TW201201819A - Treatment of BCL2-like 11 (BCL2L11) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to BCL2L11 - Google Patents

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201201819 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明實施例包括調節BCL2L11之表現及/或功能之寡 核苷酸及相關分子。 本申請案主張2010年5月19日提出申請之美國臨時專利 申請案第61/346,252號之優先權，其全部内容以引用方式 併入本文中。 【先前技術】 DNA-RNA及RNA-RNA雜交對於包含DNA複製、轉錄、 及轉譯在内之許多核酸功能態樣甚為重要。雜交對於檢測 特定核酸或改變其表現之各種技術亦至關重要。舉例而 言，反義核苷酸藉由與靶RNA雜交來破壞基因表現，由此 干擾RNA剪接、轉錄、轉譯、及複製。反義DNA具有額外 特性，亦即DNA-RNA雜合體可用作核糖核酸酶Η消化之受 質，該活性存在於大部分細胞類型中。反義分子可遞送至 細胞中，例如寡去氧核苷酸（ODN)之情形，或其可自内源 基因表現為RNA分子。FDA最近批准了反義藥物 VITRAVENE™(用於治療巨細胞病毒視網膜炎），此表明該 反義藥物具有治療用途。 【發明内容】 提供本概述以呈現本發明之概述從而簡要顯示本發明之 性質及大意。提交本概述係基於下列理解：其並非用於解 釋或限制本申請專利範圍之範圍或含義。 在一實施例中，本發明提供抑制天然反義轉錄本之作用 156341.doc 201201819 之方法，其係藉由使用鞋向天然反義轉錄本之任一區域的 反義寡核普酸從而上調相應有義基因來達成。本文亦涵 蓋’可藉由siRNA、核糖酶及小分子來抑制天然反義轉錄 本，此視為屬於本發明範圍内。 一實施例提供在活體内或活體外調節患者細胞或組織中 BCL2L11聚核苷酸之功能及/或表現之方法，其包括使該 等細胞或組織與長度為5至30個核苷酸之反義寡核苷酸接 觸，其中該寡核苷酸與聚核苷酸之反向互補序列具有至少 50%的序列一致性，該聚核苷酸包括SEQ ID NO: 2中核苷 酸1至3026及SEQ ID NO: 3中核苷酸1至1512内之5至30個 連續核苷酸’由此在活體内或活體外調節患者細胞或組織 中BCL2L11聚核苷酸之功能及/或表現。 在一實施例中，寡核苷酸靶向BCL2L11聚核苷酸之天然 反義序列（例如，SEQ ID NO: 2及3中所述之核苷酸）、及其 任一變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及 互補序列》反義寡核苷酸之實例係如SEQ ID NO: 4至13所 示0 另一實施例提供在活體内或活體外調節患者細胞或組織 中BCL2L11聚核苷酸之功能及/或表現之方法，其包括使 該等細胞或組織與長度為5至30個核苷酸之反義寡核苷酸 接觸’其中該寡核苷酸與BCL2L11聚核苷酸反義轉錄本之 反向互補序列具有至少50%的序列一致性；由此在活體内 或活體外調節患者細胞或組織中BCL2L11聚核苷酸之功能 及/或表現。 156341.doc 201201819 另一實施例提供在活體内或活體外調節患者細胞或組織 中BCL2L11聚核苷酸之功能及/或表現之方法，其包括使 s亥等細胞或組織與長度為5至30個核苷酸之反義寡核苷酸 接觸’其中該募核苷酸與BCL2L11反義聚核苷酸之反義寡 核普酸具有至少50%的序列一致性；由此在活體内或活體 外調節患者細胞或組織中BCL2L11聚核苷酸之功能及/或 表現。 在一實施例中，組合物包括一或多種結合至有義及/或 反義BCL2L11聚核苷酸之反義寡核苷酸。 在一實施例中，寡核苷酸包括一或多個經修飾或取代之 核苷酸。 在一實施例中’寡核苷酸包括一或多個經修飾鍵。 在又一實施例中，經修飾核苷酸包括含有以下之經修飾 鹼基.硫代磷酸酯、膦酸曱酯、肽核酸、2,曱基、氟_ 或碳、亞甲基或其他鎖核酸（LNA)分子。較佳地，經修飾 核苦酸係鎖核酸分子，包含a-L-LNA。 貫施例中，經皮下、肌内、靜脈内或腹膜腔内將寡 核苷酸投與患者。 在-實施例中，以醫藥組合物形式投與寡㈣酸。治療 方案包括至少一次向患者投與反義化合物；然而，此治療 可經改良以在—定時間内包含多個劑量。該治療可與—或 多個其他類型之療法組合。 5 在-實施例中，將寡核皆酸囊封於脂質體中或附 劑分子（例如膽固醇、TAT肽）。 156341.doc 201201819 其他態樣闡述於下文中。 【實施方式】 下文參照闡釋用實例應用來闡述本發明之若干態樣。應 理解，本文列舉各種具體細節、關係及方法以提=對本發 明之完全理解。然而，熟習相關技術者易於認識到，可在 不使用一或多個具體細節或使用其他方法之情形下來實踐 本發明。本發明並不限於各個動作或事件之順序，此乃因 一些作用可以不同順序發生及/或與其他動作或事件同時 發生。另外，未必需要所有所闡釋動作或事件來實施本發 明方法。 本文所揭示之所有基因、基因名稱、及基因產物意欲對 應於可應用本文所揭示組合物及方法之來自任一物種的同 系物。因此，該等術語包含但不限於人類及小鼠之基因及 基因產物。應理解’在揭示來自特定物種之基因或基因產 物時，此揭示内容意欲僅具有實例性，且不應解釋為限制 意義，除非上下文明確指明。因此，舉例而言，在某些關 於哺乳動物核酸及胺基酸序列之實施例中，本文所揭示基 因意欲涵蓋來自其他動物之同源及/或直系同源基因及基 因產物’該等其他動物包含但不限於其他哺乳動物、魚、 兩棲動物、爬行動物、及鳥。在一實施例中，基因或核酸 序列係人類。 本文所用之術語僅用於闡述特定實施例之目的而並非意 欲限定本發明。如本文中所使用，單數形式「一（a)」、 15634 丨.doc 201201819 一（an)」及「該（the)」亦意欲包含複數形式，除非上下 文另外月確‘明。另外，在詳細闡述及/或申請專利範圍 中使用術語「包含（ineluding)」、「包含（ineludes)」、 /、有（1^7丨11§)」、「具有（has)」、「具有（with)」、或其 變化形式時’該等術語意欲以類似於術語「包括 (comprising)」之方式來表示包含範圍。 術語「約」或「近似地 特定值的可接受誤差範圍 」意指熟習此項技術者所測定之 ，其部分地取決於該值之量測或 測定方式，亦即，量測系統之侷限性。舉例而言，根據業 内實踐，「約」可意指在1個或丨個以上之標準偏差内。另 一選擇為，「約」可意指與給定值相差至多2〇%、較佳至 多10%、更佳至多5%、及更佳至多1%的範圍。另一選擇 為，尤其對於生物系統或過程而言，該術語可意指在一數 值之一個數量級内、較佳在5倍内、及更佳在2倍内。在申 請案及申請專利範圍中闡述特定值時，除非另有闡述，否 則應假ax術§吾「約」意指在該特定值之可接受誤差範圍 内。 本文所用之術語「mRNA」意指靶向基因之當前已知 mRNA轉錄本、及可闡釋之任一其他轉錄本。 「反義寡核苷酸」或「反義化合物」意指結合至另一 RNA或DNA(靶RNA、DNA)之RNA或DNA分子。舉例而 言，若係RNA寡核苷酸，則其藉助RNA-RNA相互作用結 合至另一 RNA輕並改變乾RNA之活性。反義寡核苦酸可上 調或下调特定聚核Θ酸之表現及/或功能。該定義竟欲包 I56341.doc 201201819 含可用於治療、診斷、或其他方面之任一外來RNA或DNA 分子。該等分子包含（例如）反義RNA或DNA分子、干擾 RNA (RNAi)、微小 RNA、誘斜 RNA 分子、siRNA、酶 RNA、治療性編輯RNA及RNA激動劑與拮抗劑、反義寡聚 化合物、反義寡核苷酸、外部引導序列（EGS)寡核苷酸、 交替剪接、引物、探針、及與靶核酸之至少一部分雜交之 其他寡聚化合物。因此，該等化合物可以單鏈、雙鏈、部 分單鏈、或環狀寡聚化合物形式引入。 在本發明之上下文中，術語「寡核苷酸」係指核糖核酸 (RNA)或去氧核糖核酸（DNA)之寡聚物或聚合物或其模擬 物。術語「寡核苷酸」亦包含天然及/或經修飾單體或鍵 聯之直鏈或環狀寡聚物，包含去氧核糖核苷、核糖核苷、 其經取代及α-變旋異構形式、肽核酸（PNA)、鎖核酸 (LNA)、硫代構酸酉旨、膦酸甲酯、及諸如此類。寡核苷酸 能夠藉助單體與單體相互作用之規則模式特異性結合至靶 聚核苦酸，例如Watson-Crick型驗基配對、Ho0gsteen型驗 基配對或反向Ho6gsteen型驗基配對、或諸如此類。 寡核苷酸可為「嵌合」寡核苷酸，亦即，由不同區域組 成。在本發明之上下文中，「嵌合」化合物係寡核苷酸， 其含有兩個或更多個化學區域，例如DNA區域、RNA區 域、PNA區域等。在寡核苷酸化合物之情形下，每一化學 區域係由至少一個單體單元（亦即，核苷酸）組成。該等寡 核苷酸通常包括至少一個對寡核苷酸進行修飾以顯示一或 多個期望性質之區域。寡核苷酸之期望性質包含但不限於 156341.doc 201201819 (例如）：增加對於核酸酶降解之抗性、增加細胞攝取、及/ 或增加對於靶核酸之結合親和力。寡核苷酸之不同區域可 由此具有不同性質。本發明之嵌合寡核苷酸可形成為兩種 或更多種上述寡核苷酸、經修飾募核苷酸、寡核苷及/或 券核苷酸類似物的混合結構。 寡核苷酸可由可在「記錄（register)」中連接之區域組 成，亦即，單體係連續連接（如天然DNA中）、或經由間隔 體連接。間隔體意欲在區域之間構成共價「橋」且在較佳 情形下具有不超過約100個碳原子之長度。間隔體可具有 不同功能，例如具有正電荷或負電荷，具有特異性核酸結 合性質（嵌合劑、槽溝黏合劑、毒素、螢光團等），具有親 脂性，誘導特異性二級結構（例如，誘細累旋之含丙胺酸 之肽）。 本文所用之「BCL2L11」及「類BCL2U」包含所有家 族成員、突變體、等位基因、片@、物種、編碼及非編碼 序列、有義及反義聚核苷酸鏈等。 本文所用之詞語類BCL2 U、BCL2LU、BAM、細胞死 亡之Bcl2相互作用介體、Bcl2_L_u、麵、醜-^，麵_ β6、ΒΙΜ-β7、BimEL、BimL、卿在文獻中視為相同， 且在本申請案争可互換使用。 「本文所周之術語「對......具有特異性之寡核苦酸」或 靶向......之暴核苷酸」係指具有如下序列之寡核苷酸： ⑴能夠與乾向基因之一部分形成穩定複合物，或⑼能夠 與乾向基因之mRNA轉錄本的—部分形成穩定雙鏈體。複 15634I.doc 201201819 合物及雙鏈體之穩定性可藉由理論計算及/或活體外分析 進行測定。測定雜交複合物及雙鏈體之穩定性的實例性分 析闡述於下文實例中。 本文所用之術語「靶核酸」涵蓋自該DNA轉錄之DNA、 RNA(包括mRNA前體及mRNA)、以及源自該RNA、編碼序 列、非編碼序列、有義或反義聚核苷酸之cDNA。寡聚化 合物與其靶核酸之特異性雜交會干擾該核酸之正常功能。 與把核酸特異性雜交之化合物對該輕核酸功能的此調節通 常稱為「反義」。擬干擾之DNA功能包含（例如）複製及轉 錄。擬干擾之RNA功能包含所有重要功能，例如，RNA至 蛋白質轉譯位點之移位、蛋白質自RNA之轉譯、使RNA產 生一或多種mRNA物質之剪接、及RNA可參與或促進之催 化活性。對於靶核酸功能之該干擾的總體效應係可調節編 碼產物或寡核苷酸之表現。 RNA干擾（「RNAi」）係藉由與「靶」核酸序列具有序列 特異性同源性之雙鏈RNA (dsRNA)分子來調介。在本發明 某些實施例中，介質係具有5-25個核苷酸之「小干擾」 RNA雙鏈體（siRNA)。siRNA源自稱為Dicer之RNase酶對於 dsRNA之處理。siRNA雙鏈體產物募集至稱為RISC之多蛋 白siRNA複合物（RNA誘導之沉默複合物）中。不期望受限 於任一特定理論，由此據信，RISC可引導至靶核酸 (mRNA較為適宜），在此siRNA雙鏈體以序列特異性方式發 生相互作用從而以催化方式來調介裂解。可用於本發明中 之小干擾RNA可根據業内所熟知且為熟習此項技術者所習 156341.doc •10- 201201819 知的程序來合成及使用。用於本發明方法中之小干擾⑽八 適宜地包括約1至約50個核苷酸（nt)。在非限制性實施例之 實例中，siRNA可包括約5至約40個加、約5至約川個加、 約丨0至約30個nt、約15至約25個加、或約2〇_25個核苷酸。 藉由使用自動對準核酸序列並指示一致性或同源性區域 之電腦程式來促進適當寡核㈣㈣擇。使用該等程式藉 由（例如）搜索諸如GenBank等數據庫或藉由對pCR產物測 序來比較所獲得的核酸序列。對於來自各種物種之核酸序 列之比較使得可選擇顯示適當物種間一致性程度的核酸序 列。在並未測序之基因情形下，實施南方印跡（s〇uthern blot)以測定靶物種及其他物種之基因間的一致性程度。藉 由在不同嚴格度下實施南方印跡（如業内所熟知），可大致 量測一致性。該等程序使得可選擇如下寡核苷酸：其對欲 控制個體中之乾核酸序列呈現高互補性程度且對其他物種 中之相應核酸序列呈現較低互補性程度。熟習此項技術者 應》Λϋ識到，可在較大範圍中選擇適用於本發明中之基因區 域。 「酶RNA」意指具有酶活性之RNA分子（Cech，（1988)

American. Med· Assoc. 260, 3030-3035)。酶性核酸（核糖 _ )首先藉由結合至靶RNA而發揮作用。該結合經由酶性 核酸之靶結合部分來進行，該靶結合部分緊鄰分子中用於 裂解乾RNA之酶性部分。因此，酶性核酸首先識別粗 且然後經由鹼基配對與靶RNA結合，且在結合至確切位點 後以酶促方式發揮作用以切割靶RN A。 156341.doc •11- 201201819 「誘餌RNA」意指模擬配體之天然結合結構域之RNA分 子。誘_ RNA由此與天然結合乾競爭結合特異性配體。舉 例而言，已顯示HIV反式活化反應（TAR) RNA之過度表現 可用作「誘斜」並有效結合HIV tat蛋白，由此預防其結合 至在HIV RNA中編碼之TAR序列。此意欲係一具體實例。 彼等熟習此項技術者應認識到，此僅為一實例，且可易於 使用業内通常已知之技術來產生其他實施例。 本文所用之術語「單體」通常表示藉由麟酸二酯鍵或其 類似物連接以形成尺寸介於數個單體單元（例如，約34個） 至約數百個單體單元之寡核苷酸的單體。磷酸二醋鍵聯之 類似物包含··硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸曱酿、砸 代磷酸酯、胺基磷酸酯、及諸如此類，如下 *入又金面所 述。 術語「核苷酸」涵蓋天然存在之核苷酸以及非天然存在 之核苷酸。熟習此項技術者應明瞭，先前視為「非天然广 在J之各種核苷酸後來已發現於自然界中。因此，「核^ 酸」不僅包含含有已知嘌呤及嘧啶雜環之分子， 且亦包含

其雜環類似物及互變異構體。其他類型核苷酸之闞釋性A 例係含有以下部分之分子··腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺喷=貫 胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二胺基。入 疋 7 側氧美一 N6-曱基腺嘌呤、7-去氮黃嘌呤、7_去氮^ 〇 ^ 礼馬*呤、N4，N4 乙醇胞"密咬、N6，N6-乙醇-2,6-二胺基嘌呤、 T基胞0^ 啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5_氟尿嘧啶 • /昊尿喷咬、 假異胞嘧啶、2-羥基·5-甲基-4-三唑并吡啶、 心呉胞嘧啶、 I56341.doc 12 201201819 異烏嘌呤、肌苷及Benner等人之美國專利第5,432,272號中 所述之「非天然存在」核苷酸。術語「核苷酸」意欲涵蓋 每一及所有該等實例以及其類似物及互變異構體。尤其關 注之核苷酸係彼等含有腺嘌呤、烏嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧 啶、及尿嘧啶者’其係視為與人類之治療及診斷應用有關 之天然存在之核苷酸。核苷酸包含天然2·-去氧及2，-羥基糖 (例如’如 Kornberg及 Baker，DNA Replication，第 2版 (Freeman, San Francisco，1992)中所述）以及其類似物。 涉及核苷酸之「類似物」包含具有經修飾鹼基部分及/ 或經修飾糖部分之合成核苷酸（參見（例如）由以下所概述： Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980 i

Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429-4443, Toulme, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-18 » Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:1 17-139 ； Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense &

Nucleic Acid Drug Dev” 10:297-310); 2’-0、3'-C連接之 [3.2.0]雙環阿糖核苷。該等類似物包含經設計以增強結合 性質（例如’雙鏈體或三鏈體穩定性、特異性、或諸如此 類）之合成核苷酸。 本文所用之「雜交」意指募聚化合物之實質上互補鏈之 配對。一種配對機制涉及募聚化合物鏈之互補核苷或核苷 酸鹼基（核苷酸）之間的氫鍵，其可為Watson-Crick、 156341.doc •13· 201201819

Hoiigsteen或反向Hodgsteen氫鍵。舉例 , 。’腺°票呤及胸 腺嘧啶係經由形成氫鍵配對之互補核 ^ , 又雜父可在不同 在以下情形時反義化合物係「可特異性雜交」··化人物 與乾核酸之結合可干擾乾核酸之正常功能。 或活性，且存在足夠互補性程度以避免反義化合物 核酸序列在期望發生特異性結合之條件下(亦即，：活體 内分析或治療性治療情形中之生理條件下，及在活體外= 析情形中實施分析之條件下）發生非特異性結合。 本文所用之片語「嚴格雜交條件」丨「嚴格條件」舒 本發明化合物與其乾序列發生雜交、但與最少數量之^ 序列發生雜交的條件^嚴格條件具有序列依賴性且在;同 情況及本發明上下文中有所不同，藉由募聚化合物之性質 及組成及研究其之分析來測定寡聚化合物與乾序列進行雜 交的「嚴格條件」。一般而言，嚴格雜交條件包括低濃度 (<〇·15Μ)含有無機陽離子（例如^++或κ++)之鹽（亦即= 低離子強度），溫度高於2(rc_25t但低於寡聚化合物：乾 序列複合物之Tm，及存在變性劑（例如曱醯胺、二甲基曱 醯胺、二曱基亞砜）或洗滌劑十二烷基硫酸鈉（SDS)。舉例 而言，對於每一 1%甲醯胺而言，雜交速率降低1.1%。高 嚴格度雜交條件之實例係0.1X氣化鈉-擰檬酸鈉緩衝液 (SSC)/〇.1%(w/v)SDS(在 60°C 下，保持 30 分鐘）。 本文所用之「互補」係指一或兩個寡聚鏈上之兩個核苷 I之間精確配對的能力。舉例而言，若反義化合物某一位 156341.doc 201201819 置處之核鹼基能夠與靶核酸（該靶核酸係DNA、RNA、或 寡核苷酸分子）某一位置處之核鹼基發生氫鍵結，則該寡 核苷酸及該靶核酸之間發生氫鍵結之位置視為互補位置。 在每一分子中有足夠數量之互補位置由可彼此氫鍵結之核 苷酸佔據時’寡聚化合物及其他DNA、RNA、或寡核苷酸 分子彼此互補。因此，「可特異性雜交」及「互補」係用 於指示以下情形之術語：足夠數量之核苦酸中具有足夠程 度之精確配對或互補性從而寡聚化合物及靶核酸之間發生 穩定及特異性結合。 業内應理解，寡聚化合物序列無需與擬特異性雜交之其 靶核酸序列100%互補。另外，寡核苷酸可在一或多個區 段中雜交從而插入或相鄰區段並不參與雜交事件（例如， 環路結構、失配或髮夾型結構）0本發明寡聚化合物包括 與其所靶向靶核酸序列内靶區域之至少約70%、或至少約 75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至 少約95%、或至少約99。/。的序列互補性。舉例而言，反義 化合物之20個核苷酸中有18個與靶區域互補且由此特異性 雜交之反義化合物將代表90%的互補性。在此實例中，剩 餘非互補核苷酸可與互補核苷酸群集或散開且無需彼此鄰 近或與互補核苷酸鄰近。因此，長度為丨8個核苷酸且具有 4(四）個非互補核苷酸（由兩個與靶核酸完整互補之區域側 接）之反義化合物與靶核酸具有77·8%之總體互補性且由此 屬於本發明範圍内。具有靶核酸區域之反義化合物的互補 性百分比通常可使用業内已知之BLAST程式（鹼基局部對 156341.doc 15 201201819 準檢索工具）及PowerBLAST程式測得。同源性、序列一致 性或互補性百分比可藉由（例如）Gap程式（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.) 使用默認設置（其使用Smith及Waterman算法）測得（Adv. Appl, Math., (1981) 2, 482-489)。 本文所用之術語「熱力學熔點（Tm)」係指在界定離子強 度、pH、及核酸濃度下與靶序列互補之寡核苷酸中之5〇0/〇 在平衡下與乾序列雜交的溫度。通常，對於短寡核苦酸 (例如’具有10至50個核苷酸）而言，嚴格條件係彼等以下 條件：鹽濃度在pH 7.0至8.3下為至少約〇.〇1至1.0 MiNa 離子濃度（或其他鹽）且溫度為至少約3 0 。嚴格條件亦可 藉由添加諸如甲醯胺等去穩定劑來達成。 本文所用之「調節」意指增加（刺激）或降低（抑制）基因 之表現。

在用於聚核苷酸序列之背景中時，術語「變體」可涵蓋 與野生型基因有關之聚核苷酸序列。此定義亦可包含（例 如）「等位基因」、「剪接」、「物種」或「多態性」變 月3·剪接變體可與參考分子具有顯著一致性，但在mRNA 處理期間因外顯子之交替剪接而通常具有較大或較小數量 之聚核苷酸。相應多肽可擁有額外功能結構域或不存在結 構域。物種變體係在物種之間有所變化之聚核苷酸序列。 在本發明中尤其有用者係野生型基因產物之變體。變體可 源自核酸序列中之至少一個突變，且可產生改變之mRNA 156341.doc -16 - 201201819 或產生結構或功能可改變或不改變的多肽。任一給定天然 或重組基因可不具有等位基因形式、具有一種或許多等位 基因形式。產生變體之常見突變變化通常歸因於核苷酸之 天然缺失、添加、或取代。該等變化類型中之每一者可在 給定序列中單獨'或與其他者組合發生一或多次。 所得多肽通常彼此之間具有顯著之胺基酸一致性。多態 性變體係給定物種個體間特定基因之聚核苷酸序列中的變 化。多態性變體亦可涵蓋「單一核苷酸多態性」（SNp)或 單驗基突變，其中聚核苷酸序列之一個鹼基有所變化。 SNP之存在可指示（例如）某一群體具有疾病狀態傾向（亦即 相對於抗性之易感性）。 衍生聚核苷酸包含經受化學修飾（例如，氫由烷基、醯 基、或胺基代替）之核酸。衍生物（例如，衍生寡核苷酸）可 包括非天然存在之部分，例如改變之糖部分或糖間鍵聯。 該等實例性衍生物係硫代磷酸酯及業内已知之其他含硫物 質。衍生核酸亦可含有標記，包含放射性核苷酸、酶、螢 光劑、化學發光劑、發色劑、受質、輔因子、抑制劑、磁 性顆粒、及諸如此類。 衍生」多肽或肽係（例如）藉由以下方式進行修飾者： 糖基化、聚乙二醇化、磷醯化、硫酸化、還原/烷基化、 醢基化、化學偶合、或輕度福爾馬林（formalin)處理。衍 生物亦可經修飾以含有可檢測標記（直接或間接），包含但 不限於放射性同位素、螢光、及酶標記。 本文所用之術語「動物」或「患者」意欲包含（例如）人 156341.doc -17- 201201819 類、绵羊、麋鹿、鹿、長耳鹿、水紹、哺乳動物、猴子、 馬、牛、豬、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、鳥、雞、攸行 動物、魚、昆蟲及蛾》蛛。 「哺乳動物」涵蓋通常處於醫學護理下之溫血哺乳動物 (例如’人類及家養動物）。實例包含貓、犬、馬、牛、及 人類、以及僅指人類。 「治療（treating或treatment)」涵蓋對哺乳動物之疾病狀 態之治療，且包含.（a)在哺乳動物中、特定而言在該哺乳 動物易患有疾病狀態但尚未被診斷出患有該疾病狀態時預 防該疾病狀態發生；（b)抑制疾病狀態，例如阻止其發展； 及/或（c)減緩疾病狀態，例如使疾病狀態減退直至達到期 望端點為止。治療亦包含改善疾病症狀（例如，減輕疼痛 或不適），其中該改善可直接影響或可能並不直接影響疾 病（例如，起因、傳染、表現等）。 本文所用之「癌症」係指在哺乳動物中發現之所有類型 癌症或贅瘤或惡性腫瘤，其包含但不限於：白血病、淋巴 瘤、黑素瘤、癌及肉瘤。癌症自身表現為包括癌症之惡性 細胞之「腫瘤」或組織。腫瘤之實例包含肉瘤及癌，例如 但不限於：纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、 成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉 瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤 (Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰 腺癌 '乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞 癌 '腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、 156341.doc 201201819 囊腺癌、髓樣癌、枝氣管原癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽 官癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫 瘤（Wilms' tumor)、子宮頸癌、睾丸腫瘤、肺癌、小細胞 肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞 瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽 神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經母細胞 瘤、及視網膜母細胞瘤。可藉由本發明所揭示組合物治療 之額外癌症包含但不限於（例如）霍奇金氏病（H〇dgkin,s Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤（N〇n_H〇dgkin，s Lymph〇ma)、 多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、乳癌、卵巢癌、肺癌、橫 紋肌肉瘤、原發性血小板增多症、原發性巨球蛋白血症、 小細胞肺腫瘤、原發性腦腫瘤、胃癌、結腸癌、惡性胰腺 胰島素瘤、錄類癌、膀胱癌、胃癌、惡化前皮膚損傷、 睾丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、食管癌、泌 尿生殖道癌症、惡性高鈣血症、子宮頸癌、子宮内膜癌 症、腎上腺皮質癌症、及前列腺癌。術語「細胞凋亡」意 指程式性細胞死亡。其亦意指「細胞死亡」或「靶向細胞 死亡」，其發生於投與本文所述反義寡核苷酸以治療或減 幸二與未控制細胞生長及/或正常細胞凋亡及/或細胞凋亡路 徑功能失常有關之疾病或病症的情形下。 本文所用之「神經疾病或病症」係指神經系統及/或視 覺系、，先之任一疾病或病症。「神經疾病或病症」包含涉及 中柩神經系統（腦、腦幹及小腦）、周邊神經系統（包含顧神 、二）及自主神經系統（位於中樞及周邊神經系統二者中之 156341.doc -19- 201201819 部分）之疾病或病症。神經疾病或病症包含但不限於後天 性癲癇失語症；急性播散性腦脊髓炎；腎上腺腦白質營養 不良；老年性黃斑退化症；胼胝體發育不全；失認症；艾 卡迪症候群（Aicardi syndrome);亞歷山大病（Alexander disease) ’阿爾站斯病（A】pers, disease);交叉性肢體癱 痪’阿爾次海默氏病（Alzheimer's disease);血管性癡呆； 肌萎縮側索硬化，·無腦畸形；天使症候群（Angelman syndrome);灰管瘤病；缺養症；失語症；失用症；蛛網 膜囊腫，·蛛網膜炎，·阿-蔡二氏畸形（Anr〇nl Chiari malformation);動靜脈畸形；阿斯佩格症候群（Asperger syndrome);運動失調性毛細血管擴張症；注意力缺陷伴 多動病症；自閉症；自主神經功能障礙；背痛；巴登氏病 (Batten disease);貝切特氏病（Behcet's disease);貝爾麻痹 (Bell’s palsy);良性本質瞼痙攣；良性局部肌萎縮；良性 顱内兩壓，負斯旺格病（Binswanger，s disease);眼險痙 落’布洛克-蘇4貝克症候群（Bi〇ch Sulzberger syndrome); 臂叢神經損傷；腦膿腫；腦損傷；腦腫瘤（包含多形性膠 質母細胞瘤）；脊髓腫瘤；布朗-塞卡爾症候群（Br〇wn_

Sequard syndrome)，卡納萬病（Canavan disease);腕道症 候群；灼性神經痛；中樞性疼痛症候群；腦橋中央髓鞘溶 解；頭部病症；腦動脈瘤；腦動脈硬化症；大腦萎縮；大 腦性巨人症；大腦性麻痹；夏·馬-圖三氏病（Charc〇t_ Made-Tooth disease);化學療法誘導性神經病及神經性疼 痛，恰裏時形（Chiari malformation);舞蹈病；慢性炎症性 156341.doc -20- 201201819 脫髓鞘性多發性神經病；慢性疼痛；慢性區域性疼痛症候 群’科-勒一氏症候群（Coffin Lowry syndrome);昏迷，包 含持續性植物人狀態；先天性面癱；皮質基底退化；顱動 脈炎’顱縫早閉，克雅氏病（Creutzfeidt-Jakob disease); 積累性創傷病症，庫興氏症候群（Cushing's Syndrome);巨 細胞包涵體病；巨細胞病毒感染；舞蹈眼-舞蹈足症候 群，丹-沃二氏症候群（DandyWalker syndrome);道森病 (Dawson disease);德摩西埃症候群（De Morsier's syndrome);克隆普克-克隆普克症候群（Dejerine_Klumke palsy)，癡呆；皮肌炎；糖尿病神經病變；彌漫性硬化； 自主神經機能異常；書寫困難；誦讀困難；張力失常；早 期幼兒癲癇性腦病；空蝶鞍症候群；腦炎；腦疝；腦三又 神經血管瘤病；癲癇症；歐勃麻痹⑺吒、palsy);特發性 震顫；法布裏病（Fabry's disease);法爾症候群（Fahr，s syndrome);昏厥；家族性痙攣性癱瘓；發熱性驚厥；菲 希爾症候群（Fisher syndrome);弗裏德賴希共濟失調症 (Friedreich's ataxia);額顳骨癡呆症及其他「tau病變」； 高歇氏病（Gaucher’s disease);格斯特s症候群 (Gerstmann’s syndrome);巨細胞動脈炎；巨細胞性包涵體 病；球樣細胞腦白質營養不良；格-巴_沐& > w 〇 —久症候群 (Guillain-Barre syndrome); HTLV-1相關性脊髓病；必斯 二氏病（Hallervorden-Spatz disease);頭部損傷.頭，广.半 ma 面痙攣；遺傳性痙攣性截癱；遺傳病性多神經炎樣共芦ι失 調；耳部帶狀皰疹；帶狀皰疹；平山症候群（Hiraya 156341.doc -21 · 201201819 syndrome) ; HIV相關性癡呆及神經病（以及AIDS之神經表 現），前腦無裂畸形；亨廷頓病（Huntington's disease)及其 他聚麩胺醯胺重複疾病；積水性無腦畸形；腦積水；皮質 醇增多症；缺氧；免疫介導性腦脊髓炎；包涵體肌炎；色 素失調症；嬰兒植烷酸貯積病；嬰兒雷弗蘇姆病（infantile refsum disease);嬰兒痙攣；炎性肌病；顱内囊腫；顱内 高壓；朱伯特症候群（Joubert syndrome);科姆斯-塞爾症 候群（Keams-Sayre syndrome)；肯尼迪氏病（Kennedy disease)，金斯布林納症候群（Kinsboume syndrome);克-費二氏症候群（Klippel Feil syndrome);克拉伯病（Krabbe disease)，庫格爾貝格-韋蘭德病（Kugelberg-Welander disease)，庫魯病（kuru);拉福拉病（Lafora disease);朗-愛 二氏肌無力症候群（Lambert-Eaton myasthenic syndrome); 蘭達克萊夫納症候群（Landau-Kleffner syndrome);延髓外 側（瓦儉貝克（Wallenberg))症候群；學習失能；利氏病 (Leigh's disease);倫諾克斯-加斯托症候群（Lennox-Gustaut syndrome);萊-萘二氏症候群（Lesch-Nyhan syndrome)，腦白質營養不良症；路易體瘋呆（Lewy body dementia);無腦回；閉鎖症候群；盧-格裏格病（L〇u Gehrig's disease)(亦即，運動神經元病或肌萎縮側索硬 化）’腰椎間盤病；萊姆病（Lyme disease)-神經後遺症； 馬-約病（Machado-Joseph disease);腦肥大；巨腦；邁-羅 一氏症候群（Melkersson-Rosenthal syndrome);美尼爾症 (Menieres disease);髓膜炎；門克斯病（Menkes disease); 156341.doc •22- 201201819 米勒.費希 粒線體肌 異染性腦白質營養不良；小頭畸型；偏頭痛 爾症候群（Miller Fisher syndrome);小中風 病，默比烏斯症候群（Mobius syndrome);單肢肌萎縮；運 動神經元病；腦底異常血管網病；黏多糖累積病；多發梗 塞性癡呆；多灶性運動神經病；多發性硬化及其他去髓鞘 病症；具有位置性低血壓之多系統萎縮；肌營養不良症； 重症肌無力；去髓鞘彌漫性硬化；嬰兒肌陣攣性腦病；肌 陣攣，肌病；肌強直；嗜眠症；神經纖維瘤，病；神經阻滞 劑惡性症候群；AIDS之神經表現；狼瘡之神經後遺症； 神經性肌強直；神經元臘樣脂褐質症；腦神經元移行異 常，尼曼皮克病（Niemann-PickdiSease);奥沙利文麥克勞 德病症（0'SUllivan_McLe〇d syndrome);枕部神經痛；隱性 脊柱神經管閉合不全序列徵；大田原症候群⑽地咖 syndrome);撖欖體腦橋小腦萎縮；斜視性眼陣攣；視神 經炎；直立性低血壓；過度使用症候群；感覺異常；神經 退化性疾病或病症（帕金森氏病（Parkinson，s disease)、亨廷 頓病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮側索硬化(ALs)、癡呆、 多發性硬化及與神經元細胞死亡有關之其他疾病及病 症）；先天性副肌強直症；副腫瘤性疾病；陣發性發作； 帕-羅二氏症候群（Parry Romberg syndr〇me);佩_梅二氏病 (Pelizaeus-Merzbacher disease);週期性癱瘓；周邊神經 病；疼痛性神經病及神經性疼痛；持續性植物人狀態；全 身性發育遲緩；旋光性喷嚏反射；㈣酸貯積病；匹克病 (Pick’s disease);神經挾捏；垂體瘤；多肌炎，·腦穿通畸 I56341.doc •23· 201201819 形；小兒麻痹症後期症候群；帶狀皰疹後神經痛；咸染後 腦脊髓炎；體位性低血壓；帕-魏二氏症候群（Prader_Wi出 syndrome);原發性側索硬化症；朊病毒病；進行性一側 面萎縮；進行性多灶性白質腦病；進行性硬化性灰質萎 縮；進行性核上麻痹；假腦瘤；拉姆齊-亨特症候群 (Ramsay-Hunt Syndr〇me)(I及II型）；羅斯默森氏腦炎 (Rasmussen’s encephalitis);反射性交感神經營養不良症候 群；雷夫敘姆病（Refsum disease);重複性運動病症；重複 性壓迫損傷；不寧腿症候群；反轉錄病毒相關性脊髓病； 蕾特氏症候群（Rett syndrome);雷依氏症候群（Reye,s syndrome);舞蹈病（Saint Vitus dance);山德霍夫氏病 (Sandhoff disease);謝耳德病（Schilder，s disease);腦裂； 透明隔-視神經發育不良；驚嚇嬰兒症候群；帶狀皰療； 夏伊-德雷格症候群（Shy-Drager syndrome);薛格連氏症候 群（Sjogren's syndrome);睡眠呼吸暫停；索托斯症候群 (Soto’s syndrome);痙攣狀態；脊柱裂；脊髓損傷；脊髓 腫瘤；脊趙性肌萎縮；僵人症候群（Stiff Pers〇n syndrome);中風·，斯特奇-韋伯二氏症候群（Sturge Weber syndrome) ’·亞急性硬化性全腦炎；皮層下動脈硬化性腦 病，西德納姆舞蹈病（Sydenham chorea);暈厥；脊髓空洞 症；遲發性運動障礙；泰-薩克斯病（Tay_Sachs disease); 顳動脈炎；脊髓牽扯症候群；湯姆森病（Th〇msen disease);胸廓出口症候群；三叉神經痛症（Tic Douloureux);托德氏麻痹（T〇dd，s paralysis);多動穢語症 156341.doc • 24 - 201201819 候群；短暫性腦缺血發作；傳播性海綿狀腦病；橫貫性脊 髓炎；外傷性腦損傷；顫抖；三又神經痛；熱帶痙攣性輕 截癱；結節性硬化症；血管性癡呆（多發梗塞性癡呆）；血 I炎’包含顳動脈炎，希林二氏病（V〇n Hippel-Lindau disease);瓦倫伯格氏症候群（Wallenberg's syndrome);韋 德尼希-霍夫曼病（Werdnig-Hoffman disease);韋斯特病 (West syndrome);頸椎戮傷；威廉斯症候群（Williams syndrome)，威爾森氏病（wildon's disease);及澤韋格症候 群（Zellweger syndrome)。 「增殖性疾病或病症」包含但不限於涉及以下細胞之造 血腫瘤性病症：源於骨髓樣、淋巴樣或紅血球譜系之造也 源的增生性/腫瘤性細胞、或其前體細胞。該等疾病包含 但不限於成紅細胞白血病、急性前骨髄性白血病 (APML)、慢性髓性白血病（Cml)、淋巴樣惡性腫瘤（包含 但不限於急性成淋巴細胞性白血病（ALL)，其包含B-譜系 ALL及T-譜系ALL)、慢性淋巴細胞白血病（CLL)、幼淋巴 細胞白血病（PLL)、多毛細胞白血病（HLL)及沃爾登斯特倫 巨球蛋白企症（Waldenstrom's macroglobulinemia)(WM)。 惡性淋巴瘤之其他形式包含但不限於非霍奇金氏淋巴瘤及 其變體、周邊T細胞淋巴瘤、成人τ細胞白血病/淋巴瘤 (ATL)、皮膚T細胞淋巴瘤（CTCL)、巨粒淋巴細胞白血病 (LGF)、霍奇金氏病及裏德-斯藤伯格病（Reed_Sternberg disease) ° 「血液疾病或病症」包含影響造血細胞或組織之疾病、 156341.doc -25- 201201819 病症、或病狀。血液病症包含與異f血液含量或功能有關 之疾病、病症、或病狀。血液病症之實例包含源自骨髓韓 照或癌症化學療法治療之病症、諸如 -、出血❿、溶血性貧，、再生障礙性貧血、錄狀細 胞性貧血、鐵粒幼細胞貧血、與慢性感染（例如癌疾、錐 蟲病、HIV、肝炎病毒或其他病毒）有關之貧血、由骨髓缺 失引起之骨髓病性貧血、源自貧血之腎衰竭、貧血、紅細 胞增多症、感染性單核細胞增多症（IM)、急性非淋巴細胞 性白血病（ANLL)、急性髓性白血病（AML)、急性早幼粒細 胞白血病（APL)、急性粒-單核細胞白血病（AMM〇L)、真性 紅細胞增多症、淋巴瘤、急性淋巴細胞白血病（ALL)、慢 性淋巴細胞白血病、維爾姆斯腫瘤（Wilm，s tum〇r)、尤因 氏肉瘤（Ewing’s sarc〇ma)、視網膜母細胞瘤、血友病、與 血检形成風險增加有關之病症、跑療、地中海貧血、抗體 誘導之病症（例如輸血反應及成紅細胞增多病）、紅血細胞 之機械性創傷（例如微血管病性溶血性貧血、血栓性血小 板減少性紫癜及彌漫性血管内凝血）、由寄生蟲（例如癌原 愚）引起之感染、來自（例如）鉛中毒之化學性損傷、及脾功 能亢進。淋巴系統疾病包含但不限於淋巴結炎、淋巴管擴 張、淋巴管炎、淋巴水腫、淋巴囊腫、淋巴組織增殖性病 症、皮膚黏膜淋巴結症候群、網狀内皮組織增殖、脾疾 病、胸腺增生、胸腺腫瘤、肺結核、淋巴結、假性淋巴 瘤、及淋巴異常。淋巴造jk系統之病症包含但不限於非霍 奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、及反應性淋巴樣組 15634l.doc 26· 201201819 織增生。 聚核皆SllL及养核苦酸組合物及分子 與：在一實施例中，靶包括類BCL2 11 (BCL2L11)之核 酸序列’包含（不限於）與BCL2L11有關之有義及/或反義非 編碼及/或編碼序列。

Bcl-2家族蛋白之成員在結構上相似，但具有不同活 性°此蛋白家族分為「促凋亡」家族成員（亦即Bax、 Bak、Bok)、及「促存活」家族成員（亦即Bci_2、Bcl-XL、Bcl-w) ^前者可進一步細分為彼等含有bh3結構域之 蛋白質及彼等缺乏BH3結構域之蛋白質。人們認為，BH3 結構域可有利於該等蛋白質直接結合至「促存活」蛋白， 由此可抑制「促存活」活性並促進細胞死亡或細胞凋亡。 人類BCL2L11基因座位於染色體2qi 3上，其編碼198個 胺基酸之蛋白質，該蛋白質在結構上及功能上與促凋亡 BCL2家族成員之唯BH3類相關。基因在不同人類腫瘤中頻 繁突變，從而導致BCL2L11活性損失。藉由不同範圍之細 胞凋亡刺激（例如缺失生長因子/細胞因子、電離輻射、及 細胞毒性肽）來誘導BCL2L11之表現。 在一實施例中，使用反義寡核苷酸來預防或治療與 BCL2L11家族成員有關之疾病或病症。可使用自利用反義 化合物所獲得幹細胞再生之細胞/組織治療之實例性類 BCL2 11 (BCL2L11)介導的疾病及病症包括：癌症、異常 細胞〉周亡、增殖性疾病或病症、與粒線體細胞凋亡路徑有 關之疾病或病症、白血病、自體免疫性疾病或病症、與免 156341.doc •27- 201201819 疫性受損有關之疾病或病症、感染、過度增殖性病症、生 殖組織之過度增殖（例如子宮癌、睾丸癌及㈣癌、子宮 内膜異位症、及子宮頸之鱗狀、腺體上皮癌等）、神經學 疾病或病症、與發育中胚胎有關之發育病症、血液疾病或 病症、組織體内穩態受損、類風濕關節炎、敗血病、視網 膜神經節細胞死亡'肝病及腎病。 在一實施例中，對有需要之患者實施藉由一或多種反義 寡核苷酸來調節BCL2L11，從而預防或治療與BCL2LU異 常表現、功能、活性（與正常對照組相比）有關的任一疾病 或病症。 在一實施例中，寡核苷酸對BCL2L11之聚核苷酸具有特 異性’其包含（不限於）非編碼區域^ BCL2L11靶包括 BCL2L11之變體；BCL2L11之突變體，包含SNP ; BCL2L11之非編碼序列；等位基因、片段及諸如此類。較 佳地，寡核苷酸係反義RNA分子。 根據本發明實施例’靶核酸分子並不僅限於BCL2L11聚 核苦酸而是擴展至BCL2L11之任一同功型、受體、同系 物、非編碼區域及諸如此類。 在一實施例中，寡核苷酸靶向BCL2L11靶之天然反義序 列（編碼及非編碼區域之天然序列），其包含（不限於）其變 體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及互補序 列。較佳地，寡核苷酸係反義RNA或DNA分子。 在一實施例中，本發明之寡聚化合物亦包含在該化合物 中之一或多個核苷酸位置存在不同鹼基的變體。舉例而 156341.doc •28· 201201819 言’若第一核苷酸係腺嘌呤，則可產生在此位置含有胸 普、鳥苷、胞苷或其他天然或非天然核苷酸之變體。此可 發生於反義化合物之任一位置。然後使用本文所述方法測 試該等化合物以測定其抑制靶核酸表現之能力。 在一些實施例中，反義化合物及靶之間之同源性、序列 一致性或互補性為約50%至約60%。在一些實施例中，同 源性、序列一致性或互補性為約6〇%至約7〇%〇在一些實 施例中’同源性、序列一致性或互補性為約70〇/〇至約 80%。在一些實施例中，同源性 '序列一致性或互補性為 約80%至約90%。在一些實施例中，同源性、序列一致性 或互補性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約 97%、約 98%、約 99%或約 1〇〇%。 在以下情形時反義化合物係可特異性雜交：化合物與乾 核酸之結合可干擾靶核酸之正常功能而導致活性損失，且 存在足夠互補性程度以避免反義化合物與非乾核酸序列在 期望發生特異性結合之條件下發生非特異性結合。該等條 件包含（亦即）活體内分析或治療性治療情形下之生理條 件、及在活體外分析情形下實施分析之條件。 在以下情形下反義化合物（不論係DNA、RNA、嵌合化 合物、或經取代化合物等）可特異性雜交：該化合物與靶 DNA或RNA分子之結合可干擾靶DNA或RNA之正常功能而 導致實用性損失，且存在足夠互補性程度以避免反義化合 物與非靶序列在期望發生特異性結合之條件下（亦即，^ 活體内分析或治療性治療情形下之生理條件下，或在活體 156341.doc • 29- 201201819 外分析情形下實施分析之條件下）發生非特異性結合β 在一實施例中’無向BCL2L11(包含（不限於）使用（例 如）PCR、雜交等鑑別及擴展之反義序列、如SEq ID Ν〇: 2 及3所示之序列之一或多者及諸如此類）可調節bcl2L 11之 表現或功能。在一實施例中，與對照組相比上調表現或功 能。在一實施例中，與對照組相比下調表現或功能。 在一實施例中’寡核苷酸包括如SEQ ID NO: 4至13所示 之核酸序列，包含使用（例如）PCR、雜交等鑑別及擴展之 反義序列。該等寡核苷酸可包括一或多個經修飾核苦酸' 較短或較長片段、經修飾鍵及諸如此類。經修飾鍵或核普 酸間鍵聯之實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或諸如此 類。在一貫細》例中’核音酸包括填衍生物。可附接至本發 明經修飾寡核苷酸中之糖或糖類似物部分之磷衍生物（或 經修飾磷酸酯基團）可為單磷酸酯、二磷酸酯、三填酸 酯、磷酸烷基酯、烷磷酸酯、硫代磷酸酯及諸如此類。上 述鱗酸醋類似物之製備、及其進入核苷酸、經修飾核苷酸 及募核苷酸中之方法本身亦已知且無需闡述於本文中。 彼等熟習此項技術者亦在治療應用中利用反義寡核皆酸 之特異性及敏感性。採用反義寡核苷酸作為治療部分來治 療動物及人類之疾病狀態。反義募核苷酸已安全且有效地 投與人類且當前正實施許多臨床試驗。由此確定，寡核苷 酉文可為可經設置用於治療細胞、組織及動物（尤其人類）之 治療方案中的有用治療方式。 在本發明實施例中，寡聚反義化合物、尤其寡核苷酸會 156341.doc 201201819 結合至乾核酸分子並調節由靶基因編碼之分子的表現及/ 或功能。擬干擾之DNA功能包括（例如）複製及轉錄。擬干 擾之RNA功能包括所有重要功能，例如，RNA至蛋白質轉 譯位點之移位、蛋白.質自RNA之轉譯、使RNA產生一或多 種mRNA物質之剪接、及RNA可參與或促進之催化活性。 可端視期望功能來上調或抑制功能。 反義化合物包含反義寡聚化合物、反義募核苷酸、外部 引導序列（EGS)券核苷酸、交替剪接、引物、探針、及其 他與靶核酸之至少一部分雜交的寡聚化合物。因此，該等 化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈、或環狀寡聚化合物形 式引入。 在本發明之上下文中，反義化合物至特定核酸分子之乾 向可為多步過程。該過程經常始於鑑別調節功能之靶核 酸。舉例而言，此靶核酸可為表現與特定病症或疾病狀態 有關之細胞基因（或自該基因轉錄之mRNA)或來自傳染原 之核酸分子。在本發明中，靶核酸編碼類bcl2 u (BCL2L11)。 靶向過程經常亦包含測定靶核酸内發生反義相互作用從 而產生期望效應（例如，調節表現）的至少一個靶區域、區 段、或位點。在本發明之上下文内，術語「區域」定義為 靶核酸中具有至少一個可鑑別結構、功能、或特性的一部 分。靶核酸之區域内具有區段。「區段」定義為靶核酸内 區域之較小或子部分。本發明所用之「位點」定義為乾核 酸内之位置。 156341.d〇) 31 201201819 在一實施例中，反義寡核苷酸結合至類BCL2 11 (BCL2L11)之天然反義序列並調節BCL2L11 (SEQ ID NO: 1)之表現及/或功能。反義序列之實例包含SEqNO: 2至 13 〇 在一實施例中’反義寡核苷酸結合至類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之一或多個區段並調節Bcl2L1 1之表 現及/或功能。區段包括BCL2L11有義或反義聚核苷酸之 至少5個連續核苷酸。 在一實施例中，反義寡核苷酸對BCL2L11之天然反義序 列具有特異性，其中寡核苷酸與BCL2L11之天然反義序列 之結合可調節BCL2L11的表現及/或功能。 在一實施例中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID NO: 4至 13所示之序列、使用（例如）PCR、雜交等鑑別及擴展之反 義序列。該等寡核苷酸可包括一或多個經修飾核苷酸、較 短或較長片段、經修飾鍵及諸如此類。經修飾鍵或核苷酸 間鍵聯之實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或諸如此 類。在一實施例中，核苷酸包括磷衍生物。可附接至本發 明經修飾寡核苷酸中之糖或糖類似物部分之破衍生物（或 經修飾填酸酯基團）可為單鱗酸酯、二填酸酯、三磷酸 酯、磷酸烷基酯、烷磷酸酯、硫代磷酸酯及諸如此類。上 述填酸酯類似物之製備、及其在核苷酸、經修飾核苷酸及 寡核苷酸中之納入本身亦已知且無需闡述於本文中。 如業内已知，因轉譯起動密碼子通常係5’-AUG(在轉錄 mRNA分子中；在相應DNA分子中係5'-ATG)，轉譯起動密 156341.doc -32· 201201819 碼子亦稱為「AUG密碼子」'「起始密碼子」或「八卩^起 始密碼子」。少數基因具有轉譯起動密碼子，其具有rna 序列 5，-GUG、51-UUG 或 51-CUG，·且已顯示 5，_AUA、 ACG及5’-CUG可在活體内發揮作用。因此，即使起動胺基 酸在每一情形令通常係甲硫胺酸（在真核生物令）或甲醯甲 硫胺酸（在原核生物中），術語「轉譯起動密碼子」及「起 始密碼子」亦可涵蓋多種密碼子序列◊真核生物及原核生 物基因可具有兩個或更多個替代性起始密碼子，其令之任 一者可優先用於在特定細胞類型或組織中或在特定條件組 下之轉譯起動。在本發明之上下文中，「起始密碼子」及 「轉譯起動密碼子」係指用於在活體内起動自編碼類 BCL2 11 (BCL2L11)之基因轉錄之mRNA之轉譯的一或多 個密碼子，不管該等密碼子之序列如何。基因之轉譯終止 密碼子（或「停止密碼子」）可具有三種序列（亦即，5·· UAA、5'-UAG及 5I-UGA，相應 DNA序列分別係 5,_TAA、 5’- TAG及 5’-TGA)中之一者。 術δ吾起始密碼子區域」及「轉譯起動密碼子區域」係 指此一 mRNA或基因中在來自轉譯起動密碼子之任一方向 (亦即，5或3’）涵蓋約25至約50個鄰近核苷酸的一部分。同 樣術停止岔碼子區域」及「轉譯終止密碼子區域」 係指此一 mRNA或基因中在來自轉譯終止密碼子之任一方 向（亦即，5’或3’）涵蓋約25至約50個鄰近核苷酸的一部分。 因此，起始密碼子區域」（或「轉譯起動密碼子區域」） 及「仔止密碼子區域」（或「轉譯終止密碼子區域」）係本 156341.doc -33- 201201819 發明反義化合物可有效乾向之所有區域。 業内已知之開放讀碼框（ORF)或「編碼區域」係指轉譯 起動密碼子及轉譯終止密碼子之間之區域，其亦係可有效 靶向之區域。在本發明之上下文内，靶向區域係涵蓋基因 之開放讀碼框（ORF)之轉譯起動或終止密碼子的基因内區 域。 另一靶區域包含業内已知之5|非轉譯區域（5，UTR),其係 指在來自轉譯起動密碼子之5,方向上之mRNA部分，且由 此包含mRNA之5’加帽位點及轉譯起動密碼子間之核苷酸 (或基因上之相應核苷酸）。另一靶區域包含業内已知之3, 非轉譯區域（rUTR)，其係指在來自轉譯終止密碼子之3，方 向上之mRNA部分，且由此包含mRNA之轉譯終止密碼子 及3’端間之核苷酸（或基因上之相應核苷酸卜mRNAi5，加 巾目位點包括經由5’-5’三磷酸酯鍵聯接合至mRNA之5'-最殘 基之N7-曱基化鳥苷殘基。mRNA25，加帽區域視為包含y 加帽結構本身以及與加帽位點相鄰之前5〇個核苷酸。本發 明之另一乾區域係5'加帽區域。 儘管一些真核生物mRNA轉錄本可直接轉譯，但許多真 核生物mRNA轉錄本含有一或多個在轉譯之前自轉錄本切 割且稱為「内含子」的區域。剩餘（且由此轉譯）區域稱為 「外顯子」且一起剪接以形成連續mRNA序列。在一實施 例中，靶向剪接位點（亦即，内含子_外顯子結點或外顯子_ 内含子結點）尤其可用於異常剪接與疾病有關 '或特定剪 接產物之過度產生與疾病有關之情形中。因重排或缺失產 156341.doc

-34- 201201819 生之異常融合結點係靶位點之另一實施例。經由自不同基 因源剪接兩個（或更多）mRNA之過程產生之mRNA轉錄本稱 為「融合轉錄本」。可使用靶向（例如）DNA或mRNA前體 之反義化合物來有效無向内含子。 在一實施例中，反義寡核苷酸結合至靶聚核苷酸之編碼 及/或非編碼區域並調節靶分子之表現及/或功能。 在一實施例中，反義寡核苷酸結合至天然反義聚核苷酸 並調節靶分子之表現及/或功能。 在一實施例中，反義寡核苷酸結合至有義聚核苷酸並調 節靶分子之表現及/或功能。 替代性RNA轉錄本可自DNA之相同基因組區域產生。該 等替代性轉錄本通稱為「變體」。更特定而言，「mRNA 前體變體」係自相同基因組DNA產生之轉錄本，其與自相 同基因組DNA產生之其他轉錄本在起始或停止位置方面有 所不同且含有内含子及外顯子序列。 在剪接期間切割一或多個外顯子或内含子區域、或其部 分時，mRNA前體變體會產生較小「mRNA變體」。因 此，mRNA變體係經處理之mRNA前體變體且每一唯一 mRNA前體變體必須始終藉由剪接而產生唯一 mRNA變 體。該等mRNA變體亦稱為「交替剪接變體」。若mRNA 前體變體未發生剪接，則mRNA前體變體與mRNA變體相 同。 變體可經由使用起始或停止轉錄之交替信號來產生。 mRNA前體及mRNA可具有一個以上之起始密碼子或停止 156341.doc -35- 201201819 密瑪子。源自使用替代性起始密碼子之祕前體或 mRNA的變體稱為mRNA前體或抓财之「替代性起始變 體」。彼專使用替代性停止麥琪m丄 疗止在碼子之轉錄本稱為mRNA前 體或mRNA之「替代性停止變體」。替代性停止變體之一 種具體類型係「P〇lyA變體」，其中所產生之多個轉錄本 源自轉錄機對於「p〇lyA停止信號」中之一者之替代性選 擇，由此產生在唯一polyA位點終止之轉錄本。在本發明 之上下文内，本文所述變體之類型亦係靶核酸之實施例。 靶核酸上與反義化合物雜交之位置至少定義為靶區域中 由活性反義化合物靶向之長5個核苷酸的部分。 儘管本文中闡述了某些實例性靶區段之特異性序列，但 熟習此項技術者應認識到，該等序列用於闡釋及闡述本發 明範圍内之特定實施例。熟習此項技術者根據本揭示内容 可容易地鑑別其他起區段。 人們認為長度為5-1 00個核苷酸且包括一段至少五（5)個 選自較佳闡釋性輕區段之連續核苦酸之乾區段亦適於拓 向0 輕區段可包含DNA或RNA序列，其包括至少5個來自較 佳闡釋性靶區段中之一者之5，_末端之連續核苷酸（剩餘核 苷酸係同一 DNA或RNA中之連續的一段，其緊接靶區段之 5'-末端上游開始並持續至該DNA或RNA含有約5至約1〇〇個 核苷酸為止）。同樣，較佳靶區段表示為DNA或RNA序 列’其包括至少5個來自較佳闡釋性靶區段中之一者之3，_ 末端之連續核苷酸（剩餘核苷酸係同一 DNA或RNA中之連 I56341.doc •36· 201201819 續的一段，其緊接靶區段之3,_末端下游開始並持續至該 DNA或RNA含有約5至約1〇〇個核苷酸為止）。瞭解本文所 示無區ί又之熟習此項技術者無需過多實驗即能鑑別其他較 佳靶區段。 .監另·]或夕個乾區域、區段或位點後，即可選擇组乾充 分互補（亦即雜交足夠充分且具有足夠特異性）之反義化合 物以得到期望效應。 在本發明實施例中，寡核苷酸結合至特定靶之反義股。 寡核苷酸之長度為至少5個核苷酸且可經合成以使每一寡 核苦酸皆乾向重疊序列，從而寡核㈣經合成以覆蓋乾聚 核苦酸之整個長度。乾亦包含編碼以及非編碼區域。 在一實施例中，反義寡核苷酸較佳靶向特異性核酸。反 義化δ物至特疋核酸之乾向係多步過程。該過程經常始於 鑑別調節功能之核酸序列。此可（例如）係表現與特定病症 或疾病狀態有關之細胞基因（或自基因轉錄之mRNA)、或 非編碼聚核苷酸（例如，非編碼RNA (ncRNA))。 RNA可分類為（丨）信使1^八（mRNA)，其轉譯成蛋白質； 及（2)非蛋白編碼性RNA (ncRNA)。ncRNA包括微小rna、 反義轉錄本及含有高密度停止密碼子且缺乏任一廣泛性 (extensive)「開放讀碼框」的其他轉錄單元。許多 ncRNA似乎始於編碼蛋白質之基因座之3，非轉譯區域 (3 UTR)中之起動位點。ncRNA通常較罕見且fant〇m聯 盟已測序之ncRNA中至少一半似乎未經聚腺苷酸化。大部 刀研九者出於明顯原因而著重關注經處理並輸出至細胞質 156341.doc •37· 201201819 中之聚腺苷酸化mRNA。最近，顯示非聚腺苷酸化核rna 之組可能極大，且許多該等轉錄本源自所謂的基因間區 域。ncRNA可調控基因表現之機制係與靶轉錄本之鹼基配 對。藉由鹼基配對發揮作用之RNA可分組為：（1)順式編碼 之RNA，其在其發揮作用之相同遺傳位置、但在rna之相 對鏈處編碼且由此顯示與其靶之完全互補性；及（2)反式編 碼之RNA，其在與其發揮作用之RNA不同的染色體位置處 編碼且通常並不顯示與其靶之完全鹼基配對潛力。 不期望受限於理論，本文所述反義寡核苷酸對反義聚核 苷酸之干擾可改變相應有義信使RNA之表現。然而，此調 控可不協調（反義弱化（knockdown)造成信使rna增加）或協 調（反義弱化造成伴隨信使RNA減少）。在該等情形下，反 義寡核苷酸可靶向反義轉錄本之重疊或非重疊部分以產生 弱化或隔絕（sequestration)。可以相同方式靶向編碼以及非 編碼反義轉錄本，且任一種類皆能以協調或不協調方式調 控相應有義轉錄本。在鑑別針對靶使用之新寡核苷酸時採 用的策略可基於藉由反義寡核苷酸來弱化反義RNA轉錄本 或調節期望輕的任一其他方式。 灰够7 .在不協调調控之情形下，弱化反義轉錄本會增 加習用（有義）基因之表現。若後一基因編碼已知或假定藥 物靶’則可設想弱化其反義對等部分來模擬受體激動劑或 酶刺激物之作用。 茗略2 :在協調調控之情形下，可同時弱化反義及有義 轉錄本且由此協同性降低習知（有義）基因表現。舉例而 156341.doc •38· 201201819 舌’若使用反義寡核苷酸來達成弱化，則可使用此策略來 應用種輕向有義轉錄本之反義寡核芽酸及乾向相應反義 轉錄本之另一反義寡核苷酸、或同時靶向重疊有義及反義 轉錄本之單一能量對稱性反義寡核苷酸。 根據本發明，反義化合物包含反義寡核苷酸、核糖酶、 外。卩引導序列（EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單_或雙鏈 RNA干擾（RNAi)化合物（例如siRNA化合物）、及與靶核酸 之至少一部分雜交並調節其功能之其他寡聚化合物。因 此，其可為DNA、RNA、類DNA、類RNA、或其混合物， 或可為該等物質中一或多者之模擬物。該等化合物可為單 鍵、雙鏈、環狀或髮夾型募聚化合物，且可含有諸如内部 或末端膨脹、失配或環路等結構要素。反義化合物通常製 成直鏈形式’但可經接合或以其他方式製成環狀及/或具 支鏈形式。反義化合物可包含諸如以下構築體：經雜交以 形成完全或部分雙鏈化合物之兩股，或具有足夠自體互補 陡以進仃雜交並形成完全或部分雙鏈化合物之單鍵。兩條 鍵可在内部連接’以產生游離3,或5,末端，或可連接形成 ^續髮夹型結構或環路。髮夾型結構可在5,或Γ末端含有 懸垂部分，以延長單 ▲人4 之長早鏈特徵。雙鏈化合物視需要可在末端 吐含懸垂部分。装仙彳欠名 其他修飾可包含附接至一個末端、所選核 發酸位置、糖位置或 „ ^ ^附接至一個核苷間鍵聯之偶聯基團。 另一選擇為，兩條鏈可經 、由非核駄部分或連接體基團進行 連接。若自僅由一停錘形士、士 八m 条鍵t成時，dsRNA可呈自體互補髮夾 型分子形式，JL自畚料4匕 、斤以形成雙鏈體。因此，dsRNA可 156341.doc .39· 201201819 c^NA麥t 。可藉由在轉基因細胞系中穩定表現 N々夾型來特異性調節㈣表現，^，在-歧實施 例中，基因表現或功能經上調。若由兩條鍵、或呈自體互 補髮夹型分子形式(自身對折以形成雙鍵體)之單鏈形成 時’兩條鏈（或單鏈中形成雙鏈體之區域）係依偏_ Cnck方式鹼基配對之互補RNA鏈。 引入系統中之後’本發明化合物可引發_或多種酶或結 構蛋白質之作用’以實現靶核酸之裂解或其他修飾或可經 由基於佔據之機制進行作用。—般而t，核酸（包含募核 苦酸）可闡述為「類DNA」（亦即，通常具有一或多個2，_去 氧糖及（通常）T而非U鹼基）或「類RNA」（亦即，通常具有 一或多個2，-羥基或2，-修飾糖及（通常}u而非τ鹼基）。核酸 螺旋可採用一種以上之結構類型，最通常係Α型及8型。 據信’一般而言，具有Β型樣結構之募核苷酸係「類 DNA」且彼等具有Α型樣結構者係「類rNA」^在一些（截 合）實施例中’反義化合物可含有A-及B-型區域。 在一實施例中，期望寡核苷酸或反義化合物包括以下中 之至少一者：反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、 包括經修飾鍵聯之反義寡核苷酸、干擾RNA(RNAi)、短干

擾 RNA (siRNA);微小干擾 RNA (miRNA);小時序 RNA (stRNA);或短髮夾型RNA (shRNA);小RNA誘導之基因 活化（RNAa);小活化RNA(saRNA)、或其組合。 dsRNA亦可活化基因表現，此機制稱為「小RNA誘導之 基因活化」或RNAa。靶向基因啟動子之dsRNA可誘導相 156341.doc -40- 201201819 關基因之有效轉錄活化》在使用合成dsRNA(稱為「小活 化RNA」（saRNA))之人類細胞中顯示RNAa。當前尚未瞭 解，在其他有機體中RNAa是否保守。 已發現，小雙鏈RNA (dsRNA)(例如小干擾RNA (siRNA) 及微小RNA (miRNA))係稱為RNA干擾（RNAi)之進化保守 機制的觸發物^ RNAi通常經由重塑染色質以由此阻抑轉 錄來引起基因沉默，從而降解互補mRNA、或阻斷蛋白質 轉譯。然而，在詳細闡述於下文實例部分之情形下，顯示 寡核苷酸可增強類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸及其編碼 產物之表現及/或功能《 dsRNA亦可用作小活化RNA (saRNA)。不期望受限於理論，藉由乾向基因啟動子中之 序列’ saRNA可誘導靶基因表現，此現象稱為dsRNA誘導 之轉錄活化（RNAa)。 在另一實施例中，本文所鑑別之「較佳靶區段」可用於 篩選調節類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之表現之額外化 合物《「調節劑」係彼等如下化合物：可降低或增加編碼 BCL2L11之核酸分子之表現，且至少包括與較佳靶區段互 補之5-核苷酸部分。篩選方法包括以下步驟：使編碼 BCL2L11之有義或天然反義聚核苷酸之核酸分子的較佳靶 區段與一或多種候選調節劑接觸，且選擇一或多種可降低 或增加編碼BCL2L11聚核苷酸之核酸分子（例如SEq m NO: 4至13)之表現的候選調節劑。若顯示一或多種候選調 節劑能夠調節（例如降低或增加）編碼bCL2LU聚核苷酸之 核酸分子的表現，則該調節劑可用於BCL2L1丨聚核苷酸功 156341.doc • 41 201201819 能之其他調查性研究，或用作本發明之研究、診斷、或治 療藥劑。 靶向天然反義序列較佳地可調節靶基因之功能。例如， BCL2L11基因（例如，登錄號為nm_207002)。在一實施例 中’乾係BCL2L11基因之反義聚核皆酸。在一實施例中， 反義寡核苷酸靶向BCL2L11聚核苷酸（例如，登錄號為 NM—207002)之有義及/或天然反義序列、其變體、等位基 因、同功型、同系物、突變體、衍生物、片段及互補序 列。較佳地，寡核苷酸係反義分子且靶包含反義及/或有 義BCL2L11聚核苷酸之編碼及非編碼區域。 本發明之較佳靶區段亦可與本發明之其相應互補反義化 合物組合以形成穩定雙鏈（雙鏈體）寡核苷酸。 業内已顯示，該等雙鏈寡核苷酸部分可調節靶表現並經 由反義機制調控轉譯以及RNA處理。另外，雙鏈部分可經 受化學修飾。舉例而言，已顯示該等雙鏈部分可藉由雙鏈 體之反義股與靶之典型雜交來抑制靶，由此觸發靶之酶降 解》 在一實施例中，反義募核苷酸靶向類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸（例如，登錄號為NM_207002)、其變 體、等位基因、同功型、同系物、突變體、衍生物、片段 及互補序列。較佳地，寡核普酸係反義分子。 根據本發明實施例，靶核酸分子並不僅限於BCL2L11而 是擴展至BCL2L11分子之任一同功型、受體、同系物及諸 如此類。 156341.doc •42- 201201819 在一實施例中，寡核苷酸靶向BCL2L11聚核苷酸之天然 反義序列（例如，如SEQ ID NO: 2及3所示之聚核苷酸）、及 其任一變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物 '片段 及互補序列。反義寡核苷酸之實例係如SEQ ID NO: 4至13 所示。 在一實施例中，寡核苷酸與BCL2L11反義分子之核酸序 列（包含（不限於）與BCL2L11聚核苷酸有關之非編碼有義及 /或反義序列）互補或結合並調節BCL2L11分子之表現及/或 功能。 在一實施例中，寡核苷酸與BCL2L11天然反義分子之核 酸序列（如SEQ ID NO: 2及3所示）互補或結合並調節 BCL2L11分子之表現及/或功能。 在一實施例中，募核苷酸包括SEQ ID NO: 4至13中至少 5個連續核苷酸之序列並調節BCL2L11分子之表現及/或功 能。 聚核苷酸靶包括BCL2L11 (包含其家族成員）、BCL2L11 之變體；BCL2L11之突變體，包含SNP ; BCL2L11之非編 碼序列；BCL2L11之等位基因；物種變體、片段及諸如此 類。較佳地，寡核苷酸係反義分子。 在一實施例中，靶向BCL2L11聚核苷酸之寡核苷酸包 括：反義 RNA、干擾 RNA (RNAi)、短干擾 RNA (siRNA); 微小干擾RNA (miRNA);小時序RNA (stRNA);或短髮夾 型RNA (shRNA);小RNA誘導之基因活化（RNAa);或小活 化 RNA (saRNA)。 156341.doc -43- 201201819 在一實施例中’歡向類BCL2 11(BCL2L11)聚核苷酸（例 如SEQ ID NO : 2至13)可調節該等靶之表現或功能。在一 實施例中，與對照組相比上調表現或功能。在一實施例 中，與對照組相比下調表現或功能。 在一實施例中，反義化合物包括如SEQ ID NO: 4至13所 示之序列。s亥4寡核皆酸可包括一或多個經修飾核苦酸、 較短或較長片段、經修飾鍵及諸如此類。 在一實施例中，SEQ id NO: 4至13包括一或多個LNA核 苷酸。表1顯示用於本發明方法中之實例性反義寡核苷 酸。 表1 ··

序列編號 反義序列 名稱 序列 SEQ ID NO: 4 CUR-1519 G*T*T*C*C*A*C*C*T*T*C*T*C*C* 丁 *C*C*C*A*G SEQ ID NO: 5 CUR-1520 C*T*G*C*T*G*T*C*C*T*A*G*T*G*T*C*T*C3*eCi*eC SEQ ID NO: 6 CUR-1523 G*T*C*T*G*T*T*G*C*T*T*C*C*C* 丁 *C*C*T*C*T SEQ ID NO: 7 CUR-1525 G*G*A*G*G*G*A*G*G*T*G*T*G*T*G*T*G*T*G*T SEQ ID NO: 8 CUR-1524 C*C*T*T*C*T*T*T*C*T*C3|:C:*:T*C*A*C*A!*tC*CsiEC SEQ ID NO: 9 CUR-1526 G*C*C*A*C*C*C*A*G*T*A*C*A*C*A*C*A*C*C*T SEQ ID NO: 10 CUR-1521 〇*0*0*Α*Τ*Τ*0*0*Τ*Τ*Τ*0*0*Τ*0*0*ϋ*Τ*0*Α SEQ ID NO: 11 CUR-1522 g*c*t*g*c*t*a*c*t*c*t*c*a*c*c*c*a*c*a*t SEQ ID NO: 12 CUR-1174 C*C*A* 0ΦΤ*0* A*G*G* G*C*A* A*C*A* C*A*G*C*A SEQ ID NO: 13 CUR-1505 C*C*T*C*T*C*C*A*C*G*C*G*C*A*G*T*A*C*A*T*T 可以業内已知之若干方式來調節期望靶核酸。舉例而 言，使用反義寡核苷酸、siRNA等。酶性核酸分子（例如’ 核糖酶）係能夠催化一或多種不同反應之核酸分子，包含 156341.doc • 44- 201201819 能夠以核苷酸鹼基序列特異性方式重複裂解其他單獨核酸 分子。該酶性核酸分子可用於（例如）靶向實質上任一 rNA 轉錄本。 因具有序列特異性，故反式裂解之酶性核酸分子可顯示 用作人類疾病之治療劑的前景，可設計酶性核酸分子來裂 解細胞RNA背景内之特異性rnA靶。此一裂解事件使得 mRNA失去功能性並去除來自該RNA之蛋白質表現。以此 方式可選擇性抑制與疾病狀態有關之蛋白質的合成。 一般而言，具有RNA裂解活性之酶性核酸藉由首先結合 至靶RNA來發揮作用。該結合經由酶性核酸之靶結合部分 來進行’該靶結合部分緊鄰分子中用於裂解靶RNA之酶性 部分。因此，酶性核酸首先識別靶RNA且然後經由互補鹼 基配對與靶RNA結合’且在結合至確切位點後以酶促方式 發揮作用以切割靶RNA。此一靶RNA之裂解策略將破壞其 引導合成所編碼蛋白之能力。酶性核酸已結合且裂解其 RNA靶之後，其自該RNA釋放以尋找另一靶且可重複結合 及裂解新靶。 已使用諸如活體外選擇（演變）策略（〇rgel，（1979) pr〇c 1 London’ B 205, 435)等若干方式來產生能夠催化各 種反應（例如磷酸二酯鍵聯及醯胺鍵聯之裂解及連接）的新 核酸觸媒。 對於具有最適催化活性之核糖酶之研發將顯著有助於採 用RNA裂解性核糖酶來調控基因表現的任一策略。舉例而 5，錘頭狀核糖酶在飽和（1〇 濃度之Mg2+輔因子存在 156341.doc -45- 201201819 下以約1 min-l之催化速率（kcat)發揮作用。已顯示人工 「RNA連接酶」核糖酶可以約100 min-1之速率催化相應自 修飾反應。此外，已知某些經修飾錘頭狀核糖酶具有由 DNA構成之受質結合臂，其可以接近100 min-1之多倍周轉 速率催化RN A裂解。最後，使用某些核苷酸類似物代替錘 頭狀核糖酶催化核心内之特定殘基可產生經修飾核糖酶， 其催化速率顯示提高多達10倍。該等發現表明，核糖酶可 以顯著大於大部分天然自裂解核糖酶在活體外所顯示之催 化速率的催化速率來促進化學轉化。則可優化某些自裂解 核糖酶之結構以得到最大催化活性，或可製備顯示顯著較 快之RNA磷酸二酯裂解速率之全新RNA基序。 符合「錘頭」模型之RNA觸媒催化之RNA受質的分子間 裂解首次顯示於 1987年（Uhlenbeck，0· C. (1987) Nature， 328: 596-600)。回收RNA觸媒並使其與多個RNA分子進行 反應，從而表明其確實具有催化性。 基於「錘頭」基序設計之催化RNA已用於裂解特異性靶 序列，其係藉由在催化RNA中作出適當鹼基改變以維持與 把序列之必需驗基配對來達成。此使得可使用催化RN A來 裂解特異性靶序列，且表明根據「錘頭」模型設計之催化 RNA可在活體内裂解特異性受質RNA。 RNA干擾（RNAi)已成為調節哺乳動物及哺乳動物細胞中 之基因表現之有效工具。此方式需要使用表現質粒或病毒 及用於處理成siRNA之小髮夾型RNA的編碼序列以RNA自 身或DNA形式來遞送小干擾RNA (siRNA)。此系統使得能 156341.doc -46- 201201819 夠將siRNA前體有效輸送至其具有活性之細胞質中且容許 使用用於基因表現之經調控及組織特異性啟動子。 在一實施例中，募核苷酸或反義化合物包括核糖核酸 (RNA)及/或去氧核糖核酸（DNA)之寡聚物或聚合物、或其 模擬物、嵌合體、類似物或同系物，此術語包含由天然存 在之核苷酸、糖及共價核苷間（主鏈）鍵聯組成之寡核苷 酸，以及具有非天然存在部分且以相似方式發揮作用之寡 核苷酸。該等經修飾或經取代寡核苷酸經常優於天然形 式，此乃因諸如增強之細胞攝取、對於靶核酸之增強之親 和力及在核酸酶存在下之增加之穩定性等期望性質。 根據本發明’寡核苷酸或r反義化合物」包含反義寡核 苦酸（例如RNA、DNA、其模擬物、嵌合體、類似物或同 系物）、核糖酶、外部引導序列（EGS)寡核苷酸、siRNA化 合物、單鏈或雙鏈RNA干擾（RNAi)化合物（例如siRNA化合 物）、saRNA、aRNA、及其他與靶核酸之至少一個部分雜 交並調節其功能之寡聚化合物。因此，其可為DNA、 RNA、類DNA、類RNA、或其混合物，或可為該等物質中 一或多者之模擬物。該等化合物可為單鏈、雙鏈、環狀或 髮夾型寡聚化合物，且可含有諸如内部或末端膨脹、失配 或環路等結構要素。反義化合物通常製成直鏈形式，但可 經接合或以其他方式製成環狀及/或具支鏈形式。反義化 合物可包含諸如以下構築體：經雜交以形成完全或部分雙 鏈化合物之兩條鏈’或具有足夠自體互補性以進行雜交並 幵V成7L王或分雙鏈化合物之單鏈。兩條鏈可在内部連接 15634I.doc -47- 201201819 以產生游離3’或5,末端或可連接形成連續髮夾型結構或環 路髮夾型結構可在51或3'末端含有懸垂部分以延長單鏈 特徵。雙鏈化合物視需要可在末端包含懸垂部分。其他修 飾可包含附接至一個末端、所選核苷酸位置、糖位置或附 接至一個核苷間鍵聯之偶聯基團。另一選擇為，兩條鏈可 經由非核酸部分或連接體基團進行連接。在自僅—條鏈形 成時，dsRNA可呈自體互補髮夾型分子形式，其自身對折 以形成雙鏈體。因此，dsRNA可為完全或部分雙鏈。可藉 由穩定表現轉基因細胞系中之dsRNA髮夾型來特異性調節 基因表現。在自兩條鏈、或呈自體互補髮夾型分子形式 (自身對折以形成雙鏈體）之單鏈形成時，兩條鏈（或單鏈中 形成雙鏈體之區域）係以Wats〇n_CHck方式鹼基配對之互補 RNA 鍵。 引入系統中之後，本發明化合物可引發一或多種酶或結 構蛋白質<作用以實現靶核酸之裂解或其他修飾或可經由 基於伯據之機制進行作用一般而言，核酸(包含募核苦 酸）可闡述為「類DNA」（亦即，通常具有一或多個2，_去氧 糖及（通常）T而非TJ鹼基）或「類RNA」（亦即，通常具有一 或多個2，-羥基或2，_修飾糖及（通常川而非τ鹼基核酸螺 走可如用種以上之結構類型，最通常係A型及B型。據 信二般而言’具有B型樣結構之寡料酸係「類dna」 且彼等具有A型樣結構者係「類RNA」。在一些（嵌合）實 把例中，反義化合物可含有A及3_型區域。 本發月之反義化合物可包括長度為約5至約8〇個核苦酸 156341.doc •48- 201201819 (亦即，約5至約80個連接核苷）的反義部分，此係指反義化 合物之反義股或部分之長度。換言之，本發明之單鏈反義 化合物包括5至約80個核皆酸’且本發明之雙鏈反義化合 物（例如，dsRNA)包括長度為5至約80個核苷酸之有義及反 義股或部分。熟習此項技術者應瞭解，此涵蓋長度為5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22 ' 23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34 ' 35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、或80個核苷酸、或其任一範圍之反義部分。 在一實施例中’本發明之反義化合物具有長度為1 〇至5〇 個核苷酸之反義部分。熟習此項技術者應瞭解，此展現反 義部分長度為 10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、或 50個核苷酸、或其任一 範圍之寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為15 個核苷酸。 在一實施例中，本發明之反義或寡核苷酸化合物具有長 度為12或13至30個核苷酸的反義部分。熟習此項技術者應 瞭解，此展現反義部分長度為12、13、14、15、16、17、 18 、 19 、 20 、 21 、 22 、 23 、 24 、 25 、 26 、 27 、 28 、 29或30 156341.doc •49· 201201819 個核苷酸、或其任一範圍之反義化合物。 在一實施例中，本發明之寡聚化合物亦包含在該化合物 中之一或多個核苷酸位置存在不同鹼基的變體。舉例而 言’若第一核苷酸係腺嘌呤，則可產生在此位置含有胸 苷、烏苷或胞苷之變體。此可發生於反義或dsRNA化合物 之任一位置。然後使用本文所述方法測試該等化合物以測 定其抑制靶核酸表現之能力。 在一些實施例中’反義化合物及靶之間之同源性、序列 一致性或互補性為約40%至約60%。在一些實施例中.，同 源性、序列一致性或互補性為約60%至約70%«在一些實 施例中’同源性、序列一致性或互補性為約7〇%至約 80%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為 約80%至約90%。在一些實施例中，同源性、序列一致性 或互補性為約90%、約92%、約94%、約95。/。、約96%、約 97%、約 98%、約 99%或約 100%。 在一實施例中，反義寡核苷酸（例如，SEQ ID NO: 4至 13中所述之核酸分子）包括一或多個取代或修飾。在一實 施例中，核苷酸經鎖核酸（LNA)取代。 在一實施例中，寡核苷酸靶向與BCL2L11有關之編碼及/ 或非編碼序列及如SEQ ID NO: 1至3所示之序列之有義及/ 或反義核酸分子的一或多個區域。寡核苷酸亦乾向SEQ ID NO: 1至3之重疊區域。 本發明之某些較佳寡核苷酸係嵌合寡核苷酸。本發明上 下文中之「嵌合寡核苷酸」或「嵌合體」係含有兩個或更 156341.doc •50- 201201819 多個化學上不同之區域之寡核苷酸，每個區域皆由至少一 個核苦酸構成。該等寡核苷酸通常含有至少一個經修飾核 苦酸區域，該區域賦予一或多種有益性質（例如增加核酸 酶抗性，增加細胞攝取，增加與靶之結合親和力）；及係 能夠裂解RNA:DNA或RNA:RNA雜合體之酶受質的區域。 舉例而言，RNase Η係可裂解RNA:DNA雙鏈體之RNA鏈之 細胞内切核酸酶。因此’活化RNase Η可裂解RNA乾，由 此大大增強基因表現之反義調節的效率。因此’同與相同 乾區域雜交之硫代磷酸酯去氧寡核苷酸相比，在使用嵌合 券核苦酸時利用較短寡核苷酸通常可獲得可比性結果。通 常可藉由凝膠電泳及（若需要）業内已知之相關核酸雜交技 術來檢測RNA靶之裂解》在一實施例中，嵌合寡核苷酸包 括至少一個經修飾以增加靶結合親和力之區域、及（經常） 用作RNAse Η受質之區域。通常藉由量測寡核苷酸/靶配對 之Tm來測定寡核苷酸與其靶（在此情形下係編碼之核 酸）之親和力，Tm係寡核苷酸與靶離解之溫度；使用分光 光度法來檢測離解。Tm愈高，則寡核苷酸與靶之親和力 愈大。 本發明之嵌合反義化合物可以兩個或更多個如上所述之 寡核苷酸、經修飾募核苷酸、寡核苷及/或募核苷酸模擬 物之複合結構形式形成。因此，化合物在業内亦稱為雜合 體或結合體。教示該等雜合體結構之製備的代表性美國專 利包括但不限於美國專利第5,〇13,830號、第5，149,797號、 第 5,220,0〇7號、第 5,256,775 號、第 5,366,878 號、第 156341.doc •51- 201201819 5,403,711 號、第 5,491,133 號、第 5,565,350號、第 5,623,065 號、第 5,652,355號、第 5,652,356號、及第 5,700,922號，每 一者皆以引用方式併入本文中。 在一實施例中，寡核苷酸之經修飾區域包括至少一個在 糖之2'位處修飾的核苷酸，最佳係經2，_〇烷基、2'-〇-烷基-〇-烷基或2'-氟修飾之核苷酸《在另一實施例中，rnA修飾 包含對於嘧啶之核糖、無鹼基殘基或RNA中3,端之反向鹼 基之2、氟、2’-胺基及2,〇-曱基修飾。通常將該等修飾納入 寡核苷酸中且已顯示該等寡核苷酸相對於2，-去氧寡核苷酸 對於給定乾具有較高Tm(亦即，較高乾結合親和力）。該增 加之親和力效應大大增強了 RNAi寡核苷酸對基因表現之 抑制。RNAse Η係裂解RNA:DNA雙鏈體中RNA鏈之細胞内 切核酸酶；因此’活化此酶可裂解RNA靶，且由此可大大 增強RNAi抑制之效率。對rnA靶之裂解通常可藉由凝膠 電泳來顯示。在一實施例中，亦對嵌合寡核苷酸進行修飾 以增強核酸酶抗性。細胞含有多種可降解核酸之外切核酸 酶及内切核酸酶。已顯示多種核苷酸及核苷修飾可使納入 該荨修飾之寡核苷酸對核酸酶消化之抗性強於天然寡去氧 核皆酸》核酸酶抗性通常藉由將寡核苷酸與細胞提取物或 分離核酸酶溶液一起培育並在一段時間後經常藉由凝膠電 冰里測剩餘完整寡核苷酸之含量來進行量測。已經修飾以 增強其核酸酶抗性之寡核苷酸保持完整之時間長於未經修 飾之寡核苦酸。已證實多種寡核苦酸修飾可增強或賦予核 西欠S#抗性。當前’含有至少一個硫代填酸酯修飾之寡核苷 156341.doc •52- 201201819 酸更佳。在一些情形下，增強靶結合親和力之寡核苷酸經 修飾亦能獨立地增強核酸酶抗性。 擬用於本發明之一些較佳寡核苷酸的具體實例包含彼等 包括經修飾主鏈者，該等經修飾主鏈係（例如）硫代磷酸 酯、磷酸三酯、膦酸曱酯、短鏈烷基或環烷基糖間鍵聯或 短鏈雜原子或雜環糖間鍵聯*最佳者係具有硫代磷酸酯主 鏈之寡核苷酸及彼等具有雜原子主鏈者，該等雜原子主鏈 尤其係CH2 --NH--0--CH2、CH,--N(CH3)--0--CH2 [稱為 亞曱基（甲基亞胺基）或MMI主鏈]、（：112--0--：^(〇^3)--CH2、CH2 -N (CH3)--N (CH3)--CH2及0--N (CH3)--CH2 -CH2 主鏈，其中天然磷酸二酯主鏈表示為0--P--0--CH)。由De Mesmaeker 等人（1995) Acc. Chem. Res. 28:366-374 所揭示 之醯胺主鏈亦較佳。亦較佳者係具有嗎啉基主鏈結構之寡 核普酸（Summerton及.Weller，美國專利第5,034,506號）。在 另一實施例中（例如肽核酸（PNA)主鏈），寡核苷酸之磷酸 二酯主鏈由聚醯胺主鏈代替，核苷酸直接或間接結合至聚 醯胺主鏈之氮雜氮原子。寡核苷酸亦可包括一或多個經取 代糖部分。較佳寡核苷酸在2'位包括下列基團中之一者： OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3 OCH3、OCH3 0(CH2)n CH3、0(CH2)n NH2 或 0(CH2)n CH3(n 為 1至約 10) ; C1-C10低碳烷基、烷氧基、經取代低碳烷基、烷芳基或芳烷 基；Cl ; Br ; CN ; CF3 ; OCF3 ; 、S--、或N-烷基；0-- 、S--、或 N-烯基；SOCH3 ; S02 CH3 ; 0N02 ; N02 ; N3 ; NH2 ;雜環烷基；雜環烷芳基；胺基烷基胺基；聚烷 156341.doc •53- 201201819 基胺基；經取代甲矽烷基；RNA裂解基團；報導子基團； 遷入劑，用於改良寡核苷酸之藥物代謝動力學性質之基 團，或用於改良寡核苷酸之藥效動力學性質之基團及其他 具有相似性質之取代基。較佳修飾包含2，_甲氧基乙氧基 [2I-0-CH2 CH2 OCH3，亦稱為2，-0-(2-甲氧基乙基）]。其 他較佳修飾包含2·-甲氧基（2，-0—CH3)、2·-丙氧基（2,_ OCH2CH2CH3)及2'_氟（π)。#可在冑核苦酸上之其他位 置進打類似修飾，尤其係3,末端核苷酸上糖之3,位及5，末端 核苷酸之5’位。寡核苷酸亦可具有糖模擬物，例如使用環 丁基來代替戊呋喃醯基。 寡核苷酸亦可另外或作為另一選擇包含核鹼基（業内通 常簡寫為「鹼基」）修飾或取代。本文所用之「未經修 飾」或「天然」核苷酸包含腺嘌呤（A)、烏嘌呤、胸腺 嘧啶（τ)、胞嘧啶（C)及尿嘧啶（U)。經修飾核苷酸包含僅偶 爾或短暫在天然核酸中發現之核苷酸，例如次黃嘌呤、6 甲基腺嘌呤、5~Me嘧啶、尤其5-甲基胞嘧啶（亦稱為5_甲 基-2’去氧胞嘧啶且業内通常稱為5_Me_c)、％經甲其胞喷 啶（HMC)、糖基HMC及龍膽二糖基HMC ;以及合成核苷 酸，例如，2_胺基腺嘌呤、2_(曱基胺基）腺嘌呤、唑 基烷基）腺嘌呤、2_ (烷基烷基胺基）腺嘌呤或其他雜取代 烷基腺嘌呤、2_硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5_溴尿嘧啶、 羥曱基尿嘧啶、8_氮雜鳥嘌呤、7_去氮鳥嘌呤、 胺基己基）腺°票呤及2,6-二胺基票吟。可包含業内已头 「常用」驗基(例如肌苦已顯示5_Me_C取代可將核酸: 156341.doc •54· 201201819 鏈體穩定性增加以-⑽且係當前之較佳驗基取代。 對本發明寡核㈣之另—修飾涉及使—或多種可增強寡 核普酸之活性或細胞攝取之部分或偶聯物以化學方式連接 至养核苷酸。該等部分包含但不限於脂質部分(例如膽固 醇部分）、膽固醇基部分、脂肪族鍵（例如，十二烧二醇或 - 十一烷基殘基）、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸。業 内已知包括親脂性部分之寡核皆酸、及製備該等寡核苦酸 之方法，例如，美國專利第5，138,045號、第5,218，1〇5號及 第 5,459,255號。 給定寡核㈣中之所有位置並不需要經—致性修飾，且 事實上可將上述修冑中之—種以上納入單一冑核苦酸中或 甚至納入募核苦酸内之單—核苦中。本發明亦包含係上文 所定義嵌合寡核苷酸之募核苷酸。 在另一實施例中，本發明之核酸分子與另一部分偶聯， 該另一部分包含但不限於無鹼基核苷酸、聚醚、聚胺、聚 醯胺、肽、碳水化合物、脂質、或聚烴化合物。彼等熟習 此項技術者應認識到，該等分子可連接至在糖、鹼基或磷 酸酯基團上之若干位置包括核酸分子之任一核苷酸中的一 或多者上。 本發明所用之寡核苷酸可以便捷常規方式經由熟知固相 &成技術來製備。包含Applied Biosystems在内之若干供 貨商出售實施該合成之設備。亦可採用用於該合成之任一 其他方式’熟習此項技術者熟知寡核苷酸之現行合成。亦 熟知使用相似技術來製備諸如硫代磷酸酯及烷基化衍生物 156341.doc -55- 201201819 等其他寡核苷酸。業内亦熟知使用相似技術及市售經修飾 DNA合成核苷酸（amidite)及定孔玻璃（CPG)產品（例如經生 物素、螢光素、吖啶或補骨脂素修飾之DNA合成核苷酸及/ 或CPG(可自Glen Research，Sterling，VA購得））來合成經螢 光標記、經生物素化或經其他修飾之寡核苷酸，例如經膽 固醇修飾之寡核苷酸。 根據本發明’使用修飾（例如使用LNA單體）來增強作用 之功效、特異性及持續時間並拓寬寡核苷酸之投與途徑包 括諸如MOE、ANA、FANA、PS等化學方式。此可藉由使 用LNA單體代替當前寡核苷酸中之一些單體來達成。經 LNA修飾之寡核苷酸可具有類似於母體化合物之尺寸或可 較大或較佳地較小。較佳地，經LNA修飾之寡核苷酸含有 小於約70%、更佳小於約60%、最佳小於約50%之LNA單 體，且其尺寸介於約5與25個核苷酸、更佳約12與20個核 苷酸之間。 較佳經修飾寡核苷酸主鏈包括但不限於硫代磷酸酯、對 掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷 酸三酯、膦酸曱酯及其他膦酸烷基酯（包括膦酸3，_伸烷基 酯及對掌性膦酸酯）、次膦酸酯、胺基磷酸酯（包括胺基磷 酸3胺基酯及胺基磷酸胺基烷基酯）、硫羰基胺基磷酸 酯、膦酸硫羰基烷基酯、硫羰基烷基構酸三酯、及具有常 見3'-5’鍵聯之硼烷磷酸酯、該等主鏈之2，-5,連接類似物、 及彼等具有反極性者（其中相鄰核苷單元對之連接由3'-5'變 為5'-3'或由2’-5'變為5'-2’）。亦包含各種鹽、混合鹽及游離 156341.doc •56- 201201819 酸形式。 教示上述含碟鍵聯之代表性美國專利包括但不限於美國 專利第3,687,808號、第4，仏9,863號、第4,476,301號、第 5,〇23,243號、第 5，177，196號、第 5,188,897號、第 5,264,423 號、第 5,276,019 號、第 5,278,302 號、第 5,286,717號、第 5,321，131號、第 5,399,676號、第 5,405,939號、第 5,453,496 號、第 5,455,233 號、第 5,466,677 號、第 5,476,925 號、第 5,519,126號、第 5,536,821 號、第 5,541，306號、第 5,550,1 1 1 號、第 5,563,253號、第 5,571，799號、第 5,587,361 號、及第 5,625,050號，每一者皆以引用方式併入本文中。 不含磷原子之較佳經修飾寡核苷酸主鏈具有藉由以下形 成之主鏈：短鏈烷基或環烷基核苷間鍵聯、混合雜原子及 烷基或環烷基核苷間鍵聯、或一或多個短鏈雜原子或雜環 核苷間鍵聯。該等主鏈包括彼等具有嗎啉基鍵聯者（部分 自核苷之糖部分形成）；矽氧烷主鏈；硫化物、亞砜及砜 主鏈；甲醢乙醯基及硫代曱醯乙醯基主鏈；亞曱基曱醯乙 臨基及硫代甲醯乙醯基主鏈；含有烯烴之主鏈；胺基磺酸 醋主鏈，亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；石黃酸酯及續酿 胺主鏈；醯胺主鏈；及其他具有混合N、〇、s及CH2組成 部分者。 教示上述寡核苷之代表性美國專利包括但不限於美國專 利第 5,034,506 號、第 5，166,315號、第 5，185,444 號、第 5,214，134號、第 5,216，141號、第 5,235’033號、第 5,264,562 號、第 5,264,564 號、第 5,4〇5,938 號、帛 5,434,257 號、第 156341.doc -57- 201201819 5,466,677號、第 5,470,967號、第 5,489,677號、第 5,541，307 號、第 5,561，225 號、第 5,596,086 號、第 5,602,240號、第 5,610,289號、第 5,602,240號、第 5,608,046號、第 5,610,289 號、第 5,618,704 號、第 5,623,070 號、第 5,663,312 號、第 5,633,360號、第 5,677,437號、及第 5,677,439號，每一者皆 以引用方式併入本文中。 在其他較佳寡核苷酸模擬物中’核苷酸單元中之糖及核 苷間鍵聯（亦即主鍵）二者經新基團代替。保留驗基單元以 與適宜核酸把化合物雜交° 一種該寡聚化合物（已顯示具 有極佳雜交性質之寡核苷酸模擬物）稱為肽核酸（PNA)。在 PNA化合物中’寡核苷酸中之糖-主鏈經含醯胺主鏈、特 定而言胺基乙基甘胺酸主鏈代替。保留核驗基且其與主鏈 中醯胺部分之氮雜氮原子直接或間接結合。教示PNA化合 物之製備之代表性美國專利包括但不限於美國專利第 5,539,082號、第 5,714,331號、及第 5,719,262 號，每一者 皆以引用方式併入本文中。PNA化合物之其他教示内容可 參見 Nielsen 等人 ’（1991) Science 254，1497-1500。 本發明一實施例係具有硫代磷酸酯主鏈之寡核苷酸及具 有雜原子主鏈之寡核苦，且特定而言係上文所提及美國專 利第 5,489,677號中之-CH2-NH-0-CH2-、-CH2-N (CH3)-0-CH2-[稱為亞甲基（曱基亞胺基）或MMI主鏈]、-CH2-0-N(CH3)-CH2-、-CH2N(CH3)-N(CH3) CH2-及-0-N(CH3)-CH2-CH2-[其中天然磷酸二酯主鏈表示為-Q-P-0-CH2-]， 及上文所提及美國專利第5,602,240號中之醯胺主鏈。亦較 156341.doc -58 - 201201819 佳者係上文所提及美國專利第5,034,506號中之具有嗎啉基 主鏈結構之募核苷酸。 經修飾寡核苷酸亦可含有一或多個經取代糖部分。較佳 寡核苷酸在2’位包括以下中之一者：〇H ; F ; 0-、S-或N-烷基、0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；或Ο烷基-0-烷 基，其中烷基、烯基及炔基可係經取代或未經取代之C1至 C10烷基或C2至C10烯基及炔基《尤佳者係Ο (CH2)n OmCH3、0(CH2)n、OCH3、0(CH2)nNH2、0(CH2)nCH3、 0(CH2)n0NH2、及 0(CH2n0N(CH2)nCH3)2，其中 n及 m可 為1至約10。其他較佳寡核苷酸在2'位包括以下中之一者： C1至C10低碳烷基、經取代低碳烷基、烷芳基、芳烷基、 0-烷芳基或 0-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、 CF3、0CF3、SOCH3、S02CH3、0N02、N02、N3、 NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺 基、經取代甲矽烷基、RNA裂解基團、受體基團、嵌入 劑、改良寡核苷酸之藥物代謝動力學性質之基團、或改良 寡核苷酸之藥效動力學性質之基團、及其他具有相似性質 之取代基。較佳修飾包括2·-曱氧基乙氧基（2'-0-CH2CH20CH3，亦稱為 2'-0-(2-甲氧基乙基）或 2'-MOE)， 亦即，烷氧基烷氧基。其他較佳經修飾包括2’-二甲基胺基 氧基乙氧基（亦即，0(CH2)20N(CH3)2基團，亦稱為2匕 DMAOE，如下文實例中所述）、及2·-二曱基胺基乙氧基乙 氧基（業内亦稱為2'-0-二曱基胺基乙氧基乙基或2·-DMAEOE，亦即，2'-0-CH2-0-CH2-N (CH2)2)。 15634 丨.doc -59- 201201819 其他較佳修飾包括2·-甲氧基（2，-〇 CH3)、2'-胺基丙氧基 (2'-〇 CH2CH2CH2NH2)及2’-氟（2'-F)。亦可在寡核苷酸上 之其他位置進行相似修飾，尤其係3,末端核苷酸上或2，_5, 連接寡核苷酸中糖之3·位及5,末端核苷酸之5·位。寡核苷酸 亦可具有糖模擬物’例如使用環丁基部分來代替戊呋喃糖 基糖。教示該等經修飾糖結構之製備之代表性美國專利包 括但不限於美國專利第4,981，957號、第5，1 18,800號、第 5,319,080號、第 5,359,044號、第 5,393,878號、第 5,446,137 號、第 5,466,786 號、第 5,514,785 號、第 5,519，134 號、第 5,567,81 1 號、第 5,576,427號、第 5,591，722號、第 5,597,909 號、第 5,610,300 號、第 5,627,053 號、第 5,639,873 號、第 5,646,265 號、第 5,658,873 號、第 5,670,633 號、及第 5,700,920號，每一者皆以引用方式併入本文中。 寡核苷酸亦可包括核鹼基（業内通常簡寫為「鹼基」）修 飾或取代。本文所用之「’未經修飾」或「天然」核苷酸包 括嘌呤驗基（腺嘌呤（A)及鳥嘌呤（G))及嘧唆驗基（胸腺嘧啶 (T)、胞嘧啶（〇及尿嘧啶（u))。經修飾核苷酸包括其他合 成及天然核苷酸’例如5-甲基胞嘧啶（5-me-C)、5-羥曱基 胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2_胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥 嘌吟之6-曱基及其他烧基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2_丙 基及其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶及 2-硫代胞嘧啶、5-函代尿嘧啶及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶 及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧咬 (假尿》密咬）、4-硫代尿癌咬、8-齒代、8-胺基、8-硫醇、8- 156341.doc •60· 201201819 硫代烷基、8-羥基及其他8-取代腺嘌呤及烏嘌呤、5-鹵 代、尤其5-溴、5-三氟曱基及其他5-取代尿〇密唆及胞喊 啶、7-曱基鳥嘌呤及7-曱基腺嘌呤、8-氮雜烏嘌呤及8-氮 雜腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤及3-去氮鳥嘌呤 及3-去氮腺嘌呤。 另外，核苷酸包括彼等揭示於美國專利第3,687,808號中 者、彼等揭示於 ’The Concise Encyclopedia of Polymer

Science And Engineering’，第 858-859頁，Kroschwitz，J.I. 編輯 ’ John Wiley & Sons, 1990 中者、彼等由 Englisch等 人，「Angewandle Chemie，International Edition」，1991， 30，第613頁揭示者、及彼等由Sanghvi, Y.S.，第15章， 「Antisense Research and Applications」，第 289-302 頁， Crooke，S.T·及Lebleu，Β· ea” CRC Press，1993揭示者。某 些該等核苷酸尤其用於增加本發明之寡聚化合物之結合親 和力。δ亥卓核音酸包括5 -取代《•密咬、6-氮雜喊〇定及n_2、 Ν·6及0-6取代嘌呤，包括2_胺基丙基腺嘌呤、5丙炔基尿 嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。已顯示甲基胞嘧啶取代可將核 酸雙鏈體穩定性增加 〇.6-l_2°C(SanghVi，Y.S·，Crooke，S.T. 及 Lebleu，Β·編輯，，Antisense Research and Applications，， CRC Press，Boca Raton，1993，第 276-278頁）且係當前較佳 之鹼基取代，甚至更尤其在與2，_〇曱氧基乙基糖修飾組合 時〇 教不上述經修飾核苷酸以及其他經修飾核苷酸之製備之 代表性美國專利包括但不限於美國專利第3,687期號、以 15634】,doc -61 - 201201819 及第 4,845,205 號、第 5，130,302 號、第 5，134,066 號、第 5，175,273號 '第 5,367,066號、第 5,432,272號、第 5,457，187 號、第 5,459,255 號、第 5,484,908 號、第 5,502,177 號、第 5,525,71 1 號、第 5,552,540號、第 5,587,469號、第 5,596,091 號、第5,614,617號、第 5,750,692號、及第 5,681,941 號，每 一者皆以引用方式併入本文中。 對本發明募核苷酸之另一修飾涉及使一或多種可增強寡 核苷酸之活性、細胞分佈或細胞攝取之部分或偶聯物以化 學方式連接至寡核苷酸。 該等部分包括但不限於脂質部分（例如膽固醇部分）、膽 酸、硫醚（例如，己基-S-三苯曱基硫醇）、硫代膽固醇、脂 肪族鏈（例如，十二烷二醇或十一烷基殘基）、磷脂（例如， 二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基銨1，2-二-0-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯）、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷 乙酸、棕櫊基部分、或十八胺或己基胺基-羰基-氧基膽固 醇部分。 教示該等寡核苷酸偶聯物之製備之代表性美國專利包括 但不限於美國專利第4,828,979號、第4,948,882號、第 5,218，105號、第 5,525,465號、第5,541，313號、第 5,545,730 號、第 5,552,538 號、第 5,578,717 號、第 5,580,731 號、第 5,580,731 號、第 5,591，584號、第 5，109，124號、第 5,118,802 號、第 5，138,045 號、第 5,414,077 號、第 5,486,603 號、第 5,512,439號、第 5,578,718號、第 5,608,046號、第 4,587,044 號、第 4,605,735 號、第 4,667,025 號、第 4,762,779 號、第 156341.doc -62- 201201819 4,789,737號、第 4,824,941號、第 4,835,263 號、第 4,876,335 號、第 4,904,582 號、第 4,958,013 號、第 5,082,830 號、第 5，112,963 號、第 5,214，136號、第 5,082,830號、第 5，112,963 號、第 5,214，136 號、第 5,245,022 號 '第 5,254,469 號、第 5,258,506號、第 5,262,536號、第 5,272,250號、第 5,292,873 號、第 5,317,098 號、第 5,371，241 號、第 5,391，723 號、第 5,416,203號、第 5,451，463號、第 5,510,475號、第 5,512,667 號、第 5,514,785 號、第 5,565,552 號、第 5,567,810 號、第 5,574，142號、第 5,585,481 號、第 5,587,371 號、第 5,595,726 號、第 5,597,696號、第 5,599,923號、第 5,599,928號、及第 5，688，941號，每一者皆以引用方式併入本文中。 藥物研究：亦可將本發明化合物加至藥物研究及乾驗證 之區域中。本發明涵蓋本文所鑑別化合物及較佳靶區段在 藥物研究中之用途，該藥物研究試圖闡釋類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸與疾病狀態、表現型、或病狀之間所 存在之關係。該等方法包含檢測或調節BCL2L11聚核苷 酉文，其包括使試樣、組織、細胞、或有機體與本發明化合 物接觸’在治療後某一時間量測BCL2LU聚核苦酸之核酸 或蛋白質含量及/或相關表現型或化學端點，及視 較量測值與未處理試樣或經本發明中另

效性。 明中另一化合物處理之試 實施以測定用於 或用以測定特定基因產物 狀、或表現型之靶的有 15634 丨.doc .63· 201201819 評價基因表現之上調或抑制： 可藉由直接檢測細胞或有機體中核酸之存在來評 核酸向宿主細胞或有機體中的轉移。該檢測可藉 孰 知之若干方法來達成。例如’可藉由南方印跡或藉由聚： 酶鏈反應（p⑶技術使㈣異性擴增與核酸㈣之㈣二 序列之引物來檢測外源核酸的存在。亦可使用包含基因表 現分析在内之習用方法來量測外源核酸之表現。二列而 言，可使用北方印跡及逆轉錄pcr(rt_pcr)來檢測及量化 自外源核酸產生之mRNA。 亦可藉由量測酶活性或報導子蛋白活性來檢測來外源核 酸令RNA之表現。舉例而言，可根據乾核酸表現之降低^ 增加來間接量測反義調節活性’從而指示外源核酸在效應 子隱中產生。基於序列料性，可設計引物並用於擴^ 靶基因之編碼區域。最初，可使用來自每一基因之最高表 現編碼區域來建立對照基因模㉟，但可使用任—編褐或非 編碼區域。#由將#一編碼區域插入報導子編竭區域及其 p〇ly(A)〗s號之間來組裝每一對照基因。該等質粒將產生在 基因上游部分具有報導子基因且在3,非編碼區域中具有潛 在RNAi靶之mRNA。藉由調節報導子基因來分析個別反義 寡核苷酸之有效性。用於本發明方法中之報導子基因包含 乙醯羥酸合酶（AHAS)、鹼性磷酸酶（AP)、β半乳糖苷酶 (LacZ)、β葡糖醛酸糖苷酶（GUS)、氯黴素乙醯轉移酶 (CAT)、綠色螢光蛋白（GFp)、紅色螢光蛋白（RFp)、黃色 發光蛋白（YFP)、青色螢光蛋白（CFP)、辣根過氧化物酶 156341.doc -64- 201201819 (HRP)、螢光素酶（Luc)、胭脂鹼合酶（NOS)、章魚肉鹼合 酶（OCS)、及其衍生物。可使用賦予以下物質抗性之多種 可選擇標記物：胺苄西林（ampicillin)、博來黴素（bleomycin) 、氯黴素（chloramphenicol)、慶大黴素（gentamycin.)、潮黴 素（hygromycin)、卡那黴素（kanamycin)、林可黴素 (lincomycin)、曱胺蝶呤（methotrexate)、草胺膦 (phosphinothricin)、°票呤黴素（puromycin)、及四環素 (tetracycline)。測定報導子基因之調節的方法在業内已眾 所周知，且包含但不限於螢光方法（例如螢光光譜法、螢 光活化細胞分選（FACS)、螢光顯微術）、抗生素抗性測 定。 可使用彼等熟習此項技術者已知及闡述於本文其他處之 方法來分析BCL2L11蛋白及mRNA表現。舉例而言，可使 用諸如ELISA等免疫分析來量測蛋白質含量。BCL2L11 ELISA分析套組市面有售，例如，購自R&D Systems (Minneapolis, MN)。 在實施例中，藉由與對照試樣中之BCL2L11表現進行比 較來評估使用本發明反義寡核苷酸處理之試樣（例如，活 體内或活體外中之細胞或組織）中的BCL2L11表現（例如， mRNA或蛋白質）。舉例而言，可使用彼等熟習此項技術者 已知之方法來對蛋白質或核酸之表現與模擬處理或未處理 試樣進行比較。另一選擇為，可端視期望資訊來比較所處 理試樣與對照反義寡核苷酸（例如，具有經改變或不同序 列者）。在另一實施例中，可使用經處理試樣與未處理試 156341.doc -65- 201201819 樣中不同核酸（包含研究者認為適宜之任一標準，例如， 持家基因)表現之差異來比較經處理試樣與未處理試樣中 BCL2L11蛋白質或核酸表現之差異。 可根據需要（例如）以比率或份數形式來表示所觀察之差 異以用於錢肋㈣比較。在實_巾，相對於未處理 試樣或經對照核酸處理之試樣，經本發明反義寡核菁酸處 理之試樣中BCL2LH mRNA或蛋白f之含量增加或降低約 1·25倍至約1()倍或更高。在實施例中，咖儿"爪職或 蛋白質之含量增加或降低至少約125倍、至少約13倍、至 少、々1.4倍、至少約！ 5倍、至少約】6倍至少約！ 7倍至 少約1.8倍、至少約2倍、至少約2 5倍、至少約3倍、至少 約3.5倍、至少約4倍、至少約4 5倍、至少約5倍、至少約 5-5L、至少約6倍、至少約6.5倍、至少約7倍、至少約7 5 倍、至少約8倍、至少約8.5倍、至少約9倍、至少約9 5 倍、或至少約10倍或更高。 套組、研究試劑、診斷、及治療 本叙明化合物可用於診斷、治療、及預防，且可用作套 組之研究試劑及組份。另外，彼等熟習此項技術者通常使 用能夠以強烈特異性抑制基因表現之反義寡核苷酸來闡釋 特定基因之功能或區別生物路徑之各個成員的功能。 對於在套組及診斷及各種生物系統中之應用而言，本發 明化合物（單獨或與其他化合物或治療劑組合）可用作差值 及/或組合分析中之工具以闡釋細胞及組織内所表現基因 之一部分或整個互補序列的表現模式。 156341.doc •66- 201201819 本文所用之術語「生物系統」或「系統」定義為表現、 或使其足以表現類BCL2 11 (BCL2L11)基因產物的任一有 機體、細胞、細胞培養物或組織。該等系統包含但不限於 人類、轉基因動物、細胞、細胞培養物、組織、異種移植 ‘ 物、移植物及其組合。 - 根據一非限制性實例，對經一或多種反義化合物處理之 細胞或組織内的表現模式與未經反義化合物處理之對照細 胞或組織進行比較，且分析所得模式關於（例如）疾病相關 性、k號傳導路徑、細胞定位、表現程度、所檢驗基因之 尺寸、結構或功能之基因表現的差異程度。該等分析可在 經刺激或未經刺激細胞中且在影響表現模式之其他化合物 存在或不存在下實施。 業内已知之基因表現分析之方法實例包含Dna陣列或微 陣列、SAGE(基因表現之系列分析）、READS(消化①财之 限制性酶擴增）、T0GA(總體基因表現分析）、蛋白質陣列 及蛋白組學、已表現序列標誌（EST)測序、消減RNA指紋 技術（SuRF)、消減選殖、差異顯示（DD)、比較基因組雜 交' FISH(螢光原位雜交）技術及質譜方法。 ' 本發明化合物可用於研究及診斷中，此乃因該等化合物 可與編碼類BCL2 11 (BCL2L11)之核酸雜交。舉例而言， 在如本文所揭示可用作有效BCL2L11調節劑之效率及條件 不雜交之寡核苷酸在分別有利於基因擴增或檢測之條件下 係有效引物或探針。該等引物及探針可用於需要特異性檢 測編碼BCL2L11之核酸分子的方法中，及擴增該等核酸分 156341.doc • 67- 201201819 子’以用於檢測或用於進一步研究BCL2L11。本發明之反 義寡核苷酸（尤其引物及探針）與編碼BCL2L11之核酸的雜 父可藉由業内已知方式進行檢測。該等方式可包含使酶與 寡核苷酸偶聯、放射性標記寡核苷酸、或任一其他適宜檢 測方式。亦可使用該等檢測試樣中BCL2L11含量的檢測方 式製成套組 彼等熟習此項技術者亦在治療應用中利用反義化合物之 特異性及敏感性。反義化合物已用作治療部分，來治療動 物（包含人類）之疾病狀態。反義寡核苷酸藥物已安全且有 效地投與人類且當前正實施許多臨床試驗。由此確定，反 義化合物可為可經設置用於治療細胞、組織及動物（尤其 人類）之治療方案中的有用治療方式。 在/α療時’藉由投與本發明反義化合物來治療懷疑患有 可藉由調節BCL2L11聚核普酸之表現進行治療之疾病或病 症的動物（較佳係人類）。舉例而言，在一非限制性實施例 中，該等方法包括向需要治療之動物投與治療有效量之 BCL2L11調節劑之步驟。本發明之BCL2L11調節劑可有效 調節BCL2L11之活性或調節BCL2L11蛋白質之表現。在一 實施例中’與對照組相比，使BCL2L11在動物中之活性或 表現抑制約10%。較佳地，使BCL2L11在動物中之活性或 表現抑制約30%。更佳地，使BCL2L11在動物中之活性或 表現抑制50%或更高。因此，與對照組相比，寡聚化合物 可將類BCL2 11 (BCL2Lll)mRNA之表現調節至少10%、至 少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少 156341.doc -68 · 201201819 60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%、至少98%、至少99%、或100%。 在一實施例中，與對照組相比，使類BCL2 11 (BCL2L11)在動物中之活性或表現增加約10% »較佳地， 使BCL2L11在動物中之活性或表現增加約30%。更佳地， 使BCL2L11在動物中之活性或表現增加50%或更高。因 此，與對照組相比’寡聚化合物可將BCL2L11 mRNA之表 現調節至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少 40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少 99%、或 100%。 舉例而言’可量測動物之血清、血液、脂肪組織、肝或 任一其他體液、組織或器官中類BCL2 11 (BCL2L11)之表 現的下降程度。較佳地，所分析該等流體、組織或器官内 所含之細胞含有編碼BCL2L11肽及/或BCL2L11蛋白質本身 的核酸分子。 可藉由將有效1之本發明化合物添加至適宜醫藥上可接 又之稀釋劑或載劑中來將該化合物用於醫藥組合物中。本 發明之化合物用途及方法亦可用於預防目的。 偶聯物 對本發明寡核苦酸之另—修倚涉及使一或多種可增強募 核«之活性、細胞分佈或細胞攝取之部分或偶聯物以化 學方式連接至寡㈣酸。該等部分或偶聯物可包含Μ结 合至諸如-級或二級經基等功能基團之偶聯基團。本發明 156341.doc -69· 201201819 之偶聯基團包含嵌入劑、報導子分子、聚胺、聚醯胺、聚 乙二醇、聚醚、增強寡聚物之藥效動力學性質之基團、及 增強寡聚物之藥物代謝動力學性質之基團。典型偶聯基團 包含膽固醇、脂質、填脂、生物素、吩嗓、葉酸酿、菲 啶、蒽醌、吖啶、螢光素、若丹明（rh〇damine)、香豆素、 及染料。在本發明之上下文中，增強藥效動力學性質之基 團包含可改良攝取、增強降解抗性、及/或增強與靶核酸 之序列特異性雜交的基團。在本發明之上下文中，增強藥 物代謝動力學性質之基團包含可改良本發明化合物之攝 取、分佈、代謝或分泌的基團。代表性偶聯基團揭示於 1992年10月23日提出申請之國際專利申請案第 PCT/US92/09196號、及美國專利第6,287,860號中，其以引 用方式併入本文中《偶聯部分包含但不限於脂質部分（例 如膽固醇部分）、膽酸、硫醚（例如，己基_5_三苯甲基硫 醇）、硫代膽固醇、脂肪族鍵（例如，十二烧二醇或十一燒 基殘基）、磷脂（例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基 銨1，2-二-0-十六烷基-外消旋-甘油_3_H膦酸酯）、聚胺或聚 乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕橺基部分、或十八胺或己基 胺基-羰基-氧基膽固醇部分》本發明之寡核苷酸亦可偶聯 至活性藥物物質，例如，阿司匹林（aspirin)、華法林 (warfarin)、保泰松（phenylbutazone)、布洛芬（ibuprofen)、 舒洛芬（suprofen)、芬布芬（fenbufen)、酮洛芬（ketoprofen) ' (S)-(+)-普拉洛芬（（s)-(+)-pranoprofen)、卡洛芬 (carprofen)、丹肌胺酸（dansylsarcosine)、2,3,5-三碘苯曱 156341.doc •70· 201201819 酸、氟芬那酸（flufenamic acid)、亞葉酸、笨并嗔二嗪、氯 噻嗪、二氮呼、吲哚美辛（indomethicin)、巴比妥酸鹽、頭 抱菌素（cephalosporin)、續胺藥、抗糖尿病藥、抗菌劑或 抗生素。 教示該等寡核苷酸偶聯物之製備之代表性美國專利包含 但不限於美國專利第4,828,979號、第4,948,882號、第 5,218，105號、第 5,525,465號、第 5,541，313 號、第 5,545,730 號、第 5,552,538 號、第 5,578,717 號、第 5,580,731 號、第 5,580,731號、第 5,591，584號、第 5，109，124號、第 5,118,802 號、第 5，138,045 號、第 5,414,077 號、第 5,486,603 號、第 5,512,439號、第 5,578,718號、第 5,608,046號、第 4,587,044 號、第 4,605,735 號、第 4,667,025 號、第 4,762,779 號、第 4,789,737號、第 4,824,941號、第 4,835,263號、第 4,876,335 號、第 4,904,582 號、第 4,958,013 號、第 5,082,830 號、第 5，112,963 號、第 5,214，136號、第 5,082,830號、第 5，112,963 號、第 5,214，136號、第 5,245,022號、第 5,254,469 號、第 5,258，傷號、第 5,262,536號、第 5,272,25G號、第 5,292,873 號、第 5,317,098 號、第 5,371，241號、第 5,391，723 號、第 5,416,203號、第 5,451，463 號、第 5,510,475號、第 5,512,667 號、第 5,514,785 號、第 5,565,552 號、帛 5,567,81G 號、第 5,574，142號、第 5,585,481 號、第 5,587,371 號、第 5’595,726 號、第 5,597,696 號、第 5,599,923 號、f 5,599,928 號及第 5,688,941 號。 調配物 156341.doc • 71· 201201819 本發明化合物亦可與其他分子、分子結構或化合物混合 物（例如，脂質體、把向受體之分子、經口、直腸、局部 或其他調配物）混合、囊封、偶聯或以其他方式結合以有 助於攝取、分佈及/或吸收。教示該等有助於攝取、分佈 及/或吸收之調配物之製備的代表性美國專利包含但不限 於美國專利第5，108,921號、第5,354,844號、第5,416,016 號、第 5,459，127號、第 5,521，291號、第 5,543，165號、第 5,547,932號、第 5,583,020號、第 5,591，721號、第 4,426,330 號、第 4,534,899 號、第 5,013,556 號、第 5，108,921 號、第 5,213,804號、第 5,227，170號、第 5,264,221號、第 5,356,633 號、第 5,395,619 號、第 5,416,016 號、第 5,417,978 號、第 5,462,854號、第 5,469,854號、第 5,512,295號、第 5,527,528 號、第 5,534,259 號、第 5,543，152 號、第 5,556,948 號、第 5,580,575號、及第5,595,756號，每一者皆以引用方式併入 本文中。 儘管為調節靶表現及/或功能不需要在載體背景中投與 反義寡核苷酸，但本發明實施例係關於用於表現反義寡核 苷酸之表現載體構築體，其包括啟動子、雜合啟動子基因 序列且具有較強組成型啟動子活性，或可在期望情形下誘 導之啟動子活性。 在一實施例中，本發明實踐涉及使用適宜核酸遞送系統 投與上述反義寡核苷酸中之至少一者。在一實施例中，該 系統包含可操作地連接至聚核苷酸之非病毒載體。該等非 病毒載體之實例包含僅寡核苷酸（例如，SEQ ID NO: 4至 156341.doc •72- 201201819 13之任一者或多者）或與適宜蛋白質、多糖或脂質調配物 之組合。 另外，適宜核酸遞送系統包含病毒載體，其通常係來自 腺病毒、腺病毒相關病毒（AAV)、輔助細胞依賴性腺病 毒、逆轉錄病毒、或日本脂質體血凝病毒（HVJ)複合物中 之至少一者之序列。較佳地，病毒載體包括可操作地連接 至聚核苷&之強真核生物啟動子（例如，巨細胞病毒（CMV) 啟動子）。

另外，較佳載體包含病毒載體、融合蛋白及化學偶聯 物。逆轉錄載體包含“⑴仙巧小鼠白血病病毒及Hiy基病 毒。一種較佳HIV基病毒載體包括至少兩個載體，其中gag 及P〇l基因來自HIV基因組且env基因來自另一病毒。DNA 病毒載體較佳。該等載體包含pGx載體（例如正痘病毒或鳥 痘病母載體）、皰疹病毒載體（例如單純皰疹I病毒（HS v)載 體）、腺病毒載體及腺相關病毒載體。 本發明之義化合物涵蓋任一醫藥上可接受之鹽、酯、或 忒等酯之鹽、或在投與動物(包含人類)後能夠提供(直接或 間接）生物活性代謝物或其殘基的任一其他化合物。 術語「醫藥上可接受之鹽」係指本發明化合物之生理上 及醫藥上可接受H即，可保留母體化合物之期望生 I·生且並不賦予其不期望毒理學效應之鹽。對於寡核普 而。4藥上可接党之鹽及其應用之較佳實例進一步闡 述於美國專利第6,287，_號中，其以引用方式併入本文 中。 156341 .d〇c •73- 201201819 本發明亦包含含有本發明之反義化合物之醫藥組合物及 調配物。端視期望局部抑或全身性治療及擬治療區域，本 發明之醫藥組合物可以各種方式投與。投與可為局部（包 含眼:投與及投與㈣，包含陰道及直腸遞送）、肺部（例 糟由吸入或喷射粉末或氣溶膠’包含藉由霧化器）； 氣管内、鼻内、表皮及經皮、經口或非經腸投與。非經腸 投與包含靜脈内、動脈内、皮下、腹膜腔内或肌内注射或 輸注；或顱内（例如，鞘内或心室内）投與。 為治療中樞神經系統中之組織，可藉由（例如）注射或輸 注至腦脊髓流體中來進行投與。反義RNA在腦脊髓流體中 之投與闡述於（例如）美國專利申請公開案第2007/01 17772 號之「Methods for slowing famiiiai Als disease progression」中’其全部内容以引用方式併入本文中。 在意欲將本發明之反義寡核苷酸投與中樞神經系統之細 胞中時，可投與一或多種能夠促進標題反義寡核苷酸滲透 經過血腦障壁之藥劑。可在（例如）内嗅皮層或海馬區中進 行注射。藉由向肌肉組織中之運動神經元投與腺病毒載體 來遞送神經營養因子闡述於（例如）美國專利第6，632,427號 之「Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons」中，其以引用方式併入本文中。業内已知 將載體直接遞送至腦（例如，紋狀體、丘腦、海馬區、或 黑質）中並闡述於（例如）美國專利第6,756,523號之 「Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain」 156341 .doc -74- 201201819 一—引用方式併人本文中。可藉由注射快速投與或經 疋時間藉由緩慢輸注或投與緩釋調配物進行投與。 t題反義寡核㈣亦可與提供期望醫藥或藥效動力學性 質之藥舉例而言，反義隸㈣可與業内 促進在血腦障壁中之滲透或輸送之任一物質（例如鐵 傳遞蛋白文體之抗體）偶合，並藉由靜脈内注射投與。反 義化合物可與病毒載體連接，該病毒載體可（例如）使反義 化a物更有效及/或增加反義化合物在血腦障壁中之輸 达。亦可藉由（例如）輸注以下物質來破壞滲透性血腦障 壁糖，包含但不限於内消旋赤藻糖醇、木糖醇、d(+)半 礼糖、D(+)乳糖、D(+)木糖、衛矛醇、肌_肌醇、[㈠果 糖、D(-)甘露醇、d(+)葡萄糖、d(+)阿拉伯糖、d㈠阿拉 伯糖、纖維二糖、D(+)麥芽糖、D(+)棉子糖、L(+)鼠李 糖、D(+)蜜二糖、〇(-)核糖、核糖醇、〇(+)阿糖醇、l(-) 阿糖醇' D(+)岩藻糖、L(-)岩藻糖、D(-)來蘇糖、L(+)來 蘇糖、及L(-)來蘇糖；或胺基酸，包含但不限於麩胺醯 胺、離胺酸、精胺酸、天門冬醯胺、天門冬胺酸、半胱胺 酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、亮胺酸、曱硫胺酸、苯丙 胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、纈胺酸、及牛 磺酸。用於增強血腦障壁滲透之方法及材料闡述於（例如） 美國專利第 4,866,042號之「Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier」、第 6,294,520號之「Material for passage through the blood-brain barrier」 及第 6,936,589號之 「 Parenteral delivery 156341.doc -75- 201201819 systems」中，其全部内容皆以引用方式併入本文中。 標題反義化合物可與其他分子、分子結構或化合物混合 物（例如，脂質體、靶向受體之分子、經口、直腸、局部 或其他調配物）混合、囊封、偶聯或以其他方式結合以有 助於攝取、分佈及/或吸收《舉例而言，陽離子型脂質可 包含於調配物中以促進寡核㈣攝取。—種顯示可促進攝 取之該組合物係 LIPOFECTIN(購自 GIBCO-BRL，Bethesda， MD)。 ， 據仏，至少一個2’-〇-甲氧基乙基修飾之寡核苷酸尤其可 用於經口投與。用於局部投與之醫藥組合物及調配物可包 含經皮貼片、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、喷 霧劑、液體及粉末。可能需要或期望習用醫藥載劑 '水 性、粉末或油性基質、增稠劑及諸如此類。亦可使用包覆 避孕套、手套及諸如此類。 可便利地以單位劑型呈現之本發明醫藥調配物可根據醫 藥工業中熟知之習用技術製得。該等技術包含使活性成份 與j藥載劑或賦形劑結合之步驟。一般而言，調配物可藉 由使活性成份與液體載劑或微細固體載劑或二者均勻且充 分結合且然後（若必要）使該產物成型來製備。 可將本發明組合物調配成許多可能劑型中之任一者，例 如但不限於錠劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿、軟質凝 醪、栓劑、及灌腸劑。本發明組合物亦可調配成存於水 性、非水性或混合介質中之懸浮液。水性懸浮液可進一步 含有可增加懸浮液之黏度之物質，其包含（例如）羧甲基纖 156341.doc •76· 201201819 维素鈉、山梨糖醇及/或右旋糖酐。懸浮液亦可含有穩定 劑。 本發明之醫藥組合物包含但不限於溶液、乳液、發泡體 及含有脂質體之調配物。本發明之醫藥組合物及調配物可 包括一或多種滲透增強劑'載劑、賦形劑或其他活性或惰 性成份。 乳液通常係一種液體分散於另一液滴形式液體（直徑經 常超過0.1 μιη)的異質系統。乳液除分散相外亦可含有額外 組份、及可呈現為存於水相、油相中之溶液形式或自身作 為分離相的活性藥物。本發明一實施例包含微乳液。乳液 及其應用在業内已眾所周知且進一步闡述於美國專利第 6,287,860號中。 本發明調配物包含脂質體調配物。本發明所用之術語 「脂質體」意指由佈置於一或多個球形雙層中之兩親性脂 質組成的囊泡。脂質體係單層或多層囊泡，其具有自親脂 性材料形成之膜及含有擬遞送組合物之水性内部結構。陽 離子型脂質體係帶正電之脂質體，據信其可與帶負電之 DNA分子相互作用以形成穩定複合物。對ρΗ敏感或帶負電 之脂質體據信可捕獲DNA而非與其複合。陽離子型及非陽 離子型脂質體皆可用於向細胞遞送DNA。 脂質體亦包含「空間穩定」之脂質體，本文所用之該術 語係指包括一或多種特定脂質之脂質體。在納入脂質體中 犄，該等特定脂質會產生相對於缺乏該等特定脂質之脂質 體具有增強之循環壽命的脂質體。空間穩定脂質體之實例 15634 丨.doc •77· 201201819 係彼等脂質體中形成囊泡之脂質部分包括一或多種糖脂或 衍生自一或多種親水性聚合物（例如聚乙二醇（pEG)部分） 者。脂質體及其應用進一步闡述於美國專利第6,287,860號 中。 本發明之醫藥調配物及組合物亦可包含表面活性劑。表 面活性劑在藥物產物、調配物及乳液中之應用在業内已眾 所周知。表面活性劑及其應用進一步闡述於美國專利第 6,287,860號中，其以引用方式併入本文中。 在一實施例中’本發明採用各種滲透增強劑來實現核 酸、尤其寡核苷酸之有效遞送。除有助於非親脂性藥物在 細胞膜中之擴散外，滲透增強劑亦增強親脂性藥物之滲透 性。滲透增強劑可歸類為5大類中之一者：亦即，表面活 性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑、及非螯合性非表面活性 劑。滲透增強劑及其應用進一步闡述於美國專利第 6,287,860號中，其以引用方式併入本文中。 熟I此項技術者應認識到，調配物通常根據其預期廣用 (亦即投與途徑）來進行設計。 用於局部投與之較佳調配物包含彼等本發明寡核苷酸與 局部遞送劑混合者，該局部遞送劑係（例如）脂質、脂質 體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑及表面活性劑。 較佳脂質及脂質體包含中性脂質及脂質體（例如二油醯基_ 磷脂醯基DOPE乙醇胺、二肉豆蔻醯基磷脂醯基膽鹼 DMPC、二硬脂醯基磷脂醯基膽鹼）、負脂質及脂質體（例 如二肉豆蔻醯基磷脂醯基甘油DMPG)及陽離子型脂質及脂 156341.doc •78· 201201819 質體（例如二油醯基四f基胺基丙基D〇TAp及二油醯基-磷 脂醯基乙醇胺DOTMA)。 對於局部或其他投與而言’本發明之寡核普酸可囊封於 月曰質體内或可與其形成複合物（尤其陽離子型脂質體）。另 -選擇為’寡核苷酸可與脂質、尤其陽離子型脂質複合。 較佳脂肪酸及醋、其醫藥上可接受之鹽、及其應用進一步 闡述於美國專利第6,287,860號中。 用於經σ投與之組合物及調配物包含粉末或粒子 '微顆 粒不米顆粒、存於水或非水性介質令之懸浮液或溶液、 膠囊、凝膠膠囊、藥囊、錠劑或微錠劑。可能期望使用增 ㈣卜矯味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。較 佳口服調配物係彼等本發明寡核芽酸與一或多種渗透增強 劑、表面活性劑及聲合劑聯合投與者。較佳表面活性劑包 s月曰肪^及/或其g旨或鹽、膽汁酸及/或其鹽。較佳膽汁酸/ 孤及月日肪I及其應用進一步闡述於美國專利第6,287，_號 -乂引用方式併人本文中。亦較佳者係;參透增強劑之 组合，例如，脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽之組合。尤佳之組合 ^ ^及UDCA。其他滲透增強劑包含聚 氧乙烯9月桂基喊、聚氧乙婦_2〇_録壤基謎。本發明之寡 核苷酸可以粒子形式（包含喷霧乾燥顆粒、或經複合以形 成微顆粒或不米顆粒）經口遞送。寡核苦酸複合劑及其應 用進一步闡述於美國專利第6,287，細號中，其以引用方式 併入本文中。 用於非、&腸、|肖内或心室内投與之組合物及調配物可包 156341.doc •79- 201201819 含亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適宜添加劑之無菌水溶 液，該等其他適宜添加劑係（例如）但不限於滲透增強劑、 載劑化合物及其他醫藥上可接受之載劑或賦形劑。 本發明某些實施例提供含有一或多種寡聚化合物及一或 多種藉由非反義機制發揮作用之其他化學治療劑之醫藥組 合物。該等化學治療劑之實例包含但不限於癌症化學治療 藥物，例如柔紅黴素（daunorubicin)、道諾黴素 (daunomycin)、更生黴素（dactinomycin)、多柔比星 (doxorubicin)、表柔比星（epirubicin)、伊達比星（idarubicin) 、依索比星（esorubicin)、博來黴素、馬峨酿胺 (mafosfamide)、異環填胺（ifosfamide)、胞嘯咬阿糖核苷 (cytosine arabinoside)、亞硝腺氮茶（bischloroethyl-nitrosurea)、白消安（busulfan)、絲裂黴素 C(mitomycin C)、放線菌素D(actinomycin D)、光輝黴素（mithramycin)、 潑尼松（prednisone)、經孕酮（hydroxyprogesterone)、睾銅 (testosterone)、他莫昔芬（tamoxifen)、達卡巴 °秦 (dacarbazine)、丙卡巴肼（procarbazine)、六曱三聚氰胺 (hexamethylmelamine)、五曱三聚氰胺（pentamethylmelamine) 、米托蒽 S昆（mitoxantrone)、安0丫咬（amsacrine)、苯 丁酸氮 芥（chlorambucil)、環己亞石肖脲（methylcyclohexylnitrosurea) 、氮芥（nitrogenmustards)、美法余（melphalan)、環填酿胺 (cyclophosphamide)、6-疏0票0令（6-mercaptopurine)、6-硫鳥 0票吟（6-thioguanine)、阿糖胞苦（cytarabine)、5-氮雜胞苦 (5-azacytidine)、經基脲（hydroxyurea)、喷司他丁 156341.doc -80- 201201819 (deoxycoformycin) 、 4-羥基過氧環填醢胺（4· hydroxyperoxycyclo-phosphoramide) 、5-敦尿0密咬（5-fluorouracil)(5-FU)、5-氣去氧尿苦（5-fluorodeoxyuridine) (5-FUdR)、曱胺蝶吟（MTX)、秋水仙驗（c〇ichicines)、紫杉 醇（taxol)、長春新鹼（vincristine)、長春鹼（vinblastine)、 依託泊甙（etoposide)(VP-16)、三甲曲沙（trimetrexate)、伊 立替康（irinotecan)、托泊替坎（t〇potecan)、吉西他濱 (gemcitabine)、替尼泊甙（teniposide)、順鉑（ciSpiatin)及己 烯雌酚（diethylstilbestrol)(DES)。在與本發明化合物一起 使用時’該等化學治療劑可單獨（例如，5_FIJ及寡核苦 酸）、依序（例如’ 5-FU及寡核苷酸，隨後在一定時間之後 係MTX及募核苷酸）、或與一或多種其他該等化學治療劑 組合（例如，5-FU、MTX及寡核苷酸，或5_FU、放射療法 及寡核苷酸）使用》抗炎藥（包含但不限於非類固醇抗炎藥 及皮質類固醇，以及抗病毒藥，包含但不限於利巴韋林 (ribivirin)、阿糖腺苷（vidarabine)、阿昔洛韋（acyci〇vir)及 更昔洛韋（ganciclovir))亦可組合於本發明組合物中。反義 化合物及其他非反義藥物之組合亦屬於本發明範圍内兩種 或更多種組合之化合物可一起或依序使用。 在另-相關實施例中’本發明組合物可含有一或多種靶 向第-核酸之反義化合物（尤其寡核㈣）及—或多種乾向 第二核酸靶之額外反義化合物。舉例而言，第一靶可為類 BCL211(BCL2Ul)m義序列，且第4可為來自 另一核苷酸序列之區域。另—選擇為，本發明組合物可含 156341.doc 81 201201819 有兩種或更多種乾向同-類BCL2 11 (BCL2L11)核酸乾之 不同區域的反義化合物。反義化合物之諸多實例閣釋於本 文中且其他實例可選自業内已知之適宜化合物。兩種或更 多種組合之化合物可—起或依序使用。 投藥： 據L ’彼等熟習此項技術者應瞭解治療性組合物之調配 及其隨後之投與(投藥)。投藥取決於欲治療疾病狀態之嚴 重=度及反應性中治療過程可持續數天至數月，或直 至實現治癒或減輕疾病狀態為止。可藉由量測患者體内之 藥=積累來計算最適投藥方案。熟習此項技術者可容易地 確定最適劑量、投藥方法及重複速率。最適劑量可端視個 別寡核《之相對功效而有所變化’且通常可基於發現在 :體外及活體内動物模型中有效之EC50進行估計…般而 言’劑量為0.01 _g體重至1〇〇 g/kg體重，且可每日、每 週每月或每年給予一次或更多：欠，或甚至每2至年給 予一次。熟習此項技術者可容易地基於體液或組織中藥物 之所量測滯留時間及濃度來估計投藥的重複速率。成功治 療後，可期望使患者維持該療法以預防疾病狀態復發，其 中以介於0.01吨/kg體重至1〇〇 g/kg體重之間之維持劑量投 與寡核苦酸’且每日投與—次或更多次至每2()年投與一 次。 在實施例令，使用以下劑量之藥物來治療患者：至少約 1 mg/kg體重、至少約2 mg/kg體重、至少約3 mg/kg體重、 至少約4 mg/kg體重、至少約5 mg/kg體重、至少約6 I56341.doc •82· 201201819 體重、至少約7 mg/kg體重、至少約8 mg/kg體重、至少約9 mg/kg體重、至少約10 mg/kg體重、至少約15 mg/kg體重、 至少約20 mg/kg體重、至少約25 mg/kg體重、至少約3〇 mg/kg體重、至少約35 mg/kg體重、至少約4〇 mg/kg體重、 至少約45 mg/kg體重、至少約50 mg/kg體重、至少約6〇 mg/kg體重、至少約70 mg/kg體重、至少約8〇 mg/kg體重、 至少約9〇11^/1^體重、或至少約1〇〇111§/4體重。反義寡核 苷酸之某些注射劑量闡述於（例如）美國專利第7,563,884號 之「Antisense modulation 〇f PTP1B expressi〇n」中，其全 部内容以引用方式併入本文中。 儘管上文已闡述本發明之各個實施例，然而，應理解， 該等實施錢仙實射式而非限财式提供q根據本 文之揭示内容對所揭示實施例作出諸多改變，此並不背離 本發明之精神或範圍。因此’本發明之廣度及範圍不應受 上述實施例中之任一者限制。 丰文所k及之所有文件皆以引用方式併入本文中。出於 所有目的，在本申請案中引用之所有出版物及專利文件比 係以引用方式併入，其併入程度如同每-個別出版物或； 利文件係早獨閣述-般。對於此文件中引用之各個參考文 獻，申請者不承認任一特定參考文獻係其發明之「= 術」。本發明組合物及方法之實施例闡釋於下列實例中。 實例 以下非限制性實例用 解，所示組份之元素之 於闡釋本發明之所選實施例。 比率變化及代替物已為彼等熟 應瞭 習此 I5634l.doc -83- 201201819 項技術者所明瞭且屬於本發明實施例之範圍内。 實例1 :對類BCL2 11 (BCL2L11)之反義核酸分子及f或 BCL21A 1聚核苷酸之有義股具有特異性之反義寡核苷酸的 設計 如上所述，術語「對……具有特異性之寡核苷酸」或 「靶向......之寡核苷酸」係指具有如下序列之寡核苷酸： ⑴能夠與靶向基因之一部分形成穩定複合物，或（丨丨）能夠 與靶向基因之mRNA轉錄本之一部分形成穩定雙鏈體。

藉由使用電腦程式（例如IDT AntiSense Design，IDT 01ig〇AnalyZer)來促進適當寡核苷酸之選擇，該等電腦程 式自動鑑別每一給定序列中之19-25個核苷酸之子序列， 該等子序列與靶聚核苷酸序列形成雜合體且具有期望熔融 溫度（通常為50-60。〇，且不會形成自身二聚體或其他複雜 二級結構。 藉由使用自動對準核酸序列並指示一致性或同源性區域 之電腦程式來進一步促進適當寡核苷酸的選擇。使用該等

程式藉由（例如）搜索諸如GenBank等數據庫或藉由對PCR 產物測序來比較所獲得的核酸序列。對來自給定基因組中 一定範圍基因及基因間區域之核酸序列進行比較使得可選 擇對目標基因顯示適當特異性程度的核酸序列。該等程序 使得可選擇對給定基因組中之靶核酸序列顯示高互補性程 度且對其他核酸序列顯示較低互補性程度的寡核芽酸。孰 習此項技術者應認_，可在較大範財選擇適用於本發 明中之基因區域。 156341.doc • 84 · 201201819 在以下情形時反義化合物係、「可特異性雜交」：化合物 與靶核酸之結合可干擾靶核 〜ι*功月b以调節功能及/ 或活性’且存在^夠互補性程度以避免反義化合物與非乾 核酸序列在期望發生特異性結合之條件下（亦即，在活體 内分析或治純治療情形中之生理條件下，及在活體外分 析情形中實施分析之條件下）發生非特異性結合。 本文所述寡核苦酸之雜交性f可藉由業内已知之一或多 個活體外分析進行敎。舉例而言’可藉由使㈣融曲線 分析測定乾天然反義分子及潛在藥物分子間之結合強度來 獲得本文所述寡核苷酸之性質。 可使用量測分子間相互作用之強度之已確立方法中的任 一者（例如，熔融曲線分析）來估計靶天然反義分子及潛在 藥物分子（分子）間之結合強度。 熔融曲線分析可測定對於天然反義分子/分子複合物自 雙鏈快速轉變成單鏈形態時之溫度。此溫度已廣泛接受作 為兩個分子間相互作用強度之可靠量度。 可使用實際天然反義RNA分子之CDNA拷貝或對應於分 子結合位點之合成DNA或RNA核苷酸來實施熔融曲線分 析。可使用含有所有必需試劑以實施此分析之多個套组 (例如 Applied Biosystems公司，MeltDoctor套組）。該等套 組包含含有雙鏈DNA (dsDNA)結合染料（例如ABI HRM染 料、SYBR Green、SYT0等）中之一者的適宜緩衝溶液。 dsDNA染料之性質在於其幾乎不發射游離形式之螢光，但 在與dsDNA結合時具有高螢光性。 15634l.doc * 85 · 201201819 為實施分析，以由特定製造商方案界定之濃度將cDNA 或相應养核Θ酸與分子混合。將混合物加熱至9 5 以離解 所有預形成之dsDNA複合物，然後緩慢冷卻至室溫或由套 組製造商界定之其他較低溫度以使DNA分子退火。然後將 新形成複合物緩慢加熱至95°C，同時繼續收集關於反應中 所產生螢光之量的數據。螢光強度與反應中存在之dsC)NA 量成反比》可使用與套組相容之實時PCR儀器（例如ABIis

StepOne Plus Real Time PCR System 或 lightTyper儀器， Roche Diagnostics，Lewes，UK)來收集數據。 藉由使用適當軟體（例如lightTyper (R〇che)或SDS Dissociation Curve，ABI)繪製螢光相對於溫度之負導數(_d(螢 光）/dT) ’ y抽）與溫度（X軸）的圖線來構建熔融蜂。分析數據 以確定自dsDNA複合物快速轉變成單鏈分子時之溫度。此 溫度稱為Tm且與兩個分子間之相互作用強度成正比。通 常，Tm高於40°C。 實例2 : BCL2L11聚核苷酸之調節 使用反義寡核苷酸處理MCF-7細胞 貫例2中所用之所有反義募核苦酸皆如實例1中所述進行 設計。指示製造商（IDT公司’ Coralville，IA)來製造所設計 之硫代磷酸酯鍵寡核苷酸並提供表丨中所示之所設計硫代 填酸酯類似物。核苷酸間之星形符號表示存在硫代填酸酯 鍵。實例2中之實驗所需的寡核苷酸可使用任一適當技術 狀態之方法來合成’例如IDT所用之方法：在固體載體（例 如5微米定孔玻璃珠（CPG))上使用亞磷醯胺單體（常見核苦 I56341.doc -86 - 201201819 酸’其所有活性基團皆經保護基團保護，例如糖上之三苯 甲基、A及C上之苯甲醯基及g上之N-2-異丁醯基）。保護 基團在寡核苷酸合成期間可防止發生不期望之反應。在合 成過程結束時去除保護基團。經由3'碳使初始核苷酸連接 至固體載體且在31至5,方向上進行合成。在以下4步中向生 長之寡核苷酸鏈中添加新鹼基：〇使用三氣乙酸自固定核 苦酸之5’氧處去除保護基團；2)使用四唑使經固定核苷酸 與序列中之下一個核苷酸偶合至一起；經由四唑基亞磷醯 胺中間體使反應繼續進行；3)洗滌除去未反應之游離核苷 酸及反應副產物且將未反應之固定募核苷酸封端以防止其 參與下一輪合成；藉由使用乙酸酐及N-甲基咪唑對游離5· 經基實施乙醯化來達成封端；4)為穩定核苷酸間之鍵，使 用蛾及水（若欲產生礙酸二酯鍵）、或Beaucage試劑（3H-1,2-苯并二硫醇·3-酮-i，i-二氧化物）（若期望硫代磷酸酯鍵）來 氡化磷。藉由交替使用兩種氧化劑，可構建嵌合主鏈。對 於序列中之每一核苷酸而言，皆重複上述4步循環。合成 完整序列時’在高溫下使用氫氧化銨自固體載體解離寡核 苷酸並實施去保護。藉由去鹽來洗滌除去保護基團且將剩 餘寡核苷酸凍乾。為實施實例2中所設計之實驗，在37°C 及5% (：02下於生長培養基（MEM/EBSS(Hycl〇ne目錄編號： SH30024，或 Mediatech 目錄編號：MT-10-010-CV)+10。/。FBS (Mediatech 目錄編號：MT35-011-CV)+青徽素（penicillin)/ 鏈黴素（streptomycin)(Mediatech目錄編號：MT30-002-CI)) 中生長來自ATCC之MCF-7細胞（目錄編號：HTB-22)。在 156341.doc -87 · 201201819 實驗前一天，以1·5χ105/ml之密度將細胞再次平鋪於6孔板 中並在37°C及5% C02下培育過夜。在實驗當天，將6孔板 中之培養基更換為新鮮生長培養基。 將由製造商以凍乾形式運送之寡核苷酸在不含 RNAse/DNAse之去離子水中稀釋至濃度為20 μΜ。將2 μΐ 此溶液與400 μΐ OptiMEM培養基（Gibco目錄編號：31985-070)及 4 μΐ Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄編號： 1 1668019)在室溫下一起培育20 min，然後逐滴施加至6孔 板中具有MCF-7細胞之一個孔中。使用包含2 μΐ水代替寡 核苷酸溶液之相似混合物作為模擬轉染對照組。在37°C及 5% C02下培育3-18 h之後，將培養基更換為新鮮生長培養 基。添加反義寡核苷酸48 h後，去除培養基，且使用來自 Promega 之 SV Total RNA Isolation System (目錄編號： Z3105)或來自 Qiagen之 RNeasy Total RNA Isolation套組（目 錄編號：741 81)根據製造商說明書自細胞提取RNA ^將 600 ng提取之RNA添加至使用來自Thermo Scientific之 Verso cDNA套組（目錄編號：AB1453B)或高容量cDNA逆 轉錄套組（目錄編號：4368813)實施的逆轉錄反應中，如製 造商方案中所述。使用來自此逆轉錄反應之cDNA藉由實 時 PCR使用 ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄編號： 43 69510)及由 ABI 設計之引物 / 探針（Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay ： HsOO 197982_ml >

Applied Biosystems公司，Foster City CA)來監測基因表 現。使用 StepOne Plus實時 PCR機器（Applied Biosystems) 156341.doc • 88 - 201201819 來實施下列PCR循環：在5(TC下保持2 min，在95亡下保持 10 min，40個循環之（在95它下保持15秒，在6〇t下保持丄 min)。基於經處理及模擬轉染試樣間18S標準化dCt值之差 值來s十算使用反義寡核苷酸處理後基因表現的變化倍數。 結果：實時PCR結果顯示，在使用設計為BIM反義 Hs.652337之养聚物處理48 h之後，MCF7細胞中之BIM mRNA之含量顯著增加。 使用反義募核苷酸處理HepG2細胞 貫例2中所用之所有反義募核普酸皆如實例1中所述進行 6又sj·。指示製造商（IDT公司，Coralville，IA)來製造所設計 之硫代磷酸酯鍵寡核苷酸並提供表1中所示之所設計硫代 構酸醋類似物。核苷酸間之星形符號表示存在硫代磷酸酯 鍵。實例2中之實驗所需的募核苷酸可使用任一適當技術 狀態之方法來合成，例如IDT所用之方法：在固體載體（例 如5微米定孔玻璃珠（CPG))上使用亞填醢胺單體（常見核苦 酸’其所有活性基團皆經保護基團保護，例如糖上之三苯 甲基、A及C上之苯曱醯基及〇上之N-2-異丁醯基）。保護 基團在募核苷酸合成期間可防止發生不期望之反應β在合 成過程結束時去除保護基團。經由3,碳使初始核苷酸連接 至固體載體且在3'至5’方向上進行合成。在以下4步中向生 長之寡核苷酸鏈中添加新鹼基：1)使用三氣乙酸自固定核 苷酸之5'氧處去除保護基團；2)使用四唑使經固定核苷酸 與序列中之下一個核苷酸偶合至一起；經由四唑基亞磷醯 胺中間體使反應繼續進行；3)洗滌除去未反應之游離核苦 15634l.doc -89- 201201819 酸及反應副產物且將未反應之固定寡核苷酸封端以防止其 參與下一輪合成；藉由使用乙酸酐及N-甲基咪唑對游離5, 羥基實施乙醯化來達成封端；4)為穩定核苷酸間之鍵，使 用蛾及水（右欲產生填酸二醋鍵）、或Beaucage試劑（3H-1,2_ 苯并二硫醇-3-酮-1，1 -二氧化物）（若期望硫代磷酸酯鍵）來 氧化磷。藉由交替使用兩種氧化劑，可構建嵌合主鏈。對 於序列中之每一核苦酸而言’皆重複上述4步循環。合成 完整序列時，在高溫下使用氫氧化銨自固體載體解離寡核 苷酸並實施去保護。藉由去鹽來洗滌除去保護基團且將剩 餘寡核苷酸凍乾。 為實施實例2中所設計之實驗，在37°C及5% C02下於生 長培養基（MEM/EBSS(Hyclone目錄編號：SH30024，或 Mediatech 目錄編號：MT-10-010-CV)+10% FBS(Mediatech 目錄編號：MT35- 011-CV)+青黴素/鏈黴素（Mediatech目錄 編號：MT30-002-CI))中生長來自ATCC之HepG2細胞（目錄 編號：HB-8065)。在實驗前一天，以〇·5 X 1 〇4/mi之密度將 細胞再次平鋪於6孔板中並在37°C及5% C02下培育過夜。 在實驗當天’將6孔板中之培養基更換為新鮮生長培養 基。 將由製造商以凉乾形式運送之寡核普酸在不含 RNAse/DNAse之去離子水中稀釋至濃度為20 μΜ。將2 μΐ 此溶液與400 μΐ OptiMEM培養基（Gibco目錄編號：3 1985-070)及 4 μΐ Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄編號： 1 1668019)在室溫下一起培育20 min，然後逐滴施加至6孔 156341.doc -90- 201201819 板中具有HepG2細胞之一個孔中。使用包含2 μΐ水代替寡 核苷酸溶液之相似混合物作為模擬轉染對照組。在37°C及 5% C02下培育3-18 h之後，將培養基更換為新鮮生長培養 基。添加反義募核苷酸48 h後，去除培養基，且使用來自 Promega之 SV Total RNA Isolation System (目錄編號： Z3105)或來自 Qiagen之RNeasy Total RNA Isolation套組（目 錄編號：74181)根據製造商說明書自細胞提取RNA。將 600 ng提取之RNA添加至使用來自Thermo Scientific之 Verso cDNA套組（目錄編號：AB1453B)或高容量cDNA逆 轉錄套組（目錄編號：4368813)實施的逆轉錄反應中，如製 造商方案中所述。使用來自此逆轉錄反應之cDNA藉由實 時 PCR使用 ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄編號： 43695 10)及由 ABI 設計之引物 / 探針（Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay : Hs00197982_ml(BCL2Lll)， Applied Biosystems公司，Foster City CA)來監測基因表 現。使用 StepOne Plus實時 PCR機器（Applied Biosystems) 來實施下列PCR循環：在50°C下保持2 min，在95°C下保持 10 min，40個循環之（在95°C下保持15秒，在60°C下保持1 min)。基於經處理及模擬轉染試樣間18S標準化dCt值之差 值來計算使用反義寡核苷酸處理後基因表現的變化倍數》 結果：實時PCR結果顯示，在使用設計為BIM反義 Hs.652337之寡聚物處理48 h之後，HepG2細胞中之BIM mRNA之含量顯著增加（圖2)。 使用反義寡核苷酸處理初級角質形成細胞 156341.doc -91 - 201201819 在37°C及5% C02下於生長培養基（角質形成細胞生長培 養基，Lifeline目錄編號：LM0004+Lifeline生長因子1030) 生長初級角質形成細胞（來自Lifeline Technologies)。在實 驗前一天，以約5xlOA4/ml(或90%鋪滿之約1/3稀釋度）將細 胞再次平鋪於24孔膠原塗覆板（Beckton Dickinson BioCoat 板，目錄編號：35 6408)中，並在37°C及5% C02下培育過 夜。在實驗當天，將24孔板中之培養基更換為1 ml新鮮生 長培養基。將由製造商以凍乾形式運送之寡核苷酸在不含 RNAse/DNAse之去離子水中稀釋至濃度為20 μΜ將2 μΐ此 溶液與400 μΐ OptiMEM培養基（Gibco目錄編號：3 1985-070)及 4 μΐ TransIT®-LTl轉染試劑（Minis目錄編號：MIR 2300)在室溫下一起培育20 min，然後逐滴施加至6孔板中 具有HepG2細胞之一個孔中。使用包含2 μΐ水代替寡核苷 酸溶液之相似混合物作為模擬轉染對照組。投藥後，將板 在3 7°C、5% C02下培育過夜。添加反義寡核苷酸後24 h 時，使用新鮮生長培養基代替培養基且如上所述重複投 藥。第二次投藥24 h時，使用來自Promega之SV Total RNA分離系統（目錄編號：Z3 1 05)根據製造商說明書自細 胞提取RNA。將總共600 ng RNA添加至逆轉錄反應中，該 逆轉錄反應係使用來自Applied Bio systems之高容量cDN A 套組（目錄編號：43688 13)如製造商方案中所述來實施。使 用來自此逆轉錄反應之cDNA藉由實時PCR使用ABI Taqman Gene Expression Mix(目錄編號：4369510)及由 ABI設計之引物/探針（Hs00197982_ml)來監測基因表現。 156341.doc -92- 201201819 使用 StepOne Plus 實時 PCR機器（Applied Biosystems)來實 施下列PCR循環：在50°C下保持2 min，在95°C下保持10 min，40個循環之（在95°C下保持15秒，在60°C下保持1 min)。基於經處理及模擬轉染試樣間18S標準化dCt值之差 值來計算使用反義寡核苷酸處理後基因表現的變化倍數。 結果：實時PCR結果顯示，在使用設計為BIM反義 Hs.6523 3 7之寡聚物處理48 h之後，角質形成細胞中之BIM mRNA之含量顯著增加（圖3)。 實例3 :活體外細胞凋亡分析 使用HT Titer TACS分析套組根據製造商方案（Trevigen 目錄編號：4822-96-K)檢測細胞中之細胞凋亡程度。簡言 之，對寡核苷酸轉染48小時後之細胞實施胰蛋白酶化，計 數並以100,000細胞/孔之密度再次平鋪於96孔板中。然後 將96孔板在37°C、5% C02下培育過夜。次日早晨，去除 培養基且將細胞固定於使用PBS及100%曱醇（Sigma-M1 775-1GA)沖洗之3.7%緩衝甲醛溶液（Sigma-252549)中， 並在+4°C下儲存於80%乙醇（Sigma-4935 1 1)中。 為標記DNA斷裂，去除乙醇，且使用PBS洗滌細胞並與 蛋白酶K溶液在室溫下一起培育15分鐘，在水及PBS中沖 洗，然後與TACS核酸酶溶液在37°C下一起培育10分鐘。 培育後，使用PBS沖洗細胞，且在室溫下經5分鐘添加過氧 化氫溶液（Sigma-MKBD1394)。然後將細胞與lx TdT標記 在室溫下一起再培育5分鐘。去除缓衝液且隨後將細胞與 標記反應混合物在37°C下一起培育一小時，且然後經5分 156341.doc -93- 201201819 鐘添加lx TdT終止缓衝液。標記反應停止後，使用PBS洗 滌細胞，與Strep-HRP溶液在室溫下一起培育10分鐘，使 用PBS/Tween洗滌且與TACS蘭寶石在暗處一起培育30分 鐘。藉由添加0.2 N HC1 (Fluka-343102)來停止反應，且在 450 nm下於板讀數儀中讀取吸光度。 1_使用20 nM CUR-1174(p63反義寡核苷酸）及CUR-1522(BIM反義寡核苷酸）使用Lipofectamine™ 2000轉染試 劑（Invitrogen)來轉染 A549 細胞（ATCC 編號：CCL-185™)。 結果：在使用CUR-1174及CUR-1522轉染之A549細胞 中，細胞凋亡顯著增加（圖4)。 2.使用 CUR-1519、CUR-1521 及 CUR-1522 在 20 nM 下使 用 Lipofectamine™ 2000 轉染試劑（Invitrogen)來轉染 Hep G2細胞（ATCC目錄編號：HB-8065)。亦使用20 nM CUR-1 505(無活性寡核苷酸）且使用LipofectamineTM 2000及水（模 擬轉染）來轉染細胞子組。 結果：在使用CUR-1522轉染之HepG2細胞中，細胞凋亡 顯著增加。其他寡核苷酸對細胞凋亡並無顯著影響（圖5及 6) 〇 儘管已根據一或多個實施方案闡釋及闡述了本發明，但 熟習此項技術者在閱讀並理解本說明書及附圖後可作出等 效改變及修改。此外，儘管可能只根據多種實施方案中之 一者揭示了本發明之特定特徵，但該特徵可與其他實施方 案之一或多個其他特徵組合，此對於任何給定或特定之應 用而言可能係合乎要求且有利的。 156341.doc • 94- 201201819 本揭示内容之摘要使得讀者可快速地確定技術揭示内容 之性質。提交本摘要係基於以下理解：其並非用於解釋或 限制下列申請專利範圍之範圍或含義。 參考文獻 1. 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<130> BIW <140> 100117636 <141> 2011-05-19 <150> 61/346,252 <151> 2010-05-19 <160> 13 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 722 <212> DNA <213>智人 <300> <308> NM_207002.2 <309> 2〇Tl-02-06 <313〉 （1)..(722) <400> 1 acttcgctcc gcgcagccgc ctggtctgca gtttgttgga gctctgcgtc cagcgccgct 60 gccgctgccg ccgccgccgc cgccgccgcc gccgccgccg ccgccgccac taccaccact 120 tgattcttgc agccaccctg cgaaccctgc cacactgcga tcgcatcatc gcggtattcg 180 gttcgctgcg ttcccgccgc caccgcctcg gcgccctttc ttggcccttg ttcccccaaa 240 tgtctgactc tgactctcgg actgagaaac gcaagaaaaa aagaccaaat ggcaaagcaa 300 ccttctgatg taagttctga gtgtgaccga gaaggtagac aattgcagcc tgcggagagg 360 cctccccagc tcagacctgg ggcccctacc tccctacaga cagagccaca agacaggagc 420 ccagcaccca tgagttgtga caaatcaaca caaaccccaa gtcctccttg ccaggccttc 480 aaccactatc tcagtgcaat ggtagtcatc ctagaggata taggtgatct ttcactgtgc 540 tttggattta tatttactgg cttagatttg tatggccacc accatagtca agatacagaa 600 caactcaacc acaaggattt ctcatgatac ctttttatag ccacagccac ctctctccct 660 cttccttgag cattttgtca tatggtcatt ggtgattaaa taaaatgtat tttaatatig 720 ac 722 <210〉 2 <211> 3026 <212> DNA <213>智人 <400> 2 ctagtcctgt tgaactcaga tgactgcagc cacaggagtg atcccagagt cttttgcact 60 gggaggagaa ggtggaacag gagacaccca cattctagtt ggtccctgct gtctccaaga 120 ggtggtgtac caggagtcct acagatgtga agctaggtta aaaccagttc tggggatgct 180 ttcaaatcaa agaggattta aaaatgtgac tcccagttgc atttccggag ccaagcagca 240 tcctggcttg ggggcctggt gtctaccaca cttctgcgca ttcttcctcc aagccacatc 300 tcctgagaat aaagcaagat gccattggca atgtctactc agaactactt gaatgactca 360 tcaatcaaca ggcttgaatg ctcttcttcc tctatgattc aacggtttga ttgactgaac 420 tgaaactaaa acccaaccct agtggtcatt ttagacttga gcagatacag tcagaatctc 480 156341-序列表.doc 201201819 aatcacatgt catcagcagg ccctccttgg cctccttatt gcagctgggc tcctgagcag ctctccctca ctcagggagg aaacgaacgg ctcctttcag tagggcagac gaaggctgct ggctgacgca actgctcctg tgtccacttc ccagcaaggg tgcaaaacag gatttgtgct tgtgctggtg aatctgggct tcacctagca aatcaggggg acaccaaaat gaaaacagcc ctagaggcat ggagaaagcc tcaggtgcac taa^gtgcca acagaaacga tgcatctcag agttgacagt catgactcaa ataggacgtg aaggcaacat gtgggtgaga gtagcagcta tgggtgtaaa tatgatcaaa latgggggag gtgtccagat ttcttggaca tggttacaat cagtatttat tttctctctt agtgaacgag tttttggttt ttcaatactg ctaattttac aggcaattca ctacgttccc tgggaggtgg agtggccttc ctccctgctg tgcgtgggtt acacagcctg cctcacttcc ctgtgggtcc ttcatcacct gcatgctcac atgattccat tatttgagct catggcagga aatagaacct gattcaacat tttgctaagt attattttca ccacactgaa tagggtcctt itttgatctg caacccacag ctgggctgtg gttctctcaa cacaggtaga ctgaaaagct tcctcctgca ttgatttctc agcatgggct gaccacatgt tcacaagtac ttgttctut ccatacgtcc caatgcaggc aggoaclggc agagcaggac agctgtgtcc aggagttcag ggaacaaaat aaggctactg taacttcagt caacttcaag gcacggtgta aaataaagta agagattatc agtcaaatag ccatttgcat taaaattctc cactttaaga agctgagatc tttgctttat tttttaaaaa gcaaaatgaa gtcagtttta atggagatat acaattgtta actgttgggt cattttgaaa ggctttcttc cttaaaatga gtctcagctg atagctactc actaatgctg ataattatct gaagcaaaat aaatacaaat gtctgggtta atgaagactg aaacaggata atgcctggac actaaatttt ccaagaacaa ggaacacaat tgttctctac atacccctgc aaaaatgctt aatggccagg acacaggaat cttgtgtact tagagacctt gttaggatgg agccccgggg gcaccaccac tggccttcga gccaaggtct cacagagagg gcagcaaggg ggagcagctc atcctcctcc ccagctaggg agacactagg acagcagtgg agtggagtcc gaaatctgcc atagaagccc cagcttacta tttgctcact gagcagcaag tcaacctcag tttctctgtg cctacagggg agtaacagct glicacacta aagggtgctt gtgaggatga tataagaatg aatatggacc tgctctgaca acactgaagt tccagacaaa agaataggca ttagttatct gatttgaag£ actgtggggg attggaattt taaaaataaa cctcaaccca actccttctc ttgtggggcc tcggttgaac aactgggcac ttgcactgcc ttctgaatat gtggatggat tttgcctgct ttggagaagc atatgaactc ctcagggcat ctagtgccct agagtgtgcc aaaggaacaa ggaggactac aaatgggtga【gcctggagc ttaacccacc tccatUggg atlcggagct ctggtttctg tgttcagcia gaatcttcga cagtcattta atgtctctct ttcttagttt tactcatttg ttgaatgggg attatattag ccttactttc cttgaaggtc ttaatgagaa tgaaatgaga taatttttaa gtatatatat gcatttctaa tttccatcag actggagcgt cggtataagt cctgggtgtt ctggaaagtt ttatttattt agaaacagtt taggctgatt gctatctccc tatgctaact ttttgttttt ttagtaaact tutattttg gaatactttc aaatttacag aaaagtttca aagataacaa gagttctcat ttgcccttca cccagtttcc ccataactat 156341-序列表.doc • 2 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700

201201819 ggctcattgt aaaaactagg aaaccaatat taatgcatta ctaaiaacta tagactttat 2760 tcagatttta ccagtttttc tactcatgtt cttctgtccc aggattcaa丨 acatgatact 2820 gcattgtatt tagttaccat atctcctgag tctcttctgc tctgtgatgg cttcagtctt 2880 ttttcgtctt ccatgcatcg tcagttttaa tgggtactag gcaggtatta tggacaagct 2940 tggcaaatcc acagcccatg ggccacatga ggcccaggat aactttgaat gtggcccagt 3000 acaaattcat aaacttttta aaaaac 3026 <210> 3 <211> 1512 <212> <213>智人 <400> 3 gtcacatcat gacattctct ctccaaaacc cagttgttct ctgtgacgat gccataaagt 60 gacatctaat gactcaggtg tgtgtactgg gtggcagggg catgtcacac acaagcattc 120 tcaactgcag cctcagtctg ggaacgaggt ggtgcgaccc tcatttccga ggggcagctg 180 ctgttttagt tcccatctta tcattactgg aatttcaagt gtagtaccag aaaccaaatt 240 aaaattcaca ggaacgctgc actctgtact gttttcagat gttcasatat ctacaaacac 300 tcgagtagaa tcaagattag attttcaagt catcagcgtg aattaagctt tgaatcgata 360 ttcaactcag aactgagaga ggattttaca cacataatag aacatactta gccaaaaagt 420 gcacattctg tctggcactt gcgggaaaca gccaggcaca gccagggact gcaggggtgt 480 gaggagaaag aaggcctgtc cttcagacat tgcagggctg tctaccttta ctctccagag 540 agattctgct ttaaccacca aaagcaataa aggatcctgt aaagggccat ttctttgtfig 600 actctgaaac cagctttaaa ccaattccaa gagatactcc gaaaatgttt aggggagtca 660 ctgcctctgt ctgcaggtgg gctctctgaa gctgacattc atttagagaa agaaaaattc 720 caggatgttt attcaactct gtaagtctcc ttctttaaat atcttcagaa atatctttct 780 aaattcagag ttatccaaag cttacaagag gagggaagca acagaccagc ccccttatgt 840 ttccttataa aactcacctg ggtgatggag ctgtttctag tcccagttag ctataaggca 900 aaggagagca actgccatca gcgtttgcgg taaatgctat cagaatcatg tttgaaatcc 960 tcaactctga cggttctcag aaataaaata agcaagtaac caacaacaca cacacacacc 1020 tccctccagg tctatttctc acttgtatca ttttattttt tggcaatccc aatcaattcc 1080 gct£agccac tggatgaaaa caaaagctat gagaaatacg atgacagcat tagtactcaa 1140 agattcctca atctgtctcc ctggaacaca tttgtgtcaa aagcctgggc agtcacatga 1200 attcaagaca gtgcttcaaa aacagctgct aggataaaat actatcaata ataaagttta 1260 tgagatgagg ccagtgtttt catacttact ctttcaacgt gcactgccca ttgcctttat 1320 ggagccatgg tcaaaagaaa cagctttcat caatttccag cctgaccatt tggaaactgc 1380 cagtaaacca aggctgtgaa gttggacaga agtctggaaa ctagtgttca tgagattttt 1440 tccctcattc actattatct gtcccttata ataaaaatac aagtctaaag acattaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aa 1512

<210> 4 <211> 20 <212> DNA 15634卜序列表-doc 201201819 <213> 人工序列 <220> <223> 反義寡核苷酸 <400> 4 gttccacctt ctcctcccag <210>. 5 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 反義寡核苷酸 <400> 5 ctgctgtcct agtgtctccc <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 反義寡核苷酸 <400> 6 gtctgttgct tccctcctct <210> 7 <2Π> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 反義寡核苷酸‘ <400> 7 ggagggaggt gtgtgtgtgt <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 反義寡核苷酸 <400> 8 ccttctttct cctcacaccc <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 反義寡核苷酸 <400> 9 gccacccagt acacacacct <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> <220> 人工序列 -4- 156341·序列表.doc 201201819 <223>反義寡核苷酸 <400> 10 gccattcgtt tcctccctga <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>反義寡核苷酸 <400> 11 gctgctactc tcacccacat 156341-序列表.doc <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 反義寡核苷酸 <400> 12 ccagtcaggg caacacagca <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> A工序列 <220> <223> 反義寡核苷酸 <400> 13 cctctccacg cgcagtacat t

Claims (1)

1. 201201819 七、申請專利範圍： 1. 一種長度為5至30個核苷酸之反義募核苷酸的用途，其 用以製造用於調節生物系統中類BCL2 u (BCL2LU)聚 核苷酸之功能及/或表現的藥劑，其中該寡核苷酸與類 BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之天然反義轉錄本之反向 互補序列具有至少50%的序列一致性β 2. 如請求項1之用途，其中該天然反義轉錄本包含seq id NO: 2之核苷酸1至3026及5]^ ID N〇: 3之核苷酸工至 1512。 3. —種長度為5至30個核苷酸之反義寡核苷酸的用途，其 用以製造用於調節患者細胞或組織中類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之功能及/或表現的藥劑，其中該寡 核苷酸與該類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之反義寡核 普酸具有至少50%的序列一致性。 4. 如請求項3之用途’其中該天然反義轉錄本包含SEq id NO: 2之核苷酸1至3〇26及8叫id NO: 3之核苷酸1至 1512 〇 5_ —種反義募核苷酸的用途，該反義寡核苷酸靶向類bcl2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之天然反義寡核苷酸中之區域， 該反義寡核苷酸用以製造用於調節生物系統中類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之功能及/或表現的藥劑。 6. 如請求項5之用途，其中該類BCL2 11 (BCL2L11)之功能 及/或表現比對照組增強。 7. 如請求項5之用途，其中該反義募核苷酸靶向類BCL2 11 156341.doc 201201819 (BCL2L11)聚核苷酸之天然反義序列β 8·如請求項5之用途，其中該反義寡核苷酸靶向核酸序 列’該核酸序列包括類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苦酸之 編碼及/或非編媽核酸序列。 9.如請求項5之用途，其中該反義寡核苷酸靶向類bcL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之重疊及/或非重疊序列。 10·如請求項5之用途，其中該反義寡核苷酸包括一或多個 選自以下之修飾：至少一個經修飾糖部分、至少一個經 修飾核苷間鍵聯、至少一個經修飾核苷酸、及其組合。 11 ·如請求項1〇之用途’其中該一或多個修飾包括至少一個 選自以下之經修飾糖部分：經2，_〇·甲氧基乙基修飾之糖 部分、經2'-曱氧基修飾之糖部分、經2ι_〇_烷基修飾之糖 部分、雙環糖部分、及其組合。 12. 如請求項1〇之用途’其卡該一或多個修飾包括至少一個 選自以下之經修飾核苷間鍵聯：硫代磷酸酯、2'-〇曱氧 基乙基（ΜΟΕ)、2' - It、膦酸烧基酯、二硫代構酸酯、硫 代鱗酸烷基酯、胺基磷酸酯、胺基曱酸酯、碳酸酯、填 酸二醋、胺基乙酸酯、叛曱基酯、及其組合。 13. 如请求項1 〇之用途，其中該一或多個修飾包括至少一個 選自以下之經修飾核苷酸：肽核酸（PNA)、鎖核酸 (LNA)、阿糖核酸（FANA)、其類似物、衍生物、及組 合。 14·如請求項1之用途，其中該寡核苷酸包括至少一個如SEQ ID NO: 4至13所示之寡核苷酸序列。 156341.doc 201201819 15. —種長度為5至30個核苷酸之短干擾rnA (siRNA)寡核芽 酸的用途，其用以製造用於調節哺乳動物細胞或組織令 類BCL2 11 (BCL2L11)基因之功能及/或表現的藥劑，其 中該siRNA寡核苷酸對類BCL2 11 (BCL2L11)聚核普酸之 反義聚核苷酸具有特異性，且其中該至少一種siRNA寡 核苷酸與該類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸中之反義及/ 或有義核酸分子中之至少約5個連續核酸之互補序列具 有至少50%的序列一致性。 16. 如請求項15之用途’其中該寡核苷酸與該類BCL2 ^ (BCL2L11)聚核苷酸之反義及/或有義核酸分子之互補序 列之至少約5個連續核酸之序列具有至少8〇%的序列一致 性。 Π. —種長度為約5至30個核苷酸之反義寡核苷酸之用途， 該反義寡核苷酸對類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苦酸之有 義及/或天然反義股之非編碼及/或編碼序列具有特異 性，該反義寡核苷酸用以製造用於調節哺乳動物細胞或 組織中類BCL2 11 (BCL2L11)之功能及/或表現的藥劑， 其中該反義寡核苷酸與SEQIDN〇: 1至3中所示之至少一 個核酸序列具有至少5〇%的序列一致性。 1 8. —種包括至少一個修飾之經合成與修飾之寡核苷酸，其 中該至V、一個修娜選自：至少一個經修飾糖部分、至少 個、’ΐ修飾核苷酸間鍵聯、至少一個經修飾核苷酸、及 其組合；其中該寡核苷酸係在活體内或活體外與類BCL2 11 (BCL2L11)基因雜交且相對於正常對照組可以調節該 156341.doc 201201819 類BCL2 11 (BCL2L11)基因之功能及/或表現之反義化合 物’且其中該寡核苷酸與該類BCL2 11 (BCL2L11)聚核 苦酸之反義及/或有義核酸分子及其等位基因、同系物、 同功型 '變體、衍生物、突變體、片段、或組合之互補 序列之至少約5個連續核酸之序列具有至少5〇%的序列一 致性。 19 ·如請求項18之寡核苷酸，其中該募核苷酸之長度為5至 30個核苷酸，且與該BCL2L11基因之天然反義轉錄本内 5至30個連續核苷酸之反向互補序列具有至少5〇%的序列 一致性。 20. 如請求項19之寡核苷酸’其中該至少一個修飾包括選自 由以下組成之群之核苷酸間鍵聯：硫代磷酸酯、膦酸烷 基酯、二硫代磷酸酯、硫代膦酸烷基酯、胺基磷酸酯、 胺基曱酸醋、碳酸醋、踏酸三醋、胺基乙酸醋、叛甲基 醋、及其組合。 21. 如請求項19之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括至少一個 硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。 22. 如請求項19之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括硫代磷酸 西旨核苷酸間鍵聯之主鏈。. 23. 如請求項19之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括至少一個 經修飾核苷酸，該經修飾核苷酸選自：肽核酸、鎖核酸 (LNA)、其類似物、衍生物、及組合。 24. 如請求項19之寡核苷酸’其中該寡核苷酸包括複數個修 飾’其中該等修飾包括選自以下之經修飾核苷酸：硫代 156341.doc 201201819 構酸酯、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、硫代膦酸烧基 酯、胺基磷酸酯、胺基曱酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、胺 基乙酸酯、羧曱基酯、及其組合。 25.如請求項19之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括複數個修 飾’其中該等修飾包括選自以下之經修飾核苷酸：肽核 酸、鎖核酸（LNA)、其類似物、衍生物、及組合。 26·如請求項19之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括至少一個 選自以下之經修飾糖部分：經2，_〇_曱氧基乙基修飾之糖 部分、經2'-曱氧基修飾之糖部分、經2·_〇_烷基修飾之糖 部分、雙環糖部分、及其組合。 27. 如請求項19之募核苷酸，其中該寡核苷酸包括複數個修 飾，其中該等修飾包括選自以下之經修飾糠部分：經2，_ 〇-曱氧基乙基修飾之糖部分、經2，-曱氧基修飾之糖部 分、經2’-0-烷基修飾之糖部分、雙環糖部分、及其組 合.。 28. 如請求項19之寡核苷酸，其中該寡核苷酸之長度為至少 約5至30個核苷酸且與類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之 反義及/或有義股雜交，其中該寡核苷酸與該類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸中之反義及/或有義編碼及/或非編碼 核酸序列中至少約5個連續核酸之互補序列具有至少約 6 0 %的序列 '—致性。 29. 如請求項19之寡核苷酸，其中該寡核苷酸與該類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之反義及/或有義編碼及/或非編 碼核酸序列中至少約5個連續核酸之互補序列具有至少 156341.doc 201201819 約8 0 %的序列一致性。 30. 如請求項19之寡核苷酸，其中該寡核苷酸在活體内或活 體外與至少一種類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苦酸雜交， 且相對於正常對照組，可以調節該類BCL2 η (BCL2L11)聚核苷酸之表現及/或功能。 31. 如請求項19之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括如SEQ m NO: 4至13所示之序列。 32. —種醫藥組合物，其包括一或多種如請求項18之對一或 多種類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸具有特異性之寡核 苷酸及醫藥上可接受之賦形劑。 33. 如請求項32之組合物’其中該等寡核苷酸與如SEq ID NO: 4至13所示之任一種核苷酸序列比對，具有至少約 4 0 %的序列一致性。 34. 如請求項32之組合物，其中該等寡核苷酸包括如SEq ID NO: 4至13所示之核苷酸序列。 35. 如請求項34之組合物’其中該等如SEq m NO: 4至13所 示之寡核苷酸包括一或多個修飾或取代。 36. 如請求項35之組合物，其中該一或多個修飾選自：硫代 磷酸酯、膦酸曱酯、肽核酸、鎖核酸（LNA)分子、及其 組合。 37. —種反義寡核苷酸之用途，其用以製造用於預防或治療 與至少一種類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸及/或其至少 一種編碼產物有關之疾病的藥劑，其中該反義寡核苷酸 與該至少一種類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之天然反 I56341.doc 201201819 義序列、，ασ，並調節該至少一種類BCL2 11 (BCL2L11) 聚核苷酸的表現。 38·如請求項37>ώ、么 之用途’其中與該至少一種類BCL2 ! J (BCL2L11)聚核苦酸有關之疾病選自：與BeL2Ln之異 *力知及/或表現有關之疾病或病症、癌症、異常細胞调 亡增殖性疾病或病症、與粒線體細胞凋亡路徑有關之 疾病或病症、白血病、自體免疫性疾病或病症、與免疫 性受相有關之疾病或病症、感染、過度增殖性病症、生 殖組織之過度增殖（例如子宮癌、睾丸癌及卵巢癌、子宮 内膜異位症、及子宮頸之鱗狀、腺體上皮癌等）、神經學 疾病或病症、與發育中胚胎有關之發育病症、血液疾病 或病症、組織體内穩態受損、類風濕關節炎、敗血病、 視網膜神經節細胞死亡、肝病及腎病。 39. —種長度為5至30個核苷酸之募核苷酸之用途，其用以 製造用於誘導生物系統中之細胞凋亡之藥劑，其中該寡 核苷酸與該系統中BCL2L11聚核苷酸之天然反義轉錄本 之反向互補序列内的5至30個連續核苷酸至少5〇%一致。 40. 如請求項39之用途，其中該天然反義轉錄本具有託卩id NO: 2 或 3。 41 ‘如請求項3 9之用途，其中該生物系統係患者細胞或組 織。 42. —種長度為約5至30個核苷酸之寡核苷酸之用途，其用 以製造用於誘導生物系統中之細胞凋亡之藥劑，其中該 寡核苷酸可藉由靶向靶基因之天然反義轉錄本來上調該 156341.doc 201201819 基因，且其中該寡核苷酸與該經上調基因之天然反義轉 錄本之反向互補序列至少5〇%一致。 43 · 一種鑑別及選擇至少一種對BCL2L11基因之天然反義轉 錄本具有選擇性之寡核苷酸作為選定靶聚核苷酸供用於 體内技與之方法，該方法包括：鑑別至少一種包括與 該選定靶聚核苷酸之反義聚核苷酸至少部分互補之至少 5個連續核苷酸的寡核苷酸；在嚴格雜交條件下量測反 義寡核苷酸與該靶聚核苷酸或該選定靶聚核苷酸之反義 聚核苷酸之雜合體的熱熔點；及基於所獲得資訊選擇至 少一種寡核苷酸用於活體内投與。 44，一種在活體外調節生物系統中類bcl2 11 (BC：L2L11)聚 核苷酸之功能及/或表現之方法，其包括：使該系統與至 ’ 種長度為5至30個核苷酸之反義寡核苷酸接觸，其 中该至少一種寡核苷酸與類bcL2 11 (BCL2L11)聚核苷 酉文之天然反義轉錄本之反向互補序列具有至少50%的序 列一致性；由此調節該類BCL2 u (BCL2L11)聚核苷酸 之功能及/或表現》 45.如請求項44之在活體外調節生物系統中類bcL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之功能及/或表現的方法，其包括： 使該生物系統與至少一種長度為5至30個核苷酸之反義 寡核苷酸接觸，其中該至少一種寡核苷酸與包括天然反 義轉錄本SEQ ID NO: 2之核苷酸1至3026及SEQ ID NO: 3 之核苷酸1至1 5 12内之5至30個連續核苷酸之聚核苷酸之 反向互補序列具有至少50%的序列一致性；由此調節該 156341.doc 201201819 類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之功能及/或表現。 46. —種在活體外調節患者細胞或組織中類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之功能及/或表現之方法，其包括： 使該等細胞或組織與至少一種長度為5至30個核苷酸之 反義寡核苷酸接觸，其中該寡核苷酸與該類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之反義募核苷酸具有至少50%的序 列一致性；由此在活體外調節患者細胞或組織中該類 BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之功能及/或表現。 47. 如請求項46之調節患者細胞或組織中類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之功能及/或表現的方法，其包括： 使s亥生物糸統與至少一種長度為5至3 0個核苦酸之反義 寡核苷酸接觸，其中該至少一種寡核苷酸與包括天然反 義轉錄本SEQ ID NO: 2之核苷酸1至3026及SEQ ID NO: 3 之核普酸1至1512内之5至30個連續核苦酸之聚核苷酸之 反向互補序列具有至少50%的序列一致性；由此調節該 類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苦酸之功能及/或表現。 48. —種在活體外調節生物系統中類bcL2 11 (BCL2L11)聚 核苷酸之功能及/或表現的方法’其包括：使該系統與至 少一種靶向該類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之天然反 義寡核苷酸中區域之反義寡核苷酸接觸；由此調節該類 .BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之功能及/或表現。 49. 如請求項48之方法’其中該類BCL2 11 (BCL2L11)在活 體外之功能及/或表現比對照組增強。 50. 如請求項48之方法，其中該至少一種反義寡核苷酸靶向 156341.doc 201201819 類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之天然反義序列。 51.如請求項48之方法，其中該至少一種反義寡核苷酸靶向 核酸序列，該核酸序列包括類BCL2 11 (Bcl2Ui)聚核 苷酸之編碼及/或非編碼核酸序列。 52.如請求項48之方法，其中該至少一種反義寡核苷酸靶向 類BCL2 Η (BCL2L11)聚核苦酸之重疊及/或非重疊序 列。 53.如請求項48之方法，其中該至少一種反義寡核苷酸包括 一或多個選自以下之修飾：至少一個經修飾糖部分、至 少一個經修飾核苷間鍵聯、至少一個經修飾核苷酸、及 其組合。 54. 如請求項53之方法，其中該一或多個修飾包括至少一個 選自以下之經修飾糖部分：經2，-〇-甲氧基乙基修飾之糖 部分、經2，-甲氧基修飾之糖部分、經2，·〇·烷基修飾之糖 部分、雙環糖部分、及其組合。 55. 如請求項53之方法，其中該一或多個修飾包括至少一個 選自以下之經修飾核苷間鍵聯：硫代磷酸酯、2,_〇曱氧 基乙基（ΜΟΕ)、2，·氟、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、硫 代膦酸燒基酯、胺基麟酸酯、胺基甲酸酯、碳酸酯、破 酸三醋、胺基乙酸酯、羧曱基酯、及其組合。 56. 如請求項53之方法，其中該一或多個修飾包括至少一個 選自以下之經修飾核苷酸：肽核酸（ρΝΑ)、鎖核酸 (LNA)、阿糖核酸（FANA)、其類似物、衍生物、及組 合0 156341.doc 201201819 57. 如請求項44之方法，其中該至少一種募核苦酸包括至少 一個如SEQ ID NO: 4至13所示之寡核苷酸序列。 58. —種在活體外調節哺乳動物細胞或組織中類bcL2 ! j (BCL2L11)基因之功能及/或表現的方法，其包括：使該 等細胞或組織與至少一種長度為5至3〇個核苷酸之短干 擾RNA (siRNA)募核苷酸接觸，該至少一種siRNA募核 苷酸對類BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之反義聚核苷酸 具有特異性，其中該至少一種siRNA寡核苷酸與該類 BCL2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之反義及/或有義核酸分子 中至少約5個連續核酸之互補序列具有至少5〇%的序列一 致性，及在活體外調節哺乳動物細胞或組織中之類BCL2 11 (BCL2L11)之功能及/或表現。 59. 如請求項58之方法’其中該募核苷酸與該類bcl2 11 (BCL2L11)聚核苷酸之反義及/或有義核酸分子之互補序 列中至少約5個連續核酸之序列具有至少8〇%的序列一致 性。 60. —種在活體外調節嗜乳動物細胞或組織中類bcl2 11 (BCL2L11)之功能及/或表現的方法，其包括：使該等細 胞或組織與至少一種長度為約5至30個核苷酸之反義寡 核普酸接觸’該反義寡核普酸對類BCL2 11 (BCL2L11) 聚核苷酸之有義及/或天然反義股之非編碼及/或編碼序 列具有特異性’其中該至少一種反義寡核苷酸與至少一 種如SEQ ID NO: 1至3所示之核酸序列具有至少5〇%的序 列一致性；及在活體外調節哺乳動物細胞或組織中該類 BCL2 11 (BCL2L11)之功能及/或表現。 156341.doc