TW201300539A

TW201300539A - 新型內溶素

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Publication number: TW201300539A
Application number: TW100140109A
Authority: TW
Inventors: Azeredo Joana Cecilia Valente Rodrigues; Dos Santos Silvio Roberto Branco; Leonardus Dorothea Kluskens; Rob Lavigne; Maarten Walmagh
Original assignee: Univ Leuven Kath; Univ Minho
Priority date: 2010-11-03
Filing date: 2011-11-03
Publication date: 2013-01-01
Also published as: US20140017224A1; WO2012059545A1; CN103201381A; EP2635676A1; EP2635676B1; BR112013010844A2; JP2014500714A; GB201018518D0

Abstract

本發明有關包含序列識別號1所示的氨基酸序列的具有內溶素活性的多肽及其片段或衍生物，或其衍生的融合蛋白。此外，本發明有關編碼所述多肽或融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的載體和包含所述核酸分子或所述載體中任一的宿主細胞。另外，本發明有關作為藥物(特別是用於治療或預防革蘭氏陰性細菌感染)、作為診斷手段、作為化妝用物質或作為消毒劑使用的所述多肽、片段、衍生物或融合蛋白。本發明還有關所述多肽、片段、衍生物或融合蛋白用於處理或預防食品、食物加工設備、食物加工廠、與食品接觸的表面、醫學裝置、醫院和診所的表面的革蘭氏陰性細菌污染的用途。此外，本發明有關包含所述多肽、片段、衍生物或融合蛋白的藥物組合物。

Description

新型內溶素

本發明有關具有如序列識別號1所示的氨基酸序列的具有內溶素活性的多肽及其片段或衍生物。此外，本發明有關編碼所述多肽或其片段或衍生物的核酸分子、包含所述核酸分子的載體和包含所述核酸分子或所述載體中任一的宿主細胞。另外，本發明有關作為藥物(特別是用於治療或預防革蘭氏陰性細菌感染)、作為診斷手段、作為化妝用物質或作為消毒劑使用的所述多肽、其片段或衍生物。本發明還有關所述多肽、其片段或衍生物用於處理或預防食品、食物加工設備、食物加工廠、與食品接觸的表面、醫學裝置、醫院和診所的表面的細菌污染，特別是革蘭氏陰性污染的用途。此外，本發明有關包含所述多肽、其片段或衍生物的藥物組合物。

革蘭氏陰性細菌具有以其特徵性不對稱雙層為標誌的外膜。所述外膜雙層由含有磷脂(主要為磷脂酰乙醇胺)的內部單層和主要由單糖脂、脂多糖(LPS)構成的外部單層組成。細菌界中的LPS結構存在巨大的多樣性，並且LPS結構可以回應於主流環境條件而得到修飾。LPS層的穩定性和不同LPS分子之間的相互作用主要通過二價離子(Mg²⁺、Ca²⁺)與LPS分子陰離子成分(磷脂A和內核中的磷酸基團以及KDO的羧基基團)的靜電相互作用實現。此外，脂質A的疏水性模組的密集且有序的包裝，其由於缺乏不飽和脂肪酸而得到促進，形成具有高粘度的剛性結構。這使其對親脂性分子可透過性較低，而且對外膜(OM)賦予額外的穩定性。

具有殺菌或抑菌活性的各種類型的藥劑是已知的，例如抗生素、內溶素、抗微生物肽和防衛素。然而，微生物對抗生素逐漸增加的抗性在治療越來越多由細菌引起的感染方面造成了困難。特定的困難伴隨由革蘭氏陰性細菌如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌(Salmonella sp.)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引起的感染出現。

內溶素是由噬菌體(或細菌病毒)編碼的肽聚糖水解酶。它們在噬菌體繁殖的裂解週期中在晚期基因表達過程中合成，而且經由降解細菌肽聚糖來介導後代病毒體自受感染細胞的釋放。它們是β-(1,4)-糖基化酶(溶菌酶)、轉糖基酶、酰胺酶或內肽酶。Gasson(GB2243611)在1991年已經提示了內溶素的抗微生物應用。儘管內溶素的殺滅能力久為人知，由於抗生素的成功和主宰地位，這些酶作為抗細菌劑的用途一直受忽略。僅在多重抗生素耐藥性細菌出現後，用內溶素對抗人類病原體這一簡單概念方才受到注意。出現了開發完全新穎類型的抗細菌劑的令人矚目的需求，且用作“酶抗生素(enzybiotics)”(“酶”和“抗生素”的組合術語)的內溶素完美地符合該需求。在2001年，Fischetti及其同事首次闡明了細菌噬菌體C1內溶素對A組鏈球菌的治療潛力(Nelson等，2001)。從此，多份文獻確立了內溶素作為控制細菌感染，特別是革蘭氏陽性細菌的細菌感染的有吸引力和補充的替代手段。接著，針對其他革蘭氏陽性病原體如肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(Loeffler等,2001)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)(Schuch等,2002)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(Cheng等,2005)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(Rashel等,2007)的不同的內溶素證明了其作為酶抗生素的效力。現在，內溶素療法的最重要的考驗在於革蘭氏陰性細菌對內溶素的外源作用的不敏感性，因為外膜遮罩內溶素接近肽聚糖。這目前阻止有效內溶素的範圍擴展至重要的革蘭氏陰性病原體。

抗微生物肽(AMP)代表廣泛範圍的短的、陽離子性或兩親性(amphipatic)、由基因編碼的肽抗生素，其可見於幾乎所有生物。不同的AMP顯示不同的特性，且該類型中的許多肽不僅作為抗生素，還作為細胞穿透肽的範本正經受徹底的研究。儘管分享一些共同特徵(例如，陽離子性，兩親性和小尺寸)，AMP序列變化極大，且已提出至少四種結構組(α-螺旋，β-片層，延伸型(extended)和環狀(looped))引起觀察到的AMP構象的多樣性。同樣，已提出了幾種其作為抗生素的作用模式，且顯示例如許多這些肽的主要靶是細胞膜，而對於其他肽，主要靶是細胞質侵襲和核心代謝功能的擾亂。儘管缺乏特異性靶結合，AMP可變得足夠集中(concentrated)以顯示協作活性(cooperative activity)，例如，通過在膜上形成孔，如對於大部分AMP的情況下。然而，該現象僅在模式磷脂雙分子層中觀察到，且在一些情況下，需要在膜中AMP的濃度高至每六個磷脂分子一個肽分子來使這些事件發生。所述濃度接近甚至可達到全膜飽和。因為對於AMP最低抑制濃度(MIC)通常在低微摩爾範圍，可理解地，對於這些閾值的相關性及其在體內的重要性產生了懷疑(Melo等,Nature reviews,Microbiology,2009,245)。

防衛素是一大家族的小的、陽離子性、富含半胱氨酸和精氨酸的抗微生物肽，見於脊椎動物和無脊椎動物兩者。防衛素根據半胱氨酸的間隔樣式(spacing pattern)分為五個組：植物、無脊椎動物、α-、β-和θ-防衛素。後三種主要見於哺乳動物。α-防衛素為見於嗜中性粒細胞和腸上皮細胞的蛋白質。β-防衛素為最廣泛分佈的，並由白細胞和許多類型的上皮細胞所分泌。θ-防衛素目前很少見，例如見於獼猴(rhesus macaques)的白細胞。防衛素對細菌、真菌和許多有包膜和無包膜病毒有活性。然而，有效殺滅細菌所需的濃度多數情況下較高，即在微摩爾範圍。許多肽的活性在生理鹽條件、二價陽離子和血清的存在下受限。取決於疏水氨基酸殘基的含量，防衛素亦顯示溶血活性。

如此，需要新的針對革蘭氏陰性細菌的抗微生物劑。

本發明有關自腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritis)噬菌體PVPSE1分離的且可用於製備針對革蘭氏陰性細菌的新型抗細菌劑的具有內溶素活性的新型多肽。

本發明的第一目的提供了一種包含如序列識別號1所示的氨基酸序列的具有內溶素活性的多肽或其片段或衍生物。

較佳地，包含如序列識別號1所示的氨基酸序列的多肽是由如序列識別號2所示的核苷酸序列編碼的。

在一個較佳的實施方案中，所述片段包含如序列識別號3和/或5所示的氨基酸序列，其較佳地分別由序列識別號4和/或序列識別號6所示的核苷酸序列編碼。

在又一個較佳的實施方案中，所述衍生物在如序列識別號1、3、和/或5所示的氨基酸序列中具有刪除、添加、插入和/或替代。

在又一個較佳的實施方案中，如本發明的所述多肽或其片段或衍生物在N端或C端與具有膜或LPS破壞活性的肽段，特別是陽離子或聚陽離子肽融合。

所述多肽、其片段或衍生物或融合蛋白可以另外包含標籤，較佳地為His6-標籤。

在本發明的一個較佳的實施方案中，所述多肽包含如序列識別號7所示的氨基酸序列。

本發明的又一個目的有關包含如上述任一項的多肽和在N端或C端與所述多肽融合的肽段的融合蛋白，其中所述肽段是陽離子肽、聚陽離子肽、兩親肽、壽司(sushi)肽、防衛素、疏水性肽和/或抗微生物肽。

在本發明的一個較佳的實施方案中，所述肽段包含約5至約100個氨基酸殘基，特別地約5至50個氨基酸殘基，特別地約5至30個氨基酸殘基。

在本發明的又一個較佳的實施方案中，所述陽離子和/或聚陽離子肽段包含至少一個選自下組的氨基酸殘基：精氨酸、組氨酸和賴氨酸殘基，特別地其中所述肽段中包含的至少70%的氨基酸殘基是精氨酸、組氨酸和/或賴氨酸殘基，特別地精氨酸和/或賴氨酸殘基。

在本發明的一個較佳的實施方案中，所述兩親肽包含與至少一個疏水性氨基酸殘基組合的至少一個選自下組的帶正電荷的氨基酸殘基：賴氨酸、精氨酸和組氨酸殘基，所述疏水性氨基酸殘基選自下組：纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和甘氨酸殘基，特別地其中所述兩親肽中的至少約70%的所述氨基酸殘基是精氨酸或賴氨酸殘基，且所述兩親肽中的至少約30%的所述氨基酸殘基是纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸或甘氨酸殘基。

在本發明的又一個較佳的實施方案中，所述肽段包含如序列識別號14-19所示的氨基酸序列。

在本發明的一個具體的較佳實施方案中，所述融合蛋白包含如序列識別號13所示的氨基酸序列。

本發明的又一個目的有關包含如申請專利範圍第13項的核酸分子的載體。

本發明的又一個目的提供了一種分離的核酸分子，其編碼如本發明的多肽、其片段或衍生物或融合蛋白。

本發明的又一個目的有關包含如本發明的核酸分子的載體。

本發明的又一個目的有關包含如本發明的核酸分子或如本發明的載體的宿主細胞。

本發明的又一個目的有關如本發明的多肽、片段或衍生物或如本發明的融合蛋白，其用作人用醫藥物質、獸用醫藥物質或診斷物質、用作食物中或化妝品上的抗微生物劑、用作消毒劑或者用於環境領域中。

在一個較佳的實施方案中，如本發明的所述多肽、片段或衍生物或融合蛋白在生產用於治療或預防革蘭氏陰性細菌感染的藥物中使用。

另一個較佳的實施方案有關如本發明的所述多肽、片段或衍生物或融合蛋白用於處理或預防食品、食物加工設備、食物加工廠、與食品接觸的表面、醫學裝置、醫院和診所的表面的革蘭氏陰性細菌污染的用途。

本發明的又一個較佳的實施方案有關包含本發明的多肽或本發明的融合蛋白的藥物組合物。

定義：

如在本文中出現，則下列術語應當具有下文所列出的定義。

如本文中使用的術語“蛋白質”與術語“多肽”所指相同。本文中使用的術語“蛋白質”指氨基酸殘基通過肽鍵以特定序列連接的直鏈聚合物。蛋白的氨基酸殘基可通過例如共價附著多種基團如糖和磷酸來修飾。其他的物質如血紅素或脂質可更鬆散的與多肽鏈相聯繫，得到綴合的蛋白質，其也包含于本文中使用的術語“蛋白質”中。有多種方式闡明多肽鏈的折疊，特別是針對α螺旋和β折疊片層的存在。如本文中使用的術語“蛋白質”指所有四種類型的蛋白質，即全α、全β、α/β和α加上β。

如本文中所使用的，術語“融合蛋白”指源自兩種核酸序列融合的表達產物。此類蛋白質可以例如在重組DNA表達系統中生成。此外，如本文中所使用的，術語“融合蛋白”指第一氨基酸序列，如例如內溶素與第二或別的氨基酸序列的融合物。較佳地，所述第二或別的氨基酸序列是肽段，特別是陽離子肽或聚陽離子肽。較佳地，所述第二和/或別的氨基酸序列對於第一氨基酸序列的任何域而言是外來的，而且與第一氨基酸序列的任何域基本上不是同源的。

如本文中所使用的，術語“肽段”指與諸如內溶素等蛋白質連接的任何種類的肽。然而，本發明意義上的肽段不指His6標籤、Strep標籤、Avi標籤、Myc標籤、Gst標籤、JS標籤、半胱氨酸標籤、FLAG標籤或本領域中已知的其他標籤、硫氧還蛋白或麥芽糖結合蛋白(MBP)。如本文中所使用的，與術語“肽段”形成對比，術語“標籤”指可用於促進多肽表達和/或親和純化、將多肽固定化於表面或者充當標誌物或標記模組以供例如通過不同ELISA測定法形式中的抗體結合來檢測多肽的肽，只要使標籤可用于上文所列輔助作用之一的所述功能不是由所述肽的正電荷引起的。然而，根據各自的pH，His₆標籤也可以是帶正電荷的，但是由於它結合固定化的二價陽離子而作為親和純化工具使用，而不作為如本發明的肽段使用。

如本文中所使用的，術語“肽”指由約2至約100個氨基酸殘基、更較佳地約4至約50個氨基酸殘基、更較佳地約5至約30個氨基酸殘基組成的短的多肽，其中一個氨基酸殘基的氨基基團與另一個氨基酸殘基的羧基基團通過肽鍵連接。肽可以具有特定功能。肽可以是天然存在的肽或合成設計並生成的肽。肽可以例如通過酶促或化學切割自天然蛋白質衍生或取出，或者可以使用常規的肽合成技術(例如固相合成)或分子生物學技術(參見Sambrook,J.等,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N. Y.(1989))來製備。

如本文中所使用的，術語“內溶素”指適合於水解細菌細胞壁的酶。“內溶素”包含至少一個“酶活性域”(EAD)，其具有至少一項下列活性：內肽酶、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(酰胺酶)、N-乙酰基-溶菌酶(muramidase)、N-乙酰基-氨基葡萄糖苷酶(溶菌酶)或轉糖基酶。另外，內溶素還可以含有無酶活性，並且結合宿主細菌細胞壁的區域，即所謂的CBD(細胞壁結合域)。內溶素可以含有兩個或更多個CBD。然而，如本文中所使用的，術語“內溶素”還指具有至少一個EAD但無CBD的酶。一般而言，細胞壁結合域能夠結合細菌表面上的不同成分。較佳地，細胞壁結合域是肽聚糖結合域，而且結合細菌的肽聚糖結構。內溶素的不同域可以通過域接頭連接。

如本文中所使用的，術語“域接頭”指發揮使單一蛋白質域彼此連接的功能的氨基酸序列。通常，域接頭不形成或僅形成很少的規則二級結構，如α-螺旋或β-片層，並且在各種結構背景的情況中可以佔有不同構象。檢測域接頭和接頭序列特性的方法是本領域公知的，例如記載於Bae等,2005,Bioinformatics,21,2264-2270或George和Heringa,2003,Protein Engineering,15,871-879的。

如本文中所使用的，術語“野生型”或“wt”指如序列識別號1中所描述的內溶素PVPSE1gp146的氨基酸序列。編碼野生型內溶素PVPSE1gp146的核酸序列在序列識別號2中描述。

如本文中所描述的，術語“刪除”指自各自的起始序列除去1、2、3、4、5或更多個氨基酸或核酸殘基。

如本文中所使用的，術語“插入”或“添加”指向各自的起始序列插入或添加1、2、3、4、5或更多個氨基酸或核酸殘基。

如本文中所使用的，術語“替代”指將位於某個位置的氨基酸殘基交換為不同的氨基酸殘基。

如本文中所使用的，術語“細胞壁”指形成革蘭氏陰性細菌的細胞外殼，並且如此保證其完整性的所有組分。具體地，如本文中所使用的，術語“細胞壁”指肽聚糖、具有脂多糖的革蘭氏陰性細菌的外膜、細菌細胞膜，但是還指別的沉積於肽聚糖上作為例如莢膜、蛋白質外層或粘液的層。

如本文中所使用的，術語“EAD”指內溶素的酶活性域。EAD負責水解細菌肽聚糖。它展現出內溶素的至少一種酶活性。EAD也可以由超過一種酶活性模組構成。術語“EAD”在本文中與術語“催化域”同義使用。

本發明有關自腸炎沙門氏菌噬菌體PVPSE1分離的新型模組內溶素，其可用於製備針對革蘭氏陰性細菌的新型抗細菌劑。特別地，本發明有關包含如序列識別號1的氨基酸序列的多肽或其片段或衍生物。較佳地，包含如序列識別號1的氨基酸序列的多肽是由如序列識別號2的核苷酸序列編碼的。

具有如序列識別號1的氨基酸序列的內溶素PVPSE1gp146具有236個氨基酸的長度。它包含N端細胞壁結合域(CBD)和C端酶活性域(EAD)。N端CBD是具有如SEQ ID No. 3的氨基酸序列和如SEQ ID No. 4的核苷酸序列的肽聚糖結合域(PGB,aa 3至39)。C端EAD是遵照溶菌酶樣超家族的催化域且具有如SEQ ID No. 5的氨基酸序列及如SEQ ID No. 6的核苷酸序列的催化域(aa 81至234)。內溶素PVPSE1gp146的PGB和催化域通過域接頭連接。

如此，如本發明的多肽的較佳的片段是包含如序列識別號3和/或如序列識別號5的氨基酸序列的多肽。

如本發明的衍生物是包含如序列識別號1、3、和/或5的氨基酸序列，但是具有額外的修飾和/或變化的多肽。

在一個實施方案中，如本發明的內溶素的所述衍生物的所述修飾和/或變化可以是突變，特別是刪除、插入、添加、替代或其任何組合和/或氨基酸殘基的化學變化，例如生物素化、乙酰化、PEG化、氨基-、SH-或羧基-基團的化學變化。如本發明的所述衍生物展現出PVPSE1gp146(序列識別號1)的裂解活性和/或如本發明的片段的活性。所述活性可以是PVPSE1gp146的活性和/或如本發明的片段的活性的約10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190或約200%。可以通過本領域技術人員在本領域公知的測定法，如例如平板裂解測定法或液體裂解測定法(其記載於例如(Briers et al.,J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533,(2007)))來測量活性。

在本發明的一個較佳的實施方案中，如本發明的多肽、片段和/或衍生物在N端或在C端另外包含標籤諸如His6-標籤、Strep-標籤、Avi-標籤、Myc-標籤、Gst-標籤、JS-標籤、半胱氨酸-標籤、FLAG-標籤或本領域中已知的其他標籤。在本發明的一個較佳的實施方案中，所述標籤在C端與如本發明的多肽、片段和/或衍生物連接。所述標籤可以通過其他氨基酸殘基與所述多肽、片段和/或衍生物連接。所述其他氨基酸殘基可以由至少1,2,3,4,5,6,7,8,9或10個額外的氨基酸殘基組成。在本發明的一個較佳的實施方案中，標籤通過額外的氨基酸殘基Leu-Glu或Lys-Gly與如本發明的多肽、片段和/或衍生物連接。在一個較佳的實施方案中，本發明有關包含如SEQ ID No. 7的氨基酸序列的多肽。與具有如SEQ ID No. 1的氨基酸序列的多肽相比，具有如SEQ ID No. 7的氨基酸序列的多肽分別包含通過額外的氨基酸殘基賴氨酸和甘氨酸(Lys-Gly)與所述具有如SEQ ID No. 1的氨基酸序列的多肽的C端連接的額外的C端His6-標籤。另外，在第2位和第3位導入BamHI限制性位點。較佳地，包含如SEQ ID No. 7的氨基酸序列的多肽是由如SEQ ID No. 8的核苷酸序列編碼的。

本發明的又一方面是融合蛋白，其由如本發明的多肽、片段和/或衍生物和在N端或C端與如本發明的多肽、片段和/或衍生物融合以增強所述內溶素針對革蘭氏陰性細菌的活性的具有膜破壞或LPS破壞活性的肽段構成。較佳地，所述肽段是如WO2010023207的陽離子肽和/或聚陽離子肽，通過提及而將其完整收入本文。

較佳地，如本發明的融合蛋白的肽段與如本發明的多肽、片段和/或衍生物共價結合。較佳地，所述肽段由至少5，更較佳地至少6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99個或至少100個氨基酸殘基組成。特別較佳的是包含約5至約100個氨基酸殘基、約5至約50或約5至約30個氨基酸殘基的肽段。更較佳的是包含約6至約42個氨基酸殘基、約6至約39個氨基酸殘基、約6至約38個氨基酸殘基、約6至約31個氨基酸殘基、約6至約25個氨基酸殘基、約6至約24個氨基酸殘基、約6至約22個氨基酸殘基、約6至約21個氨基酸殘基、約6至約20個氨基酸殘基、約6至約19個氨基酸殘基、約6至約16個氨基酸殘基、約6至約14個氨基酸殘基、約6至約12個氨基酸殘基、約6至約10個氨基酸殘基或約6至約9個氨基酸殘基的肽段。較佳地，肽段沒有標籤諸如His6-標籤、Strep-標籤、Avi-標籤、Myc-標籤、Gst標籤、JS-標籤、半胱氨酸標籤、FLAG-標籤或本領域中已知的其他標籤，而且沒有硫氧還蛋白或麥芽糖結合蛋白(MBP)。然而，肽段可以另外包含一種或多種此類標籤等，其用於純化或定位蛋白質。

本發明進一步有關編碼如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的分離的核酸分子。特別較佳的如本發明的分離的核酸分子包含如序列識別號2、4、6或8的核酸序列。本發明進一步有關包含如本發明的核酸分子的載體。所述載體可以提供如本發明的所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的組成型或誘導型表達。本發明還有關用於自表達所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的微生物，諸如經遺傳修飾的合適的宿主細胞獲得所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的方法。所述宿主細胞可以是微生物，諸如細菌或酵母或動物細胞，如例如哺乳動物細胞，特別是人細胞。在本發明的一個實施方案中，宿主細胞是大腸桿菌(Escherichia coli)細胞。宿主可以僅由於生物技術原因，例如產量、溶解度、成本等而選擇，而且也可以從醫學觀點而選擇，例如非病理性細菌或酵母或人細胞。本發明的另一方面有關用於遺傳轉化合適的宿主細胞以獲得如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的表達的方法，其中通過將編碼所述多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的遺傳材料導入宿主細胞中，並且通過本領域技術人員公知的遺傳工程方法獲得其翻譯和表達來遺傳修飾宿主細胞。

在又一方面，本發明有關包含如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或用包含編碼如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子或載體轉化的宿主的組合物，較佳地藥物組合物。

在本發明的一個較佳的實施方案中，組合物另外包含使革蘭氏陰性細菌的外膜透化的試劑，諸如金屬螯合劑例如EDTA、TRIS、乳酸、乳鐵蛋白、多粘菌素、檸檬酸和/或其他物質，如例如由Vaara(Agents that increase the permeability of the outer membrane. Vaara M. Microbiol Rev. 1992年9月；56(3):395-441)所描述的。還較佳的是包含上文所提及的透化劑的組合的組合物。特別較佳的是包含約10uM至約100mM EDTA，更較佳地約50uM至約10mM EDTA，更較佳地約0.5mM至約10mM EDTA，更較佳地約0.5mM至約2mM EDTA，更較佳地約0.5mM至1mM EDTA的組合物。還較佳的是包含約0.5mM至約2mM EDTA，更較佳地約1mM EDTA和另外約10至約100mM TRIS的組合物。

本發明還有關作為藥物使用的如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或用包含編碼如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列的核酸轉化的宿主。在又一方面，本發明有關如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或用包含含有編碼如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子的載體轉化的宿主在製造用於治療和/或預防與革蘭氏陰性細菌有關的病症、疾病或狀況的藥物中的用途。特別地，所述要治療和/或預防的病症、疾病或狀況可以由包括人或動物的病原性菌株的細菌群(bacterial group)、科、屬或種的革蘭氏陰性細菌引起，所述革蘭氏陰性細菌如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(埃希氏菌屬(Escherichia)特別是大腸桿菌(E. coli)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)特別是肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)、摩根氏菌屬(Morganella)、變形菌屬(Proteus)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、耶爾森氏菌屬(Yersinia))、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)(假單胞菌屬(Pseudomonas)特別是銅綠假單胞菌、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas))、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、弧菌屬(Vibrio)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、布魯氏菌屬(Brucella)、弗朗西絲氏菌屬(Francisella)、博多特氏菌屬(Bordetella)、軍團菌屬(Legionella)、巴爾通氏體屬(Bartonella)、考克斯氏體屬(Coxiella)、嗜血菌屬(Haemophilus)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、曼海姆氏菌屬(Mannheimia)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、加德納氏菌屬(Gardnerella)、螺旋體科(Spirochaetaceae)(密螺旋體屬(Treponema)和疏螺旋體屬(Borrelia))、鉤端螺旋體科(Leptospiraceae)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、螺菌屬(Spirillum)、鏈桿菌屬(Streptobacillus)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)(擬桿菌屬(Bacteroides)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas))、不動桿菌屬(Acinetobacter)特別是鮑氏不動桿菌(A. baumannii)。特別地，所述要治療和/或預防的病症、疾病或狀況可以是由銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、大腸桿菌和/或鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)引起的。

本發明進一步有關包含如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或用包含編碼如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列的核酸轉化的宿主的藥物。

在又一方面，本發明有關在需要治療和/或預防的受試者中治療病症、疾病或狀況的方法，該方法包括對所述受試者施用有效量的如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或有效量的經下述核酸轉化的宿主或如本發明的組合物，所述核酸包含編碼如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。受試者可以是人或動物。特別地，所述治療方法可以用於治療和/或預防由革蘭氏陰性細菌，特別是如上文所列的革蘭氏陰性細菌引起的皮膚、軟組織、呼吸系統、肺、消化道、眼、耳、牙、鼻咽、口、骨、陰道、菌血症傷口的感染和/或心內膜炎。

在如本發明的治療(或預防)方法中使用的施用劑量和路徑取決於要治療的特定疾病/感染部位。施用路徑可以是例如口服、局部(topical)、鼻咽、胃腸外、靜脈內、直腸、或任何其他施用路徑。對於將如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或有效量的經下述核酸轉化的宿主或如本發明的組合物應用於感染部位(或有感染危險的部位)，可以使用保護活性化合物免于環境影響諸如蛋白酶、氧化、免疫應答等，直至它達到感染部位的配製劑，所述核酸包含編碼如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。因此，配製劑可以是膠囊、糖衣片、丸劑、栓劑、可注射溶液或任何其他醫學合理的蓋倫配製劑。較佳地，蓋倫配製劑可以包含合適的載體、穩定劑、調味劑、緩衝劑或其他合適的試劑。例如，對於局部應用，配製劑可以是洗劑或硬膏劑，對於鼻咽應用，配製劑可以是要經由噴霧向鼻應用的鹽水溶液。

較佳地，若要治療(或預防)的感染是由多抗性細菌菌株，特別是由對下列一種或多種抗生素有抗性的菌株引起的：鏈黴素、四環素、頭孢噻吩(cephalothin)、慶大黴素(gentamicin)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢菌素(cephalosporin)、頭孢他啶(ceftazidime)或亞胺培南(imipenem)，則使用如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白進行醫學處理。此外，如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白可以在治療方法中使用，其通過將其與常規的抗細菌劑，諸如抗生素、硫醚抗生素(lantibiotics)、細菌素或內溶素等聯合施用來進行。

本發明還有關包含一個或多個隔室的藥物包，其中至少一個隔室包含一種或多種如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或一種或多種經下述核酸轉化的宿主或如本發明的組合物，所述核酸包含編碼如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。

在另一方面，本發明有關製備藥物組合物的方法，所述方法包括混合一種或多種如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白和/或一種或多種經下述核酸轉化的宿主與藥學可接受稀釋劑、賦形劑或載體，所述核酸包含編碼如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白的核苷酸序列。

在甚至又一方面，如本發明的組合物是化妝用組合物。數種細菌物種可以在患者身體的環境暴露表面諸如皮膚上引起刺激。為了預防此類刺激或者為了消除所述細菌病原體的次要病候(minormanifestation)，可以採用特殊的化妝用製品，其包含足夠量的如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白以降解已經存在的或新近沉降的病原性革蘭氏陰性細菌。

在又一方面，本發明有關在醫學、食物或飼料或環境診斷學中作為診斷手段，特別是作為用於診斷細菌感染特別是由革蘭氏陰性細菌引起的細菌感染的診斷手段使用的如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白。在此方面，可以使用如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白作為特異性降解病原性細菌，特別是革蘭氏陰性病原性細菌的工具。可以通過添加去污劑如Triton X-100或削弱細菌細胞包膜的其他添加劑如多粘菌素B來支持如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白對細菌細胞的降解。需要特定的細胞降解作為初始步驟，以隨後特異性檢測細菌，其使用基於核酸的方法如PCR、核酸雜交或NASBA(基於核酸序列的擴增)、免疫學方法如IMS、免疫螢光或ELISA技術、或其他依賴於細菌細胞的細胞內容物的方法如使用對獨特的細菌群或物種特異性的蛋白質(例如對於腸細菌為β-半乳糖苷酶，對於凝固酶陽性菌株為凝固酶)的酶測定法進行。在又一方面，本發明有關如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白用於處理或預防食品、食物加工設備、食物加工廠、與食品接觸的表面諸如架子和食物保存區和所有其他情況(其中病原性、偶發病原性(facultative pathogenic)或其他不想要的細菌能潛在地侵染食物材料的情況)、醫學裝置和醫院和診所的所有種類表面的革蘭氏陰性細菌污染的用途。

特別地，本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白可以作為消毒劑預防性使用。所述消毒劑可以在手術前或後，或者例如在血液透析過程中使用。此外，可以用如本發明的融合蛋白處理早產嬰兒和免疫受損個人，或那些需要假體裝置的受試者。所述處理可以是預防性的或在急性感染期間。在相同背景中，醫院內感染(特別是由抗生素抗性菌株如銅綠假單胞菌(FQRP)、不動桿菌屬物種和腸桿菌科諸如大腸桿菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、愛德華氏菌屬、腸桿菌屬、哈夫尼菌屬、克雷伯氏菌屬、摩根氏菌屬、變形菌屬、普羅威登斯菌屬、沙雷氏菌屬和耶爾森氏菌屬物種引起的)可以用本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白預防性地或在急性階段期間處理。因此，還可以與其他可用於消毒溶液的成分如去污劑、Tensids、溶劑、抗生素、硫醚抗生素、或細菌素組合使用如本發明的多肽、片段、衍生物和/或融合蛋白作為消毒劑。

以下實施例解釋本發明，但不認為是對公開內容或所附申請專利範圍的限制性。除非不同地指明，使用分子生物學標準方法，如例如由Sambrock等,1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York所描述的。

實施例1：PVP-SE1gp146及其N端PK融合的變體PK-PVP-SE1gp146 腸炎沙門氏菌噬菌體PVPSE1的模組內溶素PVP-SE1gp146及N端PK融合的變體PK-PVP-SE1gp146的克隆、表達和純化

PVP-SE1gp146(長236個氨基酸，MW=25325Da)是源自腸炎沙門氏菌噬菌體PVPSE1的模組內溶素，其預測為擁有N端肽聚糖結合域(氨基酸3至39)和溶菌酶樣超家族C端催化殼多糖酶域(氨基酸81至234)(參見圖1)。

使用噬菌體PVPSE1(獲自S. Santos博士,Universidade do Minho,Braga,Portugal)的純化的基因組DNA作為範本以在用Pfu聚合酶(Fermentas,Ontario,Canada)的標準PCR反應中擴增編碼內溶素PVP-SE1gp146的可讀框(ORF146)。使用以下PCR參數：

表1中顯示了此PCR的正向(引子1)和反向(引子2)引子。

表1：ORF146的標準PCR擴增期間及對ORF146添加N端PK標籤的尾部PCR期間使用的引子

為了延伸具有編碼聚陽離子9聚體肽Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-的基因片段的ORF146 5’端，用延伸的5’引子(引子3，序列識別號11，表1)和標準的3’引子(引子2，序列識別號10，表1)進行尾部PCR(遵循與上述標準PCR相同的參數)。然後，遵循由製造商提供的TA克隆方案在商品化pEXP5CT/表達載體(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中連接這兩種獲得的PCR片段，這引起內溶素ORF/蛋白質的3’/C端一側與純化必需的6x組氨酸標籤的融合。獲得的重組PVP-SE1gp146和PK-PVP-SE1gp146內溶素的DNA和氨基酸序列顯示於序列識別號7(重組PVPSE1gp146的氨基酸序列)、序列識別號8(重組PVPSE1gp146的核苷酸序列)、序列識別號12(重組PK-PVPSE1gp146的DNA序列)和序列識別號13(重組PK-PVPSE1gp146的氨基酸序列)。

用1mM IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)於16℃誘導過夜後在指數生長的大腸桿菌BL21(λDE3)pLysS細胞中實施PVP-SE1gp146/PK-PVP-SE1gp146的重組表達。然後，使用由pEXP5CT/表達載體編碼的C端6xHis標籤通過Ni²⁺親和層析(Akta FPLC,GE Healthcare)來純化內溶素。Ni²⁺親和層析在隨後的4步中實施，均為室溫：

1.以0.5ml/分鐘的流速用10個柱體積的清洗緩衝液(70mM咪唑、0.5mM NaCl和20mM NaH₂PO₄-NaOH，pH 7.4)平衡Histrap HP 1ml柱(GE Healthcare)。

2.以0.5ml/分鐘的流速將總溶胞物(具有期望的內溶素)在Histrap HP 1ml柱上載入。

3.以1ml/分鐘的流速用15個柱體積的清洗緩衝液清洗柱。

4.以0.5ml/分鐘的流速用10個柱體積的洗脫緩衝液(500mM咪唑、5mM NaCl和20mM NaH₂P0₄-NaOH，pH 7.4)自該柱洗脫結合的內溶素。

表2中顯示了重組PVP-SE1gp146/PK-PVP-SE1gp146的純化收率。以280nm的波長用分光光度法測定蛋白質濃度。洗脫緩衝液(20mM NaH₂P0₄-NaOH pH7.4;0.5M NaCl;500mM咪唑)中的這兩種蛋白質的純化的儲備溶液是超過90%純的，如在SDS-PAGE凝膠上通過視覺測定的(圖2)。

表2：每升大腸桿菌表達培養物的純化的重組PVP-SE1gp146/PK-PVP-SE1gp146內溶素的收率，如通過以280nm的分光光度測量測定的。經PK修飾的變體的收率幾乎高達未修飾的PVP-SE1gp146的兩倍，揭示了PK標籤對蛋白質表達的穩定化作用。

實施例2：腸炎沙門氏菌噬菌體內溶素PVPSE1gp146的生物化學胞壁質水解活性的表徵和測定

對於量化胞壁質水解活性，使用對內溶素活性致敏的外膜透化的銅綠假單胞菌PAO1_krylov(獲自國家工業微生物遺傳學研究所(State Institute for Genetics of Industrial Microorganisms),1st Dorozhnii proezd 1,113545 Moscow,Russia的V. Krylov教授的PAO1_Krylov)細胞底物。在存在過量的此底物的情況中，創建洗脫緩衝液中的PVPSE1gp146的酶活性的飽和曲線，以不同內溶素濃度(以nM表示)範圍的函數顯示肽聚糖降解活性(表示為每分鐘的OD_655nm降低)(圖3)。用具有pH 7.3和80mM離子強度的對於酶活性最佳的KH₂PO₄/K₂HPO₄緩衝液中溶解的底物一式三份完成測量。

使用此飽和曲線的線性部分的最好的線性回歸的斜率來測定胞壁質水解活性數值，其如Cheng等(2004)及Briers等(2007)的酶活性定義的改編型式進行：

使用上面的公式，PVPSE1gp146在溶解於洗脫緩衝液中時擁有15,005,330個單位/mM的胞壁質水解活性數值。

實施例3：與腸炎沙門氏菌噬菌體PVP-SE1的內溶素的N端抗細菌肽融合物 1.抗細菌標籤融合的PVP-SE1gp146構建體的克隆、表達和純化

將PVP-SE1gp146與一組天然的抗細菌肽標籤(在表3中顯示)在N端融合以提高其抗革蘭氏陰性活性並加寬其細菌宿主範圍。這些標籤是基於其兩親性、疏水性或聚陽離子特性和較短的長度進行選擇或開發的。此列表含有文獻中選擇的許多已知的抗細菌肽(其源自昆蟲、兩栖類或魚，而且證明為對革蘭氏陰性菌株有效地起作用)；和三種設計的抗細菌標籤。圖4顯示了經修飾的標籤-PVP-SE1gp146變體的可能的二維模組結構。

表3：與PVP-SE1gp146融合的抗細菌肽標籤的列表

除了五肽(PP)標籤外，使用不依賴於連接的克隆(LIC)技術(Berrow等,2007,A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications)的改編型式來將所有抗細菌肽標籤與編碼PVP-SE1gp146的ORF融合。因此，在噬菌體OBP的純的基因組DNA上用特異性設計的5’正向引子(GGAATGGGGAGCTCCTCCAATGCTGCAATTGCGGAGAT；序列識別號30)和標準的PVP-SE1gp146反向引子(CGAGGTTAGAACAGATTTTGCCT,序列識別號10)通過尾部PCR在PVP-SE1gp146編碼基因前面插入獨特的Ec1136II限制性位點。然後，通過遵循製造商的TA克隆方案在pEXP5CT/表達載體(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中連接此延伸的片段。以Ec1136II限制性消化對純的質粒進行一次切割，並在沒有必需的連接步驟的情況中將雜交的肽盒(通過引子對(參見表4)雜交創建)插入經切割的質粒中。對於N端五肽標籤融合物，對純化的pEXP5-CT/PK-OBPgpLys質粒DNA施以用編碼此五肽的延伸的5’引子(ATGGGATCCTTCTTCGTAGCACCGGGCTCCTCCAATGCTGCAAT,序列識別號31；五肽加下劃線)的尾部PCR。在將該構建體導入合適的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS表達菌株中前通過測序分析來確認表達載體中的片段的正確插入。

表4：與PVP-SE1gp146融合前的抗細菌肽標籤雜交所使用的引子

在溶原性肉湯(Lysogeny Broth,LB)中在用1mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導的指數生長細胞(OD_600nm=0.6)中實施標準的表達。表達參數，如溫度、時間和表達菌株按蛋白質特定的基礎(on a protein specific basis)變化以優化經修飾的內溶素的可溶性表達水平(參見表5)。對於純化，將來自表達培養物(500-600 ml)的細胞收穫(4500rpm,30分鐘,4℃)，並在1/25個體積的裂解緩衝液(10mM咪唑、20mM NaH₂PO₄、0.5M NaCl，pH 7.4)中重懸。將此懸浮液冷凍/融化三次，之後進行聲處理(8 x 30秒，Vibra CellTM,Sonics,Dandurry,CT,USA上的振幅40%)，並過濾通過0.45和0.22μm Durapore膜濾器(Millipore,Billerica,MA,USA)。通過採用Ni²⁺親和層析(HisTrap HP 1ml柱,GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)如製造商的指令的一步方案實施加有His標籤的融合蛋白的純化。Ni²⁺親和層析在隨後的4步中實施，均在室溫：

1.以0.5ml/分鐘的流速用10個柱體積的清洗緩衝液(蛋白質依賴性用量的咪唑(60-70mM)、0.5mM NaCl和20mM NaH₂P0₄-NaOH，pH 7.4)平衡Histrap HP 1ml柱(GE Healthcare)。

2.以0.5ml/分鐘的流速將總溶胞物(具有想要的內溶素)在Histrap HP 1ml柱上載入。

3.以1ml/分鐘的流速用15個柱體積的清洗緩衝液清洗柱。

清洗緩衝液包含低咪唑濃度，其以特定蛋白質為基礎變化以確保較高的蛋白質純度(參見表5)。表5中還顯示了每升大腸桿菌表達培養物的重組蛋白的總收率。通過以280nm的波長用分光光度法測量蛋白質濃度和純化的儲備溶液的總體積來測定數值。純化的儲備溶液是至少90%純的，如在SDS-PAGE凝膠上通過視覺測定的(資料未顯示)。表5：表達參數和每升N端融合的PVP-SE1gp146構建體的表達培養物獲得的蛋白質收率。ON=過夜；*=大腸桿菌Codon Plus RIL,Agilent Technologies產品目錄編號230245,基因型=大腸桿菌B F- ompT hsdS(r_B ^- m_B ^-)dcm+Tet^r gal (DE3)endA Hte[argU ileY leuW Cam^r]

2. N端標籤融合的PVP-SE1gp146變體的體外抗細菌活性

為了測定抗細菌標籤融合物對PVP-SE1gp146的體外抗細菌活性是否具有正面影響，在2種不同革蘭氏陰性細菌：對大腸桿菌XL1 blue和食物病原體鼠傷寒沙門氏菌LT2上測試了一些N端標籤融合的PVP-SE1gp146變體Artilys2-PVPSE1gp146和Lycotoxl-PVPSE1gp146。為了優化其抗細菌特性，添加少量的外膜透化劑乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na₂)。

將指數生長的革蘭氏陰性細菌細胞(OD_600nm=0.6)稀釋100倍至終濃度約10⁶個細胞/ml，並於室溫在不搖動的情況中與具有和沒有0.5mM EDTA-Na₂的經不同修飾的PVP-SE1gp146變體一起溫育30分鐘。溫育後，將細胞懸浮液稀釋三倍，以10⁶個細胞/ml開始至10⁵個細胞/ml，然後至濃度10⁴個細胞/ml，最終至濃度10³細胞/ml，並將100μl每種稀釋物在LB培養基上鋪板。在於37℃過夜溫育後對殘留的菌落計數。基於計數的細胞數目，計算作為以對數單位(log₁₀(N₀/N_i)，其中N₀=未處理細胞的數目，而N_i=經處理的細胞的數目，這兩者在溫育後計數)計的相對滅活的抗細菌活性(表6)。

表6：與未修飾的PVP-SE1gp146相比沒有(A)和具有(B)0.5mM EDTA-Na₂的5μM N端標籤融合的PVP-SE1gp146變體對革蘭氏陰性細菌的體外抗細菌活性。抗細菌活性作為以對數單位(log₁₀(N₀/Ni)，其中N₀=未處理細胞的數目，而N_i=溫育後計數的經處理的細胞的數目)計的相對滅活量化。將所有樣品重複三次。顯示了平均值+/-標準偏差。觀察到的最大降低依賴於10個細胞/ml的檢測水平和初始細胞密度。

在沒有外膜透化劑EDTA的情況中，在鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌中僅可檢出低抗細菌活性。在包含EDTA的樣品中，可以觀察到更強的抗細菌活性。具有修飾Artilysin 2的融合蛋白擁有良好的針對鼠傷寒沙門氏菌的抗細菌活性。然而，活性在未修飾的變體PVPSE1gp146的範圍中。針對鼠傷寒沙門氏菌的抗細菌活性在具有Lycotoxin 1修飾的融合蛋白的情況中甚至得到改善。就大腸桿菌而言，Lycotoxin融合蛋白及Artilysin 2融合蛋白也施展抗細菌活性，由此與針對鼠傷寒沙門氏菌的抗細菌活性相比，活性處於降低的水平。

實施例4：重組PVP-SE1gp146及其PK融合的變體PK-PVP-SE1gp146的熱穩定性

溫度在PVP-SE1gp146/PK-PVP-SE1gp146的穩定性中發揮主要的作用，並且如此在其酶活性或胞壁質水解活性中發揮主要的作用。提高溫度可以容易地打破蛋白質三維結構內部的氫鍵和非極性疏水性相互作用，引起蛋白質變性及其酶功能的部分喪失。為了調查PVP-SE1gp146和PK-PVP-SE1gp146的熱穩定性，在Biometra T3000熱迴圈儀(Gttingen,Germany)中於不同溫度(42,50,60,70,80,90和100℃)將這兩種重組內溶素溫育不同時間間隔(於42和50℃的1,2,3,4,8和24小時；在1小時期間對於50至100℃各為10分鐘)。在熱溫育後，將30μl每個溫育的樣品添加至270μl外膜透化的銅綠假單胞菌PAO1(獲自國家工業微生物遺傳學研究所(State Institute for Genetics of Industrial Microorganisms),1st Dorozhnii proezd 1,113545 Moscow,Russia的V. Krylov教授的PAO1_Krylov)細胞底物(Lavigne等,2004**)，並且以時間的函數追蹤光密度(OD_655nm)。將每個樣品一式三份溫育並測試。如Briers等(2007)***文章基於OD_655nm/時間曲線量化每個樣品的酶或胞壁質水解活性，並以相對于時間0時的未加熱參照樣品的活性(=100%活性)的百分比表示。在圖5中，顯示了24小時的時間間隔期間於42℃和50℃溫育的結果。選擇42℃的數值，因為它模擬發熱體溫條件，而50℃是熱不穩定性蛋白質開始變性的重要溫度。

PVP-SE1gp146和PK-PVP-SE1gp146兩者於42℃甚至在溫育24小時後是熱穩定的(圖5A)。甚至於50℃(圖5B)，PVP-SE1gp146的胞壁質水解活性在一段24小時的期間裏不顯著改變。相反，PK-PVP-SEg1gp146在8和24小時的時間點間喪失30%的初始活性，這可能是由於PK標籤的存在。于42℃溫育2小時及于50℃溫育3小時後，PK-PVP-SE1gp146的胞壁質水解活性甚至顯著升高。可能地，較高的溫度最初抑制由PK修飾引起的活性降低；即一種隨增加的溫育時間而降低的效應。

因為PVP-SE1gp146在24小時後於50℃仍顯示完全的活性，所以還分別在1小時和40分鐘的溫育時間期間於50-100℃的較高溫育測定了PVP-SE1gp146/PK-PVP-SE1gp146的熱穩定性(圖6)。對PVP-SE1gp146在時間點0、20、40和60分鐘時(圖6A)及對PK-PVP-SE1gp146在0、20、30和40分鐘時(圖6B)測量活性。

圖6A顯示了PVP-SE1gp146在於80℃溫育1小時後仍保持其最大活性，但是於100℃，20分鐘的短溫育足以降低其活性超過80%。如上述圖5中所描述的，在高於50℃的溫度，PK-PVP-SE1gp146的活性逐漸地降低。在於80℃的30分鐘溫育後，內溶素已經幾乎喪失其全部活性。

這些結果強調未修飾的PVP-SE1gp146的強熱穩定性，使其成為一種在食物防腐的障礙性方法(hurdle approach)中使用的感興趣的候選物。可以使用與PVP-SE1gp146組合的溫和熱處理來有效減少食物病原體，而不喪失食物產品的質量。

引用的參考文獻

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BrierS Y.,Lavigne R.,Volckaert,G.和Hertveldt,K.(2007a)A standardized approach for accurate quantification of murein hydrolase activity in high-throughput assays. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 70,531-533.

從本文中所公開的本發明的說明書和實踐考慮，本發明的其他實施方案對於本領域技術人員會是顯而易見的。意圖認為說明書和實施例僅為例示性的，本發明的真正的範圍和精神由所附申請專利範圍指明。

<110>　魯文天主教大學研發處米尼奧大學

<120>　新型內溶素

<130>　5122-12004-P

<150>　GB 1018518.9

<151>　2010-11-03

<160>　31

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　235

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　wt PVPSE1gp146

<400>　1

<210>　2

<211>　711

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　PVPSE1的wt ORF146

<400>　2

<210>　3

<211>　37

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　PVPSE1的肽聚糖結合域

<400>　3

<210>　4

<211>　111

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　PVPSE1的肽聚糖結合域

<400>　4

<210>　5

<211>　153

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　PVPSE1的催化域

<400>　5

<210>　6

<211>　459

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　PVPSE1的催化域

<400>　6

<210>　7

<211>　245

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　重组PVPSE1gp146

<400>　7

<210>　8

<211>　741

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　重组PVPSE1gp146

<400>　8

<210>　9

<211>　28

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　ORF146正向引子

<400>　9

<210>　10

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　ORF146反向引子

<400>　10

<210>　11

<211>　55

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　延伸的ORF146正向引子

<400>　11

<210>　12

<211>　768

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　重组PK-PVPSE1gp146的DNA序列

<400>　12

<210>　13

<211>　254

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　重组PK-PVPSE1gp146的氨基酸序列

<400>　13

<210>　14

<211>　13

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　T4-溶菌酶的α4-螺旋

<400>　14

<210>　15

<211>　5

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　五肽

<400>　15

<210>　16

<211>　18

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　Artilysin 1

<400>　16

<210>　17

<211>　25

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　Artilysin 2

<400>　17

<210>　18

<211>　19

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　Parasin 1

<400>　18

<210>　19

<211>　25

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　Lycotoxin 1

<400>　19

<210>　20

<211>　39

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　T4-溶菌酶的α4-螺旋的正向引子

<400>　20

<210>　21

<211>　39

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　T4-溶菌酶的α4-螺旋的反向引子

<400>　21

<210>　22

<211>　39

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　Artilysin 1的正向引子

<400>　22

<210>　23

<211>　46

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　Artilysin 1的反向引子

<400>　23

<210>　24

<211>　47

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　Artilysin 2的正向引子

<400>　24

<210>　25

<211>　57

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　Artilysin 2的反向引子

<400>　25

<210>　26

<211>　48

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　Parasin 1的正向引子

<400>　26

<210>　27

<211>　48

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　Parasin 1的反向引子

<400>　27

<210>　28

<211>　55

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　Lycotoxin 1的正向引子

<400>　28

<210>　29

<211>　57

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　Lycotoxin 1的反向引子

<400>　29

<210>　30

<211>　38

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　尾部PCR的5'正向引子

<400>　30

<210>　31

<211>　44

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　五肽的延伸的5'正向引子

<400>　31

以下的圖用來例示本發明。

圖1顯示了使用BLASTp和Pfam分析系統對野生型模組腸炎沙門氏菌內溶素PVPSE1gp146的功能分析。如它們在野生型噬菌體中出現的氨基酸序列和DNA及氨基酸序列分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2。預測的N端肽聚糖結合域(PBD，氨基酸3-39，序列識別號3，加下劃線)和溶菌酶樣超家族C端催化域(氨基酸81-234，序列識別號5，以灰色突出顯示)都在圖解和序列中顯示。

圖2：對PVPSE1gp146(左側)和PK-PVPSE1gp147(右側)的重組表達和純化的SDS-PAGE分析。SDS-PAGE分析顯示了相對於LMW參照標誌物的洗脫蛋白質級分及流過物(FT)和廢物級分(W)。26.4kDa(代表PVPSE1gp146)和27.7kDa(代表PK-PVPSE1gp146)左右的厚條帶標示這兩種重組蛋白的高收率。分別伴隨52.8kDa和55.4kDa左右的蛋白質的二聚化可見一些少量次級條帶(蛋白質降解)。

圖3：洗脫緩衝液中的腸炎沙門氏菌噬菌體內溶素PVPSE1gp146對外膜透化的銅綠假單胞菌PAO1的胞壁質水解活性(muralytic activity)的飽和曲線。對增加濃度的PVPSE1gp146(以nM計，X-軸)顯示活性(以ΔOD_655nm/分鐘計，Y-軸)。此外，線性曲線部分的最好的線性回歸標示為趨勢線及相應的最佳R方值。重複三次對結果的測定。將PAO1_Krylov底物在最佳的KH₂PO₄/KH₂PO₄緩衝液中溶解。

圖4顯示了經修飾的標籤-PVP-SE1gp146變體的可能的二維模組結構。PVP-SE1gp146的推定的N端肽聚糖結合域(PBD)和溶菌酶樣超家族C端催化殼多糖酶域與N端融合的抗細菌肽標籤(APT)的取向一起顯現。

圖5顯示了在24小時中的不同時間點在於42℃(A)和50℃(B)溫育後PVP-SE1gp146(藍色柱形)和PK-PVP-SE1gp146(紅色柱形)對外膜透化的PAO1細胞底物的熱穩定性。與時間0時的未加熱樣品相對地比較胞壁質水解活性，並以百分比表示。顯示了三次獨立實驗的平均值和標準偏差。

圖6顯示了對於PVP-SE1gp146在0(藍色)、20(紅色)、40(綠色)和60(紫色)分鐘時；及對於PK-PVP-SE1gp146在0(藍色)、20(紅色)、30(綠色)和40(紫色)分鐘時在50-100℃的溫育後PVP-SE1gp146(A)和PK-PVP-SE1gp146(B)對外膜透化的PAO1細胞底物的熱穩定性。與時間0時的未加熱樣品相對地比較胞壁質水解活性，並以百分比表示。顯示了三次獨立實驗的平均值和標準偏差。

Claims

一種具有內溶素活性的多肽或其片段或衍生物，包含如序列識別號1所示的氨基酸序列。
如申請專利範圍第1項所述之多肽，其中所述片段包含如序列識別號3和/或5所示的氨基酸序列。
如申請專利範圍第1或2項所述之多肽，其中該衍生物在如序列識別號1、3、和/或5所示的氨基酸序列中具有刪除、添加、插入和/或替代。
如申請專利範圍第1至3項任一項所述之多肽，其中該多肽在N端或C端與具有膜或LPS破壞活性的肽段融合。
如上述申請專利範圍任一項所述之多肽，其另外包含標籤，較佳地His6-標籤。
如申請專利範圍第5項所述之多肽，其中該多肽包含如序列識別號7所示的氨基酸序列。
一種融合蛋白，包含如上述申請專利範圍任一項所述之多肽和在N端或C端與該多肽融合的肽段，其中該肽段是陽離子肽、聚陽離子肽、兩親肽、壽司肽、防衛素、疏水性肽和/或抗微生物肽。
如申請專利範圍第7項所述之融合蛋白，其中該肽段包含約5至約100個氨基酸殘基，特別地約5至50個氨基酸殘基，特別地約5至30個氨基酸殘基。
如申請專利範圍第7或8項所述之融合蛋白，其中該陽離子和/或聚陽離子肽段包含至少一個選自下組的氨基酸殘基：精氨酸、組氨酸和賴氨酸殘基，特別地其中該肽段中包含的至少70%的氨基酸殘基是精氨酸、組氨酸和/或賴氨酸殘基，特別地精氨酸和/或賴氨酸殘基。
如申請專利範圍第7項所述之融合蛋白，其中該兩親肽包含與至少一個疏水性氨基酸殘基組合的至少一個選自下組的帶正電荷的氨基酸殘基：賴氨酸、精氨酸和組氨酸殘基，該疏水性氨基酸殘基選自下組：纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸和甘氨酸殘基，特別地其中該兩親肽中的至少約70%的該氨基酸殘基是精氨酸或賴氨酸殘基，且該兩親肽中的至少約30%的該氨基酸殘基是纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸或甘氨酸殘基。
如申請專利範圍第7項所述之融合蛋白，其中該肽段包含如序列識別號14-19所示的氨基酸序列。
如申請專利範圍第7項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白包含如序列識別號13的氨基酸序列。
一種分離的核酸分子，其編碼如申請專利範圍第1至6項任一項所述之多肽或如申請專利範圍第7至12項任一項所述之融合蛋白。
一種載體，其包含如申請專利範圍第13項所述之核酸分子。
一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第13項所述之核酸分子或如申請專利範圍第14項所述之載體。
如申請專利範圍第1至6項任一項所述之多肽或如申請專利範圍第7至12項任一項所述之融合蛋白，其用作人用醫藥物質、獸用醫藥物質或診斷物質、用作食物中或化妝品上的抗微生物劑、用作消毒劑或者用於環境領域中。
如申請專利範圍第1至6項任一項所述之多肽或如申請專利範圍第7至12項任一項所述之融合蛋白，其作為藥物用於治療或預防革蘭氏陰性細菌感染。
一種如申請專利範圍第1至6項任一項所述之多肽或如申請專利範圍第7至12項任一項所述之融合蛋白的用途，其用於處理或預防食品、食物加工設備、食物加工廠、與食品接觸的表面、醫學裝置、醫院和診所的表面的革蘭氏陰性細菌污染。
一種藥物組合物，其包含如申請專利範圍第1至6項任一項所述之多肽或如申請專利範圍第7至12項任一項所述之融合蛋白。