TW201343915A - 蛇菊醇糖基轉移酶及編碼該轉移酶之基因 - Google Patents

Abstract

本發明之目的為提供蛇菊醇糖基轉移酶及使用該轉移酶之蛇菊醇糖苷之製造方法。本發明提供蛇菊醇糖基轉移酶及使用該轉移酶之蛇菊醇糖苷之製造方法。本發明提供導入有蛇菊醇糖基轉移酶基因之轉形體及該轉形體之製作方法。

Description

蛇菊醇糖基轉移酶及編碼該轉移酶之基因

本發明係關於具有合成蛇菊醇(steviol)糖苷之活性的蛋白質及編碼該蛋白質之聚核苷酸，利用該蛋白質之蛇菊醇糖苷之製造方法，高度表現蛇菊醇糖基轉移酶之轉形體及藉由前述方法所製作之蛇菊醇糖苷及其之利用。

菊科蛇菊(Stevia rebaudiana)之葉中含有為二萜類之一種，被稱為蛇菊醇(steviol)之二次代謝產物，由於蛇菊醇糖苷呈現約為砂糖300倍之甜味，所以在食品產業中被利用做為低熱量之甜味料。肥胖在國際上已成為嚴重的社會問題，從增進健康及削減醫療費之觀點而言，對於低熱量之甜味料的期望亦與日俱增。現今人工合成之胺基酸衍生物中之阿斯巴甜(Aspartame)或乙醯磺胺酸鉀(Acesulfame Potassium)雖被利用做為人工甜味料，然而如蛇菊醇糖苷之天然存在之低熱量甜味料更為安全，預期容易被消費者接受(Public Acceptance)。

蛇菊之葉所含有之蛇菊醇，最終以糖修飾成附加4個糖之糖苷，該糖苷被稱為萊鮑迪苷A(Rebaudioside A)(第1圖)。為其前驅體之蛇菊醇三糖糖苷之蛇菊苷(Stevioside)含量最多，萊 鮑迪苷A及蛇菊苷為蛇菊之甜味的中心物質。除此等以外，已知存在被認為是反應中間物之類似物，該等類似物之糖苷或糖之種類不同。

達成萊鮑迪苷A之生合成的酵素基因，經由蛇菊之表現序列標幟(Expressed Sequence Tag(EST))解析而被單離(非專利文獻1及2、專利文獻1)。映-貝殼杉烯酸(ent-kaurenoic acid)之13位被為細胞色素P450酵素之映-貝殼杉烯酸13位氫氧化酵素(EK13H)氫氧化，生成蛇菊醇，其中該映-貝殼杉烯酸係植物荷爾蒙二萜類之赤黴素(Gibberellin)的前驅體(第2圖)(非專利文獻3、專利文獻1)。首先，蛇菊醇之13位之羥基被UGT85C2糖苷化(單糖基化)，生成蛇菊醇單糖苷(Steviolmonoside)。蛇菊醇單糖苷之13位之葡萄糖之2位被進一步糖基化，生成蛇菊醇雙糖苷(Steviolbioside)，或者蛇菊醇單糖苷之19位之羧基被糖基化，生成被稱為甜茶苷(Rubusoside)之蛇菊醇二糖糖苷。如此生成之蛇菊醇雙糖苷或甜茶苷被進一步糖苷化，生成如蛇菊苷或萊鮑迪苷A(Rebaudioside A)之蛇菊醇糖苷。就與蛇菊醇糖苷之生成相關之酵素基因而言，已知有UGT74G1或UGT76G1。

已知UGT74G1可催化蛇菊醇單糖苷之19位之糖基化(非專利文獻1)。UGT74G1又可將蛇菊醇雙糖苷糖基化，產生為蛇菊醇三糖糖苷之蛇菊苷(Stevioside)。已知在蛇菊葉中該蛇菊苷含量最多，呈現為砂糖之約250至300倍的甜味。該蛇菊苷進一步被UGT76G1糖基化，生成甜味最高(砂糖之350至450倍)，且味質良好之蛇菊醇四糖糖苷，即萊鮑迪苷A(Rebaudioside A)。

由於報導在蛇菊醇糖苷中，尤其於13位之葡萄糖附 加分枝狀糖，可提高味質及甜味度(非專利文獻4、專利文獻2)，所以研判催化此等反應之糖基轉移酶為決定蛇菊甜味特性的重要酵素。

在先前研究(非專利文獻2)中，雖然報導從蛇菊之葉之EST解析，得到數種糖基轉移酶(UGT)，不過未充分檢討所有此等轉移酶之詳細酵素活性。又，對於UGT91D1之同源性蛋白質，只有報導非全長序列之單離(專利文獻3)。

專利文獻1：EP 1 897 951 B1

專利文獻2：日本特開平5-255372

專利文獻3：WO2011/153378A1

非專利文獻1：Brandle and Telmer (2007) Phyto- chemistry 68, 1855-1863

非專利文獻2：Richman et al (2005) Plant J. 41, 56-67

非專利文獻3：Mizutani and Ohta (2010) Annu. Rev. Plant Biol. 61, 291 - 315

非專利文獻4：笠井氏等(1981)日本化學會誌5, 726-735

本發明人等進行專心研究之結果，成功鑑定出可催化蛇菊中蛇菊醇糖苷之13位葡萄糖之糖附加反應的酵素及編碼該酵素的基因。本發明係依據上述認知而完成者。

亦即，本發明如以下說明。

[1]一種蛋白質，其係選自以下(a)至(c)所構成之組群之任一者所記載之蛋白質： (a)包含序列編號2之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入及/或附加1至48個胺基酸之胺基酸序列，且具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性的蛋白質；(c)具有與序列編號2之胺基酸序列90%以上序列相同性之胺基酸序列，且具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性的蛋白質； (式中，R₁表示H、C₁至C₂₀烷基、C₂至C₂₀烯基、C₂至C₂₀炔基、C₄至C₂₀鏈二烯基(alkyldienyl)、C₆至C₁₈芳基、C₆至C₂₀烷芳基、C₆至C₂₀芳烷基、C₄至C₂₀環烷基、C₄至C₂₀環烯基、(C₃至C₁₀環烷基)C₁至C₁₀烷基或糖殘基)。

[2]如前述[1]記載之蛋白質，其中前述糖分子為六碳糖。

[3]如前述[1]記載之蛋白質，其中前述糖分子係選自葡萄糖、甘露糖及半乳糖所構成之組群者。

[4]如前述[1]記載之蛋白質，其中前述R₁為H或葡萄糖單體或葡萄糖二聚體之糖殘基。

[5]如前述[1]記載之蛋白質，其中前述化合物為蛇菊醇單糖苷或甜茶苷。

[6]一種聚核苷酸，其係選自以下(a)至(e)所構成之組群： (a)含有序列編號1之鹼基序列的聚核苷酸；(b)編碼包含序列編號2之胺基酸序列之蛋白質的聚核苷酸；(c)編碼包含在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入、及/或附加1至48個胺基酸之胺基酸序列，且具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性之蛋白質的聚核苷酸；(d)編碼具有與序列編號2之胺基酸序列90%以上序列相同性之胺基酸序列，且具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性之蛋白質的聚核苷酸；(e)在高度嚴苛條件下可與包含與序列編號1之鹼基序列為互補之鹼基序列之聚核苷酸雜交的聚核苷酸，且係編碼具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性之蛋白質的聚核苷酸； (式中，R₁表示H、C₁至C₂₀烷基、C₂至C₂₀烯基、C₂至C₂₀炔基、C₄至C₂₀鏈二烯基、C₆至C₁₈芳基、C₆至C₂₀烷芳基、C₆至C₂₀芳烷基、C₄至C₂₀環烷基、C₄至C₂₀環烯基、(C₃至C₁₀環烷基)C₁至C₁₀烷基或糖殘基)。

[7]如前述[6]記載之聚核苷酸，其中前述糖分子係選自葡萄糖、甘露糖及半乳糖所構成之組群。

[8]如前述[6]記載之聚核苷酸，其中前述R₁為H或葡萄糖單體或葡萄糖二聚體之糖殘基。

[9]如前述[6]記載之聚核苷酸，其中前述化合物為蛇菊醇單糖苷或甜茶苷。

[10]一種非人類轉形體，其係導入有前述[6]記載之聚核苷酸。

[11]如前述[10]記載之轉形體，其係將前述聚核苷酸插入表現載體者。

[12]如前述[10]記載之轉形體，其為微生物或植物體。

[13]一種如前述[10]記載之轉形體之萃取物。

[14]一種食品、醫藥品或工業原料，其含有前述[13]記載之萃取物。

[15]一種蛋白質之製造方法，該蛋白質具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性，該方法之特徵為培養如前述[10]記載之非人類轉形體； (式中，R₁表示H、C₁至C₂₀烷基、C₂至C₂₀烯基、C₂至C₂₀炔基、C₄至C₂₀鏈二烯基、C₆至C₁₈芳基、C₆至C₂₀烷芳基、C₆至C₂₀芳烷基、C₄至C₂₀環烷基、C₄至C₂₀環烯基、(C₃至C₁₀環烷基)C₁至C₁₀烷基或糖殘基)。

[16]一種蛇菊醇糖苷之製造方法，其特徵為使用前述[10]記載之非人類轉形體。

[17]如前述[16]記載之方法，其中前述蛇菊醇糖苷為蛇菊醇雙糖苷、蛇菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F或此等之組合。

[18]如前述[16]記載之方法，其中前述非人類轉形體係表現選自UGT85C2基因、UGT74G1基因、UGT76G1基因所構成之組群之至少1種基因者，所製造之蛇菊醇糖苷為蛇菊醇雙糖苷、萊鮑迪苷A、蛇菊苷及萊鮑迪苷B。

[19]一種蛇菊醇糖苷之製造方法，其中包含使前述[1]記載之蛋白質與UDP-糖、及下述通式(I)所示之化合物反應之步驟； (式中，R₁表示H、C₁至C₂₀烷基、C₂至C₂₀烯基、C₂至C₂₀炔基、C₄至C₂₀鏈二烯基、C₆至C₁₈芳基、C₆至C₂₀烷芳基、C₆至C₂₀芳烷基、C₄至C₂₀環烷基、C₄至C₂₀環烯基、(C₃至C₁₀環烷基)C₁至C₁₀烷基或糖殘基)。

[20]如前述[19]記載之方法，其中前述UDP-糖中之糖為葡萄糖。

[21]如前述[19]記載之方法，其中前述蛇菊醇糖苷為蛇菊醇雙糖苷、蛇菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F或此等之組合。

藉由利用本發明之蛋白質及編碼該蛋白質之聚核苷酸，可高效率地製造蛇菊醇糖苷(例如，蛇菊醇雙糖苷及蛇菊苷 等)。又，本發明之轉形體，由於蛇菊醇糖苷(例如，蛇菊醇雙糖苷及蛇菊苷等)之含量高，所以可效率良好地從此等轉形體萃取/精製蛇菊醇糖苷(例如，蛇菊醇雙糖苷及蛇菊苷等)。

又，藉由使本發明之蛋白質及編碼該蛋白質之聚核苷酸，與其他蛇菊醇糖基轉移酶或編碼該酵素之聚核苷酸在相同宿主細胞內共表現，可製作更高度配糖化之蛇菊醇糖苷(例如，萊鮑迪苷A及萊鮑迪苷B等)。

第1圖：展現蛇菊醇糖苷群之名稱及構造。第1圖中，「Glc-Glc(β 2→1)」表示「Glc-Glc」藉由β 2→1糖苷鍵鍵結，「Glc-Glc(β 3→1)」表示「Glc-Glc」藉由β 3→1糖苷鍵鍵結。

第2圖：展現推定之蛇菊醇糖苷之生合成途徑。

第3圖：在大腸菌中所表現之蛇菊UGT蛋白質之SDS-PAGE結果。左為顆粒部分，右為藉由咪唑溶液溶出之部分之CBB染色圖。星號表示經表現之重組蛋白質。

第4圖：展現UGT91D樣蛋白3(UGT91D-like3)之酵素活性。

第5圖：展現導入有UGT85C2、UGT91D樣蛋白3、UGT74G1及UGT76G1基因之重組酵母之培養液的LC-MS分析結果。

第6圖：展現重組蛋白質之表現之圖。藉由西方轉漬法(Western blotting)檢測重組蛋白質時，可確認UGT91D樣蛋白3及UGT91D2e分別以His標籤(HisTag)融合蛋白質之形式表現。由於UGT91D2e短少12個胺基酸，可見到比UGT91D樣蛋白3之尺寸略小之帶。

第7圖：展現UGT91D同源性酵素之N末端部分序列之對齊(alignment)。從上算起為UGT91D1、UGT91D樣蛋白3、UGT91D2e之胺基酸序列。星號(＊)對應於組織胺酸殘基(VvGT1_His20)之位置，該組織胺殘基係來自葡萄之糖轉移酵素VvGT1之觸媒活性所必需者。

以下，將詳細地說明本發明。以下之實施態樣，係用於說明本發明之例示，本發明之旨趣並非僅只限定於該實施態樣。本發明在不超脫其要旨之範圍，可以各式各樣之態樣實施。

再者，在本說明書中所引用之所有文獻、及公開公報、專利公報或其他專利文獻係做為參照，並編入本說明書中。又，本說明書包含2012年3月16日所申請，為本申請案優先權主張基礎之日本國專利申請案(日本特願2012-60473號)之說明書及圖式記載之內容。

本發明人等最先闡明負責蛇菊醇糖苷13位之葡萄糖之糖附加反應的酵素蛋白質為UGT91D樣蛋白3。

UGT91D樣蛋白3之CDS序列及推定胺基酸序列分別為序列編號1及2。前述聚核苷酸及酵素可依照後述之實施例中記載之手法、公知之基因工學手法、公知之合成手法等而取得。

1.蛇菊醇糖基轉移酶

本發明提供一種選自以下(a)至(c)所構成之組群之任一者所記載之蛋白質(以下，稱為「本發明之蛋白質」)：(a)包含序列編號2之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入及 /或附加1至48個胺基酸之胺基酸序列，且具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性的蛋白質；(c)具有與序列編號2之胺基酸序列90%以上序列相同性之胺基酸序列，且具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性的蛋白質； (式中，R₁表示H、C₁至C₂₀烷基、C₂至C₂₀烯基、C₂至C₂₀炔基、C₄至C₂₀鏈二烯基、C₆至C₁₈芳基、C₆至C₂₀烷芳基、C₆至C₂₀芳烷基、C₄至C₂₀環烷基、C₄至C₂₀環烯基、(C₃至C₁₀環烷基)C₁至C₁₀烷基或糖殘基)。

在上述(b)或(c)中所記載之蛋白質，雖然以天然存在之序列編號2之多肽的變異體為代表，不過亦包含，例如，使用在"Sambrook & Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons 1987-1997"、"Nuc.Acids.Res.,10,6487(1982)"、"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)"、"Gene,34,315(1985)"、"Nuc.Acids.Res.,13,4431(1985)"、"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)"等中所記載之部位特異性變異導入法，而能以人為方式取得者。

在本說明書中，就「包含在序列編號2之胺基酸序 列中，刪除、置換、插入及/或附加1至48個胺基酸之胺基酸序列，且具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性的蛋白質」而言，可列舉：包含在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入及/或附加，例如，1至48個、1至47個、1至46個、1至45個、1至44個、1至43個、1至42個、1至41個、1至40個、1至39個、1至38個、1至37個、1至36個、1至35個、1至34個、1至33個、1至32個、1至31個、1至30個、1至29個、1至28個、1至27個、1至26個、1至25個、1至24個、1至23個、1至22個、1至21個、1至20個、1至19個、1至18個、1至17個、1至16個、1至15個、1至14個、1至13個、1至12個、1至11個、1至10個、1至9個(1至數個)、1至8個、1至7個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、1至2個、或1個胺基酸殘基之胺基酸序列，且具有在通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性的蛋白質。一般而言，上述胺基酸殘基之刪除、置換、插入及/或附加之數目越小越好。

又，就此種蛋白質而言，可列舉：具有與序列編號2之胺基酸序列有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、或99.9%以上序列相同性之胺基酸序列，且具有在通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性的蛋白質。一般而言，上述序列相同性之數值越大越好。

其中，「在通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附 加糖分子之活性」，意指在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖基上附加糖之活性：

在通式(I)中，Glc表示葡萄糖殘基。又，在通式(I)中，R₁表示H、C₁至C₂₀烷基、C₂至C₂₀烯基、C₂至C₂₀炔基、C₄至C₂₀鏈二烯基、C₆至C₁₈芳基、C₆至C₂₀烷芳基、C₆至C₂₀芳烷基、C₄至C₂₀環烷基、C₄至C₂₀環烯基、(C₃至C₁₀烷基)C₁至C₁₀烷基或糖殘基。

在本說明書中，「C₁至C₂₀烷基」以C₁至C₁₀烷基為較佳，以C₁至C₆烷基為更佳。就烷基之例子而言，雖無限制，惟可列舉：甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、二級丁基、三級丁基、戊基、己基、十二烷基等。

在本說明書中，「C₂至C₂₀烯基」以C₂至C₁₀烯基為較佳，以C₂至C₆烯基為更佳。就烯基之例而言，雖無限制，惟可列舉：乙烯基、烯丙基、丙烯基、異丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基烯丙基、2-丁烯基等。

在本說明書中，「C₂至C₂₀炔基」以C₂至C₁₀炔基為較佳，以C₂至C₆炔基為更佳。就炔基之例子而言，雖無限制，惟可列舉：乙炔基、2-丙炔基、2-丁炔基等。

在本說明書中，「C₄至C₂₀鏈二烯基」以C₄至C₁₀鏈二烯基為較佳，以C₄至C₆鏈二烯基為更佳。就鏈二烯基之例子而 言，雖無限制，惟可列舉：1,3-丁二烯基等。

在本說明書中，「C₆至C₁₈芳基」以C₆至C₁₀芳基為較佳。就芳基之例子而言，雖無限制，惟可列舉：苯基、1-萘基、2-萘基、茚基、聯苯基、蒽基、菲基等。

在本說明書中，「C₆至C₂₀烷芳基」以C₆至C₁₂烷芳基為較佳。就烷芳基之例子而言，雖無限制，惟可列舉：鄰-甲苯基、間-甲苯基、對-甲苯基、2,3-二甲苯基、2,4-二甲苯基、2,5-二甲苯基、鄰-異丙苯基、間-異丙苯基、對-異丙苯基、三甲苯基等。

在本說明書中，「C₆至C₂₀芳烷基」以C₆至C₁₂芳烷基為較佳。就芳烷基之例子而言，雖無限制，惟可列舉：苯甲基、苯乙基、二苯基甲基、三苯基甲基、1-萘基甲基、2-萘基甲基、2,2-二苯基乙基、3-苯基丙基、4-苯基丁基、5-苯基戊基等。

在本說明書中，「C₄至C₂₀環烷基」以C₄至C₁₀環烷基為較佳。就環烷基之例子而言，雖無限制，惟可列舉：環丙基、環丁基、環戊基、環己基等。

在本說明書中，「C₄至C₂₀環烯基」以C₄至C₁₀環烯基為較佳。就環烯基之例子而言，雖無限制，惟可列舉環丙烯基、環丁烯基、2-環戊烯-1-基、2-環己烯-1-基、3-環己烯-1-基等。

在本說明書中，就「(C₃至C₁₀環烷基)C₁至C₁₀烷基」之例子而言，可列舉：甲基環丙基、乙基環丙基、甲基環丁基、乙基環戊基、甲基環己基等。

在本說明書中，「糖殘基」雖沒有特別限定，然而只要為1個以上之五碳糖、六碳糖或其組合所構成之糖之殘基即可 (排除木糖、鼠李糖或其組合)。

就五碳糖(排除木糖、鼠李糖或其組合)之例子而言，可列舉：核糖、阿拉伯糖及來蘇糖，就六碳糖之例子而言，可列舉：阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、葡萄糖、甘露糖、古羅糖(gulose)、艾杜糖(idose)、半乳糖、塔羅糖(talose)。

「糖殘基」為包含1個以上之六碳糖單元之糖之殘基，係以葡萄糖單體(-Glc)或葡萄糖二聚體(-Glc-Glc)之糖殘基為更佳。在葡萄糖二聚體之糖殘基中，以葡萄糖彼此以β 2→1糖苷鍵來鍵結為較佳。

通式(I)之化合物係以蛇菊醇單糖苷或甜茶苷為較佳。

藉由本發明之蛋白質在通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖所附加之糖分子，並無特別限定，只要為包含1個以上之五碳糖、六碳糖或其組合之糖分子即可(排除木糖、鼠李糖或其組合)。五碳糖及六碳糖之例子係如同上述。前述糖分子係以六碳糖為較佳，係以選自葡萄糖、甘露糖及半乳糖所構成之組群之六碳糖為更佳。前述糖分子係以葡萄糖為最佳。

在通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性，可藉由在含有1至500ng(較佳為50至200ng，最佳為100ng)之受檢蛋白質、1至1000μM(較佳為100至700μM，最佳為500μM)之UDP糖(例如，UDP-葡萄糖)、及1至500μM(較佳為100至500μM，最佳為250μM)之基質化合物(通式(I)之化合物)之pH6.0至8.0之中性領域緩衝液(例如，磷酸鈉緩衝液或磷酸鉀緩衝液)中，於20至40℃之溫度下進行10分鐘至2小時培育 後，將前述基質化合物精製，並將經精製之單萜烯以液相層析-質譜分析(LC-MS，即Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)等公知手法分析進行驗證。

LC-MS分析之結果，通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之化合物被檢出時，即可謂前述被檢蛋白質為具有在通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性者。

一般而言，前述糖附加反應為約1分鐘至12小時結束。

在本發明之蛋白質的胺基酸序列中刪除、置換、插入及/或附加1個或複數個胺基酸殘基，意指在相同序列中之任意1個或複數個胺基酸序列中之位置有1個或複數個胺基酸殘基被刪除、置換、插入及/或附加，在刪除、置換、插入及附加之中可2種以上同時發生。

以下，表示可互相取代之胺基酸殘基之例子。同一群所含之胺基酸殘基可互相取代。A群：白胺酸、異白胺酸、降白胺酸、纈胺酸、降纈胺酸、丙胺酸、2-胺基丁酸、甲硫胺酸、鄰-甲基絲胺酸、三級丁基甘胺酸、三級丁基丙胺酸、環己基丙胺酸；B群：天冬胺酸、麩胺酸、異天冬胺酸、異麩胺酸、2-胺基己二酸、2-胺基辛二酸；C群：天冬醯胺酸、麩醯胺酸；D群：離胺酸、精胺酸、鳥胺酸、2,4-二胺基丁酸、2,3-二胺基丙酸；E群：脯胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸；F群：絲胺酸、酥胺酸、升絲胺酸；G群：苯基丙胺酸、酪胺酸。

本發明之蛋白質，雖可藉由使編碼該蛋白質之聚核 苷酸(參照後述之「本發明之聚核苷酸」)於適當之宿主細胞內表現而得到，然而亦可藉由Fmoc法(芴基甲基氧基羰基法)、tBoc法(三級丁基氧基羰基法)等化學合成法而製造。又，亦可利用Advanced Automation Peptide Protein Technologies公司製、Perkin Elmer公司製、Protein Technologies公司製、PerSeptive公司製、Applied Biosystems公司製、SHIMADZU公司製等肽合成機進行化學合成。

2.蛇菊醇糖苷之製造方法

藉由利用本發明之蛋白質所具有之在通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性，可容易且大量地製造蛇菊醇糖苷。

在其他實施態樣中，本發明提供蛇菊醇糖苷之第1製造方法，其包含：使本發明之蛋白質與UDP-糖，及下述通式(I)所示之化合物反應，而在通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之步驟。

通式(I)之Glc及R₁之定義如同前述。通式(I)之化合物係以蛇菊醇單糖苷或甜茶苷為較佳。

在本說明書中，「UDP-糖」意指尿苷二磷酸(uridine diphosphate：UDP)結合型之糖。就UDP-糖中之糖部分之較佳例而 言，可列舉包含1個以上之五碳糖(木糖除外)、六碳糖或其組合之糖。五碳糖(木糖除外)及六碳糖之例子如同上述。UDP-糖較佳為UDP-六碳糖，更佳為選自葡萄糖、甘露糖及半乳糖所構成之組群之六碳糖。前述UDP-糖最佳為UDP-葡萄糖。

根據本發明之蛇菊醇糖苷之第1製造方法包含使本發明之蛋白質，與UDP糖，及通式(I)所示之化合物反應，而在通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子的步驟。本發明之第1製造方法可進一步包含將在前述步驟中所生成之蛇菊醇糖苷精製的步驟。

就依照第1製造方法所生成之蛇菊醇糖苷之例子而言，可列舉蛇菊醇雙糖苷、蛇菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F或此等之組合，然而並不限定此等。

所生成之蛇菊醇糖苷，可用適當溶劑(水等水性溶劑或醇類、醚類及丙酮類等有機溶劑)萃取，並藉由利用乙酸乙酯或其他有機溶劑：水之梯度進行高效能液相層析(High Performance Liquid Chromatography：HPLC)、氣相層析、飛行時間質譜術(Time-of-Flight mass spectrometry：TOF-MS)、超高效能液相層析(Ultra(High)Performance Liquid chromatography：UPLC)等公知方法來精製。

3.蛇菊醇糖苷含量高之非人類轉形體

蛇菊醇糖苷，亦可使用本發明之蛋白質，在細菌(大腸菌或酵母等)、植物、昆蟲、排除人類之哺乳動物等之細胞內生成。本發明之蛋白質，由於為來自蛇菊之酵素或其變異體，可期 待在細胞內環境亦具有高活性。此種情況，藉由將編碼本發明蛋白質的聚核苷酸(參照後述之「本發明之聚核苷酸」)，導入來自細菌、植物、昆蟲、排除人類之哺乳動物等之宿主細胞，而使本發明之蛋白質表現，使本發明之蛋白質與前述細胞內所存在之UDP-糖及通式(I)所示之化合物反應，即可生成蛇菊醇糖苷。

再者，本發明提供一種非人類轉形體(以下，稱為「本發明之轉形體」)，其係導入有選自以下(a)至(e)所構成之組群之任一者中所記載之聚核苷酸(以下，稱為「本發明之聚核苷酸」)：(a)含有序列編號1之鹼基序列的聚核苷酸；(b)編碼包含序列編號2之胺基酸序列之蛋白質的聚核苷酸；(c)編碼包含在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入、及/或附加1至48個胺基酸之胺基酸序列，且具有在通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性之蛋白質的聚核苷酸；(d)編碼具有與序列編號2之胺基酸序列90%以上序列相同性之胺基酸序列，且具有在通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性之蛋白質的聚核苷酸；以及(e)在高度嚴苛條件下與包含與序列編號1之鹼基序列為互補之鹼基序列之聚核苷酸可雜交的聚核苷酸，且係編碼具有在通式 (I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性之蛋白質的聚核苷酸。

通式(I)之定義及具體例係如前文所述，又，「在通式(I)所示之化合物之13位附加之糖分子」的定義及具體例亦係如前述。

在本說明書中，「聚核苷酸」意指DNA或RNA。

在本說明書中，「在高度嚴苛條件下可雜交之聚核苷酸」意指，例如，藉著以包含與序列編號1之鹼基序列為互補之鹼基序列的聚核苷酸、或包含編碼序列編號2之胺基酸序列之鹼基序列的聚核苷酸之全部或一部分做為探針，並使用菌落(colony)雜交法、噬菌斑(plaque)雜交法或南方氏(Southern)雜交法等所得到的聚核苷酸。就雜交之方法而言，可利用例如在"Sambrook & Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor,Laboratory Press 2001"及"Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons 1987-1997"等中所記載之方法。

在本說明書中，「高度嚴苛條件」意指，例如，(1)5×SSC、5×登哈特溶液(Denhardt’s solution)、0.5%SDS、50%甲醯胺、50℃；(2)0.2 x SSC、0.1% SDS、60℃；(3)0.2 x SSC、0.1% SDS、62℃；(4)0.2 x SSC、0.1% SDS、65℃；或(5)0.1 x SSC、0.1% SDS、65℃之條件，然而並不以此等為限。此等條件中，越提高溫度，可期待越能有效地得到具有高度序列相同性之DNA。但是，就影響雜交之嚴苛度之要素而言，被認為有溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等複數種要素，本技術領域人士藉 著適宜選擇此等要素，即可實現同樣之嚴苛度。

再者，於雜交時使用市售套組之情況，例如可使用Alkphos直接標記及檢測系統(Alkphos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare))。此種情況，依照隨附於套組內之規程(protocol)，與經標識之探針進行一夜培育後，將膜(membrane)於55至60℃之條件下，用含有0.1%(w/v)SDS之1次洗淨緩衝液洗淨後，可檢測出雜交之DNA。或者，根據與序列編號1之鹼基序列為互補的鹼基序列，或與編碼序列編號2之胺基酸序列之鹼基序列之全部或一部分為互補的序列來製作探針時，於使用市售之試藥(例如，PCR標記混合物(Roche．Diagnostics公司)等)並將該探針以地高辛(digoxigenin)(DIG)標識之情況中，可使用DIG核酸檢測套組(Roche．Diagnostics公司)來檢測雜交。

就上述以外之可雜交之聚核苷酸而言，可列舉藉由FASTA、BLAST等同源性檢索軟體，使用預設參數(default parameters)計算時，具有與序列編號1之DNA、或編碼序列編號2之胺基酸序列之DNA有80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、或99.9%以上之序列相同性的DNA。

再者，胺基酸序列或鹼基序列之序列相同性，可使用FASTA(Science 227(4693)：1435-1441,(1985))或Kalin及Altschul產生之演算法BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268,1990；Proc Natl Acad Sci USA 90：5873,1993)來決定。根據BLAST之演算法之被稱為blastn、blastx、blastp、tblastn或tblastx之程式已被開發(Altschul SF,et al：J Mol Biol 215：403,1990)。在使用blastn解析鹼基序列之情況，參數例如為：分數(score)=100、字長(wordlength)=12。又，使用blastp解析胺基酸序列之情況，參數為例如分數=50、字長=3。使用BLAST及Gapped BLAST程式之情況，係使用各程式之預設參數。

上述之本發明之聚核苷酸，可藉由公知之基因工程手法或公知之合成手法而取得。

本發明之聚核苷酸，以呈插入適當表現載體之狀態導入宿主中為較佳。

適當之表現載體，通常係以包含下列(i)至(iii)之方式構成：(i)在宿主細胞內可轉錄之啟動子；(ii)結合於該啟動子之本發明聚核苷酸；及(iii)與RNA分子之轉錄終結及多腺苷酸化(polyadenylation)相關，且以於宿主細胞內可發揮功能之信息做為構成要素的表現盒(cassette)。

就表現載體之製作方法而言，可列舉使用質體、噬菌體或黏粒(cosmid)等之方法，然而無特別限定。

對於載體之具體種類無特別限定，可適宜地選擇在宿主細胞中能表現之載體。亦即，只要依據宿主細胞之種類，選擇可用來使本發明之聚核苷酸確實表現之適當啟動子序列，並以 其與本發明之聚核苷酸組入各種質體等而得之載體做為表現載體即可。

本發明之表現載體含有表現控制區域(例如，啟動子、終結子及/或複製起點等)，該表現控制區域係依要導入該表現載體之宿主之種類而定。就細菌用表現載體之啟動子而言，可使用慣用之啟動子(例如，trc啟動子、tac啟動子、lac啟動子等)；就酵母用啟動子而言，可列舉如：GAL1啟動子、GAL10啟動子、甘油醛3-磷酸去氫酶啟動子、PH05啟動子等；就絲狀真菌用啟動子而言，可列舉如：澱粉酶(amylase)、trpC等。又，就在植物細胞內用於表現目的基因之啟動子之例子而言，可列舉：花椰菜花葉病毒之35S RNA啟動子、rd29A基因啟動子、rbcS啟動子、將前述花椰菜花葉病毒之35S RNA啟動子之增強子序列附加於來自農桿菌(agrobacterium)之甘露鹼(mannopine)合成酶啟動子序列之5’側而得的mac-1啟動子等。就動物細胞宿主用啟動子而言，可列舉：病毒性啟動子(例如，SV40初期啟動子、SV40後期啟動子等)。

表現載體以含有至少1個選擇標記(marker)為較佳。就此等標記而言，可利用營養要求性標記(ura5、niaD、TRP1、URA3、HIS3、LEU2)、藥劑耐性標記(潮黴素(hygromycine)、抗菌素(zeocin))、遺傳黴素(geneticin)耐性基因(G418r)、銅耐性基因(CUP1)(Marin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.81,p.337,1984)、淺藍菌素(cerulenin)耐性基因(fas2m,PDR4)(分別參考猪腰淳嗣等，生化學，vol.64,p.660,1992；Hussain et al.,Gene,vol.101,p.149,1991)等。

本發明之轉形體的製作方法(生產方法)雖無特別限定，惟可列舉如：將含有本發明之聚核苷酸的表現載體導入宿主，進行轉形之方法。

本發明之轉形體，可期待以高效率生產蛇菊醇糖苷。使用於轉形之宿主細胞，無特別限定，可適宜地使用公知之各種細胞。例如，就宿主細胞之例子而言，可列舉大腸菌(Escherichia coli)等細菌、酵母(出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe)、植物細胞、人類除外之動物細胞等。

較佳之宿主細胞為可生成通式(I)所示之化合物之宿主細胞。其中，宿主細胞不限定於以天然狀態生成通式(I)所示之化合物者，亦可為例如以公知之基因重組操作，生成通式(I)所示之化合物者。

就編碼主導通式(I)所示之化合物之合成之酵素的基因而言，可列舉EK13H、UGT74G1及UGT76G1(非專利文獻2)等公知者，然而並不以此等為限。

在宿主細胞為無法生成通式(I)所示之化合物者之情況，藉由在該宿主細胞中導入本發明基因所得到之轉形體的培養系中添加通式(I)之化合物或含有該化合物之植物萃取物做為基質，即使未導入編碼主導通式(I)所示之化合物合成之酵素的基因，仍可製造蛇菊醇糖苷。

再者，藉由使用導入編碼糖基轉移酶之基因的宿主細胞(該糖基轉移酶係參與從蛇菊醇至萊鮑迪苷A為止之一連串糖苷之合成者)，並使本發明之聚核苷酸在該宿主細胞中表現，即 可製作經更高度配糖化之蛇菊醇糖苷(例如，蛇菊醇雙糖苷、萊鮑迪苷A、蛇菊苷及萊鮑迪苷B等)。就參與從蛇菊醇至萊鮑迪苷A為止之一連串糖苷合成之糖基轉移酶及其基因之例子而言，可列舉UGT85C2(CDS序列：序列編號5；胺基酸序列：序列編號6)、UGT74G1(CDS序列：序列編號7；胺基酸序列：序列編號8)、UGT76G1(CDS序列：序列編號9；胺基酸序列：序列編號10)等。

用於上述宿主細胞之適當培養基及條件為此領域中所周知。又，成為轉形對象之生物亦無特別限定，可列舉在上述宿主細胞中所例示之各種微生物或植物或人類以外之動物。

就宿主細胞之轉形方法而言，可利用一般所使用之公知方法。例如，可藉由電穿孔(electroporation)法(Mackenxie,D.A.et al.,Appl.Environ.Microbiol.,vol.66,p.4655-4661,2000)、粒子輸送(particle delivery)法(特開2005-287403)、球狀質體(spheroplast)法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.75,p.1929,1978)、乙酸鋰法(J.Bacteriology,vol.153,p.163,1983)、Methods in yeast genetics,2000 Edition：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等記載之方法)來實施，不過不以此等為限。

此外，關於一般分子生物學之手法，可參照"Sambrook & Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor,NY)"等。

藉由培養以此種方式所得到之轉形體，可使轉形體生產蛇菊醇糖苷。如前述，藉由在轉形體之培養系中，添加通式 (I)之化合物或含有該化合物之植物萃取物做為基質，亦可促進蛇菊醇糖苷之製造。藉由萃取/精製所蓄積之蛇菊醇糖苷，可得到目的之蛇菊醇糖苷。

因此，本發明提供蛇菊醇糖苷之第2製造方法，其特徵為使用本發明之轉形體。適當之培養基及條件係該領域所周知。又，關於蛇菊醇糖苷之萃取/精製方法，係如同已述者。

蛇菊醇糖苷，雖無特別限定，惟係以選自蛇菊醇雙糖苷、蛇菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F及此等之組合所構成之組群者為較佳。

在本發明之1個態樣中，轉形體可為植物轉形體。根據本實施態樣之植物轉形體，可藉由將含有本發明之聚核苷酸的重組載體，以可使該聚核苷酸所編碼之多肽表現之方式導入植物中而取得。

使用重組表現載體之情況，於植物體之轉形時所使用之重組表現載體，只要為在該植物體內可使本發明之聚核苷酸表現之載體即可，無特別限定。就此種載體而言，可列舉如：具有在植物細胞內使聚核苷酸持續性表現(constitutively-expressing)之啟動子的載體，或具有被外在刺激誘導而活化之啟動子的載體。

就在植物細胞內使聚核苷酸持續性表現之啟動子之例而言，可列舉花椰菜花葉病毒之35S RNA啟動子、rd29A基因啟動子、rbcS啟動子、mac-1啟動子等。

就被外在刺激誘導而活化之啟動子之例子而言，可列舉鼠乳房瘤病毒(MMTV)啟動子、四環素應答性啟動子、金屬硫 蛋白啟動子及熱休克蛋白啟動子等。

在本發明中為轉形對象之植物意指植物體整體、植物器官(例如葉、花卉、莖、根、種子等)、植物組織(例如表皮、篩部、薄壁組織(parenchyma)、木質部、維管束、柵狀組織、海綿狀組織等)或植物培養細胞，或者各種形態之植物細胞(例如，懸浮培養細胞)、原生質體、葉之切片、癒合組織等之任一種。就使用於轉形之植物而言，無特別限定，只要為屬於單子葉植物綱或双子葉植物綱之植物之任一種即可。

基因對植物之導入，可使用本技術領域人士公知之轉形方法(例如，農桿菌法、基因槍法、PEG法、電穿孔法等)。例如，經由農桿菌之方法及直接導入植物細胞之方法為眾所周知。使用農桿菌法之情況，將所構築之植物用表現載體導入適當之農桿菌(例如，根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens))，依照葉片圓盤(leaf disc)法(內宮博文著，植物基因操作手冊(1990)27至31頁，講談社(Scientific)，東京)等，使無菌培養葉片感染此農桿菌株，即可得到轉形植物。又，可使用Nagel等人之方法(Micribiol.Lett.,67：325(1990))。該方法首先將例如表現載體導入農桿菌，繼而，藉由在Plant Molecular Biology Manual(Gelvin,S.B.et al.,Academic Press Publishers)中所記載之方法將已轉形之農桿菌導入植物細胞或植物組織之方法。其中，所謂的「植物組織」包含藉由植物細胞之培養所得到之癒合組織。在使用農桿菌法進行轉形之情況中，可使用二元(binary)載體(pBI121或pPZP202等)。

又，就將基因直接導入植物細胞或植物組織之方法而言，已知有電穿孔法、粒子槍法。使用粒子槍之情況，可原樣 使用植物體、植物器官、植物組織本身，可於調製切片後使用，也可調製原生質體再使用。將以此種方式所調製之試料使用基因導入裝置(例如PDS-1000(BIO-RAD公司)等)進行處理。處理條件雖隨植物或試料而異，然而通常係以約450至2000psi之壓力，約4至12cm之距離進行。

將經導有基因之細胞或植物組織，首先以潮黴素耐性等藥劑耐性進行選擇，繼而依照標準法，於植物體中再生。從轉形細胞至植物體之再生，可視植物細胞之種類，以本技術領域人士公知之方法進行。

使用植物培養細胞做為宿主之情況，轉形可將重組載體藉由基因槍、電穿孔法等導入培養細胞中。轉形之結果所得到之癒合組織或芽、毛狀根等，可原樣使用於細胞培養、組織培養或器官培養，又，可使用先前已知之植物組織培養法，藉由適當濃度之植物荷爾蒙(生長激素(auxin)、細胞分裂素、赤黴素、脫落酸(abscisic acid)、乙烯、芸苔素內酯(brassinolide)等)的投與等，於植物體中再生。

本發明之聚核苷酸是否導入植物之確認，可藉由PCR法、南方雜交法、北方雜交法等而進行。例如，從轉形植物調製DNA，設計DNA特異性引子，進行PCR。PCR可藉由與用於調製前述質體所使用之條件同樣之條件進行。然後，針對增幅產物進行瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯醯胺凝膠電泳或毛細管電泳等，藉由溴化乙錠(ethydium bromide)、SYBR Green液等染色，接著藉由檢測為1條區帶之增幅產物，即可確認轉形。又，使用預先藉由螢光色素等標識之引子進行PCR，亦可檢測增幅產物。再 者，亦可採用：使增幅產物結合於微量盤(microplate)等固相上，並藉由螢光或酵素反應等確認增幅產物之方法。

於基因組內組入有本發明之聚核苷酸之轉形植物體，若一旦取得，可藉由該植物體之有性生殖或無性生殖得到後代。又，從該植物體或其後代、或此等之純系，得到，例如，種子、果實、切穂、塊莖、塊根、殘枝、癒合組織、原生質體等，可基於此等而將該植物體量產。因此，在本發明中亦包含：以可表現方式導入本發明之聚核苷酸之植物體、或與該植物體具有相同性質之該植物體的後代、或來自此等之組織。

又，對各種植物之轉形方法已被報導。就有關本發明之轉形體植物而言，可列舉：茄科植物(例如，茄子、番茄、辣椒、馬鈴薯、煙草、曼陀羅、酸漿、矮牽牛、萬鈴花、賽亞麻等)、豆科植物(例如，大豆、小豆、花生、四季豆、蠶豆、百脈根等)、薔薇科植物(例如，草莓、梅子、櫻桃、玫瑰、藍莓、黑苺、覆盆子、黑醋栗、樹莓、甜茶等)、石竹科植物(康乃馨、滿天星等)、菊科植物(菊、非洲菊、向日葵、雛菊、蛇菊等)、蘭科植物(蘭等)、櫻草科植物(仙客來等)、龍膽科植物(桔梗、龍膽草等)、鳶尾科植物(小蒼蘭、鳶尾、劍蘭等)、玄參科植物(金魚草、藍豬耳等)、景天科(長壽花)、百合科植物(百合、鬱金香等)、旋花科植物(牽牛花、楓旋花、月光花、紅薯、賽普拉斯藤、土丁桂等)、繡球花科植物(繡球花、密蒙花等)、瓜科植物(葫蘆等)、萬年蘚科植物(香葉、天竺葵等)、木犀科植物(連翹等)、葡萄科植物(例如，葡萄等)、山茶花科植物(山茶花、茶樹等)、稻科植物(例如，稻米、大麥、小麥、燕麥、黑麥、玉米、小米、稗、高粱、甘蔗、竹、燕麥、 四石稗、高粱、茭白、鳩麥、牧草等)、桑科植物(桑樹、啤酒花、楮樹、橡膠樹、麻等)、茜草科植物(咖啡樹、梔子花等)、櫸科植物(小橡樹、櫸木、柏樹等)、芝麻科植物(芝麻等)、芸香科植物(例如，酸橘、柚子、溫州蜜柑、日本辣椒)及十字花科植物(紅白菜、甘藍、蘿蔔、白茄菜、油菜、白菜、西蘭花、花椰菜等)、紫蘇科(鼠尾草、紫蘇、薰衣草、露珠草等)。就轉形對象植物而言，特佳之例以使用已知以蛇菊醇做為配質(aglycone)來生合成各種糖苷之植物，就此種植物而言，可列舉蛇菊或甜茶(Rubus suauissimus)等。

以本發明之聚核苷酸轉形之植物體(以下，稱為「本發明之植物」或「本發明之植物體」)，在具有適當基質之情況或從外部添加適當基質之情況，與其野生型相比，可更大量生產蛇菊醇糖苷。

本發明之植物係藉由培育本發明之植物之種子、插枝、球根等，可容易地得到完全的植物體。

因此，本發明之植物包含植物體整體、植物器官(例如葉、花卉、莖、根、種子、球根等)、植物組織(例如表皮、篩部、薄壁組織、木質部、維管束、柵狀組織、海綿狀組織等)或植物培養細胞、或者各種形態之植物細胞(例如，懸浮培養細胞)、原生質體、葉之切片、癒合組織等。

4.轉形體之萃取物及其利用

又，本發明在其他實施態樣中，提供上述轉形體的萃取物。本發明之轉形體，在具有適當基質之情況或者從外部添加適當基質之情況，由於與其野生型相比，蛇菊醇糖苷含量較高， 所以研判在其萃取物中，含有高濃度之蛇菊醇糖苷。

本發明之轉形體的萃取物，可藉由將轉形體使用玻璃珠粒、均質機或超音波破碎機等進行破碎，將該破碎物離心處理，回收其上清液而得到。再者，藉由如上所述之蛇菊醇糖苷之萃取方法，可進一步實施萃取步驟。

本發明之轉形體的萃取物，可依照常法，使用於例如食品、醫藥品、工業原料之製造等用途。

又，本發明在其他實施態樣中，提供包含本發明轉形體之萃取物的食品、醫藥、工業原料(食品等之原料)。含有本發明之轉形體之萃取物的食品、醫藥、工業原料的調製，係根據常法。如此，包含本發明之轉形體之萃取物的食品、醫藥、工業原料等，係含有使用本發明轉形體所生成之蛇菊醇糖苷。

就本發明之食品之例子而言，可列舉營養補助食品、健康食品、功能性食品、幼兒用食品、老人用食品等。在本說明書中，食品為固體、流體及液體、以及此等之混合物，為可攝食者之總稱。

營養補助食品意指強化特定營養成分的食品。健康食品意指健康性或有益健康之食品，包含營養補助食品、自然食品、減肥食品等。功能性食品意指用於補給擔任身體調節功能之營養成分的食品，與特定保健用途食品同義。幼兒用食品意指提供給約6歳以下小孩之食品。老人用食品意指以使消化及吸收變得比未經處理之食品容易之方式處理過的食品。

本發明之食品，係使用低熱量之蛇菊醇糖苷做為甜味料。因此，本發明之食品為低熱量，具有「可增進健康或維持 健康」之優點。

就此等食品之形態之例而言，可為：麵包、麵類、義大利麵、米飯、糕點類(蛋糕、冰淇淋、冰棒、甜甜圈、烘焙糕餅、糖果、口香糖、軟糖、糖果片、及丸子及包子等日式點心)、豆腐及其加工品等農產食品，清酒、藥用酒、味醂、食醋、醬油、味噌等發酵食品，優酪乳、火腿、培根、香腸等畜產食品，魚板、油炸物、碎魚蒸等水產食品，果汁飲料、清涼飲料、運動飲料、酒精飲料、茶等或調味料。就其他食品形態之例而言，可列舉：低熱量飲料、無糖飲料、水果罐頭、乳飲料、粉末飲料、優酪乳、果凍、調味汁、泡麵、醬菜、魚煮醬油、醬油、味噌、胡椒鹽、佛蒙特醋、甜醋醃辣韮、甜醋生薑、醋蓮藕、或醬菜、天婦羅及蒲燒之醬汁、烤肉醬、調味醬等、口香糖、糖果/糖飴、牙膏、醬炒魚球、煎蛋捲、炒麵醬、冷麵醬、鹽醋鯖魚、冰品、果子露、霜淇淋、魚泥製品、小點心、米菓、玉米杯、味附海苔、天婦羅渣、飯上調味粉等。

本發明之醫藥品(組成物)的劑型，無特別限定，可採取溶液狀、糊狀、凝膠狀、固體狀、粉末狀等任何劑型。又，本發明之醫藥組成物，除僅用於油、塗劑(lotion)、乳膏、乳液、凝膠、洗髮劑、潤髮劑、護髮素、琺瑯、粉底、口紅、粉餅、面膜(pack)、軟膏、撲粉、牙膏、氣霧劑(aerosol)、泡沫潔面劑(cleansing foam)等皮膚外用藥之外，可用於浴用劑、養毛劑、皮膚美容液、防曬劑等。

本發明之醫藥組成物，視需要可進一步含有其他醫藥活性成分(例如，消炎成分)或補助成分(例如，潤滑成分、載劑 (carrier)成分)。

5.篩選蛇菊醇糖苷含量高之植物的方法

本發明提供篩選蛇菊醇糖苷含量高之植物的方法。具體而言，前述方法包含以下(1)至(3)之步驟：

(1)從受檢植物萃取mRNA之步驟

(2)使前述mRNA或從前述mRNA調製之cDNA，與「可和包含與本發明之聚核苷酸為互補性鹼基序列之聚核苷酸於高度嚴苛條件下雜交之聚核苷酸」進行雜交的步驟

(3)檢測前述雜交之步驟。

上述步驟(1)可藉由從受檢植物萃取mRNA而進行。待萃取mRNA之受檢植物的部位，雖無特別限定，不過以花瓣為較佳。在萃取mRNA之情況，可藉由逆轉錄而從mRNA調製cDNA。

步驟(2)，可藉著以包含與本發明之聚核苷酸為互補之鹼基序列的聚核苷酸或寡核苷酸做為探針或引子，在高度嚴苛條件下使該探針或引子與上文所萃取之mRNA雜交而進行。高度嚴苛條件係如先前所述者。聚核苷酸或寡核苷酸之長度較佳為5至500bp，更佳為10至200bp，進一步更佳為10至100bp。聚核苷酸或寡核苷酸，可使用各種自動合成裝置(例如，AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare))輕易地合成，或者亦可委託第三者機關(例如，Promega公司或Takara公司)等來合成。

在步驟(2)中，於使用包含與本發明之聚核苷酸為互補之鹼基序列的聚核苷酸做為探針之情況中，步驟(3)可藉由通常之南方轉漬法(Southern blotting)、北方轉漬法(Northern blotting)(Sambrook,Fritsch and Maniatis,”Molecular Cloning：A Laboratory Manual”2nd Edition(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press)、微陣列(microarray)(Affymetrix公司；參照美國專利第6,045,996號、第5,925,525號、及第5,858,659號)、TaqMan PCR(Sambrook,Fritsch and Maniatis,”Molecular Cloning：A Laboratory Manual”2nd Edition(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press)、或螢光原位雜交(Fluorescent In Situ Hybridization(FISH))(Sieben V.J.et al.,(2007-06).IET Nanobiotechnology 1(3)：27-35)等雜交檢測方法而進行。另一方面，在步驟(2)中，使用包含與本發明之聚核苷酸為互補之鹼基序列的聚核苷酸做為引子之情況，步驟(3)可藉由進行PCR增幅反應，並將所得到之增幅產物藉由電泳或定序(Sambrook,Fritsch and Maniatis,”Molecular Cloning：A Laboratory Manual”2nd Edition(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press)等來解析，而檢測雜交。

被檢測出雜交較多之植物體，與其他植物體相比，由於表現較多的具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性的蛋白質，所以可預測蛇菊醇糖苷含量高。

實施例

以下，使用實施例更具體地說明本發明，不過本發明之範圍不受此等實施例限定。

[實施例1]蛇菊醇雙糖苷糖基轉移酶之候選基因的單離

在本實施例中所使用之分子生物學手法，只要未另外詳述，皆係依照在Molecular Cloning(Sambrook氏等，Cold Spring Harbour Laboratory Press,2001)中所記載之方法。

根據在蛇菊葉中所發現之糖基轉移酶基因之序列，藉由PCR進行基因探索。為了得到與UGT91D1(GENBANK登錄編號：AY345980)同源性高的基因，用下述之引子組(序列編號3及4)並以從蛇菊葉所調製之cDNA作為模板進行PCR，其中該UGT91D1在先前文獻(非專利文獻2)中被報導未見到對於蛇菊醇單糖苷具活性。

關於蛇菊葉cDNA，係藉由使用RNeasy植物迷你套組(QIAGEN)從蛇菊葉萃取總RNA，之後將其中之0.5μg以隨機寡-dT(Random Oligo-dT)引子進行逆轉錄(RT)反應而得到。

CACC-NdeI-SrUGT91D1-Fw(下方畫線部為NdeI識別部位)：5’-CACCCATATGTACAACGTTACTTATCATCA-3’(序列編號3)

BamHI-SrUGT91D1-Rv2(下方畫線部為BamHI識別部位)：5’-GGATCCTTAACTCTCATGATCGATGGCA-3’(序列編號4)

PCR反應液(50μl)係由1μl之來自蛇菊葉之cDNA、1×ExTaq緩衝液(TaKaRaBio)、0.2mM dNTPs、引子各0.4pmol/μl、2.5U之ExTaq聚合酶所成。PCR反應係於94℃反應3分鐘後，於94℃反應1分鐘，於50℃反應1分鐘，於72℃反應2分鐘，如此進行總計30個循環之增幅。PCR產物藉由0.8%瓊脂糖凝膠電泳並進行溴化乙錠染色，結果可從各個模板DNA得到被推定為約1.4kb大小之增幅帶。

將該PCR產物以製造業者推薦之方法次選殖(subcloning)入pENTR-TOPO定向載體(pENTR-TOPO Directional vector)(Invitrogen)中。使用DNA定序儀3100型(DNA Sequencer model 3100，Applied Biosystems)，藉由利用合成寡核苷酸引子之引子移步(primer walking)法決定序列。其結果明示存在4種與UGT91D1同源性高之基因。此等雖與已知之UGT91D1同源性高但為序列相異之新穎蛇菊UGT基因。為其中之一之UGT91D樣蛋白3係蛇菊之新穎UGT基因(CDS序列：序列編號1，胺基酸序列：序列編號2)，其與UGT91D1之同源性，就DNA層次(level)而言，為98%(27鹼基相異)，就胺基酸層次而言，為95%(18殘基相異)。

[實施例2]表現載體之構築

利用附加於引子之NdeI及BamHI限制酵素部位(序列編號3及4之下方畫線部)，切出約1.4kb之UGT91D樣蛋白3的開放閱讀框(open reading frame(ORF))斷片，將其連結至大腸菌表現載體pET15b(Novagen公司)之NdeI及BamHI部位(site)，得到包含本酵素基因之大腸菌表現載體。將在本載體NdeI部位上游之His標籤(tag)與UGT91D樣蛋白3基因之開放閱讀框合併，而設計成以UGT91D樣蛋白3與His標籤融合而成之嵌合(chimera)蛋白質之形式來表現。

[實施例3]重組蛋白質之表現及精製

為闡明本酵素之生化學功能，使本酵素在大腸菌中表現。使用上文所得到之UGT91D樣蛋白3大腸菌表現用質體，依照標準法，將大腸菌BL21(DE3)株轉形。將所得到之轉形體用4ml之含有50μg/ml之安比西林(ampicillin)的LB培養基(10g/L胰 蛋白腖(typtone pepton)，5g/L酵母萃取物，1g/L NaCl)，於37℃振盪培養一晚。將4ml達到靜止期之培養液接種於80ml之相同組成的培養基中，於37℃進行振盪培養。在菌體濁度(OD600)達到大約0.5之時點，添加終濃度0.5mM之IPTG，並於18℃振盪培養20小時。

以下所有操作係在4℃進行。所培養之轉形體藉由離心(5,000×g，10分鐘)集菌，每公克細胞添加1ml緩衝液S[20mM HEPES緩衝液(pH 7.5)，20mM咪唑，14mM β-巰基乙醇]，並懸浮。繼而，進行超音波破碎(15秒×8次)，及進行離心分離(15,000×g，15分鐘)。回收所得到之上清液做為粗酵素液。將粗酵素液加載於經緩衝液S平衡化之His SpinTrap(GE Healthcare)中，並離心(70×g，30秒)。以緩衝液洗淨後，藉由分別含有100mM及500mM咪唑之緩衝液S各5ml，階梯式地溶出與管柱結合之蛋白質。使用Microcon YM-30(Amicon)，將各溶出部分在20mM HEPES緩衝液((pH 7.5)、14mM β-巰基乙醇中進行緩衝液置換(透析倍率1000倍)。

由於SDS-PAGE分離後之CBB染色之結果，確認在500mM咪唑溶出部分中，於HisTag與UGT91D樣蛋白3融合而成之嵌合蛋白質之推定分子量約50kDa附近存在蛋白質，所以將該部分用於酵素解析(第3圖)。

[實施例4]UGT91D樣蛋白3之酵素活性測定

標準的酵素反應條件如以下所示。將反應液(2mM UDP-葡萄糖，0.1mM糖受體基質，100mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)，25μl之精製UGT91D樣蛋白3酵素溶液)以蒸餾水調製成 50μl，並於30℃反應1小時。將5μl之酵素反應液於下述條件進行LC-MS分析。

LC條件

管柱：Waters Sunfire C18 3.5um 2.0mm I.D.×20mm

移動相：A：MilliQ水(+0.05%甲酸)，B：MeCN

梯度：B濃度從15%至55%之直線濃度梯度(20分鐘)

流速：每分鐘0.2ml

管柱烘箱：40℃

MS條件

ESI(負模式)

所選擇之離子監測：m/z 317,479,641,687,803及849

藉由使UGT85C2與蛇菊醇(波峰A)反應，調製蛇菊醇單糖苷(波峰B)，使該蛇菊醇單糖苷與UGT91D樣蛋白3反應，結果發現新生成物(波峰C)(第4圖：第1格)。該波峰從保持時間及質譜碎片圖形(mass fragment pattern)判定為蛇菊醇雙糖苷。進一步使其與市售之甜茶苷(波峰D)反應時，得到新波峰E，從其保持時間及質譜碎片，可知為蛇菊苷(第4圖：第2格)。由於在使用經熱變性(99℃，3分鐘)而失活之UGT91D樣蛋白3的情況未生成該波峰E，可確認該波峰E為本酵素生成物(第4圖：第3格)。又，由於藉著酵素反應從蛇菊醇所調製之蛇菊醇單糖苷中含有少量之蛇菊醇(波峰A)(第4圖：第1格)，不過縱使令蛇菊醇(波峰A)與UGT91D樣蛋白3反應，亦未見到生成物(第4圖：第4格)，可確認UGT91D樣蛋白3具有將蛇菊醇單糖苷(波峰B)糖苷化，生成蛇菊醇雙糖苷(波峰C)之活性。又，以蛇菊醇雙糖苷為基質之情況， 未見到新生成物(第4圖：第5格)。再者，雖然蛇菊中蛇菊醇之13位葡萄糖之2位附加有木糖或鼠李糖之蛇菊醇糖苷為已知(第1圖)，然而UGT91D樣蛋白3並非以UDP-木糖做為糖提供體。從以上之結果，顯然可知UGT91D樣蛋白3為具有將蛇菊醇之13位上所附加之葡萄糖之2位特異地糖苷化之活性的新穎糖基轉移酶。

[實施例5]從蛇菊醇合成萊鮑迪苷A

從蛇菊所發現之UGT91D樣蛋白3，具有將蛇菊醇單糖苷之13位之葡萄糖之2位糖基化(2-O-糖基化)而生成蛇菊醇雙糖苷之活性，及將甜茶苷之13位之葡萄糖之2位糖基化(2-O-糖基化)而生成蛇菊苷之活性。由此顯然可知其係從蛇菊醇經4次糖基化反應至形成天然甜味料萊鮑迪苷A之生合成途徑中的糖基轉移酶(第2圖)。

實際上，為了驗證UGT85C2(CDS序列：序列編號5；胺基酸序列：序列編號6)、UGT91D樣蛋白3(CDS序列：序列編號1；胺基酸序列：序列編號2)、UGT74G1(CDS序列：序列編號7；胺基酸序列：序列編號8)、UGT76G1(CDS序列：序列編號9；胺基酸序列：序列編號10)4種之表現在萊鮑迪苷A之生合成中是否為十分必要，嘗試使此等4個糖基轉移酶(UGT)基因於酵母中表現。

各UGT基因係藉由下述之引子組，從來自蛇菊葉之cDNA進行PCR增幅。

UGT85C2基因增幅用引子組

CACC-NdeI-SrUGT85C2-Fw(下方畫線部為NdeI識別部位)： 5’-CACCCATATGGATGCAATGGCTACAACTGAGAA-3’(序列編號11)

BglII-SrUGT85C2-Rv(下方畫線部為BglII識別部位)：5’-AGATCTCTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTT-3’(序列編號12)

UGT91D樣蛋白3基因增幅用引子組

CACC-NdeI-SrUGT91D1-Fw(下方畫線部為NdeI識別部位)：5’-CACCCATATGTACAACGTTACTTATCATCA-3’(序列編號3)

BamHI-SrUGT91D1-Rv2(下方畫線部為BamHI識別部位)：5’-GGATCCTTAACTCTCATGATCGATGGCA-3’(序列編號4)UGT74G1基因增幅用引子組

CACC-NdeI-SrUGT74G1-Fw(下方畫線部NdeI識別部位)：5’-CACCCATATGGCGGAACAACAAAAGATCAAGAAAT-3’(序列編號13)

BamHI-SrUGT74G1-Rv(下方畫線部為BamHI識別部位)：5’-GGATCCTTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATT-3’(序列編號14)

UGT76G1基因增幅用引子組

CACC-NdeI-SrUGT76G1-Fw(下方畫線部為NdeI識別部位)：5’-CACCCATATGGAAAATAAAACGGAGACCA-3’(序列編號15)

BamHI-SrUGT76G1-Rv(下方畫線部BamHI識別部位)：5’-GGATCCTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTA-3’(序列編 號16)

PCR反應液(50μl)係由1μl之來自蛇菊葉之cDNA、1×KOD plus緩衝液(TOYOBO)、0.2mM dNTPs、0.4pmol/μl之各引子、1mM MgSO₄、1U耐熱性KOD plus聚合酶所組成。PCR反應為於95℃反應5分鐘後，進行於94℃ 0.5分鐘、於50℃ 0.5分鐘、於68℃ 2分鐘之反應，共計進行30個循環之增幅。將各PCR產物藉由0.8%瓊脂糖凝膠電泳，並進行溴化乙錠染色，結果可分別從模板DNA得到被推定為約1.4kb大小之增幅帶。

將該PCR產物以製造業者推薦之方法次選殖入pENTR-TOPO定向載體(Invitrogen)中。使用DNA定序儀3100型(Applied Biosystems)，藉由利用合成寡核苷酸引子之引子移步(primer walking)法決定序列，可確認目的UGT基因，亦即包括UGT85C2、UGT91D樣蛋白3、UGT74G1、UGT76G1之全部UGT基因均選殖成功。

為了將此等4種UGT基因組入酵母表現載體，設計下述之引子組。

SrUGT85C2組

Bgl2-UGT85C2-F(下方畫線部為BglII識別部位)：5’-ACAGATCTATGGATGCAATGGCTACAACTGAGA-3’(序列編號17)

Sal-UGT85C2-R(下方畫線部為SalI識別部位)：5’-TAGTCGACTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTTC-3’(序列編號18)

SrUGT91D樣蛋白3組

N0tI-UGT91DIL3-F(下方畫線部為NotI識別部位)：5’-AAGCGGCCGCATGTACAACGTTACTTATCATCAAAATTCAA A-3’(序列編號19)

Pac-UGT91D1L3-R(下方畫線部為PacI識別部位)：5’-CGTTAATTAACTCTCATGATCGATGGCAACC-3’(序列編號20)

SrUGT74G1組

Not-UGT74G1-F(下方畫線部為NotI識別部位)：5’-AAGCGGCCGCATGGCGGAACAACAAAAGATCAAG-3’(序列編號21)

Pac-UGT74G1-R(下方畫線部為PacI識別部位)：5’-CGTTAATTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATTCG-3’(序列編號22)

SrUGT76G1組

Bam-UGT76G1-F(下方畫線部為BamHI識別部位)：5’-AAGGATCCATGGAAAATAAAACGGAGACCACCG-3’(序列編號23)

Sal-UGT76G1-R(下方畫線部為SalI識別部位)：5’-GCGTCGACTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTAGAGACTC TAA-3’(序列編號24)

藉由下列組合：以UGT85C2做為模板，以SrUGT85C2組做為引子；以UGT91D樣蛋白3做為模板，以SrUGT91D樣蛋白3組做為引子； 以UGT74G1做為模板，以SrUGT74G1組作為引子；以UGT76G1做為模板，以SrUGT76G1組作為引子，使用耐熱性KOD DNA聚合酶(東洋紡)，藉由PCR增幅，分別在ORF之兩端附加限制酵素部位。將所得到之DNA斷片，使用Zero Blunt-TOPO PCR選殖套組(Invitrogen)進行次選殖，並使用DNA定序儀3100型(Applied Biosystems)，藉由利用合成寡核苷酸引子之引子移步法決定序列，確認可分別選殖目的UGT基因。

為了使用pESC酵母表現系統(Stratagene)，在酵母中同時表現上述4個UGT基因，而構築以下之表現載體。

(1)質體pESC-URA-UGT-1之構築

將UGT85C2以限制酵素BglII及限制酵素SalI切出，與將載體pESC-URA(Stratagene)以限制酵素BamHI及限制酵素SalI切斷者連結，得到質體pESC-URA-UGT-1。將該質體pESC-URA-UGT-1以限制酵素NotI及限制酵素PacI切斷者，與將UGT91D樣蛋白3以限制酵素NotI及限制酵素PacI切出者連結，得到pESC-URA-UGT-12。

(2)質體pESC-HIS-UGT-34之構築

將UGT76G1以限制酵素BamHI及限制酵素SalI切出，與將載體pESC-HIS(Stratagene)以相同限制酵素切斷者連結，得到質體pESC-HIS-UGT-4。將該質體pESC-HIS-UGT-4以限制酵素NotI及限制酵素PacI切斷者，與將UGT74G1以NotI及PacI切出者連結，得到pESC-HIS-UGT34。

酵母之轉形

以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPH500株 (ura3-52 lys2-801^amber ade2-101^ochre trp1-△63 his3-△200 leu2-△1 α)做為宿主，採用乙酸鋰法，藉由質體pESC-URA-UGT-12及pESC-HIS-UGT-34轉形。就轉形株而言，選出在SC-Ura&His瓊脂培養基(每1L含有6.7g之不含胺基酸之酵母氮源(Yeast nitrogen base without amino acids))、20g之葡萄糖、1.3g之胺基酸混合粉末-Ura&His、20g之Bacto瓊脂)中生長者，做為UGT-1234株#1、UGT-1234#2株。再者，胺基酸混合粉末-Ura&His，係將2.5g之腺嘌呤硫酸鹽、1.2g之L-精胺酸鹽酸鹽、6.0g之L-天冬胺酸、6.0g之L-麩胺酸、3.6g之L-白胺酸、1.8g之L-離胺酸、1.2g之L-甲硫胺酸、3.0g之L-苯基丙胺酸、22.5g之L-絲胺酸、12g之L-酥胺酸、2.4g之L-色胺酸、1.8g之L-酪胺酸、9.0g之L-纈胺酸混合而調製。另一方面，藉由載體pESC-URA及載體pESC-HIS，以與上述同樣之方法進行轉形之株做為對照株。

糖基轉移酶基因之表現誘導及表現解析

將所得到之轉形株UGT-1234株#1、UGT-1234#2株、對照株如以下方式培養。首先，進行前培養，即在10ml之SC-Ura&His液體培養基(除去SC-Ura&His瓊脂培養基之Bacto瓊脂者)中分別接種各轉形株，於30℃進行1日振盪培養。繼而，將前培養液中之1ml接種於10ml之SG-Ura&His液體培養基(每1L含有6.7g之不含胺基酸之酵母氮源、20g之半乳糖、1.3g之胺基酸混合粉末-Ura&His)中進行本培養，並於30℃進行1日振盪培養。

為了確認4個UGT基因之表現是否被誘導，從培養液收集菌體，使用RNeasy迷你套組精製全部RNA。

取1μg之總RNA(total RNA)，使用Superscript II逆 轉錄酵素(Invitrogen)，並以隨機六聚體(Random Hexamer)做為引子，合成cDNA。

為了確認4個UGT基因之表現，製作以下之引子。

確認UGT85C2表現用

UGT85C2-r1：5’-CAAGTCCCCAACCAAATTCCGT-3’(序列編號25)

確認UGT91D樣蛋白3表現用

UGT91D1L3-r1：5’-CACGAACCCGTCTGGCAACTC-3’(序列編號26)

確認UGT74G1表現用

UGT74G1-r1：5’-CCCGTGTGATTTCTTCCACTTGTTC-3’(序列編號27)

確認UGT76G1表現用

UGT76G1-r1：5’-CAAGAACCCATCTGGCAACGG-3’(序列編號28)

GAL10p領域(啟動子區域)

PGAL10-f3：5’-GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCA-3’(序列編號29)GAL1p領域(啟動子區域)

PGAL1-f3：5’-CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACC-3’(序列編號30)

各UGT基因表現，可藉由以下序列編號之引子組合，以先前合成之cDNA做為模板，使用ExTaq(Takara Bio)，進 行PCR而確認。

UGT85C2：UGT85C2-r1(序列編號25)及PGAL1-f3(序列編號30)

UGT91D樣蛋白3：UGT91D1L3-r1(序列編號26)及PGAL10-f3(序列編號29)

UGT74G1：UGT74G1-r1(序列編號27)及PGAL1-f3(序列編號30)

UGT76G1：UGT76G1-r1(序列編號28)及PGAL10-f3(序列編號29)

相對於在UGT-1234株#1、UGT-1234#2株中分別得到大的目的PCR產物，在對照株中則未得到PCR產物。由此可確認在UGT-1234株#1、UGT-1234#2株中，所導入之4個UGT基因全部表現。

蛇菊醇糖苷之生產

培養係除了在本培養用之液體培養基中，每1ml之培養基添加0.5μg之蛇菊醇(ChromaDex Inc.)以外，以與上述「糖基轉移酶基因之表現誘導及表現解析」同樣之條件進行。培養終了後，將培養液藉由離心分離上清液及菌體。將菌體懸浮於水中，以玻璃珠粒破碎後離心，回收上清液。將所得到之菌體破碎上清液及培養上清液分別以乙腈洗淨後，饋入已用水平衡化之Sep-PakC18管柱中，以20%乙腈洗淨後，用50%乙腈溶出，乾固後，溶解於少量乙腈中，調製成糖苷樣品。將該糖苷樣品提供於以下之分析。

藉由薄層層析(TLC)確認生成物

在TLC用矽膠平板(Merck)上放置前述糖苷樣品，以氯仿：甲醇：水=65：35：10(下層)做為展開溶劑，進行展開。展開後，用5%硫酸噴霧，於120℃之平板上加熱5-10分鐘。其結果， 在UGT-1234株#1、UGT-1234#2株之培養上清液樣品中，可確認被研判為蛇菊醇單糖苷、蛇菊醇雙糖苷、甜茶苷、蛇菊苷、萊鮑迪苷A之斑點。另一方面，在UGT-1234株#1、UGT-1234#2株之菌體破碎上清液樣品，及對照株之菌體破碎上清液樣品及培養上清液樣品中，無法確認任何一種被研判為蛇菊醇糖苷之斑點。

藉由LC-MS確認生成物

繼而，以下述之分析條件進行前述糖苷樣品之LC-MS分析。

LC條件

管柱：CAPCELL PAK C18(5μm 2.0mm I.D.×150mm)

移動相：A：MilliQ水(+0.05%甲酸)，B：乙腈

15%至67%B/(A+B)，共計26分鐘

流速：0.2ml/分鐘

管柱溫度：40℃

注射量：5μl

MS條件

分析模式：所選擇之離子監測(負)

所選擇之離子監測：m/z 849,803,687,641,479,317,965

分析之結果，在獨立之轉形酵母2系統中特異地檢測出蛇菊醇糖苷(第5圖II：UGT-1234株#1：波峰A表示以添加之蛇菊醇做為基質)。此等糖苷從保持時間及MS值而言，明顯地為蛇菊醇單糖苷(第5圖II：波峰B)、蛇菊醇雙糖苷(第5圖II：波峰C)、甜茶苷(第5圖：波峰D)、萊鮑迪苷B(第5圖II：波峰E)、蛇菊苷(第5圖II：波峰F)、萊鮑迪苷A(第5圖II：波峰G)。 再者，將只導入載體之株(陰性對照)進行相同分析，不過幾乎未發現此等糖苷(第5圖I)。

因此，可研判糖苷係於菌體內合成後，排出至培養基中。

從以上之結果，顯示藉由此4種UGT酵素，可於酵母中從蛇菊醇生產萊鮑迪苷A。

[實施例6]重組蛋白質之活性比較 UGT91D2e蛋白質之表現

以本發明之UGT91D樣蛋白3與在先前技術文獻(專利文獻3)中所記載之UGT91D2e(CDS序列：序列編號31，胺基酸序列：序列編號32)，進行酵素活性之比較評價。

如以下所示，製作UGT91D2e之大腸菌表現對比(contrast)，用與實施例3及4同樣之方法進行UGT91D2e與UGT91D樣蛋白3之酵素活性評價。

選殖UGT91D2e時，以前述之UGT91D樣蛋白3做為模板，藉由使用序列編號33及序列編號34之特異性引子之PCR進行增幅，使用GeneArt無縫(seamless)系統(Life technology公司)並按照製造業者推薦之方法將將增幅之UGT91D2e斷片組入pET15b表現載體中。藉由定序確認所組入之斷片之鹼基序列正確後，以該表現用質體將大腸菌BL21(DE3)株(Life technology公司)轉形，並使UGT91D2e以HisTag融合蛋白質之形式表現。

SrUGT91D1-3-Art-NdeI-FW(下方畫線部為NdeI識別部位)：5’-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTACCAGTGACTCCATAG-3’(序列編號33)

SrUGT91D1-3-Art-BamHI-RV(下方畫線部為BamHI識別部位)：5’-CTTTGTTAGCAGCCGGATCCTTAACTCTCATGATCGATGGCAAC-3’(序列編號34)

藉由西方轉漬(Western blotting)法檢測表現蛋白質

HisTag融合UGT91D2e蛋白質及前述之HisTag融合UGT91D樣蛋白3蛋白質，以與實施例3同樣之方法，將大腸菌破碎液之上清液部分藉由HisSpinTrap管柱精製。將500mM咪唑溶出之精製蛋白質部進行丙烯醯胺凝膠Multi-MiniGel Ⅱ(10/20)(Cosmo Bio公司)電泳(30V，60分鐘)。泳動凝膠係以下述順序將蛋白質轉漬於Immobilon-P膜(Millipore公司)。

將泳動凝膠用轉漬緩衝液(將5.82g之Tris，2.93g之甘胺酸，200ml之甲醇，1ml之10%(v/v)SDS，以水混合成1L)平衡化20分鐘，使用轉漬機Trans-blot SD semi-dry transfer cell(BioRad公司)，在15V之下經30分鐘轉漬在已預先浸漬於轉漬緩衝液之膜。

轉漬後，以TBS-T緩衝液(TBS緩衝液：在500ml之1M Tris-HCl中，添加87.5g之NaCl，以水混合成1L，使其溶解；在其中添加0.1%(v/v)Tween 20而成者)將膜輕輕洗淨，並以含有1%(w/v)脫脂乳之TBS-T緩衝液進行1小時封阻(blocking)，然後，將膜用TBS-T緩衝液輕輕洗淨。

將Anti-His單株抗體/小鼠(Novagen公司)經TBS-T緩衝液稀釋1000倍之液，以液體遍布整片膜之方式展開在轉漬有蛋白質之表面，於室溫培育一小時(一次抗體處理)。然後，將膜用TBS-T緩衝液輕輕洗濯後，以TBS-T緩衝液洗淨5分鐘，如 此重複3次。

繼而，將抗-小鼠IgG抗體(Horse Radish Peroxidase-linked)(GE healthcare公司)以TBS-T緩衝液調整為稀釋50000倍之液，在其中放入經一次抗體處理過之膜，於室溫緩慢搖動1小時(二次抗體處理)。然後，將膜輕輕用TBS-T緩衝液洗濯後，以TBS-T緩衝液洗淨5分鐘，如此重複3次。

檢測係使用Amersham ECL-Prime西方轉漬定向試劑套組(Western Blotting Detection reagents kit)(GE healthcare公司)，依循製造商推薦之順序實施。用顯色液處理轉漬面，於室溫培育5分鐘，使用ChemiDoc XRS+系統(BioRad公司)檢測表現蛋白質(第6圖)。在pET15載體對照組中雖未發現帶(band)，不過就UGT91D樣蛋白3而言，如從其胺基酸序列所預測者，檢測比50kDa稍大尺寸帶。同樣地，關於UGT91D2e，只檢測出尺寸稍小於UGT91D樣蛋白3之帶，確認以短少12個胺基酸之蛋白質之形式表現。將UGT91D1、UGT91D樣蛋白3及UGT91D2e之N末端部位之部分序列示於第7圖。

相對酵素活性之比較

使用於大腸菌中表現之UGT91D樣蛋白3及UGT91D2e之精製蛋白質，比較二者之酵素活性。基質係使用甜茶苷，以與實施例4同樣之酵素反應條件及分析條件進行。將生成物量之蛇菊苷除以供給至反應之蛋白質量，算出相對酵素活性之結果為：若以UGT91D2e之糖基化活性當做100%，則UGT91D樣蛋白3為167%，顯示每單位蛋白質量之相對酵素活性，UGT91D樣蛋白3比UGT91D2e高67%。

若考量UGT91D樣蛋白3蛋白質之全長為485胺基 酸殘基，藉由僅僅12個殘基(佔全體比率：(12/485)x 100=3.09%)之存在，即可使活性上升67%，可謂效果非常顯著。

結果

如從與包含UGT91D1之其他糖轉移酵素之序列比較所明示，可研判UGT91D樣蛋白3為全長的蛇菊醇糖苷之糖基轉移酶。此外，可以實驗方式證明，UGT91D樣蛋白3，藉由於N末端存在12個胺基酸，具有比UGT91D2e高67%之相對酵素活性。

產業上之可利用性

若依照本發明，利用UGT91D樣蛋白3基因，可將蛇菊醇單糖苷、及甜茶苷之13位葡萄糖之2位糖苷化，使蛇菊醇糖苷之甜味度及味質提高。藉由本發明，至萊鮑迪苷A為止之生合成途徑之全貌變得明白，而且提供不僅在植物中，而且在微生物中用於生產低熱量天然甜味料，即萊鮑迪苷A或蛇菊苷或其他類似化合物之分子工具。

序列表非關鍵文字(Free Text)

序列編號3：合成DNA

序列編號4：合成DNA

序列編號11：合成DNA

序列編號12：合成DNA

序列編號13：合成DNA

序列編號14：合成DNA

序列編號15：合成DNA

序列編號16：合成DNA

序列編號17：合成DNA

序列編號18：合成DNA

序列編號19：合成DNA

序列編號20：合成DNA

序列編號21：合成DNA

序列編號22：合成DNA

序列編號23：合成DNA

序列編號24：合成DNA

序列編號25：合成DNA

序列編號26：合成DNA

序列編號27：合成DNA

序列編號28：合成DNA

序列編號29：合成DNA

序列編號30：合成DNA

序列編號33：合成DNA

序列編號34：合成DNA

<110> 三得利控股股份有限公司(SUNTORY HOLDINGS LIMITED)

<120> 蛇菊醇糖基轉移酶及編碼該轉移酶之基因(Steviol Glycosyltransferase and Gene Thereof)

<130> PCT12-0056

<150> JP 2012-060473

<151> 2012-03-16

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> 蛇菊

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1458)

<400> 1

<210> 2

<211> 485

<212> PRT

<213> 蛇菊

<400> 2

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成DNA

<400> 3

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成DNA

<400> 4

<210> 5

<211> 1446

<212> DNA

<213> 蛇菊

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1446)

<400> 5

<210> 6

<211> 481

<212> PRT

<213> 蛇菊

<400> 6

<210> 7

<211> 1383

<212> DNA

<213> 蛇菊

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1383)

<400> 7

<210> 8

<211> 460

<212> PRT

<213> 蛇菊

<400> 8

<210> 9

<211> 1377

<212> DNA

<213> 蛇菊

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1377)

<400> 9

<210> 10

<211> 458

<212> PRT

<213> 蛇菊

<400> 10

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 11

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 12

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 13

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 14

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 15

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 16

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 17

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 18

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 19

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 20

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 21

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 22

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 23

<210> 24

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 24

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 25

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 26

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 27

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 28

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 29

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 30

<210> 31

<211> 1422

<212> DNA

<213> 蛇菊

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1422)

<400> 31

<210> 32

<211> 473

<212> PRT

<213> 蛇菊

<400> 32

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 33

<210> 34

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 34

Claims (22)

1. 一種蛋白質，其係選自下述(a)至(c)所構成之組群之任一者：(a)包含序列編號2之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入、及/或附加1至48個胺基酸之胺基酸序列，且具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性的蛋白質；(c)具有與序列編號2之胺基酸序列90%以上序列相同性之胺基酸序列，且具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性的蛋白質； 式中，R₁表示H、C₁至C₂₀烷基、C₂至C₂₀烯基、C₂至C₂₀炔基、C₄至C₂₀鏈二烯基(alkyl dienyl)、C₆至C₁₈芳基、C₆至C₂₀烷芳基、C₆至C₂₀芳烷基、C₄至C₂₀環烷基、C₄至C₂₀環烯基、(C₃至C₁₀環烷基)C₁至C₁₀烷基或糖殘基。
2. 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質，其中該糖分子為六碳糖。
3. 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質，其中該糖分子係選自葡萄糖、甘露糖及半乳糖所構成之組群者。
4. 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質，其中該R₁為H或葡萄糖單體或葡萄糖二聚體之糖殘基。
5. 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質，其中該化合物為蛇菊醇單糖苷(steviol monoside)或甜茶苷(rubusoside)。
6. 一種聚核苷酸，其係選自下述之(a)至(e)所構成之組群：(a)含有序列編號1之鹼基序列的聚核苷酸；(b)編碼包含序列編號2之胺基酸序列之蛋白質的聚核苷酸；(c)編碼包含在序列編號2之胺基酸序列中，刪除、置換、插入、及/或附加1至48個胺基酸之胺基酸序列，且具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性之蛋白質的聚核苷酸；(d)編碼具有與序列編號2之胺基酸序列90%以上序列相同性之胺基酸序列，且具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性之蛋白質的聚核苷酸；(e)在高度嚴苛條件下可與包含與序列編號1之鹼基序列為互補之鹼基序列之聚核苷酸雜交之聚核苷酸，且其係編碼具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性之蛋白質的聚核苷酸； 式中，R₁表示H、C₁至C₂₀烷基、C₂至C₂₀烯基、C₂至C₂₀炔基、C₄至C₂₀鏈二烯基、C₆至C₁₈芳基、C₆至C₂₀烷芳基、C₆至C₂₀芳烷基、C₄至C₂₀環烷基、C₄至C₂₀環烯基、(C₃至C₁₀環烷基)C₁ 至C₁₀烷基或糖殘基。
7. 如申請專利範圍第6項所述之聚核苷酸，其中該糖分子為六碳糖。
8. 如申請專利範圍第6項所述之聚核苷酸，其中該糖分子係選自葡萄糖、甘露糖及半乳糖所構成之組群者。
9. 如申請專利範圍第6項所述之聚核苷酸，其中該R₁為H或者葡萄糖單體或葡萄糖二聚體之糖殘基。
10. 如申請專利範圍第6項所述之聚核苷酸，其中該化合物為蛇菊醇單糖苷或甜茶苷。
11. 一種非人類轉形體，其係導入如申請專利範圍第6項所述之聚核苷酸者。
12. 如申請專利範圍第11項所述之轉形體，其中該聚核苷酸係插入表現載體中者。
13. 如申請專利範圍第11項所述之轉形體，其係植物體。
14. 一種如申請專利範圍第11項所述之轉形體之萃取物。
15. 一種食品、醫藥品或工業原料，其含有如申請專利範圍第14項所述之萃取物。
16. 一種蛋白質之製造方法，該蛋白質具有在下述通式(I)所示之化合物之13位之葡萄糖附加糖分子之活性，該方法之特徵為培養申請專利範圍第11項所述之非人類轉形體； 式中，R₁表示H、C₁至C₂₀烷基、C₂至C₂₀烯基、C₂至C₂₀炔基、C₄至C₂₀鏈二烯基、C₆至C₁₈芳基、C₆至C₂₀烷芳基、C₆至C₂₀芳烷基、C₄至C₂₀環烷基、C₄至C₂₀環烯基、(C₃至C₁₀環烷基)C₁至C₁₀烷基或糖殘基。
17. 一種蛇菊醇糖苷之製造方法，其特徵為使用如申請專利範圍第11項所述之非人類轉形體。
18. 如申請專利範圍第17項所述之製造方法，其中該蛇菊醇糖苷為蛇菊醇雙糖苷、蛇菊苷(stevioside)、萊鮑迪苷(rebaudioside)A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F或此等之組合。
19. 如申請專利範圍第17項所述之製造方法，其中該非人類轉形體為表現選自UGT85C2基因、UGT74G1基因、UGT76G1基因所構成之組群之至少1種基因者，其所製造之蛇菊醇糖苷為蛇菊醇雙糖苷、萊鮑迪苷A、蛇菊苷及萊鮑迪苷B。
20. 一種蛇菊醇糖苷之製造方法，其包含使申請專利範圍第1項所述之蛋白質與UDP-糖及下述通式(I)所示之化合物進行反應之步驟； 式中，R₁表示H、C₁至C₂₀烷基、C₂至C₂₀烯基、C₂至C₂₀炔基、C₄至C₂₀鏈二烯基、C₆至C₁₈芳基、C₆至C₂₀烷芳基、C₆至C₂₀芳烷基、C₄至C₂₀環烷基、C₄至C₂₀環烯基、(C₃至C₁₀環烷基)C₁至C₁₀烷基或糖殘基。
21. 如申請專利範圍第20項所述之製造方法，其中該UDP-糖中之糖為葡萄糖。
22. 如申請專利範圍第20項所述之製造方法，其中該蛇菊醇糖苷為蛇菊醇雙糖苷、蛇菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷E、萊鮑迪苷F或此等之組合。