TW201329235A

TW201329235A - 增加植物類病毒顆粒產率

Info

Publication number: TW201329235A
Application number: TW101135891A
Authority: TW
Inventors: Aoust Marc-Andre D; Manon Couture; Louis-Philippe Vezina
Original assignee: Medicago Inc
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2013-07-16
Also published as: IL231587B; ES2951259T3; SG11201400712VA; HK1200179A1; PT2760882T; MX358883B; TWI700368B; US20150104480A1; AU2012315421C1; SG10201708052XA; CA2850407C; SI2760882T1; HRP20230695T1; RU2014116371A; MX2018006627A; JP6248040B2; IL231587A0; EP3626733A1; AU2012315421B2; EP3626733B1

Abstract

提供一種生產植物類病毒顆粒(VLP)的方法。該方法係包含將一第一核酸與一第二核酸引入該植物，或該植物的部分。該第一核酸包含在植物中具活性的一第一調節區域並且被操作性地連接至一編碼一結構性病毒蛋白的一核苷酸序列。第二核酸包含在植物中具活性的一第二調節區域並且被操作性地連接至編碼一通道蛋白(其例如但不限於一質子通道蛋白)的一核苷酸序列。將該植物或該植物的部分在容許該核酸表現的條件下培養，從而生產VLP。

Description

增加植物類病毒顆粒產率

本發明係相關於生產植物病毒蛋白。更具體地，本發明係相關於生產並且增加植物類病毒顆粒生產。

流行性感冒係由一正粘病毒科(orthomyxoviridae)的RNA病毒引起。這些病毒有三類型並且它們引起三個不同類型的流行性感冒：A型、B型與C型。A型流感病毒感染哺乳動物(人類、豬、雪貂、馬)以及鳥類。由於此類型病毒是已造成全世界流行的病毒類型，這對於人類是非常重要的。B型流感病毒(又簡稱為B型流感)僅感染人類。它偶爾引發流感的地方性爆發。C型流感病毒亦僅感染人類。它們感染大多數年輕的人類並且鮮少造成嚴重的疾病。

疫苗接種經由在感染前誘發個體發動防禦而提供對由類似媒介物引起之疾病的保護。慣例地，此經由感染物之活的減毒(live attenuated)形式或完全去活化(whole inactivated)形式的使用作為免疫原(immunogen)而達成。為了避免使用全病毒(例如殺死的或減弱的病毒)作為疫苗的危險，已將重組病毒蛋白例如次單元(subunit)實行為疫苗。胜肽與次單元兩者皆受到一些潛在的限制。由於不正確的折疊或不良抗原呈現(antigen presentation)，次單元疫苗可能表現不良免疫性 (immunogenicity)。主要問題為在其自然環境中確保工程蛋白的構型仿似抗原的構型之困難度。必須使用適合的佐劑，並且在胜肽的例子中，須使用載體蛋白以加強免疫反應。此外，這些疫苗主要引起體液免疫反應(humoral response)，並因此可能無法引起有效的免疫。次單元疫苗對於可證實以全去活化病毒提供保護的疫病經常是無效的。

類病毒顆粒(VLP)為列入產生免疫的組成物的潛在候選。VLP酷似成熟的病毒粒子，但它們不包含病毒的遺傳物質。因此，VLP本質上為不可複製的，使得將它們實施為疫苗是安全的。此外，可將VLP設計為在VLP的表面上表現病毒醣蛋白，其為其最天然的生理構形。此外，因為VLP類似完整的病毒粒子並且為多價粒子結構，比起可溶的套膜蛋白抗原，VLP在引發對醣蛋白的中和抗體可能是更有效的。

已在植物中(WO2009/009876；WO 2009/076778；WO 2010/003225；WO 2010/003235；WO 2011/03522；WO 2010/148511；將其以引用的方式併入本文)，以及在昆蟲以及哺乳動物系統中(Noad,R.and Roy,P.,2003,Trends Microbiol 11：438-44；Neumann et al.,2000,J.Virol.,74,547-551)生產VLP。Latham與Galarza(2001,J.Virol.,75,6154-6165)報導在以共同表現血球凝集素(HA)、神經胺酸酶(NA)、M1與M2基因的重組桿狀病毒感染之昆蟲細胞中流感VLP的生成。此研究證實了於真核細胞中共同表現時流感病毒粒子蛋白的自組裝，以及需要M1基質蛋白供VLP產生。然而，Gomez-Puertas et al.(1999,J.Gen.Virol,80,1635-1645)亦顯示M2的過量表現完全阻斷CAT RNA傳輸至MDCK培養株。

M2作用為離子通道蛋白並且已顯示當過量表現此蛋白質時，共同表現的HA之胞內運輸被抑制，以及血球凝集素(HA)於細胞膜的累積減少75-80%(Sakaguchi et al.,1996；Henkel & Weisz,1998)。此外，經由過量表現M2，病毒膜蛋白於細胞膜的累積降低，因而產生的功能VLP數目急劇降低。

M2蛋白於A型流感感染的細胞之細胞表面豐富地表現(Lamb et al.(1985)Cell,40,627至633)。亦在病毒顆粒本身的膜發現此蛋白質，但量少得多，每病毒粒子14至68分子的M2(Zebedee and Lamb(1988)J.Virol.62,2762至72)。經由在位置50之半胱胺酸上加入棕櫚酸，M2蛋白被轉譯後修飾(Sugrue et al.(1990)Virology 179,51至56)。

M2蛋白為由兩個二硫鍵連接的二聚體構成的同型四聚體，其經由非共價交互作用抓在一起(Sugrue與Hay(1991)Virology 180,617至624)。經由位點定向突變誘發(site-directed mutagenesis)，Holsinger與Lamb,(1991)Virology 183,32至43證實於第17以及第19位的半胱胺酸殘基涉及二硫鍵橋生成。僅有位於第17位的半胱胺酸存在於所有分析的病毒中。在半胱胺酸19亦存在的病毒株中，不清楚第二個二硫鍵橋是否在相同二聚體(已經由Cys 17-Cys 17連接)或伴隨其他二聚體形成。

Smith et al.(美國專利申請書2010/0143393)以及Song et al.(Plos ONE 2011 6(1)：e14538)描述含有流感M2蛋白的疫苗與VLP。VLP包含至少一病毒核心蛋白，例如M1。此核心蛋白驅動出芽以及顆粒從昆蟲宿主細胞的釋放。Szecsi et al.(Virology Journal,2006,3：70)在衍生自鼠類白血病病毒(MLV)複製缺失核心顆粒組裝VLP。此設計的流感VLP係經由暫時共同表達的細胞表面(HA、NA、M2)以及內部病毒組成物(Gag、GFP標記基因組) 衍生，並且存放於其表面HA、HA以及NA或M2或是衍生自H7N1或H5N1病毒的全部三個蛋白質。根據Szecsi et al.，在Flu-VLP生產期間M2的表現不影響HA或NA至病毒顆粒的合併(Szecsi et al.中的第2頁，右欄，第二段)。

本發明的目標為提供增加植物類病毒顆粒生產之改良方法。

根據本發明提供生產植物類病毒顆粒(VLP)的方法(A)，其包含a)將包含在植物中具活性的一第一調節區域並且操作性地連接至編碼一結構性病毒蛋白的核苷酸序列之第一核酸引入至植物或植物的部分，b)將包含在植物中具活性的一第二調節區域並且操作性地連接至編碼一通道蛋白的核苷酸序列之第二核酸引入c)在容許核酸表現的條件下培養植物或植物的部分，從而生產VLP。

在植物中具活性的第一調節區域，以及在植物中具活性的第二調節區域可以是相同或不同的。

上述方法(A)中的通道蛋白可為質子通道蛋白。該質子通道蛋白可選自M2或BM2。此外，質子通道蛋白可包含質子通道識別序列HXXXW。M2蛋白可為從流感A/波多黎各/8/1934(SEQ ID NO：14)或從流感A/新喀里多尼亞/20/1999(SEQ ID NO：11)獲得之M2蛋白。

本發明亦提供如同上述的方法(A)，其中該結構性病毒蛋白包含三聚(trimerization)區域。此外，編碼該結構性病毒蛋白的核苷酸序列包含嵌合核苷酸序列，其依序編碼抗原病毒蛋白或其片段、流感穿膜區域以及胞質尾。該結構性病毒蛋白可包含流感HA蛋白質。此外流感HA蛋白中的一或更多的蛋白水解環可能被刪除。

本發明提供如同上述之方法(A)，其中編碼結構性病毒蛋白的該核苷酸序列可選自由BHA、C、HA、H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15與H16所組成之群組。舉例來說，編碼結構性病毒蛋白的該核苷酸序列可能為B型HA或H3。編碼結構性病毒蛋白的該核苷酸序列可能為例如來自流感B/布里斯班/60/2008、B/馬來西亞/2506/2004或B/威斯康辛/1/2010的HA，或來自流感A/伯斯/16/2009或A/維多利亞/361/2011的H3。此外，編碼結構性病毒蛋白的該核苷酸序列具有至少70%序列與SEQ ID NO：23、28、43、46、51、57或61相同。結構性病毒蛋白的序列亦可包含SEQ ID NO：25、30、41、48、54、58或64的序列。

本發明亦包括如同上述之方法(A)，其中該第一核酸序列包含與一或多於一的豇豆嵌紋病毒(comovirus)增強子、編碼結構性病毒蛋白的核苷酸序列以及一或多於一的雙生病毒(geminivirus)擴增元素操作性地連接之第一調節區域，以及將編碼雙生病毒複製酶的第三核酸引入植物或植物的部分。一或多於一的豇豆嵌紋病毒增強子可能為豇豆嵌紋病毒UTR，舉例來說，豇豆嵌紋病毒超轉譯(CPMV-HT)UTR，例如CPMV-HT 5’及/或3’UTR。一或多於一的雙生病毒擴增元素可選自豆黃矮病毒(Bean Yellow Dwarf Virus)長間隔區域(BeYDV LIR)以及BeYDV短間隔區域(BeYDV SIR)。此外，編碼結構性病毒蛋白的核苷酸序列可能為B型HA或H3，舉例來說，編碼結構性病毒蛋白的核苷酸序列可具有至少70%序列與SEQ ID NO：23、28、43、46、51、57或61相同。結構性病毒蛋白的序列亦可包含SEQ ID NO：25、30、41、48、54、58或64的序列。

如同上述的方法(方法A)亦可涉及引入例如HcPro或p19的編碼沉默抑制劑(suppressor of silencing)的另一核酸序列。

本發明亦包括如同上述的方法(A)，其中在引入的步驟中(步驟a)，核酸係於植物中暫時表現。替代地，在引入的步驟中(步驟a)，核酸於植物中穩定地表現。

如同上述的方法(A)可進一步包含步驟：

d)收穫植物並純化VLP。

本發明亦包括如同上述的方法(A)，其中VLP不包含病毒基質或核心蛋白。

本發明提供由如同上述之方法(A)生產的VLP。該VLP可進一步包含一或多於一的衍生自植物的脂質。該VLP亦可以不包含通道蛋白為特徵。此外，VLP的結構性病毒蛋白可為HA蛋白。該一或更多的病毒蛋白包含該VLP，該VLP可包含植物特異的N-聚醣或經修飾的N-聚糖。本發明亦提供使用該VLP製備的多株抗體。

本發明包括含有一有效劑量的如同剛才所述的方法製造之用於誘發免疫反應之VLP的組成物以及藥學上可接受之載體。

本發明亦包括在個體中對流感病毒感染誘發免疫的方法，其包含將如同剛才所述之VLP給藥予該個體。可將VLP以口服、皮內、鼻腔內、肌肉、腹膜腔內、靜脈或皮下給藥予個體。

本發明亦提供包含由上述之方法(A)所生產的VLP的植物物質。該植物物質可用於在個體中誘發對流感病毒感染的免疫。該植物物質亦可被混合作為食物補充品。

本發明亦提供生產類病毒顆粒(VLP)之方法(B)，其包含

a)提供植物或植物的部分，其包含將一第一核酸及一第二核酸引至該植物或該植物的部分，該第一核酸，該第一核酸含有在植物中具活性的第一調節區域並且被操作性地連接至編碼結構性病毒蛋白的核苷酸序列，該第二核酸含有在植物中具有活性之第二調節區域並且被操作性地連接至編碼通道蛋白的核苷酸序列。

b)在容許核酸表現的條件下培養植物或植物的部分，從而生產VLP。

上述方法(B)中的通道蛋白可為質子通道蛋白。該質子通道蛋白可選自M2或BM2。此外，質子通道蛋白可包含質子通道識別序列HXXXW。

本發明提供如同上述之方法(B)，其中編碼結構性病毒蛋白的該核苷酸序列可選自由B HA、C、HA、H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15與H16所組成之群組。舉例來說，編碼結構性病毒蛋白的該核苷酸序列可能為B型HA或H3。編碼結構性病毒蛋白的該核苷酸序列可能為例如來自流感B/布里斯班/60/2008、B/馬來西亞/2506/2004或B/威斯康辛/1/2010 的HA，或來自流感A/伯斯/16/2009或A/維多利亞/361/2011的H3。

發明亦包括如同上述之方法(B)，其中將該第一核酸序列包含與一或多於一的豇豆嵌紋病毒(comovirus)增強子、編碼結構性病毒蛋白的核苷酸序列以及一或多於一的雙生病毒(geminivirus)擴增元素操作性地連接之第一調節區域，以及將編碼雙生病毒複製酶的第三核酸引入植物或植物的部分。一或多於一的豇豆嵌紋病毒增強子可能為豇豆嵌紋病毒UTR，舉例來說，豇豆嵌紋病毒超轉譯(CPMV-HT)UTR，例如CPMV-HT 5’及/或3’UTR。此外，一或多於一的雙生病毒擴增元素可選自豆黃矮病毒(Bean Yellow Dwarf Virus)長間隔區域(BeYDV LIR)以及BeYDV短間隔區域(BeYDV SIR)。

如同上述的方法(方法B)亦可涉及引入編碼沉默抑制劑(例如HcPro或p19)的另一核酸序列。

本發明亦包括如同上述的方法(B)，其中在引入的步驟中(步驟a)，核酸係於植物中暫時表現。替代地，在引入的步驟中(步驟a)，核酸於植物中穩定地表現。

如同上述的方法(B)可進一步包含步驟：

d)收穫植物並純化VLP。

本發明亦包括如同上述的方法(B)，其中VLP不包含病毒基質或核心蛋白。

本發明提供由如同上述之方法(B)生產的VLP。該VLP可進一步包含一或多於一的衍生自植物的脂質。該VLP亦可以不包含通道蛋白為特徵。此外，VLP的結構性病毒蛋白可能為HA0蛋白。組成VLP的一或更多病毒蛋白可包含植物特異的N-聚醣或經修飾的N-聚糖。本發明亦提供使用該VLP製備的多株抗體。

本發明包括含有一有效劑量的如同剛才所述的方法(B)製造的用於誘發免疫反應之VLP的組成物以及藥學上可接受之載體。

本發明亦包括在個體中誘發對流感病毒感染之免疫的方法，其包含將如同剛才所描述之VLP給藥予該個體。可將VLP以口服、皮內、鼻腔內、肌肉、腹膜腔內、靜脈或皮下給藥予個體。

本發明亦提供含有由上述之方法(B)所生產的VLP之植物物質。該植物物質可用於在個體中誘發對流感病毒感染的免疫。該植物物質亦可被混合作為食物補充品。本發明係提供包含SEQ ID NO：41(來自流感B/布里斯班/60/2008的PDISP/HA伴隨被刪除的蛋白水解環)之胺基酸序列的多胜肽，以及編碼SEQ ID NO：41的多胜肽之核酸序列。該核酸序列可包含SEQ ID NO：43的核苷酸序列。本發明提供包含含有SEQ ID NO：41的胺基酸序列之多胜肽的VLP。此VLP可進一步包含衍生自植物的一或多於一的脂質。此VLP亦可以不包含通道蛋白為特徵。此VLP可包含植物特異性N聚醣或經修飾的N聚醣。本發明提供包含一有效劑量之包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列、用於誘發免疫反應的VLP以及一藥學上可接受的載體之組成物。本發明亦包括誘發個體對流感病毒感染之免疫的方法，其包含將含有SEQ ID NO：41的胺基酸序列之VLP給藥予個體。可將VLP以口服、皮內、鼻腔內、肌肉、腹膜腔內、靜脈或皮下給藥予個體。本發明亦提供包含含有SEQ ID NO：41的胺基酸序列之VLP的植物物質。可將植物物質用於誘發個體對流感病毒感染的免疫。該植物物質亦可被混合作為食物補充品。經由共同表現結構性病毒蛋白以及通道蛋白，舉例來說但不限於質子通道蛋白，觀察到結構性病毒蛋白以及VLP的產率增加。已知HA經歷pH依賴性構型變化。不希望被理論所約束地，於成熟與遷移作用期間，HA生產細胞之高基氏體(Golgi apparatus)內的pH可能影響HA折疊，影響HA的穩定性並且增加降解作用，或其結合。經由共同表現通道蛋白(舉例來說但不限於質子通道蛋白)以及HA，在高基氏體內的pH可能增加，並且造成穩定性的增加、降解作用的降低或其結合，而增加HA產率。本發明的上述說明不需描述本發明的所有特徵。

本發明的這些與其他特徵將參考所附圖式由下列描述而變得更明顯，其中：

第1A圖顯示引子IF-H5A-I-05.s1+3c(SEQ ID NO：2)。第1B圖顯示引子IF-H5dTm.r(SEQ ID NO：3)。第1C圖顯示基因構築體1191的示意圖。第1D圖顯示基因構築體1191(SEQ ID NO4)。第1E圖顯示表現卡匣編號489(SEQ ID NO5)。第1F圖顯示來自流感A/印尼/5/2005(H5N1)的H5胺基酸序列(SEQ ID NO：6)。第1G圖顯示編碼來自流感A/印尼/5/2005(H5N1)的H5之核酸苷酸序列(SEQ ID NO：42)。

第2A圖顯示引子IF-S1-M1+M2ANC.c(SEQ ID NO：7)。第2B圖顯示引子IF-S1-4-M2ANC.r(SEQ ID NO：8)。第2C圖顯示合成M2基因的核苷酸序列(與來自GenBank登錄號DQ508860連接至nt 715-982之nt 1-26相對應)(SEQ ID NO：9)。第2D圖顯示由2X35S啟動子至NOS終止子之表現卡匣編號1261。將來自流感A/新喀里多尼亞/20/1999的M2(H1N1)加下底線(SEQ ID NO：10)。第2E圖顯示來自流感A/新喀里多尼亞/20/1999(H1N1)的M2胺基酸序列(SEQ ID NO：11)。

第3A圖顯示合成的M2基因的核苷酸序列(與來自 GenBank登錄號EF467824連接至nt 740-1007之nt 26-51相對應)(SEQ ID NO：12)。第3B圖顯示由2X35S啟動子至NOS終止子之表現卡匣編號859。將來自流感A/波多黎各/8/1934(H1N1)之M2加下底線(SEQ ID NO：13)。第3C圖顯示來自流感A/波多黎各/8/1934(H1N1)之M2的胺基酸序列(SEQ ID NO：14)。

第4A圖顯示引子IF-H1A-C-09.s2+4c(SEQ ID NO：15)。第4B圖顯示引子IF-H1A-C-09.s1-4r(SEQ ID NO：16)。第4C圖顯示合成的H1基因的核苷酸序列(GenBank登錄號FJ966974)(SEQ ID NO：17)。第4D圖顯示基因構築體1192的示意圖。將用於質體線性化的SacII與StuI限制酵素位點註釋於示意圖上。第4E圖顯示基因構築體1192由左至右的t-DNA邊界(加下底線)。具有質體藍素-P19-質體藍素沉默抑制劑表現卡匣之2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS(SEQ ID NO：18)。第4F圖顯示由2X35S啟動子至NOS終止子之表現卡匣編號484。將來自流感A/加州/7/2009(H1N1)的PDISP/H1加下底線(SEQ ID NO：19)。第4G圖顯示來自流感A/加州/7/2009(H1N1)的PDISP-H1的胺基酸序列(SEQ ID NO：20)。

第5A圖顯示引子IF-S2+S4-H3 Per.c(SEQ ID NO：21)。第5B圖顯示引子IF-S1a4-H3 Per.r(SEQ ID NO：22)。第5C圖顯示合成的H3基因的核苷酸序列(與來自GenBank登錄號GQ293081的nt 26-1726相對應)(SEQ ID NO：23)。第5D圖顯示由2X35S啟動子至NOS終止子之表現卡匣編號1019。將來自流感A/伯斯/16/2009(H3N2)的PDISP/H3加下底線(SEQ ID NO：24)。第5E圖顯示來自流感A/伯斯/16/2009(H3N2)的PDISP/H3胺基酸序列(SEQ ID NO：25)。

第6A圖顯示引子IF-S2+S4-B Bris.c(SEQ ID NO：26)。第6B圖顯示引子IF-S1a4-B Bris.r(SEQ ID NO：27)。第6C圖顯示合成的HA B布里斯班基因的核苷酸序列(與來自GenBank登錄號FJ766840的nt 34-1791相對應)(SEQ ID NO：28)。第6D圖顯示表現卡匣編號1029由2X35S啟動子至NOS終止子之核苷酸序列。將來自流感B/布里斯班/60/2008的PDISP/HA加下底線。(SEQ ID NO：29)。第6E圖顯示來自流感B/布里斯班/60/2008的PDISP/HA的胺基酸序列(SEQ ID NO：30)。第6F圖顯示基因構築體1194的示意圖。將用於質體線性化的SacII與StuI限制酵素位點註釋於示意圖。第6G圖顯示基因構築體1194由左至右的t-DNA邊界(加下底線)。具有質體藍素P19-質體藍素沉默抑制劑表現卡匣的2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS至BeYDV+複製酶擴增系統(SEQ ID NO：31)。第6H圖顯示由BeYDV左LIR至BeYDV右LIR的表現卡匣編號1008。將來自流感B/布里斯班/60/2008的PDISP/HA加下底線(SEQ ID NO：32)。

第7A圖顯示引子dTmH5I-B Bris.r(SEQ ID NO：33)。第7B圖顯示引子B Bris-dTmH5I.c(SEQ ID NO：34)。第7C圖顯示引子IF-S1aS4-dTmH5I.r(SEQ ID NO：35)。第7D圖顯示由BeYDV左LIR至BeYDV右LIR的表現卡匣編號1009。將PDISP/HA B布里斯班/H5Indo TMCT加下底線(SEQ ID NO：36)。第7E圖顯示PDISP/HA B布里斯班/H5Indo TMCT的胺基酸序列(SEQ ID NO：37)。

第8A圖顯示引子1039+1059.r(SEQ ID NO：38)。第8B圖顯示引子1039+1059.c(SEQ ID NO：39)。第8C圖顯示由BeYDV左LIR至BeYDV右LIR的表現卡匣編號1059。將來自流感B/布里斯班/60/2008伴隨刪除的蛋白水解環的PDISP/HA加下底線(SEQ IDNO：40)。第8D圖顯示來自流感B/布里斯班/60/2008伴隨刪除的蛋白水解環的PDISP/HA之胺基酸序列(SEQ ID NO：41)。第8E圖顯示來自流感B/布里斯班/60/2008伴隨刪除的蛋白水解環的PDISP/HA之核苷酸序列(SEQ IDNO：43)。

第9圖顯示基因構築體編號1008的質體圖譜。基因構築體編號1008主導來自流感株B/布里斯班/60/2008的野生型HA之表現。此基因構築體包含DNA擴增的BeYDV衍生元素。

第10圖顯示基因構築體編號1009的質體圖譜。基因構築體編號1009主導來自流感株B/布里斯班/60/2008的嵌合HA之表現，其中穿膜區以及胞質尾以來自流感A/印尼/05/2005之H5的那些取代。此基因構築體包含DNA擴增的BeYDV衍生元素。

第11圖顯示基因構築體編號1029的質體圖譜。基因構築體編號1029主導來自流感株B/布里斯班/60/2008的野生型HA之表現。

第12圖顯示基因構築體編號1059的質體圖譜。基因構築體編號1059主導來自伴隨刪除的蛋白水解環之流感株B/布里斯班/60/2008的突變型HA之表現。此基因構築體包含DNA擴增的BeYDV衍生元素。

第13圖顯示基因構築體編號1019的質體圖譜。基因構築體編號1019主導來自流感株A/伯斯/16/2009(H3N2)的野生型H3之表現。

第14圖顯示基因構築體編號484的質體圖譜。基因構築體編號484主導來自流感株A/加州/07/2009(H1N1)的野生型H1之表現。

第15圖顯示基因構築體編號489的質體圖譜。基因構築體編號489主導來自流感株A/印尼/05/2005(H5N1)的野生型H5之表現。

第16圖顯示基因構築體編號1261的質體圖譜。基因構築體編號1261主導來自流感株A/新喀里多尼亞/20/99(H1N1)的野生型M2之表現。

第17圖顯示基因構築體編號859的質體圖譜。基因構築體編號859主導來自流感株A/波多黎各/8/34(H1N1)的野生型M2之表現。

第18圖顯示在以農桿菌浸潤之菸草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表現之西方墨點分析。將來自B/布里斯班/60/2008的HA伴隨來自A/新喀里多尼亞/20/99的M2共同表現。「C+」：陽性控制組，來自澳洲診療產品局(Therapeutic Goods Administration)之半純化的B/布里斯班/60/2008病毒；「C-」：陰性控制組，模擬浸潤植物；「1008」：在擴增元素(BeYDV)的存在下，來自B/布里斯班/60/2008的野生型HA之表現；「1008+1261」：在擴增元素(BeYDV)的存在下，來自B/布里斯班/60/2008的野生型HA伴隨M2的共同表現；「1009+1261」：在擴增元素(BeYDV)的存在下，來自B/布里斯班/60/2008的嵌合HA伴隨M2的共同表現；「1029」：在擴增元素(BeYDV)的缺乏下，來自B/布里斯班/60/2008的野生型HA之表現；「1029+1261」：在擴增元素(BeYDV)的缺乏下，來自B/布里斯班/60/2008的野生型HA伴隨來自A/新喀里多尼亞/20/99的M2之共同表現。比率表示用於共同表現實驗之農桿菌(Agrobacterium)培養株的比例。

第19圖顯示在以農桿菌浸潤之菸草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表現之西方墨點分析。欄「C+」：陽性控制組，來自澳洲診療產品局之半純化A/ 威斯康辛/15/2009(H3N2)病毒；「C-」，陰性控制組，模擬浸潤的植物；「1019」：來自A/伯斯/16/2009(H3N2)之野生型HA的表現；「1019+1261」：來自A/伯斯/16/2009(H3N2)之野生型HA伴隨來自A/新喀里多尼亞/20/99之M2的共同表現。比率表示用於共同表現實驗之農桿菌(Agrobacterium)培養株的比例。

第20圖顯示在以農桿菌浸潤之菸草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表現之西方墨點分析。欄「C+」：陽性控制組，來自NIBSC之半純化A/加州/7/2009(H1N1)NYMC X-179A病毒(NIBSC碼09/146)；「C-」，陰性控制組，模擬浸潤的植物；「484」：來自A/加州/7/2009(H1N1)之野生型HA的表現；「484+1261」：來自A/加州/7/2009(H1N1)之野生型HA伴隨來自A/新喀里多尼亞/20/99之M2的共同表現。比率表示用於共同表現實驗之農桿菌(Agrobacterium)培養株的比例。

第21圖顯示在以農桿菌浸潤之菸草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表現之西方墨點分析。欄「C+」：陽性控制組，來自免疫科技公司(產品編號IT-003-052p)之A/印尼/05/2005的純化重組H5；「C-」，陰性控制組，模擬浸潤的植物；「489」，來自A/印尼/5/05(H5N1)之野生型HA之表現；「489+1261」：來自A/印尼/5/05(H5N1)之野生型HA伴隨來自A/新喀里多尼亞/20/99之M2的共同表現。

第22A圖顯示在以農桿菌浸潤之菸草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表現之西方墨點分析。「1008」：在擴增元素(BeYDV)的存在下，來自B/布里斯班/60/2008的野生型HA的表現：「1008+1261」：在擴增元素(BeYDV)的存在下來自B/布里斯班/60/2008的野生型HA伴隨來自A/新喀里多尼亞/20/99之M2的共同表現：「1059」：在擴增元素(BeYDV)的存在下，來自B/布里斯班/60/2008的突變型HA的表現；「1059+1261」：在擴增元素(BeYDV)的存在下來自B/布里斯班/60/2008的突變型HA伴隨來自A/新喀里多尼亞/20/99之M2的共同表現。分析來自三個不同浸潤之植物(A、B與C)。比率表示用於共同表現實驗之農桿菌(Agrobacterium)培養株的比例。第22B圖顯示來自HA生產植物的粗蛋白萃取物的血球凝集能力之比較。

第23圖顯示在以農桿菌浸潤之菸草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表現之西方墨點分析。第23A圖：「1059」：在擴增元素(BeYDV)的存在下，來自B/布里斯班/60/2008的突變型HA的表現：「1059+1261」：在擴增元素(BeYDV)的存在下來自B/布里斯班/60/2008的突變型HA伴隨來自A/新喀里多尼亞/20/99之M2的共同表現。「1059+859」：在擴增元素(BeYDV)的存在下來自B/布里斯班/60/2008的突變型HA伴隨來自A/波多黎各/8/34之M2的共同表現。分析來自三不同浸潤之植物(A、B與C)。比率表示用於共同表現實驗之農桿菌(Agrobacterium)培養株的比例。第23B圖：「1019」：來自A/伯斯/16/2009(H3N2)之野生型HA的表現；「1019+1261」：來自A/伯斯/16/2009(H3N2)之野生型HA伴隨來自A/新喀里多尼亞/20/99之M2的共同表現；「1019+859」：來自A/伯斯/16/2009(H3N2)之野生型HA伴隨來自A/波多黎各/8/34之M2的共同表現。比率表示用於共同表現實驗之農桿菌(Agrobacterium)培養株的比例。

第24圖顯示來自幾株流感的HA的序列比對。以箭號表示前驅物HA0的切割位點。

第25A圖顯示引子IF-H3V36111.S2+4c(SEQ ID NO： 44)。第25B圖顯示引子IF-H3V36111.s1-4r(SEQ ID NO：45)。第25C圖顯示合成的H3基因之核苷酸序列(與來自GISAID分離號EPI_ISL_101506之HA序列的nt 25至1725相對應)(SEQ ID NO：46)。第25D圖顯示由2X35S啟動子至NOS終止子的表現卡匣編號1391之核苷酸序列。將來自流感A/維多利亞/361/2011(H3N2)的PDISP/H3加下底線(SEQ ID NO：47)。第25E圖顯示來自流感A/維多利亞/361/2011(H3N2)的PDISP-H3的胺基酸序列(SEQ ID NO：48)。第25F圖顯示基因構築體1391的示意圖。

第26A圖顯示引子IF-HAB110.S1+3c(SEQ ID NO：49)。第26B圖顯示引子IF-HAB110.s1-4r(SEQ ID NO：50)。第26C圖顯示合成的HAB威斯康辛(GenBank登錄號JN993010)之核苷酸序列(SEQ ID NO：51)。第26D圖顯示基因構築體193的示意圖。第26E圖顯示基因構築體193由左至右t-DNA邊界(加下底線)。伴隨質體藍素-P19-質體藍素沉默抑制劑表現卡匣的2X35S/CPMV-HT/NOS至BeYDV(m)+複製酶擴增系統(SEQ ID NO：52)。第26F圖顯示表現卡匣編號1462由2X35S啟動子至NOS終止子的核苷酸序列。將來自流感B/威斯康辛/1/2010的HA加下底線(SEQ ID NO：53)。第26G圖顯示來自流感B/威斯康辛/1/2010的HA之胺基酸序列(SEQ ID NO：54)。第26H圖顯示基因構築體1462的示意圖。

第27A圖顯示引子HAB110(PrL-).r(SEQ ID NO：55)。第27B圖顯示引子HAB110(PrL-).c(SEQ ID NO：56)。第27C圖顯示表現卡匣編號1467由2X35S啟動子至NOS終止子的核苷酸序列。將具有刪除的蛋白水解環的來自流感B/威斯康辛/1/2010之HA加下底線(SEQ ID NO：57)。第27D圖顯示具有刪除的蛋白水解環的流感B/威斯康辛/1/2010之胺基酸序列(SEQ ID NO：58)。第27E圖顯示基因構築體1467的示意圖。

第28A圖顯示引子IF-HB-M-04.s2+4c(SEQ ID NO：59)。第28B圖顯示引子IF-HB-M-04.s1-4r(SEQ ID NO：60)。第28C圖顯示合成的HA B馬來西亞的核苷酸序列(與來自GenBank登錄號EU124275的nt 31-1743相對應)，其具有被加下底線的T759C與C888G突變(SEQ ID NO：61)。第28D圖顯示基因構築體194的示意圖，伴隨將用於質體線性化的SacII與StuI限制酵素位點註釋於示意圖上。第28E圖顯示基因構築體194由左至右的t-DNA邊界(加下底線)。伴隨質體藍素P19-質體藍素沉默抑制劑表現卡匣的2X35S/CPMV-HT/NOS至BeYDV(m)+複製酶擴增系統(SEQ ID NQ：62)。第28F圖顯示表現卡匣編號1631由2X35S啟動子至NOS終止子的核苷酸序列。將來自流感B/馬來西亞/2506/2004的PDISP-HA加下底線(SEQ ID NO：63)。第28G圖顯示來自流感B/馬來西亞/2506/2004的PDISP-HA胺基酸序列(SEQ ID NO：64)。第28H圖顯示基因構築體1631的示意圖。

第29圖顯示在以農桿菌浸潤之菸草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表現之西方墨點分析。將來自B/馬來西亞/2506/2004的HA伴隨來自A/新喀里多尼亞/20/99的M2共同表現。於每一欄裝載二十微克的蛋白質萃取物。「C+」：陽性控制組，來自英國國家生物標準品暨管制研究所(National Institute for Biological Standards and Control)的半純化B/馬來西亞/2506/2004病毒；「1631」：在擴增元素(BeYDV)的存在下，來自B/馬來西亞/2506/2004的野生型HA之表現：「1631+1261」：在擴增元素(BeYDV)的存在下，來自 B/馬來西亞/2506/2004的野生型HA伴隨M2之共同表現。比率表示用於共同表現實驗之農桿菌(Agrobacterium)培養株的比例。

第30A圖顯示在以農桿菌浸潤之菸草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表現之西方墨點分析。將來自B/威斯康辛/1/2010的HA伴隨來自/新喀里多尼亞/20/99的M2共同表現。於每一欄裝載十微克的蛋白質萃取物。「C+」：陽性控制組，來自英國國家生物標準品暨管制研究所(National Institute for Biological Standards and Control)的半純化B/威斯康辛/1/2010病毒；「1462」：在擴增元素(BeYDV)的存在下，來自B/威斯康辛/1/2010的野生型HA；「1467」：在擴增元素(BeYDV)的存在下，來自B/威斯康辛/1/2010的突變型HA；「1462+1261」：在擴增元素(BeYDV)的存在下，將來自B/威斯康辛/1/2010的野生型HA伴隨M2共同表現；「1467+1261」：在擴增元素(BeYDV)的存在下，將來自B/威斯康辛/1/2010的突變型HA伴隨M2共同表現。比率表示用於表現與共同表現實驗之每一農桿菌(Agrobacterium)培養株的光學密度。第30B圖顯示來自以AGL1/1462、AGL1/1467、AGL1/1462+AGL1/1261以及AGL1/1467+AGL1/1261轉殖的植物之粗蛋白萃取物的血球凝集能力的比較。

第31圖顯示在以農桿菌浸潤之菸草(Nicotiana benthamiana)葉中的HA蛋白表現之西方墨點分析。將來自H3/維多利亞/361/2011的HA伴隨來自A/新喀里多尼亞/20/99的M2共同表現。於每一欄裝載二十微克的蛋白質萃取物。「C+」：陽性控制組，來自澳洲診療產品局之半純化H3/威斯康辛/15/2009病毒；「1391」：來自H3/維多利亞/361/2011的野生型HA之表現；「1391+1261」：來自H3/維多利亞/361/2011的野生型HA伴隨M2之共同表現。比率表示用於表現與共同表現實驗之每一農桿菌(Agrobacterium)培養株的光學密度。

以下描述為優選的具體實施例。

本發明係相關於類病毒顆粒(VLP)以及在植物中生產並且增加VLP產率與生產的方法。

本發明部分地提供在植物中或植物的部分生產類病毒顆粒(VLP)的方法。該方法涉及引入第一核酸以及第二核酸至植物。第一核酸包含在植物或植物的部分中具活性的第一調節區域，並且被操作性地連接至編碼結構病毒蛋白質的核苷酸序列。第二核酸包含在植物中具活性的第二調節區域並且被操作性地連接至一通道蛋白(例如但不限於一質子通道蛋白)。第一調節區域以及第二調節區域可能是相同或不同的。將植物或植物的部分在容許核酸表現的條件下培養，從而生產VLP。如有需要，可將植物或植物的部分收穫並且純化VLP。較佳地，VLP不包含M1、病毒基質或核心蛋白質。本發明亦提供以此方法生產的VLP。VLP可包含衍生自植物的一或多於一的脂質。可將VLP用於製備包含用於誘發免疫反應的有效劑量之VLP以及藥學上可接受之載體的組成物。

本發明亦提供包含以表現上述第一與第二核酸而生產的VLP之植物物質。可將植物物質用以誘發個體中對流感病毒感染的免疫。該植物物質亦可被混合作為食物補充品。

本發明之VLP亦可透過如下方式而生產：提供包含如上定義之第一核酸與第二核酸的植物以及植物的部分，並且將植物或植物的部分於容許該第一與第二核酸表現的條件下培養，從而生產VLP。該VLP可能包含衍生自植物的一或多於一的脂質。可將VLP用以製備包含用於誘發免疫反應的有效量之VLP以及藥學上可接受之載體的組成物。本發明亦提供包含經由表現第一與第二核酸而生產的VLP之植物物質。可將植物物質用以誘發個體對流感病毒感染之免疫。該植物物質亦可被混合作為食物補充品

本發明之VLP包含一或更多的病毒蛋白質。舉例來說而不將其視為限制性的，一或更多病毒蛋白質可能是結構病毒蛋白質(例如流感血球凝集素(HA))或通道蛋白質(舉例來說但不限於質子通道蛋白，像是舉例來說M2)。該HA可能是任何HA，舉例來說H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16或如同於WO 2009/009876；WO 2009/076778；WO 2010/003225；WO 2010/003235；WO 2011/03522中所描述的B型HA，將其以引用的方式併入本文。

如同以下更詳細地描述，可經由將編碼病毒蛋白質的第一核酸伴隨編碼通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)的第二核酸共同表現而在植物中生產VLP。可將第一與第二核酸在相同步驟引入至植物，或它們可連續地引入至植物。第一與第二核酸可以暫時的方式或以穩定的方式引入植物。此外，可將例如但不限於質子通道蛋白的通道蛋白質(第二核酸)轉殖到表現編碼病毒蛋白質之第一核酸的植物中，以便第一以及第二核酸兩者在植物中共同表現。替代地，可將編碼病毒蛋白質的第一核酸轉殖到表現通道蛋白質(其例如但不限於質子通道蛋白)(第二核酸)的植物，以便第一以及第二核酸兩者在植物中共同表現。此外，可將表現編碼病毒蛋白質的第一核酸的第一植物與表現編碼通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)之第二核酸的植物雜交，以生產共同表現分別地編碼病毒蛋白質與通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)的第一與第二核酸的子代植物。

本發明亦提供增加在植物中的病毒蛋白質表現以及產率的方法，其係經由共同表現編碼病毒蛋白質的第一核酸與編碼通道蛋白質(例如但不限於質子通道蛋白)的第二核酸。可將第一與第二核酸在相同步驟引至植物中，或可將它們先後地引至植物中。第一與第二核酸可以暫時的方式或以穩定的方式引至植物中。此外，可將例如但不限於質子通道蛋白的通道蛋白質(第二核酸)轉殖到表現編碼病毒蛋白質的第一核酸的植物中，以便第一以及第二核酸兩者在植物中共同表現。替代地，可將編碼病毒蛋白質的第一核酸轉殖到表現通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)(第二核酸)的第二植物中，以便第一以及第二核酸兩者在植物中共同表現。此外，可將表現編碼病毒蛋白質的第一核酸之第一植物與表現編碼通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)之第二核酸的植物雜交，以生產共同表現分別地編碼病毒蛋白質與通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)之第一與第二核酸的子代植物。

通道蛋白

關於「通道蛋白」係指能夠形成跨越磷脂膜的通道之蛋白質，其容許離子及/或小分子跨越通過膜。通道蛋白對於離子及/或小分子的尺寸及/或電荷可具選擇性。通道蛋白的非限制性範例為對小分子量化合物改變膜的滲透性之非特異性通道蛋白，以及像是例如氯通道、鉀通道、鈉通道、鈣通道以及質子通道的離子通道蛋白。

關於「質子通道蛋白」係指能夠形成跨越磷脂雙膜之質子選擇性通道的蛋白質。質子通道蛋白可以為具有疏水區旁之穿膜(TM)區域的單一通行膜蛋白。質子通道的 TM區域可包含序列HXXXW(SEQ ID NO.1)。

在HA0的切割之後，HA變得對pH敏感，於內體的pH(<pH 6.0)經歷不可逆的構形改變。前驅物HA0的構形於低pH時為穩定的，但經切割的HA1-HA2形式為介穩定的(Bullough PA et.al.,1994,Nature.Vol 371：37-43)。對於在不同HA中誘發構形改變之pH閾值的研究中，顯示對於B株此閾值約略為pH 5.8-5.9，然而對於A型HA為更酸(pH 5.1至5.3)(Beyer WEP et al,1986,Archives Virol,vol 90：173)。在植物生質萃取期間(介於pH 5-6)，HA1-HA2的構形改變亦可能伴隨B型HA發生。

不希望被理論所約束地，包含HA的細胞隔間(其包括高基氏體)之pH，因而可能對HA的折疊、穩定性及/或蛋白水解是重要的。質子通道蛋白，像是例如流感M2以及BM2蛋白可調節細胞隔間中的pH。舉例來說，M2經由在流感病毒複製的晚期與早期兩者緩衝細胞內隔間以調節膜融合的電位。在新細胞的感染早期、於病毒顆粒的胞吞攝取之後，M2質子通道活性的活化導致脫殼過程期間病毒粒子內部的酸化。在感染晚期的病毒產生期間，M2在運輸通過反式高基氏網(trans-Golgi network)期間作用為升高pH，並且避免低pH誘發之共同運輸蛋白質(例如在流感情況中的HA)的去活化作用。經由共同表現結構性病毒蛋白以及例如但不限於質子通道蛋白的通道蛋白，觀察到結構性病毒蛋白與VLP的增加產率。已知HA經歷pH依賴性的構形改變。不希望被理論所約束地，HA生產細胞之高基氏體內的pH於成熟與遷移期間可能影響HA折疊、影響HA的穩定性與增加HA降解作用或其結合。經由共同表現例如但不限於質子通道蛋白的通道蛋白以及HA，高基氏體內的pH可能增加，並且造成HA及/或VLP穩定性的增加，降解作用的減少或其結合，並且增加其表現量與產率。

當與表現結構性病毒蛋白而沒有共同表現通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)之植物相較，觀察到經由在植物中共同表現結構性病毒蛋白以及通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)，結構性病毒蛋白及/或VLP的增加產率。此外，當與未與通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)共同表現的HA蛋白相較，經由在植物中共同表現結構性病毒蛋白(例如HA)以及通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)，HA蛋白可能表現增加的活性，如同由更強的血球凝集作用能力所顯示的。關於活性的增加，指的是當與在缺乏通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)之下產生的相同HA蛋白之活性相較，使用本領域標準技術決定之血球凝集作用能力增加約2%至約100%，或任何介於其間之量，例如，由大約10%至大約50%或介於其間的任何值，例如大約2、5、8、10、12、15、18、20、22、24、25、26、28、30、32、34、35、36、38、40、42、44、45、46、48、50、52、54、55、56、58、60、65、70、75、80、85、90、95或100%。

如同本文中所使用的，該用語「M2」、「M2蛋白質」、「M2序列」以及「M2區域」意指由根據或存在於任何天然發生或人工產生的流感病毒株或分離株所分離之M2蛋白質序列的全部或部分。因此，該用語M2以及類似物包括天然發生的經由病毒生命週期期間的突變產生或對選擇性壓力(例如，藥物療法、宿主細胞嗜性的擴張或感染性等等)回應而產生之M2序列變化形，以及重組地或合成地產生之M2序列。可使用的通道蛋白之範例包括但不限於質子通道蛋白，例如列舉於表格1的那些。可伴隨本發明使用的序列之非限制性的範例包括來自A/波多黎各/8/1934的M2以及來自A/新喀里多尼亞/20/1999的 M2。示範性的M2蛋白係由如同於SEQ ID NO：11或14中顯示之胺基酸序列所組成。

如同本文中所使用的，該用語「BM2」、「BM2蛋白」、「BM2序列」以及「BM2區域」意指由根據或存在於任何自然發生或人工產生的流感病毒株或分離株分離之BM2蛋白序列的所有或部分。因此，該用語BM2以及類似物包括在病毒生命週期期間由突變產生之自然發生的或對選擇性壓力(例如，藥物療法、宿主細胞嗜性的擴張或感染性等等)回應而產生之BM2序列變化形，以及重組地或合成地產生之BM2序列。可被使用的通道蛋白之範例包括但不限於那些列舉於表格2之質子通道蛋白。

額外的示範性質子通道蛋白序列由表格1與表格2所顯示之寄存於GenBank登錄號下的序列組成。

結構性病毒蛋白

結構性病毒蛋白(亦稱為結構性病毒的蛋白)可能為病毒的抗原蛋白或其片段，舉例來說但不限於病毒醣蛋白或病毒套膜蛋白。結構性病毒蛋白可能為嵌合病毒蛋白。病毒蛋白可以單體、二聚體、三聚體或其組合而存在。三聚體為由三個通常非共價鍵結蛋白質所形成之巨分子複合物。不希望被理論所約束地，蛋白質的三聚區域對此類三聚體的形成可能是重要的，因此，結構性病毒蛋白或其片段可能包含三聚區域。結構性病毒蛋白的非限制性範例為流感血球凝集素(HA)或HA片段。根據本發明可使用的HA或HA片段之非限制性範例包括那些描述於WO2009/009876、WO 2009/076778；WO 2010/003225、WO 2010/003235、WO 2011/03522、WO 2010/006452、WO 2010/148511、WO 2011/0354221(將其以引用的方式併入本文)。

此外結構性病毒蛋白可能為HA未經處理的前驅物蛋白。HA蛋白被合成為大約75 kDa的前驅物蛋白(HA0)，其於表而組裝至一延長的三聚體蛋白質。此前驅物蛋白在保留的活化切割位點被切割為由雙硫鍵連接之2個多肽鏈，HA1與HA2(其包含穿膜區域)。

蛋白水解環(切割位點)修飾

結構性病毒蛋白可能為血球凝集素蛋白內帶有蛋白水解環(切割位點)刪除或修飾的流感B血球凝集素或流感A血球凝集素蛋白。蛋白水解環的刪除或修飾確保HA分子大多數以HA0前驅物維持。

HA係以前驅物蛋白HA0合成，其經歷蛋白水解程序成為由雙硫橋連接在一起的兩個次單元(HA1與HA2)。由於分泌可於細胞外切割HA0前驅物之蛋白酶的有限範圍細胞，哺乳類以及高致病性禽流感病毒株引起解剖學上的局部感染(Chen J,et.al.1998,Cell.Vol 95：409-417)。在人類流感感染中負責HA0之切割的蛋白酶係由呼吸道的細胞或由共同感染的細菌或黴漿菌分泌，或它可能在對感染的發炎反應中產生。一主要的蛋白酶候選為胰蛋白酶Clara，其係由支氣管上皮的Clara細胞產生，並且具有有限的組織分佈(上呼吸道)。此蛋白酶對於H1、H2、H3以及H6的切割位點發現之一元序列Q/E-X-R具特異性。來自H9與B病毒株的HA分別地顯示SSR與KER之稍微不同的一元切割位點(見第24圖)。在造成在水鳥中見到的腸胃與呼吸道感染的大多數流感病毒中尚未確認出蛋白酶。在實驗室中，除非加入外源性蛋白酶(通常是胰蛋白酶)，大多數細胞株不支持多週期複製。

然而，高度致毒性禽流感病毒株係由更廣泛分佈的細胞內蛋白酶家族切割，其造成全身性的感染。此致病性的差異係與位於HA0切割位點的結構性差異相關。致毒性病毒株具有多元胺基酸插入於或相鄰於一元位點。在此情況下切割於細胞內發生並且涉及的蛋白酶已被確定為成對鹼性胺基酸蛋白酶(furin)，以及其他類枯草桿菌蛋白酶酵素，其於高基氏體中發現並涉及荷爾蒙與生長因子前驅物的轉譯後處理。鹼性胺基酸蛋白酶辨識序列R-X-R/K-R為在H5與H7之HA0切割位點常見的插入胺基酸(見第24圖)。酵素的廣泛組織分佈以及細胞內切割的效率，有助於這些病毒導致的廣泛傳播與致命性全身感染。

Horimoto T,et.al.(2006,Vaccine,Vol 24：3669-3676)描述H5中之H5多元切割位點(RERRRKKR↓G)的去除。將選定的突變進行小鼠的免疫原性(immunogenicity)研究，其包括帶有前4個帶電荷胺基酸(RERR)之刪除的突變以及對多元切割位點的去活化修飾(以TETR取代RKKR)。切割位點的去除不影響突變的H5之免疫致原特性。多元位點的去除(被RETR取代之GERRRKKR↓G)以產生突變NIBSC 05/240 NIBSC流感參考病毒NIBG-23亦已被報導。Hoffman et.al.(2002,2002,Vaccine,Vol 20：3165-3170)以H6的一元位點取代H5 HA的多元切割位點以提高在蛋中的表現。將頭4個殘基刪除並且以IETR取代多元位點的最後四個胺基酸(以IETR↓G之RERRRKKR↓G取代)。此突變株H5顯示高表現量、在低pH下潛在的蛋白水解與構形變化，而免疫原性則未被報導。這些研究顯示可採用切割位點的修飾以消滅病毒顆粒的毒性(在當真實病毒已複製的情況下，容許病毒複製而不殺害宿主的蛋)。在無此類突變下，病毒在到達高效價前便將蛋殺害。

在HA折疊與分泌通過高基氏體的期間，位於HA表面之環上的血球凝集素前驅物切割位點，易被蛋白酶接近而進行蛋白水解。不希望被理論所約束地，若前驅物HA0的水解發生於ER內的HA折疊期間之一元或多元位點，因為植物之高基氏體以及質外體的pH環境是微酸性的，蛋白質的構形變化可能在分泌期間於高基氏體發生。可能產生低pH構形HA，其降低表現量與顆粒固有的穩定性兩者。因此，大多數未切割的HA0前驅物蛋白將由細胞質膜出芽。

關於「蛋白水解環」或「切割位點」意指涉及前驅物HA0切割之蛋白水解位點的一致性序列(consensus sequence)。如同本文中所使用之「一致性」或「一致性序列」意指包含根據多個序列的比對分析之相關序列的序列變異性的序列(胺基酸或核苷酸序列)，該多個序列舉例來說是特定流感HA0序列的多個亞型。流感HA0切割位點的一致性序列可包括流感A一致性血球凝集素胺基酸序列，其包括例如一致性H1、一致性H3、或流感B一致性血球凝集素胺基酸序列。一致性序列的非限制性範例係顯示於第24圖。

在HA的胺基酸序列中，蛋白水解環位於在由HA2部分的頭20個胺基酸所組成的融合胜肽之前。來自A/Hong Kong/68的HA0的晶體結構已被測定(Chen,J.,1998.Cell 95：409-417：以引用的方式併入本文)。暴露於溶劑的殘基一般被認為是生成延長的、高度暴露的表面環之切割位點的部分。由此特定的胜肽序列，可在此選定的區域測定一致性序列(Bianchi et al.,2005,Journal of Virology, 79：7380-7388；以引用的方式併入本文)。

為了破壞蛋白水解環，評估B HA的結構。僅有HA蛋白水解切割位點的刪除將留下分離開來的HA1的C端以HA2的N端，並且必須設計長連接子。然而刪除部分的融合胜肽以及蛋白水解位點容許移除完整的蛋白水解環並且經由2個胺基酸的最小胜肽連接子連接剩餘的HA1以及HA2序列。綜合上述，B變化形包含HA1的C端序列ALKLLKER的刪除加上HA2的N端胺基酸GFFGAIAGFLEG的刪除。經由GG連接子將變短的HA1-HA2連接在一起。

如同在第22B圖中所顯示的，經由刪除HA0的蛋白水解環，當相較於不具有其蛋白水解環移除之HA蛋白時，生成的HA0蛋白如同更強的血球凝集能力所顯示地表現增加的活性。經由活性的增加，意指血球凝集能力以使用本領域之標準技術所測得的增加大約2%至大約100%，或其間的任何量，舉例來說，當相較於不具有其蛋白水解環移除之相同HA蛋白的活性時，增加大約10%至大約50%或介於其間的任何數值，例如大約2、5、8、10、12、15、18、20、22、24、25、26、28、30、32、34、35、36、38、40、42、44、45、46、48、50、52、54、55、56、58、60、65、70、75、80、85、90、95或100%。

關於「嵌合病毒蛋白」或「嵌合病毒多肽」亦稱為「嵌合蛋白」或「嵌合多肽」，其意指包含自二或多於二來源的胺基酸序列，舉例來說但不限於二或更多型或亞型的流感，或融合為單一多肽之不同來源的流感。嵌合蛋白或多肽可包括與多肽或蛋白質的剩餘部分相同或異源的信號肽。嵌合蛋白或嵌合多肽可被產生為來自嵌合核苷酸序列之轉錄子，並且在合成後切割的嵌合蛋白或嵌合多肽，並且如所需的相關於生成多聚體蛋白質。因此嵌合蛋白或嵌合多肽亦包括含有藉由雙硫橋相關聯之次單元的蛋白質或多肽(即，多聚體蛋白質)。舉例來說，包含來自二或多於二來源之胺基酸序列的嵌合多肽可被處理成次單元，並且次單元藉由雙硫橋相關聯以產生嵌合蛋白或嵌合多肽。嵌合病毒蛋白亦可包含第一流感病毒的抗原性蛋白或其片段以及來自第二病毒流感HA的穿膜區域複合物(TDC)，其包括穿膜區域以及胞質尾區域(TM/CT)。多肽可能為血球凝集素(HA)，以及構成此多肽的二或多於二個的胺基酸序列的每一者可由不同HA獲得以產生嵌合HA或嵌合流感HA。嵌合HA亦可包括含有在蛋白質合成之後或期間切割的異源性信號肽(嵌合HA前蛋白)的胺基酸序列。較佳地，嵌合多肽或嵌合流感HA不是自然發生的。可將編碼嵌合多肽的核酸描述為「嵌合核酸」或「嵌合核苷酸序列」。可將由嵌合HA所組成之類病毒顆粒描述為「嵌合VLP」。

此嵌合蛋白質或多肽可包括與多肽或蛋白質的剩餘部分相同或異源的信號肽。該用語「信號肽」為本領域熟知的並且一般意指胺基酸的短(大約5-30個胺基酸)序列，一般發現位於多肽的N端，其引導新轉譯的多肽移位至特定胞器，或協助多肽鏈的特定區域相對於其他者的定位。作為非限制性的範例，此信號肽可能以蛋白質移位至內質網為目標及/或協助相對於新生多肽之膜錨定區域之N端近端區域的定位，以協助成熟蛋白質(不視為限制地例如成熟HA蛋白質)的切割與折疊。

根據本發明而可使用之嵌合病毒蛋白或嵌合病毒核酸之非限制性範例係描述於WO 2009/076778、WO 2010/003235或WO 2010/148511(將其以引用的方式併入本文)。

信號肽

信號肽(SP)對抗原蛋白質或病毒蛋白質可為原生的，或是信號肽相關於抗原蛋白質或被表現的病毒蛋白質之一級序列可為異源的。抗原蛋白質或病毒蛋白質可包含來自第一型流感、亞型或病毒株的信號肽，伴隨來自一或多於一不同型流感、亞型或病毒株之HA的平衡。舉例來說可使用HA的H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9亞型或流感B型的原生信號肽以在植物系統中表現嵌合病毒蛋白質。在本發明的一些具體實施例中，SP可以是流感B型、H1、H3或H5；或是H1/Bri、H1/NC、H5/Indo、H3/Bri或B/Flo亞型。

信號肽亦可能是非原生的，舉例來說，來自抗原蛋白質、病毒蛋白質、或病毒蛋白質以外的病毒的血球凝集素，或來自植物、動物或細菌的多肽。可使用的信號肽的一個非限制性範例為苜蓿草(alfalfa)蛋白質雙硫鍵異構酶(PDI SP；登錄號Z11499之核苷酸32-103；亦可見WO 2009/076778；WO 2010/148511或WO 2010/003235，將其以引用的方式併入本文)。因而本發明提供包含原生的、非原生的信號肽以及編碼此類嵌合病毒蛋白的核酸之嵌合病毒蛋白。

本發明因此亦提供植物中生產嵌合VLP之方法，其中將編碼嵌合病毒蛋白的第一核酸伴隨編碼通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)的第二核酸共同表現。第一與第二核酸可在相同步驟中被引入至植物，或可相繼地引入至植物中。

HA

關於流感病毒，如同本文中所使用之該用語「血球凝集素」或「HA」意指於流感病毒顆粒外側發現之醣蛋白。HA為同源三聚體I型膜醣蛋白，一般包含單一肽、HA1區域以及HA2區域，其包含在C端的跨膜錨定點以及一個小的胞質尾。編碼HA的核苷酸序列為已熟知的並且可得的，見例如BioDefence Public Health base(流感病毒；見URL：biohealthbase.org)或國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)(見URL：ncbi.nlm.nih.gov)，將兩者以引用的方式併入本文。

該用語「同源三聚體(homotrimer)」或「同源三聚體的 (homotrimeric)」意指由三個HA蛋白質分子生成之寡聚合物。不希望被理論所約束地，在動物細胞中HA蛋白質被合成為大約75 kDa的單聚體前驅物蛋白(HA0)，其於表面組裝成延長的三聚體蛋白。在三聚作用發生之前，前驅物蛋白係於保留的活化切割位點(亦稱為融合肽)被切割成2個多肽鏈，HA1與HA2(包含穿膜區域)，其由雙硫鍵連接。HA1段長度可為328胺基酸，以及HA2長度可為221胺基酸。雖然此切割對病毒感染性可能是重要的，但對蛋白質的三聚作用可不為必需的。宿主細胞之內質網(ER)膜內的HA插入、信號肽切割以及蛋白質醣化作用為共轉譯事件。HA的正確再折疊需要蛋白質的醣化作用以及6鏈內雙硫鍵的形成。HA三聚體於順式以及反式高基氏體複合物內組裝，穿膜區域在三聚作用過程中扮演了角色。經鳳梨酵素(bromelain)處理的HA蛋白之晶體結構(其缺乏穿膜區域)在流感病毒株間已顯示高度保留結構。在感染過程期間HA經歷主要構形改變亦已被建立，其需要前驅物HA0被切割為2多肽鏈HA1與HA2。HA蛋白可被處理(即，包含HA1與HA2區域)或可不被處理(即，包含HA0區域)。HA蛋白可被用於使用植物或植物細胞表現系統之VLP生產或形成中。

本發明之HA可由任何亞型獲得。舉例來說，HA可能是H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16亞型或流感B型HA。本發明之重組HA亦可包含根據本領域已知的任何血球凝集素的序列之胺基酸序列，見例如BioDefence Public Health base(流感病器；見URL：biohealthbase.org)或國家生物技術資訊中心(見URL：ncbi.nlm.nih.gov)。此外，HA可根據由一或更多新出現或新確認的流感病毒中分離出的血球凝集素序列。

根據本發明而可使用的HA或HA片段之非限制性範例包括那些描述於WO2009/009876、WO 2009/076778；WO 2010/003225、WO 2010/003235、WO 2010/006452、WO 2011/035422或WO 2010/148511中者(將其以引用的方式併入本文)。

如同第18圖中所顯示的，來自B/布里斯班/60/2008之HA在農桿菌浸潤之菸草葉中表現不佳(見欄1008或1029)。然而，B型HA伴隨來自A/新喀里多尼亞/20/99的M2之共同表現，造成HA表現的顯著增加(見欄「1008+1261」、「1009+1261」以及「1029+1261」)。在原生B型HA或嵌合B型HA兩者中觀察到HA表現的增加。在擴增元素(BeYDV)的存在或缺乏下以及於不同農桿菌稀釋濃度觀察HA表現。當將來自A/伯斯/16/2009之H3伴隨來自A/新喀里多尼亞/20/99的M2共同表現時觀察到H3表現類似的增加(第19圖；比較欄1019中單獨的H3以及欄「1019+1261」中與M2共同表現之H3)。

VLP

該用語「類病毒顆粒」(VLP)或「類病毒顆粒」或「VLP」意指自組裝並且包含病毒蛋白質(例如像是流感HA蛋白的結構病毒蛋白質或例如但不限於像是M2的質子通道蛋白的通道蛋白)或那些蛋白之組合物的結構。VLP一般在形態上與致原性上類似於感染中產生之病毒粒子，但缺乏足以複製的基因資訊因而為非感染性的。在一些範例中，VLP可能包含單一蛋白質種類，或多於一的蛋白質種類。對包含多於一種蛋白質種類的VLP而言，蛋白質種類可能來自相同病毒種或可能包含來自不同病毒之種、屬、亞科或科(如同由ICTV命名法指定的)的一蛋白質。在其他範例中，構成VLP的一或更多蛋白質種類可由自然發生的序列做修改。VLP可於合適的宿主細胞生產，其包括植物與昆蟲宿主細胞。在適合的條件下從宿主細胞萃取與分離以及進一步純化之後，可將VLP純化為完整的結構。

此外，可生產包含HA亞型的組合之VLP。舉例來說，VLP可包含來自H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16亞型、HA B亞型或其組合的一或多於一的HA。可從由VLP製備之疫苗的期望用途而決定HA組合的選擇。舉例來說用以接種鳥類的疫苗可包含HA亞型的任何組合，而對接種人類有效用的VLP可包含一或多於一的H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16亞型、HA B亞型之亞型。然而，其他HA亞型組合可視VLP的用途而製備。為了生產包含HA亞型組合物的VLP，可將所想要的HA亞型於相同細胞(例如植物細胞)中共同表現。

如同以下更詳細描述的，當將來自A/新喀里多尼亞/20/99的M2共同表現時，在農桿菌浸潤的菸草葉中之B型HA或來自B/布里斯班/60/2008之H3的表現增加(見第18以及19圖)。當將H1或H5與M2共同表現時未觀察到類似增加，因在M2的存在或缺乏下皆觀察到高量的H1或H5表現(分別為第20圖與第21圖)。已知HA以pH依賴性方式被處理(見Reed M.L.et.al.Journal of Virology,February 2010,p.1527-1535,Vol.84,No.3)，並且經歷pH依賴性構形改變(Skehel J.J.et.al.1982,PNAS79：968-972)。H1與H5在低於在H3與B型HA觀察到構形變化之pH展現構形的變化。不希望被理論所約束地，在成熟與遷移期間高基氏體內的pH可能不具有對H1與H5折疊的影響，然而，在高基氏體內的低pH可能影響H3以及B型HA折疊。經由共同表現通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)以及H3或B型HA，高基氏體內的pH可能增加並且造成HA折疊而導致增加的HA產率。此外，H1與H5可能比起H3以及B型HA在較低pH下更穩定。因此，經由共同表現通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)以及H3或B型HA，較少的HA在高基氏體內降解。

根據本發明由流感衍生蛋白質產生之VLP不包含M1蛋白。已知M1蛋白結合RNA(Wakefield and Brownlee,1989)，其為VLP製備的汙染物。當獲得VLP產物之管理批准時，RNA的存在是不希望的，因此缺少RNA的VLP製備可能是有利的。

如同本文所描述而產生之VLP不典型地包含神經醯胺酶(neuramindase,NA)。然而，萬一需要包含HA與NA的VLP時，NA可伴隨HA共同表現。

本發明亦包括但不限於由表現VLP蛋白質之細胞的質膜獲得脂質套膜的病毒衍生VLP。舉例來說，若VLP表現於植物基礎的系統，VLP可由細胞的質膜獲得脂質套膜。

一般而言，該用語「脂質」意指脂溶性(親油的)、自然發生的分子。該用語亦用以更具體地意指脂肪酸以及其衍生物(包括三-、二-以及單甘油酯與磷脂質)，以及其他包含脂溶性固醇的代謝產物或固醇。磷脂質為所有生物性膜的主要組成分，伴隨醣脂質、固醇以及蛋白質。磷脂質的範例包括磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine)、磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine)、磷脂醯肌醇(phosphatidylinositol)、磷脂醯絲胺酸(phosphatidylserine)以及類似物。固醇的範例包括動物固醇(例如，膽固醇)以及植物固醇。超過200種植物固醇已在各種植物物種中被確認出來，最常見的為油菜籽固醇、豆固醇、麥角固醇、菜子固醇、d-7-豆固醇、d-7-燕麥固醇、胡蘿蔔固醇、麥固醇、24-甲基膽固醇、膽固醇或ß-麥固醇。如同本領域之技術人員將了解的，細胞質膜的脂質組成可隨著細胞或由此獲得細胞之有機體的培養或生長條件而變化。細胞膜一般包含脂雙層以及各種功能的蛋白質。特定脂質的局部集中可於脂雙層發現，稱為「脂筏」(lipid rafts)。不希望被理論所約束地，在胞飲與胞吐作用、病毒或其他具感染性之劑的進入或外出、細胞間訊息傳遞、與細胞或有機體的其他結構組成分(例如細胞內與細胞外間質)之交互作用中，脂筏可能具有重要角色。

在植物中，流感VLP由質膜出芽，因此VLP的脂質組成物反映其來源。根據本發明生產之VLP包含與植物衍生性脂質複合的一或多於一流感病毒類型或亞型的HA。植物脂質可刺激特定免疫細胞並增強誘發的免疫反應。植物膜係由脂質、磷脂醯膽鹼(PC)以及磷脂醯乙醇胺(PE)製成，並且亦包含醣原神經脂質(glycosphiugolipid)、皂苷以及植物固醇。此外，亦於植物質膜發現脂筏，這些微區域富含於神經脂質與固醇中。在植物中，已知存在各種植物固醇，包括豆固醇、麥固醇、24-甲基膽固醇以及膽固醇(Mongrand et al.,2004)。

PC與PE以及醣原神經脂質可結合至由哺乳動物免疫細胞例如抗原呈現細胞(APC)像是樹狀細胞以及巨噬細胞以及其他細胞包括在胸腺與肝臟之B與T淋巴球表現之CD1分子(Tsuji M,.2006)。CD1分子為結構上類似於第I類主要組織相容複合物(MHC)分子，以及其角色為呈現醣脂質抗原給NKT細胞(自然殺手T細胞)。於活化時，NKT細胞活化先天免疫細胞，例如NK細胞以及樹狀細胞，並且亦活化適應性免疫細胞、像是抗體生成B細胞以及T細胞。可於質膜發現各種植物固醇-特定的補體可能視物種、生長條件、營養來源或病原體狀態而變化，僅列出幾個因子。一般而言，ß-麥固醇為最豐富的植物固醇。

植物固醇存在於與脂雙層複合的流感VLP中，例如質膜衍生套膜可提供有利的疫苗組成分。不希望被理論所約束地，植物製成之VLP與脂雙層複合(例如質膜衍生的套膜)可能比以其他表現系統製成的VLP誘發更強烈的免疫反應，並且可能類似於由活的或減毒全病毒疫苗誘發的免疫反應。因此，在一些具體實施例中，本發明提供與植物衍生脂雙層複合之VLP。在一些具體實施例中，植物衍生脂雙層可包含VLP的套膜。植物衍生脂質可包含生產VLP之植物的質膜的脂質組成物，其包括但不限於磷脂醯膽鹼(PC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、醣原神經脂質、植物固醇或其組合物。植物衍生脂質可替代地稱為「植物脂質」。植物固醇的範例為本領域已知的，並且包括例如豆固醇、麥固醇、24-甲基膽固醇以及膽固醇，參考例如Mongrand et al.,2004。

VLP可經由例如血凝試驗、電子顯微鏡或經由粒徑篩析層析法評估結構與尺寸。

對於粒徑篩析層析法，可將總可溶性蛋白質從植物組織中經由將冷凍粉碎的植物材料樣本在萃取緩衝液中均質化(Polytron)而萃取，以及經由離心移除不可溶材料。可使用PEG沉澱。將可溶性蛋白質量化，並且將萃取物通過粒徑篩析基質，舉例來說但不限於Sephacryl^TM。在色層分析後，可將分餾物經由免疫墨點法進一步分析以測定分餾物的蛋白質補體。

不希望被理論所約束地，HA結合至來自不同動物之RBC的能力係由HA對唾液酸a2,3或a2,3的親和力以及這些唾液酸於RBC表面的存在所驅動。來自流感病毒的馬與禽流感HA凝集所有數個品種，包括土雞、雞、鴨、天竺鼠、人類、羊、馬以及牛；而人類HA將結合至土雞、雞、鴨、天竺鼠、人類與羊的紅血球(亦可見Ito T.et al,1997,Virology,vol 227,p493-499；以及Medeiros R et al,2001,Virology,vol 289 p.74-85)。

折疊(伴隨蛋白(chaperon))

表現的病毒蛋白質之正確折疊對蛋白質的穩定性、多聚體的形成、VLP的形成、病毒蛋白質的功能與病毒蛋白質於其他特性中被抗體的辨認可能是重要的。蛋白質的折疊與累積可被一或更多因素影響，其包括但不限於，蛋白質的序列、蛋白質的相對富集度、細胞內的擁擠程度、於細胞隔間內的pH、可結合或暫時結合於折疊的、部分折疊的或未折疊的蛋白質之輔助因子的可得性、一或更多伴隨蛋白的存在，或諸如此類者。

熱休克蛋白(Hsp)或壓力蛋白(stress protein)為伴隨蛋白蛋白質的範例，其可參與於各種細胞程序，包括蛋白質合成、細胞內運輸、錯誤折疊的預防、蛋白質聚集的預防、蛋白質複合體的組裝與分解、蛋白質折疊以及蛋白質解聚作用。此類伴隨蛋白的範例包括但不限於Hsp60、Hsp65、Hsp70、Hsp90、Hsp100、Hsp20-30、Hsp10、Hsp100-200、Hsp100、Hsp90、Lon、TF55、FKBP、環菲林、ClpP、GrpE、泛蛋白、鈣聯蛋白以及蛋白質雙硫鍵異構酶(見例如Macario,A.J.L.,Cold Spring Harbor Laboratory Res.25：59-70.1995；Parsell,D.A.& Lindquist,S.Ann.Rev.Genet.27：437-496(1993)；美國專利號5,232,833)。如同本文所描述的，可使用例如但不限於Hsp40與Hsp70的伴隨蛋白以確保病毒蛋白質的折疊。

Hsp70的範例包括來自哺乳動物細胞的Hsp72以及Hsc73、來自細菌的DnaK，特別地為分枝桿菌例如麻瘋分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)以及牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)(例如Bacille-Calmette Guerin：此處稱為Hsp71)。來自大腸桿菌(Escherichia coli)、酵母菌以及其他原核生物的DnaK，以及來自例如阿拉伯芥(A.thaliana)的真核生物的BiP與Grp78(Lin et al.2001 Cell Stress and Chaperones 6：201-208)。Hsp70的特定範例為阿拉伯芥Hsp70(由 Genbank ref：AY120747.1編碼)。Hsp70能專一地結合ATP以及未折疊的多肽與肽，從而參與蛋白質折疊與展開以及蛋白質複合體之組裝與分解。

Hsp40的範例包括來自原核生物例如E.coli與分枝桿菌的DnaJ以及來自真核生物例如苜蓿草(alfalfa)之HSJ1、HDJ1與Hsp40(Frugis et al.,1999.Plant Molecular Biology 40：397-408)。Hsp40的特定範例為M.sativa MsJ1(Genbank ref：AJ000995.1)。Hsp40扮演於其他細胞活動中之蛋白質折疊、耐熱性與DNA複製中的分子伴隨蛋白角色。

在Hsp中，Hsp70以及其共同伴隨蛋白Hsp40涉及在合成完成之前轉譯與新合成之多肽的穩定。不希望被理論所約束地，Hsp40結合至未折疊(新生或新轉移)的多肽之疏水區(hydrophobic patches)，因而促進Hsp70-ATP複合體與多肽的交互作用。ATP水解導致多肽、Hsp70與ADP間穩定複合體的生成以及Hsp40的釋放。Hsp70-ADP複合體與多肽疏水區的結合防止它們與其他疏水區的交互作用，進而防止不正確折疊以及與其他蛋白質之聚集體的形成(於Hartl,FU.1996.Nature 381：571-579中回顧)。

原生伴隨蛋白可能促進低表現量的重組蛋白質之正確折疊，但隨著表現量的增加，原生伴隨蛋白的豐度可能變為限制因素。在農桿菌浸潤之葉子中病毒蛋白質之高表現量可能導致病毒蛋白質在細胞質中的累積，並且一或多於一的伴隨蛋白(例如Hsp70、Hsp40或Hsp70與Hsp40兩者)的共同表現可能降低錯誤折疊或聚集的蛋白質量，並且增加表現三級與四級結構特徵之蛋白質數量，其可讓類病毒顆粒形成。因此，本發明亦提供在植物中生產病毒蛋白質VLP的方法，其中編碼病毒蛋白質的第一核酸係伴隨編碼通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)的第二核酸以及編碼伴隨蛋白的第三核酸共同表現。可將第一與第二與第三核酸於相同步.驟引至植物中，或可相繼地引至植物中。

N-聚醣

在植物內生產之VLP可誘導包含植物特異N-聚醣之病毒蛋白質。因此，此發明亦提供包含具有植物特異N-聚醣之病毒蛋白質的VLP。

此外，已知植物中N-聚醣的修飾作用(見例如WO 2008/151440；WO 2010/006452；或U.S.60/944,344；將其以引用的方式併入本文)並且可生產具有修飾N-聚醣之病毒蛋白質。含有修飾的醣基化模式之病毒蛋白質，舉例來說伴隨降低的海藻糖苷化(fucosylation)、木糖苷化(xylosylation)或海藻糖苷化與木糖苷化兩者，可獲得N-聚醣，或可獲得具有修飾的醣基化模式之病毒蛋白質，其中蛋白質缺乏海藻糖苷化、木糖苷化或兩者，以及含有增加的醣基化。此外，轉譯後修飾之調節，舉例來說，當相較於表現病毒蛋白質之野生型植物，尾端半乳糖的添加可造成表現之病毒蛋白質海藻糖苷化與木糖苷化的降低。

舉例來說，不將其視為限制，具有經修飾的醣基化模式之病毒蛋白質的合成可經由共同表現興趣蛋白質與編碼ß-1.4-半乳糖基轉移酶(GalT)的核苷酸序列而達成，其例如但不限於哺乳動物GalT或人類GalT，然而亦可使用來自另一來源的GalT。亦可將GalT的催化區域融合至N-乙醯葡萄醣胺移轉酶(N-acetylglucosaminyl transferase,GNT1)的CTS區域(即，胞質尾、穿膜區域、幹區域)以生產GNT1-GalT混合酶，並可將混合酶與病毒蛋白質共同表現。亦可與編碼N-乙醯葡萄醣胺移轉酶III(N-acetylglucosaminyltrasnferase III,GnT-III)的核苷酸序列(其例如但不限於哺乳動物GnT-III或人類GnT-III，亦可使用來自其他來源的GnT-III)共同表現病毒蛋白質。此外，亦可使用包含融合至GnT-III的GNT1 CTS之GNT1-GnT-III 混合酶。

因此本發明亦包括含有一或更多具有經修飾之N-聚醣的病毒蛋白質之VLP。

序列

以本發明可使用之序列的非限制性範例包括：由核酸分子編碼之H2蛋白質可來自A/Singapore/1/57(H2N2)株；由核酸分子編碼之H3蛋白質可來自A/布里斯班10/2007(H3N2)、A/威斯康辛/67/2005(H3N2)株、A/維多利亞/361/2011(H3N2)或A/伯斯/16/2009(H3N2)；由核酸分子編碼之H6蛋白質可來自A/Teal/HongKong/W312/97(H6N1)株；由核酸分子編碼之H7蛋白質亦可來自A/Equine/Prague/56(H7N7)株；由核酸分子編碼之H9蛋白質亦可來自A/HongKong/1073/99(H9N2)株；由核酸編碼的來自B亞型之HA蛋白質可來自B/Florida/4/2006、B/馬來西亞/2506/2004、B/威斯康辛/1/2010或B/布里斯班/60/2008株。

以本發明可使用的序列之非限制性範例亦包括那些描述於WO 2009/009876；WO 2009/076778；WO 2010/003225；WO 2010/148511；WO 2010/003235；WO 2010/006452中者，將其以引用的方式併入本文。來自本領域已知的H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16以及B型HA的編碼此類HA蛋白質之胺基酸分子的序列範例。舉例來說H3或B亞型包括SEQ ID No：25或30。編碼結構性病毒蛋白的序列可能為例如來自流感B/布里斯班/60/2008、B/馬來西亞/2506/2004或B/威斯康辛/1/2010的HA，或是來自流感A/伯斯/16/2009或A/維多利亞 /361/2011之H3。其他範例包括編碼HA蛋白的核酸分子序列，其中HA蛋白的蛋白水解環已被刪除，像是例如但不限於由SEQ ID NO：41所定義之序列。

本發明亦包括但不限於編碼HA的核苷酸序列，該HA係來自例如H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16以及B型HA。舉例來說SEQ ID NO：28、43、23，分別地編碼來自B、B具有刪除的蛋白水解環或H3的HA，於嚴格雜交條件下與SEQ ID NO：28、43、23雜交之核苷酸序列，或於嚴格雜交條件下與SEQ ID NO：28、43、23的互補物雜交之核苷酸序列，其中該核苷酸序列編碼血球凝集素蛋白，當其表現時生成VLP，並且VLP誘發抗體的產生。舉例來說，植物細胞內的核苷酸序列表現生成VLP，並且可將VLP用以生產能夠結合HA(包括來自B或H3的成熟HA)的抗體。當將VLP給藥予個體時，誘發免疫反應。亦可將核苷酸序列伴隨編碼通道蛋白第二核苷酸序列共同表現，該核苷酸序列例如但不限於核苷酸序列SEQ ID NO：9、12、在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO：9、12雜交之核苷酸序列或在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO：9、12的互補物雜交之核苷酸序列，其中編碼質子通道蛋白的第二核苷酸序列生成VLP。較佳地，VLP誘發抗體生成，並且當將VLP給藥予個體時，誘發免疫反應。

舉例來說，在植物細胞中之核苷酸序列的表現生成VLP，並且可使用VLP生產能夠結合病毒蛋白質(像是例如HA)的抗體，該HA係包括但不限於HA0、其蛋白水解環經刪除或修飾的HA0蛋白、一或更多型或亞型流感(像是例如但不限於H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16亞型以及HA B亞型)的HA1或HA2。當將VLP給藥予個體時，誘發免疫反應。

在嚴格雜交條件下的雜交反應為本領域已知的(見例如 Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.,eds.1995以及補充資料；Maniatis et al.,in Molecular Cloning(A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Laboratory,1982；Sambrook and Russell,in Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3^rdedition 2001；將其每個以引用的方式併入本文)。此類嚴格雜交條件的一個範例可為於65℃下在4 X SSC中的大約16-20小時的雜交反應，接著於65℃下在0.1 X SSC中清洗1小時，或於65℃下在0.1 X SSC中清洗2次，每次20或30分鐘。替代地，示範性的嚴格雜交條件可為於42℃下在50%甲醯胺、4 X SSC中隔夜(16-20小時)，接著於65℃下在0.1 X SSC中清洗1小時，或於65℃下在0.1 X SSC中清洗2次，每次20或30分鐘，或於65℃下在Church磷酸鹽緩衝水溶液(7% SDS；0.5M NaPO₄緩衝液pH 7.2；10 mM EDTA)中隔夜(16-20小時)的雜交，伴隨於50℃下在0.1 X SSC、0.1% SDS的兩次清洗，每次20或30分鐘，或者於65℃下在2 X SSC、0.1% SDS的兩次清洗，每次20或30分鐘。

額外地，本發明包括核苷酸序列，其特徵在於相較於編碼來自B(SEQ ID NO：28)、B伴隨刪除的蛋白水解環(SEQ ID NO：43)或H3(SEQ ID NO：23)的HA、或與由SEQ ID NO：23、28、43、46、51、57或61中的任何一或更多者編碼的HA，具有大約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或介於其間任何量的序列一致性或序列相似性，其中該核苷酸序列編碼血球凝集素，當其表現時生成VLP，並且VLP誘發抗體的生成。舉例來說，植物細胞內的核苷酸序列之表現生成VLP，並且可將VLP用以產生能夠結合HA(其包括來自B或H3之未處理的及/或成熟的HA，或是未處理的及/或成熟的HA，其中蛋白水解環已被刪除)的抗體。當將VLP給藥予個體時，誘發免疫反應。

本發明亦包括核苷酸序列，其特徵在於相較於編碼M2之核苷酸序列(SEQ ID NO：9、12)，具有大約70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或介於其間任何量的序列一致性或序列相似性，其中該核苷酸序列編碼通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)，當將其伴隨結構性病毒蛋白共同表現時，生成VLP。較佳地，VLP引發抗體產生，並且當將VLP給藥予個體時，誘發免疫反應。

序列一致性序列相似性可使用核苷酸序列比對程式決定，例如在DNASIS中提供者(使用例如但不限於下列參數：GAP懲罰5、頂對角線# 5、固定GAP懲罰10、k-元組2、浮動差距10以及視窗尺寸5)。然而，序列排比以用於比對的其他方法為本領域熟知的，例如Smith & Waterman演算法(1981,Adv.Appl.Math.2：482)、Needleman & Wunsch(J.Mol.Biol.48：443,1970)、Pearson & Lipman(1988,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444)以及經由這些演算法之計算執行(例如GAP、BESTFIT、FASTA以及BLAST)，或經由手動排比以及目視檢查。可以在第24圖發現來自不同流感病毒株的HA序列比對範例。

「免疫反應」一般意指適應性免疫系統的反應。適應性免疫系統一般地包含體液反應以及細胞媒介反應。體液反應為由分泌的抗體媒介之免疫的方面，該抗體係由B淋巴球系的細胞(B細胞)產生。分泌的抗體結合至侵入微生物(例如病毒或細菌)表面的抗原，其將它們標誌為破壞。體液免疫一般用以意指抗體產生以及與其相伴的程序，以及抗體的作用功能，其包括Th2細胞活化以及細胞介素產生、記憶細胞生成、吞噬作用的調理素(opsonin)的促進、病原體消除以及諸如此類。該用語「調節(modulate)」或「調節 (modulation)」或諸如此類意指特定反應或參數之增加或降低，其係如同以一般已知或使用的數個分析的任一者所測定，將其中的一些於本文例舉。

細胞媒介的反應是不涉及抗體但涉及回應抗原之巨噬細胞、自然殺手細胞(NK)、抗原特異細胞毒性T淋巴球以及各種細胞介素釋放的活化之免疫反應。一般用細胞媒介的免疫指一些Th細胞活化、Tc細胞活化以及T細胞媒介的反應。細胞媒介的免疫在回應病毒感染是特別重要的。

舉例來說，抗原特異CD8陽性T淋巴球的誘導可使用ELISPOT分析來測量；CD4陽性淋巴球的誘導可使用增生分析來測量。可使用ELISA分析定量抗流感抗體效價；亦可使用抗同型抗體(例如抗IgG、IgA、IgE或IgM)測量抗原特異同型或交叉反應抗體。操作此類分析的方法與技術為本領域已熟知的。

亦可使用交叉反應HAI效價以論證對疫苗亞型相關的其他病毒株之免疫反應的效果。舉例來說，可在HAI分析中使用來自以第一株疫苗組成物(例如A/印尼5/05的VLP)誘發免疫之個體的血清伴隨全病毒或病毒顆粒的第二株(例如A/越南/1194/2004)，並且測定HAI效價。

亦可定量細胞介素的存在或量。舉例來說T幫手細胞反應(Th1/Th2)將以使用ELISA(例如BD Biosciences OptEIA套組)之IFN-g與IL-4分泌細胞的測量為特徵。可培養由個體獲得的週邊血單核細胞(PMBC)或脾細胞，並且分析上清液。亦可使用本領域已知的標記特異性螢光標籤與方法，以螢光活化細胞分選(FACS)定量T淋巴球。

亦可進行微中和(microneutralization)分析以描述個體中的免疫反應之特性，見例如Rowe et al.,1973的方法。可以數種方式獲得病毒中和效價，包括：1)細胞的結晶紫固定/染色後的溶菌斑列舉(溶菌斑檢定)；2)培養基中的細胞破裂之顯微鏡觀察；3)NP病毒蛋白質之ELISA與分光光度法偵測(與宿主細胞之病毒感染相關聯)。

基因構築體

本發明係進一步針對包含編碼通道蛋白(例如但不限於質子通道蛋白)或結構性病毒蛋白的核酸之基因構築體，如同上述的，被操作性地連接至植物中運作的調節元素。在植物細胞中運作的調節元素並且可根據本發明而使用之範例包括但不限於質體藍素調節區域(US 7,125,978；將其以引用的方式併入本文)或核酮糖1,5-雙磷酸鹽羧酶/加氧酶(RuBisCO：US 4,962,028；將其以引用的方式併入本文)、葉綠素a/b結合蛋白(CAB；Leutwiler et al；1986；將其以引用的方式併入本文)ST-LS1(與光系統II之放氧複合物相關，並且由Stockhauset al.1987,1989描述；將其以引用的方式併入本文)。

調控元素

本申請書中的用語「調控區域」、「調控元素」或「啟動子」之使用係意圖反映典型地核酸之部分，但非總是在基因的蛋白質編碼區域的上游，該編碼區域可由DNA或RNA或者DNA與RNA兩者組成。當調控區域為具活性的，並且與興趣基因於操作性的關連或操作性地連結時，此可造成興趣基因的表現。調控元素可能調控器官專一性或控制生長的基因活化或暫時的基因活化。「調控區域」可包括啟動子元素、表現基礎啟動子活性之核心啟動子元素、對回應外部刺激而為可誘導之元素、調控啟動子活性之元素(例如負調控子或轉錄增強子)。如同本文使用的，「調控區域」亦可包括轉錄之後具活性的元素，舉例來說，調控基因表現的調控元素，例如轉譯與轉錄增強子、轉譯與轉錄抑制子、上游活化序列以及mRNA不穩定性決定因素。這些後者因素中的幾個可位於編碼區域近端。

在此揭露內容之上下文中，該用語「調控元素」或「調控區域」典型地意指通常但非總是於結構基因的編碼序列上游(5')之DNA序列，其經由提供RNA聚合酶及/或轉錄需要的其他因子之辨識而於特定位點開始轉錄，以控制編碼區域的表現。然而，要了解位於內含子內的其他核苷酸序列或序列的3'亦可有助於興趣編碼區域表現之調控。提供RNA聚合酶或其他轉錄因子辨識以確保於特定位點起始轉錄的調控元素範例為啟動子元素。大部分但非全部地，真核生物的啟動子元素包含TATA盒、由腺苷酸與胸苷酸鹼基對組成之保留核酸序列，其通常位於轉錄起始位點上游大約25鹼基對。啟動子元素包含負責轉錄的起始之基礎啟動子元素，以及修飾基因表現的其他調控元素(如上所列者)。

有幾種類型的調控區域，包括那些由生長調控的，可誘導的(inducible)或非誘導的(constitutive)。由生長調控的或在其控制之下控制基因的不同表現的調控區域，係於那器官或組織生長期間的特定時間於某些器官或器官之組織內活化。然而，由生長調控的一些調控區域可於特定器官或組織內於特定生長階段較佳地活化，或同樣地在植物中的其他器官或組織位於基本量。組織特異的調控區域之範例，例如視特異(see-specific)調控區域，其包括油菜種籽(napin)啟動子，以及十字花科蛋白(cruciferin)啟動子(Rask et al.,1998,J.Plant Physiol.152：595-599；Bilodeau et aI.,1994,Plant Cell 14：125-130)。葉子特異性啟動子的範例包括質體藍素啟動子(見US 7,125,978，將其以引用的方式併入本文)。

可誘導的調控區域能夠對誘導子反應而直接或間接活化一或更多DNA序列或基因之轉錄。在缺少誘導子下，DNA序列或基因將不會被轉錄。典型地特異性地結合至可誘導調控區域以活化轉錄之蛋白質因子可以未活化形式存在，其再被誘導子直接或間接轉變為活化形式。然而，蛋白質因子亦可不存在。誘導子可以是化學劑，例如蛋白質、代謝產物、生長調控劑、除草劑或酚類化合物或由熱、冷、鹽、有毒元素直接施加或經由病原體或疾病之劑(例如病毒)間接施加的生理壓力。可將包含可誘導調控區域之植物細胞例如經由噴灑、澆灌、加熱或類似的方法由外部施加誘導子至細胞或植物而暴露於誘導子。可誘導的調控元素可衍生自植物或非植物基因(例如Gatz,C.and Lenk,LR.P.,1998,Trends Plant Sci.3,352-358；將其以引用的方式併入)。潛在的可誘導啟動子之範例包括但不限於可由四環黴素誘導之啟動子(Gatz,C.,1997,Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48,89-108；將其以引用的方式併入)、可由類固醇誘導之啟動子(Aoyama.T.and Chua,N.H.,1997,Plant 1.2,397-404；將其以引用的方式併入)以及可由乙醇誘導之啟動子(Salter,M.G.,et aI,1998,Plant 10urnal 16,127-132；Caddick,M.X.,et al,1998,Nature Biotech.16,177-180，將其以引用的方式併入)、可由細胞分裂素誘導之IB6與CKI 1基因(Brandstatter,I.and K.ieber,1.1.,1998,Plant Cell 10,1009-1019；Kakimoto,T.,1996,Science 274,982-985；將其以引用的方式併入)以及可由生長激素誘導之元素DR5(Ulmasov,T.,et aI.,1997,Plant Cell 9,1963-1971；將其以引用的方式併入)。

非誘導式調控區域於整個植物的各部分以及持續地於整個植物生長中導引基因表現。已知的非誘導式調控元素包括關聯於CaMV 35S轉錄之啟動子(Odell et aI.,1985,Nature,313：810-812)、稻肌動蛋白1(Zhang et aI,1991,Plant Cell,3：1155-1165)、肌動蛋白2(An et al.,1996,Plant J.,10：107-121)或tms 2(U.S.5,428,147，將其以引用的方式併入本文)以及磷酸三碳醣異構酶(triosephosphate isomerase 1)基因(Xu et.aI.,1994,Plant Physiol.106：459-467)、玉米泛蛋白1基因(Cornejo et ai,1993,Plant Mol.BioI.29：637-646)、阿拉伯芥泛蛋白1與6基因(Holtorf et aI,1995,Plant Mol.BioI.29：637-646)以及菸草轉譯起始因子4A基因(Mandel et aI,1995,Plant Mol.BioI.29：995-1004)。

該用語「非誘導的」(constitutive)如同本文中所使用，不一定指基因在非誘導調節區域的控制下於所有細胞類型中以相同量表現，亦可指即使常常觀察到基因豐度的變化，基因在廣泛的細胞類型中表現。非誘導的調節元素可與其他序列耦合以進一步增強它們操作性連接的核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。舉例來說，CPMV-HT系統係衍生自豇豆鑲嵌病毒(CPMV)的未轉譯區域並且展現相關編碼序列之增強轉譯。所謂「原生」意指核酸或胺基酸序列為天然地發生，或「野生型」。所謂「操作性地連結或連接」意指使特定序列(例如調節元素)以及興趣編碼區域直接或間接交互作用以進行預定功能，例如基因表現之媒介或調節。操作性地連結序列之交互作用可經由例如與操作性地連結序列交互作用的蛋白質而媒介。

一或更多病毒蛋白質(例如結構性病毒蛋白或例如但不限於質子通道蛋白的通道蛋白)可在包含以病毒為基礎的、DNA或RNA表現系統之表現系統中表現，例如但不限於豇豆鑲嵌病毒屬(comovirus)為基礎的表現卡匣以及雙生病毒(geminivirus)為基礎的擴增元素。

如同本文所描述之表現系統可包含以兩條單股(bipartite)病毒或帶有兩條單股基因組的病毒為基礎之表現卡匣。舉例來說，兩條單股病毒可能是豇豆嵌紋病毒科(Comoviridae)。豇豆嵌紋病毒科之屬包括豇豆嵌紋病毒屬、線蟲核多角體病毒屬(Nepovirus)、豆科病毒屬 (Fabavirus)、櫻桃銼葉病毒屬(Cheravirus)以及溫州蜜柑矮縮病毒屬(Sadwavirus)。豇豆嵌紋病毒屬包括豇豆嵌紋病毒(CPMV)、豇豆嚴重嵌紋病毒(CPSMV)、胡瓜嵌紋病毒(SqMV)、紅三葉草斑駁病毒(RCMV)、扁豆斑駁病毒(BPMV)、蕪菁環斑病毒(TuRSV)、蠶豆真嵌紋病毒(BBtMV)、蠶豆染色病毒(BBSV)、蘿蔔嵌紋病毒(RaMV)。包含對本發明的各方面有用的增強子元素之豇豆嵌紋病毒RNA-2序列的範例包括但不限於：CPMV RNA-2(GenBank登錄號NC_003550)、RCMV RNA-2(GenBank登錄號NC_003738)、BPMV RNA-2(GenBank登錄號NC_003495)、CPSMV RNA2(GenBank登錄號NC_003544)、SqMV RNA-2(GenBank登錄號NC_003800)、TuRSV RNA-2(GenBank登錄號NC_013219.1)、BBtMV RNA-2(GenBank登錄號GU810904)、BBSV RNA2(GenBank登錄號FJ028650)、RaMV(GenBank登錄號NC_003800)。

兩條單股病毒豇豆鑲嵌病毒RNA基因組的片段意指RNA-1與RNA-2。RNA-1編碼涉及複製的蛋白質而RNA2編碼細胞-細胞移動所需的蛋白質以及兩個蛋白衣(capsid)蛋白質。可使用任何合適的以豇豆鑲嵌病毒為基礎之卡匣包括CPMV、CPSMV、SqMV、RCMV或BPMV，舉例來說，表現卡匣可以CPMV為基礎。

「表現卡匣」意指包含興趣核酸的核苷酸序列，該興趣核酸受控於且操作性地連結於適合的啟動子或其他調節元素，以在宿主細胞中轉錄該興趣核酸。

已顯示菸草以全長、CPMV兩基因組RNA之複製勝任的cDNA拷貝的轉殖可造成生產的感染(Liu et al.,2004,Virology 323,37-48，以引用的方式併入本文)。CPMV為基礎的表現卡匣的範例描述於WO2007/135480：WO2009/087391；以及Sainsbury F.et al.(2008,Plant Physiology；148：1212-1218；Sainsbury F.et al(2008,Plant Biotechnology Journal；6：82-92；Sainsbury F.et al.,2009,Plant Biotechnology Journal；7：682-693；其係以引用的方式併入本文)。作為範例而不將其視為限制地，由其中於5’領導序列發現的兩個第一轉譯起始碼已被刪除的豇豆嵌紋病毒(CPMV)的基因組RNA2獲得之非轉譯區域(UTR)，可將其如同描述於WO 2009/087391中地使用。當與CaMV 35S啟動子以及胭脂鹼合成酶(NOS)終止子結合時，經修飾的CPMV UTR增強相鄰編碼區域的轉譯。以CPMV為基礎的表現系統稱為CPMV-HT(增強轉譯)。本發明之表現卡匣、表現基因構築體以及表現系統因此亦可包含以CPMV為基礎的表現系統，像是例如CPMV-HT表現系統。

如同本文所描述的，可使用衍生自(或與之享有同源性)兩單股RNA病毒(例如豇豆嵌紋病毒)的RNA-2基因組片段的序列，其中目標起始位點已被突變的表現增強子序列，以表現興趣核酸序列。本發明進一步提供增加衍生自兩單股病毒RNA-1基因組片段序列的表現或轉譯增強活性的程序，其程序包含將在其中的目標起始位點突變。

「增強子」序列(或增強子元素)包括衍生自(或與之享有同源性)兩單股RNA病毒(例如豇豆嵌紋病毒)的RNA-2基因組片段的序列，其中目標起始位點已被突變。此類序列可增強其所附著之異源性ORF的下游表現。沒有限制地，相信當存在於已轉錄的RNA時，此類序列可增強其所附著之異源性ORF的轉譯。

表現系統亦可包含來自雙生病毒的擴增元素，舉例來說，來自豆類黃矮病毒(BeYDV)之擴增元素。BeYDV屬於適應於雙子葉植物的Mastreviruses屬。BeYDV為具有單股環狀DNA基因組的單體(monopartite)並且可經由旋轉環狀機制複製至非常高的拷貝數。已使用BeYDV衍生之DNA複製子載體系統在植物中的快速高產量蛋白質生產。

如同本文中所使用的，該措辭「擴增元素」意指包含雙生病毒基因組一或更多長間隔區(long intergenic region,LIR)的至少部分之核酸片段。如同本文中所使用的，「長間隔區」意指包含rep結合位點的長間隔區，其能夠經由雙生病毒Rep蛋白質媒介切除及複製。在一些方面，包含一或更多LIR的核酸片段可進一步包含雙生病毒基因組的短間隔區(SIR)。如同本文中所使用的，「短間隔區」意指互補之股(Mastrevirus之短IR(SIR))。任何合適的雙生病毒衍生之擴增元素可用於本文。參考例如WO2000/20557；WO2010/025285；Zhang X.et al.(2005,Biotechnology and Bioengineering,Vol.93,271-279)、Huang Z.et al.(2009,Biotechnology and Bioengineering,Vol.103,706-714)、Huang Z.et al(2009,Biotechnology and Bioengineering,Vol.106,9-17)；將其以引用的方式併入本文。若在基因構築體中使用多於一的LIR，舉例來說二LIR，那麼啟動子區域以及興趣核酸序列以及終止子被兩LIR的每一者圍住。

如同本文所描述的，經由菸草葉片的農桿菌浸潤，豆類黃矮病毒(BeYDV)衍生載體以及Rep/RepA供應載體的共同輸送造成高效複製體擴增以及大量蛋白質生產。

以豇豆嵌紋病毒為基礎的表現卡匣以及雙生病毒衍生的擴增元素可被個別包含於第一與第二載體，或組成分部分可被包含於一載體。若使用兩載體，可將第一與第二載體同時或分別地引入至植物細胞。

亦可將病毒複製酶包含於如同本文所述的表現系統中，以增加興趣核酸的表現。複製酶的非限制性範例為編碼BeYDV Rep與RepA的BeYDV複製酶(pREP110)(C2/C1；Huang et al.,2009,Biotechnol.Bioeng.103,706-714：將其以引用的方式併入本文)。

轉錄後基因沉默(PTGS)可能涉及植物中轉基因的限制表現，並且可使用來自番茄叢矮病毒的p19(TBSV p19)或馬鈴薯病毒(HcPro)的沉默抑制劑之共同表現以抑制轉基因的特異性降解(Brigneti et al.,1998)。

替代的沉默抑制劑為本領域熟知的並且可如同本文所描述地使用(Chiba et al.,2006,Virology 346：7-14；將其以引用的方式併入本文)，舉例來說但不限於TEV-p1/HC-Pro(菸草刻紋病毒-p1/HC-Pro)、BYV-p21、番茄皺縮病毒的殼體蛋白(TCV-CP)、黃瓜花葉病毒的2b(CMV-2b)、馬鈴薯病毒X的p25(PVX-p25)、馬鈴薯病毒M的p11(PVM-p11)、馬鈴薯病毒S的p11(PVS-p11)、藍莓焦枯病毒的p16(BScV-p16)、柑橘腐根病病毒的p23(CTV-p23)、葡萄樹捲葉關聯性病毒-2的p24(GLRaV-2 p24)、葡萄樹病毒A的p10(GVA-p10)、葡萄樹病毒B的p14(GVB-p14)、獨活屬潛伏病毒的p10(HLV-p10)或大蒜普通潛伏病毒的p16(GCLV-p16)。因此，可將沉默抑制劑，例如但不限於HcPro、TEV-p1/HC-Pro、BYV-p21、TBSV p19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-p11、PVS-p11、BScV-p16、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-p14、HLV-p10、GCLV-p16或GVA-p10隨著編碼興趣蛋白質的核酸序列共同表現以進一步確保植物內高量的蛋白質生產。

所謂「共同表現」意指二或多於二的核苷酸序列於植物以及植物的相同組織中大約同時表現。然而，核苷酸序列不需在完全相同的時間表現。相反地，二或更多的核苷酸序列係以編碼產物有機會交互作用的方式表現。舉例來說，修飾興趣蛋白質的醣化作用之蛋白質可在興趣蛋白質表現之前或期間表現，以便使興趣蛋白質的醣化作用的修飾發生。可使用暫時的表現系統共同表現二或多於二的核苷酸序列，於此將該二或更多的序列於大約相同時間在兩序列表現的條件下引入至植物。替代地，可將編碼興趣蛋白質的序列以暫時或穩定的方式轉殖到包含其中一種額外核苷酸序列(例如編碼用以修飾興趣蛋白質的醣化作用的蛋白質之序列)之平台植物中。在此情況下，可將編碼修飾興趣蛋白質的醣化作用的蛋白質的序列於想要的發生階段之期間表現在想要的組織中，或其表現可使用可誘發的啟動子誘發，而且可將編碼興趣蛋白質的序列於類似條件下並於相同組織中表現，以確保共同表現核苷酸序列。

可由核苷酸序列生產一或更多病毒蛋白為轉錄物，並且將蛋白質於合成後切割，且如有需要，相連接以形成多聚體蛋白質。因此，一或更多病毒蛋白質亦包括含有藉由雙硫鍵橋連接之次單元(即多聚體蛋白質)的蛋白質或多肽。舉例來說，包含來自二或多於二來源的胺基酸序列之蛋白質可被處理成次單元，並且次單元藉由雙硫鍵橋連接以產生蛋白質。本發明的一或更多的核酸序列或遺傳基因構築體可經由轉殖本發明之核苷酸序列或基因構築體或載體於任何適合的植物宿主中表現。適合的宿主範例包括但不限於包括苜蓿草、油菜籽、甘藍屬、玉米、菸草屬、苜蓿草、馬鈴薯、人參、豌豆、燕麥、水稻、大豆、小麥、小麥、向日葵、棉花以及諸如此類的農作物。

本發明的一或更多遺傳基因構築體可進一步包含3'不轉譯區域。3'不轉譯區域意指含有包括聚腺苷酸化訊號以及能夠造成mRNA處理或基因表現的任何其他調控訊號之DNA片段的基因部分。聚腺苷酸化訊號通常以造成追蹤mRNA前驅物之3'端的聚腺苷酸的添加為特徵。雖然變化並不少見，聚腺苷酸化訊號通常由對標準形式5' AATAAA-3'同源的存在而確認。合適的3'區域之非限制性範例為包含下列的聚腺苷酸化訊號之3'已轉錄非轉譯區域：農桿菌屬(Agrobacterium)腫瘤誘導(Ti)質體基因例如胭脂胺酸合成酶(nopaline synthase,NOS)基因、植物基因例如大豆貯藏蛋白質基因、1,5-二磷酸核酮糖酶基因的小次單元(ssRUBISCO；US 4,962,028；將其以引用的方式併入本文)、用於調節質體藍素表現的啟動子，其描述於US 7,125,978(將其以引用的方式併入本文)。

本發明的一或更多基因構築體亦可包括進一步的增強子，依需要可為轉譯或轉錄增強子。增強子可位於要轉錄的序列之5'或3'端。增強子區域為本領域之技術人員所熟知的，並且可包括ATG起始密碼子、相鄰序列或諸如此類。起始密碼子如果存在，可與編碼序列之讀取框架同相(「符合讀序(in frame)」)以提供已轉錄序列之正確轉譯。

所謂「轉殖」意指基因型地、表現型地或兩者顯露的遺傳資訊(核苷酸序列)之種間轉移。由基因構築體的遺傳資訊種間轉移至宿主可能是暫時的，且遺傳資訊的轉移為不可遺傳的，或轉移可能是遺傳的且遺傳資訊的轉移視為穩定的。本發明之基因構築體可使用Ti質體、Ri質體、植物病毒載體、直接DNA轉殖作用、顯微注射、電穿孔等引入植物細胞。此類技術的回顧見例如Weissbach and Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Academy Press,New York VIII,pp.421-463(1988)；Geierson and Corey,Plant Molecular Biology,2d Ed.(1988)；以及Miki and Iyer,Fundamentals of Gene Transfer in Plants.In Plant Metabolism,2d Ed.DT.Dennis,DH Turpin,DD Lefebrve,DB Layzell(eds),Addison Wesly,Langmans Ltd.London,pp.561-579(1997)。其他方法包括直接DNA攝取、脂質體的使用、電穿孔，例如使用原生質體、顯微注射、微粒子或晶鬚以及真空浸潤。見例如Bilang,et al.(Gene 100：247-250,1991)、Scheid et al.(Mol.Gen.Genet.228：104-112,1991)、Guerche et al.(Plant Science 52：111-116,1987)、 Neuhause et al.(Theor.Appl Genet.75：30-36,1987)、Klein et al.,Nature 327：70-73(1987)：Howell et al.(Science 208：1265,1980)、Horsch et al.(Science 227：1229-1231,1985)、DeBlock et al.(Plant Physiology 91：694-701,1989)、Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach and Weissbach,eds.,Academic Press Inc.,1988)、Methods in Plant Molecular Biology(Schuler and Zielinski,eds.,Academic Press Inc.,1989)、Liu and Lomonossoff(J Virol Meth,105：343-348,2002)、美國專利號4,945,050；5,036,006；以及5,100,792，美國專利申請輯編號08/438,666，1995年5月10日提出，以及07/951,715，1992年9月25日提出(將其所有以引用的方式併入本文)。[0091]如下描述的，可使用短暫表現的方法以表現本發明之基因構築體(見Liu and Lomonossoff,2002,Journal of Virological Methods,105：343-348；將其以引用的方式併入本文)。替代地，可使用如同由Kapila et al.,1997所描述的以真空為基礎的短暫表現方法(將其以引用的方式併入本文)。這些方法可能包括，舉例來說但不限於，農桿菌接種(Agro-inoculation)或農桿菌浸潤(Agro-infiltration)、注射器浸潤(syringe infiltration)的方法，然而，如上所提亦可使用其他短暫方法。透過農桿菌接種、農桿菌浸潤或注射器浸潤，包含想要的核酸之農桿菌混合物進入組織的細胞間隙，舉例來說，葉、植物(包括莖、葉以及花)的空氣部分、植物(莖、葉、花)的其他部分或整株植物。在穿越表皮後，農桿菌感染並轉移t-DNA拷貝至細胞。以附加體地轉錄t-DNA並且轉譯mRNA，導致感染細胞中之興趣蛋白質的生產，然而，t-DNA通過至細胞核為暫時性的。

為協助轉殖的植物細胞之確認，可進一步操作本發明的基因構築體以包含植物可選擇標記。有用的可選擇標記包括提供對化學物質具抗性之酵素，例如抗生素，舉例來說，健他黴素(gentamycin)、潮黴素(hygromycin)、康黴素(kanamycin)或例如草胺膦(phosphinothrycin)的除草劑、草甘膦(glyphosate)、氯磺隆(chlorosulfuron)以及諸如此類。類似地，可使用經由顏色改變提供可識別的化合物生產之酵素，例如GUS(ß-葡萄醣酵酸酶)或螢光例如螢光素酶(luciferase)或GFP。

所謂用語「植物物質(plant matter)」意指衍生自植物的任何材料。植物物質可包含整個植物、組織、細胞或其任何部分。進一步地，植物物質可包含細胞內植物組成物、細胞外植物組成物、植物的液體或固體萃取物或其結合物。進一步地，植物物質可包含植物、植物細胞、組織、液體萃取物或其結合物，其來自植物的葉、莖、果實、根或其結合物。植物物質可包含還未受到任何處理步驟的植物或其部分。然而，也預期可將植物物質受如下所定義的最小處理步驟或更嚴密的處理，包括使用本領域普遍所知的技術之部分或大體上的蛋白質純化，其包括但不限於層析法、電泳法以及諸如此類。

所謂用語「最小處理」意指將包含興趣蛋白的植物物質(例如植物或其部分)部分地純化，以生成植物萃取物、均質物、植物分餾均質物或諸如此類(即最小地處理)。部分純化可包含但不限於破壞植物細胞的結構，從而創造包含可溶植物組成分和不可溶植物組成分的一組成物，其可經由例如但不限於離心、過濾或其組合而分離。在這方面，在葉片或其他組織的細胞外空間分泌的蛋白質可輕易地使用真空或離心萃取而獲得，或是可將組織於壓力下經由通過滾筒或研磨或諸如此類以擠壓或釋放蛋白脫離細胞外空間而萃取。因這些製備將具有來自二級植物產物之可忽略的汙染，最小處理亦可涉及可溶性蛋白質粗萃取物的製備。進一步地，最小處理可涉及自葉片的水相萃取可溶性蛋白質，接著以任何適合的鹽類沉澱。其他方法可包括大規模的浸漬與果汁萃取以容許萃取物的直接使用。

可將植物物質，以植物材料或組織的形式口服輸送給個體。可將植物物質以食物補充品的部分隨著其他食物給藥或封裝。亦可將植物物質或組織濃縮以改善或增加嗜口性，或如有需要隨著其他材料、成分或藥學賦形劑提供。

考量到可將包含興趣蛋白或表現包含興趣蛋白之VLP的植物視需要與情況以各種方式給藥予個體或目標生物體。舉例來說，可將從植物獲得的興趣蛋白在其使用之前以粗製的、部分純化的或純化的形式萃取。若蛋白質要被純化，那麼它可在可食用的或不可食用的植物中生產。此外，若蛋白質為口服給藥，可將植物組織收穫並且直接餵食個體，或將收穫的組織在餵食前乾燥，或容許動物放牧於植物上而不預先收穫植物。亦將要提供作為動物餵食中之食物補充品的收穫植物組織考量在本發明的範圍內。若植物組織要以極少或無進一步處理而被餵食予個體或動物，較佳地要給藥之植物組織為可食用的。

可將根據本發明生產的VLP使用本領域之技術人員已知的方法從植物、植物的部分或植物物質中純化、部分地純化，或可作為口服疫苗而給藥。純化可包括如同描述於WO 2011/035422中的質外體分餾物的生產(將其以引用的方式併入本文)。對於製備型粒徑篩析層析法，可獲得包含VLP的製劑並且經由離心移除不可溶的材料。亦可使用伴隨PEG的沉澱。可使用傳統方法定量回收的蛋白質(舉例來說，Bradford Assay,BCA)，並且將萃取物通過尺寸排除管柱，使用例如SEPHACRYL^TM、SEPHADEX^TM或類似媒介並收集分餾物。可使用Blue Dextran 2000或適合的蛋白質作為校正標準品。亦可將萃取物通過陽離子交換管柱並且收集活性分餾物。在層析法之後，可進一步以蛋白質電泳、免疫墨點法或兩者分析分餾物，以確認VLP與分餾物之蛋白質補體的存在。

亦考量此發明的部分為基因轉殖植物、植物細胞、種子或其包含本發明之核苷酸序列的任何部分。從植物細胞再生整株植物的方法亦為本領域所知的。一般而言，在適當的培養基中培養轉殖的植物細胞，該培養基可包含篩選劑，例如抗生素，其中使用可選擇性標記以促進轉殖的植物細胞的確認。一旦癒合組織形成，可根據已知方法採用適當的植物荷爾蒙以促進嫩芽生成，並且將芽轉移至植物再生的發根培養基。可再將植物由種子或使用無性繁殖技術用以建立重複子代。亦可不使用組織培養而生成基因轉殖植物。

如同在第18圖所顯示的，來自B/布里斯班/60/2008的HA在農桿菌浸潤的菸草葉片中表現不佳(見欄1008或1029)。然而，HA B型伴隨來自A/新喀里多尼亞/20/99的M2之共同表現，造成HA表現的顯著增加(見欄1008+1261；1009+1261以及1029+1261)。在原生B型HA或嵌合B型HA兩者觀察到HA表現的增加。在擴增元素(BeYDV)的存在或缺乏下，以及跨越各個農桿菌稀釋濃度觀察HA表現。當來自A/伯斯/16/2009的H3伴隨來自A/新喀里多尼亞/20/99的M2共同表現時，觀察到類似的H3表現增加(第19圖；比較欄1019中單獨的H3，以及1019+1261中H3與M2共同表現)。

本發明包括如同於表格3列出的核苷酸序列：

將以下列範例進一步說明本發明。

範例

材料與方法：表現卡匣與流感病毒蛋白的組裝

A-2X35S/CPMV-HT/H5印尼/NOS(基因構築體編號489)

使用下列以PCR為基礎的方法，將編碼來自流感A/印尼/5/2005(H5N1)的H5之序列選殖至包含Plasto_pro/P19/Plasto_ter表現卡匣的質體中的2X35S/CPMV-HT/NOS表現系統。將包含完整H5編碼序列的片段使用引子IF-H5A-I-05.s1+3c(第1A圖，SEQ ID NO：2)與IF-H5dTm.r(第1B圖，SEQ ID NO：3)使用基因構築體編號972作為模板(基因構築體編號972的序列見WO 2010/003225的SEQ ID NO：134，第94圖，將其以引用的方式併入本文)擴增。將PCR產物使用In-Fusion選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)選殖至 2X35S/CPMV-HT/NOS表現系統。將基因構築體1191(第1D圖，SEQ ID NO：4)以SacII與StuI限制酵素切割，並且將線性化質體用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號1191是為在CPMV-HT為基礎的表現卡匣中之興趣基因「In Fusion」選殖而準備的一受體質體。它亦結合在苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子的控制下進行沉默的TBSV P19沉默抑制劑之共同表現的基因構築體。骨幹為pCAMBIA雙質體並且於第1D圖呈現由左至右t-DNA邊界的序列(SEQ ID NO：4)。將生成的基因構築體給定編號489(第1E圖，SEQ ID NO：5)。於第1F圖呈現來自流感A/印尼/5/2005(H5N1)的H5之胺基酸序列(SEQ ID NO：6)。質體489的示意圖係呈現於第15圖。

B-2X35S/CPMV-HT/M2新喀里多尼亞/NOS(基因構築體編號1261)

使用下列以PCR為基礎的方法，將編碼來自流感A/新喀里多尼亞/20/1999(H1N1)的M2之序列選殖至包含Plasto_pro/P19/Plasto_ter表現卡匣的質體中的2X35S/CPMV-HT/NOS表現系統。將包含完整M2編碼序列的片段使用引子IF-S1-M1+M2ANC.c(第2A圖，SEQ ID NO：7)與IF-S1-4-M2ANC.r(第2B圖，SEQ ID NO：8)使用合成的M2基因作為模板(與來自GenBank登錄號DQ508860的nt 1-26連接到nt 715-982相對應)(第2C圖，SEQ ID NO：9)擴增。將PCR產物使用In-Fusion選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)選殖至2X35S/CPMV-HT/NOS表現系統。將基因構築體1191(第1C圖)以SacII與StuI限制酵素切割，並且將線性化質體用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號1191是為在CPMV-HT為基礎的表現卡匣中之興趣基因「In Fusion」選殖而準備的一受體質體。它亦結合在苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子的控制下進行沉默的TBSV P19沉默抑制劑之共同表現的基因構築體。骨幹為pCAMBIA雙質體並且於第1D圖呈現由左至右t-DNA邊界的序列(SEQ ID NO：4)。將生成的基因構築體給定編號1261(第2D圖，SEQ ID NO：10)。於第2E圖呈現來自流感A/新喀里多尼亞/20/1999(H1N1)的M2之胺基酸序列(SEQ ID NO：11)。質體1261的示意圖係呈現於第16圖。

C-2X35S/CPMV-HT/M2波多黎各/NOS(基因構築體編號859)

使用下列以PCR為基礎的方法，將編碼來自流感A/波多黎各/8/1934(H1N1)的M2之序列選殖至包含Plasto_pro/P19/Plasto_ter表現卡匣的質體中的2X35S/CPMV-HT/NOS表現系統。將包含完整M2編碼序列的片段使用引子IF-S1-M1+M2ANC.c(第2A圖，SEQ ID NO：7)與IF-S1-4-M2ANC.r(第2B圖，SEQ ID NO：8)使用合成的M2基因作為模板(與來自GenBank登錄號DQ508860的nt26-51連接到nt 740-1007相對應)(第3A圖，SEQ ID NO：12)擴增。將PCR產物使用In-Fusion選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)選殖至2X35S/CPMV-HT/NOS表現系統。將基因構築體1191(第1C圖)以SacII與StuI限制酵素切割，並且將線性化質體用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號1191是為在CPMV-HT為基礎的表現卡匣中之興趣基因「In Fusion」選殖而準備的一受體質體。它亦結合在苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子的控制下進行沉默的TBSV P19沉默抑制劑之共同表現的基因構築體。載體為pCAMBIA雙質體並且於第1D圖呈現由左至右t-DNA邊界的序列(SEQ ID NO：4)。將生成的基因構築體給定編號859(第3B圖，SEQ ID NO：13)。於第3C圖呈現來自流感A/波多黎各/8/1934(H1N1) 的M2之胺基酸序列(SEQ ID NO：14)。質體859的示意圖係呈現於第17圖。

D-2X35S/CPMV-HT/PDISP/H1加州/NOS(基因構築體編號484)

使用下列以PCR為基礎的方法，將編碼來自流感A/加州/7/2009(H1N1)的H1之序列選殖至包含Plasto_pro/P19/Plasto_ter表現卡匣的質體中的2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS表現系統。將包含不帶有其野生型信號肽的H1編碼序列的片段使用引子IF-H1A-C-09.s2+4c(第4A圖，SEQ ID NO：15)與IF-H1A-C-09.s1-4r(第4B圖，SEQ ID NO：16)使用合成H1基因作為模板(GenBank登錄號FJ966974)(第4C圖，SEQ ID NO：17)擴增。將PCR產物使用In-Fusion選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)與苜蓿草PDI信號肽的讀序相符而選殖至2X35S/CPMV-HT/NOS表現系統。將基因構築體1192(第4D圖)以SacII與StuI限制酵素切割，並且將線性化質體用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號1192是為在CPMV-HT為基礎的表現卡匣中與苜蓿草PDI信號肽的讀序相符之興趣基因「In Fusion」選殖而準備的一受體質體。它亦結合苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子下的TBSV P19沉默抑制劑之共同表現的基因構築體。骨幹為pCAMBIA雙質體並且於第4E圖呈現由左至右t-DNA邊界的序列(SEQ ID NO：18)。將生成的基因構築體給定編號484(第4F圖，SEQ ID NO：19)。於第4G圖呈現來自流感A/加州/7/2009(H1N1)的PDISP/H1之胺基酸序列(SEQ ID NO：20)。質體484的示意圖係呈現於第14圖。

E-2X35S/CPMV-HT/PDISP/H3伯斯/NOS(基因構築體編號1019)

使用下列以PCR為基礎的方法，將編碼來自流感A/伯斯 /16/2009(H3N2)的H3之序列選殖至包含Plasto_pro/P19/Plasto_ter表現卡匣的質體中的2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS表現系統。將包含不帶有其野生型信號肽的H3編碼序列的片段使用引子IF-S2+S4-H3 Per.c(第5A圖，SEQ ID NO：21)與IF-S1a4-H3 Per.r(第5B圖，SEQ ID NO：22)使用合成的H3基因作為模板(與來自GenBank登錄號GQ293081的nt 26-1726相對應)(第5C圖，SEQ ID NO：23)擴增。使用In-Fusion選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)將PCR產物與苜蓿草PDI信號肽的讀序相符而選殖至2X35S/CPMV-HT/NOS表現系統。將基因構築體1192(第4D圖)以SacII與StuI限制酵素切割，並且將線性化質體用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號1192是為在CPMV-HT為基礎的表現卡匣中與苜蓿草PDI信號肽的讀序相符之興趣基因「In Fusion」選殖而準備的一受體質體。它亦結合在苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子的控制下進行沉默的TBSV P19沉默抑制劑之共同表現的基因構築體。骨幹為pCAMBIA雙質體並且於第4E圖呈現由左至右t-DNA邊界的序列(SEQ ID NO：18)。將生成的基因構築體給定編號1019(第5D圖，SEQ ID NO：24)。於第5E圖呈現來自流感A/伯斯/16/2009(H3N2)的PDISP/H3之胺基酸序列(SEQ ID NO：25)。質體1019的示意圖係呈現於第13圖。

F-2X35S/CPMV-HT/PDISP/HA B布里斯班/NOS(基因構築體編號1029)

使用下列以PCR為基礎的方法，將編碼來自流感B/布里斯班/60/2008的HA之序列選殖至在包含Plasto_pro/P19/Plasto_ter表現卡匣的質體中的2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS表現系統。將包含不帶有其野生型信號肽的HA B布里斯班編碼序列的片段使用引子 IF-S2+S4-B Bris.c(第6A圖，SEQ ID NO：26)與IF-S1a4-BBris.r(第6B圖，SEQ ID NO：27)使用合成的HA B布里斯班基因作為模板(與來自GenBank登錄號FJ766840的nt 34-1791相對應)(第6C圖，SEQ ID NO：28)擴增。使用In-Fusion選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)將PCR產物與苜蓿草PDI信號肽的讀序相符而選殖至2X35S/CPMV-HT/NOS表現系統。將基因構築體1192(第4D圖)以SacII與StuI限制酵素切割，並且將線性化質體用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號1192是為在CPMV-HT為基礎的表現卡匣中與苜蓿草PDI信號肽的讀序相符之興趣基因「In Fusion」選殖而準備的一受體質體。它亦結合在苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子的控制下進行沉默的TBSV P19沉默抑制劑之共同表現的基因構築體。骨幹為pCAMBIA雙質體並且於第4E圖呈現由左至右t-DNA邊界的序列(SEQ ID NO：18)。將生成的基因構築體給定編號1029(第6D圖，SEQ ID NO：29)。於第6E圖呈現來自流感B/布里斯班/60/2008的PDISP/HA之胺基酸序列(SEQ ID NO：30)。質體1029的示意圖係呈現於第11圖。

G-2X35S/CPMV-HT/PDISP/HA B布里斯班/NOS至BeYDV+複製酶擴增系統(基因構築體編號1008)

使用下列以PCR為基礎的方法，將編碼來自流感B/布里斯班/60/2008的HA之序列選殖至包含Plasto_pro/P19/Plasto_ter表現卡匣的質體中的包含BeYDV+複製酶擴增系統之2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS表現系統。將包含不帶有其野生型信號肽的HA B布里斯班編碼序列的片段使用引子IF-S2+S4-B Bris.c(第6A圖，SEQ ID NO：26)與IF-S1a4-B Bris.r(第6B圖，SEQ ID NO：27)使用合成的HA B布里斯班基因作為模板(與來自 GenBank登錄號FJ766840的nt 34-1791相對應)(第6C圖，SEQ ID NO：28)擴增。使用In-Fusion選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)將PCR產物與2X35S/CPMV-HT/NOS表現卡匣中的苜蓿草PDI信號肽的讀序相符而選殖至BeYDV擴增系統。將基因構築體1194(第6F與6G圖)以SacII與StuI限制酵素切割，並且將線性化質體用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號1194是為在CPMV-HT為基礎的表現卡匣中與苜蓿草PDI信號肽的讀序相符之興趣基因「In Fusion」選殖至BeYDV擴增系統而準備的一受體質體。它亦結合在苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子的控制下進行沉默的TBSV P19沉默抑制劑之共同表現的基因構築體。骨幹為pCAMBIA雙質體並且於第6G圖呈現由左至右t-DNA邊界的序列(SEQ ID NO：31)。將生成的基因構築體給定編號1008(第6H圖，SEQ ID NO：32)。於第6E圖呈現來自B/布里斯班/60/2008的流感PDISP/HA之胺基酸序列(SEQ ID NO：30)。質體1008的示意圖係呈現於第9圖。

H-2X35S/CPMV-HT/PDISP/HA B布里斯班/H5印尼穿膜區域與胞質尾(H5Indo TMCT)/NOS至BeYDV+複製酶擴增系統(基因構築體編號1009)

使用下列由Darveau et al.(Methods in Neuroscience 26：77-85(1995))呈現之以PCR為基礎的接合方法，將融合至來自A/Indonesia/5/2005(H5N1)的H5的胞質與穿膜區域的編碼來自流感B/布里斯班/60/2008胞外區的HA之序列選殖至包含Plasto_pro/P19/Plasto_ter表現卡匣的質體中的包含BeYDV+複製酶擴增系統之2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS。在PCR的第一回合，將包含不帶有原生信號肽、穿膜與胞質區域的HA B布里斯班胞外區編碼序列的片段使用引子IF-S2+S4-B Bris.c(第6A圖， SEQ ID NO：26)與dTmH5I-B Bris.r(第7A圖，SEQ ID NO：33)使用合成的HA B布里斯班基因作為模板(與來自GenBank登錄號FJ766840的nt 34-1791相對應)(第6C圖，SEQ ID NO：28)擴增。將包含H5印尼的穿膜與胞質區域的第二片段使用引子B Bris-dTmH5I.c(第7B圖，SEQ ID NO：34)及IF-S1aS4-dTmH5I.r(第7C圖，SEQ ID NO：35)，使用基因構築體編號489(見第1E圖，SEQ ID NO：5)作為模板而擴增。再將來自兩擴增的PCR產物混合並且用作為第二回合擴增的模板，其中使用IF-S2+S4-B Bris.c(第6A圖，SEQ ID NO：26)以及IF-H5dTm.r(第7C圖，SEQ ID NO：34)作為引子。使用In-Fusion選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)將生成片段與2X35S/CPMV-HT/NOS表現卡匣中的苜蓿草PDI信號肽的讀序相符而選殖至BeYDV擴增系統。將基因構築體1194(第6F與6G圖)以SacII與StuI限制酵素切割，並且將線性化質體用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號1194是為在CPMV-HT為基礎的表現卡匣中與苜蓿草PDI信號肽的讀序相符之興趣基因「In Fusion」選殖至BeYDV擴增系統而準備的一受體質體。它亦結合在苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子的控制下進行沉默的TBSV P19沉默抑制劑之共同表現的基因構築體。骨幹為pCAMBIA雙質體並且於第6G圖呈現由左至右t-DNA邊界的序列(SEQ ID NO：31)。將生成的基因構築體給定編號1009(第7D圖，SEQ ID NO：36)。於第7E圖呈現來自B布里斯班/H5indo TMCT的PDISP/HA之胺基酸序列(SEQ ID NO：37)。質體1009的示意圖係呈現於第10圖。

I-2X35S/CPMV-HT/PDISP-HA B布里斯班伴隨刪除的蛋白水解環至BeYDV+複製酶擴增系統(基因構築體編號1059)

使用下列由Darveau et al.(Methods in Neuroscience 26： 77-85(1995))呈現之以PCR為基礎的接合方法，將編碼來自流感B/布里斯班/60/2008伴隨刪除的蛋白水解環的HA之序列選殖至包含Plasto_pro/P19/Plasto_ter表現卡匣之質體中的含BeYDV+複製酶擴增系統之2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS。在PCR的第一回合，將包含由nt 46至nt 1065的HA B布里斯班編碼序列的片段使用引子IF-S2+S4-B Bris.c(第6A圖，SEQ ID NO：26)與1039+1059.r(第8A圖，SEQ ID NO：38)使用合成的HA B布里斯班基因作為模板(與來自GenBank登錄號FJ766840的nt 34-1791相對應)(第6C圖，SEQ ID NO：28)擴增。將包含由nt 1123至nt 1758之HA B布里斯班編碼序列的第二片段使用引子1039+1059.c(第8B圖，SEQ ID NO：39)及IF-S1a4-B Bris.r(第6B圖，SEQ ID NO：27)，使用合成的HA B布里斯班基因(與來自GenBank登錄號FJ766840的nt 34-1791相對應)作為模板而擴增。再將來自兩擴增的PCR產物混合並且用作為第二回合擴增的模板，其中使用IF-S2+S4-B Bris.c(第6A圖，SEQ ID NO：26)以及IF-H5dTm.r IF-S1a4-B Bris.r(第6B圖，SEQ ID NO：27)作為引子。使用In-Fusion選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)將生成片段(編碼HA B/布里斯班/60/2008△a.a.356-374伴隨片段間的GG連接子)與包含BeYDV擴增系統之2X35S/CPMV-HT/NOS表現卡匣中的苜蓿草PDI信號肽的讀序相符而選殖。將基因構築體1194(第6F與6G圖)以SacII與StuI限制酵素切割，並且將線性化質體用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號1194是為在CPMV-HT為基礎的表現卡匣中與苜蓿草PDI信號肽的讀序相符之興趣基因「In Fusion」選殖至BeYDV擴增系統而準備的一受體質體。它亦結合在苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子的控制下進行沉默的TBSV P19沉默抑制劑之共同表現的基因構築體。骨幹為pCAMBIA雙質體並且於第6G圖呈現由左至右t-DNA邊界的序列(SEQ ID NO：31)。將生成的基因構築體給定編號1059(第8C圖，SEQ ID NO：40)。於第8D圖呈現來自B/布里斯班/60/2008伴隨刪除蛋白水解環的PDISP/HA之胺基酸序列(SEQ ID NO：41)。將質體1059的示意圖呈現於第12圖。

A-2X35S/CPMV-HT/PDISP/H3維多利亞/NOS(基因構築體編號1391)

使用下列以PCR為基礎的方法，將編碼來自流感A/維多利亞/361/2011(H3N2)的H3之序列選殖至包含Plasto_pro/P19/Plasto_ter表現卡匣的質體中的2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS表現系統。將包含不帶有其野生型信號肽的H3編碼序列的片段使用引子IF-H3V36111.S2+4c(第25A圖，SEQ ID NO：44)與IF-H3V36111.s1-4r(第25B圖，SEQ ID NO：45)使用合成的H3基因作為模板(與來自GISAID EPI_ISL-101506分離株HA序列的nt 25至1725相對應)(第25C圖，SEQ ID NO：46)擴增。使用In-Fusion選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)將PCR產物與2X35S/CPMV-HT/NOS表現卡匣中的苜蓿草PDI信號肽的讀序相符而選殖。將基因構築體1192(第4D圖)以SacII與StuI限制酵素切割，並且將線性化質體用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號1192是為在CPMV-HT為基礎的表現卡匣中與苜蓿草PDI信號肽的讀序相符之興趣基因「In Fusion」選殖而準備的一受體質體。它亦結合在苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子的控制下進行沉默的TBSV P19沉默抑制劑之共同表現的基因構築體。骨幹為pCAMBIA雙質體並且於第4E圖呈現由左至右t-DNA邊界的序列(SEQ ID NO：18)。將生成的基因構築體給定編號1391(第25D圖，SEQ ID NO：47)。於第25E 圖呈現來自流感A/維多利亞/361/2011(H3N2)的PDISP/H3之胺基酸序列(SEQ ID NO：48)。將質體1391的示意圖呈現於第25F圖。

B-2X35S/CPMV-HT/HA B威斯康辛/NOS至BeYDV(m)+複製酶擴增系統(基因構築體編號1462)

使用下列以PCR為基礎的方法，將編碼來自流感B/威斯康辛/1/2010的HA之序列選殖至包含Plasto_pro/P19/Plasto_ter表現卡匣的質體中的包含BeYDV(m)+複製酶擴增系統之2X35S/CPMV-HT/NOS表現系統。將包含完整的HA B威斯康辛編碼序列的片段使用引子IF-HAB110.S1+3c(第26A圖，SEQ ID NO：49)與IF-HAB110.s1-4r(第26B圖，SEQ ID NO：50)使用合成的HA B威斯康辛基因作為模板(GenBank登錄號JN993010)(第26C圖，SEQ ID NO：51)擴增。使用In-Fusion選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)將PCR產物與2X35S/CPMV-HT/NOS表現卡匣中的苜蓿草PDI信號肽的讀序相符而選殖至BeYDV(m)擴增系統。將基因構築體193(第26D圖)以SacII與StuI限制酵素切割，並且將線性化質體用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號193是為在CPMV-HT為基礎的表現卡匣中的興趣基因「In Fusion」選殖至BeYDV(m)擴增系統而準備的一受體質體。它亦結合在苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子的控制下進行沉默的TBSV P19沉默抑制劑之共同表現的基因構築體。骨幹為pCAMBIA雙質體並且於第26E圖呈現由左至右t-DNA邊界的序列(SEQ ID NO：52)。將生成的基因構築體給定編號1462(第26F圖，SEQ ID NO：53)。於第26G圖呈現來自流感B/威斯康辛/1/2010的PDISP/HA之胺基酸序列(SEQ ID NO：54)。質體1462的示意圖係呈現於第26H圖。

C-2X35S/CPMV-HT/HA B威斯康辛伴隨刪除的蛋白水解環至BeYDV(m)+複製酶擴增系統(基因構築體編號1467)

使用下列由Darveau et al.呈現之以PCR為基礎的接合方法(Methods in Neuroscience 26：77-85(1995))，將編碼來自流感B/威斯康辛/1/2010伴隨刪除的蛋白水解環的HA之序列選殖至包含Plasto_pro/P19/Plasto_ter表現卡匣之質體中的含BeYDV(m)+複製酶擴增系統之2X35S/CPMV-HT/NOS。在PCR的第一回合，將包含由nt 1至nt 1062的HA B威斯康辛編碼序列的片段使用引子IF-HAB110.S1+3c(第26A圖，SEQ ID NO：49)與HAB110(PrL-).r(第27A圖，SEQ ID NO：55)使用合成的HA B威斯康辛基因作為模板(GenBank登錄號JN993010)(第26C圖，SEQ ID NO：51)擴增。將包含由nt 1120至nt 1755之HA B威斯康辛編碼序列的第二片段使用引子HAB110(PrL-).c(第27B圖，SEQ ID NO：56)及IF-HAB110.s1-4r(第26B圖，SEQ ID NO：50)，使用合成HA B威斯康辛基因(GenBank登錄號JN993010)(第26C圖，SEQ ID NO：51)作為模板而擴增。再將來自兩擴增的PCR產物混合並且用作為第二回合擴增的模板，使用IF-HAB110.S1+3c(第26A圖，SEQ ID NO：49)以及IF-HAB110.s1-4r(第26B圖，SEQ ID NO：50)作為引子。使用In-Fusion選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)將生成片段(編碼HA B/威斯康辛/1/2010△a.a.340-358伴隨片段間的GG連接子)與包含BeYDV(m)擴增系統之2X35S/CPMV-HT/NOS表現卡匣選殖。將基因構築體193(第26D圖)以SacII與StuI限制酵素切割，並且將線性化質體用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號193是為在CPMV-HT為基礎的表現卡匣中之興趣基因「In Fusion」選殖至BeYDV(m)擴增系統而準備的一受體質體。它亦結合在苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子的控制下進行沉默的 TBSV P19沉默抑制劑之共同表現的基因構築體。骨幹為pCAMBIA雙質體並且於第26E圖呈現由左至右t-DNA邊界的序列(SEQ ID NO：52)。將生成的基因構築體給定編號1467(第27C圖，SEQ ID NO：57)。於第27D圖呈現來自流感B/威斯康辛/1/2010伴隨刪除蛋白水解環的HA之胺基酸序列(SEQ ID NO：58)。將質體1467的示意圖呈現於第27E圖。

D-2X35S/CPMV-HT/PDISP/HA B馬來西亞/NOS至BeYDV(m)+複製酶擴增系統(基因構築體編號1631)

使用下列以PCR為基礎的方法，將編碼來自流感B/馬來西亞/2506/2004的HA之序列選殖至包含Plasto_pro/P19/Plasto_ter表現卡匣的質體中的包含BeYDV(m)+複製酶擴增系統之2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS表現系統。將包含不帶有其野生型信號肽的HA B馬來西亞編碼序列片段，使用引子IF-HB-M-04.s2+4c(第28A圖，SEQ ID NO：59)與IF-HB-M-04.s1-4r(第28B圖，SEQ ID NO：60)並使用合成的HA B馬來西亞基因作為模板(與來自GenBank登錄號EU124275的nt 31-1743相對應。將沉默突變T759C與C888G插入合成的序列中，以修飾DraIII與BamHI限制酵素辨識位點)(第28C圖，SEQ ID NO：61)擴增。使用In-Fusion選殖系統(Clontech,Mountain View,CA)將PCR產物與2X35S/CPMV-HT/NOS表現卡匣中的苜蓿草PDI信號肽的讀序相符而選殖至BeYDV(m)擴增系統。將基因構築體194(第28D圖)以SacII與StuI限制酵素切割，並且將線性化質體用於In-Fusion組裝反應。基因構築體編號194是為在CPMV-HT為基礎的表現卡匣中與苜蓿草PDI信號肽的讀序相符之興趣基因「In Fusion」選殖至BeYDV(m)擴增系統而準備的一受體質體。它亦結合在苜蓿草質體藍素基因啟動子與終止子的控制下進行沉默的TBSV P19沉默抑制劑之共同表現的基因構築體。骨幹為pCAMBIA雙質體並且於第28E圖呈現由左至右t-DNA邊界的序列(SEQ ID NO：62)。將生成的基因構築體給定編號1631(第28F圖，SEQ ID NO：63)。於第28G圖呈現來自流感B/馬來西亞/2506/2004的PDISP/HA之胺基酸序列(SEQ ID NO：64)。質體1631的示意圖係呈現於第28H圖。

農桿菌轉染

將農桿菌株AGL1使用由D’Aoust et al 2008描述的方法(Plant Biotechnology Journal 6：930-940)以電穿孔將DNA基因構築體轉染。將經轉染的農桿菌生長於以10 mM 2-(N-味啉基)乙磺酸(MES)、20 μM乙醯丁香酮、50 μg/ml康黴素以及25 μg/ml的pH5.6卡本西林補充之YEB培養基至OD₆₀₀介於0.6與1.6。將農桿菌懸浮液在使用前離心並重新懸浮於浸潤培養基(10 mM MgCl₂與10 mM MES pH 5.6)。

植物生質之製備、接種與農桿菌浸潤

該用語「生質」以及「植物物質」如同本文中所使用地係意指反映衍生自植物的任何材料。生質或植物物質可包含整個植物、組織、細胞或其任何部分。進一步地，生質或植物物質可包含細胞內植物組成物、細胞外植物組成物、植物的液體或固體萃取物或其結合物。進一步地，生質或植物物質可包含植物、植物細胞、組織、液體萃取物或其結合物，其來自植物的葉、幹、果實、根或其結合物。植物的部分可包含植物物質或生質。

圓葉菸草(Nicotiana benthamiana)植物係於充滿商業的泥炭蘚基質之平地中從種子生長。容許植物生長於16/8光照以及25℃日/20℃夜之溫度制度的溫室。在播種後三星期，將個別的植株挑選出來，移植於盆中並使其在相同環境條件下於溫室生長額外的三星期。

將以每個基因構築體轉染之農桿菌於以10 mM 2-(N-味啉基)乙磺酸(MES)、20 μM乙醯丁香酮、50 μg/ml康黴素以及25 μg/ml的pH5.6卡本西林補充之YEB培養基生長直至它們到達介於0.6與1.6的OD₆₀₀。將農桿菌懸浮液在使用前離心並且重新懸浮於浸潤培養基(10 mM MgCl₂與10 mM MES pH 5.6)並且於4℃儲存隔夜。在浸潤之日，將培養批次以2.5培養體積稀釋，並且在使用前升溫。將圓葉菸草(N.benthamiana)的整株植物於氣密不銹鋼罐中在20-40 Torr的真空下倒置於細菌懸浮液2 min。將植物回到溫室2-6日培養期間直至收穫。

葉片收穫以及全蛋白質萃取

在培養後，將植物的空中部分收穫，於-80℃冷凍並且粉碎成片。經由在3倍體積冰冷50 mM Tris pH 8.0、0.15 M NaCl、0.1% Triton X-100與1 mM苯甲基磺醯氟中均質化(Polytron)冷凍粉碎的植物材料的每個樣本，而萃取總可溶性蛋白。在均質化後，將泥漿狀物於4℃下以10,000 g離心10 min，並且將這些澄清的粗萃取物(上清液)繼續進行分析。

蛋白質分析與免疫墨點法

將澄清粗萃取物的總蛋白質內容物經由Bradford試驗(Bio-Rad,Hercules,CA)測定，其是使用胎牛血清白蛋白作為參考標準品。經由SDS-PAGE分離蛋白質並且電轉移至免疫偵測之聚二氟乙烯(PVDF)膜(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN)。在免疫墨點法之前，將膜以5%脫脂牛奶以及在Tris緩衝液(Tris-buffered saline,TBS-T)中之0.1% Tween-20於4℃處理16-18h。

經由在TBS-Tween 20 0.1%中之2%脫脂牛奶中以2 μg/ml一級抗體(表格4呈現用於每個HA偵測之抗體與條件)的第一次培養以執行免疫墨點法。用於化學發光偵測的二級抗體係如同表格4中所指出的，以如同所指地稀釋於TBS-Tween 20 0.1%中之2%脫脂牛奶中。免疫反應複合體係由使用發光胺(luminol)作為基質(Roche Diagnostics Corporation)之化學發光而偵測。人類IgG抗體的辣根過氧化氫酶-酵素共軛作用係經由使用e EZ-Link Plus®活化過氧化氫酶共軛套組(Pierce,Rockford,IL)而進行。

JIR：Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA：CBER：生物製劑審核及研究中心，羅克維爾，MD，USA。

Sino：Sino Biological inc.，北京，中國。

TGA：診療產品局，澳洲。

NIBSC：國家生物標準品暨管制研究所，英國。

血球凝集試驗

血球凝集試驗係根據由Nayak and Reichl(2004)所描述的方法。簡言之，在含有100 μL PBS的V底96孔微量盤中進行測試樣本(100 μL)的連續雙倍稀釋，每孔留下100 μL經稀釋的樣本。將100微升的0.25%火雞紅血球懸浮液(Bio Link Inc.,Syracuse,NY)加至每孔，並且將微量盤盤於室溫下培養2h。記錄顯示完全血球凝集之最高稀釋的倒數作為HA活性。平行地，將重組HA標準品(A/越南/1203/2004 H5N1)(Protein Science Corporation,Meriden,CT)於PBS中稀釋並且以每盤的控制組進行。

範例1：在B HA與H3累積量之流感M2共同表現的效應

流感M2共同表現對來自不同流感病毒株的HA的累積量之影響係經由在農桿菌浸潤為基礎的暫時轉殖系統中共同轉移來自流感A/新喀里多尼亞/20/1999(H1N1)的M2表現的基因構築體與驅動HA表現的基因構築體而分析。

在M2表現基因構築體(基因構築體編號1261)的存在或不存在下，來自以驅動流感B HA(來自B/布里斯班/60/2008)(基因構築體編號1008、1009與1029)表現之基因構築體轉殖的植物之蛋白質萃取物的西方墨點分析顯示M2共同表現造成流感B HA的增加累積(第18圖)。相似地，如同第19圖中所顯示地，當相較於僅以H3表現基因構築體(基因構築體編號1019)轉殖的植物時，M2與來自流感A/伯斯/16/2009的H3共同表現(基因構築體編號 1019+1261)造成轉殖植物中H3的增加累積。

來自共同表現M2與來自流感A/加州/07/2009的H1的植物之蛋白質萃取物的西方墨點分析顯示M2與H1的共同表現造成H1累積量的些微減少(第20圖，484對484+1261)。當與僅表現H5相較時，M2與來自流感A/印尼/05/2005的H5的共同表現亦造成減少的H5累積(第21圖，489對489+1261)。

進一步評估M2的共同表現對經修飾的流感B HA的累積量的效應。基因構築體編號1059編碼其蛋白水解環被2個胺基酸連接子(GG代替aa 341-359)取代之流感B HA。由第22A圖呈現之西方墨點分析法的結果顯示蛋白水解環的移除造成增加的流感B HA累積量(以1059比較1008)以及M2與經修飾的流感B HA之共同表現進一步地增加HA累積量(第22A圖，1059對1059+1261)。來自以帶或不帶修飾以及有或無M2共同表現的流感B HA轉殖之植物的粗蛋白萃取物之血球凝集活性的分析，確認了M2共同表現對原生型流感B HA(第22B圖，1008對1008+1261)以及經修飾的流感B HA(第22B圖，1059對1059+1261)之累積量的正向效應。

比較來自流感A/波多黎各/8/1934的M2與來自流感A/新喀里多尼亞/20/1999的M2對經修飾的流感B HA與H3增加累積之功效。對經修飾的流感B HA而言，比較係以來自以基因構築體1059、1059+1261以及1059+859轉殖的植物之蛋白質萃取物的西方墨點分析法進行，對以基因構築體1019、1019+1261以及1019+859轉殖的植物之蛋白質萃取物進行一個類似的比較。獲得的結果證實來自流感A/波多黎各/8/1934(由基因構築體編號859編碼)的M2共同表現與來自流感A/新喀里多尼亞/20/1999(由基因構築體編號1261編碼)的M2共同表現對於經修飾的流感B HA(第23A圖)與H3(第23B圖)兩者的增加累積同樣有效。

範例2：流感M2共同表現對B HA與H3之不同病毒株累積量的效應

在M2表現基因構築體(基因構築體編號1261)的存在或不存在下，來自以驅動流感B HA(來自B/馬來西亞/2506/2004)(基因構築體編號1631)表現之基因構築體轉殖的植物之蛋白質萃取物的西方墨點分析顯示M2共同表現造成流感B HA的增加累積(第29圖)。

在M2表現基因構築體(基因構築體編號1261)的存在或不存在下，來自以驅動流感B HA(來自B/威斯康辛/1/2010)(基因構築體編號1462)表現之基因構築體轉殖的植物之蛋白質萃取物的西方墨點分析法顯示M2共同表現造成流感B HA的增加累積(第30圖)。

進一步評估M2的共同表現對經修飾的流感B HA之累積量的效應。基因構築體編號1467編碼流感B HA，其中的蛋白水解環被2個胺基酸連接子(GG代替aa 341-359)取代。由第30A圖呈現之西方墨點分析法的結果顯示蛋白水解環的移除造成增加的流感B HA累積量(以1467比較1462)以及M2伴隨經修飾的流感B HA之共同表現進一步地增加HA累積量(第30A圖，1467對1467+1261)。來自以帶或不帶修飾以及有或無M2共同表現的流感B HA轉殖之植物的粗蛋白萃取物之血球凝集活性的分析，確認了M2共同表現對原生型流感B HA(第30B圖，1462對1462+1261)以及經修飾的流感B HA(第26B圖，1467對1467+1261)之累積量的正向效應。

在M2表現基因構築體(基因構築體編號1261)的存在或不存在下，來自以驅動流感H3(來自H3/維多利亞/361/2011)(基因構築體編號1391)表現之基因構築體轉殖的植物之蛋白質萃取物的西方墨點分析法顯示M2共同表現造成流感H3的增加累積(第31圖)。

將所有引用於此併入以作為參考。

本發明已關於一或更多具體實施例而描述。然而對於本領域之技術人員而言，在不悖離如同申請專利範圍中所定義之本發明範圍下可作出數個改變與修飾將是明顯的。

<110> Medicago Inc.

<120> 增加植物中類病毒顆粒產率

<130> V83991WO

<150> US 61/541,780

<151> 2011-09-30

<160> 64

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 質子通道識別序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(4)

<223> Xaa可為任何自然發生的胺基酸

<400> 1

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-H5A-I-05.s1+3c

<400> 2

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-H5dTm.r

<400> 3

<210> 4

<211> 4903

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因構築體1191

<400> 4

<210> 5

<211> 3447

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表現卡匣編號489

<400> 5

<210> 6

<211> 568

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 6

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-S1-M1+M2ANC.c

<400> 7

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-S1-4-M2ANC.r

<400> 8

<210> 9

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的M2基因之核苷酸序列(DQ508860)

<400> 9

<210> 10

<211> 2034

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表現卡匣編號1261

<400> 10

<210> 11

<211> 97

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 11

<210> 12

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的M2基因之核苷酸序列

<400> 12

<210> 13

<211> 2034

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表現卡匣編號859

<400> 13

<210> 14

<211> 97

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 14

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-H1A-C-09.s2+4c

<400> 15

<210> 16

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-H1A-C-09.s1-4r

<400> 16

<210> 17

<211> 1701

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的H1基因之核苷酸序列

<400> 17

<210> 18

<211> 4897

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因構築體1192

<400> 18

<210> 19

<211> 3462

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表現卡匣編號484

<400> 19

<210> 20

<211> 573

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 20

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-S2+S4-H3 Per.c

<400> 21

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-S1a4-H3 Per.r

<400> 22

<210> 23

<211> 1701

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的H3基因之核苷酸序列

<400> 23

<210> 24

<211> 3465

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表現卡匣編號1019

<400> 24

<210> 25

<211> 574

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 25

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-S2+S4-B Bris.c

<400> 26

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-S1a4-B Bris.r

<400> 27

<210> 28

<211> 1758

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的HA B布里斯本基因之核苷酸序列

<400> 28

<210> 29

<211> 3525

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表現卡匣編號1029

<400> 29

<210> 30

<211> 594

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 30

<210> 31

<211> 6861

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因構築體1194

<400> 31

<210> 32

<211> 5555

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表現卡匣編號1008

<400> 32

<210> 33

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子dTmH5I-B Bris.r

<400> 33

<210> 34

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子B Bris-dTmH5I.c

<400> 34

<210> 35

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-S1aS4-dTmH5I.r

<400> 35

<210> 36

<211> 5555

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表現卡匣編號1009

<400> 36

<210> 37

<211> 594

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 37

<210> 38

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子1039+1059.r

<400> 38

<210> 39

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子1039+1059.c

<400> 39

<210> 40

<211> 5504

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表現卡匣編號1059由BeYDV左LIR至BeYDV 右LIR.來自流感B/Brisbane/60/2008的PDISP/HA伴隨刪除之蛋白水解環

<400> 40

<210> 41

<211> 577

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 41

<210> 42

<211> 1707

<212> DNA

<213> 流感病毒

<400> 42

<210> 43

<211> 1734

<212> DNA

<213> 流感病毒

<400> 43

<210> 44

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-H3V36111.S2+4c

<400> 44

<210> 45

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-H3V36111.s1-4r

<400> 45

<210> 46

<211> 1701

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的H3基因之核苷酸序列

<400> 46

<210> 47

<211> 3465

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表現卡匣編號1391

<400> 47

<210> 48

<211> 574

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 48

<210> 49

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-HAB110.S1+3c

<400> 49

<210> 50

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-HAB110.s1-4r

<400> 50

<210> 51

<211> 1755

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的HA B/威斯康辛之核苷酸序列(JN993010)

<400> 51

<210> 52

<211> 6745

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因構築體193

<400> 52

<210> 53

<211> 3495

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表現卡匣編號1462

<400> 53

<210> 54

<211> 584

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 54

<210> 55

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子HAB110(PrL-).r

<400> 55

<210> 56

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子HAB110(PrL-).c

<400> 56

<210> 57

<211> 3444

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表現卡匣編號1467

<400> 57

<210> 58

<211> 567

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 58

<210> 59

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-HB-M-04.s2+4c

<400> 59

<210> 60

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子IF-HB-M-04.s1-4r

<400> 60

<210> 61

<211> 1713

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的HA B馬來西亞之核苷酸序列

<400> 61

<210> 62

<211> 6739

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因構築體194

<400> 62

<210> 63

<211> 3525

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表現卡匣編號1631

<400> 63

<210> 64

<211> 594

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 64

Claims

一種在一植物生產一類病毒顆粒(VLP)的方法，其包含a)將包含在該植物具活性的一第一調節區域且被操作性地連接至編碼一結構性病毒蛋白的一核苷酸序列的一第一核酸引至該植物，或該植物的部分中，b)將包含在該植物具活性的一第二調節區域且被操作性地連接至編碼一通道蛋白的一核苷酸序列的一第二核酸引入，c)將該植物或該植物的部分於容許該核酸的表現之條件下培養，從而生產該VLP。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中該通道蛋白為一質子通道蛋白。
如申請專利範圍第2項中所述之方法，其中該質子通道蛋白係選自M2或BM2。
如申請專利範圍第2項中所述之方法，其中該質子通道蛋白包含質子通道識別序列HXXXW。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中該結構性病毒蛋白包含一三聚區域。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中編碼該結構性病毒蛋白的該核苷酸序列編碼一流感HA蛋白。
如申請專利範圍第6項中所述之方法，其中該流感HA蛋白的一或更多蛋白水解環已被刪除。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中編碼該結構性病毒蛋白的該核苷酸序列為一流感結構性蛋白，且係選自由B HA、C、H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15以及H16所組成之群組。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中編碼該結構性病毒蛋白之該核苷酸序列為流感B HA或流感H3。
如申請專利範圍第9項中所述之方法，其中流感B HA係來自流感B/布里斯班/60/2008、B/馬來西亞/2506/2004或B/威斯康辛/1/2010。
如申請專利範圍第10項中所述之方法，其中該流感B HA蛋白的一或更多蛋白水解環已被刪除。
如申請專利範圍第9項中所述之方法，其中流感H3係來自流感A/伯斯/16/2009或來自流感A/維多利亞/361/2011。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中編碼一結構性病毒蛋白的該核苷酸序列具有與選自由SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：51及SEQ ID NO：61所組成之群組的一序列的至少70%序列相似性。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中該結構性病毒蛋白之該序列為如同在SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：54與SEQ ID NO：64中的至少一者所顯示的。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中編碼該結構性病毒蛋白的該核苷酸序列相較於選自由SEQ ID NO：43以及SEQ ID NO：57底線部分所組成之群組的一序列具有至少70%序列相似性。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中該結構性病毒蛋白之該序列為如同在SEQ ID NO：41與SEQ ID NO：58中的至少一者所顯示的。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中編碼該結構性病毒蛋白的該核苷酸序列相較於選自由SEQ ID NO：23以及SEQ ID NO：46所組成之群組的一序列具有至少70%序列相似性。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中該結構性病毒蛋白之該序列為如同在SEQ ID NO：25與SEQ ID NO：48中的至少一者所顯示的。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中該第一核酸序列係包含操作性地與以一或多於一的豇豆嵌紋病毒增強子、編碼該結構性病毒蛋白的該核苷酸序列以及一或多於一的雙生病毒擴增元素連接之該第一調節區域，並且將編碼一雙生病毒複製酶的一第三核酸引至該植物或該植物的部分。
如申請專利範圍第19項中所述之方法，其中該一或多於一之豇豆嵌紋病毒增強子為一豇豆嵌紋病毒UTR。
如申請專利範圍第20項中所述之方法，其中該豇豆嵌紋病毒UTR為一豇豆嵌紋病毒(Cowpea Mosaic Virus,CPMV)UTR。
如申請專利範圍第19項中所述之方法，其中該一或多於一之雙生病毒擴增元素係選自一豆黃矮病毒長間隔區(BeYDV LIR)，以及一BeYDV短間隔區(BeYDV SIR)。
如申請專利範圍第19項中所述之方法，其中編碼該結構性病毒蛋白的該核苷酸序列為流感B HA或流感H3。
如申請專利範圍第23項中所述之方法，其中流感B HA係來自流感B/布里斯班/60/2008、B/馬來西亞/2506/2004或B/威斯康辛/1/2010。
如申請專利範圍第24項中所述之方法，其中該流感B HA蛋白中的一或更多蛋白水解環已被刪除。
如申請專利範圍第23項中所述之方法，其中流感H3係來自流感A/伯斯/16/2009或來自A/維多利亞/361/2011。
如申請專利範圍第19項中所述之方法，其中編碼一結構性病毒蛋白的該核苷酸序列相較於選自由SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：51與SEQ ID NO：61所組成之群組的一序列具有至少70%序列相似性。
如申請專利範圍第19項中所述之方法，其中該結構性病毒蛋白的該序列為如同在SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：54以及SEQ ID NO：64中的至少一者所顯示的。
如申請專利範圍第19項中所述之方法，其中編碼該結構性病毒蛋白的該核苷酸序列相較於選自由SEQ ID NO：43與SEQ ID NO：57的該底線部分所組成之群組的一序列具有至少70%序列相似性。
如申請專利範圍第19項中所述之方法，其中該結構性病毒蛋白的該序列為如同在SEQ ID NO：41與SEQ ID NO：58中的至少一者所顯示的。
如申請專利範圍第19項中所述之方法，其中編碼該結構性病毒蛋白的該核苷酸序列相較於選自由SEQ ID NO：23與SEQ ID NO：46所組成之群組的一序列具有至少70%序列相似性。
如申請專利範圍第19項中所述之方法，其中該結構性病毒蛋白的該序列為如同在SEQ ID NO：25與SEQ ID NO：48中的至少一者所顯示的。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中編碼該結構性病毒蛋白的該核苷酸序列係包含依序編碼一結構性病毒蛋白或其片段、一流感穿膜區以及一胞質尾的一嵌合核苷酸序列。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中在引入的該步驟中(步驟a)，該核酸係於該植物中暫時地表現。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中在引入的該步驟中(步驟a)，該核酸係於該植物中穩定地表現。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，進一步地包含一步驟d)收穫該植物並且純化該VLP。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其中該VLP不包含一病毒基質或一核心蛋白。
一種生產一類病毒顆粒(VLP)的方法，其包含a)提供一植物或該植物的部分，其包含將一第一核酸及一第二核酸引至該植物或該植物的部分，該第一核酸包含在該植物中具活性的一第一調節區域並且被操作性地連接至編碼一結構性病毒蛋白的一核苷酸序列，該第二核酸包含在該植物中具活性的一第二調節區域並且被操作性地連接至編碼一通道蛋白的一核苷酸序列，b)將該植物或該植物的部分於容許該核酸的表現之條件下培養，從而生產該VLP。
如申請專利範圍第38項中所述之方法，其中該通道蛋白為一質子通道蛋白。
如申請專利範圍第39項中所述之方法，其中該質子通道蛋白係選自M2或BM2。
一種藉由如申請專利範圍第1項中所述之方法生產的VLP。
一種藉由如申請專利範圍第38項中所述之方法生產的VLP。
如申請專利範圍第41或第42項中所述之VLP，其進一步包含衍生自一植物的一或多於一的脂質。
如申請專利範圍第41或第42項中所述之VLP，其中一或更多病毒蛋白包含植物特異性N聚醣或經修飾的N聚醣。
一種組成物，其包含用於誘發一免疫反應的一有效劑量之如申請專利範圍第41或第42項中所述之VLP以及一藥學上可接受之載體。
一種在一個體中誘發對一流感病毒感染免疫的方法，其包含給藥如申請專利範圍第41或第42項中所述之VLP。
如申請專利範圍第46項中所述之方法，其中將該VLP是以口服、皮內、鼻腔內、肌肉、腹膜腔內、靜脈或皮下給藥予一個體。
一種多株抗體，其係使用如申請專利範圍第41或第42項中所述之VLP製備。
一種植物物質，其包含以如申請專利範圍第1或第38項中所述的方法生產的一VLP。
如申請專利範圍第49項中所述之植物物質，其用於在一個體中誘發對一流感病毒感染的免疫。
一種包含如申請專利範圍第50項中所述植物物質的食物補充品。
如申請專利範圍第1項中所述之方法，其進一步包含引入一第三核酸序列，該第三核酸序列編碼一沉默抑制劑。
如申請專利範圍第19項中所述之方法，其進一步包含引入一第四核酸序列，該第四核酸序列編碼一沉默抑制劑。
如申請專利範圍第52或第53項中所述之方法，其中該沉默抑制劑係選自該群組HcPro與p19。
如申請專利範圍第1或第38項中所述之方法，其中該VLP不包含該通道蛋白。
如申請專利範圍第1或第38項中所述之方法，其中該結構性病毒蛋白為一HA0蛋白。
如申請專利範圍第3項中所述之方法，其中該M2蛋白係選自包含流感A/波多黎各/8/1934與流感A/新喀里多尼亞/20/1999的該群組。
一種多肽，其包含選自由SEQ ID NO：41與SEQ ID NO：58所組成之群組的一序列的該胺基酸序列。
一種編碼如申請專利範圍第58項中所述之多肽的核酸序列。
如申請專利範圍第59項中所述之核酸序列，其中該核酸序列包含選自由SEQ ID NO：43與SEQ ID NO：57的底線部分所組成之群組的一序列之該核苷酸序列。