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TW201333030A - 抗體之純化 - Google Patents

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TW201333030A
TW201333030A TW102101685A TW102101685A TW201333030A TW 201333030 A TW201333030 A TW 201333030A TW 102101685 A TW102101685 A TW 102101685A TW 102101685 A TW102101685 A TW 102101685A TW 201333030 A TW201333030 A TW 201333030A
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TW
Taiwan
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antibody
hcp
exchange resin
mixture
tnfα
Prior art date
Application number
TW102101685A
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English (en)
Inventor
Min Wan
George Avgerinos
Gregory Zarbis-Papastoitsis
Original Assignee
Abbott Biotech Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38581592&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TW201333030(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Abbott Biotech Ltd filed Critical Abbott Biotech Ltd
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Abstract

本發明提供一種從包含抗體及至少一種宿主細胞蛋白質(host cell protein；HCP)之混合物中製備HCP經減少之抗體製劑的方法，該方法包含離子交換分離步驟，其中該混合物係經受第一離子交換材料，如此HCP經減少之抗體製劑便可獲得。

Description

抗體之純化
蛋白質之大規模、經濟性純化為生物技術產業之日益重要的問題。通常，蛋白質藉由細胞培養物、使用經工程化以藉由插入包含彼蛋白質之基因之重組性質體來產生所關注之蛋白質的哺乳動物或細菌細胞株而產生。因為所用細胞株為活生物，所以必須為其補給通常自動物血清製劑供給之包含糖、胺基酸及生長因子之複合生長培養基。將所需蛋白質與供應給細胞之化合物混合物及細胞自身之副產物相分離直至達成足以用作人類治療劑之純度形成難以克服的挑戰。
存在對於獲得所包含之宿主細胞蛋白質(包括原組織蛋白酶L)之量減少之抗體製劑的改良方法的需要。本發明提供純化表現於宿主細胞表現系統中之抗體的方法，其中所得抗體製劑包含減少量之包括原組織蛋白酶L之宿主細胞蛋白質。本發明之改良方法亦包括開發精確地偵測宿主細胞蛋白質之可重現的方法，及動態檢定。
本發明提供自包含抗體及至少一種宿主細胞蛋白質(HCP)之混合物產生HCP經減少之抗體製劑的方法，其包含一離子交換分離步驟，其中使混合物經受第一離子交換材料，以便獲得HCP經減少之抗體製劑。在一實施例中，離子交換分離步驟包含使混合物傳經第一離子交換材料以便獲得HCP含量減少之第一溶離液。在一實施例中，本發明之方法進一步包含一第二離子交換分離步驟，其中使第一溶離液經受 第二離子交換材料以便獲得HCP含量減少之第一徑流。在另一實施例中，本發明之方法進一步包含一疏水相互作用分離步驟，其中使第一徑流經受第一疏水相互作用材料以便獲得HCP含量減少之第二溶離液。
在本發明之一實施例中，離子交換分離步驟包含第一離子交換層析步驟，其中將混合物裝填於包含第一離子交換材料之管柱上，以便獲得HCP含量減少之第一溶離液。在一實施例中，本發明進一步包含第二離子交換層析步驟，其包含裝填第一溶離液於包含第二離子交換材料之管柱上，以便獲得第一徑流。
在一實施例中，本發明進一步包含疏水相互作用分離步驟，其包含裝填第一徑流於包含第一疏水相互作用材料之管柱上，以便獲得第二溶離液。在一實施例中，疏水相互作用分離步驟包含疏水相互作用層析。在一實施例中，疏水相互作用層析為苯基瓊脂糖層析。在另一實施例中，裝載至疏水相互作用材料上之抗體的量介於約20至約40公克抗體/公升疏水相互作用材料範圍內。在另一實施例中，裝載至疏水相互作用材料上之抗體的量介於約30至約36公克抗體/公升疏水相互作用材料範圍內。
在一實施例中，離子交換層析步驟為陽離子交換層析。在另一實施例中，陽離子交換層析為與磺酸酯基連接之以合成甲基丙烯酸酯為主之聚合樹脂。在另一實施例中，本發明進一步包含以複數個洗滌步驟洗滌離子交換材料。在一實施例中，該複數個洗滌步驟包含增加導電度。在一實施例中，離子交換材料係以包含約40-50%溶離緩衝液及約50-60%水(例如注射用水(WFI))的洗滌液洗滌。在一實施例中，溶離緩衝液為20 mM Na2PO4、150 mM氯化鈉，pH值7。
在一實施例中，第一溶離液在第一離子交換層析步驟之前經受病毒滅活。在一實施例中，病毒滅活係經由pH病毒滅活(例如降低第一溶 離液之pH值以藉此減除病毒活性)來達成。
在本發明之一實施例中，第二離子交換層析步驟包含陰離子交換層析。在一實施例中，陰離子交換層析為Q瓊脂糖層析。
本發明亦提供自包含抗體及至少一種宿主細胞蛋白質(HCP)之混合物產生HCP經減少之抗體製劑之方法，其中HCP之含量減少藉由改變第一溶離液之pH值及導電度使得第一溶離液之pH值及導電度大體上與第二離子交換材料之pH值及導電度相似來達成。在一實施例中，第二離子交換材料之pH值介於約7.7至約8.3範圍內。在另一實施例中，第一溶離液之pH值改變為介於約7.7至約8.3範圍內。在另一實施例中，第一溶離液之pH值改變為約8.0。在一實施例中，第二離子交換材料之導電度介於約3.5 mS/cm至約5.2 mS/cm範圍內，或約3.5 mS/cm至約4.9 mS/cm範圍內。在一實施例中，第一溶離液之導電度改變為介於約3.5 mS/cm至約5.2 mS/cm或約3.5 mS/cm至約4.9 mS/cm範圍內。
在本發明之一實施例中，如由HCP ELISA所測定，與混合物所包含之HCP相比，第一溶離液所包含之HCP少約90至約100倍。在另一實施例中，如由HCP ELISA所測定，與第一溶離液所包含之HCP相比，第一徑流所包含之HCP少約840至約850倍。在另一實施例中，如由HCP ELISA所測定，與第一徑流所包含之HCP相比，第二溶離液所包含之HCP少約3至約5倍。
本發明提供自包含抗體及原組織蛋白酶L的混合物產生原組織蛋白酶L經減少之抗體製劑的方法，其包含一離子交換分離步驟，其中使混合物經受第一離子交換材料，以便獲得原組織蛋白酶L經減少之抗體製劑。
在一實施例中，離子交換分離步驟包含使混合物傳經第一離子交換材料以便獲得原組織蛋白酶L含量減少之第一溶離液。在一實施例中，離子交換分離步驟包含第一離子交換層析步驟，其中將混合物裝 填於包含第一離子交換材料之管柱上，以便獲得原組織蛋白酶L含量減少之第一溶離液。
在一實施例中，本發明進一步包含一第二離子交換分離步驟，其中使第一溶離液經受第二離子交換材料，以便獲得原組織蛋白酶L含量減少之第一徑流。在一實施例中，本發明進一步包含第二離子交換層析步驟，其包含裝填第一溶離液於包含第二離子交換材料之管柱上，以便獲得第一徑流。
在一實施例中，本發明進一步包含一疏水相互作用分離步驟，其中使第一徑流經受第一疏水相互作用材料，以便獲得原組織蛋白酶L含量減少之第二溶離液。在另一實施例中，本發明進一步包含一疏水相互作用分離步驟，其包含裝填第一徑流於包含第一疏水相互作用材料之管柱上，以便獲得第二溶離液。
在一實施例中，離子交換層析步驟為包括(但不限於)與磺酸酯基連接之以合成甲基丙烯酸酯為主之聚合樹脂的陽離子交換層析。
在另一實施例中，離子交換層析步驟進一步包含以複數個洗滌步驟洗滌離子交換材料。在一實施例中，該複數個洗滌步驟包含增加導電度。在一實施例中，離子交換材料係以包含約40-50%溶離緩衝液與約50-60%水(例如注射用水(WFI))的洗滌緩衝液洗滌。在另一實施例中，溶離緩衝液為20 mM Na2PO4、150 mM氯化鈉，pH值7。
在本發明之一實施例中，第一溶離液在離子交換層析步驟之前經受病毒滅活。在一實施例中，病毒滅活經由pH病毒滅活(例如降低第一溶離液之pH值以藉此減除病毒活性)來達成。
在一實施例中，離子交換層析步驟包含陰離子交換層析。在一實施例中，陰離子交換層析為Q瓊脂糖層析。
本發明亦描述一種方法，其中原組織蛋白酶L之含量減少藉由改變第一溶離液之pH值及導電度使得第一溶離液之pH值及導電度大體 上與第二離子交換材料之pH值及導電度相似而實現。在一實施例中，第二離子交換材料之pH值介於約7.7至約8.3範圍內。在另一實施例中，第一溶離液之pH值改變為介於約7.7至約8.3範圍內。在另一實施例中，其中第一溶離液之pH值改變為約8.0。在另一實施例中，第二離子交換材料之導電度介於約3.5 mS/cm至約5.2 mS/cm，或約3.5 mS/cm至約4.9 mS/cm範圍內。在一實施例中，第一溶離液之導電度改變為介於約3.5 mS/cm至約5.2 mS/cm或約3.5 mS/cm至約4.9 mS/cm範圍內。
在本發明之一實施例中，疏水相互作用分離步驟包含疏水相互作用層析。在一實施例中，疏水相互作用層析為苯基瓊脂糖層析。在另一實施例中，裝載至疏水相互作用材料上之抗體的量介於約20至約40公克抗體/公升疏水相互作用材料範圍內。在另一實施例中，裝載至疏水相互作用材料上之抗體的量介於約30至約36公克抗體/公升疏水相互作用材料範圍內。
在一實施例中，如藉由組織蛋白酶L動態檢定所量測，第一溶離液包含之組織蛋白酶L的活性範圍介於約25至約60 RFU/s/mg抗體之間。
在另一實施例中，如藉由組織蛋白酶L動態檢定所量測，第一徑流包含之組織蛋白酶L的活性範圍介於約0.4至約4 RFU/s/mg抗體之間。
在另一實施例中，如藉由組織蛋白酶L動態檢定所量測，第二溶離液包含之組織蛋白酶L的活性範圍介於約0.5至約1.5 RFU/s/mg抗體之間。
在本發明之一實施例中，原組織蛋白酶L之含量可重現地降低。
在尤其較佳之態樣中，本發明提供抗體純化方法，其中大量抗體-HCP混合物可裝填於離子交換樹脂上以達成混合物中之HCP減少。本方法之優點在於可使用之抗體-HCP混合物在施加抗體-HCP混合物至 離子交換樹脂之前並未經受蛋白質A捕獲。蛋白質A捕獲通常於作為移除HCP之手段的抗體純化程序中用作初始純化步驟，其中抗體-HCP混合物施加至蛋白質A管柱使得抗體與蛋白質A結合且HCP貫穿流過。因此，本發明之方法適用於純化大裝載量之抗體-HCP混合物，而不必執行作為啟始步驟之蛋白質A層析。
因此，在一實施例中，本發明提供自包含抗體及至少一種宿主細胞蛋白質(HCP)之混合物產生HCP經減少之抗體製劑的方法，該方法包含：(a)施加混合物至均衡緩衝液中之第一離子交換樹脂中，其中施加大於30公克抗體/公升樹脂；(b)以複數個洗滌步驟洗去樹脂中之HCP；及(c)以溶離緩衝液溶離樹脂中之抗體以形成第一溶離液，以便獲得HCP經減少之抗體製劑。
在另一實施例中，施加約35-70公克抗體/公升樹脂。在另一實施例中，施加約70公克抗體/公升樹脂。在較佳實施例中，包含抗體及至少一種HCP之混合物在施加混合物至第一離子交換樹脂之前並未經受蛋白質A捕獲(例如，並未施加至蛋白質A管柱)。
較佳地，該複數個洗滌步驟包含至少第一洗滌與第二洗滌，其中在第一洗滌至第二洗滌過程中存在導電度增加。更佳地，第一洗滌使用均衡緩衝液且第二洗滌使用溶離緩衝液與水(例如WFI)之混合物。例如，溶離緩衝液與水之混合物可包含約40-50%溶離緩衝液與約50-60%水。更佳地，溶離緩衝液與水之混合物可包含約45%溶離緩衝液與約55%水。在一較佳實施例中，溶離緩衝液包含20 mM磷酸鈉及150 mM氯化鈉。在該情況下，為45%溶離緩衝液與約55%水之溶離緩衝液與水之混合物為9 mM磷酸鈉及68 mM氯化鈉。在一較佳實施例中，第一洗滌使用包含20 mM磷酸鹽、25 mM氯化鈉之平衡緩衝液，第二洗滌使 用包含9 mM磷酸鹽、68 mM氯化鈉(45%溶離緩衝液、55%水)之緩衝液且溶離緩衝液包含20 mM磷酸鈉及150 mM氯化鈉。
在一實施例中，使用第一離子交換樹脂之方法在pH值7下進行。在另一實施例中，使用第一離子交換樹脂之方法在pH值5下進行。在另一實施例中，使用第一離子交換樹脂之方法在pH值約5至pH值約7範圍內，或pH值5至pH值7範圍內之pH值下進行。當使用pH值7時，較佳施加約35公克抗體/公升樹脂。當使用pH值5時，較佳施加約70公克抗體/公升樹脂。當使用在pH值約5至pH值約7範圍內之pH值(例如pH值5至pH值7)時，較佳施加約35至約70公克抗體/公升樹脂(例如35-70公克抗體/公升樹脂)。
在一較佳實施例中，與較少抗體(例如約30公克抗體公升樹脂)裝載於樹脂上所達成者相比，藉由裝載更多抗體於樹脂上(例如約70公克抗體/公升樹脂)達成(例如在pH值5下)抗體-HCP混合物中更佳的HCP清除。據認為此情況由當使用抗體對樹脂之結合親和力明顯大於HCP對樹脂之彼結合親和力的條件時抗體移置樹脂中之HCP所引起。
較佳地，第一離子交換樹脂為陽離子交換樹脂。較佳地，陽離子交換樹脂形成管柱且將包含抗體及至少一種HCP之混合物施加至管柱。較佳地，陽離子交換樹脂包含與磺酸酯基連接之以合成甲基丙烯酸酯為主之聚合樹脂(例如Fractogel S)。或者，陽離子交換樹脂可包含(例如)以甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯為主之合成聚合物、二氧化矽、具有葡聚糖表面增補劑之高度交聯瓊脂糖、烯丙基葡聚糖與連接至諸如鋶離子或磺乙基之磺酸酯基之N.N.亞甲基雙丙烯醯胺樹脂的交聯共聚物。
在本發明另一態樣中，在執行如上所述使用第一離子交換樹脂之方法之後，該方法進一步包含使第一溶離液經受病毒滅活步驟。例如，其中病毒滅活可藉由pH病毒滅活達成以形成病毒滅活製劑(例如，第一 溶離液經受諸如約3.5 pH值之低pH值條件以藉此減除病毒活性)。較佳地，病毒滅活製劑施加至第二離子交換樹脂，其中，在施加病毒滅活製劑至第二離子交換樹脂之前，將病毒滅活製劑之pH值及導電度調整為大體上與第二離子交換樹脂之pH值及導電度相似。例如，第二離子交換樹脂之pH值可在pH值約7.7至pH值約8.3範圍內且將病毒滅活製劑之pH值調整為在pH值約7.7至pH值約8.3範圍內。在另一實施例中，第二離子交換樹脂之pH值可在pH值約7.8至pH值約8.2範圍內且將病毒滅活製劑之pH值調整為在pH值約7.8至pH值約8.2範圍內。更佳地，第二離子交換樹脂之pH值為pH值約8.0且將病毒滅活製劑之pH值調整為pH值約8.0。此外，第二離子交換樹脂之導電度可在約3.5 mS/cm至約5.2 mS/cm範圍內且將病毒滅活製劑之導電度調整為在約3.5 mS/cm至約5.2 mS/cm範圍內。較佳地，第二離子交換樹脂之導電度為約5.0 mS/cm且將病毒滅活製劑之導電度調整為約5.0 mS/cm。
在一較佳實施例中，第二離子交換樹脂為陰離子交換樹脂。例如，陰離子交換樹脂可為Q瓊脂糖樹脂。較佳地，第二離子交換樹脂形成管柱且將病毒滅活製劑施加至管柱以便獲得第一徑流。
在本發明之另一態樣中，在由第二離子交換樹脂獲得第一徑流之後，第一徑流可施加至疏水相互作用管柱以便獲得第二溶離液。在一較佳實施例中，疏水相互作用管柱為苯基瓊脂糖管柱。在一實施例中，施加至疏水相互作用管柱之第一徑流包含約20至約40公克抗體/公升疏水相互作用管柱材料。在另一實施例中，施加至疏水相互作用管柱之第一徑流包含約30至約36公克抗體/公升疏水相互作用管柱材料。吾人發現，歸因於純化過程中先前步驟之效率，並不需要使由疏水相互作用管柱獲得之第二溶離液經受峰值產物分餾。因此，在一實施例中，第二溶離液並不經受峰值產物分餾。
在一尤其較佳實施例中，本發明之自包含抗體及至少一種HCP之 混合物產生宿主細胞蛋白質(HCP)減少之抗體製劑的方法包含：(a)施加混合物至均衡緩衝液中之陽離子交換樹脂中，其中混合物在施加至陽離子交換樹脂之前並未經受蛋白質A捕獲且其中施加大於30公克抗體/公升樹脂；(b)以複數個洗滌步驟洗去陽離子交換樹脂中之HCP；(c)以溶離緩衝液溶離陽離子交換樹脂中之抗體以形成第一溶離液；(d)使第一溶離液經受病毒滅活步驟；(e)施加病毒滅活製劑至陰離子交換樹脂以獲得第一徑流；及(f)施加第一徑流至疏水相互作用管柱以便獲得第二溶離液；以便獲得HCP經減少之抗體製劑。
在一實施例中，陽離子交換樹脂在pH值7下且施加約35公克抗體/公升樹脂。在另一實施例中，陽離子交換樹脂在pH值5下且施加約70公克抗體/公升樹脂。在另一實施例中，pH值在pH值約5至pH值約7範圍內(例如，pH值5至pH值7)且施加約35至約70公克抗體量/公升樹脂(例如35-70公克抗體/公升樹脂)。
較佳地，該複數個洗滌步驟包含以使用均衡緩衝液之第一洗滌及使用溶離緩衝液與水之混合物的第二洗滌來洗滌樹脂。例如，溶離緩衝液與水之混合物可包含約40-50%溶離緩衝液與約50-60%水(例如WFI)，更佳約45%溶離緩衝液與約55%水(例如WFI)。在一較佳實施例中，溶離緩衝液包含20 mM磷酸鈉及150 mM氯化鈉。在該情況中，為45%溶離緩衝液及約55%水之溶離緩衝液與水之混合物為9 mM磷酸鈉及68 mM氯化鈉。在一較佳實施例中，第一洗滌使用包含20 mM磷酸鹽、25 mM氯化鈉之平衡緩衝液，第二洗滌使用包含9 mM磷酸鹽、68 mM氯化鈉(45%溶離緩衝液、55%水)之緩衝液且溶離緩衝液包含20 mM磷酸鈉及150 mM氯化鈉。
較佳地，在上述具有步驟(a)至(f)之方法中，在施加病毒滅活製劑至陰離子離子交換樹脂之前(亦即於步驟(d)與(e)之間)，病毒滅活製劑之pH值與導電度調整為大體上與陰離子交換樹脂之pH值與導電度相似。例如，第二離子交換樹脂之pH值可在pH值約7.7至pH值約8.3範圍中且病毒滅活製劑之pH值調整為在pH值約7.7至pH值約8.3範圍中。在另一實施例中，第二離子交換樹脂之pH值可在pH值約7.8至pH值約8.2範圍中且病毒滅活製劑之pH值調整為在pH值約7.8至pH值約8.2範圍中。更佳地，第二離子交換樹脂之pH值為pH值約8.0且病毒滅活製劑之pH值調整為pH值約8.0。此外，第二離子交換樹脂之導電度可在約3.5 mS/cm至約5.2 mS/cm範圍中且病毒滅活製劑之導電度調整為在約3.5 mS/cm至約5.2 mS/cm範圍中。較佳地，第二離子交換樹脂之導電度為約5.0 mS/cm且病毒滅活製劑之導電度調整為約5.0 mS/cm。
在上述具有步驟(a)至(f)之方法中，較佳地，陽離子交換樹脂為與磺酸酯基連接之以合成甲基丙烯酸酯為主之聚合樹脂(例如Fractogel)，陰離子交換樹脂為Q瓊脂糖樹脂且疏水相互作用管柱為苯基瓊脂糖管柱。
較佳地，如由HCP ELISA所測定，與混合物所包含之HCP相比，第一溶離液所包含之HCP少約90至約100倍。較佳地，如由HCP ELISA所測定，與第一溶離液所包含之HCP相比，第一徑流所包含之HCP少約840至約850倍。較佳地，如由HCP ELISA所測定，與第一徑流所包含之HCP相比，第二溶離液所包含之HCP少約3至約5倍。
在一尤其較佳實施例中，本發明之自包含抗體及至少一種宿主細胞蛋白質(HCP)之混合物產生HCP經減少之抗體製劑的方法包含：
(a)施加混合物至均衡緩衝液中之陽離子交換樹脂中，其中陽離子交換樹脂在pH值7下且施加約35公克抗體/公升樹脂，或陽離子交換樹脂在pH值5至pH值7範圍內之pH值下且施加約35至約70公克抗體/公升 樹脂，或陽離子交換樹脂在pH值5下且施加約70公克抗體/公升樹脂；(b)以包含使用均衡緩衝液之第一洗滌及使用溶離緩衝液與水之混合物的第二洗滌的洗滌步驟洗滌陽離子交換樹脂中之HCP；(c)以溶離緩衝液溶離陽離子交換樹脂中之抗體以形成第一溶離液；(d)使第一溶離液經受病毒滅活步驟，其中病毒滅活藉由pH病毒滅活達成以形成病毒滅活製劑；(e)施加病毒滅活製劑至陰離子交換樹脂，其中在施加病毒滅活製劑至陰離子離子交換樹脂之前，病毒滅活製劑之pH值及導電度調整為大體上與陰離子交換樹脂之pH值及導電度相似，以便獲得第一徑流；及(f)施加第一徑流至疏水相互作用管柱以便獲得第二溶離液；以便獲得HCP經減少之抗體製劑。
較佳地，抗體混合物在施加至陽離子交換樹脂之前並未經受蛋白質A捕獲。較佳地，溶離緩衝液與水之混合物包含約40-50%溶離緩衝液與約50-60%水，更佳約45%溶離緩衝液與約55%水(例如WFI)。在一較佳實施例中，溶離緩衝液包含20 mM磷酸鈉及150 mM氯化鈉。在該情況中，為45%溶離緩衝液與約55%水之溶離緩衝液與水之混合物為9 mM磷酸鈉及68 mM氯化鈉。在一較佳實施例中，第一洗滌使用包含20 mM磷酸鹽、25 mM氯化鈉之平衡緩衝液，第二洗滌使用包含9 mM磷酸鹽、68 mM氯化鈉(45%溶離緩衝液、55%水)之緩衝液且溶離緩衝液包含20 mM磷酸鈉及150 mM氯化鈉。較佳地，如由HCP ELISA所測定，與混合物所包含之HCP相比，第一溶離液所包含之HCP少約90至約100倍。較佳地，如由HCP ELISA所測定，與第一溶離液所包含之HCP相比，第一徑流所包含之HCP少約840至約850倍。較佳地，如由HCP ELISA所測定，與第一徑流所包含之HCP相比，第二溶離液所包含之 HCP少約3至約5倍。
在任一上述純化方法之較佳態樣中，HCP包含原組織蛋白酶L以便獲得原組織蛋白酶L經減少之抗體製劑。較佳地，如藉由組織蛋白酶L動態檢定所量測，溶離液包含之組織蛋白酶L的活性範圍介於約25至約60 RFU/s/mg抗體之間。較佳地，如藉由組織蛋白酶L動態檢定所量測，第一徑流包含之組織蛋白酶L的活性範圍介於約0.4至約4 RFU/s/mg抗體之間。較佳地，如藉由組織蛋白酶L動態檢定所量測，第二溶離液包含之組織蛋白酶L的活性範圍介於約0.5至約1.5 RFU/s/mg抗體之間。較佳地，原組織蛋白酶L之含量可重現地降低。
在另一態樣中，本發明係關於自包含抗體及至少一種宿主細胞蛋白質(HCP)之混合物產生HCP經減少之抗體製劑的方法，該方法包含：(a)施加混合物至陽離子交換樹脂以獲得第一溶離液；(b)施加第一溶離液至陰離子離子交換樹脂以獲得第一徑流；及(c)施加第一徑流至疏水相互作用管柱以便獲得第二溶離液；以便獲得HCP經減少之抗體製劑。
較佳地，包含抗體及至少一種HCP之混合物在施加混合物至第一離子交換樹脂之前並不經受蛋白質A捕獲。較佳地，該方法進一步包含在施加第一溶離液至陰離子交換樹脂之前使第一溶離液經受病毒滅活步驟。例如，病毒滅活可藉由pH病毒滅活達成。
較佳地，陽離子交換樹脂包含與磺酸酯基連接之以合成甲基丙烯酸酯為主之聚合樹脂(例如陽離子交換樹脂可為Fractogel S管柱)。例如，Fractogel S管柱可以包含20 mM磷酸鈉、25 mM氯化鈉之均衡緩衝液平衡，混合物可施加至管柱，管柱可以均衡緩衝液洗滌至少一次且第一溶離液可藉由以包含20 mM磷酸鈉、150 mM氯化鈉之溶離緩衝液溶離獲得。
較佳地，陰離子交換樹脂為Q瓊脂糖管柱。例如，Q瓊脂糖管柱可 以包含25 mM三乙醇胺、40 mM氯化鈉，pH值7.6之均衡緩衝液平衡。
較佳地，疏水相互作用管柱為苯基瓊脂糖管柱。例如，苯基瓊脂糖管柱可以包含20 mM磷酸鈉、1.1 M(NH4)2SO4，pH值7.0之均衡緩衝液平衡，第一徑流可施加至管柱，管柱可以均衡緩衝液洗滌至少一次且第二溶離液可藉由執行鹽階段梯度直至11 mM磷酸鈉、0.625 M(NH4)2SO4，pH值7.0獲得。
較佳地，pH病毒滅活藉由保持第一溶離液在pH值3.5下歷時約一小時達成。
在另一態樣中，本發明係關於自包含阿達木單抗(adalimumab)及至少一種宿主細胞蛋白質(HCP)之混合物產生HCP經減少之阿達木單抗製劑的方法，該方法包含：(a)施加混合物至陽離子交換樹脂以獲得第一溶離液，其中混合物在施加混合物至第一離子交換樹脂之前並不經受蛋白質A捕獲；(b)使第一溶離液經受pH病毒滅活以獲得病毒滅活製劑；(c)施加病毒滅活製劑至陰離子離子交換樹脂以獲得第一徑流；及(c)施加第一徑流至疏水相互作用管柱以便獲得第二溶離液；以便獲得HCP經減少之阿達木單抗製劑。
較佳地，陽離子交換樹脂為Fractogel S管柱，陰離子交換樹脂為Q瓊脂糖管柱且疏水相互作用管柱為苯基瓊脂糖管柱。例如，Fractogel S管柱可以包含20 mM磷酸鈉、25 mM氯化鈉之均衡緩衝液平衡，混合物可施加至管柱，管柱可以均衡緩衝液洗滌至少一次且第一溶離液可藉由以包含20 mM磷酸鈉、150 mM氯化鈉之溶離緩衝液溶離獲得。又例如，Q瓊脂糖管柱可以包含25 mM三乙醇胺、40 mM氯化鈉，pH值7.6之均衡緩衝液平衡。又例如，苯基瓊脂糖管柱可以包含20 mM磷酸鈉、1.1 M(NH4)2SO4，pH值7.0之均衡緩衝液平衡，第一徑流可施加至管 柱，管柱可以均衡緩衝液洗滌至少一次且第二溶離液可藉由執行鹽階段梯度直至11 mM磷酸鈉、0.625 M(NH4)2SO4，pH值7.0獲得。又例如，pH病毒滅活可藉由保持第一溶離液在pH值3.5下歷時約一小時達成。
關於所有上述之純化方法，在一本發明較佳實施例中，抗體為抗腫瘤壞死因子α(TNFα)抗體或其抗原結合部分。在一實施例中，抗TNFα抗體或其抗原結合部分為嵌合抗體、人源化抗體或多價抗體。在一實施例中，抗TNFα抗體或其抗原結合部分為英利昔單抗(infliximab)或高利木單抗(golimumab)。
在另一實施例中，抗TNFα抗體或其抗原結合部分為人類抗體。在一實施例中，抗TNFα抗體或其抗原結合部分為經分離人類抗體，其以均藉由表面電漿共振所測定之1×10-8 M或更小之Kd及1×10-3 s-1或更小之Koff速率常數自人類TNFα解離，且在標準活體外L929檢定中以1×10-7 M或更小之IC50值中和人類TNFα細胞毒性。
在另一實施例中，抗TNFα抗體或其抗原結合部分為具有下列特徵之經分離人類抗體：a)以如藉由表面電漿共振所測定之1×10-3 s-1或更小之Koff速率常數自人類TNFα解離；b)具有一輕鏈CDR3域，該輕鏈CDR3域包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列，或藉由在位置1、4、5、7或8上之單一丙胺酸取代或藉由在位置1、3、4、6、7、8及/或9上之一至五次保守胺基酸取代自SEQ ID NO：3修飾而得；c)具有一重鏈CDR3域，該重鏈CDR3域包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列，或藉由在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上單一丙胺酸取代或藉由在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11及/或12上一至五次保守胺基酸取代自SEQ ID NO：4修飾而得。
在另一實施例中，抗TNFα抗體或其抗原結合部分為具有包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之輕鏈可變區(LCVR)及包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區(HCVR)的經分離人類抗體。
在另一實施例中，抗TNFα抗體或其抗原結合部分為阿達木單抗。
本發明提供使用本發明之任一方法產生之如藉由HCP ELISA所量測大體上不含HCP之抗體製劑。本發明亦提供包含使用本發明之任一方法產生之HCP經減少之抗體製劑及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
本發明包括包含抗體及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物，該抗體為HCP經減少之抗體，其中如藉由HCP ELISA所量測，HCP之含量為不大於約70 ng HCP/mg抗體。在一實施例中，如藉由HCP ELISA所量測，HCP之含量為不大於約13 ng HCP/mg抗體。在另一實施例中，如藉由HCP ELISA所量測，HCP之含量為不大於約5 ng HCP/mg抗體。
本發明提供包含抗體之組合物，其中如藉由HCP ELISA檢定所測定，該組合物不含可偵測含量之HCP。
本發明亦提供使用本文中描述之任一方法產生之大體上不含原組織蛋白酶L的抗體製劑。本發明亦包括包含使用本文中描述之任一方法產生之原組織蛋白酶L經減少之抗體製劑及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
本發明提供包含抗體(原組織蛋白酶L經減少之抗體)及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物，其中原組織蛋白酶L之含量以組織蛋白酶活性計不大於約3.0 RFU/s/mg抗體。
關於所有上述抗體製劑及醫藥組合物，較佳地，抗體為抗腫瘤壞死因子α(TNFα)抗體或其抗原結合部分。在一實施例中，抗TNFα抗體或其抗原結合部分為選自由人源化抗體、嵌合抗體或多價抗體組成之群的抗體。在一實施例中，抗TNFα抗體或其抗原結合部分為英利昔單抗或高利木單抗。
在另一實施例中，抗TNFα抗體或其抗原結合部分為人類抗體。在一實施例中，抗TNFα抗體或其抗原結合部分為經分離人類抗體，其以均藉由表面電漿共振所測定之1×10-8 M或更小之Kd及1×10-3 s-1或更小之Koff速率常數自人類TNFα解離，且在標準活體外L929檢定中以1×10-7 M或更小之IC50值中和人類TNFα細胞毒性。
在另一實施例中，抗TNFα抗體或其抗原結合部分為具有下列特徵之經分離人類抗體：a)以如藉由表面電漿共振所測定之1×10-3 s-1或更小之Koff速率常數自人類TNFα解離；b)具有一輕鏈CDR3域，該輕鏈CDR3域包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列，或藉由在位置1、4、5、7或8上之單一丙胺酸取代或藉由在位置1、3、4、6、7、8及/或9上之一至五次保守胺基酸取代自SEQ ID NO：3修飾而得；c)具有一重鏈CDR3域，該重鏈CDR3域包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列，或藉由在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上單一丙胺酸取代或藉由在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11及/或12上一至五次保守胺基酸取代自SEQ ID NO：4修飾而得。
在另一實施例中，抗TNFα抗體或其抗原結合部分為具有包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之輕鏈可變區(LCVR)及包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區(HCVR)的經分離人類抗體。
在另一實施例中，抗TNFα抗體或其抗原結合部分為阿達木單抗。
本發明包括治療TNFα活性起有害作用之病症的方法，其包含向人類受檢者投與包含使用本發明任一方法獲得之抗體的醫藥組合物。在一實施例中，製劑歷經一段較長時間投與人類受檢者。在一實施例中，該段較長時間包括至少約3個月、至少約4個月或至少約5個月。
在一實施例中，TNFα活性起有害作用之病症係選自由自體免疫病 症、腸道病症及皮膚病組成之群。在一實施例中，自體免疫病症係選自由類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、骨關節炎、痛風性關節炎、過敏症、多發性硬化症、牛皮癬性關節炎、自體免疫糖尿病、自體免疫葡萄膜炎、腎病症候群及幼年型類風濕性關節炎組成之群。在另一實施例中，腸道病症為克羅恩氏病(Crohn's disease)。在另一實施例中，皮膚病為牛皮癬。
在一實施例中，醫藥組合物與另一治療劑組合投與。在一實施例中，另一治療劑為甲胺喋呤(methotrexate)。
本發明包括治療TNFα活性起有害作用之病症之方法，其包含投與人類受檢者包含使用本發明任一方法獲得之抗體之醫藥組合物。在一實施例中，製劑歷經一段較長時間投與人類受檢者。在一實施例中，該段較長時間包括至少約3個月、至少約4個月或至少約5個月。在一實施例中，TNFα活性起有害作用之病症係選自由自體免疫病症、腸道病症及皮膚病組成之群。在一實施例中，自體免疫病症係選自由類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、骨關節炎、痛風性關節炎、過敏症、多發性硬化症、牛皮癬性關節炎、自體免疫糖尿病、自體免疫葡萄膜炎、腎病症候群及幼年型類風濕性關節炎組成之群。在一實施例中，腸道病症為克羅恩氏病。在一實施例中，皮膚病為牛皮癬。
在一實施例中，醫藥組合物與另一治療劑組合投與。在一實施例中，另一治療劑為甲胺喋呤。
本發明提供一種製品，其包含包裝材料、阿達木單抗及包裝材料內所含之標籤或包裝說明書，該標籤或包裝說明書指明阿達木單抗調配物包含不超過約70 ng之HCP/mg阿達木單抗。在一實施例中，藉由HCP ELISA量測到約70 ng之HCP/mg阿達木單抗。
本發明亦提供一種製品，其包含包裝材料、阿達木單抗及包裝材料內所含之標籤或包裝說明書，該標籤或包裝說明書指明阿達木單抗 調配物包含不超過約13 ng HCP/mg阿達木單抗。在一實施例中，藉由HCP ELISA量測到約13 ng HCP/mg阿達木單抗。
本發明包括一種製品，其包含包裝材料、阿達木單抗及包裝材料內所含之標籤或包裝說明書，該標籤或包裝說明書指明阿達木單抗調配物包含不超過約5 ng HCP/mg阿達木單抗。在一實施例中，藉由HCP ELISA量測到約5 ng HCP/mg阿達木單抗。
本發明包括一種製品，其包含包裝材料、阿達木單抗及包裝材料內所含之標籤或包裝說明書，該標籤或包裝說明書指明阿達木單抗調配物包含之原組織蛋白酶L含量不大於由約3.0 RFU/s/mg阿達木單抗之組織蛋白酶L活性所指示的含量。在一實施例中，組織蛋白酶L活性由組織蛋白酶L動態檢定量測。
本發明進一步提供測定源自哺乳動物細胞表現系統之材料中原組織蛋白酶L之量的動態檢定，其包含使源自哺乳動物細胞表現系統之材料與酶接觸以將原組織蛋白酶L處理成活性組織蛋白酶L形式，以便獲得組織蛋白酶L試樣；使組織蛋白酶L試樣與組織蛋白酶L之受質接觸；及測定組織蛋白酶L試樣中組織蛋白酶L活性，其指示源自哺乳動物細胞表現系統之材料中原組織蛋白酶L之量。在一實施例中，哺乳動物細胞表現系統為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在另一實施例中，處理原組織蛋白酶L之酶為肽鏈內切酶。在另一實施例中，組織蛋白酶L之受質包含標記。在另一實施例中，標記為螢光劑。在一實施例中，螢光劑包含螢光7-胺基-4-甲基香豆素(AMC)基團。在一實施例中，組織蛋白酶L之受質包含Z-白胺酸-精胺酸。在另一實施例中，Z-白胺酸-精胺酸包含AMC基團。
圖1A及1B展示包括本發明方法(圖1A)及方法A(圖1B)之每一方法之Fractogel S層析步驟的典型溶離曲線。
圖2A及2B展示包括本發明方法(圖2A)及方法A(圖2B)之Q瓊脂糖FF層析步驟之徑流洗滌曲線的比較。
圖3A及3B展示包括方法B(圖3A)及方法A(圖3B)之苯基瓊脂糖HP層析步驟之溶離曲線的比較。
圖4展示一般方法B(鑽石形)及一般方法A(正方形)之原組織蛋白酶L逐步減少之圖解。
圖5展示一般方法B(鑽石形)及方法A(正方形)之HCP逐步減少之圖解。
圖6展示經活化之處理中試樣之動態讀數指示反應時間與螢光信號之線性關係。
圖7提供顯示阿達木單抗之離胺酸同功異形物及AR1(酸性區1)及AR2物質基於該分析之量可相比較之圖。
圖8顯示微分(第四導數)之信號處理之圖。
圖9顯示細胞培養過程中3000/6000 L之定量比較。
圖10顯示描繪新WCB(工作細胞庫)特徵(處理效能)及來自不同WCB之代表性批次之酸性區的比較之圖。
圖11顯示描繪於3000及6000標度時新WCB之AR定性比較之圖。
圖12顯示描繪於Q瓊脂糖層析之Q瓊脂糖性能之圖。
圖13顯示將Q瓊脂糖裝載物分半之圖。
圖14顯示描繪Fractogel效能之圖。
圖15顯示描繪例示之方法B Fractogel-裝載物及產率/HCP之圖。
圖16顯示描繪方法B Fractogel之圖。
圖17顯示描繪方法B O瓊脂糖之圖。
圖18顯示描繪DOE實驗之導電度-苯基瓊脂糖之圖。
I.定義
為可更容易地瞭解本發明，首先定義某些術語。
如本文中所用之術語"混合物"係指待純化之具有黏度之材料，其包含至少一種設法自亦可存在之其他物質中純化之所關注的抗體。混合物可(例如)為水溶液、有機溶劑系統或含水/有機溶劑混合物或溶液。混合物通常為包含許多生物分子(諸如蛋白質、抗體、激素及病毒)、小分子(諸如鹽、糖、脂質等)及甚至顆粒物質之複合混合物或溶液。雖然生物來源之典型混合物可能開始呈水溶液或懸浮液形式，但是其亦可含有用於先前諸如溶劑沉澱、萃取及其類似步驟之分離步驟中之有機溶劑。可含有順應於本發明各種實施例之純化之有價值生物物質的混合物的實例包括(但不限於)來自生物反應器之培養上清液、均質細胞懸浮液、血漿、血漿溶離份及奶。
自包含抗體及一或多種物質之混合物"純化"抗體意謂藉由自組合物移除(完全或部分地)至少一種物質來增加混合物中抗體之純度。物質可為雜質或污染物，諸如(但不限於)宿主細胞蛋白質(HCP)。
術語"宿主細胞蛋白質"或"HCP"係指混合物中不同於所關注之抗體且通常來自於生產抗體之來源的蛋白質。期望自最終抗體製劑中排除HCP。
術語"減少"係指減輕或削減物質的量。經減少之製劑包括相對於初始量具有較少諸如HCP或原組織蛋白酶L之物質的製劑。在一實施例中，物質為雜質或污染物。在一實施例中，術語"減少"意謂物質實質上更少。在另一實施例中，術語"減少"意謂無任何量之物質。在一實施例中，無任何量之物質包括使用本文中描述之檢定"無可偵測之量"。
術語"實質上不含"包括無任何量之物質，但亦可包括極少量之物質。在一實施例中，無任何量之物質包括使用本文中描述之檢定"無可偵測之量"。
術語"宿主細胞蛋白質(HCP)經減少"係指繼一或多個純化步驟之 後包含抗體及經減輕或削減量之HCP的組合物，其包括(但不限於)溶離液、製劑、徑流。在一實施例中，術語"HCP經減少"意謂包含抗體之組合物中HCP實質上更少。在另一實施例中，術語"HCP經減少"意謂包含抗體之組合物中無任何量之HCP。在一實施例中，術語"HCP經減少"意謂使用本文中描述之檢定在包含抗體之組合物中無任何可偵測量之HCP。
術語"原組織蛋白酶L經減少"係指繼一或多個純化步驟之後包含抗體及經減輕或削減量之原組織蛋白酶L的組合物，其包括(但不限於)溶離液、製劑、徑流。在一實施例中，術語"原組織蛋白酶L經減少"意謂包含抗體之組合物中HCP實質上更少。在另一實施例中，術語"原組織蛋白酶L經減少"意謂包含抗體之組合物中無任何量之HCP。在一實施例中，術語"原組織蛋白酶L經減少"意謂包含使用本文中描述之檢定在抗體之組合物中無任何可偵測量。
術語"可重現地降低"係指一致地達成減輕或削減量之能力，諸如至少80%之時間、更佳至少90%之時間、更佳至少95%之時間且甚至更佳至少98%之時間達成減輕或削減量的能力。
術語"離子交換分離步驟"係指以所關注之抗體及不當物質與帶電材料之離子相互作用的差異為基礎不當物質或雜質(例如HCP或原組織蛋白酶L)與所關注之抗體分離的步驟。離子交換分離步驟之實例包括(但不限於)離子交換層析，其包括陰離子交換層析及陽離子交換層析。
"離子交換材料"係指用作將不當物質或雜質(例如HCP或原組織蛋白酶L)與抗體分離之基質的離子材料。離子交換材料之實例包括陰離子樹脂及陽離子樹脂。
"陽離子交換材料"係指具有共價鍵結之帶負電配位基之離子交換樹脂，且因此其具有游離陽離子以便與樹脂所接觸之溶液中的陽離子 交換。在此項技術中已知多種陽離子交換樹脂，例如其中共價鍵結基團為羧酸酯基或磺酸酯基的彼等陽離子交換樹脂。市售陽離子交換樹脂包括CMC纖維素、SP-SephadexTM及Fast S-SepharoseTM(後兩者可購自Pharmacia)。
"陰離子交換材料"係指具有共價鍵結之帶正電基團(諸如四級胺基)的離子交換樹脂。市售陰離子交換樹脂包括DEAE纖維素、TMAE、QAE SephadexTM及Fast Q SepharoseTM(後兩者可購自Pharmacia)。
分子"鍵結"於離子交換材料意謂在合適條件(pH值/導電度)下使分子暴露於離子交換材料使得藉助於分子與離子交換材料之帶電基團之間的離子相互作用將分子可逆地固定於離子交換材料中或固定於離子交換材料上
術語"疏水相互作用步驟"係指以所關注之抗體及不當物質與疏水材料之疏水相互作用的差異為基礎將不當物質(例如HCP或原組織蛋白酶L)與所關注之抗體分離的步驟。
術語"疏水相互作用材料"係指用作將不當物質(例如HCP或原組織蛋白酶L)與抗體分離之基質的疏水材料。疏水相互作用材料之實例包括諸如具有約2至約8個碳原子之烷基或諸如苯基之芳基的疏水性配位基。
術語"洗滌"或"洗滌步驟"包括使合適緩衝液穿過或傳經所給材料，例如離子交換材料或疏水相互作用材料。
術語"複數個洗滌步驟"包括一個以上連續的洗滌步驟。連續的緩衝液可具有經設計以解離且移除與所給材料(例如離子交換材料或疏水相互作用材料)非特異性締合之不同類型雜質的不同特性，諸如pH值、導電度、溶劑濃度等。在一實施例中，該複數個洗滌步驟包括中間洗滌，其進一步包含約40-50%溶離緩衝液。
自材料中"溶離"分子(例如抗體或污染物質)意謂藉由改變材料周 圍之緩衝液且藉此降低分子與材料之相互作用來移除其中之分子。在一實施例中，抗體自離子交換管柱中溶離，其中緩衝液與抗體競爭離子交換材料上之帶電位點。
術語"溶離液"係指所關注之抗體鍵結於層析材料且添加溶離緩衝液以解離抗體之後所獲得之包含分子(例如抗體或污染物質)之液體。所提及之溶離液可與純化過程中之步驟有關。例如，術語"第一溶離液"係指來自第一層析步驟之溶離液，術語"第二溶離液"係指來自第二層析步驟之溶離液，等。
術語"徑流"係指藉由使包含分子之混合物傳經層析材料使得分子傳經材料而未鍵結所獲得之包含分子(例如抗體或污染物質)之液體。
"緩衝液"係指因其以溶解狀態存在而使得為了引起pH值單位變化所必須添加之酸或鹼的量得以增加的物質。緩衝溶液在酸鹼共軛組份的作用下阻止pH值變化。與生物學試劑一起使用之緩衝溶液通常能夠保持恆定濃度之氫離子使得溶液之pH值在生理學範圍之內。常規的緩衝液組份包括(但不限於)有機及無機鹽、酸及鹼。用於純化生物分子(例如抗體)之例示性緩衝液包括兩性離子或"Good"緩衝液，參見(例如)Good等人(1966)Biochemistry 5：467及Good及Izawa(1972)Methods Enzymol.24：62。例示性緩衝液包括(但不限於)TES、MES、PIPES、HEPES、MOPS、MOPSO、TRICINE及BICINE。
如本文中所用，"洗滌緩衝液"本文中皆指用以自抗體所鍵結之所給材料(例如離子交換材料或疏水相互作用材料)運走雜質的物質。
"溶離緩衝液"係指在以一或多種洗滌物質洗滌例如離子交換材料或疏水相互作用材料之所給材料之後自該所給材料解離抗體的物質。溶離緩衝液用以解離抗體。典型溶離物質在此項技術中熟知且可具有較高濃度之鹽、自由親和力配位基或類似物，或其他促進例如抗體之靶標物質自所給材料解離之物質。溶離緩衝液之導電度及/或pH值為抗 體自離子交換材料或疏水相互作用材料溶離的導電度及/或pH值。
術語"導電度"係指水溶液於兩個電極之間傳導電流之能力。在溶液中，電流藉由離子轉運而流動。因此，隨著存在於水溶液中之離子量的增加，溶液將具有較高導電度。導電度之計量單位為mmhos(mS/cm)，且可使用購自(例如)Orion之電導率計量測。溶液之導電度可藉由改變其中離子濃度來改變。例如，可改變溶液中緩衝劑之濃度及/或鹽(例如NaCl或KCl)之濃度以便達成所需導電度。在一實施例中，調節用於層析之洗滌緩衝液或任何其他水溶液之鹽濃度以達成所需導電度。
諸如抗體之多肽之"pI"或"等電點"係指多肽之正電荷與其負電荷均衡的pH值。pI可由多肽之胺基酸殘基之淨電荷計算或可藉由等電聚焦測定。
術語"病毒滅活"包括使得包含於混合物中之病毒無功能或自待純化之混合物移除病毒。病毒可源自生產抗體之來源、後續加工步驟或製造環境。使得病毒無功能或移除病毒之方法包括熱激活、pH滅活、化學減除活性藥劑等。術語"pH病毒滅活"包括使病毒經受足以使得病毒無功能之pH。
如本文中所用之術語"人類TNFα"(本文中縮寫為hTNFα或簡稱hTNF)意欲指以17 kD分泌形式及26 kD膜締合形式存在之人類細胞因子，其生物學上活性形式包含非共價鍵結之17 kD分子之三聚物。hTNFα之結構進一步描述於(例如)Pennica,D.等人(1984)Nature 312：724-729；Davis,J.M.等人(1987)Biochemistry 26：1322-1326；及Jones,E.Y.等人(1989)Nature 338：225-228。術語人類TNFα意欲包括重組性人類TNFα(rhTNFα)，其可藉由標準重組表現方法製備或市場購得(R & D Systems，目錄號第210-TA號，Minneapolis,MN)。TNFα亦稱為TNF。
如本文中所用，術語"抗體"意欲指包含四個多肽鏈(由二硫鍵相互連接之兩個重鏈(H)及兩個輕鏈(L))的免疫球蛋白分子。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含3個域CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域CL。VH區及VL區可進一步再分成稱為互補判定區(CDR)之高變區，其與稱為框架區(FR)之更保守之區域交替。各VH及VL包含3個CDR及4個FR，其自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本發明之抗體進一步詳細描述於美國專利第6,090,382號、第6,258,562號及第6,509,015號中，其每一者全部以引入的方式併入本文中。在一實施例中，本發明之抗體為干擾TNFα活性之抗TNFα。抗TNFα抗體之實例包括(但不限於)本文中描述之抗TNFα人類抗體及抗體部分以及描述於美國專利第6,090,382號、第6,258,562號、第6,509,015號及美國專利申請第09/801185號及第10/302356號中之彼等抗體及抗體部分，其每一者以引入的方式併入本文中。在一實施例中，用於本發明之TNFα抑制劑為抗TNFα抗體或其片段，其包括英利昔單抗(Remicade®，Johnson and Johnson；其描述於美國專利第5,656,272號中，該專利以引入的方式併入本文中)、CDP571(人源化單株抗TNFα IgG4抗體)、CDP 870(人源化單株抗TNFα抗體片段)、抗TNFdAb Peptech)、CNTO 148(高利木單抗；Medarex及Centocor)、描述於WO 02/12502中之抗體及阿達木單抗(Humira® Abbott Laboratories，人類抗TNFmAb，在US 6,090,382中描述為D2E7)。該術語包括為本發明方法之靶標之抗體的"所關注抗體"。
如本文中所用之術語抗體之"抗原結合部分"(或簡言之"抗體部分")係指保留與抗原(例如hTNFα)特異性結合之能力之抗體的一或多個片段。已展示可由全長抗體之片段執行抗體之抗原結合功能。包涵 於術語抗體之"抗原結合部分"內之結合片段的實例包括(i)Fab片段，其為由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，其為包含兩個在鉸鏈區上由二硫橋連接之Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，其由VH及CH1域組成；(iv)Fv片段，其由抗體單臂之VL及VH域組成；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH域組成；及(vi)經分離互補判定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個域(VL及VH)由獨立基因編碼，但其可使用重組方法由合成連接子接合，該連接子能夠使其製造成其中VL區及VH區成對以形成單價分子之單蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。該等單鏈抗體亦意欲包涵於術語抗體之"抗原結合部分"內。亦涵蓋其他形式之單鏈抗體，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH域及VL域表現於單一多肽鏈上，但所使用之連接子太短而不允許於同一鏈上之兩個域之間成對，藉此迫使該等域與另一鏈之互補域成對且形成兩個抗原結合位點(參見例如Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak等人(1994)Structure 2：1121-1123)。本發明抗體部分進一步詳細描述於美國專利第6,090,382號、第6,258,562號及第6,509,015號中，其每一者全部以引入的方式併入本文中。
結合片段由重組DNA技術、或由完整免疫球蛋白之酶促或化學裂解產生。結合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv、單鏈及單鏈抗體。除"雙特異性"或"雙功能性"免疫球蛋白或抗體以外，免疫球蛋白或抗體之每一結合位點應視為等同。"雙特異性"或"雙功能性抗體"為具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人造雜合抗體。雙特異性抗體可由包括融合融合瘤或連接Fab'片段之多種方法產生。參見，例如，Songsivilai & Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79：315-321 (1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148,1547-1553(1992)。
如本文中所用，"保守胺基酸取代"為一個胺基酸殘基經另一具有類似側鏈之胺基酸殘基置換的胺基酸取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族已在此項技術中定義，其包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電的極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。
"嵌合抗體"係指其中重鏈及輕鏈之每一胺基酸序列之一部分與源自特定物種或屬於特定種類之抗體中之相應序列同源，而該等鏈之其餘片段與另一物種之相應序列同源的抗體。在一實施例中，本發明之特徵為嵌合抗體或抗原結合片段，其中輕鏈及重鏈之可變區皆模擬源自一哺乳動物物種之抗體之可變區，而恆定部分與源自另一物種之抗體中之序列同源。在本發明之一較佳實施例中，嵌合抗體藉由移植來自小鼠抗體之CDR於人類抗體之構架區上製備。
"人源化抗體"係指包含至少一個包含實質上來自人類抗體鏈(稱為受體免疫球蛋白或抗體)之可變區框架殘基之鏈及至少一個實質上來自非人類抗體(例如小鼠)之互補判定區(CDR)的抗體。除移植CDR之外，人源化抗體通常經受進一步變化以便改良親和力及/或免疫原性。
術語"多價抗體"係指包含一個以上抗原識別位點之抗體。例如，"二價"抗體具有兩個抗原識別位點，而"四價"抗體具有四個抗原識別位點。術語"單特異性"、"雙特異性"、"三特異性"、"四特異性"等係指存在於多價抗體中之不同抗原識別位點特異性之數目(與抗原識別位點數目相對照)。例如，"單特異性"抗體之抗原識別位點皆結合相同抗原決定基。"二特異性"或"雙特異性"抗體具有至少一個結合第 一抗原決定基之抗原識別位點及至少一個結合不同於第一抗原決定基之第二抗原決定基之抗原識別位點。"多價單特異性"抗體具有多個皆結合相同抗原決定基之抗原識別位點。"多價雙特異性"抗體具有多個抗原識別位點，某些數目之抗原識別位點結合第一抗原決定基且某些數目之抗原識別位點結合不同於第一抗原決定基之第二抗原決定基。
如本文中所用，術語"人類抗體"意欲包括具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類抗體可包括(例如)在CDR且尤其CDR3中之不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如由活體外隨機或特定位點突變或由活體內體細胞突變所引起之突變)。然而，如本文中所用，術語"人類抗體"並不意欲包括其中源自諸如小鼠之另一哺乳動物物種之生殖系之CDR序列已移植於人類框架序列上的抗體。
如本文中所用，術語"重組性人類抗體"意欲包括由重組方法製備、表現、形成或分離之所有人類抗體，諸如使用轉染於宿主細胞(下文描述)中之重組性表現載體表現之抗體、自重組性組合人類抗體庫(下文描述)中分離之抗體、自人免疫球蛋白基因之轉殖基因動物(例如小鼠)分離之抗體(參見例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287)或由任何其他涉及剪接人類免疫球蛋白基因序列於其他DNA序列上之方法製備、表現、形成或分離的抗體。該等重組性人類抗體具有源自於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。然而，在某些實施例中，該等重組性人類抗體可經受活體外突變(或當使用人類Ig序列之轉殖基因動物時，則為活體內體細胞突變)且因此重組性抗體之VH區及VL區之胺基酸序列為雖然源自人類生殖系VH序列及VL序列且與人類生殖系VH序列及VL序列相關但可能並不自然活體內存在於人類抗體生殖系所有組成部分內之序列。
該等嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體及雙重特異性抗體可由在 此項技術中已知之重組DNA技術，例如使用描述於以下文獻中之方法產生：PCT國際申請案第PCT/US86/02269號；歐洲專利申請案第184,187號；歐洲專利申請案第171,496號；歐洲專利申請案第173,494號；PCT國際公開案第WO 86/01533號；美國專利第4,816,567號；歐洲專利申請案第125,023號；Better等人(1988)Science 240：1041-1043；Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Liu等人(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura等人(1987)Cancer Res.47：999-1005；Wood等人(1985)Nature 314：446-449；Shaw等人(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques 4：214；美國專利第5,225,539號；Jones等人(1986)Nature 321：552-525；Verhoeyan等人(1988)Science 239：1534；及Beidler等人(1988)J.Immunol.141：4053-4060；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；US 5,530,101；US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；Selick等人，WO 90/07861；及Winter，US 5,225,539。
如本文中所用，"經分離抗體"意欲指大體上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如特異性結合hTNFα之經分離抗體大體上不含特異性結合除hTNFα以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合hTNFα之經分離抗體可具有與諸如來自其他物種之TNFα分子之其他抗原的交叉反應性(以下進一步詳細討論)。此外，經分離抗體可大體上不含其他細胞物質及/或化學物。
如本文中所用，"中和抗體"(或"中和hTNFα活性之抗體")意欲指其與hTNFα之結合引起抑制hTNFα之生物活性的抗體。hTNFα生物活性之此抑制可由量測hTNFα生物活性之一或多種指示項量測，諸如hTNFα誘發之細胞毒性(活體外或者活體內)、hTNFα誘發之細胞活化及hTNFα 與hTNFα受體之結合。hTNFα生物活性之該等指示項可由在此項技術中已知之若干標準活體外或活體內檢定來評估(參見美國專利第6,090,382號)。較佳地，抗體中和hTNFα活性之能力藉由抑制hTNFα誘發針對L929細胞之細胞毒性來評估。作為hTNFα活性之另一或替代性參數，可評估抗體抑制hTNFα誘發ELAM-1表現於HUVEC上(其為hTNFα誘發之細胞活化之度量)之能力。
如本文中所用，術語"表面電漿共振"係指允許藉由(例如)使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden及Piscataway,NJ)偵測生物傳感器基質內蛋白質濃度變化來分析即時生物特異性相互作用的光學現象。對於進一步描述，可參見美國專利6,258,562之實例1及Jönsson等人(1993)Ann.Biol.Clin.51：19；Jönsson等人(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson等人(1995)J.Mol.Recognit.8：125；及Johnnson等人(1991)Anal.Biochem.198：268。
如本文中所用，術語"Koff"意欲指抗體自抗體/抗原複合物解離之脫離速率常數。
如本文中所用，術語"Kd"意欲指特定抗體-抗原相互作用之解離常數。
如本文中所用，術語"IC50"意欲指抑制所關注之生物端點(例如中和細胞毒性活性)所需之抑制劑濃度。
如本文中所用，術語"核酸分子"意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單股或雙股的，但較佳為雙股DNA。
如本文中關於編碼結合hTNFα之抗體或抗體部分(例如VH、VL、CDR3)之核酸分子所用，術語"經分離核酸分子"意欲指其中編碼抗體或抗體部分之核苷酸序列不含編碼結合除hTNFα以外之抗原之抗體或抗體部分的其他核苷酸序列，該等其他序列可在人類染色體組DNA中天然側接該核酸。因此，例如，本發明之編碼抗hTNFα抗體之VH區之 經分離核酸不含編碼結合除hTNFα以外之抗原之其他VH區的其他序列。
如本文中所用，術語"載體"意欲指能夠傳輸另一已與其連接之核酸的核酸分子。一類載體為"質體"，其係指其他DNA片段可接合於其中的環狀雙股DNA環。另一類載體為病毒載體，其中其他DNA片段可接合於病毒基因組中。某些載體能夠於該載體引入至其中之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點的細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)一旦引入宿主細胞中後可併入宿主細胞之基因組中，且藉此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導表現與其操作性連接之基因。該等載體本文中稱為"重組性表現載體"(或簡稱"表現載體")。一般而言，應用於重組DNA技術中之表現載體通常呈質體形式。在本說明書中，因為質體為載體之最通常使用形式，所以可互換使用"質體"及"載體"。然而，本發明意欲包括該等提供等效功能之其他形式的表現載體，諸如病毒載體(例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
如本文中所用，術語"重組性宿主細胞"(或簡稱"宿主細胞")意欲指重組性表現載體已引入其中之細胞。應瞭解該等術語意欲不僅指特定主體細胞，而且指該細胞之子代。因為某些修飾可由於突變或環境影響而發生於繼代中，所以該子代實際上可能與母細胞不同，但仍包括於如本文中所用術語"宿主細胞"之範疇內。
如本文中所用，術語"套組"係指包含組份之封裝產品或製品。套組較佳包含容納套組之組份的箱子或容器。箱子或容器黏貼有標籤或食品及藥物管理局批准之協議。箱子或容器容納較佳包含於塑膠、聚乙烯、聚丙烯、乙烯或丙烯器皿內之本發明組份。器皿可為封端管或瓶。套組亦可包括投與本發明之TNFα抗體之用法說明書。在一實施例中，本發明之套組包括如PCT/IB03/04502及美國申請案第10/222140號 中所述之包含人類抗體D2E7之調配物。
本發明之各種態樣進一步詳細描述於本文中。
II.抗體生產
本發明提供自包含抗體及一或多種HCP之混合物純化抗體之方法。初始混合物通常為由重組性生產該抗體所產生之混合物。或者，初始混合物可由藉由肽合成(或其他合成方式)生產該抗體而產生或抗體可自抗體之天然來源純化。
為表現本發明之抗體或抗體部分，使編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA插入表現載體中使得基因操作性連接至轉錄及轉譯控制序列。在此上下文中，術語"操作性連接"意欲意謂抗體基因接合至載體中使得載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調節抗體基因轉錄及轉譯之預期功能。選擇表現載體及表現控制序列以使其與使用之表現宿主細胞相容。可使抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入獨立載體中或更通常使兩種基因插入同一表現載體中。抗體基因藉由標準方法插入表現載體中，(例如抗體基因片段及載體上之互補限制酶切位點之連接反應，或若不存在限制酶切位點則鈍端連接反應)。在插入抗體或抗體相關輕鏈或重鏈序列之前，表現載體可能已帶有抗體恆定區序列。例如，一種轉換阿達木單抗或阿達木單抗相關VH及VL序列為全長抗體基因之方法為將其插入於已分別編碼重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體中，使得VH片段操作性連接至載體內之CH片段且VL片段操作性連接至載體內之CL片段。另外或者替代地，重組性表現載體可編碼有助於自宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。抗體鏈基因可選殖於載體中使得信號肽同框連接至抗體鏈基因之胺基末端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(亦即來自非免疫球蛋白蛋白質之信號肽)。
除抗體鏈基因之外，本發明之重組性表現載體帶有控制抗體鏈基因在宿主細胞中之表現之調節序列。術語"調節序列"意欲包括啟動 子、強化子及其他控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯之表現控制元件(例如多聚腺嘌呤信號)。該等調節序列描述於(例如)Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中。熟習此項技術者將瞭解包括選擇調節序列之表現載體之設計可視諸如待轉型之宿主細胞之選擇、所需蛋白質之表現量等之因子而定。用於哺乳動物宿主細胞表現之較佳調節序列包括引導哺乳動物細胞中高蛋白質表現量之病毒元素，諸如由細胞巨化病毒(CMV)(諸如CMV啟動子/強化子)、猴病毒40(SV40)(諸如SV40啟動子/強化子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒衍生之啟動子及/或強化子。對於病毒調節元素及其序列之其他描述，參見例如Stinski之美國專利第5,168,062號、Bell等人之美國專利第4,510,245號及Schaffner等人之美國專利第4,968,615號。
除抗體鏈基因及調節序列之外，本發明之重組性表現載體可帶有其他序列，諸如調節載體在宿主細胞中之複製的序列(例如複製起點)及可選擇的標記基因。可選擇的標記基因有助於選擇載體已引入其中之宿主細胞(參見例如皆屬Axel等人之美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號)。例如，通常可選擇的標記基因將對於諸如G418、濕黴素或甲胺喋呤之藥物之抗藥性賦予載體已引入其中之宿主細胞。較佳可選擇性標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於經甲胺喋呤選擇/擴增之dhfr-宿主細胞中)及neo基因(用於G418選擇)。
對於輕鏈及重鏈之表現而言，編碼該等重鏈及輕鏈之表現載體經由標準技術轉染至宿主細胞中。多種形式之術語"轉染"意欲涵蓋通常用於將外生性DNA引入原核或真核宿主細胞中之多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖轉染及其類似技術。儘管使本發明之抗體在原核或真核宿主細胞中表現理論上為可能的，但是抗體在真核 細胞且最佳哺乳動物宿主細胞中表現最佳，此係由於該等真核細胞且尤其哺乳動物細胞比原核細胞更有可能組裝且分泌經適當折疊及免疫活性之抗體。已報導抗體基因之原核表現對於製備高產率之活性抗體而言無效(Boss及Wood(1985)Immunology Today 6：12-13)。
本文中用於在載體中選殖或表現DNA之合適宿主細胞為原核生物細胞、酵母細胞或如上所述更高級真核生物細胞。用於該目的之合適原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性生物體或格蘭氏陽性生物體，例如，腸內菌科(Enterobacteriaceae)，諸如埃希氏菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌(E.coli))、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門菌屬(Salmonella)(例如鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌屬(Serratia)(例如黏質沙雷菌(Serratia marcescans))及志賀菌屬(Shigella)；以及芽孢桿菌屬(Bacilli)，諸如枯草桿菌(B.subtilis)及地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如在1989年4月12日公開之DD 266,710中揭示之地衣芽孢桿菌41P)；假單胞菌屬(Pseudomonas)，諸如綠膿桿菌(P.aeruginosa)；及鏈黴菌。一種較佳大腸桿菌選殖宿主為大腸桿菌294(ATCC 31,446)，但是諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)之其他菌株亦適合。該等實例為例示性的而非限制性的。
除原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為用於編碼多肽之載體之適合選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常見麵包酵母為較低級真核宿主微生物中最通常使用者。然而，大量其他屬、種類及菌株通常可購得且適用於本文中，諸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；刻魯維拉菌(Kluyveromyces)宿主，諸如乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、維克拉米克魯維酵母(K.wickeramii)ATCC 24,178)、沃爾第克魯維酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)及馬克西安克魯維酵母(K.marxianus)；耶氏酵母(yarrowia)(EP 402,226)；甲醇酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假絲酵母(Candida)；裏氏木黴(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)；施氏酵母(Schwanniomyces)，諸如施氏西洋酵母(Schwanniomyces occidentalis)；及絲狀真菌，諸如脈孢菌(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、彎頸黴菌(Tolypocladium)及麯黴屬宿主，諸如構巢麯黴(A.nidulans)及黑曲黴菌(A.niger)。
用於表現糖基化抗體之適合宿主細胞源自於多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑定眾多的桿狀病毒株及變異體及來自諸如草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)及家蠶(Bombyx mori)之宿主的相應允許昆蟲宿主細胞。可公開可用的有多種用於轉染之病毒株，例如苜蓿丫紋夜蛾NPV之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5菌株，且根據本發明，該等病毒可用作本文中之尤其用於轉染草地黏蟲細胞之病毒。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛花、番茄及菸草之植物細胞培養物亦可用作宿主。
用於表現本發明之重組抗體之較佳哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary)(CHO細胞)(包括dhfr-CHO細胞，Urlaub及Chasin,(1980)PNAS USA 77：4216-4220中所述，與DHFR可選擇性標記一起使用，例如如Kaufman及Sharp(1982)Mol.Biol. 159：601-621中所述)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，該等抗體係 藉由將該等宿主細胞培養一段足以允許該抗體在宿主細胞中表現或更佳該抗體分泌至該等宿主細胞生長於其中之培養基中的時間來製備。適用之哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40轉型之猴腎CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎株(經次選殖以生長於懸浮培養物中之293或293細胞，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠塞爾托利氏細胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤株(Hep G2)。
宿主細胞經用於生產抗體之上述表現或選殖載體轉型且在視情況經修飾之習知營養培養基中培養以便誘發啟動子、選擇轉型體，或擴增編碼所需序列之基因。
用以產生抗體之宿主細胞可於多種培養基中培養。諸如Ham's F10(Sigma)、最低必需培養基(Minimal Essential Medium)(MEM)、(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)及杜貝卡氏經改良依格培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM)、Sigma))之市售培養基適於培養宿主細胞。此外，描述於以下文獻中之任一培養基均可用作宿主細胞之培養基：Ham等人，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等人，Anal.Biochem.102：255(1980)；美國專利第4,767,704號；第4,657,866號；第4,927,762號；第4,560,655號；或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利第30,985參考案號。任何該等培養基可根據需要補充有激 素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、磷酸鈣、磷酸鎂及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如慶大黴素(gentamycin)藥物)、痕量元素(定義為通常以微莫耳濃度範圍中之最終濃度存在之無機化合物)，及葡萄糖或等效能源。熟習此項技術者已知之任何其他必要補充劑亦可以合適濃度包括在內。諸如溫度、pH值及其類似條件之培養條件為經選擇用以表現之宿主細胞先前所使用之彼等培養條件，且將對於普通熟習此項技術者而言為顯而易見的。
宿主細胞亦可用以產生完整抗體之部分，諸如Fab片段或scFv分子。應瞭解關於上述程序之變化在本發明之範疇之內。例如，可能需要以編碼本發明抗體之輕鏈或者重鏈(而非兩者)之DNA轉染宿主細胞。重組DNA技術亦可用以移除編碼不為與hTNFα結合所需的輕鏈及重鏈之任一者或兩者之DNA的一些或全部。本發明之抗體亦涵蓋由該等截斷DNA分子所表現之分子。此外，可藉由以標準化學交聯方法使本發明抗體與第二抗體交聯來產生其中一重鏈及一輕鏈為本發明抗體且另一重鏈及輕鏈具有針對除hTNFα以外的抗原之特異性的雙功能抗體。
在重組性表現本發明之抗體或其抗原結合部分之較佳系統中，藉由磷酸鈣介導之轉染將編碼抗體重鏈與抗體輕鏈之重組性表現載體引入dhfr-CHO細胞中。在重組性表現載體內，抗體重鏈及輕鏈基因各自與CMV強化子/AdMLP啟動子調節元素操作性連接以達成較高程度之基因轉錄。重組性表現載體亦帶有DHFR基因，其使得可選擇已使用甲胺喋呤選擇/擴增而以該載體轉染之CHO細胞。培養所選擇之轉型體宿主細胞以使得可表現抗體重鏈及輕鏈且自培養基中回收完整抗體。使用標準分子生物學技術來製備重組性表現載體、轉染宿主細胞、選擇轉型體、培養宿主細胞及自培養基回收抗體。
本發明之重組性人類抗體加上本文中所揭示之阿達木單抗或其抗原結合部分或阿達木單抗相關之抗體可藉由篩檢使用由源自人類淋巴細胞之mRNA所製備之人類VL及VH cDNA製備之重組性組合抗體庫(較佳scFv噬菌體呈現庫)來分離。此項技術中已知製備及篩檢該等庫之方法。除產生噬菌體呈現庫之市售套組(例如Pharmacia重組性噬菌體抗體系統，目錄號27-9400-01；及Stratagene SurfZAP TM噬菌體呈現套組，目錄號240612)之外，尤其適合用以產生及篩檢抗體呈現庫之方法及試劑的實例可見於(例如)Ladner等人美國專利第5,223,409號；Kang等人PCT公開案第WO 92/18619號；Dower等人PCT公開案第WO 91/17271號；Winter等人PCT公開案第WO 92/20791號；Markland等人PCT公開案第WO 92/15679號；Breitling等人PCT公開案第WO 93/01288號；McCafferty等人PCT公開案第WO 92/01047號；Garrard等人PCT公開案第WO 92/09690號；Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等人(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse等人(1989)Science 246：1275-1281；McCafferty等人，Nature(1990)348：552-554；Griffiths等人(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等人(1992)J Mol Biol 226：889-896；Clackson等人(1991)Nature 352：624-628；Gram等人(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrard等人(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；及Barbas等人(1991)PNAS 88：7978-7982。
當使用重組技術時，抗體可以細胞內方式產生，在細胞周質間隙中產生，或直接分泌於培養基中。若抗體以細胞內方式產生，則作為第一步驟，例如藉由離心或超濾作用移除作為宿主細胞或溶解細胞之微粒碎片(例如由均質化作用引起)。當抗體分泌於培養基中時，來自該等表現系統之上清液通常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置)濃縮。
在本發明方法之前，自細胞碎片中純化抗體之程序最初視抗體之表現位點而定。可促使自細胞中直接分泌某些抗體至周圍生長培養基中；其他以細胞內方式產生。對於後者抗體而言，純化過程之第一步驟涉及：溶解細胞，其可藉由包括機械剪切、滲透壓衝擊或酶促處理之多種方法來進行。該破壞將細胞全部內容物釋放至勻漿中，且另外產生歸因於其小尺寸而難以移除之亞細胞片段。該等物質通常藉由差速離心或藉由過濾來移除。當抗體分泌至培養基中時，來自該等表現系統之上清液通常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置)濃縮。當抗體分泌至培養基中時，重組宿主細胞亦可藉由切向流動過濾與細胞培養基分離。可使用本發明之抗體純化方法進一步自培養基中回收抗體。
在一實施例中，本發明之方法包括人類抗體或其抗原結合部分，其以高親和力及低脫離速率與人類TNFα結合，且具有高中和能力。較佳地，人類抗體為重組性中和人類抗hTNFα抗體。用於本發明方法之最佳重組性中和抗體於本文中稱為阿達木單抗，亦稱為阿達木單抗(Humira®)，及D2E7(D2E7 VL區之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：1中；D2E7 VH區之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：2中)。D2E7(阿達木單抗；Humira®)之特性已描述於Salfeld等人美國專利第6,090,382號、第6,258,562號及第6,509,015號中，其各自以引入的方式併入本文中。TNFα抗體之其他實例包括已經受治療類風濕性關節炎之臨床試驗之嵌合及人源化鼠類抗hTNFα抗體(參見例如Elliott等人(1994)Lancet 344：1125-1127；Elliot等人(1994)Lancet 344：1105-1110；Rankin等人(1995)Br.J.Rheumatol. 34：334-342)。在另一實施例中，用於本發明之TNFα抗體為英利昔單抗(Remicade®，Johnson and Johnson；描述於以引入的方式併入本文中之美國專利第5,656,272號中)、CDP571(人源化單株抗TNFα IgG4抗體)、CDP 870(人源化單株抗TNFα抗體片段)、抗 TNF dAb(Peptech)及CNTO 148(高利木單抗；Medarex及Centocor，亦參見WO 02/12502)。
在一實施例中，本發明之方法包括阿達木單抗抗體及抗體部分、阿達木單抗相關之抗體及抗體部分，及其他具有與阿達木單抗等效特性(諸如與hTNFα結合之高親和力以及低解離動力學及高中和能力)之人類抗體及抗體部分。在一實施例中，本發明提供以經分離人類抗體或其抗原結合部分所進行之治療，該人類抗體或其抗原結合部分以均藉由表面電漿共振所測定之1×10-8 M或更小之Kd及1×10-3 s-1或更小之Koff速率常數自人類TNFα解離，且在標準活體外L929檢定中以1×10-7 M或更小之IC50值中和人類TNFα細胞毒性。更佳地，該經分離人類抗體或其抗原結合部分以5×10-4 s-1或更小之Koff或甚至更佳以1×10-4 s-1或更小之Koff自人類TNFα解離。更佳地，經分離人類抗體或其抗原結合部分在標準活體外L929檢定中以1×10-8 M或更小之IC50、甚至更佳以1×10-9 M或更小之IC50且仍更佳以1×10-10 M或更小之IC50中和人類TNFα細胞毒性。在一較佳實施例中，抗體為經分離之人類重組性抗體或其抗原結合部分。
在此項技術中熟知抗體重鏈及輕鏈CDR3域在抗體對於抗原之結合特異性/親和力中扮演重要角色。因此，在另一態樣中，本發明係關於藉由投與使用本發明方法所獲得之人類抗體來治療類風濕性關節炎之方法，其中該抗體具有便於與hTNFα締合之較慢解離動力學且所具有之輕鏈及重鏈CDR3域在結構上與阿達木單抗之彼等域一致或與其有關。阿達木單抗VL CDR3之位置9可由Ala或Thr佔據而大體上不影響Koff。因此，阿達木單抗VL CDR3之一致基元包含胺基酸序列：Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A)(SEQ ID NO：3)。另外，阿達木單抗VH CDR3之位置12可由Tyr或Asn佔據，而大體上不影響Koff。因此，阿達木單抗VL CDR3之一致基元包含胺基酸序列：V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID NO：4)。此外，如美國專利第6,090,382號之實例2中證明，阿達木單抗重鏈及輕鏈之CDR3域順應經單一丙胺酸殘基之取代(在VL CDR3內位置1、4、5、7或8上或在VH CDR3內位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上)而大體上不影響Koff。另外，熟習此項技術者應理解，在給定阿達木單抗VL及VH CDR3域對於丙胺酸取代之順應性的情況下，可尤其經保守胺基酸之取代而取代CDR3域內之其他胺基酸，同時仍保留抗體之低脫離速率常數。較佳地，在阿達木單抗VL及/或VH CDR3域內進行不超過一至五次保守胺基酸取代。更佳地，在阿達木單抗VL及/或VH CDR3域內進行不超過一至三次保守胺基酸取代。另外，在對於與hTNFα結合至關重要之胺基酸位置處不應進行保守胺基酸取代。阿達木單抗VL CDR3之位置2及5及阿達木單抗VH CDR3之位置1及7似乎對於與hTNFα相互作用至關重要且因此，較佳不在該等位置進行保守胺基酸取代(儘管阿達木單抗VL CDR3之位置5處之丙胺酸取代可以接受(如上所述))(參見美國專利第6,090,382號)。
因此，在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分較佳含有下列特徵：a)以如藉由表面電漿共振所測定之1×10-3 s-1或更小之Koff速率常數自人類TNFα解離；b)具有一輕鏈CDR3域，該輕鏈CDR3域包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列，或藉由在位置1、4、5、7或8上之單一丙胺酸取代或藉由在位置1、3、4、6、7、8及/或9上之一至五次保守胺基酸取代自SEQ ID NO：3修飾而得；c)具有一重鏈CDR3域，該重鏈CDR3域包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列，或藉由在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上單一丙胺酸取代或藉由在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11及/或12上一至五次保守胺基酸取代自SEQ ID NO：4修飾而得。
更佳地，抗體或其抗原結合部分以5×10-4 s-1或更小之Koff自人類TNFα解離。甚至更佳地，抗體或其抗原結合部分以1×10-4 s-1或更小之Koff自人類TNFα解離。
在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分較佳含有一輕鏈可變區(LCVR)，該輕鏈可變區(LCVR)具有包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列或藉由在位置1、4、5、7或8上單一丙胺酸取代自SEQ ID NO：3修飾之CDR3域；及一重鏈可變區(HCVR)，該重鏈可變區(HCVR)具有包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列或藉由在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上單一丙胺酸取代自SEQ ID NO：4修飾之CDR3域。較佳地，LCVR另外具有包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之CDR2域(亦即阿達木單抗VL CDR2)且HCVR另外具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之CDR2域(亦即阿達木單抗VH CDR2)。甚至更佳地，LCVR另外具有包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之CDR1域(亦即阿達木單抗VL CDR1)且HCVR另外具有包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之CDR1域(亦即阿達木單抗VH CDR1)。VL之構架區較佳來自VκI人類生殖系家族，更佳來自A20人類生殖系Vk基因且最佳來自美國專利第6,090,382號之圖1A及1B中所展示之阿達木單抗VL框架序列。VL之構架區較佳來自VH3人類生殖系家族，更佳來自DP-31人類生殖系VH基因且最佳來自美國專利第6,090,382號之圖2A及2B中所展示之阿達木單抗VH框架序列。
因此，在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分較佳含有一包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之輕鏈可變區(LCVR)(亦即阿達木單抗VL)及一包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區(HCVR)(亦即阿達木單抗VH)。在某些實施例中，抗體包含重鏈恆定區，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區。較佳地，重鏈恆定區為IgG1重鏈恆定區或IgG4重鏈恆定區。此外，抗體可包含輕鏈恆定區，其為κ輕鏈恆定區或λ輕鏈恆定區。較佳地，抗體包含κ輕鏈恆定區。 或者，抗體部分可為(例如)Fab片段或單鏈Fv片段。
在其他實施例中，抗體或其抗原結合部分較佳含有阿達木單抗(例如抗體或其抗原結合部分)相關之VL及VH CDR3域，輕鏈可變區(LCVR)具有包含選自由以下各胺基酸序列組成之群之胺基酸序列的CDR3域：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26，或重鏈可變區(HCVR)具有包含選自由以下各胺基酸序列組成之群之胺基酸序列的CDR3域：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35。
用於本發明之TNFα抗體可經修飾。在某些實施例中，TNFα抗體或其抗原結合片段以化學方式修飾以提供所需效應。例如，本發明抗體及抗體片段之聚乙二醇化可藉由此項技術中已知之如(例如)在以下參考文獻中所描述之任何聚乙二醇化反應來執行：Focus on Growth Factors 3：4-10(1992)；EP 0 154 316及EP 0 401 384(其每一者全部以引入的方式併入本文中)。較佳地，聚乙二醇化經由與反應性聚乙二醇分子(或類似的反應性水溶性聚合物)之醯基化反應或烷基化反應來執行。用於本發明抗體及抗體片段之聚乙二醇化之較佳水溶性聚合物為聚乙二醇(PEG)。如本文中所用，"聚乙二醇"意欲涵蓋已用以衍生其他蛋白質之任何形式之PEG，諸如單(Cl-ClO)烷氧基-聚乙二醇或單(Cl-ClO)芳氧基-聚乙二醇。
製備本發明聚乙二醇化抗體及抗體片段之方法通常包含以下各步驟：(a)在藉以使抗體或抗體片段變得連接至一或多個PEG基團之條件下，使抗體或抗體片段與諸如PEG之反應性酯或醛衍生物的聚乙二 醇反應，及(b)獲得反應產物。一般熟習此項技術者顯而易見基於已知參數及所需結果來選擇最佳反應條件或醯基化反應。
聚乙二醇化抗體及抗體片段通常可藉由投與本文中所描述之TNFα抗體及抗體片段來治療本發明之TNFα相關之病症。與未聚乙二醇化抗體及抗體片段相比，聚乙二醇化抗體及抗體片段通常具有增加之半衰期。聚乙二醇化抗體及抗體片段可單獨、共同或與其他醫藥組合物組合來使用。
在本發明另一實施例中，可改變TNFα抗體或其片段，其中抗體之恆定區經修飾以相對於未修飾之抗體而言降低至少一種由恆定區介導之生物效應功能。為修飾本發明抗體以使得其所顯示之與Fc受體之結合減少，抗體之免疫球蛋白恆定區片段可在Fc受體(FcR)相互作用所需的特定區域上進行突變。(參見例如Canfield及Morrison(1991)J.Exp.Med. 173：1483-1491；及Lund等人(1991)J.of Immunol. 147：2657-2662)。降低抗體之FcR結合能力亦可降低其他依賴FcR相互作用之效應功能，諸如調理作用及吞噬作用及抗原依賴性細胞毒性。
本發明抗體或抗體部分可衍生化或與另一官能分子(例如另一肽或蛋白質)連接。因此，本發明抗體及抗體部分意欲包括本文中描述之人類抗hTNFα抗體之經衍生及以其他方式修飾之形式，包括免疫黏附分子。例如，本發明抗體或抗體部分可與一或多種諸如以下各物之其他分子實體功能性地連接(藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或以其他方式)：另一抗體(例如雙特異性抗體或雙功能抗體)、可偵測藥劑、細胞毒性藥劑、醫藥劑及/或可介導抗體或抗體部分與另一分子之締合的蛋白質或肽(諸如抗生蛋白鏈菌素核心區域或聚組胺酸標記)。
一類衍生化之抗體藉由使兩個或兩個以上抗體(相同類型或不同類型，例如為了形成雙特異性抗體)交聯來產生。適合交聯劑包括具有異質雙功能性(具有兩個由合適間隔基(例如m-馬來醯亞胺苯甲醯基 -N-羥基琥珀醯亞胺酯)分離之獨特反應性基團)或同質雙功能性(例如辛二酸二琥珀醯亞胺基酯)之彼等交聯劑。該等連接子可獲自Pierce Chemical Company,Rockford,IL。
可用來使本發明抗體或抗體部分衍生化之適用可偵測藥劑包括螢光化合物。例示性螢光可偵測藥劑包括螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅蛋白及其類似物。抗體亦可使用諸如鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶、葡萄糖氧化酶及其類似物之可偵測酶來衍生化。當抗體使用可偵測酶來衍生化時，其藉由添加其他由酶用來產生可偵測反應產物的試劑來偵測。例如，當所存在之可偵測藥劑為辣根過氧化酶時，添加過氧化氫及二胺基聯苯胺以產生可偵測之顯色反應產物。抗體亦可使用生物素來衍生化，且藉由間接量測抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合來偵測。
本發明抗體或抗體部分可藉由在宿主細胞中重組表現免疫球蛋白輕鏈及重鏈基因來製備。為重組表現抗體，將宿主細胞以一或多個帶有編碼抗體之免疫球蛋白輕鏈及重鏈之DNA片段的重組表現載體轉染以使得輕鏈及重鏈表現於宿主細胞中，且較佳分泌至宿主細胞培養於其中之培養基中，可自培養基中回收抗體。使用諸如在以下各參考案中描述之標準重組DNA方法來獲得抗體重鏈及輕鏈基因，將該等基因併入重組表現載體中且將載體引入宿主細胞中：Sambrook,Fritsch及Maniatis(編)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989),Ausubel等人(編)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,(1989)及Boss等人之美國專利第4,816,397號。
為表現阿達木單抗或阿達木單抗相關之抗體，首先獲得編碼輕鏈及重鏈可變區之DNA片段。該等DNA可藉由使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增及修飾生殖系輕鏈及重鏈可變序列來獲得。在此項技術中已知人 類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列(參見例如"Vbase"人類生殖系序列資料庫；亦參見Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國健康與人類服務部，NIH公開案第91-3242號；Tomlinson等人(1992)"The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J.Mol.Biol. 227：776-798；及Cox等人(1994)"A Directory of Human Germ-line V78 Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur.J.Immunol. 24：827-836；該等文獻中之每一者之內容均以引用的方式明確併入本文中)。為獲得編碼阿達木單抗或阿達木單抗相關抗體之重鏈可變區之DNA片段，人類生殖系VH基因之VH3家族之成員藉由標準PCR擴增。最佳地，擴增DP-31 VH生殖系序列。為獲得編碼阿達木單抗或阿達木單抗相關抗體之輕鏈可變區之DNA片段，人類生殖系VL基因之VκI家族之成員藉由標準PCR擴增。最佳地，擴增A20 VL生殖系序列。適用於擴增DP-31生殖系VH及A20生殖系VL序列之PCR引子可根據前文引述之參考文獻中揭示之核苷酸序列使用標準方法來設計。
一旦獲得生殖系VH及VL片段，則該等序列可進行突變以編碼本文中揭示之阿達木單抗或阿達木單抗相關之胺基酸序列。生殖系VH及VL DNA序列編碼之胺基酸序列首先與阿達木單抗或阿達木單抗相關之VH及VL胺基酸序列相比較以鑑定阿達木單抗或阿達木單抗相關之序列中之不同於生殖系的胺基酸殘基。隨後，生殖系DNA序列之合適核苷酸進行突變以使得經突變之生殖系序列藉由使用遺傳密碼來測定將作何種核苷酸變化，從而編碼阿達木單抗或阿達木單抗相關之胺基酸序列。生殖系序列之突變藉由標準方法執行，諸如PCR介導之突變(其中經突變之核苷酸併入PCR引子中以使得PCR產物含有突變作用)或定點突變。
一旦獲得編碼阿達木單抗或阿達木單抗相關之VH及VL區段之DNA片段(藉由生殖系VH及VL基因之擴增及突變，其如上所述)，則該等DNA片段可進一步藉由標準重組DNA技術來處理以便(例如)將可變區基因轉換為全長抗體鏈基因、轉換為Fab片段基因或轉換為scFv基因。在該等處理中，編碼VL或VH之DNA片段與另一編碼另一蛋白質之DNA片段(諸如抗體恆定區或可撓性連接子)操作性連接。如本上下文中所使用，術語"操作性連接"意欲意謂接合兩個DNA片段以使得兩個DNA片段所編碼之胺基酸序列保持同框。
經分離之編碼VH區之DNA可藉由使編碼VH之DNA與另一編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之DNA分子操作性連接而轉化為全長重鏈基因。在此項技術中已知人類重鏈恆定區基因之序列(參見例如Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國健康與人類服務部，NIH公開案第91-3242號)且涵蓋該等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳為IgG1或IgG4恆定區。對於Fab片段重鏈基因而言，編碼VH之DNA可與另一僅編碼重鏈CH1恆定區之DNA分子操作性連接。
經分離之編碼VL區之DNA可藉由使編碼VL之DNA與另一編碼輕鏈恆定區(CL)之DNA分子操作性連接而轉化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。在此項技術中已知人類輕鏈恆定區基因之序列(參見例如Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國健康與人類服務部，NIH公開案第91-3242號)且涵蓋該等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，但最佳為κ恆定區。
為形成scFv基因，使編碼VH及VL之DNA片段與另一編碼可撓性連接子(例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3)之片段操作性連接以使得VH 及VL序列可表現為鄰接的單鏈蛋白質，VL與VH區由可撓性連接子接合(參見例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，Nature(1990)348：552-554)。
為表現本發明抗體或抗體部分，使如上所述而獲得之編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA插入表現載體中以使得基因與轉錄及轉譯控制序列操作性連接。在此上下文中，術語"操作性連接"意欲意謂抗體基因接合至載體中以使得載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調節抗體基因之轉錄及轉譯的預期功能。選擇表現載體及表現控制序列以使其與所使用之表現宿主細胞相容。可使抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入獨立載體中，或更通常兩種基因插入同一表現載體中。抗體基因藉由標準方法(例如抗體基因片段及載體上之互補限制酶切位點之連接反應，或若不存在限制酶切位點則鈍端連接反應)插入表現載體中。在插入阿達木單抗或阿達木單抗相關輕鏈或重鏈序列之前，表現載體可能已帶有抗體恆定區序列。例如，一種將阿達木單抗或阿達木單抗相關VH及VL序列轉換為全長抗體基因之方法為將其插入至已分別編碼重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體中，以使得VH片段與載體內之CH片段操作性連接且VL片段與載體內之CL片段操作連接。另外或替代地，重組表現載體可編碼信號肽以有助於自宿主細胞分泌抗體鏈。抗體鏈基因可選殖至載體中以使得信號肽以同框方式與抗體鏈基因之胺基末端連接。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(亦即來自非免疫球蛋白蛋白質之信號肽)。
除抗體鏈基因之外，本發明重組表現載體帶有控制抗體鏈基因在宿主細胞中之表現的調節序列。術語"調節序列"意欲包括啟動子、強化子及其他控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯之表現控制元件(例如多聚腺嘌呤信號)。例如，該等調節序列描述於Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中。熟習此項技術者應瞭解包括選擇調節序列之表現載體之設計可視諸如待轉型之宿主細胞之選擇、所需蛋白質之表現量等而定。用於哺乳動物宿主細胞表現之較佳調節序列包括引導哺乳動物細胞中高蛋白質表現量之病毒元素，諸如由細胞巨化病毒(CMV)(諸如CMV啟動子/強化子)、猴病毒40(SV40)(諸如SV40啟動子/強化子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒衍生之啟動子及/或強化子。對於病毒調節元素及其序列之其他描述，參見例如Stinski之美國專利第5,168,062號、Bell等人之美國專利第4,510,245號及Schaffner等人之美國專利第4,968,615號。
除抗體鏈基因及調節序列之外，本發明之重組性表現載體可帶有其他序列，諸如調節載體在宿主細胞中之複製的序列(例如複製起點)及可選擇的標記基因。可選擇的標記基因有助於選擇載體已引入其中之宿主細胞(參見例如皆屬Axel等人之美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號)。例如，通常可選擇的標記基因將對於諸如G418、濕黴素或甲胺喋呤之藥物之抗藥性賦予載體已引入其中之宿主細胞。較佳可選擇性標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於經甲胺喋呤選擇/擴增之dhfr-宿主細胞中)及neo基因(用於G418選擇)。
對於輕鏈及重鏈之表現而言，編碼該等重鏈及輕鏈之表現載體經由標準技術轉染至宿主細胞中。多種形式之術語"轉染"意欲涵蓋通常用於將外生性DNA引入原核或真核宿主細胞中之多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖轉染及其類似技術。儘管使本發明之抗體在原核或真核宿主細胞中表現理論上為可能的，但是抗體在真核細胞且最佳哺乳動物宿主細胞中表現最佳，此係由於該等真核細胞且尤其哺乳動物細胞比原核細胞更有可能組裝且分泌經適當折疊及免疫 活性之抗體。已報導抗體基因之原核表現對於製備高產率之活性抗體而言無效(Boss及Wood(1985)Immunology Today 6：12-13)。
用於表現本發明之重組抗體之較佳哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括dhfr-CHO細胞，Urlaub及Chasin,(1980)PNAS USA 77：4216-4220中所述，與DHFR可選擇性標記一起使用，例如如Kaufman及Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所述)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，該等抗體係藉由將該等宿主細胞培養一段足以允許該抗體在宿主細胞中表現或更佳該抗體分泌至該等宿主細胞在其中生長之培養基中的時間來製備。抗體可使用蛋白質純化方法自培養基中回收。
宿主細胞亦可用以產生完整抗體之部分，諸如Fab片段或scFv分子。應瞭解關於上述程序之變化在本發明之範疇之內。例如，可能需要以編碼本發明抗體之輕鏈或者重鏈(而非兩者)之DNA轉染宿主細胞。重組DNA技術亦可用以移除編碼不為與hTNFα結合所需的輕鏈及重鏈之任一者或兩者之DNA的一些或全部。本發明之抗體亦涵蓋由該等截斷DNA分子所表現之分子。此外，可藉由以標準化學交聯方法使本發明抗體與第二抗體交聯來產生其中一重鏈及一輕鏈為本發明抗體且另一重鏈及輕鏈具有針對除hTNFα以外的抗原之特異性的雙功能抗體。
在重組性表現本發明之抗體或其抗原結合部分之較佳系統中，藉由磷酸鈣介導之轉染將編碼抗體重鏈與抗體輕鏈之重組性表現載體引入dhfr-CHO細胞中。在重組性表現載體內，抗體重鏈及輕鏈基因各自與CMV強化子/AdMLP啟動子調節元素操作性連接以達成較高程度之基因轉錄。重組性表現載體亦帶有DHFR基因，其使得可選擇已使用甲胺喋呤選擇/擴增而以該載體轉染之CHO細胞。培養所選擇之轉型體宿 主細胞以使得可表現抗體重鏈及輕鏈且自培養基中回收完整抗體。使用標準分子生物學技術來製備重組性表現載體、轉染宿主細胞、選擇轉型體、培養宿主細胞及自培養基回收抗體。
本發明之重組性人類抗體加上本文中所揭示之阿達木單抗或其抗原結合部分或阿達木單抗相關之抗體可藉由篩檢使用由源自人類淋巴細胞之mRNA所製備之人類VL及VH cDNA製備之重組性組合抗體庫(較佳scFv噬菌體呈現庫)來分離。此項技術中已知製備及篩檢該等庫之方法。除產生噬菌體呈現庫之市售套組(例如Pharmacia重組性噬菌體抗體系統，目錄號27-9400-01；及Stratagene SurfZAPTM噬菌體呈現套組，目錄號240612)之外，尤其適合用以產生及篩檢抗體呈現庫之方法及試劑的實例可見於(例如)Ladner等人美國專利第5,223,409號；Kang等人PCT公開案第WO 92/18619號；Dower等人PCT公開案第WO 91/17271號；Winter等人PCT公開案第WO 92/20791號；Markland等人PCT公開案第WO 92/15679號；Breitling等人PCT公開案第WO 93/01288號；McCafferty等人PCT公開案第WO 92/01047號；Garrard等人PCT公開案第WO 92/09690號；Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等人(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse等人(1989)Science 246：1275-1281；McCafferty等人，Nature(1990)348：552-554；Griffiths等人(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等人(1992)J Mol Biol 226：889-896；Clackson等人(1991)Nature 352：624-628；Gram等人(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrard等人(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；及Barbas等人(1991)PNAS 88：7978-7982。
在較佳實施例中，為分離對hTNFα具有高親和力及低脫離速率常數之人類抗體，首先使用對hTNFα(例如MAK 195，具有寄存編號ECACC 87 050801之融合瘤)具有高親和力及低脫離速率常數之鼠類抗 hTNFα抗體來選擇對hTNFα具有類似結合活性之人類重鏈及輕鏈序列，其係使用在Hoogenboom等人之PCT公開案第WO 93/06213號中描述之抗原決定基印記法來進行。用於該方法之抗體庫較佳為如以下各文獻中所述製備及篩檢之scFv庫：McCafferty等人，PCT公開案第WO 92/01047號；McCafferty等人，Nature(1990)348：552-554；及Griffiths等人(1993)EMBO J 12：725-734。scFv抗體庫較佳使用重組人類TNFα作為抗原來篩檢。
一旦選擇初始人類VL及VH片段，則執行根據hTNFα結合篩檢初始經選擇之VL與VH片段之不同對的"混合搭配"實驗，以便選擇較佳VL/VH成對組合。另外，為進一步改良對於hTNFα結合之親和力及/或降低脫離速率常數，較佳VL/VH對之VL及VH片段可較佳在VH及/或VL之CDR3區域內以與引起抗體在天然免疫反應期間親和力成熟之活體內體細胞突變方法類似之方法進行隨機突變。該活體外親和力成熟可藉由使用分別與VH CDR3或VL CDR3互補之PCR引子擴增VH及VL區而實現，該等引子已經某些位置上之四種核苷酸鹼基之隨機混合物"強化"以使得所得PCR產物編碼隨機突變作用已引入該VH及/或VL CDR3區中之VH及VL片段。該等隨機突變之VH及VL片段可根據與hTNFα之結合進行再篩檢且可選擇顯示hTNFα結合之高親和力及低脫離速率之序列。
繼自重組免疫球蛋白呈現庫篩檢且分離抗hTNFα抗體之後，編碼所選擇之抗體之核酸可自呈現包裝(例如自噬菌體基因組)中回收且藉由標準重組DNA技術次選殖至其他表現載體中。若需要，核酸可進一步處理以形成本發明之其他抗體形式(例如與編碼其他免疫球蛋白域(諸如其他恆定區)之核酸連接)。為表現藉由篩檢組合庫所分離之重組人類抗體，使編碼抗體之DNA選殖至重組表現載體中且引入哺乳動物宿主細胞中，其如上文中進一步詳述。
分離對hTNFα具有高親和力及低脫離速率常數之人類抗體的方法亦描述於各自以引入的方式併入本文中之美國專利第6,090,382號、第6,258,562號及第6,509,015號中。
III.抗體純化
本發明提供自包含抗體及至少一種HCP之混合物產生HCP經減少之抗體製劑的方法。本發明亦提供自包含抗體及至少一種原組織蛋白酶L之混合物產生原組織蛋白酶L減少之抗體製劑的方法。本發明之純化過程從已使用第II部分中所描述之方法及在此項技術中習知之方法產生抗體時之分離步驟開始。通常，在此項技術中，抗體-HCP混合物經受作為初始純化步驟之蛋白質A捕獲(例如蛋白質A管柱)，因而抗體與蛋白質A結合而HCP將徑直流過。本發明之純化方法有下列優點：並不需要使包含抗體及至少一種HCP之混合物經受作為啟始步驟或作為純化方法中之任何步驟的蛋白質A捕獲(例如蛋白質A管柱)。
一旦已獲得包含抗體之澄清液或混合物，則使用包括離子交換分離步驟及疏水相互作用分離步驟之不同純化技術之組合執行抗體與由細胞產生之另一蛋白質(諸如HCP)分離。分離步驟基於蛋白質之電荷、疏水程度及/或尺寸來分離蛋白質之混合物。在本發明之一實施例中，使用包括陽離子層析、陰離子層析及疏水層析之層析執行分離。若干不同層析樹脂可用於該等技術之每一者，使得可針對所涉及之特定蛋白質精確定製純化流程。每一分離方法之實質在於可促使蛋白質以不同速率沿著長管柱移動，從而達成當其沿著管柱進一步傳遞，或者選擇性黏附於分離介質，隨後由不同溶劑有區別地溶離時而物理分離增加。在某些情況下，當雜質特異性黏附於管柱，且抗體並不黏附於管柱，亦即抗體存在於徑流中時，抗體與雜質分離。
以下提供自不當蛋白質純化抗體之方法，例如方法A。在一實施例中，本發明包括以下在方法A中單獨或組合描述之步驟。方法A提供 使用離子交換分離(陽離子交換層析及陰離子交換層析)及疏水相互作用分離來純化包含抗體之混合物，從而產生適用於醫藥組合物中之抗體製劑的方法。方法A之優點在於其可在無需執行作為抗體純化中之啟始步驟的蛋白質A捕獲的情況下來進行。在一實施例中，使用方法A純化之抗體為阿達木單抗。方法A通常包含下列步驟：
將包含抗體及例如HCP之雜質的混合物裝載於諸如陽離子交換管柱之離子交換管柱上。混合物可以約30 g抗體/L/循環之裝載量裝載。隨後將裝載於陽離子管柱上之混合物以洗滌緩衝液(均衡緩衝液)洗滌。隨後使抗體自管柱溶離，且獲得第一溶離液。
隨後使第一溶離液通常經病毒滅活及調整pH值以為陰離子交換層析作準備。第一溶離液藉由調整pH值至相對於溶離緩衝液而言低之pH值來進行病毒滅活(進一步描述於第IIIC部分中)。隨後於一個以上步驟中將病毒滅活之溶離液之pH值調整至約7.6之最終pH值，其為依次循序之陰離子交換管柱之pH值。
繼病毒滅活之後，通常使第一溶離液經受第二離子交換分離步驟，其中第一溶離液裝載於陰離子交換管柱(例如Q瓊脂糖管柱)上。將管柱以洗滌緩衝液洗滌，且獲得包含抗體之第一徑流。
藉由將徑流裝載於疏水相互作用管柱(苯基瓊脂糖)上來使其進一步純化。將管柱洗滌，且使抗體自管柱溶離以便獲得第二溶離液。
方法B描述如下且提供自包含抗體之混合物產生宿主細胞蛋白質(HCP)減少之抗體製劑的改良方法。詞語"減少"當涉及HCP或原組織蛋白酶L時包括優於方法A中之可比性點處HCP或原組織蛋白酶L之水準(例如濃度或活性)的改良。在一實施例中，方法B之第一溶離液包含與方法A之第一溶離液相比經減少含量之HCP或原組織蛋白酶L。在一實施例中，方法B之第一徑流包含與方法A之第一徑流相比經減少含量之HCP或原組織蛋白酶L。在一實施例中，方法B之第二溶離液包含與方 法A之第二溶離液相比經減少含量之HCP或原組織蛋白酶L。在另一實施例中，方法B產生之抗體製劑包含與方法A產生之抗體製劑相比經減少含量之HCP或原組織蛋白酶L。
方法B通常包含下列步驟：將包含抗體及例如HCP之雜質的混合物裝載於諸如陽離子交換管柱之離子交換管柱上。混合物可在pH值7下以約35 g抗體/L/循環之裝載量裝載或在pH值5下以約70 g抗體/L/循環之裝載量裝載。隨後將裝載於陽離子管柱上之混合物以洗滌緩衝液(均衡緩衝液)洗滌。繼均衡洗滌緩衝液之後，執行中間洗滌步驟，其中將管柱以具有與溶離緩衝液相似之導電度的中間緩衝液洗滌。該中間洗滌步驟改良製程相關之雜質之清除。隨後抗體使用溶離緩衝液自管柱溶離，且獲得第一溶離液。
隨後將第一溶離液病毒滅活及調整pH值以為陰離子交換層析作準備。第一溶離液藉由調整pH值至相對於溶離緩衝液而言低之pH值來病毒滅活。病毒滅活溶離液之pH值及導電度隨後以一個步驟調整至約7.8-8.2之最終pH值，其為依次循序之平衡陰離子交換管柱之pH值。
繼病毒滅活之後，使第一溶離液經受第二離子交換分離步驟，其中第一溶離液裝載於陰離子交換管柱(例如Q瓊脂糖管柱)上。將管柱以洗滌緩衝液洗滌，且獲得包含抗體之第一徑流。
藉由將徑流裝載於疏水相互作用管柱(苯基瓊脂糖)上來使其進一步純化。將管柱洗滌，且使抗體自管柱溶離以便獲得第二溶離液。方法B之結果為具有減少之包括原組織蛋白酶L之HCP的製劑。方法B之其他結果包括藉由將HCP清除轉移至製程之前面部分來消除製程瓶頸(例如擴大細胞培養規模中引起的生產力提高)及抗體產率總體改良。以下提供關於本發明之改良方法的其他細節。
III.A.離子交換分離
本發明之特徵為藉由使包含抗體及至少一種HCP之混合物經受至少一個離子交換分離步驟，以便獲得包含抗體之第一溶離液，而自混合物產生HCP經減少之抗體製劑的方法。離子交換分離包括藉以使兩種物質根據其各自離子電荷之差異予以分離的任何方法。
在執行分離的過程中，可例如使用分批純化技術或層析使抗體混合物與離子交換材料接觸。例如，對於分批純化而言，離子交換材料在所需起始緩衝液中製備或與所需起始緩衝液保持平衡。獲得離子交換材料之漿液。使抗體溶液與漿液接觸以使待分離之抗體吸附至離子交換材料。例如，藉由使漿液沉澱及移除上清液，使包含並不與離子交換材料結合之HCP的溶液與漿液分離。漿液可經受一或多個洗滌步驟。若需要，漿液可與更高導電度之溶液接觸，以使與離子交換材料結合之HCP解除吸附。為溶離出結合的多肽，可增加鹽濃度。
離子交換層析亦可用作離子交換分離技術。離子交換層析根據分子之間總電荷之差異來使分子分離。對於抗體之純化而言，抗體必須具有與連接至離子交換材料(例如樹脂)之官能基之彼電荷相反的電荷，以便結合。例如，通常在低於其pI之緩衝液pH值中具有總正電荷之抗體將與含有帶負電的官能基之陽離子交換材料充分結合。
在離子交換層析中，在溶質表面上之帶電區域為連接至層析基質之相反電荷所吸引，其限制條件為周圍緩衝液之離子強度較低。溶離通常藉由增加緩衝液之離子強度(亦即導電度)以與溶質競爭離子交換基質之帶電位點來達成。改變pH值及藉此改變溶質電荷為達成溶質之溶離的另一方式。導電度或pH值之變化可為漸進的(梯度溶離)或逐步的(分步溶離)。
陰離子或陽離子取代基可連接至基質以形成用於層析之陰離子或陽離子載體。陰離子交換取代基包括二乙胺基乙基(DEAE)、四級胺基乙基(QAE)及第四胺(Q)基團。陽離子取代基包括羧甲基(CM)、磺乙 基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸酯基(P)及磺酸酯基(S)。諸如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32及CM-52之纖維素離子交換樹脂可自Whatman Ltd.Maidstone,Kent,U.K.購得。以SEPHADEX®為主及與克羅斯(locross)結合之離子交換劑亦已知。例如，DEAE-、QAE-、CM-及SP-SEPHADEX®及DEAE-、Q-、CM-及S-SEPHAROSE®及SEPHAROSE® Fast Flow皆可自Pharmacia AB.購得。此外，諸如TOYOPEARL DEAE-650S或M及TOYOPEARL CM-650S或M之由DEAE及CM衍生之乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物可自Toso Haas Co.,Philadelphia,Pa.購得。
在本發明之一實施例中，將包含抗體及至少一種HCP之混合物裝載於陽離子交換(CEX)層析管柱上。混合物於可與用以平衡管柱之均衡緩衝液相同的裝載緩衝液中裝載於CEX管柱上。當包含HCP之混合物傳經CEX管柱時，靶標蛋白質吸附至CEX樹脂且各種HCP(諸如宿主細胞蛋白質，其中靶標蛋白質產生於重組宿主細胞中，或其他源自製程之雜質)徑直流過或微弱地或非特異性地與CEX樹脂結合。在各種實施例中，CEX樹脂為與磺酸酯基連接之以合成甲基丙烯酸酯為主之聚合樹脂(Fractogel SO3 -(Fractogel S))。在一實施例中，均衡緩衝液包含20 mM Na2PO4、25 mM NaCl，pH 6.8。其他適當均衡緩衝液包括(例如)處於例如約0.5 mM與約100 mM之間之範圍內的濃度的生理學濃度(例如10 mM、20 mM、50 mM等)及生理學鹽濃度(例如約0.15 mM NaCl)下且處於5.0-9.0之pH值下的BIS及HEPES。
在例示性實施例中，CEX層析為Fractogel S管柱。在一實施例中，約30公克(g)抗體/公升(L)樹脂至約40 g抗體/L樹脂裝載於Fractogel S管柱上。在另一實施例中，約35 g抗體/L樹脂在pH值7下裝載於Fractogel S管柱上。已發現在pH值7下約35 g抗體/L樹脂之裝載量增加例如HCP及原組織蛋白酶L之雜質之清除。以下表1中描述欲用於本發 明方法中之Fractogel S管柱之可接受的操作範圍。
此外已發現管柱之裝載量可藉由在pH值5下進行層析來增加。詳言之，已發現在pH值5下約70 g抗體/L樹脂之裝載量增加例如HCP及原組織蛋白酶L之雜質之清除。因此，在約pH 5至約pH 7之pH範圍中，可使用約35 g至約70 g抗體/L樹脂之裝載量。
繼裝載抗體混合物於管柱上之後，隨後將CEX樹脂以洗滌緩衝液洗滌。詳言之，已發現複數個使用不同洗滌緩衝液之洗滌步驟產生HCP進一步減少之抗體製劑。具體言之，已發現原組織蛋白酶L含量可藉由使用分別使用洗滌緩衝液及中間洗滌緩衝液之第一洗滌步驟及中間洗滌步驟來減少。在一實施例中，CEX樹脂首先以與均衡緩衝液相同之洗滌緩衝液洗滌。在某些實施例中，洗滌緩衝液為20 mM Na2PO4、25 mM NaCl，pH 6.8。其他適合洗滌緩衝液包括(例如)處於例如約0.5 mM與約100 mM之間之範圍內的濃度的生理學濃度(例如10 mM、20 mM、50 mM等)及生理學鹽濃度(例如約0.15 mM NaCl)下且處於5.0-9.0之pH值下的BIS及HEPES。
在本發明之一較佳實施例中，執行中間洗滌步驟。已發現減少通常HCP、且尤其原組織蛋白酶L之含量可藉由使用部分地包含與CEX溶離緩衝液相同之緩衝液的中間洗滌緩衝液來達成。增加中間洗滌緩衝液之導電度部分地導致通常HCP且尤其原組織蛋白酶L之減少改良。增 加中間洗滌緩衝液之導電度導致相對於抗體之pI具有較低pI之HCP的電荷位移，因此導致較弱結合之HCP自管柱中洗去。增加較弱結合之例如HCP(包括原組織蛋白酶L)之雜質的清除又為例如抗體之靶標物質提供更大結合面積。在其他實施例中，中間洗滌緩衝液含有約40%至約50%之溶離緩衝液及約50%至約60%之注射用水。在其他實施例中，中間洗滌緩衝液含有45%溶離緩衝液及55%注射用水。在一實施例中，用於中間洗滌之洗滌緩衝液為20 mM Na2PO4、150 mM氯化鈉，pH 7。
繼複數個洗滌之後，抗體自第一陽離子交換材料中溶離以便獲得具有減少含量之HCP之第一溶離液。鑒於中間洗滌步驟，第一溶離液亦具有減少含量之原組織蛋白酶L。在一實施例中，與方法A之可比性步驟相比，使用本發明方法獲得之第一溶離液包含的HCP含量降低約3至約5倍。在另一實施例中，與方法A之可比性步驟相比，使用本發明方法獲得之第一溶離液包含的組織蛋白酶L的活性降低約2至約3倍。在一實施例中，如由HCP ELISA所測定，與混合物所包含之HCP相比，第一溶離液所包含之HCP少約90至約100倍。在另一實施例中，如藉由組織蛋白酶L動態檢定所量測，第一溶離液包含之組織蛋白酶L的活性範圍介於約25至約60 RFU/s/mg抗體之間。
在一較佳實施例中，包含抗體之初始溶離液傳經第二IE材料且獲得包含進一步減少含量之HCP之徑流。在某些實施例中，第二IE步驟可為如下文描述之分批純化。在其他實施例中，第二IE步驟包含將第一溶離液裝載於第二離子交換層析管柱上，洗滌管柱及獲得第一徑流。第二IE材料可為陰離子交換(AEX)樹脂，例如Q瓊脂糖管柱。在某些實施例中，將約30 g抗體/L樹脂與約40 g抗體/L樹脂裝載於陰離子交換管柱上。增加裝載量至介於約40 g抗體/L樹脂與約50 g抗體/L樹脂之間導致例如HCP之雜質清除減弱。當包含HCP之混合物傳經AEX管柱 時，各種HCP與AEX樹脂結合，且抗體穿過AEX樹脂或非特異性地與AEX樹脂結合。在某些實施例中，陰離子交換樹脂為Q瓊脂糖。
通常，待純化之抗體混合物存在於來自先前純化步驟之緩衝液中。可獲得許多緩衝液且其可藉由常規實驗來選擇。例如，可使用25 mM三乙醇胺、40 mM NaCl，pH 8之均衡緩衝液。在一實施例中，在使初始溶離液傳經第二IE材料之前，第二IE材料可使用均衡緩衝液來平衡。此舉可藉由改變第一溶離液之pH值及導電度以使得第一溶離液之pH值及導電度與平衡之第二IE材料之pH值及導電度大體上相似或相當，亦即改變第一溶離液之pH值及導電度以使得其與平衡之第二離子交換材料之pH值及導電度相當來進行。在某些實施例中，AEX材料(例如Q瓊脂糖)之pH使用均衡緩衝液調整至介於約7.7至約8.3範圍內。在其他實施例中，CEX溶離液(例如初始溶離液)之pH調整至約7.7至約8.3之範圍內。在某些實施例中，AEX材料與初始溶離液之pH值為約8。在某些實施例中，AEX材料之導電度介於約3.5 mS/cm至約4.9 mS/cm範圍內。在其他實施例中，初始溶離液之導電度介於約3.5 mS/cm至約4.9 mS/cm範圍內。已發現調整裝載物導電度及pH值至第二離子交換材料之彼導電度及pH值增強雜質清除。關於方法A，已發現第一溶離液及/或平衡之第二離子交換材料之導電度總體降低及/或pH值增加導致HCP清除增加。
繼裝載抗體混合物於管柱上之後，隨後將AEX樹脂以洗滌緩衝液洗滌。洗滌緩衝液可與例如25 mM三乙醇胺、40 mM NaCl，pH 8之均衡緩衝液相同。在一實施例中，洗滌液可與徑流組合以便獲得包含抗體且具有減少含量之HCP之第一徑流。在其他實施例中，第一徑流具有減少含量之原組織蛋白酶L。在一實施例中，與方法A之可比性步驟相比，使用本發明方法獲得之第一徑流包含的HCP含量降低約7至約700倍。在另一實施例中，與方法A之可比性步驟相比，使用本發明方 法獲得之第一徑流包含的組織蛋白酶L的活性降低約6至約25倍。在其他實施例中，如由HCP ELISA所測定，與第一溶離液所包含之HCP相比，第一徑流所包含之HCP少約840至約850倍。在另一實施例中，如藉由組織蛋白酶L動態檢定所量測，第一徑流包含之組織蛋白酶L的活性範圍介於約0.4至約4 RFU/s/mg抗體之間。
欲用於本發明方法中之Q瓊脂糖層析之可接受的操作範圍描述於下表2中：
陽離子交換材料與陰離子交換材料相對照之使用係如前文所討論以蛋白質總電荷為根據。因此，在本發明範疇之內，使用陰離子交換材料，而後使用陽離子交換材料。此外，僅使用陽離子交換材料或僅使用陰離子交換材料係在本發明範疇之內。
本發明之方法可視情況包括其他純化步驟。可在離子交換層析方法之前、期間或之後執行之其他純化程序之實例包括在疏水相互作用層析上(例如在苯基瓊脂糖上)之分餾、乙醇沉澱、等電聚焦、逆相HPLC、二氧化矽層析、肝素瓊脂糖層析、其他陰離子交換層析及/或其他陽離子交換層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉澱、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和性層析(例如使用蛋白質A、蛋白質G、抗體、特異性受質、配位子或抗原作為捕獲試劑)。
III.B.疏水相互作用分離
本發明之特徵亦為自包含抗體及至少一種HCP之混合物產生HCP經減少之抗體製劑之方法，其進一步包含使第一徑流經受第一疏水相 互作用材料以便獲得具有減少含量之HCP之第二溶離液的疏水相互作用分離步驟。
在執行分離的過程中，可例如使用分批純化技術或使用一管柱使多肽混合物與HIC材料接觸。在HIC純化之前，可能需要例如藉由使混合物穿過前置柱來移除任何離液劑或極具疏水性的物質。
例如，對於分批純化而言，HIC材料在所需均衡緩衝液中製備或與所需均衡緩衝液保持平衡。獲得HIC材料之漿液。使抗體溶液與漿液接觸以使待分離之抗體吸附至HIC材料。例如，藉由使漿液沉澱及移除上清液，使包含並不與HIC材料結合之HCP的溶液與漿液分離。漿液可經受一或多個洗滌步驟。若需要，漿液可與較低導電度之溶液接觸以使與HIC材料結合之抗體解除吸附。為溶離結合抗體，可降低鹽濃度。
在其他實施例中，疏水相互作用分離步驟包含裝填第一徑流於包含第一疏水相互作用材料之管柱上及洗滌第一疏水相互作用材料以便獲得第二溶離液。
疏水相互作用分離步驟可包括疏水相互作用層析(HIC)步驟。儘管離子交換層析依賴例如抗體之蛋白質之電荷以將其分離，但是疏水相互作用層析使用例如抗體之某些蛋白質之疏水特性。抗體上之疏水基與管柱上之親水基結合。蛋白質疏水性越大，其與管柱的結合力越強。HIC步驟移除(例如)源自宿主細胞之雜質(例如DNA及其他高及低分子量之產物相關的物質)。
疏水相互作用在高離子強度下最強烈，因此，此形式之分離繼鹽沉澱或離子交換程序之後便利地執行。高鹽濃度有利於抗體吸附至HIC管柱，但實際濃度可視抗體性質及所選特定HIC配位子而定在寬範圍內變化。各種離子視其是否促進疏水相互作用(鹽析效應)或破壞水之結構(離液效應)且導致疏水相互作用之削弱而定以所謂抗溶 (soluphobic)系列方式排列。陽離子依據增加之鹽析效應如下排列：Ba++ ‹；Ca++ ‹；Mg++ ‹；Li+ ‹；Cs+ ‹；Na+ ‹；K+ ‹；Rb+ ‹；NH4 +，而陰離子可依據增加之離液效應如下排列：PO--- ‹；SO4 -- ‹；CH3COOO- ‹；Cl- ‹；Br- ‹；NO3 - ‹；ClO4 - ‹；I- ‹；SCN-。
通常，硫酸鈉、硫酸鉀或硫酸銨有效地促進HIC中之配位子-蛋白質相互作用。可調配如下列關係所表明影響相互作用之強度的鹽：(NH4)2SO4 ›；Na2SO4 ›；NaCl ›；NH4Cl ›；NaBr ›；NaSCN。通常，介於約0.75與約2 M之間的硫酸銨或介於約1與4 M之間的NaCl的鹽濃度為適用的。
HIC管柱通常包含疏水性配位基(例如烷基或芳基)與其偶合之基質(例如交聯瓊脂糖或合成共聚物材料)。較佳HIC管柱包含經苯基取代之瓊脂糖樹脂(例如Phenyl SepharoseTM管柱)。許多HIC管柱可購得。實例包括(但不限於)具有低或高取代之Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow管柱(Pharmacia LKB Biotechnology,AB,Sweden)；Phenyl SepharoseTM High Performance管柱(Pharmacia LKB Biotechnology,AB,Sweden)；Octyl SepharoseTM High Performance管柱(Pharmacia LKB Biotechnology,AB,Sweden)；FractogelTM EMD Propyl或FractogelTM EMD Phenyl管柱(E.Merck,Germany)；Macro-PrepTM Mehyl或Macro-PrepTM t-Butyl Support(Bio-Rad,California)；WP HI-Propyl(C.sub.3)TM管柱(J.T.Baker,New Jersey)；及ToyopearlTM醚、苯基或丁基管柱(TosoHaas,PA)。
繼任何初步純化步驟之後，包含所關注之抗體及HCP之混合物可經受HIC。通常，待純化之抗體組合物存在於來自先前純化步驟之緩衝液中。然而，可能需要在HIC步驟之前添加緩衝液至抗體組合物中。可獲得許多緩衝液且其可藉由常規實驗來選擇。在一實施例中，裝載緩衝液中之包含待純化之抗體及至少一種HCP之混合物的pH值視起始pH值而定使用酸或者鹼調整至約7之pH值，且導電度為約136至約158 mS/cm。在一實施例中，抗體混合物以包含40 mM磷酸鈉、2.2 M(NH4)2SO4，pH 7之緩衝液稀釋。
在裝載抗體混合物之前，管柱可使用均衡緩衝液平衡。在某些實施例中，均衡緩衝液為20 mM磷酸鈉、1.1 M(NH4)2SO4、pH 7。
在一實施例中，將例如包含抗體之第一徑流之混合物裝載於苯基瓊脂糖HIC管柱上。在某些實施例中，該步驟之蛋白質裝載量在約20與約40 g蛋白質/L樹脂之間之範圍內。在其他實施例中，該步驟之蛋白質裝載量為約35 g蛋白質/L樹脂。在某些實施例中，可能需要兩個或三個層析循環以處理全部數量之可用材料。
繼蛋白質與疏水相互作用管柱結合之後，管柱可以可與例如1.1 M(NH4)2SO4，pH 7之均衡緩衝液相同之洗滌緩衝液洗滌。
抗體係使用溶離緩衝液自管柱中溶離以便獲得第二溶離液。溶離緩衝液可使用常規實驗選擇。溶離緩衝液之pH值在約6與約8之間之範圍內且溶離緩衝液具有低硫酸銨濃度(亦即小於約1 M(NH4)2SO4)。溶離緩衝液之導電度介於約87至約101 mS/cm範圍內。在一實施例中，溶離緩衝液含有11 mM磷酸鈉、0.625 M(NH4)2SO4，pH 7。已發現較低鹽濃度導致阿達木單抗與樹脂結合減少。抗體自第二離子交換材料中溶離以便獲得具有減少含量之HCP之第二溶離液。第二溶離液亦具有減少含量之原組織蛋白酶L。在一實施例中，與方法A之可比性步驟相比，使用本發明方法獲得之第二包含的HCP含量降低約10至約96倍。在另一實施例中，與方法A之可比性步驟相比，使用本發明方法獲得之第二溶離液包含的組織蛋白酶L的活性降低約5至約15倍。在一實施例中，如由HCP ELISA所測定，與第一徑流所包含之HCP相比，第二溶離液所包含之HCP少約3至約5倍。在另一實施例中，如藉由組織蛋白酶L動態檢定所量測，第二溶離液包含之組織蛋白酶L的活性範圍介於約0.5至約1.5 RFU/s/mg抗體之間。
用於本發明方法之苯基瓊脂糖層析管柱之可接受的操作範圍展示於下表3中。
如本文中描述，其他純化步驟可包括病毒移除步驟以及奈米過濾、超濾及/或透濾步驟。
III.C.病毒滅活
為提供安全裕度，將潛在的未偵測出之病毒在純化過程期間滅活。病毒滅活之方法在此項技術中已知且包括熱滅活(巴氏滅菌法)、pH滅活、溶劑/清潔劑處理、UV及γ射線照射及添加某些化學滅活劑，諸如β-丙內酯或例如如美國專利第4,534,972號等中之啡啉銅。在某些實施例中，使混合物經受病毒滅活可包括pH病毒滅活。pH病毒滅活技術之方法亦在此項技術中熟知。舉例而言，病毒滅活之典型方法包括在低pH值下培育混合物一段時間，隨後使中和pH及藉由過濾移除微粒。pH水準之選擇主要視抗體產物之穩定性概況及緩衝液組份而定。已知在低pH病毒滅活期間靶標抗體之品質受pH值及低pH培育之持續期間影響。除在高濃度下滅活可降低蛋白質濃度之外，病毒滅活亦視該等相同參數而定。因此，可藉由常規實驗選擇蛋白質濃度、pH值及滅活之持續期間之適當參數。
混合物之pH值可藉由包括(但不限於)檸檬酸、乙酸、辛酸或其他適合酸之任何適合酸來降低。在較佳實施例中，混合物之pH值以1 M檸檬酸調整。
在某些實施例中，混合物在約2.9至約3.9之pH值下培育約15分鐘至約180分鐘。在其他實施例中，混合物在pH值約3.5下培育約60分鐘 至約120分鐘。在另外實施例中，混合物在pH值約3.5下培育約60分鐘至約180分鐘。
在一實施例中，包含抗體及HCP之混合物在IE分離之前經受病毒滅活。在其他實施例中，初始溶離液在IE分離之前經受病毒滅活。在某些實施例中，初始溶離液在陰離子交換層析之前經受病毒滅活。
繼病毒滅活之後，混合物按照其他純化步驟所需受到調整。例如，pH值經調整之集合可經受過濾。在一實施例中，繼低pH病毒滅活及/或過濾之後，混合物之pH值通常調整為更趨中性的pH值，例如約6.5至約8.5。例如，混合物可以注射用水(WFI)沖洗以獲得所需pH值。
用於本發明方法之低pH病毒滅活參數展示於下表4中。
本發明包括來自離子交換管柱之第一溶離液在第二離子交換層析步驟之前經受病毒滅活的方法。在一實施例中，病毒滅活藉由pH病毒滅活達成。
IV.測定宿主細胞蛋白質(HCP)含量之方法
本發明亦提供測定經純化之抗體組合物中宿主細胞蛋白質(HCP)濃度之殘餘量之方法。如上所述，期望自例如抗體之最終靶標物質產物中排除HCP。例示性HCP包括來自於生產抗體之來源之蛋白質。不能鑑定HCP及將其自靶標抗體中充分地移除可能導致功效降低及/或不利之患者反應。
如本文中所用，術語"HCP ELISA"係指其中用於檢定之第二抗體對於用以產生例如阿達木單抗之抗體之細胞(例如CHO細胞)所產生之HCP具有特異性的ELISA。第二抗體可根據熟習此項技術者已知之習 知方法產生。例如，第二抗體可使用藉由假性生產及純化運作(亦即用以產生所關注之抗體之相同細胞株，但該細胞株並不以抗體DNA轉染)獲得之HCP來產生。在一例示性實施例中，第二抗體使用與所選之細胞表現系統(亦即用以產生靶標抗體之細胞表現系統)中所表現之彼等HCP相似的HCP來產生。
通常，HCP ELISA包含將包含HCP之液體試樣插入雙層抗體(亦即第一抗體與第二抗體)之間。在試樣培育期間，試樣中之HCP由經親和力純化之第一抗體(例如山羊抗CHO(Cygnus))捕獲。添加對於由用以產生抗體之細胞產生之HCP(例如經生物素標記之抗CHO HCP)具有特異性的經標記之第二抗體，且其與試樣內之HCP結合。試樣中所含之HCP的量使用基於第二抗體之標記的合適測試來測定。
HCP ELISA可用於測定諸如使用以上第III部分中描述之方法獲得之溶離液或徑流之抗體組合物中之HCP的含量。本發明亦提供包含抗體之組合物，其中如HCP酵素結合免疫吸附分析法("ELISA")測定，組合物不含可偵測含量之HCP。在一實施例中，第一溶離液包含介於約12,000至約19,500 ng/mg之間之HCP。在一實施例中，第二溶離液包含介於約1.0與約0.0 ng/mg之間之HCP。
V.測定原組織蛋白酶L含量之方法
本發明提供測定試樣中之原組織蛋白酶L的量之動態檢定(或組織蛋白酶L動態檢定)。原組織蛋白酶L為源自某些表現系統之宿主細胞蛋白質，且已知其一旦活化為組織蛋白酶L後，則促使包括諸如阿達木單抗之抗體的蛋白質的分裂。研究證明原組織蛋白酶L作為非活性酶原而合成且隨後經處理成為活性組織蛋白酶L形式。原組織蛋白酶L之活化藉由諸如組織蛋白酶D之其他蛋白酶或者藉由溶酶體在酸性條件下之自催化活化而蛋白水解性移除N末端原肽區來進行(Turk等人(1999)Eur J Biochem 259：929)。此外，Mason等人(參見Mason等人(1992) Biochem Biophysical Res Comm 189：1659)報導藉由在較低pH條件下添加諸如硫酸葡聚糖之帶負電的分子，可在pH值5.5下達成更高程度之組織蛋白酶L活化。
偵測原組織蛋白酶L(或活性形式組織蛋白酶L)之含量之先前方法包括諸如弱陰離子交換層析之分析方法。然而，當測試處理中試樣(亦即由如上第III部分中所述之方法獲得之試樣)時，歸因於緩衝系統干擾及基質效應，該等方法具有限制性。因此，本發明提供(例如)為了過程監控起見而更好地監控原組織蛋白酶L的高產量螢光酶促法。
本發明之動態檢定提供測定不易於由標準終點檢定來偵測之含量下的原組織蛋白酶L的方法。動態檢定亦提供測定原組織蛋白酶L之含量是否可重現地降低的方法。在一實施例中，試樣可由第III部分中描述之方法中之任一點獲得，以便確認或判定總過程中之原組織蛋白酶L之含量正在降低。原組織蛋白酶L藉由自蛋白質移除胺基末端來活化。在一實施例中，活化使用諸如(但不限於)組織蛋白酶D之肽酶來達成。一旦活化，組織蛋白酶L可選擇性使受質水解。使受質與試樣接觸且基於受質之變化監控組織蛋白酶L活性。
在一較佳實施例中，組織蛋白酶L之受質包含標記。標記可包括任何允許測定組織蛋白酶活性之試劑。組織蛋白酶L可選擇性水解之經標記受質之實例包括諸如Z-白胺酸-精胺酸-AMC之合成受質(R & D Systems)。肽受質可能含有由介於AMC之胺基與精胺酸之羧基之間的醯胺鍵淬滅的螢光7-胺基-4-甲基香豆素(AMC)基團。一旦由組織蛋白酶L裂解醯胺鍵後，所釋放之AMC基團發螢光且可分別藉由380 nm之激發波長與460 nm之發射波長來量測。可量測此激發且其可用以測定組織蛋白酶L活性水準。受質轉換率與存在於試樣中之組織蛋白酶L的量成正比。此量測與具有已知組織蛋白酶L活性及已知量之組織蛋白酶L的參考試樣組合使用。隨後試樣中之組織蛋白酶L活性與存在於試樣 中之抗體的量相關聯。在一實施例中，第一溶離液所包含之組織蛋白酶L活性範圍介於約25至約60 RFU/s/mg抗體之間。在另一實施例中，第一徑流所包含之組織蛋白酶L活性範圍介於約0.4至約4 RFU/s/mg抗體之間。在一實施例中，第二溶離液所包含之組織蛋白酶L活性範圍介於約0.5至約1.5 RFU/s/mg抗體之間。
在一實施例中，動態檢定包含測定源自哺乳動物細胞表現系統之材料中之原組織蛋白酶L的量，其包含藉由使材料與酶接觸以將原組織蛋白酶L處理成為活性組織蛋白酶L形式，以便獲得組織蛋白酶L試樣。一旦活化，組織蛋白酶L可選擇性水解包括諸如Z-白胺酸-精胺酸-AMC之合成受質的受質。隨後將包括例如Z-白胺酸-精胺酸-AMC之受質添加至試樣中，該受質含有由介於AMC之胺基與精胺酸之羧基之間的醯胺鍵淬滅的螢光7-胺基-4-甲基香豆素(AMC)基團。一旦由組織蛋白酶L裂解醯胺鍵後，所釋放之AMC基團發螢光且可分別藉由380 nm之激發波長與460 nm之發射波長來量測。所測定之組織蛋白酶L活性用作源自哺乳動物細胞表現系統(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)之材料中之原組織蛋白酶L的量之指示。
在一實施例中，第一溶離液所包含之組織蛋白酶L活性範圍介於約25至約60 RFU/s/mg抗體之間。在另一實施例中，第一徑流所包含之組織蛋白酶L活性範圍介於約0.4至約4 RFU/s/mg抗體之間。在一實施例中，第二溶離液所包含之組織蛋白酶L活性範圍介於約0.5至約1.5 RFU/s/mg抗體之間。
本發明亦涵蓋亦意欲為本發明之部分的上述量之中間範圍。例如，意欲包括使用上述作為上限及/或下限之任何值的組合的數值範圍，以及介於所描述範圍之間的任何數字。
本發明包括單獨或彼此組合之任何上述變更。
VI.醫藥組合物
使用本發明之方法獲得之抗體可併入適於投與受檢者之醫藥組合物中。通常，醫藥組合物包含抗體或其抗原結合部分及醫藥學上可接受之載劑。如本文中所用，"醫藥學上可接受之載劑"包括任何及所有生理上相容之溶劑、分散介質、包衣料、抗菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及其類似物。醫藥學上可接受之載劑之實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物之一或多者以及其組合。在多數情況下，較佳於組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。醫藥學上可接受之載劑可進一步包含微量助劑物質，諸如潤濕或乳化劑、防腐劑或緩衝液，其增強抗體或其抗原結合部分之存放期或有效性。
包含使用本發明方法純化之抗體或其抗原結合部分的醫藥組合物可以多種形式呈現。該等形式包括(例如)液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如可注射及可灌注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、脂質體及栓劑。較佳形式視所需投藥方式及治療應用而定。典型較佳組合物呈可注射或可灌注溶液之形式，諸如與用於人類使用其他抗體或其他TNFα抑制劑進行被動免疫接種之組合物相似之組合物。較佳投藥方式為非經腸(例如靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內)。在一較佳實施例中，抗體藉由靜脈內灌注或注射來投與。在另一較佳實施例中，抗體藉由肌肉內或皮下注射來投與。
在製造及儲存條件下，治療組合物通常必須無菌且穩定。組合物可調配成適於高藥物濃度之溶液、微乳液、分散液、脂質體或其他有序結構。無菌可注射溶液可藉由將所需量之活性化合物(亦即抗體或其抗原結合部分)與以上列舉成份之一者或組合一起併入合適溶劑中，視需要繼之以過濾滅菌來製備。通常，分散液藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及來自彼等以上所列舉成份之所需其他成份的無菌媒劑中來製備。在使用無菌散劑製備無菌可注射溶液之情況下，較佳製 備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其由先前無菌過濾之溶液產生活性成份加任何其他所需成份的粉末。可(例如)藉由使用包衣料(諸如卵磷脂)、藉由在分散液情況下維持所需粒徑及藉由使用界面活性劑來保持溶液之適當流動性。可藉由包括延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)於組合物中來實現可注射組合物之延長吸收。
補充活性化合物亦可併入該等組合物中。在某些實施例中，用於本發明方法中之抗體或其抗原結合部分與一或多種其他治療劑共同調配及/或共同投與。例如，本發明之抗hTNFα抗體或抗體部分可與以下各物共同調配及/或共同投與：一或多種DMARD或一或多種NSAID或一或多種其他結合其他靶標之抗體(例如結合其他細胞因子或結合細胞表面分子之抗體)、一或多種細胞因子、可溶性TNFα受體(參見例如PCT公開案第WO 94/06476號)及/或一或多種抑制hTNFα產生或活性之化學藥劑(諸如如PCT公開案第WO 93/19751號中所述之亞環己基衍生物)或其任何組合。此外，一或多種本發明抗體可與兩種或兩種以上之上述治療劑組合使用。該等組合療法可有利地使用較低劑量之所投與治療劑，因此避免與各種單一療法相關之可能副效應、併發症或低水準患者反應。
在一實施例中，本發明包括包含有效量之TNFα抗體或其抗原結合部分及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物，其中該有效量之TNFα抗體可有效治療包括(例如)克羅恩氏病之TNFα相關病症。在一實施例中，抗體或抗體部分併入如以引入的方式併入本文中之PCT/IB03/04502及美國申請案第10/222140號中所述之醫藥調配物中。此調配物包括濃度為50 mg/ml之抗體阿達木單抗，其中一預填充注射器含有40 mg之抗體用於皮下注射。
儘管對於許多治療應用而言，較佳投藥途徑/方式為皮下注射，但是使用本發明之方法獲得之抗體或抗體部分可藉由在此項技術中已知 之多種方法投與。在另一實施例中，投藥係經由靜脈內注射或灌注進行。如熟習此項技術者所瞭解，投藥途徑及/或方式將視所需結果而變化。在某些實施例中，活性化合物可與保護化合物免於快速釋放之載劑一起製備，諸如受控釋放調配物，其包括植入物、經皮貼片及微囊封傳遞系統。可使用生物可降解的生物相容的聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。製備該等調配物之許多方法取得專利權或通常為熟習此項技術者已知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
使用本發明方法獲得之抗體或其抗原結合部分亦可以蛋白質晶體調配物之形式投與，其包括囊封於聚合物載劑之內以形成包覆顆粒之蛋白質晶體組合。蛋白質晶體調配物之包覆顆粒可具有球狀形態且為至多500微米直徑之微球體或其可具有某種其他形態且為微型粒子。蛋白質晶體之濃度增加使得本發明抗體可經皮下傳遞。在一實施例中，本發明抗體經由蛋白質傳遞系統傳遞，其中將蛋白質晶體調配物或組合物之一或多者投與患有TNFα相關病症之受檢者。製備全抗體晶體或抗體片段晶體之穩定化調配物之組合物及方法亦描述於以引入的方式併入本文中之WO 02/072636中。在一實施例中，描述於以引入的方式併入本文中之PCT/IB03/04502及美國申請案第10/222140號中之包含結晶抗體片段的調配物用以使用本發明多變劑量方法治療TNFα相關病症。
在某些實施例中，使用本發明方法獲得之抗體或其抗原結合部分可與惰性稀釋劑或可吸收之可食用載劑一起經口投與。化合物(及若需要之其他成份)亦可封裝於硬或軟殼明膠膠囊中、壓縮成錠劑，或直接併入受檢者膳食中。對於經口治療投藥而言，化合物可與賦形劑混合且以可吸收錠劑、頰內錠劑、片劑、膠囊劑、酏劑、懸浮液、糖漿劑、 糯米紙囊劑及其類似物之形式使用。為以除非經腸投與以外之方式投與本發明化合物，可能需要以預防化合物滅活之材料塗覆化合物，或使化合物與該材料共同投與。
本發明醫藥組合物可包括"治療有效量"或"預防有效量"之本發明抗體或其抗原結合部分。"治療有效量"係指在必需的劑量下且歷時必需的一段時間而有效達成所需治療結果之量。抗體或其抗原結合部分之治療有效劑量可根據諸如個體之疾病病況、年齡、性別及體重之因素及抗體、抗體部分、其他TNFα抑制劑引發所需之個體反應的能力而變化。治療有效量亦為治療有益效應超過抗體或其抗原結合部分之任何毒性或損害效應的量。"預防有效量"係指在必需的劑量下且歷時必需的一段時間而有效達成所需預防效應之量。通常，因為預防劑量在疾病較早期之前或期間用於受檢者，所以預防有效量應小於治療有效量。
可調整給藥方案以提供最佳所需反應(例如治療或預防反應)。舉例而言，可投與單次大丸劑，可隨時間投與若干分次劑量或劑量可隨治療情況之迫切要求按比例降低或增加。尤其有利為調配單位劑型之非經腸組合物以便於投藥及劑量之均一性。如本文中所用之單位劑型係指適合作為單次劑量用於欲治療之哺乳動物受檢者的實體上離散單位；各單位包含預定數量之與所需醫藥載劑締合、預計產生所需治療效應的活性化合物。本發明單位劑型之規格由以下各因素決定且直接視其而定：(a)活性化合物之獨特特性及待達成之治療或預防效應，及(b)混配該活性化合物以治療個體敏感之技術所固有之限制。
治療或預防有效量之抗體或其抗原結合部分之例示性非限制性範圍為10至200 mg、更佳20至160 mg、更佳40至80 mg，且最佳80 mg。在一實施例中，抗體或其抗原結合部分之治療有效量為約20 mg。在另一實施例中，抗體或其部分之治療有效量為約40 mg。在另一實施例 中，抗體或其抗原結合部分之治療有效量為約80 mg。在一實施例中，用於本發明方法之抗體或其部分之治療有效量為約120 mg。在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分之治療有效量為約160 mg。上述劑量之中間範圍，例如約78.5至約81.5；約15至約25；約30至約50；約60至約100；約90至約150；約120至約200，亦意欲為本發明之部分。例如，使用作為上限及/或下限之任何上述值之組合的數值範圍意欲包括在內。
應注意劑量值可隨待減輕之病狀之類型及嚴重程度而變化。應進一步瞭解，對於任何特定受檢者而言，特定給藥方案將隨時間根據個體需要及投與組合物或監督投與組合物之個人之職業判斷而調整，且本文中闡明之劑量範圍僅為例示性的且並不意欲限制所主張組合物之範疇或實務。
使用本發明方法獲得之抗體或其抗體部分可按照如WO 02/100330中所述之兩週一次的給藥方案、如WO 04/037205中所述之低劑量方案及如WO 05/110452中所述之多變給藥方案投與，該等文獻每一者以引入的方式併入本文中。
本發明亦係關於包含使用本發明之方法獲得之抗體或其抗原結合部分的封裝醫藥組合物、製品或套組。製品可包含使用本發明方法獲得之抗體或其抗原結合部分及包裝材料。製品亦可包含指明包含抗體或其抗原結合部分之調配物或組合物具有減少含量之HCP及/或原組織蛋白酶L的標籤或包裝說明書。製品可包含包裝材料內所含之指明阿達木單抗調配物包含不超過約70 ng/mg之HCP的標籤或包裝說明書或包裝材料內所含之指明阿達木單抗調配物包含不超過約13 ng/mg的標籤或包裝說明書。製品可包含包裝材料內所含之指明阿達木單抗調配物包含不超過約5 ng HCP/mg阿達木單抗的標籤或包裝說明書。製品亦可包含指明阿達木單抗調配物所包含之原組織蛋白酶L含量不大於 由約3.0 RFU/s/mg阿達木單抗之組織蛋白酶L活性所指示之原組織蛋白酶L含量。
VII.治療方法
本發明方法產生可用於抑制患有TNFα活性起有害作用之病症之受檢者之TNFα活性的HCP或原組織蛋白酶L減少之抗體製劑。TNFα已涉及多種病症之病理生理學(參見例如Moeller,A.等人(1990)Cytokine 2：162-169；Moeller等人之美國專利第5,231,024號；Moeller,A.之歐洲專利公開案第260 610 B1號)。TNFα已涉及多種TNFα相關病症之病理生理學，該等病症包括膿毒病、感染、自體免疫疾病、移植排斥反應及移植物抗宿主疾病(參見例如Moeller,A.等人(1990)Cytokine 2：162-169；Moeller等人之美國專利第5,231,024號；Moeller,A.等人之歐洲專利公開案第260 610 B1號；Vasilli,P.(1992)Annu.Rev.Immunol. 10：411-452；Tracey,K.J.及Cerami,A.(1994)Annu.Rev.Med. 45：491-503)。本發明方法產生有益於抑制患有TNFα相關病症之受檢者之TNFα活性的HCP或原組織蛋白酶L減少之抗體製劑方法，該方法包含投與受檢者初始誘發劑量且隨後投與治療劑量之抗體或其抗原結合片段以便抑制TNFα活性。較佳地，TNFα為人類TNFα且受檢者為人類受檢者。在一實施例中，TNFα抑制劑為阿達木單抗，亦稱為HUMIRA®(D2E7)。
如本文中所用，術語"TNFα活性起有害作用之病症"意欲包括患有病症之受檢者體內存在之TNFα已證明為或懷疑為病症之病理生理學之起因或造成病症惡化之因素的疾病及其他病症。因此，TNFα活性起有害作用之病症為預期TNFα活性之抑制會減輕病症之症狀及/或病程的病症。該等病症可例如由患有該病症之受檢者之生物流體中之TNFα濃度增加(例如受檢者之血清、血漿、滑液等中之TNFα濃度增加)來證明，此增加可例如使用如上所述之抗TNFα抗體來偵測。存在TNFα活 性起有害作用之病症之眾多實例。以下進一步討論本發明方法獲得之TNFα及抗體部分用於治療特定病症的用途：
A.膿毒病
腫瘤壞死因子在膿毒病之病理生理學中具有經證實之作用，生物效應包括低血壓、心肌抑制、血管滲漏徵候群、器官壞死、刺激毒性二級介體之釋放及凝結級聯之活化(參見例如Moeller,A.(1990)Cytokine 2：162-169；Moeller等人之美國專利第5,231,024號；Moeller,A.之歐洲專利公開案第260 610 B1號；Tracey,K.J.及Cerami,A.(1994)Annu.Rev.Med. 45：491-503；Russell,D及Thompson,R.C.(1993)Curr.Opin.Biotech.4：714-721)。本發明之多變劑量方法可用於治療處於其任何臨床情況中之膿毒病，包括敗血性休克、內毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒病及中毒性休克徵候群。
此外，為治療膿毒病，使用本發明之方法獲得之抗hTNFα抗體或抗體部分可與一或多種可進一步減輕膿毒病之其他治療劑共同投與，該其他治療劑為諸如介白素-1抑制劑(諸如描述於PCT公開案第WO 92/16221號及第WO 92/17583號中之抑制劑)、細胞因子介白素-6(參見例如PCT公開案第WO 93/11793號)或血小板活化因子之拮抗劑(參見例如歐洲專利申請公開案第EP 374 510號)。在一較佳實施例中，抗TNFα抗體或抗體部分投與膿毒病患者之子群內之IL-6之血清或血漿濃度在治療時超出500 pg/ml，且更佳1000 pg/ml之人類受檢者(參見Daum,L.等人PCT公開案第WO 95/20978號)。
B.自體免疫疾病
腫瘤壞死因子已涉及在多種自體免疫疾病之病理生理學中起作用。例如，TNFα已涉及活化組織炎症及導致類風濕性關節炎之關節破壞(參見例如Moeller,A.等人(1990)Cytokine 2：162-169；Moeller等人之美國專利第5,231,024號；Moeller,A.歐洲專利公開案第260 610 B1號； Tracey及Cerami，前述；Arend,W.P.及Dayer,J-M.(1995)Arth.Rheum. 38：151-160；Fava,R.A.等人(1993)Clin.Exp.Immunol. 94：261-266)。TNFα亦已涉及促進胰島細胞之死亡及介導糖尿病之胰島素抵抗(參見例如Tracey及Cerami前述；PCT公開案第WO 94/08609號)。TNFα亦已涉及介導針對寡樹突神經膠質細胞之細胞毒性及誘發多發性硬化症之發炎性斑塊(參見例如Tracey及Cerami，前述)。TNFα亦已涉及介導針對寡樹突神經膠質細胞之細胞毒性及誘發多發性硬化症之發炎性斑塊(參見例如Tracey及Cerami，前述)。嵌合及人源化鼠類抗hTNFα抗體已經受治療類風濕性關節炎之臨床試驗(參見例如Elliott,M.J.等人(1994)Lancet 344：1125-1127；Elliot,M.J.等人(1994)Lancet 344：1105-1110；Rankin,E.C.等人(1995)Br.J.Rheumatol. 34：334-342)。
諸如阿達木單抗之TNFα抗體可用以治療自體免疫疾病，尤其與發炎相關之彼等自體免疫疾病。該等自體免疫病狀之實例包括類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、骨關節炎及痛風性關節炎、過敏症、多發性硬化症、自體免疫糖尿病、自體免疫葡萄膜炎及腎病症候群。自體免疫病狀之其他實例包括多系統自體免疫疾病及自體免疫聽力喪失。
通常，抗體或抗體部分係全身性地投與，儘管對於某些病症，在發炎位點局部投與抗體或抗體部分可能有利(例如如PCT公開案第WO 93/19751號中所述，單獨或與亞環己基衍生物組合，局部投與類風濕性關節炎之關節中或表面施用於糖尿病潰瘍)。包括諸如D2E7之人類抗體及抗體部分的TNFα抑制劑亦可與一或多種適用於自體免疫疾病之多變劑量治療的其他治療劑一起投與，其如以下進一步討論。
在本發明之一實施例中，將使用本發明方法獲得之TNFα抗體用以治療諸如狼瘡之自體免疫病症。已展示狼瘡與TNF活性相關(Shvidel等人(2002)Hematol J.3：32；Studnicka-Benke等人(1996)Br J Rheumatol.35：1067)。如本文中所用之術語"狼瘡"係指可影響包括皮 膚、關節及內臟之許多器官系統的稱為紅斑性狼瘡之慢性發炎性自體免疫病症。狼瘡為包括大量特定類型狼瘡之普通術語，其包括全身性狼瘡、狼瘡腎炎及狼瘡大腦炎。在全身性狼瘡(SLE)中，身體天然防禦轉向對抗身體且劣性免疫細胞侵襲身體組織。可能產生可反抗身體血細胞、器官及組織之抗體。此反應導致免疫細胞侵襲受感染之系統，從而產生慢性病。亦稱為狼瘡腎小球疾病之狼瘡腎炎為通常作為SLE併發症之腎臟病症，且其特徵在於腎小球受損及腎臟功能之進行性損失。狼瘡大腦炎係指另一SLE併發症，其為腦及/或中樞神經系統之炎症。
另一可使用TNFα抗體治療之自體免疫疾病為克羅恩氏病，其更詳細描述於以下腸道病症部分中。
C.傳染性疾病
腫瘤壞死因子已涉及介導在多種傳染性疾病中觀察到之生物效應。例如，TNFα已涉及在瘧疾中介導大腦發炎及毛細管血栓症及梗塞。TNFα亦已涉及在腦膜炎中介導大腦發炎、誘發血腦屏障之崩潰、觸發敗血性休克徵候群及激發靜脈梗塞。TNFα亦已涉及在後天免疫缺陷症候群(AIDS)中誘發惡病質、激發病毒增殖及介導中樞神經系統損傷。因此，針對TNF之抗體及抗體部分可用於治療傳染性疾病，包括細菌性腦膜炎(參見例如歐洲專利申請公開案第EP 585 705號)、腦型瘧疾、AIDS及AIDS相關症候群(ARC)(參見例如歐洲專利申請公開案第EP 230 574號)以及移植繼發之細胞巨大病毒感染(參見例如Fietze等人(1994)Transplantation 58：675)。本發明抗體及抗體部分亦可用於減輕與傳染性疾病相關之症狀，包括歸因於感染(諸如流行性感冒)之熱病及肌痛及感染繼發(例如AIDS或ARC繼發)之惡病質。
D.移植
腫瘤壞死因子已涉及充當同種異體移植排斥及移植物抗宿主疾 病(GVHD)之關鍵介體且涉及介導當針對T細胞受體CD3複合物之大鼠抗體OKT3用以抑制腎移植之排斥反應時已觀察到之副反應(參見例如Eason等人(1995)Transplantation 59：300；Suthanthiran及Strom(1994)New Engl.J.Med.331：365)。因此，本發明抗體及抗體部分可用於使用多變劑量治療來抑制移植排斥反應，包括同種異體移植物及異種移植物之排斥反應，且可用於抑制GVHD。儘管可單獨使用抗體或抗體部分，但是更佳其與一或多種抑制針對同種異體移植物之免疫反應或抑制GVHD之其他藥劑組合使用。例如，在一實施例中，本發明抗體或抗體部分與OKT3組合使用以抑制OKT3誘導之反應。在另一實施例中，本發明抗體或抗體部分與一或多種指向與調節免疫反應有關之其他靶標之抗體組合使用，該等靶標為諸如細胞表面分子CD25(介白素-2受體-α)、CD11a(LFA-1)、CD54(ICAM-1)、CD4、CD45、CD28/CTLA4、CD80(B7-1)及/或CD86(B7-2)。在另一實施例中，本發明抗體或抗體部分與一或多種諸如環孢素A或FK506之一般免疫抑制劑組合使用。
E.惡性腫瘤
腫瘤壞死因子已涉及在惡性腫瘤中誘發惡病質、激發腫瘤生長、增加轉移性潛能及介導細胞毒性。因此，針對TNF之抗體及抗體部分可用於治療惡性腫瘤，其中治療抑制腫瘤生長或轉移及/或減輕惡性腫瘤繼發之惡病質。抗體或抗體部分可全身地或局部地投與腫瘤位點。
F.肺病症
腫瘤壞死因子已涉及成人呼吸窘迫症候群(ARDS)之病理生理學，包括激發白血球-內皮細胞活化、引導針對肺細胞之細胞毒性及誘發血管滲漏徵候群。使用本發明方法獲得之抗體可用以治療各種肺病症，包括成人呼吸窘迫症候群(參見例如PCT公開案第WO 91/04054號)、休克肺、慢性肺發炎性疾病、肺肉狀瘤病、肺纖維化及矽粉沉著病。抗體或抗體部分可例如以氣霧劑形式全身地或局部地投與肺表 面。抗體或抗體部分亦可與一或多種適用於治療肺病症之其他治療劑一起投與，其如以下進一步討論。
TNFα已涉及其病理生理學之肺病症之其他實例包括特發性間質性肺疾病及慢性阻塞性氣管病症(參見例如Piquet等人(1989)J Exp Med.170：655；Whyte等人(2000)Am J Respir Crit Care Med.162：755；Anticevich等人(1995)Eur J Pharmacol.284：221)。本發明進一步提供治療患有該肺病症之受檢者之TNFα活性的方法，該方法包含向受檢者投與抗體或抗體部分以使得患有特發性間質性肺疾病或慢性阻塞性氣管病症之受檢者之TNFα活性得以抑制。TNFα活性起有害作用之特發性間質性肺疾病及慢性阻塞性氣管病症之實例進一步討論如下。
1.特發性間質性肺疾病
在一實施例中，使用本發明方法獲得之TNFα抗體用以治療患有特發性間質性肺疾病之受檢者。術語"特發性肺纖維化"或"IPF"係指以發炎及最終深度肺組織結疤，導致呼吸急促為特徵之病症群。IPF中肺泡("alveoli"、"air sac")及其支承結構(間質)之結疤最終導致損失功能性肺泡單元及減少自空氣轉移至血液中之氧。IPF亦稱為擴散實質性肺疾病；肺泡炎；隱原性纖維性肺泡炎(CFA)；特發性肺炎(IPP)；及普通型間質性肺炎(UIP)。所使用之IPF通常與UIP同義("IPF/UIP")，此歸因於UIP為IPF之病理診斷中最常見之細胞模式。
特發性間質性肺疾病以三種方式侵害肺：首先，肺組織以某種已知或未知的方式受損傷；其次，肺中之肺泡之壁變得發炎；及最後，間質(或介於肺泡之間之組織)中開始結疤(或纖維化)且肺變得硬化。特發性間質性肺疾病之實例包括特發性肺纖維化(IPF)。腫瘤壞死因子已涉及特發性肺纖維化(IPF)之病理生理學(參見Piquet等人(1989)J Exp Med.170：655；Whyte等人(2000)Am J Respir Crit Care Med 162：755；Corbett等人(2002)Am J Respir Crit Care Med.165：690)。例如，已發現 IPF患者之巨噬細胞及第II型上皮細胞中所表現之TNF表現量增加(Piquet等人(1993)Am J Pathol 143：651；Nash等人(1993)Histopathology 22：343；Zhang等人(1993)J Immunol 150：4188)。某些遺傳多態性亦與TNF表現增加相關，且涉及在IPF及矽粉沉著病中起作用(Whyte等人，前述；Corbett等人，前述)。
患有IPF之患者通常顯示某些症狀，包括乾咳、胸痛及/或呼吸急促。通常用於治療IPF之藥物為潑尼松(prednisone)及環磷醯胺，儘管僅一部分患者藉由持續使用該等藥物而改良(American Thoracic Society(2000)Am.J.Respir.Crit.Care Med.161：646)。給氧及肺移植為其他治療選擇。在一實施例中，藉由本發明方法獲得之抗體可與例如氧之另一治療劑組合使用以便治療特發性肺纖維化。
用以研究特發性間質性肺疾病及慢性阻塞性氣管病症之動物模型之實例包括卵白蛋白(OVA)誘發之過敏性哮喘小鼠及捲煙煙氣誘發之慢性障礙性肺病小鼠(參見Hessel等人(1995)Eur J Pharmacol.293：401；Keast等人(1981)J.Pathol.135：249)。
2.慢性阻塞性氣管病症
在一實施例中，TNFα抗體用以治療患有慢性阻塞性氣流病症之受檢者。在該等疾病中，氣流阻塞可為慢性及持續性或陣發性及復發性的。氣流阻塞通常由用力呼氣肺活量測定法測定，其記錄在最大呼氣期間儘快地呼出體積之時間。在並不患有氣流阻塞之受檢者中，完全用力呼氣通常耗費3至4秒。在氣流不通的患有慢性阻塞性氣流病症之患者中，其通常耗費高達15至20秒且可受屏氣時間限制。呼氣第一秒之正常用力呼氣體積(FEV1)易於量測且基於年齡、性別及身高精確地預測。FEV1與用力肺活量之比率(FEV1/FVC)通常超過0.75。記錄在用力呼氣及隨後用力吸氣期間氣流量(流量循環)亦適用，主要用於區分上氣管窄化與下氣管窄化。慢性阻塞性氣管病症之實例描述如下。
a.哮喘
腫瘤壞死因子已涉及哮喘之病理生理學，(Anticevich等人(1995)Eur J Pharmacol.284：221；Thomas等人1995.Am J Respir Crit Care Med.152：76；Thomas及Heywood(2002)Thorax.57：774)。例如，已發現急性哮喘發作與肺嗜中性白血球增多及BAL TNF含量升高相關(Ordonez等人(2000)Am J Respir Crit Care Med 161：1185)。已發現哮喘症狀之嚴重程度與室內塵埃中之內毒素含量有關。在大鼠中，抗TNF抗體降低內毒素誘發之氣管變化(Kips等人(1992)Am Rev Respir Dis 145：332)。
如本文中所用之術語"哮喘"係指氣管發炎導致進出肺之氣流受限制的病症。哮喘亦稱為支氣管哮喘、運動誘發之哮喘-支氣管及反應性氣管疾病(RAD)。在某些情況下，哮喘與過敏症相關及/或具家族性。哮喘包括特徵在於支氣管直徑或口徑在短時間內廣泛波動，導致肺功能變化之病狀。所導致之氣流阻力增加產生染病受檢者之症狀，包括透不過氣(呼吸困難)、胸部收縮或"緊窄感"及喘鳴。
患有哮喘之患者根據NIH指標表徵，描述為輕度間歇性、輕度持續性、中度持續性及嚴重持續性(參見NAEPP Expert Panel Report Guidelines for the Diagnosis and Management of Asthma-Update on Selected Topics 2002.JACI 2002；110：S141-S209；Guidelines for the Diagnosis and Management of Asthma.NIH公開案97-4051，1997年7月)。經診斷患有中度持續性哮喘之患者通常以吸入皮質類固醇來治療。經診斷患有嚴重持續性哮喘之患者通常以大劑量吸入之皮質類固醇及口服皮質類固醇來治療。
b.慢性障礙性肺病(COPD)
腫瘤壞死因子已涉及慢性障礙性肺病之病理生理學，(Keatings(2000)Chest.118：971；Sakao等人(2001)Am J Respir Crit Care Med. 163：420；Sakao等人(2002)Chest.122：416)。如本文中可互換使用之術語"慢性障礙性肺病"或"COPD"係指以因氣囊擴大程度變化及肺組織破壞而導致之氣流受限制為特徵的肺疾病群。術語COPD包括慢性支氣管炎(具有杯狀細胞黏膜下腺增生之黏液分泌過多)、慢性阻塞性支氣管炎或肺氣腫(氣管實質之破壞)或該等病狀之組合。肺氣腫及慢性支氣管炎為最常見形式之慢性障礙性肺病。COPD定義為不可逆的氣流阻塞。
在COPD中，慢性發炎導致小氣管之既定窄化及肺實質及肺泡壁破壞(肺氣腫)。此病症之特徵在於由肺泡巨噬細胞、嗜中性細胞及細胞毒性T淋巴細胞之數目增加及多種發炎性介體(脂質、趨化因子、細胞因子、生長因子)之釋放。此發炎引起因小氣管窄化及肺實質破壞而導致的纖維化。亦存在較高程度之可能放大此發炎之氧化應激。
G.腸道病症
腫瘤壞死因子已涉及包括克羅恩氏病之發炎性腸病症之病理生理學(參見例如Tracy等人(1986)Science 234：470；Sun等人(1988)J.Clin.Invest.81：1328；MacDonald等人(1990)Clin.Exp.Immunol.81：301)。嵌合鼠類抗hTNFα抗體已經受治療克羅恩氏症之臨床試驗(van Dullemen等人(1995)Gastroenterology 109：129)。本發明所包括之治療包含投與使用本發明方法獲得之TNFα抗體以使用人類抗體或其抗原結合片段來治療諸如特發性發炎性腸疾病之腸道病症。特發性發炎性腸疾病包括兩種徵候群：克羅恩氏症及潰瘍性結腸炎。在一實施例中，使用本發明方法獲得之抗體亦用以治療通常與IBD及克羅恩氏病相關之病症。如本文中可互換使用之術語"發炎性腸病症(IBD)相關之病症"或"克羅恩氏病相關之病症"用以描述通常與IBD及克羅恩氏病相關之病狀及併發症。
本發明包括包含投與TNFα抗體以治療克羅恩氏病之多變劑量方 案。克羅恩氏病之治療係基於疾病之位置、範圍及嚴重程度。藥理學介入包括消炎劑(胺基水楊酸鹽及皮質類固醇)及免疫調節藥劑(硫唑嘌呤(azathioprine)及6-巰基嘌呤[6-MP]、環孢素、甲胺喋呤[MTX]、抗生素藥劑及生物藥劑)。C-反應性蛋白(CRP)及紅血球沈降速率(ESR)程度反映非特異性急性期反應。內窺鏡檢查法為診斷克羅恩氏病之主要方法。克羅恩氏病之放射性特徵係由包括黏膜水腫、口瘡及線狀潰瘍、不對稱窄化及狹窄及由腸系膜稠化所引起之相鄰腸迴分離的鋇檢驗所展示。異常現象呈局灶性及不對稱性。主要組織病變為口瘡性潰瘍。患有克羅恩氏病之受檢者可使用克羅恩氏病活性指數(CDAI)來評估，其為疾病嚴重程度之標準度量，較高分數表明更嚴重之疾病活性。
可使用本發明方法治療之克羅恩氏病相關病症之實例包括膀胱、陰道及皮膚中之瘺；腸阻塞；膿腫；管養缺乏；源自使用皮質類固醇之併發症；關節發炎；結節性紅斑；壞疽性膿皮病；及眼病變。通常與克羅恩氏病相關之其他病症包括克羅恩氏病相關之關節痛、腸瘺羅恩氏病、未定結腸炎及慢性腸炎。
H.心臟病症
使用本發明方法獲得之抗體或其抗原結合片段亦可用於治療各種心臟或冠狀病症，包括心臟之局部缺血(參見例如歐洲專利申請公開案第EP 453 898號)及心臟功能障礙(心肌虛弱)(參見例如PCT公開案第WO 94/20139號)。TNFα亦已涉及再狹窄之病理生理學(參見例如Clausell等人(1994)前述；Medall等人(1997)Heart 78：273)。
如本文中所用，術語"TNFα活性起有害作用之心臟病症"意欲包括患有病症之受檢者體內存在之TNFα已證明為或懷疑為病症之病理生理學之起因或造成病症惡化之因素的冠狀及心血管疾病，包括例如再狹窄之心血管病症。如本文中可互換使用之術語"心血管病症"或"冠狀病症"係指涉及例如心臟、血管及/或血液之心血管系統的任何疾病、 病症或病態。冠狀病症之特徵通常在於向心臟提供血液及氧之血管(冠狀動脈)窄化。冠心病可由脂肪物質及斑塊之積聚引起。當冠狀動脈窄化時，至心臟之血液流可較慢或停止。本發明之冠狀病症可用於無論結構性、組織性、生物化學性或任何其他異常之任何動脈異常。冠心病之實例為再狹窄。在一實施例中，冠狀病症係指不包括心臟局部缺血及心臟功能障礙之涉及心血管系統的任何疾病、病症或病態。
TNFα活性起有害作用之冠狀病症通常由動脈閉塞引起。該閉塞可由凝塊造成，此凝塊通常形成於先前因通常與動脈粥樣硬化有關之變化而導致窄化的冠狀動脈中。例如，若動脈壁內之動脈粥樣硬化斑破裂，則其可引起血栓或凝塊之形成。該等病症可例如由患有該病症之受檢者之生物流體中的TNFα濃度增加(例如受檢者之血清、血漿、滑液等中之TNFα濃度增加)來證明，此增加可例如使用如上所述之抗TNFα抗體來偵測。冠狀病症亦可由動脈壓失調、心臟官能障礙或血管閉塞(例如由血栓)引起。冠狀病症包括冠狀動脈病與周邊血管疾病。
存在TNFα活性起有害作用之眾多心臟病症的實例，包括再狹窄。以下進一步討論使用抗體、抗體部分治療特定冠狀病症。在某些實施例中，如下所述，抗體、抗體部分與另一治療劑組合投與受檢者。
使用本發明方法獲得之抗體亦可用於抑制患有心臟病症之受檢者之TNFα活性。本發明提供抑制或降低患有冠狀病症之受檢者之TNFα活性的方法，包含向受檢者投與本發明之抗體或抗體部分或其他TNFα抑制劑以便抑制或降低受檢者之TNFα活性。較佳地，TNFα為人類TNFα且受檢者為人類受檢者。或者，受檢者可為表現本發明抗體與其交叉反應之TNFα的哺乳動物。另外，受檢者可為hTNFα已引入其中(例如藉由投與hTNFα或藉由表現hTNFα轉殖基因)的哺乳動物。本發明抗體可投與人類受檢者用於治療目的。
此外，本發明抗體可投與用於治療動物之目的或作為人類疾病之 動物模型的表現抗體與其交叉反應之TNFα的非人類哺乳動物(例如靈長類、豬或小鼠)。關於後者，該等動物模型可適用於評估多變劑量治療效能(例如測試投與之劑量及時程)。通常用於研究包括再狹窄之冠狀病症之動物模型包括大鼠或小鼠頸動脈結紮模型及頸動脈損傷模型(Ferns等人(1991)Science 253：1129；Clowes等人(1983)Lab.Invest.49：208；Lindner等人(1993)Circ Res.73：792)。在頸動脈結紮模型中，動脈血流量受接近遠端分叉點受之血管結紮干擾。如Clowes等人所述，執行頸動脈損傷模型以便藉由將經由頸外動脈引入之氣囊導管傳遞至管腔內而將頸總動脈剝去內皮。2週後，頸動脈由於平滑肌細胞收縮而顯著窄化，但在第2週與第12週之間，內膜厚度加倍，引起管腔尺寸減小。任何該等模型均可用於測定本發明TNFα抗體在預防及治療人類之再狹窄中的潛在治療作用。
本發明包括治療TNFα活性起有害作用之心血管病症，其中預期TNFα活性之抑制減輕冠心病之症狀及/或病程或預防冠心病。患有冠狀病症或處於顯現冠狀病症之危險中之受檢者可藉由臨床症狀鑑定。冠心病之臨床症狀通常包括胸痛、呼吸急促、虛弱、昏厥、意識變化、劇痛、陣發性夜間呼吸困難、短暫性缺血性發作及其他由患者經歷之徵兆。冠心病之臨床症狀亦可包括EKG異常、周邊脈衝改變、動脈雜音、異常心音、速率及笛音、頸靜脈膨脹、神經病學變化及其他由臨床醫師辨別之觀測結果。冠狀病症亦可例如由患有該病症之受檢者之生物流體中之TNFα濃度增加(例如受檢者之血清、血漿、滑液等中之TNFα濃度增加)來證明。
心血管病症之實例包括(但不限於)冠狀動脈病、心絞痛、心肌梗塞、心跳驟停引起之心血管組織損傷、心臟搭橋引起之心血管組織損傷、心原性休克及高血壓、動脈粥樣硬化、冠狀動脈痙攣、冠狀動脈病、瓣膜疾病、心律不整及心肌病。以下進一步討論抗體、抗體部分 用於治療特定心血管疾病的用途。在某些實施例中，如下所述，抗體、抗體部分與另一治療劑組合投與受檢者。
1.再狹窄
如本文中所用之術語"再狹窄"係指為動脈之窄化或收縮之狹窄的復發。再狹窄通常以繼患病血管中之改造程序之後出現的趨閉合病變形式發生。該術語不僅應用於預先存在之狹窄之復發，而且應用於繼血管搭橋之後變得部分阻塞之先前正常血管。在另一實施例中，本發明提供治療再狹窄之方法，其包含將使用本發明獲得之抗體或其抗原結合部分投與患有再狹窄或處於顯現再狹窄危險中之受檢者。
TNFα已涉及再狹窄之病理生理學(參見Zhou等人(2002)Atherosclerosis.161：153；Javed等人(2002)Exp and Mol Pathol 73：104)。例如，在鼠類導線頸動脈模型中，TNF-/-小鼠證明與野生型小鼠相比較初始增生降低7倍(Zimmerman等人(2002)Am J Phsiol Regul Integr Comp Physiol 283：R505)。再狹窄可作為無論在冠狀維管結構中或在末梢中之任何類型血管改造之結果而發生(Colburn及Moore(1998)Myointimal Hyperplasia第690-709頁，於Vascular Surgery：A Comprehensive Review Philadelphia：Saunders中)。例如，研究報導繼冠狀血管成形術之後30-50%之症狀性再狹窄比率(參見Berk及Harris(1995)Adv.Intern.Med.40：455)。作為另一實例，在頸動脈內膜切除術之後，所研究之20%患者患有大於50%之管腔窄化(Clagett等人(1986)J.Vasc.Surg.3：10)。證明呈不同程度症狀之再狹窄與歸因於包括所涉及血管之性質、殘餘疾病之範圍及局部血液動力學之因素之組合而在不同解剖學位置中出現之趨閉塞病變同時發生。
如本文中所用，"狹窄"係指如閉塞性病症或再狹窄中所見之動脈窄化。狹窄可伴隨有反映經過窄化動脈區段之血流量減小之彼等症狀，在該情況下導致狹窄之病症稱為疾病(亦即閉塞性疾病或再狹窄疾 病)。狹窄可無症狀地存在於血管中，僅僅由諸如血管造影術或血管實驗室研究之診斷介入偵測。
使用本發明方法獲得之抗體可用以治療患有再狹窄或處於顯現再狹窄危險中之受檢者。處於顯現再狹窄危險中之受檢者包括經受PTCA之受檢者。受檢者亦可能已具有所插入以預防再狹窄之支架。TNFα抗體可單獨或與支架組合使用以預防患有心血管疾病之受檢者中之狹窄的再發生。
2.充血性心臟衰竭
TNFα已涉及充血性心臟衰竭之病理生理學(參見Zhou等人(2002)Atherosclerosis 161：153)。TNFα之血清含量以與疾病嚴重程度成正比之方式較高水準地存在於充血性心臟衰竭患者中(Levine等人(1990)N Engl J Med 323：236；Torre-Amione等人(1996)J Am Coll Cardiol 27：1201)。另外，亦已展示TNFα之抑制劑可改良充血性心臟衰竭症狀(Chung等人(2003)Circulation 107：3133)。
如本文中所用，術語"充血性心臟衰竭"包括以心臟滿足身體需氧量之能力減少為特徵之病狀。充血性心臟衰竭之症狀及病侯包括至身體之各種組織中之血流量減少、過量血液積累於各種器官中(例如當心臟不能泵出經由大靜脈回流至其中之血液時)、勞累性呼吸困難、疲勞及/或周邊水腫(例如由左心室功能障礙引起之周邊水腫)。充血性心臟衰竭可呈急性或慢性。充血性心臟衰竭之表現通常在共同具有心臟功能之暫時或永久損失之心臟或全身性病症之後發生。該等病症之實例包括高血壓、冠狀動脈病、瓣膜疾病及心肌病，例如肥大、膨脹或限制性心肌病。
"患有或罹患充血性心臟衰竭之受檢者"為患有所涉及之各種病因之臨床徵候群與心臟泵送削弱之共同點相關之病症的受檢者，其中心臟不能泵送符合代謝組織之要求的血液，或僅能以較高充填壓力實現 此舉。"處於顯現充血性心臟衰竭危險中之受檢者"為由於某些影響受檢者之心血管系統之因素而具有顯現充血性心臟衰竭之傾向的受檢者。在此等受檢者中，需要降低充血性心臟衰竭之風險或預防其顯現。短語"患有充血性心臟衰竭"包括即使其尚未罹患此病狀，但由於顯示風險因素而相對於一般人群而言處於罹患此病狀危險中的患者。例如，患有未經治療之高血壓之患者可能未罹患充血性心臟衰竭，但歸因於其高血壓病狀而處於危險中。在本發明之一實施例中，抗體阿達木單抗用以治療處於顯現充血性心臟衰竭危險中之受檢者。
3.急性冠狀徵候群
TNFα已涉及急性冠狀徵候群之病理生理學(參見Libby(1995)Circulation 91：2844)。急性冠狀徵候群包括歸因於血流量受限制引起到達心臟之氧不足而導致受檢者經歷疼痛的彼等病症。研究發現TNFα在急性冠狀徵候群中起作用。例如，在不存在下游血液動力學效應的情況下能夠誘發心肌梗塞之新穎大鼠異向心臟移植-冠狀結紮模型中，投與嵌合可溶性TNF受體(sTNFR)消除短暫LV重塑及功能障礙(Nakamura等人(2003)J.Cardiol.41：41)。亦發現將sTNFR表現質體直接注入心肌中，導致急性心肌梗塞(AMI)實驗大鼠中之梗塞尺寸減小(Sugano等人(2002)FASEB J 16：1421)。
在一實施例中，TNFα抗體用於治療或預防受檢者之急性冠狀徵候群，其中急性冠狀徵候群為心肌梗塞或絞痛。
如本文中所用，術語"心肌梗塞"或"MI"係指心臟病發作。心肌梗塞涉及歸因於供應至心臟區域中之氧不充足而導致彼區域壞死或永久性損傷。此壞死通常由源自動脈粥樣硬化或者栓塞之冠狀動脈阻塞引起。由使用本發明方法獲得之TNFα抗體治療之MI包括Q波與非Q波心肌梗塞。大多數心臟病發作由阻塞冠狀動脈(將血液及氧引入心肌中之血管)之一的凝塊造成。例如，冠狀動脈中之凝塊阻斷血液及氧流至心 肌中，引起彼區域中之心臟細胞死亡。受損傷心肌永久地喪失其收縮能力，且其餘心肌需要對其進行補償。MI亦可由個體中之壓倒性應激反應造成。
術語"絞痛"係指痙攣性、氣哽性或窒息性疼痛，且尤其表示為最通常歸因於心肌缺氧之突發性胸疼痛的心絞痛。絞痛包括變異型絞痛與勞累型絞痛。患有絞痛之受檢者患有表現為通常輻射至左肩部且直至左臂之突然、嚴重、壓迫性胸骨下疼痛的缺血性心臟病。因為TNFα含量在患有MI與穩定型絞痛之患者中上調，所以TNFα已涉及於絞痛中(Balbay等人(2001)Angiology 52109)。
4.動脈粥樣硬化
如本文中所用，"動脈粥樣硬化"係指脂肪物質沿動脈壁沈積之病狀。此脂肪物質稠化、硬化，且可最終阻塞動脈。動脈粥樣硬化亦係指動脈硬化("arteriosclerosis"、"hardening of the arteries")及動脈斑塊積聚。已展示針對TNFα之多株抗體可有效中和在兔動脈粥樣硬化模型中導致發炎及再狹窄之TNFα活性(Zhou等人，前述)。因此，TNFα抗體可用以治療或預防罹患動脈粥樣硬化或處於患有動脈粥樣硬化危險中之受檢者。
5.心肌病
如本文中所用之術語"心肌病"用以定義心肌("heart muscle"、"myocardium")受削弱，通常導致心臟泵送不充足的心肌疾病。心肌病可由病毒感染、心臟病發作、酒精中毒、長期嚴重高血壓("hypertension"、"high blood pressure")或由自體免疫病因造成。
在約75-80%之心臟衰竭患者中，冠狀動脈病為心肌病之潛在病因且稱為"缺血性心肌病"。缺血性心肌病由在心肌中留下疤痕之心臟病發作造成。染病心肌則不會有助於心臟泵送功能。疤痕越大或心臟病發作次數越多，顯現缺血性心肌病之機會越高。
並不歸因於潛在冠狀動脈病之心肌病稱為"非缺血性心肌病"。非缺血性心肌病包括(但不限於)特發性心肌病、肥厚型心肌病、酒精性心臟病、擴張型心肌病、分娩前後心肌病及限制性心肌病。
I.脊椎關節病
TNFα已涉及包括諸如脊椎關節病之發炎疾病的多種病症之病理生理學(參見例如Moeller等人(1990)Cytokine 2：162；美國專利第5,231,024號；歐洲專利公開案第260 610號)。本發明提供抑制罹患脊柱關節病之受檢者之TNFα活性的多變劑量方法，該方法包含向受檢者投與抗體、抗體部分，以便抑制罹患脊柱關節病之受檢者之TNFα活性。
如本文中所用，術語"脊柱關節病"或"脊椎關節病"用以指影響脊柱關節之若干疾病之任一者，其中該等疾病共同具有常見臨床、放射性及組織性特徵。大量脊椎關節病共有遺傳特性，亦即其與HLA-B27等位基因相關。在一實施例中，術語脊柱關節病用以指影響脊柱關節之若干疾病(不包括強直性脊椎炎)之任一者，其中該等疾病共同具有常見臨床、放射性及組織性特徵。脊椎關節病之實例包括強直性脊椎炎、牛皮癬性關節炎/脊椎炎、腸病性關節炎、反應性關節炎或萊特爾氏症候群(Reiter's syndrome)及未分化脊椎關節病。用以研究脊椎關節病之動物模型之實例包括ank/ank轉殖基因小鼠、HLA-B27轉殖基因大鼠(參見Taurog等人(1998)The Spondylarthritides.Oxford：Oxford University Press)。
本發明多變劑量方法亦可用以使用多變劑量方法治療處於顯現脊柱關節病危險中之受檢者。處於患有脊椎關節病危險中之受檢者之實例包括罹患關節炎之人類。脊椎關節病可與包括類風濕性關節炎之其他形式之關節炎相關。在本發明之一實施例中，抗體用於多變劑量方法中以治療罹患與類風濕性關節炎相關之脊柱關節病的受檢者。可以TNFα抗體治療之脊椎關節病之實例描述如下：
1.強直性脊椎炎(AS)
腫瘤壞死因子已涉及強直性脊椎炎之病理生理學(參見Verjans等人(1991)Arthritis Rheum.34：486；Verjans等人(1994)Clin Exp Immunol.97：45；Kaijtzel等人(1999)Hum Immunol.60：140)。強直性脊椎炎(AS)為涉及一或多個椎骨之發炎的發炎性病症。AS為影響主軸骨骼及/或周邊關節(包括脊柱椎骨之間之關節及骶骼關節及脊柱與骨盆之間之關節)的慢性發炎性疾病。AS可最終致使染病椎骨融合或生長在一起。包括AS之脊椎關節病可與牛皮癬性關節炎(PsA)及/或包括潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病之發炎性腸疾病(IBD)相關。
AS之早期表現可由包括CT掃描及MRI掃描之射線照相測試測定。AS之早期表現通常包括骶髂關節炎及骶髂關節之變化，其由軟骨下骨骼之皮層邊緣模糊，繼之以侵蝕及硬化所證明。亦已指出疲勞為AS之常見症狀(Duffy等人(2002)ACR 66th Annual Scientific Meeting摘要)。因此，包含投與本發明之抗體或其抗原結合片段之多變劑量方法可用於治療AS。
在一實施例中，本發明多變劑量方法用以治療與包括AS之IBD相關之脊椎關節病。AS通常以諸如阿司匹林(aspirin)或吲哚美辛(indomethacin)之非類固醇消炎藥物(NSAID)治療。因此，用於本發明多變劑量方法之TNFα抗體亦可與通常用以減少通常與強直性脊椎炎相關之發炎及疼痛的藥劑組合投與。
2.牛皮癬性關節炎
腫瘤壞死因子已涉及牛皮癬性關節炎(PsA)之病理生理學(Partsch等人(1998)Ann Rheum Dis.57：691；Ritchlin等人(1998)J Rheumatol.25：1544)。如本文中所提及，牛皮癬性關節炎或與皮膚相關之牛皮癬係指與牛皮癬相關之慢性發炎性關節炎，其為導致身體上之紅色斑點之常見慢性皮膚病狀。20個患有牛皮癬之個體中約1者將顯現關節炎以 及皮膚病狀，且在約75%之病例中，牛皮癬發生於關節炎之前。PsA以輕度至重度關節炎之範圍內之多種方式自我展現，其中關節炎通常侵染手指及脊柱。當脊柱受侵染時，症狀與如上所述之強直性脊椎炎之彼等症狀相似。使用本發明獲得之TNFα抗體或其抗原結合片段可用於治療PsA。
PsA有時與破壞性關節炎相關。破壞性關節炎係指以導致破壞關節之總體糜爛性變形的過度骨侵蝕為特徵之病症。在一實施例中，使用本發明方法獲得之抗體用以治療破壞性關節炎。
3.反應性關節炎/萊特爾氏症候群
腫瘤壞死因子已涉及亦稱為萊特爾氏症候群之反應性關節炎之病理生理學(Braun等人(1999)Arthritis Rheum.42(10)：2039)。反應性關節炎(ReA)係指與體內其它地方之感染併發，通常繼腸道或泌尿生殖器感染之後出現之關節炎。ReA之特徵通常在於包括關節發炎(關節炎)、尿道炎、結膜炎及皮膚及黏膜病變之某些臨床症狀。另外，ReA可繼性傳播疾病感染或痢疾感染(包括衣原體屬、彎曲桿菌屬、沙門菌屬或耶爾森氏菌屬)之後發生。因此，使用本發明方法獲得之抗體可用以治療ReA。
4.未分化脊椎關節病
在一實施例中，使用本發明方法獲得之抗體用以治療罹患未分化脊椎關節病之受檢者(參見Zeidler等人(1992)Rheum Dis Clin North Am.18：187)。用以描述未分化脊椎關節病之其他術語包括血清陰性寡關節炎及未分化寡關節炎。如本文中所用，未分化脊椎關節病係指受檢者僅展示某些與脊椎關節病相關之症狀的病症。此病狀通常在並未患有IBD、牛皮癬或AS或萊特爾氏症候群之典型症狀的青年成人中觀察到。在某些情況下，未分化脊椎關節病可為AS之早期指示。在一實施例中，本發明包含投與使用所主張之方法獲得之TNFα抗體或其抗原結 合片段來治療未分化脊椎關節病。
J.代謝障礙
TNFα已涉及包括諸如糖尿病及肥胖症之代謝障礙之多種病症的病理生理學(Spiegelman及Hotamisligil(1993)Cell 73：625；Chu等人(2000)Int J Obes Relat Metab Disord.24：1085；Ishii等人(2000)Metabolism.49：1616)。如本文中所用之術語"代謝障礙"係指影響身體處理實現生理機能所需要之物質之方式的疾病或病症。代謝障礙之實例包括(但不限於)糖尿病及肥胖症。在本發明之一實施例中，術語"代謝障礙"用以指影響身體處理實現生理機能所需要之物質之方式的病症，不包括自體免疫糖尿病。
本發明提供抑制罹患該代謝障礙之受檢者之TNFα活性的方法，該方法包含向受檢者投與抗體、抗體部分，以便抑制罹患代謝障礙之受檢者之TNFα活性。TNFα抗體亦可用以治療處於顯現代謝障礙危險中之受檢者。
代謝障礙通常與包括類風濕性關節炎之關節炎相關。在一實施例中，諸如抗體之TNFα抑制劑用於罹患與類風濕性關節炎相關之代謝障礙之受檢者的多變劑量方案中。在另一實施例中，本發明包含投與TNFα抗體以治療與糖尿病或肥胖症相關之病症。
用於評估治療代謝障礙之TNFα抗體之功效的動物模型之實例包括NOD轉殖基因小鼠、Akita小鼠、NSY轉殖基因小鼠及ob/ob小鼠(參見Baeder等人(1992)Clin Exp Immunol.89：174；Haseyama等人(2002)Tohoku J Exp Med.198：233；Makino等人(1980)：Exp.Anim.29：1；Kolb(1987)Diabetes/Metabolism Reviews 3：751；Hamada等人(2001)Metabolism.50：1282；Coleman,(1978)Diabetologia,14：141；Bailey等人(1982)Int.J.Obesity 6：11)。用以研究脈管炎之動物模型之實例包括小鼠HSV模型(白塞氏病(Behcet's disease))、小鼠乾酪乳酸桿菌(L. casei)模型(川崎氏疾病(Kawasaki's disease)及小鼠ANCA模型(川崎氏疾病)。脈管炎之其他模型包括McH5-lpr/lpr系(Nose等人(1996)Am.J.Path.149：1763)及小鼠SCG/Kj系(Kinjoh等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 90：3413)。該等小鼠品系自發地顯現新月體性絲球體腎炎(crescentic glomerulonephritis)及脾臟、胃部、心臟、子宮及卵巢之小動脈及微動脈之壞死性脈管炎。該等動物顯現高γ-球蛋白血症及與髓過氧化酶(MPO)反應之ANCA自體抗體。另外，使用人類MPO使大鼠免疫導致ANCA相關之壞死性新月體性絲球體腎炎(Brouwer等人(1993)J.Exp.Med.177：905)。
代謝障礙影響身體處理實現生理機能所需要之物質之方式。若干本發明之代謝障礙共有某些特性，亦即其與胰島素抵抗、缺少調節血糖之能力、體重增加及體重指數增大相關。代謝障礙之實例包括糖尿病及肥胖症。糖尿病之實例包括1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病性神經病、周圍神經病、糖尿病性視網膜病、糖尿病潰瘍、視網膜病潰瘍、糖尿病性大血管病變及肥胖症。以下更詳細描述可使用包含投與TNFα抗體之多變劑量方法治療之代謝障礙之實例：
1.糖尿病
腫瘤壞死因子已涉及糖尿病之病理生理學。(參見例如Navarro等人(2003)Am J Kidney Dis.42：53；Daimon等人(2003)Diabetes Care.26：2015；Zhang等人(1999)J Tongji Med Univ.19：203；Barbieri等人(2003)Am J Hypertens.16：537)。例如，TNFα涉及胰島素抵抗之病理生理學。已發現患有胃腸癌症之患者之血清TNF含量與胰島素抵抗有關(參見例如McCall等人(1992)Br.J.Surg.79：1361)。
如本文中可互換使用之術語"糖尿病"("diabetes"、"diabetic disorder"、"diabetes mellitus")係指以血液中較高糖(葡萄糖)含量為特徵之疾病。糖尿病可由過少胰島素(由胰腺產生以調節血糖之化學 物)、胰島素抵抗或兩者造成。糖尿病包括兩種最常見類型之病症，亦即I型糖尿病及II型糖尿病，其兩者由身體不能調節胰島素引起。胰島素為由胰腺響應於血液中血糖(葡萄糖)含量增加而釋放之激素。
如本文中所用之術語"1型糖尿病"係指當胰腺產生過少胰島素而不能適當地調節血糖量時發生之慢性疾病。1型糖尿病亦稱為胰島素依賴型糖尿病、IDMM、幼年型發作糖尿病及I型糖尿病。1型糖尿病作為胰腺β細胞之進行性自體免疫破壞，繼之以胰島素缺乏的結果而出現。
術語"2型糖尿病"係指當通常由於身體未對胰島素作出完全響應而使胰腺未產生足夠的胰島素以保持正常血糖含量時所發生的慢性疾病。2型糖尿病亦稱為非胰島素依賴性糖尿病、NDDM及II型糖尿病。
糖尿病可由施以葡萄糖耐量試驗來診斷。臨床上，糖尿病通常分成若干基本類別。該等類型之主要實例包括自體免疫糖尿病、非胰島素依賴性糖尿病(1型NDDM)、胰島素依賴性糖尿病(2型IDDM)、非自體免疫糖尿病、非胰島素依賴性糖尿病(2型NIDDM)及年青人成年型糖尿病(MODY)。另一通常稱為繼發之類型係指由某種導致或使得糖尿病徵候群顯現之可鑑定病狀引起之糖尿病。繼發類型之實例包括由胰腺疾病、激素異常引起之糖尿病、藥物誘發或化學物誘發之糖尿病、由胰島素受體異常引起之糖尿病、與遺傳徵候群相關之糖尿病及其他病因之糖尿病。(參見例如Harrison's(1996)第14版，New York,McGraw-Hill)。
糖尿病通常以膳食、胰島素劑及各種本文中描述之藥物治療。因此，TNFα抗體亦可與通常用以治療代謝障礙及與糖尿病相關之疼痛的藥劑組合投與。
另外，如本文中所用，短語"與糖尿病相關之病症"係指通常與糖尿病相關或與其有關之病狀及其他疾病。與糖尿病相關之病症之實例包括(例如)高血糖症、高胰島素血症、高脂質血症、胰島素抵抗、葡 萄糖代謝不良、肥胖症、糖尿病性視網膜病、黃斑退化、白內障、糖尿病性腎病、腎小球硬化、糖尿病性神經病、勃起困難、經前期症候群、血管再狹窄、潰瘍性結腸炎、冠心病、高血壓、心絞痛、心肌梗塞、中風、皮膚及結締組織病症、足部潰瘍、代謝性酸中毒、關節炎及骨質疏鬆症。
糖尿病在上述類型中自我展現且可導致在下列部分中討論之若干併發症。因此，本發明之抗體或其抗原結合片段可用於治療糖尿病。在一實施例中，TNFα抗體或其抗原結合片段用以治療與以上確定之類型相關之糖尿病。在另一實施例中，本發明包括投與TNFα抗體以治療與糖尿病相關之病症。糖尿病在包括下列類別之許多與糖尿病相關之併發症及病狀中自我展現：
a.糖尿病性神經病及周圍神經病
腫瘤壞死因子已涉及糖尿病性神經病及周圍神經病之病理生理學。(參見Benjafield等人(2001)Diabetes Care.24：753；Qiang等人(1998)Diabetologia.41：1321；Pfeiffer等人(1997)Horm Metab Res.29：111)。
如本文中所用之亦稱為神經損傷-糖尿病之術語"神經病"係指神經由於高血糖症(高血糖含量)而受損傷之糖尿病之常見併發症。已確認多種糖尿病性神經病，諸如末端多發性感覺運動神經病、局灶性運動神經病及自主神經病。
如本文中所用之亦稱為周圍神經炎及糖尿病性神經病之術語"周圍神經病"係指神經不能夠傳送往返於腦與脊髓之資訊。周圍神經病產生諸如疼痛、喪失知覺及不能控制肌肉之症狀。在某些情況下，神經不能夠控制血管、腸道功能及其他器官導致異常血壓、消化及喪失其他基本非自主過程。周圍神經病可涉及損害單一神經或神經群(單神經病)或可影響若干神經(多發性神經病)。
影響交感神經及副交感神經之小有髓鞘纖維及無髓鞘纖維之神 經病稱為"周圍神經病"。此外，亦稱為周圍神經炎及糖尿病性神經病之周圍神經病之相關病症係指神經不能夠傳送往返於腦與脊髓之資訊。此情形產生諸如疼痛、喪失知覺及不能控制肌肉之症狀。在某些情況下，神經不能夠控制血管、腸道功能及其他器官導致異常血壓、消化及喪失其他基本非自主過程。周圍神經病可涉及損害單一神經或神經群(單神經病)或可影響若干神經(多發性神經病)。
術語"糖尿病性神經病"係指神經由於高血糖症(高血糖含量)而受損傷之糖尿病之常見併發症。糖尿病性神經病亦稱為神經病及神經損傷-糖尿病。已確認多種糖尿病性神經病，諸如末端多發性感覺運動神經病、局灶性運動神經病及自主神經病。
b.糖尿病性視網膜病
腫瘤壞死因子已涉及糖尿病性視網膜病之病理生理學(Scholz等人(2003)Trends Microbiol.11：171)。如本文中所用之術語"糖尿病性視網膜病"係指由長期糖尿病引起之眼視網膜之進行性破壞。糖尿病性視網膜病包括增殖性視網膜病變。增殖性神經病又包括新血管生成、視網膜出血及視網膜脫離。
在晚期視網膜病中，小血管在視網膜表面上增殖。該等血管較脆弱、易於出血且可導致視網膜出血。出血可遮蔽視力，且當透過之血經再吸收時，形成傾向於導致視網膜剝離及喪失視力之纖維組織。另外，糖尿病性視網膜病包括增殖性視網膜病，其包括新血管生成、視網膜出血及視網膜脫離。糖尿病性視網膜病亦包括涉及視網膜諸層所發生之變化的"背景性視網膜病"。
c.糖尿病潰瘍及視網膜病潰瘍
腫瘤壞死因子已涉及糖尿病潰瘍之病理生理學(參見Lee等人(2003)Hum Immunol.64：614；Navarro等人(2003)Am J Kidney Dis.42：53；Daimon等人(2003)Diabetes Care.26：2015；Zhang等人(1999)J Tongji Med Univ.19：203；Barbieri等人(2003)Am J Hypertens.16：537；Venn等人(1993)Arthritis Rheum.36：819；Westacott等人(1994)J Rheumatol.21：1710)。
如本文中所用之術語"糖尿病潰瘍"係指作為糖尿病之併發症所導致之潰瘍。潰瘍係皮膚或黏膜上之由發炎性、傳染性、惡性病狀或代謝障礙引起之凹坑狀病變。通常，糖尿病潰瘍可見於四肢及手足，更通常足部。由諸如神經病及血管機能不全之糖尿病病狀引起之該等潰瘍可導致局部缺血及創傷癒合不良。更大範圍的潰瘍可進行至骨髓炎。一旦顯現骨髓炎，單獨使用抗生素可能難以根除且可能需要截肢。
如本文中所用之術語"視網膜病潰瘍"係指導致或引起眼及眼視網膜損傷之潰瘍。視網膜病潰瘍可包括諸如視網膜出血之病狀。
d.糖尿病性大血管病變
腫瘤壞死因子已涉及糖尿病性大血管病變之病理生理學(Devaraj等人(2000)Circulation.102：191；Hattori等人(2000)Cardiovasc Res.46：188；Clausell等人(1999)Cardiovasc Pathol.8：145)。如本文中所用之亦稱為"大血管疾病"之"糖尿病性大血管病變"係指由糖尿病引起之血管疾病。當例如脂肪及血塊在較大血管中積聚且黏著於管壁時，出現糖尿病性大血管病變併發症。糖尿病性大血管病變包括諸如冠心病、腦血管疾病及周邊血管疾病、高血糖症及心血管疾病及中風之疾病。
2.肥胖症
腫瘤壞死因子已涉及肥胖症之病理生理學(參見例如Pihlajamaki J等人(2003)Obes Res.11：912；Barbieri等人(2003)Am J Hypertens.16：537；Tsuda等人(2003)J Nutr.133：2125)。如本文中所用之術語"肥胖症"係指相對於瘦體重而言受檢者具有過量體脂肪之病狀。在一實施例中，肥胖症係指個體體重超過對於其身高所合意之最大值至少約 20%或更多之病狀。當一個成年人超重超過100磅時，則將其視為"病態肥胖"。在另一實施例中，肥胖症定義為超過30 kg/m2之BMI(體重指數)。由於糖尿病、中風、冠狀動脈病、高血壓、高膽固醇及腎臟及膽囊病症，肥胖症增加個人之疾病及死亡之風險。肥胖症亦可增加某些類型癌症之風險，且可能為顯現骨關節炎及睡眠呼吸暫停症之風險因素。
K.貧血
TNFα已涉及多種貧血之病理生理學(參見例如Jongen-Lavrencic等人(1997)J.Rheumatol.24：1504；Demeter等人(2002)Ann Hematol.81：566；DiCato(2003)The Oncologist 8(增刊1)：19)。本發明提供抑制罹患貧血之受檢者之TNFα活性的方法，該方法包含向受檢者投與抗體、抗體部分，以便抑制罹患貧血之受檢者之TNFα活性。在一實施例中，貧血與類風濕性關節炎相關。
如本文中所用之術語"貧血"係指在血液中異常低數量之循環紅血球或降低濃度之血色素。與類風濕性關節炎有關之貧血之實例包括(例如)慢性病之貧血、缺鐵性貧血及自身免疫性溶血性貧血。在一實施例中，本發明提供治療相關性貧血之方法，該等貧血為例如與類風濕性關節炎有關之貧血、感染及慢性發炎疾病之貧血、缺鐵性貧血、自身免疫性溶血性貧血、骨髓病性貧血、再生障礙性貧血、再生不良性貧血、純紅細胞再生障礙性貧血及與腎衰竭或內分泌病症相關之貧血、巨成紅細胞性貧血、亞鐵原卟啉或血球蛋白合成中之缺陷、由紅血球中之結構缺陷引起之貧血(例如鐮形細胞性貧血)及未明原因之貧血(諸如鐵粒細胞性貧血)、與諸如瘧疾、錐蟲病、HIV、肝炎病毒或其他病毒之慢性感染相關之貧血及由骨髓缺乏引起之骨髓病性貧血。
用以研究貧血之動物模型之實例包括以肽聚糖-多醣聚合物接種之大鼠(參見Coccia等人(2001)Exp Hematology.29：1201-1209)。用以研 究疼痛之動物模型之實例在此項技術中熟知，且包括大鼠坐骨神經結紮模型及大鼠節段性脊神經結紮模型(參見Bennett及Zie,(1988)Pain.33：87-107；Kim及Chung,(1992)Pain 50：355-363)。
L.疼痛
TNFα已涉及多種疼痛徵候群之病理生理學(參見例如Sorkin等人(1997)Neuroscience.81：255；Huygen等人(2002)Mediators Inflamm.11：47；Parada等人(2003)Eur J Neurosci.17：1847)。如本文中所用之術語"疼痛"係指所有類型之疼痛。該術語係指急性及慢性疼痛，諸如神經痛及手術後疼痛、慢性下背疼痛、叢集性頭痛、疱疹神經痛、幻肢痛、中樞性疼痛、牙齒疼痛、類鴉片抵抗性疼痛、內臟疼痛、手術疼痛、骨損傷疼痛、勞動及搬運期間之疼痛、由包括曬傷之燒傷引起之疼痛、產後疼痛、偏頭痛、心絞痛及包括膀胱炎之泌尿生殖道相關之疼痛。該術語亦包括傷害感受性疼痛或傷害感受。
本發明提供抑制罹患該疼痛病症之受檢者之TNFα活性的方法，該方法包含向受檢者投與抗體、抗體部分，以便抑制罹患疼痛之受檢者之TNFα活性。疼痛已以多種方式定義，包括傷害感受性疼痛及神經痛。疼痛之最通常經歷形式可定義為刺激物對神經末梢之效應，其導致脈衝傳輸至大腦。疼痛亦通常與包括例如類風濕性關節炎之發炎性病症相關。在一實施例中，本發明抗體用以治療罹患與類風濕性關節炎相關之疼痛的受檢者。以下進一步討論TNFα活性起有害作用之疼痛病症之實例。
1.神經痛
腫瘤壞死因子已涉及神經痛之病理生理學(參見Sommer(1999)Schmerz.13：315；Empl等人(2001)Neurology.56：1371；Schafers等人(2003)J Neurosci.23：3028)。如本文中所用之術語"神經痛"係指由對於神經、脊髓或大腦之損傷引起且通常涉及神經過敏性之疼痛。神經痛 之實例包括慢性下背疼痛、與關節炎相關之疼痛、癌症相關疼痛、疱疹神經痛、幻肢痛、中樞性疼痛、類鴉片抵抗性神經痛、骨損傷疼痛及在勞動及搬運期間之疼痛。神經痛之其他實例包括手術後疼痛、叢集性頭痛、牙齒疼痛、手術疼痛、由重度(例如三度)燒傷引起之疼痛、產後疼痛、心絞痛、泌尿生殖道相關之疼痛，且包括膀胱炎。
神經痛不同於傷害感受性疼痛。涉及傷害感受性機制之疼痛通常在持續期間方面限於組織修復時期且通常由使用止痛劑或類鴉片而減輕(Myers(1995)Regional Anesthesia 20：173)。神經痛通常持久或呈慢性且通常繼初始急性組織損傷之後顯現數天或數月。神經痛可涉及持續性、自發性疼痛以及作為對於通常並不致痛之刺激物之疼痛反應的異常疼痛。神經痛亦可以痛覺過敏為特徵，其中存在對於通常輕微的致痛刺激物(諸如針刺)之強化反應。不同於傷害感受性疼痛，神經痛通常對類鴉片療法具有抗性(Myers前述，1995)。因此，使用本發明方法獲得之抗體可用於治療神經痛。
2.傷害感受性疼痛
如本文中所用之術語"傷害感受性疼痛"係指橫越完整神經元途徑傳輸之疼痛，亦即由對身體之損傷引起之疼痛。傷害感受性疼痛包括疼痛之軀體感覺及正常功能，且向受檢者通知即將發生之組織損傷。存在用於保護受檢者之傷害感受性途徑，例如響應於燒傷所經歷之疼痛。傷害感受性疼痛包括骨骼疼痛、內臟疼痛及與軟組織相關之疼痛。
腫瘤壞死因子已涉及內臟疼痛之病理生理學(參見Coelho等人(2000)Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.279：G781；Coelho等人(2000)Brain Res Bull.52：223)。內臟疼痛用以指由A-△及C神經纖維上之受體所介導之傷害感受性疼痛。A-△及C-神經纖維係位於皮膚、骨骼、結締組織、肌肉及內臟中。內臟疼痛在分佈範圍方面可為不明確的，在性質上具痙攣性且通常在性質上描述為深位、疼痛、壓迫及絞 痛。內臟疼痛之實例包括與心臟病發作相關之疼痛，其中可在臂、頸部及/或背部中感受到內臟疼痛；及肝包膜疼痛，其中可在背部及/或右肩部中感受到內臟疼痛。因此，使用本發明獲得之抗體可用於治療內臟疼痛。
M.肝病症
TNFα已涉及多種肝病症之病理生理學(參見例如Colletti等人(1990)J Clin Invest.85：1936；Tiegs(1997)Acta Gastroenterol Belg.60：176；Fernandez等人(2000)J Endotoxin Res.6：321)。本發明提供抑制罹患該肝病症之受檢者之TNFα活性的方法。
如本文中所用，術語"TNFα活性起有害作用之肝病症"意欲包括患有病症之受檢者體內存在之TNFα已證明為或懷疑為病症之病理生理學之起因或造成病症惡化之因素的肝臟疾病及其他病症或與肝細胞損傷相關之病狀或膽道病症。因此，TNFα活性起有害作用之肝病症係預期TNFα活性之抑制會減輕肝病症之症狀及/或病程的病症。在一實施例中，肝病症係指不包括肝炎、酒精性肝炎及病毒性肝炎之人類肝臟疾病或與肝細胞損傷相關之病狀或膽道病症。
用於評估使用多變劑量方法治療肝病症之藥劑之治療效能的動物模型之實例包括黑猩猩C型肝炎病毒模型(參見Shimizu等人(1990)Proc Natl Acad Sci.USA 87：6441)。用以研究皮膚及指甲病症之動物模型之實例包括(例如)重度聯合免疫缺陷(SCID)小鼠模型(牛皮癬)及史密斯(Smith)品系(SL)雞及脫色小鼠(白斑症)(參見Nickoloff(2000)Investig Dermatol Symp Proc.5：67；Austin等人(1995)Am J Pathol.146：1529；Lerner等人(1986)J Invest Dermatol.87：299)。
肝病症包括肝臟不當地起作用或停止起作用之許多疾病及病症。肝細胞損傷可包括酒精性肝硬變、α1抗胰蛋白酶缺乏、自體免疫硬化、隱原性硬化、暴發型肝炎、B型及C型肝炎及脂肪變性肝炎。膽 道病症之實例包括囊腫性纖維化、原發性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎及膽道阻塞(Wiesner(1996)"Current Indications,Contra Indications and Timing for Liver Transplantation"於Transplantation of the Liver,Saunders(出版)中；Busuttil及Klintmalm(編)第6章；Klein(1998)Partial Hypertension：The Role of Liver Transplantation,Musby(出版)在Current Surgical Therapy 6.sup.th Ed.Cameron,J.(編)。
術語"肝炎"係指肝臟發炎。肝炎可由包括細菌、病毒(A型、B型、C型肝炎等)或寄生蟲之各種生物體之感染造成。諸如酒精、藥物或毒蕈之化學毒素亦可損傷肝臟且導致其變得發炎。肝炎之罕有但極其危險的病因由過量乙醯胺苯酚(撲熱息痛(Tylenol))引起，其可致命。另外，體內之免疫細胞可攻擊肝臟且導致自體免疫性肝炎。肝炎可迅速消除(急性肝炎)，或導致長期疾病(慢性肝炎)。在某些情況下，可產生進行性肝臟損傷或肝功能衰竭。肝炎之發病率及嚴重程度視包括肝臟損傷之原因及患者體內之任何潛在疾病之許多因素而變化。
在一實施例中，本發明提供治療TNFα活性起有害作用之肝病症之方法，其包含向受檢者投與有效量之誘發劑量及隨後治療劑量之TNFα抑制劑，以便治療該病症。在一實施例中，肝病症係選自由C型肝炎病毒、自體免疫性肝炎、脂肪肝疾病、B型肝炎病毒、肝中毒及包括非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)之非酒精性肝炎組成之群。以下進一步描述肝病症之實例。
1.C型肝炎病毒(HCV)
腫瘤壞死因子已涉及C型肝炎病毒之病理生理學(參見Gonzalez-Amaro.(1994)J Exp Med.179：841；Nelson等人(1997)Dig Dis Sci 42：2487；Kallinowski等人(1998)Clin Exp Immunol.111：269)。術語"C型肝炎病毒"或"HCV"用以描述作為非A、非B型肝炎之病原體的肝炎病毒。C型肝炎病毒導致肝臟發炎。HCV感染導致C型肝炎。急性期 之C型肝炎通常比B型肝炎輕，但較大比例之該等感染變成慢性。HCV係急性肝炎及包括硬化及肝癌之慢性肝病之主要病因。HCV係共同說明病毒性肝炎病例之絕大多數的病毒(A、B、C、D及E)之一者。其係似乎具有窄寄主範圍之黃病毒科家族中之包膜RNA病毒。該病毒之重要特徵係其基因組之相對易變性，其又可能與誘發慢性感染之高傾向(80%)有關。HCV叢集為若干不同的基因型，其可能在測定疾病之嚴重程度及治療反應中很重要。在一實施例中，本發明提供治療HCV之多變劑量方法。
2.自體免疫性肝炎(AIH)
腫瘤壞死因子已涉及自體免疫性肝炎之病理生理學(參見Cookson等人(1999)Hepatology 30：851；Jazrawi等人(2003)Liver Transpl.9：377)。如本文中所用，"自體免疫性肝炎"係指以由將肝臟正常細胞誤認為外來組織或病原體(導致疾病之作用物)之劣性免疫細胞引起之肝臟發炎為特徵的肝病症。自體免疫性肝炎通常造成肝實質之進行性破壞，且若保留未經治療，則具有高死亡率。(Johnson等人(1993)Hepatology,18：998)。自體免疫性肝炎之一特徵係在幾乎90%之患者血清中存在循環自體抗體。該等抗體可用於鑑定患有自體免疫性肝炎之受檢者。
患者之間的臨床及血清學差異使AIH分為兩種類型。1型之特徵在於在患者血清中存在抗平滑肌(SMA)及/或抗細胞核抗體(ANA)，而第II型患者之血清展示1型抗肝臟腎臟微粒體抗體(LKM1)(Homberg等人(1987)Hepatology,7：1333；Maggiore等人(1993)J.Pediatr.Gastroenterol Nutr.17：376)。已在30%之患有II型AIH之患者中鑑定出血清學標記抗肝臟胞液I型抗體(LC1)。另外，已證明LC1為10%之所測試患者中之唯一血清學標記(Martini等人(1988)Hepatology,8：1662)。在一實施例中，本發明方法用以治療AIH。
3.脂肪肝疾病
腫瘤壞死因子已涉及脂肪肝疾病之病理生理學(參見Valenti等人(2002)Gastroenerology 122：274；Li等人(2003)Hepatology 37：343)。脂肪肝疾病係指脂肪(肝細胞)過度地積聚於肝臟中之疾病。咸信脂肪肝疾病係由營養過多、酒精攝入過多、糖尿病及歸因於投與藥物之副效應造成。脂肪肝疾病可導致諸如慢性肝炎及肝硬化之重度疾病。在患有脂肪肝疾病之患者中，脂質、尤其中性脂肪積聚於肝細胞中至該量超過生理學容許範圍之程度。自生物化學觀點而言，判斷脂肪肝之標準係中性脂肪之重量為肝組織之濕重之約10%(100 mg/g濕重)或更多。在一實施例中，本發明方法用以治療脂肪肝疾病。
4.B型肝炎病毒(HBV)
腫瘤壞死因子已涉及B型肝炎病毒之病理生理學(參見Kasahara等人(2003)J Virol.77：2469；Wang(2003)World J Gastroenterol.9：641；Biermer等人(2003)J Virol.77：4033)。術語"B型肝炎病毒"(HBV)用以描述產生人類之B型病毒性肝炎之病毒(血清肝炎病毒)。此係與具有短潛伏期之A型肝炎病毒(傳染性肝炎病毒)對比具有長潛伏期(約50至160天)之病毒性疾病。B型肝炎病毒通常由注射受感染之血液或血液衍生物或僅藉由使用受污染之針、柳葉刀或其他器具而傳播。臨床上及病理上，該疾病與A型病毒性肝炎相似；然而，不存在交叉保護性免疫。病毒抗原(HBAg)見於感染後之血清中。
B型肝炎病毒以極高比率感染人類。感染B型肝炎之大多數人在6個月內排除該病毒，其中短期感染稱為B型肝炎之"急性"病案。據估計至少約300百萬人係HBV之慢性帶菌者。感染該病毒導致包括次要流感狀症狀至死亡之一系列臨床症狀。在一實施例中，本發明多變劑量方法用以治療HBV感染。
5.肝中毒
腫瘤壞死因子已涉及肝中毒之病理生理學(參見Bruccoleri等人(1997)Hepatology 25：133；Luster等人(2000)Ann NY Acad Sci.919：214；Simeonova等人(2001)Toxicol Appl Pharmacol.177：112)。術語肝中毒係指由藥物及其他化學物或毒品引起之肝臟損傷。鑑定受檢者之肝中毒之最佳指示物係在血液中之某些升高之酶量測值，諸如AST(天冬胺酸轉胺酶)、ALT(丙胺酸轉胺酶)及GOT(麩胺酸鹽草乙酸鹽轉胺酶)。
肝中毒可導致永久性損傷及死亡。肝中毒之最初症狀可包括急性消化系統症狀，例如重度腹瀉。肝中毒之第二階段以症狀減輕為特徵。在此表觀消退期間，出現肝損傷之生物化學跡象。在第二階段期間，常見少尿症(尿排出量減少)。第三階段(明顯肝損傷之階段)在攝入化學物之後3至5天變得臨床上明顯，且出現黃疸。亦可出現腎衰竭。以化學方式誘發(藥物誘發)之肝炎之症狀與傳染性肝炎之症狀相似。在一實施例中，本發明方法用以治療肝中毒。
6.肝功能衰竭(例如慢性肝功能衰竭)
腫瘤壞死因子已涉及肝功能衰竭(慢性肝功能衰竭)之病理生理學(參見Takenaka等人(1998)Dig Dis Sci.43：887；Nagaki等人(1999)J Hepatol.31：997；Streetz等人(2000)Gastroenterology.119：446)。包括慢性肝功能衰竭之肝功能衰竭通常經數年時間顯現且由緩慢損傷器官之對肝臟之反覆損害(諸如酗酒或感染肝炎病毒)造成。較少見地，肝功能衰竭係急性的，且經數天或數周時間出現。急性肝功能衰竭之病因包括肝炎病毒感染、藥物、妊娠、自體免疫疾病及至肝臟之血流量突然降低。在一實施例中，本發明方法用以治療肝功能衰竭。
7.包括NASH之非酒精性肝炎
腫瘤壞死因子已涉及包括非酒精性脂肪變性肝炎之非酒精性肝炎之病理生理學(參見Crespo等人(2001)Hepatology.34：1158；Pessayre 等人(2002)282(2)：G193)。術語"非酒精性脂肪變性肝炎"或"NASH"係指可與由過度酒精攝入所誘發之彼等變化相比較，但在不存在酗酒的情況下所顯現之肝臟中之組織學變化。NASH之特徵在於大泡性及/或小泡性脂肪變性、小葉性及門脈性發炎及偶爾馬洛裏小體具有纖維化及硬化。NASH亦通常與高脂質血症、肥胖症及II型糖尿病相關。
表徵肝脂質沉著症及發炎之其他臨床狀態包括過度禁食、空腸與迴腸繞道術、全靜脈營養療法、C型慢性肝炎、威爾森氏症(Wilson's disease)及諸如來自皮質類固醇、鈣離子通道阻斷劑、大劑量合成雌激素、甲胺喋呤及胺碘酮之彼等藥效的不利藥效。因此，術語"非酒精性脂肪變性肝炎"可用於描述在不存在以下情形的情況下展現此等活組織檢查觀測結果之彼等患者：(a)相當多之酒精消費、(b)先前減輕重量之手術、(c)與脂肪變性肝炎相關之藥物使用史、(d)遺傳性肝臟疾病之跡象或e)C型慢性肝炎感染(參見例如Ludwig等人(1980)Mayo Clin.Proc.55：434；Powell等人(1990)Hepatol.11：74)。在一實施例中，使用本發明方法獲得之抗體用以治療NASH。
N.皮膚及指甲病症
腫瘤壞死因子已涉及皮膚及指甲病症之病理生理學。在一實施例中，投與本發明方法獲得之抗體以治療皮膚及指甲病症。如本文中可互換使用之術語"皮膚病症"或"皮膚病"係指已誘發發炎狀態之除損傷創口以外的皮膚異常。在一實施例中，本發明之皮膚病症係發炎性皮膚病症，其中皮膚以毛細管擴張、白血球浸潤、紅腫、發熱及/或疼痛為特徵。皮膚病之實例包括(但不限於)牛皮癬、尋常天疱瘡、硬皮病、異位性皮膚炎、肉狀瘤病、結節性紅斑、化膿性汗腺炎、扁平苔癬、史維特徵候群(Sweet's syndrome)及白斑症。如本文中所用，術語"TNFα活性起有害作用之皮膚及指甲病症"意欲包括患有病症之受檢者體內存在之TNFα已證明為或懷疑為病症之病理生理學之起因或造成病症 惡化之因素的皮膚及/或指甲病症及其他病症，例如牛皮癬。因此，TNFα活性起有害作用之皮膚及指甲病症係預期TNFα活性之抑制會減輕病症之症狀及/或病程的病症。以下進一步討論本發明之抗體、抗體部分及其他TNFα抑制劑用於治療特定皮膚及指甲病症的用途。在某些實施例中，如下所述，本發明之治療方法係與另一治療劑組合執行。在一實施例中，使用包含投與與另一治療劑組合之TNFα抗體之本發明方法獲得的抗體用於治療牛皮癬及治療與關節炎相關之牛皮癬。
1.牛皮癬
腫瘤壞死因子已涉及牛皮癬之病理生理學(Takematsu等人(1989)Arch Dermatol Res.281：398；Victor及Gottlieb(2002)J Drugs Dermatol.1：264)。如本文中所用，術語"牛皮癬"係指與表皮增生相關之皮膚病。牛皮癬之實例包括(但不限於)慢性斑塊牛皮癬、滴狀牛皮癬、逆反型牛皮癬、膿皰性牛皮癬、尋常性牛皮癬及紅皮症型牛皮癬。牛皮癬亦可與包括發炎性腸疾病(IBD)及類風濕性關節炎(RA)之其他發炎性病症相關。
牛皮癬係描述為以頻繁急性發作之紅腫、發癢及皮膚上之較厚乾燥銀色鱗屑為特徵之皮膚發炎(刺激及紅腫)。詳言之，所形成之病變涉及表皮增殖之主要及次要變化、皮膚之發炎性反應及諸如淋巴激素及發炎因子之調節分子的表現。牛皮癬性皮膚之形態特徵為表皮細胞之轉換增加、表皮稠化、異常角質化、發炎細胞浸潤至表皮中及多形核白血球及淋巴細胞浸潤至表皮層中，導致基底細胞循環增加。牛皮癬通常涉及指甲，其常常展現凹痕、指甲分離、變厚及變色。牛皮癬通常與例如關節炎(包括類風濕性關節炎)、發炎性腸疾病(IBD)及克羅恩氏病之其他發炎性病症相關。約三分之一之患有牛皮癬之受檢者亦患有牛皮癬性關節炎(PsA)，如上所述，其導致關節僵直、腫脹、疼痛及活動範圍減小(Greaves等人(1995)N.Eng.J.Med.332：581)。
牛皮癬之跡象最常見於軀幹、肘、膝、頭皮、皮膚褶襞或手指甲上，但其可影響皮膚之任何或所有部分。通常，新皮膚細胞自底層向上移動至表面耗費約一個月。在牛皮癬中，此過程僅耗費幾天，導致死皮膚細胞積聚及厚鱗屑形成。牛皮癬之症狀包括：覆蓋有銀色鱗屑之乾燥或紅腫之皮膚斑塊、伴有紅色邊緣之隆起皮膚斑塊，其可破裂且變得致痛，且通常位於肘、膝、軀幹、頭皮及手上；包括膿皰、皮膚破裂及皮膚紅腫之皮膚損害；可能與例如牛皮癬性關節炎之關節炎相關之關節疼痛或隱痛。
牛皮癬之治療通常包括局部皮質類固醇、維生素D類似物及局部或經口類視色素或其組合。在一實施例中，本發明TNFα抗體係與所存在之此等常見療法之一者組合施用。以下更詳細描述可與使用本發明方法獲得之TNFα抗體組合用於治療牛皮癬之其他治療劑。
牛皮癬之診斷通常基於皮膚之外觀。另外，可能需要皮膚活體組織檢查或刮除及培養皮膚斑塊以排除其他皮膚病症。若存在持續性關節疼痛，則可使用X射線以核驗牛皮癬性關節炎。
受檢者之牛皮癬之改善可由受檢者之牛皮癬區域及嚴重度指數量表(PASI)來監控。測定PASI之方法已描述於Fredriksson及Pettersson(1978)Dermatologica 157：238及Marks等人(1989)Arch Dermatol 125：235中。簡言之，該指標係基於使用5點量表(0=無症狀；1=輕微；2=中度；3=顯著；4=極顯著)來評估包括頭部、上肢、軀幹及下肢之四種解剖部位的紅斑、硬化及剝落。基於給定解剖部位中病變之程度，染病區域指定一數值(0=0；1=<10%；2=10-29%；3=30-49%；4=50-69%；5=70=89%；6=90-100%)。隨後計算PASI分數，其中PASI分數之可能範圍係0.0至72.0，且最高分數表示最嚴重程度之完全紅皮病。
在本發明之一個實施例中，TNFα抗體係用於治療牛皮癬，包括慢性斑塊牛皮癬、滴狀牛皮癬、逆反型牛皮癬、膿皰性牛皮癬、尋常天 疱瘡、紅皮症型牛皮癬、與發炎性腸疾病(IBD)相關之牛皮癬及與類風濕性關節炎(RA)相關之牛皮癬。在另一實施例中，諸如阿達木單抗之TNFα抗體係用以治療患有合併有PsA之牛皮癬的受檢者。以下詳細描述包括於本發明之治療方法中之特定類型牛皮癬：
a.慢性斑塊牛皮癬
腫瘤壞死因子業經暗指與慢性斑塊牛皮癬之病理生理學有關(Asadullah等人(1999)Br J Dermatol.141：94)。慢性斑塊牛皮癬(亦稱為尋常性牛皮癬)係最常見形式之牛皮癬。慢性斑塊牛皮癬之特徵在於硬幣尺寸至更大尺寸之範圍內之隆起變紅皮膚斑塊。在慢性斑塊牛皮癬中，斑塊可為單個或若干個，其大小可自幾毫米至若干公分不同。斑塊通常呈紅色，具有鱗狀表面，且當輕微刮擦時反光，產生"銀色"效應。慢性斑塊牛皮癬之病變(其通常具對稱性)會遍及整個身體出現，但偏向於包括膝、肘、腰骶區域、頭皮及指甲之伸肌表面。慢性斑塊牛皮癬偶爾可出現於陰莖、外陰及折褶上，但通常不會有鱗狀。診斷患有慢性斑塊牛皮癬之患者通常係以上述之臨床特徵為基礎。詳言之，慢性斑塊牛皮癬中病變之分佈範圍、顏色及典型銀色鱗屑為慢性斑塊牛皮癬之特徵。
b.滴狀牛皮癬
滴狀牛皮癬係指具有獨有的滴水形鱗狀斑塊之牛皮癬形式。滴狀牛皮癬之爆發通常繼感染之後，最顯著為鏈球菌性咽喉感染。滴狀牛皮癬之診斷通常基於皮膚外觀，及通常存在近期咽喉痛病史的事實。
c.逆反型牛皮癬
逆反型牛皮癬係患者具有不同於與斑塊牛皮癬相關之起鱗的光滑、通常濕潤之紅色且發炎皮膚區域的牛皮癬形式。逆反型牛皮癬亦稱為對磨部位牛皮癬或曲側型牛皮癬。逆反型牛皮癬主要出現於腋窩、腹股溝中、乳房下及生殖器及腚部附近之其他皮膚褶襞中，且由 於呈現位置，因此摩擦及出汗可刺激染病區域。
d.膿皰性牛皮癬
亦稱為手掌腳底牛皮癬之膿皰性牛皮癬係導致大小及位置不同，但通常出現於手及腳上之填有膿液之水皰的牛皮癬形式。水皰可能局部化，或遍佈身體之較大區域。膿皰性牛皮癬可敏感且致痛，可導致發熱。
e.其他牛皮癬病症
可以使用本發明方法獲得之TNFα抗體治療之牛皮癬性病症的其他實例包括紅皮症型牛皮癬、尋常牛皮癬、與IBD相關之牛皮癬及與包括類風濕性關節炎之關節炎相關之牛皮癬。
2.尋常天疱瘡
尋常天疱瘡係通常影響口黏膜及皮膚之嚴重性自體免疫全身性皮膚疾病。據信尋常天疱瘡之發病機制為針對皮膚及口黏膜橋粒之自體免疫過程。相應地，細胞並不彼此黏附。病症表現為填有流體、易於破裂且具有獨特的組織學外觀之較大皰。消炎劑係用於此具有高死亡率之疾病之唯一有效療法。出現在罹患尋常天疱瘡之患者中之併發症係難治性疼痛、干擾營養作用及體液喪失，及感染。
3.異位性皮膚炎/濕疹
異位性皮膚炎(亦稱為濕疹)係以鱗狀及發癢斑塊歸類之慢性皮膚病症。患有濕疹之人通常具有如哮喘、花粉病或濕疹之過敏性病狀之家族史。異位性皮膚炎係出現於皮膚中、導致慢性發炎之過敏性反應(類似於過敏症)。發炎導致皮膚變得發癢及鱗狀。長期刺激及刮擦可導致皮膚變厚且變得具有皮革質地。如皮膚乾燥、接觸水、溫度改變及應激反應可使症狀惡化一般，接觸環境刺激物亦可使症狀惡化。
患有異位性皮膚炎之受檢者可藉由某些症狀鑑定，該等症狀通常包括強烈發癢、具有分泌物且結殼之水皰、水皰附近皮膚紅腫或發炎、 皮疹、乾燥、革質皮膚區域、由刮擦所致之粗糙皮膚區域及耳朵泄出物/出血。
4.肉狀瘤病
肉狀瘤病係在淋巴結、肺、肝臟、眼、皮膚及/或其他組織中出現肉芽腫發炎之疾病。肉狀瘤病包括皮膚肉狀瘤病(皮膚之肉狀瘤病)及結節性肉狀瘤病(淋巴結之肉狀瘤病)。患有肉狀瘤病之患者可藉由通常包括全身性不適、不舒適或惡感；發熱；皮膚病變之症狀鑑定。
5.結節性紅斑
結節性紅斑係指以通常在下部前腿上之皮膚下觸痛、紅腫節結為特徵之發炎性病症。與結節性紅斑相關之病變通常開始為平坦、但堅硬、灼熱紅腫致痛之結塊(約一吋寬)。數日內，病變可變得略帶紫色，且隨後經數星期消退為帶褐色的平坦斑塊。
在某些情況下，結節性紅斑可能與包括以下各感染之感染相關：鏈球菌、球孢子菌病、結核病、B型肝炎、梅毒、貓抓病、兔熱病、耶爾森氏菌屬、鉤端螺旋體病鸚鵡熱、組織胞漿菌病、單核細胞增多症(EBV)。在其他情況下，結節性紅斑可能與對於包括以下各藥物之某些藥物之敏感相關：口服避孕藥丸、青黴素、磺醯胺、碸類、巴比妥鹽、尿囊素、非那西丁(phenacetin)、水楊酸鹽、碘化物及孕酮。結節性紅斑通常與包括以下各病症之其他病症相關：白血病、肉狀瘤病、風濕熱及潰瘍性結腸炎。
結節性紅斑之症狀通常自我呈現於脛上，但病變亦可出現在包括腚部、小腿、踝、大腿及上肢之其他身體區域上。患有結節性紅斑之受檢者之其他症狀可包括發熱及不適感。
6.化膿性汗腺炎
化膿性汗腺炎係指腫脹、致痛、發炎病變或結塊顯現在腹股溝中且有時在臂及乳房下之皮膚病症。當頂分泌腺出口變得被汗阻塞或由 於腺體發育不完全而不能正常地排乾時，出現化膿性汗腺炎。陷入腺體中之分泌物迫使所排汁及細菌進入周圍組織內，導致皮下硬化、發炎及感染。化膿性汗腺炎限於含有頂分泌腺之身體區域。此等區域係腋下、乳頭暈、腹股溝、會陰、圍肛及臍周區域。
7.扁平苔癬
腫瘤壞死因子已涉及扁平苔癬之病理生理學(Sklavounou等人(2000)J Oral Pathol Med.29：370)。扁平苔癬係指導致發炎、發癢及特殊皮膚損害之皮膚及黏膜病症。扁平苔癬可能與C型肝炎或某些藥物相關。
8.史維特徵候群
包括腫瘤壞死因子之發炎性細胞因子已涉及史維特徵候群之病理生理學(Reuss-Borst等人(1993)Br J Haematol.84：356)。由R.D.Sweet在1964年描述之斯威特症候群之特徵在於熱病突然發作、白血球增多及皮膚出疹。皮疹由觸痛、紅斑狀、定界清晰之丘疹及斑塊組成，其在顯微鏡下展示密集的嗜中性浸潤物。病變可出現在任何地方，但偏向於包括面部之上身。個別病變通常描述為似囊泡狀或似膿皰狀，但可能完全呈膿皰狀、大皰狀或潰瘍性。在患有史維特徵候群之患者中，亦常常報導涉及口腔及眼睛(結膜炎或鞏膜表層炎)。白血病亦與史維特徵候群相關。
9.白斑症
白斑症係指皮膚區域之色素有所損失，導致正常皮膚結構具有不規則的白斑斑的皮膚病狀。白斑症特有之病變表現為平坦褪色區域。病變之邊緣界定明晰但不規則。在患有白斑症之受檢者中常常染病之區域包括面部、肘及膝、手及腳、及生殖器。
10.硬皮病
腫瘤壞死因子已涉及硬皮病之病理生理學(Tutuncu等人(2002) Clin Exp Rheumatol.20(6增刊28)：S146；Mackiewicz等人(2003)Clin Exp Rheumatol.21：41；Murota等人(2003)Arthritis Rheum.48：1117)。硬皮病係指以皮膚、血管、骨骼肌及內臟之變化為特徵之擴散性結締組織病。硬皮病亦稱為CREST徵候群或進行性全身性硬化，且通常影響介於30歲-50歲之間之人。染病女性通常多於男性。
硬皮病之病因未知。疾病可產生局部或全身性症狀。疾病之過程及嚴重程度在染病者中有較大不同。皮膚及其他器官中之過多膠原沈積物產生症狀。亦出現對於皮膚及染病器官內之小血管之損害。在皮膚中，可出現潰瘍、鈣化及色素沉著之變化。全身性特徵可包括心臟、肺、腎臟及胃腸道之纖維化及退化。
罹患硬皮病之患者展現某些臨床特徵，包括響應於熱及冷之手指及腳趾發白、發藍或紅腫(裏諾氏現象(Raynaud's phenomenon))；手指及關節之疼痛、僵直及腫脹；皮膚變厚及手及前臂有光澤；食管逆流或胃灼熱；吞咽困難；及呼吸急促。用以診斷硬皮病之其他臨床症狀包括升高之紅血球沈降速率(ESR)、升高之類風濕因子(RF)、陽性抗核抗體測試、展示蛋白質及微觀血液之尿分析、可展示纖維化之胸部X射線及展示限制性肺疾病之肺功能研究。
11.指甲病症
指甲病症包括任何指甲異常。如本文中所用之術語"指甲病症"或"指甲疾病"係指手指甲或腳趾甲具異常顏色、形狀、質地或厚度之病狀。特定指甲病症包括(但不限於)凹痕、凹甲、博氏線(Beau's lines)、反甲、甲松離、黃甲、翼狀胬肉(扁平苔癬中所見)及白甲病。凹痕以指甲表面上存在小凹陷為特徵。可沿指甲顯現在"縱向"或"交叉"方向中出現之脊或線狀隆起。博氏線係在手指甲中"交叉"(橫向)出現之線狀凹陷。白甲病描述指甲上之白色斑紋或斑點。凹甲係指甲具有隆起之脊且較薄且呈凹形之異常形狀的手指甲。凹甲通常與缺鐵症相關。
可以本發明TNFα抗體治療之指甲病症亦包括牛皮癬性指甲。牛皮癬性指甲包括可歸因於牛皮癬之指甲變化。在某些情況下，牛皮癬可僅在指甲中且不在身體其他地方上出現。指甲中之牛皮癬性變化在輕度至重度範圍內，通常反映指甲板、甲母(亦即指甲自其中生長之組織)、甲床(亦即指甲以下之組織)及在指甲基部之皮膚所涉及之牛皮癬的程度。膿皰類型牛皮癬對於甲床之損害可導致指甲喪失。牛皮癬中之指甲變化分成可個別地或一起出現之一般類型。在一類牛皮癬性指甲中，指甲板深深凹陷，其可能歸因於指甲生長中由牛皮癬引起之缺陷。在另一類型中，指甲具有黃色至黃色-粉紅色之變色，其可能歸因於甲床涉及牛皮癬。第三亞型之牛皮癬性指甲以在指甲板下出現之白色區域為特徵。白色區域實際上為標明指甲板變得自甲床脫離之點的氣泡。指甲附近亦可能具有變紅皮膚。第四類型由指甲板瓦解成淺黃色斑塊(亦即甲變形)來證明，其可能歸因於甲母涉及牛皮癬。第五類型以指甲完全喪失為特徵，其歸因於甲母及甲床涉及牛皮癬。
使用本發明方法獲得之抗體亦可用以治療通常與扁平苔癬相關之指甲病症。患有扁平苔癬之受檢者之指甲通常展示具有縱脊或翼狀胬肉之指甲板變薄且表面粗糙。
使用本發明獲得之抗體可用於治療指甲病症，諸如本文中描述之彼等指甲病症。指甲病症通常與皮膚病相關。在一實施例中，本發明使用TNFα抗體治療指甲病症。在另一實施例中，指甲病症與包括諸如牛皮癬之皮膚病症之另一病症相關。在另一實施例中，與指甲病症相關之病症係包括牛皮癬性關節炎之關節炎。
12.其他皮膚及指甲病症
使用本發明方法獲得之抗體可用於治療其他皮膚及指甲病症，諸如慢性光激性皮炎、大皰狀類天疱瘡及斑形脫髮。慢性光激性皮炎(CAD)亦稱為光敏感性皮膚炎/光化性類網狀細胞增多徵候群 (PD/AR)。CAD係尤其在暴露於日光或人造光之區域皮膚變得發炎之病狀。通常，CAD患者患有對接觸其皮膚之某些物質，尤其各種花、木材、香料、防曬劑及橡膠化合物的過敏症。大皰狀類天疱瘡係指以在軀幹及手足上形成較大水皰為特徵之皮膚病症。斑形脫髮係指以頭皮或鬍鬚中之完全裸露之圓形斑塊為特徵的毛髮損失。
O.血管炎
TNFα已涉及多種血管炎之病理生理學(參見例如Deguchi等人(1989)Lancet.2：745)。在一實施例中，本發明提供抑制罹患TNFα活性起有害作用之脈管炎之受檢者之TNFα活性的多變劑量方法。
如本文中可互換使用之術語"脈管炎"或"血管炎"係指以血管發炎為特徵之病症群。自體內最大血管(主動脈)至皮膚中之最小血管(毛細管)之所有尺寸血管均可染病。染病血管之尺寸根據脈管炎之特定類型而不同。如本文中所用，術語"TNFα活性起有害作用之脈管炎"意欲包括患有病症之受檢者體內存在之TNFα已證明為或懷疑為病症之病理生理學之起因或造成病症惡化之因素的脈管炎。該等病症可例如由患有該病症之受檢者之生物流體中的TNFα濃度增加(例如受檢者之血清、血漿、滑液等中之TNFα濃度增加)來證明，此增加可例如使用如上所述之抗TNFα抗體來偵測。
存在TNFα活性起有害作用之眾多血管炎實例，包括白塞氏病。以下進一步討論使用抗體或其抗原結合部分治療特定血管炎。在某些實施例中，如下所述，使用本發明獲得之抗體或抗體部分與另一治療劑組合投與受檢者。
使用本發明獲得之抗體或抗體部分亦可用以治療TNFα活性起有害作用之脈管炎，其中預期抑制TNFα活性會減輕脈管炎之症狀及/或病程或預防脈管炎。患有脈管炎或處於顯現脈管炎之危險中之受檢者可藉由臨床症狀及測試鑑定。例如，患有血管炎之受檢者通常顯現對 於嗜中性細胞之胞漿中之某些蛋白質的抗體，抗嗜中性胞漿抗體(ANCA)。因此，在某些情況下，血管炎可由量測ANCA是否存在之測試(例如ELISA)來證明。
脈管炎及其結果可為單獨表現之疾病或其可為另一原發病之繼發組份。脈管炎可限於單一器官或其可同時影響若干器官。且視徵候群而定，可影響所有尺寸之動脈及靜脈。脈管炎可影響體內任何器官。
在脈管炎中，血管內腔通常受損害，其與由所涉及血管補給之組織之局部缺血相關。可由此過程引起廣泛範圍病症係歸因於可涉及任何類型、尺寸及位置之血管(例如動脈、靜脈、微動脈、小靜脈、毛細管)的事實。如下所述，血管炎通常根據染病血管之尺寸歸類。應注意某些小及大血管之血管炎可能涉及中等尺寸動脈；但大血管及中等尺寸血管之血管炎並不涉及小於動脈之血管。大血管疾病包括(但不限於)巨細胞性動脈炎(亦稱為顳動脈炎或顱動脈炎)、風濕性多肌痛及高安氏疾病(Takayasu's disease)或動脈炎(其亦稱為主動脈弓症候群)、年幼女性動脈炎及無脈症。中等血管疾病包括(但不限於)典型多發性結節性動脈炎及川崎氏疾病(Kawasaki's disease)(亦稱為皮膚黏膜淋巴結症候群)。小血管疾病之非限制性實例係白塞氏徵候群、韋格納氏肉芽腫病、微觀多血管炎、過敏性脈管炎(亦稱為皮膚血管炎)、小血管脈管炎、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、過敏性肉芽腫及脈管炎(亦稱為徹奇斯全司徵候群(Churg Strauss syndrome))。其他血管炎包括(但不限於)經分離中樞神經系統脈管炎及血栓閉塞性脈管炎(亦稱為伯格氏疾病(Buerger's disease))。典型多發性結節性動脈炎(PAN)、微觀PAN及過敏性肉芽腫亦通常集合在一起且稱作全身性壞死性血管炎。脈管炎之進一步描述描述如下：
1.大血管脈管炎
在一實施例中，使用本發明獲得之TNFα抗體可用以治療患有大血 管脈管炎之受檢者。如本文中所用之術語"大血管"係指集中到主要身體區域上之主動脈及最大支脈。大血管包括(例如)主動脈及其支脈及相應靜脈，例如鎖骨下動脈；頭臂動脈；總頸動脈；無名靜脈；內部及外部頸靜脈；肺動脈及靜脈；腔靜脈；腎動脈及靜脈；股動脈及靜脈；及頸動脈。大血管血管炎之實例描述如下。
a.巨細胞性動脈炎(GCA)
腫瘤壞死因子已涉及巨細胞性動脈炎之病理生理學(Sneller(2002)Cleve.Clin.J.Med.69：SII40；Schett等人(2002)Ann.Rheum.Dis.61：463)。巨細胞性動脈炎(GCA)係指涉及血管、尤其自頸部之頸外動脈分枝之較大或中等動脈之發炎及損害的脈管炎。GCA亦稱為顳動脈炎或顱動脈炎，且為老年人中之最常見原發性脈管炎。其幾乎獨佔地影響超過50歲之個體，然而，存在40歲及更年輕之患者之經完全證明之病例。GCA通常影響顱外動脈。GCA可影響包括顳動脈之頸動脈之支脈。GCA亦為可涉及多個位置中之動脈的全身疾病。
組織病理學上，GCA為發炎性單核細胞浸潤血管壁內部，同時經常形成郎罕氏(Langhans)類型巨細胞的全身動脈炎。存在內膜之增殖、肉芽腫發炎及內部彈性薄層之分裂。器官中之病理檢查所見為與所涉及血管有關之局部缺血之結果。
罹患GCA之患者展現某些臨床症狀，包括發熱、頭痛、貧血及高紅血球沈降速率(ESR)。GCA之其他典型徵候包括頜咀嚼或舌攪動暫停、頭皮觸痛、全身症狀、蒼白視神經盤水腫(尤其'白堊質白色'圓盤水腫)及視力障礙。診斷由顳動脈活組織檢查確認。
b.風濕性多肌痛
腫瘤壞死因子已涉及風濕性多肌痛之病理生理學(Straub等人(2002)Rheumatology(Oxford)41：423；Uddhammar等人(1998)Br.J.Rheumatol.37：766)。風濕性多肌痛係指在早晨最顯著的與頸部、肩部 及臀部中之中度至重度肌肉疼痛及僵直相關之風濕性病症。亦在患有風濕性多肌痛之患者之大多數循環單核細胞中偵測到IL-6及IL-1β表現。風濕性多肌痛可獨立地出現，或其可與為血管發炎之GCA共存或在其之前出現。
c.高安動脈炎
腫瘤壞死因子已涉及高安動脈炎之病理生理學(Kobayashi及Numano(2002)Intern.Med.41：44；Fraga及Medina(2002)Curr.Rheumatol.Rep.4：30)。高安動脈炎係指以主動脈及其主要支脈發炎為特徵之脈管炎。高安動脈炎(亦稱為主動脈弓症候群、年幼女性動脈炎及無脈症)影響胸及腹主動脈及其主要支脈或肺動脈。主動脈壁及其支脈(例如頸動脈、無名動脈及鎖骨下動脈)之纖維化變厚可導致起因於主動脈弓之血管內腔尺寸減小。此病狀通常亦影響腎動脈。
高安動脈炎主要影響通常20-40歲、尤其亞洲人血統之年輕女性，且可表現為不適感、關節痛及手足跛行之逐漸發作。大多數患者具有不對稱減少之脈搏，且通常伴隨有臂中之血壓差異。可出現冠狀及/或腎動脈狹窄。
高安動脈炎之臨床特徵可劃分成早期發炎性疾病之特徵及後期疾病之特徵。高安氏疾病之早期發炎性階段之臨床特徵為：不適感、輕度熱病、重量減輕、肌痛、關節痛及多形性紅斑。高安氏疾病之後期階段以動脈之纖維化狹窄及血栓症為特徵。主要所得臨床特徵為缺血現象，例如虛弱及不對稱之動脈脈搏、臂之間血壓差異、視力障礙(例如盲點及半盲)、包括眩暈及昏厥之其他神經病學特徵、輕偏癱或中風。臨床特徵由歸因於動脈狹窄及血栓症之局部缺血引起。
2.中等血管疾病
在一實施例中，使用本發明獲得之TNFα抗體可用以治療患有中等血管脈管炎之受檢者。術語"中等血管"用以指為主要內臟動脈之彼等 血管。中等血管之實例包括腸系膜動脈及靜脈、腸骨動脈及靜脈、及上頜骨動脈及靜脈。中等血管之血管炎之實例描述如下。
a.多發性結節性動脈炎
腫瘤壞死因子已涉及多發性結節性動脈炎之病理生理學(DiGirolamo等人(1997)J.Leukoc.Biol.61：667)。多發性結節性動脈炎或結節性動脈周圍炎係指涉為嚴重血管疾病之脈管炎，其中小及中型動脈由於受劣性免疫細胞攻擊而變得腫脹且受損傷。多發性結節性動脈炎通常更頻繁地影響成人而非兒童。因為受染病動脈補給之組織在無適當血液供給的情況下並未接收足夠的氧及營養物，所以多發性結節性動脈炎損傷該等組織。
在患有多發性結節性動脈炎之患者中展現之症狀通常由對於通常皮膚、心臟、腎臟及神經系統之染病器官的損害引起。多發性結節性動脈炎之普遍症狀包括熱病、疲勞、虛弱、食慾不振及重量減輕。肌肉疼痛(肌痛)及關節疼痛(關節痛)較常見。患有多發性結節性動脈炎之受檢者之皮膚亦可展示皮疹、腫脹、潰瘍及疙瘩(結節性病變)。
典型PAN(多發性結節性動脈炎)為常涉及腎及內臟動脈之小至中等肌肉動脈炎之全身性動脈炎。在50%之PAN患者中腹部血管具有動脈瘤或閉塞。儘管可涉及支氣管血管，但是典型PAN並不涉及肺動脈。肉芽腫、顯著嗜伊紅細胞增多及過敏素質並不為該徵候群之部分。儘管可涉及任何器官系統，但是最常見表現包括周圍神經病、多發性神經炎、腸道局部缺血、腎缺血、睪丸疼痛及網狀青斑。
b.川崎氏疾病
腫瘤壞死因子已涉及川崎氏疾病之病理生理學(Sundel(2002)Curr.Rheumatol.Rep.4：474；Gedalia(2002)Curr.Rheumatol.Rep.4：25)。儘管川崎氏疾病之病因未知，但是其與冠狀動脈之急性發炎相關，表明與此病相關之組織損傷可由前發炎劑(諸如TNFα)所介導。川 崎氏疾病係指影響黏膜、淋巴結、血管內層及心臟之脈管炎。川崎氏疾病亦通常稱為皮膚黏膜淋巴結症候群、皮膚黏膜淋巴結疾病及嬰兒多動脈炎。罹患川崎氏疾病之受檢者顯現可導致心肌炎及心包炎之通常涉及冠狀動脈的脈管炎。通常當急性發炎減弱時，冠狀動脈可顯現動脈瘤、血栓症，且導致心肌梗塞。
川崎氏疾病為與手掌及腳底中之水腫相關、與頸部淋巴結腫大、唇裂及"草莓舌"相關之發熱性全身性脈管炎。儘管發炎性反應見於整個身體之血管中，但是終點器官損傷之最常見位點為冠狀動脈。川崎氏疾病主要影響5歲以下的兒童。最高發病率在日本，但在西方日益變得為人所公認且現在為美國兒童之後天性心臟病之主要病因。川崎氏病之最嚴重併發症為在三分之一之未經治療患者中出現之冠狀動脈炎及動脈瘤形成。
3.小血管疾病
在一實施例中，TNFα抗體用以治療患有小血管脈管炎之受檢者。術語"小血管"用以指微動脈、小靜脈及毛細管。微動脈為僅含有1或2層平滑肌細胞且位於毛細管網路之終端且與毛細管網路相連的動脈。小靜脈將血液自毛細管網路傳送至靜脈且毛細管連接微動脈與小靜脈。小血管血管炎之實例描述如下。
a.白塞氏病
腫瘤壞死因子已涉及白塞氏病之病理生理學(Sfikakis(2002)Ann.Rheum.Dis.61：ii51-3；Dogan及Farah(2002)Oftalmologia.52：23)。白塞氏病為涉及整個身體之血管之發炎的慢性病症。白塞氏病亦可導致多種類型之皮膚病變、關節炎、腸發炎及腦膜炎(腦與脊髓之膜之發炎)。由於白塞氏病，患有該病症之受檢者可在整個身體之組織及器官中具有發炎，該等組織及器官包括胃腸道、中樞神經系統、血管系統、肺及腎臟。白塞氏病在男性中之普及率比在女性中大三倍且在東地中 海及日本更常見。
患有白塞氏病之受檢者可展示包括復發性口腔潰瘍(類似於口瘡)、復發性生殖器潰瘍及眼睛發炎之臨床症狀。TNFα、IL-8、IL-1、IL-6、INF-γ及IL-12之血清含量在白塞氏病患者中升高，且已展示此等因子之產量在白塞氏病患者之單核細胞中升高(參見例如Inflammatory Disease of Blood Vessels(2001)Marcel Dekker,Inc.，編G.S.Hoffman及C.M.Weyand，第473頁)。
b.韋格納肉牙腫病
腫瘤壞死因子已涉及韋格納肉牙腫病之病理生理學(Marquez等人(2003)Curr.Rheumatol.Rep.5：128；Harman及Margo(1998)Surv.Ophthalmol.42：458)。韋格納肉牙腫病係指導致上呼吸道(鼻、竇、耳)、肺及腎臟中之血管之發炎的脈管炎。韋格納肉牙腫病亦稱為中線肉芽腫病。韋格納肉牙腫病包括涉及呼吸道之肉芽腫發炎，及影響小至中型血管之壞死性脈管炎。患有韋格納肉牙腫病之受檢者通常亦患有關節炎(關節發炎)。絲球體腎炎亦可存在於染病受檢者中，但實際上可涉及任何器官。
患有韋格納肉牙腫病之患者通常展示包含復發性竇炎或鼻出血、黏膜潰瘍、中耳炎、咳嗽、咯血及呼吸困難之臨床症狀。韋格納肉牙腫病之第一症狀經常包括上呼吸道症狀、關節疼痛、虛弱及疲倦。
c.謝格-司托司症候群
腫瘤壞死因子已涉及謝格-司托司症候群之病理生理學(Gross(2002)Curr.Opin.Rheumatol.14：11；Churg(2001)Mod.Pathol.14：1284)。謝格-司托司症候群係指呈全身性且展示哮喘及嗜伊紅細胞增多之早期表現病徵之脈管炎。謝格-司托司症候群亦稱為過敏性肉芽腫及脈管炎，且在過敏性鼻炎、哮喘及嗜伊紅細胞增多之背景中出現。竇炎及肺浸潤亦出現在謝格-司托司症候群中，主要影響肺及心臟。常 見周圍神經病、冠狀動脈炎及胃腸牽涉。
罹患謝格-司托司症候群之患者可根據美國風濕病學會(ACR)建立之標準來診斷。此等標準意欲區分CSS與其他形式之脈管炎。並非所有患者均滿足每個標準。實際上，某些可僅具有2或3個標準，但其仍歸類為謝格-司托司症候群。ACR選擇6個疾病特徵(標準)作為良好地區分謝格-司托司症候群與其他血管炎之彼等疾病特徵。此等標準包括：1)哮喘；2)嗜伊紅細胞增多[按照差異WBC計數>10%]；3)單神經病；4)按照胸部X射線之短暫肺浸潤；5)鼻旁竇異常；及6)包含具有血管外嗜伊紅細胞之血管的活組織檢查。
P.其他TNFα相關病症
在一實施例中，本發明提供治療TNFα活性起有害作用之TNFα相關病症之多變劑量方法，其包含向受檢者投與TNFα抗體，以便治療該TNFα相關病症。以下進一步討論TNFα活性起有害作用之TNFα相關病症之實例。
1.幼年型關節炎
腫瘤壞死因子已涉及包括幼年型類風濕性關節炎之幼年型關節炎之病理生理學(Grom等人(1996)Arthritis Rheum.39：1703；Mangge等人(1995)Arthritis Rheum.8：211)。在一實施例中，本發明TNFα抗體用以治療幼年型類風濕性關節炎。
如本文中所用之術語"幼年型類風濕性關節炎"或"JRA"係指在16歲之前出現的可導致關節或結締組織損傷之慢性發炎性疾病。JRA亦稱為幼年型慢性多發性關節炎及史提爾氏病(Still's disease)。
JRA導致16歲或更小之兒童之關節發炎及僵直達6週以上。發炎導致關節紅腫、腫脹、暖熱及瘡。任何關節均可受影響且發炎可限制染病關節之活動性。一類JRA亦可影響內臟。
經由所涉及關節之數目、症狀及血試驗所發現之某些抗體的存在 與否，JRA通常分類為三種類型。此等分類有助於醫師確定疾病進行之方式及是否影響內臟或皮膚。JRA之分類包括下列各類：
a.少關節型JRA，其中患者具有四個或更少染病關節。少關節型為最常見形式之JRA，且通常影響諸如膝之較大關節。
b.多關節型HRA，其中影響五個或更多關節。最常涉及諸如手及腳中之彼等關節之小關節，但疾病亦可影響大關節。
c.全身性JRA，其係以關節腫脹、發熱、輕度皮疹為特徵，且亦可影響諸如心臟、肝臟、脾臟及淋巴結之內臟。全身性JRA亦稱為史提爾氏病(Still's disease)。較小百分比之此等兒童顯現許多關節中之關節炎且可具有持續至成人期中之重度關節炎。
2.子宮內膜異位
因為患有子宮內膜異位之女性具有TNF之升高腹膜含量，所以腫瘤壞死因子已涉及子宮內膜異位之病理生理學(Eisermann等人(1988)Fertil Steril 50：573；Halme(1989)Am J Obstet Gynecol 161：1718；Mori等人(1991)Am J Reprod Immunol 26：62；Taketani等人(1992)Am J Obstet Gynecol 167：265；Overton等人(1996)Hum Reprod 1996；11：380)。在一實施例中，TNFα抗體可用以治療子宮內膜異位。如本文中所用之術語"子宮內膜異位"係指正常地鑲襯子宮之組織(子宮內膜)生長於身體之其他區域中，導致疼痛、不規則出血及經常不育症之病狀。
3.前列腺炎
因為患有慢性前列腺炎及慢性骨盆疼痛之男性與對照組相比較精液中具有明顯較高含量之TNF及IL-1，所以腫瘤壞死因子已涉及前列腺炎之病理生理學(Alexander等人(1998)Urology 52：744；Nadler等人(2000)J Urol 164：214；Orhan等人(2001)Int J Urol 8：495)。此外，在前列腺炎之大鼠模型中，TNF含量與對照組相比較亦增加(Asakawa 等人(2001)Hinyokika Kiyo 47：459；Harris等人(2000)Prostate 44：25)。在一實施例中，本發明TNFα抗體用以治療前列腺炎。
如本文中所用之術語"前列腺炎"係指前列腺之發炎。前列腺炎亦稱為骨盆疼痛徵候群。前列腺炎以多種形式自我展現，包括非細菌性前列腺炎、急性前列腺炎、細菌性前列腺炎及急性前列腺炎。急性前列腺炎係指突然顯現之前列腺發炎。急性前列腺炎通常由前列腺之細菌感染引起。慢性前列腺炎為逐漸顯現，持續一段較長時間且通常具有隱蔽症狀之前列腺發炎。慢性前列腺炎亦通常由細菌感染引起。
4.脈絡膜新血管生成
腫瘤壞死因子已涉及脈絡膜新血管生成之病理生理學。例如，在以手術方式切除之脈絡膜新血管膜中，新血管因TNF與IL-1而染色呈陽性(Oh H等人(1999)Invest Ophthalmol Vis Sci 40：1891)。在一實施例中，TNFα抗體用以治療脈絡膜新血管生成。如本文中所用之術語"脈絡膜新血管生成"係指藉由Bruch膜斷裂為視網膜下色素上皮(下RPE)或視網膜下空間而源於脈絡膜之新血管的生長。脈絡膜新血管生成(CNV)為患有該病狀之患者中視力喪失之主要原因。
5.坐骨神經痛
腫瘤壞死因子已涉及坐骨神經痛之病理生理學(Ozaktay等人(2002)Eur Spine J.11：467；Brisby等人(2002)Eur Spine J.11：62)。在一實施例中，本發明TNFα抗體用以治療坐骨神經痛。如本文中所用之術語"坐骨神經痛"係指涉及由坐骨神經損害引起之腿運動障礙及/或感覺障礙的病狀。坐骨神經痛通常亦稱為坐骨神經之神經病及坐骨神經功能障礙。坐骨神經痛為周圍神經病形式。當存在對於位於腿後部之坐骨神經的損害時，出現坐骨神經痛。坐骨神經控制膝後部及下肢的肌肉且向大腿後部、下肢部分及腳底提供知覺。坐骨神經痛可指示另一病症，包括腰椎間盤突出、椎管狹窄症、腰椎間盤退變性疾病、 峽部裂腰椎滑脫及梨狀肌徵候群。
6.史格倫症候群(Sjogren's syndrome)
腫瘤壞死因子已涉及史格倫症候群之病理生理學(Koski等人(2001)Clin Exp Rheumatol.19：131)。在一實施例中，本發明TNFα抗體用以治療史格倫症候群。如本文中所用之術語"史格倫症候群"係指以口乾、眼淚減少及其他乾燥黏膜為特徵，且通常與諸如類風濕性關節炎之自體免疫風濕性病症相關的全身性發炎性病症。眼睛及口腔乾燥為此徵候群之最常見症狀。症狀可單獨出現，或具有與類風濕性關節炎或其他結締組織疾病相關之症狀。可能存在相關之唾液腺腫大。其他器官可變得受影響。該徵候群可與類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼瘡症、硬皮病、多發性肌炎及其他疾病相關。
7.葡萄膜炎
腫瘤壞死因子已涉及葡萄膜炎之病理生理學(Wakefield及Lloyd(1992)Cytokine 4：1；Woon等人(1998)Curr Eye Res.17：955)。在一實施例中，本發明TNFα抗體用以治療葡萄膜炎。如本文中所用之術語"葡萄膜炎"係指作為介於鞏膜與視網膜之間的包括虹膜、睫狀體及脈絡膜之層的葡萄膜之發炎。葡萄膜炎通常亦稱為虹膜炎、睫狀體平坦部炎、脈絡膜炎、脈絡膜視網膜炎、前葡萄膜炎及後葡萄膜炎。最常見之葡萄膜炎形式為前葡萄膜炎，其涉及通常與虹膜分離之眼睛前面部分之發炎。此病狀通常稱為虹膜炎。在一實施例中，術語葡萄膜炎係指不包括與自體免疫疾病相關之發炎的葡萄膜發炎，亦即不包括自體免疫葡萄膜炎。
8.濕性黃斑退化
腫瘤壞死因子已涉及濕性黃斑退化之病理生理學。在一實施例中，本發明TNFα抗體用以治療濕性黃斑退化。如本文中所用之術語"濕性黃斑退化"係指影響黃斑(眼睛視網膜之中心部分)且導致視敏度 降低及可能喪失中心視覺的病症。患有濕性黃斑退化之患者顯現視網膜下之新血管，其導致出血、腫脹及瘢痕組織。
9.骨質疏鬆症
腫瘤壞死因子已涉及骨質疏鬆症之病理生理學(Tsutsumimoto等人(1999)J Bone Miner Res.14：1751)。骨質疏鬆症用以指以骨骼密度進行性損失及骨組織變薄為特徵的病症。當身體未能形成足夠的新骨骼時，或當過多舊骨骼由身體再吸收時，或兩者同時發生時，出現骨質疏鬆症。本發明之TNFα抗體或其抗原結合片段可用於治療骨質疏鬆症。
10.骨關節炎
腫瘤壞死因子已涉及骨關節炎之病理生理學(Venn等人(1993)Arthritis Rheum.36：819；Westacott等人(1994)J Rheumatol.21：1710)。骨關節炎(OA)亦稱為肥大性骨關節炎、骨關節病及退化性關節病。OA為骨骼關節之慢性退化病，其影響所有年齡之成人中之通常膝、臀部、手關節及脊柱之特定關節。OA以多種下列表現為特徵，包括具有相關聯顯現之"潰瘍"或凹坑之關節軟骨退化及變薄、骨贅形成、邊緣處之骨骼過度生長及滑膜變化及染病關節腫大。此外，尤其在長時間活動之後，骨關節炎伴隨有疼痛及僵直。本發明之抗體或其抗原結合片段可用於治療骨關節炎。骨關節炎之獨有射線照相特徵包括關節間隙窄化、軟骨下硬化、骨贅病、軟骨下孢囊形成、疏鬆骨體(或"關節小鼠")。
用以治療骨關節炎之藥物包括多種非類固醇、消炎藥物(NSAID)。另外，包括西樂葆(Celebrex)、萬絡(Vioxx)及伐地昔布(Bextra)、依託昔布(Etoricoxib)之COX 2抑制劑亦用以治療OA。直接注射至關節中之類固醇亦可用以減少發炎及疼痛。在本發明之一實施例中，本發明TNFα抗體與NSAID、COX2抑制劑及/或類固醇組合投與。
11.其他
本發明方法亦可用於治療TNFα活性起有害作用之各種其他病症。TNFα活性已涉及其病理生理學且因此可使用本發明抗體或抗體部分治療之其他疾病及病症的實例包括發炎性骨骼病症、骨再吸收病、止血障礙、燒傷、再灌注損傷、瘢痕瘤形成、瘢痕組織形成、熱病、牙周病、肥胖症、輻射毒性、年齡相關之惡病質、阿茲海默氏症、大腦水腫、發炎性腦損傷、癌症、慢性疲勞徵候群、皮肌炎、藥物反應(諸如史蒂芬-瓊森症候群(Stevens-Johnson syndrome)及赫克斯海默氏反應(Jarisch-Herxheimer reaction))、脊髓中及/或脊髓附近之水腫、家族性週期性發熱、費爾提氏症候群(Felty's syndrome)、纖維化、絲球體腎病(例如鏈球菌感染後絲球體腎炎或IgA腎病)、修復體疏鬆、微觀多血管炎、混合結締組織病症、多發性骨髓瘤、癌症及惡病質、多器官病症、髓發育不良徵候群、睪丸切開骨質溶解、胰腺炎(包括急性、慢性及胰膿腫)、多發性肌炎、進行性腎衰竭、假性痛風、壞疽性膿皮病、復發性多軟骨炎、風濕性心臟病、肉狀瘤病、硬化性膽管炎、中風、胸腹主動脈瘤修復(TAAA)、TNF受體相關週期性徵候群(TRAPS)、與黃熱病疫苗接種有關之症狀、與耳朵相關之發炎疾病、慢性耳朵發炎、有或無膽脂瘤之慢性中耳炎、小兒科耳朵發炎、肌炎、卵巢癌、結腸直腸癌、與經誘發發炎性徵候群(例如繼IL-2投與之後之徵候群)相關之療法、及與再灌注損傷相關之病症。
應瞭解，若適當，所有以上提及之TNFα相關病症包括成人疾病與幼年型疾病。亦應瞭解所有以上提及之病症包括慢型病與急型病。另外，本發明之多變劑量方法可用於治療單獨或彼此組合之以上提及之TNFα相關病症之每一者，例如罹患葡萄膜炎及狼瘡之受檢者。
其他治療劑
本發明係關於使用多變劑量方案治療TNFα相關病症之醫藥組合 物及其使用方法。醫藥組合物包含預防或抑制TNFα相關病症之第一藥劑。醫藥組合物及使用方法可包含作為活性醫藥成份之第二藥劑；亦即，第二藥劑為治療劑且其作用超出非活性成份之作用，該非活性成份為諸如醫藥載劑、防腐劑、稀釋劑或緩衝液。第二藥劑可適用於治療或預防TNFα相關病症。第二藥劑可減弱或治療至少一種與目標疾病相關之症狀。第一及第二藥劑可由類似或無關作用機制發揮其生物效應；或第一及第二藥劑之任一者或者兩者可由許多作用機制發揮其生物效應。醫藥組合物亦可包含第三化合物，或甚至更多，其中第三(及第四等)化合物具有第二藥劑之相同特徵。
應瞭解，對於每一所描述之實施例而言，本文中描述之醫藥組合物可具有於相同醫藥學上可接受之載劑或不同醫藥學上可接受之載劑中之第一藥劑及第二藥劑、第三藥劑或其他藥劑。應進一步瞭解，在所描述實施例內，第一藥劑、第二藥劑、第三藥劑及其他藥劑可同時或連續地投與。或者，第一藥劑及第二藥劑可同時投與，且第三藥劑或其他藥劑可在該兩種藥劑之前或之後投與。
本文中描述之方法及醫藥組合物內使用之藥劑組合可具有對於待治療之目標病狀或疾病之治療性加成或協同效應。本文中描述之方法或醫藥組合物內使用之藥劑組合亦可能減少與至少一種藥劑在單獨或未聯合特定醫藥組合物之另一(其他)藥劑投與時相關之損害效應。例如，一種藥劑之副效應毒性可由組合物之另一藥劑減弱，因此允許較高劑量、改良患者順應性及改良治療性結果。組合物之加成或協同效應、益處及優點適用於治療劑之類別(結構性或功能性類別)或適用於個別化合物本身。
補充活性化合物亦可併入組合物中。在某些實施例中，本發明抗體或抗體部分與一或多種適用於治療TNFα活性起有害作用之TNFα相關病症之其他治療劑共同調配及/或共同投與。例如，本發明之抗 hTNFα抗體、抗體部分或其他TNFα抑制劑可與以下各物共同調配及/或共同投與：一或多種結合其他目標之其他抗體(例如結合其他細胞因子或結合細胞表面分子之抗體)、一或多種細胞因子、可溶性TNFα受體(參見例如PCT公開案第WO 94/06476號)及/或一或多種抑制hTNFα產生或活性之化學藥劑(諸如如PCT公開案第WO 93/19751號中所述之亞環己基衍生物)。此外，一或多種本發明抗體或其他TNFα抑制劑可與兩種或兩種以上之上述治療劑組合使用。該等組合療法可有利地使用較低劑量之所投與治療劑，因此避免與各種單一療法相關之可能毒性或併發症。如以下討論，特定治療劑通常基於所治療之特定TNFα相關病症來選擇。
在本發明之多變劑量治療方法中可與抗體、抗體部分或其他TNFα抑制劑組合之治療劑之非限制性實例包括下列各治療劑：非類固醇消炎藥物(NSAID)；細胞因子抑制消炎藥物(CSAID)；CDP-571/BAY-10-3356(人源化抗TNFα抗體；Celltech/Bayer；cA2/英利昔單抗(嵌合抗TNFα抗體；Centocor；75 kdTNFR-IgG/依那西普(etanercept)(75 kD TNF受體-IgG融合蛋白質；Immunex；參見例如Arthritis & Rheumatism(1994)第37卷，S295；J.Invest.Med.(1996)第44卷，235A)；55 kdTNF-IgG(55 kD TNF受體-IgG融合蛋白質；Hoffmann-LaRoche)；IDEC-CE9.1/SB 210396(非耗盡靈長化抗CD4抗體；IDEC/SmithKline；參見例如Arthritis & Rheumatism(1995)第38卷，S185)；DAB 486-IL-2及/或DAB 389-IL-2(IL-2融合蛋白質；Seragen；參見例如Arthritis & Rheumatism(1993)第36卷，1223)；Anti-Tac(人源化抗-IL-2Rα；Protein Design Labs/Roche)；IL-4(消炎細胞因子；DNAX/Schering)；IL-10(SCH 52000；重組IL-10，消炎細胞因子；DNAX/Schering)；IL-4；IL-10及/或IL-4激動劑(例如激動劑抗體)；IL-1RA(IL-1受體拮抗劑；Synergen/Amgen)；阿那白滯素(anakinra)(Kineret®/Amgen)； TNF-bp/s-TNF(可溶性TNF結合蛋白；參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9號(增刊)，S284；Amer.J.Physiol.-Heart and Circulatory Physiology(1995)第268卷，第37-42頁)；R973401(IV型磷酸二酯酶抑制劑；參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9號(增刊)，S282)；MK-966(COX-2抑制劑；參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9號(增刊)，S81)；伊洛前列素(Iloprost)(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9號(增刊)，S82)；甲胺喋呤；沙力度胺(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9號(增刊)，S282)及沙力度胺相關藥物(例如美加健寶(Celgen))；來氟米特(leflunomide)(消炎及細胞因子抑制劑；參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9號(增刊)，S131；Inflammation Research(1996)第45卷，第103-107頁)；胺甲環酸(纖溶酶原活化之抑制劑；參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9號(增刊)，S284)；T-614(細胞因子抑制劑；參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9號(增刊)，S282)；前列腺素E1(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9號(增刊)，S282)；替尼達普(Tenidap)(非類固醇消炎藥物；參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9號(增刊)，S280)；萘普生(Naproxen)(非類固醇消炎藥物；參見例如Neuro Report(1996)第7卷，第1209-1213頁)；美儂西康(Meloxicam)(非類固醇消炎藥物)；布洛芬(Ibuprofen)(非類固醇消炎藥物)；吡羅昔康(Piroxicam)(非類固醇消炎藥物)；雙氯芬酸(Diclofenac)(非類固醇消炎藥物)；吲哚美辛(Indomethacin)(非類固醇消炎藥物)；柳氮磺吡啶(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9號(增刊)，S281)；硫唑嘌呤(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9號(增刊)，S281)；ICE抑制劑(酶介白素-1β轉化酶之抑制劑)；zap-70及/或lck抑制劑(酪胺酸激酶zap-70或lck之抑制劑)；VEGF抑制劑及/或VEGF-R抑制劑(血管內皮 細胞生長因子或血管內皮細胞生長因子受體之抑制劑；血管生成之抑制劑)；皮質類固醇消炎藥物(例如SB203580)；TNF-轉化酶抑制劑；抗-IL-12抗體；抗-IL-18抗體；介白素-11(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)，第39卷，第9號(增刊)，S296)；介白素-13(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)，第39卷，第9號(增刊)，S308)；介白素-17抑制劑(參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)，第39卷，第9號(增刊)，S120)；金；青黴胺；氯喹；羥氯喹；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；環孢素；環磷醯胺；完全淋巴照射；抗胸腺細胞球蛋白；抗CD4抗體；CD5毒素；經口投與之肽及膠原；氯苯紮利二鈉(lobenzarit disodium)；細胞因子調節劑(CRA)HP228及HP466(Houghten Pharmaceuticals,Inc.)；ICAM-1反義硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals,Inc.)；可溶性補體受體1(TP10；T Cell Sciences,Inc.)；潑尼松；奧古蛋白(orgotein)；葡糖胺聚糖多硫酸鹽；米諾環素(minocycline)；抗IL2R抗體；海產及植物脂質(魚及植物籽脂肪酸；參見例如DeLuca等人(1995)Rheum.Dis.Clin.North Am. 21：759-777)；金諾芬(auranofin)；苯基丁氮酮；甲氯芬那酸(meclofenamic acid)；氟芬那酸(flufenamic acid)；靜脈內免疫球蛋白；齊留通(zileuton)；阿紮立平(azaribine)；黴酚酸(mycophenolic acid)(RS-61443)；他克莫司(tacrolimus)(FK-506)；西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin))；胺普立糖(amiprilose)(阿普勞斯(therafectin))；克拉屈濱(cladribine)(2-氯脫氧腺苷)；甲胺喋呤；抗病毒劑；及免疫調節劑。任何以上提及之藥劑均可與本發明TNFα抗體組合投與以使用本發明之多變劑量
或單次劑量治療方法治療TNFα相關病症。
在一實施例中，本發明TNFα抗體與治療類風濕性關節炎之下列藥劑之一組合使用本發明之多變劑量治療方法來投與：KDR之小分子抑制劑(ABT-123)、Tie-2之小分子抑制劑；甲胺喋呤；潑尼松；賽利克西 (celecoxib)；葉酸；羥氯喹硫酸鹽；羅非考昔(rofecoxib)；依那西普；英利昔單抗；阿那白滯素(Kineret®/Amgen)；來氟米特；萘普生；伐地考昔；柳氮磺吡啶；布洛芬；甲潑尼龍；美儂西康；甲潑尼龍乙酸酯；金硫丁二鈉；阿司匹林；硫唑嘌呤；曲安奈德(triamcinolone acetonide)；萘磺酸右丙氧芬(propxyphene napsylate)/apap；葉酸鹽；萘丁美酮(nabumetone)；雙氯芬酸；吡羅昔康；依託度酸(etodolac)；雙氯芬酸鈉；噁丙嗪(oxaprozin)；鹽酸羥考酮(oxycodone hcl)；重酒石酸氫可酮(hydrocodone bitartrate)/apap；雙氯芬酸鈉/米索前列醇(misoprostol)；芬太尼(fentanyl)；阿那白滯素，人類重組體；鹽酸曲馬多(tramadol hcl)；雙水楊酯；舒林酸(sulindac)；氰鈷胺(cyanocobalamin)/fa/吡多辛(pyridoxine)；乙醯胺苯酚；阿侖膦酸鈉；潑尼龍；硫酸嗎啡；鹽酸利多卡因(lidocaine hydrochloride)；吲哚美辛；葡糖胺硫酸鹽/軟骨素；環孢素；磺胺嘧啶；鹽酸阿米替林(amitriptyline hcl)；鹽酸羥考酮/乙醯胺苯酚；鹽酸奧洛他定(olopatadine hcl)；米索前列醇；萘普生鈉；奧美拉唑(omeprazole)；黴酚酸酯(mycophenolate mofetil)；環磷醯胺；利妥昔單抗(rituximab)；IL-1 TRAP；MRA；CTLA4-IG；IL-18 BP；ABT-874；ABT-325(抗-IL 18)；抗-IL 15；BIRB-796；SCIO-469；VX-702；AMG-548；VX-740；羅氟司特(Roflumilast)；IC-485；CDC-801；及美索普蘭(mesopram)。在另一實施例中，本發明TNFα抗體與治療類風濕性關節炎之以上提及之藥劑之一組合使用治療TNFα相關病症之多變劑量方法來投與。在另一實施例中，以上提及之其他藥劑在本發明之單次劑量治療方法中與TNFα抗體組合使用。
在一實施例中，本發明TNFα抗體與治療TNFα活性起有害作用之TNFα相關病症之下列藥劑之一組合使用多變劑量方案投與：抗IL12抗體(ABT 874)；抗IL18抗體(ABT 325)；LCK之小分子抑制劑；COT之小分子抑制劑；抗IL1抗體；MK2之小分子抑制劑；抗CD19抗體；CXCR3 之小分子抑制劑；CCR5之小分子抑制劑；CCR11抗E/L選擇素抗體之小分子抑制劑；P2X7之小分子抑制劑；IRAK-4之小分子抑制劑；糖皮質激素受體之小分子激動劑；抗C5a受體抗體；C5a受體之小分子抑制劑；抗CD32抗體；及作為治療性蛋白質之CD32。
在另一實施例中，使用本發明獲得之TNFα抗體可與抗生素或抗感染劑組合投與。抗感染劑包括在此項技術中已知治療病毒、真菌、寄生蟲或細菌感染之彼等藥劑。如本文中所用之術語"抗生素"係指抑制微生物之生長或殺死微生物之化學物質。該術語涵蓋由微生物產生之抗生素以及在此項技術中已知之合成抗生素(例如類似物)。抗生素包括(但不限於)克拉黴素(clarithromycin)(Biaxin®)、環丙沙星(ciprofloxacin)(Cipro®)及甲硝噠唑(metronidazole)(Flagyl®)。
在另一實施例中，使用本發明獲得之TNFα抗體可與另一治療劑一起投與以治療坐骨神經痛或疼痛。可用於減少或抑制坐骨神經痛或疼痛之症狀之藥劑的實例包括重酒石酸氫可酮/apap、羅非考昔、鹽酸環苯紮平(cyclobenzaprine hcl)、甲潑尼龍、萘普生、布洛芬、鹽酸羥考酮/乙醯胺苯酚、賽利克西、伐地考昔(valdecoxib)、甲潑尼龍乙酸酯、潑尼松、磷酸可待因/apap、鹽酸曲馬多/乙醯胺苯酚、美他沙酮(metaxalone)、美儂西康、美索巴莫、鹽酸利多卡因、雙氯芬酸鈉、加巴噴丁(gabapentin)、地塞米松(dexamethasone)、肌安寧(carisoprodol)、酮洛酸胺丁三醇(ketorolac tromethamine)、吲哚美辛、乙醯胺苯酚、二氮雜環庚烷、萘丁美酮(nabumetone)、鹽酸羥考酮、鹽酸替紮尼定(tizanidine hcl)、雙氯芬酸鈉/米索前列醇、萘磺酸右丙氧芬/apap、asa/羥考酮(oxycod)/第三羥考酮(oxycodone ter)、布洛芬/重酒石酸氫可酮、鹽酸曲馬多、依託度酸、鹽酸右丙氧芬、鹽酸阿米替林、肌安寧/磷酸可待因/asa、硫酸嗎啡、多種維生素、萘普生鈉、奧芬那君檸檬酸鹽(orphenadrine citrate)及替馬西泮(temazepam)。
在另一實施例中，TNFα相關病症以與血液透析組合之使用本發明獲得之TNFα抗體治療。
在另一實施例中，使用本發明獲得之TNFα抗體可在本發明之多變劑量方案中與用以治療克羅恩氏病或克羅恩氏病相關病症之藥物組合使用。可用於治療克羅恩氏病之治療劑的實例包括美沙拉嗪、潑尼松、硫唑嘌呤、巰嘌呤、英利昔單抗、布地奈德、柳氮磺吡啶、甲潑尼龍琥珀酸鈉、地芬諾酯/阿托品硫酸鹽(diphenoxylate/atrop sulf)、洛哌丁胺鹽酸鹽、甲胺喋呤、奧美拉唑、葉酸鹽、環丙沙星/右旋糖-水、重酒石酸氫可酮/apap、鹽酸四環素、氟輕鬆(fluocinonide)、甲硝噠唑、硫柳汞/硼酸、硫酸莨菪鹼、消膽胺/蔗糖、環丙沙星鹽酸鹽、鹽酸哌替啶、咪達唑侖鹽酸鹽、鹽酸羥考酮/乙醯胺苯酚、鹽酸異丙嗪、磷酸鈉、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶(sulfamethoxazole/trimethoprim)、賽利克西、聚卡波非、萘磺酸右丙氧芬、氫化可的松、多種維生素、巴柳氮二鈉、磷酸可待因/apap、鹽酸考來維侖(colesevelam hcl)、氰鈷胺、葉酸、左氧氟沙星、那他珠單抗(natalizumab)、甲潑尼龍、干擾素γ及沙格司亭(sargramostim)(GM-CSF)。在一實施例中，甲胺喋呤係以每週2.5 mg至30 mg之劑量投與以便治療克羅恩氏病。
在另一實施例中，TNFα抗體在本發明之多變劑量方案中與另一治療劑組合投與以便治療哮喘。可用於減少或抑制哮喘之症狀之藥劑的實例包括下列各藥劑：舒喘寧(albuterol)；沙美特羅/氟替卡松；鈉；氟替卡松丙酸酯；布地奈德；潑尼松；沙美特羅羥萘甲酸鹽；鹽酸左旋沙丁胺醇；硫酸鹽/異丙托銨；潑尼龍磷酸鈉；曲安奈德；二丙酸倍氯米松；異丙托溴銨；阿奇黴素(Azithromycin)；吡布特羅乙酸酯；潑尼龍；無水茶鹼；紮魯司特；甲潑尼龍琥珀酸鈉；克拉黴素；福莫特羅反丁烯二酸鹽；流感病毒疫苗；甲潑尼龍；三水合物；過敏症注射劑；色甘酸鈉；頭孢丙烯；鹽酸菲索特非那定(fexofenadine hydrochloride)；氟尼縮松(flunisolide)/薄荷腦；左氧氟沙星；阿莫西林/棒酸鹽、吸入劑輔助裝置、愈創甘油醚(guaifenesin)、地塞米松磷酸鈉；鹽酸莫西沙星；hyclate；愈創甘油醚/d-甲嗎喃；加替沙星(gatifloxacin)；偽麻黃鹼/cod/氯芬尼(chlorphenir)；西替利嗪鹽酸鹽(cetirizine hydrochloride)；糠酸莫米他松(mometasone furoate)；沙美特羅羥萘甲酸鹽；苯佐那酯(benzonatate)；頭孢胺苄(cephalexin)；pe/氫可酮/氯芬尼；鹽酸西替利嗪/假麻黃素；苯腎上腺素/cod/異丙嗪；可待因/異丙嗪；氟尼縮松；地塞米松；愈創甘油醚/偽麻黃鹼；氯芬尼拉明/氫可酮；奈多羅米鈉(nedocromil sodium)；特布他林硫酸鹽；腎上腺素及甲潑尼龍、羥異丙腎上腺素硫酸鹽(metaproterenol sulfate)。
在另一實施例中，本發明TNFα抗體與另一治療劑組合投與以便治療COPD。可用於減少或抑制COPD之症狀之藥劑的實例包括：沙丁胺醇硫酸鹽/異丙托銨；異丙托溴銨；沙美特羅/氟替卡松；沙丁胺醇；沙美特羅；羥萘甲酸鹽；氟替卡松丙酸酯；潑尼松；無水茶鹼；左氧氟沙星；甲潑尼龍琥珀酸鈉；孟魯司特鈉(montelukast sodium)；布地奈德；福莫特羅反丁烯二酸鹽；曲安奈德；愈創甘油醚；阿奇黴素；倍氯米松；二丙酸酯；鹽酸左旋沙丁胺醇；氟尼縮松；鈉；三水合物；加替沙星；紮魯司特；糖酸鹽；阿莫西林/棒酸鹽；氟尼縮松/薄荷腦；氯芬尼拉明/氫可酮；羥異丙腎上腺素硫酸鹽；甲潑尼龍；麻黃鹼/cod/氯芬尼；吡布特羅乙酸酯；-麻黃鹼/洛拉他定；特布他林硫酸鹽；噻托溴銨；(R,R)-福莫特羅；TgAAT；西洛司特(Cilomilast)及羅氟司特(Roflumilast)。
在另一實施例中，本發明TNFα抗體與另一治療劑組合投與以便治療IPF。可用於減少或抑制IPF之症狀之藥劑的實例包括：潑尼松；硫唑嘌呤；沙丁胺醇；秋水仙鹼(colchicine)；硫酸鹽；地高辛(digoxin)；γ干擾素；甲潑尼龍琥珀酸鈉；呋喃苯胺酸；賴諾普利(lisinopril)；硝 酸甘油；螺內酯；環磷醯胺；異丙托溴銨；放線菌素D；阿替普酶(alteplase)；氟替卡松丙酸酯；左氧氟沙星；羥異丙腎上腺素硫酸鹽；硫酸嗎啡；鹽酸羥考酮；氯化鉀；曲安奈德；無水他克莫司；鈣；干擾素α；甲胺喋呤；黴酚酸酯。
在本發明之一實施例中，TNFα抗體與通常用以治療脊椎關節病之藥劑組合投與。該等藥劑之實例包括非類固醇、消炎藥物(NSAID)、COX 2抑制劑(包括Celebrex®、Vioxx®及Bextra®)及依託昔布。物理療法亦通常結合非類固醇發炎藥物常用以治療脊椎關節病。
在另一實施例中，本發明TNFα抗體可與另一治療劑組合投與以便治療強直性脊椎炎。可用於減少或抑制強直性脊椎炎之症狀之藥劑的實例包括布洛芬、雙氯芬酸及米索前列醇、萘普生、美儂西康、吲哚美辛、雙氯芬酸、賽利克西、羅非考昔、柳氮磺吡啶、潑尼松、甲胺喋呤、硫唑嘌呤、米諾環素、潑尼松、依那西普及英利昔單抗。
在另一實施例中，本發明TNFα抗體與另一治療劑組合投與以便治療牛皮癬性關節炎。可用於減少或抑制牛皮癬性關節炎之症狀之藥劑的實例包括甲胺喋呤；依那西普；羅非考昔；賽利克西；葉酸；柳氮磺吡啶；萘普生；來氟米特；甲潑尼龍乙酸酯；吲哚美辛；羥氯喹硫酸鹽；舒林酸；潑尼松；加強之倍他米松二丙酸鹽；英利昔單抗；甲胺喋呤；葉酸鹽；曲安奈德；雙氯芬酸；二甲亞碸；吡羅昔康；雙氯芬酸鈉；酮基布洛芬(ketoprofen)；美儂西康；潑尼松；甲潑尼龍；萘丁美酮；托美丁鈉；鈣泊三醇；環孢素；雙氯芬酸；鈉/米索前列醇；氟輕鬆；葡糖胺硫酸鹽；金硫丁二鈉；重酒石酸氫可酮/apap；布洛芬；利塞膦酸鈉；磺胺嘧啶；硫鳥嘌呤；伐地考昔；阿來塞普(alefacept)；及依法珠單抗(efalizumab)。
在一實施例中，TNFα抑制劑在本發明之多變劑量方案中繼治療冠心病之初始程序之後投與。該等程序之實例包括(但不限於)冠狀動脈 繞道移植術(CABG)及經皮經管腔冠狀動脈氣囊血管成形術(PTCA)或血管成形術。在一實施例中，投與TNFα抑制劑以預防狹窄復發。在本發明之另一實施例中，投與TNFα抑制劑以預防或治療再狹窄。本發明亦提供治療方法，其中TNFα抑制劑在接受治療冠心病之程序之受檢者動脈中插入支架之前、同時或之後投與。在一實施例中，支架係繼CABG或PTCA之後投與。
視所需治療之位點及性質而定，本發明之情形內可使用多種支架移植物。支架移植物可為(例如)分叉或導管移植物、圓柱狀或錐形、可自身膨脹或可氣囊膨脹、單身式或模組式。此外，支架移植物可適合於僅在末端處或沿支架移植物之整個本體釋放藥物。本發明之TNFα抑制劑亦可在支架上投與。在一實施例中，包括(例如)阿達木單抗/D2E7/HUMIRA®之TNFα抗體係經由溶離藥物之支架投與。
TNFα抗體可與另一治療劑組合投與以便治療再狹窄。可用於治療或預防再狹窄之藥劑的實例包括西羅莫司、紫杉醇、依維莫司(everolimus)、他克莫司、ABT-578及乙醯胺苯酚。
本發明TNFα抗體可與另一治療劑組合投與以便治療心肌梗塞。可用於治療或預防心肌梗塞之藥劑的實例包括阿司匹林、硝酸甘油、美托洛爾酒石酸鹽(metoprolol tartrate)、依諾肝素鈉(enoxaparin sodium)、肝素鈉、克羅匹多硫酸氫鹽(clopidogrel bisulfate)、卡維地洛(carvedilol)、阿替洛爾(atenolol)、硫酸嗎啡、美托洛爾琥珀酸鹽、華法林鈉(warfarin sodium)、賴諾普利、單硝酸異山梨酯、地高辛、呋喃苯胺酸、辛伐他汀、雷米普利、替奈普酶(tenecteplase)、依那普利順丁烯二酸酯、托西邁(torsemide)、瑞替普酶(retavase)、洛沙坦鉀、鹽酸喹那普利/碳酸鎂、布美他尼(bumetanide)、阿替普酶、依那普利拉、胺碘酮鹽酸鹽(amiodarone hydrochloride)、鹽酸替羅非班單水合物(tirofiban hcl m-hydrate)、地爾硫卓鹽酸鹽(diltiazem hydrochloride)、 卡托普利(captopril)、厄貝沙坦(irbesartan)、纈沙坦(valsartan)、普萘洛爾鹽酸鹽(propranolol hydrochloride)、福辛普利鈉(fosinopril sodium)、鹽酸利多卡因、埃替菲巴肽(eptifibatide)、頭孢唑林鈉(cefazolin sodium)、硫酸阿托平(atropine sulfate)、胺基己酸、螺內酯、干擾素、索他洛爾鹽酸鹽(sotalol hydrochloride)、氯化鉀、多庫酯鈉(docusate sodium)、鹽酸多巴酚丁胺(dobutamine hcl)、阿普唑侖(alprazolam)、普伐他汀鈉(pravastatin sodium)、阿托伐他汀鈣(atorvastatin calcium)、咪達唑侖鹽酸鹽(midazolam hydrochloride)、鹽酸哌替啶(meperidine hydrochloride)、二硝酸異山梨醇酯、腎上腺素、多巴胺鹽酸鹽、比伐盧定(bivalirudin)、羅素他汀(rosuvastatin)、依澤替米貝(ezetimibe)/辛伐他汀、阿伐麥布(avasimibe)、阿昔單抗(abciximab)及卡立泊來德(cariporide)。
本發明TNFα抗體可與另一治療劑組合投與以便治療絞痛。可用於治療或預防絞痛之藥劑的實例包括：阿司匹林；硝酸甘油；單硝酸異山梨酯；阿替洛爾；美托洛爾琥珀酸鹽；美托洛爾酒石酸鹽；胺氯地平苄磺酸鹽；地高辛；地爾硫卓鹽酸鹽；二硝酸異山梨醇酯；克羅匹多硫酸氫鹽；硝苯地平；阿托伐他汀鈣；氯化鉀；辛伐他汀；鹽酸維拉帕米(verapamil hcl)；呋喃苯胺酸；鹽酸普萘洛爾；卡維地洛；賴諾普利；螺內酯；二氫氯噻嗪；依那普利順丁烯二酸酯；馬多醇(madolol)；雷米普利(ramipril)；依諾肝素鈉；肝素鈉；纈沙坦；索他洛爾鹽酸鹽；非諾貝特(fenofibrate)；依澤替米貝；布美他尼；洛沙坦鉀；賴諾普利/二氫氯噻嗪；非洛地平(felodipine)；卡托普利；及比索洛爾反丁烯二酸鹽。
在本發明之一實施例中，TNFα抗體與通常用以治療C型肝炎病毒之藥劑組合投與。該等藥劑之實例包括干擾素α-2a、干擾素α-2b、干擾素α con1、干擾素α-n1、聚乙二醇化干擾素α-2a、聚乙二醇化干擾素 α-2b、病毒唑(Ribavirin)、聚乙二醇化干擾素α-2b及病毒唑、熊脫氧膽酸、甘草酸、胸腺法新(Thymalfasin)、二鹽酸組胺及VX-497。
TNFα抗體可與局部皮質類固醇、維生素D類似物及局部或口服類視色素或其組合組合投與以便治療牛皮癬。另外，TNFα抗體可與下列藥劑之一組合投與以便治療牛皮癬：KDR之小分子抑制劑(ABT-123)、Tie-2之小分子抑制劑、鈣泊三醇、丙酸氯氟美松、曲安奈德、鹵貝他索丙酸酯(halobetasol propionate)、他紮羅汀(tazarotene)、甲胺喋呤、氟輕鬆、加強之倍他米松二丙酸鹽、膚輕鬆(fluocinolone)、縮丙酮化物、阿曲汀(acitretin)、焦油香波、倍他米松戊酸鹽、糠酸莫米他松、酮康唑(ketoconazole)、普莫卡因/膚輕鬆、氫化可的松戊酸鹽、氟氫縮松、尿素、倍他米松、丙酸氯氟美松/emoll、氟替卡松丙酸酯、阿奇黴素、氫化可的松、活水配方、葉酸、地奈德(desonide)、煤焦油、二氟拉松二乙酸酯、依那西普、葉酸鹽、乳酸、甲氧沙林、hc/次沒食子酸鉍/znox/resor、甲潑尼龍乙酸酯、潑尼松、防曬劑、水楊酸、哈西奈德(halcinonide)、蒽三酚、氯可托龍特戊酸酯(clocortolone pivalate)、煤餾出物、煤焦油/水楊酸、煤焦油/水楊酸/硫、去羥米松(desoximetasone)、二氮雜環庚烷、潤膚劑、吡美莫司潤膚劑(pimecrolimus emollient)、氟輕鬆/潤膚劑、礦物油/蓖麻油/乳酸鈉、礦物油/花生油、石油/十四烷酸異丙酯、補骨脂素(psoralen)、水楊酸、肥皂/三溴沙侖(tribromsalan)、硫柳汞/硼酸、賽利克西、英利昔單抗、阿來塞普、依法珠單抗、他克莫司、吡美莫司、PUVA、UVB及其他光線療法及柳氮磺吡啶。
抗體、抗體部分可與其他藥劑組合使用以便治療皮膚病狀。例如，本發明之抗體、抗體部分或其他TNFα抑制劑與PUVA療法組合。PUVA為用以治療許多不同皮膚病狀之補骨脂素(P)與長波紫外輻射(UVA)之組合。本發明之抗體、抗體部分或其他TNFα抑制劑亦可與吡 美莫司組合。在另一實施例中，本發明抗體用以治療牛皮癬，其中抗體與他克莫司組合投與。在另一實施例中，他克莫司及TNFα抑制劑與甲胺喋呤及/或環孢素組合投與。在另一實施例中，本發明之TNFα抑制劑與準分子雷射治療一起施用以便治療牛皮癬。
TNFα抗體可與其組合以便治療皮膚或指甲病症之其他治療劑之非限制性實例包括UVA及UVB光線療法。可與TNFα抑制劑組合使用之其他非限制性實例包括抗IL-12及抗IL-18治療劑，包括抗體。
在一實施例中，TNFα抗體可與另一治療劑組合投與以治療白塞氏病。可用於治療白塞氏病之另一治療劑包括(但不限於)潑尼松、環磷醯胺(Cytoxan)、硫唑嘌呤(亦稱為硫唑嘌呤(imuran))、甲胺喋呤、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(亦稱為磺胺增效片A(bactrim)或美拉磺胺(septra))及葉酸。
單獨或以其組合方式之以上提及之治療劑之任一者可與TNFα抗體組合使用本發明之多變劑量治療方案向患TNFα起有害作用之TNFα相關病症之受檢者投與。在一實施例中，除TNFα抗體之外，單獨或以其組合方式之以上提及之治療劑之任一者可向罹患類風濕性關節炎之受檢者投與以便治療TNFα相關病症。應瞭解，其他治療劑不僅可用於如上所述之組合療法中，而且可用於本文中描述之需要有利效應之其他適應症中。
本發明進一步由下列不應視為具限制性之實例來說明。將在整個本申請案中所引用之所有參考文獻、專利及經公開之專利申請案的內容係以引入的方式併入本文中。
實例 實例1：阿達木單抗之純化程序
在此實例中，設計純化阿達木單抗與宿主細胞蛋白質(HCP)之混合物之純化方法，該方法稱為方法A。在方法A中，阿達木單抗-HCP 混合物未經受蛋白質A層析步驟。用於方法A之第一管柱為陽離子交換樹脂Fractogel S，阿達木單抗與其結合而HCP徑直流過。隨後阿達木單抗在第一溶離液中自Fractogel S管柱中溶離。接著，第一溶離液經受pH病毒滅活以便獲得病毒滅活製劑。接著，將病毒滅活製劑施加至陰離子離子交換樹脂Q瓊脂糖管柱，阿達木單抗並不與其結合，藉此獲得第一徑流。該第一流隨後施加至疏水相互作用管柱苯基瓊脂糖管柱，阿達木單抗與其結合且HCP徑直流過，藉此獲得第二溶離液。執行第二溶離液之進一步處理及封裝以便獲得最終瓶裝產物。
更詳細地，方法A包含下列步驟：步驟1：將100×20 cm(157 L)、v=175 cm/hr、裝載量30 g蛋白質/L樹脂/循環之Fractogel S管柱使用20 mM磷酸鈉、25 mM氯化鈉平衡。裝載阿達木單抗之後，將管柱用均衡緩衝液洗滌一次且用包含20 mM磷酸鈉、150 mM氯化鈉之溶離緩衝液溶離以便獲得第一溶離液；步驟2：脫脂過濾；步驟3：超濾；步驟4：在pH 3.5下pH滅活歷時1小時；在滅活完成之後，將pH調整為6.8至7.5，過濾器系列用兩體積之50 mM三乙醇胺洗滌；步驟5：將60×30 cm(85 L)、v=150 cm/hr、裝載量40 g蛋白質/L樹脂/循環之Q瓊脂糖FF管柱用包含25 mM三乙醇胺、40 mM氯化鈉，pH 7.6之均衡緩衝液平衡；獲得徑流；步驟6：將80×15 cm(75 L)、v=75 cm/hr(溶離37.5 cm/hr)、裝載量20-40 g蛋白質/L樹脂/循環之苯基瓊脂糖HP管柱用包含20 mM磷酸鈉、1.1 M(NH4)2SO4，pH 7之均衡緩衝液平衡，用均衡緩衝液洗滌一次且經由執行鹽階段梯度至11 mM磷酸鈉、0.625 M(NH4)2SO4，pH 7.0來溶離以藉此獲得第二溶離液，若裝載量35 g蛋白質/L樹脂則分餾產物； 步驟7：病毒過濾；步驟8：最終超濾/透濾；步驟9：最終裝瓶。
以下實例2中亦描述方法A之更多細節。
實例2：純化阿達木單抗以改良產率且減少雜質
在抗體阿達木單抗之製造方法，亦即以上實例1中描述之方法A中，在捕獲及精細純化操作中引入改良。改良方法於本文中稱為"方法B"，且包括下列總步驟：初始材料為由使用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞表現系統之醱酵過程獲得之混合物。混合物首先使用陽離子交換層析，亦即Fractogel S管柱分離，其中阿達木單抗被捕獲於管柱上(稱為"捕獲")。Fractogel S管柱上之裝載量由於移置而增加。洗滌Fractogel S管柱之改良方法用以減少宿主細胞蛋白質(HCP)的量。結合有阿達木單抗之Fractogel S管柱以複數個洗滌液洗滌，包括為包含45%溶離緩衝液及55%注射用水(WFI)之較高導電度洗滌液之中間洗滌液。繼捕獲及洗滌之後，使阿達木單抗自Fractogel S管柱中溶離且溶離液經受陰離子交換層析，亦即Q瓊脂糖管柱。在第一阿達木單抗溶離液在陰離子交換管柱上運作之前，溶離液使用基於pH值及導電度之改良方法使病毒滅活。在陰離子管柱之徑流中收集阿達木單抗製劑，且隨後進一步根據疏水相互作用層析，亦即苯基瓊脂糖管柱來分離。來自苯基瓊脂糖管柱之溶離液根據此項技術中之標準方法進一步進行病毒過濾、最終超濾及最終裝瓶處理。
方法B為達成HCP及原組織蛋白酶L含量減少之抗體製劑的改良純化方法。本文中描述之方法使用6000 L體積執行，然而應注意方法B中描述之改良可使用任何體積。方法A與方法B之改良之間的比較提供於表5中(方法B中之改良以粗體突出)：
以下更詳細地描述方法B中之各種步驟之改良：
陽離子層析
方法B之最初回收及捕獲操作包含深層過濾、Fractogel SO3 -陽離子交換層析(Fractogel S)，其中後者用來捕獲澄清之收穫物中之阿達木單抗及減少方法相關雜質(例如CHO宿主細胞及培養基雜質)。100 cm直徑×20 cm長之管柱(床體積157 L)用於此操作。將管柱以Fractogel S樹脂(EM Industries,Hawthorne,NY)填充且量測等效理論塔板(HETP) 之不對稱性及高度以確定填料之品質。隨後將管柱用1.0 M NaOH消毒1小時，且儲存於0.1 M NaOH中以待使用。
陽離子交換層析可受蛋白質裝載量、離子強度(經由所過濾收穫物之稀釋來控制)、pH值及線性速度的影響。蛋白質裝載量可影響選擇性、溶解(純度)及產率。裝填試樣之離子強度(經由裝載物之稀釋來控制)及pH值可影響結合力、選擇性、溶解及產率。線性速度可影響質量傳遞特性，潛在地導致結合減少及極高流動速率之溶解及極低流動速率之軸向分散。
Fractogel S管柱之最大裝載量增至35 g蛋白質/公升樹脂。將陽離子管柱用20 mM磷酸鈉、25 mM NaCl，pH 7平衡。繼均衡之後，將管柱用35 g蛋白質/L樹脂之稀釋之深層濾液裝載。一份深層濾液用大致1.3份水稀釋以使導電度降低至大致6.1 mS/cm。隨後管柱用均衡緩衝液繼之以用9 mM磷酸鈉、68 mM NaCl，pH 7(相當於45%溶離緩衝液，55% WFI)洗滌來洗滌至基線。產物用20 mM磷酸鈉、150 mM NaCl，pH 7(溶離緩衝液)以單一溶離份形式自管柱中溶離。產物集合自前緣及後緣兩者上之10%滿度偏轉之A280峰值產物中收集。管柱根據需要循環以處理粗阿達木單抗。來自每一管柱循環之Fractogel S溶離液集合至同一收集貯槽中。各循環之間，管柱用25 mM磷酸鈉、1.0 M NaCl，pH 7再生。
實驗室規模下執行之研究展示與先前建立之15至30 g蛋白質/L樹脂之可接受操作範圍(AOR)相比，產物有效回收及HCP減少可在較高裝載量範圍下達成。阿達木單抗透過量相對於管柱裝載量之分析表明所計算之5%透過量在pH 7下出現在38 g/L樹脂中。因此，對於Fractogel S層析步驟，建立35 g蛋白質/L樹脂之校正AOR。大體上，裝載量極限亦增至35公克蛋白質/公升樹脂以增加處理能力。
在另一組使用Fractogel樹脂之實驗中，檢驗pH對於阿達木單抗透 過量相對於管柱裝載量的效應。詳言之，產物透過曲線用以確定所界定之裝載量條件下樹脂動態結合能力。以下表6概述先前描述之pH 7條件下Fractogel裝載量研究之回收數據。10 g/L下之回收百分比標準化為100%。
Fractogel步驟產率50%，BR-068。
pH 7下之結果展示對於小於50 g阿達木單抗/公升Fractogel樹脂之裝載量條件觀察到大於90%阿達木單抗回收率。相對於裝載量繪製阿達木單抗透過量之曲線以產生理論透過曲線。pH 7下，發現理論10%透過係在54 g阿達木單抗/公升Fractogel樹脂下。亦在pH 7下，發現理論5%透過係在38 g阿達木單抗/公升Fractogel樹脂下，確認如上所述之結果。
除裝載物及第一洗滌pH條件調整至pH 5以外，如上所述進行相似研究。陽離子管柱用24 mM檸檬酸及51 mM磷酸氫二鈉，pH 5平衡。繼均衡之後，管柱以多達80 g蛋白質/L樹脂之稀釋之深層濾液裝載。在深層過濾之前，細胞培養收穫物之pH用3 M酸性酸調整至5.0。一份深層濾液以大致相同體積之水稀釋以使導電度降低至大致8至10 mS/cm。又，相對於裝載量繪製阿達木單抗透過量之曲線以產生理論透過曲線。在所研究條件下，發現理論10%透過係在大致74 g阿達木單抗/公升Fractogel樹脂下。發現理論5%透過係在大致73 g阿達木單抗/ 公升Fractogel樹脂下。歸因於樹脂之陽離子交換之特徵，降低層析條件之pH明顯增加阿達木單抗動態結合能力。比較pH 5及pH 7下之透過曲線，觀察到阿達木單抗分子與Fractogel樹脂之間之結合在較低pH下更強。亦發現，藉由在pH 5下較高裝載動態量，達成更佳HCP清除。以下表7概述新近測試之pH 5條件下Fractogel裝載量研究相對於存在於溶離液中之HCP的數據。數據清楚地表明在測試條件下，出現阿達木單抗移置HCP。
因為pH 5下之阿達木單抗透過量相對於管柱裝載量之分析指示所計算之5%透過出現在73 g/L樹脂下，對於pH 5下之Fractogel S層析步驟可建立70 g蛋白質/L樹脂之校正AOR。大體上，先前在pH 7下增至35公克蛋白質/公升樹脂之裝載量極限(如上所述)可藉由降低pH至5進一步增至70公克蛋白質/公升樹脂。
中間洗滌
為進一步減少阿達木單抗製劑中雜質的量，在阿達木單抗自陽離子管柱中溶離之前執行中間洗滌步驟(參見以下表8)。此另一洗滌相對於溶離緩衝液之導電度調整，且有助於改良HCP之清除。與方法A相比較，在溶離之前插入中間洗滌步驟減少阿達木單抗溶離之HCP的量達60%以上。所研究之參數包括用於洗滌液中之溶離緩衝液與水之摻合物(%溶離緩衝液)、導電度、pH值、洗滌液體積、流動速率及樹脂陳化。最佳洗滌液由45%溶離緩衝液(20 mM磷酸鈉、150 mM氯化鈉，pH 7)與55%水之摻合物組成。表8呈現在有及無另一洗滌的情況下Fractogel S溶離液中之HCP含量的比較數據。檢定Fractogel S溶離液試樣之HCP且與來自試驗規模Fractogel S處理(併有較高裝載量及洗滌步驟)之溶離液中之HCP含量相比較。試驗規模數據表明添加第二洗滌步驟明顯改良Fractogel S步驟對於HCP之清除。
各方法之Fractogel S層析步驟之典型溶離概況提供於圖1中。方法B包括在溶離之前之以上提及之中間額外洗滌步驟，因此與先前方法相比，溶離峰之前緣較陡，且所偵測之早期溶離物質較少。大體上，剛好在溶離阿達木單抗之前，將中間洗滌步驟引入Fractogel S步驟以改良諸如HCP之方法相關雜質之清除。
病毒滅活
方法B之低pH滅活步驟藉由使可存在於脫脂濾液中之潛在未偵測出之包膜病毒滅活來提供安全裕度。隨後使經病毒滅活之集合pH中和且過濾以移除微粒且使生物裝載物減到最少。在低pH病毒滅活期間阿 達木單抗之品質可受pH值及低pH培育之持續期間的影響。病毒滅活視該等前述的參數而定，且其可受在高濃度下可使滅活減弱之蛋白質濃度的影響。低pH下之最小培育時間自15分鐘增加至60分鐘。低pH步驟前後獲得之製造試樣之分析確認阿達木單抗可安全地保持在pH 3.5下歷時1小時而不損害其保護鼠類L929細胞免受腫瘤壞死因子(TNF)之細胞毒性效應影響的能力。
繼滅活之後，病毒滅活之溶離液之pH值及導電度根據例如Q瓊脂糖管柱之後繼管柱的均衡緩衝液來調整。將pH值調整至7.8-8.2，目標pH為8.0。大體上，充當Q瓊脂糖FF裝載物之經病毒滅活之集合的pH值及導電度調整至與Q瓊脂糖均衡緩衝液之pH值及導電度相配。
陰離子層析
陰離子管柱(亦即Q瓊脂糖)步驟用來減少諸如HCP(具體言之包括原組織蛋白酶L以及DNA及胰島素)之方法相關雜質。60 cm直徑×30 cm長之管柱(床體積85 L)用於Q瓊脂糖FF層析。將管柱用Q瓊脂糖FF樹脂(Amersham Pharmacia,Piscataway,NJ)填滿且量測不對稱性及HETP以確定填料之品質。隨後管柱用1.0 M NaOH消毒1小時，且儲存於25 mM磷酸鈉、20%異丙醇中以待使用。
樹脂之均衡係用25 mM三乙醇胺、40 mM NaCl，pH 8(均衡緩衝液)實現。該步驟之最大蛋白質裝載量40 g蛋白質/L樹脂/循環。方法相關雜質吸附至樹脂上，且阿達木單抗徑直流過管柱。通常以大致相等量之兩個循環處理經稀釋、經過濾之病毒滅活材料；可能需要額外循環以處理全部可用材料。在150 cm/hr下執行裝載及溶離，且當A280上升超出2%滿標度時收集管柱徑流。隨後管柱以均衡緩衝液洗滌且收集洗滌液直至A280恢復5%滿標度。洗滌液與徑流組合且稱為Q瓊脂糖FTW。諸循環之間，管柱使用25 mM磷酸鈉、1.0 M NaCl，pH 7再生，且隨後使用均衡緩衝液平衡。
以徑流方式運作之陰離子交換層析可受蛋白質裝載量、離子強度(導電度，其可能由低pH滅活濾液之稀釋度控制)、pH及線性速度的影響。蛋白質裝載量可影響選擇性及產率。裝載試樣之離子強度及pH可影響結合力及選擇性。線性速度可影響質量傳遞特性，潛在地導致極高流動速率下方法相關雜質之結合減少及極低流動速率下之軸向分散。已基於實驗室研究建立新裝載物之導電度及pH範圍。
實驗室研究指示由Q瓊脂糖FF步驟減少HCP可由裝載條件之變化來增進。所研究之參數包括裝載物之pH、導電度及每公升樹脂所裝載蛋白質之公克數。調整裝載物導電度及pH以匹配管柱均衡緩衝液之導電度及pH(5 mS/cm，pH 8)，且限制裝載量40 g阿達木單抗/L樹脂使得HCP及原組織蛋白酶L之清除得以改良。表9呈現在方法A(pH 7.7，導電度6.65 mS/cm)及方法B之pH 8及5 mS/cm之導電度之經改良方法條件下HCP得以減少的實驗室規模數據。將Q瓊脂糖管柱上之裝載量限制於40 g/L樹脂提供清除HCP之四倍改良且裝載物之pH值及導電度之額外改良又獲得HCP減少之三倍改良。
包含由離子交換管柱獲得之阿達木單抗的HCP經減少之徑流隨後用於疏水相互作用層析。
疏水相互作用層析
苯基瓊脂糖HP層析管柱之目的為進一步減少分別為諸如宿主細胞蛋白質及凝集物之方法相關雜質及產物相關雜質。80 cm直徑×15 cm 長之管柱(床體積75 L)用於此操作。將管柱用苯基瓊脂糖HP樹脂(Amersham Pharmacia,Piscataway,NJ)填滿且量測不對稱性及HETP以確定填料之品質。隨後將管柱用1.0 M NaOH消毒1小時，且儲存於25 mM磷酸鈉、20%異丙醇中以待使用。
樹脂之均衡係用20 mM磷酸鈉、1.1 M(NH4)2SO4，pH 7.0(均衡緩衝液)實現。該步驟之蛋白質裝載量為20至40 g蛋白質/L樹脂，且需要兩個或三個層析循環以處理全部數量之可用材料。管柱係以75 cm/hr之線性速度操作。Q瓊脂糖徑流以相等體積之40 mM磷酸鈉、2.2 M(NH4)2SO4，pH 7.0稀釋。繼裝載之後，將管柱以20 mM磷酸鈉、1.1 M(NH4)2SO4，pH 7.0洗滌。產物藉由執行鹽階段梯度至11 mM磷酸鈉、0.625 M(NH4)2SO4，pH 7.0來溶離。當吸光度上升超出50% UV滿標度時收集產物且持續直至當峰拖尾時吸光度降低至小於20% UV滿標度為止。
Fractogel S及Q瓊脂糖FF層析步驟之方法改良明顯減少分攤於苯基瓊脂糖HP步驟上之方法相關雜質減少之負擔。由於該等變化，苯基瓊脂糖HP步驟之主要功能為移除阿達木單抗凝集物。
方法A要求在35 g蛋白質/L樹脂或更高之管柱裝載量下，當UV吸光度上升超出50%滿刻度偏轉時收集產物且持續直至吸光度降低至<20%滿標度。在低於35 g蛋白質/L樹脂之管柱裝載量下，將首次0.15管柱體積之峰值溶離液自所收集之組合中排除以改良此步驟之HCP清除。在方法B中之先前層析步驟併入改良減輕對於低於35 g蛋白質/L樹脂之裝載量下峰值排除之需要，此歸因於引入之HCP裝載量明顯減少。HCP裝載量之減少允許在不分餾的情況下擴大裝載量範圍。此變化之效應允許藉由回收過程處理來自各醱酵作用之所有材料而無需苯基瓊脂糖HP峰值截斷。
在實驗室規模下研究苯基瓊脂糖操作之線性流速。阿達木單抗裝 載量保持不變且檢查25至125 cm/hr之流動速率。流動速率影響產物回收率但如藉由SEC(%單體)及HCP清除(表10)所評估沒有影響產物品質，此證明25至125 cm/hr之更廣泛範圍合適。苯基瓊脂糖製造操作之目標流動速率保持在如先前所建立之75 cm/hr及對於溶離階段之37.5 cm/hr下。
研究苯基瓊脂糖HP層析之可接受操作範圍。疏水相互作用層析可受蛋白質裝載量、離子強度(導電度)及線性速度的影響。蛋白質裝載量可影響選擇性及產率。裝載試樣之離子強度可影響結合力、選擇性及溶解。線性速度可影響質量傳遞特性，潛在地導致極高流動速率下方法相關雜質之溶解減少及極低流動速率下之軸向分散。線性流速範圍擴大為25至125 cm/hr。苯基瓊脂糖層析之其他可接受操作範圍相對於彼等先前對於6000 L方法所建立者無變化且列於表10中。
證明兩種方法中之精細純化操作之可比性效能。作為改良方法B之一部分所引入之變化包括：調整充當Q瓊脂糖FF裝載物之經病毒滅活之集合的pH值及導電度以匹配Q瓊脂糖均衡緩衝液；限制Q瓊脂糖裝載量小於40 g蛋白質/公升樹脂；及消除對於分餾小於35 g蛋白質/公升樹脂之裝載量下之苯基瓊脂糖溶離液的要求。如由SEC及WCX-10檢定所確定之中間物之品質在兩種方法之間具可比性。
各方法之Q瓊脂糖FF及苯基瓊脂糖HP層析步驟之典型溶離曲線 分別提供於圖2及3中。收集包含阿達木單抗之Q瓊脂糖徑流。歸因於先前層析步驟下之較大裝載量(Fractogel S)及增加之稀釋體積，方法B之裝載體積量與先前方法相比更高；因此總徑流體積相對較大。
大體上，歸因於由Fractogel S及Q瓊脂糖操作之變化引起之雜質清除改良，消除對於分餾小於35 g蛋白質/公升樹脂之裝載量之苯基瓊脂糖溶離液的要求。另外，線性流速範圍擴大為25至125 cm/hr。
HCP減少
方法B包括Fractogel S及Q瓊脂糖層析步驟之改良，其經實施以改良對於諸如宿主細胞蛋白質(HCP)及尤其原組織蛋白酶L之方法相關雜質之控制。進行研究以評估方法B對於此等雜質之移除的影響。在製造規模下評估Fractogel S、Q瓊脂糖FF及苯基瓊脂糖HP管柱移除CHO宿主細胞蛋白質之能力。宿主細胞蛋白質含量由HCP ELISA(參見實例3)測定且數據以ng HCP/mg阿達木單抗表達。
在方法B期間獲得代表性試樣且檢定HCP。結果呈現於表11中。層析步驟之變化提供將預期改良HCP清除之更嚴格的層析條件。所報導之脫脂過濾結果為來自方法A之彼等結果。脫脂過濾步驟為無變化之方法B，因此此步驟之所達成HCP減少因數包括於方法B之綜合效能中。平均而言，方法B能夠移除大於4.35 log10之HCP。Fractogel S層析與Q瓊脂糖FF層析清除超過1 log10 HCP，且深層過濾步驟亦清除超過1 log10。額外HCP由苯基瓊脂糖管柱移除，然而，不可計算清除值，此歸因於裝載量與溶離液HCP含量低於定量水準。方法B產生之藥物物質對於三個驗證批次展現低於定量極限(LOQ)之HCP含量。
HCP及原組織蛋白酶L含量之總改良亦分別展示於表12及13中，其中方法B與方法A相比展示兩種含量之顯著降低。
原組織蛋白酶L過程映射
處理中間試樣在若干步驟下獲得且分析由原組織蛋白酶L活化為組織蛋白酶L所產生之螢光。方法B及方法A試樣之結果展示於以下表14中。由於干擾該方法，不能評估Fractogel S裝載量及苯基瓊脂糖裝載量及溶離液試樣。Q瓊脂糖FF層析步驟具有移除裝載物中大於90%之可偵測酶的能力。與來自6000 L先前方法之Q瓊脂糖FTW相比，來自改良方法之Q瓊脂糖徑流及洗滌液(FTW)含有大致50%以下之可活化 原組織蛋白酶L。在Fractogel S與Q瓊脂糖步驟之間(在此期間，執行脫脂過濾、超濾濃縮、低pH病毒滅活及深層過濾操作)亦出現減少。
圖4中呈現方法A及B之原組織蛋白酶L減少之比較。在各中間步驟下，與方法A相比，方法B展現較低原組織蛋白酶L含量，表明Fractogel S及Q瓊脂糖層析步驟之改良改進關於移除此雜質之處理效能。
HCP過程映射
自方法A與方法B中收集處理中間試樣，且分析HCP含量。執行此研究以便直接比較兩方法之HCP減少。HCP分析之結果展示於表15中。HCP之顯著移除出現在兩方法中之Fractogel S及Q瓊脂糖步驟下，但方法B展現貫穿此等步驟兩者之HCP清除改良。包括在產物溶離之前之第二洗滌步驟之改良Fractogel S步驟具有減少因數96(1.96 log10)，而先前方法中之相同步驟獲得減少因數48(1.67 log10)。兩方法展現由在Fractogel S與Q瓊脂糖層析步驟之間執行之脫脂過濾實現之減少因數50。在將裝載物調整至管柱均衡緩衝液之pH值及導電度的情況下，執行方法B中之Q瓊脂糖操作。由改良Q瓊脂糖步驟達成之HCP減少因數比由先前方法展示之因數大4倍(21比5)。貫穿苯基瓊脂糖步驟出現進 一步減少以使得HCP之含量低於改良方法UF/DF集合及藥物物質中之定量水準；先前藥物物質試樣展現極低但可量測之HCP含量。
按照log10標度繪製曲線之方法B對比方法A中之HCP減少的比較展現於圖5中。在各中間步驟下，與方法A相比，方法B展現較低HCP含量，包括繼Q瓊脂糖步驟之後10倍差異，表明Fractogel S及Q瓊脂糖層析步驟之改良改進關於移除HCP之處理效能。
捕獲及精細純化操作對處理能力之影響
引入兩個變化以增加方法B中捕獲及精細純化操作之處理能力。第一者為Fractogel S管柱上容許裝載量極限在pH 7下自30 g蛋白質/L樹脂增加至35 g蛋白質/L樹脂及在pH 5下自30 g蛋白質/L樹脂增加至70 g蛋白質/L樹脂。此等變化允許來自生物反應器之所有過濾收穫物材料裝載於Fractogel S管柱上。Fractogel S管柱上之平均裝載量在改良方法(在pH 7下)中比先前方法中之裝載量高大致9%(表16)。
第二變化為移除對於分餾小於35 g蛋白質/L樹脂之裝載量之苯基瓊脂糖峰值產物之要求。分餾導致為了適當地控制宿主細胞蛋白質而丟棄大量部分峰值產物。在Fractogel S及Q瓊脂糖步驟下為控制宿主細胞蛋白質及原組織蛋白酶L含量所實施之變化使得不需要分餾峰值苯基瓊脂糖。此變化允許以方法B之較低裝載量範圍運作苯基瓊脂糖管柱之三個循環，導致與方法A相比苯基瓊脂糖管柱上之總裝載量增加12%。
表16將來自經改良方法及先前方法之Fractogel S及苯基瓊脂糖管柱上之裝載量以及最終藥物物質量作比較。經改良方法對於三個驗證批次展現大致8%之阿達木單抗產率總增加。
純化抗體阿達木單抗之改良方法改良HCP及原組織蛋白酶L之清除(相對於方法A)，導致在藥物物質中之含量減少。更特定言之，在藥物物質批次釋放數據之比較中，如表17中所述，測定HCP及原組織蛋白酶L之以下含量。
執行使用方法B產生之藥物物質之擴展表徵。分析來自三個驗證批次之藥物物質且將其與阿達木單抗參考標準相比，其使用包括胺基酸分析、圓二色性、分析離心分離、QSTAR LC質譜分析、使用MS偵測之非還原胰蛋白酶及LYS C肽製圖、游離氫硫基檢定、使用MS偵測之胰蛋白酶肽製圖、免疫印跡、L929生物檢定及BIAcore之檢定。所有批次由改良方法製造之藥物物質均符合接收標準且可與參考標準相比。
大體上，在醱酵作用、捕獲及精細純化階段下，方法B已展示可與方法A相比之效能。然而，方法B展現關於減少宿主細胞蛋白質及原組織蛋白酶L以及增加阿達木單抗產率容量之改良能力。藥物物質釋放測試及擴展特徵研究進一步證明由方法B產生之阿達木單抗藥物物質與由方法A產生之藥物物質之可比性。
實例3：HCP偵測之檢定
以下實例描述測定由實例2中描述之方法B獲得之阿達木單抗藥物物質試樣中之殘餘宿主細胞蛋白質(HCP)濃度之HCP ELISA方法。酶聯免疫吸附檢定(ELISA)用以將包含HCP抗原之試樣插入於雙層特定抗體之間。此舉之後為以酪蛋白阻斷非特異性位點。隨後培育試樣，在此期間，抗原分子由第一抗體(經親和力純化之塗佈抗體Cygnus山羊抗CHO(中國倉鼠卵巢))捕獲。隨後添加固定至抗原(CHO宿主細胞蛋白質)上之第二抗體(經生物素標記之抗CHO宿主細胞蛋白質)。重要地，由用以產生抗體之細胞產生對HCP具有特異性的第二抗體。添加與經生物素標記之抗CHO宿主細胞蛋白質結合之與HRP結合的中性抗生物素蛋白。隨後添加K藍色受質。產色受質由與結合酶結合之抗體水解，產生藍色。反應以2 M H3PO4停止，顏色變為黃色。色彩強度與孔所結合之抗原的量成正比。HCP ELISA展示與標準ELISA方法相比之測定抗體製劑中之HCP含量的改良。
實例4：組織蛋白酶L動態檢定
開發動態檢定且用以量化方法B之阿達木單抗製造過程中間物之組織蛋白酶L活性(參見實例2)。用以量測藥物物質釋放測試之HCP的弱陰離子交換HPLC檢定(WAX-10 HPLC)不能用於此研究，此歸因於處理中試樣之變化蛋白質含量及緩衝液組成可能干擾該方法。不能直接測定過程中間物中之原組織蛋白酶L之數量導致開發藉由動態螢光法量測組織蛋白酶L之活性之檢定。與用以偵測原組織蛋白酶L含量之標準方法相比，動態檢定(亦即高產量螢光酶催法)具有處理中試樣的更少干擾。動態檢定亦提供檢驗實例1及2中描述之純化阿達木單抗處理中試樣之方法可靠性的手段。
此方法藉由添加硫酸葡聚糖迫使試樣中之原組織蛋白酶L活化為組織蛋白酶L。螢光肽受質，Z-白胺酸-精胺酸-AMC(7-胺基-4-甲基香 豆素)用以在激發380 nm及發射460 nm下偵測組織蛋白酶L活性。試樣中之螢光活性水準藉由每秒裂解該受質所產生之螢光信號之斜率測定。測定此螢光活性檢定之範圍在0.0144至1.04 RFU/sec之間。此活性與存在於試樣中之阿達木單抗的量相關連；因此結果報導為RFU/sec/mg阿達木單抗。使用源自JMP軟體之DOE實驗開發用於各過程中間物試樣之達成最大螢光信號的最佳活化條件。此檢定之推薦活化條件概括於表16中。
物質及方法 製備500 mM DTT儲備溶液
將7.7公克之Ultrapure DTT(Invitrogen)添加至90 mL Milli-Q水中且混合直至均質。將溶液以Milli-Q水裝滿至100 mL之最終體積。隨後將此500 mM DTT備料等分且保存在-80℃下。
製備活化緩衝液(25 mM NaOAc、5 mM DTT、1 mM EDTA pH 5.5)
將3.44公克之乙酸鈉(J.T.Baker)、0.38公克之EDTA(J.T.Baker)及950 mL Milli-Q水添加至適當容器中且混合直至完全均質。將緩衝液之pH以1 M HCl調整至5.5，且使其達到量瓶中之1 L之最終體積。緩衝液經0.22 μm過濾器過濾且在使用之前保存在4℃下。在使用日，將500 μL之DTT儲備溶液(如上所述500 mM)添加至50 mL之緩衝液中達成5 mM之最終濃度。
製備硫酸葡聚糖+0.1%疊氮化鈉儲備溶液
1公克之硫酸葡聚糖(EM Science)添加至90 mL Milli-Q水中且混合直至均質。添加來自1 mg/mL儲備溶液之100 μL疊氮化鈉(J.T.Baker)。將溶液裝滿至100 mL之最終體積。隨後將該溶液等分且保存在-80℃。
動態檢定方案
待測試組織蛋白酶L活性之試樣需要將酶原(原組織蛋白酶L)活化為活性酶(組織蛋白酶L)。此舉藉由將試樣稀釋於活化緩衝液中、添加 硫酸葡聚糖及在37℃培育歷時合適時間來實現(以下詳細討論)。活化之後，試樣可保存在-80℃且保持穩定。所測定之處理中試樣之最佳活化條件展示於表18中。
在測試之日，將測試試樣之等分樣自-80℃中移出且於冰浴中解凍。一旦試樣解凍，則將(2×)100 μL之每一試樣裝載入黑色聚苯乙烯微量滴定盤中(Corning目錄號3650)。將Z-L-R-AMC螢光肽受質VII(R&D Systems)之等分試樣解凍同時避光保存。將受質以乙酸鹽緩衝液稀釋1：1350至20 μM之最終濃度。將100 μL之螢光受質添加至每一孔中。隨後將板混合約1秒且在37℃培育3分鐘，同時避光保存。隨後將板置於已設定於37℃之螢光板讀取器中。激發波長設定為380 nm且發射設定為460 nm。歷時30分鐘每3分鐘量測每一孔之螢光且計算受質水解之比率。將考慮稀釋因子之結果隨後除以阿達木單抗濃度來作對比。使用此動態檢定之結果如上實例2中所述。
使用1.39之消光係數藉由A280測定阿達木單抗濃度。使用Poros A分析對於研究試樣執行阿達木單抗定量。應用試樣稀釋以達成標準曲線內之示數。Shimadzu HPLC系統與Poros A ImmunoDetection感應器筒一起組態(Applied Biosystems,Foster City,CA)。管柱維持在環境溫度下。系統以2毫升/分鐘運作。自動採樣器料盤溫度設定在4℃。在280 nm下監控吸光度。緩衝液A為1X PBS；緩衝液B為0.1 M乙酸及150 mM氯化鈉。注射試樣且使用100%緩衝液B溶離阿達木單抗。
圖6中展示使用Fractogel裝載物(參見第一溶離液實例2；方法B)之螢光肽自由CHO細胞表現阿達木單抗所獲得之材料的轉換。此試樣以使用0.5 μg/mL硫酸葡聚糖之活化緩衝液稀釋至200 μg/mL、50 μg/mL及20 μg/mL之阿達木單抗，且在37℃下培育16小時。此批次在50 μg/mL及20 μg/mL下展示線性反應。R2值0.99。然而，在200 μg/mL下之批次在接近於30分鐘量測時間結束時展示非線性受質轉換，產生0.91之較低R2值。因此，小心稀釋試樣對於保持線性水解比率至關重要。
亦執行檢定以確定使用組織蛋白酶活性來測定原組織蛋白酶A之含量的動態檢定服從ICH準則，包括包含再現性精確度之精確度分析。此外，判定例如玻璃及聚丙烯小瓶之容器類型影響組織蛋白酶L活性。結果表明與玻璃容器相對照當在聚丙烯容器中培育時達成較高含量之組織蛋白酶L。在兩種情況中，為在pH 5.5下活化原組織蛋白酶L，需要添加0.5 μg/mL硫酸葡聚糖。
大體上，動態檢定之精確度證明此檢定對於偵測阿達木單抗過程中間物之潛在組織蛋白酶L活性有效。
圖7-18
使用包括HCP ELISA、偵測原組織蛋白酶L之動態檢定，及純化抗體以使得HCP含量減少之方法的本發明方法之其他結果亦展示於圖7-18中，其完全併入本文中。
此申請案涉及美國專利第6,090,382號、第6,258,562號及第6,509,015號。此申請案亦涉及2001年3月7日申請之美國專利申請案第09/801,185號；2002年11月22日申請之美國專利申請案第10/302,356號；2002年6月5日申請之美國專利申請案第10/163657號；及2002年4月26日申請之美國專利申請案第10/133715號；2002年8月16日申請之美國專利申請案第10/222140號；2003年10月24日申請之美國專利申請案第10/693233號；2003年7月18日申請之美國專利申請案第10/622932 號；2003年7月18日申請之美國專利申請案第10/623039號；2003年7月18日申請之美國專利申請案第10/623076號；2003年7月18日申請之美國專利申請案第10/623065號；2003年7月18日申請之美國專利申請案第10/622928號；2003年7月18日申請之美國專利申請案第10/623075號；2003年7月18日申請之美國專利申請案第10/623035號；2003年7月18日申請之美國專利申請案第10/622683號；2003年7月18日申請之美國專利申請案第10/622205號；2003年7月18日申請之美國專利申請案第10/622210號；及2003年7月18日申請之美國專利申請案第10/623318號。此申請案亦涉及2005年4月11日申請之PCT/US05/12007。此等專利及專利申請案之每一者的整個內容據此以引入的方式併入本文中。
等效物
熟習此項技術者將認識到或能夠僅僅使用常規實驗來確定本文中所述之本發明之特定實施例的許多等效物。該等等效物意欲包涵於下列申請專利範圍中。將在整個本申請案中所引用之所有參考文獻、專利及經公開之專利申請案的內容以引入的方式併入本文中。
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3C-H2重鏈可變區CDR3
<400> 34
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH1-D2.N重鏈可變區CDR3
<400> 35
<210> 36
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗輕鏈可變區
<400> 36
<210> 37
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗重鏈可變區
<400> 37

Claims (73)

  1. 一種用以從包含抗體及至少一種宿主細胞蛋白質(host-cell protein；HCP)之混合物製備HCP經減少之抗體製劑之方法，該方法包含：(a)將該混合物施加至均衡緩衝液中之第一離子交換樹脂，其中每公升樹脂係施加大於30公克抗體；(b)以複數個洗滌步驟洗去該樹脂中之HCP；及(c)以溶離緩衝液從該樹脂中溶離出該抗體，以形成第一溶離液，如此該HCP經減少之抗體製劑便可獲得。
  2. 如請求項1之方法，其中每公升樹脂係施加約35-70公克抗體。
  3. 如請求項1之方法，其中每公升樹脂係施加約70公克抗體。
  4. 如請求項1之方法，其中將該包含抗體及至少一種HCP之混合物施加至該第一離子交換樹脂之前，該混合物並未經受蛋白質A捕獲。
  5. 如請求項1之方法，其中該複數個洗滌步驟包含至少第一洗滌及第二洗滌，其中在該第一洗滌至該第二洗滌過程中導電度有增加。
  6. 如請求項5之方法，其中該第一洗滌係使用均衡緩衝液，而該第二洗滌係使用溶離緩衝液與水之混合物。
  7. 如請求項6之方法，其中該溶離緩衝液與水之混合物包含約40-50%溶離緩衝液與約50-60%水。
  8. 如請求項7之方法，其中該溶離緩衝液與水之混合物包含約45%溶離緩衝液與約55%水。
  9. 如請求項8之方法，其中該溶離緩衝液包含20 mM磷酸鈉及150 mM氯化鈉。
  10. 如請求項1之方法，其係在pH 7下進行。
  11. 如請求項1之方法，其係在介於約pH 5與約pH 7之間之pH下進行。
  12. 如請求項1之方法，其係在pH 5下進行。
  13. 如請求項1之方法，其中該第一離子交換樹脂為陽離子交換樹脂。
  14. 如請求項13之方法，其中該陽離子交換樹脂係構組成一管柱，且該包含該抗體與至少一種HCP之混合物係施加至該管柱。
  15. 如請求項14之方法，其中該陽離子交換樹脂包含一以合成甲基丙烯酸酯為基礎之聚合樹脂，該樹脂與一磺酸酯基連接。
  16. 如請求項1之方法，其進一步包含將該第一溶離液經受一病毒滅活步驟。
  17. 如請求項16之方法，其中病毒滅活係藉由pH病毒滅活作用達成，以形成病毒滅活製劑。
  18. 如請求項17之方法，其中該病毒滅活製劑係施加至第二離子交換樹脂，其中將該病毒滅活製劑施加至該第二離子交換樹脂之前，該病毒滅活製劑之pH及導電度係經調整至與該第二離子交換樹脂之pH及導電度大體上相似。
  19. 如請求項18之方法，其中該第二離子交換樹脂之pH係在約pH 7.7至約pH 8.3範圍內，且該病毒滅活製劑之pH係經調整至在約pH 7.7至約pH 8.3範圍內。
  20. 如請求項19之方法，其中該第二離子交換樹脂之pH為約pH 8.0，且該病毒滅活製劑之pH係經調整至約pH 8.0。
  21. 如請求項18之方法，其中該第二離子交換樹脂之導電度係在約3.5 mS/cm至約5.2 mS/cm之範圍內，且該病毒滅活製劑之導電度係經調整至在約3.5 mS/cm至約5.2 mS/cm之範圍內。
  22. 如請求項21之方法，該第二離子交換樹脂之導電度為約5.0 mS/cm，且該病毒滅活製劑之導電度係經調整至約5.0 mS/cm。
  23. 如請求項18之方法，其中該第二離子交換樹脂為陰離子交換樹脂。
  24. 如請求項23之方法，其中該陰離子交換樹脂為Q瓊脂糖樹脂。
  25. 如請求項18之方法，其中該第二離子交換樹脂係構組成一管柱，且該病毒滅活製劑係施加至該管柱，如此第一徑流便可獲得。
  26. 如請求項25之方法，其中該第一徑流係施加至一疏水性相互作用管柱，如此第二溶離液便可獲得。
  27. 如請求項26之方法，其中該疏水性相互作用管柱為苯基瓊脂糖管柱。
  28. 如請求項26之方法，其中該施加至該疏水性相互作用管柱之第一徑流包含約20至約40公克抗體/公升疏水性相互作用管柱材料。
  29. 如請求項28之方法，其中該施加至該疏水性相互作用管柱之第一徑流包含約30至約36公克抗體/公升疏水性相互作用管柱材料。
  30. 如請求項26之方法，其中該第二溶離液並未經受峰值產物分餾。
  31. 如請求項1之方法，其包含：(a)將該混合物施加至均衡緩衝液中之陽離子交換樹脂中，其中該混合物在施加至該陽離子交換樹脂之前並未經受蛋白質A捕獲，且其中每公升樹脂係施加大於30公克抗體；(b)以複數個洗滌步驟洗去該陽離子交換樹脂中之HCP；(c)以溶離緩衝液溶離出該陽離子交換樹脂中之該抗體，以形成第一溶離液；(d)使該第一溶離液經受一病毒滅活步驟；(e)將該病毒滅活製劑施加至陰離子交換樹脂，以獲得第一徑流；及(f)將該第一徑流施加至一疏水性相互作用管柱，以便獲得第二溶離液； 如此該HCP經減少之抗體製劑便可獲得。
  32. 如請求項31之方法，其中該陽離子交換樹脂係在pH 7下，且每公升樹脂係施加約35公克抗體。
  33. 如請求項31之方法，其中該陽離子交換樹脂係在pH 5下，且每公升樹脂係施加約70公克抗體。
  34. 如請求項31之方法，其中該複數個洗滌步驟包含以一使用該均衡緩衝液之第一洗滌及一使用該溶離緩衝液與水之混合物的第二洗滌來洗滌該樹脂。
  35. 如請求項34之方法，其中該溶離緩衝液與水之混合物包含約40-50%溶離緩衝液及約50-60%水。
  36. 如請求項31之方法，其中將該病毒滅活製劑施加至該陰離子離子交換樹脂之前，該病毒滅活製劑之pH及導電度係經調整至與該陰離子交換樹脂之pH及導電度大體上相似。
  37. 如請求項31之方法，其中如藉由HCP ELISA所測定，該第一溶離液包含之HCP較該混合物所含者少約90至約100倍。
  38. 如請求項31之方法，其中如藉由HCP ELISA所測定，該第一徑流包含之HCP較該第一溶離液所含者少約840至約850倍。
  39. 如請求項31之方法，其中如藉由HCP ELISA所測定，該第二溶離液包含之HCP較該第一徑流所含者少約3至約5倍。
  40. 如請求項1之方法，其包含：(a)將該混合物施加至均衡緩衝液中之陽離子交換樹脂中，其中該陽離子交換樹脂係在pH 7下，且每公升樹脂施加約35公克抗體，或該陽離子交換樹脂係在pH 5至pH 7範圍內之pH下，且每公升施加約35至約70公克抗體，或該陽離子交換樹脂係在pH 5下，且每公升施加約70公克抗體；(b)以包含一使用該均衡緩衝液之第一洗滌及一使用溶離緩衝 液與水之混合物之第二洗滌的洗滌步驟洗去該陽離子交換樹脂中之HCP；(c)以該溶離緩衝液溶離出該陽離子交換樹脂中之該抗體，以形成第一溶離液；(d)使該第一溶離液經受一病毒滅活步驟，其中病毒滅活藉係由pH病毒滅活達成，以形成病毒滅活製劑；(e)將該病毒滅活製劑施加至陰離子交換樹脂，其中在將該病毒滅活製劑施加至該陰離子離子交換樹脂之前，該病毒滅活製劑之pH及導電度係經調整至與該陰離子交換樹脂之pH及導電度大體上相似，以便獲得第一徑流；及(f)將該第一徑流施加至一疏水性相互作用管柱，以便獲得第二溶離液；如此該HCP經減少之抗體製劑便可獲得。
  41. 如請求項40之方法，其中該抗體混合物在施加至該陽離子交換樹脂之前並未經受蛋白質A捕獲。
  42. 如請求項40之方法，其中該溶離緩衝液與水之混合物包含約40-50%溶離緩衝液與約50-60%水。
  43. 如請求項40之方法，其中如藉由HCP ELISA所測定，該第一溶離液包含之HCP較該混合物所含者少約90至約100倍。
  44. 如請求項40之方法，其中如藉由HCP ELISA所測定，該第一徑流包含之HCP較該第一溶離液所含者少約840至約850倍。
  45. 如請求項40之方法，其中如藉由HCP ELISA所測定，該第二溶離液包含HCP較該第一徑流所含者少約3至約5倍。
  46. 如請求項1-45中任一項之方法，其中該HCP包含原組織蛋白酶L，如此原組織蛋白酶L經減少之抗體製劑便可獲得。
  47. 如請求項46之方法，其中如藉由組織蛋白酶L動態檢定所量測， 該第一溶離液所包含之組織蛋白酶L活性範圍介於約25至約60 RFU/s/mg抗體之間。
  48. 如請求項46之方法，其中如藉由組織蛋白酶L動態檢定所量測，該第一徑流所包含之組織蛋白酶L活性範圍介於約0.4至約4 RFU/s/mg抗體之間。
  49. 如請求項46之方法，其中如藉由組織蛋白酶L動態檢定所量測，該第二溶離液所包含之組織蛋白酶L活性範圍介於約0.5至約1.5 RFU/s/mg抗體之間。
  50. 如請求項46-49中任一項之方法，其中原組織蛋白酶L之含量係為重現地降低。
  51. 如請求項1-45中任一項之方法，其中該抗體為抗腫瘤壞死因子α(TNFα)抗體或其抗原結合部分。
  52. 如請求項51之方法，其中該抗TNFα抗體或其抗原結合部分為人源化抗體、嵌合抗體或多價抗體。
  53. 如請求項51之方法，其中該抗TNFα抗體或其抗原結合部分為英利昔單抗(infliximab)或高利木單抗(golimumab)。
  54. 如請求項51之方法，其中該抗TNFα抗體或其抗原結合部分為人類抗體。
  55. 如請求項54之方法，其中該抗TNFα抗體或其抗原結合部分為經分離人類抗體，其係以兩者均藉由表面電漿共振所測定之1×10-8 M或更小之Kd及1×10-3 s-1或更小之Koff速率常數自人類TNFα解離，且在一標準活體外L929檢定中以1×10-7 M或更小之IC50中和人類TNFα細胞毒性。
  56. 如請求項54之方法，其中該抗TNFα抗體或其抗原結合部分為具有以下特性之經分離人類抗體：a)以如藉由表面電漿共振所測定之1×10-3 s-1或更小之Koff速 率常數自人類TNFα解離；b)具有一輕鏈CDR3域，該輕鏈CDR3域包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列，或藉由在位置1、4、5、7或8上之單一丙胺酸取代或藉由在位置1、3、4、6、7、8及/或9上之一至五次保守胺基酸取代自SEQ ID NO：3修飾而得；c)具有一重鏈CDR3域，該重鏈CDR3域包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列，或藉由在位置2、3、4、5、6、8、9、10或11上之單一丙胺酸取代或藉由在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11及/或12上之一至五次保守胺基酸取代自SEQ ID NO：4修飾而得。
  57. 如請求項54之方法，其中該抗TNFα抗體或其抗原結合部分為經分離人類抗體，其具有一包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之輕鏈可變區(LCVR)及一包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區(HCVR)。
  58. 如請求項54之方法，其中該抗TNFα抗體或其抗原結合部分為阿達木單抗(adalimumab)。
  59. 一種使用如請求項1-45中任一項之方法產生之抗體製劑，如藉由HCP ELISA所量測，其大體上不含HCP。
  60. 一種醫藥組合物，其包含使用如請求項1-45中任一項之方法產生之HCP經減少之抗體製劑及醫藥學上可接受之載劑。
  61. 一種醫藥組合物，其包含HCP經減少之抗體及醫藥學上可接受之載劑，其中如藉由HCP ELISA所量測，所包含之HCP含量不大於約70 ng HCP/mg毫克抗體。
  62. 如請求項61之醫藥組合物，其中如藉由HCP ELISA所量測，所包含之HCP含量不大於約13 ng HCP/mg抗體。
  63. 如請求項61之醫藥組合物，其中如藉由HCP ELISA所量測，所包含之HCP含量不大於約5 ng HCP/mg抗體。
  64. 一種包含抗體之組合物，其中如藉由HCP ELISA檢定所測定，該組合物不含可偵測含量之HCP。
  65. 一種使用如請求項1-45中任一項之方法產生之抗體製劑，其大體上不含原組織蛋白酶L。
  66. 一種醫藥組合物，其包含使用如請求項1-45中任一項之方法產生之原組織蛋白酶L經減少之抗體製劑及醫藥學上可接受之載劑。
  67. 一種醫藥組合物，其包含抗體原組織蛋白酶L經減少之抗體及醫藥學上可接受之載劑，其中原組織蛋白酶L之含量以組織蛋白酶活性計不大於約3.0 RFU/s/mg抗體。
  68. 如請求項59-67中任一項之組合物或製劑，其中該抗體為抗腫瘤壞死因子α(TNFα)抗體或其抗原結合部分。
  69. 一種治療其中TNFα活性會起有害作用之病症的方法，其包含向人類受檢者投與如請求項68之組合物或製劑。
  70. 一種製品，其包含包裝材料、阿達木單抗及該包裝材料內所含之標籤或包裝說明書，該標籤或包裝說明書指明該阿達木單抗調配物包含不超過約70 ng HCP/mg阿達木單抗。
  71. 一種製品，其包含包裝材料、阿達木單抗及該包裝材料內所含之標籤或包裝說明書，該標籤或包裝說明書指明該阿達木單抗調配物包含不超過約13 ng HCP/mg阿達木單抗。
  72. 一種製品，其包含包裝材料、阿達木單抗及該包裝材料內所含之標籤或包裝說明書，該標籤或包裝說明書指明該阿達木單抗調配物包含不超過約5 ng HCP/mg阿達木單抗。
  73. 一種製品，其包含包裝材料、阿達木單抗及該包裝材料內所含之標籤或包裝說明書，該標籤或包裝說明書指明該阿達木單抗調配物所包含之原組織蛋白酶L含量不超過由約3.0 RFU/s/mg阿達木單抗之組織蛋白酶L活性所指示的含量。
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