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TW201402813A - 對單核苷酸ｋｒａｓ突變具專一性之雙功能性短髮夾ｒｎａ（ｂｉ－ｓｈｒｎａ） - Google Patents

對單核苷酸ｋｒａｓ突變具專一性之雙功能性短髮夾ｒｎａ（ｂｉ－ｓｈｒｎａ） Download PDF

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TW201402813A
TW201402813A TW102116636A TW102116636A TW201402813A TW 201402813 A TW201402813 A TW 201402813A TW 102116636 A TW102116636 A TW 102116636A TW 102116636 A TW102116636 A TW 102116636A TW 201402813 A TW201402813 A TW 201402813A
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TW
Taiwan
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ras
shrna
bifunctional
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seq
Prior art date
Application number
TW102116636A
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English (en)
Inventor
Donald Rao
Zhao-Hui Wang
John J Nemunaitis
Neil Senzer
Original Assignee
Gradalis Inc
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Publication date
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Abstract

本發明包括一種製造及使用能夠減少K-ras基因(例如突變K-ras基因)表現之雙功能性shRNA之組合物及方法，其中該雙功能性RNA分子之至少一個靶位點序列係位於該K-ras基因內，且其中該雙功能性RNA分子能夠活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物，以減少K-ras之表現量。

Description

對單核苷酸 KRAS 突變具專一性之雙功能性短髮夾RNA(BI-SHRNA) 相關申請案交叉參考
本申請案主張於2012年5月9日提出申請的美國臨時申請案第61/644,875號之優先權，該申請案之全部內容以引用方式併入本文中。
本發明概言之係關於癌症治療之領域，且更具體而言，關於對K-ras突變具專一性之雙功能性shRNA。
在不限制本發明之範疇下，結合K-ras闡述本發明之背景。
KRAS(Kirsten-ras)致癌基因在較大比例之胰管腺癌(PDAC)、結腸直腸癌及非小細胞肺癌(NSCLC)中突變。在大多數(70-90%)攜帶KRAS突變之PDAC患者中，五年存活率小於5%。KRAS係鳥嘌呤核苷酸結合蛋白家族之成員且係多種包含表皮生長因子受體(EGFR)之細胞內信號傳導途徑不可缺少的組份。絕大多數KRAS突變係在密碼子12或13處引起單胺基酸取代之單核苷酸體細胞突變。G12D、G12V、G12R及G12C KRAS突變佔在PADC患者中所發現KRAS突變之90%以上。KRAS突變實質上產生組成型活性KRAS及失控的下游信號傳導。
靶向劑(例如抗體西妥昔單抗(Cetuximab)，用於結腸直腸癌中)及 小分子抑制劑威羅菲尼(vemurafenib，用於BRAF突變黑色素瘤中)在具有KRAS突變之患者中表現較差。因此，有效的癌症治療策略需要KRAS突變選擇性，從而保留野生型功能。業內仍迫切需要針對具有KRAS突變之癌症之組合物、方法及治療。
在一實施例中，本發明包含能夠減少K-ras基因之表現之雙功能性shRNA；其中雙功能性RNA分子之至少一個靶位點序列係位於K-ras基因內，其中雙功能性RNA分子能夠活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少K-ras之表現量。在一態樣中，雙功能性shRNA包括至少一個藉由SEQ ID NO：1至22定義之序列。在另一態樣中，雙功能性shRNA包括至少一個藉由SEQ ID NO：31至52或53至56定義之序列。在另一態樣中，至少一個靶位點序列係在人類K-ras基因cDNA序列(SEQ ID NO：27至30)內。在另一態樣中，K-ras係突變K-ras。在另一態樣中，雙功能性shRNA包括靶向專一性K-ras突變之三重體插入物，該等插入物係選自SEQ ID NO.：2、18、20、21、或SEQ ID NO：2、18及20之組合、或SEQ ID NO：21、2及18之組合。
在一實施例中，本發明包含包括啟動子及可操作地連接至該啟動子之核酸插入物之表現載體(vector)，其中該插入物編碼一或多種能夠經由RNA干擾法抑制至少一個靶基因(其係K-ras基因)表現之shRNA；其中該一或多種shRNA包括活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少K-ras表現量之雙功能性RNA分子。在一態樣中，靶基因序列包括SEQ ID NO：1至5。在另一態樣中，shRNA之序列排列包括5’莖臂-19核苷酸靶，其係K-ras-TA-15核苷酸環-19核苷酸靶互補序列-3’莖臂-間隔體-5’莖臂-19核苷酸靶變體-TA-15核苷酸環-19核苷酸靶互補序列-3’莖臂。在另一態樣中，核酸插入 物包括至少一個選自SEQ ID NO：6至27之序列。在另一態樣中，至少一個shRNA具有處於突變K-ras基因cDNA序列內之靶位點序列。在另一態樣中，本發明包含包括治療劑載體(carrier)及表現載體之治療性遞送系統，該表現載體包括啟動子及可操作地連接至該啟動子之核酸插入物，該核酸插入物編碼一或多種能夠經由RNA干擾法抑制靶基因序列(其係K-ras基因)表現之短髮夾RNA(shRNA)；其中該一或多種shRNA包括活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少K-ras表現量之雙功能性RNA分子。在另一態樣中，治療劑載體係包覆之DNA奈米粒子。在另一態樣中，DNA奈米粒子係使用一或多種聚陽離子物包覆。在另一態樣中，一或多種聚陽離子物係經10kDA聚乙二醇(PEG)取代之半胱胺酸-離胺酸三聚體肽(CK30PEG10k)。在另一態樣中，包覆之DNA奈米粒子係進一步囊封於脂質體中。在另一態樣中，脂質體係雙層內陷性囊泡(BIV)。在另一態樣中，脂質體係可逆式遮蔽脂質體。在另一態樣中，治療劑載體係脂質體。在另一態樣中，靶基因序列包括SEQ ID NO：27至30。在另一態樣中，核酸插入物包括選自SEQ ID NO：31至52或53至56之序列中之至少一者。在另一態樣中，插入物係選自SEQ ID NO：1-22。在另一態樣中，雙功能性shRNA包括靶向專一性K-ras突變之三重體插入物，該等插入物係選自SEQ ID NO.：2、18、20、21、55、或SEQ ID NO：2、18及20之組合、或SEQ ID NO：21、2及18之組合。
在一實施例中，本發明包含將一或多種shRNA遞送至表現K-ras基因之靶組織之方法，該方法包括以下步驟：製備表現載體，該表現載體包括啟動子及可操作地連接至該啟動子之核酸插入物，該核酸插入物編碼一或多種shRNA，其中該一或多種shRNA包括活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少K-ras表現量之雙功能性RNA分子；組合表現載體與治療劑載體，其中該治療劑載體包括 脂質體；及向有需要之患者投與治療有效量之表現載體與治療劑載體複合物。在一態樣中，治療劑載體係包覆之DNA奈米粒子。在另一態樣中，DNA奈米粒子係使用一或多種聚陽離子物包覆，其中該一或多種聚陽離子物包括經10kDA聚乙二醇(PEG)取代之半胱胺酸-離胺酸三聚體肽(CK30PEG10k)或三十聚體離胺酸縮合肽。在另一態樣中，包覆之DNA奈米粒子係進一步囊封於脂質體中，其中該脂質體係雙層內陷性囊泡(BIV)且經一或多個「聰明」受體靶向部分修飾。在另一態樣中，一或多個「聰明」受體靶向部分係小分子二價β小彎模擬物。在另一態樣中，脂質體係可逆式遮蔽脂質體。在另一態樣中，脂質體係雙層內陷性囊泡(BIV)。在另一態樣中，脂質體係可逆式遮蔽脂質體。在另一態樣中，一或多個「聰明」受體靶向部分係小分子二價β小彎模擬物。在另一態樣中，核酸插入物包括選自SEQ ID NO：1至22或53至56之序列。在另一態樣中，雙功能性shRNA包括靶向專一性K-ras突變之三重體插入物，該等插入物係選自SEQ ID NO.：2、18、20、21、或SEQ ID NO：2、18及20之組合、或SEQ ID NO：21、2及18之組合。
在一實施例中，本發明包含抑制K-ras基因在一或多種靶細胞中表現之方法，該方法包括以下步驟：選擇一或多種靶細胞；及用表現一或多種短髮夾RNA(shRNA)之載體轉染靶細胞，該一或多種短髮夾RNA(shRNA)能夠經由RNA干擾法抑制K-ras基因在一或多種靶細胞中之表現，其中該一或多種shRNA包括活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少K-ras表現量之雙功能性RNA分子。在另一態樣中，shRNA納入siRNA(裂解依賴型)及miRNA(非裂解依賴型)基序。在另一態樣中，雙功能性shRNA包括靶向專一性K-ras突變之三重體插入物，該等插入物係選自SEQ ID NO.：2、18、20、21、或SEQ ID NO：2、18及20之組合、或SEQ ID NO：21、2及18之組 合。
在一實施例中，本發明包含阻抑人類個體之腫瘤細胞生長之方法，該方法包括以下步驟：識別需要阻抑腫瘤細胞生長之人類個體；及向該人類個體投與足以阻抑腫瘤細胞生長之量之表現載體與治療劑載體複合物，其中該表現載體表現一或多種能夠經由RNA干擾法抑制係K-ras之靶基因在一或多種靶細胞中表現之shRNA；其中該一或多種shRNA包括活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少靶基因表現量之雙功能性RNA分子；其中該抑制導致該等腫瘤細胞之凋亡、增殖受阻或侵襲力降低。在另一態樣中，治療劑載體包括雙層內陷性囊泡(BIV)。在另一態樣中，治療劑載體包括一或多個「聰明」受體靶向部分，該一或多個「聰明」受體靶向部分係小分子二價β小彎模擬物。在另一態樣中，投與步驟係選自由以下組成之群：皮下、靜脈內、腹膜內、肌內及靜脈內注射。在另一態樣中，投與步驟包括腫瘤內注射。在另一態樣中，投與步驟包括注射DNA：脂複合物(lipoplex)。在另一態樣中，腫瘤細胞生長表現K-ras。在另一態樣中，腫瘤細胞生長係人類胰管腺癌。在另一態樣中，腫瘤細胞生長係選自由以下組成之群：肺癌、結腸癌、黑色素瘤、胰島素瘤、間皮瘤、卵巢癌及胰臟癌。在另一態樣中，腫瘤細胞生長係胰臟癌。在另一態樣中，bishRNA係選自SEQ ID NO：1至22或53至56。在另一態樣中，雙功能性shRNA包括靶向專一性K-ras突變之三重體插入物，該等插入物係選自SEQ ID NO.：2、18、20、21、或SEQ ID NO：2、18及20之組合、或SEQ ID NO：21、2及18之組合。在另一態樣中，該方法可進一步包括與另一抗腫瘤劑之組合療法。在另一態樣中，該方法可進一步包括與西妥昔單抗或威羅菲尼之組合療法。
本發明之另一實施例包含包括以下之表現載體：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、 50、75或100個能夠減少突變K-ras基因表現之雙功能性shRNA插入物；其中該雙功能性RNA分子之至少一個靶位點序列係位於K-ras基因內，其中該雙功能性RNA分子能夠活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少K-ras之表現量。在一態樣中，雙功能性shRNA係選自SEQ ID NO：1至22或53至56。在另一態樣中，雙功能性shRNA包括靶向專一性K-ras突變之三重體插入物，該等插入物係選自以下中之至少一者：G12D-G12V-G12R、G12C-G12D-G12R、G12D-G12V-G12R或G12C-G12D-G12R。在另一態樣中，雙功能性shRNA包括靶向專一性K-ras突變之三重體插入物，該等插入物係選自SEQ ID NO.：2、18、20、21、或SEQ ID NO：2、18及20之組合、或SEQ ID NO：21、2及18之組合。
本發明之另一實施例包含包括表現載體之細胞，該表現載體包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75或100個能夠減少突變K-ras基因表現之雙功能性shRNA插入物；其中該雙功能性RNA分子之至少一個靶位點序列係位於K-ras基因內，其中該雙功能性RNA分子能夠活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少K-ras之表現量。在一態樣中，雙功能性shRNA係選自SEQ ID NO：1至22或53至56。在另一態樣中，雙功能性shRNA增加非突變K-ras之表現。在另一態樣中，雙功能性shRNA包括靶向專一性K-ras突變之三重體插入物，該等插入物係選自SEQ ID NO.：2、18、20、21、或SEQ ID NO：2、18及20之組合、或SEQ ID NO：21、2及18之組合。
本發明之另一實施例包含評估據信可用於治療包括至少一個突變K-ras之細胞或組織之候選藥物的方法，該方法包括：(a)量測野生型K-ras及一或多個突變K-ras基因中之至少一者在細胞或組織中之表現量；(b)向細胞或組織之第一亞群投與候選藥物，且向細胞或組織 之第二亞群投與安慰劑；(c)在投與候選藥物或安慰劑後重複步驟(a)；及(d)測定候選藥物是否減少突變K-ras之表現(與野生型K-ras相比)，該減少與在細胞或組織之第二亞群中發生之任何減少相比在統計上顯著，其中該統計上顯著之減少表明候選藥物可用於治療K-ras誘導之疾病。在一態樣中，細胞或組織進一步表現一或多個已經改質包括野生型K-ras及一或多個突變K-ras之可檢測基因，其中可檢測標記之表現量與候選物質對野生型K-ras及一或多個突變K-ras之效應相關。在另一態樣中，細胞或組織已經改質以表現能夠減少K-ras基因表現之雙功能性shRNA，其中該雙功能性RNA分子之至少一個靶位點序列係位於K-ras基因內且其中該雙功能性RNA分子能夠活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少K-ras之表現量。
本發明之另一實施例包含評估據信可用於治療包括至少一個經有效沉默之突變K-ras之細胞或組織之候選藥物的方法，該方法包括：(a)量測以下中之一或多者：a.至少一個野生型K-ras及一或多個突變K-ras基因在細胞或組織中之表現量；b.候選基因或候選基因組在細胞環境中之表現量，在該細胞環境中癌細胞或組織中之一或多個突變K-ras基因之表現減少；c.候選藥物對該等細胞之表型之效應，包括癌細胞或組織中之一或多個突變K-ras基因之表現減少；(b)向該等細胞或組織之第一亞群投與候選藥物，且向該等細胞或組織之第二亞群投與安慰劑；(c)在投與候選藥物或安慰劑後重複步驟(a)；及(d)測定候選藥物是否可在細胞環境中有效產生所測定之表型，使其突變K-ras之表現比在表現K-ras突變體之細胞環境中減少，該減少係與第二亞群細胞或組織中發生之任何減少相比具統計上顯著性，其中統計上顯著減少表示該候選藥物可用於治療無顯著K-ras突變背景之疾病。在一態樣中，細胞或組織進一步表現一或多個已經改質包括野生型K-ras及一或多個突變K-ras之可檢測基因，其中可檢測標記之 表現量與候選物質對野生型K-ras及一或多個突變K-ras之效應相關。在另一態樣中，細胞或組織已經改質以表現能夠減少K-ras基因表現之雙功能性shRNA，其中該雙功能性RNA分子之至少一個靶位點序列係位於K-ras基因內且其中該雙功能性RNA分子能夠活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少K-ras之表現量。在另一態樣中，細胞或組織已經改質以表現包括一或多種靶向專一性K-ras突變之插入物之雙功能性shRNA，該等插入物係選自SEQ ID NO.：2、18、20、21、或SEQ ID NO：2、18及20之組合、或SEQ ID NO：21、2及18之組合。
為更全面理解本發明之性質及優點，現參考本發明之詳細說明以及附圖，且其中：圖1顯示測試載體之一示意圖。將野生型KRAS之最初17個胺基酸插入psiCHECK2載體之海腎螢光素酶基因(hRluc)的胺基末端，同時將G12D、G12V、G12R或G12C KRAS突變體之最初17個胺基酸插入同一載體上之螢火蟲螢光素酶基因(hluc+)的胺基末端。
圖2顯示測試載體之野生型及突變體表現之效應。使用雙重Glo螢光素酶分析系統(Promega)比較每一測試載體與psiCHECK2母載體之野生型(Wt)及突變體(Mu)表現。藉由海腎(RL)對螢火蟲(FF)之表現比率來評價Wt對Mu表現比較。
圖3A至圖3C展示本發明之分析系統。藉由共轉染測試載體與雙功能性shRNA(bi-shRNA)表現載體(86、87、88、89、90、91或92，分別為SEQ ID NO.：1至7)，突變體比野生型之優先減弱(圖3A)可藉由FF對RL比率(嵌圖a)來快速評價。突變體或野生型之減弱可進一步藉由比較FF(圖3B)或RL(圖3C)與空載體對照(C)之RLU來個別分析。
圖4顯示各種突變體之位置效應。藉由將單突變核苷酸序列置於 引導股最初11個位置中之一者處來比較對G12D突變體具專一性之Bi-shRNA構築物。評價每一構築物對野生型(wt)及突變體(mu)之減弱百分比。(n=3)。
圖5顯示當引入某些錯配時減弱效率降低之比較。比較在中心區(p9、p10及p11)處具有突變核苷酸之G12D構築物與在種子區或與突變核苷酸並置處具有其他錯配之構築物：野生型(wt)與突變體(mu)。(n=3)。
圖6顯示針對G12D、G12V、G12R及G12C之3位或4位構築物之選擇性減弱。比較針對G12D、G12V、G12R及G12C之所有3位或4位bi-shRNAi構築物相對於所有對四種突變體中之每一者具專一性之測試載體之突變體減弱之優點。突變體對野生型比率大於空載體對照樣品(樣品C，橫線條)表明對專一性突變體等位基因之強減弱優點。
圖7A至圖7C顯示KRAS在經bi-shRNA轉染之細胞中之表現的西方免疫墨點分析(Western immunoblot analysis)。用多種突變體靶向bi-shRNA構築物轉染HEK-293(WT)、PANC-1(G12D等位基因)及MiaPaCa(G12C等位基因)。用西方免疫墨點對轉染後48hr收穫之細胞提取物進行半定量分析。(圖7A)經G12D靶向構築物轉染之PANC-1細胞。(圖7B)比較G12D構築物對3種細胞系之KRAS減弱。(圖7C)比較G12C構築物對3種細胞系之KRAS減弱。
圖8係顯示具有6個串聯miRNA之miR-17-92簇之圖。
圖9顯示三重構築物經報告測試載體測試以與其單重對應部分比較減弱效率之結果。
圖10顯示用於製造包括一或多種本發明之雙功能性shRNA之細胞的方案。
圖11顯示使用具有miR-17-92間隙序列之三重構築物(pGBI-129及pGBI-130)僅可輕微減弱突變體(4帶及5帶)，而使用具有miR-17-92骨 架序列之三重構築物(pGBI-131及pGBI-132)可極有效地減弱突變體(6帶及7帶)之結果。
在下文詳細論述本發明之多個實施例之製造及應用的同時，應瞭解本發明可提供許多可在眾多種特定背景下體現之適用發明概念。本文所論述之特定實施例僅係製造及使用本發明之特定方式的例示性說明且並不限制本發明之範疇。
為便於理解本發明，下文將定義大量術語。本文所定義之術語具有熟習本發明相關領域之技術者通常理解之含義。諸如「一(a、an)」及「該」等術語並非僅欲指單數實體，且包含可使用特定實例說明之一般類別。本文術語用於闡述本發明之特定實施例，但除如申請專利範圍所概述之外，其用法並不限制本發明。
在所有人類癌症中通常觀察到ras原致癌基因家族中之活化突變使其具有組成型活性。具體而言，在大於90%之胰臟癌中觀察到KRas活化突變。小分子難以專一性靶向Kras突變，因此在不影響wt Kras表現下減弱Kras突變係治療癌症之可行方式。所有基於RNAi之Kras突變減弱靶向一專一性突變或同時減弱wt表現。本發明揭示能夠減弱胰臟癌中之大於90%之經識別Kras突變而不顯著減少wt Kras表現之新穎設計及構築物。
RNAi係Fire及Mello在1998年獲得諾貝爾獎的發現，其已催生大量研究及出版物從而促進對基因功能之理解且刺激眾多I期及II期臨床試驗。此天然存在之藉助小RNA(包含內源性微RNA(miRNA))之基因沉默機制在很大程度上依賴於基因序列；因此該機制在理論上可用於以強專一性抑制任何靶基因的表現。RNAi並不受限於小分子研發所固有之藥理學約束，此使得有機會接近傳統上「無藥可及」之靶以供疾病治療。
此機制之核心作用者係RNA誘導之沉默複合物(RISC)。該過程起始於納入預RISC中之雙股小RNA(由過客股及引導股組成)，然後裂解依賴型或非裂解依賴型釋放過客股以形成含有引導股之RISC。引導股(mRNA之反義股)引導RISC經由序列互補(全部或擴展部分)來識別靶mRNA。RISC之關鍵組份係阿耳戈英雄蛋白(Argonaute protein，Ago)家族，在哺乳動物系統中Ago 1、2、3及4，其中僅Ago 2具有內切酶活性以裂解靶mRNA使其進一步降解(裂解依賴型途徑)；所有含有Ago之RISC可經由非裂解依賴型效應子途徑起作用從而引起翻譯阻遏及處理小體(p-body)中之mRNA隔離以及隨後降解。裂解依賴型效應子過程需要引導股與過客股及靶mRNA二者之間之廣泛的同源性(尤其在中心區中)；另一方面，非裂解依賴型效應子過程僅需要引導股與過客股及靶mRNA二者之間之部分同源性。
本發明利用RISC複合物處之裂解依賴型及非裂解依賴型裝載，而非RISC複合物下游之事件。因此，如本文所使用，片語「裂解依賴型及非裂解依賴型」係指專一性靶向RISC以及RISC複合物處之裂解依賴型及非裂解依賴型活性(即裝載)之RNA設計。在本文及針對此情形之母申請案中已發現，該等「雙功能性shRNA」具有高於靶向RISC複合物之每一個別部分之總和的抑制活性。因此，本發明之抑制活性較高。
RNA干擾可藉由合成雙股小干擾RNA(siRNA)或藉由載體驅動之短髮夾RNA(shRNA)來引發。已證實siRNA及載體驅動之shRNA二者在活體外及活體內應用中皆有效，各自具有其各別優點。大多數siRNA在結構上經設計以促進有效納入含有Ago2之RISC中，含有RNA酶III之Dicer-受質設計藉由在預RISC處初始結合及處理將siRNA之效率改良至少10倍。載體驅動之shRNA利用宿主微RNA生源途徑，此似乎更有效。siRNA更易於經化學改質同時shRNA表現可藉由專一 性啟動子來調節並調控。
本發明者研發出新穎載體驅動之shRNA技術，即雙功能性shRNA(bi-shRNA)，以藉由控制一預程式化分子中之RISC裝載之裂解依賴型及非裂解依賴型途徑二者進一步改良RNAi之效率。載體驅動之bi-shRNA包含兩個針對每一mRNA靶序列之莖環結構，一個莖環shRNA在莖處具有完全互補性且另一莖環shRNA在莖之過客股上含有錯配(因而不同於先前技術之在引導股上包含錯配之錯配RNA)。重要的是，在納入RISC中之後，源自兩個結構中之每一者之引導股與mRNA靶序列完全互補但與含有不同Ago之RISC結合。當與siRNA或習用shRNA比較時，bi-shRNA設計使基因沉默之開始更快速、功效更高且耐久性更強。將使用靶專一性bi-shRNA之當前個別化癌症療法轉換成使用經改質雙層內陷性脂質體遞送媒劑之臨床I期研究。下文提供涉及bi-shRNA之設計、構築物及實施之關鍵分子方法。
端視此目標及實施例，可使用若干不同載體、啟動子或質體骨架及遞送系統。已發現選擇具有高效轉基因表現之表現載體有用。本發明者意識到，具有強啟動子(例如含有IE 5’UTR及部分內含子A之擴展CMV啟動子)之表現載體(pUMVC3)比彼等選殖位點直接毗鄰CMV啟動子者更有效。在某些實施例中，在莖環結構之前具有一段前導轉錄本有益。此外，若計劃使用一種以上之載體，則應事先制定出有效穿梭策略；藉由PCR擴增改質表現盒並不如此有效。啟動子之選擇亦至關重要；RNA聚合酶III啟動子之表現較強，但在核輸出及RISC裝載步驟二者時使內源性miRNA成熟過程競爭性飽和，從而在使用某些遞送媒劑時在活體外及活體內產生致死毒性。儘管RNA聚合酶II啟動子之表現較不強，但其作用有效且對內源性miRNA途徑之面對面(vis-à-vis)競爭毒性小得多。
在某些實施例中，尤其在使用多個動物模型系統時，設計可在 一種以上之物種中起作用之序列。對於大多數靶基因，可發現在物種之間保守之靶核苷酸段。為尋找保守且對減弱最佳之序列，必須比較同源性匹配之序列與所選靶位點序列。
使用不同演算法之公共可訪問電腦程式(例如Dharmacon RNAi設計中心(www.dharmacon.com)及IDT(www.idtdna.com))可容易地獲得且可用於定位靶基因內之適宜靶位點。用大多數電腦程式進行之搜索通常將產生初步第一組靶以供進一步分析。一些可獲得出版物提供宜(do)及不宜(do-not)建議。對每一靶序列進行BLAST搜索以分析與感興趣物種內之其他mRNA之潛在殘餘同源性。
在選擇了靶位點序列之後，即可開始bi-shRNA設計過程；該設計過程呈現於下文中。本發明者所使用之bi-shRNA莖環結構採用經充分分析的miR-30a骨架，但可使用任何功能性miRNA骨架。bi-shRNA係由miR-30a骨架上之兩個莖環結構組成，該兩個莖環結構彼此直接毗鄰定位且具有約10個核苷酸長之間隙。可使用較長之核苷酸間隙，且可設計多個bi-shRNA單元以在靶向多個位點處之單基因或同時靶向多個不同基因之單轉錄本中串在一起。
為構築置於表現載體之多個選殖位點中之表現單元，已研發出使用依序連接在一起之合成寡核苷酸之組裝策略。另一選擇為，亦可將具有指定序列之基因構築物之合成外包給生物技術服務公司。對於寡核苷酸組裝過程，設計且合成重疊DNA片段。由於在兩個莖環結構中存在豐餘序列，因此必須最先連接5’片段及3’片段。然後可在凝膠上純化5’片段及3’片段且進一步連接至中間連接片段。此組裝過程有效，且經小心設計許多片段可重複用於不同雙功能性構築物。
對於每一靶，最佳設計及構築至少三個雙功能性構築物以進行比較且自其選擇減弱效率較高之構築物以供進一步評估。可在活體外在組織培養細胞中比較減弱效率。本發明者意識到，通常難以比較具 有內源性表現基因者之減弱效率，此乃因活體外轉染方法具有廣泛不同的效率；此在轉染效率較低時尤其如此，此乃因來自未經轉染細胞之背景雜訊導致難以對減弱進行評價。
藉助bi-shRNA之靶基因減弱之功效及效率可使用眾多活體外及活體內系統來測試，此端視靶及計劃應用而定。此活體外評價可在bi-shRNA表現質體在多種培養細胞中轉染後實施。本發明者發現，當使用對照載體或通用隨機序列小心控制質體DNA之量時，藉由電穿孔及脂質體(例如脂染胺(Lipofectamine)2000)二者之轉染高度有效。對於脂染胺(Lipofectamine)或相關試劑，本發明者發現逆轉染方法通常比正轉染方法毒性低。靶基因減弱可藉由靶基因mRNA之qRT-PCR或藉由靶基因蛋白之西方法(Western)及/或ELISA來評價。在一分析方法中，藉由莖環RT-PCR檢測成熟shRNA之表現，在另一分析方法中，藉由5’RNA配體介導之RACE(5’RLM-RACE)來檢測靶mRNA裂解。莖環RT-PCR係依賴於所使用之專一性探針引物之靈敏方法；此外，可專一性檢測且量化過客股及引導股二者。對於bi-shRNA，該方法可對完全互補以及錯配(部分互補)之過客股二者差異評分。5’RLM-RACE方法需要將RNA寡聚物連接至裂解mRNA末端上，因此致使該方法較不有效。儘管通常需要多輪擴增，但套式引物設計對確保專一性至關重要。
bi-shRNA之可評估功能取決於將質體有效遞送至靶細胞中。本發明者意識到，一些活體外轉染系統通常無法轉化用於固有地更複雜之活體內動物模型。眾多遞送系統經特定設計以供活體內之全身性應用。本發明者將融合陽離子DOTAP：膽固醇雙層內陷性囊泡脂複合物(BIV)用於活體內研究且已將其成功轉化用於臨床。研發出用於更集中生物分佈、靶向遞送及細胞內攝取增強之改質策略。有效脂複合物應使用不含任何來自宿主大腸桿菌(E.coli)之污染物之質體。儘管通 常使用不含內切酶之質體純化套組產生之質體，但GLP或GMP產生之質體更有效。遺憾的是，莢膜異多糖酸(colanic acid)及其他非內毒素相關多糖藉由陰離子交換層析及氯化銫密度梯度離心與DNA共純化。因此，移除內毒素並未移除該等污染物，且HPLC無法檢測該等污染物。為校正此現象，研發出SupercleanTM程序以產生清洗掉該等污染物之超高品質之質體DNA以供活體內及臨床應用。脂質體製備涉及高度專業化設備；在GMP設施中本發明者以常規方式產生DOTAP：膽固醇BIV。預製造脂質體可自合作者獲得或自供應商購得。製備具有高品質脂質體及質體DNA之脂複合物之製程闡述於下文中。脂複合物調配物可在大多數實驗室設置中達成。一旦製得脂複合物，即可經由緩慢尾靜脈注射或使用導管將調配物全身性遞送至實驗動物。可分別使用針對質體DNA之PCR方法及針對成熟bi-shRNA之莖環RT-PCR分析靶位點載體表現。可使用針對靶mRNA裂解之5’RLM-RACE及針對靶蛋白減弱之西方墨點(Western blot)或IHC來分析bi-shRNA功能。該等分析可在治療後約48小時時實施。對於功效，通常需要重複遞送至實驗動物中；給藥方案需要經實驗測定且優化。
本發明提供，靶基因專一性shRNA可經設計以進入裂解依賴型RISC及非裂解依賴型RISC途徑且與其相互作用。如本文所使用，術語「雙功能性shRNA」通常意指一或多種各自包含駐留在單獨莖環結構之莖部分內之雙股序列的RNA分子，其中第一RNA分子係經設計呈現於裂解依賴型RISC途徑且第二RNA分子係經設計呈現於非裂解依賴型RISC途徑。在某些實施例中，bi-shRNA皆在單股上。
更特定而言，第一引導股序列與由靶基因編碼之mRNA轉錄本之至少一部分互補，較佳100%互補。本發明提供，此引導股(最先結合至過客股以形成雙股莖)包括能夠結合至靶基因之mRNA轉錄本且呈現於裂解依賴型RISC途徑之核酸序列。本發明提供，該引導股序列 與mRNA轉錄本之結合且於裂解依賴型RISC途徑之呈現使mRNA轉錄本降解。
在具體實施例中，提供至少與由靶基因編碼之mRNA轉錄本之至少一部分部分互補之第二引導股序列。更具體而言，該第二引導股序列可含有與由靶基因編碼之mRNA轉錄本互補，較佳100%互補之第一部分，而引導股序列之第二部分含有某些與靶基因mRNA轉錄本之相應序列錯配之鹼基。
如本文所使用，「錯配」鹼基對係指核酸序列內之兩個含氮鹼基彼此結合(或雜交)時不遵循鹼基配對之查加夫法則(Chargaffs rule)。查加夫法則提供，第一核酸序列內之嘌呤腺嘌呤(A)將與第二核酸序列內之嘧啶胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶核苷(U))配對。此外，查加夫法則提供，第一核酸序列內之嘌呤鳥嘌呤(G)將與第二核酸序列內之嘧啶胞嘧啶(C)配對。因此，將認為不遵循且不符合該等法則之兩條股(核酸序列)之間之鹼基配對視為「錯配」鹼基對，例如G與U、A與G、A與C、G與T、G與U等之間之配對。其中所顯示之相對於過客股含有一或多個「錯配」鹼基對之莖環結構之雙股序列內的引導股在雙股莖序列中產生凸起。
如本文所使用，術語「核酸」或「核酸分子」係指聚核苷酸(例如去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))、寡核苷酸、藉由聚合酶鏈式反應(PCR)產生之片段及藉由連接、剪切、內切酶作用及外切酶作用中之任一者產生之片段。核酸分子可由單體組成，該等單體為天然核苷酸(例如DNA及RNA)或天然核苷酸之類似物(例如天然核苷酸之α-鏡像異構形式)或二者之組合。經改質核苷酸之糖部分及/或嘧啶或嘌呤鹼基部分可具有變化形式。糖改質包含(例如)用鹵素、烷基、胺及疊氮基置換一或多個羥基，或可將糖官能化為醚或酯。此外，整個糖部分可經空間結構上及電子結構上相似之部份(例如氮雜-糖及碳環糖 類似物)置換。鹼基部分之改質法實例包含烷基化嘌呤及嘧啶、醯化嘌呤或嘧啶或其他熟知雜環取代基。核酸單體可藉由磷酸二酯鍵或該等鍵之類似物連接。磷酸二酯鍵之類似物包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯、胺基磷酸酯及諸如此類。術語「核酸分子」亦包含所謂「肽核酸」，其包括附接至聚醯胺骨架之天然存在或經改質之核酸鹼基。核酸可呈單股或雙股。
如本文在說明書及申請專利範圍中所使用之術語「表現載體」包含編碼在宿主細胞中表現之基因之核酸分子。通常，表現載體包括轉錄啟動子、基因及轉錄終止子。通常將基因表現置於啟動子之控制下，且稱該基因「可操作地連接至」該啟動子。類似地，若調控元件調節核心啟動子之活性，則調控元件與核心啟動子可操作地連接。術語「啟動子」係指當與宿主酵母菌細胞中之結構基因結合時，在適當生長條件下與不存在啟動子序列時之轉錄、翻譯或mRNA穩定性相比，促進該結構基因之1)轉錄、2)翻譯或3)mRNA穩定性(mRNA之半衰期較長)中之一或多者之任一DNA序列。
如本文所使用之術語「致癌基因」係指允許惡性贅瘤細胞形成及存活之基因(Bradshaw,T.K.：Mutagenesis 1,91-97(1986))。
如本文所使用，術語「受體」表示與稱為「配體」之生物活性分子結合之細胞相關蛋白。此相互作用介導配體對細胞之效應。受體可係膜結合受體、細胞溶質受體或核受體；單體受體(例如甲狀腺促素受體、β-腎上腺髓素受體)或多聚體受體(例如PDGF受體、生長激素受體、IL-3受體、GM-CSF受體、G-CSF受體、紅血球生成素受體及IL-6受體)。膜結合受體之特徵在於多結構域結構，包括細胞外配體結合結構域及通常參與信號轉導之細胞內效應子結構域。在某些膜結合受體中，細胞外配體結合結構域及細胞內效應子結構域係位於包括 完整功能性受體之單獨多肽中。
術語「雜交」係指任何使核酸股與互補股經由鹼基配對結合之過程。
術語「轉染」係指將外源DNA引入真核細胞中。轉染可藉由多種業內已知之方式完成，包含(例如)磷酸鈣-DNA共沈澱、DEAE-葡聚糖介導之轉染、聚凝胺(polybrene)介導之轉染、電穿孔、顯微注射、脂質體融合、脂質轉染、原生質融合、逆轉錄病毒感染及生物彈道學。
如本文所使用，術語「雙功能」係指具有兩條作用機制途徑之shRNA，該兩條作用機制途徑為siRNA途徑及miRNA途徑。術語「傳統」shRNA係指藉由siRNA作用機制起作用之DNA轉錄源性RNA。術語「雙重」shRNA係指兩個各自針對兩個不同基因之表現但以「傳統」siRNA模式起作用之shRNA。
如本文所使用，術語「脂質體」係指由圍繞內部水性空間之脂質雙層組成之閉合結構。如本文所使用之術語「聚陽離子物」表示在同一分子中具有多個陽離子部分(例如四級銨基團)之材料，且包含其游離鹼以及其醫藥上可接受之鹽。
因此，雙功能性shRNA可包括經設計進入裂解依賴型RISC及非裂解依賴型RISC二者且與其相互作用之shRNA。與其他當前可獲得之RNAi方法及組合物(包含siRNA及習用shRNA(即經設計進入裂解依賴型RISC或非裂解依賴型RISC但不同時進入二者之shRNA構築物))相比，使用該等雙功能性shRNA可達成更高基因「減弱」量。
如本文所使用，基因「減弱」係指表現之有效定量及耐久抑制。該基因「減弱」可表現或顯現為靶基因mRNA翻譯之阻抑、增加之靶細胞凋亡及/或細胞殺死。
如本文所使用，「靶基因」係指細胞中之核酸序列，其中該序列 之表現可使用雙功能性shRNA來專一且有效地調節。在某些實施例中，靶基因可能與個體癌症之生長(增殖)、維持(存活)及/或遷移(轉移)行為相關。然而，本發明提供，靶基因可能與任何其他疾病或醫學病況相關，且並不限於與癌症相關之基因。例如，靶基因可代表任何研究者或臨床醫師希望沉默(即減少該靶基因之表現量)之序列。
載體序列可包括直接或間接可操作地連接(或連結)至編碼雙功能性shRNA之序列之啟動子。該等啟動子可基於宿主細胞及所尋求之效應來選擇。適宜啟動子之非限制性實例包含組成型啟動子及誘導型啟動子，例如基於誘導型RNA聚合酶II(pol II)之啟動子。適宜啟動子之非限制性實例進一步包含四環素誘導型或阻遏型啟動子、基於RNA聚合酶I或III之啟動子、pol II依賴型病毒啟動子(例如CMV-IE啟動子)及pol III U6及H1啟動子。亦可使用T7噬菌體啟動子(在該情形下，應瞭解亦必須存在T7聚合酶)。本發明並不限於使用任何單啟動子，原因尤其在於本發明可包括兩種或更多種雙功能性shRNA(即效應子之組合)，包含(但不限於)所納入之shRNA單體。每一納入之啟動子可控制shRNA單重組份中之一者或其任何組合。
在某些實施例中，啟動子可優先在靶細胞中有活性，例如可期望使用腫瘤細胞專一性啟動子優先在腫瘤細胞中表現雙功能性shRNA分子。可在兩種或更多種含於雙功能性shRNA前體轉錄本內之RNA分子最初駐留於單一初級轉錄本內之條件下將該等構築物引入宿主細胞中，以使得單獨RNA分子(各自包括其自身莖環結構)隨後藉由內源性核糖核酸酶自該前體轉錄本切除。本發明進一步提供，在策略上可將剪接供體及受體序列置於初級轉錄本序列內以促進剪接體介導之核處理。然後所得成熟shRNA可誘導在細胞中產生之靶基因mRNA轉錄本之降解及/或翻譯阻遏。另一選擇為，每一前體莖環結構可作為單獨轉錄本之一部分產生，在該情形下每一shRNA編碼之序列較佳將包含 其自身啟動子及轉錄終止子序列。此外，雙功能性shRNA前體轉錄本可駐留於單一初級轉錄本內，該單一初級轉錄本視情況進一步包括一或多種編碼一或多種功能性哺乳動物蛋白質之mRNA序列。例如，該一或多種mRNA序列可編碼某些已知支持患者免疫系統之蛋白質，或以其他方式提供一些將與雙功能性shRNA平行操作之預防及/或治療效應。
本文所闡述shRNA分子之莖環結構可係約40至100個核苷酸長或較佳約50至75個核苷酸長。莖區可係約19-45個核苷酸長(或更長)或更佳約20-30個核苷酸長。該莖可包括完全互補之雙倍體(除任何3'尾之外)，然而可存在凸起或內部環且甚至較佳存在於該莖之任一臂上。該等凸起及不對稱內部環之數目在數量上較佳較小(例如1、2或3個)且大小為約3個核苷酸或更少。末端環部分可包括約4個或更多個核苷酸，但較佳不大於約25個。更具體而言，環部分之大小較佳將為6-15個核苷酸。
如本文所闡述，雙功能性shRNA之莖區包括過客股及引導股，其中引導股含有與由靶基因編碼之靶mRNA轉錄本互補之序列。較佳地，針對利用或不利用內切酶裂解之熱力學上有利的解股活動小心地設計引導股及過客股之G-C含量以及其匹配。此外，較佳經由BLAST搜索(www.ncbi.nim.nih.qov/BLAST)來確認引導股之專一性。
可使用本文所闡述之方法及雙功能性shRNA來調節多個靶基因之表現量。例如，本發明提供，第一組雙功能性shRNA可經設計以包含經設計減少第一靶基因表現量之序列(引導股)，而第二組雙功能性shRNA可經設計以包含經設計減少第二靶基因表現量之序列(引導股)。不同組之雙功能性shRNA可經表現且駐留於相同或單獨初步轉錄本內。在某些實施例中，該多重方式(即使用本文所闡述之雙功能性shRNA來調節兩種或更多種靶基因之表現量)可對患者具有增強的 治療效應。例如，若向患者提供本文所闡述之雙功能性shRNA來治療、預防或改善癌症之效應，則可需要向患者提供兩種或更多種類型之雙功能性shRNA，該等雙功能性shRNA係經設計以減少與患者癌症相關之多個基因之表現量。
在某些實施例中，本發明進一步提供，雙功能性shRNA序列可包括天然存在之miRNA(例如miR-30、秀麗隱桿線蟲(C.elegans)let-7及/或lin-4)之莖序列。儘管可期望(例如)存在miR-30環，但本發明提供可耐受該結構之變化形式，其中可使用與(例如)miR-30序列具有以下一致性之環：大於72%，較佳大於79%，更佳大於86%，且最佳大於93%(使用熟知電腦程式(例如BESTFIT程式(Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix第8版，Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,Wis.53711)測定)。
可使用多種業內熟知技術及遞送媒劑中之任一者將編碼雙功能性shRNA之前體序列(或構築物)引入宿主細胞中。例如，可用包括一或多種構築物之病毒載體實施感染，其中該等病毒載體較佳包含複製缺陷型逆病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關載體、慢病毒載體或麻疹載體。此外，可採用經包括一或多種構築物之質體之轉染。該等質體可以裸DNA存在，或可與(例如)脂質體(例如免疫脂質體)結合存在。此外，遞送媒劑可係由以下組成：免疫脂複合物、靶向奈米粒子、靶向脂質體、環糊精、奈米粒子、適配體、樹枝狀聚合物、聚葡萄胺糖或其聚乙二醇化衍生物。遞送媒劑之性質可端視靶宿主細胞變化。
可端視靶組織使用多種技術中之任一者實施編碼雙功能性shRNA之構築物之活體內遞送。遞送可藉由(例如)以下來達成：直接注射、吸入、靜脈內注射或其他物理方法(包含經由微彈靶向可見及可觸及組織區域(例如用裸DNA))。若適宜，投與可進一步經由注射器針 頭、套針、套管、導管等來達成。
除使用本文所闡述之雙功能性shRNA之方法外，提供shRNA本身。因此，其他態樣包含核酸序列，該等核酸序列可包括單一連續序列或多個個別或共同編碼兩種或更多種RNA分子之不同序列。根據該等實施例，第一RNA分子將包括包含引導股序列之雙股序列，該引導股序列與由靶基因編碼之mRNA轉錄本之一部分互補；而第二RNA分子包括包含第二引導股序列之第二雙股序列，該第二引導股序列與該mRNA轉錄本之一部分部分互補。第二RNA分子之第二引導股序列較佳包括一或多個與由靶基因編碼之mRNA轉錄本之核酸序列錯配的鹼基。根據其他態樣，提供如本文所闡述包括核酸序列且可用於實施該等方法並表現雙功能性shRNA之表現載體。
此外，本文闡述使用核酸序列及雙功能性shRNA來預防、治療及/或改善一或多種醫學病況(包含但不限於多種類型之癌症)之效應之方法。例如，本發明提供，可使用本文所闡述之雙功能性shRNA來減少一或多種與癌細胞生長、存活及/或轉移相關之靶基因之表現量。例如，如以下實例中所展示，雙功能性shRNA可用於減少某些編碼支架蛋白之靶基因之表現量，已發現該等靶基因在癌細胞中過表現。該等靶基因之非限制性實例包含K-ras。
RNA干擾：將人工雙股小干擾RNA(siRNA)引入動物及植物細胞中可誘導具有互補序列之靶mRNA分子降解；該過程稱為RNA干擾(RNAi)(Sharp 2001；Hutvagner及Zamore 2002；Zamore 2002)(參見美國專利第6,506,559號)。RNAi已作為具有強大治療應用潛能之有用實驗工具出現(Fire、Xu等人1998；Hammond、Bernstein等人2000；Elbashir、Harborth等人2001；Senzer、Rao等人2009；Wang Z 2011)。然而，在哺乳動物細胞中，使用shRNA誘導RNAi需要轉染RNA寡核苷酸，此可因有效沉默之持續時間受限於媒劑解組裝時間及 siRNA生物半衰期而效率較低。儘管有該等限制，但在臨床I期研究之最近早期結果出版物中，Davis及其同事已令人信服地證實全身性遞送靶向核糖核苷酸還原酶之M2亞單元(RRM2)之聚乙二醇化、經轉鐵蛋白修飾、基於環糊精之siRNA(CALAA-01)之靶專一性沉默及位點專一性裂解(Davis、Zuckerman等人2010)。使依照劑量遞增I期研究治療之三名生檢可觸及黑色素瘤報告患者在21天週期之第1、3、8及10天藉由靜脈內輸注接受18、24或30mg/m2 CALAA-01。在每名患者中在第1週期之最後給藥後實施自願生檢且與存檔腫瘤進行比較，且在經30mg/m2治療之患者中在第1週期後1個月時(在第2週期開始之前)及在第2週期之最後給藥當天亦如此。藉由qRT-PCR比較在30mg/m2下第2週期之後及之前之組織樣品來確認RRM2 mRNA減少。在同一患者中，第1週期之前及之後之免疫組織化學及西方墨點顯示MMR2蛋白減少至1/5。在支持所提出之作用機制下，5’-RLM-RACE(5’-RNA連接酶介導之互補DNA末端之快速擴增)確認預測之裂解位點。此全身性遞送後之靶向腫瘤細胞進入(使用透射電子顯微鏡)及mRNA及蛋白質表現減少以及所預測之位點專一性siRNA裂解首先在人類中之證實促進RNAi之轉化應用。
siRNA需要化學改質以增加血清穩定性、細胞攝取及作用持續時間。另一選擇為，siRNA可構築為短髮夾RNA(shRNA)。shRNA係由在細胞中可自質體構築物上之RNA聚合酶III(或較不常使用之RNA聚合酶II)啟動子轉錄之莖環結構組成(Miyagishi及Taira 2002；Yu、DeRuiter等人2002)。來自不依賴於染色體之質體之shRNA的組成型表現提供優於合成siRNA之優點。可將shRNA表現單元納入多種質體及病毒載體中以供細胞內遞送及核導入。此外，亦可調控或誘導基於載體之shRNA表現(Gossen及Bujard 1992；Gupta、Schoer等人2004；Dickins、Hemann等人2005)。與合成的siRNA相反，shRNA係在細胞 核中合成，然後經處理且轉運至細胞質中以納入RNA誘導之沉默複合物(RISC)中進行活動(Cullen 2005)。為有效，shRNA必須經設計利用內源性細胞微RNA生源機制。
雙功能性shRNA：如上文所闡述，RNA干擾(RNAi)係能夠抑制轉錄機制、轉錄後機制及翻譯機制從而調節基因表現之天然細胞調控過程。使用miR30-支架，本發明者研發出「雙功能性」RNAi策略，該策略藉由同時誘導翻譯阻遏及[GW182介導之]處理小體(作為儲存器(holding reservoir)或促進去帽、去腺苷化及mRNA降解)中之隔離(非裂解依賴型)以及轉錄後mRNA mRNA裂解(裂解依賴型)來展示靶基因表現之更有效沉默(Rao D 2010)。
本發明者已研發出新穎雙功能性shRNA(bi-shRNA)RNA干擾(RNAi)技術。Bi-shRNAi容許含有程式化內切酶及非內切酶阿耳戈英雄蛋白(Ago)之RISC(RNA誘導之沉默複合物)裝載以同時實現mRNA裂解、降解及翻譯阻遏，從而產生與其他RNAi調介劑相比較高之效能及較長持續時間。為探究bi-shRNAi在KRAS突變體選擇性減弱中之潛能，建立活體外雙重螢光素酶報告分析系統以在相同分析環境中系統性比較突變體等位基因與野生型等位基因之減弱活性。本發明包含研發對G12D、G12V、G12R及G12C具專一性之治療劑以治療(例如)胰管腺癌(PDAC)。
在一系列靶向在引導股之每一位置處具有單核苷酸突變之G12D之bi-shRNA表現載體構築物中發現，突變體等位基因之最可辨別減弱活性係藉由將突變體核苷酸置於2-4位產生。藉由檢查引導股之其他位置處之其他錯配之減弱效應，確定該過程具有序列專一性。製造針對G12V、G12R及G12C突變之相似構築物且其可有效減弱其各別靶突變體等位基因。G12R專一性構築物與G12C突變體交叉反應。
使用HEK-293細胞(wt/wt)、PANC-1細胞(wt/G12D等位基因)及 MiaPaCa2細胞(wt/G12C等位基因)比較本發明構築物與對照載體之KRAS減弱。與KRAS在PANC-1細胞及MiaPaCa2細胞中之表現分別減少相比，G12D及G12C選擇性bi-shRNA表現載體並未減少KRAS在HEK-293中之表現。發現，例如將測試具有能夠減弱G12D、G12V、G12R及G12C之多聚bi-shRNA單元之單表現構築物之活體外及活體內有效性及專一性。
KRAS(Kirsten-ras)致癌基因在較大比例之胰管腺癌(PDAC)、結腸直腸癌及非小細胞肺癌(NSCLC)中突變(Downward J,Nat Rev Cancer.2003；3：11-22.)。在大多數(70-90%)攜帶KRAS突變之PDAC患者中，五年存活率小於5%(Saif MW等人World J Gastroenterol.2007；13；4423-4430)。KRAS係鳥嘌呤核苷酸結合蛋白家族之成員且係多種包含表皮生長因子受體(EGFR)之細胞內信號傳導途徑不可缺少的組份。絕大多數KRAS突變係在密碼子12或13處引起單胺基酸取代之單核苷酸體細胞突變。G12D、G12V、G12R及G12C KRAS突變佔在PADC患者中所發現KRAS突變之90%以上(COSMIC數據庫，www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/)。KRAS突變實質上產生組成型活性KRAS及失控的下游信號傳導(Schubbert S等人Nat Rev Cancer.2007；7：295-308)。此外，靶向劑(例如抗體西妥昔單抗，用於結腸直腸癌中)及小分子抑制劑威羅菲尼(用於BRAF突變性黑色素瘤中)在具有KRAS突變之患者中表現較差(Karapetis CS等人N Engl J Med 2008；259(17)：1757-1765)。因此，有效的癌症治療策略需要KRAS突變選擇性，從而保留野生型功能。本發明者最近已研發出新穎雙功能性shRNA RNA干擾(bi-shRNAi)技術。Bi-shRNAi容許含有程式化內切酶及非內切酶阿耳戈英雄蛋白(Ago)之RISC(RNA誘導之沉默複合物)裝載以同時實現mRNA裂解、降解及翻譯阻遏，從而產生與其他RNAi調介劑相比較高之效能及較長持續時間。為探究hi-shRNAi在KRAS突 變體選擇性減弱中之潛能，建立活體外雙重螢光素酶報告分析系統以在相同分析環境中系統性比較突變體等位基因與野生型等位基因之減弱活性。此項目之目標係研發專一性靶向G12D、G12V、G12R及G12C突變體等位基因之單治療劑以治療PDAC。
已系統性地分析因單核苷酸之等位基因專一性減弱而不同之基因間之siRNA差異(參考文獻1-4)。已在活體外用疾病(例如阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、亨丁頓舞蹈症(Huntington’s disease)及帕金森氏病(Parkinson’s disease))之模型系統展示突變體等位基因專一性減弱(參考文獻10-13)。已報導針對單一G12C、G12D或G12V KRAS突變之對KRAS突變之等位基因專一性基因沉默(參考文獻5-9)。尚未報導用單一試劑達成多個KRAS突變體減弱之嘗試。本發明包含發現用於PDAC之四種關鍵KRAS突變體之最有效bi-shRNAi減弱組合之系統性方式。
(SEQ ID NO：1)G12D，2位。加下劃線處為miR-30a骨架序列。
(SEQ ID NO：2)G12D，3位。加下劃線處為miR-30a骨架序列。
(SEQ ID NO：3)G12D，4位。加下劃線處為miR-30a骨架序列。
(SEQ ID NO：4)G12D，5位。加下劃線處為miR-30a骨架序列。
(SEQ ID NO：5)G12D，6位。加下劃線處為miR-30a骨架序列。
(SEQ ID NO：6)G12D，7位。加下劃線處為miR-30a骨架序列。
(SEQ ID NO：7)G12D，8位。加下劃線處為miR-30a骨架序列。
(SEQ ID NO：8)G12D，9位。
(SEQ ID NO：9)G12D，10位。
(SEQ ID NO：10)G12D，11位。
(SEQ ID NO：11)G12D，9位，mod 4。
(SEQ ID NO：12)G12D，10位，mod 5。
(SEQ ID NO：13)G12D，11位，MOD 6。
(SEQ ID NO：14)G12D，9位，MOD 10。
(SEQ ID NO：15)G12D，10位，mod 11。
(SEQ ID NO：16)G12D，11位，mod 12。
(SEQ ID NO：17)G12V，3位。
(SEQ ID NO：18)G12V，4位。
(SEQ ID NO：19)G12R，3位。
(SEQ ID NO：20)G12R，4位。
(SEQ ID NO：21)G12C，3位。
(SEQ ID NO：22)G12C，4位。
測試載體之示意圖。將野生型KRAS之最初17個胺基酸插入psiCHECK2載體之海腎螢光素酶基因(hRluc)之胺基末端，同時將G12D、G12V、G12R或G12C KRAS突變體之最初17個胺基酸插入同一載體上之螢火蟲螢光素酶基因(hluc+)之胺基末端。
將KRAS序列插入海腎基因或螢火蟲基因中：將人類KRAS野生型序列ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGT(SEQ ID NO：58)之最初17個胺基酸插入psiCHECK2之海腎基因序列之翻譯起始ATG處。插入KRAS(WT)序列後之區域中之核苷酸序列如下(加下劃線處為KRAS序列)： (SEQ ID NO：23)
簡言之，命名如下：斜體為海腎或螢火蟲編碼序列，加黑色下劃線的粗體為插入的KRAS序列，粗體為G12及G13之三重體密碼子，且雙下劃線係用於亞選殖之限制位點，但對於海腎其顯現為黑色。
人類KRAS突變體序列(G12D)之最初17個胺基酸：將ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGT(SEQ ID NO：24)插入psiCHECK2之螢火蟲基因序列之翻譯起始ATG處。插入KRAS(突變體)序列後之區域中之核苷酸序列如下(加下劃線處為KRAS序列)： (SEQ ID NO：25)
測試載體之構築：藉由基因合成過程產生具有適宜插入物之DNA片段。將合成DNA片段插入psiCHECK2中以產生如下文所列示之測試載體。根據合同由Epoch Life Sciences公司(Missouri City,TX)進行基因合成及載體構築。
(pGBI70)psiCHECK2-KRAS-WT(GGTGGC)：用NheI及DraIII消化hRluc中之KRAS(WT)複合物，且插入psiCHECK2之NheI及DraIII位點中以形成psiCHECK2-KRAS-WT
(pGBI71)psiCHECK2-KRAS-WT/G12D(GATGGC)：用MluI及PspOMI消化hluc+中之KRAS(G12D)之複合物，且插入psiCHECK2-KRAS-WT之MluI及PspOMI位點中以形成psiCHECk2-KRAS-WT/G12D
(pGBI72)psiCHECK2-KRAS-WT/G12V(GTTGGC)：用MluI及PspOMI消化hluc+中之KRAS(G12D)之複合物，且插入psiCHECK2-KRAS-WT之MluI及PspOMI位點中以形成psiCHECk2-KRAS-WT/G12V
(pGBI73)psiCHECK2-KRAS-WT/G12R(CGTGGC)：用MluI及PspOMI消化hluc+中之KRAS(G12D)之複合物，且插入psiCHECK2-KRAS-WT之MluI及PspOMI位點中以形成psiCHECk2-KRAS-WT/G12R
(pGBI74)psiCHECK2-KRAS-WT/G12C(TGTGGC)：用MluI及PspOMI消化hluc+中之KRAS(G12D)之複合物，且插入psiCHECK2-KRAS-WT之MluI及PspOMI位點中以形成psiCHECk2-KRAS-WT/G12C
bi-shRNAi設計及構築。Bi-shRNA設計實質上如先前所公開來完成(參考文獻14-15)。經由基因合成將每一bi-shRNA表現單元放在一起且插入pUMVC3載體之多選殖位點之Sal I及Not I位點中。
細胞轉染。藉由電穿孔法(Gene Pulser MX Cell,BIO-RAD)或脂 染胺(Lipofectamine)LTX(Invitrogen)進行細胞轉染。用於HEK-293細胞之電穿孔條件實質上遵循由製造商儲存在儀器中之預設條件。使用脂染胺(Lipofectamine)LTX之轉染法係遵循製造商推薦之建議且進一步藉由調整輸入DNA濃度與脂染胺比率達到最優化。所有脂染胺轉染法皆使用逆轉染方法。大多數共轉染法係採用最優化的總DNA濃度與脂染胺比率，使用比率為1：1之測試載體與bi-shRNAi載體進行。亦測試且優化測試載體對bi-shRNAi載體之比率。
雙重螢光素酶分析：使用雙重Glo螢光素酶分析系統(Promega)且實質上遵循製造商所提供之說明進行雙重螢光素酶分析。在具有化學發光微量板光度計(Luminoskan Ascent Microplate Luminometer，Thermo Scientific)之96孔模式中量測螢光。基本上，在96孔板中轉染細胞或將細胞在轉染後塗佈於96孔板中。在轉染後24hr或48hr時分析轉染細胞。
細胞生長抑制分析：用Cell Titer-Blue細胞活力分析試劑或Cell Titer-Glo發光法細胞活力分析試劑(Promega)藉由遵循製造商推薦之程序分析細胞生長抑制性。所使用之每株細胞系都先在分析發展時間優化。
藉由西方免疫墨點法分析KRAS減弱：用溶解緩衝液CelLytic-M(Sigma)溶解細胞且刮下培養皿之表面，在室溫下在緩慢振盪器上培育30分鐘並短暫離心。取少量分液，藉由Coomassie Bradford Plus分析法，以BSA作為標準物估測蛋白質濃度。使用SoftMaxPro軟體計算該數值且繪製標準曲線。在預組裝之15%聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)上使用Mini-Protein II細胞系統(Bio-Rad)分離等量蛋白質(通常5-20ug)。電泳後，將所分離之蛋白質依標準條件電轉移至PVDF膜上。首先在4℃下，在DPBS-T中，用含有5%無脂奶粉之封阻緩衝液封阻所轉移之膜一夜。更換兩次洗滌緩衝液後，首先用指定稀釋度之初級抗體 (用於KRAS及β肌動蛋白，Santa Cruz Biotechnology)且然後用HRP偶聯之二級抗體標記蛋白質。藉由ECL Plus西方墨點檢測試劑，使用G：BOX Chemi XT16自動化化學發光影像分析儀(Syngene,Frederick,MD)檢測化學發光。可將膜剝離且用不同抗體或管家蛋白(例如β肌動蛋白)再探測。
針對每一突變體等位基因之測試載體保留海腎對螢火蟲之表現比率。焦點在於設計靶向四種在PDAC中最普遍之KRAS突變之等位基因專一性減弱bi-shRNA。構築四種測試載體以個別測試G12D、G12V、G12R或G12C突變體等位基因。檢查每一測試載體構築物以確保插入KRAS序列並不會對海腎(RL)或螢火蟲(FF)螢光素酶之表現或活性造成不同影響。針對G12D、G12V、G12R及G12C突變之測試載體皆保留與psiCHECK2母載體相似之RL對FF比率(圖2)。僅KRAS wt序列插入RL螢光素酶中之載體(pGBI70)顯示RL對FF比率減小，從而表明該插入物影響RL螢光素酶活性(數據未顯示)，在含有突變體之測試載體中保留RL對FF比率表明將KRAS突變體序列插入FF螢光素酶中影響FF活性，同樣影響RL活性。
圖1顯示測試載體之示意圖。將野生型KRAS之最初17個胺基酸插入psiCHECK2載體之海腎螢光素酶基因(hRluc)之胺基末端，同時將G12D、G12V、G12R或G12C KRAS突變體之最初17個胺基酸插入同一載體上之螢火蟲螢光素酶基因(hluc+)之胺基末端。
發現針對每一突變體之測試載體保留海腎對螢火蟲表現比率。圖2顯示測試載體之野生型及突變體表現。使用雙重Glo螢光素酶分析系統(Promega)比較每一測試載體與psiCHECK2母載體之野生型(Wt)及突變體(Mu)表現。藉由海腎(RL)對螢火蟲(FF)之表現比率來評價Wt對Mu表現比較。
為測試分析系統，構築若干靶向G12D突變之bishRNA表現構築 物且用含有wt(RL)序列及G12D突變體(FF)序列之測試載體實施共轉染實驗。測試7種bishRNA構築物，每一構築物在引導股之多個位置處具有突變體等位基因序列之補體。共轉染每一bishRNA構築物與G12D測試載體且在轉染後48hr時進行雙重螢光素酶分析。可藉由如圖3a所例示之野生型對突變體比率或藉由螢火蟲(圖3b)或海腎(圖3c)之相對發光單位(RLU)來分析所收集之數據。微量板光度計取樣來自每孔中之小區域之發光信號且未乘以放大因數。一式三份之數據通常具有極小標準偏差且實驗彼此之間係可再現的。野生型對突變體比率提供對突變體對野生型減弱中之每一bishRNA構築物之粗查。野生型對突變體比率大於空載體對照(圖3a，c帶)表明突變體減弱之優點，而等於或小於對照表明無優點。亦可比較每一構築物與空載體對照之野生型或突變體等位基因之減弱效率。每一bishRNA構築物顯示野生型或突變體減弱效率方面之不同特徵。
發現，可藉由相對發光單位(RLU)或海腎(RL)對螢火蟲(FF)比率來評價突變體對WT之比較減弱效率。圖3：分析系統之展示. 藉由共轉染測試載體與雙功能性shRNA(bi-shRNA)表現載體(86、87、88、89、90、91或92)，突變體比野生型之優先減弱可藉由FF對RL比率(嵌圖a)來評價。突變體或野生型之減弱可進一步藉由比較FF(嵌圖b)或RL(嵌圖c)與空載體對照(C)之RLU來個別分析。
隨後，測定比較減弱效率且發現當將突變體序列置於bi-shRNA構築物之引導股之不同位置處時效率有所不同。每一bishRNA構築物在野生型及突變體等位基因減弱中顯示不同特徵，如圖3所顯示。其他出版物已顯示中心區對於siRNA介導之RNAi之等位基因專一性至關重要。為測試且理解雙功能性策略之專一性，製造一系列將G12D突變核苷酸之補體置於引導股之2位至11位之構築物且系統性分析每一構築物之專一性及功效。2位至11位涵蓋種子區及中心區。將突變核 苷酸置於5位及10位(圖4，P5及P10)顯示野生型或突變體皆未被減弱，另一方面7、8、9及11位(圖4，P7、P8、P9及P11)在野生型及突變體二者之減弱中高度有效。處在種子區之2、3及4位(圖4，P2、P3及P4)顯示野生型及突變體減弱之最大差異。因此，種子區尤其位置3與4在專一性減弱中最有效。
圖4顯示本發明之雙功能性shRNA之位置效應。藉由將單突變核苷酸序列置於引導股最初11個位置中之一者處來比較對G12D突變體具專一性之Bi-shRNA構築物。評價每一構築物針對野生型(wt)及突變體(mu)之減弱百分比。(n=3)
將其他錯配引入引導股中。發現在引導股引入其他錯配顯著降低減弱效率。Ohnishi及同事報導在種子區引入錯配增強中心區處之突變體等位基因識別(1)。針對中心區構築物製造具有其他種子區錯配之bishRNA構築物(突變核苷酸在引導股之P9、P10及P11處)。亦製造具有與突變核苷酸並置之錯配之bishRNA構築物來測試用一構築物減弱兩個突變體等位基因之潛能。與G12D測試載體之共轉染數據顯示種子區錯配降低野生型及突變體二者之減弱效率(圖5，P9+P4帶對P9帶；p10+p5帶對p10帶；p11+p6帶對p11帶)且突變體識別增強僅有輕微改良。引入與突變核苷酸並置之錯配顯著降低突變體及野生型二者之減弱效率(圖5，P9+P10帶對P9帶；P10+P11帶對P10帶；P11+P12帶對P11帶)。
圖5展示引入錯配對減弱效率之效應。Ohnishi及同事報導在種子區引入錯配增強中心區處之突變體識別(1)。比較在中心區(p9、p10及p11)處具有突變核苷酸之G12D構築物與在種子區或與突變核苷酸並置處具有其他錯配之構築物：野生型(wt)與突變體(mu)。(n=3)
為擴大雙功能性shRNA之可能效應及靶向，使shRNA靶向靶之專一性位置以使得重疊效應成為可能。發現在3位或4位具有突變核苷酸 之構築物亦對G12V、G12R及G12C具有選擇性。將針對G12V、G12R及G12C突變之在3位或4位具有突變核苷酸之構築物與G12D構築物一起相對於所有四種測試載體進行測試。針對G12D之3位構築物比4位構築物更有效(圖6，G12D帶)，且針對其他突變體有極少或無活性(圖6，G12D帶)。另一方面，針對G12V之4位構築物比3位構築物更有效(圖6，G12V帶)且針對其他突變體有極少或無活性(圖6，G12V帶)。 G12R構築物不具有選擇性，且對G12D之突變體具有稍高活性，對G12R及G12C幾乎相同(圖6，G12R帶)。對於G12C，3位優於4位，且對其他突變體有極少或無活性(圖6，G12C帶)。針對每一構築物之野生型或突變體之減弱效率匯總於表1中。
圖6展示對G12D、G12V、G12R及G12C之3位或4位構築物之選擇性減弱。比較針對G12D、G12V、G12R及G12C之所有3位或4位bi-shRNAi構築物相對於所有對四種突變體中之每一者具專一性之測試載體之突變體減弱之優點。突變體對野生型比率大於空載體對照樣品(樣品C，橫線條)表明對專一性突變體等位基因之強減弱優點。
表1顯示關鍵bi-shRNA構築物之野生型及突變體等位基因減弱效率。表1匯總靶序列、關鍵bi-shRNA構築物之引導股序列及各自對突變體或野生型等位基因之各別減弱效率，分別為SEQ ID NO.：26-52。
表1係對減弱SEQ ID NO.：26-52之位置效應之匯總。
隨後，測試構築物在癌細胞中之有效性。用KRAS野生型細胞系及具有突變體等位基因之胰臟癌細胞系對測試構築物進行測試。沒有抗體可用於差異性識別突變KRAS蛋白與野生型KRAS蛋白，使用具有三種不同基因型之三種不同細胞系來測試每一構築物之差異減弱。HEK-293係具有野生型KRAS(KRAS+/+)之人類胚腎細胞系，PANC1係具有雜合KRAS(KRAS+/G12D)之人類胰臟癌細胞系且MiaPaCa2係具有雜合KRAS(KRAS+/G12C)之人類胰臟癌細胞系。2、3及4位構築物能夠減弱KRAS表現且具有不同效率(圖7A)。減弱不夠有效，佔未經轉染之對照的65%至70%，此可歸因於轉染效率及野生型KRAS之存在。用三種不同細胞系進一步比較K12D及K12C突變體之3位及/或4位構築物的減弱效率。G12D構築物在HEK293細胞中似乎不減弱KRAS(圖7B)，在PANC1細胞中之KRAS減弱中最有效(圖7B)且在MiaPaCa2細胞中KRAS減弱活性較低(圖7B)。另一方面，G12C構築物在HEK293細胞(圖7C)及PANC1細胞(圖7C)中之KRAS減弱中無效，但 在MiaPaCa2細胞(圖7C)中之KRAS減弱中有效。
圖7A至圖7C顯示KRAS在經bi-shRNA轉染之細胞中表現之西方免疫墨點分析。用多種突變體靶向bi-shRNA構築物轉染HEK-293(WT)、PANC-1(G12D等位基因)及MiaPaCa(G12C等位基因)。用西方免疫墨點對轉染後48hr收穫之細胞提取物進行半定量分析。(a)經G12D靶向構築物轉染之PANC-1細胞。圖7B比較G12D構築物對3種細胞系之KRAS減弱。圖7C比較G12C構築物對3種細胞系之KRAS減弱。
在一系列靶向在引導股之每一位置處具有單核苷酸突變之G12D之bi-shRNA表現載體構築物中發現，突變體等位基因之最可辨別減弱活性係藉由將突變體核苷酸置於2-4位產生。藉由檢查引導股之其他位置處之其他錯配之減弱效應，確定該過程具有序列專一性。
與大多數基於siRNA之RNAi將最有效單核苷酸辨別位置置於引導股之中心區處相比，本發明之雙功能性shRNA減弱之系統性分析將最有效辨別位置置於引導股之2-4位(種子區)。
製造針對G12V、G12R及G12C突變之相似構築物且其可有效減 弱其各別靶突變體等位基因。G12R專一性構築物與G12C突變體交叉反應且發現所有皆具有功能性。
使用HEK-293細胞野生型(wt)、PANC-1細胞(G12D等位基因)及MiaPaCa2細胞(G12C等位基因)進一步比較所選構築物與對照載體之KRAS減弱。與KRAS在PANC-1細胞及MiaPaCa2細胞中之表現分別減少相比，G12D及G12C選擇性bi-shRNA表現載體並未減少KRAS在HEK-293中之表現。
可使用本文之教示製造其他測試構築物且與適宜的KRAS突變體表現細胞系一起使用以在蛋白減弱層面及信號轉導層面進一步證明減弱之專一性。
將測試具有能夠減弱G12D、G12V、G12R及G12C之多聚bi-shRNA單元之單表現構築物之活體外及活體內之有效性及專一性。
使用miR-17-92簇序列之在一載體中具有三重減弱能力之多聚bi-shRNA之構築。圖8顯示具有6個串聯miRNA之miR-17-92簇。
該區域中之序列係自以下獲得：gi|47076873|dbj|AB176708.1|智人(Homo sapiens)C13orf25 v_2 mRNA、完全cds、miR-91-前體-13微RNA、微RNA miR-91、微RNA miR-17、miR-18-前體-13微RNA、微RNA miR-18、miR-19a-前體-13微RNA、微RNA miR-19a、微RNA miR-20、miR-19b-前體-13微RNA、微RNA miR-19b、miR-92-前體-13微RNA、微RNA miR-92。
(SEQ ID NO.：57)
粗體且加下劃線之區域為微RNA序列且斜體區域為每一微RNA作用子之間之間隙序列。
製造兩組三重bi-shRNA多聚構築物以測試對三種不同KRAS突變之減弱。第一組維持miR-30a骨架莖環結構且使用miR-17-92簇間隙序列。第二組使用miR-17-92簇天然莖環結構骨架且用bi-shRNA靶向序列取代miRNA序列。對每一組構築兩個三重體之組合，pGBI-129及pGBI-130在miR-17-92間隙序列中具有miR30a骨架，而pGBI-131及pGBI-132具有miR-17-92骨架及間隙序列。對於pGBI-129及pGBI-131，bi-shRNA之順序為G12D-G12V-G12R。對於pGBI-130及pGBI-132，bi-shRNA之順序為G12C-G12D-G12R。該等序列顯示於下文中。
使用miR-17-92間隙序列與miR-30a骨架，粗體字母為miR30a骨架序列，Courier new字母為miR-17-92間隙序列，粗體傾斜加下劃線之字母為KRAS靶向序列，處在每一末端之小寫字母序列為插入限制位點序列。
pGBI-129(G12D-G12V-G12R)： (SEQ ID NO.：53)
pGBI-130(G12C-G12D-G12R)： (SEQ ID NO.：54)
使用miR-17-92骨架，粗體字母為替代miR-17-92靶向序列之KRAS靶向序列。處在每一末端之小寫字母為插入限制酶位點序列。
pGBI-131(G12D-G12V-G12R)： (SEQ ID NO.：55)
pGBI-132(G12C-G12D-G12R)： (SEQ ID NO.：56)
多插入物構築物。上文所顯示之插入物序列全部皆係藉由基因合成方法合成且選殖至pUMVC3載體中。在一實例中，首先用報告測試載體測試三重構築物以與其單重對應部分比較減弱效率。圖9顯示 三重構築物可如同單重構築物一樣有效減弱G12D報告子(左上方嵌圖，第8-11條對第2-3條)。pGBI-131(右上方嵌圖，第10條)可如同單體(第5條)一樣減弱G12V。G12R之三重體並未如同單體一樣實施減弱(左下方嵌圖，第8-11條對第7條)。對於G12C，三個三重體表現優於單體(右下方嵌圖，第9-11條對第6條)。熟習此項技術者將意識到，構築物可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75或100個插入物。該等插入物可包含於1、2、3、5、6、7、8、9或10種不同載體中，該等載體可具有不同類型(或重疊)之啟動子、複製起點、抗生素或其他抗性基因、選擇性域或基因、可變表現域、重組域及構築物表現及載體繁殖所需要之其他域。概括而言，此處所顯示之三重構築物可如同單體一樣實施減弱。四種所測試三重體構築物之間之減弱效率有所不同。
隨後用PANC-1細胞測試測試三重體之減弱效率。PANC-1細胞具有KRAS wt/G12D基因型，具有一個野生型等位基因及一個G12D突變體等位基因。測試三重體是否可有效減弱G12D表現同時不影響野生型表現。為測試所有細胞群，用G418抗性載體建立轉化體。集合中之大多數G418抗性轉化體應組成性表現bi-sh-KRAS。圖10顯示建立轉化體之方案。
針對KRAS mRNA群測試所建立之轉化體集合。使用限制片段長度多態性(RFLP)以辨別野生型轉錄本與突變體轉錄本。在PCR擴增期間引入BstXI限制位點，作為結果BstXI將切割野生型片段同時使含有突變之片段保持完整。在4%瓊脂糖凝膠上分離經BstXI消化之PCR產物，上方條帶代表突變體群且下方條帶代表野生型群。圖11顯示，具有miR-17-92間隙序列之三重構築物(pGBI-129及pGBI-130)僅可輕微減弱突變體(4帶及5帶)，而具有miR-17-92骨架序列之三重構築物(pGBI-131及pGBI-132)可極有效地減弱突變體(6帶及7帶)。令人感興 趣且出乎意料地，pGBI-131及pGBI-132不僅大大減少突變體mRNA群且增強野生型mRNA表現。三重構築物pGBI-131及pGBI-132可有效且選擇性地減少G12D突變體mRNA且使野生型表現恢復至正常量。
本發明涵蓋，本說明書中所論述之任一實施例可根據本發明之任一方法、套組、試劑或組合物來實施，且反之亦然。此外，本發明之組合物可用於達成本發明之方法。
應瞭解本文所闡述之具體實施例以說明方式展示而非限制本發明。本發明之主要性質可在不背離本發明之範疇下在多個實施例中應用。彼等熟習此項技術者僅使用常規實驗即可瞭解或能夠識別本文所闡述之特定程序之諸多等效物。認為該等等效物在本發明範疇內且為申請專利範圍所囊括。
本說明書中所提及之所有公開案及專利申請案皆指示彼等熟習本發明所涉及之技術者之熟練程度。所有出版物及專利申請案皆以引用方式併入本文中，其程度如同將每一個別出版物或專利申請案特定地及個別地所指以引用方式併入本文中。
在申請專利範圍及/或說明書中，詞語「一(a或an)」在與術語「包含」結合使用時可意指「一個」，但亦與「一或多個」、「至少一個」及「一個或一個以上」之含義一致。儘管本發明支持所用術語「或」可僅指替代及「及/或」之定義，但除非明確表明此術語僅指替代或該等替代相互排斥，否則申請專利範圍中所使用之術語「或」皆係用來指「及/或」。在整個本申請案中，術語「約」係用來表明值包含用來測定該值之裝置、方法之固有誤差改變或存在於研究主體中之改變。
如在本說明書及申請專利範圍中所使用，詞語「包括(comprising)」(及其任一形式，例如「包括(comprise)」及「包括(comprises)」)、「具有(having)」(及其任一形式，例如「具有(have)」 及「具有(has)」)、「包含(including)」(及其任一形式，例如「包含(includes)」及「包含(include)」)或「含有(containing)」(及其任一形式，例如「含有(contains)」及「含有(contain)」)具有包涵性或開放性，且不排除其他未列出之要素或方法步驟。
如本文所使用之術語「或其組合」係指在該術語之前所列出條目之所有排列及組合。例如，「A、B、C或其組合」意欲包含以下中之至少一者：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且在具體上下文中若順序很重要，則亦包含BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。繼續此實例，其明確包含含有一或多個條目或術語之重複之組合，例如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。熟習此項技術者將理解，除非上下文中另外指明，否則任一組合中之條目或術語數量通常並無限制。
如本文所使用，近似性詞語(例如但不限於)「約」、「實質的」或「實質上」係指條件經該等詞語修飾時應理解為不一定係絕對或完美的，但可被彼等熟習此項技術者認為足夠接近以保證指明該條件存在。該描述可變之程度將取決於可設立多大變化且仍使熟習此項技術者認識到經改質之特性仍具有未經修改特性之所需特徵及能力。通常且根據先前論述，本文中經近似性詞語(例如「約」)修飾之數值可自所述之值變化至少±1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、10%、11%、12%、13%、14%或15%。
藉助本發明無需過多實驗即可製造且執行本文所揭示且主張之所有組合物及/或方法。儘管本發明之組合物及方法已根據較佳實施例予以闡述，但熟習此項技術者將明瞭，在不背離本發明之概念、精神及範疇下，可改變該等組合物及/或方法及本文所闡述方法之步驟或步驟之順序。對彼等熟習此項技術者顯而易見的所有該等類似取代及修改皆視為在如隨附申請專利範圍所界定之本發明之精神、範疇及 概念內。
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Claims (48)

  1. 一種能夠減少K-ras基因表現之雙功能性shRNA，其中該雙功能性RNA分子之至少一個靶位點序列係位於該K-ras基因內且其中該雙功能性RNA分子能夠活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物，以減少K-ras之表現量。
  2. 如請求項1之雙功能性shRNA，其中該雙功能性shRNA包括至少一個由SEQ ID NO：1至22或53至56定義之序列。
  3. 如請求項1之雙功能性shRNA，其中該雙功能性shRNA包括至少一個由SEQ ID NO：31至52定義之序列。
  4. 如請求項1之雙功能性shRNA，其中至少一個靶位點序列係位於人類K-ras基因cDNA序列(SEQ ID NO：27至30)內。
  5. 如請求項1之雙功能性shRNA，其中該K-ras係突變K-ras。
  6. 一種表現載體，其包括：啟動子；及可操作地連接至該啟動子之核酸插入物，其中該插入物編碼一或多種能夠經由RNA干擾法抑制至少一個靶基因(其係K-ras基因)表現之shRNA；其中該一或多種shRNA包括活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少K-ras表現量之雙功能性RNA分子。
  7. 如請求項6之表現載體，其中該靶基因序列包括SEQ ID NO：1至5。
  8. 如請求項6之表現載體，其中該shRNA之序列排列包括5’莖臂-19核苷酸靶，其係K-ras-TA-15核苷酸環-19核苷酸靶互補序列-3’莖臂-間隔體-5’莖臂-19核苷酸靶變體-TA-15核苷酸環-19核苷酸靶 互補序列-3’莖臂。
  9. 如請求項6之表現載體，其中該核酸插入物包括至少一個選自SEQ ID NO：6至27或53至56之序列。
  10. 如請求項6之表現載體，其中該載體包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75或100個能夠減少一或多個突變K-ras基因表現之雙功能性shRNA插入物之複本。
  11. 如請求項6之表現載體，其中至少一種shRNA具有位於突變K-ras基因cDNA序列內之靶位點序列。
  12. 一種治療性遞送系統，其包括：治療劑載體；及表現載體，其包括啟動子及可操作地連接至該啟動子之核酸插入物，該核酸插入物編碼一或多種能夠經由RNA干擾法抑制靶基因序列(其係K-ras基因)表現之短髮夾RNA(shRNA)；其中該一或多種shRNA包括活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少K-ras表現量之雙功能性RNA分子。
  13. 如請求項12之遞送系統，其中該治療劑載體係包覆之DNA奈米粒子或使用一或多種聚陽離子物包覆之DNA奈米粒子。
  14. 如請求項13之遞送系統，其中該一或多種聚陽離子物係經10kDA聚乙二醇(PEG)取代之半胱胺酸-離胺酸三聚體肽(CK30PEG10k)。
  15. 如請求項13之遞送系統，其中該等包覆之DNA奈米粒子係進一步囊封於以下至少一種脂質體中：可逆式遮蔽脂質體或雙層內陷性囊泡(BIV)。
  16. 如請求項12之遞送系統，其中該靶基因序列包括SEQ ID NO：27 至30。
  17. 如請求項12之遞送系統，其中該核酸插入物包括選自SEQ ID NO：31至52之序列中之至少一者。
  18. 如請求項12之遞送系統，其中該核酸插入物係選自SEQ ID NO：1至22或53至56。
  19. 一種表現載體(vector)與治療劑載體(carrier)複合物之用途，其用於製造用來將一或多種shRNA遞送至表現K-ras基因之靶組織之藥劑，其中該表現載體與治療劑載體複合物之製造方法包括以下步驟：製備表現載體，該表現載體包括啟動子及可操作地連接至該啟動子之核酸插入物，該核酸插入物編碼該一或多種shRNA，其中該一或多種shRNA包括活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少K-ras表現量之雙功能性RNA分子；組合該表現載體與治療劑載體，其中該治療劑載體包括脂質體。
  20. 如請求項19之用途，其中該治療劑載體係包覆之DNA奈米粒子。
  21. 如請求項20之用途，其中該DNA奈米粒子係使用一或多種聚陽離子物包覆，其中該一或多種聚陽離子物包括經10kDA聚乙二醇(PEG)取代之半胱胺酸-離胺酸三聚體肽(CK30PEG10k)或三十聚體離胺酸縮合肽。
  22. 如請求項20之用途，其中該等包覆之DNA奈米粒子係進一步囊封於脂質體中，其中該脂質體係包括一或多個受體靶向部分之雙層內陷性囊泡(BIV)。
  23. 如請求項22之用途，其中該一或多個受體靶向部分包括小分子二價β小彎模擬物。
  24. 如請求項19之用途，其中該核酸插入物包括選自SEQ ID NO：1至22或53至56之序列。
  25. 一種抑制K-ras基因在一或多種靶細胞中表現之活體外方法，其包括以下步驟：選擇該一或多種靶細胞；及用表現一或多種短髮夾RNA(shRNA)之載體轉染該靶細胞，該一或多種短髮夾RNA能夠經由RNA干擾法抑制K-ras基因在該一或多種靶細胞中之表現，其中該一或多種shRNA包括活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少K-ras表現量之雙功能性RNA分子。
  26. 如請求項25之方法，其中該shRNA納入siRNA(裂解依賴型)及miRNA(非裂解依賴型)基序。
  27. 一種表現載體與治療劑載體複合物之用途，其用於製造用來在需要阻抑腫瘤細胞生長之人類個體中阻抑該腫瘤細胞生長之藥劑，其中該表現載體表現一或多種能夠經由RNA干擾法抑制靶基因(其係突變K-ras)在該一或多種靶細胞中表現之shRNA；其中該一或多種shRNA包括活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少該靶基因之表現量之雙功能性RNA分子；其中該抑制作用導致該等腫瘤細胞之凋亡、增殖受阻或侵襲力降低。
  28. 如請求項27之用途，其中該治療劑載體包括雙層內陷性囊泡(BIV)。
  29. 如請求項27之用途，其中該治療劑載體包括一或多個包括小分子二價β小彎模擬物之「聰明」受體靶向部分。
  30. 如請求項27之用途，其中該藥劑係經由選自由以下組成之群之 途徑投與：腫瘤內、皮下、靜脈內、腹膜內、肌內及靜脈內注射。
  31. 如請求項27之用途，其中該藥劑係與DNA：脂複合物(lipoplex)組合投與。
  32. 如請求項27之用途，其中該腫瘤細胞生長表現突變K-ras。
  33. 如請求項27之用途，其中該腫瘤細胞生長係人類胰管腺癌。
  34. 如請求項27之用途，其中該腫瘤細胞生長係選自由以下組成之群：肺癌、結腸癌、黑色素瘤、胰島素瘤、間皮瘤、卵巢癌及胰臟癌。
  35. 如請求項27之用途，其中該bishRNA係選自SEQ ID NO：1至22或53至56。
  36. 如請求項27之用途，其中該藥劑係與另一抗腫瘤劑組合使用。
  37. 如請求項27之用途，其中該藥劑係與西妥昔單抗(cetuximab)或威羅菲尼(vemurafenib)組合使用。
  38. 一種表現載體，其包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75或100個能夠減少突變K-ras基因表現之雙功能性shRNA插入物；其中該雙功能性RNA分子之至少一個靶位點序列係位於該K-ras基因內，其中該雙功能性RNA分子能夠活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少K-ras之表現量。
  39. 如請求項38之表現載體，其中該雙功能性shRNA係選自SEQ ID NO：1至22或53至56。
  40. 如請求項38之表現載體，其中該雙功能性shRNA包括靶向專一性K-ras突變之三重體插入物，該等插入物係選自以下中之至少一者：G12D-G12V-G12R、G12C-G12D-G12R、G12D-G12V-G12R或G12C-G12D-G12R。
  41. 如請求項38之表現載體，其中該雙功能性shRNA包括靶向專一性K-ras突變之三重體插入物，該等插入物係選自SEQ ID NO.：2、18、20、21、或SEQ ID NO：2、18及20之組合、或SEQ ID NO：21、2及18之組合。
  42. 一種包括表現單元之細胞，該表現單元包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75或100個能夠減少突變K-ras基因表現之雙功能性shRNA插入物；其中該雙功能性RNA分子之至少一個靶位點序列係位於該K-ras基因內，其中該雙功能性RNA分子能夠活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物以減少K-ras之表現量。
  43. 如請求項42之細胞，其中該雙功能性shRNA係選自SEQ ID NO：1至22或53至56。
  44. 如請求項42之細胞，其中該雙功能性shRNA增加野生型K-ras之表現。
  45. 一種評估據信可用於治療包括至少一個經有效沉默之突變K-ras之細胞或組織之候選藥物的方法，該方法包括：(a)量測以下中之一或多者：a.至少一個野生型K-ras及一或多個突變K-ras基因在該等細胞或組織中之表現量；b.候選基因或候選基因組在細胞環境中之表現量，在該細胞環境中癌細胞或組織中之一或多個突變K-ras基因之表現減少；c.候選藥物對該等細胞之表型之效應，包括該等癌細胞或組織中之一或多個突變K-ras基因之表現減少；(b)向該等細胞或組織之第一亞群投與候選藥物，且向該等 細胞或組織之第二亞群投與安慰劑；(c)在投與該候選藥物或該安慰劑後重複步驟(a)；及(d)測定該候選藥物是否可在細胞環境中有效產生所測定之表型，使其突變K-ras之表現比在表現K-ras突變體之細胞環境中減少，該減少係與第二亞群細胞或組織中所發生之任何減少相比具統計上顯著性，其中統計上顯著之減少表示該候選藥物可用於治療無顯著K-ras突變背景之疾病。
  46. 如請求項44之方法，其中該等細胞或組織進一步表現一或多個已經過改質而包括野生型K-ras及一或多個突變K-ras之可檢測基因，其中該可檢測標記之表現量與該候選物質對該野生型K-ras及一或多個突變K-ras之該效應具相關性。
  47. 如請求項44之方法，其中該等細胞或組織已經過改質以表現能夠減少K-ras基因表現之雙功能性shRNA，其中該雙功能性RNA分子之至少一個靶位點序列係位於該K-ras基因內，且其中該雙功能性RNA分子能夠活化裂解依賴型及非裂解依賴型RNA誘導之沉默複合物，以減少該K-ras之表現量。
  48. 如請求項44之方法，其中該等細胞或組織已經過改質以表現選自SEQ ID NO：1至22或53至56之雙功能性shRNA。如請求項44之方法，其中該等細胞或組織已經過改質以表現包括一或多種靶向專一性K-ras突變之插入物之雙功能性shRNA，該一或多種插入物選自SEQ ID NO.：2、18、20、21、或SEQ ID NO：2、18及20之組合、或SEQ ID NO：21、2及18之組合。
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