TW201536917A - 腎前驅細胞的製造方法及含有腎前驅細胞之醫藥 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種包含將中間中胚層細胞以含有TGFβ信息刺激劑及BMP阻礙劑之培養基進行培養之步驟，由中間中胚層細胞製造腎前驅細胞的方法，以及，提供以此方法所製造之腎前驅細胞、包含此細胞之醫藥組成物、及、包含此細胞之腎疾病治療劑。
Description
本發明關於由多能性幹細胞分化誘導腎前驅細胞之方法。本發明亦關於由此而得之含有腎前驅細胞之腎疾病的治療劑。
腎臓自血中藉由過濾去除因體內代謝活動而產生的有害物質等之廢棄物，係為了維持身體健康發揮機能的重要臓器之一。作為腎臓之疾病，可舉例腎衰竭等，其治療方法可舉例人工透析。然而，因為此治療所需之醫療費用負擔大，不僅從醫學上，從醫療經濟面來看仍然是全球性的問題。又，作為其他治療雖可舉例腎移植，但為捐贈臓器嚴重不足的狀態。
另一方面，迄今已報告有胚胎幹細胞(ES細胞)，或藉由向體細胞導入未分化細胞特異性基因所得之人工多能性幹細胞(iPS細胞)等具有多能性之細胞(專利文獻1及2)。然後，作為腎衰竭之治療方法，移植此等由多能性幹細胞所分化誘導之腎細胞的治療法被研究。進而，使用此等來自多能性幹細胞之均一的腎細胞進行治療藥的
開發亦被考慮。
哺乳類之腎臓為經過前腎、中腎、後腎的3階段所形成，其中已知後腎生於中間中胚層之後方區域。至今，為了腎形成之由小鼠多能性幹細胞向中間中胚層之分化誘導方法被研究著(非專利文獻1)，OSR1被確認作為中間中胚層之特徵標記。又，製作使用細菌人工染色體(BAC)載體以與內在性OSR1對偶基因之同源重組導入綠色螢光蛋白質(GFP)基因的人類iPS細胞(OSR1-GFP報導(reportor)人類iPS細胞)，藉由使用此細胞的研究，使用Activin A、Wnt、BMP及各種低分子化合物成功由人類多能性幹細胞向中間中胚層分化誘導(非專利文獻2、專利文獻3)。
若考慮對腎組織之移植時，誘導較中間中胚層更往腎臓分化進行之腎前驅細胞較佳，作為腎前驅細胞特徵因子之一已知有SIX2(非專利文獻4)。然而，至今由中間中胚層向腎前驅細胞之人工誘導方法尚未確立。
專利文獻1 美國專利第5,843,780號
專利文獻2 國際公開第WO2007/069666號
專利文獻3 國際公開第WO2012/011610號
非專利文獻1 Mae S, et al. (2010), Biochem Biophys
Res Commun. 393:877-82
非專利文獻2 Mae S, et al. (2013), Nat Commun.4:1367
非專利文獻3 Osafune K, et al. (2006), Development. 133:151-61
非專利文獻4 Kobayashi A, et al. (2008), Cell Stem Cell. 3:169-81
本發明之課題為提供一種由中間中胚層細胞分化誘導腎前驅細胞之方法。更具體而言，提供一種由中間中胚層細胞分化誘導腎前驅細胞之方法，其係包含使由多能性幹細胞所誘導之中間中胚層細胞進一步向腎前驅細胞分化誘導的步驟。
本發明者們為了解決上述課題進行潛心研究的結果，初次發現藉由以含有TGFβ信息刺激劑及BMP阻礙劑之培養基進行培養，可由中間中胚層細胞分化誘導腎前驅細胞。本發明為基於此見解所完成者。
即，本發明具有以下特徵：
[1]一種由中間中胚層細胞製造腎前驅細胞的方法，其特徵為包含下述步驟：將中間中胚層細胞以含有TGFβ信息刺激劑及BMP阻礙劑之培養基進行培養，由中間中胚層細胞誘導腎前驅細胞的步驟。
[2]如[1]之方法，其中，前述腎前驅細胞為SIX2陽
性細胞。
[3]如[1]或[2]之方法，其中，前述中間中胚層細胞為OSR1陽性細胞。
[4]如[1]至[3]中任一項之方法，其中，前述TGFβ信息刺激劑為選自TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、IDE1及IDE2所成群中1以上之物質。
[5]如[1]至[4]中任一項之方法，其中，前述BMP阻礙劑為選自朵索莫吩(Dorsomorphin)、頭發生素(Noggin)、LDN193189及DMH1所成群中1以上之物質。
[6]如[1]至[3]中任一項之方法，其中，前述TGFβ信息刺激劑為TGFβ1，前述BMP阻礙劑為DMH1。
[7]如[1]至[6]中任一項之方法，其中，前述中間中胚層細胞為由多能性幹細胞所誘導之中間中胚層細胞。
[8]如[7]之方法，其中，前述中間中胚層細胞為以包含下述步驟(i)及(ii)之方法所製造之中間中胚層細胞，(i)將多能性幹細胞以含有選自活化素(Activin)A、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物所成群之1以上的物質之培養基進行培養的步驟、及(ii)將步驟(i)中所得之細胞以含有選自BMP7、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物所成群之1以上的物質之培養基進行培養的步驟。
[9]如[8]之方法，其中，前述步驟(ii)包含下述之
步驟(ii-1)及(ii-2)：(ii-1)將於步驟(i)所得之細胞以含有選自BMP7及GSK-3β阻礙劑之1以上的物質之培養基進行培養的步驟、及(ii-2)將於步驟(ii-1)所得之細胞以含有選自TGFβ信息刺激劑及視黃酸衍生物之1以上的物質之培養基進行培養的步驟。
[10]如[9]之方法，其中，前述步驟(ii-1)為以含有BMP7及GSK-3β阻礙劑之培養基進行培養的步驟，前述步驟(ii-2)為以含有TGFβ信息刺激劑及視黃酸衍生物之培養基進行培養的步驟。
[11]如[8]至[10]中任一項之方法，其中，前述GSK3β阻礙劑為CHIR99021。
[12]如[8]至[11]中任一項之方法，其中，前述視黃酸衍生物為AM580或TTNPB。
[13]如[7]至[12]中任一項之方法，其中，前述多能性幹細胞為人工多能性幹(iPS)細胞。
[14]如[13]之方法，其中，前述iPS細胞為人類iPS細胞。
[15]一種方法，其係由多能性幹細胞製造腎前驅細胞之方法，其包含下述步驟(i)至(iii)：(i)將多能性幹細胞以含有選自Activin A、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物所成群之1以上的物質之培養基進行培養的步驟、
(ii)將步驟(i)中所得之細胞以含有選自BMP7、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物所成群之1以上的物質之培養基進行培養的步驟、及(iii)將步驟(ii)中所得之細胞以含有TGFβ信息刺激劑及BMP阻礙劑之培養基進行培養步驟。
[16]如[15]之方法，其中，前述腎前驅細胞為SIX2陽性細胞。
[17]如[15]或[16]之方法，其中，前述步驟(ii)所得之細胞為OSR1陽性細胞。
[18]如[15]至[17]中任一項之方法，其中，前述TGFβ信息刺激劑為選自TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、IDE1及IDE2所成群中1以上之物質。
[19]如[15]至[18]中任一項之方法，其中，前述BMP阻礙劑為選自Dorsomorphin、Noggin、LDN193189及DMH1所成群中1以上之物質。
[20]如[15]至[17]中任一項之方法，其中，前述TGFβ信息刺激劑為TGFβ1，前述BMP阻礙劑為DMH1。
[21]如[15]至[20]中任一項之方法，其中，前述步驟(ii)包含下述步驟(ii-1)及(ii-2)：(ii-1)將步驟(i)所得之細胞以含有選自BMP7及GSK-3β阻礙劑中之1以上的物質之培養基進行培養的步驟、及(ii-2)將步驟(ii-1)所得之細胞以含有選自TGFβ信息刺激劑及視黃酸衍生物中之1以上的物質之培
養基進行培養的步驟。
[22]如[21]之方法，其中，前述步驟(ii-1)為以含有BMP7及GSK-3β阻礙劑之培養基進行培養的步驟，前述步驟(ii-2)為以含有TGFβ信息刺激劑及視黃酸衍生物之培養基進行培養的步驟。
[23]如[15]至[22]中任一項之方法，其中，前述GSK3β阻礙劑為CHIR99021。
[24]如[15]至[23]中任一項之方法，其中，前述視黃酸衍生物為AM580或TTNPB。
[25]如[15]至[24]中任一項之方法，其中，前述多能性幹細胞為人工多能性幹(iPS)細胞。
[26]如[25]之方法，其中，前述iPS細胞為人類iPS細胞。
[27]一種腎前驅細胞，其特徵為以如[1]至[26]中任一項之方法所製造。
[28]一種醫藥組成物，其特徵為包含以如[1]至[26]中任一項之方法所製造之腎前驅細胞。
[29]一種腎疾病治療劑，其特徵為包含以如[1]至[26]中任一項之方法所製造之腎前驅細胞。
[30]一種治療腎疾病的方法，其特徵為包含將以如[1]至[26]中任一項之方法所製造之腎前驅細胞投予至必須治療之患者的步驟。
[31]一種以如[1]至[22]中任一項之方法所製造之腎前驅細胞，其係欲使用於腎疾病之治療。
[32]一種以如[1]至[26]中任一項之方法所製造之腎前驅細胞的用途，其係用於腎疾病治療用醫藥組成物之製造中。
依據本發明初次能夠由中間中胚層向腎前驅細胞人工誘導。進而，依據本發明初次能夠由多能性幹細胞(例如，iPS細胞)向腎前驅細胞人工誘導。又，以本發明之方法所製造之腎前驅細胞，確認具有腎疾病模式動物中之治療效果。以本發明之方法所製造之腎前驅細胞，可使用於腎衰竭等之腎疾病的治療或再生醫療。
本說明書包含本案優先權基礎之日本國專利申請2013-123072號(申請日：2013年6月11日)以及2014-92108號(申請日：2014年4月25日)之說明書及/或圖式所載內容。
圖1表示實施例2~4中分化誘導後SIX2陽性細胞之含有率。圖1A為對照組，表示以含有DMSO之培養基進行培養的結果。圖1B表示依據誘導方法1(實施例2)之結果。圖1C表示依據誘導方法2(實施例3)之結果。圖1D表示依據誘導方法3(實施例4)之結果。圖中，tdTomato表示報導基因。
圖2表示實施例5中分化誘導後SIX2陽性細胞之含有率。圖2A為對照組，表示以含有DMSO之培養基進行培養的結果。圖2B、C及D於表示誘導方法1之階段3
中，分別使用頭發生素(Noggin)、LDN193189及DMH1代替朵索莫吩(Dorsomorphin)時之結果。圖2E及F表示於誘導方法1之階段3中，分別使用IDE1及IDE2代替TGFβ1時之結果。圖2G表示於誘導方法1之階段3中，使用TGFβ2及LDN193189時之結果。圖2H表示於誘導方法1之階段3中，使用TGFβ3及LDN193189時之結果。
圖3表示由人類iPS細胞製作OSR1+SIX2+腎前驅細胞之方法的一例。圖3A表示使用EB(類胚體)三維培養之向OSR1+SIX2+腎前驅細胞之分化方法。圖3B表示藉由流動式細胞測量術之OSR1+SIX2+細胞隨時間的分化模式分析，具體為表示細胞集團之二維分布的結果(n=5)。圖3C表示相對於分化細胞集團中所表示之各基因的mRNA表現時程分析。圖表表示Day1~Day28中相對於β-肌動蛋白表現之相對表現量(n=3)。圖3D表示實施例7中藉由流動式細胞測量術之OSR1+SIX2+細胞隨時間的分化模式分析，具體為表示該細胞集團之時程分析的結果(n=5)。圖3D中，d1表示於Day1之iPS細胞、d3以含有CHIR99021與活化素(Activin)A之培養基(階段1)所製作之EB(Day3)的結果。圖3D中，d6~d28表示於Day6~Day28之DMSO群(標記為DMSO)及TGFβ1+TTNPB處理群(標記為Tx)的結果。階段2(Day3~Day6)中，以含有CHIR99021與BMP7之培養基進行培養3日後，於Day6分成DMSO群與Tx群，進行
階段3及階段4之培養。且，DMSO群中，階段3中以含有DMSO之培養基代替TGFβ1及TTNPB進行培養(於Day8以相同培養基更換)，階段4中以含有DMSO之培養基代替TGFβ1及DMH1進行培養(3日以相同培養基更換一次)。圖3E表示培養第28日之由A6C3-10所分化之OSR1+SIX2+腎前驅細胞中腎前驅細胞標記的表現。
圖4表示相對於由人類iPS細胞之OSR1+SIX2+細胞誘導，TGFβ信息刺激劑及BMP阻礙劑之各組合的效果。數據以平均±S.E.M表示(n=5)。
圖5表示依據各種人類iPS細胞及人類ES細胞之誘導方法4的分化誘導結果(OSR1表現量(圖5A)及SIX2表現量(圖5B))。表示相對於在4A6C3-10之表現量，各細胞中OSR1及SIX2之相對表現量。
圖6表示腎前驅細胞之評估試驗的結果。圖6A表示將OSR1+SIX2+細胞於REGM培養基中培養7日後之免疫染色像。圖中，NEPHRIN表示絲球體足細胞之標記，AQP1及MEGALIN表示近曲小管之標記，及UROMUCOID表示亨耳氏套之標記。此等各標記以粉紅色、核以藍色分別染色。比例尺表示50μm。圖6B表示將OSR1+SIX2+細胞之細胞塊與表現Wnt4之NIH3T3共培養7日後之顯微鏡像(左圖)及免疫染色像(3個右圖)。圖6C表示將OSR1+SIX2+細胞之細胞塊與E11.5之小鼠胚脊髓共培養7日後之顯微鏡像(左圖)及免疫染色像(3個右圖)。圖6D表示將OSR1+SIX2+細胞之細胞塊
與E11.5之小鼠胚後腎細胞進行器官培養後之免疫染色像。圖6E表示將OSR1+SIX2+細胞之細胞塊移植至NOD.CB17-Prkdcscid/J之副睪脂肪組織後之組織免疫染色像。
圖中，WT1及PODOCALYXIN(PODX)表示絲球體足細胞之標記(分別為紅色、粉紅色)，LTL表示近曲小管之標記(紅色)，LAMININ表示極性上皮之標記(粉紅色)，CDH1表示遠曲小管之標記(粉紅色)，及CDH6表示腎小胞之標記(粉紅色)，HuNu表示人類的核(綠色)，小鼠核以藍色染色，而比例尺表示50μm。圖6F表示將來自iPS細胞之各劃分區域(OSR1-SIX2-、OSR1+SIX2-、OSR1-SIX2+、及OSR1+SIX2+)之細胞塊與E11.5之小鼠輸尿管芽進行器官培養7日後之顯微鏡像(左圖)及OSR1+SIX2+細胞塊與輸尿管芽共培養之免疫染色像(右圖)。圖中，DBA表示輸尿管芽之標記(紅色)，比例尺表示50μm。HuNu為人類的核(綠色)，小鼠核以藍色分別染色。
圖7表示向小鼠腎疾病模式之移植實驗的結果。圖7A及B表示將OSR1+SIX2+細胞之細胞塊往腎實質移植後2週之小鼠急性腎損害(AKI)模式(圖7A)及小鼠慢性腎衰竭模式(圖7B)之腎臓切片的免疫染色像。LTL及AQP1表示近曲小管之標記，分別以綠色、紅色染色。
HuNu表示人類的核(粉紅色)，比例尺表示50μm。圖7C表示接受hiPSC-RP(n=10，iPSC-RPS，三角形)、未分化人類iPS細胞(n=10，iPSCs，正方形)、或生理
食鹽水(n=10，Saline，圓形)之腎臓被膜下移植的AKI模式小鼠中，BUN水平及血清Cr水平之時程分析〔*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001 vs Saline〕。圖7D表示經移植hiPSC-RP(iPSC-RPs)或生理食鹽水(Saline)之來自小鼠腎組織的組織學表現。腎組織於缺血再灌流後(I/R)第3日以過碘酸-Schiff(PAS，上)或馬森三色(MT，下)染色進行染色。圖7E表示I/R後第3日之宿主腎臓中伴隨管型之內腔擴張的腎小管(Dilated tubules with casts)或纖維化(Fibrosis)面積之測定的結果〔**P<0.01 vs Saline，每一群n=3〕。
以下詳細說明本發明。
本發明中提供一種製造腎前驅細胞的方法，其包含將中間中胚層細胞以含有TGFβ信息刺激劑及BMP阻礙劑之培養基進行培養的步驟。
本發明中，所謂中間中胚層細胞，係指本發明中藉由以含有TGFβ信息刺激劑及BMP阻礙劑之培養基進行培養向腎前驅細胞誘導之任意細胞的意思。作為取得中間中胚層細胞的方法，例如，由小鼠及人類的多能性幹細胞向中間中胚層細胞之分化誘導方法為周知(非專利文獻1及2、專利文獻3)。作為中間中胚層細胞特徵之標記已知OSR1，作為本發明之方法中所使用之中間中胚層細胞的例，可舉例OSR1陽性之中間中胚層細胞。例如，培養具
有OSR1啟動子調控下導入之報導基因(例如，GFP)的多能性幹細胞(例如，後述實施例所記載之OSR1-GFP報導人類iPS細胞)，以該報導基因之表現為指標藉由該領域所周知的方法(例如，使用細胞分選儀之方法)，可單離OSR1陽性之中間中胚層細胞。又，藉由定量RT-PCR(Nat Commun 4,1367,(2013))等之分析基因表現的方法，可確任中間中胚層細胞中OSR1的表現。本發明中，OSR1陽性之中間中胚層細胞中包含：表現有OSR1蛋白質的細胞、及表現OSR1啟動子調控下之基因所編碼之蛋白質的細胞。本發明中，OSR1包含：具有NCBI之登錄號碼，人類的為NM_145260.2、小鼠的為NM_011859.3所記載之核苷酸序列之基因及該基因所編碼之蛋白質，以及具有此等機能之天然存在的突變體。較佳為：本發明之方法中所使用之中間中胚層細胞為SIX2陰性、OSR1陽性之細胞。
本發明中，腎前驅細胞被當作與腎元前驅細胞同等的細胞，係於in vitro可分化為腎臓之類絲球體構造或類腎小管構造等之器官構造的細胞，往器官構造之分化能力，可以例如Osafune K,et al.(2006),Development 133：151-61所記載之方法評估。作為用以維持腎元前驅細胞狀態的特徵性因子已知有SIX2(非專利文獻4)，作為以本發明之方法所誘導之腎前驅細胞的例，可舉例SIX2陽性之腎前驅細胞。例如，培養具有SIX2啟動子調控下導入之報導基因(例如，tdTomato)的多能性幹細胞(例如，後述實
施例所記載之OSR1-GFP & SIX2-tdTomato報導人類iPS細胞)，以該報導基因之表現為指標藉由該領域所周知的方法(例如，使用細胞分選儀之方法)，可單離SIX2陽性之腎前驅細胞。又，藉由定量RT-PCR(Nat Commun 4,1367,(2013))等之分析基因表現的方法，可確認腎前驅細胞中SIX2之表現。本發明中，SIX2陽性之腎前驅細胞中包含：表現SIX2蛋白質之細胞、及表現SIX2啟動子調控下之基因所編碼之蛋白質。本發明中，SIX2包含：具有NCBI之登錄號碼，人類為NM_016932.4、小鼠為NM_011380.2所記載之核苷酸序列之基因及該基因所編碼之蛋白質，以及具有此等機能之天然存在的突變體。較佳為：以本發明之方法所誘導之腎前驅細胞為OSR1陽性，且SIX2陽性之細胞。
本發明中，中間中胚層細胞或腎前驅細胞，可作為包含其他細胞種類之細胞集團而提供，亦可為經純化之集團。較佳為：5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%、20%、28%或30%以上包含該細胞之細胞集團。
本發明之方法中，透過將中間中胚層細胞以任意方法實質分離(或解離)，以單一細胞狀態、或、細胞彼此接著之細胞塊的狀態，藉由浮游培養進行培養，或是，亦可使用經塗佈處理之培養皿進行附著培養。此處，作為分離之方法，可舉例例如，力學性分離，或使用具有蛋白酶活性與膠原蛋白酶活性之分離溶液(例如，可舉例含有胰蛋
白酶與膠原蛋白酶之溶液Accutase(TM)及Accumax(TM)(Innovative Cell Technologies,Inc))或僅具有膠原蛋白酶活性之分離溶液的分離。
所謂本發明之方法中所使用之浮游培養，係指將細胞與培養皿非附著之狀態下培養，雖無特別限定，但可使用未經以提升與細胞之附著性為目的之人工處理(例如，經細胞外基質等塗佈處理)者、或、經抑制人工性接着之處理(例如，經聚甲基丙烯酸羥乙酯(poly-HEMA)塗佈處理)者進行。
所謂本發明之方法中所使用之附著培養，係指以經塗佈處理之培養皿進行培養。作為塗佈劑，可舉例例如，基質膠(Matrigel)(BD Biosciences)、Synthemax(Corning)、膠原蛋白、明膠、層連結蛋白、硫酸乙醯肝素蛋白多醣、或巢蛋白、及此等之組合，較佳為基質膠、Synthemax或明膠。
本發明之中間中胚層細胞的培養步驟中所使用之培養基，可於動物細胞培養用之基礎培養基添加TGFβ信息刺激劑及BMP阻礙劑來調製。作為基礎培養基，包含例如，IMDM培養基、Medium 199培養基、Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM)培養基、αMEM培養基、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)培養基、Ham’s F12(F12)培養基、RPMI 1640培養基、Fischer’s培養基、及此等之混合培養基等。培養基中，可含有血清(例如，胎牛血清(FBS))，或無血清亦可。
應需要，亦可含有例如，白蛋白、運鐵蛋白、KnockOut Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時之血清替代物)(Invitrogen)、N2 supplement(Invitrogen)、B27 supplement(Invitrogen)、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前驅體、微量元素、2-巰基乙醇、3’-巰基丙三醇等之1種以上之血清替代物，可含有脂質、胺基酸、L-麩醯胺、GlutaMAX(Invitrogen)、非必需胺基酸(NEAA)、維生素、生長因子、抗生素、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類、及此等之同等物等之1種以上之物質。1種實施形態中，基礎培養基為於DMEM與F12為1：1的混合培養基(DMEM/F12)中，含有GlutaMAX、KSR、非必需胺基酸、2-巰基乙醇及抗生素之培養基。
所謂本發明中所使用之TGFβ信息刺激劑，只要是使TGFβ信息途徑活性化者並無特別限定，作為TGFβ信息刺激劑，可例示TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3等之蛋白質(可由Peprotech、R&D公司等取得)、IDE1((Z)-2-((2-(6-carboxyhexanoyl)hydrazono)methyl)benzoic acid)及IDE2(7-(2-cyclopentylidenehydrazinyl)-7-oxoheptanoic acid)(Borowiak M,et al,Cell Stem Cell.2009,4：348-58)等之化合物。IDE1及IDE2可由Stemgent公司、Tocris公司等取得。較佳的TGFβ信息刺激劑為TGFβ1。
本發明中，使用TGFβ信息刺激劑時之濃度，雖可對應使用之TGFβ信息刺激劑由該發明所屬技術領域具有通
常知識者適宜地選擇，但例如，使用作為TGFβ信息刺激劑之TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3等之蛋白質時之濃度為0.1ng/ml至100ng/ml，較佳為1ng/ml至10ng/ml，更佳為5ng/ml至10ng/ml。又，使用IDE1及IDE2時之濃度為1μM至100μM，較佳為25μM至75μM，更佳為40μM至60μM。
所謂本發明中所使用之BMP阻礙劑，只要是抑制BMP(Bone Morphogenetic Protein)信息途徑者並無特別限定，作為BMP阻礙劑，可例示Chordin、Noggin、Follistatin等之蛋白質性阻礙劑，Dorsomorphin(6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine)及其衍生物(P.B.Yu et al.(2007),Circulation,116：II_60；P.B.Yu et al.(2008),Nat.Chem.Biol.,4：33-41；J.Hao et al.(2008),PLoS ONE,3(8)：e2904)、DMH1(4-[6-(4-Isopropoxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline,4-[6-[4-(1-Methylethoxy)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]-quinoline)，以及LDN193189(4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline)。
Dorsomorphin及LDN193189為已市售，可由Sigma-Aldrich、Stemgent、Merck、Axon MedChem、Peprotech公司等取得。作為較佳的BMP阻礙劑可舉例DMH1、Noggin、LDN193189、及Dorsomorphin，更佳的BMP阻礙劑為DMH1。
本發明中，使用BMP阻礙劑時之濃度，雖可對應使用之BMP阻礙劑由該發明所屬技術領域具有通常知識者適宜地選擇，但例如，使用作為BMP阻礙劑之Chordin、Noggin、Follistatin等之蛋白質性阻礙劑時之濃度為0.1ng/ml至1000ng/ml，較佳為1ng/ml至500ng/ml，更佳為10ng/ml至100ng/ml。又，使用Dorsomorphin、DMH1及LDN193189時之濃度為0.01μM至100μM，較佳為0.1μM至10μM，更佳為0.5μM至1μM。
本發明之中間中胚層細胞的培養步驟中，亦可於基礎培養基中進一步添加FGF9、FGF20、BMP7、視黃酸衍生物、GSK-3β阻礙劑中任一或任意之組合。
本發明之中間中胚層細胞之培養步驟的日數，雖因長期間培養對腎前驅細胞之製造效率無特別影響故無上限，但可舉例例如，2日以上、4日以上、6日以上、8日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上、15日以上、16日以上、17日以上、18日以上、19日以上、20日以上。
本發明之中間中胚層細胞的培養步驟中，培養溫度雖無限定為以下，但為約30~40℃，較佳為約37℃，在含有CO2之空氣的氣體環境下進行培養，CO2濃度較佳為約2~5%。
本發明之1種實施形態中，中間中胚層細胞為由多能性幹細胞所誘導之中間中胚層細胞。此時，一旦單離所誘導之中間中胚層細胞，將經單離之中間中胚層細胞藉由本
發明之培養步驟向腎前驅細胞誘導亦可。或、由多能性幹細胞誘導中間中胚層細胞，藉由不單離中間中胚層細胞直接供於本發明之培養步驟向腎前驅細胞誘導亦可。
單離中間中胚層細胞時，可使用具有由內在性OSR1啟動子調控表現之報導基因的多能性幹細胞。作為多能性幹細胞之OSR1啟動子調控下導入報導基因之方法，可舉例例如，使用BAC載體等之同源重組，記載於WO2012/011610等。又，為了單離經誘導之腎前驅細胞，可使用具有由SIX2啟動子調控表現之報導基因的多能性幹細胞，可使用與前述相同的方法來製作。作為所使用之報導基因，可舉例編碼β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、螢光素酶、綠色螢光蛋白質(GFP)、tdTomato、細胞表面蛋白質等之周知報導蛋白質之基因。由此等多能性幹細胞所誘導之中間中胚層細胞或腎前驅細胞，可將該報導蛋白質表現作為指標使用細胞分選儀的方法、使用針對該細胞表面蛋白質之抗體、使用磁珠藉由磁性選別細胞的方法(例如，MACS)、使用該抗體等經固定化之載體(例如，細胞濃縮管柱)的方法等、使用該領域所周知的方法來單離。
所謂本發明中之多能性幹細胞，係具有可分化成存在於活體之多種細胞的多能性，且同時具有增殖能力的幹細胞，包含向本發明中所使用之中間中胚層細胞誘導之任意細胞。多能性幹細胞中雖未特別限定，但包含例如，胚胎幹(ES)細胞、經由核移植所得之來自複製胚胎的胚胎幹
(ntES)細胞、精子幹細胞(「GS細胞」)、胚胎生殖
細胞(「EG細胞」)、人工多能性幹(iPS)細胞、來自培養纖維母細胞或骨髓幹細胞之多能性細胞(Muse細胞)等。由在製造步驟中可不破壞胚、卵子等取得的觀點來看，較佳的多能性幹細胞為iPS細胞，更佳為為人類iPS細胞。
iPS細胞之製造方法為該領域所周知，可藉由往任意體細胞導入初期化因子所製造。此處，所謂初期化因子，可例示例如，Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等基因或基因產物，此等初期化因子，可單獨使用，亦可組合使用。作為初期化因子之組合，可例示WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、
WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D,et al.(2008),Nat.Biotechnol.,26：795-797、Shi Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,2：525-528、Eminli S,et al.(2008),Stem Cells.26：2467-2474、Huangfu D,et al.(2008),Nat.Biotechnol.26：1269-1275、Shi Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,3,568-574、Zhao Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,3：475-479、Marson A,(2008),Cell Stem Cell,3,132-135、Feng B,et al.(2009),Nat.Cell Biol.11：197-203、R.L.Judson et al.,(2009),Nat.Biotechnol.,27：459-461、Lyssiotis CA,et al.(2009),Proc Natl Acad Sci U S A.106：8912-8917、Kim JB,et al.(2009),Nature.461：649-643、Ichida JK,et al.(2009),Cell Stem Cell.5：491-503、Heng JC,et al.(2010),Cell Stem Cell.6：167-74、Han J,et al.(2010),Nature.463：1096-100、Mali P,et al.(2010),Stem Cells.28：713-720、Maekawa M,et al.(2011),Nature.474：225-9.所記載之組合。
體細胞中非限定地包含胎兒(仔)之體細胞、新生兒(仔)之體細胞、及成熟健全之或疾病性之體細胞中任一種，又，亦包含初代培養細胞、繼代細胞、及株化細胞中任一種。具體而言，體細胞可例示例如(1)神經幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、齒髓幹細胞等之組織幹細胞(體幹細胞)、(2)組織前驅細胞、(3)血液細胞(末梢血細胞、臍帶血細胞等)、淋巴球、上皮細胞、內皮細胞、肌肉細胞、纖維母細胞(皮膚細胞等)、毛細
胞、肝細胞、胃黏膜細胞、腸細胞、脾細胞、胰細胞(胰外分泌細胞等)、腦細胞、肺細胞、腎細胞及脂肪細胞等之已分化的細胞等。
又，將iPS細胞作為移植用細胞的材料時，由不發生排斥反應之觀點來看，宜使用與移植對象個體之HLA基因型相同或實質上相同的體細胞。此處，所謂「實質上相同」，係指與對於已移植細胞能藉由免疫抑制劑抑制免疫反應的程度之HLA基因型一致，例如，具有與HLA-A、HLA-B及HLA-DR之3基因座或加上HLA-C之4基因座一致之HLA型的體細胞。
本發明中，由多能性幹細胞向中間中胚層細胞分化誘導時，可使用包含以下步驟之方法：(i)將多能性幹細胞以含有Activin A、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物所成群之1以上的物質之培養基進行培養的步驟、及(ii)將步驟(i)所得之細胞以含有BMP7、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物所成群之1以上的物質之培養基進行培養的步驟。
以下進一步說明各步驟。
(i)將多能性幹細胞以含有Activin A、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物所成群之1以上的物質之培養基進行培養的步驟：本步驟中，將多能性幹細胞以該領域所周知的任意方法分離，可藉由浮游培養或附著培養進行培養。作為分離
多能性幹細胞之方法，可舉例例如，力學性分離，或是，使用具有蛋白酶活性與膠原蛋白酶活性之分離溶液(可舉例例如，Accutase(TM)及Accumax(TM)(Innovative Cell Technologies,Inc))或僅具有膠原蛋白酶活性之分離溶液進行分離。較佳為：使用具有蛋白酶活性與膠原蛋白酶活性之分離溶液進行解離，且力學地細細分散成單一細胞之方法。作為本步驟中所使用之類多能性幹細胞，使用相對於所使用之培養皿培養至成為70%~80%滿時的群落(colony)較佳。
本步驟(i)中所使用之培養基，可於動物細胞培養用之基礎培養基中添加選自Activin A、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物所成群之1以上物質來調製。1種實施形態中，本步驟中所使用之物質為Activin A及GSK-3β阻礙劑之組合、或、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物之組合。作為基礎培養基，包含例如，IMDM培養基、Medium 199培養基、Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM)培養基、αMEM培養基、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)培養基、Ham’s F12(F12)培養基、RPMI 1640培養基、Fischer’s培養基、及此等混合培養基等。培養基中可含有血清(例如，FBS)，或無血清亦可。應需要，可含有例如，白蛋白、運鐵蛋白、KnockOut Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時之血清替代物)(Invitrogen)、N2 Supplements(Invitrogen)、B27 Supplements(Invitrogen)、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白
前驅體、微量元素、2-巰基乙醇、3’-巰基丙三醇等之1種以上之血清替代物，亦可含有脂質、胺基酸、L-麩醯胺、GlutaMAX(Invitrogen)、非必需胺基酸(NEAA)、維生素、生長因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等之1種以上之物質。本步驟之1種實施形態中，基礎培養基為含有GlutaMAX、血清及抗生素之DMEM/F12。
本步驟(i)中，Activin A中包含來自人類及其他動物之Activin A，以及此等機能性改變體，可使用例如，R&D systems公司等之市售品。本步驟中所使用之Activin A的濃度為1ng/ml至1000ng/ml，較佳為10ng/ml至500ng/ml，更佳為50ng/ml至200ng/ml。
本步驟(i)中，GSK-3β阻礙劑只要是能阻礙GSK-3β之機能，例如激酶活性者並無特別限定，但可舉例例如，靛玉紅衍生物之BIO(別名：GSK-3β阻礙劑IX；6-溴靛玉紅-3'-肟)、馬來醯亞胺衍生物之SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、苯基-α-溴甲基酮化合物之GSK-3β阻礙劑VII(α,4-二溴苯乙酮)、細胞膜透過型磷酸化胜肽之L803-mts(別名：GSK-3β胜肽阻礙劑；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2：序列號碼1)及具有高選擇性之CHIR99021(Nature(2008)453：519-523)。此等化合物可自例如，Stemgent公司、Calbiochem公司、Biomol公司等取得，又可自行製作。作為本步驟中所用之較佳的
GSK-3β阻礙劑，可舉例CHIR99021。本步驟中所使用之GSK-3β阻礙劑的濃度，雖可對應於所使用之GSK-3β阻礙劑由該發明所屬技術領域具有通常知識者適宜地選擇，但例如，使用GSK-3β阻礙劑之CHIR99021時為0.01μM至100μM，較佳為0.1μM至10μM，更佳為1μM至3μM。
本步驟(i)中，視黃酸衍生物可為保持天然視黃酸具有之機能的人工修飾視黃酸，包含例如，類視色素化合物及維生素D3化合物。作為類視色素化合物之例，可舉例視黃酸、3-脫氫視黃酸、4-[[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)carbonyl]amino]-Benzoic acid(AM580)(Tamura K,et al.,Cell Differ.Dev.32：17-26(1990))、4-[(1E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propen-1-yl]-Benzoic acid(TTNPB)(Strickland S,et al.,Cancer Res.43：5268-5272(1983))、及Tanenaga,K.et al.,Cancer Res.40：914-919(1980)所記載之化合物、棕櫚酸視黃醇、視黃醇、視黃醛、3-脫氫視黃醇、3-脫氫視黃醛等。所謂視黃酸化合物，係指類視色素化合物之中具有羧基之化合物，可舉例例如，視黃酸、3-脫氫視黃酸、AM580、TTNPB等。維生素D3化合物之例中，可舉例Abe,E.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)78：4990-4994(1981)、及Schwartz,E.L.et al.,Proc.Am.Assoc.Cancer Res.24：18(1983)所記載之化合物。本步驟之1種
實施形態中，視黃酸衍生物為類視色素化合物或維生素D3化合物。本步驟之其他實施形態中，視黃酸衍生物為類視色素化合物，又另一實施形態中，視黃酸衍生物為視黃酸化合物。作為本步驟中所使用之較佳的視黃酸衍生物，可舉例AM580或TTNPB。本步驟中所使用之視黃酸衍生物的濃度，雖可對應使用之視黃酸衍生物由該發明所屬技術領域具有通常知識者適宜地選擇，但例如，使用視黃酸衍生物之AM580或TTNPB時為0.01μM至100μM，較佳為0.1μM至10μM，更佳為0.5μM至2μM。
本步驟(i)中之培養基，可進一步含有ROCK阻礙劑。尤其是，本步驟包含將多能性幹細胞分散成單一細胞之步驟時，於培養基中含有ROCK阻礙劑較佳。
ROCK阻礙劑只要是能抑制Rho-激酶(ROCK)機能者並無特別限定，可舉例例如，Y-27632(例，參照Ishizaki et al.,Mol.Pharmacol.57,976-983(2000)；Narumiya et al.,Methods Enzymol.325,273-284(2000))、Fasudil/HA1077(例，參照Uenata et al.,Nature 389：990-994(1997))、H-1152(例，參照Sasaki et al.,Pharmacol.Ther.93：225-232(2002))、Wf-536(例，參照Nakajima et al.,Cancer Chemother Pharmacol.52(4)：319-324(2003))及此等之衍生物，以及對於ROCK之反義核酸、RNA干渉誘導性核酸(例，siRNA)、顯性負突變體、及此等之表現載體。又，亦可使用作為ROCK阻礙劑之其他周知的低分子化合物(參照
例如，美國專利申請公開第2005/0209261號、同前第2005/0192304號、同前第2004/0014755號、同前第2004/0002508號、同前第2004/0002507號、同前第2003/0125344號、同前第2003/0087919號、及國際公開第2003/062227號、同前第2003/059913號、同前第2003/062225號、同前第2002/076976號、同前第2004/039796號)。本發明中，可使用1種或2種以上之ROCK阻礙劑。作為本步驟中所使用之較佳的ROCK阻礙劑，可舉例Y-27632。本步驟中所使用之ROCK阻礙劑的濃度，雖可對應於所使用之ROCK阻礙劑由該發明所屬技術領域具有通常知識者適宜地選擇，但例如，使用ROCK阻礙劑之Y-27632時為0.1μM至100μM，較佳為1μM至50μM，更佳為5μM至20μM。
本步驟(i)中，培養溫度雖未限定為以下，但為約30~40℃，較佳為約37℃，在含有CO2之空氣的氣體環境下進行培養。CO2濃度為約2~5%，較佳為約5%。本步驟之培養時間為例如2日以下之培養，較佳為2日。
(ii)將步驟(i)中所得之細胞，以含有BMP7、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物所成群之1以上的物質之培養基進行培養的步驟：本步驟中，將前述步驟(i)中所得之浮游培養後之細胞集團直接以經塗佈處理之培養皿，於任意培養基中進行附著培養亦可、或、前述步驟(i)中將以附著培養所得之細胞，藉由培養基更換繼續培養亦可。
本步驟(ii)中所使用之培養基，可添加選自BMP7、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物所成群之1以上的物質至動物細胞培養用基礎培養基來調製。1種實施形態中，本步驟中所使用之物質為BMP7及GSK-3β阻礙劑之組合、或、視黃酸衍生物。作為基礎培養基，包含例如，IMDM培養基、Medium 199培養基、Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM)培養基、αMEM培養基、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)培養基、Ham’s F12(F12)培養基、RPMI 1640培養基、Fischer’s培養基、及此等之混合培養基等。培養基中，可含有血清(例如，FBS)，或無血清亦可。應需要，可含有例如，白蛋白、運鐵蛋白、KnockOut Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時之血清替代物)(Invitrogen)、N2 Supplements(Invitrogen)、B27 Supplements(Invitrogen)、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前驅體、微量元素、2-巰基乙醇、3’-巰基丙三醇等之1種以上之血清替代物，亦可含有脂質、胺基酸、L-麩醯胺、GlutaMAX(Invitrogen)、非必需胺基酸(NEAA)、維生素、生長因子、抗生素、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類、及此等之同等物等之1種以上的物質。本步驟之1種實施形態中，基礎培養基為於DMEM與F12為1：1的混合培養基(DMEM/F12)中含有GlutaMAX、KSR、非必需胺基酸、2-巰基乙醇及抗生素的培養基。
本步驟(ii)中，例如，將步驟(i)中所得之細胞，
以含有選自BMP7及GSK-3β阻礙劑中1以上之物質的培養基進行培養，之後，以含有視黃酸衍生物之培養基進一步培養亦可。較佳為：本步驟(ii)中，將步驟(i)中所得之細胞，以含有選自BMP7及GSK-3β阻礙劑中1以上之物質的培養基進行培養，之後，以含有視黃酸衍生物及TGFβ信息刺激劑之培養基進一步培養。
即，本步驟(ii)為下列之步驟(ii-1)及(ii-2)之2步驟分離進行亦可。
(ii-1)以含有選自BMP7及GSK-3β阻礙劑中1以上之物質的基礎培養基進行培養的步驟、及(ii-2)以含有選自TGFβ信息刺激劑及視黃酸衍生物中1以上之物質的基礎培養基進行培養的步驟。
更佳為：本步驟(ii)中，(ii-1)步驟為以含有BMP7及GSK-3β阻礙劑之培養基進行培養之步驟，且(ii-2)步驟為以含有TGFβ信息刺激劑及視黃酸衍生物之培養基進行培養之步驟。
本步驟(ii)中，BMP7中包含來自人類BMP7(NCBI登錄號碼：NM_001719.2)及來自其他動物之BMP7、以及此等之機能性改變體，可使用例如，Invitrogen公司、R&D公司等之市售品。本步驟中所使用之BMP7的濃度為1ng/ml至1000ng/ml，較佳為10ng/ml至500ng/ml，更佳為50ng/ml至200ng/ml。
本步驟(ii)中，GSK-3β阻礙劑可使用前述步驟(i)中所例示之GSK-3β阻礙劑，作為較佳的GSK-3β阻
礙劑，可舉例CHIR99021。本步驟中所使用之GSK-3β阻礙劑的濃度，雖可對應使用之GSK-3β阻礙劑由該發明所屬技術領域具有通常知識者適宜地選擇，但例如，使用GSK-3β阻礙劑之CHIR99021時為0.01μM至100μM，較佳為0.1μM至10μM，更佳為1μM至3μM。
本步驟(ii)中，TGFβ信息刺激劑只要是使TGFβ信息途徑活性化者並無特別限定，作為TGFβ信息刺激劑，可使用TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3或是IDE1及IDE2，作為較佳的TGFβ信息刺激劑，可舉例TGFβ1。本步驟(ii)中，使用TGFβ信息刺激劑時的濃度，雖可對應使用之TGFβ信息刺激劑由該發明所屬技術領域具有通常知識者適宜地選擇，但例如，使用TGFβ信息刺激劑之TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3等之蛋白質時的濃度為0.1ng/ml至100ng/ml，較佳為1ng/ml至10ng/ml，更佳為5ng/ml至10ng/ml。又，使用IDE1及IDE2時的濃度為1μM至100μM，較佳為25μM至75μM，更佳為40μM至60μM。
本步驟(ii)中，視黃酸衍生物可使用前述步驟(i)中所例示之視黃酸衍生物，作為較佳的視黃酸衍生物，可舉例AM580或TTNPB。本步驟中所使用之視黃酸衍生物的濃度，雖可對應使用之視黃酸衍生物由該發明所屬技術領域具有通常知識者適宜地選擇，但例如，使用視黃酸衍生物之AM580或TTNPB時為0.01μM至100μM，較佳為0.1μM至10μM，更佳為0.5μM至2μM。
本步驟(ii)、(ii-1)及(ii-2)中，培養溫度雖未
限定為以下，但為約30~40℃，較佳為約37℃，在含有CO2之空氣的氣體環境下進行培養。CO2濃度為約2~5%，較佳為約5%。培養時間雖因長期間培養對腎前驅細胞之製造效率無特別影響故無上限，但作為步驟(ii)之培養時間，可舉例例如3日以上之培養，較佳為3日以上至12日以下，更佳為3日以上9日以下。步驟(ii)包含步驟(ii-1)及(ii-2)時，步驟(ii)之培養時間雖如前述，但作為步驟(ii-1)之培養時間，可舉例例如1日以上之培養，較佳為2日以上至11日以下，更佳為2日以上6日以下，作為步驟(ii-2)之培養時間可舉例例如1日以上之培養，較佳為2日以上至11日以下，更佳為3日以上6日以下。此時，培養基為每3日更換為宜。
本發明中分別提供由上述方法所得到之腎前驅細胞、含有該腎前驅細胞之醫藥組成物、含有該腎前驅細胞之腎疾病治療劑、包含投予該腎前驅細胞之治療有效量的治療腎疾病的方法、用以使用於腎疾病治療之該腎前驅細胞、及腎疾病治療用醫藥組成物之製造中該腎前驅細胞之使用。作為對必須治療的患者投予治療劑的方法，可舉例例如，將所得之腎前驅細胞薄片化，貼附於患者腎臓之方法、將所得之腎前驅細胞經懸浮於生理食鹽水等的細胞懸濁液、或進行三維培養(例如，Dev Cell.Sep 11,2012；23(3)：637-651)，直接移植所得之細胞塊至患者腎臓的方法、於由基質膠等所構成之支架上進行三維培養，移植所得之腎前驅細胞塊的方法等。雖移植部位只要是腎臓內
並無特別限定，但較佳為腎被膜下。腎疾病可例示急性腎損害、慢性腎衰竭、不會導致慢性腎衰竭之慢性腎臓病。
本發明中，腎疾病治療劑中所含之腎前驅細胞的細胞數，只要是移植片投予後能植活並無特別限定，可配合患部大小或身材大小適宜地增減來調製。
依據以下之實施例進一步具體說明本發明，但本發明之範圍並不限制於該等之實施例。
人類iPS細胞(201B7)為從京都大學(日本國、京都)山中伸彌教授得到、以習知的方法培養(Takahashi K,et al.Cell.131：861-72)。接著，以Mae S,et al,Nat Commun.4：1367,2013所記載之方法，製作與內在性OSR1表現連動之表現GFP的OSR1-GFP報導人類iPS細胞株。接著，使用與Mae等(同上)相同之方法，使用插入IRES-tdTomato之BAC克隆(RP11-819H19、Children’s Hospital Oakland Research Institute)，藉由同源重組導入IRES-tdTomato至該OSR1-GFP報導人類iPS細胞株之SIX2終止密碼子的下游，製作與內在性SIX2表現連動之表現tdTomato之OSR1-GFP & SIX2-tdTomato報導iPS人類細胞株。
在含有添加5ng/ml bFGF(Wako)之靈長類ES/iPS細胞用培養基(ReproCELL)的10cm培養皿上，使用SNL細胞(McMahon,A.P.and Bradley,A.(1990)Cell 62；1073-1085)(以15.5μg/ml之絲裂黴素(協和發酵麒麟)處理2~3小時，以3×105細胞/10cm培養皿進行播種)作為飼養細胞，將以實施例1之方法所得之OSR1-GFP & SIX2-tdTomato報導人類iPS細胞株於37℃、2~5%CO2氣體環境下培養至鋪滿為止。於此添加CTK溶液(2.5%Trypsin(Invitrogen)、1mg/ml Collagenase IV(Invitrogen)、0.1M CaCl2、10mL KnockOut SR(Invitrogen)、29.5mL H2O)使其解離，除去飼養細胞後，懸浮於含有1μM CHIR99021(Stemgent、04-0004)、100ng/ml Activin A(R&D systems、338-AC)、1%GlutaMAX(100X)(Invitrogen、35050-061)、2%FBS(Hyclone)、及0.5%PenStrep(Invitrogen、10565)之DMEM/F12培養基中，移入非附著培養盤(LOW CELL BIND 6WELL DISH(Nunc、145383))每1uferu由10cm培養皿所得之細胞懸濁液的1/3~1/6量以浮游培養於37℃、5%CO2氣體環境下進行培養2日。
將階段1中所得之細胞塊，移入以基質膠(BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced(BD Biosciences、356230)塗佈之24孔或6孔培養盤(以DMEM中0.2mg/ml之基質膠塗佈，37℃下處理30分或以4℃處理一晚)或以Synthemax(Corning Synthemax II-SC Substrate(Corning、3535XX1))塗佈之24孔或6孔培養盤(以經滅菌水稀釋40倍之Synthemax塗佈，於室溫處理2小時)，更換成添加了含有1μM CHIR99021、100ng/ml BMP7(Recombinant human BMP7(R&D systems、3534-BP))、0.1% 2-巰基乙醇(1000X)(Invitrogen、21985)、1% GlutaMAX(100X)、10%KnockOut SR(Invitrogen)、0.1mM MEM NEAA(Invitrogen、11140)、及0.5%PenStrep之DMEM/F12的培養基，於37℃、5%CO2氣體環境下以附著培養培養3日至6日。培養3日以上時，第3日以相同條件之培養基更換。
由階段2中所得之細胞去除培養基，以PBS洗淨後，更換成添加了含有5ng/ml TGFβ1(Peprotech,100-21C)、0.5μM Dorsomorphin(AMPK Inhibitor,Compound C(Merck、171260))、0.1%2-巰基乙醇(1000X)、1% GlutaMAX(100X)、10% KnockOut SR、0.1mM MEM
NEAA、及0.5%PenStrep之DMEM/F12的培養基，進而以浮游培養於37℃、5%CO2氣體環境下培養15日至22日。此時，3日以相同條件之培養基更換一次。所得之細胞的SIX2-tdTomato陽性細胞率使用流式細胞儀(Becton Dickinson)評估時為21.5±2.0%(圖1B)。
以與誘導方法1之階段1中所載方法相同的方法，使用SNL細胞作為飼養細胞，將於實施例1方法所得之OSR1-GFP & SIX2-tdTomato報導人類iPS細胞株於10cm培養皿上培養至鋪滿為止。於此處添加CTK溶液使其解離，除去飼養細胞後，懸浮於含有1μM TTNPB(Sigma、T3757)、1μM CHIR99021、1%GlutaMAX(100X)、2%FBS、及0.5% PenStrep之DMEM/F12培養基，往非附著培養盤(LOW CELL BIND 6WELL DISH)每1孔移入由10cm培養皿所得之細胞懸濁液的1/3~1/6量，以浮游培養於37℃、5%CO2氣體環境下培養2日。
將階段1中所得之細胞塊，移入經基質膠塗佈之培養皿或經Synthemax塗佈之培養皿(以誘導方法1之階段2中所記載之方法調製)，更換成已添加含有1μM
TTNPB、0.1%2-巰基乙醇(1000X)、1% GlutaMAX(100X)、10%KnockOut SR、0.1mM MEM NEAA、及0.5%PenStrep之DMEM/F12的培養基，以附著培養於37℃、5%CO2氣體環境下培養3日至9日。此時，3日以相同條件之培養基更換一次。
自階段2中所得之細胞除去培養基，以PBS洗淨後，更換成已添加含有5ng/ml TGFβ1、0.5μM Dorsomorphin、0.1%2-巰基乙醇(1000X)、1%GlutaMAX(100X)、10%KnockOut SR、0.1mM MEM NEAA、及0.5%PenStrep之DMEM/F12的培養基，進而以浮游培養於37℃、5%CO2氣體環境下培養12日至22日。此時，3日以相同條件之培養基更換一次。所得之細胞中之SIX2-tdTomato陽性細胞率使用使用流式細胞儀評估時為20.6±5.3%(圖1C)。
以與誘導方法1之階段1中所記載之方法相同的方法，使用SNL細胞作為飼養細胞，將以實施例1方法所得之OSR1-GFP & SIX2-tdTomato報導人類iPS細胞株於10cm培養皿上培養至鋪滿為止。於此處添加CTK溶液使
其解離，除去飼養細胞，加入Accutase(TM)(Innovative Cell Technologies、AT-104)使iPS細胞分散成單一細胞。接著，使其懸浮於含有10μM Y-27632(Wako、253-00513)、1μM CHIR99021、1μM TTNPB、1% GlutaMAX(100X)、2%FBS、及0.5%PenStrep之DMEM/F12培養基，將上述細胞懸濁液(1×105細胞/孔(96孔時))移入經0.1%明膠(Gelatin from porcine skin,Type A(Sigma、G1890))塗佈之培養皿，於37℃、5%CO2氣體環境下以附著培養進行培養2日。
將階段1中所得之細胞以PBS洗淨，更換成已添加含有1μM TTNPB、0.1%2-巰基乙醇(1000X)、1%GlutaMAX(100X)、10%KnockOut SR、0.1mM MEMNEAA、及0.5%PenStrep之DMEM/F12的培養基，以附著培養於37℃、5%CO2氣體環境下培養3日至9日。此時，3日以相同條件之培養基更換一次。
於階段2中所得之細胞加入Accutase(TM)使其解離，將OSR1(GFP)作為指標藉由FACS分選OSR1陽性細胞。將所得之OSR1陽性細胞於已添加含有5ng/ml TGFβ1、0.5μM Dorsomorphin、0.1% 2-巰基乙醇(1000X)、1%GlutaMAX(100X)、10%KnockOut SR、
0.1mM MEM NEAA、及0.5%PenStrep之DMEM/F12的培養基中，以1×106細胞/孔移入非附著培養盤(LOW CELL BIND 6WELL DISH)，於37℃、5%CO2氣體環境下以浮游培養培養2日。將所得之細胞塊移入經基質膠(BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced)塗佈之培養皿，於含有5ng/ml TGFβ1、0.5μM Dorsomorphin、0.1%2-巰基乙醇(1000X)、1%GlutaMAX(100X)、10% KnockOut SR、0.1mM MEM NEAA、及0.5%PenStrep之DMEM/F12中，於37℃、5%CO2氣體環境下附著培養2日至13日。
此時，3日以相同條件之培養基更換一次。所得之細胞中之SIX2-tdTomato陽性細胞率，使用流式細胞儀評估時為31.1±10.0%(圖1D)。
SIX2陽性細胞之誘導方法1之階段3中，將Dorsomorphin變更成100ng/ml Noggin(Peprotech)、0.5μM LDN193189(Axon MedChem、1509)或0.5μM DMH1(Tocris、4126)進行相同的分化誘導時，SIX2-tdTomato陽性細胞率分別為7.5%、20.4%或15.4%(分別為圖2B、C及D)。
SIX2陽性細胞之誘導方法1之階段3中，將TGFβ1
變更成50μM IDE1(Tocris)或50μM IDE2(Tocris)進行相同的分化誘導時，SIX2-tdTomato陽性細胞率分別為8.4%、39.4%(圖2E及F)。
SIX2陽性細胞之誘導方法1之階段3中，將Dorsomorphin變更成0.5μM LDN193189，TGFβ1變成10ng/ml TGFβ2(Peprotech)或10ng/ml TGFβ3(R & D)進行相同的分化誘導時，SIX2陽性細胞率分別為8.6%、9.3%(圖2G及H)。
使用與實施例1所記載相同的方法，由Mae S,et al,Nat Commun.4：1367,2013中所記載之OSR1-GFP報導人類iPS細胞株(3D45)，製作OSR1-GFP & SIX2-tdTomato報導iPS人類細胞株(4A6C3-10)。
於含有已添加500U/ml盤尼西林/鏈黴素(Invitrogen)及5ng/ml重組人類鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF，Wako)之靈長類ES培養基(ReproCELL)的10cm培養皿上，使用胎生12.5日ICR小鼠胚由來小鼠胚性纖維母細胞(MEF)或SNL飼養細胞(McMahon,A.P.and Bradley,A.(1990)Cell 62；1073-1085)(以15.5μg/ml之絲裂黴素(協和發酵麒麟)處理2~3小時，播種於2×105細胞/6cm培養皿)作為飼養細胞，將4A6C3-10於37℃、2~5%CO2氣體環境下培養至70%~80%滿為止。將含有細胞之10cm培養盤以PBS清洗，以CTK溶液(PBS中，0.25% Trypsin(Invitrogen)、0.1% Collagenase IV(Invitrogen)、20% KnockOut SR(KSR、Invitrogen)及1mM CaCl2)37℃處理4分鐘。將CTK溶液藉由PBS清洗除去後，置換成含有0.1mM MEM NEAA(Invitrogen)、1000U/ml盤尼西林/鏈黴素、0.55mM 2-巰基乙醇(Invitrogen)、及20% KSR之DMEM/F12+Glutamax(Invitrogen)。接著，將細胞以細胞刮刀刮起，播種於經0.2%明膠塗佈之6cm培養盤，除去飼養細胞。1小時後，將細胞以含有500U/ml盤尼西林/鏈黴素及2%FBS(HyClone)之DMEM/F12+Glutamax〔階段1培養基〕洗淨，移入含有100ng/ml重組人類/小鼠/大鼠Activin A(R&D systems)及1μM CHIR99021之階段1培養基的超低附著培養皿(Corning 3471)，於37℃、5% CO2氣體環境下培養2日。
為了使細胞往中間中胚層分化，將階段1中所得之細胞塊(類胚體(EB))，移入經Synthemax II(Corning)塗佈之24孔盤，更換成含有0.1mM MEM NEAA、500U/ml盤尼西林/鏈黴素、0.55mM 2-巰基乙醇、10%KSR、100ng/ml BMP7(recombinant human BMP7、R&D systems)、及1μM CHIR99021之DMEM/F12+Glutamax，於37℃、5% CO2氣體環境下培養3日。
階段2之後，將培養基更換成含有0.1mM MEM NEAA、500U/ml盤尼西林/鏈黴素、0.55mM 2-巰基乙醇、10%KSR、1μM TTNPB(Sigma T3757)及5ng/ml TGFβ1(Peprotech)之DMEM/F12+Glutamax，於37℃、5%CO2氣體環境下培養5日。培養開始後第2日(自階段1開始(第1日)之第8日)以相同條件之培養基更換。
階段3之後，將培養基更換成含有0.1mM MEM NEAA、500U/ml盤尼西林/鏈黴素、0.55mM 2-巰基乙醇、10%KSR、5ng/ml TGFβ1及0.5μM DMH1(Tocris)之DMEM/F12+Glutamax，於37℃、5%CO2氣體環境下培
養17日(自階段1開始(第1日)全部28日之培養。圖3A)。此時，3日以相同條件之培養基更換一次。將所得之細胞中OSR1陽性SIX2陽性(OSR1+SIX2+)細胞率，使用流式細胞儀評估時為培養第28日為32.8%(圖3B)。又，確認到OSR1+SIX2+細胞率於培養第25日到達最大，之後維持至培養28日(圖3D)。
關於各種TGFβ信息刺激劑及BMP阻礙劑之組合，研究由前述iPS細胞株4A6C3-10向OSR1+SIX2+細胞之誘導。具體而言，在下列說明之條件1)~10)下，研究由4A6C3-10向OSR1+SIX2+細胞之誘導。
條件1)~10)之階段1~2中，分別使用與實施例7之階段1~2相同方法。條件1)~7)及10)之階段3中，使用與實施例7之階段3相同方法。條件8)之階段3中，以將實施例7之階段3中之5ng/ml TGFβ1及1μM TTNPB置換成5ng/ml TGFβ2(Peprotech)之培養基進行培養。條件9)之階段3中，以將實施例7之階段3中之5ng/ml TGFβ1及1μM TTNPB取代成5ng/ml TGFβ3(Peprotech)之培養基進行培養。各條件之階段4中，與實施例7之階段4相同方法、或將實施例7之階段4中之5ng/ml TGFβ1及0.5μM DMH1置換成以下任一種之培養基進行培養：條件1)僅DMSO、條件2)5ng/ml
TGFβ1、條件3)0.5μM DMH1、條件4)5ng/ml TGFβ1及100ng/ml Noggin(Peprotech)、條件5)5ng/ml TGFβ1及0.5μM Dorsomorphin(Merck)、條件6)5ng/ml TGFβ1及0.5μM LDN193189(Axon MedChem)、條件7)5ng/ml TGFβ1(Peprotech)及0.5μM DMH1(與實施例7相同)、條件8)5ng/ml TGFβ2(Peprotech)及0.5μM DMH1、條件9)5ng/ml TGFβ3(Peprotech)及0.5μM DMH1、條件10)50μM IDE2(Tocris)及0.5μM DMH1。
其結果(圖4)，向OSR1+SIX2+細胞之誘導中，確認到作為TGFβ信息刺激劑使用TGFβ1、作為BMP阻礙劑使用DMH1為有效的。實施例7中之階段4中，與5ng/ml TGFβ1及0.5μM DMH1同時，以含有TGFβ受體1阻礙劑之SB431542(Tocris)(10μM)之培養基進行培養時(條件11))，向OSR1+SIX2+細胞之分化被抑制。
將15種人類iPS細胞(來自末梢血之iPS細胞585A1、585B1、604A1、604B1、648A1、648B1、692D2；來自臍帶血之iPS細胞606A1、606B1、610B1；來自成人皮膚纖維母細胞(aHDF)之iPS細胞201B6、201B7、253G1、253G4；及4A6C3-10)及3種人類ES細胞(khES1、khES3、H9)(Proc Natl Acad Sci USA 109,
12538-12543(2012)、Stem Cells 31,458-466(2013))，以與實施例7所記載之方法相同的方法進行處理，藉由定量RT-PCR(Nat Commun 4,1367,(2013))分析OSR1及SIX2之基因表現。藉由實施例7所記載之方法，4A6C3-10以外之複數的細胞株中，確認到OSR1及SIX2之表現(圖5)，確認本方法亦可適用於其他iPS細胞及ES細胞。
將以實施例7之誘導步驟進行處理之4A6C3-10中之各種表現標記，以RT-PCR或定量RT-PCR分析。結果表示於圖3C及E。階段1後之細胞中確認到初期之後方中胚層(posterior nascent mesoderm)之標記BRACHYURY及TBX6的表現，階段2後之細胞中確認到中間中胚層標記之OSR1的表現(圖3C)。之後，後腎間充質(間葉)標記之WT1、PAX2、SIX2、及後方(posterior)HOX基因的表現活性化(圖3C)。培養第28日之OSR1+SIX2+細胞中，表現腎前驅細胞標記之CITED1、EYA1、PAX2、WT1、SALL1、ITGA8、CDH11、GDNF、HOXA11及HOXD1，另一方面，該細胞中檢測出間質標記之FOXD1、中腎管標記、輸尿管芽之HOXB7(圖3E)。
將以實施例7之誘導步驟進行處理之培養第28日的OSR1+SIX2+細胞以流動式細胞測量術單離，以3.0×104細胞/孔播種於經Synthemax II塗佈之96孔盤上，於添加了10μM Y-27632之REGM培養基(LONZA)中，於37℃、5% CO2氣體環境下培養7日。將所得之細胞藉由針對NEPHRIN(絲球體足細胞標記)、AQP1及MEGALIN(近曲小管標記)以及UROMUCOID(亨耳氏套標記)之免疫染色，確認到各標記之陽性細胞(圖6A)。
接著，將相同OSR1+SIX2+細胞，以1.0×105細胞/孔播種至含有已添加50ng/ml BMP7(R&D systems)及10μM Y-27632(Wako)之UBC培養上清(參照下述)的紡錘底低附著96孔盤(Lipidure Coat、NOF)，於37℃、5% CO2氣體環境下培養24小時。接著，將培養基置換成添加了50ng/ml BMP7、0.5μM BIO(Wako)、及10μM Y-27632之UBC培養上清，培養2至3日後，回收細胞，以3.0×104細胞/孔(24孔盤)播種至經絲裂黴素處理之表現Wnt4的NIH3T3(Osafune K,et al.(2006),Development 133：151-61)上、培養5至7日。將所得之細胞藉由針對Lotus Tetragonolobus lectin(LTL)(近曲小管標記)、LAMININ(極性上皮細胞標記)、CDH1(遠曲小管標記)以及PODOCALYXIN及WT1(絲球體足細胞標記)之免疫染色，確任各標記之陽性細胞(圖6B)。
進而，將OSR1+SIX2+細胞與E11.5之小鼠胚脊髓進行器官培養。詳細情形為，將OSR1+SIX2+細胞以1.0×105細胞/孔播種至含有已添加50ng/ml BMP7(R&D systems)及10μM Y-27632(Wako)之UBC培養上清(參照下述)的紡錘底低附著96孔盤(Lipidure Coat、NOF)，於37℃、5%CO2氣體環境下培養24小時。接著，將培養基置換成添加了50ng/ml BMP7、0.5μM BIO(Wako)、及10μM Y-27632之UBC培養上清，培養2至3日後，回收細胞，與E11.5之小鼠胚脊髓一同在具有0.4μm孔之聚碳酸酯(polycarbonate)過濾器(Millipore)上的空氣-培養液交界處，以37℃培養。培養液側使用添加了500U/ml盤尼西林/鏈黴素及10% FBS之DMEM(Nacalai tesque)(Osafune K,et al.(2006),Development133：151-61)。一週後將所得之細胞藉由針對LTL、LAMININ、CDH1、PODOCALYXIN及WT1之免疫染色，確認到各標記之陽性細胞(圖6C)。
同樣地，將OSR1+SIX2+細胞與E11.5之小鼠胚後腎進行器官培養。詳細情形為，將OSR1+SIX2+細胞以1.0×105細胞/孔播種至含有已添加50ng/ml BMP7(R&D systems)及10μM Y-27632(Wako)之UBC培養上清(參照下述)的紡錘底低附著96孔盤(Lipidure Coat、NOF)，於37℃、5%CO2氣體環境下培養24小時。接著，將培養基置換成添加了50ng/ml BMP7、0.5μM BIO(Wako)、及10μM Y-27632之UBC培養上清，培養2
至3日後，回收細胞，使用Accumax進行分離。自ICR小鼠取出E11.5之小鼠胚後腎，在DMEM中切斷，於0.05%Trypsin-EDTA中放置10分鐘，藉由沖吸分離。將分離之小鼠胚後腎細胞在添加了500U/ml盤尼西林/鏈黴素及10%FBS之DMEM中，於37℃靜置10分鐘後，以40μm細胞濾網(BD)過濾。將所得5.0×105細胞的小鼠胚後腎細胞與5.0×105細胞之的前述Accumax分離之OSR1+SIX2+細胞混合，紡錘底低附著96孔盤上，於添加了10μM Y-27632、500U/ml盤尼西林/鏈黴素及10%FBS之DMEM中培養一晝夜，使其形成凝集塊。將所得之凝集塊於具有0.4μm孔之聚碳酸酯(polycarbonate)過濾器(Millipore)上之空氣-培養液交界處以37℃培養。培養液側使用添加了500U/ml盤尼西林/鏈黴素及10%FBS之DMEM(Nacalai tesque)(Uchino,S.et al.JAMA 294,813-818(2005))。一週後將所得之細胞藉由針對CDH6(腎小胞標記)、LTL、LAMININ、CDH1、PODOCALYXIN及WT1之免疫染色，確認到各標記之陽性細胞(圖6D)。
進而，將OSR1+SIX2+細胞以1.0×105細胞/孔播種至含有已添加50ng/ml BMP7(R&D systems)及10μM Y-27632(Wako)之UBC培養上清(參照下述)之紡錘底低附著96孔盤(Lipidure Coat、NOF)，於37℃、5%CO2氣體環境下培養24小時。接著，將培養基置換成添加了50ng/ml BMP7、0.5μM BIO(Wako)、及10μM Y-27632
之UBC培養上清，培養2至3日後，回收細胞，移植至免疫不全小鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/J(Charles river))的副睪脂肪組織，30日後回收移植部位時，確認到LTL及LAMININ陽性之類近曲小管構造(圖6E)。
進而，將以實施例7之誘導步驟處理之培養第28日的各劃分區域的細胞(OSR1-SIX2-、OSR1+SIX2-、OSR1-SIX2+、及OSR1+SIX2+)與E11.5之小鼠胚輸尿管芽進行器官培養。詳細情形為，將來自iPS細胞之細胞以1.0×105細胞/孔播種至含有已添加50ng/ml BMP7(R&D systems)及10μM Y-27632(Wako)之UBC培養上清(參照下述)的紡錘底低附著96孔盤(Lipidure Coat、NOF)，於37℃、5%CO2氣體環境下培養24小時。接著，將培養基置換成添加了50ng/ml BMP7、0.5μM BIO(Wako)、及10μM Y-27632之UBC培養上清，培養2至3日後，回收細胞，使用Accumax進行分離。自ICR小鼠取出E11.5之小鼠胚輸尿管芽。將所得5.0×105細胞之小鼠胚輸尿管芽與5.0×105細胞的以前述Accumax分離之OSR1-SIX2-、OSR1+SIX2-、OSR1-SIX2+、及OSR1+SIX2+之各細胞群混合，紡錘底低附著96孔盤上，在添加了10μM Y-27632、500U/ml盤尼西林/鏈黴素及10% FBS之DMEM中培養一晝夜，使其形成凝集塊。將所得之凝集塊於具有0.4μm孔之polycarbonate過濾器(Millipore)上的空氣-培養液交界處，以37℃培養。培養液側使用添加了500U/ml盤尼西林/鏈黴素及10%FBS
之DMEM(Nacalai tesque)(Uchino,S.et al.JAMA 294,813-818(2005))。觀察一週後所得之細胞凝集塊時，僅於與OSR1+SIX2+細胞之凝集塊中確認到管狀構造(圖6F左圖)。進而，對於與OSR1+SIX2+細胞之凝集塊，進行針對DBA(輸尿管芽標記)之免疫染色時，確認到來自小鼠輸尿管芽之分枝(圖6F右圖)。
依據上述，顯示以實施例7所記載之方法分化誘導之OSR1+SIX2+細胞為腎前驅細胞。
以文獻(Am J Physiol 273,F757-767(1997))所載方法之改良方法製作Ureteric Bud細胞(UBC)馴化培養基。UBC(由Dr Sakurai受讓，將Proc Natl Acad Sci USA 94,6279-6284(1997)以含有10%胎牛血清(FBS)之最小必需培養基(MEM；Invitrogen)培養。80%滿時將細胞以PBS清洗，將培養基以含有0.1mM MEM NEAA、500U/ml盤尼西林/鏈黴素、及0.55mM 2-巰基乙醇、10%KSR之DMEM/F12+Glutamax置換。接著，培養細胞3日生成培養上清。培養上清在使用前以0.22μm過濾器過濾。
以實施例7所記載之方法分化誘導之包含第25日~28
日的來自人類iPS之腎前驅細胞(OSR1+SIX2+細胞；亦稱為RP-OS)或來自人類iPS之腎前驅細胞的細胞群(OSR1+SIX2-細胞及OSR1+SIX2+細胞；亦稱為hiPSC-RP)以流動式細胞測量術單離，以1.0×105細胞/孔播種至含有已添加50ng/ml BMP7(R&D systems)及10μM Y-27632(Wako)之UBC培養上清(上述)的紡錘底低附著96孔盤(Lipidure Coat、NOF)，於37℃、5%CO2氣體環境下培養24小時。接著，將培養基置換成添加了50ng/ml BMP7、0.5μM BIO(Wako)、及10μM Y-27632之UBC培養上清，進而培養24小時。將作為對照組之未分化人類iPS細胞(4A6C3-10)，以1.0×105細胞/孔播種至含有已添加10μM Y-27632之靈長類ES細胞培養基(ReproCELL)的紡錘底低附著96孔盤，於37℃、5%CO2氣體環境下培養48小時。培養後之各細胞以生理食鹽水洗淨，除去培養基。之後，如下述記載，將15個hiPSC-RP之細胞塊移植至急性腎損害(AKI)模式小鼠的腎臓被膜下。又，作為確認OSR1+SIX2+細胞之組織分化的實驗(圖7A及B)，如下述記載，將5個RP-OS之細胞塊以移液注入AKI模式小鼠及慢性腎衰竭模式小鼠之腎臓實質中。
依照周知方法(Aging Cell 8,192-200(2009)、J Am Soc Nephrol 20,1544-1555(2009)、J Am Soc
Nephrol 25,316-328(2014))製作小鼠缺血再灌流AKI模式。將6週齡之雌性免疫不全小鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/J(Charles river))藉由吸入異氟醚麻醉，維持在37℃。側腹切開進行右腎摘出後，使用非外傷性微小血管用鉗(夏目製作所，日本國)，將左腎動脈閉塞45分鐘。取下鉗後，移植RP-OS、hiPSC-RP、或4A6C3-10(對照小鼠注入生理食鹽水)。使用DRI-CHEM 7000VZ(富士軟片，日本國)測定小鼠末梢血中腎機能標記之血中尿素氮(BUN)及血清肌酐(Cr)水平。AKI狀態之確立，係藉由於缺血再灌流後沒有腎梗塞而第2日BUN水平上昇(>41mg/dl)來確認。腎組織之解析係缺血再灌流後(I/R)第3日以過碘酸-Schiff(PAS)或馬森三色(MT)染色進行染色。
依照周知方法(Nephrol Dial Transplant 26,832-838(2011))製作小鼠慢性腎衰竭模式(5/6腎摘出模式)。6週齡之雌性免疫不全小鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/J)藉由吸入異氟醚麻醉，維持在37℃。進行右腎摘出後，切除左腎臓之上下兩極。於術後2週移植RP-OS之細胞塊。移植3日後或2週後將小鼠屠殺，將腎組織切片以免疫染色試驗。
RP-OS之腎實質移植後第2週之AKI模式(圖7A)及慢性腎衰竭模式(圖7B)兩者中，經移植之RP-OS的一些結合到宿主腎臓中，分化成近曲小管標記LTL及AQP1陽性細胞。然而，RP-OS之腎實質移植於兩模式中對於腎機能未顯示明確的效果(未顯示數據)。因為與靜脈內注射相比，藉由向腎臓被膜下移植被報告有較多數間葉系幹細胞直接送達經損傷的腎臓(Transplant Proc 41,947-951(2009))，故本發明者們試驗hiPSC-RP之腎臓被膜下移植的治療效果。結果，與缺血再灌流後第2、4、6日對照群及未分化人類iPS細胞移植群相比，hiPSC-RP移植群中BUN水平及血清Cr水平顯著地降低(圖7C)。藉由組織學分析，確認到與對照群相比，hiPSC-RP移植群中伴隨腎實質區域之管型(casts)的擴張腎小管顯著地較小，纖維化區域亦在hiPSC-RP移植群中較小(圖7D及E)。因為hiPSC-RP結合至宿主腎臓中，推測以本操作程序確認之hiPSC-RP治療效果主要係基於旁分泌效果。
如以上詳述，本發明提供一種由中間中胚層細胞分化誘導腎前驅細胞之方法。藉此，以本方法所製造之腎前驅細胞可使用於腎衰竭等之腎疾病的再生醫療。
本說明書中所引用之全部出版物、專利及專利申請直接作為參考納入本說明書中。
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<221> LIPID
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<223> MYRISTATE
<220>
<221> MOD_RES
<222> 11
<223> PHOSPHORYLATION
<220>
<221> MOD_RES
<222> 12
<223> AMIDATION
<400> 1
Claims (32)
- 一種由中間中胚層細胞製造腎前驅細胞的方法，其特徵為包含下述步驟：將中間中胚層細胞以含有TGFβ信息刺激劑及BMP阻礙劑之培養基進行培養，由中間中胚層細胞誘導腎前驅細胞的步驟。
- 如請求項1之方法，其中，前述腎前驅細胞為SIX2陽性細胞。
- 如請求項1或2之方法，其中，前述中間中胚層細胞為OSR1陽性細胞。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中，前述TGFβ信息刺激劑為選自TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、IDE1及IDE2所成群中1以上之物質。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中，前述BMP阻礙劑為選自Dorsomorphin、Noggin、LDN193189及DMH1所成群中1以上之物質。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中，前述TGFβ信息刺激劑為TGFβ1，前述BMP阻礙劑為DMH1。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中，前述中間中胚層細胞為由多能性幹細胞所誘導之中間中胚層細胞。
- 如請求項7之方法，其中，前述中間中胚層細胞為以包含下述步驟(i)及(ii)之方法所製造之中間中胚層細胞，(i)將多能性幹細胞以含有選自Activin A、GSK- 3β阻礙劑及視黃酸衍生物所成群之1以上的物質之培養基進行培養的步驟、及(ii)將步驟(i)所得之細胞以含有選自BMP7、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物所成群之1以上的物質之培養基進行培養的步驟。
- 如請求項8之方法，其中，前述步驟(ii)包含下述之步驟(ii-1)及(ii-2)：(ii-1)將於步驟(i)所得之細胞以含有選自BMP7及GSK-3β阻礙劑之1以上的物質之培養基進行培養的步驟、及(ii-2)將於步驟(ii-1)所得之細胞以含有選自TGFβ信息刺激劑及視黃酸衍生物之1以上的物質之培養基進行培養的步驟。
- 如請求項9之方法，其中，前述步驟(ii-1)為以含有BMP7及GSK-3β阻礙劑之培養基進行培養的步驟，前述步驟(ii-2)為以含有TGFβ信息刺激劑及視黃酸衍生物之培養基進行培養的步驟。
- 如請求項8至10中任一項之方法，其中，前述GSK3β阻礙劑為CHIR99021。
- 如請求項8至11中任一項之方法，其中，前述視黃酸衍生物為AM580或TTNPB。
- 如請求項7至12中任一項之方法，其中，前述多能性幹細胞為人工多能性幹(iPS)細胞。
- 如請求項13之方法，其中，前述iPS細胞為人 類iPS細胞。
- 一種方法，其係由多能性幹細胞製造腎前驅細胞之方法，其包含下述步驟(i)至(iii)：(i)將多能性幹細胞以含有選自Activin A、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物所成群之1以上的物質之培養基進行培養的步驟、(ii)將步驟(i)所得之細胞以含有選自BMP7、GSK-3β阻礙劑及視黃酸衍生物所成群之1以上的物質之培養基進行培養的步驟、及(iii)將步驟(ii)所得之細胞以含有TGFβ信息刺激劑及BMP阻礙劑之培養基進行培養的步驟。
- 如請求項15之方法，其中，前述腎前驅細胞為SIX2陽性細胞。
- 如請求項15或16之方法，其中，前述步驟(ii)所得之細胞為OSR1陽性細胞。
- 如請求項15至17中任一項之方法，其中，前述TGFβ信息刺激劑為選自TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、IDE1及IDE2所成群中1以上之物質。
- 如請求項15至18中任一項之方法，其中，前述BMP阻礙劑為選自Dorsomorphin、Noggin、LDN193189及DMH1所成群中1以上之物質。
- 如請求項15至17中任一項之方法，其中，前述TGFβ信息刺激劑為TGFβ1，前述BMP阻礙劑為DMH1。
- 如請求項15至20中任一項之方法，其中，前述 步驟(ii)包含下述步驟(ii-1)及(ii-2)：(ii-1)將步驟(i)所得之細胞以含有選自BMP7及GSK-3β阻礙劑中之1以上的物質之培養基進行培養的步驟、及(ii-2)將步驟(ii-1)所得之細胞以含有選自TGFβ信息刺激劑及視黃酸衍生物中之1以上的物質之培養基進行培養的步驟。
- 如請求項21之方法，其中，前述步驟(ii-1)為以含有BMP7及GSK-3β阻礙劑之培養基進行培養的步驟，前述步驟(ii-2)為以含有TGFβ信息刺激劑及視黃酸衍生物之培養基進行培養的步驟。
- 如請求項15至22中任一項之方法，其中，前述GSK3β阻礙劑為CHIR99021。
- 如請求項15至23中任一項之方法，其中，前述視黃酸衍生物為AM580或TTNPB。
- 如請求項15至24中任一項之方法，其中，前述多能性幹細胞為人工多能性幹(iPS)細胞。
- 如請求項25之方法，其中，前述iPS細胞為人類iPS細胞。
- 一種腎前驅細胞，其特徵為以如請求項1至26中任一項之方法所製造。
- 一種醫藥組成物，其特徵為包含以如請求項1至26中任一項之方法所製造之腎前驅細胞。
- 一種腎疾病治療劑，其特徵為包含以如請求項1 至26中任一項之方法所製造之腎前驅細胞。
- 一種治療腎疾病的方法，其特徵為包含將以如請求項1至26中任一項之方法所製造之腎前驅細胞投予至必須治療之患者的步驟。
- 一種以如請求項1至26中任一項之方法所製造之腎前驅細胞，其係欲使用於腎疾病之治療。
- 一種以如請求項1至26中任一項之方法所製造之腎前驅細胞的用途，其係用於腎疾病治療用醫藥組成物之製造中。
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