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TW201531300A - 胜肽／β－１，３－葡聚糖複合體及其製造方法以及含有彼之醫藥組成物 - Google Patents

胜肽／β－１，３－葡聚糖複合體及其製造方法以及含有彼之醫藥組成物 Download PDF

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TW201531300A
TW201531300A TW103146265A TW103146265A TW201531300A TW 201531300 A TW201531300 A TW 201531300A TW 103146265 A TW103146265 A TW 103146265A TW 103146265 A TW103146265 A TW 103146265A TW 201531300 A TW201531300 A TW 201531300A
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TW
Taiwan
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peptide
polynucleotide
glucan
complex
derivative
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TW103146265A
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櫻井和朗
望月慎一
森下博美
Original Assignee
獨立行政法人科學技術振興機構
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Publication date
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Abstract

本發明之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體包含β-1,3-葡聚糖、與胜肽/多核苷酸結合體，該胜肽/多核苷酸結合體係抗原性胜肽與多核苷酸或其衍生物經由共價鍵鍵結而成，該胜肽/多核苷酸結合體之多核苷酸或其衍生物與β-1,3-葡聚糖經由氫鍵而鍵結，以形成具有包含一條多核苷酸或其衍生物之分子鏈與二條β-1,3-葡聚糖之分子鏈之三重螺旋結構的複合體，或者β-1,3-葡聚糖之側鏈與抗原性胜肽經由共價鍵而鍵結，該共價鍵係藉由炔烴與疊氮衍生物之加成環化反應、馬來醯亞胺基或乙烯碸基與硫醇基之反應中的任一者而生成。

Description

胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體及其製造方法以及含有彼 之醫藥組成物
本發明係關於一種新穎之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體及其製造方法以及含有彼之醫藥組成物。
利用疫苗(vaccine)預防感染之基本原理在於：藉由人為之假性感染來誘導獲得性免疫，進而產生對抗特定病原體之抗體或誘導細胞性免疫。於獲得性免疫中，已知擔當免疫之「記憶」之T細胞或B細胞發揮關鍵作用，由去氧核糖核酸(DNA)重排帶來之抗體可變區域之多樣性可針對無數抗原產生特異性免疫反應。另一方面，認為白血球、巨噬細胞(macrophage)、樹突狀細胞等吞噬細胞發揮關鍵作用之先天性免疫先前係為吞噬病原體或異物之非特異性之作用(process)，直至獲得性免疫成立為止僅作為「權宜之計」發揮作用，但根據關於先天性免疫之分子機制之研究進展而明瞭：於先天性免疫中亦進行自己或非己之特異性辨識，或先天性免疫對於獲得性免疫之成立而言係為必需的。更具體而言，根據最近之研究而明瞭：存在於樹突狀細胞、巨噬細 胞、B細胞等抗原呈現細胞中之類鐸受體(TLR)家族與各種病原體反應，誘導產生細胞介素(cytokine)，並藉由促進初始T細胞(naive T cell)向Th1細胞分化、殺手T細胞(killer T cell)之活性化等而誘導獲得性免疫。
同族TLR家族所辨識之病原體之構成成分各種各樣，於其中之一種構成成分存在有TLR9之配體，即具有CpG序列之DNA(CpG DNA)。CpG序列係為如下序列：於中心部使胞嘧啶(cytosine，C)與鳥嘌呤(guanine，G)排列之6個鹼基作為基本之序列，且係為於哺乳類中很少看到、於微生物中經常看到之鹼基序列。另外，於哺乳類中存在少數之CpG序列大部分受到甲基化。於哺乳類中幾乎不存在之非甲基化CpG序列具有強有力之免疫增強活性(例如：參照非專利文獻1至非專利文獻3)。藉由胞吞作用(endocytosis)而吞入至細胞內之CpG DNA係由存在於類吞噬體(phagosome)內質網之TLR9來辨識，以強烈地誘導Th1反應。Th1反應抑制Th2反應所主導之過敏反應(allergic reaction)，且具有強抗腫瘤活性。因此，CpG DNA除預防感染之外，亦期待作為針對過敏疾病、腫瘤性疾病之佐劑(adjuvant)而發揮作用(例如：參照非專利文獻4)。
然而，將CpG DNA用作免疫療法之佐劑時，在避免因細胞質或血漿中之核酸酶而分解，或與蛋白質進行非特異性鍵結的同時，如何使CpG DNA到達目標細胞內部成為問題。
作為新穎之基因載體(carrier)，本發明者等人著眼於具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖(以下，簡稱為「β-1,3-葡聚糖」)， 迄今為止發現β-1,3-葡聚糖與以核酸醫藥(反義DNA(antisense DNA)、CpG DNA)為首之各種核酸形成新型之複合體(例如：參照專利文獻1、專利文獻2、非專利文獻5至非專利文獻7)。
發現使以三重螺旋之形態天然存在之β-1,3-葡聚糖溶解於二甲基亞碸(DMSO)等非質子性極性有機溶劑、或0.1N以上之鹼性溶液中而解離成單鏈後，添加單鏈之核酸，將溶劑恢復成水或中性，藉此形成包含一分子核酸與二分子β-1,3-葡聚糖之三重螺旋複合體。在此種情況下，一般認為三重螺旋複合體中之β-1,3-葡聚糖分子與核酸分子主要藉由氫鍵與疏水性相互作用來形成分子間鍵結(參照非專利文獻8)。
如上所述，藉由將核酸與β-1,3-葡聚糖複合化，可在抑制核酸分子因核酸酶而進行水解，或血漿蛋白質與核酸進行非特異性鍵結等核酸分子與生物體內蛋白質之不理想之相互作用的同時，使核酸到達細胞內部。利用β-1,3-葡聚糖與核酸之複合體，進而利用包含具有抗原性之蛋白質之三元複合體，將CpG DNA成功傳送至細胞內(例如：參照專利文獻3、專利文獻4、非專利文獻9至非專利文獻11)。
[現有技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第01/34207號
[專利文獻2]國際公開第02/072152號
[專利文獻3]日本專利特開2007-174107號公報
[專利文獻4]日本專利特開2010-70307號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Bacterial CpG DNA Activates ImmuneCells to Signal Infectious Danger, H. Wagner, Adv. Immunol., 73, 329-368 (1999).
[非專利文獻2]CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects, M. Krieg, Annu. Rev. Immunol., 20, 709-760 (2002).
[非專利文獻3]The discovery of immunostimulatory DNA sequence, S. Yamamoto, T. Yamamoto, and T. Tokunaga, Springer Seminars in Immunopathology, 22, 11-19 (2000).
[非專利文獻4]「標準免疫學」第2版，醫學書院，2002年，333頁
[非專利文獻5]Molecular Recognition of Adenine, Cytosine, and Uracil in a Single-Stranded RNA by a Natural Polysaccharide: Schizophyllan. K. Sakurai and S. Shinkai, J. Am. Chem. Soc., 122, 4520-4521 (2000).
[非專利文獻6]Polysaccharide-Polynucleotide Complexes. 2. Complementary Polynucleotide Mimic Behavior of the Natural Polysaccharide Schizophyllan in the Macromolecular Complex with Single-Stranded RNA and DNA. K. Sakurai, M. Mizu and S. Shinkai, Biomacromolecules, 2, 641-650 (2001).
[非專利文獻7]Dectin-1 targeting delivery of TNF-α antisense ODNs complexed with β-1,3-glucan protects mice from LPS-induced hepatitis. S. Mochizuki and K. Sakurai, J. Control. Release, 151 (2011) 155-161.
[非專利文獻8]Structural Analysis of the Curdlan/Poly(cytidylic acid) Complex with Semiempirical Molecular Orbital Calculations. K. Miyoshi, K. Uezu, K. Sakurai and S. Shinkai, Biomacromolecules, 6, 1540-1546 (2005).
[非專利文獻9]A Polysaccharide Carrier for Immunostimulatory CpG DNAs to Enhance Cytokine Secretion, M. Mizu, K. Koumoto, T. Anada, T. Matsumoto, M. Numata, S. Shinkai, T. Nagasaki and K. Sakurai, J. Am. Chem. Soc., 126, 8372-8373 (2004).
[非專利文獻10]Protection of Polynucleotides against Nuclease-mediated Hydrolysis by Complexation with Schizophyllan, M. Mizu, K. Koumoto, T. Kimura, K. Sakurai and S. Shinkai, Biomaterials, 25, 15, 3109-3116 (2004).
[非專利文獻11]Synthesis and in Vitro Characterization of Antigen-Conjugated Polysaccharide as a CpG DNA Carrier, N. Shimada, K. J. Ishii, Y. Takeda, C. Coban, Y. Torii, S. Shinkai, S. Akira and K. Sakurai, Bioconjugate Chem., 17 1136-1140 (2006).
然而，該先前技術具有如下問題。例如，於非專利文獻11所記載之β-1,3-葡聚糖/具有抗原性之蛋白質/CpG DNA之三元複合體之製造方法中，藉由過碘酸氧化，於β-1,3-葡聚糖之側鏈之葡萄糖殘基上生成甲醯基，藉由還原性胺基化反應使甲醯基與具有抗原性之胜肽(以下，簡稱為「抗原性胜肽」)的胺基反應，以形成由β-1,3-葡聚糖與抗原性胜肽共鍵結而成之複合體，但具有收產率極低之問題。鑒於該情況，例如於專利文獻4所記載之β-1,3-葡聚糖/抗原性蛋白質(抗原性胜肽)/CpG DNA之三元複合體之製造方法中，藉由側鏈上具有甲醯基之β-1,3-葡聚糖與抗原性胜肽於鹼性水溶液中反應且同時進行中和，或於鹼性水溶液中反應逐次進行中和，而使β-1,3-葡聚糖側鏈上之甲醯基與抗原性胜肽之胺基的反應性及收率提高。然而，胜肽中存在多個胺基，因此難以控制反應點。故有產生如下問題之虞：由於抗原性胜肽之反應位置而導致免疫原性(immunogenicity)不同，或由於與β-1,3-葡聚糖之反應產物成為複雜之混合物而難以分離精製等。另外，與藉由氫鍵結形成複合體之方式來形成β-1,3-葡聚糖與DNA之複合體相比，β-1,3-葡聚糖與抗原性胜肽基於共價鍵之形成來形成複合體更為繁雜。就該等觀點而言，專利文獻4所記載之β-1,3-葡聚糖/抗原性胜肽/CpG DNA之三元複合體之製造方法於生產性等方面依然具有問題。
本發明係鑒於該等情況而完成之發明，其目的在於提供一種生產性優異、具有高免疫增強活性之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體及其製造方法以及含有彼之醫藥組成物。
根據該等目的之本發明之第一態樣係藉由提供如下胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體來解決該等問題，該胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體之特徵在於包含：具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖、及化學鍵結於該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖且具有抗原性之胜肽。
本發明中，「化學鍵結」不僅包含作為分子內鍵結之共價鍵結、配位鍵結，亦包含構成分子集團或原子集團之離子鍵結、氫鍵結及凡得瓦(van der Waals)鍵結。
於本發明之第一態樣之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體中，該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖較佳為西佐糖(sizofiran)、蘑菇多糖(lentinan)、硬葡聚糖(scleroglucan)及卡特蘭多糖(curdlan)中的任一者。
本發明之第二態樣係藉由提供如下之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體來解決該等問題，該胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體之特徵在於包含：具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖、及具有抗原性之胜肽與多核苷酸或多核苷酸衍生物經由共價鍵鍵結而成之胜肽/多核苷酸結合體(peptide/polynucleotide conjugate)，且該胜肽/多核苷酸結合體之多核苷酸或多核苷酸衍生物與該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖經由氫鍵而鍵結，以形成具有三重螺旋結構之複合體，該三重 螺旋結構包含一條該多核苷酸或多核苷酸衍生物之分子鏈與二條該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖之分子鏈。
於本發明之第二態樣之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體中，該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖較佳為西佐糖、蘑菇多糖、硬葡聚糖及卡特蘭多糖中的任一者。
於本發明之第二態樣之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體中，該多核苷酸或多核苷酸衍生物亦可係為多去氧腺苷(polydeoxyadenosine)。
於本發明之第二態樣之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體中，該多核苷酸或多核苷酸衍生物較佳為DNA或RNA之磷酸雙酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯基取代之多核苷酸衍生物。
於本發明之第二態樣之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體中，磷酸雙酯鍵之50%以上亦可經硫代磷酸酯基取代。
於本發明之第二態樣之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體中，構成該胜肽/多核苷酸結合體之該具有抗原性之胜肽與該多核苷酸或多核苷酸衍生物亦可經由共價鍵而鍵結，該共價鍵係藉由炔烴與疊氮衍生物之加成環化反應、馬來醯亞胺基與硫醇基之反應、胜肽C末端之半胱胺酸殘基之硫醇基與硫醇修飾核酸之硫醇基的反應中的任一者而生成。
本發明之第三態樣係藉由提供如下之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體來解決該等問題，該胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體之特徵在於包含：具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖、及具有抗原性之胜肽，該 胜肽經由共價鍵而與該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖之主鏈或側鏈上之葡萄糖殘基鍵結，該共價鍵係藉由炔烴與疊氮衍生物之加成環化反應、馬來醯亞胺基或乙烯碸基與硫醇基之反應中的任一者而生成。
於本發明之第三態樣之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體中，該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖較佳為西佐糖、蘑菇多糖、硬葡聚糖及卡特蘭多糖中的任一者。
本發明之第四態樣係藉由提供如下之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體來解決該等問題，該胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體之特徵在於：於本發明之第一態樣至第三態樣之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體中，更包含含有具有免疫增強活性之部分鹼基序列之多核苷酸或多核苷酸衍生物，該多核苷酸或多核苷酸衍生物與該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖係經由氫鍵而鍵結，以形成具有三重螺旋結構之複合體，該三重螺旋結構包含一條該多核苷酸或多核苷酸衍生物之分子鏈與二條該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖之分子鏈。
於本發明之第四態樣之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體中，該多核苷酸或多核苷酸衍生物之形成具有該三重螺旋結構之複合體之部分較佳為聚去氧腺苷。
於本發明之第四態樣之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體中，該多核苷酸或多核苷酸衍生物之形成具有該三重螺旋結構之複合體之部分較佳為DNA或RNA之磷酸雙酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯基取代之多核苷酸衍生物。
於本發明之第四態樣之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體中，於該多核苷酸或多核苷酸衍生物之形成具有該三重螺旋結構之複合體之部分中，DNA或RNA之磷酸雙酯鍵之50%以上亦可經硫代磷酸酯基取代。
本發明之第五態樣係藉由提供如下胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體之製造方法來解決該等問題，該製造方法係為製造胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體之方法，該胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體包含具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖、及胜肽/多核苷酸結合體，該胜肽/多核苷酸結合體係具有抗原性之胜肽與多核苷酸或多核苷酸衍生物經由共價鍵鍵結而成，該共價鍵係藉由炔烴與疊氮衍生物之加成環化反應、馬來醯亞胺基與硫醇基之反應、胜肽C末端之半胱胺酸殘基之硫醇基與硫醇修飾核酸之硫醇基的反應中的任一者而生成，該胜肽/多核苷酸結合體之多核苷酸或多核苷酸衍生物與該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖經由氫鍵而鍵結，以形成具有三重螺旋結構之複合體，該三重螺旋結構包含一條該多核苷酸或多核苷酸衍生物之分子鏈與二條該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖之分子鏈，且該製造方法之特徵在於：該胜肽/多核苷酸結合體於螯合劑的存在下利用液相層析法進行分離。
本發明之第六態樣係藉由提供如下之醫藥組成物來解決該等問題，該醫藥組成物包含：含有具有免疫增強活性之部分鹼基序列之多核苷酸或多核苷酸衍生物、及本發明之第一態樣至第三態樣之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體。
於本發明之第六態樣之醫藥組成物中，該多核苷酸 或多核苷酸衍生物亦可與具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖係經由氫鍵而鍵結，以形成具有三重螺旋結構之多核苷酸/β-1,3-葡聚糖複合體，該三重螺旋結構包含一條該多核苷酸或多核苷酸衍生物之分子鏈與二條該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖之分子鏈。
於本發明之第六態樣之醫藥組成物中，構成該多核苷酸/β-1,3-葡聚糖複合體之該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖較佳為西佐糖、蘑菇多糖、硬葡聚糖及卡特蘭多糖中的任一者。
本發明之第七態樣係藉由提供包含本發明之第四態樣之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體之醫藥組成物來解決該等問題。
藉由本發明獲得如下有利之效果。
(1)根據β-1,3-葡聚糖及抗原性胜肽之種類、分子量、組合等，可自β-1,3-葡聚糖與抗原性胜肽之共價鍵結、β-1,3-葡聚糖與胜肽/多核苷酸結合體之多核苷酸或多核苷酸衍生物間之氫鍵結中選擇β-1,3-葡聚糖與抗原性胜肽之鍵結方式，因此關於廣泛的β-1,3-葡聚糖與抗原性胜肽之組合，可獲得胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體。
(2)藉由使用炔烴與疊氮衍生物之加成環化反應、馬來醯亞胺基與硫醇基之反應(麥可(Michael)加成反應)中的任一者作為生成β-1,3-葡聚糖與抗原性胜肽之共價鍵的反應，可於包含水之極性溶劑中迅速且高效地進行反應。故可於短時間內以高收率獲得胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，且分離精製所需要之時間亦 可減少。因此，本發明之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體之生產性優異，且可以低成本製造。
(3)藉由使用本發明之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，與單獨使用抗原性勝肽之情形相比，可更有效地進行對抗原性胜肽而言具特異性之免疫反應(immune response)之誘導。
(4)藉由將本發明之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體與含有具有免疫增強活性之部分鹼基序列之多核苷酸或多核苷酸衍生物組合使用，或使用胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，可更有效地進行免疫反應之誘導，該胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體更包含含有具有免疫增強活性之部分鹼基序列之多核苷酸或多核苷酸衍生物，多核苷酸或多核苷酸衍生物與β-1,3-葡聚糖經由氫鍵而鍵結，以形成具有包含一條多核苷酸或多核苷酸衍生物之分子鏈與二條β-1,3-葡聚糖之分子鏈之三重螺旋結構之複合體。
(5)包含本發明之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體之醫藥組成物，與單獨使用抗原性勝肽之情形相比，針對廣泛的抗原性胜肽更能有效地誘導特異性免疫反應。因此，可期待用作疫苗或免疫增強劑。
第1圖係實施例1中dA40(S)(炔烴)與OVA(N3)之化學結構。
第2圖係表示實施例1中製作抗原性胜肽/多核苷酸結合體之結果的高效液相層析法(HPLC)層析圖。
第3圖係表示實施例2中抗原性胜肽-dA40(S)與SPG進行複合化之結果的凝膠電泳照片。
第4圖係表示對實施例3中之抗原性胜肽特異性IFN-γ之產生量進行定量之結果的圖表，該抗原性胜肽特異性IFN-γ係藉由以抗原性胜肽刺激各樣品中經免疫誘導之小鼠脾臟細胞而產生。
第5圖係表示實施例4中以抗原性胜肽刺激各樣品中經免疫誘導之小鼠脾臟細胞而增殖的抗原性胜肽特異性細胞毒性T細胞之比例的圖表。
第6圖係表示實施例5中製作胜肽/CpG/SPG三元複合體之結果的凝膠電泳照片。
第7圖係表示對實施例6中之抗原性胜肽特異性IFN-γ之產生量進行定量之結果的圖表，該抗原性胜肽特異性IFN-γ係藉由以抗原性胜肽刺激各樣品中經免疫誘導之小鼠脾臟細胞而產生。
第8圖係表示實施例7中以抗原性胜肽刺激各樣品中經免疫誘導之小鼠脾臟細胞而增殖的抗原性胜肽特異性細胞毒性T細胞之比例的圖表。
第9圖係表示對實施例8中之抗原性胜肽特異性IFN-γ之產生量進行定量之結果的圖表，該抗原性胜肽特異性IFN-γ係藉由以抗原性胜肽刺激各樣品中經免疫誘導之小鼠脾臟細胞而產生。
以下將對本發明具體化之實施例加以說明，用於理解本發明。
本發明之第1實施例之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體包含具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖(β-1,3-葡聚糖)、及胜肽/多核苷酸結合體，該胜肽/多核苷酸結合體係具有抗原性之胜肽(抗原性胜肽)與多核苷酸或多核苷酸衍生物經由共價鍵鍵結而成。胜肽/多核苷酸結合體之多核苷酸或多核苷酸衍生物與β-1,3-葡聚糖經由氫鍵而鍵結，以形成具有包含一條多核苷酸或多核苷酸衍生物之分子鏈與二條該β-1,3-葡聚糖之分子鏈之三重螺旋結構的複合體。
(1)β-1,3-葡聚糖
β-1,3-葡聚糖只要為可形成具有包含一條多核苷酸或多核苷酸衍生物之分子鏈與二條β-1,3-葡聚糖之分子鏈之三重螺旋結構的複合體者，則可無特別限制地使用任意種類、分子量者。已知具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖具有與poly(C)等核酸近似之螺旋參數(例如：參照高橋、小畠、鈴木，Prog.Polym.Phys.Jpn.(日本聚合物物理學進展)27卷，767頁；以及「Conformation of Carbohydrates(碳水化合物之構象)」，Harwood academic publisher (哈伍德學術出版社)，1998年)，且具有可與核酸鹼基進行氫鍵結之羥基，因此與核酸相互作用，以形成具有三重螺旋結構之穩定之複合體。作為β-1,3-葡聚糖之具體例子係如：西佐糖、卡特蘭多糖、蘑菇多糖、茯苓聚糖(pachyman)、灰樹花多糖(grifolan)、硬葡聚糖等。該等係為主鏈由β-鍵(β-D-鍵)鍵結之葡聚糖，且係為側鏈之頻率不同之天然多糖。該等β-1,3-葡聚糖可不進行化學修飾等處理而直接使用，但亦可使用通常之過碘酸氧化法將其側鏈適當地拉長間隔，藉此控制其溶解性。
β-1,3-葡聚糖之分子量係根據胜肽/核苷酸結合體中包含之多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基序列及鹼基長等而適宜調節。然而，若分子量小則所謂之群集效應(cluster effect)(高分子系之協同現象)難以顯現而不佳。通常，可與核酸形成複合體之β-1,3-葡聚糖的重量平均分子量(每一條分子鏈)係因核酸鹼基之種類或高次結構而異，較佳為2000以上，更佳為4000以上，進一步較佳為6000以上。另外，與多核苷酸上之核酸鹼基形成氫鍵之羥基的數量通常需要五個以上，較佳為需要8個以上，進一步較佳為需要10個以上。
再者，可使用光散射法、沈降速度法(超離心法)等任意公知之方法來決定β-1,3-葡聚糖之重量平均分子量。
β-1,3-葡聚糖通常由菌類或真細菌(eubacteria)產生，因此可藉由如下方式獲得：於對該等微生物進行培養後，使菌體均質化，然後利用超離心法等方法自細胞溶出部分或不溶性殘渣等雜質中分離。通常，以此種方式獲得之β-1,3-葡聚糖係為高分子量(重量平均分子量係為幾十萬左右)且取得三重螺旋結構。亦可視需要進行低分子化後使用。低分子化係根據β-1,3-葡聚糖之種類或所期望之分子量，自酵素分解、酸水解等適宜地選擇適當之方法及條件來進行。例如，於西佐糖之情況下，藉由利用80%DMSO-硫酸之水解等，可獲得具有各種分子量之單鏈西佐糖。
(2)胜肽/多核苷酸結合體
胜肽/多核苷酸結合體係為抗原性胜肽與多核苷酸或多核苷酸衍生物經由共價鍵而鍵結之複合體。與抗原性胜肽鍵結之多核苷 酸或多核苷酸衍生物，藉由如上所述與β-1,3-葡聚糖之間形成具有三重螺旋結構之複合體，發揮使抗原性胜肽與β-1,3-葡聚糖鍵結之作用。
「具有抗原性之胜肽」係為具有抗原性者，即於生物體之免疫系統中被辨識為異物且引起特異性之抗體產生(誘導免疫反應)者，則可無特別限制地使用具有任意胺基酸序列及胺基酸殘基數者。本實施例中製造胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體時所使用之抗原性胜肽可例如：引起食物過敏等過敏性蛋白質、源自細菌、病毒等病原體、腫瘤細胞等可作為抗原決定位(epitope)而發揮作用之具有部分胺基酸序列之蛋白質。構成抗原性胜肽之胺基酸殘基數只要可作為抗原決定位而發揮作用，則並無特別限制，大多數情況下係在5至30之範圍內，大部分處於8至17左右之範圍內。
抗原性胜肽係使用起源自酵素分解、胜肽合成等任意公知方法而獲得之蛋白質。另外，抗原性胜肽之胺基酸序列可利用使用胜肽矩陣法(peptide array)之抗原決定位解析等任意公知方法來決定。
與抗原性胜肽鍵結之多核苷酸或多核苷酸衍生物係如上所述，只要可與β-1,3-葡聚糖之間形成具有三重螺旋結構之複合體，則可為無特別限制地使用具有任意之鹼基序列及鹼基數之多核苷酸或其衍生物。多核苷酸之具體例子係如：與β-1,3-葡聚糖具有高鍵結能力之多核糖腺苷酸(polyriboadenylic acid，poly A)、多核糖胞苷酸(polyribocytidylic acid，poly C)、多去氧核糖腺苷酸(polydeoxyriboadenylic acid，poly(dA))、多去氧核糖胸苷酸 (polydeoxyribothymidylic acid，poly(dT))。多核苷酸之鹼基數係如上所述，只要可與β-1,3-葡聚糖之間形成具有三重螺旋結構之複合體，則並無特別限制，為提高複合體形成能力，多核苷酸較佳為與β-1,3-葡聚糖具有高鍵結能力之多核糖腺苷酸(poly A)、多胞苷酸(poly C)、多去氧核糖腺苷酸(poly(dA))、多去氧核糖胸苷酸(poly(dT))中之任一者之重複序列。構成較佳之重複序列之鹼基及核苷酸的種類及鹼基數係根據核糖核苷酸(ribonucleotide)部分之長度、所使用之β-1,3-葡聚糖的種類及分子量等而適宜地決定。例如於使用西佐糖作為β-1,3-葡聚糖之情形下，多去氧核苷酸部分較佳為具有poly(dA)序列作為重複序列。關於重複序列之長度，若鹼基數少，則難以藉由與β-1,3-葡聚糖之氫鍵結而形成三重螺旋結構，因此鹼基數必須為10以上，較佳為20至80，更佳為30至80。
多核苷酸於生物體內容易受到核酸酶之分解，因此為提高於生物體內之穩定性，亦可使用多核苷酸衍生物代替多核苷酸。多核苷酸衍生物之實例係如：核糖核苷酸之2號位置之羥基之全部或一部分經氟或甲氧基取代者、多核糖核苷酸(polyribonucleotide，RNA)或多去氧核糖核苷酸(polydeoxyribonucleotide，DNA)之磷酸雙酯基之全部或一部分經硫代磷酸酯基取代者等。於多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸之磷酸雙酯基之一部分經硫代磷酸酯基取代之情形下，較佳為磷酸雙酯鍵之50%以上經硫代磷酸酯基取代。經硫代磷酸酯基取代之磷酸雙酯基之位置並無特別限制，可為連續的多個磷酸雙酯基經取代，或者亦可以硫代磷酸酯基不相互鄰接之方式經取代。
多核苷酸或多核苷酸衍生物亦可與抗原性胜肽之N末端、C末端、或側鏈中之任一者鍵結。二者可藉由適當之反應性官能基彼此反應而直接鍵結，亦可經由適當之間隔物(spacer)而鍵結。反應性官能基可直接使用存在於抗原性胜肽及多核苷酸或多核苷酸衍生物中之官能基，或可使用藉由化學修飾將該等官能基活性化而成者，亦可導入適當之反應性官能基。另外，多核苷酸或多核苷酸衍生物可以5'末端與抗原性胜肽鍵結，亦可以3'末端鍵結。
較佳之胜肽/多核苷酸結合體之一實例係如下式(A)所示，具有在胜肽之C末端鍵結有硫代磷酸酯化多聚去氧腺苷酸(polyA之磷酸雙酯基被取代為硫代磷酸酯基之多核苷酸衍生物)之5'末端之結構。
[抗原性胜肽]-X-(dA(S))x (A)
再者，式(A)中，dA(S)表示硫代磷酸酯化去氧腺苷酸(deoxyadenylic acid)，x為例如20以上、80以下之整數。X表示藉由間隔物或反應性官能基彼此反應而形成之官能基。間隔物之一實例係可如烷基、聚乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)等。反應性官能基之組合的實例係如用於將生物體分子固定於生物晶片(biochip)表面之反應性官能基彼此之組合，更具體而言係例如以下者。
(a)炔烴與疊氮化合物
炔烴與疊氮化合物(疊氮化物)藉由如下所示之加成環化反 應(胡伊斯根(Huisgen)反應)而形成1,2,3-三唑環。二者之官能基係可導入至包含生物體分子之大多數有機化合物之穩定的官能基中，即便於包含水之溶劑中亦可迅速且大致定量地反應，幾乎不伴隨有副反應且不會生成多餘之廢棄物，故作為所謂「點擊化學(click chemistry)」之關鍵反應而廣泛用於生物化學領域。炔烴衍生物及疊氮基可使用任意公知之方法而導入至抗原性胜肽或者多核苷酸或多核苷酸衍生物中。炔烴衍生物可容易地獲取炔丙醇、炔丙胺等具有反應性之官能基，該等官能基可與羧基或羥基等反應性官能基直接反應，或者與羰基二咪唑等一起反應，且經由所生成之醯胺鍵、酯鍵、胺基甲酸酯鍵等而導入炔烴衍生物。關於疊氮基，亦可使用任意公知之方法而導入至抗原性胜肽或者多核苷酸或多核苷酸衍生物中。再者，胡伊斯根反應係於銅觸媒存在下進行，但於抗原性胜肽及將磷酸二酯基以硫代磷酸酯基等含硫官能基取代之多核苷酸衍生物中，存在配位於銅離子上之硫原子，因此有銅觸媒活性降低之虞。為提高反應率，較佳為添加過量的銅。
(b)馬來醯亞胺或乙烯碸及硫醇基
與吸電子性之羰基或碸基鄰接之具有雙鍵的馬來醯亞胺或乙烯碸的pH接近中性，且如以下所示藉由與硫醇基進行加成反應(麥可加成反應)，而生成穩定之硫醚衍生物。因市售有具有適當之間 隔物的馬來醯亞胺及乙烯碸衍生物，因此容易將該等官能基導入至抗原性胜肽或者多核苷酸或多核苷酸衍生物中。於將硫醇基導入至抗原性胜肽時，在抗原性胜肽包含半胱胺酸的情形下，可利用半胱胺酸殘基側鏈之硫醇基。其中，半胱胺酸係為存在比率低之胺基酸，故使用在抗原性胜肽之C末端導入有半胱胺酸而成者。作為包含硫醇基之多核苷酸或多核苷酸衍生物，係使用將該等之5'末端之羥基轉變成硫醇基而成之硫醇化多核苷酸。
(c)半胱胺酸側鏈之硫醇基與硫醇化多核苷酸之硫醇基
以如上方式，使於C末端導入有半胱胺酸之抗原性胜肽之半胱胺酸殘基側鏈的硫醇基與硫醇化多核苷酸的硫醇基反應，以形成二硫化物基。二硫化物鍵於還原劑存在下被切斷，因此與以上二者相比，穩定性較差。
(3)胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體之製造
西佐糖等β-1,3-葡聚糖通常於水中呈現三重螺旋結構。因此，為與多核苷酸或多核苷酸衍生物形成複合體，溶解於如DMSO之溶劑中來解除由分子間氫鍵及疏水性相互作用所產生之締合狀態，而變成單鏈。若於其中添加含有多核苷酸之水溶液(或者醇等極性溶劑之溶液)，則伴隨溶劑之極性增大，多核苷酸與β-1,3-葡聚 糖藉由疏水性相互作用而締合，一方面導入多核苷酸之分子鏈，一方面於分子內及分子間形成多核苷酸與多糖之締合體。結果，形成具有包含一分子之多核苷酸或多核苷酸衍生物與二分子之β-1,3-葡聚糖分子的三重螺旋結構的複合體。複合體之形成可例如藉由測定圓偏光二色性(Circular Dichroism，CD)光譜，並藉由調查構形(conformation)變化來確認。
本發明之第二實施例之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體包含具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖、及具有抗原性之胜肽，該胜肽係經由藉由炔烴與疊氮衍生物之加成環化反應、馬來醯亞胺基或乙烯碸基與硫醇基之反應中的任一者而生成之共價鍵，而鍵結於該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖之主鏈或側鏈上的葡萄糖殘基。
於本實施例中製造胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體時所使用之抗原性胜肽、β-1,3-葡聚糖，係與本發明之第一實施例中製造胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體時所使用之抗原性胜肽、β-1,3-葡聚糖相同，因此不再予以贅述。β-1,3-葡聚糖與抗原性胜肽經由藉由炔烴與疊氮衍生物之加成環化反應、馬來醯亞胺基或乙烯碸基與硫醇基之反應中的任一者而生成之共價鍵來鍵結。抗原性胜肽可鍵結於β-1,3-葡聚糖分子之主鏈及側鏈之葡萄糖殘基中的任一者上，若慮及立體阻礙，較佳為鍵結於側鏈之葡萄糖殘基上。另外，抗原性胜肽亦可鍵結於N末端及C末端中的任一者上，或者亦可於側鏈上鍵結，若慮及與抗原呈現細胞接觸時之立體阻礙，較佳為於N末端或C末端與β-1,3-葡聚糖鍵結。關於將炔烴衍生物及疊氮基導入β-1,3-葡聚糖及抗原性胜肽中，可與本發明之第一實施例中製造 胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體時之胜肽/核苷酸結合體的情形相同，使用任意公知之方法來進行。
本發明之第三實施例之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體係於該等本發明之第一或第二實施例之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體中，更包含含有具有免疫增強活性之部分鹼基序列之多核苷酸或多核苷酸衍生物，多核苷酸或多核苷酸衍生物與β-1,3-葡聚糖經由氫鍵而鍵結，以形成具有包含一條多核苷酸或多核苷酸衍生物之分子鏈與二條β-1,3-葡聚糖之分子鏈的三重螺旋結構複合體(包含抗原性胜肽、β-1,3-葡聚糖、多核苷酸或多核苷酸衍生物之三元複合體)。
於本實施例中製造胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體時所使用之抗原性胜肽、β-1,3-葡聚糖、多核苷酸或多核苷酸衍生物中，與β-1,3-葡聚糖經由氫鍵而鍵結之部分，係與本發明之第一、第二實施例中製造胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體時所使用者相同，故不再予以贅述。
多核苷酸或多核苷酸衍生物中具有免疫增強活性之部分鹼基序列的具體實例係如：經由TLR9之辨識，且將先天性免疫與獲得性免疫「橋接」，藉此使免疫活性化之源自細菌(bacteria)或病毒之非甲基化CpG DNA；經由TLR3之辨識，且將先天性免疫與獲得性免疫「橋接」，藉此使免疫活性化之源自病毒之雙鏈RNA；經由類RIG-I螺旋酶受體(RLR)之辨識而使免疫活性化之病毒基因組(virus genome)RNA或人工RNA等。
如上所述之RNA或DNA與多核苷酸或多核苷酸衍生 物之混合物(hybrid)可使用任意公知之方法來獲取或合成，該RNA或DNA含有具有免疫增強活性之部分鹼基序列，該多核苷酸或多核苷酸衍生物與β-1,3-葡聚糖經由氫鍵而鍵結且含有部分鹼基序列。再者，當多核苷酸或多核苷酸衍生物為在DNA之3'末端鍵結有RNA5'末端之嵌合核酸(chimeric nucleic acid)，RNA與DNA間之磷酸雙酯鍵特別容易受到分解，因此較佳為以甲氧基或氟基取代與DNA鍵結之RNA5'末端核苷酸中2號位置的羥基，及/或以硫代磷酸酯基將與DNA鍵結之最初的核糖核苷酸之3號位置以及與3號位置鄰接之RNA5號位置間的磷酸雙酯基等取代的衍生物化，從而提高對水解之耐受性。
本實施例之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體系藉由以下之任一方法而製造。
(1)使用與本發明第一實施例之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體之製造方法相同的方法，將該等β-1,3-葡聚糖、胜肽/核苷酸結合體及多核苷酸或多核苷酸衍生物複合化。
(2)使用與本發明第一實施例之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體之製造方法相同的方法，將本發明之第二實施例之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體與多核苷酸或多核苷酸衍生物複合化。
本發明之第四實施例之醫藥組成物(以下，簡稱為「醫藥組成物」)係包含：多核苷酸/β-1,3-葡聚糖複合體、本發明之第一或第二實施例之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體、或本發明之第三實施例之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，該多核苷酸/β-1,3-葡聚糖複合體係藉由含有具有免疫增強活性之部分鹼基序列之多核苷酸或多 核苷酸衍生物與β-1,3-葡聚糖骨架經由氫鍵鍵結而形成，且該多核苷酸/β-1,3-葡聚糖複合體具有包含一條多核苷酸或多核苷酸衍生物之分子鏈與二條具有該β-1,3-葡聚糖骨架之多糖之分子鏈的三重螺旋結構。
關於多核苷酸/β-1,3-葡聚糖複合體，除使用核苷酸或多核苷酸衍生物代替胜肽/核苷酸結合體以外，係使用與本發明第一實施例之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體相同之方法來製造。
於製造醫藥組成物時，除作為有效成分之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體及多核苷酸/β-1,3-葡聚糖複合體以外，亦可使用任意公知之成分(醫藥用途所容許之任意載體、賦形劑及添加物)及配製方法。例如，醫藥組成物可呈錠劑、栓劑、膠囊劑、糖漿劑、奈米凝膠等微型膠囊劑、殺菌液劑、懸浮液劑(suspension agent)等注射劑、氣溶膠(aerosol)、噴霧劑(spraying agent)等形態。
醫藥組成物對於人或恆溫動物(小鼠(mouse)、大鼠(rat)、兔、羊、豬、牛、馬、鶏、貓、狗、猴子等)，亦可經由口服及非口服路徑中的任一者來投藥。非口服投藥路徑係如：皮下注射、皮內注射及肌肉注射、腹腔內投藥、點滴、對鼻黏膜或咽部噴霧等。
活性成分之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體及多核苷酸/β-1,3-葡聚糖複合體之用量係根據活性、即將治療對象所患之疾病、即將投藥之對象之動物種類、體重、性別、年齡、疾病之嚴重程度、投藥方法等而不同。以體重60公斤的成人為例，於口服投藥的情形下，每日之用量通常為約0.1毫克至約100毫克，較佳為 約1.0毫克至約50毫克，更佳為約1.0毫克至約20毫克，於非口服投藥的情形下，每日之用量通常為約0.01毫克至約30毫克，較佳為約0.1毫克至約20毫克，更佳為約0.1毫克至約10毫克。對其他動物投藥時，係使用將該用量換算成每單位體重之用量後，乘以即將投藥之對象的動物體重所獲得之用量。
醫藥組成物可用以作為治療及預防感染症、癌等腫瘤之疫苗，該感染症係由使免疫活性化之細菌、病毒等病原體的感染所引起。
[實施例]
接著，將對用以確認本發明之作用效果而進行之實施例加以說明。
實施例1：抗原性胜肽/多核苷酸結合體之製作
本實施例中，對多核苷酸衍生物(下稱「dA40(S)(炔烴)」)(自基因設計(GeneDesign)股份有限公司購入)與抗原性胜肽(下稱「OVA(N3)」)(自基因設計(GeneDesign)股份有限公司購入)之抗原性胜肽/多核苷酸結合體(下稱「OVA胜肽-dA40(S)」)之製作進行研究，該多核苷酸衍生物係將炔烴導入具有如下結構之多核苷酸衍生物(下稱「dA40(S)」)之5'末端而成，該結構係為將去氧腺嘌呤40聚體中之磷酸二酯鍵全部取代為硫代磷酸酯鍵而成，該抗原性胜肽係將疊氮基導入源自卵白蛋白(ovalbumin，OVA)之抗原性胜肽(胺基酸序列：SIINFEKL(序列編號1))之C末端而成。化學結構係分別示於第1圖中。
以達到OVA(N3)(最終濃度：10微莫耳濃度至800微莫耳濃度，溶劑：水+DMSO)、dA40(S)(炔烴)(最終濃度：10微莫耳濃度，溶劑：水)、硫酸銅(II)五水合物(最終濃度：1.5毫莫耳濃度，溶劑：水)、抗壞血酸鈉(最終濃度：3.0毫莫耳濃度，溶劑：水)、(三(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺(最終濃度：0.6毫莫耳濃度，溶劑：DMSO)之方式進行混合，於室溫下使用銅觸媒進行點擊化學反應，歷時1小時。反應後，以作為螯合劑之pH為7.4之乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)溶液(最終濃度：20毫莫耳濃度以上)來稀釋樣品溶液後，進行HPLC測定。dA40(S)與HPLC管柱之相互作用強而有力，難以溶出，因此藉由添加EDTA，減弱其相互作用，進而使其容易溶出。
HPLC測定中，使用Inertsil ODS-3(GL科技(GL Science)公司)作為管柱，使用0.1莫耳濃度之三乙基胺-乙酸(TEAA)緩衝液(pH為7.0)與乙腈作為溶離液，且使用二極體陣列作為檢測器，來追蹤260奈米下之dA40(S)(炔烴)之UV吸收變化。將結果示於第2圖。藉由添加胜肽確認到dA40(S)(炔烴)的峰值隨著胜肽量自第17分鐘附近向第20分鐘附近偏移。於使用逆相管柱的測定中，溶出時間變遲緩顯示分子更具疏水性。根據該結果可知生成了OVA胜肽-dA40(S)。
實施例2：抗原性胜肽/多核苷酸結合體與具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖的複合化
本實施例中作為具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖而使用之西佐糖(SPG)係使用日本專利特開2010-174107號公報之實施例中所 記載之方法而獲得。利用規定之方法將其精製。藉由GPC算出分子量，結果於單鏈狀態下係為15萬，於三鏈狀態下係為45萬。對該SPG與實施例1所製備之OVA胜肽-dA40(S)之複合化進行研究。
如上所述，SPG等β-1,3-葡聚糖於鹼性水溶液中解離成單鏈，若藉由添加磷酸緩衝液而中和包含β-1,3-葡聚糖之溶液，則三分子之β-1,3-葡聚糖經由氫鍵締合，進而再生成三重螺旋結構。本發明者發現：此時混合物中若存在dA40(S)等多核苷酸或多核苷酸衍生物，則一分子之多核苷酸或多核苷酸衍生物與二分子之β-1,3-葡聚糖經由氫鍵及疏水性相互作用而締合，生成具有三重螺旋結構之複合體。本實施例中係加以查證抗原性胜肽-dA40(S)與SPG之組合中，是否同樣地生成具有三重螺旋結構之複合體，該抗原性胜肽-dA40(S)係抗原性胜肽係鍵結於作為多核苷酸或多核苷酸衍生物之一實例的dA40(S)。
於0.25N之NaOH溶液中溶解SPG(15毫克/毫升)，為使完全解離成單鏈而放置2天以上。將OVA胜肽-dA40(S)之10%二甲基亞碸(DMSO)水溶液(以含有10體積%之DMSO的水作為溶劑之溶液。以下相同)與磷酸緩衝液(330毫莫耳濃度之NaH2PO4，pH為4.5)混合後，添加該SPG溶液並攪拌。接著，調整各溶液之濃度，以使SPG與OVA胜肽-dA40(S)之混合比率以莫耳比計為3：1，且SPG溶液與磷酸緩衝液之體積比率為1：1。於4℃下靜置一晚後，再於攪拌後進行反應混合物之丙烯醯胺凝膠電泳。為用於比較，亦對抗原性胜肽-dA40(S)進行丙烯醯胺電泳。
電泳後以SYBR Gold將丙烯醯胺凝膠染色，並拍攝螢 光圖像，將其結果示於第3圖。於攪拌後之反應混合物的電泳道(lane)(電泳道2：complex(peptide/SPG))中確認到：於電泳道1(peptide-dA40(S))中所觀測到的OVA胜肽-dA40(S)之譜帶(band)的消失。根據該結果可知：OVA胜肽-dA40(S)與SPG複合化，會生成更高分子量之複合體(OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體)。
實施例3：評估抗原性胜肽與SPG複合化對小鼠脾細胞中抗原性胜肽之抗原特異性免疫反應所帶來的影響
對小鼠(C57BL/6小鼠，雄性，7周齡)進行皮內投藥(1次)：(1)源自卵白蛋白(OVA)之具有胺基酸序列(序列編號1)之抗原性胜肽(OVA胜肽)(5微克)、(2)OVA胜肽(5微克)及CpG DNA(鹼基序列：ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(序列編號2))(30微克)、(3)OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體(參照實施例1，5微克)、(4)OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體(實施例1所製備，5微克)及CpG DNA(30微克)、(5)OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體(5微克)及弗氏不完全佐劑(Incomplete Freund adjuvant，IFA)(30微克)中的任一者。投藥一週後，自小鼠採取脾細胞，然後於96孔盤中播種(1.0×106細胞/孔)並以OVA胜肽刺激(10微克/毫升)，以研究是否誘導抗原特異性干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)。
於以OVA胜肽刺激脾細胞24小時後，利用酵素結合免疫測定法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，定量培養基中IFN-γ的量，結果示於第4圖。於僅投予OVA胜肽時、同時投予OVA胜肽及CpG DNA時、僅投予OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體時，並未看到對OVA胜肽而言具特異性之干擾素反應。即便 於同時投予OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體與市售之佐劑(即，弗氏不完全佐劑(IFA))時，該反應亦非常小。然而，於同時投予OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體與CpG DNA時，可誘發顯著的免疫反應(IFN-γ之產生量增大)。認為其原因在於：於僅投予OVA胜肽時，自體內迅速排除，相對於此，藉由將OVA胜肽-dA40(S)與SPG複合化，可促進抗原呈現細胞之吞入，且藉由施加CpG DNA對TLR 9之刺激，增加抗原特異性T細胞之比例。
實施例4：評估抗原性胜肽與SPG之複合化對抗原性胜肽特異性之細胞毒性T細胞之誘導能力所帶來的影響
將小鼠脾細胞培養6天，進行抗體染色後，使用流式細胞儀(flow cytometer)，評估對OVA胜肽而言具特異性之細胞毒性(CD8陽性)T細胞之比例，該小鼠脾細胞係採取自實施例3之小鼠，其係皮內投藥有(1)OVA胜肽、(2)OVA胜肽及CpG DNA、(3)OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體、(4)OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體及CpG DNA中任一者，且藉由OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體而受到刺激。
將脾細胞中對OVA胜肽而言具特異性之CD8陽性T細胞之比例示於第5圖。且確認到：於僅投予OVA胜肽(peptide)時、同時投予OVA胜肽及CpG DNA(peptide+CpG)時、僅投予OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體(peptide/SPG)時的任一者，對OVA胜肽而言具特異性之CD8陽性T細胞之比例均少。於同時投予OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體與CpG DNA(peptide/SPG+CpG)時，對OVA胜肽而言具特異性之CD8陽性T細胞之比例顯著增加。
實施例5：抗原性胜肽、含有具有免疫增強活性之部分鹼基序列之多核苷酸衍生物、及具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖的複合化
對SPG、OVA胜肽-dA40(S)、CpG DNA-dA40(S)同時進行複合化加以研究。
於0.25N之NaOH溶液中溶解SPG(15毫克/毫升)，為完全解離成單鏈而放置2天以上。將CpG DNA-dA40(S)(具有在CpG DNA之3'-末端鍵結有dA40(S)之結構的多核苷酸衍生物)之水溶液、OVA胜肽-dA40(S)之10%DMSO水溶液與磷酸緩衝液(330毫莫耳濃度之NaH2PO4，pH為4.5)混合後，添加該SPG溶液並攪拌。接著，調整各溶液之濃度，使SPG與OVA胜肽-dA40(S)之混合比、SPG與CpG DNA-dA40(S)之混合比，以莫耳比計均為3：1，且使SPG溶液與磷酸緩衝液之體積比為1：1。
電泳後以SYBR Gold將丙烯醯胺凝膠染色，並拍攝螢光圖像，將其結果示於第6圖。於攪拌後之反應混合物之電泳道(電泳道3：complex(peptide/CpG/SPG))中確認到：於電泳道1中所觀測到的OVA胜肽-dA40(S)之譜帶以及於電泳道2中所觀測到的CpG DNA-dA40(S)之譜帶均消失。根據該結果可知：抗原性胜肽-dA40(S)及CpG DNA-dA40(S)二者與SPG複合化，會生成更高分子量之複合體(OVA胜肽-dA40(S)/CpG DNA-dA40(S)/SPG三元複合體)。本實施例中，調節SPG、OVA胜肽-dA40(S)及CpG DNA-dA40(S)之莫耳比，以使三元複合體每一分子最大包含七條dA40(S)之分子鏈。另外，認為OVA胜肽-dA40(S)及CpG DNA-dA40(S)之莫耳比係為1：1，且二者之間並不存在與SPG形成複合體之能力的差異，因此認為生成三元複合體。
使用OVA胜肽以外之抗原性胜肽，對下述具有胺基酸序列之抗原性胜肽/核苷酸結合體，藉由以上所述之方法來製備三元複合體。
實施例6：評估抗原性胜肽/CpG/SPG三元複合體之胜肽特異性免疫反應
對小鼠(C57BL/6小鼠，雄性，7週齡)進行皮內投藥(1次)： (1)實施例2所製備之OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體(5微克)、(2)OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體(5微克)及CpG DNA(30微克)、(3)OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體(5微克)及CpG DNA-dA40(S)/SPG複合體(除未使用OVA胜肽-dA40(S)之10%DMSO水溶液以外，以與實施例5相同之方法製備；30微克)、(4)實施例5所製備之OVA胜肽-dA40(S)/CpG DNA-dA40(S)/SPG三元複合體(5微克)中的任一者。投藥1週後，自小鼠採取脾細胞，然後於96孔盤中播種(1.0×106細胞/孔)並以OVA胜肽刺激(10微克/毫升)，以研究是否誘導抗原特異性干擾素-γ(IFN-γ)。
於以OVA胜肽刺激脾細胞24小時後，利用酵素結合免疫測定法(ELISA)，定量培養基中IFN-γ的量，結果示於第7圖。如實施例3所示，於僅投予OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體時，無法誘導對OVA胜肽而言具特異性之干擾素反應，若同時投予OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體及CpG DNA，則會誘導強的干擾素反應。藉由進而投予OVA胜肽-dA40(S)/CpG DNA-dA40(S)/SPG三元複合體，亦確認到與同時投予OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體及CpG DNA時相同程度之干擾素誘導。頗有意思的係為於同時投予OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體及CpG DNA-dA40(S)/SPG複合體時，會誘導強的干擾素反應。根據該等結果可知：藉由投予OVA胜肽-dA40(S)/CpG DNA-dA40(S)/SPG三元複合體，亦可分別發揮OVA胜肽被抗原呈現細胞吞入及CpG DNA經由TLR 9而刺激細胞之效果。
實施例7：評估抗原性胜肽/CpG/SPG三元複合體胜肽 對特異性細胞毒性T細胞之誘導能力
將小鼠脾細胞培養6天，進行抗體染色後，使用流式細胞儀，評估對OVA胜肽而言具特異性之細胞毒性(CD8陽性)T細胞之比例，該小鼠脾細胞係採取自實施例6之小鼠，其皮內投藥有(1)OVA胜肽、(2)OVA胜肽及CpG DNA、(3)OVA胜肽及CpG DNA-dA40(S)/SPG複合體、(4)實施例5中製備之OVA胜肽-dA40(S)/CpG DNA-dA40(S)/SPG三元複合體中的任一者，且藉由OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體而受到刺激。
CD8陽性T細胞中，對OVA胜肽而言具特異性之CD8陽性T細胞之比例係示於第8圖。與僅投予OVA胜肽之情形(peptide)、同時投予OVA胜肽及CpG DNA之情形(peptide+CpG)相比較，投予OVA胜肽-dA40(S)/SPG複合體及CpG DNA-dA40(S)/SPG複合體(peptide+CpG/SPG)、或投予OVA胜肽-dA40(S)/CpG DNA-dA40(S)/SPG三元複合體(peptide/CpG/SPG)時，可使對OVA胜肽而言具特異性之CD8陽性T細胞的之比例增大。
實施例8：對於源自黑素瘤細胞之特異性抗原蛋白質之免疫反應(評估利用抗原性胜肽/CpG/SPG三元複合體之胜肽特異性免疫反應)
對小鼠(C57BL/6小鼠，雄性，7週齡)進行皮內投藥(1次)：(1)使用抗原性胜肽(gp100)，根據實施例1、實施例2同樣地製備之gp100胜肽-dA40(S)/SPG複合體(5微克)及CpG DNA-dA40(S)/SPG複合體(30微克)，該抗原性胜肽具有源自小鼠 黑素瘤細胞之特異性抗原蛋白質之胺基酸序列(EGSRNQDWL(序列編號3))、(2)根據實施例5同樣地製備之gp100胜肽-dA40(S)/CpG DNA-dA40(S)/SPG三元複合體(5微克)中的任一者。投藥1週後，自小鼠採取脾細胞，然後於96孔盤中播種(1.0×106細胞/孔)並以gp100胜肽刺激(10微克/毫升)，以研究是否誘導抗原特異性干擾素-γ(IFN-γ)。
於以gp100胜肽刺激脾細胞24小時後，利用酵素結合免疫測定法(ELISA)，定量培養基中IFN-γ的量，結果示於第9圖。如實施例3所示，於僅投予gp100胜肽-dA40(S)/SPG複合體時，無法誘導對gp100胜肽而言具特異性之干擾素反應(未示出資料，data not shown)。然而，若同時投予gp100胜肽-dA40(S)/SPG複合體及CpG DNA-dA40(S)/SPG複合體，則會誘導強的干擾素反應。藉由進而投予gp100胜肽-dA40(S)/CpG DNA-dA40(S)/SPG三元複合體，同樣地亦確認到干擾素誘導。根據該等結果可知：藉由對小鼠投予含有OVA胜肽以外之抗原性胜肽之抗原性胜肽/CpG/SPG三元複合體，亦會誘導胜肽特異性之免疫反應。
實施例9：在不同抗原性胜肽下之免疫反應
使用OVA胜肽以外之抗原性胜肽，藉由實施例5所記載之方法來製備抗原性胜肽-dA40(S)/CpG DNA-dA40(S)/SPG三元複合體，且根據實施例6所記載之順序，進行胜肽特異性免疫反應之評估。將所使用之抗原性胜肽之胺基酸序列及實驗結果(有無對抗原性胜肽而言具特異性之IFN-γ之誘導)示於下述表2。接著，No.2所示之胺基酸序列(序列編號28)係為OVA胜肽(No.1)之隨機序 列。表2中的No.1、No.3、No.4係使用三元複合體中所含之抗原性胜肽，刺激自小鼠中採取後於孔盤中播種之脾細胞，No.2係使用胺基酸組成相同但胺基酸序列不同之OVA胜肽。另外，表2的IFN反應一行中，「+」表示觀測到產生IFN-γ，「-」表示未觀測到IFN-γ之誘導。於以具有與投予至小鼠之三元複合體中所使用之抗原性胜肽相同的胺基酸序列之胜肽刺激脾細胞時(No.1、No.3、No.4、No.5)，觀察到抗原性胜肽特異性的IFN反應，相對於此，於以具有不同之胺基酸序列之胜肽刺激脾細胞時(No.2)，完全未觀測到IFN產生。根據該等結果可知：可藉由投予小鼠三元複合體而誘導胜肽特異性免疫反應。
實施例10：藉由將抗原性胜肽導入至SPG之主鏈或側鏈上之葡萄糖殘基上來製備胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體(1)
加以研究利用炔烴與疊氮化合物之「點擊反應」(胡伊斯根反應)將抗原性胜肽導入至SPG之主鏈或側鏈上之葡萄糖殘基的情況。將反映流程示於以下。使羰基二咪唑(CDI)、炔丙胺(PA)與存在於SPG之葡萄糖殘基之6號位置上的一級醇反應，經由所生成之胺基甲酸酯鍵，位置選擇性地將炔烴導入至SPG之主鏈或側鏈之葡萄糖殘基上(SPG-PA)。導入至SPG之炔烴殘基數相對於葡萄 糖殘基數之比係10%至20%，故認為藉由主鏈之葡萄糖殘基周圍之立體障礙，大部分炔烴導入至側鏈之葡萄糖殘基上。於銅觸媒存在下，使以該方式獲得之SPG衍生物與C末端經疊氮基修飾之抗原性胜肽(胜肽(N3)；自基因設計(GeneDesign)(股)購入。於本實施例中係使用疊氮修飾OVA胜肽)反應，並藉由點擊反應製備胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體。
實施例11：藉由將抗原性胜肽經由共價鍵導入至SPG之主鏈或側鏈上之葡萄糖殘基上來製備胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體(2)
加以研究利用α,β-不飽和酮與硫醇之麥可加成反應將抗原性胜肽導入至SPG之主鏈或側鏈上之葡萄糖殘基的情況。將反映流程示於以下。於N,N-二異丙基乙基胺(N,N-Diisopropylethylamine，DIPEA)存在下，使羰基二咪唑(CDI)、2-胺基乙基甲基丙烯酸 酯(AEMA)與存在於SPG側鏈之葡萄糖殘基之6號位置的一級醇反應，經由所生成之胺基甲酸酯鍵來導入甲基丙烯醯基(SPG-AEMA)。其後於三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)存在下，使在C末端導入半胱胺酸之抗原性胜肽(胜肽(-SH)；自基因設計(GeneDesign)(股)購入)與SPG-AEMA反應而製備胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體。
實施例12：經由共價鍵，抗原性胜肽鍵結於具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖側鏈上之葡萄糖殘基而形成抗原性胜肽/CpG/SPG三元複合體，評估利用該三元複合體之抗原性胜肽特異性免疫反應
利用與實施例2、實施例5所記載之方法相同的方法，使實施例10、實施例11所製備之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體與CpG DNA-dA40(S)複合化，以製備抗原性胜肽/CpG/SPG三元複合體。 將該三元複合體投藥1次(相當於30微克之CpG DNA的量)至C57BL/6小鼠(雄性，7週齡)皮內。投藥1週後，自小鼠採取脾細胞，然後於96孔盤中播種(1.0×106細胞/孔)並以OVA胜肽刺激(10微克/毫升)，以研究是否誘導抗原特異性干擾素-γ(IFN-γ)。將所使用之抗原性胜肽之胺基酸序列及實驗結果(有無對抗原性胜肽而言具特異性之IFN-γ之誘導)示於下述表3。接著，與實施例9同樣地，No.2所示之胺基酸序列(序列編號28)係為OVA胜肽(No.1)之隨機序列。表3中的No.1、No.3、No.4係使用三元複合體中所含之抗原性胜肽，刺激自小鼠中採取後於孔盤中播種之脾細胞，No.2係使用胺基酸組成相同但胺基酸序列不同之OVA胜肽。另外，表3的IFN反應一行中，「+」表示觀測到產生IFN-γ，「-」表示未觀測到IFN-γ之誘導。與實施例9的結果相同，於以具有與投予至小鼠之三元複合體中所使用之抗原性胜肽相同的胺基酸序列之胜肽刺激脾細胞時(No.1、No.3、No.4)，觀察到抗原性胜肽特異性的IFN反應，相對於此，於以具有不同之胺基酸序列之胜肽刺激脾細胞時(No.2)，完全未觀測到IFN產生。根據該等結果可知：可藉由投予小鼠三元複合體而誘導胜肽特異性免疫反應。
再者，本發明於不脫離本發明廣義之精神與範圍之情況下，可進行各種實施例及變形。另外，該等實施例係用以說 明本發明之實施例，並不限定本發明之範圍。即，本發明之範圍並非藉由實施例而示出，而是藉由申請專利範圍而示出。而且，於申請專利範圍內及與其同等之發明意義之範圍內所實施的各種變形被視為本發明之範圍內。
本申請案係基於2014年2月6日提出申請之日本專利申請案第2014-21333號，且包含該說明書、申請專利範圍、圖式及摘要。該日本專利申請案中所揭示之內容全部作為參照而包含於本說明書中。
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<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 智慧人
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於佐劑之非甲基化CpG序列
<400> 2
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<400> 3
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 智慧人
<400> 4
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 智慧人
<400> 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 流感病毒A型
<400> 6
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 流感病毒A型
<400> 7
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 流感病毒A型
<400> 8
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 智慧人
<400> 9
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠白血病逆轉錄病毒
<400> 10
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 仙台病毒
<400> 11
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠細胞巨大病毒1
<400> 12
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 淋巴球性脉絡叢腦膜炎病毒
<400> 13
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 淋巴球性脉絡叢腦膜炎病毒
<400> 14
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 淋巴球性脉絡叢腦膜炎病毒
<400> 15
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 三日瘧原蟲
<400> 16
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒
<400> 17
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<212> PRT
<213> 牛結核杆菌
<400> 18
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<212> PRT
<213> 智慧人
<400> 19
<210> 20
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<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<400> 20
<210> 21
<211> 12
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<213> B型肝炎病毒
<400> 21
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 皰疹單純型病毒1
<400> 22
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 智慧人
<400> 23
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 原自增強型綠色螢光蛋白之表位
<400> 24
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 智慧人
<400> 25
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 水泡性口炎病毒
<400> 26
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 多瘤病毒
<400> 27
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列編號1之隨機序列
<400> 28

Claims (20)

  1. 一種胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，其包含：多糖，具有β-1,3-葡聚糖骨架；以及具有抗原性之胜肽，該胜肽化學鍵結於該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖。
  2. 如請求項1所述之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，其中該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖係為西佐糖(sizofiran)、蘑菇多糖(lentinan)、硬葡聚糖(scleroglucan)及卡特蘭多糖(curdlan)中之任一者。
  3. 一種胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，其包含：多糖，具有β-1,3-葡聚糖骨架；以及胜肽/多核苷酸結合體(peptide/polynucleotide conjugate)，其係由具有抗原性之胜肽與多核苷酸或多核苷酸衍生物經由共價鍵鍵結而成，該胜肽/多核苷酸結合體之多核苷酸或多核苷酸衍生物與該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖經由氫鍵而鍵結，以形成具有三重螺旋結構之複合體，該三重螺旋結構包含一條該多核苷酸或多核苷酸衍生物之分子鏈與二條該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖之分子鏈。
  4. 如請求項3所述之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，其中該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖係為西佐糖、蘑菇多糖、硬葡聚糖及卡特蘭多糖中之任一者。
  5. 如請求項3或請求項4所述之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，其中該多核苷酸或多核苷酸衍生物係為多去氧腺苷(polydeoxyadenosine)。
  6. 如請求項3所述之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，其中該多核苷酸或多核苷酸衍生物係為DNA或RNA之磷酸雙酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯基取代之多核苷酸衍生物。
  7. 如請求項6所述之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，其中該DNA或RNA之磷酸雙酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯基取代之多核苷酸衍生物中，磷酸雙酯鍵之50%以上經硫代磷酸酯基取代。
  8. 如請求項3所述之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，其中構成該胜肽/多核苷酸結合體之該具有抗原性之胜肽與該多核苷酸或多核苷酸衍生物係經由共價鍵而鍵結，該共價鍵係藉由炔烴與疊氮衍生物之加成環化反應、馬來醯亞胺基與硫醇基之反應、胜肽C末端之半胱胺酸殘基之硫醇基與硫醇修飾核酸之硫醇基之反應中的任一者而生成。
  9. 如請求項8所述之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，其中該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖係為西佐糖、蘑菇多糖、硬葡聚糖及卡特蘭多糖中之任一者。
  10. 一種胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，其包含：多糖，具有β-1,3-葡聚糖骨架；以及具有抗原性之胜肽，該胜肽經由共價鍵而鍵結於該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖之主鏈或側鏈上之葡萄糖殘基，該共 價鍵係藉由炔烴與疊氮衍生物之加成環化反應、馬來醯亞胺基或乙烯碸基與硫醇基之反應中的任一者而生成。
  11. 如請求項10所述之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，其中該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖係為西佐糖、蘑菇多糖、硬葡聚糖及卡特蘭多糖中之任一者。
  12. 如請求項1所述之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，其更包含多核苷酸或多核苷酸衍生物，該多核苷酸或多核苷酸衍生物含有具有免疫增強活性之部分鹼基序列，且該多核苷酸或多核苷酸衍生物與該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖係經由氫鍵而鍵結，以形成具有三重螺旋結構之複合體，該三重螺旋結構包含一條該多核苷酸或多核苷酸衍生物之分子鏈與二條該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖之分子鏈。
  13. 如請求項12所述之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，其中該多核苷酸或多核苷酸衍生物之形成具有該三重螺旋結構之複合體之部分係為聚去氧腺苷。
  14. 如請求項12或請求項13所述之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，其中該多核苷酸或多核苷酸衍生物之形成具有該三重螺旋結構之複合體之部分係為多核苷酸衍生物，該多核苷酸衍生物係由DNA或RNA之磷酸雙酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯基取代而成。
  15. 如請求項14所述之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體，其中於該多核苷酸或多核苷酸衍生物之形成具有該三重螺旋結構之複合體之 部分中，DNA或RNA之磷酸雙酯鍵之50%以上係經硫代磷酸酯基取代。
  16. 一種胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體之製造方法，其係為製造如請求項8所述之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體之方法，該胜肽/多核苷酸結合體於螯合劑之存在下利用液相層析法進行分離。
  17. 一種醫藥組成物，其包含：多核苷酸或多核苷酸衍生物，含有具有免疫增強活性之部分鹼基序列；以及如請求項1所述之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體。
  18. 如請求項17所述之醫藥組成物，其中該多核苷酸或多核苷酸衍生物與具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖係經由氫鍵而鍵結，以形成具有三重螺旋結構之多核苷酸/β-1,3-葡聚糖複合體，該三重螺旋結構包含一條該多核苷酸或多核苷酸衍生物之分子鏈與二條該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖之分子鏈。
  19. 如請求項18所述之醫藥組成物，其中構成該多核苷酸/β-1,3-葡聚糖複合體之該具有β-1,3-葡聚糖骨架之多糖係為西佐糖、蘑菇多糖、硬葡聚糖及卡特蘭多糖中之任一者。
  20. 一種醫藥組成物，其包含如請求項12所述之胜肽/β-1,3-葡聚糖複合體。
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