TW201241182A

TW201241182A - Method of production of sialylated antibodies

Info

Publication number: TW201241182A
Application number: TW101106076A
Authority: TW
Inventors: Francis Blanche; Beatrice Cameron; Bruno Genet; Fabienne Soubrier
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 2011-02-24
Filing date: 2012-02-23
Publication date: 2012-10-16
Also published as: EP2678357A1; JP2014508759A; US20140046032A1; WO2012113863A1; AR085302A1

Description

201241182 六、發明說明：【先前技術】阿茲海默病（Alzheimer disease，AD)為一種影響較大比例之老年人口之進行性神經退化疾病。β-澱粉樣蛋白（Αβ) 肽被認為是一種病原體，其經由形成不溶性Αβ肽原纖維及 • 此等原纖維沈積而形成殿粉樣蛋白斑塊（Tanzi及Bertram, ； Ce//，120: 545-555，2005)。在對記憶及其他認知功能關鍵之腦區域内形成此等斑塊被認為會導致與此疾病相關之癡呆（參見 Selkoe，·/. iVewropaiAo/.五；φ· jVewro/. 53: 438_447, 1994) » Αβ為來自稱為澱粉樣前驅蛋白質（APP)之較大蛋白質之片段，該蛋白質為一種穿透過神經元膜之跨膜蛋白質》在AD之情況下，正常可溶性Αβ(δΑβ)肽轉化成寡聚/原纖維Αβ。因此，神經元毒性可存在於大分子量原纖維中，大分子量原纖維係經由sAp聚集成不溶性原纖維且隨後原纖維合併成澱粉樣蛋白斑塊而形成。已進行各種治療以試圖防止Αβ肽形成。當前，將顯著影響疾病進展之介入術之最大希望來自免疫療法（Brody及 Holtzman，Annu Rev Neurosci, 31: 175-193, 2008 ；

Winiewski及Konietzko, Lancet Neurol, 7: 805-811，2008 ; ' Winiewski及 Boutajangout，Brain Struct Funct，214: 201- 218，2010)。免疫療法治療涵蓋投與識別特定Αβ形式之抗體（參見例如 WO 2007/068412、WO 2009/065054、WO 2009/048538、WO 2009/052125、WO 2009/074583、ΕΡ 2 2224 000 Α1)與用Αβ肽抗原免疫（參見例如ΕΡ 2 226 081 162091.doc 201241182 A1)。舉例而言，已描述針對Αβ之N端之抗體（美國專利第 6,761，888 號及第 6,750,324 號；Brody 及 Holtzman, Annu Rev Neurosci, 31: 175-193，2008);此等抗體可預防或逆轉 Αβ原纖維之聚集。美國專利第7,179,463號揭示一種藉由投與針對由Αβ肽編碼區内之北極型突變（Arctic mutation) 組成之原原纖維產生的抗體來治療阿茲海默氏病之方法。說明書中未舉例說明所產生抗體且未提供低分子量Αβ肽形式之親和力比較。此外，已報導在臨床前或臨床試驗中用一些此等抗體治療之後的不利事件，諸如微出血 (microhaemorraghe)及血管源性水腫（winiewski 及 Konietzko, Lancet Neurol，7: 805-81 1，2008 ; Weller等人， Alzheimers Res Ther，1(2): 6) 〇近來已描述對Αβ肽之原原纖維形式具有特異性之新穎人類化抗體（WO 2010/130946)。此等抗體僅識別老年斑而非 Αβ肽之彌漫性沈積物，如藉由對阿茲海默氏患者之腦樣品進行之免疫化學研究所證明。此外，該等人類化抗體能夠誘導澱粉樣蛋白斑塊消減。在過去15年間，已在死後AD患者之腦中鑑別多種發炎性蛋白質。目前有大量跡象表明在AD中，澱粉樣蛋白· β(Αβ)蛋白質之沈積先於最終導致局部「腦發炎反應」之事件級聯。因此，特別重要的是治療AD之治療性抗體不引發另一發炎反應。充分確立的是，高劑量之自匯合人類血漿純化之單體免疫球蛋白G(IgG)(所謂靜脈内免疫球蛋白或IVIG)經由由其 162091.doc 201241182

Fc片段介導之相互作用來賦予消炎活性（Samuelsson等人， Science, 291: 484-486, 2001 ; Kaneko等人，J. Exp. Med. 2〇3: 789_797, 20〇6)。因此，儘管Fc-FcyR相互作用導致免疫複合物及細胞毒性抗體之促炎性，但IVIG及其Fc片段具有消炎性且廣泛用於抑制發炎疾病。IgG之糖基化且更詳言之唾液酸化（Kanuko等人，Science, 313: 670-673，2006) 似乎對IgG之細胞毒性及發炎潛力之調節至關重要：唾液酸化重組人類IgG Fc部分足以達成IVIG之消炎效應 (Anthony等人，Science，320: 373-376, 2008 ; WO 2007/117505)。末端唾液酸與次末端半乳糖之間的鍵聯似乎對該消炎活性至關重要（Anthony 等人，Science, 320: 373-376，2008 ; Anthony#、，ProcNatlAcadSciU.S.A.，105:19571-19578, 2008 ； WO 2007/117505) 〇因此’使治療性抗體之唾液酸化最佳化為改良對AD之治療之重要因素。實際上，在該種治療中使用均質完全唾液酸化抗體將有助於使引發不利發炎反應之風險最小。因此’有利的是獲得一種製備均質且完全唾液酸化之重組治療性抗體之方法。此外，工業製備重組抗體中之一個關鍵特徵及挑戰為生產力、成本、均質性及抗體活性之最佳化。特定言之，已知糖基化為製備高產量均質及強力重組治療性抗體中之一個關鍵問題，在製備重組治療性抗體時其會造成一系列關鍵問題。各種現有製備細胞株呈現一系列不同挑戰及問題，其大部分歸因於糖基化之複雜性及種類、組織及位點特異性（參見例如jefferis，Bi〇technol Prog， 162091.doc 201241182 21(1): 11-16, 2005)。因此，該方法必需確保以足以確保臨床前及臨床試驗之高生產力製備均質且完全唾液酸化之重組治療性抗體。然而’先前技術之方法僅產生經異質或部分唾液酸化之抗體及/或產生抗體的量過低以致不能用於臨床試驗中。舉例而§ ’表現外源性半乳糖基轉移酶及/或唾液酸基轉移酶活性之細胞株用於製備醣蛋白。然而，獲得適合之唾液酸化程度需要高量表現此等酶。然而，在彼情況下，細胞株之生產力顯著減小’此意謂其不適合用作製備重組治療性抗體之宿主細胞。亦已在活體外進行半乳糖基化及/ 或唾液酸化反應。然而，產量過低以致無法製備足以進行活體内測試的完全唾液酸化抗體。藉由在凝集素（lectin)親和管柱上選擇性富集唾液酸化抗體未改善此情況。或者，在所製備抗體之Fc域中引入突變。從而在ig〇3抗體之Fc域中之各種位置引入丙胺酸殘基。然而，僅引起唾液酸化略有增強，其中在最佳情況下獲得之二唾液酸化N-聚糖不超

過 30%(Lund 等人 ’ J. Immunol” 157: 4963-4969，1996 ; Weikert 等人，Nature Biotech.，17: 1116-1121，1999 ; Shields等人，J· Biol. Chem·，276(1): 6591-6604，2001 ; Jassal等人，Biochem Biophys Res Commun.，286(2): 243-249，2001 ; Scallon等人，Mol. Immunol., 44: 1524-1534, 2007 ; Baudino等人，J. Immunol.，181: 6664-6669, 2008 ; Hossler 等人，Glycobiology，19(9): 936-949，2009 ; WO 2007/048122 ； WO 2008/057634 ； WO 2008/065543 ； WO 162091.doc 201241182 2009/079382 ; WO 2010/109010)。因此，仍然需要一種高量製備顯示完全唾液酸化N-聚糖之抗體之方法》【發明内容】先前技術之方法無法以符合開發醫藥產品之量製備廣泛唾液酸化抗體。本發明者已觀測到在過度表現β半乳糖基轉移酶及/或唾液酸基轉移酶之細胞株中表現IgG抗體僅在極低生產力之條件下產生唾液酸化抗體。同樣，在普通細胞株中表現在Fc域中經突變之抗體會產生具有極異質唾液酸化樣式之抗體組合物。本發明者目前已顯示有可能藉由在表現β半乳糖基轉移酶及唾液酸基轉移酶活性之宿主細胞中表現在以域中攜帶突變之抗體而獲得高產量的廣泛唾液酸化IgG抗體。藉由本發明方法獲得之抗體呈現均質畴形式，該等醣形式包含基本上具有複合雙觸角形式之义聚糖，且其中寡醣之兩個分支鏈均攜帶唾液酸殘基。根據本發明，「廣泛唾液酸化」意謂至少80%、較佳至少85%、更佳至少9〇。/。、甚至更佳至少95%、還要最佳至少97%或最佳至少99%之由抗體之Fc域攜帶的N•聚糖之寡醣鏈包含2個唾液酸殘基。本發明之第一態樣係關於一種製備IgG抗體之方法，其中至少80%之該抗體包含含有兩個唾液酸殘基之複合雙觸角寡醣連接於抗體之各以域，該方法包含以下步驟： a)在該抗體之該Fc域中引入突變，及 162091.doc 201241182 b)在表現β-半乳糖基轉移酶及唾液細胞株中表現步驟a)中獲得之突變抗體酸基轉移酶活性之在一特定實施例中，β-半乳糖基轉移酿& β 你啤為β-1，4-半乳糠基轉移酶且唾液酸基轉移酶為α-2,6-唾液Α 叹毁基轉移酶。在另一特定實施例中，β-Μ-半乳糖基轉務碰於

付移鉍係由SEQ ID NO: 35所示之聚核苷酸序列編碼且，〇唾液酸基轉移酶係由SEQ ID NO: 33所示之聚核苷酸序列迫〜竭碼。在另一特定實施例中該等唾液酸殘基經由α·2,6鍵連接於抗體。在另一特定實施例中，抗體為單株抗體。在另—特定實施例中，抗體為人類化抗體。在另一特定實施例中’該突變影響選自由F243、ν264 及D265組成之群之胺基酸。在另一特定實施例中，該突變係選自由F243A、V264A及D265A組成之群。在另一特定實施例中，該突變為D265 A。在另一特定實施例中，該抗體包含IgG4 Fc域》在另一特定實施例中’該抗體特異性結合肽Αβ之原原纖維形式。在另一特定實施例中，該抗體具有至少一個由序列與選自SEQ ID NO: 9、11、13、15、17及19之序列一致’或序列與該等序列SEQ ID NO: 9、11、13、15 ' 17及 19之一有1、2、3、4或5個核苷酸不同之聚核苷酸編碼的 CDR。在另一特定實施例中，該抗體具有至少一個顯示序列與選自 SEQ ID NO: 1〇、12、14、16、18 及 20 之一個序列一致的CDR。在另一特定實施例中，該抗體具有至少一個與該等序列有1或2個胺基酸殘基不同，而保留其結合特 162091.doc 201241182 異性的CDR ^在另一特定實施例中，該抗體包含由核苷酸序列SEQ ID NO: 9、Π、13、15、17及19編碼或由與該等序列 SEQ ID N0: 9、11、13、15、17及 19僅有 1、2、3、4 或5個核苷酸不同之序列編碼的CDR。在另一特定實施例中’ s亥抗體包含序列與由SEq ID N〇: 1〇、12、14、16、 1 8及20表不之序列一致之6個CDR。在另一特定實施例中’該抗體包含由核苷酸序列SEq ID NO: 9、11、13、 31、17及19編碼或由與該等序列SEq ID N〇: 9、11、13、 31、17及19僅有1、2、3、4或5個核苷酸不同之序列編碼的CDR °在另一特定實施例中，該抗體包含序列與由SEQ ID NO: 10、12、14、32、18及20表示之序列一致之6個 CDR °在另一特定實施例中，該抗體包含由核苷酸序列 SEQ ID NO: 9、11、29、31、17及19編碼或由與該等序列 SEQ ID NO: 9、11、29、31、17 及 19 僅有 1、2、3、4或 5 個核苦酸不同之序列編碼的CDR。在另一特定實施例中，該抗體包含序列與由SEq ID NO: 10、12、30、32、18及 20表示之序列一致之6個CDR。在另一特定實施例中，該抗體包含由與SEQ ID NO: 5所示之序列或SEQ ID NO·· 27 所示之序列顯示至少80% —致性之聚核苷酸序列編碼的 Vh °在另一特定實施例中，該抗體包含序列與由SEQ ID N0: 6表示之序列或由SEQ ID NO: 28表示之序列具有至少 80°/。一致性的。在另一特定實施例中，該抗體VL由與 SEQ ID NO: 7所示之序列或SEQ ID NO: 23所示之序列顯示至少80% —致性的聚核苷酸序列編碼。在另一特定實施 162091.doc -9- 201241182 例中，該抗體包含序列與由SEQ ID NO: 8表示之序列或由 SEQ ID NO: 24表示之序列具有至少80%—致性的VL »在另一特定實施例中，該抗體包含由SEQ ID NO: 5所示之聚核苷酸序列或SEQ ID NO: 27所示之聚核苷酸序列編碼的 VH。在另一特定實施例中，該抗體包含具有由SEQ ID NO: 6表示之序列或由SEQ ID NO: 28表示之序列的VH。在另一特定實施例中，該抗體VL由SEQ ID NO: 7所示之聚核苷酸序列或SEQ ID NO: 23所示之聚核苷酸序列編碼》在另一特定實施例中，該抗體包含具有由SEQ ID NO: 8或由 SEQ ID NO: 24表示之序列的VL。在另一特定實施例中，該抗體包含由聚核苷酸序列SEQ ID NO: 5及7編碼之序列。在另一特定實施例中，該抗體包含由SEQ ID NO: 6及 8表示之胺基酸序列。在另一特定實施例中，該抗體包含由聚核苷酸序列SEQ ID NO: 5及23編碼之序列。在另一特定實施例中’該抗體包含由SEQ ID NO: 6及24表示之胺基酸序列。在另一特定實施例中，該抗體包含由聚核苷酸序列SEQ ID NO: 27及23編碼之序列。在另一特定實施例中’該抗體包含由SEQ ID NO: 28及24表示之胺基酸序列。在另一特定實施例中，該抗體包含由與SEq ID NO: 1 或SEQ ID NO: 25所示之序列具有至少80%一致性之聚核苷酸序列編碼的重鏈。在另一特定實施例中，該抗體包含胺基酸序列與由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 26表示之序列具有至少80% —致性的重鏈。在另一特定實施例中，該抗體包含由與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 21所示之序列具 162091.doc •10- 201241182 有至少80% —致性之聚核苷酸序列編碼的輕鏈β在另一特定實施例中，該抗體包含胺基酸序列與由SEQ ID NO: 4或 SEQ ID NO: 22表示之序列具有至少80%—致性的輕鏈。在另一特定實施例中，該抗體包含由SEQ N0: 1及3所示之聚核苷酸序列編碼之序列。在另一特定實施例中’該抗體具有由SEQ ID NO: 2及4表示之胺基酸序列。在另一特定實施例中，該抗體包含由SEQ ID NO: 1及21所示之聚核苷酸序列編碼之序列。在另一特定實施例中，該抗體具有由SEQ ID NO: 2及22表示之胺基酸序列。在另一特定實施例中，該抗體包含由SEQ ID NO: 25及21所示之聚核苷酸序列編碼之序列。在另一特定實施例中，該抗體具有由 SEQ ID NO: 26及22表示之胺基酸序列。本發明之第二態樣係關於一種由以上方法製備之抗體》本發明之第三態樣係關於包含以上抗體之醫藥組合物。本發明之第四態樣係關於用作藥劑之以上抗體。本發明之第五態樣係關於用於治療與澱粉樣蛋白斑塊形成相關之疾病，諸如阿茲海默病之以上抗體。本發明之第六態樣係關於一種包含IgG抗體之組合物，其中至少80〇/〇之該抗體包含複合雙觸角寡醣連接該抗體之各Fc域，該募醣包含兩個唾液酸殘基，其中Fc域包含不同於天然序列人類IgG Fc域之胺基序列。在一特定實施例中，該等唾液酸殘基經由α-2,6鍵連接於抗體。在另一特定實施例中，組合物之抗體在胺基酸位置 162091.doc 201241182 諸如選自且尤其為 243、264及265之任一或多處包含胺基酸取代，由F243A ' V264A及D265A組成之群之取代， D265A取代。【實施方式】本發明係關於一種製備IgG抗體之方法，其中至少8〇% 之該抗體包含含有兩個唾液酸殘基之複合雙觸角寡畴連接於抗體之各Fc域，該方法包含以下步驟： a) 在該抗體之該Fc域中引入突變，及 b) 在表現β半乳糖基轉移酶及唾液酸基轉移酶活性之細胞株中表現步驟a)中獲得之突變抗體》

IgG免疫球蛋白在其兩個重鏈之各者之ch2域中的Asn 297處含有單一N-連接聚糖，其結構於圖1上說明。如本文所用’術語「N-聚糖」係指N-連接寡醣，例如藉由天冬醯胺-N-乙醯葡糖胺鍵聯而連接於多肽之天冬醯胺殘基的寡醣。N-聚糖具有共同五醣核心Man3GlcNAc2(「Man」係指甘露糖；GlcNAc係指N-乙醯葡糖胺）。 N-聚糖就包含連接於Man3核心結構之周邊糖（例如 GlcNAc、半乳糖、海藻糖及唾液酸）的分支键（觸角）之數目及性質而言不同。N-聚糖係根據其分支鏈組分（例如高甘露糖、複合或雜交）加以分類。「複合雙觸角」型N-聚糖通常具有至少一個GlcNAc連接於三甘露糖核心之1，3甘露糖分支鏈、及至少一個GlcNAc連接於三甘露糠核心之1，6 甘露糖分支鏈。複合雙觸角N-聚糖亦可具有包含「對分」 GlcNAc及核心海藻糖（「Fuc」）之鏈内取代。「對分 16209l.doc •12· 201241182

GlcNAc」為連接於成熟核心碳水化合物結構之β_14·甘露糖之GlcNAc殘基。複合雙觸角N-聚糖亦可具有視情況經唾液酸修飾之半乳糖（「Gal」）殘基。唾液酸經唾液酸基轉移酶催化而添加至寡醣鏈中，但需要預先使一或多個半乳糖殘基經半乳糖基轉移酶而連接於末端N·乙醯葡糖胺。本發明之「唾液酸」涵蓋5-N-乙酿神經胺酸（NeuNAc)與5-經乙酿神經胺酸 (NeuNGc) 〇因此’分泌之IgG為展現糖殘基海藻糖、半乳糖、唾液酸及對分N-乙醯葡糖胺之可變添加之醣形式的異質混合物。唾液酸殘基可經由α-2,3或α-2,6鍵而連接於半乳糖殘基，且由此連接於抗體。已顯示在Fc域中具有α_2,6唾液酸化Ν-聚糖之抗體具有消炎活性（Kanek〇等人，Science，313: 670-673, 2006 ； Jefferis, Nature Biotechnol., 24(10)： 1230- 1231，2006，Anthony 等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.， 105: 19571-19578，2008 ; Anthony 等人，Science，320: 3 73-3 76，2008)。在本發明之一個實施例中，兩個唾液酸殘基係經由α-2,6鍵連接於抗體。‘ 術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且特定涵蓋任何同型（諸如IgG ' IgM、IgA、IgD及IgE)之單株抗體（包括全長單株抗體）、多株抗體、多特異性抗體、嵌合抗體及抗體片段。與特定抗原具有反應性之抗體可藉由重組方法 (諸如選擇噬菌體或類似載體中之重組抗體文庫）或藉由抗 162091.doc 201241182 原或編碼抗原之核酸使動物免疫來產生β 「多株抗體」為在一或多種其他不相同抗體中或在其存在下製備之抗體。一般而言，多株抗體係在產生不相同抗體之若干其他Β_淋巴細胞存在下自某一 Β淋巴細胞製備。通常’多株抗體係直接自經免疫動物獲得。如本文所用，「單株抗體」為自實質上均質之抗體群體獲得的抗體，亦即除可能少量存在之天然產生之突變之外’形成此群體之抗體基本上相同。此等抗體係針對單一抗原決定基且因此具有高度特異性。「抗原決定基」為抗原上與抗體結合之位點。其可由鄰接殘基形成或由非鄰接殘基藉由抗原性蛋白質之摺疊而變得緊密鄰近而形成。由鄰接胺基酸形成之抗原決定基在暴露於變性溶劑時通常得以保持，而由非鄰接胺基酸形成之抗原決定基在該暴露下通常會喪失。較佳地，本發明抗體為單株抗體。典型抗體包含由雙硫鍵聯接之兩個相同重鏈及兩個相同輕鏈。各重鏈及輕鏈含有恆定區及可變區β各可變區含有三個稱為「互補決定區」（「CDR」）或「高變區」之區段’其主要負貴結合抗原之抗原決定基。其通常稱為自Ν 端依序編號之CDR1、CDR2及CDR3(參見Kabat等人，

Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版， National Institute of Health，Bethesda，MD，1991)。可變區之更高度保守部分稱為「構架區」。如本文所用’「VH」係指抗體之免疫球蛋白重鏈（包括 162091.doc 14 201241182

Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab，）2片段之重鏈）之可變區。k及「VL」係心抗體之免疫球蛋白輕鍵（包括fv、 scFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab，）2片段之輕鏈）之可變區。抗體恆定域不直接參與抗體與抗原之結合，但展現各種效應功flb。對應於免疫球蛋白之不同類別之重鍵怪定區分別稱為α ' δ、ε ' γ及μ。視其重鏈之恆定區之胺基酸序列而定，抗體或免疫球蛋白可歸為不同類別，亦即IgA、 IgD、IgE、IgG及IgM，且若干此等類別可進一步分成子類 (同型），例如IgGl、IgG2、IgG3 及 IgG4 ; IgAl及 IgA2(參見 W. E. Paul編，1993，Fundamental Immunology，Raven Press, New York, New York)。木瓜蛋白酶（Papain)消化抗體會產生兩個相同抗原結合片段（稱為F ab片段’各具有單一抗原結合位點）以及殘餘「Fc」片段。已確定人類IgG Fc域之晶體結構 (Deisenhofer，Biochemistry, 20，2361-2370，1981)。如說明書及申請專利範圍中所用，「免疫球蛋白Fc域或Fc」意謂免疫球蛋白重鏈恆定區之羧基端部分。如本文所用，「天然序列Fc域」包含與自然界中所見之!^域之胺基酸序列一致的胺基酸序列。天然序列人類Fc域包括天然序列人類 IgGl Fc域（非A及A異型）；天然序列人類IgG2 Fc域；天然序列人類IgG3 Fc域；及天然序列人類IgG4 Fc域以及其天然產生之變異體。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc域之邊界可能變化，但人類 IgG重鏈Fe域通常定義為自鉸鏈區中之位置Cys226或 162091.doc -15- 201241182

Pro23 0處之胺基酸殘基延伸至其含有重鏈之CH2及CH3域之羧基端。在整篇本說明書及申請專利範圍中，免疫球蛋白重鍵中之殘基編號為如Kabat等人，Sequences of

Proteins of Immunological Interest，第 5 版 Public Health

Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 中之EU索引之編號。「如Kabat中之EU索引」係指人類 IgGl EU抗體之殘基編號。術語「鉸鏈區」通常定義為人類IgGl之Glu216至Pro230 之鏈段（Burton，Mol Immunol, 22: 161-206，1985)。其他 IgG同型之较鍵區可藉由將形成重鏈間S-S鍵之第一半胱胺酸殘基及末個半胱胺酸殘基置放於相同位置中來與IgGl序列比對。人類IgG Fc部分之「CH2域」（亦稱為「Cy2」域）通常自約胺基酸231延伸至約胺基酸340。CH2域之獨特之處在於其不與另一域緊密配對。相反，兩個N -連接分支碳水化合物鏈插入在完整天然IgG分子之兩個CH2域之間。已推測碳水化合物可提供域-域配對之替代且有助於使CH2 域穩定（Burton，Mo/ 22: 161-206，1985)。「CH3 域」包含Fc部分中之CH2域C端殘基之鏈段（亦即自igG之約胺基酸殘基341至約胺基酸殘基447)。

Fc域在決定免疫球蛋白之生物功能方面為重要的且此等生物功能稱為「效應功能」。此等Fc域介導之活性係經由免疫效應細胞（諸如殺手細胞、自然殺手細胞及活化巨噬細胞）或各種補體組分介導。此等效應功能涉及活化該等效應細胞表面上的受體’此係經由抗體之Fc域與該受體或 •16· 162091.doc 201241182 補體組分結合來達成。抗體依賴性細胞毒性（ADCC)及補體依賴性細胞毒性（CDC)活性涉及Fc域與效應細胞之Fc受體（諸如FcyRI、FcylUI、FcyRIII)或補體組分（諸如Clq)結合。在各種人類免疫球蛋白類別中，人類IgGl及IgG3介導 ADCC比IgG2及IgG4更有效。本發明抗體包含Fc域中之突變。有利的是攜帶該突變之 Fc域包含的唾液酸殘基比天然序列Fc域更多。較佳地，該突變影響選自由F243、V264及D265組成之群之胺基酸。更佳地，該胺基酸經選自由丙胺酸（A)、甘胺酸（G)、白胺酸（L)及離胺酸（K)組成之群之胺基酸取代。甚至更佳地，該突變係選自由 F243A、V264A、D265A、D265G、D265L 及D265K組成之群。還要更佳地，該突變係選自由 D265 A、D265G、D265L及D265K組成之群。甚至更佳地，該突變係選自由D265A、D265K及D265L組成之群。以上胺基酸位置對應於如Kabat等人（Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，National Institute of Health, Bethesda，MD，1991)中所述之 EU 編號所指定之位置。EU編號已用於[實施方式]及申請專利範圍中。然而，在實例中，胺基酸位置有時係藉由參考其在鼠類13C3抗體或人類化13C3抗體序列上之位置加以提供。儘管熟習此項技術者鑒於整個說明書可即刻顯而易知突變位置，但為方便起見提供下表及圖27。 16209 丨.doc -17· 201241182 根據EU編號之位置鼠類抗AP_13C3 mAb 上之位置人類化抗Ap_13C3 mAb 上之位置 D265 D257 D260 F243 F235 F238 V264 V256 V259 在本發明之框架中，Fc域可為例如人類IgGl Fc域（例如具有SEQ ID NO: 57)、人類IgG2 Fc域（例如具有SEQ ID NO: 5 8)、人類 IgG3 域（參見例如 Lund 等人，J. Immunol·， 157: 4963-4969，1996)、人類 IgG4 Fc 域（例如具有 SEQ ID NO: 59 或 SEQ ID NO: 60)、鼠類 IgGl Fc 域（例如具有 SEQ ID NO: 61)、鼠類 IgG2a Fc域（例如具有 SEQ ID NO: 62)、或鼠類IgG3 Fc域（例如具有SEQ ID NO: 63)。其可對應於天然產生之Fc域或已藉由遺傳工程改造引入突變以增強或降低抗體之效應功能及/或延長抗體之半衰期的Fc域。此等突變為熟習此項技術者所熟知。在一些實施例中，本發明方法將包含在欲表現之抗體之 Fc域中引入突變的初步步驟。此可使用熟習此項技術者已知之任何適合方法，例如寡核苷酸介導之定點突變誘發、卡匣突變誘發、易出錯PCR、DNA改組或大腸桿菌突變株來進行（Vaughan 等人，Nature Biotech， 16·· 535-539, 1998 ; Adey 等人，1996，第 16 章，第 277-291 頁，「Phage Display of Peptides and Proteins」，Kay 等人編，Academic Press)。在一個實施例中，在本發明方法中製備之抗體為人類化抗體。如本文所用，術語「人類化抗體」係指含有源於非人類 162091.doc -18· 201241182 免疫球蛋白之最小序列之嵌合抗體β如本文所用，「嵌合抗體」為怪定區或其一部分經改變、置換或交換以使可變區連接於不同物種之恆定區或屬於另一抗體類別或子類之 •1·亙定區的抗體《「嵌合抗體」亦指可變區或其一部分經改變、置換或交換以使恆定區連接於不同物種之可變區或屬於另一抗體類別或子類之可變區的抗體。人類化之目的為降低異種抗體（諸如鼠類抗體）之免疫原性以便引入人類中，同時維持抗體之完全抗原結合親和力及特異性。人類化抗體或經改適而不被其他哺乳動物排斥之抗體可使用諸如表面重塑及CDR移植之若干技術製備。如本文所用’表面重塑技術係將分子模型化、統計分析及突變誘發組合使用以改變抗體可變區之非CDR表面來類似於目彳示宿主之已知抗體之表面。用於表面重塑抗體之策略及方法及用於降低抗體在不同宿主内之免疫原性之其他方法揭示於美國專利5,639,641 中’該專利以全文引用的方式併入本文中。簡言之，在一特定方法中’（1)產生一組抗體重鏈及輕鏈可變區之位置比對’以產生一組重鏈及輕鏈可變區構架表面暴露位置，其中所有可變區之比對位置至少約98%—致；（2)確定齧齒動物抗體（或其片段）之一組重鏈及輕鏈可變區構架表面暴露胺基酸殘基；（3)鑑別一組其一致性最接近齧齒動物表面暴露胺基酸殘基組之重鏈及輕鏈可變區構架表面暴露胺基酸殘基；（4)步驟（2)中確定之重鏈及輕鏈可變區構架表面暴露胺基酸殘基組經步驟（3 )中鑑別之重鏈及輕鏈可變區構架 16209 丨.doc -19· 201241182 表面暴露胺基酸殘基組取代，但在齧齒動物抗體之互補決定區之任何殘基的任何原子之5 a内之彼等胺基酸殘基除外’及（5)製備具有結合特異性之人類化齧齒動物抗體。基於鑑別柔性殘基而使抗體人類化之另一方法已描述於 PCT申請案WO 2009/032661中》該方法包含下列步驟：〇) 構建親本單株抗體之一致性模型且進行分子動力學模擬； (2)分析柔性殘基且鑑別非人類抗體分子之最具柔性之殘基，以及鑑別可能為異質性或降解反應來源之殘基或基元；（3)鑑別展現最類似親本抗體之整體識別區之人類抗體，（4)確疋欲突變之柔性殘基，亦使可能為異質性及降解來源之殘基或基元突變；及（5)檢查已知τ細胞或B細胞抗原決定基之存在。可使用分子動力學計算、利用内隱溶劑模型來找出柔性殘基，該模型解釋水溶劑與蛋白質原子在模擬期間之相互作用。

可使用多種其他技術使抗體人類化，該等技術包括CDR 美國專利第5,530，101 移植（ΕΡ 0 239 400 ; WO 91/09967 ; 號，及第5,585,089號）、鎮飾或表面重塑（Ep 〇 592 1〇6 ;

ΕΡ 0 519 596 ； Padlan E. 489-498 ; Studnicka G· Μ·等人， 7(6): 805-814 ; Roguska Μ·Α· dcac?. ί/.U.，91: 969-973)及鏈改組（美國專利第 5,565,332號）。在一個態樣中，本發明抗體為IgG同型之人類化抗體其特異性結合肽Α-β之原原纖維形式，亦即高分子量肽 162091.doc ·20· 201241182 更佳地，本發明抗體結合分子量大於或等於2〇〇、3〇〇、 400 或 500 kDa 之肽 Α-β。本發明亦關於一種具有降低之效應功能，從而允許減弱諸如微出血之不良反應的人類化抗體。在一個實施例中，本發明抗體不具有任何效應功能。在另一實施例中，本發明抗體包含IgG4 Fc域。在另一實施例中，本發明抗體之 IgG4 Fc域含有會減少半分子產生之一或多個突變。在另一實施例中’該抗體之Fc域攜帶引起該抗體之效應功能降低之至少一個突變。較佳地，本發明抗體為具有至少一個由序列與選自SEQ ID NO: 9、11、13、15、17及19之序列一致或序列與該等序列之一有1、2、3、4或5個核苷酸不同之聚核苷酸編碼的CDR之人類化抗體。

本發明亦關於一種具有至少一個顯示序列與選自Seq ID NO: 1〇、12、14、16、18及20之一個序列一致之CDR的人類化抗體。在另一態樣中’本發明抗體具有至少一個與該專序列有1或2個胺基酸殘基不同，同時保留其結合特異性之 CDR。在一個實施例中’本發明抗體包含由核苷酸序列SEQ m NO: 9、11、13、15、17及19或由其與該等序列僅有i、 2、3、4或5個核苷酸不同之變異體編碼之6個cdr。在另一實施例中’本發明抗體包含序列與由Seq id NO: 1 〇、 12、14、16、18及20表示之序列一致之6個CDR。

在另一實施例中’本發明抗體包含由核苷酸序列SEq ID 162091.doc -21 - 201241182 NO: 9、11、13、31、17及19或由其與該等序列僅有i、 2、3、4或5個核苷酸不同之變異體編碼之6個CDR。在另一實施例中，本發明抗體包含序列與由SEQ ID no: i〇、 12、14、32、18及20表示之序列一致之6個cdR。在另一實施例中’本發明抗體包含由核苷酸序列SEQ id NO: 9' 11、29、31、17及19或由其與該等序列僅有1、 2、3、4或5個核苷酸不同之變異體編碼之6個CDR。在另一實施例中’本發明抗體包含序列與由SEq ID NO: 1 〇、 12、30、32、18及20表示之序列一致之6個CDR。在另一態樣中，本發明係關於一種抗體，其包含由顯示與SEQ ID NO: 5所示之序列或SEQ ID NO: 27所示之序列至少80%、85%、90%、95%或99%—致之聚核苷酸序列編碼的VH。在一個實施例中，編碼本發明抗體之vh之序列選自SEQ ID NO: 5與SEQ ID NO: 27。在另一實施例中，本發明抗體之VH的序列與由SEQ ID NO: 6表示之序列或由SEQ ID NO: 28表示之序列具有至少80%、85%、90%、 95%或99°/〇 —致性。在另一實施例中，本發明抗體之VHi 序列係由SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 28表示。在另一態樣中，本發明提供一種抗體，其VL係由顯示與SEQ ID NO: 7所示之序列或SEQ ID NO: 23所示之序列至少80。/。、85°/。、90%、95%或99%—致之聚核苷酸序列編碼。較佳地，本發明抗體之VL係由SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 23所示之聚核苷酸序列編碼。在另一實施例中，本發明抗體之VL的序列與由SEQ ID NO: 8表示之序列或由 162091.doc -22· 201241182 SEQ ID NO: 24表示之序列具有至少80%、85%、90%、 95%或99%—致性。在另一實施例中，本發明抗體之VL之序列係由SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 24表示。在一個實施例中，本發明提供一種包含由聚核苷酸序列 SEQ ID NO: 5及7編碼之序列之抗體。在另一實施例中，本發明包含由SEQ ID NO: 6及8表示之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明提供一種包含由聚核苷酸序列 SEQ ID NO: 5及23編碼之序列之抗體。在另一實施例中，本發明包含由SEQ ID NO: 6及24表示之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明提供一種包含由聚核苷酸序列 SEQ ID NO: 27及23編碼之序列之抗體。在另一實施例中，本發明包含由SEQ ID NO·· 28及24表示之胺基酸序列。本發明亦關於一種抗體，其包含由與SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 25所示之序列具有至少80%、85%、90%、 95%或99% —致性之聚核苷酸序列編碼之重鏈。本發明亦關於一種抗體，其包含胺基酸序列與由SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 26表示之序列具有至少80%、85%、90%、 95%或99%—致性之重鏈。在另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含由與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 21所示之序列具有至少80%、 85%、90%、95%或99% —致性之聚核苷酸序列編碼之輕鏈。本發明亦關於一種抗體，其包含胺基酸序列與由SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 22表示之序列具有至少80%、 •23· I62091.doc I? 201241182 85%、90%、95%或99%—致性之輕鏈。本發明之另一態樣係關於一種包含由SEQ ID NO: 1及3 所示之聚核苷酸序列編碼之序列的抗體。較佳地，本發明抗體具有由SEQ ID NO: 2及4表示之胺基酸序列。本發明之另一態樣係關於一種包含由SEQ ID NO: 1及21 所示之聚核苷酸序列編碼之序列的抗體。較佳地，本發明抗體具有由SEQ ID NO: 2及22表示之胺基酸序列。本發明之另一態樣係關於一種包含由SEQ ID NO: 25及 2 1所示之聚核苷酸序列編碼之序列的抗體。較佳地，本發明抗體具有由SEQ ID NO: 26及22表示之胺基酸序列。編碼或構成本發明抗體之序列顯示於表1中。表1 :

SEQ ID No 性質域抗體名稱 1 DNA HC 2 蛋白質 HC 3 DNA LC 4 蛋白質 LC 5 DNA VH 6 蛋白質 VH 7 DNA VL 8 蛋白質 VL 9 DNA CDR 10 蛋白質 CDR 11 DNA CDR 12 蛋白質 CDR 13 DNA CDR 14 蛋白質 CDR 人類化 15 DNA CDR 13C3 16 蛋白質 CDR 17 DNA CDR 18 蛋白質 CDR 19 DNA CDR 20 蛋白質 CDR 21 DNA LC 22 蛋白質 LC 162091.doc -24· 201241182

23 DNA VL 24 蛋白質 VL 25 DNA HC 26 蛋白質 HC 27 DNA VH 28 蛋白質 VH 29 DNA CDR 30 蛋白質 CDR 31 DNA CDR 32 蛋白質 CDR 33 DNA SIAT1 34 蛋白質 SIAT1 不適用 35 DNA B4GT1 36 蛋白質 B4GT1 37 DNA HC 38 蛋白質 HC 鼠類 39 DNA LC 13C3 40 蛋白質 LC 41 DNA HC 鼠類 42 蛋白質 HC 13C3F235A 43 DNA HC 鼠類 44 蛋白質 HC 13C3 V256A 45 DNA HC 鼠類 46 蛋白質 HC 13C3 D257A 47 DNA HC 人類化 48 蛋白質 HC 13C3 D260A 49 DNA HC 人類化 50 蛋白質 HC 13C3D260G 51 DNA HC 人類化 52 蛋白質 HC 13C3 D260L 53 DNA HC 人類化 54 蛋白質 HC 13C3D260K 55 DNA HC 人類化 56 蛋白質 HC 13C3 D260S 術語「序列一致性」係指兩個肽之間或兩個核酸之間的一致性。序列之間的一致性可藉由比較為比較目的而比對之各序列之位置來確定。當所比較序列中之某一位置由相同鹼基或胺基酸佔據時，則序列在彼位置處為一致的。核酸序列之間的序列一致性程度與此等序列所共有位置處之相同核苷酸數目有關。胺基酸序列之間的一致性程度與此 162091.doc -25- 201241182 等序列之間所共有之相同胺基酸序列數目有關。因為兩個多肽可各自⑴包含在兩個聚核苷酸之間類似之序列（亦即完全聚核苷酸序列之一部分）且（π)可另外包含在兩個聚核苦酸之間有歧異之序列’所以兩個或兩個以上聚核苷酸之間在「比較窗」進行之序列一致性比較係指具有至少2〇個鄰接核苷酸位置之概念區段，其中聚核苷酸序列可與具有至少20個鄰接核苷酸之參照核苷酸序列進行比較且其中比較窗中之聚核苷酸序列之一部分相較於參照序列（其不包含添加或缺失）可包含20%或20%以下之添加或缺失（亦即空隙）以達成兩個序列之最佳比對。為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之一致性百分比’對準序列以達成最佳比較。舉例而言，可在第一胺基酸序列或第一核酸序列之序列中引入空隙以達成與第二胺基酸序列或第二核酸序列之最佳比對。接著比較相應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之某一位置由與第二序列中之相應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則分子在彼位置處為一致的。兩個序列之間的一致性百分比與序列所共有之相同位置數目有關。因此，一致性％=相同位置數目/重疊位置之總數目 xlOO。在此比較中，序列可為相同長度或可在長度方面不同。用於確定比較窗之最佳序列比對可藉由Smith及

Waterman(J. 772eor. 5ζ·〇/·，91(2): 370-380, 1981)之局部一致性决算法、藉由 Needleman及 Wunsch(·/. Aib/·价〇/，48(3): 16209 丨.doc -26· 201241182 443-453，1972)之一致性比對演算法、藉由pearson及 Lipman(尸roc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85(5): 2444-2448, 1 988)之方法搜尋類似性、藉由此等演算法之電腦化工具 (Wisconsin Genetics 套裝軟體 7.0 版（Genetic Computer Group，575，Science Drive, Madison，Wisconsin)中之 GAP、 BESTFIT、FASTA及TFASTA)或藉由檢查來進行。選擇藉由各種方法產生之最佳比對（亦即在比較窗上得到最高一致性百分比）。術語「序列一致性」意謂兩個聚核苷酸或多肽序列在比較窗上為一致的（亦即基於核苷酸逐個比較或基於胺基酸逐個比較）。術語「序列一致性百分比」係藉由以下方式來計算：在比較窗上比較兩個經最佳對準之序列，確定兩個序列中存在之相同核酸鹼基（例如A、T、C、G、U或I) 所處之位置數目以產生匹配位置之數目，用比較窗中之位置總數目（亦即窗大小）除匹配位置之數目並用1 〇〇乘以結果以產生序列一致性百分比。相同過程可應用於多肽序列。核酸序列或胺基酸序列之序列一致性百分比亦可使用 BLAST軟體（1998年9月之第2.06版）在預設參數或使用者定義之參數下計算。術語「序列類似性」意謂胺基酸可經修飾同時保留相同功能。已知胺基酸係根據其侧基之性質加以分類且諸如驗性胺基酸之一些胺基酸可彼此互換同時維持其基本功能。根據本發明，唾液酸殘基在宿主細胞表現本發明抗體期間添加於其上。本發明宿主細胞過度表現p半乳糖基轉移 162091.doc •27· 201241182 酶及唾液酸基轉移酶。「β半乳糖基轉移酶」在本文中係指能夠使半乳糖殘基共價連接於醣蛋白之Ν-聚糖上之Ν·乙醯葡糖胺殘基的酶。該酶較佳為β-1，4·半乳糖基轉移酶（EC=2.41 ^舉例而言，該酶為β·1，4-半乳糖基轉移酶，稱為p_i，4半乳糖基轉移酶1(〇61^111<:寄存編號：灿一001488.2)，其由基因 B4GALTl(Genbank寄存編號：NM一00M973)編碼。β-Μ半乳糖基轉移酶更佳具有由SEQ ID NO: 36表示之胺基酸序列且係由SEQ ID NO: 35所示之聚核苷酸序列編碼。本發明之「唾液酸基轉移酶」為能夠使唾液酸殘基連接於醣蛋白之N-聚糖上之半乳糖殘基的酶。適用於本發明方法中之唾液酸基轉移酶的適合非限制性實例為ST3Gal 111(其亦稱為(1-2,3-唾液酸基轉移酶（£0 2.4_99.6))及〇1-2,6-唾液酸基轉移酶（EC 2.4.99.1)。 α-2,3-唾液酸基轉移酶催化唾液酸殘基轉移至Gai_p_ l，3GIcNAc 或 Gal-p-l，4GIcNAc 醣苷之 Gal(參見例如 Wen 等人 ’·/·別〇/. C/iem. 267: 21011-21019，1992)且導致酷肽中之N-連接寡醣唾液酸化。唾液酸殘基隨著兩個醣之間形成 α-鍵而連接於半乳糖。醣之間的鍵結（鍵聯）係介於唾液酸殘基之2位與半乳糖殘基之3位之間。此特定酶可自大鼠肝分離（Weinstein 等人，《/.价οΛ CAew.，257: 13845-13853, 1982);已知人類cDNA(Sasaki等人，丄則〇/. C/iem.，268: 22782-22787，1993 ; Kitagawa及 Paulson, «/. Βζ·σ/· C/iem.， 269: 1394-1401，1994)及基因組（Kitagawa 等人，《/. Bk/. 162091.doc • 28 * 201241182 271: 931-938，1996)DNA序列，從而有助於藉由重組表現製備此酶。 α-2,6-唾液酸基轉移酶之活性會產生α·2,6_唾液酸化募醣，包括α-2,6-唾液酸化半乳糖。名稱「α_2,6_唾液酸基轉移酶」係指使唾液酸連接於接受體多醣之第六個原子之唾液酸基轉移酶家族。可自不同組織分離不同形式之α_2,6· 唾液酸基轉移酶。舉例而言’此酶之一種特定形式ST6Gai II可自月®及胎組織分離（Krzewinski-Recchi等人，^^./· 扪M/zem·，270: 950-961，2003)。α-2,6-唾液酸基轉移酶較佳為β半乳糖苷α·2,6-唾液酸基轉移酶（Genbank寄存編號： NP_003023.1)，其由 siATl 基因（Genbank 寄存編號： NM_003032)編碼。α_2,6_唾液酸基轉移酶更佳具有由SEQ ID NO: 34表示之胺基酸序列且係由SEq id no: 33所示之聚核苷酸序列編碼。因此，本發明方法可獲得廣泛唾液酸化抗體，其中半乳糖與唾液酸之間的大多數共價鍵係呈α-2,3或α-2,6形式，視斤用轉而疋。尤其有利的是使用過度表現β-1，4 -半乳糖基轉移酶及α_2,6_唾液酸基轉移酶之宿主細胞。因此，由所得抗體權帶之寡醣包含大多數唾液酸殘基經由α·2,6鍵結合於半乳糖殘基。因此’所要宿主細胞可經轉染以短暫或穩定表現此等酶之或兩者。因此，在本發明方法之一特定實施例中，表見β半乳糖基轉移酶及唾液酸基轉移酶活性之細胞株為已 "7l ，兩個編碼卩-半乳糖基轉移酶及唾液酸基轉移酶之載 162091.doc -29· 201241182 體（例如第-載體表現Ρ·半乳糖基轉移酶且第二載體表現唾液酸基轉移酶，或一個載體表現兩種酶）穩定轉染之細胞株較佳地，替齒動物（例如小鼠或大鼠）或人類來源之α· 2,6-唾液酸基轉移酶及/或卜丨，4半乳糖基轉移酶用於添加唾液酸殘基至所表現之抗體上。最佳地，本發明方法中使用之α_2,6·唾液酸基轉移酶及/或⑷·半乳糖基轉移酶為人類酶。在本發明之一特別有利之實施例中，宿主細胞過度表現人類β-1，4·半乳糖基轉移酶與人類α 2,6•唾液酸基轉移酶。編碼β半乳糖基轉移酶及唾液酸基轉移酶之核酸可藉由一般技術者已知之任何方法引入宿主細胞中（參見例如 Sambrook等人，1990,cl〇ning，a Lab〇rat〇ry

Manual，第 2 版 ’ Cold Spring Harbor Laboratory, Cold

Spring Harbor, N.Y.及 Ausubel 等人編，1998，

Protocols in Molecular Biol〇gy，J〇hn WUey & s〇ns，NY中所述之技術）。此等方法包括（不限於）轉染（例如磷酸鈣轉染）、使用例如脂質體進行之膜融合轉移、病毒轉移（用例如腺病毒載體）及顯微注射或電穿孔。根據本發明，多種表現系統可用於表現本發明之IgG抗體。在一個態樣中，此等表現系統不僅表示可製備及隨後純化相關編碼序列所利用之載體，而且表示當用適當核苷酸編碼序列短暫轉染時可原位表現本發明之IgG抗體的細胞0 本發明提供包含本發明聚核苷酸之載體。在一個實施例 162091.doc •30· 201241182 中，載體+有編碼本發明之IgG抗體（亦即在Fc域中攜帶突變之抗體）之聚核苷酸。在另一實施例中，該聚核苷酸編碼本發明之IgG抗體之輕鏈。本發明亦提供包含編碼融合蛋白、經修飾抗體、抗體片段及其探針之聚核苷酸分子之載體。為表現本發明之IgG抗體之重鍵及/或輕鍵，編碼該等重鏈及/或輕鏈之聚核苷酸插入表現載體中以使基因可操作地連接於轉錄及轉譯序列。可操作地連接」之序列包括與相關基因鄰接之表現控制序列與以反式或在一定距離下起控制相關基因之作用之表現控制序列》如本文所用之術語「表現控制序列」係指為貫現其所連接之編碼序列之表現及加工所必需的聚核普酸序列。表現控制序列包括適當轉錄起始、終止、啟動子及增強子序列；高效RNA加工信號，諸如剪接及聚腺苷酸化信號；使細胞質mRNA穩定之序列；增強轉譯效率之序列（亦即Kozak共同序列）；增強蛋白質穩定性之序列；及必要時增強蛋白質分泌之序列。此等控制序列之性質視宿主生物體而不同；在原核生物中，此等控制序列通常包括啟動子、核糖體結♦位點及轉錄終止彳列；纟真核生物中，此等控制序列通常包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列」意欲至少包括因表現及加工而必需存在之；有組分’ ^亦可包括存在具有有利性之其他組分，例如前導序列及融合搭配物序列。其能夠如本文所用，術語「載體」意指一種核酸分子 162091.doc -31 - 201241182 轉運已與其連接之另一核酸。一種類型之載體為「質體」’其係指可連接其他DNA區段之環狀雙股DNA環。另一類型之載體為病毒載體，其中其他DNA區段可連接於病毒基因組中。某些載體能夠在其引入之宿主細胞中自主複製（例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體P其他載體（例如非游離型哺乳動物載體）可在引入宿主細胞中時整合至宿主細胞之基因組中，且藉此連同宿主基因組一起複製。某些載體能夠引導其可操作地連接之基因之表現。此等載體在本文中稱為「重組表現載體」（或簡稱為「表現載體」）。一般而言，適用於重組DNA技術中之表現載體呈質體形式。因為質體為載體之最常用形式，所以在本說明書中’質體」與「載體」可互換使用。然而，本發明意欲包括此等形式之表現載體，諸如細菌質體、YAC、黏質體、反轉錄病毒、EBV源性游離基因體及熟習此項技術者將瞭解會便於確保本發明抗體之重鏈及/或輕鏈之表現的所有其他載體。熟習此項技術者將認識到編碼重鏈及輕鍵之聚核苷酸可選殖入不同載體中或相同載體中。在一個實施例中’該等聚核苷酸選殖入兩個載體中。本發明聚核苦酸及包含此等分子之載體可用於轉型適合宿主細胞。如本文所用，術語「宿主細胞」意指其中已引入重組表現載體以表現本發明之IgG抗體的細胞。應瞭解此等術語不僅意指特定個體細胞，而且亦指該種細胞之子代。因為某些修飾可由於突變或環境影響而在繼代中發 162091.doc -32· 201241182 生’所以此子代實際上可能與母細胞不相同，但仍包括在如本文所用之術語「宿主細胞」之範疇内。轉型可藉由用於將聚核苷酸引入細胞宿主中之任何已知方法來進行。此等方法為熟習此項技術者所熟知且包括葡聚糖介導之轉型、鱗酸約沈澱、凝聚胺（P〇lybrene)介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、將聚核苷酸囊封入脂質體中、基因搶注射及將DNA直接顯微注射入核中。宿主細胞可用兩個或兩個以上表現載體（包括表現本發明蛋白質之載體）共轉染。舉例而言，宿主細胞可用編碼如上所述之IgG抗體之第一載體、及編碼糖基轉移酶多肽之第二載體轉染。或者，宿主細胞可用編碼本發明抗體之第一載體、編碼如上所述之糖基轉移酶之第二載體、及編碼另一糖基轉移酶之第三載體轉型。哺乳動物細胞通常用於表現重組治療性免疫球蛋白，尤其用於表現完整重組 IgG抗體。舉例而言，諸如HEK293或CH〇細胞之哺乳動物細胞連同含有表現信號之載體（諸如攜帶來自人類細胞巨大病毒之主要極早期基因啟動子元件之載體）為表現本發明之IgG抗體之有效系統（F〇ecking等人，1986，^邮 45:101 ; Cockett等人’ 199〇, 8: 2)。此外，選擇以所要特定方式調節插入序列之表現或修飾及加工基因產物之宿主細胞。對蛋白質產物之此等修飾 (例如糖基化）及加工對蛋白質之功能而言可為重要的。不同宿主細胞具有轉譯後加工及修飾蛋白質及基因產物之特徵及特定機制。選擇適當細胞株或宿主系統以確保正確修 I62091.doc •33- 201241182 飾及加工表現之相關抗體。因此，可使用具有用於適當加工初級轉錄物、使基因產物糖基化之細胞機構的真核宿主細胞（且特定言之哺乳動物宿主細胞）。此等哺乳動物宿主細胞包括（但不限於）中國倉鼠細胞（例如CHO細胞）、猴細胞（例如COS細胞）、人類細胞（例如HEK293細胞）、幼小倉鼠細胞（例如BHK細胞）、NS/0、Y2/0、3T3或骨髓瘤細胞 (所有此等細胞株皆可獲自公開寄存處，諸如法國國家微生物菌種保存中心（Collection Nationale des Cultures de Microorganismes，Paris，France)或美國菌種保存中心 (American Type Culture Collection，Manassas, VA，U.S.A)) » 或者’酵母細胞可為已經工程改造以使糖基化（且特定言之葡糖基化）機制與哺乳動物細胞中進行之糖基化機制類似或一致的酵母細胞。穩定表現對於長期高產量製備重組蛋白質而言為較佳。在本發明之一個實施例中，穩定表現抗體之細胞株可經工程改造。因此，在本發明方法之一特定實施例中，表現卜半乳糖基轉移酶及唾液酸基轉移酶活性之細胞株已經一或兩個編碼抗體之載體（例如第一載體表現輕鏈且第二載體表現重鏈，或一個載體表現兩個鏈）穩定轉染。勝於使用含有病毒複製起點之表現載體，宿主細胞用在適當表現調控元件（包括啟動子、增強子、轉錄終止子、聚腺普酸化位點及熟習此項技術者6知之其他適當序列）及可選擇標記控制下之DNA轉型。在引入外源職之後，可使經工程改造細胞在富集培養基中生長—至兩天，且接著移至選擇 162091.doc .34. 201241182 性培養基中。重組質體上之可選擇標記賦予選擇抗性且允許細胞穩定地將質體整合入染色體中且擴增至細胞株中。構築穩定細胞株之其他方法在此項技術中為已知的。特定言之，已開發用於位點特異性整合之方法。根據此等方法，在適當表現調控元件（包括啟動子、增強子、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點及其他適當序列）控制下之經轉型 DNA在先前已裂解之特定目標位點處整合於宿主細胞基因組中（Moele等人，Proc. Natl. Acad· Sci. U.S.A.，104(9): 3055-3060 ； US 5,792,632 ； US 5,830,729 ； US 6,238,924 ； WO 2009/054985 ; WO 03/025183 ; WO 2004/067753) ° 許多選擇系統可根據本發明加以使用，包括（但不限於）單純性疮療病毒（Herpes simplex virus)胸普激酶（Wigler等人，Cell 11:223, 1977)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶 (Szybalska等人，Proc Natl Acad Sci USA 48: 202, 1992)、在甲硫胺酸硫草醯亞胺存在下之麩胺酸合成酶選擇（Adv Drug Del Rev, 58: 671，2006及 Lonza Group Ltd之網站或文獻）及分別於tk、hgprt或aprt細胞中之腺嘌吟墙酸核糖轉移酶（Lowy等人，Cell 22: 817，1980)基因。此外，可採用抗代謝物抗性作為下列選拔下列基因之基礎：dhfr，其賦予對甲胺嗓吟（methotrexate)之抗性（Wigler等人’ Proc Natl Acad Sci USA 77: 357，1980) ; gpt，其賦予對黴紛酸 (mycophenolic acid)之抗性（Mulligan等人，Proc Natl Acad Sci USA 78: 2072，1981) ; neo，其賦予對胺基醣苷 (aminoglycoside)G-418 之抗性（Wu等人，Biotherapy 3: 87, 162091.doc -35- 201241182 1991);及hygro ’其賦予對潮黴素（hygr〇mycin)之抗性 (Santerre等人，Gene 30: 147，1984)。重組⑽八技術之相關技藝中已知之方法可常規應用於選拔所要之重組純系，且此等方法描述於例如Ausubel等人編，Current Pr〇t〇c〇ls in Molecular Biology’ j〇hn Wiley & Sons (1993)中。抗體之表現，量可藉由載體擴增而增加。當表現抗體之載體系統中之標記可擴增時，增加培養物中存在之抑制劑之含量將會增加標記基因之複本數量。因為經擴增區域與編碼本發明之IgG抗體之基因締合，所以該抗體之產量亦將增加 (Crouse等人，Mo/ Ce// 扪〇/ 3: 257，1983)。存在表現本發明基因之替代性方法且其為熟習此項技術者所知。舉例而言，可工程改造能夠結合本發明基因上游之表現調控元件之經修飾辞指蛋白質；該經工程改造鋅指蛋白質（ZFp)在本發明宿主細胞中之表現引起蛋白質產量增加（參見例如 Reik等人，出仙以⑽/. 97(5): 118〇1189, 2〇〇6)。此外’ ZFN(鋅指核酸酶）可刺激dna整合進入預定基因組位置中’從而達成高效率之位點特異性基因加成作用 (Moehle等人，Ad W t/以，104: 3055, 2007)。本發明抗體製法可藉由使經轉型宿主細胞之培養物在為表現所要抗體所必需之培養條件下生長。所得經表現抗體可接著自培養基或細胞提取物純化。可自培養上清液回收可溶形式之本發明抗體。其可接著藉由此項技術中已知之用於純化免疫球蛋白分子之任何方法純化，例如藉由層析 (例如離子交換層析、親和層析（特定言之藉由針對&之蛋 162091.doc • 36 - 201241182 白質A親和層析）等）、離心、差異溶解性或藉由用於純化蛋白質之任何其他標準技術加以純化。一般技術者將顯然了解合適之純化方法。相較於未經修飾及/或未純化抗體，本發明之lgG抗體可基於其唾液酸之增加量而進一步純化。有多種方法可用以達到此目#。在一種方法中，使未純化多肽源(諸如本發明宿主細胞之培養基）通過具有已知會結合唾液酸之凝集素之管柱。一般技術者將瞭解不同凝集素對半乳糖與唾液酸之間的α-2,6鍵與α·2,3鍵顯示不同親和力。因此，選擇特定凝集素將允許富集唾液酸與半乳糖之間具有所要鍵聯類型之抗體。在一個實施例中，凝集素係自歐洲接骨木 (Sambucus nigra)分離。一般技術者將瞭解歐洲接骨木凝集素（SNA)對經α-2·6鍵連接於半乳糖或冰乙醯半乳糖胺之唾液酸具有特異性（Shibuya等人，/·价〇/. CTzem.，262: 1596-1601，1987)。相反，朝鮮槐（Maakia amurensis) (「MAA」）凝集素對經α_2·3鍵連接於半乳糖之唾液酸具有特異性（Wang等人，263: 4576-4585, 1988)。為檢查含有至少一個IgG Fc域之多肽上之糖基化程度，可純化並在還原條件下用SDS-PAGE分析此等多肽。糖基化可藉由使經分離多肽與特定凝集素反應來測定或者如一般技術者所瞭解，可依次使用HPLC及質譜鑑別醣形式 (Wormald等人，的36(6): 1370-1380，1997)。可基本上如先前所述對IgG抗體中之N-聚糖進行定量唾液酸鑑別（N-乙酿神經胺酸殘基）、碳水化合物組成分析及定量寡 162091.doc -37- 201241182 醣定位（Saddic 等人，Mei/zoA 从0/ sw，J94: 23-36, 2002 ; Anumula等人，G/_yc?o6z〇/〇g少，8:685-694，1998)。因此’本發明方法允許以高生產力製備一種抗體，其包含含有兩個唾液酸殘基之複合雙觸角寡醣連接於該抗體之 Fc域。如本文所用之「高生產力」意謂製備該抗體之產量可大於或專於25 mg/L、較佳30 mg/L、更佳35 mg/L、還要更佳40 mg/L、甚至更佳45 mg/L或最佳50 mg/L或50 mg/L以上。本發明亦關於一種經純化之廣泛唾液酸化IgG抗體，其可藉由上述方法獲得。該抗體為IgG同型之抗體’其在各

Fc域上包含複合雙觸角廣泛唾液酸化N_聚糖，該抗體在Fc 域中攜帶突變。較佳地’本發明抗體攜帶G2F形式之寡膽’亦即該抗體之各N-聚糖包含兩個半乳糖殘基及一個海藻糖。更佳地，本發明抗體之該N-聚糖包含兩個唾液酸殘基。甚至更佳地，唾液酸殘基經由α·2,6鍵連接於半乳糖殘基。還要更佳地’唾液酸殘基均為5-Ν-乙醯神經胺酸殘基 (NeuNAc)。較佳地’本發明抗體為特異性結合肽Α-β之原原纖維形式之人類化抗體且因此可用於治療與澱粉樣蛋白斑塊形成相關之疾病。特定言之’本發明之人類化抗體可用於治療 AD。更佳地’該人類化抗體具有降低之效應功能，且從而可減少不良反應。由於該人類化抗體之廣泛唾液酸化，所以其顯示消炎性質。因此’本發明之人類化抗體顯示治療功效與較高安全性之組合。 16209 丨.doc -38· 201241182 本發明者已首次顯示有可能獲得IgG抗體之組合物，其中該等抗體中經廣泛唾液酸化之比例極高（參見例如表3)。因此，本發明亦提供一種包含本發明之IgG抗體之組合物，其中至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、甚至更佳至少95%、還要最佳至少97%或最佳至少99%之該抗體為經純化之廣泛唾液酸化IgG抗體。因此，本發明提供一種包含IgG抗體之組合物，其中至少80%、較佳至少 85°/。、更佳至少90%、甚至更佳至少95%、還要最佳至少 97%或最佳至少99%之該抗體包含複合雙觸角N-聚糖連接該抗體之各Fc域，該寡醣包含兩個唾液酸殘基，其中該抗體之Fc域包含不同於天然人類IgG Fc域序列之胺基酸序列。較佳地，本發明組合物之抗體在胺基酸位置243、264 及265之任一或多處包含胺基酸取代。更佳地，該胺基酸經選自由丙胺酸（A)、甘胺酸（G)、白胺酸（L)及離胺酸（K) 組成之群之胺基酸取代。甚至更佳地，取代選自包含 F243A、V264A、D265A、D265G、D265L及 D265K之群。還要更佳地，該突變係選自由D265A、D265G、D265L及 D265K組成之群。最佳地，該突變係選自由D265A、 D265K及D265L組成之群。實際上，本發明者已有利地顯示位置F243、V264及 D265之一處之突變可獲得展現極均質唾液酸化概況之抗體物質（參見圖12B、C及D)，該等物質經充分表徵及確定（參見表3)。與此不同，不存在此等突變導致產生至少12種含有非唾液酸化或不完全唾液酸化N-聚糖之不同物質之混合 I62091.doc -39- 201241182 物（圖12A)。重要的是注意並非在位置265處之每個突變皆會導致唾液酸化增加。舉例而言，D265S取代在彼方面之表現如同野生型，而D265A、D265G、D265L或D265K突變皆導致二唾液酸化抗體分子之比例增加，由此強調本發明之突變體之特異性（參見實例7)。在一特定實施例中，突變為在位置D265處之突變（例如 D265L、D265K或D265A突變）。實際上，本發明者已驚人地發現此位置處之突變不僅產生廣泛唾液酸化抗體，而且產生對其目標展現增強之結合之抗體（參見實例6及圖 16B)。在另一態樣中，本發明抗體包含序列選自由SEQ ID NO: 48、50、52及54組成之群之重鍵。較佳地，本發明抗體之重鏈選自 SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 52及 SEQ ID NO: 5 4之序列。在另一有利實施例中，本發明組合物之抗體攜帶G2F形式之寡醣，亦即該抗體之各N-聚糖包含兩個半乳糖殘基及一個海藻糖。較佳地，唾液酸殘基經由α-2,6鍵連接於半乳糖殘基。更佳地，唾液酸殘基均為5-Ν-乙醯神經胺酸殘基 (NeuNAc)。長期已知消炎性質係由IVIG之Fc部分決定。在脾巨噬細胞之表面上表現之小鼠凝集素SIGN-Rl(Kang等人，/«/· /mwwwo/·，，15(2): 177-186，2003)為 α-2,6-唾液酸化 Fc 片段之受體，在人類樹突狀細胞上表現之人類凝集素DC- 162091.doc •40· 201241182 SIGN(Anthony 等人，/Voc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(50): 19571-19578，2008)亦如此。α·2,6-唾液酸殘基與該受體之相互作用與該等免疫球蛋白之消炎活性相關。在一有利實施例中，本發明之抗體組合物結合SIGN-R1 或DC-SIGN，由此顯示消炎活性。較佳地，本發明之人類化抗體組合物結合SIGN-R1或DC-SIGN之親和力大於其中小於5%之抗體攜帶至少一個二唾液酸化Ν-聚糖的組合物》「SIGN-R1」在本文中係指蛋白質，其亦稱為「CD209 抗原樣蛋白質A」且具有如NP一573501.1中之胺基酸序列。「DC-SIGN」在本文中意謂具有如AAK20997中之胺基酸序列之蛋白質。更佳地’本發明之人類化抗體組合物所結合之受體為DC-SIGN。

本發明者已顯示根據本發明製備且在其以域中攜帶 D265A突變之抗體對SIGN-K·1顯示最高親和力。因此，根據本發明製備且含有選自由D265A、D265G、D265K及 D265L組成之群之突變的抗體將提供對SIGN-R1之最高親和力。本發明抗體甚至更值具有選自SEQIDN〇:48、SEQ ID NO: 52及SEQ ID NO: 54之序列的重鍵° 因此，本發明亦關於作為藥劑之本發明抗體。本發明之另一目標在於提供一種治療與澱粉樣蛋白斑塊形成相關之疾病之方法’該方法包含向有需要之患者投與 IgG同塑人類化抗體，其在FC域上包含複合雙觸角廣泛唾液酸化N-聚糖，該人類化抗體在FC域中攜帶突變。本發明亦關於一種用於治療與澱粉樣蛋白斑塊形成相關之疾病之 I62091.doc .41- 201241182 I gG同型人類化抗體’該人類化抗體在Fc域上包含複合雙觸角廣泛唾液酸化N-聚糖’且該人類化抗體在卜域中攜帶突變。本發明另外係關於IgG同型人類化抗體用於製造供治療與澱粉樣蛋白斑塊形成相關之疾病之藥劑的用途，該人類化抗體在Fc域上包含複合雙觸角廣泛唾液酸化N—聚糖，且該人類化抗體在Fc域中攜帶突變。在一個實施例中，與澱粉樣蛋白斑塊形成相關之疾病為AD。在另一實施例中’唾液酸殘基係經由α_2,6鍵連接於半乳糖殘基。在另一態樣中，本發明係關於一種用於治療與澱粉樣蛋白斑塊形成相關之疾病，特定言之AD之醫藥組合物，該治療組合物包含治療有效量之本發明之人類化抗體及醫藥學上可接受之載劑。除本發明抗體之外，本發明之醫藥組成物亦可含有各種稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、穩定劑、增溶劑及此項技術中熟知之其他物質。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括在生理學上相容之任何及所有溶劑 '緩衝劑、鹽溶液、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑及其類似物。可根據預定投藥途徑選擇載劑類型。在各種實施例中載劑適於靜脈内、腹膜内、皮下、肌肉内、表面、經 ^或經口投藥。醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或刀散液’及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粕末。介質及藥劑針對醫藥活性物質之使用在此項技術中為熟知的。用於靜脈内輸注之典型醫藥組合物可經配製以 162091.doc •42· 201241182 含有 250 ml無菌林格氏溶液（Ringer，s s〇iuti〇n)&1〇〇 111§組合。熟習此項技術者已知或顯而易知製備可非經腸投與之化合物之實際方法且該等方法更詳細描述於例如 Remington's Pharmaceutical Science,第 17 版，Mack

Publishing Company，Easton, Pa. (1985)及其第 is及第 19版中，該文獻以引用的方式併入本文中。組合物中之人類化抗體較佳以有效量調配。「有效量」係指在必需劑量下且持續必需時期有效達成所要結果（諸如預防或治療澱粉樣蛋白斑塊形成）的量。「治療有效量」意謂足以影響特定疾病狀態之治療過程之量。治療有效量亦為治療有益效應勝過藥劑之任何毒性或有害效應所用的量。對於治療應用’本發明之人類化抗體係以醫藥學上可接受之劑型（諸如上述劑型）投與哺乳動物，較佳為人類，該等劑型包括可以大丸劑形式或藉由一段時期之連續輸注靜脈内、藉由肌肉内、腹膜内、腦脊髓内、皮下、關節内、滑膜内、鞘内、經口、表面或吸入途徑投與人類之劑型。可調整給藥方案以提供最佳反應。舉例而言，可投與單一大丸劑’可隨時間投與若干分次劑量’或可按比例降低或增加劑量。可向個體投與本發明組合物以影響個體中之細胞生長活性。如本文所用，術語「個體音」忍奴包括細胞凋亡可經誘導之活生物體且特定包括哺乳動物，兔、狗、貓、小鼠、大鼠、猴轉殖基因種，且較佳為人類。 ~ I62091.doc 43- 201241182 下述實例僅舉例說明本發明之範疇及本發明之内容。熟習此項技術者可在不脫離本發明之範疇之情況下針對以下所列實例設計及建構眾多修改。實例在下列實例中，取代係指如圖式中提供而非根據EU編號之分泌多肽之胺基酸序列的位置。因此，以EU編號之位置D265對應於抗Ap_13C13_D257A之HC上之D257或抗 Αβ—13C13— IgG4_D260A mAb、抗 Αβ一13C13— IgG4_D260K、抗 Ap_13C13_IgG4_D260L mAb、抗 Αβ_13(：13_ IgG4_D260G mAb、抗 AP_13C13_IgG4_D260S mAb之 HC 上之 D260。類似地，以EU編號之F243A對應於抗AP_13C13_F235A mAb 之HC上之F235A，且以EU編號之V264A對應於抗 AP_13C13_V256A mAb之HC上之 V256。實例1 :過度表現糖基轉移酶時，mAb生產力較低此實例顯示，在糖基轉移酶存在下，單株抗體（mAb)之短暫產量會顯著減小，而編碼此等糖基轉移酶之質體之濃度增加。自純系集合（Invitrogen)取得編碼人類α-2,6唾液酸基轉移酶（SIAT1)之cDNA(SEQ ID No. 33)或編碼人類β-1，4半乳糖基轉移酶（B4GT1)之cDNA(SEQ ID No. 35)且插入表現由 CMV啟動子驅動之哺乳動物表現載體pXL4214中以產生質體PXL4555及pXL455 1。質體圖譜呈現於圖2上，SIAT1及 B4GT1之核酸及相應胺基酸序列分別呈於圖3及圖4上。亦使用相同表現載體選殖編碼鼠類抗Ap_13C3 mAb之輕鏈 162091.doc -44- 201241182 (LC)及重鏈（HC)之 cDNA。質體pXL4808 編碼抗 Αβ_130：13 mAb 之 LC，圖 5A;質體pXL4792 編碼抗 Αβ—13C13 mAb 之 HC，圖5B。LC為鼠類Ck且HC為鼠類IgGl同型。LC及HC mAb變異體之核酸及相應胺基酸序列描述於圖6及圖7上。 (SEQ ID No. 37至 40) 在懸浮培養之293-F細胞（源於人類胚腎HEK 293細胞且購自Invitrogen)中短暫表現抗Ap_13C3 mAb係藉由以不同比率共轉染四個質體PXL4792、pXL4808、pXL455 1及 pXL4555 與 293fectinTM(Invitrogen)之複合物來進行。亦包括編碼 EBNA 之質體，如 Durocher 等人（iVwc/. Λα.， 30: e9, 2002)所報導。根據供應商（Invitrogen)之推薦在100 mL規模下於搖瓶中進行細胞培養及轉染。轉染後8天，對活細胞計數（Vi-CELL XR細胞存活率分析儀（Beckman Coulter))且藉由分析型 HPLC(Poros G/20)耦聯 280 nm之UV 偵測來測定mAb濃度。如表2中所示，當活細胞顯著減少時，mAb產量對應於所收集之細胞。當編碼SIAT1及B4GT1之質體之濃度增加40倍時，活細胞之百分比減小且生產力下降5倍（參見表2)。表2.在糖基轉移酶存在下之mAb生產力編碼質體之比率活細胞產量批次 LC 及 HC SIAT1 B4GT1 Ballast % mg/L LP10081 6 0 0 4 63 54 LP10082 6 0.05 0.05 3.9 60 57 LP10083 6 0.15 0.15 3.7 59 52 LP10084 6 0.5 0.5 3 52 30 LP10085 6 1 1 2 47 17 LP10086 6 2 2 0 43 11 162091.doc -45- 201241182 六批 mAb藉由蛋白質 A(MabSelect，GE，Healthcare)親和層析純化且用100 mM乙酸（pH 2.8)、20 mM NaCl緩衝液自管柱溶離。其於PBS中調配且藉由nanoLC質譜耦聯1^(5-Orbitrap MS加以分析。抗Ap_13C3 mAb之預期質量及N-聚糖之存在展示於圖11上。當糖基轉移酶之表現量增加時，唾液酸化N-聚糖含量提高且複合度更大。實例2 :製備在Fc中具有α-2,6-唾液酸化N-聚糖之mAb變異體。此實例描述藉由小規模短暫表現於哺乳動物細胞HEK 293或CHO中來製備在Fc中具有α-2,6-唾液酸化N-聚糖之 mAb變異體。

相同表現載體用於選殖編碼抗AP_13C3 mAb變異體之 LC及HC之cDNA。產生下列質體且展示於圖5上。質體 pXL4808 編碼抗 Αβ_13(：13 mAb 之 LC，圖 5A ;質體 pXL4792 編碼抗 Αβ_13(：13 mAb 之 HC，圖 5B ;質體 pXL5105編碼抗AP_13C3_D257A之經修飾HC，圖5C;質體PXL5111編碼抗AP_13C3_F235A mAb之經修飾HC，圖 5D ;及質體pXL5132編碼抗Ap_13C3_V256A mAb之經修飾HC，圖5E。LC及HC mAb變異體之核酸及相應胺基酸序列描述於圖6、7、8、9及10上。抗AP_13C3_F235A、抗 Ap_13C3_V256A 及抗 Ap_13C3_D257A mAb 變異體之 HC 之核苷酸序列分別對應於序列SEQ ID NO: 41、43及45。抗 A0_13C3_F235A、抗 Ap_13C3_V256A 及抗 Ap_13C3_D257A mAb變異體之HC之胺基酸序列分別對應於序列SEQ ID 162091.doc -46- 201241182 NO:42、44及46。鼠類IgGl Fc域之位置235、256及257分別對應於使用EU編號之人類IgGl Fc域中之位置243、264 及 265。在懸浮培養之293-F細胞中藉由短暫共表現編碼HC、 LC、SIAT1 及 B4GT1 之四個質體與 293fectinTM(Invitrogen) 之複合物來製備各單株抗體變異體。使質體比率最佳化以確保最佳生產力及唾液酸含量。[HC及LC質體]/[SIAT1質體]/[B4GT1質體]之最佳質體比率為6/0.5/0.5。轉染後八天收集所分泌mAb並離心。mAb藉由蛋白質A(MabSelect， GE，Healthcare)親和層析純化且用100 mM乙酸（pH 2.8)、 20 mM NaCl緩衝液自管柱溶離。其於PBS中調配，經0.22 μηι過濾且在+5°C儲存。藉由在280 nm量測吸光度來測定純化mAb濃度。自150 mL培養物純化總計1.5 mg至1.8 mg mAb。各批料在還原及非還原條件下藉由SDS-PAGE(Nupage Bistris/MOPS-SDS 4-12%，Invitrogen)力口以分析，測定純度超過99%及各次單元及單體之預期分子量。各批料亦藉由凝膠過遽（Tricorn 10/300 GL Superdex 200)加以分析’ 測定99%之單體均質性及小於1.2%之低含量之高分子量物質。質譜分析係在nanoLC耦聯LTQ-Orbitrap MS上進行》其揭示不同mAb及基本上經唾液酸化之N-聚糖的預期質量，其中批次LP10091、10094及LP10097之各變異體在Fc 域中含有點突變（參見圖12及表3)。開發兩個酶聯凝集素分析（ELLA)以用朝鮮槐（MAA)凝集 ll62091.doc •47- 201241182 素偵測N-聚糖中之末端α-2,3唾液酸或用歐洲接骨木（SNa) 凝集素偵測N-聚糖中之末端α-2,6唾液酸。如圖13所示，未發現與MAΑ具有反應性，而觀測到與SNa具有特異性且當唾液酸化N-聚糖含量較高時，反應性較高（參見批次 LP10091 、 LP10094及LP10097)。表3.在Fc中具有α-2,6-唾液酸聚糖imAb變異體之特徵質體 mAb 質譜相對; 之反肩、以下 t性突變批次 LC 及 HC 純化 (mg) 質量(Da) 具有呈以下形式之N-聚糖之mAb的理論質量 MAA α-2,3 SNA α-2,6 野生型 LP10088 pXL4808 pXL4792 1.6 147534(主要） 149347(次要） G0F/G0F G2F/G2F + 4 NeuNAc +至少10種具有0至3個 NeuNAc之其他物質無中等 V256A LP10091 PXL4808 PXL5132 1.7 149290(主要） 14卯01(次要） G2F/G2F + 4 NeuNAc G2F/G2F + 3 NeuNAc 無高 D257A LP10094 PXL4808 PXL5105 1.8 149258(主要） 148970(次要） G2F/G2F + 4 NeuNAc G2F/G2F + 3 NeuNAc 無高 F235A LP10097 pXL4808 PXL5111 1.5 149194(主要） 148906(次要） G2F/G2F + 4 NeuNAc G2F/G2F + 3 NeuNAc 無高總之，此等結果表明，當藉由在編碼B4GT1及SIAT1之質體存在下於HEK293細胞中短暫表現來製備經工程改造而在Fc中具有三個點突變（V256A、D257A、F235A)之一之 mAb變異體時，N-聚糖基本上由α-2,6-唾液酸化形式組成。更詳言之，存在V256A、D257A或F235A可獲得展現極均質唾液酸化概況之抗體物質（參見圖1 2B、C及D) ’該等物質經充分表徵及確定（參見表3)。相較於其他峰實際上佔優勢之主峰對應於完全唾液酸化（四個唾液酸殘基）物質。與此不同，B4GT1及SIAT1與野生型mAb—起過度表 162091.doc • 48- 201241182 現導致產生至少12種含有非唾液酸化或不完全唾液酸化N-聚糖之不同物質之混合物（圖12 A)。亦在懸浮培養之CHO細胞中藉由以HEK293中所用之最佳質體比率短暫共表現編碼HC pXL5105、LC pXL4808、 SIAT1 pXL4555及B4GT1 pXL4551之四個質體來製備抗 Ap_13C3_D257A mAb變異體。用CHO及HEK293中所製備之批料、藉由ELLA分析來偵測α-2,6唾液酸之類似含量，參見圖14。實例3:大規模製備Fc中具有α-2,6-唾液酸化Ν-聚糖之mAb 變異體。此實例描述藉由在哺乳動物細胞中大規模短暫共表現 SIAT1及B4GT1來製備Fc中具有α-2,6-唾液酸化N-聚糖之抗 Ap_13C3_D257A mAb。此mAb之表徵及結合特異性與在不共表現SIAT1及B4GT1而製備之抗Ap_13C3_D257A mAb進行比較。在10 L波式生物反應器（Wave Bioreactor)中，在懸浮培養之293-F細胞中藉由使用實例1中所用之最佳質體比率短暫共表現編碼 HC(pXL5105)、LC(pXL4808)、SIATl(pXL4555) 及B4GTl(pXL4551)之四個質體與293fectin™之複合物來製備抗A0_13C3_D257A mAb變異體》轉染後8天收集批料且命名為LP10104。命名為LP10116之另一批料亦在10 L波式生物反應器中於懸浮培養之293-F細胞中藉由短暫共表現編碼HC(pXL5105)及LC(pXL4808)之質體來製備。兩批料均如實例1中所述加以純化及表徵。兩批料LP10104及 162091.doc -49- 201241182 LP10116之表徵概述於表5中。亦基本上如先前所述對mAb中之N-聚糖進行定量唾液酸鑑別、碳水化合物組成分析及定量寡醣定位（Saddic等人， Methods Mol. Biol., 194: 23-36, 2002 ; Anumula 等人， 8: 685-694，1998)。首先，mAb輕度水解之後釋放唾液酸殘基且用鄰苯二胺進行螢光標記並藉由逆相 HPLC分離。個別峰藉由螢光偵測（激發，230 nm ;發射， 425 nm)加以偵測，藉由與N-乙醯神經胺酸（NeuNAc)及N-羥乙醢神經胺酸（NeuNGc)標準物進行比較加以鑑別並定量。其次，在酸水解mAb樣品而釋放個別單醣之後測定碳水化合物組成。在水解之後，單醣（中性及胺基糖）用鄰胺基苯曱酸衍生化且接著藉由逆相HPLC分離並藉由螢光偵測（激發，360 nm ;發射，425 nm)加以^貞測。個別峰藉由與單醣標準物進行比較加以鑑別並定量。第三，用PNGase F酶促釋放募醣且用鄰胺基苯曱酸進行螢光標記，隨後根據其唾液酸殘基數目藉由正相陰離子交換HPLC於 Asahipak-NH2P(Phenomenex)管柱上分離。藉由榮光摘測 (激發，360 nm ;發射，425 nm)對經標記之聚糖進行偵測並定量。分析資料報導於表4上。表4.關於批次LP10104及LP10116之N·聚糖之分析含量批次唾液酸(SA) 單醣聚糖定位 mol/mol蛋白質//% 數目/聚糖糖數目/3個甘露糖 NeuNAc NeuGc SA GlcN Gal Fuc 0SA ISA 2SA 3SA LP10104 1.5//100% 未測出 1.5 4.37 2.04 1.04 17 18.5 54 0.5 LP10116 0.13//100% 未測出 0.13 4.87 1.02 1.12 87 11 2 0 162091.doc •50· 201241182 表5.較大批次LP10104之在Fc中具有α-2,6唾液酸化N-聚糖之抗Ap_13C3_D257AmAb變異體的特徵。製備、純化表徵過程 LP10104 LP10116 短暫表現於 HEK293 10L-分批 ΗΕΚ293 10L-分批共轉染編碼SIAT1及B4G 丁糖基轉移酶之質體無純化步驟蛋白質A親和蛋白質Α親和 CHT第I型調配 PBS PBS 濃度(mg/mL) 4.01 4.65 純化量(mg) 169 669 根據質譜之質量(Da) 149258 147445 根據質譜之聚糖分析結果 G2F/G2F+ 4 NeuNAc G0F/G0F 對凝集素(SNA及MAA)之親和力對α-2,6唾液酸具有特異性未偵測到親和力根據分析HPLC之定量唾液酸鑑別結果每個聚糖具有1.5個以上唾液酸基約90% mAb具有至少一個二唾液酸化Ν-聚糖主要為雙觸角-α2,6二唾液酸基N-聚糖未偵測到Ν·羥乙醯神經胺酸小於5% mAb具有至少一個二唾液酸化N-聚糖根據SDS-PAGE之純度 99% 99% 聚集體％ 0.2% 未測出内毒素(Endotoxin)含量 (LAL)EU/mg 0.07 0.04 無菌性測試符合符合此實例中呈現之總體資料顯示可製備品質達到治療用途之要求且具有極高含量之α-2,6唾液酸化N-聚糖Fc的數百毫克抗Αβ mAb。此mAb已在下列實例中命名為α-2,6唾液酸化抗Ap_13C3_D257A » 實例4 : α-2,6唾液酸化抗Ap_13C3_D257A對其配位體之親和力在此實例中’分析抗Ap_13C3_D257A對Αβ原原纖維之 162091.doc -51 - 201241182 親和力，因為原始抗Ap_13C3 mAb特異性結合此配位體》原原纖維為澱粉樣蛋白β肽Αβ 1-42肽經自身聚集而產生之可溶性桿樣結構。其係藉由將合成人類Αβ 1-42肽溶解於 10 mM NaOH中且在37°C下於NaCl/磷酸鹽緩衝液中培育16 小時來獲得，如先前所公佈（Johansson等人， •7o«r«a/，273: 2618-30, 2006)。藉由尺寸排阻層析使分子量高於200 kDa之原原纖維與分子量約11 kDa之低分子量形式分離。藉由ELISA分析親和力，將原原纖維塗佈於96孔盤上，塗覆一系列濃度之抗體且用抗Fc單株抗體偶合過氧化酶進行偵測。量測Αβ原原纖維對α-2,6唾液酸化抗Ap_13C3_D257A之親和力，其中EC5〇為0.(M15 mg/L，類似於用原始抗 Αβ_1303及低唾液酸化抗AP_13C3_D257A獲得之EC5Q，如表6所述。因此，歸因於α-2,6唾液酸化N-聚糖Fc之修飾不干擾 mAb/配體親和力。表6· α-2,6唾液酸化抗Ap_13C3_D257A對Αβ原原纖維之親和力 mAb 批次唾液酸含量針對 PF 之 EC5G(mg/L) 抗 Ap_13C3 LP09009 低 3.84E-02 抗 Ap_13C3_D257A LP10104 極高 4.15E-02 抗 Ap_13C3一D257A LP10116 低 3.70E-02 實例5 : α-2,6唾液酸化抗AP_13C3_D257A對FcY受體之親和力實例3中所述之α-2,6唾液酸化抗A0_13C3_D257A mAb已 162091.doc •52· 201241182 藉由使Fc域中存在廣泛唾液酸化N-聚糖而經顯著修飾。此修飾可干擾Fc結合於經描述在此域中結合之FcY受體及C 1 q 組分（Shields 等人 J. Biol. Chem., 276: 6591-6604, 2001 ； Mershon 等人，第 373-382 頁，「TTzerizpewiz’i； powoc/ona/ antibodies : from bench to clinic j ， Zh'iqiang An編，2009, John Wiley & Sons, Inc” Hoboken, NJ，USA)。因此，相較於具有Fc介導之強效應功能之鼠類IgG2a單株抗體 (LP09078)，測定α-2,6唾液酸化抗Ap_13C3_D257A對鼠類蛋白質FcyR及Clq之親和力。使用Biacore 3000儀器’用表面電漿子共振技術（SPR)測定α-2,6唾液酸化抗AP_13C3_D257A對重組鼠類Fc7R(自 R&D Systems獲得）之親和力。用BiaEvaluation軟體分析親和力資料。對於解離快速之低親和力，用穩態分析測定親和力參數，或對於解離緩慢之高親和力，用適當模型進行整體擬合來測定親和力參數。藉由ELISA量測α-2,6唾液酸化抗A0_13C3_D257A對重組 Clq之親和力。將Calbiochem之重組Clq(參考號204876)塗佈於96孔盤上’塗覆一系列濃度之抗體且用抗以單株抗體偶合過氧化酶進行偵測。表7中指示之結果顯示在α_2,6唾液酸化Ν-聚糖Fc不存在及存在下，抗Ap_i3C3_D257A對 FcyR及Clq之親和力極低。歸因於α-2,6唾液酸化N-聚糖Fc之修飾不干擾mAb對Fey 受體之親和力’亦不干擾m Ab對C1 q組分之親和力。因此，就此α-2,6唾液酸化抗Αβ 一 13C3JD257A而言，嚙合免 162091.doc -53· 201241182 疫效應細胞或補體級聯之能力將極低。表7 : α-2,6唾液酸化抗Ap_13C3_D257A對Fey受體及Clq組分之親和力。 mAb之特微 W受體(KD) Clq組分 (EC50 . me/Li 名稱批次唾液酸含量 FeyRI FcyRIIb FcyRIII FcyRIV ci^ 抗 Αβ 13C3 LP09009 低無結合 354 nM 471 ηΜ 無結合無結合抗 AP_13C3_D257A LP10104 極高無結合 > 4 μΜ >2.3 μΜ 無結合無結合抗 Ap_13C3_D257A LP10116 低無結合 >5.3 μΜ > 1.9 μΜ 無結合無結合抗 Αβ一 13C3_mIgG2a LP09078 低 15.2 nM 704 ηΜ 349 ηΜ 14.3 nM 26.9 實例6 : α-2,6唾液酸化抗Ap_13C3_D257A對SIGN-R1之親和力已假設α-2,6唾液酸化Fc嚙合SIGN-R1，其為一種誘導細胞程式、從而分泌靶向效應巨噬細胞之消炎可溶性介體的凝集素（Anthony等人，iVai/ dead C/U·，105: 19571-195 78，2008)。因此，在此實例中，分析a-2,6唾液酸化抗A0_13C3_D257A對SIGN-R1之親和力。藉由ELISA分析親和力：將自R&D Systems獲得之SIGN-Rl::Fc塗佈於96孔盤上，塗覆一系列濃度之抗體且用抗鼠類Ck單株抗體偶合過氧化酶進行偵測。圖15上呈現之結果指示α·2,6唾液酸化抗Ap_13C3_D257A(批次LP10104)對 SIGN-R1的反應性大於抗AP_13C3_D257A(批次 LP10116)。用自表現SIAT6之細胞株獲得之抗Ap_13C3_D257A mAb(實例7，批次VA1_1 1033)重複實驗來確認SIGN-R1結合對<x-2,6鍵具有特異性。此mAb含有混合a-2,6/a-2,3唾液 162091.doc • 54· 201241182 酸化N-聚糖（參見圖26)且在表現B4GT1及SIAT1之細胞株中所產生、從而攜帶募醣之mAb(其中大多數唾液酸基殘基經cx-2,6鍵連接於半乳糖）（參見圖26)與在不表現任何其他糖基轉移酶之細胞株中所產生之mAb(圖16A)之間產生中等程度的SIGN-R1結合。因此，α-2,6唾液酸化N-聚糖Fc涉及mAb與SIGN-R1之反應性。最後，研究與SIGN-R1之結合是否受α-2,6唾液酸化抗 A0_13C3之CH2域中之突變位置（235處之F、256處之V或 D257)影響。如圖16B所示，在彼位置257處取代導致結合大大增強。因此，位置257處之突變特別較佳，因為其不僅產生完全唾液酸化抗體，而且產生與其目標之結合增強之抗體。實例7:獲得及表徵α-2,6唾液酸化人類化抗 Αβ 一 13C3一IgG4_D260X(X = A、D、K、S、N、L、G) 此實例提供一種製備具有人類IgG4同型且在Fc中在以 EU命名法之位置265處含有點突變之α-2,6唾液酸化mAb的方法。對於抗A0_13C3_IgG4中之相應位置而言，其對應於位置260處之天冬胺酸，其中殘基係自分泌mAb重鏈之首個殘基開始編號。為驗證本發明方法可應用於人類化或人類抗體，藉由 PCR在人類化抗Αβ 13C3 mAb之IgG4 Fc域之位置D260處插入6個不同取代。引入之胺基酸為A、D、K、S、N、L或 G。所得各突變抗體皆於HEK293中藉由短暫表現而製備且 162091.doc -55- 201241182 分析其唾液酸含量及其結合SNA凝集素之能力。質體PXL4973編碼融合於人類Ck域之人類化VL1域（圖 17A)，而質體pXL4979編碼融合於抗A0_13C13_IgG4 mAb 之人類IgG4恆定域之人類化VH1 (圖A2)。使用相同表現載體選殖編碼抗AP_13C3_D260X mAb變異體之人類化LC及HC之cDNA。藉由在IgG4域中進行點突變而自PXL4979獲得質體5227 至 5232。質體 pXL5227 編碼抗 Ap_13C3_IgG4_D260A之經修飾HC，質體pXL5228編碼抗Ap_13C3_IgG4_D260K mAb之經修飾 HC，質體 pXL5229 編碼抗 Ap_13C3_IgG4_D260L mAb 之經修飾 HC，質體 pXL5230 編碼抗 Ap_13C3_IgG4_D260G mAb之經修飾 HC，質體pXL5232編碼抗 Ap_13C3_IgG4_D260S mAb之經修飾HC。LC及HC mAb變異體之核酸及相應胺基酸序列描述於圖20至24上。在懸浮培養之293-F細胞中藉由短暫共表現編碼HC、 LC、SIAT1 及 B4GT1 之四個質體與 293fectin™(Invitrogen) 之複合物來製備各單株抗體變異體。使質體比率最佳化以確保最佳生產力及唾液酸含量。[HC及LC質體]/[SIAT1質體]/[B4GT1質體]之最佳質體比率為6/0.5/0.5。以在轉染後八天收集39至43 mg/L範圍内之生產力產生所分泌mAb，且離心。mAb藉由蛋白質A(MabSelect，GE， Healthcare)親和層析純化且用100 mM乙酸（pH 2.8)、20 mM NaCl緩衝液自管柱溶離。其於PBS中調配，經0.22 μηι 過濾且在+5°C儲存。藉由在280 nm量測吸光度來測定純化 162091.doc -56- 201241182 mAb濃度。自5 0 0 mL培養物純化約10 -11 mg mAb"在還原及非還原條件下藉由 SDS-PAGE(Nupage Bistris/MOPS-SDS 4-12%， Invitrogen)分析各批料以測定純度超過97%及各次單元及單體之預期分子量。亦藉由凝膠過濾（Tricorn 10/300 GL Superdex 200)分析各批料以測定單體之均質性及小於10% 之高分子量物質之含量。於nanoLC耦聯LTQ-Orbitrap MS上進行質譜分析。其揭示所有批次之不同mAb之預期質量。此外，就下列批次 (VA1_11053至VA1_11056)而言，N-聚糖基本上經唾液酸化。此等批次分別對應於在Fc域中含有使用EU命名法之下列點突變之變異體：D265G、D265L、D265K及 D265A(參見圖25及表8)。開發兩個酶聯凝集素分析（ELLA)以用朝鮮槐（MAA)凝集素偵測N-聚糖中之末端α-2,3唾液酸或用歐洲接骨木（SNA) 凝集素偵測N-聚糖中之末端α-2,6唾液酸。亦包括含有α-2,3及α-2,6唾液酸化抗A0_13C3_D257A之對照批次 (VA1_11033)。其由編碼 HC、LC、SIAT6 及B4GT1之四個質體 pXL5105、pXL4808、pXL4544及 pXL4551 共表現而製備且如上加以純化。如圖26所示，未發現MAA與批次VA1_11051至 VA1_1 1056具有反應性，而觀測到與SNA具有特異性且當唾液酸化N-聚糖含量較高時，反應性較高。各批次及Fc中之點突變之等級如下：VA1_11054〜VA1_11056〜VAl_ll〇55 162091.doc -57- 201241182 >VA1_11053»VA1_11052~VA1_11051 ;對於點突變，此轉換如下：L〜A〜K>G>>S〜D。此等級與各種突變體之N-聚糖之唾液酸含量相關。表8 :在Fc中具有α-2,6-唾液酸化N-聚糖之mAb變異體之特徵質體 mAb 質譜與以下之反應性突變 (在抗體上之位置）批次 LC 及 HC 純化 (mg) 質量 (Da) 具有呈以下形式之N-聚糖之mAb 的理論質量 MAA α-2,3 SNA α-2,6 野生型 VA1J1051 PXL4973 PXL4979 11.2 49650 50103 50266 50557 G0F G1F+1 NeuNAc G2F+1 NeuNAc G2F + 2 NeuNAc 無中等 D260S VA1_11052 pXL4973 PXL5232 10.0 49622 50076 50238 50529 GOF GIF + 1 NeuNAc G2F + 1 NeuNAc G2F + 2 NeuNAc 無中等 D260G VA1_11053 PXL4973 PXL5230 11.0 50499 (主要） 49593 (次要） G2F + 2 NeuNAc GOF 無尚 D260L VA1J1054 PXL4973 PXL5229 10.0 50555 G2F + 2 NeuNAc 無高 D260K VA1一11055 PXL4973 pXL5228 10.8 50569 (主要） 49664 (次要） G2F + 2 NeuNAc GOF 無高 D260A VA1J1056 pXL4973 PXL5227 10.2 50510 (主要） 49606 (次要） G2F + 2 NeuNAc GOF 無高總之，D265A、D265G、D265L及D265K突變皆導致二唾液酸化抗體分子之比例增加》【圖式簡單說明】 N-聚糖圖1.兩種Ν·聚糖G0F及G2F+2 NeuNAc之結構。 162091.doc • 58 - 201241182 之單醣組成係使用各種單醣（亦即海藻糖、N-乙醯葡糖胺、甘露糖、半乳糖及N-乙醯神經胺酸）之標準象形圖呈現。圖2.分別編碼SIAT1及B4GT1之表現質體pXL4555(圖 2A)及pXL4551(圖2B)之圖譜。圖3.用於自表現質體PXL4555表現之SIAT1之核酸序列 (SEQ ID Νο·33)(圖 3A)及胺基酸序列（SEQ ID No. 34)(圖 3B)。圖4A及4B.用於自表現質體pXL4551表現之B4GT1之核酸序列（SEQ ID No.35)(圖4A)及胺基酸序列（SEQ ID No. 36)(圖 4B)。圖5.以下表現質體之圖譜：編碼抗Ap_13C13 mAb之輕鏈（LC)之 pXL4808(圖 5A);編碼抗 Αβ_13(：13 mAb 之重鏈 (HC)之 pXL4792(圖 5B);編碼抗 Ap_13C3_D257A 之經修飾 HC之pXL5105(圖 5C);編碼抗A0_13C3_F235A mAb之經修飾 HC 之 pXL5111(圊 5D);及編碼抗 AP_13C3_V256A mAb 之經修飾1^之？乂1^5132(圖5£)。圖6·用於自表現質體PXL4808表現之LC抗Αβ一13C13 mAb之核酸序列（SEQ ID Νο.39)(圖6Α)及胺基酸序列（SEQ ID No. 4〇)(圖 6Β)。圖7.用於自表現質體pXL4792表現之HC抗Αβ_】.3(：13 mAb之核酸序列（SEQ ID Νο·37)(圖7Α)及胺基酸序列（SEQ ID No. 38)(圖 7B) 0

圖8.用於自表現質體PXL5105表現之HC抗AP_13C13_D257A 162091.doc •59· 201241182 mAb之核酸序列（SEQ ID No. 45)(圖8A)及胺基酸序列（SEQ ID No. 46)(® SB) > 圖9·用於自表現質體pXL5111表現之HC抗 Αβ 13C13一F235A mAb之核酸序列（SEQ ID No. 41)(圖 9A) 及胺基酸序列（SEQ ID No. 42)(圖9B)。圓10.用於自表現質體PXL5132表現之HC抗 Ap_13Cl3—V256A mAb之核酸序列（SEQ ID No. 43)(圖 10A) 及胺基酸序列（SEQ ID No. 44)(圖l〇B)。圖11.在不同糖基轉移酶表現量下製備之抗AP_13C3 mAb之質譜資料。囷nA，批次LP10081 ;圖11B ’批次 LP10082 ;圖 11C ’ 批次LP10084 ;圖 11D ’ 批次LP10086。圖12.唾液酸化mAb之質譜資料。圖12A，抗 Ap_13C3(批次LP10088)之質譜；圖12B ，抗

Ap_13C3_V256A(批次 LP10091)之質譜；囷 12C，抗 Ap_13C3一D257A(批次 LP10094)之質譜；圖 12D，抗 A0_13C3_F235A(批次 LP10097)之質譜；圖 12E，圖 12A 之放大。圖 13.抗 Ap_13C3 mAb 變異體（批次 LP10088、 LP10091、LP10094、LP10097)與分另 ij 對 N-聚糖中之 α-2,3 及α-2,6唾液酸具有特異性之凝集素ΜΑΑ(圓13Α)及SNA(圖 13B)的反應性》圓14·在糖基轉移酶SIAT1及B4GT1存在下於CHO中製備之抗Αβ_13〇3—D257A mAb與凝集素MAA(圖14A)及 SNA(囷14B)之反應性。 162091.doc •60- 201241182 圖 15. α-2,6唾液酸化抗 Ap_13C3_D257A與 SIGN-R1 之反應性。SIGN-R1 :Fc 之 ELISA(塗層：SIGN-Rl:Fc [R&D Systems];二次抗體：抗mK-HRP)。圖16. 16A，唾液酸化抗Ap_13C3變異體與SIGN-R1之反應性。SIGN-R1 :Fc 之 ELISA(塗層：SIGN-Rl:Fc [R&D Systems];二次抗體：抗 mK-HRP)。抗 Ap_13C3 及抗 AP_13C3—D257A(批次 VA111018、VA111019、VA111026、乂八111027及乂八111033)在無或有84〇1'1及81八丁1或81八丁6糖基轉移酶下製備；16B : α·2,6唾液酸化抗Αβ_13〇3變異體與 SIGN-R1之反應性。SIGN-Rl:Fc 之 ELISA(塗層：SIGN-Rl:Fc [R&D Systems];二次抗體：抗 mK-HRP)。抗 Αβ_1303 、抗 A0_13C3_D257A、抗 Ap_F235A 及抗 Αβ_ν256Α mAb 變異體（批次 VA111018 至 VA111029)在無或有B4GT1及SIAT1糖基轉移酶下製備。圖17· 以下表現質體之圖譜：編碼人類化抗 Ap_13C13_IgG4_D260X mAb之輕鏈（LC)之pXL4973，其中 X=A、K、L、G或S(圖17A);及編碼人類化抗 Ap_13C13_IgG4 mAb之重鏈（HC)之 pXL4979(圖 17B)。圖18·人類化抗Ap_13C13_D260X mAb之LC之核酸序列 (SEQ ID No: 3)及胺基酸序列（SEQ ID No. 4)。圖19.人類化抗Ap_13C13_IgG4 mAb之HC之核酸序列 (SEQ ID No: 1)及胺基酸序列（SEQ ID No: 2)。圖 20·人類化抗AP_13C13— IgG4_D260A mAb之HC之核酸序列（SEQ ID No: 47)及胺基酸序列（SEQ ID No: 48)。 -61 · I62091.doc I? 201241182 圖 21.人類化抗 AP_13C13_IgG4_D260K mAb 之 HC 之核酸序列（SEQ ID No: 53)及胺基酸序列（SEQ ID No: 54)。圖 22.人類化抗 Ap_13C13_IgG4_D260L mAb之 HC之核酸序列（SEQ ID No: 51)及胺基酸序列（SEQ ID No: 52)。圖 23.人類化抗 Αβ_13(：13_ IgG4_D260G mAb 之 HC 之核酸序列（SEQ ID No: 49)及胺基酸序列（SEQ ID No: 50)。圖24.用於表現之人類化抗AP_13C13_IgG4_D260S mAb 之HC的核酸序列（SEQ ID No: 55)及胺基酸序列（SEQ ID No: 56) 〇圖25. 唾液酸化mAb之質譜資料。圖25A，抗 AP_13C3_IgG4(批次 VA1-11051)之質譜；圖 25B，抗 A0_13C3_D26OS(批次 VA1-11052)之質譜；圖 25C，抗 AP_13C3_ D260G(批次 VA1-11053)之質譜；圖 25D，抗 A0_13C3_D26OL(批次 VA1-11054)之質譜；圖 25E，抗 Ap_13C3_D260K(批次 VA1-11055)之質譜；圖 25F，抗 AP_13C3_D260A(批次 VA1 -11056)之質譜。圖26.抗Ap_13C3_IgG4_D260X mAb變異體（多批次）與分別對N-聚糖中之α-2,3及α-2,6唾液酸具有特異性之凝集素ΜΑΑ(圖26Α)及SNA(圖26Β)之反應性。空心菱形：抗 Ap_13C3_IgG4(批次 VA1-11051);實心菱形：抗 AP_13C3_D260S(批次 VA1-11052)；空心圓圈：抗 AP_13C3_D260G(批次 VA1-11053);空心三角：抗 Ap_13C3_D260L(批次 VA1-11054);空心正方形：抗 AP_13C3一D260K(批次 VA1-11055);實心三角：抗 162091.doc -62- 201241182 A0_13C3_D26OA(批次 VA1-1 1056);實線：在 B4GT1 及 SIAT1糖基轉移酶下製備之抗AP_13C3_D257A(批次LP 10104);點線：在B4GT1及SIAT6糖基轉移酶下製備之抗 AP_13C3_D257A(批次VA-111033)。點線+小實心圓圈：抗 Ap_13C3_D257A(批次LP 10106)。圖27.來自人類及鼠類同型之IgG恆定域之序列比對。

• F243、V264及D265之位置用框突出顯示。hIgGl(SEQ ID NO: 57)對應於如SwissProt條目第IGHG1_HUMAN號中所述之人類IgGl之恆定域。hIgG2(SEQ ID NO: 58)對應於人類IgG2之恆定域。hIgG4(SEQ ID NO: 59)對應於如 SwissProt條目第IGHG4_HUMAN號中所述之人類IgG4之十互定域。hIgG4-PE(SEQ ID NO: 60)對應於人類IgG4之恆定域，其中位置228之絲胺酸取代為脯胺酸且位置235之白胺酸取代為麩胺酸。mIgGl(SEQ ID NO: 61)對應於自BALBc 小鼠所產生之融合瘤分離之小鼠IgGl的恆定域。 mIgG2a(SEQ ID NO: 62)對應於小鼠IgG2a之恆定域。 mIgG3(SEQ ID NO: 63)對應於小鼠IgG3之恆定域。 162091.doc •63- 201241182 序列表 <110>法商賽锘菲公司

<120>唾液酸化(SIALYLATED)抗體之製備方法 <130：> FR2011-001 PCT <140:> 101106076 <141> 2012-02-23 <150:> 11305200.5; 11306090.9 <151> 2011-02-24; 2011-09-01 <160> 63 <170> Patentln version 3.3 ’· <210> 1 <211> 1326 <212> m . <213>人工 <220>

<223> 人類化抗A p_13C13_IgG4 mAb之HC <220> <221> CDS <222> (1)..(1326) <400> 1 gag gtc cag ctg cag cag tct ggg cct gag gtg gt£ aag cot ggg gtc

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Val 15 10 15 tea g：tg aag att tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat

Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 get atg cac tgg gtg aag cag agt cct ggc aag agt ctg gag tgg att

Ala Met His Trp Val Lys Gin Ser Pro Gly Lys Set Leu Glu Trp lie 35 40 45 gga gtt att agt act aag tat ggt aag aca aac tac aac ccc age ttt

Gly Val He Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe 50 55 60 cag j>gc cag gcc aca atg act gtt gac aaa tcc tcc age aca gcc tat

Gin Gly Gin Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Scr Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ett gcc age ttg aag gcc tcc gat tct gcc ate tat tac tgt

Met Glu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala lie Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggg gac gat ggt tat tcc tgg ggt caa gga acc tea gtc acc

Ala Arg Gly Asp Asp Gly Tyr Ser Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 gtc tcc age get tct acc aag ggc cct tcc gtg ttc cct ctg gcc cct

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 tgc tcc egg tcc acc tcc gag tcc acc gcc get ctg ggc tgc ctg gtg

Cys Scr Arg Ser Thr Scr Glu Scr Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 aag gac tac ttc cct gag cct gtg acc gtg tcc tgg aac tct ggc gcc

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 ctg acc tcc ggc gtg cac acc ttc cct gcc gtg ctg cag tcc tcc ggc

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly 165 170 175 ctg tac tcc ctg tcc tcc gtg gtg acc gtg cct tcc tcc tcc ctg ggc

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 acc aag acc tac acc tgt aac gtg gac cac aag cct tcc aac acc aag 162091·序列表.doc 5 672 201241182

Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 gts gac aag egg gtg gag tee aag tac ggc cct cct tgc cct ccc tgc

Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220 cct gee cct gag ttc gag ggc gga cct age gtg ttc ctg ttc cct cct

Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 aag cct aag gac acc ctg atg ate tee egg acc cct gag gtg acc tgt

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 gtg gtg gtg gac gtg tee cag gag gac cct gag gtc cag ttc aac tgg

Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp 260 265 270 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cac aac sec aag acc aag cct egg gag

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 gag cag ttc aat tee acc tac egg gtg gtg tet gtg ctg acc gtg ctg

Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 cac ca^ gac tgg ctg aac ggc aaa gaa tac aag tgt aag gtc tee aac

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 aag ggc ctg ccc tee tee ate gag aaa acc ate tee aag gee aag ggc

Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 cag cct agg gag cct cag gtg tac acc ctg cct cct age cag gaa gag

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu 340 345 350 atg acc aag aac cag gtg tee ctg acc tgt ctg gtg aag ggc ttc tac

Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 cct tee gac ate gee gtg gag tgg gag tee aac ggc cag cct gag aac

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 370 375 380 aac tac aag acc acc cct cct gtg cts gac tee gac ggc tee ttc ttc

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 ctg tac tee agg ctg acc gtg gac aag tee egg tgg cag gag ggc aac

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn 405 410 415 gtc ttt tee tgc tee gtg atg cac gag gee ctg cac aac cac tac acc

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 cag aag tee ctg tee ctg tet ctg ggc tga

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 2 <211> 441 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成搆築體 <400> 2

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Val 162091·序列表.doc -2- 720 768 816 864 912 960 1008 1056 1104 1152 1200 1248 1296 1326 201241182 1 5 10 15

Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Gin Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Val He Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 M；et Glu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala lie Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Asp Asp Gly Tyr Ser Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125

Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly 165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val TTir Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190

Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205

Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220

Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp 260 265 270

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285

Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 16209卜序列表.doc 201241182

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320

Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu 340 345 350

Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn 405 410 415

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 3 <211> 660 <212> DNA <213>人工 <220> <223> 人類化抗 A3_13C13_D260XmAb 之 LC <220>

<221> C3)S <222> (1)..(660) <400> 3 gag ate gtg atg acc caa act cca etc tcc ctg cct gtc agt ett gga

Glu lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15 gat aga £cc tcc ate tet tgc aga tet ggt cag age ett gtg cac agt

Asp Arg Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Gly Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30 aat gga aac acc tat ctg cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tet

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 cca aag etc ctg ate tat aca gtt tcc aac ega ttt tet ggg gtc ccg

Pro Lys Leu Leu He Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tea ggg tea gat ttc aca etc acc ate

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75 80 age aga gig gag get gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tet caa aat

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Asn 85 90 95 aca ttt gtt cct tgg aeg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ate aaa 16209丨·序列表.doc 384 201241182

Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 cgt acg gtg get gca cca tet gtc ttc ate ttc ccg cca tet gat gag

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 432 480 528 576 624 660 cag ttg aaa tet gga act gee tet gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 tat ccc aga gag gee aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gee etc caa

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160 teg ggt aac tee cag gag agt gtc aca gag cag gac age aag gac age

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 acc tac age etc age age acc ctg acg ctg age aaa gca gac tac gag llir Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 aaa cac aaa gtc tac gee tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg age teg

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205 ccc gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tgt tga

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 4 <21]> 219 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成構築體 <400> 4

Glu lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly l 5 10 15

Asp Arg Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Gly Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Lys Leu Leu lie Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Asn 85 90 · 95

Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 16209卜序列表.doc 201241182 G1 r8 A o pr Γ 5 Ty14

va so y5 LI 5 1 3 na 16 G1 u Le Ia n s p As 15 a 5 VI s Ly p Γ 6 s P5 s 7 A1 s Ly Γ c s p As n Ξ uo 17 G1 Γ Th va Γ e s u G1 n5 16 G1 Γ e s n As y Γ € s Γ Ty po s 9 A1 na s Ly Γ 6 s u Le Γ 5 Th18 u Le Γ Th Γ c s Γ 6 s uo Le18 Γ c s Γ Ty Γ Th 6 s Γ £ s u Le y5 lo G2 n s s Hi Γ几va uo 1 o G2 s cy Q Γ Ty va S5 y9 L· 1 s Hi s Ly r8 A n 5 SI A2 6 ph Γ 6 s s Ly Γ Th lo & 11 V2 o pr 5wh 534dn人 ^ > > > &1Z3 1i 1A tx 2ΛΖ2ΛΖ vN/vN/ <220> <223>人類化序列 <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400〉 5 gag gtc cag ctg cag cag tct ggg cct gag gtg gtg aag cct ggg gtc

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Val 15 10 15 tea gtg aag att tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat

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Ala Met His Trp Val Lys Gin Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45 gga gtt att agt act aag tat ggt aag aca aac tac aac ccc age ttt

Gly Val lie Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe 50 55 60 cag ggc cag gcc aca atg act gtt gac aaa tcc tcc age aca gcc tat

Gin Gly Gin Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ett gcc age ttg aag gcc tcc gat tct gcc ate tat tac tgt

Met Glu Leu. Ala Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala lie Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggg gac gat ggt tat tcc tgg ggt caa gga acc tea gtc acc

Ala Arg Gly Asp Asp Gly Tyr Ser Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 gtc tcc age Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 115 <212> PRT <213>人工 16209卜序列表_(1(^ -6- 48 96 144 192 240 288 336 345 201241182 <220> <_223>合成構築體 <400> 6

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Val 15 10 15

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Ala Met His Trp Val Lys Gin Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45

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Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 339 <212> DNA <213> 人工 <220> <223>人類化序列 <220> <c221> CDS <ail> (1)..(339) <400> 7 gag ate gtg atg acc caa act cca etc tcc ctg cct gtc agt ett gga

Glu lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15 gat aga gcc tcc ate tet tgc aga tet ggt cag age ett gtg cac agt

Pro Lys Leu Leu lie Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tea ggg tea gat ttc aca etc acc ate

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75 80 age aga gtg gag get gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tet caa aat

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Asn 85 90 95 :丨62091-序列表.doc 201241182 aca ttt gtt cct tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ate aaa Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 cgt

Arg <210> 8 <211> 113 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成構築體 <400> 8

Glu lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Arg Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Gly Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30

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Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

Arg <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213>小鼠屬 <220> <221> CDS <222> (1)..(33) <400> 9 tcc ggc tac aca ttc act gat tat get atg cac Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met His 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213>小鼠屬 <400> 10

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met His 162091·序列表.doc 201241182 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213>小鼠屬 <：220> <：221> CDS <222> (1)..(30) <:400> 11 i：tt att agt act aag tat ggt aag aca aac Val lie Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn 1. 5 10 <210> 12 <211> 10 <：212> PRT <213>小鼠屬 <400> 12

Ty s Lyc Γ Th Γ c s so A1 Γ Th s Ly 屬 A鼠 1318g小 ^ > > > Q1 3 1A 11 1X 1Λ 2 220« V < \/\/ <220> <221> CDS <222> (1)..(18) 18 <400> 13 ggg gac gat ggt tat tcc Gly Asp Asp Gly Tyr Ser 屬 G 了鼠sp 4^、 4 A 16PT* 1 ) p '>>>>feA Q 1 <Si 3 o ·--* <4G1 G1 6 s Γ Tyc <210> 15 <211> 48 <212> DNA <213>小鼠屬 <220> <221> CDS <222> (1)..(48) <400> 15 aga tct ggt cag age ett gtg cac agt aat gga aac acc tat ctg cat 48

Arg Ser Gly Gin Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 15 10 15 <210> 16 <211> 16 9- 162091·序列表.doc 201241182

<212> PRT <213>小鼠屬 <400> 16

Arg Ser Gly Gin Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 15 10 15 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213>小鼠屬 <220> <221> CDS <222> (1)..(24) <400> 17 aca gtt tcc aac cga ttt tct ggg Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213>小鼠屬 <400> 18

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Ser Gin Asn Thr Phe Val Pro Trp Thr

> > > > 0123 · · ΤΑ <A

21660DNA 工 <220> <223>人類化序列 <220>

<221> CDS <222> (1)..(660) 10- 16209丨·序列表.doc 48 201241182 <400> 21 gag ate gtg atg acc caa act cca etc tee ctg cct gtc agt ett gga

Glu lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gat aga gee tee ate tet tgc aga tet ggt cag age ett gtg cac agt

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Pro Lys Leu Leu He Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 g：ac agg ttc agt ggc agt gga tea ggg tea gat ttc aca etc acc ate

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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 22 <211> 219 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成構築體 <400> 22

Glu lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Arg Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Gly Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30 16209丨-序列表.doc -II - 96 144 192 240 288 336 384 432 480 528 576 624 660 r 201241182

Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Lys Leu Leu lie Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser .Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Asn 85 90 95

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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

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Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 23 <211> 339 <212> DNA <213>人工 <220> <223>人類化序列 <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 23 gag ate gtg atg acc caa act cca etc tcc ctg cct gtc agt ett gga

Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 •12· 162091-序列表.doc 201241182 cca aag etc ctg ate tat aca gtt tcc aac ega ttt tet ggg gtc ccg 192 Pro Lys Leu Leu lie Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 g;ac agg ttc agt ggc agt gga tea ggg tea gat ttc aca etc acc ate 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75 80 age aga gtg gag get gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tet caa aat 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Asn 85 90 95 £ica ttt gtt cct tgg aeg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ate aaa 336 Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 llO cgt 339

Arg <210> 24 <211> 113 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成構築體 <400> 24

Glu lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Arg Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Gly Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30

Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Lys Leu Leu lie Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75 80 va rg A Γ e s

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<221> CDS 162091·序列表.doc · 13· 48 201241182 <222> (1)..(1326) <400> 25 gag gtc cag ctg cag cag tct ggg cct gag £tg gtg aag cct ggg gtc

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Ala Arg Gly Asp Glu Gly Tyr Ser Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 gtc tcc age get tct acc aag ggc cct tcc gtg ttc cct ctg gcc cct

Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 aag gac tac ttc cct gag cct gtg acc gtg tcc tgg aac tct ggc gcc

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 acc aag acc tac acc tgt aac gtg gac cac aag cct tcc aac acc aag

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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 16209丨-序列表.doc • 14· 96 144 192 240 288 336 384 432 480 528 576 624 672 720 768 816 864 912 201241182

Kag cag ttc aat tcc acc tac cg£ gtg gtg tct gtg ctg acc gtg ctg

Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 9al ger VaT Leu Thr 9aT Leu 290 295 300 oac cag gac tgg ctg aac ggc aaa gaa tac aag tgt aag gtc tcc aac

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Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 370 375 380 aac tac aag acc acc cct cct gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 ctg tac tcc agg ctg acc gtg gac aag tcc egg tgg cag gag ggc aac

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn 405 410 415 gtc ttt tcc tgc tcc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 cag aag tcc ctg tcc ctg tct ctg ggc tga

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440

<210> 26 <211> 441 <212> FRT <213>人工 <220> <223>合成構築體 <400> 26

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Val 15 10 15

Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 A1aMet His Trp Val Lys Gin Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie

Gly Val lie Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala He Tyr Tyr Cys 85 90 95 162091·序列表doc •15- 960 1008 1056 1104 1152 1200 1248 1296 1326 201241182

Ala Arg Gly Asp Glu Gly Tyr Ser Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125

Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly 165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190

Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205

Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220

Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp 260 265 270

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285

Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320

Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys TTir lie Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu 340 345 350

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Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 •16· 16209卜序列表.doc 201241182

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn 405 410 415

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 G!ln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly. 435 440 <210> 27 <211> 345 <212> DNA <213>人工 <220> <223>人類化序列 <:220> <221> CDS <:222>. (1)..(345) <400> 27 gag gtc cag ctg cag cag tct ggg cct gag gtg gtg aag cct ggg gtc

Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 ^ct atg cac tgg gtg aag cag agt cct ggc aag agt ctg gag tgg att

Ala Met His Trp Val Lys Gin Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45 公ga gtt att agt act aag tat ggt aag aca aac tac aac ccc age ttt

Ala Arg Gly Asp Glu Gly Tyr Ser Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 gtc tcc age Val Ser Ser 115

<210> 28 <211> 115 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成構築體 <400> 28

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Val 15 10 15

Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 162091-序列表.doc 17- 48 96 144 192 240 288 336 345 201241182 20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Gin Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Val lie Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala He Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Asp Glu Gly Tyr Ser Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110

Val Ser Ser 115 ^ > > > &123

屬 <220> <221> CDS <222> (1)..(18) <400> 29 ggg gac gag ggt tat tcc 18

Gly Asp Glu Gly Tyr Ser 1 5 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213>小鼠屬 <400> 30

Gly Asp Glu Gly Tyr Ser 1 5 屬 A鼠 3148l 小 ^ > > > &123 11 IX 11 1A 2222 <220> <221> CDS <222> (1)..(48) <400> 31 aga tct ggt cag age ett gtg cac agt aat acc aac acc tat ctg cat 48

Arg Ser Gly Gin Ser Leu Val His Ser Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 ^ > > > 012 3 11 11 ix 11 2222 < < < < 屬 T鼠 26WK 、 31pl^« 18· 162091·序列表.doc 201241182 <400> 32

Arg Ser Gly Gin Ser Leu Val His Ser Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His 10 15 <210> 33 <211> 1221 <212> DNA <213>智人 <400> 33 atgattcaca ccaacctgaa gaaaaagttc gcagtcatct gtgtgtggaa ggaaaagaag caaaccaagg aattccaggt gttaaagagt cagtctgtat cctcaagcag cacccaggac ctcagaggcc tagccaaggc caaaccagag tcttccaaaa accttatccc taggctgcaa aagtacaaag tgtcctacaa ggggccagga cgctgccacc tccgggacca tgtgaatgta aatacctctg aatgggaggg ttatctgccc i：ggggcaggt gtgctgttgt gtcgtcagcg Kaaatcgatg atcatgacgc agtcctgagg caagatgtgg gcacaaaaac taccattcgc aagcgcttcc tcaaagacag tttgtacaat igtataccact cagatatccc aaagtggtac tacaagactt atcgtaagct gcaccccaat ccttgggagc tatgggacat tcttcaagaa ccatcctctg ggatgcttgg tatcatcatc tatgagttcc tcccatccaa gcgcaagact gatagtgcct gcacgatggg tgcctaccac catctcaacc agggcacaga tgaggacatc ttccggacca ttcactgcta a agctgctgcg tcctggtctt tcttctgttt aaagggagtt actatgattc ctttaaattg ctggggaaat tggccatggg gtctgattcc ccccacaggg gccgccagac cctcggcagt gcctccttcc aggtgtggaa caaggacagc aagatctgga agaattacct aagcatgaac ccaggcatca agttcagtgc agaggccctg tccatggtag aggtcacaga ttttcccttc aaggagagca ttaggaccaa ggctgggcct ggatctctga agtcctccca actaggcaga tttaatgggg cacccacagc caacttccaa ctgatgaact ctcagttggt taccacagag gaaggaatcc taattgtatg g£acccatct cagaatccgg attataattt ctttaataac cagccctttt acatcctcaa gccccagatg atctccccag aagagattca gccaaacccc atgatgacgc tgtgtgacca ggtggatatt gacgtgtgct actactacca gaagttcttc ccgctgctct atgagaagaa tttggtgaag tacctgcttg gaaaagccac actgcctggc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1221 <210> 34 <211> 406 <212> PRT <213>智人 <400> 34

Met lie His Thr Asn Leu Lys Lys Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val 15 10 15

Phe Leu Leu Phe Ala Val lie Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly 20 25 30

Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gin Thr Lys Glu Phe Gin Val Leu 35 40 45

Lys Scr Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Scr Asp Ser Gin Ser Val Ser -I9 162091·序列表.doc 201241182 50 55 60

Ser Ser Ser Thr 65

Gin Asp Pro His Arg Gly

Arg Gin Thr Leu Gly Ser 75 80

Leu Arg Gly Leu

Ala Lys Ala Lys Pro Glu 85 90

Ala Ser Phe Gin Val Trp 95

Asn Lys Asp Ser 100

Ser Ser Lys Asn Leu lie 105

Pro Arg Leu Gin Lys lie 110

Trp Lys Asn Tyr 115

Leu Ser Met Asn Lys Tyr 120

Lys Val Ser Tyr Lys Gly 125

Pro Gly Pro Gly 130 lie Lys Phe Ser Ala Glu 135

Ala Leu Arg Cys His Leu 140

Arg Asp His Val 145

Asn Val Ser Met Val Glu 150

Val Thr Asp Phe Pro Phe 155 160

Asn Thr Ser Glu

Trp Glu Gly Tyr Leu Pro 165 170

Lys Glu Ser lie Arg Thr 175

Lys Ala Gly Pro 180

Trp Gly Arg Cys Ala Val 185

Val Ser Ser Ala Gly Ser 190

Leu Lys Ser Ser 195

Gin Leu Gly Arg Glu lie 200

Asp Asp His Asp Ala Val 205

Leu Arg Phe Asn 210

Gly Ala Pro Thr Ala Asn 215

Phe Gin Gin Asp Val Gly

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Gin Leu Val Thr Thr Glu 235 240

Lys Arg Phe Leu

Lys Asp Ser Leu Tyr Asn 245 250

Glu Gly lie Leu lie Val 255

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Pro Lys Trp Tyr Gin Asn 270

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Gin Met Pro Trp Glu Leu 300

Trp Asp lie Leu 305

Gin Glu lie Ser Pro Glu 310

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Pro Ser Ser Gly

Met Leu Gly lie lie He 325 330

Met Met Thr Leu Cys Asp 335

Gin Val Asp lie 340

Tyr Glu Phe Leu Pro Ser 345

Lys Arg Lys Thr Asp Val 350 162091-序列表.doc -20- 201241182

Cys Tyr Tyr Tyr Gin Lys Phe Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala 355 360 365

Tyr His Pro Leu Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gin 370 375 380

Gly Thr Asp Glu Asp lie Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Pro Gly 385 390 395 400

Phe Arg Thr lie His Cys 405 <210> 35 <211> 1197 <212> DNA <:213>會人 <400> 35 atgaggette gggageeget cctgagcggc agcgccgcga tgccaggcgc gtccctacag 60 cgggcctgcc gcctgctcgt ggccgtctgc gctctgcacc ttggcgtcac cctcgtttac 120 cacctggctg gccgcgacct gagccgcctg ccccaactgg tcggagtctc cacaccgctg 180 cagggcggct cgaacagtgc cgccgccatc gggcagtcct ccggggagct ccggaccgga 240 iSgggcc^cggc cgccgcctcc tctaggcgcc tcctcccagc cgcgcccggg tggcgactcc 300 agcccagtcg tggattctgg ccctggcccc gctagcaact tgacctcggt cccagtgccc 360 cacaccaccg cactgtcgct gcccgcctgc cctgaggagt ccccgctgct tgtgggcccc 420 atgctgattg agtttaacat gcctgtggac ctggagctcg tggcaaagca gaacccaaat 480 gtgaagatgg gcggccgcta tgcccccagg gactgcgtct ctcctcacaa ggtggccatc 540 atcattccat tccgcaaccg gcaggagcac ctcaagtact ggetatatta tttgcatcca 600 gtcctgcagc gccagcagct ggactatggc atctatgtta tcaaccaggc gggagacact 660 atattcaatc gtgetaaget cctcaatgtt ggctttcaag aagccttgaa ggactatgac 720 tacacctgct ttgtgtttag tgacgtggac ctcattccaa tgaatgacca taatgcgtac 780 aggtgttttt cacagccacg gcacatttcc gttgcaatgg ataagtttgg attcagccta 840 ccttatgttc agtattttgg aggtgtctct getetaagta aacaacagtt tctaaccatc 900 aatggatttc ctaataatta ttggggctgg ggaggagaag atgatgacat ttttaacaga 960 ttagttttta gaggcatgtc tatatetege ccaaatgctg tggtcgggag gtgtcgcatg 1020 atccgccact caagagacaa gaaaaatgaa cccaatcctc agaggtttga ccgaattgca 1080 cacacaaagg agacaatgct ctctgatggt ttgaactcac tcacctacca ggtgctggat 1140 gtacagagat acccattgta tacccaaatc acagtggaca tcgggacacc gagetag 1197 <210> 36 <211> 398 <212> PRT <213>智人 <400> 36

Met Arg Leu Arg Glu Pro Leu Leu Ser Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Leu Gin Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu •21- 162091·序列表.doc 201241182 20 25 30

His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser 35 40 45

Arg Leu Pro Gin Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gin Gly Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Ala Ala Ala lie Gly Gin Ser Ser Gly Glu Leu Arg Thr Gly 65 70 75 80

Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Ser Ser Gin Pro Arg Pro 85 90 95

Gly Gly Asp Ser Ser Pro Val Val Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser 100 105 110

Asn Leu Thr Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro 115 120 125

Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met Leu lie Glu 130 135 140

Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu Val Ala Lys Gin Asn Pro Asn 145 150 155 160

Val Lys Met Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser Pro His 165 170 175

Lys Val Ala lie lie lie Pro Phe Arg Asn Arg Gin Glu His Leu Lys 180 185 190

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Tyr Gly lie Tyr Val lie Asn Gin Ala Gly Asp Thr lie Phe Asn Arg 210 215 220

Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Gin Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp 225 230 235 240

Tyr Thr Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu lie Pro Met Asn Asp 245 250 255

His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gin Pro Arg His lie Ser Val Ala 260 265 270

Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gin Tyr Phe Gly Gly -275 280 285

Val Ser Ala Leu Ser Lys Gin Gin Phe Leu Thr lie Asn Gly Phe Pro 290 295 300

Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp lie Phe Asn Arg 305 310 315 320 •22· 16209卜序列表.doc 201241182

Leu Val Phe Arg Gly Met Ser lie Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly 325 330 335

Arg Cys Arg Met lie Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro Asn 340 345 350

Pro Gin Arg Phe Asp Arg lie Ala His Thr Lys Glu Thr Met Leu Ser 355 360 365

Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Gin Val Leu Asp Val Gin Arg Tyr 370 375 380

Pro Leu Tyr Tlir Gin lie Thr Val Asp lie Gly Thr Pro Ser 385 390 395 <210> 37 <211> 1374 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 37 atggaatgca gctgggtctt tctctttctg gtagcaacag ctacaggtgt gcactcccag 60 gtccagctgc agcagtctgg gcctgagctg gtgaggcctg gggtctcagt gaagatttcc 120 tgcaagggtt ccggctacac attcactgat tatgctatgc actgggtgaa gcagagtcat 180 gcaaagagtc tagagtggat tggagttatt agtactaagt atggtaagac aaactacaac 240 cagaagttta agggcaaggc cacaatgact gttgacaaat cctccagcac agcctatatg 300 gagcttgcca gattgacatc tgaggattct gccatctatt actgtgcaag aggggacgat 360 ggttattcct ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcct cagccaaaac gacaccccca 420 tctgtctatc cactggcccc tggatctgct gcccaaacta actccatggt gaccctggga 480 tgcctggtca agggctattt ccctgagcca gtgacagtga cctggaactc tggatccctg 540 tccagcggtg tgcacacctt cccagctgtc ctgcagtctg acctctacac tctgagcagc 600 tcagtgactg tcccctccag cacctggccc agcgagaccg tcacctgcaa cgttgcccac 660 ccggccagca gcaccaaggt ggacaagaaa attgtgccca gggattgtgg ttgtaagcct 720 tgcatatgta cagtcccaga agtatcatct gtcttcatct tccccccaaa gcccaaggat 780 gtgctcacca ttactctgac tcctaaggtc acgtgtgttg tggtagacat cagcaaggat 840 gatcccgagg tccagttcag ctggtttgta gatgatgtgg aggtgcacac agctcagacg 900 caaccccggg aggagcagtt caacagcact ttccgctcag tcagtgaact tcccatcatg 960 caccaggact ggctcaatgg caaggagttc aaatgcaggg tcaacagtgc agctttccct 1020 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc aaaggcagac cgaaggctcc acaggtgtac 1080 accattccac ctcccaagga gcagatggcc aaggataaag tcagtctgac ctgcatgata 1140 acagacttct tccctgaaga cattactgtg gagtggcagt ggaatgggca gccagcggag 1200 aactacaaga acactcagcc catcatggac acagatggct cttacttcgt ctacagcaag 1260 ctcaatgtgc agaagagcaa ctgggaggca ggaaatactt tcacctgctc tgtgttacat 1320 gagggcctgc acaaccacca tactgagaag agcctctccc actctcctgg ttga 1374 <210> 38 <211> 438 -23- 16209丨-序列表_如〇 201241182 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 38

Gin Val Gin Leu Glu Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val 15 10 15

Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Gin Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Val lie Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala lie Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Asp Asp Gly Tyr Ser Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110

Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 115 120 125

Gly Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140

Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser 145 150 155 160

Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu 165 170 175

Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser 180 185 190

Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val 195 200 205

Asp Lys Lys lie Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys lie Cys 210 215 220

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Asp Val Leu Thr lie Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val 245 250 255

Asp lie Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe Ser Trp Phe Val Asp 260 265 270

Asp Val Glu Val His Thr Ala Gin Thr Gin Pro Arg Glu Glu Gin Phe 275 280 285 • 24· 162091-序列表.doc 201241182

Asn Scr Thr Phe Arg Scr Val Scr Glu Leu Pro lie Met His Gin Asp 290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe 305 310 315 320

Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys 325 330 335

Ala Pro Gin Val Tyr Thr lie Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met Ala Lys 340 345 350

Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met lie Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp 355 360 365

He Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly Gin Pro Ala Glu Asn Tyr Lys 370 375 380

Asn Thr Gin Pro lie Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser ：385 390 395 400

Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr 405 410 415

Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser 420 425 430

Leu Ser His Ser Pro Gly 435 <210> 39 <211> 717 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 39 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctggtcagag ccttgtacac agtaatggaa acacctattt acattggtac 180 ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctata cagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccgg acaggttcag tggcagtgga tcagggtcag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaaatacatt tgttccttgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttaa 717 <210> 40 <211> 219 25- 162091-序列表.doc 201241182 <212> PRT <213>小家鼠 <400〉 40

Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Set Leu Pro Val Ser Lea Gly 15 10 15

Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Gly Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Lys Leu Leu lie Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Set Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Asn 85 90 95

Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 110

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125

Gin Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Lys Asp lie Asn Val Lys Trp Lys He Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160

Gin Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205

Pro lie Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 41 <211> 1374 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 41 atggaatgca gctgggtctt tctctttctg gtagcaacag ctacaggtgt gcactcccag gtccagctgc agcagtctgg gcctgagctg gtgaggcctg gggtctcagt gaagatttcc tgcaagggtt ccggctacac attcactgat tatgctatgc actgggteaa scagastcat gcaaagagtc tagagtggat tggagttatt agtactaagt atggtaagac aaactacaac -26· 16209卜序列表.doc 201241182 cagaagttta agggcaaggc cacaatgact gttgacaaat cctccagcac agcctatatg 300 gagcttgcca gattgacatc tgaggattct gccatctatt actgtgcaag aggggacgat 360 ggttattcct ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcct cagccaaaac gacaccccca 420 tctgtctatc cactggcccc tggatctgct gcccaaacta actccatggt gaccctggga 480 tgcctggtca agggctattt ccctgagcca gtgacagtga cctggaactc tggatccctg 540 tccagcggtg tgcacacctt cccagctgtc ctgcagtctg acctctacac tctgagcagc 600 tcagtgactg tcccctccag cacctggccc agcgagaccg tcacctgcaa cgttgcccac 660 ccggccagca gcaccaaggt ggacaagaaa attgtgccca gggattgtgg ttgtaagcct 720 tgcatatgta cagtcccaga agtatcatct gtcttcatcg cccccccaaa gcccaaggat 780 gtgctcacca ttactctgac tcctaaggtc acgtgtgttg tggtagacat cagcaaggat 840 gatcccgagg. tccagttcag ctggtttgta gatgatgtgg aggtgcacac agctcagacg 900 caaccccggg aggagcagtt caacagcact ttccgctcag tcagtgaact tcccatcatg 960 caccaggact ggctcaatgg caaggagttc aaatgcaggg tcaacagtgc agctttccct 1020 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc aaaggcagac cgaaggctcc acaggtgtac 1080 accattccac ctcccaagga gcagatggcc aaggataaag tcagtctgac ctgcatgata 1140 acagacttct tccctgaaga cattactgtg gagtggcagt ggaatgggca gccagcggag 1200 aactacaaga acactcagcc catcatggac acagatggct cttacttcgt ctacagcaag 1260 ctcaatgtgc agaagagcaa ctgggaggca ggaaatactt tcacctgctc tgtgttacat 1320 {：agggcctgc acaaccacca tactgagaag agcctctccc actctcctgg ttga 1374 <210> 42 <211> 438 <C212> PRT <213>小家鼠 <400> 42

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val 1 5 10 15

Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr TTir Phc Thr Asp Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Gin Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Val He Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala lie Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Asp Asp Gly Tyr Ser Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr 100 105 no

Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro -27- :丨62091-序列表.doc 201241182 115 120 125

Gly Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140

Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser 145 150 155 160

Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu 165 170 175

Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser 180 185 190

Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val 195 200 205

Asp Lys Lys lie Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys lie Cys 210 215 220

Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe lie Ala Pro Pro Lys Pro Lys 225 230 235 240

Asp Val Leu Thr lie Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val 245 250 255

Asp lie Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe Ser Trp Phe Val Asp 260 265 270

Asp Val Glu Val His Thr Ala Gin Thr Gin Pro Arg Glu Glu Gin Phe 275 280 285

Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro lie Met His Gin Asp 290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe 305 310 315 320

Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys 325 330 335

Ala Pro Gin Val Tyr Thr lie Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met Ala Lys 340 345 350

Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met lie Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp 355 360 365 lie Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly Gin Pro Ala Glu Asn Tyr Lys 370 375 380

Asn Thr Gin Pro lie Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser 385 390 395 400

Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr 405 410 415 16209卜序列表.doc 201241182 C/s Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser 420 425 430

Leu Ser His Ser Pro Gly 435 <210> 43 <211> 1374 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 43 atggaatgca gctgggtctt tctctttctg gtagcaacag ctacaggtgt gcactcccag 60 gtccagctgc agcagtctgg gcctgagctg gtgaggcctg gggtctcagt gaagatttcc 120 tgcaagggtt ccggctacac attcactgat tatgctatgc actgggtgaa gcagagtcat 180 gcaaagagtc tagagtggat tggagttatt agtactaagt atggtaagac aaactacaac 240 cagaagttta agggcaaggc cacaatgact gttgacaaat cctccagcac agcctatatg 300 gagcttgcca gattgacatc tgaggattct gccatctatt actgtgcaag aggggacgat 360 £；gttattcct ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcct cagccaaaac gacaccccca 420 tctgtctatc cactggcccc tggatctgct gcccaaacta actccatggt gaccctggga 480 tgcctggtca agggctattt ccctgagcca gtgacagtga cctggaactc tggatccctg 540 i^ccagcggtg tgcacacctt cccagctgtc ctgcagtctg acctctacac tctgagcagc 600 tcagtgactg tcccctccag cacctggccc agcgagaccg tcacctgcaa cgttgcccac 660 ccggccagca gcaccaaggt ggacaagaaa attgtgccca £ggattgtgg ttgtaagcct 720 tgcatatgta cagtcccaga agtatcatct gtcttcatct tccccccaaa gcccaaggat 780 ；gtgctcacca ttactctgac tcctaaggtc acgt£tgttg tggcagacat cagcaaggat 840 gatcccgagg tccagttcag ctggtttgta gatgatgtgg aggtgcacac agctcagacg 900 caaccccggg aggagcagtt caacagcact ttccgctcag tcagtgaact tcccatcatg 960 caccaggact ggctcaatgg caaggagttc aaatgcaggg tcaacagtgc agctttccct 1020 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc aaaggcagac cgaaggctcc acaggtgtac 1080 accattccac ctcccaagga gcagatggcc aaggataaag tcagtctgac ctgcatgata 1140 acagacttct tccctgaaga cattactgtg gagtggcagt ggaatgggca gccagcggag 1200 aactacaaga acactcagcc catcatggac acagatggct cttacttcgt ctacagcaag 1260 ctcaatgtgc agaagagcaa ctgggaggca ggaaatactt tcacctgctc tgtgttacat 1320 gagggcctgc acaaccacca tactgagaag agcctctccc actctcctgg ttga 1374 <210> 44 <211> 438 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 44

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val 15 10 15

Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 • 29· 162091·序列表.doc 201241182

Ala Met His Trp Val Lys Gin Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Val lie Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala lie Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Asp Asp Gly Tyr Ser Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110

Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 115 120 125

Gly Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140

Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser 145 150 155 160

Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu 165 170 175

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Asp Lys Lys lie Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys lie Cys 210 215 220

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Asp Val Leu Thr lie Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Ala 245 250 255

Asp lie Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe Ser Trp Phe Val Asp 260 265 270

Asp Val Glu Val His Thr Ala Gin Thr Gin Pro Arg Glu Glu Gin Phe 275 280 285

Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro lie Met His Gin Asp 290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe 305 310 315 320

Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys 325 330 335 •30· 16209丨·序列表.doc 201241182

Ala Pro Gin Val Tyr Thr lie Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met Ala Lys 340 345 350

Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met He Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp 355 360 365 lie Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly Gin Pro Ala Glu Asn Tyr Lys 370 375 380

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Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 60 <211> 327 <212> PRT <213>智人 -53- 162091-序列表.doc 201241182 <400> 60

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Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 61 <211> 324 <212> PRT <213>小家鼠 <：400> 61

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala 1i 5 10 15

Ala Gin Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val 65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 lie Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys lie Cys Thr Val Pro 100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 115 120 125

Thr lie Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp lie Ser 130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu 145 150 155 160

Val His Thr Ala Gin Thr Gin Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr 165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro lie Met His Gin Asp Trp Leu Asn 180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro 195 200 205 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gin 210 215 220

Val Tyr Thr lie Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met Ala Lys Asp Lys Val -55- 162091-序列表.doc 201241182 225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met lie Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp lie Thr Val 245 250 255

Glu Trp Gin Trp Asn Gly Gin Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gin 260 265 270

Pro lie Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn 275 280 285

Val Gin Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val 290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His 305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys <210> 62 <211> 330 <212> PRT <213>小家鼠 <400〉 62

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly 15 10 15

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Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gin Thr Gin Thr His Arg -56- 162091·序列表.doc 201241182 165 170 175

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Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 325 330 <210> 63 <211> 330 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 63

Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Val Pro Gly Cys Ser 15 10 15

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Pro Pro Gly Asn lie Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 115 120 125

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Gin Lys Asn Leu Ser Arg Ser Pro Gly Lys 325 330 58- 162091·序列表.doc

Claims

201241182 七、申請專利範圍： 1· 一種製備IgG抗體之方法，其中至少80%之該抗體包含含有兩個唾液酸殘基之複合雙觸角寡醣連接於該抗體之各 Fc域，該方法包括以下步驟： a) 在該抗體之該Fc域中引入突變，及 b) 在表現β-半乳糖基轉移酶及唾液酸基轉移酶活性之細胞株中表現步驟a)中獲得之該突變抗體。 2. 如請求項丨之方法，其中該卜半乳糖基轉移酶為βι，4半乳糖基轉移酶且該唾液酸基轉移酶為α_2,6_唾液酸基轉移酶。 3. 如前述請求項中任一項之方法，其中該ρ ι，4_半乳糖基轉移酶係由SEQIDNO:35所示之聚核普酸序列編碼且該 «·2,6-唾液酸基轉移酶係由SEQ ID N〇: 33所示之聚核苷酸序列編碼》 4. 如前述請求項中任—項之方法，其中該等唾液酸殘基經由α-2,6鍵連接於該抗體。 5. 如前述請求項中任_須古甲仕項方法其甲該抗體為單株抗其中該抗體為人類化抗 6·如前述請求項_任一項之方法，體。前述4求項中任一項之方法，其中該突變影響選自由 F243、V264及D265組成之群之胺基酸。中該突變為該胺基酸白胺酸（L)及離胺酸 8.如前述請求項中任一項之方法，其經選自由丙胺酸（A)、甘胺酸（G)、 I62091.doc 201241182 (κ)組成之群之胺基酸取代。 9. 如刚述睛求項中任一項之方法’其中該突變係選自由 D265L、D265K 及 D265A 組成之群。 10. 如前述請求項中任一項之方法，其中該抗體包含人類 IgG4 Fc域。 11. 如前述請求項中任一項之方法，其中該抗體包含人類 IgGl Fc域。 12. 如前述請求項中任一項之方法，其中表現卜半乳糠基轉移酶及唾液酸基轉移酶活性之該細胞株為用一成雨個編碼β-半乳糖基轉移酶及唾液酸基轉移酶之載體穩定轉染之細胞株。 13. 如前述請求項中任一項之方法，其中表現ρ半乳糖基轉移酶及唾液酸基轉移酶活性之該細胞株為用一或兩個編碼該抗體之載體穩定轉染之細胞株。 14. 一種抗體，其係藉由如前述請求項中任一項之方法製備。 15. —種醫藥組合物，其包含如請求項14之抗體。 16. 如請求項14之抗體’其係用作藥劑。 17. —種包含lgG抗體之組合物，其中至少8〇%之該抗體包含複合雙觸角寡醣連接於該抗體之各以域，該寡醣包含兩個唾液酸殘基，其t該Fc域包含不同於天然序列人頬 IgG Fc域之胺基序列。 18. 如請求項17之組合物，其中該等唾液酸殘基經由α·2,6^ 連接於該抗體。 162091.doc 201241182 19. 如請求項17或18之組合物，其中本發明之該組合物中之該抗體在胺基酸位置243、264及265中任一或多處包含胺基酸取代。 20. 如請求項19之組合物，其中該取代為該胺基酸經選自由丙胺酸（A)、甘胺酸（G)、白胺酸（L)及離胺酸（K)組成之群之胺基酸取代。 21. 如請求項20之組合物，其中該取代係選自由D265L、 D265K及D265A組成之群。 162091.doc