肌肉生長抑制素，為骨骼肌組織之負調節劑(McPherron等人，PNAS USA 94：12457-12461(1997))。肌肉生長抑制素經合成為長度約375個胺基酸的非活性蛋白質，人類之肌肉生長抑制素具有基因庫寄存編號：AAB86694。前驅蛋白藉由蛋白水解分裂而在四鹼基加工位點活化，產生N末端非活性前域與約109個胺基酸的C末端蛋白質，其二聚合而形成約25kDa之均二聚體。此均二聚體為成熟的生物活性蛋白質(Zimmers等人，Science 296,1486(2002))。

如本文所使用，術語「前域」或「前肽」係指經裂解而釋放活性C末端蛋白質的非活性N末端蛋白質。如本文所用，術語「肌肉生長抑制素」或「成熟肌肉生長抑制素」係指呈單體、二聚物或其他形式的成熟、生物活性C末端多肽，以及生物活性片段或相關多肽，包括對偶基因變異體、剪接變異體以及融合肽及多肽。已報導成熟肌肉生長抑制素在多種物種(包括人類、小鼠、雞、豬、火雞及大鼠)中具有100%序列一致性(Lee等人，PNAS 98,9306(2001))。

如本文所用，GDF-11係指具有Swissprot寄存編號O95390的BMP(促骨骼形態形成的蛋白質)，以及該蛋白質之變異體及物種同源物。GDF-11涉及軸向骨架之前/後模式化的調節(McPherron等人，Nature Genet.22(93)：260-264(1999)；Gamer等人，Dev.Biol.208(1),222-232(1999))，但出生後功能未知。

活化素A為多肽鏈βA之均二聚體。如本文所用，術語「活化素A」係指具有基因庫寄存編號：NM_002192的活化素蛋白質。活化素 A、B及AB分別為兩種多肽鏈βA及βB的均二聚體及雜二聚體。如本文所用，「活化素」係指活化素A、B及AB，以及該蛋白質之變異體及物種同源物。

受體多肽

如本文所用，術語活化素IIB型受體(ActRIIB)係指具有寄存編號NP_001097的人類活化素受體或其變異體，諸如位置64之精胺酸經丙胺酸取代的彼等受體。術語可溶性ActRIIB(野生型)係指ActRIIB之胞外域，例如SEQ ID NO：2之胺基酸1至134(具有信號序列)，或胺基酸19直至134(無信號序列)，或SEQ ID NO：2之胺基酸20、21、22、23、24或25直至134(無信號序列)。

穩定化受體多肽

本文亦提供一種經分離之蛋白質，其包含穩定化ActIIB受體多肽(在本文中稱為「svActRIIB多肽」)。如本文所用，術語「svActRIIB蛋白質」係指包含穩定化ActRIIB多肽的蛋白質。此等多肽及蛋白質的特徵為，除可製造性特徵改良之外，亦能夠結合及抑制活化素A、肌肉生長抑制素或GDF-11中任一者之活性。

穩定化ActRIIB多肽的特徵可為相對於SEQ ID NO：2的位置28與44均具有胺基酸取代。出於一致性，穩定化ActRIIB多肽及蛋白質上的胺基酸位置均相對於SEQ ID NO：2中的位置提及，不論多肽是否為成熟的或截短的。如本文所使用，術語「成熟」係指多肽或肽不具有其信號序列。如本文所使用，術語「截短」係指N末端胺基酸或C末端胺基酸已移除的多肽。

在一個實施例中，經分離之穩定化活化素IIB受體多肽(svActRIIB)具有SEQ ID NO：2中所示之多肽序列。在另一個實施例中，多肽具有SEQ ID NO：2之胺基酸19直至134中所示序列。在另一個實施例中，多肽具有SEQ ID NO：2之胺基酸23直至134中所示序 列。在另一個實施例中，多肽具有SEQ ID NO：2之胺基酸25直至134中所示序列。在另一個實施例中，多肽與上述多肽中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列。在一個實施例中，多肽能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11。在一個實施例中，經分離之穩定化活化素IIB受體多肽(svActRIIB)包含與SEQ ID NO：2之胺基酸19-24、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的序列。

在一個實施例中，經分離之穩定化活化素IIB受體多肽(svActRIIB)具有SEQ ID NO：2中所示之多肽序列，但位置28具有胺基酸取代且位置44具有胺基酸取代，其中位置28之取代係選自W或Y，且位置44之取代為T。在另一個實施例中，多肽具有SEQ ID NO：2之胺基酸19直至134中所示序列，但位置28具有胺基酸取代，且位置44具有胺基酸取代，其中位置28之取代係選自W或Y，且位置44之取代為T。在另一個實施例中，多肽具有SEQ ID NO：2之胺基酸23直至134中所示序列，但位置28具有胺基酸取代，且位置44具有胺基酸取代，其中位置28之取代係選自W或Y，且位置44之取代為T。在另一個實施例中，多肽具有SEQ ID NO：2之胺基酸25直至134中所示序列，但位置28具有胺基酸取代，且位置44具有胺基酸取代，其中位置28之取代係選自W或Y，且位置44之取代為T。在另一個實施例中，多肽具有與上述多肽中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列，其中多肽具有位置28之胺基酸取代及位置44之胺基酸取代，視情況其中位置28之取代係選自W或Y，且位置44之取代為T，且其中多肽能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11。在一個實施例中，上述多肽之位置28之取代為W， 且位置44之取代為T，其中多肽能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11。

在一個實施例中，svActRIIB多肽包括信號序列，例如SEQ ID NO：4、8、12及16中所示的序列。然而，可使用各種信號肽製備本申請案之多肽。信號肽可具有例如SEQ ID NO：4之胺基酸1至19中所示序列。可使用適用於表現svActRIIB多肽的任何其他信號肽。在其他實施例中，移除信號序列，得到成熟肽。缺乏信號序列之svActRIIB多肽之實例包括例如SEQ ID NO：6、10、14及18中所示的序列。

在一個實施例中，蛋白質包含穩定化活化素IIB受體多肽，其中多肽係選自由以下組成之群：具有由SEQ ID NO：4、6、12及14組成之群中所示序列的多肽。此等多肽代表SEQ ID NO：2之胺基酸25至134，其中多肽具有位置28之胺基酸取代及位置44之胺基酸取代，其中位置28之取代係選自W或Y，且位置44之取代為T，且其中多肽能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11，具有及不具有不同於SEQ ID NO：2中所示的信號序列。在另一個實施例中，蛋白質包含與SEQ ID NO：4、6、12或14具有至少80-100%、90-100%、85-95%、90-95%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的多肽，視情況其中多肽在位置28具有W或Y且在位置44具有T，且其中多肽能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11。在一個實施例中，位置28之取代為W且位置44之取代為T，其中多肽能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11。

在另一實施例中，svActRIIB蛋白質進一步包含異質蛋白質。在一個實施例中，異質蛋白質為Fc域。在另一實施例中，Fc域為人類IgG Fc域。在一個實施例中，蛋白質包含具有由SEQ ID NO：8、10、16及18組成之群中所示序列的多肽。在另一個實施例中，蛋白質包含與SEQ ID NO：8、10、16或18中所示之序列具有至少80-100%、90- 100%、85-95%、90-95%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的多肽，視情況其中多肽在位置28具有W或Y且在位置44具有T，且其中多肽能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11。在一個實施例中，位置28之取代為W且位置44之取代為T，其中多肽能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11。在某些態樣中，蛋白質包含或其組成為SEQ ID NO：10中所示的序列。在某些態樣中，序列發生糖基化。

在另一實施例中，svActRIIB蛋白質為實例中所述之STM 434。

在另一實施例中，蛋白質包含上述多肽中之任一者，其中位置64之胺基酸殘基為丙胺酸。

在另一個實施例中，術語svActRIIB多肽及蛋白質涵蓋包含SEQ ID NO：2、4、6、12及14之片段(包括N及C末端截短)的蛋白質，其中位置28為W或Y，且位置44為T，且其中多肽能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11。

如本文所用，術語svActRIIB多肽之「衍生物」係指連接至少一種其他化學部分或至少一種其他多肽而形成共價或聚集體結合物，諸如糖基、脂質、乙醯基，或C末端或N末端融合多肽；與PEG分子結合；及下文更充分描述的其他修飾。穩定化ActRIIB受體多肽亦可包括其他修飾及衍生物，包括由於在不同類型細胞(諸如哺乳動物細胞、大腸桿菌、酵母及其他重組宿主細胞)表現而由加工產生的C及N末端修飾。

svActRIIB蛋白質可進一步包含直接或經由連接子連接至svActRIIB多肽的異質多肽以形成融合蛋白。如本文所用，術語「融合蛋白」係指異質多肽與另一多肽(諸如svActRIIB)連接的蛋白質。異質多肽包括(但不限於)Fc多肽、his標記及白胺酸拉鏈域以促進穩定化ActRIIB多肽之寡聚及進一步穩定化，如例如WO 00/29581中所述， 該文獻以引用的方式併入本文中。在一個實施例中，異質多肽為Fc多肽或域。在一個實施例中，Fc域係選自人類IgG1 Fc(SEQ ID NO：23)、經修飾的IgG1 Fc、IgG2 Fc(SEQ ID NO：22)及IgG4 Fc(SEQ ID NO：24)域。SvActRIIB蛋白質可進一步包含IgG1、IgG2或IgG4之鉸鏈序列的全部或一部分。例示性svActRIIB多肽係選自由如SEQ ID NO：8、10、16及18中所示序列組成的多肽，以及與此等序列具有實質性相似度的彼等多肽，其中位置28及44之取代予以保留。如本文所用，「實質性相似度」係指與SEQ ID NO：8、10、16及18中之任一者至少80-100%、90-100%、85-95%、90-95%、80%一致、85%一致、90%一致、95%一致、96%一致、97%一致、98%一致、99%一致的序列，其中多肽保留位置28之W或Y及位置44之T，且其中多肽能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11。在一個實施例中，位置28之取代為W且位置44之取代為T，其中多肽能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11。

svActRIIB多肽可視情況進一步包含「連接子」。連接子主要用作多肽與第二異質多肽或其他類型融合物之間或兩種或超過兩種穩定化ActRIIB多肽之間的間隔子。在一個實施例中，連接子係由經肽鍵連接在一起的胺基酸組成，較佳由經肽鍵連接的1至20個胺基酸組成，其中胺基酸係選自20種天然存在之胺基酸。此等胺基酸中之一或多者可經糖基化，如熟習此項技術者所瞭解。在一個實施例中，1至20種胺基酸可選自甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸及離胺酸。在一個實施例中，連接子由大部分無空間位阻之胺基酸(諸如甘胺酸及丙胺酸)組成。例示性連接子為聚甘胺酸，特定言之，(Gly)₅(SEQ ID NO：51)、(Gly)₈(SEQ ID NO：52)、聚(Gly-Ala)及聚丙胺酸。 一種例示性適合連接子為(Gly)₄Ser(SEQ ID NO：25)。在另一實施例中，svActRIIB可包含「鉸鏈連接子」，其為鄰近於IgG之鉸鏈區或部 分鉸鏈區提供的連接子序列，如SEQ ID NO：27中所說明。鉸鏈序列包括IgG2Fc、IgG1Fc及IgG4Fc。

鉸鏈連接子序列亦可經設計以改良svActRIIB-Fc蛋白質的可製造性及穩定性。在一個實施例中，SEQ ID NO：27、38、40、42、44、45及46之鉸鏈連接子經設計以改良IgG2 Fc(SEQ ID NO：22)當連接至svActRIIB多肽時之可製造性。在一個實施例中，鉸鏈連接子序列經設計以便在svActRIIB多肽連接至人類IgG1 Fc(SEQ ID NO：23)或經修飾之人類IgG1 Fc時改良可製造性。

連接子亦可為非肽連接子。舉例而言，可使用烷基連接子，諸如-NH-(CH₂)s-C(O)-，其中s=2-20。此等烷基連接子可進一步經任何無空間位阻的基團取代，諸如低碳數烷基(例如C₁-C₆)、低碳數醯基、鹵素(例如Cl、Br)、CN、NH₂、苯基等。

本文揭示的svActRIIB多肽亦可連接至非多肽分子，用於賦予svActRIIB多肽所要特性之目的，諸如減少降解及/或延長半衰期、降低毒性、降低免疫原性及/或增強生物活性。例示性分子包括(但不限於)線性聚合物，諸如聚乙二醇(PEG)、聚離胺酸、聚葡萄糖、脂質、膽固醇族群(諸如類固醇)；碳水化合物，或寡醣分子。

svActRIIB蛋白質及多肽相較於其他ActRIIB可溶性多肽可具有改良的可製造性特性。如本文所使用，術語「可製造性」係指特定蛋白質在該蛋白質之重組表現及純化期間的穩定性。可製造性咸信歸因於分子在表現及純化之條件下的固有特性。改良之可製造性特徵之實例包括蛋白質之均一糖基化、增加之細胞效價、在蛋白質之重組產生期間的生長及蛋白質表現、改良之純化特性，及在低pH下改良的穩定性。相較於其他可溶性ActRIIB多肽，svActRIIB蛋白質及多肽展現改良的可製造性，以及活體外及活體內活性之保持。另外，其他鉸鏈連接子序列可帶來其他可製造性益處。

如本文所用，術語「svActRIIB多肽活性」或「可溶性ActRIIB多肽之生物活性」係指svActRIIB多肽的一或多種活體外或活體內活性。svActRIIB多肽活性包括(但不限於)結合至肌肉生長抑制素或活化素A或GDF-11的能力，及抑制或中和肌肉生長抑制素或活化素A或GDF-11之活性的能力。如本文所使用，術語「能夠結合」至肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11係指如藉由此項技術中已知之方法量測的結合，諸如KinExA^TM方法。肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11之活體外抑制可使用例如基於pMARE C2C12細胞的分析進行量測。 活體內活性係依據小鼠模型之瘦肌肉質量增加來證明。svActRIIB多肽及蛋白質之活體內活性包括(但不限於)體重增加、瘦肌肉質量增加，及瘦肌肉相對於脂肪質量之比率增加。治療活性進一步包括減輕或預防因某些腫瘤類型所致的惡病質、預防某些腫瘤類型的生長，及提高某些動物模型之存活率。下文提供svActRIIB蛋白質及多肽活性之進一步論述。

在另一態樣中，提供包含編碼svActRIIB多肽之聚核苷酸的經分離核酸分子。

在一個實施例中，聚核苷酸編碼具有SEQ ID NO：2中所示序列的多肽，但在位置28具有胺基酸取代且在位置44具有胺基酸取代，其中位置28之取代係選自W或Y，且位置44之取代為T。在另一個實施例中，聚核苷酸編碼具有SEQ ID NO：2之胺基酸19直至134中所示序列的多肽，但在位置28具有胺基酸取代且在位置44具有胺基酸取代，其中位置28之取代係選自W或Y，且位置44之取代為T。在另一個實施例中，聚核苷酸編碼具有SEQ ID NO：2之胺基酸23直至134中所示序列的多肽，但在位置28具有胺基酸取代且在位置44具有胺基酸取代，其中位置28之取代係選自W或Y，且位置44之取代為T。在另一個實施例中，聚核苷酸編碼具有SEQ ID NO：2之胺基酸25直至134中所示 序列的多肽，但在位置28具有胺基酸取代且在位置44具有胺基酸取代，其中位置28之取代係選自W或Y，且位置44之取代為T。在另一個實施例中，聚核苷酸編碼具有與上述多肽中之任一者至少80-100%、90-100%、85-95%、90-95%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽，其中多肽具有位置28之單一胺基酸取代及位置44之胺基酸取代，視情況其中位置28之取代係選自W或Y，且位置44之取代為T，且其中多肽能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11。在一個實施例中，上述實施例之聚核苷酸編碼其中位置28之取代為W且位置44之取代為T的多肽。

在一個實施例中，經分離核酸分子包含編碼多肽的聚核苷酸，該多肽具有由SEQ ID NO：4、6、12及14組成之群中所示序列。在另一個實施例中，核酸包含編碼多肽的聚核苷酸，該多肽與SEQ ID NO：4、6、12或14具有至少80-100%、90-100%、85-95%、90-95%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，視情況其中該多肽具有位置28之W或Y及位置44之T，且其中多肽能夠結合活化素A、GDF-11或肌肉生長抑制素。在一個實施例中，上述實施例之聚核苷酸編碼其中位置28之取代為W且位置44之取代為T的多肽，其中多肽能夠結合活化素A、GDF-11或肌肉生長抑制素。

在另一個實施例中，經分離核酸分子進一步包含編碼至少一種異質蛋白質的聚核苷酸。在一個實施例中，異質蛋白質為Fc域；在另一實施例中，Fc域為人類IgG Fc域。在另一個實施例中，核酸分子進一步包含編碼例如SEQ ID NO：25、27中所示之連接子及鉸鏈連接子的聚核苷酸。

在一個實施例中，核酸分子包含編碼多肽的聚核苷酸，該多肽由列舉於由SEQ ID NO：8、10、16及18組成之群的序列組成。在另一個實施例中，核酸包含編碼多肽的聚核苷酸，該多肽與由SEQ ID NO：8、10、16及18組成之群具有至少80-100%、90-100%、85-95%、90-95%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性，視情況其中多肽具有位置28之W或Y及位置44之T，且其中多肽能夠結合活化素A、GDF-11或肌肉生長抑制素。在一個實施例中，上述實施例之聚核苷酸編碼其中位置28之取代為W且位置44之取代為T的多肽，其中多肽能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11。

在一個實施例中，經分離核酸分子包含具有選自由SEQ ID NO：3、5、11或13組成之群之序列的聚核苷酸，或其補體。在另一個實施例中，經分離核酸分子包含具有選自由序列SEQ ID NO：7、9、15及17組成之群之序列的聚核苷酸，或其補體。在另一實施例中，經分離核酸分子在嚴格或中等條件下與SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15或17雜交，其中經編碼之多肽與SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16或18實質上相似，視情況其中多肽包含具有位置28之W或Y及位置44之T的胺基酸序列，且其中經編碼之多肽能夠結合或抑制活化素A、肌肉生長抑制素或GDF-11。

核酸分子包括DNA的單股形式與雙股形式，以及其RNA互補序列。DNA包括例如cDNA、基因組DNA、合成DNA、藉由PCR擴增的DNA，及其組合。基因組DNA可藉由習知技術分離，諸如使用SEQ ID NO：3、5、11或13之DNA或其適合片段作為探針。編碼ActRIIB多肽的基因組DNA獲自可用於多種物種的基因組文庫。合成DNA如下獲得：化學合成重疊寡核苷酸片段，隨後組裝片段以重建編碼區及側接序列的一部分或全部。RNA可獲自導引mRNA高量合成的原核生物表現載體，諸如使用T7啟動子及RNA聚合酶的載體。cDNA獲自利用自表現ActRIIB之各種組織分離之mRNA所製備的文庫。DNA分子包括全長基因以及聚核苷酸及其片段。全長基因亦可包括編碼N末端信號序列的序列。

亦提供上述核酸分子，其中聚核苷酸可操作地連接至轉錄或轉譯調節序列。

在另一態樣中，亦提供含有核酸分子及聚核苷酸的表現載體，且亦提供經此等載體轉型的宿主細胞，及產生svActRIIB多肽的方法。術語「表現載體」係指用於表現來自聚核苷酸序列之多肽的質體、噬菌體、病毒或載體。用於表現svActRIIB多肽的載體至少含有為載體擴增及表現所選殖插入所必需的序列。表現載體包含轉錄單元，該轉錄單元包含(1)對基因表現具有調節作用的基因元件，例如啟動子或增強子；(2)編碼svActRIIB多肽及蛋白質的序列，以轉錄成mRNA且轉譯成蛋白質；及(3)適當的轉錄起始及終止序列。此等序列可進一步包括選擇標記。適於宿主細胞中表現的載體容易獲得且核酸分子係使用標準重組DNA技術插入載體中。此等載體可包括在特定組織中發揮作用的啟動子，及用於在所靶向人類或動物細胞中表現svActRIIB多肽的病毒載體。適於表現svActRIIB的例示性表現載體為含有svActRIIB聚核苷酸的pDSRa(描述於WO 90/14363中，該文獻以引用的方式併入本文中)及其衍生物，以及此項技術中已知或下文描述的任何其他適合載體。

多肽

在一些實施例中，本文揭示的組合物包括與本文所揭示之胺基酸序列的一致性小於100%的多肽。在一些實施例中，多肽與本文所揭示之序列的一致性為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或在99%與100%之間相同。

在兩個或超過兩個胺基酸或核酸序列之情形下，術語「一致性百分比」係指當根據最大一致性進行比較且比對時，兩個或超過兩個序列或子序列具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基，如使用下述序列比較算法之一(例如BLASTP及BLASTN或熟悉此項技術者可獲 得之其他算法)或藉由目測所量測。視應用而定，一致性百分比可存在於所比較之序列區域，例如功能域，或者可替代地存在於待比較之兩個序列的全長上。

序列比較時，典型地，一個序列充當待與測試序列比較之參考序列。使用序列比較算法時，將測試及參考序列輸入電腦，必要時指定子序列座標，且指定序列算法程式參數。接著，序列比較算法根據所指定之程式參數來計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。

比較序列之最佳比對可例如藉由以下進行：Smith及Waterman,Adv.Appl.Math.2：482(1981)之局部同源性算法；Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.48：443(1970)之同源性比對算法；Pearson及Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)之相似性搜尋方法；此等算法之電腦化實施方式(Wisconsin Genetics套裝軟體中的GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.)；或目視檢查(一般參見Ausubel等人，見下文)。

適於測定序列一致性百分比及序列相似性之算法之一個實例為BLAST演算法，其描述於Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中。用於進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。

變異體

本文所述之組合物亦包含本文所述之多肽的變異體。如本文所使用，術語「變異體」係指一或多個胺基酸殘基插入、缺失或取代至原始胺基酸序列中且保留本文所述之多肽功能之至少一部分的多肽。 如本文所用，「變異體」之定義內包括多肽片段。應瞭解，任何指定 的肽或肽體可含有一種或兩種或全部三種類型的變異體。插入型及取代型變異體可含有天然胺基酸以及含有非天然存在之胺基酸或兩者。 變異體可包括例如含有前導序列或信號序列之多肽；具有其他胺基末端殘基(例如Met1或Lys 2)的多肽；具有表現標記(例如組胺酸標記)的多肽；及以融合蛋白形式表現之多肽。

本文所述之多肽變異體可包括胺基酸取代。20種習知(天然存在)之胺基酸之立體異構體(例如D-胺基酸)、非天然存在之胺基酸(諸如α-,α-二取代胺基酸)、N-烷基胺基酸、乳酸及其他非習知胺基酸亦可為本發明之多肽的適合組分。非天然存在之胺基酸之實例包括例如：胺基己二酸、β-丙胺酸、β-胺基丙酸、胺基丁酸、哌啶酸、胺基己酸、胺基庚酸、胺基異丁酸、胺基庚二酸、二胺基丁酸、鎖鏈素(desmosine)、二胺基庚二酸、二胺基丙酸、N-乙基甘胺酸、N-乙基天冬醯胺、羥基離胺酸、別羥基離胺酸、羥基脯胺酸、異鎖鏈素、別異白胺酸、N-甲基甘胺酸、肌胺酸、N-甲基異白胺酸、N-甲基纈胺酸、正纈胺酸、正白胺酸、鳥胺酸、4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸，及其他類似胺基酸及胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。

天然存在之殘基可根據共同的側鏈特性分類(重疊)：1)中性疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、Met、Phe；2)中性極性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Gly；3)酸性：Asp、Glu；4)鹼性：His、Lys、Arg；5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；及6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

經天然存在之胺基酸取代可為保守的或非保守的。保守性胺基酸取代包括用上述類別之一的一員交換同類別之其他成員。保守性變化可涵蓋非習知胺基酸殘基，其典型地藉由化學肽合成而非藉由在生物系統中合成來併入。此等非習知胺基酸殘基包括肽模擬物及胺基酸部分之其他逆轉或反轉形式。

製備方法

亦提供製備svActRIIB多肽的方法。可使用多種其他表現/宿主系統。此等系統包括(但不限於)微生物，諸如經重組噬菌體、質體或黏質體DNA表現載體轉型的細菌；經酵母表現載體轉型的酵母；感染有病毒表現載體(例如桿狀病毒)的昆蟲細胞；經病毒表現載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV；菸草花葉病毒，TMV)轉染或經細菌表現載體(例如Ti或pBR322質體)轉型的植物細胞系統；或動物細胞系統。適用於產生重組蛋白質的哺乳動物細胞包括(但不限於)VERO細胞、海拉細胞(HeLa cells)；中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株，或其衍生物，諸如生長於無血清培養基中的Veggie CHO及相關細胞株(參見Rasmussen等人，1998,Cytotechnology 28：31)或缺乏DHFR的CHO株系DX-B11(參見Urlaub等人，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-20)；COS細胞，諸如猴腎細胞之COS-7細胞株(ATCC CRL 1651)(參見Gluzman等人，1981,Cell 23：175)、W138、BHK、HepG2、3T3(ATCC CCL 163)、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、L細胞、C127細胞、BHK(ATCC CRL 10)細胞株、衍生自非洲綠猴腎細胞株CV1的CV1/EBNA細胞株(ATCC CCL 70)(參見McMahan等人，1991,EMBO J.10：2821)；人類胚腎細胞，諸如293、293 EBNA或MSR 293；人類表皮A431細胞；人類Colo205細胞；其他經轉型之靈長類動物細胞株；正常二倍體細胞；初始組織、初始外植體之活體外培養所產生的細胞株；HL-60、U937、HaK或傑卡特細胞(Jurkat cells)。哺乳動物表現允 許產生可自生長培養基中回收的分泌性或可溶性多肽。

使用適當的宿主載體系統，藉由在允許產生的條件下培養經含有核酸分子之表現載體轉型的宿主細胞來重組產生svActRIIB多肽。 可使用經轉型的細胞進行長期高產量多肽製備。一旦此等細胞經含有可選標記以及所要表現卡匣的載體轉型，則可允許細胞在所富集培養基中生長，隨後將所富集培養基交換為例如選擇性培養基。可選標記經設計以允許成功表現所引入序列之細胞生長及回收。穩定轉型之細胞的抗凝塊可使用適於所用細胞株之組織培養技術增殖。重組蛋白質表現之概述見於Methods of Enzymology,185版，Goeddell,D.V.，編，Academic Press(1990)。

在一些情況下，諸如在使用原核生物系統表現時，所表現的多肽可能需要「再摺疊」及氧化成適當的三級結構及產生二硫鍵以便具生物活性。再摺疊可使用此項技術中熟知的多種程序完成。此等方法包括例如使所溶解多肽在離液劑存在下暴露於通常高於7的pH。離液劑之選擇類似於包涵體增溶所用之選擇，然而離液劑典型地在較低濃度下使用。例示性離液劑為胍及尿素。在大多數情況下，再摺疊/氧化溶液亦將含有特定比率的還原劑及其氧化形式以產生特定氧化還原電位，從而允許發生二硫鍵改組以便形成半胱胺酸橋。一些常用氧化還原對包括半胱胺酸/胱胺、麩胱甘肽/二硫基雙GSH、氯化銅、二硫蘇糖醇DTT/二噻烷DTT，及2-巰基乙醇(bME)/二硫基-bME。在許多情況下，可使用共溶劑提高再摺疊效率。常用的共溶劑包括丙三醇、各種分子量之聚乙二醇，及精胺酸。

另外，多肽可根據習知技術、在溶液中或在固體載體上合成。 多種自動合成器可市購且可根據已知方案使用。參見例如Stewart及Young,Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical Co.(1984)；Tam等人，J Am Chem Soc,105：6442,(1983)；Merrifield, Science 232：341-347(1986)；Barany及Merrifield,The Peptides,Gross及Meienhofer編，Academic Press,New York,1-284；Barany等人，Int J Pep Protein Res,30：705-739(1987)。

多肽及蛋白質可根據熟習此項技術者熟知的蛋白質純化技術加以純化。此等技術包括在一種層面下對蛋白質及非蛋白質溶離份進行大致的分離。在肽、多肽與其他蛋白質已分離的情況下，可使用層析及電泳技術進一步純化所關注之肽或多肽以達成部分或完全純化(或純化至均質)。如本文所用，術語「分離多肽」或「純化多肽」意指可與其他組分分離的組合物，其中多肽相對於其天然可獲得狀態而言純化至任何程度。因此純化多肽亦指脫離其可天然存在於其中之環境的多肽。一般而言，「純化」係指已進行分離以移除多種其他組分的多肽組合物，該組合物實質上保持其所表現的生物活性。在使用術語「實質上純化」的情況下，此命名係指一種肽或多肽組合物，其中多肽或肽形成組合物之主要組分，諸如蛋白質在組合物中佔約50%、約60%、約70%、約80%、約85%或約90%或超過90%。術語分離可包括合成組分，諸如多肽。

適用於純化的多種技術將為熟習此項技術者所熟知。此等技術包括例如用硫酸銨進行沈澱、PEG、抗體(免疫沈澱)等；或進行熱變性、隨後離心；層析，諸如親和層析(蛋白質A管柱)、離子交換、凝膠過濾、逆相、羥磷灰石、疏水性相互作用層析；等電聚焦；凝膠電泳；及此等技術之組合。如此項技術中通常所知，咸信執行多個純化步驟之次序可改變，或可省略某些步驟，且仍不失為適用於製備實質上經純化之多肽的方法。例示性純化步驟提供於下文實例中。

熟習此項技術者根據本發明將獲知用於量化多肽之純化程度的多種方法。此等方法包括例如測定活性溶離份的特異性結合活性，或藉由SDS/PAGE分析來評估溶離份內的肽或多肽量。用於評估多肽溶 離份之純度的較佳方法為計算溶離份之結合活性，將其與初始萃取物之結合活性進行比較且由此計算純化程度，如本文中藉由「純化倍數」所評估。用於表示結合活性之量的實際單位當然取決於為追蹤純化所選擇的特定分析技術及多肽或肽是否展現可偵測的結合活性。

治療方法

亦提供用於活體內及活體外降低或中和肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11中之至少一者之量或活性的方法、蛋白質及組合物。 svActRIIB多肽對於肌肉生長抑制素、活化素A及GDF-11具有高結合親和力，且能夠降低且抑制肌肉生長抑制素、活化素A及GDF-11中之至少一者的生物活性。在一些態樣中，蛋白質為抗體或Fc融合蛋白。 在一些態樣中，Fc融合蛋白為ActRIIB Fc融合蛋白。在一些態樣中，ActRIIB Fc融合蛋白包含與SEQ ID NO：2之胺基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的序列，視情況其中Fc為IgG，視情況其中IgG為人類IgG。在一些態樣中，ActRIIB Fc融合蛋白包含或其組成為SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10中所示序列。在一些態樣中，蛋白質抑制活化素、肌肉生長抑制素及GDF-11中之至少兩者。 在一些態樣中，蛋白質抑制活化素、肌肉生長抑制素及GDF-11。在一些態樣中，蛋白質抑制活化素。

在一個態樣中，提供用於治療需要此治療之個體之肌肉生長抑制素相關病症及/或活化素A相關病症的方法及試劑，其係藉由向該個體投與有效劑量的svActRIIB組合物。如本文所用，術語「個體」係指任何動物，諸如哺乳動物，包括人類。

該等組合物適用於增加個體之瘦肌肉質量。該等組合物亦可適用於增加瘦肌肉質量相對於脂肪質量的比例，且因此降低脂肪質量佔 個體體重之百分比。

可藉由svActRIIB治療的病症包括(但不限於)多種形式的肌肉萎縮，以及代謝障礙，諸如糖尿病及相關病症，以及骨骼退化性疾病，諸如骨質疏鬆。

肌肉萎縮病症亦包括營養不良，諸如杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne's muscular dystrophy)、進行性肌肉萎縮症、貝克型肌肉萎縮症(Becker's type muscular dystrophy)、德傑林-郎都茲肌肉萎縮症(Dejerine-Landouzy muscular dystrophy)、厄伯氏肌肉萎縮症(Erb's muscular dystrophy)以及嬰兒神經軸索性肌肉萎縮症。其他肌肉萎縮病症來源於慢性疾病或病症，諸如肌肉萎縮性側索硬化、充血阻塞性肺病、癌症、AIDS、腎衰竭、器官萎縮、雄性激素去除及類風濕性關節炎。

肌肉生長抑制素及/或活化素之過度表現可導致惡病質(一種重度肌肉萎縮症候群)。惡病質由癌症產生且亦因類風濕性關節炎、糖尿病性腎病變、腎衰竭、化學療法、燒傷所致損傷以及其他原因而產生。在另一實例中，發現血清及肌肉內之肌肉生長抑制素免疫反應性蛋白質濃度在呈現AIDS相關性肌肉萎縮的男性中增加且與無脂肪質量逆相關(Gonzalez-Cadavid等人，PNAS USA 95：14938-14943(1998))。亦已顯示作為對燒傷損傷的反應，肌肉生長抑制素含量增加，導致分解代謝型肌肉作用(Lang等人，FASEB J 15,1807-1809(2001))。導致肌肉萎縮的其他病狀可起因於因失能所致的不活動(諸如輪椅限制)；因中風、疾病、脊索損傷、骨折或外傷所致之臥床休養延長；及微重力環境(太空飛行)下之肌肉萎縮。舉例而言，在臥床休養延長之後發現血漿肌肉生長抑制素免疫反應性蛋白質增加(Zachwieja等人，J Gravit Physiol.6(2)：11(1999)。亦發現，相較於未暴露之大鼠肌肉，在太空船飛行期間暴露於微重力環境之大鼠的肌肉顯 示肌肉生長抑制素量增加(Lalani等人，J.Endocrin 167(3)：417-28(2000))。

另外，脂肪與肌肉比率的年齡相關性增加，及年齡相關性肌肉萎縮似乎與肌肉生長抑制素相關。舉例而言，在年輕(19至35歲)、中年(36至75歲)及老年(76至92歲)男性及女性族群中，平均的血清肌肉生長抑制素免疫反應性蛋白質隨著年齡增長而增加，而此等族群中的平均肌肉質量及無脂肪質量隨著年齡增長而下降(Yarasheski等人，J Nutr Aging 6(5)：343-8(2002))。另外，現已發現肌肉生長抑制素在心肌中表現量較低且在梗塞之後，心肌細胞中的表現上調(Sharma等人，J Cell Physiol.180(1)：1-9(1999))。因此，降低心肌中的肌肉生長抑制素含量可使梗塞之後的心肌恢復改善。

肌肉生長抑制素似乎亦影響代謝障礙，包括2型糖尿病、非胰島素依賴性糖尿病、高血糖症及肥胖。舉例而言，缺乏肌肉生長抑制素已顯示可改善兩個小鼠模型之肥胖及糖尿病表現型(Yen等人，FASEB J.8：479(1994)。本發明之svActRIIB多肽適用於治療此等代謝障礙。 因此，投與組合物將改善適合個體之糖尿病\肥胖及高血糖病狀。另外，含有svActRIIB多肽的組合物可降低肥胖個體的攝食量。

投與穩定化ActRIIB多肽可提高骨骼強度且減少骨質疏鬆及其他退化性骨骼疾病。舉例而言，已發現，缺乏肌肉生長抑制素的小鼠顯示，在肌肉附著之區域處，小鼠肱骨之礦物質含量及密度增加及小樑骨與皮層骨之礦物質含量均增加，且肌肉質量增加(Hamrick等人，Calcif Tissue Int 71(1)：63-8(2002))。另外，在諸如用於治療例如前列腺癌之雄性激素去除療法的情況下，svActRIIBs可用於治療雄性激素去除的影響。

亦提供用於增加食用動物之肌肉質量的方法及組合物，其係藉由向該動物投與有效劑量的svActRIIB蛋白質來達成。由於成熟C末端 肌肉生長抑制素多肽在所測試的全部物種中類似或相同，因此預期svActRIIB多肽將會有效地增加任何農業上重要之物種(包括牛、雞、火雞及豬)的瘦肌肉質量及減少其脂肪。

在一些態樣中，本文揭示治療個體之肥胖或肥胖相關性疾病、增加其肌肉質量或減少其脂肪質量的方法，包含：向該個體投與有效劑量的抑制活化素、肌肉生長抑制素及GDF-11中之至少一者的蛋白質。

在一些態樣中，肥胖相關性疾病為以下中之至少一者：遺傳性肥胖症候群、普拉德威利症候群、下丘腦病症、家族性高膽固醇血症、巴德-畢德氏症候群、普拉德-威利症候群、15q11-13上之印記基因缺失所致的症候群、艾爾斯通症候群、柯亨症候群、艾爾伯拉特遺傳性骨營養不良(假副甲狀腺低能症)、卡本特症候群、MOMO症候群、魯賓斯坦-泰必症候群；6q16、1p36、2q37及9q34中之至少一者缺失所致的症候群；染色體14之母源單親雙染色體症、脆弱X染色體症候群、動脈粥樣硬化、非酒精性脂肝炎、內臟脂肪沈積導致一或多種有害結果的疾病、腦血管疾病、脂肪肝及伯吉森-佛斯曼-萊曼症候群。

在一些態樣中，個體為需要治療或投藥的人類個體。在一些態樣中，個體患有以下中之至少一者：遺傳性肥胖症候群、普拉德威利症候群、下丘腦病症、家族性高膽固醇血症、巴德-畢德氏症候群、普拉德-威利症候群、15q11-13上之印記基因缺失所致的症候群、艾爾斯通症候群、柯亨症候群、艾爾伯拉特遺傳性骨營養不良(假副甲狀腺低能症)、卡本特症候群、MOMO症候群、魯賓斯坦-泰必症候群；6q16、1p36、2q37及9q34中之至少一者缺失所致的症候群；染色體14之母源單親雙染色體症、脆弱X染色體症候群、動脈粥樣硬化、非酒精性脂肝炎、內臟脂肪沈積導致一或多種有害結果的疾病、腦血 管疾病、脂肪肝及伯吉森-佛斯曼-萊曼症候群。在一些態樣中，個體患有胰島素抗性、慢性腎病、癌症及分解代謝病狀中之至少一者。

在一些態樣中，蛋白質為抗體或Fc融合蛋白。在一些態樣中，Fc融合蛋白為ActRIIB Fc融合蛋白。在一些態樣中，ActRIIB Fc融合蛋白包含與SEQ ID NO：2之胺基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的序列，視情況其中Fc為IgG，視情況其中IgG為人類IgG。在一些態樣中，ActRIIB Fc融合蛋白包含或其組成為SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10中所示序列。在一些態樣中，蛋白質抑制活化素、肌肉生長抑制素及GDF-11中之至少兩者。在一些態樣中，蛋白質抑制活化素、肌肉生長抑制素及GDF-11。在一些態樣中，蛋白質抑制活化素。

在一些態樣中，本文揭示的方法降低總脂肪質量、皮下脂肪質量及內臟脂肪質量中之至少一者。在一些態樣中，本文揭示的方法使得內臟脂肪質量之降低百分比大於總脂肪質量之降低百分比。在一些態樣中，本文揭示的方法增加瘦體質量及四肢瘦體質量中之至少一者。在一些態樣中，本文揭示的方法使得瘦體質量及四肢瘦體質量中之至少一者增加至少1-50%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或超過50%。在一些態樣中，本文揭示的方法使得總脂肪質量、皮下脂肪質量及內臟脂肪質量中之至少一者降低至少1-99%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或超過99%。

svActRIIB多肽及組合物亦拮抗活化素A之活性，如下文活體外 分析中所示。活化素A已知表現於某些類型的癌症中，特定言之，性腺腫瘤，諸如卵巢癌，且導致重度惡病質。(Ciprano等人，Endocrinol 141(7)：2319-27(2000)；Shou等人，Endocrinol 138(11)：5000-5(1997)；Coerver等人，Mol Endocrinol 10(5)：534-43(1996)；Ito等人，British J Cancer 82(8)：1415-20(2000)；Lambert-Messerlian等人，Gynecologic Oncology 74：93-7(1999)。因此，本發明之組合物可用於治療與活化素A過度表現以及肌肉生長抑制素表現相關的病狀，諸如某些癌症所致的惡病質，及治療某些性腺型腫瘤。

另外，svActRIIB多肽適用於在多種分析中偵測及定量肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11。一般而言，穩定化ActRIIB多肽在多種分析中作為捕捉劑用於結合及固定肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11，類似於例如以下文獻中所述之彼等內容：Asai編，Methods in Cell Biology,37,Antibodies in Cell Biology,Academic Press,Inc.,New York(1993)。多肽可以一些方式標記或可與第三種分子反應，諸如經標記以使得肌肉生長抑制素能夠被偵測及定量的抗體。舉例而言，多肽或第三種分子可經修飾而具有可偵測部分，諸如生物素，其接著可被第四種分子(諸如酶標記的抗生蛋白鏈菌素，或其他蛋白質)結合。 (Akerstrom,J Immunol 135：2589(1985)；Chaubert,Mod Pathol 10：585(1997))。

在一些態樣中，本發明之組合物可用於治療諸如實體腫瘤之癌症。術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中典型地以不受調節之細胞生長為特徵的生理病狀。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤(包括神經管胚細胞瘤及視網膜母細胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤及滑膜細胞肉瘤)、神經內分泌腫瘤(包括類癌瘤、胃泌素瘤及胰島細胞癌)、間皮瘤、神經鞘瘤(包括聽神經瘤)、腦膜瘤、腺癌、黑色素瘤，及白血病或淋巴惡性疾病。此等癌症之更特定實例包 括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)；肺癌，包括小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌及肺鱗狀癌；腹膜癌、肝細胞癌、胃癌，包括胃腸癌；胰臟癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌(包括轉移性乳癌)、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎臟或腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖、睾丸癌、食道癌、膽道腫瘤以及頭頸癌。在一些態樣中，本發明之組合物可用於治療癌症，諸如此等癌症或卵巢癌(顆粒層細胞、透明細胞、漿液性、子宮內膜樣、生殖細胞腫瘤)、頭頸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胰臟癌、前列腺癌、小腸腫瘤、結腸癌、腎細胞癌、腺樣囊性癌症、胃癌、食道癌、鱗狀細胞癌(皮膚)、黑色素瘤、乳癌、膀胱癌、肝細胞癌及/或子宮癌(子宮內膜、子宮頸、平滑肌瘤、外陰、陰道癌症)。

本文所述之蛋白質及多肽的使用劑量可為0.1-10、0.25-5、1-3、0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、2、3、4、5或大於5mg/kg(包括此等值)。在一些態樣中，各劑量可每小於1-10、2-9、3-8、4-7、5-6、1、1、2、3、4、5、6、7、8或大於8週(包括此等值)投與。在一些態樣中，各劑量可每小於1-10、2-9、3-8、4-7、5-6、1、1、2、3、4、5、6、7天(包括此等值)投與。在一些態樣中，各劑量係靜脈內投與。在一些態樣中，向個體投與至少1-30、5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次劑量(包括此等值)。在一些態樣中，複數個劑量中之至少一者的量為至少0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg(包括此等值)。在一些態樣中，複數個劑量中之每一者的量為至少0.1-30、0.25-20、0.25-10、1-5、1-3、0.1-1、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19或20mg/kg(包括此等值)。在一些態樣中，各劑量至少每日、每週或每月投與。在一些態樣中，各劑量至少每1-30、5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天(包括此等值)投與。在一些態樣中，治療持續至少1-30、5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天；至少1-30、5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20週；或至少1-30、5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個月(包括此等值)。

在一些態樣中，可使用某些準則(諸如包含準則或排除準則)來選擇治療癌症的個體。

在一些態樣中，準則為包含準則。在一些態樣中，包含準則可包括：18歲的男性及停經後女性，存在組織學確診癌症的晚期實體腫瘤，至少一線先前標準療法(若可利用)失敗之後存在復發性轉移性或局部晚期疾病，使用實體腫瘤之反應評估標準(RECIST 1.1)可量測的疾病，東部腫瘤學合作組織(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)效能狀態0或1，在無其他人協助的情況下能夠行走至少30公尺(可允許使用輔助裝置，諸如手杖或助行架)，停經後女性自發性停經12個月，停經後女性自發性停經(FSH>40 IU/L)6個月，停經後女性之手術後雙側卵巢切除伴隨或不伴隨子宮切除術，先前使用基於鉑之化學療法治療，及/或有不能接受基於鉑之化學療法的記錄。

在一些態樣中，準則為排除準則。在一些態樣中，排除準則可包括：嚴重不受控制或未消退醫學病狀(諸如感染)限制方案順應性或 使個體暴露於極端風險；先前抗癌療法的毒性未消退，諸如運動或感覺神經病變，CTCAE(4.03版)級2，禿髮症除外；在開始治療6個月內胃腸出血的病史；存在QTcF>470msec；遺傳性延長QT間隔的病史，或妨礙評估QT間隔的任何心律不整(諸如束支傳導阻滯)、心肌梗塞、第1循環之6個月第1天內出現之不穩定絞痛，或紐約心臟協會充血性心臟衰竭II級；肝功能測試升高，包括總膽紅素>1.5×正常值上限(ULN；除非個體有文件證明吉伯氏疾病(Gilbert's disease))、天冬胺酸轉胺酶(AST)或丙胺酸轉胺酶(ALT)>3.0×ULN(對於已知有肝轉移的個體而言，AST或ALT>5×ULN)、肌酐>1.5×ULN及估計之肌酐清除率<60mL/min(使用科克羅夫特-高爾特方程式(Cockcroft-Gault equation))、血紅素<9g/dL；血小板<100×10⁹/L；絕對嗜中性白血球計數(ANC)<1.5×10⁹/L(在開始治療2週內無粒細胞群落刺激因子支持)，在開始治療8週內有大手術或在開始治療4週內有小手術，當前腸阻塞，腦轉移，存在需要頻繁(每週超過1次)醫學介入的腹水或胸膜積水；存在門靜脈分流裝置或廣泛肝切除(超過一個區段)病史，已知人類免疫缺乏病毒(HIV)感染，活動性B型或C型肝炎感染，開始治療4週內先用任何研究性產品治療，生育潛力之女性，或具有生育潛力之女性伴侶之男性，不願意使用非常有效的避孕方法(亦即造成每年懷孕機率小於1%的方法)(一貫地且正確地使用時，諸如植入物、可注射劑、組合的口服避孕藥、一些子宮內避孕裝置、禁慾或伴侶輸精管結紮)；對阿黴素鹽酸鹽(doxorubicin HCl)之習知調配物或脂質體阿黴素之組分有過敏反應；先前阿黴素鹽酸鹽之累積劑量>300mg/m²，或先前表柔比星(epirubicin)之累積劑量>500mg/m²，在開始治療28天內的減小的心臟射血分數小於正常值下限(根據MUGA掃描或超音波心電圖(ECHO))，及/或正哺乳的女性。

醫藥組合物及調配物

亦提供含有本文所揭示之蛋白質及多肽的醫藥組合物。在一些態樣中，蛋白質為抗體或Fc融合蛋白。在一些態樣中，Fc融合蛋白為ActRIIB Fc融合蛋白。在一些態樣中，ActRIIB Fc融合蛋白包含與SEQ ID NO：2之胺基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25直至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的序列，視情況其中Fc為IgG，視情況其中IgG為人類IgG。在一些態樣中，ActRIIB Fc融合蛋白包含或其組成為SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10中所示序列。在一些態樣中，蛋白質抑制活化素、肌肉生長抑制素及GDF-11中的至少兩者。在一些態樣中，蛋白質抑制活化素、肌肉生長抑制素及GDF-11。在一些態樣中，蛋白質抑制活化素。

此等組合物包含治療或預防有效量之多肽或蛋白質與醫藥學上可接受之物質及生理學上可接受之調配物質的混合物。醫藥組合物可含有用於調節、維持或保持例如組合物之pH、容積滲透濃度、黏度、透明度、顏色、等張性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或滲透的調配物質。適合的調配物質包括(但不限於)胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸)；抗菌劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽、其他有機酸)；增積劑(諸如甘露糖醇或甘胺酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；錯合劑(諸如咖啡鹼(caffeine)、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥基丙基-β-環糊精)；填充劑；單醣；雙醣及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑；調味及稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；成鹽相對離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如苯紮氯銨、苯甲酸、水楊 酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)；懸浮劑；界面活性劑或濕潤劑(諸如普朗尼克(pluronics)、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯，諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、曲拉通(triton)、緩血酸胺、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；穩定性增強劑(蔗糖或山梨糖醇)；張力增強劑(諸如鹼金屬鹵化物(較佳為氯化鈉或氯化鉀)、甘露糖醇、山梨糖醇)；遞送媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑。 (Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro編，Mack Publishing Company,1990)。

如本文所用，術語“緩衝劑”欲意謂使液體pH(其酸性或鹼性)穩定的物質。該術語如其在本文中所用，意指具有緩衝物質(諸如酸)與其共軛鹼處於平衡狀態的溶液。適用於本文所揭示之調配物中的例示性緩衝劑包括磷酸鉀緩衝劑。本發明之緩衝劑可包括之緩衝劑的例示性鹽形式包括例如鈉、鉀、鈣、有機胺基或鎂鹽。術語「緩衝劑」如其在本文中所用，亦意欲包括除磷酸鉀緩衝劑外的所有緩衝劑，其已為熟習此項技術者所熟知且適於聯合生物藥劑(諸如治療性多肽)使用。鑒於本文提供的教示及指導，熟習此項技術者應理解，除磷酸鉀緩衝劑外的緩衝劑同樣可在本發明之調配物中經取代以維持或增強治療性多肽的穩定性。此項技術中熟知的多種緩衝組分中之任一者可用於本發明之調配物中。此等緩衝組分包括例如乙酸、麩胺酸、丁二酸、丙酸、順丁烯二酸、葡糖酸鹽、組胺酸或其他胺基酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽，或其鹽形式。多種其他緩衝劑(包括例如其他有機酸)在此項技術中已熟知且可類似地用作本發明之調配物中的緩衝組分。鑒於本文提供的教示及指導，熟習此項技術者將瞭解到，在指定調配物之所要pH及調配物中所包括之賦形劑(若存在)的情況下，可選擇上述 緩衝組分或此項技術中熟知之其他組分中之任一者且用於本發明之調配物中。緩衝組分可以多種不同形式供應至緩衝系統。在一些態樣中，調配物可包括1-30、5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20或大於20mM緩衝劑(包括此等值)。

如本文所用，術語「賦形劑」欲意謂治療上的非活性物質。賦形劑可包括於調配物中用於多種目的，包括例如用作稀釋劑、媒劑、緩衝劑、穩定劑、張力劑、增積劑、界面活性劑、低溫保護劑、凍乾保護劑、抗氧化劑、金屬離子源、螯合劑及/或防腐劑。賦形劑包括例如多元醇，諸如山梨糖醇或甘露糖醇；糖，諸如蔗糖、乳糖或右旋糖；聚合物，諸如聚乙二醇；鹽，諸如NaCl、KCl或磷酸鈣；胺基酸，諸如甘胺酸、甲硫胺酸或麩胺酸；界面活性劑、金屬離子；緩衝鹽，諸如丙酸鹽、乙酸鹽或丁二酸鹽；防腐劑及多肽，諸如人類血清白蛋白；以及生理鹽水及水。本發明之特別適用賦形劑包括糖，包括糖醇、還原糖、非還原糖及糖酸。賦形劑在此項技術中已熟知且可發現描述於例如Wang W.,Int.J.Pharm.185：129-88(1999)及Wang W.,Int.J.Pharm.203：1-60(2000)。非還原糖含有變旋異構碳，其為縮醛且實質上不與胺基酸或多肽發生起始梅納反應(Maillard reaction)的反應。使斐林氏溶液(Fehling's solution)或托倫氏試劑(Tollen's reagent)還原的糖亦稱為還原糖。非還原糖之特定實例包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、蔗糖素(sucralose)、松三糖(melezitose)及棉子糖(raffinose)。緩衝賦形劑例如維持液體調配物之pH直至產品儲存期限且維持凍乾調配物在凍乾過程中及復原時之pH。一般而言，賦形劑可基於其使蛋白質穩定抵抗多種化學及物理應力的機制來選擇。

如本文所述，包括某些賦形劑為有益的，以便緩解特定應力的影響或調節特異性多肽的特定敏感性。包括其他賦形劑有益的原因在 於，其對蛋白質的物理及共價穩定性具有更普遍的作用。特別適用之賦形劑包括在化學上及功能上無害或與水性緩衝劑溶液及多肽相容的彼等物以便使調配物之穩定性特性最佳化。多種此等賦形劑在本文中描述為例示性賦形劑，其展現與本發明之水性調配物的化學相容性及與此等調配物中所包括之多肽的功能相容性。熟習此項技術者將瞭解，本文中關於所說明之賦形劑提供的教示及指導同樣適用於此項技術中熟知之廣泛範圍之其他賦形劑的使用。舉例而言，為增強或賦予調配物內之多肽之穩定性所選擇的最佳賦形劑包括實質上不與多肽上之官能基反應的彼等物。就此而言，還原糖與非還原糖均可用作本發明之調配物中的賦形劑。然而，由於還原糖含有半縮醛基團，因此其可與多肽之胺基酸側鏈上的胺基發生反應且形成加成物或其他修飾(亦即糖基化)。類似地，諸如檸檬酸鹽、丁二酸鹽或組胺酸之賦形劑亦可與胺基酸側鏈形成加合物。鑒於本文所提供之教示及指導，熟習此項技術者將瞭解，增大所指定多肽之穩定性的保持力可藉由選擇非還原糖而不是還原糖或其他胺基酸反應性賦形劑(諸如上文舉例說明的彼等物)來達成。亦根據本發明之水性調配物的投藥方式來選擇可增強或提供穩定作用的最佳賦形劑。舉例而言，當調配物之所有組分在製造、儲存及投藥期間時維持物理及化學穩定性時，靜脈內(IV)、皮下(SC)或肌內(IM)非經腸投藥途徑可更安全且有效。熟習此項技術者將瞭解，在，例如特定製造或儲存條件或特定投藥方式指定的情況下，使用一或多種賦形劑維持多肽活性形式的最大穩定性。本文中舉例說明用於調配物的賦形劑展現此等及其他特徵。

用於本發明之調配物中的賦形劑之量或濃度將根據例如以下而改變：調配物中所包括之多肽的量、所需調配物中所包括之其他賦形劑的量、是否需要或必需稀釋劑、調配物中之其他組分的量或體積、調配物內之各組分的總量、多肽之特異活性及所需張力或欲達成的重 量莫耳滲透濃度。賦形劑濃度之特定實例進一步舉例說明於下文中。 此外，不同類型之賦形劑可組合於調配物中。因此，本發明之調配物可含有賦形劑(兩種、三種或四種或超過四種不同類型之賦形劑)。就含有兩種或超過兩種不同多肽的調配物而言，賦形劑尤其可組合使用。賦形劑可展現類似或不同的化學特性。鑒於本文所提供之教示及指導，熟習此項技術者將瞭解到，任何特定調配物中可包括使得本發明調配物有助於多肽保持穩定性之量或範圍的賦形劑。舉例而言，本發明之調配物中所包括的鹽之量及類型可根據最終溶液之重量莫耳滲透濃度(亦即等張性、低張性或高張性)以及調配物中所包括之其他組分的量及重量莫耳滲透濃度來選擇。類似地，根據參照調配物中所包括之多元醇或糖的類型的舉例說明，此賦形劑之量將視其重量莫耳滲透濃度而定。包括約5%山梨糖醇可達成等張性，而達成等張性需要約9%蔗糖賦形劑。可包括於本發明之調配物內的一或多種賦形劑之量或濃度範圍的選擇已參照鹽、多元醇及糖舉例說明如上。然而，熟習此項技術者應理解，本文所述及進一步參照特定賦形劑舉例說明之考慮因素同樣適用於賦形劑之所有類型及組合，包括例如鹽、胺基酸、其他張力劑、界面活性劑、穩定劑、增積劑、低溫保護劑、凍乾保護劑、抗氧化劑、金屬離子、螯合劑及/或防腐劑。

本發明之調配物中可包括濃度範圍通常為約1-40%(w/v)、約5-35%(w/v)、約8-30%(w/v)、約8-25%(w/v)或濃度為約8%(w/v)的賦形劑。在某些情況下，本發明之調配物中亦可使用高達約45%(w/v)、50%(w/v)或大於50%(w/v)的濃度。舉例而言，在一些情況下，為了製備本發明之高張性調配物可能需要包括高達60%(w/v)或75%(w/v)的濃度。必要時，此等高張性溶液可在使用前稀釋以製備等張性調配物。其他適用的濃度範圍包括約1-20%，特定而言，約2-18%(w/v)，更特定而言，約4-16%(w/v)，甚至更特定而言，約6-14% (w/v)或約8-12%(w/v)，或約10%(w/v)。小於、大於或介於此等範圍之間的賦形劑濃度及/或量亦可用於本發明之調配物中。舉例而言，調配物中可包括佔小於約1%(w/v)的一或多種賦形劑。類似地，調配物可含有濃度大於約40%(w/v)的一或多種賦形劑。從而可製得含有實質上任何所需濃度或量之一或多種賦形劑的本發明調配物，此濃度或量包括例如1-30、5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20%(w/v)或大於20%(w/v)(包括此等值)。

本發明之調配物中的緩衝組分可包括一或多種賦形劑。如先前所述，所包括之賦形劑的一個作用為提供多肽抵抗應力的穩定作用，應力可在製造、裝運及儲存期間發生。為了實現此作用，至少一種賦形劑可充當緩衝劑、穩定劑、張力劑、增積劑、界面活性劑、冷凍保護劑、凍乾保護劑抗氧化劑、金屬離子源、螯合劑及/或防腐劑。此外，至少一種賦形劑亦可充當稀釋劑及/或媒劑或用於減小高濃度調配物的黏度以便達成其遞送及/或增強患者便利性。類似地，至少一種賦形劑另外可向本發明之調配物賦予超過一種上述功能。或者，本發明之調配物中可包括兩種或超過兩種賦形劑以執行超過一種上述或其他功能。舉例而言，賦形劑作為改變、調節或最佳化調配物之重量莫耳滲透濃度的組分包括於本發明之調配物中，從而充當張力劑。類似地，張力劑與界面活性劑均可包括於本發明之調配物中以調節重量莫耳滲透濃度與控制聚集。賦形劑、其用途、調配物及特徵在此項技術中已熟知且可發現描述於例如Wang W.,Int.J.Pharm.185：129-88(1999)及Wang W.,Int.J.Pharm.203：1-60(2000)。

液體調配物中所包括的張力劑及/或穩定劑可用於例如向調配物提供等張性、低張性或高張性，以使得其適於投藥。此等賦形劑亦可用於例如促進多肽結構之維持及/或最小化靜電性、溶液蛋白質-蛋白 質相互作用。張力劑及/或穩定劑之特定實例包括多元醇、鹽及/或胺基酸。凍乾調配物中所包括的張力劑及/或穩定劑可用作例如冷凍保護劑以保護多肽免受冷凍應力的影響或用作凍乾保護劑以使多肽在冷凍乾燥狀態下穩定化。此等冷凍保護劑及凍乾保護劑之特定實例包括多元醇、糖及聚合物。

如本文所使用，術語「界面活性劑」欲意謂作用為減小其溶解於其中之液體之表面張力的物質。調配物中可包括界面活性劑用於多種目的，包括例如防止或控制液體調配物中之聚集、顆粒形成及/或表面吸附，或防止或控制凍乾調配物在凍乾及/或復原過程中出現此等現象。界面活性劑包括例如部分溶解於有機溶劑與水溶液中的兩性有機化合物。界面活性劑之一般特徵包括其能夠減小水之表面張力、減小油與水之間的界面張力以及形成微胞。本發明之界面活性劑包括非離子及離子界面活性劑。界面活性劑在此項技術中已熟知且可發現描述於例如Randolph T.W.及Jones L.S.,Surfactant-protein interactions.Pharm Biotechnol.13：159-75(2002)。簡言之，非離子界面活性劑包括例如烷基聚(氧化乙烯)、烷基聚葡萄糖苷(諸如辛基葡糖苷及癸基麥芽糖苷)、脂肪醇(諸如鯨蠟基醇及油醇)、椰油醯胺MEA、椰油醯胺DEA及椰油醯胺TEA。非離子界面活性劑之特定實例包括聚山梨醇酯，包括例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81、聚山梨醇酯85及其類似物；泊洛沙姆，包括例如泊洛沙姆188(亦稱為聚羥亞烴(poloxalkol)或聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯))、泊洛沙姆407或聚乙烯-聚丙二醇及其類似物，及聚乙二醇(PEG)。聚山梨醇酯20與吐溫20(TWEEN 20)、脫水山梨糖醇單月桂酸酯及聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯同義。

可選擇本發明調配物中所包括的最佳界面活性劑，例如藉由防 止或減少聚集及/或吸附來增強或促進多肽保持穩定性。舉例而言，脫水山梨糖醇脂肪酸酯(諸如聚山梨醇酯)為展現廣泛範圍之親水性及乳化特徵的界面活性劑。其可個別地使用或與其他界面活性劑組合使用以滿足廣泛範圍之穩定化需要。此等特徵由於其可經定製以涵蓋多肽之廣泛範圍之疏水性及親水性特徵而特別適用於多肽。用於選擇界面活性劑的考慮因素包括先前參照賦形劑一般性所述的彼等因素以及界面活性劑之疏水性特徵及臨界微胞濃度。本文中舉例說明的界面活性劑以及此項技術中熟知的多種其他物可用於本發明之調配物中。

本發明調配物中的界面活性劑濃度範圍包括先前參照賦形劑一般性所述的彼等範圍，其中特別適用之濃度小於約1%(w/v)。就此而言，可使用之界面活性劑濃度的範圍通常為約0.0001-0.10%(w/v)，特定而言，約0.002-0.05%(w/v)，更特定而言，約0.003-0.01%(w/v)，甚至更特定而言，約0.004-0.008%(w/v)或約0.005-0.006%(w/v)。本發明之調配物亦可使用小於、大於或介於此等範圍之間的界面活性劑濃度及/或量。舉例而言，調配物中可包括佔小於約0.001%(w/v)的一或多種界面活性劑。類似地，調配物可含有濃度大於約0.10%(w/v)的一或多種界面活性劑。從而可製得含有基本上任何所要濃度或量之一或多種界面活性劑的本發明調配物，此濃度或量包括例如0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.010、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.10%(w/v)或超過0.10%(w/v)(包括此等值)。適用作本發明調配物中之賦形劑的多種界面活性劑先前已描述。適用於本發明之液體或凍乾調配物中的其他界面活性劑包括例如糖酯，諸如月桂酸酯(C12)、棕櫚酸酯(C16)、硬脂酸酯(C18)、聚乙二醇十六烷基十八烷基醚、聚乙二醇月桂基醚、聚乙二醇油基醚、聚乙二醇油酸酯、聚乙二醇硬脂酸酯、聚乙二醇甘油蓖麻油酸酯、聚乙二醇甘油羥基硬脂酸酯；烷基聚 葡萄糖苷，諸如辛基葡糖苷及癸基麥芽糖苷；脂肪醇，諸如鯨蠟基醇及油醇；及椰油醯胺，諸如椰油醯胺MEA、DEA、TEA；其他非離子界面活性劑及其他離子界面活性劑。

本發明之調配物(包括本發明之液體調配物)的穩定性係指調配物內之多肽之結構及/或功能的保持力。本發明之調配物中的多肽將展現影響穩定性或功能的特性，諸如對變化或變質的抗性，且因此隨時間之流逝維持一致的功能特徵。

本發明調配物中的緩衝組分亦可包括一或多種界面活性劑作為賦形劑。如先前所描述，本發明調配物中之界面活性劑的一種作用為防止或最小化聚集及/或吸附，諸如表面誘發性降解。在足夠的濃度下(通常約為界面活性劑的臨界微胞濃度)，界面活性劑分子之表層用以防止蛋白質分子在界面吸附。從而最小化表面誘發性降解。界面活性劑、其用途、調配物及調配物特徵在此項技術中已熟知且可發現描述於例如Randolph及Jones，同上(2002)中。

在另一個實施例中，本發明調配物內之多肽的穩定性包括例如物理及/或化學穩定性之保持。多肽穩定性可如下評估：例如測定多肽是否已經歷物理降解及/或化學降解路徑，諸如先前所述的彼等降解路徑，包括其結構之化學修飾。本發明調配物中之多肽穩定性的保持包括例如相較於多肽在初始時間點的穩定性，或相對於在低溫(例如-70攝氏度)下所保存的相同對照物，物理或化學穩定性保持約80-100%、85-99%、90-98%、92-96%或94-95%。因此，本發明之調配物內之多肽的穩定性包括相較於多肽在初始時間點的穩定性，相對於在低溫(例如-70攝氏度)下所保存的相同對照物，穩定性保持大於99.5%、至少約99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%或80%(包括此等值)。

在另一實施例中，本發明調配物內之多肽的穩定性包括例如保持活性。多肽活性可使用例如指示多肽功能的活體外、活體內及/或原位分析來評估。本發明調配物內之多肽穩定性保持包括例如活性保持約50-100%或超過100%，此視分析之可變性而定。舉例而言，穩定性保持可包括相較於多肽在初始時間點的活性，活性保持約60-90%或70-80%。因此，本發明調配物內之多肽穩定性包括相較於多肽在初始時間點的活性，活性保持至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%且可包括活性量測值大於100%，諸如105%、110%、115%、120%、125%或150%或超過150%(包括此等值)。一般而言，初始時間點選為本發明調配物中之多肽最初製備之時間或最初檢查品質(亦即滿足合格規格)的時間。初始時間點亦可包括將本發明調配物中之多肽再調配的時間。再調配可在例如濃度高於、低於或同於初始製劑的情況下進行。

本發明之調配物可經製備而與參考溶液或流體(亦即血清)具等張性。等張性溶液中所溶解之溶質的量實質上類似於其周圍物質以使得其具有滲透穩定性。除非明確與特定溶液或流體比較，否則本文中例示性參照人類血清使用等張或等張性(例如300mOsmol/kg)。因此，本發明之等張性調配物含有濃度與人類血液實質上類似的溶質或展現與人類血液實質上類似的滲透壓。一般而言，等張性溶液含有濃度與用於人類及多種其他哺乳動物之標準生理鹽水大約相同的溶質，標準生理鹽水為含有約0.9wt%(0.009g/ml)鹽的水溶液(例如0.009g/ml NaCl)。本發明之調配物亦可包括低張性或高張性溶液製劑。

最佳醫藥組合物將由熟習此項技術者根據例如預定投藥途徑、遞送形式及所要劑量而確定。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，同上。該等組合物可影響多肽之物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。舉例而言，適合組合物可為非經腸投 與的注射用水(生理鹽水溶液)。離子界面活性劑包括例如陰離子、陽離子及兩性離子界面活性劑。陰離子界面活性劑包括例如基於磺酸鹽或基於羧酸鹽的界面活性劑，諸如肥皂、脂肪酸鹽、十二烷基硫酸鈉(SDS)、月桂基硫酸銨及其他烷基硫酸鹽。陽離子界面活性劑包括例如基於四級銨的界面活性劑，諸如溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)、其他烷基三甲基銨鹽、氯化十六烷基吡錠、聚乙氧基化動物脂胺(POEA)及苯紮氯銨(benzalkonium chloride)。兩性離子或兩性界面活性劑包括例如十二烷基甜菜鹼、十二烷基二甲胺氧化物、椰油醯胺基丙基甜菜鹼及椰油基兩性甘胺酸鹽。

醫藥組合物中之主要媒劑或載劑可實質上具有水性或非水性。 舉例而言，適合的媒劑或載劑可為注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊髓液，其中可能補充有供非經腸投與之組合物中所常見之其他物質。中性緩衝生理鹽水或與血清白蛋白混合之生理鹽水為另外的例示性媒劑。其他例示性醫藥組合物包含Tris緩衝劑或乙酸鹽緩衝劑，其可進一步包括山梨糖醇或其適合的替代物。在一個實施例中，可藉由將具有所要純度的所選組合物與視情況選用之調配劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，同上)混合而製得呈凍乾餅或水溶液形式的組合物。另外，治療性組合物可使用適當賦形劑(諸如蔗糖)調配為凍乾物。

調配物可以多種方法遞送，例如吸入療法、經口或注射。當涵蓋非經腸投藥時，治療組合物可呈無熱原質、非經腸可接受之水溶液形式，其包含所要多肽於醫藥學上可接受之媒劑中。尤其適用於非經腸注射之媒劑為無菌蒸餾水，多肽於其中調配成經適當防腐之無菌等張性溶液。又一種製備可包括用諸如以下媒介物調配所要分子：可注射微球、生物可侵蝕顆粒、聚合物化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠粒或脂質體，從而得到控制或持續釋放的產物，其接著可經由儲槽式注 射劑遞送。亦可使用玻糖醛酸，且其可具有在循環中促進持續作用的作用。用於引入所要分子的其他適合方式包括可植入的藥物遞送裝置。

在另一態樣中，適用於可注射投藥的醫藥調配物可調配於水溶液中，較佳調配於生理上相容的緩衝液中，諸如漢克氏溶液(Hanks' solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理性緩衝生理鹽水。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或聚葡萄糖。另外，適當時可將活性化合物之懸浮液製備成油性注射懸浮液。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯；或脂質體。亦可使用非脂質聚陽離子胺基聚合物遞送。視情況而言，懸浮液亦可含有適合穩定劑或提高化合物溶解性之試劑且允許製備高濃度溶液。在另一個實施例中，醫藥組合物可經調配用於吸入。亦可用推進劑調配吸入溶液以供氣溶膠遞送。在又另一個實施例中，溶液可霧化。肺部投藥進一步描述於PCT申請案第PCT/US94/001875號中，其描述經化學修飾之蛋白質之肺部遞送。

在一些態樣中，蛋白質可調配為無菌水溶液，其含有50-100、60-80、65-75、60-70、70-80、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80mg/mL蛋白質；1-30、5-20、5-10、10-20、15-20、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20或大於20mM磷酸鉀緩衝劑；小於1-10、5-10、5、5、6、7、8、8.8、9、10或大於10%(w/v)蔗糖及/或小於0.006、0.006或大於0.006%(w/v)聚山梨醇酯20，pH 4-12、5-6、5-7、6-7、5、6、6.7、7或8(包括此等值)。在一些態樣中，蛋白質可調配為含有蛋白質、磷酸鉀緩衝劑、蔗糖及/或聚山梨醇酯20的無菌水溶液。在一些態樣中，蛋白質可用磷酸鉀緩衝 劑、蔗糖及/或聚山梨醇酯20調配。在一些態樣中，蛋白質可經調配用於靜脈內投藥。在一些態樣中，蛋白質可在中性pH下調配。在一些態樣中，蛋白質可在約pH 4-12、5-6、5-7、6-7、5、6、6.7、7或8(包括此等值)下調配。在一些態樣中，本文所述之蛋白質可用非天然存在之組分(諸如非天然存在之賦形劑)調配。

亦預期某些調配物可經口投與。在一個實施例中，以此方式投與之分子可用或不用混配固體劑型(諸如錠劑及膠囊)所常用之彼等載劑來調配。舉例而言，膠囊可經設計以使調配物之活性部分在胃腸道之某處釋放，此時生物可用性最大化且到達全身前的降解最小化。可包括促進治療性分子吸收的其他藥劑。亦可使用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。經口投與的醫藥組合物亦可使用此項技術中熟知之醫藥學上可接受之載劑調配成適於經口投與的劑型。此等載劑使得醫藥組合物能夠調配成錠劑、丸劑、糖衣藥丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液以及其類似物，以便患者攝入。

經口使用的醫藥製劑可如下獲得：合併活性化合物與固體賦形劑且加工所得顆粒混合物(視情況在研磨之後)以獲得錠劑或糖衣藥丸核心。必要時可添加適合助劑。適合賦形劑包括碳水化合物或蛋白質填充劑，諸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇及山梨糖醇；玉米、小麥、稻穀、馬鈴薯或其他植物之澱粉；纖維素，諸如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉；樹膠，包括阿拉伯膠及黃蓍膠；及蛋白質，諸如明膠及膠原蛋白。必要時，可添加崩解劑或增溶劑，諸如交聯聚乙烯吡咯啶酮、瓊脂及海藻酸或其鹽，諸如海藻酸鈉。

糖衣藥丸核心可結合適合包衣一起使用，諸如濃縮的糖溶液，其亦可含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯啶酮、卡波莫凝膠(carbopol gel)、聚乙二醇，及/或二氧化鈦、漆溶液及適合有機溶劑或溶劑混合 物。可將染料或顏料添加至錠劑或糖衣藥丸包衣中以鑑別或表徵活性劑之量，亦即劑量。

可經口使用之醫藥製劑亦包括由明膠製成之配合插入式膠囊以及由明膠及包衣(諸如甘油或山梨糖醇)製成之密封軟膠囊。配合插入式膠囊可含有活性成分與填充劑或黏合劑(諸如乳糖或澱粉)、潤滑劑(諸如滑石或硬脂酸鎂)及視情況存在之穩定劑的混合物。在軟膠囊中，活性化合物在穩定劑存在或不存在下可溶解或懸浮於適合液體中，諸如脂肪油、液體或液體聚乙二醇。

對於熟習此項技術者而言，其他醫藥組合物將為顯而易見的，包括在持續或控制遞送型調配物中包含多肽的調配物。用於調配多種其他持續或控制遞送工具(諸如脂質體載劑)、生物可侵蝕微粒或多孔珠粒及儲槽式注射劑的技術亦為熟習此項技術者所知。參見例如PCT/US93/00829，其描述用於遞送醫藥組合物之多孔聚合物微粒之控制釋放。持續釋放型製劑之其他實例包括半滲透聚合物基質的成形物件形式，例如薄膜，或微膠囊。持續釋放型基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳酸交酯(U.S.3,773,919、EP 58,481)、L-麩胺酸與L-麩胺酸γ乙基酯(Sidman等人，Biopolymers,22：547-556(1983)、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙基酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.,15：167-277,(1981)；Langer等人，Chem.Tech.,12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。持續釋放型組合物亦包括可藉由此項技術中已知之若干方法中之任一者製備的脂質體。參見例如Eppstein等人，PNAS(USA),82：3688(1985)；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949。

待用於活體內投與之醫藥組合物典型地必須為無菌的。此可藉由無菌過濾膜過濾來完成。在凍乾組合物的情況下，可在凍乾及復原之前或之後使用此方法進行滅菌。非經腸投與之組合物可以凍乾形式 儲存或儲存於溶液中。另外，非經腸組合物通常置放於具有無菌接取孔之容器中，例如具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。

一旦醫藥組合物已調配，即可將其以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或脫水或凍乾粉末形式儲存於無菌小瓶中。此等調配物可以即用形式或需要在投與前復原之形式(例如凍乾形式)儲存。

在一個特定實施例中，提供用於產生依劑量投藥單元的套組。套組可各含有具有乾燥蛋白質之第一容器及具有含水調配物之第二容器。本發明之範疇內亦包括含有單室及多室預填充注射器(例如液體注射器及冷凍乾燥物注射器)之套組。

治療上使用的醫藥組合物之有效量將根據例如治療情形及目標而定。熟習此項技術者應瞭解，適用於治療之劑量水準將部分地根據以下而變化：所遞送之分子、所用多肽所針對之適應症、投藥途徑及患者之體型(體重、體表面或器官大小)及狀況(年齡及總體健康狀況)。因此，臨床醫師可滴定劑量且修改投藥途徑以獲得最佳治療作用。典型劑量可在約0.1mg/kg至高達約100mg/kg或超過100mg/kg之範圍內，此視上述因素而定。多肽組合物較佳可靜脈內(IV)注射或投與。視特定調配物之半衰期及清除速率而定，長效醫藥組合物可每三至四天、每週或每兩週投與。給藥頻率將視所用調配物中之多肽的藥物動力學參數而定。典型地，投與組合物直至達到達成所需作用之劑量。組合物因此可隨時間以單次劑量或以多次劑量(濃度/劑量相同或不同)投與，或以連續輸注形式投與。通常對適當劑量作出進一步改進。適當劑量可經由使用適當的劑量反應資料來確定。

本文所述之蛋白質及多肽的使用劑量可為0.1-10、0.1-5、0.25-5、0.25-3、1-3、0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、2、3、4、5或大於5mg/kg(包括此等值)。在一些態樣 中，各劑量可每小於1-10、2-8、2-5、1-4、1、1、2、3、4、5、6、7、8或大於8週(包括此等值)投與。在一些態樣中，各劑量可每小於1-10、2-8、2-5、1-4、1、1、2、3、4、5、6、7天(包括此等值)投與。在一些態樣中，各劑量係靜脈內投與。

醫藥組合物之投藥途徑係根據已知方法，例如經口；經由靜脈內、腹膜內、腦內(實質內)、腦室內、肌肉內、眼內、動脈內、門靜脈內、病灶內途徑注射；髓內、鞘內、室內、經皮、皮下或腹膜內；以及鼻內、腸內、局部、舌下、尿道、陰道或直腸方式；藉由持續釋放系統或藉由植入裝置。需要時，可藉由快速注射或連續輸注或藉由植入裝置投與組合物。或者或另外，組合物可經由已吸收或囊封所需分子之膜、海綿或另一種適當材料的植入來局部投與。在使用植入裝置的情況下，可將裝置植入任何適合的組織或器官內，且所需分子可經由擴散、定時釋放型藥團或連續投藥來遞送。

在一些情況下，svActRIIB多肽可藉由使用諸如本文所述之彼等方法之方法植入已經基因工程改造之某些細胞來遞送，以表現及分泌多肽。此等細胞可為動物或人類細胞，且可為自體、異質或異種細胞。視情況，細胞可為不朽化細胞。為了減小免疫反應的機率，可將細胞囊封以避免浸潤周圍組織。囊封材料典型地為生物相容性、半滲透性聚合物外殼或膜，其容許多肽產物釋放，但防止患者免疫系統或來自周圍組織之其他有害因子摧毀該等細胞。

亦設想活體內svActRIIB基因療法，其中將編碼svActRIIB或svActRIIB衍生物的核酸分子直接引入個體中。舉例而言，編碼svActRIIB的核酸序列使用或不使用適當遞送載體(諸如腺相關病毒載體)、經由核酸構築體之局部注射而引入靶細胞中。替代病毒載體包括(但不限於)逆轉錄病毒、腺病毒、單純性疱疹病毒及乳頭狀瘤病毒載體。病毒載體之身體內傳遞可藉由局部注射所需核酸構築體或含有 所需核酸序列的其他適當遞送載體、脂質體介導之傳遞、直接注射(裸DNA)或微粒轟擊(基因槍)來活體內達成。

本發明之組合物可單獨或與其他治療劑組合使用，例如以增強其治療作用或減少潛在副作用。在一些態樣中，阿黴素可組合投與。 在一些態樣中，阿黴素為脂質體阿黴素。在一些態樣中，阿黴素係以40mg/m²給予。在一些態樣中，阿黴素係以5-200、10-150、25-100、30-50、35-45、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mg/m²(包括此等值)給予。

本發明之調配物亦可包括調配物中之多肽組合。舉例而言，本發明之調配物可包括用於治療一或多種病狀的多肽。本發明之調配物亦可包括兩種或超過兩種不同多肽。本發明調配物中之多種多肽的用途可針對例如相同或不同的適應症。類似地，多種多肽在本發明之調配物中可用於治療例如病理性病狀與初始療法所致的一或多種副作用。多種多肽亦可包括於本發明之調配物中以實現不同的醫學目的，包括例如同時治療及監測病理性病狀之進展。多種並行療法(諸如上文舉例說明的彼等療法)以及此項技術中熟知的其他組合由於調配物對於一些或全部所提療法及/或診斷可為足夠的而特別適用於患者順應性。熟習此項技術者將瞭解可根據廣泛範圍之組合療法混合的彼等多肽。類似地，本發明之調配物亦可聯合小分子醫藥劑及一或多種多肽與一或多種小分子醫藥劑之組合使用。因此，本發明提供含有1-10、2-5、1、2、3、4、5或6種或超過6種不同多肽的本發明調配物且提供一或多種多肽與一或多種小分子醫藥劑之組合。

本發明之調配物亦可包括此項技術中熟知的一或多種防腐劑及/或添加劑。類似地，本發明之調配物可進一步調配成多種已知遞送調配物中之任一者。舉例而言，本發明之調配物可包括潤滑劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑(諸如甲基苯甲酸鹽及丙基羥基苯甲酸鹽)、甜味 劑及調味劑。此等視情況存在之組分、其化學及功能特徵在此項技術中已熟知。類似地，在投藥之後促進多肽快速、持續或延遲釋放的調配物在此項技術中已熟知。本發明之調配物可經製備而包括此項技術中熟知的此等或其他調配物組分。

本發明之調配物亦可製備成例如除含水液體外的狀態。舉例而言，製備成凍乾調配物。凍乾調配物通常含有例如增積劑或結塊劑及非晶形穩定劑。

一旦本發明之調配物如本文所述製備，則調配物內所含之一或多種多肽的穩定性可使用此項技術中熟知之方法評估。若干此等方法在下文實例中進一步舉例說明且包括尺寸排阻層析及顆粒計數。多種功能分析(包括例如結合活性、其他生物化學活性及/或生理學活性)中之任一者可在兩個或超過兩個不同的時間點評估以測定本發明之緩衝調配物中之多肽的穩定性。

本發明之調配物通常根據醫藥標準且使用醫藥級試劑製備。類似地，本發明之調配物通常使用無菌試劑在無菌製造環境下製備或在製備之後滅菌。無菌可注射溶液可使用此項技術中熟知的程序製備，包括例如將所需量之一或多種多肽與本文所述之調配物組分之一或組合合併於本發明之乙酸、麩胺酸或丁二酸緩衝劑或賦形劑中，隨後進行滅菌微過濾。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的特定實施例中，特別適用之製備方法包括例如真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，如先前所描述。此等乾燥方法將由先前無菌過濾的溶液產生一或多種多肽與任何其他所需組分之粉末。

套組

本文中亦描述套組，其包含含有本文所揭示之蛋白質之小瓶及使用說明書。蛋白質可於如本文所述之任何適合醫藥組合物中，例如適於靜脈內輸注之液體懸浮液。或者，蛋白質可呈適於在使用前再懸 浮之凍乾狀態。使用說明書可包括儲存說明、患者選擇、劑量、投藥方法、使用時間段、臨床終點及其類似說明。在一些態樣中，說明書包括執行本文所揭示方法的說明。

必須指出，除非文中另有明確規定，否則本說明書及隨附申請專利範圍中所使用單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數指示物。

實例

下文為特定實施例之實例。提供實例僅為說明之目的，且不欲以任何方式限制本發明之範疇。已盡力以確保所用數字(例如量、溫度等)的精確性，但一些實驗誤差及偏差當然應為允許的。

除非另外指明，否則本發明可使用此項技術之技能範圍內的蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學之習知方法實施。此等技術充分解釋於文獻中。參見例如T.E.Creighton,Proteins：Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,current addition)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick及N.Kaplan編，Academic Press,Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton,Pennsylvania：Mack Publishing Company,1990)；Carey及Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)A及B卷(1992)。

實例1：STM 434之表現及純化。 細胞培養方法

STM 434原料藥係由無血清的CS9中國倉鼠卵巢細胞株表現。STM 434之序列顯示於SEQ ID NO：10中，其中STM 434為SEQ ID NO：10中所示序列之均二聚體。

表現STM 434之主細胞庫(MCB)的產生命名為AMG 434 MCB。 接種擴增及細胞培養製備係使用不具有動物源原材料的化學成分確定之培養基。細胞培養方法之細節(包括過程控制)描述如下，其中方法以圖形描繪於圖1中。某些參數包括藉由蛋白質A HPLC、Q-PCR測定的產物濃度，以便偵測污染物MMV DNA、細菌內毒素、黴漿菌、外來病毒，及總好氧性微生物計數。另外，預先製造兩批(批次0010039909及0010039910)，由CMC Biologics進一步處理為經調配的批量原料藥(批次13-0066及13-0067)。

解凍及初始擴增(階段N-7至N-4)

將一個小瓶的AMG 434 MCB解凍，且將內容物轉移至含有59±1mL生長培養基IMX 5.0、含有300nM甲胺喋呤(MTX)及100μg/L胰島素樣生長因子1(IGF-1)的250mL振盪燒瓶中，預溫熱至36.0±1.0℃。 所接種的振盪燒瓶接著在36.0±1.0℃、在5% CO₂氛圍中、使用通氣帽及攪拌、在155±5轉數/分鐘(rpm)下培育72±12小時。分析細胞培養物之後，如圖1中所定義，將細胞培養物的一部分接種至500mL振盪燒瓶中之預溫熱生長培養基中直至目標體積為120mL及目標密度為4×10⁵個細胞/毫升。振盪燒瓶在如上所述的相同條件下培育72±12小時。分析細胞培養物之後，將細胞培養物的一部分接種至1L振盪燒瓶中之預溫熱生長培養基中直至目標體積為240mL及目標密度為4×10⁵個細胞/毫升，且振盪燒瓶在如上所述的相同條件下培育72±12小時。

對1L燒瓶中之細胞培養物進行分析之後，使用此細胞培養物接種兩個含有預溫熱生長培養基的2L振盪燒瓶，各燒瓶的目標體積為600mL及目標密度為4×10⁵個細胞/毫升。兩個振盪燒瓶均使用通氣帽及150-160rpm攪拌、在36.0±1.0℃、在5% CO₂氛圍中培育72±12小時。2L燒瓶培育完成時，分析各燒瓶中的樣品(圖1)，隨後將兩個燒瓶的內容物合併。量測合併池之細胞密度，且接著將合併池接種至10 L玻璃轉移容器中之預溫熱生長培養基中直至5L之目標及4×10⁵個細胞/毫升之目標密度。此培養物在方法之下一步驟之前在90±5rpm下持續混合，下一步驟的起始時間相距合併時間小於90分鐘。

中間接種系列(階段N-3至N-1)

N-3中間接種系列階段係在50L Wave生物反應袋(GE Healthcare)中進行。使Wave袋膨脹之後，將合併的5L細胞培養物轉移至袋中。在表1中所列的條件下起始培育。每天牽拉樣品且如圖1中所述分析。第3天，在評估活細胞密度及存活率百分比(最小值分別為1.6×10⁶個細胞/毫升及90%)之後，經由Opticap XL03無菌過濾器(Millipore)將含有300nM MTX及100μg/L IGF-1的生長培養基IMX 5.0轉移至Wave袋中以達成4×10⁵個細胞/毫升之細胞密度。此塊團饋入之後的總細胞培養物體積通常為20-25L。培育在相同條件(表1)下持續超過3天，每天取樣用於分析，如圖1中所述。收穫之前，預期活細胞密度及存活率分別滿足不小於1.6×10⁶個細胞/毫升及90%之準則。

第二及第三中間接種系列階段(N-2及N-1)分別在60L及300L生物反應器中進行。轉移45.0±1.0L擴增培養基(含有100μg/L IGF-1且不含有MTX的IMX 5.0)之後，依據表2中所述之參數設定生物反應器。生物反應器接著接種達成4×10⁵個細胞/毫升之起始細胞密度所需之體積(在±3%範圍內)的最終Wave袋細胞培養物。60L生物反應器之內容物根據表2中所述之條件培育3天。每天取樣用於分析，如圖1中 所述。在培育期間，自動添加1.0M碳酸鈉以控制pH。收穫之前，預期活細胞密度及存活率分別滿足不小於2.0×10⁶個細胞/毫升及90%之準則。

一旦60L生物反應器培育完成，則藉由轉移245.0±2.0L擴增培養基至生物反應器中且依據表3中所述之參數對其進行設定來製備用於接種的300L生物反應器。生物反應器接著接種達成4×10⁵個細胞/毫升之起始細胞密度所需之體積(在±3%範圍內)的最終60L生物反應器培養物。300L生物反應器內容物根據表3中所述之條件培育3天。每天取樣用於分析，如圖1中所述。在培育期間，自動添加1.0M碳酸鈉以控制pH。收穫之前，預期活細胞密度及存活率分別滿足不小於2.3×10⁶個細胞/毫升及90%之準則。

製備型生物反應器

STM 434之上游處理中的最終製備型生物反應器具有2000L之標稱容量。為了起始此製備階段，將1100.0±5.0L製備型培養基ABM025-004(一種化學上限定的培養基，其包括定製的組分及表4中所發現的配方)裝入生物反應器中。接著依據表5中所定義的參數來設定生物反應器以準備用於接種。生物反應器接著接種達成5×10⁵個細 胞/毫升之起始細胞密度所需之體積(在±3%範圍內)的最終300L生物反應器培養物。2000L生物反應器內容物根據表5中所述之條件培育11天。在培育期間，自動添加1.0M碳酸鈉以控制pH。在製備型生物反應器運作之第3、6及8天，利用8%之初始培養物製得產生培養基AFM028-001之塊團饋料(表4)。每天將1%聚二甲矽氧烷(100公克之量)溶液作為消泡劑添加至生物反應器中。如圖1中所述，每天取樣用於分析，包括塊團饋入AFM028-001之前及之後的樣品。若葡萄糖濃度下降低於4.0g/L，則添加50%葡萄糖溶液以使得生物反應器中的濃度達成8g/L。此方法步驟之製程內測試描述於表13中。

細胞培養收穫物澄清及過濾

在製備型生物反應器運作結束時，在已取樣之後，將生物反應器冷卻至10-15℃，壓力調節至8.0-12.0psig。輸送管線置放於2000L生物反應器與CSC-20盤式堆疊離心機(Westfalia)之間，且輸出管線自離心機至離心分離液收集槽。量測生物反應器內容物之血球容積比，且此值用於測定發射間距值，發射間距值以及如圖1中所示的其他參數包括於離心機之程式設計中。開啟生物反應器與離心機之間的管線，且起始離心。一旦完成離心，則沖洗離心機筒，且將產物排放至具有25mM Tris、100mM氯化鈉pH 7.4(經Tris緩衝的生理鹽水；TBS)的離心分離液收集槽中。離心操作參數概述於表6中。

離心操作之後，經由並聯的2個過濾器對收穫池進行深度過濾。 各系列中的第一過濾器為Sartopore 2 0.2μm Maxicap濾芯(Sartorius；1.2m²膜面積)用於滅菌式深度過濾。第二過濾器為Zeta Plus Maximizer 120ZA膜盒(Cuno；1.84m²膜面積)用於降低核酸含量之目的。過濾器用TBS沖洗之後，離心分離液收集槽之內容物根據表7中所示的條件、經由過濾器系列抽吸至濾液收集槽中。一旦離心分離液完全轉移，則添加220L TBS至離心分離液收集槽中，隨後經由各過濾器系列推入濾液收集槽中。過濾方法係藉由推動空氣通過各過濾器系列、將液體收集於濾液收集槽中來完成。過濾結束時，以避免發泡 的方式使濾液池混合。濾液池在2-8℃保持不超過72小時，取樣以便根據表13分析。

純化方法

STM 434下游純化方法包括三個管柱層析步驟：低pH病毒不活化步驟、病毒過濾步驟及使用切向流過濾的最終調配步驟。此方法中的所有步驟均在環境溫度下進行，除特別指明者之外。圖2描繪STM 434純化方法。各細胞培養運作時，進行純化方法之運作。STM 434原料藥之最終配方為10mM磷酸鉀、8.8%(w/v)蔗糖、0.006%(w/v)聚山梨醇酯20(pH 6.7)，靶蛋白濃度為70mg/mL。純化方法包括使用兩種模型病毒(xMuLV及MMV)的兩種穩定正交方法用於病毒清除。

蛋白質A層析

蛋白質A層析經由蛋白質A對Fc域的親和力而用於捕捉抗體及Fc融合蛋白，諸如STM 434。STM 434純化方法係使用MabSelect SuRe蛋白質A樹脂(GE Healthcare)。除潛在病毒之外，蛋白質A親和純化步驟使宿主細胞蛋白質及DNA大幅度減少。蛋白質A層析步驟之操作參數描述於表8中。在兩次cGMP純化運作中，使用樹脂體積為39.3L的管柱。根據20g/L負載密度，蛋白質A步驟循環運作，循環數目及各循環中所負載之澄清細胞培養收穫物的體積係依據兩個生物反應器運作中之每一者之最終澄清收穫物中之STM 434之總質量來測定。

藉由平衡緩衝液(TBS)沖洗來製備用於處理的蛋白質A管柱。澄 清細胞培養收穫物之第一塊團加載至管柱上，隨後用最少80L之平衡緩衝液洗滌管柱。管柱接著用最少160L 25mM Tris、500mM氯化鈣pH 7.5洗滌。引入此步驟，以使得宿主細胞DNA得到額外的清除。管柱接著用最少120L平衡緩衝液洗滌以移除任何殘餘氯化鈣。接著使用100mM乙酸鈉pH 3.6自管柱溶離STM 434。基於管柱排出物之吸光度的收集標準提供於表8中。溶離合併物保存於在2-8℃維持的儲槽中。溶離步驟之後，用最少120L的100mM磷酸將管柱洗淨。重複此循環直至所有的澄清細胞培養收穫物耗盡。完成最後循環之後，管柱用最少40L的平衡緩衝液沖洗，隨後用最少120L的300mM氫氧化鈉沖洗以使樹脂再生。運作之間期，管柱於2%苯甲醇、50mM檸檬酸鹽pH 5.0中儲存。經由此單元操作收集多個樣品，如表13中所述。

低pH病毒不活化

經由使用低pH對合併的蛋白質A合併物進行病毒不活化。使合併物達成20±2℃之溫度，隨後藉由緩慢添加10%(v/v)乙酸來將其調節至pH 3.6±0.1。經滴定的合併物在低pH下保持60-90分鐘。不活化期之後，藉由緩慢添加2.0M Tris鹼而將合併物調節至pH 5.0±0.1。

接著使病毒不活化合併物通過包括三種不同類型之過濾器的過濾器系列。第一過濾器為Millistak+HC Pod(Millipore；1.1m²薄膜面積)，其移除可在酸處理期間形成的顆粒。系列中之第二過濾器為Sartobind Q(Sartorius；1.98m²薄膜面積)，其中並聯排列有三個30吋膜盒。此離子交換器用以進一步減少核酸及其他帶負電的雜質。最後過濾器為Express SHC Opticap XL 10 0.5μm/0.2μm膜盒(Millipore； 049m²薄膜面積)。過濾係在不超過6.6公升/分鐘的流速下進行。經過濾的病毒不活化合併物(FVIP)收集於儲槽中。當預過濾病毒不活化合併物靠近其保存容器之底部時，用最少40L的50mM乙酸鈉、70mM氯化鈉pH 5.0將剩餘部分溶離至FVIP收集槽中。經由此單元操作收集多個FVIP樣品，如表13中所述。

在最初的兩次cGMP運作中，FVIP(稱為原料藥中間物(DSI))儲存於無菌的20L Flexboy袋(Sartorius)中，且在-30℃將其保存。將第一批DSI(批號0010039909)的一部分儲存於聚碳酸酯瓶中且在-30℃儲存，充當評估長期儲存對產物品質之潛在影響的穩定性樣品。24個月及35個月穩定性研究的結果指示，在-30℃儲存35個月之DSI的品質在整個儲存期得以保持，且DSI可用於評價經由Demo DS批次製造之cGMP原料藥的適用性。

陽離子交換層析

使用陽離子交換層析(CEX)進一步處理STM 434 DSI；此步驟係使用EMD Fractogel SO3樹脂(Merck)、以流過方式進行。除其他潛在雜質之外，開發此步驟係用於減少宿主細胞DNA及蛋白質，且亦顯示能夠增加STM 434之較高度唾液酸化形式之量。CEX步驟之操作參數描述於表9中。在兩次cGMP純化運作中，使用堆積樹脂高度為21.5cm、對應管柱體積為33.6L的管柱。根據75-125g/L之負載密度範圍，循環運作CEX步驟。

起始層析操作之前，冷凍的STM 434 DSI在2-8℃靜態地解凍4-6天，隨後在環境溫度下儲存隔夜。如下製備供使用的CEX管柱：首先使最少三個管柱體積(CV)之50mM乙酸鈉、500mM氯化鈉pH 5.0流過，隨後使最少三個CV的50mM乙酸鈉、70mM氯化鈉pH 5.0流過。接著將解凍的STM 434 DSI加載至管柱上。在兩次cGMP純化運作中，將總體積不同的STM 434 DSI加載至CEX管柱上，各批次來自不 同的上游程序運作。第一次運作中之STM 434 DSI批次0010039909的總體積為260.6L(22 Flexboys)，STM 434總質量為2907公克。第二次運作中之STM 434 DSI批次0010039910的總體積為294L(25 Flexboys)，STM 434總質量為3376公克。

當UV吸光度在280nm達到0.50±0.1 OD時，藉由切換通過無菌過濾器流向無菌收集袋的溶離液流速來開始收集含有產物的溶離液。將所有DSI加載至管柱上之後，接著用50mM乙酸鈉pH 5.0洗滌CEX管柱。持續收集含有產物的溶離液(CEX合併物)直至280nm下的UV吸光度達到0.50±0.1 OD。切換回至50mM乙酸鈉、500mM氯化鈉pH 5.0之前，使最少三個CV的洗滌緩衝液流過管柱以洗淨管柱，隨後使用最少三個CV的0.5N氫氧化鈉對管柱進行衛生處理，隨後使用最少三個CV的0.1N氫氧化鈉用於儲存管柱。對CEX合併物進行無菌取樣用於製程內測試，如表13中所述，且在環境溫度下保存隔夜。

疏水性相互作用層析

對STM 434 CEX合併物進行疏水性相互作用層析(HIC)；此步驟係使用苯基瓊脂糖FF High Sub樹脂(GE Healthcare)、以流過方式進行。開發此步驟用於減少產物聚集物及其他潛在的製程雜質。HIC步驟之操作參數描述於表10中。在兩次cGMP純化運作中，使用堆積樹脂高度為27.0cm、對應管柱體積為42.2L的管柱。根據50g/L之最大負荷密度，HIC步驟係以每批兩個循環進行。

藉由用由750mM硫酸鈉、250mM乙酸鈉、69.5mM Tris鹼pH 10.5組成的稀釋緩衝液調節合併物來製備用於HIC步驟的CEX合併物。調節比率為每四份CEX合併物一份稀釋緩衝液。將經調節之CEX合併物混合的同時，藉由使最少三個CV的150mM硫酸鈉、50mM乙酸鈉pH 5.5流過來使HIC管柱平衡。一旦滿足管柱排出物之初始pH及電導率(如表10中所註明)，則將經調節之CEX合併物(HIC負載)的一半加載至管柱上。當280nm下的UV吸光度達到0.2±0.1 OD時，藉由切換流向收集袋的溶離液流速來開始收集含有產物的溶離液(HIC合併物)。將全部HIC負載加載至管柱上之後，接著用150mM硫酸鈉、50mM乙酸鈉pH 5.5洗滌HIC管柱。繼續收集HIC合併物直至280nm下的UV吸光度達到1.50±0.1 OD，此時將排出模式切換回為廢棄物收集。 抽吸最少三個CV的洗滌緩衝液通過管柱，隨後抽吸最少三個CV的0.5N氫氧化鈉以洗淨管柱。接著用最少三個CV的WFI洗滌管柱以完成第一循環。在再生步驟期間，將第一循環HIC合併物混合以確保均一性且接著經由無菌過濾器轉移至無菌生物處理袋中。

WFI管柱洗滌一經完成，則重複HIC平衡程序，隨後對HIC負載之剩餘一半進行HIC加工，如上文所述。將第二循環HIC合併物混合且接著經由無菌過濾器轉移至容納第一循環HIC合併物的生物處理袋中。合併之HIC合併物在環境溫度下保持以便儲存隔夜。0.5N氫氧化鈉洗淨管柱之後，藉由抽吸最少三個CV通過管柱而將HIC管柱儲存於0.1N氫氧化鈉中。如表13中所述，收集多個樣品用於製程內測試。

病毒過濾

合併之HIC合併物經由Planova 20N過濾器(Asahi Kasei Bioprocess；4.0m²薄膜面積)、以正交病毒減少步驟過濾。在處理含有產物的合併物之前，使用13.5-14.0psig之入口壓力對過濾器進行洩漏測試。通過洩漏測試後，將0.2μm Sartopore 2膜盒(Sartorius；0.2m²薄膜面積)安裝於病毒過濾器上游，且此系統根據表11中所列的參數、藉由用40kg±2kg 150mM硫酸鈉、50mM乙酸鈉pH 5.5沖洗來平衡。混合且取樣之後，以12±2psig之目標壓力抽吸合併之HIC合併物通過病毒過濾器。經由使過濾器系列直接連接至無菌生物處理袋來收集病毒濾液。一旦合併之HIC合併物過濾完成，則使用不少於16kg的150mM硫酸鈉、50mM乙酸鈉pH 5.5自過濾器及輸送管線中溶離殘餘產物。運作完成之後，對0.2μm過濾器進行完整性測試(使用泡點測試)，且病毒過濾器用最少16L的0.25N氫氧化鈉、0.5%(v/v)Triton X-100、隨後用最少32L的WFI來沖洗。此等沖洗之後，對病毒過濾器進行金粒子測試，以確保孔徑分佈，隨後進行使用後洩漏測試。將病毒濾液轉移至在無再循環空氣的設備以及專用空氣操縱單元中具有最高正壓力的後病毒套件中，且在環境溫度下保持。如表13中所述，收集用於製程內測試的樣品。

藉由切向流過濾進行的超濾/透濾

經由使用切向流過濾(TFF)而對STM 434病毒濾液進行超濾(UF)及透濾(DF)以相對於原料藥的最終調配物來達成原料藥的緩衝-交換 及濃縮。使用兩種關鍵溶液來獲得經調配的批量原料藥。此等溶液為：(1)10mM磷酸鉀、8.8%(w/v)蔗糖，pH 6.7，及(2)1%(w/v)Tween-20(聚山梨醇酯20)。此等溶液係依需製備。

在TFF步驟中，根據400±50g/m²之目標負載，使用四個Pellicon 3 Ultracel TFF薄膜(Millipore；10kDa標稱分子量限值；各1.14m²薄膜面積)處理循環中之全部病毒濾液。新薄膜用WFI沖洗直至滯留物電導率低於其設定點，如表12中所述，隨後用0.5N氫氧化鈉沖洗，直至滲透物沖洗體積達到40L之最小值。初始薄膜沖洗之後，且在經由所用薄膜之TFF處理開始時，用WFI自系統沖洗掉鹼直至滯留物及滲透物電導率低於其設定點(表12)。執行過濾器完整性測試(使用標準化水滲透性測試)之後，藉由抽吸最少40L之0.5N氫氧化鈉通過系統來進行消毒，其中消毒溶液在系統中保持1-24小時。消毒之後，TFF系統再次用WFI沖洗，直至滯留物及滲透物電導率低於其設定點(表12)，且滯留物沖洗體積達到40L之最小值。

為了起始STM 434病毒濾液處理，系統用10mM磷酸鉀、8.8%(w/v)蔗糖pH 6.7平衡。一旦滯留物及滲透物pH達到pH 6.5-6.9之目標範圍(其中滲透物沖洗體積不小於20L)，則平衡完成。混合病毒濾液且自滯留物容器之上部及下部取樣以量測蛋白質濃度，確保完全混合且蛋白質/表面積比率滿足其目標(表12)。接著藉由UF起始蛋白質濃縮，其中調節饋料流速以達成20±5psig之跨膜壓力。當達到對應於60g/L蛋白質濃度的滯留物體積時，自滯留物容器之上部及下部獲取滯留物樣品以確認蛋白質濃度。滯留物接著相對於10個透濾體積之10mM磷酸鉀、8.8%(w/v)蔗糖(pH 6.7)進行透濾。透濾完成之後，恢復超濾以使滯留物濃度達成105g/L之目標值(根據達成此濃度的滯留物體積)。將TFF系統之滯留物一側排入滯留物容器中之後，系統用5L 10mM磷酸鉀、8.8%(w/v)蔗糖(pH 6.7)沖洗，且添加沖洗液至滯留 物容器中。混合10-15分鐘之後，自滯留物之上部及下部取樣用於量測蛋白質濃度，確保充分混合及產物在透濾步驟期間的濃縮。滯留物視需要進一步用10mM磷酸鉀、8.8%(w/v)蔗糖(pH 6.7)稀釋，以使最終濃度達成70.0±3.5g/L。最終TFF合併物在最後調配且批量填充之前，無菌過濾至生物處理袋中儲存。如表13中所述，收集滯留物樣品用於製程內測試。

原料藥之最終調配及填充

製備最終調配的STM 434原料藥且在TFF步驟之後填充。向TFF合併物中添加足夠體積的1%(w/v)聚山梨醇酯20溶液，以使得最終聚山梨醇酯20濃度為0.006%±0.003%(w/v)。添加界面活性劑之後，將批量原料藥混合10-15分鐘。將填充套件中的層狀氣流罩，且配置填充設備，包括Opticap XL5 0.22μm過濾器膜盒(Millipore；0.35m²薄膜面積)。將最終調配的原料藥過濾之前，過濾器用30±1L之STM 434調配緩衝液(10mM磷酸鉀、8.8%[w/v]蔗糖、0.006%[w/v]聚山梨醇酯20，pH 6.7)沖洗，以使聚山梨醇酯20浸透薄膜且避免其自所調配的原料藥中移除。用調配緩衝液沖洗之後，用340-360g所調配的原料藥沖洗過濾器，丟棄沖洗液。剩餘的所調配原料藥接著過濾至10L聚碳酸酯壇中，直至每個壇5500±500mL之目標體積。過濾之後，對過濾 器進行完整性測試(使用泡點測試)。最後的壇可用超過目標體積、但通常不超過8L的所調配原料藥填充。取樣用於製程內測試(僅供參考)及批次釋放測試，隨後在80 in-lb之扭力設定下確保壇封閉。對壇作出標記，且接著在-70℃儲存。

在STM 434純化過程中的製程內監測

如表13中所述，在純化過程中收集且評估樣品。

CE-SDS=十二烷基硫酸鈉毛細電泳法；CEX=陽離子交換層析；CFU=群落形成單位；CHO=中國倉鼠卵巢；ELISA=酶聯免疫吸附分析；FVIP=經過濾的病毒不活化合併物；HCP=宿主細胞蛋白質；HIC=疏水性相互作用層析；icIEF=成像毛細管等電聚焦；LAL=鱟變形細胞溶菌液；Q-PCR=定量聚合酶鏈反應；TAMC=總好氧性微生物計數；TFF=切向流過濾；TYMC=總酵母及黴菌計數

方法步驟及總產量

STM 434 cGMP原料藥製造運作的個別步驟產率提供於表14中。總體而言，該方法可再現且為1期臨床試驗提供足夠的材料。

* Amgen所報導之產率百分比係基於各製造運作中之細胞培養收穫物之初始輸入量。兩次運作的不同歸因於不同生物反應器的產率，及Amgen將蛋白質A層析步驟限於五個循環、同時維持靶蛋白負載參數的決定。

** CMC Biologics所報導之產率百分比係基於DSI之初始輸入量，各製造運作的可用體積不同。此章節之表中所報導的DSI濃度值為CMC Biologics所測定之彼等值。

實例2：製造方法及製程控制之描述

經調配之批量原料藥經冷凍裝運用於無菌加工成未標記藥品，接著裝運用於標記、封裝及分配至臨床地點。各STM 434注射批次包括可供臨床試驗中使用之最少7000個填充小瓶。最終藥品處理之方法流程圖顯示於圖3中。

組分製備及設備

自玻璃製造商封裝中移出小瓶且用熱注射用水(WFI)洗滌。經洗滌的小瓶接著置放於經覆蓋的不鏽鋼盤中且在乾燥的熱滅菌烘箱中去熱源。滅菌烘箱空氣係經HEPA過濾。塞子用熱WFI洗滌及沖洗，隨後在高壓釜中滅菌及乾燥。所有無菌/去熱源組分在使用之前儲存於受控制的環境中。

使用過度殺傷方法來產生及驗證蒸汽滅菌循環。所用循環提供至少1×10^-6之滅菌保證水準(SAL)。所用的乾熱式去熱源循環使內毒 素減少最少3個對數。

製造方法

來料控制包括身分測試及所調配之批量原料藥分析證書之可接受性確認。STM 434原料藥在2-8℃靜態解凍(不少於7天)且在此溫度下保存供進一步處理。將材料移至操作區域且允許平衡至室溫(30-60分鐘)。對於典型的批料而言，將各含有5.5L的2個壇彙集於13L玻璃壇中且以300rpm混合不少於10分鐘。收集樣品用於生物負荷測試。彙集及混合操作在根據ISO第7類(先前為FS209E第10,000類)控制的環境區域中進行。接著將含有經合併之所調配本體溶液的容器轉移，準備進行產物過濾滅菌。此彙集的容器連接至經熱壓處理之過濾器總成。過濾器總成[管道]亦連接至填充緩衝容器。溶液藉由膜過濾、經由串聯使用的兩個滅菌級過濾器來滅菌，其中孔徑等級為0.22μm。將薄膜過濾器滅菌且在使用之前及之後進行完整性測試(使用泡點測試)。根據書面規格測試樣品。

含有經合併之所調配無菌本體溶液的填充緩衝容器接著無菌連接至填充器。經合併之所調配無菌本體溶液無菌填充於無菌去熱源小瓶中。接著將無菌塞子及密封件置放於RABS單元內的各小瓶上。填充操作由穿適合實驗長衣且經培訓之操作員執行。此等操作經設計、配備及操作，以提供適於無菌產物處理的環境條件。

在填充操作期間進行填充重量檢查。將小瓶填充、塞緊且密封之後，對其進行所有檢驗以確保無外來可見顆粒、沈澱物、可見污染、溢出跡象、小瓶破裂，或不可接受的塞子或密封件。另外，由品質部門對整批小瓶進行統計學取樣且檢驗。

此時收集樣品小瓶用於QC測試。所有可接受之小瓶在-20±5℃至-70±10℃隔離儲存置放。

受控制的環境區域維持於經HEPA過濾之空氣的正壓力下以降低 經空氣傳播之污染的可能性。定期監測過濾器之效能。接近填充室限於與填充操作有關的人員，其已完成無菌操作方面的必要培訓。

在無菌操作(諸如填充及塞緊)期間，監測ISO第5類環境中的微生物含量及非生命微粒含量。確立有生命污染物與非生命微粒的適當作用及報警級別，以確保填充環境空氣及重要表面的適當品質。

培養基填充驗證

依常規間隔時間(6個月)進行模擬填充操作的培養基填充，以另外保證人員、設施及設備之無菌處理能力。根據核准之方案進行培養基填充。

用來驗證藥品製造中所用之特定過濾、填充、塞緊及加蓋程序的製程模擬(培養基填充)資料包括(但不限於)填充室標記符號、容器封閉件類型及尺寸、培養基體積、培養基類型、所填充之單元數目、填充持續時間及容納時間段、所培育之單元數目、陽性單元數目、培育參數、培養基填充日期、製程干預、微生物監測及製程參數。

初始將培養基填充樣品小瓶渦旋/倒置以確保TSB已與所有內部表面接觸，容器在20℃-25℃豎直培育7天(不少於168個小時)，隨後在30-35℃倒置培育另外7天(不少於168小時)。培育之後，對培養基小瓶之代表性樣品進行藥典(USP)生長促進測試。培育後生長促進測試失敗的結果為培養基填充運作無效。失敗或無效的所有培養基填充運作之後進行研究。設計合併最壞情形及/或挑戰條件的製程模擬。托承概念適用於最壞情形容器封閉件組合之定義。最壞情形格式之定義係基於小瓶體積、尺寸、孔口及製程複雜性(亦即液體或冷凍乾燥)。由於凍乾方法之複雜性較高，因此冷凍乾燥方法可為液體方法之代表。每次培養基填充時進行常規干預。

標記及封裝(主要容器)

填充/修整操作之後，將STM 434注射小瓶置放於紙板箱中用於 中間儲存。紙箱經標記而含有產品特定資訊及批次特定資訊且接著冷凍儲存置放。此等小瓶紙箱在-70±10℃裝運，且紙箱中之小瓶在-20±5℃儲存。標記操作係在室溫套房中進行。將小批量小瓶置於套房中且在12小時內標記，接著恢復至-20±5℃。藉由將外部的殘餘凝聚物擦掉且接著貼附標記來備妥用於標記的各小瓶。

檢驗所印刷的組件以確保內容根據主標記為適當的。檢驗完成時，釋放標記用於初始容器上。標記及封裝方法使用核准的書面程序。

實例3：STM 434之分批配方

STM 434注射劑係以70mg/mL STM 434、10mM磷酸鉀、8.8%(w/v)蔗糖、0.006%(w/v)聚山梨醇酯20(pH 6.7)調配。各5mL小瓶標稱地填充有不少於1.0mL的STM 434原料藥。對於cGMP頭兩批STM 434注射劑中之每一者而言，自執行藥品製造的CMC Biologics接收11L STM 434原料藥。此體積在表15中用於定義每批料中各組分之量。

實例4：STM 434研究方案。 研究目標

研究的第一目標為定義患有卵巢癌或其他晚期實體腫瘤之個體 對於STM 434作為單一療法或與脂質體阿黴素化學療法組合投與的最大耐受劑量(MTD)。

第二目標如下：

˙在無MTD的情況下定義2期建議劑量(RP2D)

˙在用STM 434治療期間，利用實驗室測試、心電圖(ECG)及生命體征評估不良事件(AE)及臨床顯著變化的發生率

˙評估抗STM 434抗體形成的發生率

˙收集用STM 434治療期間的藥物動力學(PK)資料

˙收集用STM 434治療期間的ECG資料

˙收集用STM 434治療期間的初步抗腫瘤功效資料

˙評估抗腫瘤功效資料與以下中之每一者之間的關係：血清活化素A、腫瘤INHBA/ACVR2B mRNA含量，及透明細胞/子宮內膜/顆粒層腫瘤突變狀態

˙收集瘦體質量、脂肪質量、骨礦物質密度(無骨轉移的個體)、脂質分佈、空腹葡萄糖、空腹胰島素、恆穩模型評估(HOMA)、血紅素A1c(HbA1c)，及用STM 434治療期間的6分鐘行走距離

˙收集生物標記(諸如癌症抗原-125[CA-125]、前列腺特異性抗原[PSA]、碳水化合物抗原19-9[CA 19-9]、癌胚抗原[CEA])、活化素A、卵泡刺激激素(FSH)、雌二醇及睪固酮之基線及治療時資料

研究之探索性目標為評估PK參數與PD參數之間的關係、體重、身體表面積、瘦體質量、脂肪質量、四肢瘦肉質量、骨礦物質密度(無骨轉移的個體)、脂質分佈、空腹葡萄糖、空腹胰島素、6分鐘行走距離、抗藥物抗體形成、生物標記及ECG資料。

研究設計

此為患有卵巢癌或晚期實體腫瘤之成人個體的多中心、開放標記、單一組別研究。研究分三個部分進行，如下所述。研究程序之概 述顯示於表16中。

研究之第1部分

第1部分為患有晚期實體腫瘤之個體的開放標記、劑量遞增研究，其併有3+3設計。5個按計劃依序給藥組中募集總共15-30位個體，以評價IV STM 434在5種劑量(0.25mg/kg IV、0.5mg/kg IV、1mg/kg IV、2mg/kg IV及4mg/kg IV)下的安全、耐受性及PK概況。在劑量限制毒性(DLT)評估窗期間，在缺乏安全信號的情況下，依計劃的100%劑量增量增加STM 434。若觀測到安全信號(2個臨床上顯著的STM 434相關2級AE或1個STM 434相關3級毒性)，各群組之間的所有進一步劑量遞增均以50%的劑量增量進行且可研究另一種適當的劑量水準以避免過度毒性。依序評估各劑量水準，且各劑量組由3-6位個體組成(數目將視是否觀測DLT而定)。

一個群組相對於下一個群組的劑量遞增將由主持者聯合研究者確定，且將基於治療引發的AE、臨床實驗資料、身體檢查結果(包括生命體征)、ECG，及群組內之所有3位個體已完成28天治療之後的可用PK資料。若個體在研究治療之最初28天期間之DLT或STM 434相關性重度AE(SAE)發生率為<33%，則將進行劑量遞增。

在指定群組中，若3位個體在距離STM 434初始投與的28天期間均未經歷DLT，則將進行劑量遞增，且募集3位個體加入下一個劑量水準的群組。然而，若觀測到2個臨床上顯著的2級STM 434相關性AE或1個STM 434相關性3級AE，則所有進一步劑量遞增將降低至50%劑量增量。若一個群組之3位個體中有1位經歷DLT，則在相同的劑量水準下募集3位其他個體。若一個群組內之6位個體僅有1位在治療的最初28天期間經歷DLT或STM 434相關性SAE，則可開始募集下一個群組。若觀測到DLT，則所有的進一步劑量遞增將降低至50%劑量增量。若一個群組內之6位個體中有2位或超過2位在治療的 最初28天期間經歷DLT或STM 434相關性SAE，則此劑量將視為毒性劑量。劑量遞增可根據出現的毒性、PK或PD資料、依較低劑量或不太頻繁的時程進行，直至MTD確定。若PK資料觀測值低於預測水準，則可探索每4週高於4mg/kg的劑量。

研究之第2部分

第2部分為開放標記式研究，其經設計以獲得患有晚期卵巢/子宮內膜透明細胞、顆粒層及卵巢/輸卵管/原發性腹膜漿液性腫瘤之個體的其他安全及探索性功效資料。在研究之此部分中，募集總共24位個體，分成2組。一組將包括6位患有透明細胞腺癌的個體及6位患有顆粒層細胞腫瘤的個體；第二組將包括12位患有漿液性腫瘤的個體。所有個體將靜脈內接受RP2D的STM 434。第1部分中之RP2D一經確立，則第2部分中之募集可發生。

研究之第3部分

第3部分為STM 434與脂質體阿黴素化學療法組合用於患有卵巢癌、輸卵管癌或原發性腹膜癌之個體的開放標記式劑量遞增研究，該研究併有3+3設計，該等個體已接受基於鉑之化學療法療程的先前治療或不能接受基於鉑之化學療法。第1部分完成且RP2D確立之後，募集6至12位個體加入第3部分。第2部分及第3部分將同時募集個體。第3部分中的個體將分成2個劑量組(各3-6位個體)評估(每組個體數目視是否觀測DLT而定)。一組將接受低於RP2D的一種劑量水準的STM 434且第二組將接受RP2D之STM 434；兩組將接受40mg/m²之脂質體阿黴素。

兩組個體在接受STM 434之前將接受脂質體阿黴素之輸注。每次投與脂質體阿黴素之前，將評估實驗室研究，包括多閘控式擷取(MUGA)掃描。需要時，可根據毒性管理準則實現40mg/m²至30mg/m²之劑量降低。

評估STM 434伴隨脂質體阿黴素投與時的安全、耐受性及PK概況。首先評估STM 434的較低劑量(亦即低於RP2D的一種劑量水準)；劑量遞增將由主持者聯合研究者一起確定且將基於治療引發的AE、臨床實驗室資料、身體檢查結果(包括生命體征)、ECG，及群組內之所有3位個體使用針對第1部分概述的3+3設計已完成28天治療之後的可用PK資料。

劑量限制毒性

DLT定義為任何相關的3級(根據不良事件之常見術語標準[Common Terminology Criteria for Adverse Events；CTCAE]4.03版)非血液學毒性(排除無關毒性)，或任何4級的血液學毒性持續7天、發熱性嗜中性球減少症，或3級血小板減少症伴主動性出血。

當毒性已消退至CTCAE級1或基線值時，且若個體尚未經歷疾病進展，則希望恢復STM 434療法之正經歷DLT的個體可在研究者的判斷下恢復STM 434療法。

最大耐受劑量

MTD定義為群組個體之DLT發生率<33%的最高劑量水準。

2期建議劑量

考慮MTD、PK、藥效學生物標記及抗腫瘤反應資料來定義RP2D。

隨機分組及不知情

此為開放標記、非隨機、非盲研究。個體以其在研究中合格的次序分配至劑量組。

個體選擇標準 包含標準

若滿足所有以下包含標準，則個體參與此研究視為合格的：

1.18歲的男性及停經後女性

2.組織學確診為癌症的晚期實體腫瘤

3.患有復發性轉移性或局部晚期疾病的個體視為可用於其腫瘤之所有標準療法難治癒或不耐受可用於其腫瘤之所有標準療法，或患有無標準療法可供使用之腫瘤的個體

4.患有視為鉑難治癒/耐藥之漿液性卵巢/輸卵管/原發性腹膜顆粒層細胞腫瘤或透明細胞腫瘤、定義為先前已經歷至少一種基於鉑之化學治療方案(隨後無鉑間隔期<12個月)、在基於鉑之治療期間已進展或在基於鉑治療之後患有持久性疾病的個體為合格的。定義為因毒性而不能進一步接受鉑的不耐受個體為合格的。

5.使用實體腫瘤(RECIST 1.1)標準中之反應評估標準可度量的疾病

6.東部腫瘤學合作組織(ECOG)效能狀態為0或1

7.在無需另一人協助的情況下能夠行走至少30公尺(允許使用輔助裝置，諸如手杖或助行架)

8.願意且能夠提供書面知情同意書

9.停經後女性必須滿足以下中之一或多者：

a.自發性停經12個月

b.自發性停經6個月，其中FSH>40 IU/L

c.手術後雙側卵巢切除，伴隨或不伴隨子宮切除

在研究之第2部分中，必須滿足以下額外包含標準：

10.第6組個體必須患有鉑難治癒/耐藥性/不耐受(如包含標準#4中所定義)的卵巢/子宮內膜透明細胞癌瘤及卵巢顆粒層細胞腫瘤

11.第7組個體必須患有鉑難治癒/耐藥性/不耐受(如包含標準#4中所定義)的漿液性卵巢/輸卵管/原發性腹膜癌

在研究之第3部分中，必須滿足以下額外包含標準：

12.第8組及第9組個體必須患有鉑難治癒/耐藥性/不耐受(如包 含標準#4中所定義)的晚期卵巢/輸卵管/原發性腹膜癌

排除標準

若滿足任一以下標準，則個體參與研究將為不合格的：

1.同時發生的嚴重不受控制或未消退醫學病狀，諸如感染、限制方案順應性或使個體暴露於極端風險

2.先前抗癌療法的毒性未消退，諸如運動或感覺神經病變，其中CTCAE(4.03版)級2，禿髮症除外

3.第1循環之6個月內第1天發生胃腸出血的病史

4.存在QTcF>470msec、遺傳性延長QT間隔的病史，或妨礙評估QT間隔的任何心律不整(諸如束支傳導阻滯)

5.第1循環之6個月內第1天發生的心肌梗塞、不穩定絞痛，或充血性心臟衰竭(紐約心臟協會)II級

6.升高的肝功能測試，包括總膽紅素>1.5×正常值上限(ULN；除非個體已有文件證明吉伯氏疾病)、天冬胺酸轉胺酶(AST)或丙胺酸轉胺酶(ALT)>3.0×ULN(對於已知有肝轉移的個體而言，AST或ALT>5×ULN)

7.肌酐>1.5×ULN且估計之肌酐清除率<60mL/min(科克羅夫特-高爾特方程式)

8.血紅素<9g/dL；血小板<100×10⁹/L(在第1循環之4週內第1天不必接受輸注)；絕對嗜中性白血球計數(ANC)<1.5×10⁹/L(在第1循環之2週內第1天無粒細胞群落刺激因子支持)

9.在第1循環之3週內第1天進行的化學療法、激素療法或輻射療法(注意：經歷促性腺素釋放激素療法的個體為合格的)

10.第1循環之5個半衰期或4週(以較長者為準)內第1天進行的抗體/生物療法

11.第1循環之8週內第1天進行的大手術或第1循環之4週內第1 天進行的小手術

12.當前腸阻塞(有腸阻塞病史者為合格的)

13.腦轉移

14.存在腹水或胸膜積水，需要頻繁(每週超過1次)的醫學介入

15.存在門靜脈分流裝置或廣泛肝切除(超過一個區段)的病史

16.已知的人類免疫缺乏病毒(HIV)感染

17.活動性B型或C型肝炎感染

18.第1循環之4週內第1天使用任何研究性產品的先前療法

19.有生育潛力的女性，或具有生育潛力之女性伴侶的男性，不願意使用高度有效的避孕方法(亦即導致每年懷孕率小於1%者)(一致地且正確地使用時)，諸如植入物、可注射劑、組合之口服避孕藥、一些子宮內避孕裝置、禁慾，或伴侶輸精管結紮。男性在其與女性伴侶參與此研究期間不願意使用高度有效的避孕措施及/或在經歷STM 434治療的同時及最後劑量投與之後的3個月期間不願意節制供精。

20.正哺乳的女性

21.流鼻血病史，需要在第1循環之6個月內第1天進行醫學或手術介入(諸如鼻填塞術)

22.中樞神經系統出血病史

23.出血素因或已知血小板品質缺陷(包括馮威里氏病(von Willebrand disease))之病史

24.遺傳出血性毛細血管擴張症(HHT，奧斯勒-韋伯-任都症候群(Osler-Weber-Rendu syndrome))之病史

25.持續需要長期使用阿司匹林(aspirin)或抗血小板藥劑(噻氯匹啶(ticlopidine)或克羅匹多(clopidogrel))；若在篩選期間中斷阿司匹林/抗血小板藥劑，則清除期必須為2週

在研究之第3部分中，個體若其滿足以下其他排除標準中之任一者，則將為不合格的：

26.對阿黴素鹽酸鹽之習知調配物或脂質體阿黴素之組分的過敏反應

27.先前阿黴素鹽酸鹽之累積劑量>300mg/m²，或先前表柔比星之累積劑量>500mg/m²

28.在第1循環之30天內的第1天，根據MUGA掃描或超音波心電圖(ECHO)，減小的心臟射血分數小於正常值下限

個體停藥標準

個體在完成研究之前可因任一以下原因而停藥：

˙個體同意停藥

˙出現妨礙進一步參與的DLT或其他AE

˙在30天內經由適當醫學管理不能恢復至CTCAE 1級或小於1級的與STM 434及/或脂質體阿黴素相關的持續副作用(僅對於第3部分而言)。若臨床上重要的個別毒性(因STM 434或脂質體阿黴素)持續超過30天而未恢復至CTCAE 1級或小於1級，則個體可中斷研究。

˙個體對方案的非順應性明顯

˙個體選用受禁止的療法，諸如使用研究性藥劑或裝置

˙臨床病狀惡化，就研究者之觀點而言，需要立即進行特定的醫學療法

˙主持者較早關閉研究

用研究性產物治療 研究藥物之描述及操縱 調配物

STM 434調配為意欲靜脈內投藥的無菌水溶液，其含有70mg/mL STM 434、10mM磷酸鉀緩衝液、8.8%(w/v)蔗糖及0.006%(w/v)聚山 梨醇酯20，pH 6.7。

包裝及標記

使用13mm氟聚合物塞子及13mm密封件，將經調配的STM 434溶液封裝於5mL玻璃瓶中(遞送1.0mL使用1.2mL之目標填充體積)。各小瓶意欲用於單一用途。

儲存及操縱

STM 434小瓶在非自由結霜冷凍機中、在-20℃(±5℃)之溫度下儲存。產物應根據標記上所提供的資訊來儲存。

使用之前，產物應在冷凍機中、在2℃至8℃解凍隔夜；產物可在此溫度下保持長達7天。應避免使小瓶暴露於較高溫度及劇烈振盪，因為此等狀況可導致STM 434效能及結構完整性降低。一經解凍，產物不應再冷凍。

關於研究藥物供應之任何其他儲存、操縱或更新的穩定性資料，參考藥學手冊(Pharmacy Manual)。

投與研究藥物

STM 434

STM 434將以各組計劃劑量投與，如下文所特定說明。

在第1部分中，計劃劑量組如下：

˙第1組：每4週0.25mg/kg STM 434 IV

˙第2組：每4週0.5mg/kg STM 434 IV

˙第3組：每4週1mg/kg STM 434 IV

˙第4組：每4週2mg/kg STM 434 IV

˙第5組：每4週4mg/kg STM 434 IV

在第2部分中，計劃劑量組如下：

˙第6組：每4週向6位患有透明細胞腺癌的個體及6位患有顆粒層細胞腫瘤的個體靜脈內投與RP2D的STM 434

˙第7組：每4週向12位患有漿液性卵巢瘤的個體靜脈內投與RP2D的STM 434

在第3部分中，個體將接受STM 434與脂質體阿黴素。個體首先接受阿黴素輸注；此輸注完成後，個體接著將靜脈內接受STM 434。第3部分中的計劃劑量組如下：

˙第8組：低於RP2D IV之一種劑量水準的STM 434+脂質體阿黴素(40mg/m² IV)，每4週

˙第9組：RP2D IV之STM 434+脂質體阿黴素(40mg/m² IV)，每4週

第1、2及3部分中的個體將用STM 434治療直至疾病進展，除非觀測到不可接受的毒性。疾病進展將基於根據RECIST 1.1標準或腫瘤標記量測值的放射照相量測結果。

若脂質體阿黴素因任何原因(除組合療法之最初28天期間所觀測到的DLT之外)停藥或中斷，則第3部分中的個體可繼續接受STM 434。脂質體阿黴素之劑量修改及調節將遵循此產物的處方資訊。所投與之脂質體阿黴素循環的最大數目為6。

脂質體阿黴素

第3部分中的個體(第8組及第9組)將首先接受脂質體阿黴素(40mg/m²)輸注；當此輸注完成時，個體接著將接受其靜脈內劑量之STM 434。

高達90mg之脂質體阿黴素劑量在250mL 5%右旋糖溶液(D5W)中稀釋。劑量90mg應在500mL D5W中稀釋。脂質體阿黴素之首次輸注應以每分鐘1mg之速率投與。若未觀測到輸注反應，則隨後輸注可投與1小時。

用於具有中度致吐性之化學療法的止吐藥應根據機構準則開具處方。

治療持續時間

篩選將始於給藥(第1循環之第1天)之前的長達14天，但放射照相掃描可在研究藥物之第一次劑量開始之前的30天內收集。第1、2及3部分中的個體將用STM 434治療直至疾病進展，除非觀測到不可接受的毒性。疾病進展將基於根據RECIST 1.1標準或腫瘤標記量測值的放射照相量測結果。若使用CA-125作為腫瘤標記量測手段，則根據婦科癌症協作組織(Gynecologic Cancer Intergroup；GCIG)共同準則評價結果。若使用PSA作為腫瘤標記量測手段，則根據前列腺癌工作組織(Prostate Cancer Working Group；PCWG)共同準則評價結果。

若脂質體阿黴素因任何原因(除組合療法之最初28天期間所觀測到的DLT之外)停藥或中斷，則第3部分中的個體可繼續接受STM 434。

功效及安全評估

各功效及安全變數描述如下。

藥物動力學

血液樣品中之STM 434含量將由中央實驗室測定。使用標準非隔室藥物動力學方法，利用血液含量估算以下STM 434 PK參數：

˙終末半衰期(t_1/2)

˙清除率(CL)

˙平均滯留時間(MRT)

˙分佈體積(V_d)

˙穩態體積(V_ss)

另外，對於除STM 434之外亦將接受脂質體阿黴素的第3部分中之個體(第8組及第9組)而言，收集血液樣品且送至中央實驗室用於測定阿黴素/阿黴素醇含量。估算如上所述的PK參數。

功效評估 放射照相術腫瘤進展

使用基於CT(或MRI)及骨骼掃描(僅有骨轉移的個體)的RECIST 1.1標準，根據研究者的評估來測定放射照相術腫瘤進展。CT或MRI模式之選擇將依據研究者。在基線量測目標病變(若存在，每位個體至多5個)且在整個研究中追蹤。放射照相反應之持續時間將以初始觀測到目標放射照相反應直至疾病進展或死亡之日期的時間來記錄。放射照相無進展存活期將以第1循環之第1天直至放射照相疾病進展或死亡之日期的時間來記錄。

身體組成

瘦體質量、四肢瘦肌肉質量及脂肪質量以及脂肪分佈(內臟及皮下)將藉由DXA測定，如放射學手冊(Radiology Manual)中所詳述。DXA掃描將由中央放射學實驗室分析。

肌肉功能測試：6分鐘行走測試

描述

6MWT係量測個體當在平坦表面上行走6分鐘時間段時所涵蓋的距離。在此研究中，6MWT將根據美國胸科學會(American Thoracic Society；ATS)進行。此等準則係針對可能同時患有心臟或肺病且身體活力程度總體降低的患者(類似於晚期腫瘤患者)而開發。因此，當前研究中之6MWT程序已根據ATS準則作出計劃。

人員培訓

惟由主持者/主持者代表培訓的現場人員才可執行6MWT。在主持者/主持者代表評價所用面積之前，現場可不開始執行6MWT，且培訓將執行測試的現場人員。在研究期間，針對每位個別個體的所有評估必須使用相同面積。

實驗室功效參數 生物標記 腫瘤生物標記

在基線及在整個研究中將監測血清腫瘤生物標記(諸如CA-125(用於患有卵巢癌之個體、PSA(用於患有前列腺癌之個體)、CA 19-9(用於患有胰臟癌之個體)，及CEA(用於患有結腸癌之個體))。評估腫瘤標記反應及腫瘤標記進展(TTTMP)。若使用CA-125作為腫瘤標記量測手段，則根據婦科癌症協作組織(GCIG)共同準則評價結果。若使用PSA作為腫瘤標記量測手段，則根據前列腺癌工作組織(PCWG)共同準則評價結果。

血清腫瘤生物標記(活化素A、FSH、雌二醇、睪固酮)

由於STM 434抑制活化素信號傳導，因此將確定血清活化素含量是否為反映STM 434抑制標靶之程度的藥效學生物標記。由於活化素為刺激FSH及性激素(雌二醇、睪固酮)釋放之內分泌反饋機制的一部分，因此此等內分泌生物標記亦作為潛在的藥效學功效生物標記加以評估。

活化素A將由中央實驗室測定以確保個體之間的可比性。FSH、雌二醇及睪固酮將由本地實驗室評估。樣品操縱說明書提供於實驗室手冊(Laboratory Manual)中。

組織腫瘤生物標記

藉由在篩選時及第4循環之第1天訪視時使用經驗證之RNAScope^®分析量測受體ACVR2B及配位體INHBA之mRNA(所有個體)來檢查經福馬林(Formalin)固定、經石蠟嵌埋之腫瘤切片中的自分泌/旁分泌信號傳導。在篩選時藉由DNA測序來測定FOXL2基因突變狀態(針對患有顆粒層細胞腫瘤的個體)。ARID1A基因突變狀態將藉由下一代測序、比較腫瘤DNA與得自全血的體細胞DNA(針對患有透明細胞/子宮內膜腫瘤的個體)來測定；此分析亦可測定存在於微晶片上之其他癌症基因的序列。由於此等資料之臨床相關性尚未確立，因此個體將不 被告知突變分析結果。樣品(組織切片或腫瘤包埋檢體)將根據實驗室手冊中的說明書裝運至中央實驗室。

循環腫瘤細胞

活化素信號傳導為維持一些腫瘤類型中之癌症幹細胞群所必需的。因此，CTC含量減少可反映STM 434之藥效學活性。在此研究中，將在篩選時及第2循環之第1天使用經驗證之CellSearch^®平台對CTC進行計數。樣品將根據實驗室手冊中的說明書裝運至中央實驗室。

血清脂質

由於STM 434之抗活化素及抗肌肉生長抑制素藥理學可引起肌肉質量增加，因此將確定所治療個體中之血清脂質含量是否會受到影響。

藉由恆穩模型評估空腹血清葡萄糖及胰島素

胰島素抗性(IR)及高血糖症為心血管併發症發展的風險因素。在臨床前研究中，STM 434替代物STM 217使IR改良。儘管高胰島素-正常血液葡萄糖鉗夾技術為量測IR的黃金標準，但此方法的複雜性限制了其使用。已利用透析個體研究更實用的方法HOMA，其使用葡萄糖及胰島素之空腹含量。使用HOMA所得的量測值與使用高胰島素-正常血液葡萄糖鉗夾技術所得的量測值良好相關。

HbA1c由美國糖尿病協會(American Diabetes Association)推薦，用於評價血糖控制。在此研究中評價HbA1c補充空腹葡萄糖及空腹胰島素測試且將提供葡萄糖隨時間控制的整合式量測手段。

統計分析 端點 初始端點

初始端點如下：

˙第1部分：患有卵巢癌或其他晚期實體腫瘤之個體之STM 434單一療法的MTD

˙第2部分：患有卵巢/輸卵管/原發性腹膜/子宮內膜腫瘤之個體之AE在實驗室測試中之發生及臨床顯著變化、ECG，及生命體征

˙第3部分：STM 434與脂質體阿黴素化學療法組合投與患有卵巢/輸卵管/原發性腹膜癌症之個體的MTD

第二端點

第二端點(第1部分、第2部分及第3部分，除非另外指明)包括以下：

˙在不存在MTD情況下的RP2D(第1部分及第3部分)

˙AE在實驗室測試中之發生及臨床顯著變化、ECG及生命體征(第1部分及第3部分)

˙STM 434抗體形成之發生

˙STM 434之PK概況

˙阿黴素/阿黴素醇之PK概況(第3部分)

˙個體對FACT-NTX神經病變問卷的反應

˙放射照相反應率(rRR)

˙放射照相反應(dRR)之持續時間

˙放射照相無進展存活率(rPFS)

˙腫瘤標記反應率(TMRR)

˙達成腫瘤標記進展的時間(TTTMP)

˙基線及治療時活化素A血清濃度、腫瘤INHBA/ACVR2B mRNA含量及腫瘤突變狀態(患有透明細胞/子宮內膜/顆粒層細胞腫瘤之個體)與抗腫瘤功效量測值的相關性

˙瘦體質量、四肢瘦肉質量、脂肪質量(內臟及皮下)、脂質概況、空腹葡萄糖、空腹胰島素、HOMA、HbA1c及6分鐘行走距離相 對於基線的變化

探索性端點

探索性端點(第1部分、第2部分及第3部分)如下：

˙PK參數與抗腫瘤功效、骨礦物質密度(未發生骨轉移的個體)、脂質概況、空腹葡萄糖、空腹胰島素、HbA1c、6分鐘行走距離、抗藥物抗體形成、生物標記或ECG資料之間的相關性

分析群

針對功效、安全及PK的分析群分別描述如下。

˙功效分析群將包括接受STM 434投與至少4週的所有個體。功效端點之二次分析將針對接受STM 434投與至少12週的所有個體進行。

˙安全分析群將包括接受至少1次劑量之STM 434的所有個體。

˙PK分析群將包括接受至少1次劑量之STM 434且提供至少1個PK樣品的所有個體。

功效分析

rRR、dRR及rPFS將根據RECIST 1.1定義且使用描述性統計學及卡普蘭-邁耶方法(Kaplan-Meier methods)分析。對於rPFS而言，未經歷疾病進展或死亡的個體在其最後成像掃描之日檢查用於疾病評估。

TMRR及TTTMP將依據適當的共同準則定義，且使用描述性統計學及卡普蘭-邁耶方法分析。

藥物動力學分析

使用標準非隔室PK方法估算單獨及與脂質體阿黴素組合之STM 434的PK參數且使用描述性統計學(平均值、標準差、中值、最小值及最大值)概述。

使暴露量與抗腫瘤功效、瘦體重量、脂肪質量、脂質概況、空腹葡萄糖、空腹胰島素、HOMA、HbA1c、6MWT、抗藥物抗體形 成、生物標記或ECG資料相關的探索性分析可臨時或事後進行。

安全性分析

安全性評估將包括AE、伴隨藥物、實驗室結果及生命體征。所報導之所有AE將使用醫學監管活動辭典(Medical Dictionary for Regulatory Activities)編碼，利用患有AE之個體的數目及百分比以及歸因(嚴重相對於不嚴重及研究者所報導的關係[無關、可能有關、有關])概述。表中僅包括治療之第一次劑量起始之後直至最後治療之後30天發生的AE。抗STM 434抗體形成之發生將使用描述性統計學概述。

樣品大小確定

研究計劃募集多達總共66位個體(組成為第1部分中多達30位個體、第2部分中24位個體及第3部分中多達12位個體)。此樣品大小不基於冪計算，而是基於臨床判斷及計劃樣品大小滿足研究目標的預期。

在研究之第2部分中，在罕見的卵巢癌亞型透明細胞及顆粒層細胞腫瘤之群組中，由於預期臨床試驗地點之個體數目少，因此各亞型僅募集6位個體，而較常見漿液性卵巢瘤群組將募集12位個體。

結論

作為單一療法或與脂質體阿黴素化學療法組合投與的STM 434調配物治療所選個體的卵巢癌及其他晚期實體腫瘤，副作用相對有限。

實例5：STM 434研究之中期結果。

使用上述方案選擇三位人類個體以便用STM 434治療。各個體患有晚期形式的癌症：漿液性卵巢癌、顆粒層卵巢癌或結腸癌。個體1 患有漿液性卵巢癌，個體2患有顆粒層細胞卵巢癌，且個體3患有結腸癌。個體1在2014年1月診斷患有IV期卵巢癌。其先前在2014年接受卡鉑(carboplatin)及太平洋紫杉醇(paclitaxel)之後，其漿液性腺癌腫瘤有進展。個體2在1998年診斷患有卵巢癌且先前在2010年接受順鉑(cisplatin)、依託泊苷(etoposide)、博萊黴素化學療法(bleomycin chemotherapy)、在2012年接受卡鉑及太平洋紫杉醇、在2013年接受貝伐單抗(bevacizumab)、甲羥孕酮(medroxyprogesterone)、阿那曲唑(anastrozole)且在2014年接受RX-3117(研究性胞苷類似物)之後，其顆粒層細胞腫瘤有進展。個體3在2012年6月診斷患有IV期結腸癌。其先前在2012年接受5-氟尿嘧啶(5-fluorouacil)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、奧沙利鉑化學療法(oxaliplatin chemotherapy)、在2013年接受伊立替康(irinotecan)、5-氟尿嘧啶、甲醯四氫葉酸、貝伐單抗且在2014年接受帕尼單抗(panitumumab)之後，其結腸腫瘤有進展。

STM 434調配物、包裝及儲存

STM 434調配為意欲靜脈內投與的無菌水溶液，其含有70mg/mL STM 434、10mM磷酸鉀緩衝液、8.8%(w/v)蔗糖及0.006%(w/v)聚山梨醇酯20，pH 6.7。使用13mm氟聚合物塞子及13mm密封件將所調配的STM 434溶液封裝於5mL玻璃瓶中。STM 434小瓶在非自由結霜冷凍機中、在-20℃(±5℃)之溫度下儲存。使用之前，STM 434在冷凍機中、在2℃至8℃解凍隔夜。

STM 434投與

約每4週向各個體靜脈內投與0.25mg/kg STM 434。個體1在2014年10月17日開始治療，且在2014年11月14日及2014年12月15日接受兩次額外劑量，隨後在2014年12月30日中斷進一步研究治療。個體2在2014年10月29日開始治療，且在2014年11月24日、2014年12月24日及2015年1月21日接受三次額外劑量，此個體繼續接受STM 434直至 2015年2月17日；個體3在2014年11月6日開始治療，且在2014年12月4日接受一次額外劑量，隨後在2015年1月05日中斷進一步研究治療。

STM 434人類安全性及功效

在任何個體中均未觀測到視為與STM 434投與相關的不良事件。在任何個體中均未觀測到與神經病變、出血事件或內分泌症狀相關的不良事件。在任何個體中均未觀測到抗STM 434抗體。個體1報導食慾改善、有精力及效能狀態增強。研究者認為STM 434安全且耐受性良好。研究者建議遞增至下一個劑量水準。

活體內STM 434抑制活化素

由於活化素為刺激FSH釋放之內分泌反饋機制的一部分，因此FSH以潛在的藥效學功效生物標記加以評估。FSH之減少預期可表示STM 434抑制活化素。

使用ELISA定量免疫分析來評估FSH。已測定在投與0.25mg/kg劑量之STM 434之後，3位個體中有2者中的FSH含量降低。圖4.相對於基線的變化百分比標繪於y軸上，時間標繪於x軸上；C1D1指示第1循環之第1天(治療之前的基線)，C1D15指示初始投與STM 434之後的第1循環之第15、14天，且C2D1指示第2循環之第1天(給藥前，第一次投與之後第4週投與STM 434第二次劑量之前)。在C1D15觀測到的FSH減少指示STM 434抑制人類中的活化素信號傳導。FSH含量恢復至約基線，表明再抑止人類中的活化素信號傳導必需新劑量的STM 434。此等結果表明STM 434可抑制人類中的活化素。

STM 434 PK結果

藉由ELISA定量免疫分析來測定PK。相較於在猴中顯示163-259小時(7-11天)的先前資料，中期PK分析顯示2倍高的清除率及111、114或147小時(4-5天)之T½。圖5.此表明個體可受益於更頻繁的STM 434劑量方案，例如每2週或每3週靜脈內給藥。

STM 434誘發性腫瘤梗塞

患有顆粒層腫瘤的一位個體(個體2)在基線及在第4循環開始時(第1天)再次接受CT掃描。兩次掃描之間存在12週及三次劑量。圖6顯示基線掃描，其中腫瘤以圓形指示。圖7顯示第4循環開始時獲得的後續掃描，其中腫瘤再次以圓形指示。如藉由比較掃描所見，腫瘤已經歷實質性梗塞。此表明低劑量的STM 434有效治療患有顆粒層腫瘤的個體。

實例6：修改之STM 434方案。

至少部分地根據實例5之結果來修改實例4之STM 434方案。修改的方案闡述於下表17、其子表及相關附錄中。

研究程序之腳註

¹ 適當時，治療中斷訪視可在任何預定或非預定的訪視時進行。在此訪視時，需要可確認進行性疾病或不可接受之毒性的文件。

² EOS訪視應預定於最後投與STM 434之後的第28天±3天。

³ 每次訪視時記錄個體體重；篩選訪視時僅記錄身高。

⁴ 大便隱血必需在篩選時進行且可在研究者的判斷下在基線後重複進行。

⁵ 生命體征：聽覺、經皮或口腔溫度、坐血壓、心率及呼吸速率

⁶ 篩選訪視之後，必須使用中央實驗室的設備收集ECG。個體在第-1天開始連續穿戴Holter監測器直至第1循環/第2天訪視，此時移除Holter監測器。在後續各循環之第1天時及在EOS訪視時，利用中央實驗室設備獲得12引線ECG。

⁷ 若需要評估神經病變之AE，則可在非預定的訪視時收集FACT/GOG-NTX。

⁸ 惟第3部分中的個體需要MUGA或ECHO記錄心臟射血分數用於脂質體阿黴素投與。MUGA或ECHO之選擇由研究者決定，但模式一經選擇，則個體在整個研究期間應使用相同方法。MUGA/ECHO僅 在篩選時及第3循環第1天時進行。在第3部分中之阿黴素治療個體在第3循環第1天之前中斷的情況下，MUGA/ECHO應在治療中斷訪視時進行。

⁹ 脂質體阿黴素投與限於研究之第3部分中的個體。

¹⁰ 報導自簽署知情同意文件直至第1循環第1天投與研究藥物時的治療前SAE。

¹¹ 最後投與STM 434之後的30天需要進行AE隨訪，以確定是否存在任何新的或進行中的AE或SAE，不論因果歸因。隨訪可經由電話進行且必須記錄於註釋出處。

¹² 僅在篩選及第2循環第1天時。

¹³ HbA1c僅在篩選、第3循環第1天、治療中斷及EOS時收集且分析。

¹⁴ 血清腫瘤生物標記可包括CA-125、PSA、CA 19-9、CEA，或適當時基於個體腫瘤類型的其他生物標記。對於患有顆粒層細胞腫瘤的患者而言，在每一循環之第1天進行中央實驗室MIS。

¹⁵ 組織腫瘤生物標記包括腫瘤切片/腫瘤包埋檢體用於ACVR2B及INHBA基因表現(所有個體)以及基因突變狀態(患有透明細胞/子宮內膜/顆粒層細胞腫瘤的個體)。

¹⁶ 僅具有生育潛力的女性。

¹⁷ CTC僅在篩選及第2循環第1天時收集。

¹⁸ 第1循環第1天之前長達30天執行的掃描(DXA、CT、MRI、骨)可用於基線評估。

¹⁹ 研究的DXA、CT/MRI及骨掃描可在第1天訪視之前的14天內完成。在第7循環第1天訪視時進行掃描之後，若研究者認為疾病進展可能性低，則後續掃描可每四個循環進行。

²⁰ 6分鐘行走測試僅在第2循環第1天訪視時完成。

²¹ 骨掃描評估應在研究者判斷下進行，例如若個體腫瘤轉移至骨。

²² 研究者應根據RECIST 1.1(附錄7)評估放射照相術掃描

²³ 用於PK評估之詳細時程呈現於此方案之附錄4中。注意：第2、3及8天的PK評估僅在第1循環及第3循環進行。

研究程序之腳註

¹ 適當時，治療中斷訪視可在任何預定或非預定的訪視時進行。在此訪視時，需要可確認進行性疾病或不可接受之毒性的文件。

² EOS訪視應預定於最後投與STM 434之後的第28天±3天。

³ 每次訪視時記錄個體體重；篩選訪視時僅記錄身高。

⁴ 大便隱血必需在篩選時進行且可在研究者的判斷下在基線後重複進行。

⁵ 生命體征：聽覺、經皮或口腔溫度、坐血壓、心率及呼吸速 率

⁶ 篩選訪視之後，必須使用中央實驗室的設備收集ECG。個體在第-1天開始連續穿戴Holter監測器直至第1循環/第2天訪視，此時移除Holter監測器。在後續各循環之第1天時及在EOS訪視時，利用中央實驗室設備獲得12引線ECG。

⁷ 若需要評估神經病變之AE，則可在非預定的訪視時收集FACT/GOG-NTX。

⁸ 惟第3部分中的個體需要MUGA或ECHO記錄心臟射血分數用於脂質體阿黴素投與。MUGA或ECHO之選擇由研究者決定，但模式一經選擇，則個體在整個研究期間應使用相同方法。MUGA/ECHO僅在篩選時及第3循環第1天時進行。在第3部分中之阿黴素治療個體在第3循環第1天之前中斷的情況下，MUGA/ECHO應在治療中斷訪視時進行。

⁹ 脂質體阿黴素投與限於研究之第3部分中的個體。

¹⁰ 報導自簽署知情同意文件直至第1循環第1天投與研究藥物時的治療前SAE。

¹¹ 最後投與STM 434之後的30天需要進行AE隨訪，以確定是否存在任何新的或進行中的AE或SAE，不論因果歸因。隨訪可經由電話進行且必須記錄於註釋出處。

¹² 僅在篩選及第2循環第1天時。

¹³ HbA1c僅在篩選、第3循環第1天、治療中斷及EOS時收集且分析。

¹⁴ 血清腫瘤生物標記可包括CA-125、PSA、CA 19-9、CEA，或適當時基於個體腫瘤類型的其他生物標記。對於患有顆粒層細胞腫瘤的患者而言，在每一循環之第1天進行中央實驗室MIS。

¹⁵ 組織腫瘤生物標記包括腫瘤切片/腫瘤包埋檢體用於ACVR2B 及INHBA基因表現(所有個體)以及基因突變狀態(患有透明細胞/子宮內膜/顆粒層細胞腫瘤的個體)。

¹⁶ 僅具有生育潛力的女性。

¹⁷ CTC僅在篩選及第2循環第1天時收集。

¹⁸ 第1循環第1天之前長達30天執行的掃描(DXA、CT、MRI、骨)可用於基線評估。

¹⁹ 研究的DXA、CT/MRI及骨掃描可在第1天訪視之前的14天內完成。在第7循環第1天訪視時進行掃描之後，若研究者認為疾病進展可能性低，則後續掃描可每四個循環進行。

²⁰ 6分鐘行走測試僅在第2循環第1天訪視時完成。

²¹ 骨掃描評估應在研究者判斷下進行，例如若個體腫瘤轉移至骨。

²² 研究者應根據RECIST 1.1(附錄7)評估放射照相術掃描

²³ 用於PK評估之詳細時程呈現於此方案之附錄5中。注意：第2、3及8天的PK評估僅在第1循環及第3循環進行。

研究程序之腳註

¹ 適當時，治療中斷訪視可在任何預定或非預定的訪視時進行。在此訪視時，需要可確認進行性疾病或不可接受之毒性的文件。

² EOS訪視應預定於最後投與STM 434之後的第28天±3天。

³ 每次訪視時記錄個體體重；篩選訪視時僅記錄身高。

⁴ 大便隱血必需在篩選時進行且可在研究者的判斷下在基線後重複進行。

⁵ 生命體征：聽覺、經皮或口腔溫度、坐血壓、心率及呼吸速率

⁶ 篩選訪視之後，必須使用中央實驗室的設備收集ECG。個體在第-1天開始連續穿戴Holter監測器直至第1循環/第2天訪視，此時移除Holter監測器。在後續各循環之第1天時及在EOS訪視時，利用中央實驗室設備獲得12引線ECG。

⁷ 若需要評估神經病變之AE，則可在非預定的訪視時收集FACT/GOG-NTX。

⁸ 報導自簽署知情同意文件直至第1循環第1天投與研究藥物時的治療前SAE。

⁹ 最後投與STM 434之後的30天需要進行AE隨訪，以確定是否存在任何新的或進行中的AE或SAE，不論因果歸因。隨訪可經由電話進行且必須記錄於註釋出處。

¹⁰ 僅在篩選及第2循環第1天時。

¹¹ HbA1c僅在篩選、第3循環第1天、治療中斷及EOS時收集且分析。

¹² 血清腫瘤生物標記可包括CA-125、PSA、CA 19-9、CEA，或適當時基於個體腫瘤類型的其他生物標記。對於患有顆粒層細胞腫瘤的患者而言，在每一循環之第1天進行中央實驗室MIS。

¹³ 組織腫瘤生物標記包括腫瘤切片/腫瘤包埋檢體用於ACVR2B及INHBA基因表現(所有個體)以及基因突變狀態(患有透明細胞/子宮內膜/顆粒層細胞腫瘤的個體)。

¹⁴ 僅具有生育潛力的女性。

¹⁵ CTC僅在篩選及第2循環第1天時收集。

¹⁶ 第1循環第1天之前長達30天執行的掃描(DXA、CT、MRI、骨)可用於基線評估。

¹⁷ 研究的DXA、CT/MRI及骨掃描可在第1天訪視之前的14天內完成。在第7循環第1天訪視時進行掃描之後，若研究者認為疾病進展可能性低，則後續掃描可每四個循環進行。

¹⁸ 6分鐘行走測試僅在第2循環第1天訪視時完成。

¹⁹ 骨掃描評估應在研究者判斷下進行，例如若個體腫瘤轉移至骨。

²⁰ 研究者應根據RECIST 1.1(附錄7)評估放射照相術掃描

²¹ 用於PK評估之詳細時程呈現於此方案之附錄6中。注意：第2、3及8天的PK評估僅在第1循環及第3循環進行。

^a 所有STM 434取樣時間係相對於STM 434給藥而言。

^b 所有阿黴素/阿黴素醇取樣時間係相對於脂質體阿黴素給藥而言。

對於Q4W給藥而言，給藥後PK取樣窗如下：

第1循環 第1天：±30分鐘 第2、3、8天：±4小時 第15天：±1天

第2循環 第1天：±30分鐘

第3循環 第1天：±30分鐘 第2、3、8天：±4小時 第15天：±1天

第4循環 第1天：±30分鐘

第5循環 第1天：±30分鐘

^a 所有STM 434取樣時間係相對於STM 434給藥而言。

^b 所有阿黴素/阿黴素醇取樣時間係相對於脂質體阿黴素給藥而言。

對於Q2W給藥而言，給藥後PK取樣窗如下：第1循環 第1天：±30分鐘 第2、3、8天：±4小時 第15天：給藥前1天內

第2、4循環第1天：±4小時 第15天：給藥前1天內

第3循環 第1天：±30分鐘 第2、3、8天：±4小時 第15天：給藥前1天內

第5循環 第1天：±30分鐘

^a 所有STM 434取樣時間係相對於STM 434給藥而言。

對於Q3W給藥而言，給藥後PK取樣窗如下：

第1循環 第1天：±30分鐘 第2、3、8天：±4小時 第15天：±1天

第2循環 第1天：±4小時

第3循環 第1天：±30分鐘 第2、3、8天：±4小時

第4循環 第1天：±4小時

第5循環 第1天：±30分鐘

實例7：STM 434穩定性。

經調配之STM 434之穩定性係使用多種方法、在多個時間點、在多種條件下測定。STM 434如上文所示調配(STM 434注射液係用70mg/mL STM 434、10mM磷酸鉀、8.8%(w/v)蔗糖、0.006%(w/v)聚山梨醇酯20(pH 6.7)調配)。

方法

用於評估穩定性的分析方法如下：

利用紫外(UV)吸光度所得的濃度

藥品中STM 434之濃度係使用UV分光光度計量測。使用280nm光(A280)之吸光度及280nm(ε280)下之1.7mg．mL^-1．cm^-1之消光係數來測定基於比爾定律(Beer's law)之濃度。

當濃度為70.0±7.0mg/mL時，一種蛋白質在指定時間點及溫度下視為與該蛋白質零時(T0)或相同蛋白質在其他相同條件下、在-70℃具有相等穩定性。指定蛋白質在指定時間點的穩定性百分比亦可相對於此數值計算。

目測外觀

此方法提供STM 434注射液之目測評估。在環境光下觀測小瓶，且根據可見顆粒、著色程度及清晰性來報導一般外觀。

當外觀為透明、無色至淺黃色液體且基本上不含顆粒時，一種蛋白質在指定時間點及溫度下視為與該蛋白質在零時(T0)或相同蛋白質在其他相同條件下、在-70℃具有相等穩定性。

重量莫耳滲透濃度

STM 434注射液之重量莫耳滲透濃度係使用冷凍點下降滲透壓計量測，該滲透壓計相對於290mOsm/kg之重量莫耳滲透濃度標準校準。

當重量莫耳滲透濃度為330.0±50.0mOsm/kg時，一種蛋白質在指定時間點及溫度下視為與該蛋白質在零時(T0)或相同蛋白質在其他相同條件下、在-70℃具有相等穩定性。指定蛋白質在指定時間點的穩定性百分比亦可相對於此數值計算。

pH

STM 434注射液之pH係使用經國家科學及技術研究所(NIST)可追蹤的標準校準的pH計量測。

在25℃下pH為6.7±0.3時，一種蛋白質在指定時間點及溫度視為與該蛋白質在零時(T0)或相同蛋白質在其他相同條件下在-70℃具有相等穩定性。指定蛋白質在指定時間點的穩定性百分比亦可相對於此數值計算。

容器體積

量測小瓶中之STM 434注射溶液體積。

當容器體積不小於1.0mL時，一種蛋白質在指定時間點及溫度視為與該蛋白質在零時(T0)或相同蛋白質在其他相同條件下在-70℃具有相等穩定性。指定蛋白質在指定時間點的穩定性百分比亦可相對於此數值計算。

尺寸排阻高效液相層析(SE-HPLC)

SE-HPLC為一種藉由蛋白質之流體動力學尺寸來分離蛋白質的方法，其流體動力學尺寸約與分子量(MW)相關。SE-HPLC可分析藥品中之STM 434分子尺寸分佈，尤其在聚集、片段化及其他雜質方面。藉由SE-HPLC解析單體STM 434與其他物質係在TSKgel G3000SWx1 HPLC管柱上、使用100mM磷酸鈉、250mM氯化鈉(pH 6.8)之等度(isocratic)移動相、以0.5mL/min之流速進行。蛋白質係由A280 nm經35分鐘的分析運作時間偵測。蛋白質之溶離時間與其MW之對數成反比。分析結果係以A280峰面積相對於總A280峰面積的百分比報導。

當SE-HPLC主峰為95.0%時，一種蛋白質在指定時間點及溫度視為與該蛋白質在零時(T0)或相同蛋白質在其他相同條件下在-70℃具有相等穩定性。指定蛋白質在指定時間點的穩定性百分比亦可相對於此數值計算。

成像毛細管等電聚焦(icIEF)

cIEF為基於蛋白質之等電點(pI)差異的高解析蛋白質分離技術。Protein Simple(先前為Convergent Bioscience)iCE280 IEF分析儀系統係使用完整毛細管區域成像偵測器，其能夠不用習知cIEF儀器所需之移動步驟進行分析。對於STM 434注射液，使用icIEF作純度測試。

在此icIEF方法中，STM 434樣品用唾液酸酶處理以降低因產物中之唾液酸含量不同所賦予的實質性複雜度。去唾液酸化之後，將樣品與載劑兩性電解質混合以產生pH梯度的甲基纖維素，從而減少電滲透流動，及吸收280nm光之已知pI之標記。將混合物引入內部經塗佈的熔融二氧化矽毛細管中，該毛細管之濾芯中組裝有位於入口與出口儲集器之間的UV可透射區段。當向毛細管區段施加電壓時，溶液形成pH梯度，其中樣品中之兩性電解質、pI標記及蛋白質物質聚焦於其相應pI。利用電荷耦合裝置攝像機獲得完整毛細管吸收影像，從而可監測毛細管在280nm下之聚焦區域，此等聚焦區域對應於各種蛋白質物質及pI標記。包含pI標記允許對毛細管中之pI梯度進行校準，從而對樣品中之各種物質的pI值提供可再現性測定。類似於HPLC，icIEF結果係以與毛細管中之遷移距離有關的A280峰值形式提供。分析結果係以蛋白質物質之A280峰面積相對於總A280峰面積的百分比 報導。

當icIEF主峰為65.0±10.0%時，一種蛋白質在指定時間點及溫度下視為與該蛋白質在零時(T0)或相同蛋白質在其他相同條件下、在-70℃具有相等穩定性。指定蛋白質在指定時間點的穩定性百分比亦可相對於此數值計算。

十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)(非還原性CE-SDS(nrCE-SDS))

使用非還原性十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)(非還原性CE-SDS(nrCE-SDS))作為STM 434注射液的純度測試。方法包括使蛋白質在清潔劑SDS存在下發生熱變性，從而使其以相對恆定的SDS：多肽比率結合至多肽。結合至蛋白質的帶負電SDS促使其根據MW而在電場中遷移。

在此方法中，將STM 434樣品與SDS、游離硫氫基阻斷劑及內部MW標準物一起、在70℃、在非還原條件下培育10分鐘。培育之後，將經處理之樣品裝載至自動取樣器中，該自動取樣器亦承載沖洗溶液及專業化SDS凝膠。CE系統經程式化以便依序沖洗、凝膠裝載，及以電動方式將樣品注射至熔融二氧化矽空毛細管中。對於各樣品而言，使所注射的蛋白質經受電場以便進行基於MW的分離，包括移動通過偵測窗(其中毛細管塗層已移除)及光穿過毛細管至光電二極體陣列偵測器，在此方法中，該偵測器經設定可收集220nm吸光度(A220)。分析結果係以蛋白質物質之A220峰面積相對於總A280峰面積的百分比報導。

當nrCE-SDS主峰為88.0%時，一種蛋白質在指定時間點及溫度下視為與該蛋白質在零時(T0)或相同蛋白質在其他相同條件下、在-70℃具有相等穩定性。指定蛋白質在指定時間點的穩定性百分比亦可相對於此數值計算。

還原性CE-SDS(rCE-SDS)

還原性CE-SDS用作STM 434注射液之純度測試。方法包括使指定濃度的蛋白質在清潔劑SDS及使二硫鍵裂解成硫氫基的還原劑存在下發生熱變性，在此情況下，STM 434促使均二聚體之兩個多肽鏈分離。以相對恆定的SDS：多肽比率結合至多肽鏈的帶負電SDS促使多肽根據MW而在電場中遷移。

在此方法中，將STM 434樣品與SDS、還原劑β-巰基乙醇及內部MW標準物一起、在70℃、在非還原條件下培育10分鐘。培育之後，將經處理之樣品裝載至自動取樣器中，該自動取樣器亦承載沖洗溶液及專業化SDS凝膠。CE系統經程式化以便依序沖洗、凝膠裝載，及以電動方式將樣品注射至熔融二氧化矽空毛細管中。對於各樣品而言，使所注射的蛋白質經受電場以便進行基於MW的分離，包括移動通過偵測窗(其中毛細管塗層已移除)及光穿過毛細管至光電二極體陣列偵測器，在此方法中，該偵測器經設定可收集220nm吸光度(A220)。分析結果係以蛋白質物質之A220峰面積相對於總A280峰面積的百分比報導。

當rCE-SDS主峰為90.0%時，一種蛋白質在指定時間點及溫度下視為與該蛋白質在零時(T0)或相同蛋白質在其他相同條件下、在-70℃具有相等穩定性。指定蛋白質在指定時間點的穩定性百分比亦可相對於此數值計算。

產物特異性ELISA

STM 434注射液身分測試中所用的方法為固相夾心式ELISA。微量滴定條用對STM 434具有高親和性的抗STM 217單株抗體塗佈，原因在於此等蛋白質不同之處為單一胺基酸(STM 217中之絲胺酸-20，STM 434中之蘇胺酸-20)。依序向各孔中添加樣品或對照物，隨後為針對人類ActR2B產生的生物素化單株抗體，隨後為中性鏈親和素-辣根過氧化酶(HRP)結合物。存在於樣品中的STM 434結合至經固定的 捕捉抗體及生物素化二次抗體，且中性鏈親和素-HRP經由抗生素蛋白對生物素的高親和性而結合此複合物。複合物之HRP部分催化發色受質四甲基聯苯胺(TMB)轉化為吸收450nm光的產物。確認樣品的身分，其信雜比(等於樣品之背景校正A450除以空白孔之背景校正A450)不小於10.0。

當ELISA確認蛋白質身分(例如相對於陽性對照物而言)時，一種蛋白質在指定時間點及溫度下視為與該蛋白質在零時(T0)或相同蛋白質在其他相同條件下、在-70℃具有相等穩定性。指定蛋白質在指定時間點時的穩定性百分比亦可相對於藉由ELISA所測定的450nm數值來計算。

基於細胞的生物分析(生物分析)

STM 434注射液之效能係使用C2C12 pMARE純系#44骨骼肌細胞株、在報導基因表現分析中量測。鼠類C2C12細胞經人類肌肉生長抑制素/活化素反應螢光素酶構築體穩定轉染。當經工程改造之細胞株與配位體肌肉生長抑制素一起培育時，肌肉生長抑制素結合至活化素受體之後發生信號轉導。此引起螢光素酶報導基因活化及螢光素酶之隨後產生。螢光素酶與螢光素之反應產生發光，用光度計量測。STM 434以劑量依賴性方式抑制此信號傳導。使用4參數曲線擬合模型分析資料。一旦與參考曲線的平行性/相似性確立，則根據曲線內推生物濃度且計算樣品相對於參考標準物的相對效能。

當生物分析顯示60至140%之相對效能時，一種蛋白質在指定時間點及溫度下視為與該蛋白質在零時(T0)或相同蛋白質在其他相同條件下、在-70℃具有相等穩定性或活性。指定蛋白質在指定時間點的穩定性或活性百分比亦可相對於此數值計算。

內毒素

用於量化STM 434注射液中之細菌內毒素的方法係使用動力學發 色內毒素偵測系統。製備適於系統之內毒素標準物、STM 434樣品及外加有內毒素標準物之STM 434樣品的系列稀釋液，且與適於系統的水(作為空白參照物)一起裝載至96孔盤中。在37℃培育盤10分鐘之後，向孔中添加含有經對硝基苯胺(pNA)標記之肽的鱟變形細胞溶菌液(LAL)試劑。存在於樣品及標準物中的內毒素使LAL中之前酶轉化為活性酶，該活性酶使pNA與無色肽分裂而在405nm吸光度(A405)下產生信號。對內毒素標準物所產生的A405作圖以產生標準曲線，且根據標準曲線，利用其A405讀數確定STM 434樣品中的內毒素含量。 測定各樣品之EU/mL且除以樣品中之蛋白質濃度(mg/mL)之後，依據每毫克的內毒素單位(EU/mg)來報導結果。

當內毒素含量為0.5個內毒素單位(EU)/毫克時，一種蛋白質在指定時間點及溫度下視為與該蛋白質在零時(T0)或相同蛋白質在其他相同條件下、在-70℃具有相等穩定性。指定蛋白質在指定時間點的穩定性百分比亦可相對於此數值計算。

無菌性

測定STM 434注射液之無菌性的方法係使用膜過濾技術滯留測試物件中的任何微生物。

當產物無菌性滿足美國藥典之要求時，一種蛋白質在指定時間點及溫度下視為與該蛋白質在零時(T0)或相同蛋白質在其他相同條件下、在-70℃具有相等穩定性。指定蛋白質在指定時間點的穩定性百分比亦可相對於美國藥典所提供之數值計算。

顯微(Subvisible)顆粒

存在於STM 434注射液中之顯微顆粒的量係使用遮光法測定。結果係以直徑為10μm或大於10μm及直徑為25μm或大於25μm之顆粒數目報導。

當每個容器中存在不超過6,000個10μm顆粒且每個容器中存在 不超過600個25μm顆粒時，一種蛋白質在指定時間點及溫度下視為與該蛋白質在零時(T0)或相同蛋白質在其他相同條件下、在-70℃具有相等穩定性。指定蛋白質在指定時間點的穩定性百分比亦可相對於此等數值計算。

聚山梨醇酯20濃度

STM 434注射液中之聚山梨醇酯20(PS20)濃度係藉由一種使用混合模式HPLC管柱運作的方法測定，該管柱以逆相模式運作以將PS20與蛋白質分離，定量偵測係由電霧式偵測器(charged aerosol detection；CAD)進行。PS20標準物之依序注射得到基於基線校正CAD反應與PS20濃度之關係的校準曲線，將其擬合二階多項式。 STM 434樣品之PS20濃度報導值係藉由將其基線校正CAD反應輸入多項式方程式且對PS20濃度求解來測定。

當聚山梨醇酯20濃度為0.006±0.003%(w/v)時，一種蛋白質在指定時間點及溫度下視為與該蛋白質在零時(T0)或相同蛋白質在其他相同條件下、在-70℃具有相等穩定性。指定蛋白質在指定時間點的穩定性百分比亦可相對於此數值計算。

結果

下表(表18-39)顯示使用上文方法所產生的經調配STM 434穩定性相關性資料，此等資料至少部分地在指定時間點及指定條件下產生。

表18顯示在5℃保存長達54月之經調配434之所測試特徵類似於在-70℃保存長達54個月的經調配434。表22顯示在5℃保存長達6個月之經調配434的所測試特徵類似於在5℃保存0個月之經調配434的所測試特徵。表25及表30顯示在2-8℃保存長達12個月之經調配434的所測試特徵類似於在2-8℃保存0個月之經調配434的所測試特徵。表36顯示經調配434以直立位置在2-8℃保存長達6個月的所測試特徵類似於以直立位置在2-8℃保存0個月的所測試特徵。表37顯示經調配434以 倒置位置在2-8℃保存長達6個月的所測試特徵類似於經調配434以倒置位置在2-8℃保存0個月的所測試特徵。

此資料表明經調配STM 434在冷藏溫度(例如2-8℃(2、3、4、5、6、7、8℃)；5℃)下且甚至在高濃度(諸如70mg/mL)下保持長達54個月的高度穩定。此穩定性程度遠大於蛋白質在4℃保存之預期穩定性，預期穩定性典型地在1個月範圍內。參見Pierce Technical Resource TR0043.1,Protein Stability and Storage，表1(http：//sites.bio.indiana.edu/~chenlab/protocol_files/protein_storage.pdf)；及Webster等人，Predicting Long-Term Storage Stability of Therapeutic Proteins,Pharmaceutical Technology，第37卷，第11期(2013年11月2日)。因此，經調配STM 434為高度穩定的組合物，其在冷藏溫度(例如2-8℃)下可儲存大於1個月的延長時間段，例如長達3、6、12、18、24、36、48或54個月或超過54個月。

CL=無色；SY=微黃色；HMW=高分子量；LMW=低分子量

CL=無色；SY=微黃色；HMW=高分子量；LMW=低分子量；N.S.=未預定

CL=無色；SY=微黃色；HMW=高分子量；LMW=低分子量

CL=無色；SY=微黃色；HMW=高分子量；LMW=低分子量；N.S.=未預定

CL=無色；SY=微黃色；HMW=高分子量；LMW=低分子量；N.S.=未預定

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到；N.S.=未預定；NDDI=無可偵測的染料滲入

*三個因偏差所致的報導值(分析者執行三次注射；方法需要一次)

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到；N.S.=未預定；NDDI=無可偵測的染料滲入

*三個因偏差所致的報導值(分析者執行三次注射；方法需要一次)

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到；N.S.=未預定

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸 性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到；N.S.=未預定

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到；N.S.=未預定

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到；N.S.=未預定

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸 性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到；N.S.=未預定

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到；N.S.=未預定

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到；N.S.=未預定

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到；N.S.=未預定

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到；N.S.=未預定

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到；N.S.=未預定

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到；N.S.=未預定；NDDI=無 可偵測的染料滲入

CLR L=透明液體；CL=無色；LY=淡黃色；EFOP=基本上不含顆粒；NVP=無可見顆粒；HMW=高分子量；LMW=低分子量；APG=酸性峰組；BPG=鹼性峰組；N.D.=未偵測到；N.S.=未預定；NDDI=無可偵測的染料滲入

實例8：STM 434投與改變人體組成

使用實例4中的上述方案選擇用STM 434治療的人類個體。個體為62歲非裔美國男性，其復發性乳頭狀腎細胞癌轉移至對側腎臟及骨盆淋巴結。其先前已接受使用托瑞索(Torisel)、帕唑帕尼(Pazopanib)及研究性藥劑(包括B7-H3 mAb、cMet抑制劑、CHK1抑制劑、奧洛拉激酶抑制劑(Aurora kinase inhibitor)及重組人類介白素10)之8線抗腫瘤療法。

STM 434調配物、包裝及儲存

STM 434調配為意欲靜脈內投與的無菌水溶液，其含有70mg/mL STM 434、10mM磷酸鉀緩衝液、8.8%(w/v)蔗糖及0.006%(w/v)聚山梨醇酯20，pH 6.7。使用13mm氟聚合物塞子及13mm密封件將所調配的STM 434溶液封裝於5mL玻璃瓶中。STM 434小瓶在非自由結霜冷凍機中、在-20℃(±5℃)之溫度下儲存。使用之前，STM 434在冷凍機中、在2℃至8℃解凍隔夜。

STM 434投與及監測

約每4週向個體靜脈內投與0.25mg/kg STM 434(第2組)。

2014年12月30日進行首次DXA掃描；2015年1月6日、2015年2月3日及2015年3月3日給藥；2015年3月31日進行追蹤DXA掃描。

瘦體質量、四肢瘦肉質量及脂肪質量(內臟及皮下)相對於基線的變化

約隔三個月獲得多個身體組成量測結果，以評估STM 434對身體組成(例如肌肉及脂肪)的影響。瘦體質量、四肢瘦肉質量及脂肪質量及脂肪分佈(內臟及皮下)係藉由DXA掃描來測定。DXA掃描由現場放射醫師進行分析且由中央放射學實驗室使用IBIS(成像生物標記資訊系統)軟體確認以確保精確的個體定位及機器校準。

表40顯示個體之量測結果。結果展現，STM 434在相對較低的劑量下治療僅約3個月之後，瘦體質量發生實質性增加且脂肪質量發生實質性降低。

儘管本發明已參照較佳實施例及多個替代實施例進行特定顯示且描述，但應理解，在不背離本發明之精神及範疇之情況下，熟習相關技術者可對其中的形式及細節進行各種變更。

本說明書正文內引用之所有參考文獻、所頒予專利及專利申請案均以全文引用的方式併入本文中用於所有目的。

序列

<110> 美商安美基公司

美商聖塔瑪麗亞生物治療公司

<120> 經調配之受體多肽及相關方法

<130> 29957-29502 PCT

<140>

<141>

<150> 62/142,812

<151> 2015-04-03

<150> 62/058,789

<151> 2014-10-02

<150> 62/047,995

<151> 2014-09-09

<150> 61/012,104

<151> 2014-06-13

<160> 53

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 402

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(402)

<400> 1

<210> 2

<211> 134

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 387

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(387)

<400> 3

<210> 4

<211> 129

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 330

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(330)

<400> 5

<210> 6

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

<210> 7

<211> 1071

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1071)

<400> 7

<210> 8

<211> 357

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

<210> 9

<211> 1014

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1014)

<400> 9

<210> 10

<211> 338

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

<210> 11

<211> 387

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(387)

<400> 11

<210> 12

<211> 129

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

<210> 13

<211> 330

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(330)

<400> 13

<210> 14

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

<210> 15

<211> 1071

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1071)

<400> 15

<210> 16

<211> 357

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

<210> 17

<211> 1014

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1014)

<400> 17

<210> 18

<211> 338

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

<210> 19

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

<210> 20

<211> 1014

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1014)

<400> 20

<210> 21

<211> 338

<212> PRT

<213> 智人

<400> 21

<210> 22

<211> 216

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

<210> 23

<211> 217

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

<210> 24

<211> 217

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

<210> 25

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 連接子

<400> 25

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 鉸鏈連接子

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(36)

<400> 26

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鉸鏈連接子

<400> 27

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 28

<210> 29

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 29

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 30

<210> 31

<211> 18

<212> PRT

<213> 智人

<400> 31

<210> 32

<211> 18

<212> PRT

<213> 智人

<400> 32

<210> 33

<211> 512

<212> PRT

<213> 智人

<400> 33

<210> 34

<211> 426

<212> PRT

<213> 智人

<400> 34

<210> 35

<211> 375

<212> PRT

<213> 智人

<400> 35

<210> 36

<211> 217

<212> PRT

<213> 智人

<400> 36

<210> 37

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 鉸鏈連接子

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(48)

<400> 37

<210> 38

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鉸鏈連接子

<400> 38

<210> 39

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 鉸鏈連接子

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(42)

<400> 39

<210> 40

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鉸鏈連接子

<400> 40

<210> 41

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 鉸鏈連接子

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(42)

<400> 41

<210> 42

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鉸鏈連接子

<400> 42

<210> 43

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 鉸鏈連接子

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(54)

<400> 43

<210> 44

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鉸鏈連接子

<400> 44

<210> 45

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鉸鏈連接子

<400> 45

<210> 46

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鉸鏈連接子

<400> 46

<210> 47

<211> 217

<212> PRT

<213> 智人

<400> 47

<210> 48

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鉸鏈連接子

<400> 48

<210> 49

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鉸鏈連接子

<400> 49

<210> 50

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鉸鏈連接子

<400> 50

<210> 51

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 51

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 52

<210> 53

<211> 300

<212> DNA

<213> 智人

<400> 53

Claims (85)

1. 一種包含蛋白質、賦形劑、緩衝劑及界面活性劑之溶液的組合物，其中該組合物包含4-12之pH，其中該蛋白質包含能夠結合肌肉生長抑制素(myostatin)、活化素A或GDF-11的多肽，其中該多肽係選自由以下組成之群：(a)由SEQ ID NO：4、6、12及14組成之群中所示的胺基酸序列組成的多肽；(b)與(a)具有至少90%序列一致性的多肽，且該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T，及(c)與(a)具有至少95%序列一致性的多肽，其中該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T；及其中相對於該組合物中之該蛋白質在時間段開始時(0月)或相對於相同蛋白質在-20℃或-70℃在其他相同條件下保存大於1個月，該組合物中之該蛋白質在溶液中在2-8℃或5℃保存時保持至少80%穩定性的時間段大於1個月；且視情況其中該組合物進一步包含化學治療劑或第二治療劑。
2. 如請求項1之組合物，其中該蛋白質係由SEQ ID NO：10中所示之序列組成，濃度為70mg/mL，該賦形劑為8.8%重量/體積(w/v)蔗糖，該緩衝劑為10mM磷酸鉀緩衝劑，該界面活性劑為0.006%(w/v)聚山梨醇酯20，且包含6.7之pH；且其中相對於該組合物中之該蛋白質在時間段開始時(0月)或相對於相同蛋白質在-20℃或-70℃在其他相同條件下保存大於6個月，該組合物中之該蛋白質 在溶液中在2-8℃或5℃保存時保持至少90%穩定性的時間段大於6個月。
3. 如請求項1之組合物，其包含至少4、5、6、7、8或9之pH，視情況其中該pH為4-10、4-8或5-7，視情況其中該pH為至少6-7，視情況其中該pH為至少6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0。
4. 如前述請求項中除請求項2外之任一項之組合物，其中該賦形劑包含糖，視情況其中該糖為蔗糖，視情況其中該組合物中之該賦形劑濃度為至少7-11%、8-10%、8-9%、8.8%、7%、8%、9%、10%、11%、8.0%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.9%或9.0%重量/體積(w/v)。
5. 如前述請求項中除請求項2外之任一項之組合物，其中該緩衝劑包含磷酸鹽，視情況其中該磷酸鹽為磷酸鉀，視情況其中該組合物中之該緩衝劑濃度為至少7-13mM、8-12mM、9-11mM、8mM、9mM、10mM、11mM或12mM。
6. 如前述請求項中除請求項2外之任一項之組合物，其中該界面活性劑為非離子界面活性劑，視情況其中該非離子界面活性劑為聚山梨醇酯，視情況其中該聚山梨醇酯為聚山梨醇酯20，視情況其中該界面活性劑濃度為0.001-0.10%、0.05-0.10%、0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%、0.006%、0.007%、0.008%、0.009%、0.010%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.10%(w/v)。
7. 如前述請求項中除請求項2外之任一項之組合物，其中相對於該組合物中之該蛋白質在時間段開始時(0月)，該組合物中之該蛋白質在溶液中在2-8℃或5℃保存時保持至少99.5-80%、90-85%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、 91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%或80%穩定性的時間段大於1-54、6-48、12-36、24-36、1、2、3、6、12、18、24、36、48或54個月。
8. 如前述請求項中除請求項2外之任一項之組合物，其中相對於相同蛋白質在-20℃或-70℃在其他相同條件下保存相等時間段，該組合物中之該蛋白質在溶液中在2-8℃或5℃保存時保持至少99.5-80%、90-85%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%或80%穩定性的時間段大於1-54、6-48、12-36、24-36、1、2、3、6、12、18、24、36、48或54個月。
9. 如前述請求項中任一項之組合物，其中相對於該組合物中之該蛋白質在時間段開始時(0月)，該組合物中之該蛋白質在溶液中在2-8℃或5℃保存時保持至少99.5-80%、90-85%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%或80%活性的時間段大於1-54、6-48、12-36、24-36、1、2、3、6、12、18、24、36、48或54個月，視情況其中活性係使用基於細胞的生物分析測定。
10. 如前述請求項中任一項之組合物，其中相對於相同蛋白質在-20℃或-70℃在其他相同條件下保存相等時間段，該組合物中之該蛋白質在溶液中在2-8℃或5℃保存時保持至少99.5-80%、90-85%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%或80%活性的時間段大於1-54、6-48、12-36、24-36、1、2、3、6、12、18、24、36、48或54個月，視情況其中活性係使用基於細胞的生物分析測定。
11. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該組合物中之該蛋白質的穩定性百分比係藉由以下中之一或多者測定：目測外觀、重量莫耳滲透濃度(osmolality)、pH、體積、尺寸排阻高效液相層析(SE-HPLC)、成像毛細管等電聚焦(icIEF)、十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)、非還原性(nrCE-SDS)、還原性CE-SDS、酶聯免疫特異性分析(ELISA)、基於細胞的生物分析、內毒素含量、無菌性、顯微顆粒(subvisible particles)及聚山梨醇酯20濃度。
12. 如前述請求項中除請求項2外之任一項之組合物，其中該肽係由SEQ ID NO：6中所示之胺基酸序列組成。
13. 如前述請求項中除請求項2外之任一項之組合物，其中該蛋白質係由SEQ ID NO：10中所示之胺基酸序列組成。
14. 如前述請求項中除請求項2外之任一項之組合物，其中該蛋白質係由SEQ ID NO：10中所示之胺基酸序列組成，該賦形劑為蔗糖，該緩衝劑為磷酸鉀緩衝劑，且該界面活性劑為聚山梨醇酯20。
15. 如前述請求項中除請求項2外之任一項之組合物，其中該蛋白質之濃度為至少50-90、60-80、65-70、70-75、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80mg/mL。
16. 如前述請求項中除請求項2外之任一項之組合物，其中該多肽包含SEQ ID NO：6中所示之序列，該賦形劑為8.8%(w/v)蔗糖，該緩衝劑為10mM磷酸鉀緩衝劑，該界面活性劑為0.006%(w/v)聚山梨醇酯20，且該pH為6.7。
17. 如前述請求項中除請求項2外之任一項之組合物，其中該蛋白質係由SEQ ID NO：10中所示之胺基酸序列組成，濃度為70 mg/mL，該賦形劑為8.8%(w/v)蔗糖，該緩衝劑為10mM磷酸鉀緩衝劑，該界面活性劑為0.006%(w/v)聚山梨醇酯20，且該pH為6.7。
18. 如前述請求項中任一項之組合物，其包含化學治療劑阿黴素(doxorubicin)。
19. 一種抑制個體之實體腫瘤生長或治療個體之實體腫瘤或抑制、減輕或治療個體之惡病質的方法，其包含向該個體投與一劑量如上述組合物請求項中之任一項之組合物。
20. 一種抑制個體之實體腫瘤生長或治療個體之實體腫瘤的方法，其包含向該個體投與至少0.1mg/kg至20mg/kg範圍內之固定劑量的蛋白質，其中該蛋白質包含能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11的多肽，該多肽選自由以下組成之群：(a)由SEQ ID NO：4、6、12及14組成之群中所示的胺基酸序列組成的多肽；(b)與(a)具有至少90%序列一致性的多肽，且該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T，及(c)與(a)具有至少95%序列一致性的多肽，且該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T。
21. 如前述方法請求項中任一項之方法，其中該劑量為至少0.1-10mg/kg、0.25-5mg/kg、1-4mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg或5mg/kg。
22. 如前述方法請求項中任一項之方法，其中該劑量每1-5、2-4、1、2、3或4週投與該個體至少一次。
23. 如前述方法請求項中任一項之方法，其中該劑量係靜脈內(IV)投 與該個體。
24. 如前述方法請求項中任一項之方法，其中該蛋白質係由SEQ ID NO：10中所示之胺基酸序列組成。
25. 如前述方法請求項中任一項之方法，其中該蛋白質係根據任一前述組合物請求項調配。
26. 如前述方法請求項中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與阿黴素。
27. 如請求項26之方法，其中該阿黴素至少以40mg/m²輸注投與該個體。
28. 如請求項26之方法，其中該阿黴素為脂質體阿黴素。
29. 如請求項26之方法，其中該阿黴素係在該蛋白質之前、之後或同時投與。
30. 如請求項26之方法，其中該阿黴素至少每4週投與該個體，視情況6個循環或小於6個循環。
31. 如前述方法請求項中任一項之方法，其中該實體腫瘤表現肌肉生長抑制素、活化素A、活化素B及/或GDF-11。
32. 如前述方法請求項中任一項之方法，其中該實體腫瘤係選自由以下組成之群：卵巢癌，包括顆粒層細胞、透明細胞、漿液性、子宮內膜樣及生殖細胞腫瘤；輸卵管癌、子宮內膜癌、腎上腺皮質腫瘤、膽囊癌、胰腺泡癌、頭頸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胰臟癌、前列腺癌、小腸腫瘤、結腸癌、腎細胞癌、腺樣囊性癌、胃癌、食道癌、腺樣囊性癌(ACC)；鱗狀細胞癌，包括皮膚癌；黑色素瘤、乳癌、膀胱癌、肝細胞癌，及子宮癌，包括子宮內膜、子宮頸、平滑肌瘤、外陰及陰道癌症。
33. 如前述方法請求項中任一項之方法，其中該實體腫瘤為卵巢癌。
34. 如前述方法請求項中任一項之方法，其中該個體係根據至少一種標準選擇或排除。
35. 如請求項34之方法，其中該標準係用於選擇投藥的個體，且該標準為以下中之一或多者：18歲的男性及停經後女性；存在組織學確診癌症的晚期實體腫瘤；存在視為可用於腫瘤之所有標準療法難治療或不耐受之復發性轉移性或局部晚期疾病；或患有無標準療法可利用之腫瘤的個體；患有視為鉑難治性/耐藥性之漿液性卵巢/輸卵管/原發性腹膜、顆粒層細胞腫瘤或透明細胞腫瘤、定義為先前已接受至少一種基於鉑之化學治療方案、隨後無鉑間隔<12個月、在基於鉑之療法期間有進展或在基於鉑之療法之後患有持久性疾病的個體；定義為因毒性而不能進一步接受鉑的不耐受鉑之個體；使用實體腫瘤之反應評估標準(RECIST 1.1)可量測的疾病；東部腫瘤學合作組織(ECOG)效能狀態為0或1；在無其他人協助的情況下能夠行走至少30公尺(可允許使用輔助裝置，諸如手杖或助行架)；停經後女性自發性停經12個月；停經後女性自發性停經6個月，其中FSH>40 IU/L；及/或停經後女性之手術後雙側卵巢切除伴隨或不伴隨子宮切除術。
36. 如請求項34之方法，其中該標準用於排除投藥之個體，且該標準為以下中之一或多者：並行嚴重不受控制或未消退醫學病狀(諸如感染)限制方案順應性或使個體暴露於極端風險；先前抗癌療法的毒性未消退，諸如運動或感覺神經病變，CTCAE(4.03版)級2，禿髮症除外；在開始治療6個月內胃腸出血的病史；存在QTcF>470msec；遺傳性延長QT間隔的病史，或妨礙評估QT間隔的任何心律不整(諸如束支傳導阻滯)、心肌梗塞、第1循環之6個月內第1天出現之不穩定絞痛，或紐約心臟協會充血性心臟衰 竭II級；肝功能測試升高，包括總膽紅素>1.5×正常值上限(ULN；除非個體有文件證明吉伯氏疾病(Gilbert's disease))、天冬胺酸轉胺酶(AST)或丙胺酸轉胺酶(ALT)>3.0×ULN(對於已知有肝轉移的個體而言，AST或ALT>5×ULN)、肌酐>1.5×ULN及估計之肌酐清除率<60mL/min(使用科克羅夫特-高爾特方程式(Cockcroft-Gault equation))、血紅素<9g/dL；血小板<100×10⁹/L；絕對嗜中性白血球計數(ANC)<1.5×10⁹/L(在開始治療2週內無粒細胞群落刺激因子支持)；在開始治療3週內的化學療法、激素療法或輻射療法；在開始治療之5個半衰期或4週(以較長者為準)內的抗體/生物療法；開始治療8週內的大手術或開始治療4週內的小手術；當前腸阻塞；腦轉移；存在需要頻繁(每週超過1次)醫學介入的腹水或胸膜積水；存在門靜脈分流裝置或廣泛肝切除(超過一個區段)病史；已知人類免疫缺乏病毒(HIV)感染；活動性B型或C型肝炎感染；開始治療4週內先用任何研究性產品治療；具有生育潛力之女性；或具有生育潛力之女性伴侶的男性；不願意使用非常有效的避孕方法(亦即造成每年懷孕機率小於1%的方法)一貫地且正確地使用時，諸如植入物、注射劑、組合的口服避孕藥、一些子宮內避孕裝置、禁慾或伴侶輸精管結紮；對阿黴素鹽酸鹽(doxorubicin HCl)之習知調配物或脂質體阿黴素之組分有過敏反應；先前阿黴素鹽酸鹽之累積劑量>300mg/m²，或先前表柔比星(epirubicin)之累積劑量>500mg/m²；根據MUGA掃描或超音波心電圖(ECHO)，在開始治療28天內減小的心臟射血分數小於正常值下限，及/或正哺乳的女性。
37. 一種製備包含能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11之多肽之蛋白質的方法，其中該多肽係選自由以下組成之群：(a)由SEQ ID NO：4、6、12及14組成之群中所示之胺基酸序列組成的 多肽；(b)與(a)具有至少90%序列一致性的多肽，且該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T；及(c)與(a)具有至少95%序列一致性的多肽，且該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T，該方法包含：在細胞培養物中培養經工程改造以表現該蛋白質的CS9中國倉鼠卵巢細胞株；自該培養物收穫該蛋白質；及純化該蛋白質。
38. 如請求項37之方法，其中該培養步驟至少部分發生於生物反應器中。
39. 如前述製備方法請求項中任一項之方法，其中該收穫步驟包含澄清及/或過濾。
40. 如前述製備方法請求項中任一項之方法，其中該純化步驟包含蛋白質A層析、低pH病毒不活化、陽離子交換層析、疏水性相互作用層析、病毒過濾，及/或超過濾。
41. 如前述製備方法請求項中任一項之方法，其中該純化步驟包含使用層析、微生物不活化及/或過濾。
42. 如前述製備方法請求項中任一項之方法，其進一步包含將該蛋白質調配於無菌水溶液中。
43. 如前述製備方法請求項中任一項之方法，其進一步包含根據前述組合物請求項中任一項調配該蛋白質。
44. 一種抑制、減輕或治療個體之惡病質的方法，其包含向該個體投與至少0.1mg/kg至20mg/kg範圍內之固定劑量的蛋白質，其中該蛋白質包含能夠結合肌肉生長抑制素、活化素A或GDF-11的多 肽，其中該多肽係選自由以下組成之群：(a)由SEQ ID NO：4、6、12及14組成之群中所示的胺基酸序列組成的多肽；(b)與(a)具有至少90%序列一致性的多肽，且該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T，及(c)與(a)具有至少95%序列一致性的多肽，且該多肽在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置28的位置具有W或Y且在對應於SEQ ID NO：2中所示序列之位置44的位置具有T。
45. 如請求項44之方法，其中該劑量為至少0.1-10mg/kg、0.25-5mg/kg、1-4mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg或5mg/kg。
46. 如前述抑制、減輕或治療惡病質之方法請求項中任一項之方法，其中該固定劑量每1-5、2-4、1、2、3或4週投與該個體至少一次。
47. 如前述抑制、減輕或治療惡病質之方法請求項中任一項之方法，其中該固定劑量係靜脈內(IV)投與該個體。
48. 如前述抑制、減輕或治療惡病質之方法請求項中任一項之方法，其中該蛋白質係由SEQ ID NO：10中所示之胺基酸序列組成。
49. 如前述抑制、減輕或治療惡病質之方法請求項中任一項之方法，其中該蛋白質係根據前述組合物請求項中任一項調配。
50. 如前述抑制、減輕或治療惡病質之方法請求項中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與阿黴素。
51. 如請求項50之方法，其中該阿黴素係以至少40mg/m²輸注投與該個體。
52. 如請求項50之方法，其中該阿黴素為脂質體阿黴素。
53. 如請求項50之方法，其中該阿黴素係在該蛋白質之前、之後或同時投與。
54. 如請求項50之方法，其中該阿黴素至少每1、2、3或4週投與該個體。
55. 如前述抑制、減輕或治療惡病質之方法請求項中任一項之方法，其中該個體患有腫瘤，視情況其中該腫瘤為實體腫瘤，視情況其中該腫瘤為卵巢癌。
56. 如請求項55之方法，其中該腫瘤表現肌肉生長抑制素、活化素A、活化素B及/或GDF-11。
57. 如請求項55之方法，其中該腫瘤為選自由以下組成之群的實體腫瘤：卵巢癌，包括顆粒層細胞、透明細胞、漿液性、子宮內膜樣及生殖細胞腫瘤；輸卵管癌、子宮內膜癌、腎上腺皮質腫瘤、膽囊癌、胰腺泡癌、頭頸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胰臟癌、前列腺癌、小腸腫瘤、結腸癌、腎細胞癌、腺樣囊性癌、胃癌、食道癌、腺樣囊性癌(ACC)；鱗狀細胞癌，包括皮膚癌；黑色素瘤、乳癌、膀胱癌、肝細胞癌，及子宮癌，包括子宮內膜、子宮頸、平滑肌瘤、外陰及陰道癌症。
58. 如請求項55之方法，其中該腫瘤為卵巢癌。
59. 如前述抑制、減輕或治療惡病質之方法請求項中任一項之方法，其中該個體係根據至少一種標準選擇或排除。
60. 如前述抑制、減輕或治療惡病質之方法請求項中任一項之方法，其中該投藥之功效係使用至少一種量測方法分析，該量測方法包含量測瘦體質量、脂肪質量、骨礦物質密度、脂質概況(profile)、空腹葡萄糖及/或胰島素、恆穩模型評估(HOMA)、血紅素A1c(HbA1c)或六分鐘行走距離。
61. 如前述抑制、減輕或治療惡病質之方法請求項中任一項之方法，其中投藥造成以下中之至少一者改善：個體的瘦體質量、脂肪質量、骨礦物質密度、脂質概況、空腹葡萄糖及/或胰島素、恆穩模型評估(HOMA)、血紅素A1c(HbA1c)或六分鐘行走距離。
62. 如前述抑制、減輕或治療惡病質之方法請求項中任一項之方法，其進一步包含使用至少一種量測方法，該量測方法包含量測瘦體質量、脂肪質量、骨礦物質密度、脂質概況、空腹葡萄糖及/或胰島素、恆穩模型評估(HOMA)、血紅素A1c(HbA1c)或六分鐘行走距離。
63. 一種治療個體之肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持個體之肌肉質量或減少個體之脂肪質量的方法，其包含：向該個體投與有效劑量之抑制活化素、肌肉生長抑制素及GDF-11中之至少一者的蛋白質，視情況其中該肥胖相關疾病為以下中之至少一者：遺傳性肥胖症候群、普拉德威利症候群(Prader willi syndrome)、下丘腦病症、家族性高膽固醇血症、巴德-畢德氏症候群(Bardet-Biedl syndrome)、普拉德-威利症候群(Prader-Willi syndrome)、15q11-13上之印記基因缺失所致的症候群、艾爾斯通症候群(Alstrom syndrome)、柯亨症候群(Cohen syndrome)、艾爾伯拉特遺傳性骨營養不良(Albright's hereditary osteodystrophy)(假副甲狀腺低能症)、卡本特症候群(Carpenter syndrome)、MOMO症候群、魯賓斯坦-泰必症候群(Rubinstein-Taybi syndrome)；6q16、1p36、2q37及9q34中之至少一者缺失所致的症候群；染色體14之母源單親雙染色體症、脆弱X染色體症候群、動脈粥樣硬化、非酒精性脂肝炎、內臟脂肪沈積導致一或多種有害結果的疾病、腦血管疾病、脂肪肝，及伯吉森-佛斯曼-萊曼症候群 (Börjeson-Forssman-Lehman syndrome)。
64. 如請求項63之方法，其中該個體為有需要之人類個體。
65. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該蛋白質為抗體或融合蛋白，視情況其中該融合蛋白為ActRIIB融合蛋白，視情況其中該ActRIIB融合蛋白包含與SEQ ID NO：2之胺基酸19-25、19、20、21、22、23、24或25至130-134、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中所示序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的序列，視情況其中該融合蛋白包含Fc，視情況其中Fc為IgG，視情況其中IgG為人類IgG，視情況其中ActRIIB與Fc經連接子連接。
66. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該蛋白質抑制活化素、肌肉生長抑制素及GDF-11中之至少兩者，視情況其中該蛋白質抑制活化素、肌肉生長抑制素及GDF-11。
67. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該蛋白質抑制活化素。
68. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該劑量為至少0.1-10mg/kg、0.25-5mg/kg、1-4mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg或5mg/kg。
69. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該劑量每1-5、2-4、1、2、3或4週投與該個體至少一次。
70. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少 脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該劑量係靜脈內(IV)投與該個體。
71. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該蛋白質包含或組成為SEQ ID NO：10中所示之胺基酸序列。
72. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該蛋白質係根據前述組合物請求項中任一項調配。
73. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該化合物用賦形劑調配成醫藥組合物。
74. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該個體患有以下中之至少一者：遺傳性肥胖症候群、普拉德威利症候群、下丘腦病症、家族性高膽固醇血症、巴德-畢德氏症候群、普拉德-威利症候群、15q11-13上之印記基因缺失所致的症候群、艾爾斯通症候群、柯亨症候群、艾爾伯拉特遺傳性骨營養不良(假副甲狀腺低能症)、卡本特症候群、MOMO症候群、魯賓斯坦-泰必症候群；6q16、1p36、2q37及9q34中之至少一者缺失所致的症候群；染色體14之母源單親雙染色體症、脆弱X染色體症候群、動脈粥樣硬化、非酒精性脂肝炎、內臟脂肪沈積導致一或多種有害結果的疾病、腦血管疾病、脂肪肝及伯吉森-佛斯曼-萊曼症候群。
75. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該方法使總脂肪質量、皮下脂肪質量及內臟脂肪質量中之至少一者降低。
76. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該方法使得內臟脂肪質量降低百分比大於總脂肪質量降低百分比。
77. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該方法使瘦體質量及四肢瘦肉質量中之至少一者增加，或其中該方法維持瘦體質量及四肢瘦肉質量中之至少一者。
78. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該方法使得瘦體質量及四肢瘦肉質量中之至少一者增加至少1-50%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或大於50%。
79. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該方法使得總脂肪質量、皮下脂肪質量及內臟脂肪質量中之至少一者降低至少1-99%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或大於99%。
80. 如前述治療肥胖或肥胖相關疾病、增加或維持肌肉質量或減少脂肪質量的方法請求項中任一項之方法，其中該個體患有胰島素抗性、慢性腎病、癌症及分解代謝病狀中之至少一者。
81. 一種套組，其包含如前述組合物請求項中任一項之組合物及使用說明書，視情況其中該使用說明書包含前述方法請求項中任一項之方法。
82. 如請求項81之套組，其進一步包含含有該組合物的小瓶。
83. 如請求項82之套組，其中該小瓶係針對在2-8℃儲存設計。
84. 如請求項82之套組，其中該小瓶可在2-8℃儲存。
85. 如請求項82之套組，其中該小瓶具有塞子且其中該組合物可與該塞子接觸，視情況對該蛋白質之穩定性無實質性影響。