TW201316996A - 抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
一種抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌，係寄存於中華民國食品工業發展研究所，且該乳酸桿菌係選自由一寄存編號為BCRC910494之嗜酸乳桿菌、一寄存編號為BCRC910518之乳酸乳桿菌及一寄存編號為BCRC910519之植物乳桿菌所組成之群組；以及，一種乳酸桿菌之用途，係將選自由上述乳酸桿菌所組成之群組，用以製備抑制陰道炎病原菌感染之食品組成物或藥物組成物。
Description
本發明係關於一種乳酸菌，特別是一種具有抑制陰道病原菌能力之乳酸桿菌。
根據國內婦產科統計約有75%的女性於一生中至少有一次陰道感染之機會，加上國內屬亞熱帶氣候國家更容易引起細菌及黴菌的滋生，且依據不同的病原菌會產生不同症狀的陰道感染現象。目前常見造成女性陰道感染之原因係如下所述：
(1)黴菌感染
黴菌感染較常見的病原菌係為白色念珠菌(Candida albicans)，且該白色念珠菌係喜愛生長於溫熱潮濕之環境，因此，當女性陰部清潔不乾淨或者穿著緊身不易透氣之衣褲而造成陰部悶濕等情況時，係容易引起白色念珠菌的滋生，而造成陰部搔癢、灼熱、外陰部紅腫、小便疼痛…等症狀，且於個人抵抗力不足(例如：睡眠不足、月經前後、懷孕期間…等)時更易造成反覆性之感染。目前用於治療之方式係採取口服用藥(例如：Fluconazole…等)或抗黴菌陰道塞劑(例如：Fenticonazole nitrate…等)。然而，該些治療方法係容易造成不良之副作用(例如：噁心、暈眩…等)，尤其對抵抗力不足之患者(例如：懷孕婦女…等)更具有副作用加劇之風險。
(二)細菌感染
細菌感染較常見之病原菌係為混合型態的病原菌(例如：陰道伽氏桿菌(Gardnerella vaginalis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及鏈球菌屬(Streptococcus)…等)，且該混合型態之病原菌係喜愛生長於偏鹼性之環境(pH>4.5)，因此，過於頻繁的性交或太常沖洗陰道均容易導致陰道pH值的上升而造成細菌滋生，進而產生大量灰白色或黃色之陰道分泌物而引起類似魚腥味的臭味。目前用於治療之方法係採取口服用藥(例如：盤尼西林(penicillin)、四環黴素(tetracycline)…等)。然而，該些口服用藥係容易引起不良之副作用(例如：過敏、噁心、頭暈…等)，甚至造成女性陰道內原有益生菌減少而破壞菌相之平衡。
(三)滴蟲感染
滴蟲感染大多係由性行為傳染或者於溫暖潮濕的環境下(例如：三溫暖、游泳池…等)間接傳染，該滴蟲引起的陰道感染係容易產生嚴重搔癢、陰部紅腫、…等類似黴菌感染之症狀，甚至產生膿稠之分泌物而具有腥臭味。目前用於治療之方法係服用抗生素(例如：Metronidazole…等)，然而，抗生素之使用係容易引起噁心、腹部不適、排尿困難…等的不良副作用。
由上述得知，目前用於治療陰道炎之方法多採取口服用藥，且該些口服用藥係多為抗生素或類固醇等藥品，因此，於該些藥物殺死病原菌的同時亦會傷害體內之益生菌(例如：乳酸桿菌…等)，使得藥物治療初期患者陰道環境係呈現無菌之狀態，而逐漸產生益生菌與病原菌相互競爭生長環境之情況。然而，體內益生菌的生長往往較病原菌緩慢，因此，係容易於藥物治療的同時造成宿主免疫力的下降，進而發生重複感染的情形而必須反覆進行抗生素或類固醇藥物的治療，甚至使病原菌產生抗藥性而損害宿主的免疫系統。
近年來陸續有利用益生菌治療陰道感染的相關報導，經研究發現特定的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)菌株係具有抑制陰道感染之病原菌生長的功能，如中華民國公開第200806303號專利案係指出習知用以抑制陰道病原菌感染之乳酸桿菌包含嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、比菲德氏菌(Lactobacillus bifidus)、短乳酸桿菌(Lactobacillus brevis)、保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillus bulgaricus)…等，習知乳酸桿菌係分泌各種代謝產物，如乳酸、過氧化氫、細菌素或抗菌蛋白(antimicrobial peptide)，維持陰道pH值之恆定(pH3.8~4.2)以抑制陰道病原菌的孳生；或者係直接附著於陰道細胞競爭陰道病原菌的生長，以維持陰道內之菌相平衡。
然而，上述習知乳酸桿菌僅能夠針對特定病原菌產生抑菌作用舉例說明之該比菲德氏菌只能抑制白色念珠菌卻無法改善陰道細菌感染的問題，因此，抑菌效果較差，特別係當患者交叉感染多種陰道病原菌時，該習知乳酸桿菌之抑菌效果實為有限，無法廣泛地應用於多種陰道病原菌的預防或治療。
再者，該習知乳酸桿菌雖可分泌多種代謝產物，卻係以乳酸作為主要的抑菌手段，然而，該乳酸係屬弱酸，其殺菌力較低，特別係當患者嚴重感染時，習知乳酸桿菌往往無法有效控制陰道病原菌的蔓延；又，該乳酸桿菌對於陰道細胞的吸附能力不足而無法長時間停留於陰道環境內，使得該習知乳酸桿菌的抑菌能力無法有效發揮；因此可知，習知乳酸桿菌的抑菌效果有限，僅能針對特定病原菌發揮作用，且其抑菌能力較差，無法有效抑制病原菌之生長。
有鑒於近年來陰道炎對台灣人口所造成之高威脅性及高感染率，以及不同種類之病原菌可能產生交叉感染之問題，應開發具有同時抑制不同種類病原菌之新穎性菌株，以有效提升臨床醫療上對陰道炎之病原菌的預防及治療效果。
本發明之主要目的乃改良上述缺點，提供一種抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌，其係能夠同時抑制不同種類之陰道炎病原菌的生長。
本發明之次一目的係提供一種抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌，係對於陰道病源菌具有良好的殺菌能力。
本發明之再一目的係提供一種抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌，係對於宿主陰道細胞具有良好的吸附能力，以延長該乳酸桿菌的殺菌能力。
本發明之又一目的係提供一種抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌，係能夠將一抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌用於製備抑制陰道炎病原菌之食品或藥物組成物。
為達到前述發明目的，本發明抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌，係寄存於中華民國食品工業發展研究所，且該乳酸桿菌係選自由一寄存編號為BCRC910494之嗜酸乳桿菌、一寄存編號為BCRC910518之乳酸乳桿菌及一寄存編號為BCRC910519之植物乳桿菌所組成之群組；以及，一種乳酸桿菌之用途，係將選自由上述乳酸桿菌所組成之群組，用以製備抑制陰道炎病原菌感染之食品組成物或藥物組成物。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：
本發明一種抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌，係自一乳製品中選殖得一嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、一乳酸乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis)及一植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)；該些乳酸桿菌係具有黴菌性陰道炎病原菌之殺菌能力、細菌性陰道炎病原菌之殺菌能力、分泌過氧化氫之能力及宿主陰道細胞之吸附特性，且相較於習知乳酸桿菌具有較佳之抑菌能力及抑菌效果，可應用於預防或治療陰道炎之商品製備。
請參照第1圖所示，本發明之乳酸菌係經由以下各方式處理而獲得，係包含一培養步驟S1、一鑑定步驟S2及一保存步驟S3。其中，該嗜酸乳桿菌、乳酸乳桿菌及植物乳桿菌的培養、鑑定及保存步驟均相同，故僅敘述其一篩選獲得該嗜酸乳桿菌之詳細流程，其餘不再加以贅述。
該培養步驟S1係分離乳製品中所含有之乳酸菌進行培養。本發明係取樣自一乳製品(例如：乾酪…等)，置於一培養液進行增殖培養(enrichment culture)，待適當培養時間後將該培養液進行序列稀釋，另接種至一培養基以挑選可生長之菌株。本實施例之增殖培養係將該乳製品以1:50之體積比例接種於一液態MRS培養基(MRS Broth)，以37℃培養20小時而獲得一增殖培養菌液，再以序列稀釋該增殖培養菌液，將稀釋後之增殖培養菌液以塗抹法接種一固態MRS培養基(MRS Agar)，挑選可生長之菌株。該液態MRS培養基與固態MRS培養基之配方如第1及2表所示。
第1表：液態MRS培養基(MRS Broth)配方(1公升):
第2表：固態MRS培養基(MRS Agar)配方(1公升):
該鑑定步驟S2係依照該乳酸菌之物理型態、生理特性或分子特徵等判斷其菌種分類。本實施例將該乳酸菌進行革蘭氏染色、觸酶反應及16S rDNA之分子鑑定，由該乳酸菌之染色圖(結果為革蘭氏陽性菌)、16S rDNA部分序列(如SEQ ID No:1所示)[於美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology；NCBI)之序列比對資料庫(BLAST)所得相似度達99%之菌種為Lactobacillus acidophilus]及觸酶反應試驗(觸酶反應陰性)等鑑定結果確定本發明之乳酸菌係為一嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)，寄存編號為BCRC910494，命名為嗜酸乳桿菌LA25。
該保存步驟S3係使該嗜酸乳桿菌可以穩定於低溫環境下長久存放，以便後續使用。將本發明之嗜酸乳桿菌接種至該固態MRS培養基，以37℃培養48小時後挑選單一菌落轉殖至MRS培養液(如第1表之配方所示)，以進行冷凍保存。該MRS培養液中較佳係包含30%之抗凍劑(例如：甘油)，暫存於-80℃之恆溫保存室，以待後續使用。
此外，依照上述相同之技術手段另外挑選可生長之菌株，且以上述鑑定步驟S2進行菌種分類之判斷，由該乳酸菌之染色圖等鑑定確定該二乳酸菌分別為一乳酸乳桿菌，寄存編號BCRC910518，命名為乳酸乳桿菌LDL114，以及一植物乳桿菌，寄存編號BCRC910519，命名為植物乳桿菌LP115。
為證實本發明之乳酸桿菌係具有較佳之抑菌能力及抑菌效果，係分別測試該嗜酸乳桿菌、乳酸乳桿菌、植物乳桿菌及其複合物分泌過氧化氫及細胞吸附之能力，以及該嗜酸乳桿菌相較於習知洛德乳桿菌(Lactobacillus reuteri)及鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)對該些病原菌之抑制性，以觀察其對陰道炎病原菌的殺菌效果。
部分乳酸桿菌係能夠分泌乳酸、過氧化氫、細菌素等物質達到對抗病原菌之功效，其中，過氧化氫係能夠與鹵素離子(如氯離子)反應生成一種對抗病原菌之毒性氧化物(如氫氧化氯)，而提高乳酸桿菌對抗病原菌之能力。因此，為了解本發明之乳酸桿菌分泌過氧化氫之能力，本實施例係將本發明之乳酸桿菌及習知洛德乳桿菌及鼠李糖乳桿菌分別培養於該液態MRS培養基，待適當時間生長後，以檢測過氧化氫之商用套組(. H2O2-560TM,DXIS)進行過氧化氫之檢測，其中，該適當時間係指本發明之乳酸桿菌生長菌數達109時，將菌體各自離心取得上清液，以針對該些上清液進行過氧化氫濃度之測試，本發明之乳酸桿菌分泌過氧化氫之情形係紀錄於第3表：
第3表：本發明乳酸桿菌之過氧化氫分泌能力。
由上述結果得知，本發明之乳酸桿菌相較於其他習知乳酸桿菌係具有較佳過氧化氫之分泌能力，其中，又以嗜酸乳桿菌及植物乳桿菌所呈現之過氧化氫分泌量明顯高於該洛德乳桿菌之7.03μM，甚至該鼠李糖乳桿菌之過氧化氫分泌量係微量至無法偵測。由此可證實，本發明之乳酸桿菌係具有分泌過氧化氫之能力，且較其他乳酸桿菌之過氧化氫分泌量為佳，因宿主體內的過氧化氫係容易與鹵素離子反應而生成該具有毒性之氧化物，而該毒性氧化物係對陰道病原菌產生毒殺作用，因此，本發明之乳酸桿菌係能夠發揮該較佳之殺菌能力。
為了進一步了解本發明之乳酸桿菌對陰道細胞之吸附能力，本實施例係將陰道上皮細胞培養穩定後，再以每毫升5×104之陰道上皮細胞種殖於24孔盤內，待培養24小時後，於該24孔盤內加入最終濃度為108CFU/mL之乳酸桿菌體，再於37℃且具有5%二氧化碳之環境共培養2小時，接著以PBS緩衝溶液緩慢地進行沖洗以去除未吸附至陰道上皮細胞之乳酸桿菌，接著打破該陰道上皮細胞，以固態MRS培養基測定吸附於該陰道上皮細胞上的乳酸桿菌菌數。其中，該乳酸桿菌菌株係包含本發明之乳酸桿菌及習知洛德乳酸桿菌及鼠李糖乳酸桿菌。本實施例所選用之陰道上皮細胞係一人類子宮頸癌細胞株Hela cell，係購自台灣食品工業發展研究所BCRC60005，本發明乳酸桿菌之詳細吸附情形紀錄於第4表。
第4表：本發明乳酸桿菌之上皮細胞吸附能力。
由第4表之結果得知，本發明之乳酸桿菌對於該陰道上皮細胞係產生較佳之吸附效果，特別係以乳酸乳桿菌LDL114所呈現之吸附細胞量較其他乳酸桿菌所呈現之吸附細胞量為多，更以複合乳酸乳桿菌LDL114及植物乳桿菌LP115後呈現有顯著的細胞吸附能力。由此可證實，本發明之乳酸桿菌具有吸附人類陰道上皮細胞的能力，且較其他乳酸桿菌之吸附力為佳，因陰道病原菌(包含白色念珠菌及陰道伽氏桿菌)僅吸附於宿主之陰道細胞，而本發明之乳酸桿菌可以長時間停留在宿主之陰道細胞上，故能於宿主體內發揮較佳之抑菌能力。本發明特別係以乳酸乳桿菌LDL114複合乳酸乳桿菌LDL114及植物乳桿菌LP115具有較佳之吸附能力，藉以彌補其過氧化氫分泌量不足之情形，同樣能於宿主體內發揮較佳抑菌之功效。
再者，為了解本發明之乳酸桿菌對陰道細胞的預防及治療之能力。本實施例係將該乳酸桿菌分別與白色念珠菌及陰道伽氏桿菌接種於該陰道上皮細胞進行共培養，以觀察該嗜酸乳桿菌與陰道病原菌(包含白色念珠菌及陰道伽氏桿菌)於陰道上皮細胞的競爭吸附情形，藉以利用競爭排除之方法來證實本發明之乳酸桿菌對陰道細胞的治療能力；另外，本實施例係將該乳酸桿菌先與陰道上皮細胞進行培養2小時後，再以固態MRS作為共同培養基於此分別加入該白色念珠菌及陰道伽氏桿菌，以觀察該乳酸桿菌保護陰道上皮細胞避免該陰道病原菌吸附之情形(請參照第5表所示)，藉以利用此方法來證實本發明之乳酸桿菌對陰道細胞的預防能力。其中，本實施例之白色念珠菌係購自台灣食品工業發展研究所，且該白色念珠菌之寄存編號為BCRC20511及BCRC21538。
第5表：本發明乳酸桿菌吸附陰道上皮細胞之比率。
由上述結果得知，於該陰道上皮細胞上添加該乳酸桿菌與陰道病原菌共培養之情況下，本發明之乳酸桿菌係能夠具有高達87%抑制陰道伽氏桿菌吸附於陰道上皮細胞之效果，且同樣能夠抑制白色念珠菌吸附於陰道上皮細胞；另外，使該乳酸桿菌先於陰道上皮細胞產生保護作用再添加陰道病原菌共培養之情況下，本發明之乳酸桿菌係具有高達98%預防陰道伽氏桿菌吸附於陰道上皮細胞之效果，且具有高達73~82%預防白色念珠菌吸附於陰道上皮細胞。由此可證實，本發明之乳酸桿菌對陰道伽氏桿菌係具有較佳的競爭能力，能夠對抗附著於陰道上皮細胞之病原菌，使該些病原菌自陰道上皮細胞脫落而死亡；且不論對陰道伽氏桿菌或白色念珠菌均具有良好的抑制作用，能夠有效防止該陰道病原菌吸附於陰道上皮細胞而造成感染之情形，因此，本發明之乳酸桿菌係能夠長時間限制陰道炎病原菌於宿主陰道內之生長。
由上所述，本發明之乳酸桿菌可以吸附於宿主陰道細胞，長時間停留於宿主體內以產生較佳之抑菌能力，且該乳酸桿菌係能夠分泌大量的過氧化氫以產生對陰道病原菌具有毒性之氧化物，以同時於黴菌性陰道炎病原菌(如白色念珠菌)及細菌性陰道炎病原菌(如陰道伽氏桿菌)具有較佳之抑菌效果；該乳酸桿菌可廣泛應用於商用治療或預防陰道炎病原菌感染之產品製備，如保健食品、醫用製劑或加工食品等；該乳酸桿菌可以單獨或混合其他所需成分(如載劑、營養成分等)加工製成各種產品形式，如錠劑、膠囊、飲品、粉末或滴劑等，可以係由各種方式給予個體以有效控制陰道病原菌之感染，及其所引發之相關疾病。
再者，更進一步證實本發明乳酸桿菌的抑菌能力及抑菌效果，係分別測試該嗜酸乳桿菌LA25、乳酸乳桿菌LDL114、植物乳桿菌LP115及其複合後對該些病原菌之抑制性，藉此觀察其對陰道炎病原菌的殺菌效果，詳見於第2至4圖及第6-1至6-3表。
以該白色念珠菌為例(如第6-1表及第6-2表)，經0至24小時長時間的共培養下，同時具有該嗜酸乳桿菌LA25與該二乳桿菌之液態培養基中，其所含之病原菌菌數係隨時間增加仍未有上升之趨勢，甚至隨時間上升至24小時，該白色念珠菌之菌數相較於0至8小時所測得之菌數係明顯下降。藉此得知該嗜酸乳桿菌LA25與該二乳桿菌相互協同作用下不僅可以具有長時間的抑菌效果，甚至可以降低病原菌之細菌數以達到額外的殺菌作用。
第6-1表：本發明LA25與LDL114及LP115的協同抑菌情形。
第6-2表：本發明LA25與LDL114及LP115的協同抑菌情形。
再者，以該陰道伽氏桿菌為例(如第6-3表)，經0至24小時長時間的培養下，同時具有該嗜酸乳桿菌LA25與該二乳桿菌之液態培養基中，其所含之病原菌菌數相較於該病原菌正常生長速度係隨時間增加仍維持有下降之趨勢，甚至隨時間上升至24小時，該陰道伽氏桿菌之菌數相較於控制組測得之菌數係明顯下降。藉此得知該嗜酸乳桿菌LA25與該二乳桿菌相互協同作用下雖無法完全抑制該陰道伽氏桿菌之生長，但於長時間的培養下相較於控制組仍具有減緩該病原菌之繁殖速度之功效，甚至於24小時之情況下些微降低病原菌之細菌數以達到額外殺菌之作用。
第6-3表：本發明LA25與LDL114及LP115的協同抑菌情形。
本發明之抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌，其係能夠於宿主陰道細胞作用，以同時達到抑制不同種類之陰道炎病原菌生長之功效。
本發明之抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌，係能夠利用過氧化氫對病原菌的毒化作用，以完整發揮該乳酸桿菌之殺菌功效。
本發明之抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌，係能夠利用細胞吸附特性附著於陰道細胞上，以長時間限制陰道炎病原菌於宿主陰道內之生長，達到較佳抑菌之功效。
本發明之乳酸桿菌之用途，係將如上所述之抑制陰道病原菌之乳酸桿菌應用於商用抑菌產品的製備，以進一步控制陰道病原菌之感染，為本發明之功效。
本發明之乳酸桿菌之複合物，係將如上所述之抑制陰道病原菌之乳酸桿菌搭配其他相容性菌株，以提升該乳酸桿菌之抑菌能力，進而達到抑制陰道炎病原菌之功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110> applicant(ex:)
<120>抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌及其用途
<160> 3
<210> 1
<211> 1500
<212> DNA
<213> 嗜酸乳桿菌 Lactobacillus acidophilus
<400> 1
<210> 2
<211> 1466
<212> DNA
<213> 乳酸乳桿菌 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis
<400> 2
<210> 3
<211> 1500
<212> DNA
<213> 植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum
<400> 3
S1．．．培養步驟
S2．．．鑑定步驟
S3．．．保存步驟
第1圖：本發明乳酸桿菌之處理流程圖。
第2圖：本發明LA25與LDL114及LP115的協同抑制白色念珠菌情形之一。
第3圖：本發明LA25與LDL114及LP115的協同抑制白色念珠菌情形之二。
第4圖：本發明LA25與LDL114及LP115的協同抑制伽氏陰道桿菌情形。
S1．．．培養步驟
S2．．．鑑定步驟
S3．．．保存步驟
Claims (6)
- 一種抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌，係寄存於中華民國食品工業發展研究所，且該乳酸桿菌係選自由一寄存編號為BCRC910494之嗜酸乳桿菌、一寄存編號為BCRC910518之乳酸乳桿菌及一寄存編號為BCRC910519之植物乳桿菌所組成之群組。
- 依申請專利範圍第1項所述之抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌，係具有分泌過氧化氫及細胞吸附之能力。
- 依申請專利範圍第1項所述之抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌，其中，該寄存編號為BCRC910494之嗜酸乳桿菌係具有如序列辨識編碼：1所述之16S rRNA之序列。
- 依申請專利範圍第1項所述之抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌，其中，該寄存編號為BCRC910518之乳酸乳桿菌係具有如序列辨識編碼：2所述之16S rRNA之序列。
- 申請專利範圍第1項所述之抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌，其中，該寄存編號為BCRC910519之植物乳桿菌係具有如序列辨識編碼：3所述之16S rRNA之序列。
- 一種如申請專利範圍第1項所述之抑制陰道炎病原菌之乳酸桿菌之用途，係用以製備抑制陰道炎病原菌感染之食品組成物或藥物組成物。
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