TW201329238A - 變異型木聚糖酶、其製造方法及用途、以及木質纖維素之糖化物製造方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種木質纖維素之糖化物製造方法，係包含使木質纖維素原料與熱穩定性木聚糖酶接觸的步驟。

Description

變異型木聚糖酶、其製造方法及用途、以及木質纖維素之糖化物製造方法

本發明係關於從木質纖維素原料有效率地製造糖化物之方法。又，本發明係關於變異型木聚糖酶、變異型木聚糖酶之製造方法及變異型木聚糖酶之用途。

木聚糖酶係將構成植物細胞壁之木聚糖之β-1,4鍵隨機水解的酵素。該酵素期待利用於a)木質纖維素原料之糖化、b)漿泥(pulp)漂白、c)動物飼料添加劑、d)清潔劑輔助劑及e)製麵包改質劑這些廣泛用途。

a)木質纖維素原料之糖化：已知有從木質纖維素原料使用酵素產生成為發酵基質之單糖的木質纖維素原料之糖化方法。但是該糖化方法可使用的纖維素酶、半纖維素酶(木聚糖酶等)的酵素價格高，為該糖化方法實用化的阻礙。而作為減低該糖化方法之成本的有效方法，有人提出將在該糖化方法中使用之酵素予以再利用(例如參考日本特開2006-87319號公報(專利文獻1)、國際公開第2011-065449號小冊(專利文獻10)及國際公開第2011-125056號小冊(專利文獻11))。

木聚糖酶係將為木質纖維素原料之一主成分之半纖維素(主成分β-1,4 木聚糖)切斷的酵素。所以在木質纖維素原料之糖化方法中，為一重要酵素。但是木聚糖酶已知穩定性低。

另一方面，木質纖維素原料之糖化，需要在酸性區pH4.0~pH6.0於40℃~60℃的高溫下處理數日。所以，木聚糖酶之穩定性低會妨礙酵素再利用。

Trichoderma reesei(以下簡稱為「T.reesei」)來源的耐熱性木聚糖酶變異體(例如參照國際公開第2007/115391號小冊(專利文獻2)及國際公開第2007/115407號小冊(專利文獻3)。)，即使於50℃~70℃經過30分鐘熱處理後仍顯示80%以上之殘存活性。

又，桿菌(Bacillus)屬來源之耐熱性木聚糖酶(例如參照日本特開2004-121257號公報(專利文獻4))，亦為已知在70℃、30分鐘之熱處理後顯示90%以上之殘存活性。

b)漿泥漂白：已知於漿泥之漂白步驟藉由使用木聚糖酶，可減少漂白藥劑之使用量。

一般而言，在製紙工業中，漿泥漂白係由前段之利用氧從漿泥脫去木質素(pH10~pH12、80℃)之處理步驟及後段之漂白步驟構成。以此方式於後段實施漂白步驟之理由在於：即使經過利用氧的脫木質素之步驟後仍有約數%之木質素殘存於漿泥中作為著色成分。脫木質素處理步驟及漂白步驟以外，藉由再追加使木聚糖酶作用的步驟，可將於木質素及纖維素鍵結的半纖維素鏈切斷。藉此能有效去除木質素，可期待有減少漂白步驟使用之漂白藥劑之使用量的效果。

為了以良好效率實施前述使木聚糖酶作用的步驟，需使用具有於70℃~80℃、pH10附近能耐受數小時處理之特性的木聚糖酶。

T.reesei來源之耐熱性木聚糖酶變異體(例如參照專利文獻2、專利文獻3、國際公開第2001/92487號小冊(專利文獻5)及國際公開第2003/046169號小冊(專利文獻6))，最適反應溫度為70℃附近，最適反應pH為7~8，顯示在漿泥漂白步驟可利用。

c)動物飼料添加劑：動物飼料由於植物纖維豐富，藉由添加木聚糖酶可將動物飼料中之植物細胞壁分解，可提高動物對植物營養的吸收效率。

於使用木聚糖酶將動物飼料丸粒化之情形，需要有能耐受約70℃~約90℃約10分鐘處理的穩定性的木聚糖酶。又，為了使木聚糖酶在動物的消化器官之中作用，需要於40℃附近、約pH4.8的環境下呈現高活性。

木黴(Trichoderma)屬或頂孢黴(Acremonium)屬此類絲狀菌來源之木聚糖酶，多為最適pH為pH3~pH5，作用溫度域為40℃附近。

專利文獻2、專利文獻3、國際公開第2001/27252號小冊(專利文獻7)及國際公開第2005/108565號小冊(專利文獻8)記載之耐熱性木聚糖酶變異體之中，包含最適pH為pH5~pH5.5附近之變異體。

d)清潔劑輔助劑：藉由使用木聚糖酶作為清潔劑輔助劑，能去除衣類的起毛。

最近的滾筒式洗衣機為節水型，所以由於多次洗滌會容易發生微細的起毛。若起毛，容易造成衣物的再污染。

藉由使用木聚糖酶作為清潔劑輔助劑，能去除該起毛。所以也可防止再污染。又，從附著於衣服之蔬菜或水果而來的染色的主成分，係鍵結有色素的蔬菜或水果而來的細胞壁。所以，藉由於洗衣時使用木聚糖酶，即使在使用節水型的滾筒式洗衣機也能有效果洗滌。

使用木聚糖酶作為清潔劑輔助劑之情形，需使用有鹼性耐性或界面活性劑耐性的木聚糖酶。又，溫水洗衣(laundry cleaning)時使用木聚糖酶之情形，需要使用在50℃~70℃之高溫域可穩定作用之木聚糖酶。

T.reesei來源之耐熱性耐鹼性木聚糖酶變異體(例如參照專利文獻2、專利文獻3、專利文獻5及專利文獻6)，帶有最適溫度62℃~75℃、最適pH為pH7~pH8的性質。

專利文獻8所示之木聚糖酶變異體，最適pH位於pH5，係酸性側，最適溫度為70℃，在pH8~pH9中，60℃、10分鐘維持100%活性。

桿菌(Bacillus)屬來源之耐熱性耐鹼性木聚糖酶(例如參照專利文獻4及日本特開2007-54050號公報(專利文獻9))，均於50℃~70℃有最適溫度域，且具有最適pH為pH7~pH8的特性。於4℃~5℃、1日~2日、pH9維持100%活性。

e)製麵包改質劑：藉由使用木聚糖酶作為製麵包改質劑，能使改良製麵包之品質。

木聚糖酶具有將麵粉的半纖維素部分分解的性質。藉由以木聚糖酶分解半纖維素部分，將該部分結合的水分釋出到麵糰中，會使麵糰性質發生變化。其結果，藉由改善製麵包的粒子結構及麵包條(loaf)體積，與製麵包維持良好品質相關。

麵糰製作時，除了在攪拌捏揉材料的步驟會伴隨大的物理性衝撃及壓力負荷以外，在發酵步驟需於35℃~40℃花費1小時~2小時。

但是在(a)木質纖維素原料之糖化所述之糖化酵素之再利用，從糖生產成本或木質纖維素資源之有效活用的觀點，尚有改良空間。

專利文獻1記載之糖化酵素再利用中，由於酵素結合於木質纖維素殘渣，顯示酵素之糖化活性下降。所以，酵素或基質之投入量受限大。

尤其，針對酵素量，在專利文獻1之實施例中記載了木質纖維素於12小時可分解96%以上的量，且舉出了需投入多量酵素之點。因此，在經濟性的觀點中，需要長期間將酵素再利用。

又，作為基質之木質纖維素濃度為約1%程度之低，生產之糖濃度亦低。所以，若考慮乙醇發酵步驟等對糖之利用，需要為了因應糖化槽之容積效率或乙醇發酵生產前之濃縮等的設備投資，在經濟性觀點，難稱的上是工業化的方法。

是以，在含半纖維素之木質纖維素之糖化中，考量需要能分解高濃度之木質纖維素且能長期間再利用的酵素，故如前述，木聚糖酶之穩定性低 成為問題。

另一方面，在專利文獻10記載纖維素酶或半纖維素酶等酵素即使吸附於殘渣後仍維持活性。又，針對反應後使糖化酵素吸附於木質纖維素並回收，然後於其次之糖化反應再利用之方法有所記載。

但是專利文獻10中，係將成為糖化原料之木質纖維素預先在酸性條件下加熱處理，並進行木質纖維素中之半纖維素之分解。所以，會產生加熱成本或需設置有耐酸性之壓力容器等設備之必要，從經濟性的觀點並不理想。

而，雖然利用木聚糖酶分解半纖維素係為理想，但是由於糖化反應費時長，故如前述，其穩定性低成為問題。

專利文獻11記載：藉由使在起始反應使用的糖化酵素量加多，而減少相當於酵素再利用時喪失之活性之分量的追加投入酵素量，就全體而言可減少酵素成本。

但是實際上，由於還是追加投入了起始投入酵素量的1/3的酵素量，所以從經濟性的觀點並非理想方法。又，專利文獻11之實施例記載將反應殘渣廢棄。吸附於殘渣之酵素損失係無法減少追加投料的酵素量的一大要因。

又，專利文獻11之實施例中，僅記述利用木質纖維素所含之纖維素，亦即僅記述針對葡萄糖之利用。專利文獻11之實施例使用之經過前處理之小麥稈，含有35%以上之半纖維素等。從木質纖維素資源之有效活用或經濟性觀點考量，有需要將半纖維素中之木糖也作為單糖利用。但是於此情形，若設想從糖化至乙醇發酵為止之長時間反應後之酵素再利用，木聚糖酶之穩定性之低會成為問題。

作為該等問題之解決方案，有人列舉改良既存之木聚糖酶之熱穩定化木聚糖酶或耐熱菌來源之耐熱性木聚糖酶之利用，但現時點尚無使用如此之木聚糖酶之長時間之酵素再利用的報告例。

在(a)木質纖維素原料之糖化所述之專利文獻2及專利文獻3記載之T.reesei來源耐熱性木聚糖酶變異體，是否滿足木質纖維素原料之糖化時要 求之條件(在酸性區、高溫下長期間使用)並不確定。

同樣，針對(a)所述之專利文獻4記載之桿菌(Bacillus)屬來源之耐熱性木聚糖酶，顯示關於在中性附近之pH7.2熱處理時之殘存活性的結果。所以，若為了實施木質纖維素之糖化而在酸性下利用該耐熱性木聚糖酶數日，很可能該耐熱性木聚糖酶之活性會下降。

在(b)關於漿泥漂白所述之T.reesei來源之耐熱性木聚糖酶變異體之專利文獻2、專利文獻3、專利文獻5及專利文獻6，顯示於pH5、60℃~80℃處理30分鐘後之該T.reesei來源之耐熱性木聚糖酶之殘存活性相關的數據。但是未顯示假設漿泥漂白時要求之條件(pH10、70℃~80℃數小時)之該T.reesei來源之耐熱性木聚糖酶之穩定性。

在(c)動物飼料添加劑所述之木黴(Trichoderma)屬或頂孢黴(Acremonium)屬此類的絲狀菌來源之木聚糖酶，未同時具備能耐受丸粒化的熱穩定性。

同樣，(c)所述之專利文獻2、專利文獻3、專利文獻7及專利文獻8記載之耐熱性木聚糖酶變異體之中，包括最適pH為pH5~pH5.5附近之變異體。但是任一變異體均在60℃以上之高溫域發生顯著的熱失活，所以無法作為動物飼料添加劑使用。

在(d)關於清潔劑輔助劑所述之專利文獻2、專利文獻3、專利文獻5及專利文獻6記載之T.reesei來源耐熱性耐鹼性木聚糖酶變異體，完全未揭載在一般洗衣所費時間(1小時~2小時)中該耐鹼性木聚糖酶變異體於鹼性區之穩定性相關的資訊，關於能否作為清潔劑輔助劑使用並不明瞭。

同樣，在關於(d)所述之專利文獻8記載之木聚糖酶變異體、專利文獻4及專利文獻9記載之桿菌(Bacillus)屬來源之耐熱性耐鹼性木聚糖酶，能否耐受作為溫水洗衣之清潔劑輔助劑使用並不明瞭。

在(e)製麵包改質劑所述之專利文獻2、專利文獻3、專利文獻5及專利文獻6記載之T.reesei來源之耐熱性木聚糖酶變異體，能否耐受製麵包時施 加之大的物理性衝撃及壓力負荷，並不明瞭。

又，製麵包步驟包括在35℃~40℃實施1小時~2小時的發酵步驟，要求也能應付該步驟。

如以上所示，能利用木聚糖酶的用途之範圍變化多。所以，對於木聚糖酶要求的條件也牽涉廣泛。例如有於pH4~pH10、溫度40℃~80℃使用數日之時間此種酵素易失活的嚴峻條件。

為了因應於如此多樣化的需求，已有人報告多種變異型木聚糖酶或新穎的木聚糖酶，但是可以說尚未發現到在酵素易失活的嚴峻條件下能夠足以穩定作用的木聚糖酶。

又，以提高耐熱性為目的而獲得之變異型木聚糖酶，會有反應之初速度大幅下降的問題。此現象據推測係由於為了提高耐熱性而施加之胺基酸序列上之變異等造成蛋白質全體之結構上之柔軟性下降的原故。

在如此的狀況下，希望開發在酸性區(pH4~pH6)、鹼性區(pH8~pH10)或高溫域(40℃~80℃)此種酵素失活的嚴峻條件下，能於一定時間顯示穩定活性且相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度不會大幅下降的木聚糖酶。

本發明之課題為提供使用熱穩定性木聚糖酶之木質纖維素之低廉、有效率的糖化方法。又，課題為提供一種具有取代胺基酸殘基的變異型木聚糖酶，其在酵素易失活之嚴峻條件下仍顯示穩定活性，而且相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度不會大幅下降。再者，本發明之課題為提供能以低成本製造該變異型木聚糖酶之製造方法，並提供該變異型木聚糖酶之各種用途。

本發明如下。

[1]一種木質纖維素之糖化物製造方法，其係包含以下步驟： 使木質纖維素原料與熱穩定性木聚糖酶接觸。

[2]如[1]之木質纖維素之糖化物製造方法，其中，該木質纖維素原料為漿泥。

[3]一種糖化物製造方法，其係包含以下步驟：從含有由依如[1]或[2]之糖化物製造方法獲得之木質纖維素之糖化物之糖化反應液回收熱穩定性木聚糖酶，及使回收的熱穩定性木聚糖酶與木質纖維素原料接觸以製造糖化物。

[4]如[3]之糖化物製造方法，其係將該糖化反應液以離心分離或精密過濾膜予以固液分離，並將分離的液體以超過濾膜予以超過濾，而將木質纖維素之糖化物與該熱穩定性木聚糖酶分離、回收。

[5]如[4]之糖化物製造方法，其係使以該離心分離或精密過濾膜固液分離之固體及以超過濾膜回收之熱穩定性木聚糖酶、與木質纖維素原料接觸以製造糖化物。

[6]如[1]至[5]中任一項之糖化物製造方法，其中，該熱穩定性木聚糖酶係：相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度為70%以上，且於50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性為50%以上，且具有取代胺基酸殘基之變異型木聚糖酶。

[7]如[6]之糖化物製造方法，其中，該變異型木聚糖酶係至少有以下取代胺基酸殘基之變異型木聚糖酶：序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中，29號之天冬醯胺酸殘基取代為白胺酸殘基、58號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基、27號之酪胺酸殘基取代為與酪胺酸殘基不同之其他胺基酸殘基，且44號之天冬醯胺酸殘基取代為與天冬醯胺酸殘基不同之其他胺基酸殘基。

[8]如[7]之糖化物製造方法，其係將取代該變異型木聚糖酶之27號之酪胺酸殘基之與酪胺酸殘基不同之其他胺基酸殘基為苯丙胺酸殘基，且取代44號之天冬醯胺酸殘基之與天冬醯胺酸殘基不同之其他胺基酸殘基為絲胺酸殘基之變異型木聚糖酶用於糖化物製造。

[9]如[6]之糖化物製造方法，其中，該變異型木聚糖酶係序列表之序列編號2記載之胺基酸序列中，至少154號之胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基之變異型木聚糖酶。

[10]如[9]之糖化物製造方法，其係將至少含有該變異型木聚糖酶之33號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基之取代胺基酸殘基、36號之甘胺酸殘基取代為精胺酸殘基之取代胺基酸殘基、90號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基之取代胺基酸殘基、132號之麩醯胺酸殘基取代為精胺酸殘基之取代胺基酸殘基、154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基、174號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基之取代胺基酸殘基、195號之脯胺酸殘基取代為組胺酸殘基之取代胺基酸殘基、197號之絲胺酸殘基取代為天冬醯胺酸殘基之取代胺基酸殘基、及217號之甘胺酸殘基取代為麩胺酸殘基之取代胺基酸殘基之變異型木聚糖酶用於糖化物製造。

[11]如[9]之糖化物製造方法，其係將至少含有該變異型木聚糖酶之30號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基之取代胺基酸殘基、33號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基之取代胺基酸殘基、36號之甘胺酸殘基取代為精胺酸殘基之取代胺基酸殘基、及154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基之變異型木聚糖酶用於糖化物製造。

[12]如[9]之糖化物製造方法，其係將至少含有該變異型木聚糖酶之30號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基之取代胺基酸殘基、59號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基之取代胺基酸殘基、154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基、239號之酪胺酸殘基取代為組胺酸殘基之取代胺基酸殘基、及242號之半胱胺酸殘基取代為絲胺酸殘基之取代胺基酸殘基之變異型木聚糖酶用於糖化物製造。

[13]一種變異型木聚糖酶，其係至少具有序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中，29號之天冬醯胺酸殘基取代為白胺酸殘基、58號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基、27號之酪胺酸殘基取代為與酪胺酸殘基不同的其他胺基酸殘基，且44號之天冬醯胺酸殘基取代為與天冬醯胺酸殘基不同之其他胺基酸殘基之取代胺基酸殘基。

[14]如[13]之變異型木聚糖酶，其中，序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中，取代27號之酪胺酸殘基之與酪胺酸殘基為不同之其他胺基酸殘基為苯丙胺酸殘基，且取代44號之天冬醯胺酸殘基之與天冬醯胺酸殘基不同之其他胺基酸殘基為絲胺酸殘基。

[15]一種變異型木聚糖酶，其中，序列表之序列編號2記載之胺基酸 序列中，至少154號之白胺酸殘基取代為其他胺基酸殘基。

[16]如[15]之變異型木聚糖酶，其係至少包含序列表之序列編號2記載之胺基酸序列中，33號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基之取代胺基酸殘基、36號之甘胺酸殘基取代為精胺酸殘基之取代胺基酸殘基、90號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基之取代胺基酸殘基、132號之麩醯胺酸殘基取代為精胺酸殘基之取代胺基酸殘基、154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基、174號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基之取代胺基酸殘基、195號之脯胺酸殘基取代為組胺酸殘基之取代胺基酸殘基、197號之絲胺酸殘基取代為天冬醯胺酸殘基之取代胺基酸殘基、及217號之甘胺酸殘基取代為麩胺酸殘基之取代胺基酸殘基。

[17]如[15]之變異型木聚糖酶，其係至少包含序列表之序列編號2記載之胺基酸序列中，30號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基之取代胺基酸殘基、33號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基之取代胺基酸殘基、36號之甘胺酸殘基取代為精胺酸殘基之取代胺基酸殘基、及154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基。

[18]如[15]之變異型木聚糖酶，其係至少包含序列表之序列編號2記載之胺基酸序列中，30號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基之取代胺基酸殘基、59號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基之取代胺基酸殘基、154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基、239號之酪胺酸殘基取代為組胺酸殘基之取代胺基酸殘基、及242號之半胱胺酸殘基取代為絲胺酸殘基之取代胺基酸殘基。

[19]一種核酸，其係以編碼為如[13]至[18]中任一項之變異型木聚糖酶之胺基酸序列的鹼基序列表示。

[20]一種表現載體，其係包含如[19]之核酸。

[21]一種轉形體，其係包含如[20]之表現載體。

[22]如[21]之轉形體，其係以大腸菌、枯草菌、酵母、放線菌或絲狀菌來源之細胞作為宿主細胞。

[23]如[22]之轉形體，其中，該絲狀菌屬於木黴(Trichoderma)屬、頂孢黴(Acremonium)屬、腐質黴(Humicola)屬或麴黴(Aspergillus)屬。

[24]如[22]或[23]之轉形體，其中，該絲狀菌為綠木黴(Trichoderma viride)、Acremonium cellulolyticus、特異腐質黴(Humicola insolens)或黑麴黴(Aspergillus niger)。

[25]一種變異型木聚糖酶之製造方法，其係包含以下步驟： 培養如[21]至[24]中任一項之轉形體，從培養之轉形體及該轉形體之培養物當中至少其中之一者回收如[13]至[18]中任一項之變異型木聚糖酶。

[26]一種變異型木聚糖酶，其係利用如[25]之變異型木聚糖酶之製造方法製造。

[27]一種組成物，其係含有如[13]至[18]及[21]中任一項之變異型木聚糖酶。

[28]一種漿泥之漂白方法，其係包含以下步驟： 使如[13]至[18]及[21]中任一項之變異型木聚糖酶與漿泥接觸。

[29]一種清潔劑，其係包含如[13]至[18]及[21]中任一項之變異型木聚糖酶。

[30]一種動物飼料，其係包含如[13]至[18]及[21]中任一項之變異型木聚糖酶。

[31]一種製麵包改質劑，其係包含如[13]至[18]及[21]中任一項之變異型木聚糖酶。

依照本發明，可提供使用熱穩定性木聚糖酶之木質纖維素之低廉、有效率的糖化方法。又，可提供一種具有取代胺基酸殘基的變異型木聚糖酶，其在酵素易失活之嚴峻條件下仍顯示穩定活性，而且相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度不會大幅下降。再者，依照本發明，提供能以低成本製造該變異型木聚糖酶之製造方法，並提供該變異型木聚糖酶之各種用途。

本發明相關的熱穩定性木聚糖酶，只要是一定時間熱處理後之木聚糖酶活性之程度比起熱處理前之木聚糖酶活性未有改變、或熱處理後之木聚糖酶活性之減少比起熱處理前之木聚糖酶活性少者即可。

例如從麴菌屬(Aspergillus)屬、木黴屬(Trichoderma)屬、短柄黴屬(Aureobasidium)屬、裂褶菌(Schizophyllum commune)屬等絲狀菌、桿菌(Bacillus)屬或梭狀芽胞桿菌(Clostridium)屬、鏈黴菌(Streptomyces)屬等細菌類獲得之木聚糖酶。

前述野生型木聚糖酶之中，50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性為50%以上較佳。

又，本發明相關的熱穩定性木聚糖酶，也可對於包括前述絲狀菌、細菌類之野生型之木聚糖酶導入變異並視需要提高其熱穩定性之變異型木聚糖酶。為如此之變異型木聚糖酶之情形，相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度為70%以上，且50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性為50%以上且具有取代胺基酸者又更佳。

本發明相關的核酸，係以編碼為前述變異型木聚糖酶之胺基酸序列之鹼基序列表示者。

本發明相關的表現載體，係包括以編碼為前述變異型木聚糖酶之胺基酸序列之鹼基序列表示之核酸者。

本發明相關的宿主細胞，係經包括以編碼為前述變異型木聚糖酶之胺基酸序列之鹼基序列表示之核酸的表現載體轉形者。

本發明相關的變異型木聚糖酶之製造方法，係包括以下步驟：培養前述宿主細胞，並從培養的宿主細胞及該宿主細胞之培養物當中至少其中任一者採取前述變異型木聚糖酶。又，本發明相關的變異型木聚糖酶，也包括由前述變異型木聚糖酶之製造方法製造之變異型木聚糖酶。

本發明相關的組成物，係含有前述變異型木聚糖酶者。

本發明相關的木質纖維素之糖化物之製造方法，係包括使前述變異型木聚糖酶與木質纖維素原料接觸之步驟。

本發明相關的漿泥之漂白方法，包括使前述變異型木聚糖酶與漿泥接觸之步驟。

本發明相關的清潔劑、動物飼料或製麵包改質劑，係包含前述變異型木聚糖酶。

本發明中，關於編碼為變異型木聚糖酶之胺基酸序列及鹼基序列、或引子之各序列，在基於該等彼此互補之關係記述之事項，若無特別指明，針對各序列、及對各序列為互補的序列也適用。當針對各序列為互補之該序列適用本發明之事項時，針對該互補序列所認識之序列，在對於本發明所屬技術領域具有通常知識者之技術常識之範圍內，在整份說明書可以替換為對應之與本說明書記載之序列為互補的序列。

本說明書中，用語「步驟」，不僅包括獨立步驟，即使在與其他步驟未能明確區別之情形，只要能達成本步驟期待之目的，則也包括於本用語之含意。

本說明書中，使用「~」代表之數值範圍，代表包括在「~」前後記載之數值作為最小值及最大值的範圍。

本說明書中，組成物中之各成分之量，於組成物中之各成分對應有多數物質之情形，若無特別指明，係指組成物中存在之該多數物質的合計量。

以下針對本發明說明。

(1)定義

[木聚糖酶活性與反應之初速度之定義]

本發明中，「木聚糖酶活性」係指將主要構成植物細胞壁之木聚糖之β-1,4鍵隨機水解並生成有還原末端之寡糖(以下也簡稱為「還原糖」)之意。

本發明中，「反應之初速度」，代表木聚糖酶活性之反應之初速度。

反應之初速度，可如以下方式確認。首先，在作為基質之100mM之檸檬酸鈉緩衝液(pH4.5)中劇烈混合1%(w/w)之Birchwood木聚糖(Sigma Aldrich公司製)，以5000×g離心15分鐘，準備除去檸檬酸鈉緩衝液中存在的殘存木聚糖的上清液。然後，以前述上清液作為基質液，對於該基質液混合木聚糖酶使濃度為0.1%(w/w)，邊於45℃攪拌30分鐘邊反應，並以DNS法(Bailey等、1992)測定獲得之反應液中之還原糖之量，可確認木聚糖 酶活性之反應之初速度。

[與野生型為同等活性之定義]

本說明書中，「與野生型為同等活性」，係指當令野生型木聚糖酶之反應之初速度為1時，變異型木聚糖酶之反應之初速度為0.7(70%)以上。

[酵素穩定作用之範圍之定義]

本說明書中，「酵素穩定作用之範圍」，係指溫度高於30℃、低於40℃，且pH大於6、小於8的範圍。

本說明書中，「酵素易失活之嚴峻條件」，係指酸性區(pH4~pH6)、鹼性區(pH8~pH10)及高溫域(40℃~80℃)。

[殘存活性與穩定性之定義]

本說明書中，「殘存活性」，係指將酵素在酵素穩定作用之範圍外暴露一定時間後之反應之初速度除以暴露前之反應之初速度，並以百分率表示者。具體測定方法，係於50℃及pH4.5實施16小時、24小時、48小時、72小時加熱處理後，於冰上靜置5分鐘，測定反應之初速度，且同時也測定熱處理前之該酵素之初速度，相除並以百分率表示。前述以外，針對於50℃且pH8、pH9、pH10實施1小時加熱處理後、於60℃及pH8、pH9、pH10實施1小時加熱處理後、於70℃且pH5.5實施5分鐘加熱處理後之反應之初速度，也同樣測定殘存活性。

本說明書中，穩定性係利用酵素暴露於前述酵素易失活之嚴峻條件下時之殘存活性之程度判定。

(2)針對本發明之變異型木聚糖酶

本發明之變異型木聚糖酶，相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度為70%以上且於50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性為50%以上且具有取代胺基酸殘基。

本發明之變異型木聚糖酶，藉由具有取代胺基酸殘基，即使在酵素易失活之嚴峻條件下中仍顯示穩定的活性，且相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度不會大幅下降。

本發明中，變異型木聚糖酶，只要是相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度為70%以上且於50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性為50%以上且具有取代胺基酸殘基即可，不特別限制。

本發明中，變異型木聚糖酶，可列舉相較於對應之野生型木聚糖酶，較佳為反應之初速度為70%以上。

反應之初速度若為70%以上，變異型木聚糖酶之使用量，不會比與變異型木聚糖酶對應之野生型木聚糖酶之使用量多，故在產業利用上為理想。

本發明中，變異型木聚糖酶在50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性，較佳為50%以上，更佳為70%以上。

若50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性為50%以上，能在酵素穩定作用之範圍內使用，故為理想。具體而言，當於木質纖維素之糖化此種需要長時間酵素反應或酵素再利用之情形，不需為了維持反應開始起初的反應初速度而追加大量酵素，不必顧慮成本提高，從經濟性的觀點亦為理想。

本發明中，變異型木聚糖酶其來源不特別限制。例如：枯草菌、梭狀芽孢桿菌屬菌、放線菌或絲狀菌、擔子菌來源之變異型木聚糖酶。從產業利用上之觀點，前述絲狀菌當中，宜為木黴(Trichoderma)屬、頂孢黴(Acremonium)屬、腐質黴(Humicola)屬或麴黴(Aspergillus)屬來源之變異型木聚糖酶較佳。再者，從大量生產之觀點，宜為綠木黴(Trichoderma viride)、Acremonium cellulolyticus、特異腐質黴(Humicola insolens)或黑麴黴(Aspergillus niger)來源之變異型木聚糖酶更理想。

從在酵素易失活之嚴峻條件下仍顯示穩定的活性，且相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度不會大幅下降的觀點，可列舉以下二種之變異型木聚糖酶為更理想之變異型木聚糖酶。

首先第1種理想之變異型木聚糖酶，可列舉木黴(Trichoderma)屬絲狀菌來源之變異型木聚糖酶。

前述第1種理想之變異型木聚糖酶，從相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度為70%以上，且於50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性為50%以上的觀點，宜為綠木黴(Trichoderma viride)之變異型木聚糖酶較佳。

前述第1種理想之變異型木聚糖酶，從相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度為70%以上，且於50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性容易達成50%以上的觀點，可列舉序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中，29號之天冬醯胺酸殘基取代為白胺酸殘基、58號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基、27號之酪胺酸殘基取代為與酪胺酸殘基相異的其他胺基酸殘基，且44號之天冬醯胺酸殘基取代為與天冬醯胺酸殘基不同的其他胺基酸殘基之具有取代胺基酸殘基之變異體木聚糖酶。

序列表之序列編號1記載之胺基酸序列，係編碼為綠木黴(Trichoderma viride)之木聚糖酶II的胺基酸序列。

又，第2種理想之變異型木聚糖酶，可列舉頂孢黴(Acremonium)屬絲狀菌來源之變異型木聚糖酶。

前述第2種理想之變異型木聚糖酶，從相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度為70%以上，且於50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性為50%以上之觀點，宜為Acremonium cellulolyticus之變異型木聚糖酶較佳。

序列表之序列編號2記載之胺基酸序列，係編碼為Acremonium cellulolyticus之木聚糖酶I之胺基酸序列。

前述第2理想之變異型木聚糖酶，從相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度為70%以上，且於50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性容易達成50%以上之觀點，宜包括至少154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基較佳。

本發明之變異型木聚糖酶之具體例，例如具有以下表1所示選殖體編號1~選殖體編號17表示之取代胺基酸殘基者，但本發明之變異型木聚糖酶不限定於該等。

【表1】

上述表1當中，從相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度為70%以上，且50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性為50%以上之觀點，宜為變異型木聚糖酶TVX01(選殖體編號1)、變異型木聚糖酶ACX01(選殖體編號15)、變異型木聚糖酶ACX02(選殖體編號16)或變異型木聚糖酶ACX03(選殖體編號17)較佳。

前述變異型木聚糖酶TVX01，包括序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中，29號之天冬醯胺酸殘基取代為白胺酸殘基、58號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基、27號之酪胺酸殘基取代為苯丙胺酸殘基、且44號之天冬醯胺酸殘基取代為絲胺酸殘基之取代胺基酸殘基。變異型木聚糖酶TVX01，從相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度為70%以上，且於50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性為50%以上之觀點，係為理想。

本發明相關的變異型木聚糖酶TVX01，較佳為在30℃~90℃之範圍有活性，更佳為在30℃~70℃之範圍有活性。又，較佳為在pH3~pH9之範圍有活性，更佳為在pH4~pH7之範圍有活性。

前述變異型木聚糖酶ACX01，包括33號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基之取代胺基酸殘基、36號之甘胺酸殘基取代為精胺酸殘基之取代胺基酸殘基、90號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基之取代胺基酸殘基、132號之麩醯胺酸殘基取代為精胺酸殘基之取代胺基酸殘基、154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基、174號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基之取代胺基酸殘基、195號之脯胺酸殘基取代為組胺酸殘基之取代胺基酸殘基、197號之絲胺酸殘基取代為天冬醯胺酸殘基之取代胺基酸殘基、及217號之甘胺酸殘基取代為麩胺酸殘基之取代胺基酸殘基。變異型木聚糖酶ACX01，從相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度為70%以上，且於50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性為50%以上之觀點，係為理想。

本發明相關的變異型木聚糖酶ACX01，較佳為在30℃~80℃之範圍有活性，更佳為在30℃~65℃之範圍有活性。又，較佳為在pH2~pH8之範圍有活性，更佳為在pH2~pH5之範圍有活性。

前述變異型木聚糖酶ACX02，包括30號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基之取代胺基酸殘基、33號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基之取代胺基酸殘基、36號之甘胺酸殘基取代為精胺酸殘基之取代胺基酸殘基、及154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基。變異型木聚糖酶ACX02，從相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度為70%以上，且於50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性為50%以上之觀點，係為理想。

本發明相關的變異型木聚糖酶ACX02，較佳為在30℃~80℃之範圍有活性，更佳為在30℃~65℃之範圍有反應活性。又，較佳為在pH2~pH8之範圍有活性，更佳為在pH2~pH5之範圍有活性。

前述變異型木聚糖酶ACX03，包括30號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基之取代胺基酸殘基、59號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基之取代胺基酸殘基、154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基、239號之酪胺酸殘基取代為組胺酸殘基之取代胺基酸殘基、及242號之半胱胺酸殘基取代為絲胺酸殘基之取代胺基酸殘基。變異型木聚糖酶ACX03，從相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度為70%以上，且於50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性為50%以上之觀點，係為理想。

本發明相關的變異型木聚糖酶ACX03，較佳為在30℃~80℃之範圍有活性，更佳為在30℃~65℃之範圍有活性。又，較佳為在pH2~pH8之範圍有活性，更佳為在pH2~pH5之範圍有活性。

作為本發明之變異型木聚糖酶，例如由與變異型木聚糖酶TVX01認定有相同性之各胺基酸序列構成的變異型木聚糖酶，也包括在本發明的變異型木聚糖酶。

認定有相同性之胺基酸序列，只要是例如與變異型木聚糖酶TVX01顯示同等程度之木聚糖酶活性之胺基酸序列即可。較佳為與變異型木聚糖酶TVX01之胺基酸序列有80%以上之相同性，更佳為90%以上之相同性，又更佳為95%以上之相同性之變異型木聚糖酶。由於顯示80%以上之相同性，可認為木聚糖酶之立體結構類似性高，所以有可導入在本發明明白的變異點而開發顯示與本發明為同等程度之作用的變異型木聚糖酶等優點。

變異型木聚糖酶TVX01以外，針對變異型木聚糖酶ACX01、變異型木聚糖酶ACX02及變異型木聚糖酶ACX03亦同。

又，本發明中，就變異型木聚糖酶TVX01而言，只要是顯示與變異型木聚糖酶TVX01為同等程度之作用即可，在編碼為變異型木聚糖酶TVX01之胺基酸序列將胺基酸殘基插入、缺失或取代而得的變異型木聚糖酶，也包括在本發明中之變異型木聚糖酶TVX01。

胺基酸殘基插入、缺失或取代之情形，其插入、缺失或取代之位置在不損及本發明所示之作用的限度內可任意決定。插入、缺失或取代之胺基酸殘基之數目，可列舉1個胺基酸殘基或2個胺基酸殘基以上，例如1個胺基酸殘基~10個胺基酸殘基，較佳為1個胺基酸殘基~5個胺基酸殘基。具體而言，可列舉具有4個變異點，且同時序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中，47號之甘胺酸殘基取代為半胱胺酸殘基者、52號之麩醯胺酸殘基取代為離胺酸殘基者、59號之纈胺酸殘基取代為異白胺酸殘基者、67號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基者、69號之天冬醯胺酸殘基取代為異白胺酸殘基者、80號之絲胺酸殘基取代為丙胺酸殘基者、97號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基者、105號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基者、109號之蘇胺酸殘基取代為丙胺酸殘基者、120號之蘇胺酸殘基取代為精胺酸殘基者、143號之蘇胺酸殘基取代為異白胺酸殘基者、151號之天冬醯胺酸殘基取代為絲胺酸殘基者、161號之絲胺酸殘基取代為白胺酸殘基 者、186號絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基者等。

變異型木聚糖酶TVX01以外，針對變異型木聚糖酶ACX01、變異型木聚糖酶ACX02及變異型木聚糖酶ACX03亦同。具體而言，可列舉ACX01具有之變異點以外，序列表之序列編號2記載之胺基酸序列中，133號之絲胺酸殘基取代為天冬醯胺酸殘基、176號之麩醯胺酸殘基取代為精胺酸殘基者等。

又，針對變異型木聚糖酶ACX02亦同樣，具有所有其變異點的變異體有許多顯示與ACX02為同程度的性質，具體而言可列舉ACX02具有之變異點以外，序列表之序列編號2記載之胺基酸序列中，90號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、132號之麩醯胺酸殘基取代為精胺酸殘基、133號之絲胺酸取代為天冬醯胺酸殘基、174號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、195號之脯胺酸殘基取代為組胺酸殘基、176號之麩醯胺酸殘基取代為精胺酸殘基、197號之絲胺酸殘基取代為天冬醯胺酸殘基、217號之甘胺酸殘基取代為麩胺酸殘基者等。

再者，具有變異型木聚糖酶ACX03之所有變異點之變異體有許多顯示與ACX03有同程度的性質，具體而言，可列舉ACX03具有之變異點以外，序列表之序列編號2記載之胺基酸序列中，176號之麩醯胺酸殘基取代為精胺酸殘基者等。

本發明之變異型木聚糖酶可依公知方法合成。使基因發生變異的方法，例如：部位專一性變異法(Kramer,W.and frita，H.J.,Methods in Enzymology,vol.154,P.350(1987))、重組PCR法(PCR Technology,Stockton Press(1989)、以化學合成特定部分之DNA之方法、將基因以羥基胺處理之方法、將保有基因的菌株以紫外線照射處理、或以亞硝基胍或亞硝酸等化學藥劑處理之方法等。又，獲得本發明之變異型木聚糖酶之方法當中，理想之方法可列舉以下所述之變異型木聚糖酶之製造方法。

(3)變異型木聚糖酶之製造方法

本發明相關的變異型木聚糖酶之製造方法(以下也簡單稱為「製造方法」)，係培養轉形體，並從培養的轉形體及該轉形體之培養物當中至少其中之一者回收前述變異型木聚糖酶。

在此，轉形體代表經包括以編碼為前述變異型木聚糖酶之胺基酸序列之鹼基序列表示之核酸之表現載體轉形者。

本發明相關的變異型木聚糖酶之製造方法，係藉由培養經包括以編碼為前述變異型木聚糖酶之胺基酸序列之鹼基序列表示之核酸之表現載體轉形而得的轉形體以製造變異型木聚糖酶。利用該製造方法，能以低成本製造在酵素易失活之嚴峻條件下仍顯示穩定活性且相較於對應之野生型木聚糖酶的反應之初速度不會大幅下降的變異型木聚糖酶。

以下說明製造方法可包含的各步驟，但本發明相關的變異型木聚糖酶之製造方法，只要有包括培養經含以編碼為前述變異型木聚糖酶之胺基酸序列之鹼基序列表示之核酸之表現載體轉形而得之轉形體之步驟(宿主細胞培養步驟)、及從培養之轉形體及該轉形體之培養物當中至少其中之一者回收前述變異型木聚糖酶之步驟(變異型木聚糖酶回收步驟)即可，視需要也可更包含其他步驟。

A.轉形體培養步驟

轉形體培養步驟，係培養經包括以編碼為前述變異型木聚糖酶之胺基酸序列之鹼基序列表示之核酸之表現載體轉形而得之轉形體之步驟。

[轉形體]

本發明相關的製造方法中，轉形體，只要是經包括以編碼為前述變異型木聚糖酶之胺基酸序列之鹼基序列表示之核酸之表現載體轉形而得者即可，不特別限定。

前述轉形體，例如以大腸菌、枯草菌、酵母、放線菌、絲狀菌等來源之細胞為宿主細胞者，其中，以能將目的酵素分泌到菌體外分泌的枯草菌、酵母、放線菌或絲狀菌來源之細胞作為宿主細胞在產業利用上為理想。

酵母，例如屬於酵母屬(Saccharomyces)屬、漢遜酵母屬(Hansenula)屬、或畢氏酵母屬(Pichia)屬者，理想之酵母之一例，為啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

又，絲狀菌，例如屬於腐質黴(Humicola)屬、麴菌(Aspergillus)屬、木黴(Trichoderma)屬、或頂孢黴(Acremonium)屬者，理想之絲狀菌之例，為異孢腐質黴(特異腐質黴(Humicola insolens))、黑麴黴(黑麴黴(Aspergillus niger))或米麴黴(Aspergillus oryzae)、或綠木黴(Trichoderma viride)(綠木黴(Trichoderma viride))、或Acremonium cellulolyticus(Acremonium cellulolyticus)。再者，從產業利用上之觀點，綠木黴(Trichoderma viride)、Acremonium cellulolyticus、異孢腐質黴或黑麴黴較理想。

[核酸]

前述核酸，係以編碼為前述變異型木聚糖酶之胺基酸序列之鹼基序列表示。

合成編碼為前述變異型木聚糖酶之胺基酸序列之鹼基序列的方法，可列舉在編碼為對應之野生型木聚糖酶之鹼基序列導入變異點的方法、或以化學合成含有變異點的全部鹼基序列之方法等。以下針對在編碼為對應之野生型木聚糖酶之鹼基序列導入變異點之方法，使用編碼為Acremonium cellulolyticus之木聚糖酶I之鹼基序列及編碼為綠木黴(Trichoderma viride)之木聚糖酶II之鹼基序列說明，但是本發明相關的核酸不限定於該等。

[對於編碼為野生型木聚糖酶之鹼基序列導入變異點]

編碼為野生型木聚糖酶之鹼基序列，例如序列表之序列編號3記載之編碼為Acremonium cellulolyticus之木聚糖酶I之鹼基序列、及序列編號4記載之編碼為綠木黴(Trichoderma viride)之木聚糖酶II之鹼基序列。

以該等編碼為野生型木聚糖酶之鹼基序列作為模板使基因產生變異之方法，例如可利用部位專一性變異法(Kramer，W.and frita，H.J.，Methods in Enzymology，vol.154，P.350(1987))、重組PCR法(PCR Technology，Stockton Press(1989)、以化學合成特定部分之DNA之方法、將基因以羥基胺處理之方法、將保有基因的菌株以紫外線照射處理、或以亞硝基胍或亞硝酸等化學藥劑處理之方法、利用市售的突變導入套組等對前述鹼基序列導入變異。

導入變異的位置、種類不特別限定。就具體例而言，前述選殖體編號1~前述選殖體編號17表示之各種選殖體之變異點如以下表2所示，但導入變異之位置及種類不限於此。

【表2】

[表現載體]

前述表現載體，只要含有編碼為前述變異型木聚糖酶之胺基酸序列之鹼基序列表示之核酸者即可，不特別限定，但從使轉形效率或轉譯效率提高的等觀點，宜為顯示以下所示之構成之質體載體或噬菌體載體更佳。

[表現載體之基本構成]

表現載體，只要包含編碼為前述變異型木聚糖酶之鹼基序列且能將前述宿主細胞轉形者即可，不特別限定。視需要，該鹼基序列以外也可含有構成其他區的鹼基序列(以下也簡單稱為「其他區」)。

其他區，例如：前述轉形體為了生產前述變異型木聚糖酶所必要的控制區、自主複製所需要之區等。

又，從使前述轉形體之選擇容易的觀點，也可更包含編碼能成為選擇標記之選擇基因之鹼基序列。

為了生產前述變異型木聚糖酶所必要之控制區，可列舉啟動子序列(包含控制轉錄的操縱子序列)、核糖體結合序列(SD序列)、轉錄終結序列等。

[以酵母作為宿主細胞之情形之表現載體]

以酵母作為宿主細胞之情形，從前述變異型木聚糖酶之產生效率之觀點，表現載體宜除了含有編碼為前述變異型木聚糖酶之鹼基序列以外更含有啟動子序列較佳。啟動子序列，只要是能使前述變異型木聚糖酶在以酵母作為宿主細胞的轉形體中表現者均可使用。

例如可使用醇去氫酶(ADH1)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK1)啟動子、肽鏈伸長因子(TEF)啟動子、甘油3-磷酸去氫酶(GPD)啟動子、半乳糖激酶(GAL1)啟動子、金屬硫蛋白(Metallothionein)(CUP1)啟動子、抑制性酸性磷解酶(PHO5)啟動子、甘油醛-3-磷酸去氫酶(GAPDH)啟動子等啟動子序列。

又，上述啟動子序列之來源，不限定於成為宿主細胞之酵母。

也可使用如巨細胞病毒(CMV)啟動子等的外來的啟動子。該等啟動子可視使用之酵素之來源或種類適當選擇。

又，前述表現載體也可有分泌信號。藉此，當轉形體產生前述變異型木聚糖酶之情形，可將前述變異型木聚糖酶分泌到細胞外。

分泌信號只要是可從成為宿主細胞之酵母分泌前述變異型木聚糖酶者即可，不特別限定。從分泌效率之觀點，使用α因子信號序列、轉化酶信號序列、酸性磷解酶信號序列、葡糖澱粉酶信號序列等較佳。

具由如以上之啟動子序列或分泌信號之表現載體，具體而言可列舉pRS423、pRS424、YEplac195等。

[以絲狀菌作為宿主細胞之情形之表現載體]

以絲狀菌作為宿主細胞之情形，表現載體除了含有編碼為前述變異型木聚糖酶之鹼基序列以外，從前述變異型木聚糖酶之產生效率之觀點，宜更含有啟動子序列較佳。啟動子序列只要是能在以絲狀菌作為宿主細胞之轉形體中表現前述變異型木聚糖酶者均可使用。

對絲狀菌為適當的表現載體，記載於van den Hondel,C.A.M.J.J.et al.(1991)In：Bennett,J.W.and Lasure,L.L.(eds.)More gene Manipulations in Fungi.Academic Press,pp.396-428。

又，也可使用pUC18、pBR322，pUC100、pSL1180(Pharmacia Inc.公司製)、pFB6及麴菌屬(Aspergillus)pRAX、木黴屬(Trichoderma)pTEX等之類的一般使用的其他表現載體。

[以原核生物作為宿主細胞之情形之表現載體]

以大腸菌、枯草菌、放線菌等原核生物作為宿主細胞之情形，表現載體除了含有編碼為前述變異型木聚糖酶之鹼基序列以外，從前述變異型木聚糖酶之產生效率之觀點，宜更含有啟動子序列較佳。又，啟動子序列以外，也可含有核糖體結合序列或轉錄終結序列等。

啟動子序列，例如大腸菌來源之色胺酸操縱子之trp啟動子、乳糖操縱 子之lac啟動子、lambda噬菌體來源之PL啟動子及PR啟動子、或枯草菌來源之葡萄糖酸合成酵素啟動子(gnt)、鹼性蛋白酶啟動子(apr)、中性蛋白酶啟動子(npr)、α-澱粉酶啟動子(amy)等。

又，也可使用如tac啟動子之獨特地經改變或設計的啟動子序列。

核糖體結合序列可列舉大腸菌來源或枯草菌來源之序列，但只要是在大腸菌或枯草菌等所望的宿主細胞內能作用的序列即可，無特殊限制。

前述核糖體結合序列，例如：將在16S核糖體RNA之3’末端區的互補序列當中連續4鹼基以上的共有(consensus)序列以DNA合成製作成的序列等。

轉錄終結序列並非必要，但可利用ρ因子非依存性者，例如riboprotein終止子、trp操縱子終止子等。

該等控制區在表現載體上之序列順序，不特別限定，若考慮轉錄效率，希望的順序是從5’末端側上游起依序排列啟動子序列、核糖體結合序列、編碼為目的蛋白質之基因、轉錄終結序列。

在此所指之表現載體之具體例，可將具有在大腸菌中可自主複製之區的pBR322、pUC18、Bluescript II SK(+)、pKK223-3、pSC101、具有在枯草菌中可自主複製之區之pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、 1、 105等作為表現載體利用。

又，就可在2種以上宿主內自主複製之表現載體之例，可將pHV14、TRp7、YEp7及pBS7等作為表現載體利用。

[轉形體之製作方法]

本發明相關的轉形體可利用公知方法製作。例如：建構包含編碼為本發明相關的變異型木聚糖酶之鹼基序列及視需要含有前述其他區之前述表現載體，將該表現載體對於所望宿主細胞轉形之方法等。具體而言，可利用於Sambrook,J.,et.al.,”Molecular Cloning A Laboratory Manual,3^rd Edition”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2001)等記載之分子生物學、生物工程及基因工程之領域中公知之一般方法。

本發明相關的轉形體，不僅可於前述宿主細胞納入前述表現載體，且視需要可以一併進行將在前述宿主細胞之使用頻度低的密碼子改換為使用頻度高之密碼子的方式導入靜默變異等以製作。

藉此，能有機會增加納入表現載體之前述變異型木聚糖酶來源之蛋白質之生產量。

靜默變異之導入方法，例如以下表3為例，靜默變異之導入方法，只要是配合位在表現載體上之該木聚糖酶基因及使該木聚糖酶基因分泌到細胞外之信號序列之密碼子在宿主細胞之密碼子使用頻度者即可，其手法、變異點、改變的鹼基的種類等不特別限定。

以下表3，顯示在為了在T.viride中使前述變異型木聚糖酶ACX02以高頻度表現而施加靜默變異之鹼基的位置及改變的鹼基的種類。

表3中，序列名「ACX02」之「鹼基的位置」，代表序列編號4表示之鹼基的位置。序列名「A.cellulolyticus信號序列」之「鹼基的位置」，代表序列編號73表示之鹼基的位置。

【表3】

[轉形體之培養方法]

以前述表現載體轉形而獲得之轉形體之培養條件，與轉形前之宿主細胞之培養條件相同，可使用公知條件。

作為培養基只要是適量含有碳源、氮源、無機物及其他營養素的培養基即可，可使用合成培養基或天然培養基。培養基使用之成分，可使用公知者。可將例如：肉精、酵母萃取物、麥芽萃取物、蛋白腖、NZ胺及馬鈴薯等有機營養源、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、澱粉及有機酸等碳源、硫酸銨、尿素及氯化銨等氮源、磷酸鹽、鎂、鉀及鐵等無機營養源、維生素類適當組合使用。

又，於利用含前述選擇標記之表現載體轉形而得之轉形體之培養，例如當前述選擇標記為藥劑耐性之情形，使用含有與其對應之藥劑之培養基，當前述選擇標記為營養要求性之情形，使用不含與其對應之營養素之 培養基。培養基之pH從pH4~pH8之範圍選擇即可。

培養可於含前述培養基之液體培養基中，將前述轉形體使用振盪培養、通氣攪拌培養、連續培養、流加培養等通常的培養方法實施。

培養條件取決於前述轉形體、培養基、培養方法之種類適當選擇即可，只要是轉形體會生長且能生產本發明相關的變異型木聚糖酶之條件即可，無特殊限制。

培養溫度於20℃~45℃，較佳為24℃~37℃進行好氣性培養。

培養期間在1日~7日之範圍培養直到具有目的之變異型木聚糖酶活性之蛋白質之含量成為最大為止即可。

B.變異型木聚糖酶回收步驟

變異型木聚糖酶回收步驟，係從培養的轉形體及該轉形體之培養物當中至少其中之一者回收前述變異型木聚糖酶之步驟。

培養經轉形之轉形體後，回收本發明相關的前述變異型木聚糖酶之方法，可使用在該領域中慣用的方法。

本發明相關的前述變異型木聚糖酶分泌到經轉形的轉形體外之情形，可藉由將該轉形體之培養物施以離心分離、過濾等而輕易地獲得粗酵素液。又，本發明相關的前述變異型木聚糖酶在經轉形的轉形體內累積之情形，藉由將培養的該轉形體以離心分離等方式回收並將回收的該轉形體懸浮於緩衝液，依溶菌酶處理、冷凍熔解、超音波破碎等公知方法破壞該轉形體之細胞膜，回收粗酵素液即可。

可將前述粗酵素液利用超過濾法等濃縮並添加防腐劑等而以濃縮酵素的形式利用。又，也可於濃縮後利用噴霧乾燥法等獲得前述變異型木聚糖酶之粉末酵素。

針對回收的具有木聚糖酶活性的粗酵素液，當需要分離精製之情形，例如可適當組合利用硫酸銨等之鹽析、利用醇等之有機溶劑沉澱法、利用透析及超過濾等之膜分離法、或離子交換體層析、逆相高速層析、親和性層析、凝膠過濾層析等公知之層析分離法實施。

(4)變異型木聚糖酶之利用

本發明相關的前述變異型木聚糖酶，如前述，即使在酵素易失活的條件下中也長期間有穩定的活性。所以，本發明相關的前述變異型木聚糖酶可使用在廣泛的用途。

本發明之組成物，含有前述變異型木聚糖酶且視需要也可含有適合目的用途的任意成分。

本發明之組成物，含有即使在酵素易失活之條件下仍長期間穩定作用之前述變異型木聚糖酶。所以，本發明之組成物可使用在各種用途。

前述變異型木聚糖酶之含量，可依該組成物的用途適當決定，不特別限定。

本發明相關的前述變異型木聚糖酶，可使用在各種用途，但較佳為依以下方式利用。

[木質纖維素原料之糖化物之製造方法]

本發明相關的木質纖維素之糖化物之製造方法，包括使前述變異型木聚糖酶與木質纖維素原料接觸之步驟。

本發明相關的木質纖維素之糖化物之製造方法，由於使用即使在酵素易失活之條件下仍可長期間穩定作用的前述變異型木聚糖酶，所以能在酵素易失活的條件下實施，能以良好效率獲得木質纖維素之糖化。

木質纖維素原料，只要是木質素含量低的木質纖維素原料即可，可使用公知者。

木質素含量為低，由於木質纖維素原料之平均木質素含量為木質纖維素原料之全體量的約30質量%，所以代表木質素含量低於30質量%。較佳為木質素含量為20質量%以下，更佳為木質素含量為10質量%以下之木質纖維素原料。

如此的木質纖維素原料，可列舉從針葉樹、闊葉樹、林地殘材、建築廢材、修剪廢棄物、木屑、洋麻、稻草、麥桿等農產廢棄物等木質纖維素 材料利用鹼性萃取、鹼性蒸解等化學漿泥製造法、有機溶劑製漿等方法將木質素大多數除去而得之以纖維素、半纖維素為主成分之漿泥纖維等。較佳為闊葉樹牛皮紙漿泥、針葉樹牛皮紙漿泥、機械漿泥、洋麻等草本來源漿泥、舊紙漿泥、或紙污泥(包括從紙漿泥工廠回收的漿泥纖維分)、或該等之混合物。尤其，闊葉樹牛皮紙漿泥、針葉樹牛皮紙漿泥較理想。

該等木質纖維素原料，可從各別一般的漿泥製造企業取得。

使前述變異型木聚糖酶與木質纖維素原料接觸之方法，可列舉將前述變異型木聚糖酶加到木質纖維素原料中並邊攪拌邊使反應進行之方法、邊振盪邊使反應進行之方法、將變異型木聚糖酶與木質纖維素充分混合後靜置使反應進行之方法等。較佳為，從反應效率之觀點，可列舉將前述變異型木聚糖酶加到木質纖維素原料中邊攪拌邊使反應進行之方法。

反應可使用之反應容器不特別限制。較佳為能夠將裝入的木質纖維素原料及前述變異型木聚糖酶充分混合的方式攪拌且同時有溫度調節功能使得前述變異型木聚糖酶保持在最適溫度的反應容器較佳。

反應溫度，只要是前述變異型木聚糖酶能作用之溫度即可，不特別限制。例如40℃至60℃，較佳為40℃至55℃。

糖化反應容器中之液體之pH，只要是前述變異型木聚糖酶能作用之pH即可，不特別限制。例如pH4至pH7，較佳為pH4至pH6。

本發明相關的木質纖維素之糖化物之製造方法中，本發明相關的前述變異型木聚糖酶以外，視需要也可將其他酵素與前述變異型木聚糖酶組合使用。

其他酵素，可併用纖維素酶、木糖苷酶、甘露聚醣酶、果膠酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶等酵素。從以良好效率製造木質纖維素之糖化物之觀點，宜併用纖維素酶與前述變異型木聚糖酶較佳。

纖維素酶只要能將纖維素分解為葡萄糖者即不限制，可使用公知者。纖維素酶例如具有內切葡聚醣酶、纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)及β-葡萄糖苷酶之各活性中至少1種活性者。又，從酵素活性之觀點，具有該 等各活性之酵素混合物較佳。

前述纖維素酶之起源不限定，可使用絲狀菌、擔子菌、細菌類等的纖維素酶。例如可使用木黴(Trichoderma)屬、頂孢黴(Acremonium)屬、麴黴(Aspergillus)屬等絲狀菌、Irpex屬等擔子菌、Aeromonas屬、Clostridium屬、桿菌(Bacillus)屬、Pseudomonas屬、Penicillium屬、腐質黴(Humicola)屬等細菌等各種起源者、或將該等起源之纖維素酶作為模板利用基因重組製造者單獨使用或混用二種以上。又，也可直接使用一般市售的纖維素酶製劑或上述菌之培養物或其過濾液。

又，纖維素酶，從有強力纖維素分解力之觀點，以Trichoderma(木黴菌)屬來源之纖維素酶或Acremonium(頂孢黴屬)屬來源之纖維素酶等較理想。

市售的纖維素酶，可使用Accellerase1000(Genencor公司製)、Accellerase1500(Genencor公司製)、AccelleraseXC(Genencor公司製)、AccelleraseXY(Genencor公司製)、Accellerase DUET(Genencor公司製)、Accellerase TRIO(Genencor公司製)、Celluclast(Novozymes公司製)、Cellic CTec(Novozymes公司製)、Cellic HTec(Novozymes公司製)、Cellic CTec2(Novozymes公司製)、Cellic HTec2(Novozymes公司製)、頂孢黴屬纖維素酶(Meiji Seika Pharma(股)製)、Meicelase(Meiji Seika Pharma(股)製)、纖維素酶Amano A(天野酵素(股)製)、纖維素酶Amano T(天野酵素(股)製)、纖維素酶Daiwa(大和化成(股)製)、Cellulizer(Nagase生化學工業(股)製)、Driselase(協和發酵(股)製)、纖維素酶Onozuka(Yakult藥品工業(股)製)、Cellulosin(阪急Bioindustry(股)製)等。

前述變異型木聚糖酶對纖維素酶之混合比，只要是使生產的還原糖之量成為最大之混合比即可，可為任意比例，較佳為例如將前述變異型木聚糖酶相對於纖維素酶以20%~60%的比例混合。

加入反應容器作為基質之木質纖維素原料、與前述變異型木聚糖酶及其他酵素合計之酵素全體(以下也簡稱為「酵素」)的濃度，不特別限定。

木質纖維素原料之移液、裝入等操作，宜為8質量%~30質量%之固體成分濃度較佳。

又，使用之酵素，可投入因應於其活性能以良好效率分解基質之充分量。酵素之量，可因應酵素種類等適當調整。

依本發明之木質纖維素原料之糖化物之製造方法及利用糖化酵素再利用之木質纖維素原料之糖化物之製造方法所製造之糖化物，只要是木質纖維素來源之糖化物即可。糖化物具體而言，可列舉單糖、二糖以上之寡糖等。前述單糖，可列舉葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、半乳糖等。

又，前述糖化物，亦可使用在化學藥品或燃料、塑膠、及其他產物或中間體之生產，又，也可作為使用微生物生產該等物質之發酵原料。

化學藥品或燃料、塑膠、及其他產物，可列舉乙醇或異丙醇、丙酮、乙酸酯、1,3-丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、胺基酸、有機酸、糠醛、聚羥基烷酸酸類(polyhydroxyalkanoates)、動物飼料及木糖等。

尤理想為使用在乙醇、異丙醇、乳酸等發酵生產。

[用於再利用之變異型木聚糖酶之製造方法]

本發明之用於再利用之變異型木聚糖酶之製造方法，包含以下步驟：從依前述木質纖維素之糖化物之製造方法獲得之含木質纖維素之糖化物之糖化反應液(以下有時簡單稱為「糖化反應液」)回收本發明相關的變異型木聚糖酶(以下有時稱為「回收步驟」)。

藉此，能以低成分製造本發明相關的變異型木聚糖酶。

前述回收步驟中，回收方法可使用公知方法。例如進行固液分離之後使用能回收酵素的膜裝置或公知裝置將酵素回收之方法等。

固液分離之方法，可列舉將前述糖化反應液予以離心分離或粗過濾的方法。

離心分離或粗過濾的條件，可直接適用該技術領域中通常使用之方法即可，例如離心分離之情形，可設為500×g~10000×g。

粗過濾之情形中，可使用網目尺寸0.1μm~2mm之不銹鋼製濾器、陶瓷 製濾器或樹脂製過濾膜進行過濾。

又，也可利用精密過濾膜進行精密過濾。於此情形，宜使用平均細孔徑0.01μm~10μm之精密過濾膜較佳。

利用精密過濾膜進行精密過濾之方法，有加壓過濾、真空過濾、交叉流過濾、離心過濾等。其中，藉由交叉流過濾可減少膜堵塞。

從經固液分離的液體回收酵素之情形，例如有使用樹脂管柱之方法或使用膜裝置之方法。

前述使用樹脂管柱之方法，例如離子交換體層析、逆相高速層析、親和性層析、凝膠過濾層析等公知之層析分離法。

使用前述膜裝置，例如具備超過濾膜、透析膜等之膜裝置回收即可。其中，使用平均細孔徑0.001μm~0.01μm之超過濾膜較理想。

超過濾膜有平膜型、多段平膜型、中空纖維型等類型，均可使用。平膜型中，為了確保適當的過濾速度係將槽內加壓。加壓宜使用氮氣、氦氣、空氣等較佳。又，視需要，宜在反應槽內設製動葉輪較佳。藉由動葉輪攪拌液體，能防止膜表面的孔目堵塞，能維持更良好的過濾速度。另一方面，多段平膜型、中空纖維型之情形，藉由使用泵浦從基質供給槽向反應槽輸液，能保持適當的過濾壓力及線速度並維持更良好的過濾速度。

針對過濾方式，可列舉浸漬膜方式、超過濾方式、精密過濾方式等。又，加壓過濾、真空過濾、交叉流過濾、離心過濾等，可使用超過濾方式及精密過濾方式其中任一方式。前述過濾操作，可大致區分為定壓過濾、定流過濾、非定壓非定流過濾，但本發明中並不特別限定。

此外，本發明之前述回收步驟使用之膜之材質，可列舉乙酸纖維素、芳香族聚醯胺、聚乙烯醇、聚碸、聚二偏氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯腈、陶瓷、聚丙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(Teflon(註冊商標))等。該等之中，從纖維素酶之使用或於酸性條件下之反應之觀點考量，由非纖維素系且耐酸性之材質構成之聚丙烯腈或聚碸等膜較理想。

又，前述回收步驟使用之糖化反應液，也可不經前述固液分離等前處理而使用剛製造之糖化反應液。

依本發明之用於再利用之變異型木聚糖酶之製造方法所製造之用於再 利用之變異型木聚糖酶，與既述之本發明之變異型木聚糖酶同樣可使用在各種用途。又，前述用於再利用之變異型木聚糖酶，可使用於以下之單糖製造方法。

[單糖製造方法]

本發明之單糖製造方法，包含以下步驟：從由前述木質纖維素之糖化物之製造方法獲得之含有木質纖維素之糖化物之糖化反應液(以下有時簡單稱為「糖化反應液」)回收本發明相關的變異型木聚糖酶(以下有時稱為「回收步驟」)、使回收的變異型木聚糖酶與木質纖維素原料接觸以製造單糖(以下有時簡單稱為「再糖化步驟」)。

藉此，能有效活用本發明相關的變異型木聚糖酶。

前述回收步驟，係使用既述的回收步驟。

前述再糖化步驟中，係對於含有回收之變異型木聚糖酶的酵素液，追加既述之木質纖維素原料及水，並於控制pH、溫度的狀態邊攪拌邊再度進行糖化反應。針對pH或反應溫度的條件，可以與木質纖維素原料之糖化物之製造方法記載之條件為相同條件即可。

又，前述再糖化步驟中，除了追加投料的木質纖維素原料及水，宜更於前述回收步驟中追加固液分離時獲得之固體物較佳。藉此，能將於膜裝置或樹脂管柱經固液分離之固體物中所含之未反應之木質纖維素或該木質纖維素等吸附的變異型木聚糖酶有效活用。

本發明相關的再糖化步驟中，可追加前述變異型木聚糖酶或前述經固體成分離的固體物，也可追加兩者。

本發明相關的單糖製造方法中，前述回收步驟及再糖化步驟可以反複實施。藉此，可將前述經回收之變異型木聚糖酶之活性維持之期間中的觸媒成本減低。

又，本發明相關的單糖製造方法中，當重複實施前述回收步驟及再糖化步驟之情形，也可在前述再糖化步驟時重新追加變異型木聚糖酶。針對追加的變異型木聚糖酶之量不特別限定，從經濟性的觀點，宜為最初的糖 化反應使用之變異型木聚糖酶之量的50質量%以下較佳。又，從經濟性的觀點，成為最初的糖化反應使用的變異型木聚糖酶之量的20質量%以下較佳，成為最初的糖化反應使用之變異型木聚糖酶之量的10質量%以下更為理想。

依本發明之單糖製造方法，製造的單糖只要是木質纖維素來源之單糖即可。具體而言，可列舉葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、半乳糖等。

[漿泥之漂白方法]

本發明相關的漿泥之漂白方法，包含使前述變異型木聚糖酶與漿泥接觸的步驟。

本發明相關的漿泥之漂白方法，由於使用即使在酵素易失活的條件下仍能長期間穩定作用的前述變異型木聚糖酶，所以能於一般酵素易失活的條件下進行，能以良好效率將漿泥漂白。

使用在使前述變異型木聚糖酶與漿泥接觸之步驟的漿泥，可列舉木材漿泥及非木材漿泥。木材漿泥，例如以針葉樹或闊葉樹等作為原料者。又，非木材漿泥，例如係甘蔗榨渣的蔗渣(bagasse)、藁、麻、木綿等作為原料者。此外，也包括以報紙或雜誌等舊紙作為原料的舊紙漿泥。

該等漿泥，大致區分為從原料以物理性力將纖維取出的機械漿泥、及以化學性處理將纖維取出的化學漿泥。機械漿泥，例如可舉碎木漿泥、磨細的漿泥、熱機械性漿泥、化學熱機械性漿泥。又，化學漿泥，例如：可舉牛皮紙漿泥、鹼性漿泥、亞硫酸鹽漿泥。

於前述使變異型木聚糖酶與漿泥接觸的步驟中，除了前述變異型木聚糖酶以外，也可併用其他半纖維素酶或木質素分解酵素。藉此，能增強漿泥之漂白性。

半纖維素酶或木質素分解酵素之起源不限定，可列舉絲狀菌、擔子菌、細菌類等。

本發明相關的漿泥漂白方法，除了包含使前述變異型木聚糖酶與漿泥接觸之步驟以外，宜更包含脫木質素處理步驟、及漂白步驟較佳。

本說明書中，脫木質素處理步驟只要是能積極地將木質素從漿泥除去的方法均可使用，可使用自以往實施的方法。例如日本特開2004-263310號公報記載之方法。

本說明書中，漂白步驟只要是對於前述漿泥實施漂白處理的步驟即可，例如去除漿泥殘留的木質素、提高漿泥之白色度等為目的之步驟全都包含。又，該漂白步驟，係接續於前述脫木質素處理步驟的步驟，可以使用自以往實施的方法。例如日本特開2010-1594號公報記載之方法。

本發明相關的使前述變異型木聚糖酶與漿泥接觸之步驟中，當組合前述脫木質素處理步驟及前述漂白步驟進行之情形，前述使變異型木聚糖酶與漿泥接觸的步驟可從前述脫木質素處理步驟到接續於前述漂白步驟的步驟當中的任一時點實施。亦即，前述使變異型木聚糖酶與漿泥接觸之步驟，只要是在前述脫木質素處理步驟之前後及前述漂白步驟前後任一者實施即可。又，前述使變異型木聚糖酶與漿泥接觸之步驟，也可與前述脫木質素處理步驟或前述漂白步驟同時實施。

本發明相關的前述使變異型木聚糖酶與漿泥接觸之步驟，宜作為前述漂白步驟的一部分使用較佳。其中，從本發明之變異型木聚糖酶之性能發揮到最大限度的觀點，在前述漂白步驟中之木質素含量少的階段使用更理想。

又，前述使變異型木聚糖酶與漿泥接觸之步驟，也可作為前述漂白步驟當中，例如使用氯、二氧化氯、二氧化氮、次亞氯酸鹽、氧、過氧化氫、臭氧等之化學漂白的漂白步驟的一部分使用。

[清潔劑]

本發明之清潔劑，含有前述變異型木聚糖酶且視需要也可含有其他成分。

本發明之清潔劑，由於含有即使在酵素易失活之嚴峻條件下能顯示穩定的活性的前述變異型木聚糖酶，能提高清潔劑之性能。

本發明之清潔劑，包括衣物用清潔劑、自動食具洗滌機用清潔劑等各式各樣的清潔劑。又，也可作為家庭用及工業用的清潔劑。再者，本發明之清潔劑也可作為衣物用纖維製品的改質劑。

本發明之清潔劑作為衣物用纖維製品之改質劑使用之情形，可作為衣物用纖維、木綿纖維、麻纖維、嫘縈或天絲(tencel)此類含纖維素之纖維等的改質劑使用。

本發明之清潔劑，因應用途，除了前述變異型木聚糖酶以外也可摻合其他酵素。其他酵素，可使用在該技術領域中公知者。例如可列舉蛋白酶、纖維素酶、澱粉酶、脂肪酶。該等其他酵素之起源不限定，可列舉絲狀菌、擔子菌、細菌類等。

本發明之清潔劑中，除了前述其他酵素以外，也可摻合例如界面活性劑、洗滌助劑、漂白劑、螢光劑等通常清潔劑使用的各成分。

前述界面活性劑，例如陰離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑、兩性界面活性劑、陽離子性界面活性劑等。較佳為例如陰離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑。

前述陰離子性界面活性劑，例如：脂肪酸鈉(肥皂)、α-碸化脂肪酸酯鈉、直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS)、烷基硫酸酯鈉(AS)、烷醚硫酸酯鈉(AES)、α-烯烴磺酸鈉(AOS)、烷基磺酸鈉。

前述非離子性界面活性劑，例如：聚氧伸烷基烷醚(AE)、聚氧乙烯烷基苯醚(APE)、蔗糖脂肪酸鹽酯、山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、烷醇醯胺。

前述洗滌助劑，可列舉鹼性緩衝劑、二價金屬離子補充劑、再污染防止劑等，具體而言，可列舉三聚磷酸鹽、焦磷酸鹽等聚磷酸鹽、A型沸石等鋁矽酸鹽、碳酸鈉、倍半碳酸鈉、碳酸氫鈉等碳酸鹽、聚乙二醇、羧酸 系聚合物、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚環氧丙基酸鹽等聚合物、羧基甲基纖維素等纖維素衍生物、及聚天冬胺酸等胺基羧酸系之聚合物。

前述漂白劑，例如：次亞氯酸鈉、二氯異氰脲酸鹽、亞氯酸鈉、過氧化氫、過碳酸鈉、過硼酸鈉、過乙酸、亞硫酸氫鹽、二氧化硫尿酸。

前述螢光劑，可列舉雙(三氮雜苯基胺基)二苯乙烯(stilbene)二磺酸衍生物或雙苯乙烯基聯苯衍生物等。

本發明之清潔劑，可以與前述界面活性劑、前述洗滌助劑、前述漂白劑、前述螢光劑等組合並依常法製造。

清潔劑之形態可因應用途選擇，例如可製成液體、粉體、顆粒、糊劑、固體等。

[動物飼料]

本發明之動物飼料，含有前述變異型木聚糖酶且視需要也可含有其他成分。

本發明之動物飼料，含有即使在酵素易失活之嚴峻條件下仍顯示穩定活性的前述變異型木聚糖酶。藉此，本發明之動物飼料，由於該動物飼料所含之豐富的植物纖維被分解，所以攝取該動物飼料的動物對植物營養的吸收效率提高而且在動物胃內的消化能力可獲改善。

本發明之動物飼料中，前述變異型木聚糖酶之含量只要是能改善動物飼料之動物胃內的消化能力的量即可，不特別限定。

前述動物飼料，例如含有木聚糖之現成的動物飼料、穀類等。又，穀類中，尤佳為小麥、玉米、黑麥、大麥、燕麥、人工合成的黑小麥(triticale)、大米、及高粱等。

本發明之動物飼料中，前述變異型木聚糖酶也可以與其他飼料添加劑、或其他酵素組合使用。

前述其他飼料添加劑，例如：維生素飼料添加劑、礦物質飼料添加劑、 胺基酸飼料添加劑、滲透保護劑等。

前述其他的酵素，例如：纖維素酶或澱粉酶、蛋白酶等。該等酵素之起源不限定，可使用絲狀菌、擔子菌、細菌類等來源之酵素。

本發明之動物飼料可使用在廣範圍的動物。較佳為雞、火雞、鴨、鵝等家禽類，牛、馬、羊等反芻動物，豬等豬類，兔子等囓齒類，及魚類。

本發明之動物飼料，只要是添加有前述變異型木聚糖酶即可，可以用任意方法製造，該動物飼料之製造方法不特別限定。前述變異型木聚糖酶添加於動物飼料，例如可在飼料製造前、飼料製造中或製造的最終階段等任一階段實施。又，前述變異型木聚糖酶，也可以直接添加在成形為丸粒或粉料狀的現成的動物飼料。又，前述變異型木聚糖酶也可藉由直接添加在飲料水中以含有於動物飼料中。

[製麵包改質劑]

本發明之製麵包改質劑，含有前述變異型木聚糖酶且視需要也可含有其他的成分。

本發明之製麵包改質劑，含有即使在酵素易失活之嚴峻條件下仍顯示穩定活性的前述變異型木聚糖酶。藉此，本發明相關的製麵包改質劑在35℃~40℃之條件下且1小時至2小時的製麵包時之發酵步驟中仍顯示穩定的活性，所以能將麵粉的半纖維素部分予以分解，能將製麵包的性質予以改質。

本發明之製麵包改質劑，除了前述變異型木聚糖酶以外，也可含有其他的製麵包改質劑。前述其他的製麵包改質劑，例如：單甘油酯、有機酸單甘油酯、甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、山梨醇酐脂肪酸酯、磷脂質類、抗壞血酸類及其衍生物、有機酸類、胺基酸類、鹽類等。

成為添加本發明之製麵包改質劑的對象的麵包其種類，只要是混合麵包的材料並捏揉、發酵並進行烘烤等以製造者即可，除了麵包等以外，也 包括特殊麵包、預製麵包、酥皮點心、蒸麵包、鬆餅、甜甜圈等。

前述麵包之材料，可列舉麵粉、水或乳製品等水分、酵母、糖類、食鹽、油脂類(起酥油、豬脂、乳瑪琳、黃油、液狀油等)等。視需要也可加蛋、調味料(麩胺酸類、核酸等)、膨脹劑、香料等。又，若麵粉為主原料，也可與麵粉併用黑麥麵粉、米粉等。又，本說明書中，麵糰係指與前述麵包的材料混合並捏揉後得到者。

麵包之製造方法，只要是包括發酵步驟即可且只要是通常使用之方法即可，不特別限定，可使用例如：直接法、中種法、液種法等。

發酵步驟可使用通常使用的方法，但藉由將發酵溫度設定為較室溫高能縮短發酵時間，故於35℃~40℃進行1~2小時較佳。

本發明之製麵包改質劑，例如可以粉體形式混合於麵粉等原材料、或預先溶於水中後使用，又，也可在步驟中途以粉狀或液狀形態添加。

以上已針對本發明之實施形態記述，但該等為本發明之例示，上述以外的各種構成也可採用。

【實施例】

利用以下實施例更詳細說明本發明，但本發明不限定於以下實施例。又，實施例之組成物中，代表含有成分量之「%」，若無特別指明，係代表質量基準。

[實施例1]木聚糖酶活性之測定方法(標準分析法)

以DNS法(Bailey等、1992)測定經水解的木聚糖的還原糖之量，並測定木聚糖酶活性。

評價使用之基質，係在100mM檸檬酸鈉緩衝液(pH4.5)劇烈混合1%(w/w)的Birchwood木聚糖(Sigma Aldrich公司製)並於5000×g離心15分鐘後，使用上清液。

對於前述基質液混合木聚糖酶使為0.1%(w/w)，於45℃攪拌30分鐘邊反應，測定獲得之反應液中之還原糖之量，並測定木聚糖酶活性。

[實施例2]利用部位專一性突變誘發製作木聚糖酶變異體以及評價

(1)表現載體YEp-GAPDHp-GAs-TVX、YEp-GAPDHp-GAs-ACX之建構

(a)啟動子序列之取得：以Saccharomyces cerevisiae之基因體DNA序列作為模板，以PCR法取得甘油醛-3-磷酸去氫酶(以下簡稱GAPDH)之啟動子序列(GenBank Accession Number：A35397.1)。PCR使用之引子，記載於下列表4之序列編號55及56。

(b)信號序列之取得：以Rhizopus oryzae之基因體DNA序列作為模板，以PCR法取得葡糖澱粉酶基因之信號序列(GenBank Accession Number：D00049.1)。PCR使用之引子記載於下列表4之序列編號57及58。

(c)啟動子序列與信號序列之連結：將經PCR增幅的前述DNA序列以苯酚/氯仿溶液精製，進行乙醇沉澱並回收。將經精製的啟動子序列與信號序列以限制酶BglII消化後，各進行瓊脂電泳，切出含有目的DNA的碎片並精製。將以如此之方式獲得的碎片使用DNA接合酶(寶酒造公司製)連結(以下簡稱為GAPDHp-GAs)。

(d)T.viride來源木聚糖酶II基因之增幅：以T.viride之基因體DNA序列作為模板，以PCR法取得T.viride來源木聚糖酶II之全長基因(編碼為木聚糖酶基因之鹼基序列及分泌信號序列)。PCR使用之引子記載於下列表4之序列編號59及60。獲得之序列記載於序列表之序列編號74。

(e)A.cellulolyticus來源木聚糖酶基因之增幅：以A.cellulolyticus之基因體DNA序列作為模板，利用PCR法取得A.cellulolyticus來源木聚糖酶之全長基因(編碼為木聚糖酶基因之鹼基序列及分泌信號序列)。PCR使用之引子記載於下列表4之序列編號61及62。獲得之序列記載於序列表之序列編號75。

(f)啟動子序列、信號序列、木聚糖酶基因之連結：以(d)取得之T.viride來源木聚糖酶II作為模板，以PCR法取得信號序列以外編碼為木聚糖酶基因之鹼基序列。PCR使用之引子記載於下列表4之序列編號63及64。之後將獲得之碎片精製，以限制酶SacI消化後，與前述GAPDHp-GAs碎片接合(以下簡稱為GAPDHp-GAs-TVX)。

又，針對(e)取得之A.cellulolyticus來源之木聚糖酶I，也同樣利用PCR取得分泌蛋白質部分之基因並精製後，以限制酶SacI消化並與前述GAPDHp-GAs碎片接合(以下簡稱GAPDHp-GAs-ACX)。又，PCR使用之引子記載於下列表4之序列編號65及66。

又，在此所示之DNA碎片之精製或接合之手法與(c)相同。

(g)對於表現載體之導入：將前述GAPDHp-GAs-TVX碎片與出芽酵母用多副本載體YEp24(ATCC 7769)以限制酶XmaI與BamHI消化(前者約1.3kbp、後者約7.4kbp)，精製後接合，獲得T.viride來源木聚糖酶II變異體製作用質體(以下簡稱為YEp-GAPDHp-GAs-TVX)。又，同樣地，將GAPDHp-GAs-ACX與YEp24以限制酶XmaI與BamHI限制酶消化(前者約1.5kbp、後者約7.4kbp)，精製後接合，獲得A.cellulolyticus來源木聚糖酶I變異體製作用表現載體(以下簡稱為YEp-GAPDHp-GAs-ACX)。

又，在此所示之DNA碎片之精製或接合方法與(c)相同。又，YEp24可由細胞．微生物庫美國典型培養物保存中心取得。

(2)部位專一性突變誘發

本發明之實施例中使用之突變體係以(1)建構的表現載體作為模板，利用寶酒造公司製「LA PCR in vitro mutagenesis Kit」導入變異。

引子使用合成的寡核苷酸。

以表現載體YEp-GAPDHp-GAs-TVX作為模板，將以下表5之序列編號5及序列編號6、與序列編號7及序列編號8、與序列編號9及序列編號10、與序列編號11及序列編號12作為引子實施PCR，獲得變異型木聚糖酶表現載體YEp-GAPDHp-GAs-TVX01。

以表現載體YEp-GAPDHp-GAs-ACX作為模板，並將以下表5之序列編號21及序列編號22之序列作為引子，獲得序列表之序列編號2之154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之具有取代胺基酸殘基之YEp-GAPDHp-GAs-L154M。

以表現載體YEp-GAPDHp-GAs-ACX作為模板，並將以下表5之序列編號13及序列編號14、與序列編號15及序列編號16、與序列編號17及序列編號18、與序列編號19及序列編號20、與序列編號21及序列編號22、與序列編號23及序列編號24、與序列編號25及序列編號26、與序列編號27及序列編號28、與序列編號29及序列編號30之序列作為引子，同樣地獲得YEp-GAPDHp-GAs-ACX01。

以表現載體YEp-GAPDHp-GAs-ACX作為模板，並將以下表5之序列編號15及16、與序列編號21及序列編號22、與序列編號31及序列編號32、與序列編號33及序列編號34之序列作為引子，同樣地獲得YEp-GAPDHp-GAs-ACX02。

以表現載體YEp-GAPDHp-GAs-ACX作為模板，並將以下表5之序列 編號21及序列編號22、與序列編號31及序列編號32、與序列編號35及序列編號36、與序列編號37及序列編號38、與序列編號39及序列編號40之序列作為引子，同樣地獲得YEp-GAPDHp-GAs-ACX03。

將含有該變異型木聚糖酶之質體對於大腸菌HB101之勝任細胞(東洋紡公司製)轉形，獲得轉形體。

從該菌體利用鹼性SDS萃取法製備質體，以DNA定序儀將木聚糖酶基因部分之鹼基序列定序，確認在編碼係模板之YEp-GAPDHp-GAs-TVX、YEp-GAPDHp-GAs-ACX之木聚糖酶基因之部分導入了胺基酸取代。

(3)對於酵母轉形及生產變異型木聚糖酶

將由(2)製作之具有變異型木聚糖酶之表現載體使用Fast-Yeast Transformation Kit(G-Biosciences)對於Saccharomyces cerevisiae BY4741之勝任細胞轉形，並在SD-Ura瓊脂培養基(0.67% Yeast-nitrogen base without amino acids(Difco公司)、2%葡萄糖、0.5%酪蛋白胺基酸、0.077%-Ura DO Supplement(Clontech公司)、2%瓊脂、去離子水)上於30℃培養48小時。其結果取得之變異體如表6所示。

【表6】

(4)變異型木聚糖酶之穩定性之評價

將獲得之菌落接種於SD-Ura液體培養基(4%葡萄糖、無瓊脂、SD-Ura液體培養基，除此以外與前述培養基組成相同)，於30℃進行24小時前培養後，接種2%並進行48小時本培養，以離心分離含該變異型木聚糖酶之上清液後，於50℃~55℃進行加熱處理，並依實施例1所示之測定法評價殘存活性。

<TVX01>

將依實施例2-(2)記載之方法製作之變異型木聚糖酶於50℃進行0~72 小時熱處理後，依實施例1之測定方法測定殘存活性。其結果如表7。WT代表野生型，F、L、S、R代表序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中，相當於27號之酪胺酸殘基之胺基酸殘基取代為苯丙胺酸、相當於29號之天冬醯胺酸殘基之胺基酸殘基取代為白胺酸殘基、相當於44號之天冬醯胺酸殘基之胺基酸殘基取代為絲胺酸殘基、相當於58號之離胺酸殘基之胺基酸殘基取代為精胺酸殘基。又，相當於27號之酪胺酸殘基之胺基酸殘基取代為苯丙胺酸殘基的變異型木聚糖酶(表7(e))之製作，係使用表8記載之序列編號41與序列編號42的引子。

具有國際公開第2007/115391號小冊、國際公開第2001/27252號小冊、國際公開第2005/108565號小冊所示之據認為會帶來熱穩定化的特定之胺基酸殘基的有取代胺基酸殘基之變異型木聚糖酶，如表7之(d)、(f)及(h)所示，在24小時後完全失活。

又，如表7之(e)及(g)，27號之酪胺酸殘基取代為苯丙胺酸殘基之有取代胺基酸殘基之變異型木聚糖酶或44號之天冬醯胺酸殘基取代為絲胺酸殘基之有取代胺基酸殘基之變異型木聚糖酶，也在24小時後完全失活。

但是29號之天冬醯胺酸殘基取代為白胺酸殘基及58號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基之有取代胺基酸殘基之變異型木聚糖酶(表7(d))，藉由將27號之酪胺酸殘基取代為苯丙胺酸殘基而得以提高殘存活性，即使在72小時後仍顯示50%以上之殘存活性(表7(c))。

再者，藉由將前述變異型木聚糖酶之44號之天冬醯胺酸殘基取代為絲胺酸殘基，能維持同等於野生型(表7(a))之活性，即使在72小時後仍保留70%的活性(表7(b))。

又，本發明之具有4重變異點之許多變異體與TVX01有同程度的性質，具體而言，可列舉：具有4重變異點且同時序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中，47號之甘胺酸殘基取代為半胱胺酸殘基者、52號之麩醯胺酸殘基取代為離胺酸殘基者、59號之纈胺酸殘基取代為異白胺酸殘基者、67號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基者、69號之天冬醯胺酸殘基取代為異白胺酸殘基者、80號之絲胺酸殘基取代為丙胺酸殘基者、97號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基者、105號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基者、109號之蘇胺酸殘基取代為丙胺酸殘基者、120號之蘇胺酸殘基取代為精胺酸殘基者、143號之蘇胺酸殘基取代為異白胺酸殘基者、151號之天冬醯胺酸殘基取代為絲胺酸殘基者、161號之絲胺酸殘基取代為白胺酸殘基者、186號絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基者等。

<L154M>

利用含有以編碼為利用實施例2-(2)記載之方法製作之變異型木聚糖酶之胺基酸序列的鹼基序列表示之核酸的表現載體，依照實施例2-(3)記載之方法將酵母轉形並且將變異型木聚糖酶產生酵母進行液體培養，將其培養液之上清於50℃進行24小時熱處理後，依實施例1所示之測定方法測定殘存活性。

該變異型木聚糖酶之殘存活性為50%。又，針對熱處理前之反應初速 度，亦相對於野生型1，該變異型木聚糖酶為1.13之高。

<ACX01，ACX02，ACX03>

利用含有以編碼為依實施例2-(2)記載之方法製作之變異型木聚糖酶之胺基酸序列之鹼基序列表示之核酸的表現載體，依照實施例2-(3)記載之方法將酵母轉形並且將變異型木聚糖酶產生酵母進行液體培養，將其培養液之上清於50℃進行0~48小時熱處理後，依實施例1所示之測定方法測定殘存活性。其結果如表9。表中，WT代表野生型。

又，在此使用之液體培養基，係含有4%葡萄糖之SD(不含Ura)培養基。

野生型A.cellulolyticus來源木聚糖酶，在16小時之熱處理後完全失活(表9(i))。另一方面，變異型木聚糖酶之殘存活性提高，在48小時後仍顯示50%以上之殘存活性(表9(j)、(k)或(l))。ACX02、ACX03(表9(k)及(l))，針對熱處理前之反應初速度與野生型大致為同等，至於ACX01顯示接近野生型的2倍的活性(表9(j))。

又，具有ACX01之全部變異點的許多變異體顯示與ACX01為同程度之性質，具體而言，可列舉ACX01具有之變異點以外，序列表之序列編號3記載之胺基酸序列中，133號之絲胺酸殘基取代為天冬醯胺酸殘基、176號之麩醯胺酸殘基取代為精胺酸殘基者等。

又，針對ACX02亦同樣，具有其全部變異點之許多變異體顯示與ACX02有同程度的性質，具體而言，可列舉ACX02具有之變異點以外， 序列表之序列編號3記載之胺基酸序列中，90號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基、132號之麩醯胺酸殘基取代為精胺酸殘基、133號之絲胺酸取代為天冬醯胺酸殘基、174號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基、195號之脯胺酸殘基取代為組胺酸殘基、176號之麩醯胺酸殘基取代為精胺酸殘基、197號之絲胺酸殘基取代為天冬醯胺酸殘基、217號之甘胺酸殘基取代為麩胺酸殘基者等。

再者，具有ACX03之所有變異點之許多變異體顯示與ACX03為同程度之性質，具體而言，可列舉ACX03具有之變異點以外，序列表之序列編號3記載之胺基酸序列中，176號之麩醯胺酸殘基取代為精胺酸殘基者等。

[比較例]

藉由變異導入使酵素之耐熱性提高之情形，已知通常反應之初速度會大幅下降或完全失活。本申請案中亦為大部分獲得耐熱性提高但是反應初速度下降的變異體。其一例如表10所示。WT代表野生型、MT代表變異型。

又，該等變異體係依實施例2-(2)記載之方法製作。

MT1，係以質體YEp-GAPDHp-GAs-TVX作為模板，並以以下表11之序列編號43及序列編號44、與序列編號45及序列編號46、與序列編號47及序列編號48之序列作為引子。

MT2，係以質體YEp-GAPDHp-GAs-TVX作為模板，並以下表11之序列編號7及序列編號8、與序列編號47及序列編號48、與序列編號49及序列編號50之序列作為引子。

MT3，係以質體YEp-GAPDHp-GAs-ACX作為模板，並以以下表11之序列編號51及序列編號52、與序列編號53及序列編號54之序列作為引子。

表10中，MT1之變異點係指序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中，13號之酪胺酸殘基取代為苯丙胺酸殘基(Tyr13Phe)、47號之甘胺酸殘基取代為半胱胺酸殘基(Gly47Cys)、151號之天冬醯胺酸殘基取代為絲胺酸殘基(Asn151Ser)。

又，MT2之變異點，係指序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中， 46號之纈胺酸殘基取代為異白胺酸殘基(Val46Ile)、58號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基(Lys58Arg)、151號之天冬醯胺酸殘基取代為絲胺酸殘基(Asn151Ser)。

MT3之變異點，係指序列表之序列編號2記載之胺基酸序列中，100號之絲胺酸殘基取代為半胱胺酸殘基(Ser100Cys)、144號之天冬醯胺酸殘基取代為半胱胺酸殘基(Asn144Cys)。

[實施例3]以T.viride作為宿主大量生產TVX01及ACX02

(1)使用T.viride大量生產TVX01

(a)質體TVX01-pCB1之建構

以編碼為實施例2獲得之變異型木聚糖酶TVX01之鹼基序列作為模板，利用PCR法取得木聚糖酶部分之DNA序列。

PCR使用之引子記載於下列表12之序列編號67及序列編號68。

以實施例2-(1)(d)取得之T.viride來源木聚糖酶基因之全長作為模板，利用PCR法取得信號部分之DNA序列。PCR使用之引子記載於下列表12之序列編號69及序列編號70。

利用PCR法連結前述信號序列部分之DNA序列及木聚糖酶部分之DNA序列，取得前述信號序列部分之起始密碼子之上游之序列含有StuI、終始密碼子之下游含有XhoI之序列。

PCR使用之引子記載於下列表12之序列編號71及序列編號72。將增幅的0.7kbp的DNA碎片利用TOPO TA選殖套組(Invitrogen公司製)依附帶的實驗步驟插入到pCR2.1-TOPO表現載體，獲得質體TOPO-TVX01。

將質體「TOPO-TVX01」以StuI及XhoI切斷，獲得約0.7kbp之基因碎片「TVX01-N」。另一方面，將pCB1-Eg3X-hphless(國際公開第2011/021616號小冊)以StuI及XhoI切斷，回收約7kbp的碎片。將回收的碎片與約0.7kbp之基因碎片「TVX01-N」以DNA接合酶(寶酒造公司製)連結，製作質體「TVX01-pCB1」。針對酵素等反應條件，依照套組附帶的說明書的條件。質體「TVX01-pCB1」，係以使用於宿主T.viride內本身的起始密碼子表現TVX01之方式建構。

(b)利用質體「TVX01-pCB1」製作T.viride之轉形體

利用實施例3-(1)-(a)獲得之質體「TVX01-pCB1」將T.viride轉形，係依照國際公開第2011/021616號小冊記載之方法實施。以尿嘧啶生合成基因(pyr4)缺損株T.viride strain2株作為宿主，選擇標記採用Neurospora crassa(Neurospora crassa)之pyr4基因，利用共同轉形法實施轉形。又，T.viride strain2株，可依日本專利第4644603號說明書之段落編號[0102]記載之方法取得。亦即，如專利第4644603號說明書之段落編號[0102]記載，將綠木黴(Trichoderma viride)MC300-1株(FERM BP-6047)之約10⁹CFU/ml的胞子懸浮液在以30cm的高度開啟2盞UV燈之下邊溫和地混合邊照射。將UV照射後之胞子懸浮液塗佈在選擇培養基，於28℃培養7日。挑選生長的菌株，取得綠木黴(Trichoderma viride)之尿嘧啶需求株T.viride strain2株。選擇培養基之組成，係在最少培養基[0.2%磷酸2氫1鉀、0.4%硫酸銨、0.03%尿素、0.03%硫酸鎂7水合物、0.03%氯化鈣、0.5%葡萄糖、2.5%瓊脂、0.01%微量元素(5mg硫酸鐵7水合物、1.56mg硫酸錳7水合物、1.4mg硫酸鋅7水合物、2mg氯化鈷溶於1L水者)]添加10μg/mL之尿苷及1mg/mL之5-氟尿嘧啶者。

將T.viride strain2株懸浮於原生質化酵素溶液(1mg/mL β-葡萄糖醛酸苷酶、0.3mg/mL幾丁質分解酶、0.3mg/mL Zymolyase、0.5mol/L蔗糖)，使菌絲原生質化。將該懸浮液過濾及離心後，以SUTC緩衝液(0.5mol/L蔗糖、10mmol/L氯化鈣、10mmol/L Tris鹽酸(pH7.5))洗滌。

將上述原生質懸浮於100μL的SUTC緩衝液，並於其中加入含有10μg量之質體「TVX01-pCB1」之DNA溶液10μL及含有pyr4基因之DNA溶液10μL，於冰中靜置5分鐘。其次加入400μL的PEG溶液(60% PEG4000、10mmol/L氯化鈣、10mmol/L Tris鹽酸(pH7.5))，在冰中靜置20分鐘後，添加10mL的SUTC緩衝液並離心分離。將收集的原生質懸浮於1mL的SUTC緩衝液，以每次200μL與軟瓊脂一起重疊在含0.5mol/L蔗糖的最少培養基，於28℃培養5日後，將生長的菌落再度移植到最少培養基，以在此形成的菌落作為轉形體。

(c)「TVX01-pCB1」之轉形體之培養及鑑定

挑選導入質體「TVX01-pCB1」並於最少培養基有生長的菌株，依照國際公開第98/11239號小冊記載之方法培養。將獲得之培養液離心，將菌體與培養上清分離後，將該培養上清通過濾器(孔徑：0.2μm)進行過濾滅菌，製備培養上清液。將該培養上清液使用12% Gel SDS-PAGE mini(TEFCO公司製)實施電泳分離，挑選良好地檢測到TVX01的譜帶的培養上清。將挑選的培養上清液作為「經大量製備的TVX01」。

(2)使用T.viride大量生產ACX02

(a)適於在T.viride表現之ACX02基因密碼子之改變

為了使ACX02基因在T.viride中以有活性之蛋白質的形式高表現，製作A.cellulolyticus之信號序列與ACX02基因共計24個部位有鹼基改變的DNA。表13中，序列名「ACX02」之「鹼基的位置」，與序列編號4表示之野生型A.cellulolyticus木聚糖酶基因之鹼基的位置為一致。又，序列名「A.cellulolyticus信號序列」之「鹼基的位置」，代表序列編號73表示之鹼基的位置。

【表13】

該改變ACX02基因，係考慮在T.viride中之密碼子使用頻度分布而設計者。該改變ACX02基因係以GENEDESIGN(股)公司人工合成。又，人工合成時，係設計為在起始密碼子之上游之序列含有EcoRI與StuI、終始密碼子之下游含有XhoI與HindIII。獲得於pUC19之EcoRI/HindIII插入有密碼子改變ACX02基因之質體「pACX02」。

(b)質體ACX02-pCB1之建構

將質體「pACX02」以StuI及XhoI切斷，獲得約850bp之基因碎片「ACX02-N」。另一方面，將pCB1-Eg3X-hphless(國際公開第2011/021616號小冊)以StuI及XhoI切斷，回收約7kbp之碎片。將約850bp之基因碎片「ACX02-N」以DNA接合酶(寶酒造公司製)連結於回收的碎片，製作質體「ACX02-pCB1」。針對酵素等反應條件，係依照套組附帶的說明書的條件。 質體「ACX02-pCB1」，係以在宿主綠木黴(Trichoderma viride)內使用本身的起始密碼子表現ACX02之方式建構。

(c)利用質體「ACX02-pCB1」製作綠木黴(Trichoderma viride)之轉形體

利用實施例3-(2)-(b)獲得之質體「ACX02-pCB1」將綠木黴(Trichoderma viride)轉形，係依照國際公開第2011/021616號小冊記載之方法實施。以尿嘧啶生合成基因(pyr4)缺損株綠木黴(Trichoderma viride)strain2株作為宿主，選擇標記使用Neurospora crassa(Neurospora crassa)之pyr4基因，利用共同轉形法實施轉形。將綠木黴(Trichoderma viride)strain2株懸浮於原生質化酵素溶液(1mg/mL β-葡萄糖醛酸苷酶、0.3mg/mL幾丁質分解酶、0.3mg/mL Zymolyase、0.5mol/L蔗糖)，使菌絲原生質化。將該懸浮液過濾．離心後，以SUTC緩衝液(0.5mol/L蔗糖、10mmol/L氯化鈣、10mmol/L Tris鹽酸(pH7.5))洗滌。

將上述原生質懸浮於100μL的SUTC緩衝液，於其中加入含有10μg量之質體「ACX02-pCB1」的DNA溶液10μL及含有pyr4基因之DNA溶液10μL，於冰中靜置5分鐘。其次加入400μL的PEG溶液(60% PEG4000、10mmol/L氯化鈣、10mmol/L Tris鹽酸(pH7.5))，於冰中靜置20分鐘後，添加10mL的SUTC緩衝液並離心分離。將收集的原生質懸浮於1mL的SUTC緩衝液，以每次200μL與軟瓊脂一起重疊在含0.5mol/L蔗糖的最少培養基，於28℃培養5日後，將生長的菌落再度移植到最少培養基，以在此形成的菌落作為轉形體。

(d)「ACX02-pCB1」之轉形體之培養及鑑定

挑選導入質體「ACX02-pCB1」並於最少培養基有生長的菌株，依照國際公開第98/11239號小冊記載之方法培養。

將獲得之培養液離心，將菌體與培養上清分離後，將該培養上清通過濾器(孔徑：0.2μm)進行過濾滅菌，製備培養上清液。將該培養上清液使用以SDS-PAGE處理，挑選良好地檢測到ACX02的譜帶的培養上清。將挑選的培養上清液作為「經大量製備的ACX02」。

[實施例4]伴隨溫度與pH變化之TVX01之穩定性之變動

使用依實施例3所示之方法大量製備的TVX01，進行以下所述的實驗。將200mM的各種緩衝液(後述)與木聚糖酶以1：1混合，於各種溫度處理一定時間後，靜置於冰浴5分鐘後，以實施例1所示之方法測定殘存活性。又，在此使用的緩衝液係檸檬酸鈉緩衝液(pH4.5)、Tris鹽酸緩衝液(pH8~pH9)、甘胺酸鈉緩衝液(pH10)。

TVX01，在pH4.5、50℃中，72小時熱處理後仍有86%之活性。又，於高溫70℃中，pH5.5(該變異體木聚糖酶原液之pH)、5分鐘之熱處理後仍有68%之活性。任一條件均為野生型完全失活的條件，該變異體在酸性且高溫下的殘存活性有所提高。

又，於pH8~pH10、50℃，60分鐘的熱處理後，野生型之殘存活性，於pH8為28%、pH9為8%，於pH10完全失活，相對於此，該變異體於pH8有83%、於pH9有60%、於pH10有56%的活性。此外，於野生型完全失活的60℃、60分鐘的熱處理後，該木聚糖酶在pH8有30%、在pH9有17%、在pH10中有10%的活性，在鹼性及高溫下的殘存活性提高。

如以上所述，本發明之TVX01在pH4.5、pH8~pH10及50℃~70℃這樣的野生型酵素顯著失活的條件中，顯示殘存活性顯示提高。

[實施例5]伴隨溫度與pH之變化之ACX02之穩定性之變動

使用依實施例3所示之方法大量製備的ACX02，與實施例4同樣進行實驗。

大量製備的ACX02，在pH4.5、50℃中，72小時熱處理後仍有84%的活性。同樣經處理的野生型之木聚糖酶，活性下降到45%，該變異型木聚糖酶比野生型於酸性及高溫下的殘存活性提高。

又，於pH8~pH10、50℃中，60分鐘的熱處理後，野生型完全失活，相對於此，ACX02於pH8有34%、於pH9有5%、於pH10中有2%的活性，於鹼性及高溫下中的殘存活性提高。

如以上，本發明之ACX02在pH4.5、pH8~pH10及50℃這樣的野生型顯著失活的條件中，顯示顯著的殘存活性提高。

[實施例6]木質纖維素原料之糖化反應(1)

於三角燒瓶裝入乾燥重量2g之闊葉樹牛皮紙漿泥(LBKP)後，將含有依實施例3之方法大量製備的ACX02、TVX01、作為實驗對照之含有T.viride來源之野生型木聚糖酶及A.cellulolyticus來源之野生型木聚糖酶之纖維素酶水溶液，各以相當於蛋白質重量52mg加入到該三角燒瓶，注入20mM檸檬酸鈉緩衝液(pH4.5)，製備20g反應液，以矽栓密閉。之後，於50℃緩慢攪拌進行糖化反應。其結果如表14所示。WT代表野生型木聚糖酶。

經過72小時後，A.cellulolyticus來源及T.viride來源之野生型木聚糖酶之殘存活性下降到約30%(表14(m)，(o))，相對於此，大量製備的ACX02及大量製備的TVX01顯示90%以上之殘存活性(表14(n)，(p))。

[實施例7]木質纖維素原料之糖化反應(2)

(1)糖化反應

於可分離燒瓶中裝入乾燥重量40g之闊葉樹牛皮紙漿泥(LBKP)後，以實施例3之方法將含有大量製備之TVX01、ACX02之纖維素酶水溶液各以相當於蛋白質重量347mg加熱到該可分離燒瓶，注入20mM檸檬酸鈉緩衝液(pH4.5)，製備400g反應液。之後，於50℃緩慢攪拌進行糖化反應，以HPLC分析72小時反應後之生成單糖量。

<HPLC分析條件>

分析設備：日本分光HPLC

管柱：ULTRON PS-80H(300×8mm；信和化工(股)公司製)

分析溫度：50℃

移動相：過氯酸水溶液pH2.1

(2)酵素之回收

回收將該糖化反應液(72小時反應液)以7000×g離心而得的沉澱物。將離心上清液以市售UF膜(商品名；MicrozaUF鉛筆型模組AIP-0013D、旭化成化學(股)公司製)處理，獲得濃縮級分。

(3)使用回收酵素之再糖化反應

於可分離燒瓶中裝入上述糖化反應液之7000×g離心沉澱物及以UF膜處理獲得之濃縮級分，添加闊葉樹牛皮紙漿泥(LBKP)使最終固體成分為40g，於50℃緩慢攪拌，進行糖化反應，以HPLC分析72小時反應後之生成單糖量。

(4)糖化反應結果

從開始最初反應(第0次酵素再利用)72小時後，含TVX01之糖化反應液中之葡萄糖及木糖之累積濃度為79.1g/L。其中，葡萄糖之累積濃度為65.1g/L。另一方面，含野生型之T.viride來源木聚糖酶之糖化反應液中之葡萄糖及木糖之累積濃度為78.0g/L、葡萄糖之累積濃度為64.7g/L。同樣地，含ACX02之糖化反應液中，葡萄糖及木糖之累積濃度為61.3g/L、葡萄糖之累積濃度為49.9g/L。將該等糖化反應液中之酵素利用前述方法再利用於糖化反應。

第1次再利用之葡萄糖及木糖之累積濃度，在含TVX01之糖化反應液中為70.7g/L、在含野生型之T.viride來源木聚糖酶之糖化反應液中為53.3g/L、在含ACX02之糖化反應液中為53.1g/L。

第1次再利用之葡萄糖之累積濃度，在含TVX01之糖化反應液中為58.7g/L、在含野生型之T.viride來源木聚糖酶之糖化反應液中為45.0g/L、在含ACX02之糖化反應液中為43.5g/L。

第2次再利用之葡萄糖與木糖之累積濃度，在含TVX01之糖化反應液為63.6g/L、在含野生型之T.viride來源木聚糖酶之糖化反應液中為42.3g/L、在含ACX02之糖化反應液中為42.6g/L。

第2次再利用之葡萄糖之累積濃度，在含TVX01之糖化反應液中為53.0g/L、在含野生型之T.viride來源木聚糖酶之糖化反應液中為35.8g/L、在含ACX02之糖化反應液中為34.6g/L。

獲得之結果係以令第0次再利用之糖累積濃度為100%時的相對值表示。其結果如表15及表16。又，WT代表野生型木聚糖酶。

如表15所示可知：再利用酵素之糖化反應中，本發明之變異型木聚糖酶TVX01及ACX02可理想地利用。

又，如表16所示可知：藉由使用本發明之變異型木聚糖酶，不僅木糖之生產性提高，葡萄糖之生產性也能提高。

此外，對於針葉樹來源漿泥(NBKP)使用本發明之TVX01及ACX02也能獲得前述同樣的效果。

[實施例8]漿泥之漂白方法

(1)漿泥之木聚糖酶處理

漿泥使用市售的牛奶盒。牛奶盒的原料係針葉樹之間伐材或製材時產生的端材等，為含有係著色成分之木質素的未經利用的漿泥。

將充分洗淨的牛奶盒裁切成約5cm四方，浸於水約2日~5日。之後，剝除表面的聚乙烯膜。

將浸過前述紙片的水加熱到50℃，並添加本發明之變異型木聚糖酶TVX01及變異型木聚糖酶ACX02。又，作為比較對象，對於各野生型之木聚糖酶也同樣處理。在此使用之木聚糖酶均為絲狀菌來源。木聚糖酶之添加量，係探討成為最適摻合比。又，處理時間也探討最適處理時間。此外，準備未經木聚糖酶處理者。

之後，加入市售氯系漂白劑，在pH7~pH10將前述紙片靜置半日。充分水洗後，切成細碎，以家庭用混合器與適量水同時攪拌到看不見紙片為止。

使用市售的壓紙器將前述纖維加工為紙狀，去除水分後使乾燥。

(2)白色度之測定

以紫外可見分光白色度計測定前述製作之紙之白色度(JIS Z 8715)。

(3)於添加本發明之變異型木聚糖酶TVX01及變異型木聚糖酶ACX02之情形，於pH7~pH10之條件下仍能將漿泥漂白。

[實施例9]清潔劑

(1)起毛布之洗滌

洗濯對象使用起毛的舊布料。又，清潔劑使用於市售清潔劑添加了本發明之變異型木聚糖酶TVX01或變異型木聚糖酶ACX02者。又，作為比較對象，對於各野生型之木聚糖酶也同樣處理。在此使用之木聚糖酶均為絲狀菌來源。另外，也準備未經木聚糖酶處理者。木聚糖酶之添加量，係探討成為最適摻合比。添加之時點係與投入清潔劑同時。

在1L的可分離燒瓶中裝入800ml水，添加前述清潔劑與木聚糖酶，邊 於60rpm旋轉邊於pH7~pH10、50℃進行1小時之洗滌。之後使自然乾燥。

(2)起毛除去度之測定

以實體顯微鏡觀察起毛除去的狀態。又，使用分光測色計測定洗滌後之布料的起毛除去度。

(3)於添加了本發明之變異型木聚糖酶TVX01及變異型木聚糖酶ACX02之情形，於pH7~pH10、溫度50℃之條件下，起毛受抑制。

[實施例10]動物飼料

(1)動物飼料之製造

於實驗動物用粉末飼料中添加本發明之變異型木聚糖酶TVX01或變異型木聚糖酶ACX02。又，作為比較對象，也以各野生型之木聚糖酶同樣進行處理。在此使用之木聚糖酶均為絲狀菌來源。令外，也準備未經木聚糖酶處理者。木聚糖酶之添加量，係探討最適摻合比，並將混合物丸粒化。

(2)成型後動物飼料中之細胞壁分解度之測定

將成型的動物飼料靜置一晚後，以市售的剃毛的刀片切片，於製備的載玻片上進行革蘭氏染色，於光學顯微鏡觀察細胞壁的染色度。又，將靜置一晚的動物飼料於100mM檸檬酸鈉緩衝液(pH4.5)劇烈混合，以5000×g進行15分鐘離心後，分取上清液，以DNS法(Bailey等、1992)測定上清液所含的還原糖之量。

[實施例11]製麵包改質劑

(1)麵包之製造

以直接法製造麵包。原料之摻合如以下之表17所示。均採用一般市售的家庭用材料。

【表17】

添加本發明之變異型木聚糖酶TVX01或變異型木聚糖酶ACX02作為製麵包改質劑。又，作為比較對象，也以各野生型之木聚糖酶同樣進行處理。

添加之時點係與混合原料設為同時。木聚糖酶之添加量，係探討成為最適摻合比。又，也準備未經木聚糖酶處理者。

將製得的麵糰，在約37℃費時約1小時~2小時發酵直到成為約2倍大小為止。之後以微波爐烘烤。

(2)麵包之粒子結構觀察

將烘烤過的麵包以市售剃毛的刀片切片，以實體顯微鏡觀察粒子結構。

(3)麵包體積之測定

將經烘烤的麵包靜置一晚後，以菜種取代法測定加熱過的麵包的麵包體積。

(4)於添加了本發明之變異型木聚糖酶TVX01及變異型木聚糖酶ACX02之情形，在發酵步驟能於35℃~40℃、1小時至2小時之條件下穩定反應。

2011年11月25日提申之日本申請案編號第2011-257389號及2012年4月24日提申之日本申請案編號第2012-099096號之揭示其全體納入於本說明書作為參照。

本說明書記載之全部文獻、專利申請案、及技術規格，各個文獻、專利申請案、及技術規格納入作為參照係與具體且分別記載之情形為同程度，納入於本說明書中作為參照。

<110> Mitsui Chemicals,Inc.Meiji Seika Pharma Co.,Ltd

<120> Thermostable xylanase,production method and use thereof,and method for producing lignocellulosic glycation product

<130> P001201039

<150> JP2011-257389

<151> 2011-11-25

<150> JP2012-099096

<151> 2012-04-24

<160> 75

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 190

<212> PRT

<213> Trichoderma viride

<400> 1

<210> 2

<211> 243

<212> PRT

<213> Acremonium cellulolyticus

<400> 2

<210> 3

<211> 573

<212> DNA

<213> Trichoderma viride

<400> 3

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<211> 732

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<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligonucleotide to act as a PCR primer

<400> 67

<210> 68

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligonucleotide to act as a PCR primer

<400> 68

<210> 69

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligonucleotide to act as a PCR primer

<400> 69

<210> 70

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligonucleotide to act as a PCR primer

<400> 70

<210> 71

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligonucleotide to act as a PCR primer

<400> 71

<210> 72

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligonucleotide to act as a PCR primer

<400> 72

<210> 73

<211> 117

<212> DNA

<213> A.cellulolyticus

<400> 73

<210> 74

<211> 672

<212> DNA

<213> T.viride

<400> 74

<210> 75

<211> 849

<212> DNA

<213> A.cellulolyticus

<400> 75

Claims (31)

1. 一種木質纖維素之糖化物製造方法，其係包含以下步驟：使木質纖維素原料與熱穩定性木聚糖酶接觸。
2. 如申請專利範圍第1項之木質纖維素之糖化物製造方法，其中，該木質纖維素原料為漿泥。
3. 一種糖化物製造方法，其係包含以下步驟：從含有由依如申請專利範圍第1或2項之糖化物製造方法獲得之木質纖維素之糖化物之糖化反應液回收熱穩定性木聚糖酶、及使回收的熱穩定性木聚糖酶與木質纖維素原料接觸以製造糖化物。
4. 如申請專利範圍第3項之糖化物製造方法，其係將該糖化反應液以離心分離或精密過濾膜予以固液分離，並將分離的液體以超過濾膜予以超過濾，而將木質纖維素之糖化物與該熱穩定性木聚糖酶分離、回收。
5. 如申請專利範圍第4項之糖化物製造方法，其係使以該離心分離或精密過濾膜固液分離之固體及以超過濾膜回收之熱穩定性木聚糖酶與木質纖維素原料接觸以製造糖化物。
6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之糖化物製造方法，其中，該熱穩定性木聚糖酶為：相較於對應之野生型木聚糖酶，反應之初速度為70%以上，且於50℃及24小時之熱處理後之木聚糖酶活性比起熱處理前之木聚糖酶活性為50%以上，且具有取代胺基酸殘基之變異型木聚糖酶。
7. 如申請專利範圍第6項之糖化物製造方法，其中，該變異型木聚糖酶係至少具有以下取代胺基酸殘基之變異型木聚糖酶：序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中，29號之天冬醯胺酸殘基取代為白胺酸殘基、58號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基、27號之酪胺酸殘基取代為與酪胺酸殘基不同之其他胺基酸殘基，且44號之天冬醯胺酸殘基取代為與天冬醯胺酸殘基不同之其他胺基酸殘基。
8. 如申請專利範圍第7項之糖化物製造方法，其係將取代該變異型木聚糖酶之27號之酪胺酸殘基之與酪胺酸殘基不同之其他胺基酸殘基為苯丙胺酸殘基，且取代44號之天冬醯胺酸殘基之與天冬醯胺酸殘基不同之其他胺基酸殘基為絲胺酸殘基之變異型木聚糖酶用於糖化物製造。
9. 如申請專利範圍第6項之糖化物製造方法，其中，該變異型木聚糖 酶係序列表之序列編號2記載之胺基酸序列中，至少154號之胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基之變異型木聚糖酶。
10. 如申請專利範圍第9項之糖化物製造方法，其係將至少含有該變異型木聚糖酶之33號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基之取代胺基酸殘基、36號之甘胺酸殘基取代為精胺酸殘基之取代胺基酸殘基、90號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基之取代胺基酸殘基、132號之麩醯胺酸殘基取代為精胺酸殘基之取代胺基酸殘基、154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基、174號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基之取代胺基酸殘基、195號之脯胺酸殘基取代為組胺酸殘基之取代胺基酸殘基、197號之絲胺酸殘基取代為天冬醯胺酸殘基之取代胺基酸殘基、及217號之甘胺酸殘基取代為麩胺酸殘基之取代胺基酸殘基之變異型木聚糖酶用於糖化物製造。
11. 如申請專利範圍第9項之糖化物製造方法，其係將至少含有該變異型木聚糖酶之30號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基之取代胺基酸殘基、33號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基之取代胺基酸殘基、36號之甘胺酸殘基取代為精胺酸殘基之取代胺基酸殘基、及154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基之變異型木聚糖酶用於糖化物製造。
12. 如申請專利範圍第9項之糖化物製造方法，其係將至少含有該變異型木聚糖酶之30號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基之取代胺基酸殘基、59號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基之取代胺基酸殘基、154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基、239號之酪胺酸殘基取代為組胺酸殘基之取代胺基酸殘基、及242號之半胱胺酸殘基取代為絲胺酸殘基之取代胺基酸殘基之變異型木聚糖酶用於糖化物製造。
13. 一種變異型木聚糖酶，其係至少具有序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中，29號之天冬醯胺酸殘基取代為白胺酸殘基、58號之離胺酸殘基取代為精胺酸殘基、27號之酪胺酸殘基取代為與酪胺酸殘基不同的其他胺基酸殘基，且44號之天冬醯胺酸殘基取代為與天冬醯胺酸殘基不同之其他胺基酸殘基之取代胺基酸殘基。
14. 如申請專利範圍第13項之變異型木聚糖酶，其中，序列表之序列編號1記載之胺基酸序列中，取代27號之酪胺酸殘基之與酪胺酸殘基為不 同之其他胺基酸殘基為苯丙胺酸殘基，且取代44號之天冬醯胺酸殘基之與天冬醯胺酸殘基不同之其他胺基酸殘基為絲胺酸殘基。
15. 一種變異型木聚糖酶，其中，序列表之序列編號2記載之胺基酸序列中，至少154號之白胺酸殘基取代為其他胺基酸殘基。
16. 如申請專利範圍第15項之變異型木聚糖酶，其係至少包含序列表之序列編號2記載之胺基酸序列中，33號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基之取代胺基酸殘基、36號之甘胺酸殘基取代為精胺酸殘基之取代胺基酸殘基、90號之蘇胺酸殘基取代為絲胺酸殘基之取代胺基酸殘基、132號之麩醯胺酸殘基取代為精胺酸殘基之取代胺基酸殘基、154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基、174號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基之取代胺基酸殘基、195號之脯胺酸殘基取代為組胺酸殘基之取代胺基酸殘基、197號之絲胺酸殘基取代為天冬醯胺酸殘基之取代胺基酸殘基、及217號之甘胺酸殘基取代為麩胺酸殘基之取代胺基酸殘基。
17. 如申請專利範圍第15項之變異型木聚糖酶，其係至少包含序列表之序列編號2記載之胺基酸序列中，30號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基之取代胺基酸殘基、33號之天冬醯胺酸殘基取代為天冬胺酸殘基之取代胺基酸殘基、36號之甘胺酸殘基取代為精胺酸殘基之取代胺基酸殘基、及154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基。
18. 如申請專利範圍第15項之變異型木聚糖酶，其係至少包含序列表之序列編號2記載之胺基酸序列中，30號之異白胺酸殘基取代為纈胺酸殘基之取代胺基酸殘基、59號之絲胺酸殘基取代為蘇胺酸殘基之取代胺基酸殘基、154號之白胺酸殘基取代為甲硫胺酸殘基之取代胺基酸殘基、239號之酪胺酸殘基取代為組胺酸殘基之取代胺基酸殘基、及242號之半胱胺酸殘基取代為絲胺酸殘基之取代胺基酸殘基。
19. 一種核酸，其係以編碼為如申請專利範圍第13至18項中任一項之變異型木聚糖酶之胺基酸序列的鹼基序列表示。
20. 一種表現載體，其係包含如申請專利範圍第19項之核酸。
21. 一種轉形體，其係包含如申請專利範圍第20項之表現載體。
22. 如申請專利範圍第21項之轉形體，其係以大腸菌、枯草菌、酵母、放線菌或絲狀菌來源之細胞作為宿主細胞。
23. 如申請專利範圍第22項之轉形體，其中，該絲狀菌屬於木黴(Trichoderma)屬、頂孢黴(Acremonium)屬、腐質黴(Humicola)屬或麴黴(Aspergillus)屬。
24. 如申請專利範圍第22或23項之轉形體，其中，該絲狀菌為綠木黴(Trichoderma viride)、Acremonium cellulolyticus、特異腐質黴(Humicola insolens)或黑麴黴(Aspergillus niger)。
25. 一種變異型木聚糖酶之製造方法，其係包含以下步驟：培養如申請專利範圍第21至請求項24項中任一項之轉形體，從培養之轉形體及該轉形體之培養物當中至少其中之一者回收如申請專利範圍第13至18項中任一項之變異型木聚糖酶。
26. 一種變異型木聚糖酶，其係利用如申請專利範圍第25項之變異型木聚糖酶之製造方法製造。
27. 一種組成物，其係含有如申請專利範圍第13至18及21項中任一項之變異型木聚糖酶。
28. 一種漿泥之漂白方法，其係包含以下步驟：使如申請專利範圍第13至18及21項中任一項之變異型木聚糖酶與漿泥接觸。
29. 一種清潔劑，其係包含如申請專利範圍第13至18及21項中任一項之變異型木聚糖酶。
30. 一種動物飼料，其係包含如申請專利範圍第13至18及21項中任一項之變異型木聚糖酶。
31. 一種製麵包改質劑，其係包含如申請專利範圍第13至18及21項中任一項之變異型木聚糖酶。