TW201209163A - Treatment of BCL2 binding component 3 (BBC3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to BBC3 - Google Patents

Description

201209163 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明實施例包括調節BBC3之表現及/或功能之寡核苷 酸及有關分子。 本申請案主張20 10年7月12日提出申請之美國臨時專利 • 申請案第61/363,535號之優先權，其全部内容皆以引用方 ‘式併入本文中。 【先前技術】 〇 DNA-RNA及RNA-RNA雜交對核酸功能之許多態樣（包含 DNA複製、轉錄及轉譯）較為重要。雜交對於檢測特定核 酸或改變其表現之各種技術亦甚為重要。舉例而言，反義 核苷酸藉由與靶RNA雜交、由此干擾RNA剪接、轉錄、轉 譯及複製來破壞基因表現。反義DNA具有額外特徵，亦即 DNA-RNA雜合體用作核糖核酸酶Η消化之受質，該活性存 在於大部分細胞類型中。反義分子可遞送至細胞中，如募 去氧核苷酸（ODN)之情形，或其可自内源基因表現為RNA 0 分子。FDA最近批准了反義藥物VITRAVENE™(用於治療 巨細胞病毒視網膜炎），此表明該反義藥物具有治療用 途。 / 【發明内容】 提供本概述以呈現本發明之概述從而簡要顯示本發明之 性質及物質。提交本概述係基於下列理解：其並非用於解 釋或限制本申請專利範圍之範疇或含義。 在一個實施例中，本發明提供抑制天然反義轉錄物之作 157514.doc 201209163 用之方法’其係藉由使用靶向天然反義轉錄物之任一區域 的反義寡核苷酸從而上調相應正義基因來達成。本文亦涵 蓋’可藉由siRNA、核糖酶及小分子來抑制天然反義轉錄 物，此視為屬於本發明範鳴内。 一個實施例提供在活體内或活體外調節患者細胞或組織 中BBC3聚核苷酸之功能及/或表現之方法，其包括使該等 細胞或組織與長度為5至3〇個核苷酸之反義寡核苷酸接 觸’其中該寡核苷酸與聚核苷酸之反向補體具有至少5〇〇/〇 之序列一致性’該聚核苷酸包括SEq ID NO: 2中核苷酸1 至689内之5至30個連續核苷酸，由此在活體内或活體外調 節患者細胞或組織中BBC3聚核苷酸之功能及/或表現。 在一實施例中，寡核苷酸靶向BBC3聚核苷酸之天然反 義序列（例如，SEQ ID NO: 2中所述之核苷酸）、及其任一 變體、等位基因、同系物 '突變體、衍生物、片段及互補 序列。將反義募核苷酸之實例闡述為SEq ID NO: 3至8。 另一實施例提供在活體内或活體外調節患者細胞或組織 中BBC3聚核苷酸之功能及/或表現之方法，其包括使該等 細胞或組織與長度為5至30個核苷酸之反義寡核苷酸接 觸，其中該寡核苷酸與BBC3聚核苷酸反義轉錄物之反向 補體具有至少50°/。的序列一致性；由此在活體内或活體外 調節患者細胞或組織中BBC3聚核苷酸之功能及/或表現。 另一實施例提供在活體内或活體外調節患者細胞或組織 中BBC3聚核苷酸之功能及/或表現之方法，其包括使該等 細胞或組織與長度為5至30個核苷酸之反義寡核苷酸接 157514.doc 201209163 觸’其中該寡核苷酸與BBC3反義聚核苷酸之反義寡核苷 酸具有至少50%的序列一致性；由此在活體内或活體外調 節患者細胞或組織中BBC3聚核苷酸之功能及/或表現。 在一實施例中’級合物包括一或多種結合至正義及/或 • 反義BBC3聚核苷酸之反義寡核苷酸。 在一實施例中，募核苷酸包括一或多個經修飾或取代之 核苷酸。 在一實施例中，募核苷酸包括一或多個經修飾鍵。 〇 . ^ 在又一實施例中，經修飾核苷酸包括含有以下之經修飾 鹼基：硫代碳酸酯、膦酸曱酯、肽核酸、2，·〇_曱基、氟-或碳、亞甲基或其他鎖核酸（LNA)分子。較佳地，經修飾 核苷酸係鎖核酸分子，包含a-L-LNA。 在一實施例中，經皮下、肌内、靜脈内或腹膜腔内將募 核皆酸投與患者。 在一實施例中’以醫藥組合物形式投與募核苷酸。治療 Q 方案包括向患者投與至少一次反義化合物；然而，此治療 可經改變以在一定時間内包含多個劑量。該治療可與一或 多種其他類型之療法組合。 * 在一實施例中，將募核苷酸囊封於脂質體中或附接至載 . 體分子（例如膽固醇、TAT肽）。 其他態樣闡述於下文中。 【實施方式】 下文參照闡釋用實例應用來闡述本發明之若干態樣。應 理解，本文列舉各種具體細節、關係及方法以提:對本: 157514.doc 201209163 明之完全理解。然而，熟習相關技術者易於認識到，可在 不使用-或多個具體細節或使用其他方法之情形下來實踐 本發明。本發明並不限於各個動作或事件之順序，此乃因 -些動作可以不同順序發生及/或與其他動作或事件同時 發生。另彳’未必需要所有所騎動作或事件來實施 明方法。 本文所揭示所有基因、基因名稱及基因產物意欲對應於 可應用本文所揭示組合物及方法之來自任一物種的同系 物。因此，該等術語包含但不限於人類及小鼠之基因及基 因產物。應理解，在揭示來自特定物種之基因或基因產物 時二除非在上下文中明確指*，否則此揭示内容意欲僅具 有實例性，且不應解釋為限制意義。因此，舉例而言，對 於在-些實施财係_於嗜乳動物核酸及胺基酸序列之本 文所揭示基因而5，其意欲涵蓋來自其他動物之同源及/ 或直系同源基因及基因產物’該等其他動物包含但不限於 其他哺乳動物、魚'兩棲動物、爬行動物及烏。在一實施 例中’基因或核酸序列係人類。 定義 本文所用之術語僅用於闡述特定實施例之目的而並非意 欲限定本發明。如本文中所使用，單數形式「一（a)」、「一 (an)」及「該（the)J亦意欲包含複數形式，除非上下文另 外明確指明。另外，在詳細闡述及/或申請專利範圍中使 用術語「包含（including)」、「包含（includes)」、「具有 (having)」、「具有（has)」、「具有（with)」或其變化形式時， 1575l4.doc 201209163 該等術語意欲以類似於術語「包括（comprising)」之方式 來表示包含範圍。 術語「約」或「近似地」意指熟習此項技術者所測定之 特定值的可接受誤差範圍，其部分地取決於該值之量測或 測定方式，亦即，量測系統之偈限性。舉例而言，根據業 内實踐，「約」可意指在1個或1個以上之標準偏差内。另 一選擇為，「約」可意指與給定值相差至多20%、較佳至 多10%、更佳至多5%、及更佳至多1%的範圍。另一選擇 為，尤其對於生物系統或過程而言，該術語可意指在一數 值之一個數量級内、較佳在5倍内、及更佳在2倍内。在申 請案及申請專利範圍中闡述特定值時，除非另有闡述，否 則應假設術語「約」意指在該特定值之可接受誤差範圍 内。 本文所用之術語「mRNA」意指靶向基因之當前已知 mRNA轉錄物、及可闡釋之任一其他轉錄物。 「反義寡核苷酸」或「反義化合物」意指結合至另一 RNA或DNA(靶RNA、DNA)之RNA或DNA分子。舉例而 言，若其係RNA寡核苷酸，則其藉助RNA-RNA相互作用 結合至另一 RNA靶並改變靶RNA之活性。反義寡核苷酸可 上調或下調特定聚核苷酸之表現及/或功能。該定義意欲 包含自治療、診斷或其他觀點來看有用之任一外來RNA或 DNA分子。該等分子包含（例如）反義RNA或DNA分子、干 擾RNA (RNAi)、微小RNA、誘餌RNA分子、siRNA、酶 RNA、治療性編輯RNA及RNA激動劑與拮抗劑、反義募聚 157514.doc 201209163 化合物、反義寡核苷酸、外部引導序列（EGS)寡核苷酸、 交替剪接體、引物、探針及與靶核酸之至少一部分雜交之 其他寡聚化合物。因此’該等化合物可以單鏈、雙鏈、部 分單鏈或環狀募聚化合物形式引人。 在本發明之上下文中，術語「寡核苷酸」係指核糖核酸 (RNA)或去氧核糖核酸（DNA)之募聚物或聚合物或其模擬 物。術語「寡核苷酸」亦包含天然及/或經修飾單體或鍵 聯之直鏈或環狀寡聚物’包含去氧核糖核苷、核糖核苷、 其經取代及α-變旋異構形式、肽核酸（pna)、鎖核酸 (LNA)、硫代填酸酯、膦酸曱酯及諸如此類。寡核苷酸能 夠藉助單體與單體相互作用之規則模式（例如Watson-Crick 型驗基配對、Ho6gsteen型驗基配對或反向H〇6gsteen型驗 基配對、或諸如此類）特異性結合至乾聚核苷酸。 募核苷酸可為「嵌合」募核苷酸，亦即，由不同區域組 成。在本發明之上下文中，「嵌合」化合物係募核苷酸， 其含有兩個或更多個化學區域，例如DNA區域、RNA區 域、PNA區域等。在募核苷酸化合物之情形下，每一化學 區域係由至少一個單體單元（亦即，核苷酸）組成。該等寡 核苦酸通常包括至少一個對募核苷酸進行修飾以顯示一或 多種期望性質之區域。募核苷酸之期望性質包含但不限於 (例如）增加對核酸酶降解之抗性、增加細胞攝取、及/或增 加對靶核酸之結合親和力。募核苷酸之不同區域可由此具 有不同性質。本發明之嵌合寡核苷酸可形成為兩種或更多 種上述募核苷酸、經修飾募核苷酸、寡核苷及/或寡核苷 157514.doc 201209163 酸類似物的混合結構。 寡核苷酸可由可在「記錄（register)」中連接之區域組 成，亦即，單體係連續連接（如天然DNA中）、或經由間隔 體連接。間隔體意欲在區域之間構成共價「橋」且在較佳 情形下具有不超過約1〇〇個碳原子之長度。間隔體可具有 不同功能，例如具有正電荷或負電荷，具有特異性核酸結 合性質（嵌合劑、槽溝黏合劑、毒素、螢光團等），具有親 脂性，誘導特異性二級結構（例如，誘導〇螺旋之含有丙胺 酸之肽）。 本文所用之「BBC3」及「BCL2結合部分3」包含所有 家族成員、突變體、等位基因、片段、物種、編碼及非編 碼序列、正義及反義聚核苷酸鏈等。 本文所用詞語「BCL2結合部分3」、「3义2_結合部分 3」、BBC3、FLJ42994、JFY1、jfy]、細胞洞亡之 p53 上 調調節劑、PUMA在文獻中被視為相同且在本申請案中互 換使用。 本文所用之術語「對…具有特異性之募核苷酸」或「靶 向…之寡核苷酸」係指具有如下序列之寡核苷酸能 夠與靶向基因之一部分形成穩定複合物，或⑻能夠與： 向基因之mRNA轉錄物的一部分形成穩定雙鏈體。複合物 及雙鏈體之穩定性可藉由理論計算及/或活體外分析^行 測定。測定雜交複合物及雙鏈體之穩定性的實例性分析閣 述於下文實例中。 本文所用之術語「靶核酸」涵蓋DNA、自該DNA轉錄之 157514.doc 201209163 RNA(包括mRNA前體及mRNA)、以及源自該RNA之 cDNA、編碼序列、非編碼序列、正義或反義聚核苷酸。 寡聚化合物與其靶核酸之特異性雜交會干擾該核酸之正常 功能。與靶核酸特異性雜交之化合物對該靶核酸功能的此 調節通常稱為「反義」。擬干擾之DNA功能包含（例如）複 製及轉錄。擬干擾之RNA功能包含所有重要功能，例如， RNA至蛋白質轉譯位點之易位、蛋白質自RNA之轉譯、使 RNA產生一或多種mRNA物質之剪接、及RNA可參與或促 進之催化活性。對於靶核酸功能之該干擾的總體效應係調 節編碼產物或寡核普酸之表現。 RNA干擾（「RNAi」）係藉由與「靶」核酸序列具有序列 特異性同源性之雙鏈RNA(dsRNA)分子來調介。在本發明 某些實施例中，介體係具有5至25個核苷酸之「小干擾」 RNA雙鏈體（siRNA)。siRNA源自稱為Dicer之RNase酶對於 dsRNA之處理。siRNA雙鏈體產物募集至稱為RISC(RNA誘 導之沉默複合物）之多蛋白siRNA複合物中。不期望受限於 任一特定理論，由此據信，RISC可引導至靶核酸（mRNA 較為適宜），在此siRNA雙鏈體以序列特異性方式發生相互 作用從而以催化方式來調介裂解。可用於本發明中之小干 擾RNA可根據業内所熟知且為熟習此項技術者所習知的程 序來合成及使用。用於本發明方法中之小干擾RNA適宜地 包括約1至約50個核苷酸（nt)。在非限制性實施例之實例 中，siRNA可包括約5至約40個nt、約5至約30個nt、約10 至約30個nt、約15至約25個nt、或約20至25個核苷酸。 157514.doc -10- 201209163 藉由使用自動對準核酸序列並指示一致性或同源性區域 之電腦程式來促進適當寡核苷酸的選擇。使用該等程式藉 由（例如）搜索諸如GenBank等數據庫或藉由對PCR產物測 序來比較所獲得的核酸序列。對於來自各種物種之核酸序 列之比較使得可選擇顯示適當物種間一致性程度的核酸序 列。在並未測序之基因情形下，實施南方印跡（Southern blot)以測定靶物種及其他物種之基因間的一致性程度。藉 由在不同嚴格度下實施南方印跡（如業内所熟知），可大致 量測一致性。該等程序使得可選擇如下寡核苷酸：其對欲 控制個體中之靶核酸序列呈現高互補性程度且對其他物種 中之相應核酸序列呈現較低互補性程度。熟習此項技術者 應認識到，可在較大範圍中選擇適用於本發明中之基因區 域。 「酶RNA」意指具有酶活性之RNA分子（〇6(：11，（1988)】· American. Med. Assoc. 260，3030-3035)。酶性核酸（核酶） 藉由首先結合至無RNA而發揮作用。該結合經由酶性核酸 之靶結合部分來進行，該靶結合部分緊鄰分子中用於裂解 靶RNA之酶性部分。因此，酶性核酸首先識別靶RNA且然 後經由鹼基配對與靶RNA結合，且在結合至確切位點後以 酶促方式發揮作用以切割靶RNA。 「誘餌RNA」意指模擬配體之天然結合結構域之RNA分 子。誘餌RNA由此與天然結合靶競爭結合特異性配體。舉 例而言，已顯示HIV反式活化反應（TAR) RNA之過度表現 可用作「誘餌」並有效結合HIV tat蛋白，由此預防其結合 157514.doc • 11 - 201209163 至在HIV RNA中編碼之TAR序列。此意欲係一具體實例β 彼等熟習此項技術者應認識到，此僅為一實例，且可易於 使用業内通常已知之技術來產生其他實施例。 本文所用之術語「單體」通常表示藉由填酸二酯鍵或其 類似物連接以形成尺寸介於數個單體單元（例如，約3_4個） 至約數百個早體早元之券核普酸的单體。碌酸二自旨鍵聯之 類似物包含：硫代碌酸醋、二硫代磷酸醋、膦酸甲醋、栖 代墙酸酯、胺基鱗酸酯及諸如此類，如下文更全面所述。 術語「核苷酸」涵蓋天然核苷酸以及非天然核苷酸。熟 習此項技術者應明瞭，先前視為「非天然」之各種核苷酸 後來已在自然界中發現。因此，「核苷酸」不僅包含含有 已知嗓呤及响咬雜環之分子’且亦包含其雜環類似物及互 變異構體。其他類型核苷酸之闡釋性實例係含有以下部分 之分子：腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、 嘌呤、黃嘌呤、二胺基嘌呤、8-側氧基-Ν6-甲基腺嘌呤、 7-去氮育嗓呤、7-去氣鳥。票呤、Ν4，Ν4-乙醇胞嘴咬、 Ν6，Ν6-乙醇-2,6-二胺基嘌呤、5_曱基胞嘧啶、5_(C3_C6)_ 炔基胞嘧咬、5-氟尿嘧咬、5 ·溴尿嘧咬、假異胞嘧咬、2_ 羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷 及Benner等人之美國專利第5,432,272號中所述之「非天 然」核苷酸。術語「核苷酸」意欲涵蓋每一及所有該等實 例以及其類似物及互變異構體。尤其關注之核苷酸係彼等 含有腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、及尿嘧啶者， 其被視為與人類之治療及診斷應用有關之天然核苷酸。核 157514.doc -12- 201209163 芽酸包含天然2'-去氧及2'-經基糖（例如，如Kornb erg及 Baker ’ DNA Replication ’ 第 2版（Freeman, San Francisco, 1992)中所述）以及其類似物。 涉及核苷酸之「類似物」包含具有經修飾鹼基部分及/ 或經修飾糖部分之合成核苷酸（參見（例如）由以下所概述： Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980 ； Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429-4443, Toulme, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-〇 18 ; Manoharan M.，（1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139 » Freier S. M., (1997) Nucl. Acid Research, 25:4429-4443, Uhlman, E.，（2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense & iVwc/eic dc/c? Drug Dev·, 10:297-310) ; 2'-0、3'-C連接之 [3.2.0]二環阿糖核苷。該等類似物包含經設計以增強結合 性質（例如，雙鏈體或三鏈體穩定性、特異性、或諸如此 類）之合成核苷酸。 〇 本文所用之「雜交」意指寡聚化合物之實質上互補鏈之 配對。一種配對機制涉及寡聚化合物鏈之互補核苷或核苷 - 酸鹼基（核苷酸）之間的氫鍵結，其可為Watson-Crick、

HoSgsteen或反向Hodgsteen氫鍵結。舉例而言，腺嗓吟及 胸腺嘧啶係經由形成氫鍵配對之互補核苷酸。雜交可在不 同情形下發生。 在以下情形時反義化合物係「可特異性雜交」：化合物 與靶核酸之結合可干擾靶核酸之正常功能以調節功能及/ 157514.doc -13- 201209163 或活性，且存在足夠互補性程度以避免反義化合物與_ 核酸序列在期望發生特異性結合之條件下（亦即，在 内分析或治療性治療情形中之生理條件下，及在活體外八 析情形中實施分析之條件下）發生非特異性結合。 77 本文所用之片語「嚴格雜交條件」&「嚴格條件」係指 本發明化合物與其乾序列發生雜交、但與最少數量之^ 序列發生雜交的條件。嚴格條件具有序列依賴性且在； 情況及本發明上下文中有所不同，藉由寡聚化合物之性質 独成騎究其之分析來測定寡聚化合物與乾序列進行雜 交的「嚴格條件」。一般而言，嚴格雜交條件包括低濃度 (<0·15Μ)含有無機陽離子（例如Na+或κ+)之鹽（亦即，低離 :強度）’溫度高於抓至抑但低於寡聚化合物：乾序列 锼合物之Tm，及存在變性劑（例如曱醯胺、二甲基甲醯 胺、二F基亞硬）或洗務劑十二院基硫酸納（SDS)。舉例而 言’對於每一 1%甲醯胺而言’ _交速率降低1.1%。高嚴 袼度雜交條件之實例係〇.1χ氣化鈉_檸檬酸鈉緩衝液 (ssc)/o.i%(w/v)SDS(在60t 下，保持3〇分鐘）。 本文所用之「互補」係指一個或兩個募聚鏈上之兩個核 普酸之間精確配對的能力。舉例而言，若反義化合物某—Λ 位置處之核鹼基能夠與靶核酸（該靶核酸係DNA、RNA、 或寡核苷酸分子）某一位置處之核鹼基發生氫鍵結，則該 养核苷酸與該靶核酸之間發生氫鍵結之位置視為互補位 置。在每一分子中有足夠數量之互補位置由可彼此氫鍵結 之核苷酸佔據時，寡聚化合物及其他DNA、RNA、或募核 157514.doc 14 201209163 苷酸分子彼此互補。因此，「可特異性雜交」及「互補」 係用於指示以下情形之術語：足夠數量之核苷酸中具有足 夠程度之精確配對或互補性從而寡聚化合物及靶核酸之間 發生穩定及特異性結合。 業内應理解，寡聚化合物序列無需與擬特異性雜交之其 靶核酸序列100%互補。另外，寡核苷酸可在一或多個區 段中雜交從而插入或相鄰區段並不參與雜交事件（例如， 環路結構、失配或髮夾結構）。本發明寡聚化合物包括與 〇 其所靶向靶核酸序列内靶區域之至少約70%、或至少約 75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至 少約95%、或至少約99%的序列互補性。舉例而言，反義 化合物之20個核苷酸中有1 8個與靶區域互補且由此特異性 雜交之反義化合物將代表90%的互補性。在此實例中，剩 餘非互補核苷酸可與互補核苷酸群集或散開且無需彼此鄰 近或與互補核苷酸鄰近。因此，長度為1 8個核苷酸且具有 4(四）個非互補核苷酸（由兩個與靶核酸完整互補之區域側 ❹ 接）之反義化合物與靶核酸具有77.8%之總體互補性且由此 屬於本發明範疇内。具有靶核酸區域之反義化合物的互補 - 性百分比通常可使用業内已知之BLAST程式（鹼基局部對 準檢索工具）及PowerBLAST程式測得。同源性、序列一致 性或互補性百分比可藉由（例如）Gap程式（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.) 使用默認設置（其使用Smith及Waterman算法）測得（Adv. 157514.doc -15- 201209163

Appl. Math·，（1981) 2, 482-489)。 本文所用之術語「熱熔點」係指在界定離子強度、 PH及核酸濃度下與靶序列互補之寡核苷酸中之5〇%在平衡 下與靶序列雜交的溫度。通常，對於短寡核苷酸（例如， 具有10至50個核苷酸）而言，嚴格條件係彼等以下條件： 鹽濃度在？1^7.0至8.3下為至少約0.01至1_〇河之]^&離子濃 度（或其他鹽）且溫度為至少約3(rc。嚴格條件亦可藉由添 加諸如甲醯胺等去穩定劑來達成。 本文所用之「調節」意指增加（刺激）或降低（抑制）基因 之表現。 在用於聚核苷酸序列之背景中時，術語「變體」可涵蓋 與野生型基因有關之聚核苷酸序列。此定義亦可包含（例 如）「等位基因」、「剪接」、「物種」或「多態性」變體。 剪接變體可與參考分子具有顯著一致性，但在mRNA加工 期間因外顯子之交替剪接而通常具有較大或較小數量之聚 核苷酸。相應多肽可擁有額外功能結構域或不存在結構 域。物種變體係在物種之間有所變化之聚核苷酸序列。在 本發明中尤其有用者係野生型基因產物之變體。變體可源 自核酸序列中之至少一個突變，且可產生改變2mRNA或 產生結構或功能可改變或不改變的多肽。任—給定天然或 重組基因可不具有等位基因形式、具有一種或許多種等位 基因形式。產生變體之常見突變變化通常歸因於核苷酸之 天然缺失、添加或取代。該等變化類型中之每一者可在給 疋序列令單獨、或與其他者組合發生一或多次。 157514.doc -16 - 201209163 所得多肽通常彼此之間具有顯著之胺基酸一致性。多態 性變體係給定物種個體間特定基因之聚核苷酸序列中的變 化。多態性變體亦可涵蓋「單一核苷酸多態性」（SNp)或 單驗基突變，其中聚核苷酸序列之一個鹼基有所變化。 SNP之存在可指示（例如）某一群體具有疾病狀態傾向（亦即 相對於抗性之易感性）。 衍生聚核苷酸包含經受化學修飾（例如，氫由烷基、酿 基或胺基代替）之核酸。衍生物（例如，衍生寡核苷酸）可包 括非天然部分，例如改變之糖部分或糖間鍵聯。該等實例 性街生物係硫代磷酸酯及業内已知之其他含硫物質。衍生 核酸亦可含有標記，包含放射性核苷酸、酶、螢光劑、化 學發光劑、發色劑、受質、輔因子、抑制劑、磁性顆粒及 諸如此類。 「衍生」多肽或肽係（例如）藉由以下方式進行修飾者： 糖基化、聚乙二醇化、磷醯化、硫酸化、還原/烷基化、 酿基化、化學偶合或輕度福馬林（formalin)處理。衍生物 亦可經修飾以含有可檢測標記（直接或間接），包含但不限 於放射性同位素、螢光及酶標記。 本文所用之術語Γ動物」或「患者」意欲包含（例如）人 類、綿羊、麋鹿、鹿、長耳鹿、水紹、，甫乳動物、猴子、 馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥'雞、爬行 動物、魚、昆蟲及蜘蛛。 哺乳動物」涵蓋通常處於醫學護理下之溫血哺乳動物 (例如，人類及家養動物）。實例包含貓、犬、馬、牛、及 157514.doc -17- 201209163 人類、以及僅指人類。 「治療（treating或treatment)」涵蓋對哺乳動物之疾病狀 態之治療，且包含：⑷在哺乳動物中、特定而言在該哺乳 動物易患有疾病狀態但尚未被診斷出患有該疾病狀態時預 防該疾病狀態發生；（b)抑制疾病狀態，例如阻止其發展； 及/或（c)減緩疾病狀態，例如使疾病狀態減退直至達到期 望端點為止。治療亦包含改善疾病症狀（例如，減輕疼痛 或不適），其中該改善可直接影響或可能並不直接影響疾 病（例如，起因、傳染、表現等）。 本文所用之「癌症」係指在哺乳動物中發現之所有類型 癌症或贅瘤或惡性腫瘤，其包含但不限於··白血病、淋巴 瘤、黑素瘤、癌及肉瘤。癌症自身表現為包括癌症之惡性 細胞之「腫瘤」或組織。腫瘤之實例包含肉瘤及癌，例如 但不限於：纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、 成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉 瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤 (Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰 腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞 癌、腺癌 '汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、 囊腺癌、髓樣癌、枝氣管原癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽 管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫 瘤（Wilms，tumor)、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺 癌、膀胱癌、上皮癌、膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞 瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽 157514.doc -18- 201209163 神經瘤、少突神經膝質瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經母細胞 瘤及視網膜母細胞瘤。可藉由本發明所揭示組合物治療之 其他癌症包含但不限於（例如）霍奇金氏病（Hodgkin’s DiSeaSe)、非霍奇金氏淋巴瘤（N〇n-H〇dgkin，s Lymphoma)、 夕發陡月题瘤、神經母細胞瘤、乳癌、印巢癌、肺癌、橫 、’文肌肉0原發性血小板增多症、原發性巨球蛋白血症、 小細胞肺腫瘤、原發性腦腫瘤、胃癌、結腸癌、惡性胰腺 肤島素瘤、惡性類癌、膀胱癌、胃癌 '惡化前皮膚損傷、 睪丸癌淋巴瘤、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、食管癌、泌 尿生殖道癌症、惡性高鈣血症、宮頸癌、子宮内膜癌症、 腎上腺皮質癌症及前列腺癌。 本文所用之「神經疾病或病症」係指神經系統及/或視 覺系統之任一疾病或病症。「神經疾病或病症」包含涉及 中樞神經系統（腦、腦幹及小腦）、周邊神經系統（包含顱神 經）、及自主神經系統（位於十樞及周邊神經系統二者中之 °卩分）之疾病或病症。神經疾病或病症包含但不限於後天 性癲癇失語症；急性播散性腦脊髓炎；腎上腺腦白質營養 不良；老年性黃斑退化症；胼胝體發育不全；失認症；艾 卡迪症候群（Aicardi syndrome);亞歷山大病（Aiexander disease)，阿爾珀斯病（Aipers’ disease);交叉性肢體癱 瘓，阿爾茨海默氏病（Alzheimer’s disease);血管性癡呆； 肌萎縮側索硬化；無腦畸形；天使症候群（Angelrnan syndrome);血管瘤病；缺氧症；失語症；失用症；蛛網 膜囊腫；蛛網膜炎；阿-蔡二氏畸形（Anr〇nl_Chiari 157514.doc -19- 201209163 malf〇rmati〇n);㈣脈畸形；阿斯佩格症候群（Asperger synd_e);運動失調性毛細血管擴張症；注意力缺陷伴 多動病症’自閉症’自主神經功能障礙；背痛；巴登氏病 (Batten disease) ’貝切特氏病化似❹）；貝爾麻痹 (Bells palsy),良性本質瞼痙攣；良性局部肌萎縮；良性 顧内同壓，賓斯旺格病（Binswanger,s化⑽叫；眼瞼痙 擎’布洛克-蘇茲貝克症候群（Bloch Sulzberger syndrome)，臂叢神經損傷；腦膿腫；腦損傷；腦腫瘤（包 含多形性膠質母細胞瘤）；脊髓腫瘤；布朗·塞卡爾症候群 (Brown-Sequard Syndrome);卡納萬病（Canavan disease); 腕道症候群；灼性神經痛；中樞性疼痛症候群；腦橋中央 髓鞘溶解；頭部病症；腦動脈瘤；腦動脈硬化症；大腦萎 縮，大腦性巨人症；大腦性麻痹；夏-馬-圖三氏病 (Charcot-Made-Tooth disease);化學療法誘導性神經病變 及神經性疼痛’恰裏畸形（Chiari malformation);舞蹈病； 慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經病變；慢性疼痛；慢性區 域性疼痛症候群；科-勒二氏症候群（c〇ffin L〇wry syndrome);昏迷，包含持續性植物人狀態；先天性面 癱；皮質基底退化；顱動脈炎；顱縫早閉；克雅氏病 (Creutzfeldt-Jakob disease);積累性創傷病症，·庫興氏症 候群（Cushing’s syndrome);巨細胞包涵體病；巨細胞病毒 感染；舞蹈眼-舞蹈足症候群；丹-沃二氏症候群 (DandyWalker syndrome);道森病（Dawson disease);德摩 西埃症候群（De Morsier’s syndrome);克隆普克-克隆普克 157514.doc -20- 201209163 症候群（Dejerine-Klumke palsy);癡呆；皮肌炎；糖尿病 神經病變；彌漫性硬化；自主神經機能異常；書寫困難； 誦讀困難；張力失常；早期幼兒癲癇性腦病；空蝶鞍症候 群；腦炎；腦疝；腦三叉神經血管瘤病；癲癇症；歐勃麻 痛 (Erb's palsy);特發性震顫；法布裏病（Fabry's disease);法爾症候群（Fahr's syndrome);昏厥；家族性痙 攣性癱瘓；發熱性驚厥；菲希爾症候群（Fisher syndrome);弗裏德賴希共濟失調症（Friedreich's ataxia); 額顳骨癡呆症及其他「tau病變」；高歇氏病（Gaucher's disease);格斯特曼症候群（Gerstmann’s syndrome);巨細 胞動脈炎；巨細胞性包涵體病；球樣細胞腦白質營養不 良；格-巴二氏症候群（Guillain-Barre syndrome) ; HTLV-1 有關脊髓病；哈-斯二氏病（Hallervorden-Spatz disease); 頭部損傷；頭痛；半面痙攣；遺傳性痙攣性截瘫；遺傳病 性多神經炎樣共濟失調；耳部帶狀皰疹；帶狀皰疹；平山 症候群（Hirayama syndrome) ; HIV有關癡呆及神經病變（以 及AIDS之神經表現）；前腦無裂畸形；亨廷頓病 (Huntington's disease)及其他聚麩胺醯胺重複疾病；積水 性無腦畸形；腦積水；皮質醇增多症；缺氧；免疫介導性 腦脊髓炎；包涵體肌炎；色素失調症；嬰兒植烷酸貯積 病；嬰兒雷弗蘇姆病infantile refsum disease);嬰兒痙 攣；炎性肌病；顱内囊腫；顱内高壓；朱伯特症候群 (Joubert syndrome);科姆斯-塞爾症候群（Keams-Sayre syndrome)；肯尼迪氏病（Kennedy disease);金斯布林納症 157514.doc -21 - 201209163 候群（Kinsboume syndrome);克-費二氏症候群（Klippel Feil syndrome);克拉伯病（Krabbe disease);庫格爾貝格-韋蘭德病（Kugelberg-Welander disease);庫魯病（kuru);拉 福拉病（Lafora disease);朗-愛二氏肌無力症候群 (Lambert-Eaton myasthenic syndrome)；蘭達-克萊夫納症 候群（Landau-Kleffner syndrome);延趙外側（瓦倫貝克 (Wallenberg))症候群；學習失能；利氏病（Leigh’s disease)，倫諾克斯-加斯托症候群（Lennox-Gustaut syndrome);萊-萘二氏症候群（Lesch-Nyhan syndrome);腦 白質營養不良症；路易體癡呆（Lewy body dementia);無 腦回，閉鎖症候群；盧-格裏格病（Lou Gehrig's disease)(亦 即，運動神經元病或肌萎縮側索硬化）；腰椎間盤病；萊 姆病（Lyme disease)-神經後遺症；馬-約病（Machado-Joseph disease);腦肥大；巨腦；邁-羅二氏症候群 (Melkersson-Rosenthal syndrome)；美尼爾症（Menieres disease);髓膜炎；門克斯病（Menkes disease);異染性腦 白質營養不良；小頭畸型；偏頭痛；米勒·費希爾症候群 (Miller Fisher syndrome);小中風；粒線體肌病；默比烏 斯症候群（Mobius syndrome);單肢肌萎縮；運動神經元 病；腦底異常血管網病；黏多糖累積病；多發梗塞性癡 呆；多灶性運動神經病變；多發性硬化及其他去髓鞘病 症；具有位置性低血壓之多系統萎縮；肌營養不良症；重 症肌無力；去髓鞘彌漫性硬化；嬰兒肌陣攣性腦病；肌陣 攣；肌病；肌強直；嗜眠症；神經纖維瘤病；神經阻滞劑 157514.doc -22- 201209163 惡性症候群；AIDS之神經表現；狼瘡之神經後遺症；神 經性肌強直，神經元臘樣脂褐質症；腦神經元移行異常； 尼曼皮克病（Niemann-Pick disease);奥沙利文_麥克勞彳轰病 症（O'Sulhvan-McLeod syndrome);枕部神經痛；隱性脊柱 神經管閉合不全序列徵；大田原症候群（〇htahara syndrome);橄欖體腦橋小腦萎縮；斜視性眼陣攣；視神 經炎；直立性低血壓；過度使用症候群；感覺異常；神經 退化性疾病或病症（帕金森氏病（Parkins〇n,s disease)、亨廷 頓病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮側索硬化（ALs)、癡呆' 多發性硬化及與神經元細胞死亡有關之其他疾病及病 症），先天性副肌強直症；副腫瘤性疾病；陣發性發作； 帕-羅二氏症候群（parry Romberg syndrome);佩-梅二氏病 (Pelizaeus-Merzbacher disease);週期性癱瘓；周邊神經病 變；疼痛性神經病變及神經性疼痛；持續性植物人狀態； 全身性發育遲緩；旋光性噴嚏反射；植烷酸貯積病；匹克 病（Pick's disease);神經挾捏；垂體瘤；多肌炎；腦穿通 畸形’小兒麻療症後期症候群；帶狀皰療後神經痛，·感染 後腦脊髓炎；體位性低血壓；帕-魏二氏症候群（prader_ Willi syndrome);原發性侧索硬化症，；朊病毒病；進行性 一側面萎縮；進行性多灶性白質腦病；進行性硬化性灰質 萎縮；進行性核上麻痹；假腦瘤；拉姆齊-亨特症候群 (Ramsay-Hunt syndrome)(I及II型）；羅斯默森氏腦炎 (Rasmussen's encephalitis);反射性交感神經營養不良症候 群；雷夫敘姆病（Refsum disease);重複性運動病症；重複 157514.doc -23· 201209163 性壓迫損傷；不寧腿症候群；反轉錄病毒相關性脊髓病； 蕾特氏症候群（Rett syndrome);雷依氏症候群（Reye，s syndrome)，舞蹈病（Saint Vitus dance);山德霍夫氏病 (Sandhoff disease)，谢耳德病（Sehilder's disease);腦裂； 透明隔-視神經發育不良；驚嚇嬰兒症候群；帶狀皰療； 夏伊-德雷格症候群（Shy-Drager syndrome);薛格連氏症候 群（Sjogren’s syndrome);睡眠呼吸暫停；索托斯症候群 (Soto's syndrome);痙攣狀態，·脊柱裂；脊髓損傷；脊髓 腫瘤；脊髓性肌萎縮；僵人症候群（Stiff_Pers〇n syndrome);中風；斯特奇-韋伯二氏症候群（Sturge_Weber syndrome);亞急性硬化性全腦炎；皮層下動脈硬化性腦 病，西德納姆舞蹈病（Sydenham chorea);暈厥；脊髓空洞 症；遲發性運動障礙；泰-薩克斯病（Tay_Sachs diseas匀； 顧動脈k ’脊髓牵扯症候群；湯姆森病（Thomsen disease);胸廓出口症候群；三叉神經痛症（Tic Douloureux);託德氏麻痺（Todd's paralysis);多動穢語症 候群；短暫性腦缺企發作；傳播性海綿狀腦病；橫貫性脊 髓炎；外傷性腦損傷；顫抖；三叉神經痛；熱帶痙攣性輕 截癱；結節性硬化症；jk管性癡呆（多發梗塞性癡呆）；血 管炎’包含顯動脈炎；希林二氏病（V〇n Hippel-Lindau disease)，瓦倫伯格氏症候群（Wallenberg’s syndrome);韋 德尼希-霍夫曼病（Werdnig-Hoffman disease);韋斯特病 (West syndrome);頸椎戳傷；威廉斯症候群（Williams syndrome);威爾森氏病（Wildon's disease);及澤韋格症候 157514.doc •24- 201209163 群（Zellweger syndrome) 〇 「增殖性疾病或病症」包含但不限於涉及以下細胞之造 金腫瘤性病症.源於骨髓樣、淋巴樣或紅血·球譜系之造灰 源的增生性/腫瘤性細胞、或其前體細胞。該等疾病包含 但不限於成紅細胞白血病、急性前骨髄性白血病 (APML)、慢性髓性白血病（CmL)、淋巴樣惡性腫瘤（包含 但不限於急性成淋巴細胞性白血病（ALL)，其包含B_譜系 ALL及T-譜系ALL)、慢性淋巴細胞白血病（CLL)、幼淋巴 細胞白血病（PLL)、多毛細胞白血病（HLL)及沃爾登斯特倫 巨球蛋白血症（Waldenstrom's macroglobulinemia) (WM)。 惡性淋巴瘤之其他形式包含但不限於非霍奇金氏淋巴瘤及 其變體、周邊T細胞淋巴瘤、成人τ細胞白血病/淋巴瘤 (ATL)、皮膚τ細胞淋巴瘤（CTCL)、巨粒淋巴細胞白血病 (LGF)、霍奇金氏病及裏德_斯藤伯格病 disease) ° 「發炎」係指全身性發炎病狀及局部與單核細胞、白血 球及/或曰中性球遷移及吸引有_之病狀。發炎之實例包 ^但不限於因感染病原性有機體（包含格蘭氏㈣⑷陽性細 菌格蘭氏陰性細菌、病毒、真菌、及諸如原生動物及螺 蟲等寄生蟲)、移植排斥(包含實體器官(例如，腎、肝、心 臟肺或角膜）之排斥、以及骨髓移植（包含移植物抗宿主 ’、病（HD))之排斥）、或局部慢性或急性自體免疫或過敏 應引起之發火。自體免疫性疾病包含腎小球腎炎；類風 W反應性關節炎；慢性腎小球腎炎；發炎性腸病，例 157514.doc -25- 201209163 如克隆氏病（CroWs disease)、潰癌性結腸炎及壞死性小腸 結腸炎，·肝炎，·敗血症，·酒精性肝病；非酒精性脂肪變 性；顆粒球輸注有關之症候群；發炎性皮膚，例如，接觸 !生皮人4位性皮火、牛皮癖；全身性紅斑狼瘡（队E)、 自體免疫性甲狀腺炎、多發性硬化、及一些形式之糖尿 病、或由個體之自身免疫系統攻擊產生病變組織損壞的任 一其他自體免疫性狀態。過敏反應包含過敏性哮喘、慢性 枝氣管炎、急性及遲發性過敏。全身性發炎疾病狀態包含 與創傷、燒傷、再灌注後缺血性事件（例如心臟、腦、腸 或外周血管中之血栓形成性事件，包含心肌梗塞及中 風）、敗血症、ARDS或多器r功能障礙症候群有關之發 炎。發炎性細胞募集亦發生在動脈粥樣硬化斑塊中。發炎 包含但不限於非霍奇金氏淋巴瘤、韋格納氏肉芽腫病 (Wegener's granulomatosis)、橋本氏甲狀腺炎（Hashim〇t〇 s thyroiditis)、肝細胞癌、胸腺萎縮、慢性胰腺炎、類風濕 性關節炎、反應性淋巴增生、骨關節炎、潰瘍性結腸炎、 乳頭狀癌、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、急性膽囊炎、慢性 膽囊炎、硬化、慢性涎腺炎、腹膜炎、急性胰腺炎、慢性 胰腺炎、慢性胃炎、子宮肌腺症、子宮内膜異位、急性宮 頸炎、慢性宮頸炎、淋巴增生、多發性硬化、急性特發性 血小板減少紫癜繼發性肥大、原發性IgA腎病、全身性紅 斑狼瘡、牛皮癬、肺氣腫、慢性腎盂腎炎及慢性膀胱炎。 聚核苷酸及募核苷酸組合物及分子 靶：在一個實施例中，靶包括BCL2結合部分3(bbc3)之 157514.doc •26- 201209163 核酸序列，包含（不限於）與BBC3有關之正義及/或反義非 編碼及/或編>5馬序列。 BCL2結合部分3(BBC3)或識另4為DNA損傷後 誘導之p53調控基因。隨後發現purna負責許多p53誘導之促 細胞凋亡效應，但Puma亦可以p53非依賴方式引起細胞凋 亡。將Puma指定為敏感劑或活化劑一直有些爭議。唯BH3 蛋白之BH3結構域係必需的且足以與Bcl-2家族成員相互作 用且看似在很大程度上重現完整蛋白之功能。舉例而言， 〇

Bid及Blm之BH3結構域可活化脂質體或粒線體中之Bax及 Bak °在若干研究中’ Puma BH3結構域無此功能，導致許 多人將Puma歸類為敏感劑。然而，利用在活體外轉譯之全 長蛋白的實驗顯示與Bim及Bid相當之活化Bax之能力。 傳統上將Puma視為細胞死亡之p53誘導型調節劑，但其 亦在p53非依賴性細胞死亡途徑、例如彼等由生長因子缺 失或利用糖皮質激素治療誘導者中起關鍵作用。Puma之促 Q 細胞凋亡作用機制歸因於其以高親和力結合且因此抑制所 有抗細胞鴻亡Bcl-2家族成員（包含Bcl_2、bc1-XL、Bcl_ w、Mcl-1及A1)的能力。亦已報導puma可藉由直接結合至 B ax來活化内在細胞凋亡途徑。 在Λ施例中，使用反義寡核苷酸來預防或治療與 BBC3家族成員有關之疾病或病症。實例性沉[2結合部分 3(BBC3)調介之疾病及病症（其可用自使用反義化合物獲得 之幹細胞再生之細胞/組織治療）包括：與BBC3之異常功能 及/或表現有關之疾病或病症、癌症、增殖性疾病或= 157514.doc •27- 201209163 症、與細胞增殖有關或特徵在於細胞增殖之疾病或病狀、 與BBC3之大變或異常表現或功能有關之疾病或病症、神 、’二疾病或病症、發炎、以發炎關節成為病變之一部分的病 狀(」列如，骨關節炎、關節炎、牛皮癖性關節炎、幼年型 關節炎、萊特爾氏症候群（Reiter，s syndr〇me)、與潰 衅 腸炎有關之關節炎、惠伯爾病（Whipple’s disease)、與肉芽 腫回腸結腸炎有關之關節炎、貝切特氏病（Behcet's se)王身性紅斑狼瘡、乾燥症候群（Sj〇gren,s —Ο及混合型結締組織病等）、與粒線體細胞凋亡途 徑損傷有關之疾病或病症、自體免疫性疾病或病症及與神 經凡細胞死亡有關之疾病或病症、衰老或特徵在於不期望 細胞損失之其他病狀。 在本發明實施例中，為需要皮膚治療或處於發生可需要 皮膚治療之病狀風險的個體提供治療及或美容方案及相關 個性化治療。可基於（例如）個體之BBC3狀態進行診斷。患 者給定組織（例士α皮膚）中之BBC3表現量可藉由彼等熟習此 項技術者已知且在本文中別處闡述之方法，例如藉由使用 PCR或抗體基檢測方法分析組織來測定。 在一實施例中，對有需要之患者實施藉由一或多種反義 寡核«來mMBC3，以預防或治療與BBC3異常表現、 功能、活性（與正常對照組相比）相關的任一疾病或病症。 在一實施例中，寡核苷酸對BBC3之聚核苷酸具有特異 性，其包含（不限於）非編碼區域。BBC3靶包括之變 體；BBC3之突變體，包含SNp ;賦3之非編碼序列；等 157514.doc •28- 201209163 位基因、片段及諸如此類。較佳地，寡核苷酸係反義rNa 分子。 根據本發明實施例，靶核酸分子並不僅限於BBC3聚核 苷酸而是擴展至BBC3之任一同種型、受體、同系物、非 編碼區域及諸如此類。 在一實施例中，寡核苷酸靶向BBC3靶之天然反義序列 (編碼及非編碼區域之天然序列），其包含（不限於）其變 體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及互補序 列。較佳地，寡核苷酸係反義RNA或DNA分子。 在一實施例中’本發明之寡聚化合物亦包含在該化合物 中之一或多個核苷酸位置存在不同鹼基的變體。舉例而 言’若第一核苷酸係腺嘌呤，則可產生在此位置含有胸 苦、鳥苷、胞苷或其他天然或非天然核苷酸之變體。此可 發生於反義化合物之任一位置。然後使用本文所述方法測 試該等化合物以測定其抑制靶核酸表現之能力。 在一些實施例中，反義化合物與靶之間之同源性、序列 一致性或互補性為約50%至約60%。在一些實施例中，同 源性、序列一致性或互補性為約6〇%至約7〇%。在一些實 施例中’同源性、序列一致性或互補性為約7〇%至約 80%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為 約80%至約90%。在一些實施例中，同源性、序列一致性 或互補性為約90°/。、約92%、約94%、約95%、約96%、約 97%、約 98%、約 99%或約 100〇/〇。 在以下情形時反義化合物可特異性雜交：化合物與靶核 157514.doc •29· 201209163 而導致活性損失，且存 酸之結合可干擾靶核酸之正常功能 酸序列在期 。該等條件 在足夠互補性程度以避免反義化合物與非靶核 望發生特異性結合之條件下發生非特異性結合 包含（亦即）活體内分析或治療性治療情形下之生理條件 及在活體外分析情形下實施分析之條件。 在以下情形下反義化合物（不論係DNA、RNA、嵌合化 合物、或經取代化合物等）可特異性雜交〔該化合物^靶 DNA或RNA分子之結合可干擾靶DNA或RNA之正常功能而 導致實用性損失，且存在足夠互補性程度以避免反義化合 物與非靶序列在期望發生特異性結合之條件下（亦即，在 活體内分析或治療性治療情形下之生理條件下或在活體 外分析情形下實施分析之條件下）發生非特異性結合。 在一實施例中，靶向BBC3(包含（不限於）使用（例 如）PCR、雜交等鑑別及擴展之反義序列、闡述為seq N〇: 2之序列之一或多者及諸如此類）可調節BBC3之表現或 功能。在一個實施例中，與對照組相比上調表現或功能。 在一貫施例中，與對照組相比下調表現或功能。 在一實施例中，寡核苷酸包括闡述為SEQ ID NO: 3至8 之核酸序列，包含使用（例如）PCR、雜交等鑑別及擴展之 反義序列。該等养核普酸可包括一或多個經修飾核皆酸、 較短或較長片段、經修飾鍵及諸如此類。經修飾鍵或核苷 酸間鍵聯之實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或諸如此 類。在一實施例中，核苷酸包括磷衍生物。可附接至本發 明經修飾寡核苷酸中之糖或糖類似物部分之磷衍生物（或 1575l4.doc •30- 201209163 經修飾磷酸酯基團）可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸 酯、磷酸烷基酯、烷磷酸酯、硫代磷酸酯及諸如此類。上 述磷酸醋類似物之製備、及其在核普酸、經修飾核苦酸及 养核苦酸中之納入本身亦已知且無需闡述於本文中。 • 彼等熟習此項技術者亦在治療應用中利用反義寡核苷酸 之特異性及敏感性。採用反義寡核苷酸作為治療部分來治 療動物及人類之疾病狀態。反義寡核苷酸已安全且有效地 投與人類且當前正實施許多臨床試驗。由此確定，募核苷 〇 酸可為可經設置用於治療細胞、組織及動物（尤其人類）之 治療方案中的有用治療方式。 在本發明實施例中，募聚反義化合物、尤其寡核苷酸會 結合至靶核酸分子並調節由靶基因編碼之分子的表現及/ 或功能。擬干擾之DNA功能包括（例如）複製及轉錄。擬干 擾之RNA功能包括所有重要功能，例如，RNA至蛋白質轉 譯位點之易位、蛋白質自RNA之轉譯、使rNA產生一或多 ◎ 物質之剪接、及RNA可參與或促進之催化活性。 可端視期望功能來上調或抑制功能。 反義化合物包含反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部 引導序列（EGS)募核苷酸、交替剪接體、引物、探針及與 乾核酸之至少一部分雜交的其他寡聚化合物。因此，該等 化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環狀寡聚化合物形式 引入。 在本發明之上下文中，反義化合物至特定核酸分子之乾 向可為多步過程。該過程通常始於鑑別欲調節功能之乾核 157514.doc • 31 201209163 酸。舉例而言’㈣核酸可為表現與特定病症或疾病狀態 有關之細胞基因（或自該基因轉錄之mRNA)或來自傳染原 之核I刀子在本發明中，靶核酸編碼BCL2結合部分 3(BBC3)。 靶向過程通常亦包含測定靶核酸内發生反義相互作用從 而產生期望效應（例如，調節表現）的至少一個乾區域、區 段或位點。在本發明之上下文中，術語「區域」定義為乾 核酸中具有至少—種可鑑別結構、功能或特性的-部分。 靶核酸之區域内具有區段。「區段」$義為靶核酸内區域 之較小或子部分。本發明所用之「位點」$義為乾核酸内 之位置。 在一實施例中，反義募核苷酸結合至BCL2結合部分 3(BBC3)之天然反義序列並調節BBC3 (SEQ 1〇 n〇: 1)之表 現及/或功能。反義序列之實例包含Eq ID N〇: 2至8。 在一實施例中，反義寡核苷酸結合至BcL2結合部分 3(BBC3)聚核苷酸之一或多個區段並調節BBC3i表現及/ 或功能。區段包括BBC3正義或反義聚核苷酸之至少5個連 續核苷酸。 在一實施例中’反義寡核苷酸對BBC3之天然反義序列 具有特異性，其中募核苷酸與BBC3之天然反義序列之結 合可調節BBC3的表現及/或功能。 在一實施例中’寡核苷酸化合物包括闡述為SEq ID N〇: 3至8之序列、使用（例如）pcR、雜交等鑑別及擴展之反義 序列。该·#寡核苷酸可包括一或多個經修飾核苷酸、較短 157514.doc •32· 201209163 Ο

或較長片段、經修飾鍵及諸如此類。經修飾鍵或核苷酸間 鍵聯之實例包括硫代填酸酯、二硫代磷酸酯或諸如此類。 在一實施例中，核苷酸包括填衍生物。可附接至本發明經 修飾募核苷酸中之糖或糖類似物部分之填衍生物（或經修 飾磷酸酯基團）可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、鱗 酸烧基酯、烷磷酸酯、硫代磷酸酯及諸如此類。上述填酸 @旨類似物之製備、及其在核苷酸、經修飾核苷酸及寡核苦 酸中之納入本身亦已知且無需闡述於本文中。 如業内已知’因轉譯起動密碼子通常係5，_AUG(在轉錄 mRNA分子中；在相應Dna分子中係5'-ATG)，轉譯起動密 碼子亦稱為「AUG密碼子」、「起始密碼子」或rAUG起始 密碼子」。少數基因具有轉譯起動密碼子，其具有RNA序 列 5’-GUG、5I-UUG或 5I-CUG ;且已顯示 5，_aua、5，_acg 及5，-CUG可在活體内發揮作用。因此，即使起動胺基酸在 每一情形中通常係曱硫胺酸（在真核生物中）或曱醯甲硫胺 酸（在原核生物中），術語「轉譯起動密碼子」及「起始 碼子」亦可涵蓋多種密碼子序列。真核生物及原核生物基 因可具有兩個或更多個替代性起始密碼子，其中之任一者 可優先用於在特定細胞類型或組織中或在特定條件組下之 轉譯起動。在本發明之上下文中，「起始密碼子」及「轉 譯起動密碼子」係m在活體内㈣自編碼概2結合 部分3(BBC3)之基因轉錄之之轉$ & 锝#的一或多個密碼 子，不管該等密碼子之序列如何。美 ^ ^ ^丞因之轉譯終止密碼子 (或「停止密碼子」）可具有二藉忠 ;韦—種序列（亦即，5'-UAA、51- 157514.doc •33· 201209163 5'-TAG 及 UAG及51-UGA ’相應DNA序列分別係5，_taa 5'-TGA)中之一者。 術語「起始密碼子區域」及「轉譯起動密碼子區域」 指此-mRNA或基因中在來自轉譯起動密碼子之任—方向 (亦即5或3 )上涵蓋約25至約5〇個鄰近核苦酸的—部分。 類m也#f 5吾「停止密碼子區域」及「轉譯終止密碼子區 I係指此1RNA或基因中在來自轉譯終止密碼子之^ :方向(亦即，5’或3，)上涵蓋約25至約5〇個鄰近核苷酸的— 4刀目此’「起始密碼子區域」（或「轉譯起動密碼子區 域J )及「停止密碼子區域」（或「轉譯終止密碼子區域」） 係本發明反義化合物可有效乾向之所有區域。 業内已知之開放讀碼框（〇RF)或「編碼區域」係指轉嘩 起動“子與轉譯終止密碼子之間之區域，其亦係可有效 靶向之區域。在本發明之上下文中，靶向區域係涵蓋基因 之開放讀碼框（0RF)之轉譯起動或終止密碼子的基因内區 域0 另一靶區域包含業内已知之5,非轉譯區域（5,utr),其係 指在來自轉譯起動密碼子之5，方向上之mRNA部分，且由 此包含mRNA之5,加帽位點與轉譯起動密碼子間之核苷酸 (或基因上之相應核苷酸另一靶區域包含業内已知之3, 非轉譯區域（3’UTR)，其係指在來自轉譯終止密碼子之3，方 向上之mRNA部分，且由此包含mRNA之轉譯終止密碼子 與3·端間之核苷酸（或基因上之相應核苷酸）。mRNA25，加 帽位點包括經由5，-5,三磷酸酯鍵聯接合至mRNA之5，_最殘 157514.doc •34· 201209163 基之N7-T基化鳥苦殘基。mRNAi5，加帽區域視為包含 加帽結構本身以及與加帽位點相鄰之前5〇個核苷酸。本發 明之另一乾區域係5’加帽區域。 儘管一些真核生物mRNA轉錄物可直接轉譯，但許多真 • 核生物111尺1^轉錄物含有一或多個在轉譯之前自轉錄物切 割且稱為「内含子」的區域。刺餘（且由此轉譯）區域稱為 「外顯子」且一起剪接以形成連續mRNA序列。在—個實 施例中，靶向剪接位點（亦即，内含子-外顯子結點或外顯 子-内含子結點）尤其可用於異常剪接與疾病有關、或特定 剪接產物之過度產生與疾病有關之情形中。因重排或缺失 產生之異常融合結點係靶位點之另一實施例。經由自不同 基因源剪接兩個（或更多）mRNA之過程產生之mRNA轉錄物 私為「融合轉錄物」。可使用靶向（例如）1)1^入或111}〇^前體 之反義化合物來有效靶向内含子。 在一實施例中，反義寡核苷酸結合至靶聚核苷酸之編碼 Q 及/或非編碼區域並調節靶分子之表現及/或功能。 在一實施例中，反義寡核苷酸結合至天然反義聚核苷酸 並調節靶分子之表現及/或功能。 在一實施例中，反義募核苷酸結合至正義聚核苷酸並調 節把分子之表現及/或功能。 替代性RNA轉錄物可自DNA之相同基因組區域產生。該 等替代性轉錄物通稱為「變體」。更特定而言，「1111^^八前 體變體」係自相同基因組DNA產生之轉錄物，其與自相同 基因組DNA產生之其他轉錄物在起始或停止位置方面有所 157514.doc •35· 201209163 不同且含有内含子及外顯子序列。 在剪接期間切割一或多個外顯子或内含子區域、或其部 分時，mRNA前體變體會產生較小「mRNA變體」。因此， mRNA變體係經處理之mRNA前體變體且每一唯一 mRNA前 體變體必須始終藉由剪接而產生唯一 mRNA變體。該等 mRNA變體亦稱為「交替剪接變體」。若mRNA前體變體未 發生剪接，則mRNA前體變體與mRNA變體相同。 變體可經由使用起始或停止轉錄之交替信號來產生。 mRNA岫體及mRNA可具有一個以上之起始密碼子或停止 後碼子。源自使用替代性起始密碼子之mRNA前體或 mRNA的變體稱為mRNA前體或mRNA之「替代性起始變 體」。彼等使用替代性停止密碼子之轉錄物稱為mRNA前體 或mRNA之「替代性停止變體」。替代性停止變體之一種具 體類型係「polyA變體」，其中所產生之多個轉錄物源自轉 錄機對於「polyA停止信號」中之一者之替代性選擇，由 此產生在唯一 polyA位點終止之轉錄物。在本發明之上下 文中’本文所述變體之類型亦係靶核酸之實施例。 靶核酸上與反義化合物雜交之位置定義為至少靶區域中 由活性反義化合物靶向之長5個核苷酸的部分。 儘管本文中闡述了某些實例性靶區段之特異性序列，但 熟習此項技術者應認識到，該等序列用於闡釋及闡述本發 明範疇内之特定實施例。熟習此項技術者根據本揭示内容 可容易地鑑別其他靶區段。 人們認為長度為5至100個核苷酸且包括一段至少五（5) 157514.doc -36- 201209163 個選自較佳闡釋性靶區段之連續核苷酸之靶區段亦適於乾 向。 靶區段可包含DNA或RNA序列，其包括至少5個來自較 佳闡釋性靶區段中之一者之5，_末端之連續核苷酸（剩餘核 苦酸係同一 DNA或RNA中之連續的一段，其緊接靶區段之 5'-末端上游開始並持續至該DNA或RNA含有約5至約1〇〇個 核普酸為止）。類似地’較佳靶區段表示為Dna或RNA序 列，其包括至少5個來自較佳闡釋性靶區段中之一者之3，_ 末端之連續核苷酸（剩餘核苷酸係同一 DNA或RNA中之連 續的一段’其緊接靶區段之3，_末端下游開始並持續至該 DNA或RNA含有約5至約1〇〇個核苷酸為止）^瞭解本文所 示靶區段之熟習此項技術者無需過多實驗即能鑑別其他較 佳乾區段。 鑑別一或多個靶區域、區段或位點後，即可選擇與靶充 分互補（亦即雜交足夠充分且具有足夠特異性）之反義化合 物以得到期望效應。 在本發明實施例中，募核苷酸結合至特定靶之反義鏈。 募核苷酸之長度為至少5個核苷酸且可經合成以使每一募 核苦m向重疊序列’從而寡核_酸經合成以覆蓋乾聚 核苷酸之整個長度。靶亦包含編碼以及非編碼區域。 在一個實施例中’反義寡核苷酸較佳靶向特異性核酸。 反義化合物至特定核酸之靶向係多步過程。該過程通常始 於鑑別欲調節功能之核酸序列。此可（例如）係表現與特定 病症或疾病狀態有關之細胞基因（或自基因轉錄之 157514.doc -37- 201209163 mRNA)、或非編碼聚核苷酸（例如，非編碼RNA (ncRNA))。 RNA可分類為（1)信使RNA (mRNA)，其轉譯成蛋白 質；及（2)非蛋白編碼性RNA (ncRNA)。ncRNA包括微小 RNA、反義轉錄物及含有高密度停止密碼子且缺乏任一廣 泛性（extensive)「開放讀碼框」的其他轉錄單元（TU)。許 多ncRNA似乎始於編碼蛋白質之基因座之3'非轉譯區域 (3'UTR)中之起動位點。ncRNA通常較罕見且FANTOM聯盟 已測序之ncRNA中至少一半似乎未經聚腺苷酸化。大部分 研究者出於明顯原因而著重關注經處理並輸出至細胞質中 之聚腺皆酸化mRNA。最近，顯示非聚腺苦酸化核RNA之 組可能極大，且許多該等轉錄物源自所謂的基因間區域。 ncRNA可調控基因表現之機制係與靶轉錄物之鹼基配對。 藉由鹼基配對發揮作用之RNA可分組為：（1)順式編碼之 RNA，其在其發揮作用之相同遺傳位置、但在RNA之相對 鍵處編碼且由此顯示與其乾之完全互補性；及（2)反式編 碼之RNA，其在與其發揮作用之RNA不同的染色體位置處 編碼且通常並不顯示與其靶之完全鹼基配對潛力。 不期望受限於理論下，本文所述反義寡核苷酸對反義聚 核苷酸之干擾可改變相應正義信使RNA之表現。然而，此 調控可為不協調（反義擊弱（knockdown)造成信使RNA增加） 或協調（反義擊弱造成伴隨信使RNA減少）。在該等情形 下，反義寡核苷酸可靶向反義轉錄物之重疊或非重疊部 分，以產生擊弱或隔絕（sequestration)。可以相同方式把向 157514.doc -38- 201209163 編碼以及非編瑪反義轉錄物，且任一種類皆能以協調或不 協調方式調控相應正義轉錄物。用於鑑別針對標乾之新寡 ㈣酸的策略可基_由反義寡核*酸來擊弱反義轉 錄物或調節所計晝標靶的任—其他方式。 ' 策略1:在不協調調控之情形下，擊弱反義轉錄物會增 加習用（正義）基因之表現。若後-基因編碼已知或假定藥 物乾，則可設想擊弱其反義對等部分來模擬受體激動劑或 酶刺激物之作用。 冑略2:在協調調控之情形下，可同時擊弱反義及正義 2錄物且由此協同降低習用（正義）基因表現。舉例而言， 錢用反義募㈣酸來達成擊弱，則可❹此策略來應用 —種乾向正義轉錄物之反義寡料酸絲向相應反義轉錄 物之P反義寡核普酸、或同時乾向重疊正義及反義轉錄 物之單一能量對稱性反義募核苷酸。 立根據本發明，反義化合物包含反義寡核苷酸、核酶、外 Ο P引導序列（EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單-哎雙鏈 職干擾（RNAi)化合物（例如仙财化合物）、及與把核酸 之至少-部分雜交並調節其功能之其他寡聚化合物。因 此，其可為DNA、RNA、類麵、類舰、或其混合物， 或可為5亥等物質中一或多者之模擬物。該等化合物可為單 ^雙鏈、％狀或髮夾型寡聚化合物’且可含有諸如内部 或末端膨脹、失配或環路等結構要素。反義化合物通常製 成直鏈形式，但可經接合或以其他方式製成環狀及/或具 支鏈形式。反義化合物可包括諸如以下構成物：經雜交以 I57514.doc -39- 201209163 、成元王或。卩分雙鍵化合物之兩條鏈，或具有足夠自體互 補性以進订雜交並形成完全或部分雙鏈化合物之單鏈。兩 條鏈可在内部連接以產生游離3,或5,末端或可連接形成連 續髮爽結構或環路。髮夾結構可在5·或3,末端含有懸垂部 刀XL長單鏈特徵。雙鏈化合物視需要可在末端包含懸垂 部分。其他修飾可包含附接至一個末端、所選核苷酸位 置糖位置或附接至一個核苷間鍵聯之偶聯基團。另一選 擇為，兩條鏈可經由非核酸部分或連接體基團進行連接。 田僅由條鏈形成時，dsRNA可呈自體互補髮夾型分子形 式其自身對折以形成雙鏈體。因此，dsRNA可為完全或 部分雙鏈。可藉由在轉基因細胞系中穩定表現dsRNA髮夾 來特異性調節基因表現，然而，在-些實施例中，基因表 見或力此絰上调。在自兩條鏈、或呈自體互補髮夾型分子 (身對折以形成雙鏈體）之單鏈形成時，兩條鏈（或單 鏈中形成雙鏈體之區域）係以Wats〇nCrick方式驗基配對之 互補RNA鏈。 引入系統中之後，本發明化合物可引發—或多種酶或結 構蛋白質之作用以實現靶核酸之裂解或其他修飾或可經由 基於佔據之機制進行作用。一般而言，核酸（包含寡核普 酸）可闡述為「類職」（亦即，通常具有一或多個2，去氧 糖及（通常）τ而非u驗基）或「類RNA」（亦即，通常呈有一 或多個2，-經基或2，_修鋅糖及（通常）1;而非τ驗基）。核酸螺 :可採用種以上之結構類型，最通常係Α型及Β型。據 般而5，具有B型樣結構之募核苷酸係「類DNA」 157514.doc -40- 201209163 且彼等具有A型樣結構者係「類RNA」。在一些（嵌合）實施 例中，反義化合物可含有A-及B型區域。 在一實施例中，期望寡核苷酸或反義化合物包括以下中 之至少一者：反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、 包括經修飾鍵聯之反義寡核苷酸、干擾RNA(RNAi)、短干 擾 RNA (siRNA);微小干擾 RNA (miRNA);小時序 RNA (stRNA);或短髮夾RNA (shRNA);小RNA誘導之基因活 化（RNAa);小活化RNA(saRNA)、或其組合。 dsRNA亦可活化基因表現，此機制稱為「小RNA誘導之 基因活化」或RNAa。靶向基因啟動子之dsRNA可誘導有 關基因之有效轉錄活化。在使用合成dsRNA(稱為「小活 化RNA」（saRNA))之人類細胞中顯示RNAa。當前尚未瞭 解，在其他有機體中RNAa是否保守。 已發現，小雙鏈RNA (dsRNA)(例如小干擾RNA (siRNA) 及微小RNA (miRNA))係稱為RNA干擾（RNAi)之進化保守 機制的觸發物。RNAi通常經由重塑染色質以由此阻抑轉 錄來引起基因沉默，從而降解互補mRNA、或阻斷蛋白質 轉譯。然而，在詳細闡述於下文實例部分之情形下，顯示 寡核苷酸可增強BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸及其編碼 產物之表現及/或功能。dsRNA亦可用作小活化RNA (saRNA)。不期望受限於理論，藉由靶向基因啟動子中之 序列，saRNA可誘導靶基因表現，此現象稱為dsRNA誘導 之轉錄活化（RNAa)。 在另一實施例中，本文所鑑別之「較佳靶區段」可用於 157514.doc -41 · 201209163 篩選調節BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之表現之額外化 合物。「調節劑」係彼等如下化合物：可降低或增加編碼 BBC3之核酸分子之表現，且至少包括與較佳靶區段互補 之5-核苷酸部分。篩選方法包括以下步驟：使編碼BBC3 之正義或天然反義聚核苷酸之核酸分子的較佳靶區段與一 或多種候選調節劑接觸，及選擇一或多種可降低或增加編 碼BBC3聚核苷酸之核酸分子（例如SEQ ID NO: 3至8)之表 現的候選調節劑。若顯示一或多種候選調節劑能夠調節 (例如降低或增加）編碼BBC3聚核苷酸之核酸分子的表現， 則該調節劑可用於BBC3聚核苷酸功能之其他調查性研 究，或用作本發明之研究、診斷、或治療藥劑。 把向天然反義序列較佳地可調節把基因之功能。例如， BBC3基因（例如，登錄號為NM_001127242)。在一實施例 中，靶係BBC3基因之反義聚核苷酸。在一實施例中，反 義寡核苷酸靶向BBC3聚核苷酸（例如，登錄號為 NM_001127242)之正義及/或天然反義序列、其變體、等位 基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段及互補序 列。較佳地，寡核苷酸係反義分子且靶包含反義及/或正 義BBC3聚核苷酸之編碼及非編碼區域。 本發明之較佳靶區段亦可與本發明之其相應互補反義化 合物組合以形成穩定雙鏈（雙鏈體）寡核苷酸。 業内已顯示，該等雙鏈寡核苷酸部分可調節靶表現並經 由反義機制調控轉譯以及RNA處理。另外，雙鏈部分可經 受化學修飾。舉例而言，已顯示該等雙鏈部分可藉由雙鏈 157514.doc -42- 201209163 體之反義鏈與靶之典型雜交來抑制靶，由此觸發靶之酶降 解。 在一實施例中，反義寡核苷酸靶向BCL2結合部分 3(BBC3)聚核苷酸（例如，登錄號為NM_001127242)、其變 體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段 及互補序列。較佳地，寡核苷酸係反義分子。 根據本發明實施例，靶核酸分子並不僅限於BBC3而是 擴展至BBC3分子之任一同種型、受體、同系物及諸如此

在一實施例中，寡核苷酸靶向BBC3聚核苷酸之天然反 義序列（例如，闡述為SEQ ID NO: 2之聚核苷酸）、及其任 一變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及互 補序列。將反義寡核苷酸之實例闡述為SEQ ID NO: 3至 8 ° 在一個實施例中，寡核苷酸與BBC3反義分子之核酸序 列（包含（不限於）與BBC3聚核苷酸有關之非編碼正義及/或 反義序列）互補或結合並調節BBC3分子之表現及/或功能。 在一實施例中，寡核苷酸與BBC3天然反義分子之核酸 序列（闡述為SEQ ID NO: 2)互補或結合並調節BBC3分子之 表現及/或功能。 在一實施例中，寡核苷酸包括SEQ ID NO: 3至8中至少5 個連續核苷酸之序列並調節BBC3分子之表現及/或功能。 聚核苷酸靶包括BBC3(包含其家族成員）、BBC3之變 體；BBC3之突變體，包含SNP ; BBC3之非編碼序列； 157514.doc -43- 201209163 BBC3之等位基因；物種變體、片段及諸如此類。較佳 地，寡核苷酸係反義分子。 在一實施例中，靶向BBC3聚核苷酸之募核苷酸包括： 反義RNA、干擾RNA (RNAi)、短干擾RNA (siRNA);微小 干擾RNA (miRNA);小時序rnA (stRNA);或短髮夾RNA (shRNA);小RNA誘導之基因活化（RNAa);或小活化RNA (saRNA)。 在一實施例中’靶向BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸 (例如SEQ ID NO : 2至8)可調節該等靶之表現或功能。在 一個實施例中，與對照組相比上調表現或功能。在一實施 例中，與對照組相比下調表現或功能。 在一實施例中，反義化合物包括闡述為SEQ ID NO: 3至 8之序列。該等寡核苷酸可包括一或多個經修飾核苷酸、 較短或較長片段、經修飾鍵及諸如此類。 在一實施例中’ SEQ ID NO·· 3至8包括一或多個LNA核 苷酸。表1顯示用於本發明方法中之實例性反義募核苷 酸。 表1 :

序列編號 反義序列名稱 序列 SEQIDNO:3 CUR-1675 C*C*A*C*C*A*A*G*C*C*A*G*A*T*T*C*C*C*A*C SEQ ID NO: 4 CUR-1676 A*T*C*Cs|tA*C*Csf:C：iiA*T*C*Ti!!C*G*G*C*Cs,eT*T*C SEQ ID NO: 5 CUR-1677 A*G*G*C*T*C*A*A*G*C*G*T*T*C*C*T*C*C*C*A SEQ ID NO: 6 CUR-1678 C*C*C*A5,!G*T*T*A*G*G*T*T*T!|:C*C*G*C*A*T!i!G*T SEQ ID NO: 7 CUR-1679 T*C*T*G*Ti|iC*G*C*Cs|eC*A*A*Gs|!C*T*G*G*A*G*T SEQ ID NO: 8 CUR-1505 T*C*T*G*T*C*G*C*C*C*A*A*G*C*T*G*G*A*G*T 157514.doc -44 - 201209163 可以業内已知之若干方式來調節期望靶核酸。舉例而 言，使用反義寡核苦酸、siRNA等。酶性核酸分子（例如， 核酶）係能夠催化二或多種不同反應之核酸分子，包含能 夠以核苷酸鹼基序列特異性方式重複裂解其他單獨核酸分 子。該酶性核酸分子可用於（例如）靶向實質上任一 RNA轉 錄物。 因具有序列特異性，故反式裂解之酶性核酸分子可顯示 用作人類疾病之治療劑的前景。可設計酶性核酸分子來裂 解細胞RNA背景内之特異性RNA靶。此一裂解事件使得 mRNA失去功能性並去除來自該RNA之蛋白質表現。以此 方式可選擇性抑制與疾病狀態有關之蛋白質的合成。 一般而言，具有RNA裂解活性之酶性核酸藉由首先結合 至靶RNA來發揮作用。該結合經由酶性核酸之靶結合部分 來進行，該靶結合部分緊鄰分子中用於裂解靶RNA之酶性 部分。因此，酶性核酸首先識別靶RNA且然後經由互補鹼 基配對與靶RNA結合，且在結合至確切位點後以酶促方式 發揮作用以切割靶RNA。此一靶RNA之裂解策略將破壞其 引導合成所編碼蛋白之能力。酶性核酸已結合且裂解其 RNA靶之後，其自該RNA釋放以尋找另一靶且可重複結合 及裂解新靶。 已使用諸如活體外選擇（演變）策略（Orgel，（1979) Proc_ R. Soc. London, B 205, 43 5)等若干方式來產生能夠催化各 種反應（例如磷酸二酯鍵聯及醯胺鍵聯之裂解及連接）的新 核酸觸媒。 157514.doc -45- 201209163 對於具有最適催化活性之核酶之研發將顯著有助於採用 RNA裂解性核酶來調控基因表現的任一策略。舉例而言， 錘頭狀核酶在飽和（1〇 mM)濃度之Mg2+輔因子存在下以約 1 min-1之催化速率（kcat)發揮作用。已顯示人工「rna連 接酶」核酶可以約丨00 min_丨之速率催化相應自修飾反應。 此外，已知某些經修飾錘頭狀核酶具有由DNA構成之受質 結合臂，其可以接近1〇〇 min—〗之多倍周轉速率催tRNA裂 解。最後，使用某些核苷酸類似物代替錘頭狀核酶催化核 心内之特定殘基可產生經修飾核酶，其催化速率顯示提高 多達10倍。該等發現表明，核酶可以顯著大於大部分天然 自裂解核酶在活體外所顯示之催化速率的催化速率來促進 化學轉化。然後可優化某些自裂解核酶之結構以得到最大 催化活性，或可製備顯示顯著較快之RNA磷酸二酯裂解速 率之全新RNA基序。 符合「錘頭」模型之RNA觸媒催化之RNA受質的分子間 裂解首次顯示於1987年（Uhlenbeck，〇 c 〇987) _⑽， 328: 596-600)。回收RNA觸媒並使其與多個rna分子進行 反應，從而表明其確實具有催化性。 基於「錘頭」基序設計之催化RNA已用於裂解特異性乾 序列’其係藉由在催化RNA中作出適當驗基改變以維持與 乾序列之必錢基輯來達成。此使料使㈣化rna來 裂解特異錄序列，且表明根據「錘頭」模型設計之催化 RNA可在活體内裂解特異性受質RNa。 RNA干擾（RNAi)已成為調節哺乳動物及哺乳動物細胞中 157514.doc -46- 201209163 之基因表現之有效工具。此方式需要使用表現質粒或病毒 及用於處理成siRNA之小髮夾RNA的編碼序列以RNA自身 或DNA形式來遞送小干擾RNA (siRNA)。此系統使得能夠 將siRNA前體有效輸送至其具有活性之細胞質中且容許使 用用於基因表現之經調控及組織特異性啟動子。 在一實施例中，寡核苷酸或反義化合物包括核糖核酸 (RNA)及/或去氧核糖核酸（DNA)之寡聚物或聚合物、或其 模擬物、嵌合體、類似物或同系物。此術語包含由天然核 苷酸、糖及共價核苷間（主鏈）鍵聯組成之募核苷酸；以及 具有非天然部分且以相似方式發揮作用之募核苷酸。該等 經修飾或經取代寡核苷酸通常優於天然形式，此乃因諸如 增強之細胞攝取、對於靶核酸之增強之親和力及在核酸酶 存在下之增加之穩定性等期望性質。 根據本發明，寡核苷酸或「反義化合物」包含反義寡核 苷酸（例如RNA、DNA、其模擬物、嵌合體、類似物或同 系物）、核酶、外部引導序列（EGS)寡核苷酸、siRNA化合 物、單鏈或雙鏈RNA干擾（RNAi)化合物（例如siRNA化合 物）、saRNA、aRNA、及其他與乾核酸之至少一個部分雜 交並調節其功能之寡聚化合物。因此，其可為DNA、 RNA、類DNA、類RNA、或其混合物，或可為該等物質中 一或多者之模擬物。該等化合物可為單鏈、雙鏈、環狀或 髮夹募聚化合物，且可含有諸如内部或末端膨脹、失配或 環路等結構要素。反義化合物通常製成直鏈形式，但可經 接合或以其他方式製成環狀及/或具支鏈形式。反義化合 157514.doc 47· 201209163 物可包含諸如以下構成物：經雜交以形成完全或部分雙鏈 化合物之兩條鏈，或具有足夠自體互補性以進行雜交並形 成完全或部分雙鏈化合物之單鏈。兩條鏈可在内部連接以 產生游離1或5,末端或可連接形成連續髮夾結構或環路。 髮夾結構可在5,或3,末端含有懸垂部分以延長單鏈特徵。 雙鏈化合物視需要可在末端包含懸垂部分。其他修飾可包 含附接至一個末端、所選核苷酸位置、糖位置或附接至一 個核苷間鍵聯之偶聯基團。另一選擇為，兩條鏈可經由非 核酸部分或連接體基團進行連接。在自僅一條鏈形成時， dsRNA可呈自體互補髮夾型分子形式，其自身對折以形成 雙鏈體。因此，dsRNA可為完全或部分雙鏈。可藉由穩定 表現轉基因細胞系中之dsRNA髮夾來特異性調節基因表 現。在自兩條鏈、或呈自體互補髮夾型分子形式（自身對 折以形成雙鏈體）之單鏈形成時，兩條鏈（或單鏈中形成雙 鏈體之區域）係以Watson_Crick方式鹼基配對之互補 鏈。 引入系統中之後，本發明化合物可引發—或多種酶或結 構蛋白質之作用以實現靶㈣之裂解或其他修飾或可經由° 基於佔據之機制進行作用。一般而言，核酸（包含寡核# 酸）可闡述為「類腦」（亦即，通常具有一或多個2，_去氧 糖及（通常）Τ而非U驗基）或「類舰」（亦即，通常具有一 或多個2’-經基或2|_修飾糖及（通常川而非τ驗幻。核酸螺 旋可採用-種以上之結構類型，最通常係Α型及_。據 仏 奴而。，具有B型樣結構之寡核苷酸係「類DNA , 157514.doc -48- 201209163 Ο 且彼等具有_樣結構者係「類rna」h 例中，反義化合物可含有八_及6型區域。— 本發月之反義化合物可包括長度為約5至約肋個核苷酸 (亦即，約5至約80個連接核普）的反義部分。此係指反義化 合物之反義鏈或部分之長度。換言之，本發明之單鍵反義 化合物包括5至細個核苦酸，且本發明之雙鏈反義化合 物（例如，dsRNA)包括長度為5至約8〇個核芽酸之正義及反 義鏈或部分。熟習此項技術者應瞭解，此涵蓋長度為5、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、 6、7、 19、20 31 43 55 67 32 44 56 68 :、9 ‘21 33 45 57 69、 22 34 46 58 23 35 47 59 24 36 48 60 25 37 49 61 26 38 50 62 27 39 51 63 28 40 52 64 29 41 53 65 30 42 54 66 Ο 70 、 71 、 72 、 73 、 74 、 75 、 76 、 77 、 78 、 79 或80個核苷酸、或其任一範圍之反義部分。 在個貫細例中，本發明之反義化合物具有長度為i 〇至 50個核菁酸之反義部分。㉟習此項技術者應瞭解，此展現 反義部分長度為 1〇、u、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21 ' 22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43 ' 44 ' 45 ' 46、47、48、49或50個核苷酸、或其任一範 圍之寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為15個 核普酸。 在一個實施例中’本發明之反義或募核苷酸化合物具有 157514.doc •49· 201209163 長度為12或13至30個核苷酸的反義部分。熟習此項技術者 應瞭解’此展現反義部分長度為12、13、14、15、16、 17 、 18 、 19 、 20 、 21 、 22 、 23 、 24 、 25 、 26 、 27 、 28 、 29 或3 0個核苷酸、或其任一範圍之反義化合物。 在一實施例中，本發明之寡聚化合物亦包含在該化合物 中之一或多個核苷酸位置存在不同鹼基的變體。舉例而 s ’若第一核苷酸係腺嘌呤，則可產生在此位置含有胸 苦、鳥皆或胞苦之變體。此可發生於反義或dsRNA化合物 之任一位置。然後使用本文所述方法測試該等化合物以測 疋其抑制乾核酸表現之能力。 在一些實施例中，反義化合物與靶之間之同源性、序列 一致性或互補性為約4〇%至約6〇%。在一些實施例中，同 源性、序列一致性或互補性為約6〇%至約7〇%。在一些實 施例中，同源性、序列一致性或互補性為約7〇%至約 80%。在一些實施例中’同源性、序列一致性或互補性為 約80%至約90%。在-些實施例中，同源性、序列一致性 或互補性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約 97%、約 98%、約 99%或約 1〇〇%。 在一實施例中’反義募核苷酸（例如，SEQ ID NO: 3至8 中所述之核酸刀子）包括—或多個取代或修飾。在一個實 施例中，核苷酸經鎖核酸（LNA)取代。

在一實施例中，寡核苷酸靶向與BBC3有關之編碼及/或 非編碼序列及闡述為SEQ ID NO: 1及2之序列之正義及/或 反義核酸分子的一或多個區域。寡核苦酸亦乾向SEQ ID 157514.doc ，50- 201209163 NO: 1及2之重疊區域。

本發明之某些較佳寡核苷酸係嵌合寡核苷酸。本發明上 下文中之「嵌合寡核普酸」或「嵌合體」係含有兩個或更 多個化學上不同之區域之寡核苷酸，每個區域皆由至少一 個核苦酸構成。該等寡核皆酸通常含有至少一個經修飾核 苷酸區域’該區域賦予一或多種有益性質（例如增加核酸 酶抗性，增加細胞攝取，增加與乾之結合親和力）；及係 能夠裂解RNA:DNA或RNA:RNA雜合體之酶受質的區域。 舉例而言’ RNase Η係可裂解RNA:DNA雙鏈體之rNA鏈之 細胞内切核酸酶。因此，活化RNase H可裂解乾，由 此大大提高基因表現之反義調節的效率。因此，同與相同 靶區域雜交之硫代磷酸酯去氧寡核苷酸相比，在使用嵌合 寡核㈣時利用較短寡核普酸通常可獲得相當之結果。通 承可藉由凝膠電泳及（若需要）業内已知之有關核酸雜交技 術來檢測RNA&之裂解。在—個實施例中，嵌合募核苦酸 包括至少一個經修飾以增加靶結合親和力之區域、及（通 常）用作RNAse Η受質之區域。通常藉由量測寡核普酸/乾 配對之Tm來測定募核苦酸與其乾（在此情形下係編碼⑴之 一，）親和力，Tm係寡核苷酸與靶離解之溫度；使用分 光光度法來檢測離解。Tm愈高，則寡核芽酸與乾之親和 一本發明之嵌合反義化合物可以兩個或更多個如上所述之 :核、經修飾募核苷酸、募核苷及/或募核苷酸模擬 之結構形式形成。因此，化合物在業内亦稱為雜合 157514.doc -51 · 201209163 體或結合體。教示該等雜合體結構之製備的代表性美國專 利包括但不限於美國專利第5,013,830號、第5,149,797號、 第 5,220,007 號、第 5,256,775 號、第 5,366,878 號、第 5,403,711 號、第 5,491，133 號、第 5 565,35〇 號、第 5,623’065 號、第 5,652,355 號、第 5,652,356 號、及第 5,7〇0,922號，每一者皆以引用方式併入本文中。 在一實施例中’募核苷酸之經修飾區域包括至少一個在 糖之2’位處修飾的核苷酸，最佳係經2，-0烷基、2，-〇-烧基_ 〇-烷基或2’-氟修飾之核苷酸。在另一實施例中，RNA修飾 包含對於嘧啶之核糖、無鹼基殘基或RNA中3,端之反向鹼 基之21-氟、2·_胺基及2,〇_曱基修飾。通常將該等修飾納入 募核苷酸中且已顯示該等寡核苷酸相對於2，-去氧寡核苷酸 對於給定靶具有較高Tm(亦即，較高靶結合親和力）。該增 加之親和力效應大大增強了 RNAi募核苷酸對基因表現之 抑制。RNAse Η係裂解RNA:DNA雙鏈體中RNA鏈之細胞内 切核酸酶；因此，活化此酶可裂解RNA靶，且由此可大大 增強RNAi抑制之效率。對RNA靶之裂解通常可藉由凝膠 電泳來顯示。在一實施例中，亦對嵌合寡核苷酸進行修飾 以增強核酸酶抗性。細胞含有多種可降解核酸之外切核酸 酶及内切核酸酶。已顯示多種核苷酸及核苷修飾可使納入 該等修飾之寡核苷酸對核酸酶消化之抗性強於天然寡去氧 核苷酸。核酸酶抗性通常藉由將寡核苷酸與細胞提取物或 刀離核fee酶溶液一起培育並在一段時間後通常藉由凝膠電 泳量測剩餘完整寡核苷酸之含量來進行量測。已經修飾以 1575l4.doc -52- 201209163 增強其核酸酶抗性之寡核苷酸保持完整之時間長於未經修 飾之寡核苷酸。已證實多種寡核苷酸修飾可增強或賦予核 酸酶抗性。當前，含有至少一個硫代磷酸酯修飾之寡核苷 酸更佳。在一些情形下，增強靶結合親和力之寡核苷酸經 修飾亦能獨立地增強核酸酶抗性。 擬用於本發明之一些較佳寡核苷酸的具體實例包含彼等 包括經修飾主鏈者，該等經修飾主鏈係（例如）硫代磷酸 酯、磷酸三酯、膦酸甲酯、短鏈烷基或環烷基糖間鍵聯或 短鏈雜原子或雜環糖間鍵聯。最佳者係具有硫代磷酸酯主 鏈之寡核苷酸及彼等具有雜原子主鏈者，該等雜原子主鏈 尤其係CH2 --NH--0--CH2、CH，--N(CH3)--0--CH2 [稱為 亞甲基（甲基亞胺基）或MMI主鏈]、（：112--0--：^((：^13)--CH2、CH2 -N (CH3)--N (CH3)--CH2及 0--N (CH3)--CH2 --CH2主鏈，其中天然磷酸二酯主鏈表示為O--P—O--CH)。 由 De Mesmaeker等人（1995) Acc. Chem. Res. 28:366-374所 揭示之醯胺主鏈亦較佳。亦較佳者係具有嗎啉基主鏈結構 之寡核苷酸（Summerton及Weller，美國專利第5,034,506 號）。在另一實施例中（例如肽核酸（PNA)主鏈），寡核苷酸 之磷酸二酯主鏈由聚醯胺主鏈代替，核苷酸直接或間接結 合至聚醯胺主鏈之氮雜氮原子。募核苷酸亦可包括一或多 個經取代糖部分。較佳寡核苷酸在1位包括下列基團中之 一者：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3 OCH3、OCH3 0(CH2)n CH3、0(CH2)n NH2 或 0(CH2)n CH3(n 為 1至約 10) ; Cl至CIO低碳烷基、烷氧基烷氧基、經取代低碳烷 157514.doc •53· 201209163 基、烧芳基或芳烧基；Cl ; Br ; CN ; CF3 ; OCF3 ; Ο--、 S--、或 N-烷基；0--、S--、或 N 烯基；SOCH3 ; S02 CH3 ; 0N02 ; N02 ; N3 ; NH2 ;雜環烷基；雜環烷芳基； 胺基烷基胺基；聚烷基胺基；經取代曱矽烷基；RNA裂解 基團；報導子基團；遷入劑；用於改良寡核苷酸之藥物代 謝動力學性質之基團；或用於改良寡核苷酸之藥效動力學 性質之基團及其他具有相似性質之取代基。較佳修飾包含 2'-甲氧基乙氧基[2LO-CH2 CH2 OCH3，亦稱為2’-0-(2-曱 氧基乙基）]。其他較佳修飾包含2’-曱氧基（2’-0--CH3)、2'-丙氧基（2I-OCH2 CH2CH3)及2’-氟（2’-F)。亦可在寡核苷酸 上之其他位置進行類似修飾，尤其係3'末端核苷酸上糖之 3'位及5'末端核苷酸之5'位。寡核苷酸亦可具有糖模擬物， 例如使用環丁基來代替戊呋喃醯基。 寡核苷酸亦可另外或作為另一選擇包含核鹼基（業内通 常簡寫為「鹼基」）修飾或取代。本文所用之「未經修 飾」或「天然」核苷酸包含腺嘌呤（A)、鳥嘌呤（G)、胸腺 。密D定（T)、胞。密。定（C)及尿°密°定（U)。經修飾核皆酸包含僅偶 爾或短暫在天然核酸中發現之核苷酸，例如次黃嘌呤、6-曱基腺嘌呤、5-Me嘧啶、尤其5-甲基胞嘧啶（亦稱為5-甲 基-2’去氧胞嘧啶且業内通常稱為5-Me-C)、5-羥甲基胞嘧 啶（HMC)、糖基HMC及龍膽二糖基HMC ;以及合成核苷 酸，例如，2-胺基腺嘌呤、2-(甲基胺基）腺嘌呤、2-(咪唑 基烷基）腺嘌呤、2-(烷基烷基胺基）腺嘌呤或其他雜取代烷 基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5- 157514.doc -54- 201209163 羥甲基尿嘧啶、8-氤雜鳥嘌呤、7_去氮鳥嘌呤、N6 (6_胺 基己基）腺嘌呤及2,6-二胺基嘌呤。可包含業内已知之「常 用」鹼基（例如肌苷）。已顯示5_Me_c取代可將核酸雙鏈體 穩定性增加0.6°C至1.2°C且係當前之較佳鹼基取代。 對本發明寡核苷酸之另一修飾涉及使一或多種可增強募 核苷酸之活性或細胞攝取之部分或偶聯物以化學方式連接 至募核苷酸。該等部分包含但不限於脂質部分（例如膽固 醇部分）、膽固醇基部分、脂肪族鏈（例如，十二烷二醇或 十一烷基殘基）、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸。業 内已知包括親脂性部分之寡核苷酸、及製備該等寡核苷酸 之方法，例如，美國專利第5，138,〇45號 '第5,218，1〇5號及 第 5,459,255號。 給定寡核苷酸中之所有位置並不需要經一致性修飾，且 事實上可將上述修飾中之一種以上納入單一寡核苷酸中或 甚至納入募核苷酸内之單一核苷中。本發明亦包含係上文 所定義嵌合寡核苷酸之寡核苷酸。 在另一實施例中，本發明之核酸分子與另一部分偶聯， 該另一部分包含但不限於無鹼基核苷酸、聚醚、聚胺、聚 醯胺、肽 '碳水化合物、脂質、或聚烴化合物。彼等熟習 此項技術者應認識到，該等分子可連接至在糖、鹼基或磷 fccSa基團上之若干位置包括核酸分子之任一核苷酸中的一 或多者上。 本發明所用之寡核苷酸可以便捷常規方式經由熟知之固 相σ成技術來製備。包含Applied Biosystems在内之若干 157514.doc -55- 201209163 供貨商出售實施該合成之設備。亦可採用用於該合成之任 一其他方式，熟習此項技術者熟知寡核苷酸之現行合成。 亦熟知使用相似技術來製備諸如硫代磷酸酯及烷基化衍生 物等其他寡核苷酸。業内亦熟知使用相似技術及市售經修 飾DNA合成核苷酸（amidhe)及定孔玻璃（CPG)產品（例如經 生物素、螢光素、吖啶或補骨脂素修飾之DNA合成核苷酸 及/或 CPG(可自 Glen Research, Sterling, VA購得））來合成經 螢光標記、經生物素化或經其他修飾之寡核苷酸，例如經 膽固醇修飾之寡核苷酸。 根據本發明，使用修飾（例如使用LNA單體）來增強作用 之功效、特異性及持續時間並拓寬寡核苷酸之投與途徑包 括諸如MOE、ANA、FANA、PS等當前化學方式。此可藉 由使用LNA單體代替當前寡核苷酸中之一些單體來達成。 經LNA修飾之寡核苷酸可具有類似於母體化合物之尺寸或 可較大或較佳地較小。較佳地，經LNA修飾之寡核苦酸含 有小於約70%、更佳小於約60%、最佳小於約50%之LNA 單體，且其尺寸介於約5與25個核苷酸、更佳約12與20個 核苷酸之間。 較佳經修飾寡核苷酸主鏈包括但不限於硫代磷酸酯、對 掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷 酸三酯、膦酸甲酯及其他膦酸烷基酯（包括膦酸3’-伸烷基 酯及對掌性膦酸酯）、次膦酸酯、胺基磷酸酯（包括胺基磷 酸3'-胺基酯及胺基磷酸胺基烷基酯）、硫羰基胺基磷酸 酯、膦酸硫羰基烷基酯、硫羰基烷基磷酸三酯、及具有常 157514.doc -56- 201209163 見3’-5’鍵聯之硼烷填酸酯、該等主鏈之2，-5'連接類似物、 及彼等具有反極性者（其中相鄰核苷單元對之連接由3，-5,變 為5'-3'或由2，-5'變為5'-2·)。亦包含各種鹽、混合鹽及游離 酸形式。 教示上述含構鍵聯之代表性美國專利包括但不限於美國 專利第 3,687,808號、第 4,469,863 號、第 4,476,3〇1號、第 5,023,243 號、第 5，177，196 號、第 5，188,897 號、第 5,264,423 號、第 5,276,019 號、第 5,278,3〇2 號、第 0 5,286,717 號、第 5,321，131 號、第 5,399,676 號、第 5,405,939 號、第 5,453,496 號、第 5,455,233 號、第 5,466,677 號、第 5,476,925 號、第 5,519，126 號、第 5,536,821 號、第 5,541，306 號、第 5,550,111.號、第 5,563,253 號、第 5,571，799 號、第 5,587 361 號及第 5,625,050號，每一者皆以引用方式併入本文中。 不含磷原子之較佳經修飾寡核苷酸主鏈具有藉由以下形 Q 成之主鏈：短鏈烷基或環烷基核苷間鍵聯、混合雜原子及 烷基或環烷基核苷間鍵聯、或一或多個短鏈雜原子或雜環 核苷間鍵聯。該等主鏈包括彼等具有嗎啉基鍵聯者（部分 自核苷之糖部分形成）；矽氧烷主鏈；硫化物、亞碱及砜 主鏈；曱醯乙醯基及硫代甲醯乙醯基主鏈；亞甲基甲醯乙 醯基及硫代甲醯乙醯基主鏈；含有烯烴之主鏈；胺基磺酸 酉旨主鏈；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；續酸酉旨及橫酿 胺主鏈：賴域；及其他具有混合N、〇、Sach2組成 部分者。 157514.doc -57- 201209163 教示上述募核苷之代表性美國專利包括但不限於美國專 利第 5,034,506 號、第 5,166,315 號、第 5,185,444 號、第 5,214，134 號、第 5,216，141 號、第 5,235,033 號、第 5,264,562 號、第 5,264,564 號、第 5,405,938 號、第 5,434,257 號、第 5,466,677 號、第 5,470,967 號、第 5,489,677 號、第 5,541，307 號、第 5,561,225 號、第 5,596,086 號、第 5,602,240 號、第 5,610,289 號、第 5,602,240 號、第 5,608,046 號、第 5,610,289 號、第 5,618,704 號、第 5,623,070 號、第 5,663,312 號、第 5,633,360號、第 5,677,437號、及第 5,677,439號，每一者 皆以引用方式併入本文中。 在其他較佳寡核苷酸模擬物中，核苷酸單元中之糖及核 苷間鍵聯（亦即主鏈）二者經新基團代替。保留鹼基單元以 與適宜核酸靶化合物雜交。一種該募聚化合物（已顯示具 有極佳雜交性質之寡核苷酸模擬物）稱為肽核酸（pNA)。在 PN A化σ物中，寡核苦酸中之糖_主鏈經含醯胺主鏈、特 疋而S胺基乙基甘胺酸主鏈代替。保留核鹼基且其與主鏈 t醯胺。卩刀之氮雜氮原子直接或間接結合。教示化合 物之製備之代表性美國專利包括但不限於美國專利第 5’539’082 號、第 5,714,331號、及第 5,719,262 號每—者 白乂引用方式併入本文中。pNA化合物之其他教示内容可 > 見奶613611 專人，science 254, 1497-1500。 "月貫知1例係具有硫代碌酸醋主鏈之寡核芽酸及具 有雜原子主鏈之寡核普’且特定而言係上文所提及美國專 157514.doc -58- 201209163 利第 5,489,677號中之-CH2-NH-0-CH2-、-CH2-N (CH3)-0-CH2-[稱為亞甲基（甲基亞胺基）或MMI主鏈]、-CH2-0-N(CH3)-CH2- ' -CH2N(CH3)-N(CH3) CH2-及-0-N(CH3)-CH2-CH2-[其中天然磷酸二酯主鏈表示為-0-P-O-CH2-]， 及上文所提及美國專利第5,602,240號中之醯胺主鏈。亦較 佳者係上文所提及美國專利第5,034,506號中之具有嗎啉基 主鏈結構之募核苷酸。 經修飾寡核苷酸亦可含有一或多個經取代糖部分。較佳 募核苷酸在2'位包括以下中之一者：OH ; F ; Ο-、S-或N-烷基、Ο-、S-或N-烯基；Ο-、S-或N-炔基；或Ο烷基-0-烷 基，其中烷基、烯基及炔基可係經取代或未經取代之C1至 C10烷基或C2至C10烯基及炔基。尤佳者係O (CH2)n OmCH3、0(CH2)n、OCH3、0(CH2)nNH2、0(CH2)nCH3、 0(CH2)nONH2、及 0(CH2n0N(CH2)nCH3)2，其中 n及 m可 為1至約10。其他較佳寡核苷酸在2'位包括以下中之一者： C1至C10低碳烷基、經取代低碳烷基、烷芳基、芳烷基、 0-烷芳基或 Ο-芳烷基、SH、SCH3、OCN、CM、Br、CN、 CF3、OCF3、SOCH3、S02CH3、0Ν02、Ν02、Ν3、 ΝΗ2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺 基、經取代曱矽烷基、RNA裂解基團、受體基團、嵌入 劑、改良寡核苷酸之藥物代謝動力學性質之基團、或改良 募核苷酸之藥效動力學性質之基團、及其他具有相似性質 之取代基。較佳修飾包括2'-曱氧基乙氧基（2’-0-CH2CH20CH3，亦稱為 2'-0-(2-曱氧基乙基）或 2，-ΜΟΕ)， 157514.doc -59- 201209163 亦即’烧氧基烷氧基。其他較佳經修飾包括2，-二甲基胺基 氧基乙氧基（亦即，0(CH2)20N(CH3)2基團，亦稱為2ι_ DMAOE，如下文實例中所述）、及2,_二甲基胺基乙氧基乙 氧基（業内亦稱為2，_〇_二曱基胺基乙氧基乙基或2ι_ DMAEOE ’ 亦即，2i_〇 CH2_〇_CH2 N (CH2)2)。 其他較佳修飾包括2，-曱氧基（2’-〇CH3)、2，-胺基丙氧基 (2'-0 CH2CH2CH2NH2)及2，-氟（2，-F)。亦可在募核苷酸上 之其他位置進行相似修飾，尤其係3,末端核苷酸上或2，_5, 連接寡核苷酸中糖之3,位及5,末端核苷酸之5,位。寡核苷酸 亦可具有糖模擬物，例如使用環丁基部分來代替戊呋喃糖 基糖。教示該等經修飾糖結構之製備之代表性美國專利包 括但不限於美國專利第4,981，957號、第5，118,800號、第 5,319,080 號、第 5,359,〇44 號、第 5,393,878 號、第 5,446，137 號、第 5,466,786 號、第 5,514,785 號、第 5,519，134 號、第 5,567,811 號、第 5,576,427 號、第 5,591,722 號、第 5,597,909 號、第 5,610,300 號、第 5,627,053 號、第 5,639,873 號、第 5,646,265 號、第 5,658’873 號、第 5,670,633 號及第 5,700,920號，每一者皆 以引用方式併入本文中。 寡核苷酸亦可包括核鹼基（業内通常簡寫為「鹼基」）修 飾或取代。本文所用之「未經修飾」或r天然」核苷酸包 括嗓呤驗基（腺嘌呤（A)及鳥嘌呤（G))及嘧啶鹼基（胸腺嘧啶 (T)、胞嘧啶（C)及尿嘧啶（u))。經修飾核苷酸包括其他合 成及天然核苷酸’例如5-甲基胞嘧啶（5-me-C)、5-羥曱基 157514.doc -60- 201209163 胞’咬、黃料、次黃„票吟、2_胺基腺㈣、腺嗓吟及鳥 嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2_丙 基及其他烷基衍生物、2_硫代尿嘧啶、2_硫代胸腺嘧啶及 2-硫代胞嘧啶、5_齒代尿嘧啶及胞嘧啶、5_丙炔基尿嘧啶 及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5_尿嘧啶 (假尿嘧啶）、4-硫代尿嘧啶、代、8_胺基、8_硫醇、8_ 硫代烷基、8-羥基及其他8_取代腺嘌呤及鳥嘌呤、5_鹵 代、尤其5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代尿嘧啶及胞嘧 咬、7-甲基鳥嘌呤及7_甲基腺嘌呤、8_氮雜鳥嘌呤及8氮 雜腺嗓吟、7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤及3_去氮鳥嗓吟 及3-去氮腺嗓吟。 另外’核苷酸包括彼等揭示於美國專利第3,687,8〇8號中 者、彼等揭示於 ’The Concise Encyclopedia of P〇lymer

Science And Engineering'，第 858-859頁，Kroschwitz，J.I. 編輯，John Wiley & Sons，1990中者、彼等由Englisch等 人’ 'Angewandle Chemie，International Edition'，1991, 30，第613頁揭示者、及彼等由Sanghvi, Y.S.，第15章， 'Antisense Research and Applications’，第 289-302 頁， Crooke，S.T.及Lebleu, B. ea.，CRC Press，1993揭示者。某 些該等核苷酸尤其用於增加本發明之募聚化合物之結合親 和力。該等核苷酸包括5-取代嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、 N-6及0-6取代嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿 嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。已顯示5-甲基胞嘧啶取代可將核 酸雙鏈體穩定性增加 0.6°C 至 1.2°C(Sanghvi，Y.S.，Crooke， 157514.doc -61 - 201209163 S.T.及 Lebleu，B.編輯 ’ 'Antisense Research and Applications', CRC Press, Boca Raton, 1993 > 第 276-278 頁） 且係當前較佳之驗基取代，甚至更尤其在與2'_〇甲氧基乙 基糖修飾組合時。 教示上述經修飾核苷酸以及其他經修飾核苷酸之製備之 代表性美國專利包括但不限於美國專利第3,687,8〇8號、以 及第 4,845,205 號、第 5，130,302 號、第 5,134,066 號、第 5，175,273 號、第 5,367,066 號、第 5,432,272 號、第 5,457，187 號、第 5,459,255 號、第 5,484,9〇8 號、第 5,502，177 號、第 5,525,711 號、第 5,552,54〇 號、第 5,587,469 號、第 5,596,091 號、第 5,614,617 號、第 5,750,692號及苐5,681，941號，每一者皆以引用方式併入本 文中。 對本發明寡核苷酸之另一修飾涉及使一或多種可增強寡 核苷酸之活性、細胞分佈或細胞攝取之部分或偶聯物以化 學方式連接至寡核苷酸。 該等部分包括但不限於脂質部分（例如膽固醇部分）、膽 酸、硫醚（例如，己基_s_三苯曱基硫醇）、硫代贍固醇、脂 肪族鏈(例如’十二烷二醇或十一烷基殘基)、磷脂(例如， 二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基銨1，2-二_〇_十六烷基_ 外消旋mH_膦酸醋）、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛^ 乙酸、棕櫚基部分、或十八胺或己基胺基·羰基-氧基膽固 醇部分。 教示該等募核普酸偶聯物之製備之代表性美國專利包括 157514.doc -62- 201209163 但不限於美國專利第4,828,979號、第4,948,882號、第 5,218,105 號、第 5,525,465 號、第 5,541，313 號、第 5.545.730 號、第 5,552,538 號、第 5,578,717 號、第 5.580.731 號、第 5,580,731 號、第 5,591，584 號、第 5，109，124 號、第 5,118,802 號、第 5，138,045 號、第 5,414,077 號、第 5,486,603 號、第 5,512,439 號、第 5,578,718 號、第 5,608,046 號、第 4,587,044 號、第 4,605,735 號、第 4,667,025 號、第 4,762,779 號、第 4,789,737 號、第 4,824,941 號、第 4,835,263 號、第 4,876,335 號、第 4,904,582 號、第 4,958,013 號、第 5.082.830 號、第 5，112,963 號、第 5,214,136 號、第 5.082.830 號、第 5,112,963 號、第 5,214,136 號、第 5,245,022 號、第 5,254,469 號、第 5,258,506 號、第 5,262,536 號、第 5,272,250 號、第 5,292,873 號、第 5,317,098 號、第 5,371,241 號、第 5,391,723 號、第 5,416,203 號、第 5,451,463 號、第 5,510,475 號、第 5,512,667 號、第 5,514,785 號、第 5,565,552 號、第 5,567,810 號、第 5,574,142 號、第 5,585,481 號、第 5,587,371 號、第 5,595,726 號、第 5,597,696 號、第 5,5"，923號、第 5,599，S>28號及第 5,688,941 號，每一者皆 以引用方式併入本文中。 濞#兮兌：亦可將本發明化合物加至藥物研究及靶驗證 之區域中。本發明涵蓋本文所鑑別化合物及較佳靶區段在 藥物研九中之用途，該藥物研究試圖闡釋bcl2結合部分 157514.doc •63· 201209163 聚料酸與疾病狀態、表現型、或病狀之間所存 在之闕係。該等方法包含檢測或調節BBC3聚核苦酸，其 包括使試樣、組織、細胞、或有機體與本發明化合物接 觸，，治療後某一時間量測BBC3聚核苦酸之核酸或蛋白 質含量及/或相關表現型或化學端點，及視需要比較量測 值與未處理試樣或經本發明令另一化合物處理之試樣。該 等方法亦可與其他實驗並行或組合實施以測定用於乾驗證 過程之未知基因的功能，或用以測定特定基因產㈣㈣ 於治療或預防特定疾病、病狀或表現型之的有效性。 評價基因表現之上調或抑制： 可藉由直接檢測細胞或有機體中核酸之存在來評價外源 核酸向宿主細胞或有機體中的轉移。該檢測可藉由業内= 知之若干方法來達成。例如，可藉由南方印跡或藉由聚= 酶鏈反應（PCR)技術使用特異性擴增與核酸有關之核普酸 序列之引物來檢測外源核酸的存在。亦可使用包含基因表 現分析在内之習用方法來量測外源核酸之表現。舉例而 言’可使用北方印跡及逆轉錄PCR(RT_pCR)來檢測及量化 自外源核酸產生之mRNA。 亦可藉由量測酶活性或報導子蛋白活性來檢測外源核酸 中譲之表現。舉例*言’可根躲核酸表現之降低或增 Μ間接量測反義調節活性’從而指示外源核酸在效應子 RNA中產生。基於序列保守性，可設計引物並用於擴增靶 基因之編碼區域。最初，可使用來自每一基因之最高表現 編碼區域來建立對照基因模型，但可使用任一編碼或非編 157514.doc •64- 201209163 碼區域。藉由將每一編碼區域插入報導子編碼區域與其 poly(A)信號之間來組裝每一對照基因。該等質粒將產生在 基因上游部分具有報導子基因且在1非編碼區域中具有潛 在RNAi靶之mRNA。藉由調節報導子基因來分析個別反義 寡核苷酸之有效性。用於本發明方法中之報導子基因包含 乙醯羥酸合酶（AHAS)、鹼性磷酸酶（AP)、β半乳糖苷酶 (LacZ)、β葡糖醛酸糖苷酶（GUS)、氯黴素乙醯轉移酶 (CAT)、綠色螢光蛋白（GFP)、紅色螢光蛋白（RFP)、黃色 螢光蛋白（YFP)、青色螢光蛋白（CFP)、辣根過氧化物酶 (HRP)、螢光素酶（Luc)、胭月旨鹼合酶（NOS)、章魚肉鹼合 酶（0CS)及其衍生物。可使用賦予以下物質抗性之多種可 選擇標記物：胺苄西林（ampicillin)、博來黴素 (bleomycin)、氯黴素（chloramphenicol)、慶大徽素 (gentamycin)、潮黴素（hygromycin)、卡那黴素 (kanamycin)、林可黴素（lincomycin)、甲胺蝶呤 (methotrexate)、草胺膦（phosphinothricin)、π票呤黴素 (puromycin)及四環素（tetracycline)。測定報導子基因之調 節的方法在業内已眾所周知，且包含但不限於螢光方法 (例如螢光光譜法、螢光活化細胞分選（FACS)、螢光顯微 術）、抗生素抗性測定。 可使用彼等熟習此項技術者已知及闡述於本文其他處之 方法來分析BBC3蛋白及mRNA表現。舉例而言，可使用諸 如ELISA等免疫分析來量測蛋白質含量。BBC3 ELISA分析 套組有市售，例如，購自R&D Systems (Minneapolis, 157514.doc -65- 201209163 MN)。 在實施例中，藉由與對照組試樣中之BBC3表現進行比 較來s平估使用本發明反義募核苷酸處理之試樣（例如，活 體内或活體外中之細胞或組織）中的BBC3表現（例如， mRNA或蛋白質）。舉例而言，可使用彼等熟習此項技術者 已知之方法來對蛋白質或核酸之表現與模擬處理或未處理 試樣進行比較。另一選擇為，可端視期望資訊來比較所處 里α式樣與對照組反義寡核普酸（例如，具有經改變或不同 序列者）。在另一實施例中，可使用經處理試樣與未處理 試樣中不同核酸（包含研究者認為適宜之任一標準，例 如，持豕基因）表現之差異來比較經處理試樣與未處理試 樣中BBC3蛋白質或核酸表現之差異。 可根據需要（例如）以比率或份數形式來表示所觀察之差 /、以用於與對知、組進行比較。在實施例中，相對於未處理 «式樣或經對照組核酸處理之試樣，經本發明反義寡核苷酸 處理之試樣中BBC3 mRNA或蛋白質之含量增加或降低約 1.25倍至約1〇倍或更高。在實施例中，BBC3 mRNA或蛋白 質之含量增加或降低至少約1.25倍、至少約13倍、至少約 1.4倍、至少約丄乃倍、至少約h6倍、至少約1 7倍、至少約 1.8倍、至少約2倍、至少約2_5倍、至少約3倍、至少約3 5 倍、至少約4倍、至少約4 _ 5倍、至少約5倍、至少約5 · 5 倍、至少約6倍、至少約6 · 5倍、至少約γ倍、至少約7.5 倍、至少約8倍、至少約8.5倍、至少約9倍、至少約9.5 倍、或至少約1〇倍或更高。 157514.doc -66 - 201209163 套'组、研究試劑、診斷及治療 本發明化合物可用於診斷、治療及預防，且可用作套組 2研究試劑及組份。另外，彼等熟習此項技術者通常使用 月b夠以強烈特異性抑制基因表現之反義募核苷酸來闡釋特 定基因之功能或區別生物途徑之各個成員的功能。 對於在套組及診斷及各種生物系統中之應用而言，本發 月化合物（單獨或與其他化合物或治療劑組合）可用作差值 0 及/或組合分析中之工具以闡釋細胞及組織内所表現基因 之—部分或整個補體的表現模式。 本文所用之術語「生物系統」或厂系統」定義為表現、 或使其足以表現BCL2結合部分3(BBC3)基因產物的任一有 機體、細胞、細胞培養物或組織。該等系統包含但不限於 類轉基因動物、細胞、細胞培養物、組織、異種移植 物、移植物及其組合。 根據一非限制性實例，對經一或多種反義化合物處理之 〇 細胞或組織内的表現模式與未經反義化合物處理之對照组 細胞或組織進行比較，且分析所得模式關於（例如）疾病相 關性、仏號傳導途徑、細胞定位、表現程度、所檢驗基因 之尺寸、結構或功能之基因表現的差異程度。該等分析可 • 在經刺激或未經刺激細胞中且在影響表現模式之其他化合 物存在或不存在下實施。 業内已知之基因表現分析之方法實例包含DNA陣列或微 陣列、SAGE(基因表現之系列分析）、之 限制性酶擴增）、TOGA(總體基因表現分析）、蛋白質陣列 157514.doc •67· 201209163 及蛋白組學、已表現序列標帥ST)測序、消減rna指紋 技術（surf)、消減選殖、差異顯示_、比較基因組雜 交、FISH(螢光原位雜交）技術及質譜方法。 本發明化合物可用於研究及診斷中，此乃因該等化合物 可與編碼BCL2結合部分3(BBC3)之核酸雜交。舉例而言， 在如本文所揭示可用#有效BBC3調節劑之該效率及該等 條件下雜交之募核苷酸在分別有利於基因擴增或檢測之條 件下係有效引物或探針。該等引物及探針可用於需要特異 性檢測編碼BBC3之核酸分子及擴增該等核酸分子以用於〇 檢測或用於其他BBC3研究的方法中。本發明之反義寡核 苷酸（尤其引物及探針）與編碼BBC3之核酸的雜交可藉由業 内已知方式進行檢測。該等方式可包含使酶與寡料酸偶 聯、放射性標記寡核皆酸、或任一其他適宜檢測方式。亦 可製造使用該等檢測方式檢測試樣令之B B C 3含量的套 彼等熟習此項技術者亦在治療應用中利用反義化合物之 特異性及敏感性。反義化合物已用作治療部分來治療動物 (匕3人類）之疾病狀態。反義寡核㈣藥物已安全且有效 人』且* U實施許多臨床試驗。由此確定，反義 力可為H又置用於治療細胞、組織及動物（尤其人 類）之治療方案申的有用治療方式。 '、 〇 #療 >才冑由投與本發明反義化合物來治療懷疑患有 2由調即BBC3聚核㈣之表現進行治療之 的動物㈣人類)。舉例而言，在一非限制性實施例 157514.doc -68 - 201209163 中，該等方法包括向需要治療之動物投與治療有效量之 BBC3調節劑之步驟。本發明之BBC3調節劑可有效調節 BBC3之活性或調節BBC3蛋白質之表現。在一個實施例 中，與對照組相比.，使BBC3在動物中之活性或表現抑制 約1 0%。較佳地，使BBC3在動物中之活性或表現抑制約 30%。更佳地，使BBC3在動物中之活性或表現抑制50%或 更高。因此，與對照組相比，寡聚化合物可將BCL2結合 部分3(BBC3)mRNA之表現調節至少10°/。、至少50%、至少 25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%、至少 98%、至少 99%、或 100%。 在一個實施例中，與對照組相比，使BCL2結合部分 3(BBC3)及/或在動物中之活性或表現增加約10%。較佳 地，使BBC3在動物中之活性或表現增加約30%。更佳地， 使BBC3在動物中之活性或表現增加50%或更高。因此，與 對照組相比，寡聚化合物可將BBC3 mRNA之表現調節至 少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少 50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或 100%。 舉例而言，可量測動物之血清、血液、脂肪組織、肝或 任一其他體液、組織或器官中BCL2結合部分3(BBC3)之表 現的增大或減小。較佳地，所分析之該等流體、組織或器 官内所含之細胞含有編碼BBC3肽及/或BBC3蛋白質本身的 157514.doc •69· 201209163 核酸分子。 可藉由將有效量之本發明化合物添加至適宜醫藥上可接 受之稀釋劑或載劑中來將該化合物用於醫藥組合物中。本 發明之化合物用途及方法亦可用於預防目的。 偶聯物 對本發明寡核普酸之另—修飾涉及使一或多種可增強募 核苦酸之活性、細胞分佈或細胞攝取之部分或偶聯物以化 學方式連接至寡核普酸。該等部分或偶聯物可包含共價社 合至諸如-級或二級經基等官能團之偶聯基團。本發明: 偶聯基團包含嵌入劑、報導子分子、聚胺、聚醯胺、聚乙 二醇，、增強寡聚物之藥效動力學性質之基團、及辦 強募聚物之藥物代謝動力學性質之基團。典型偶聯基圈： 含膽固醇、脂質、石粦脂、生物素、吩嗓、葉酸醋、菲咬、 “…定、螢光素、若丹明(―)、香豆素及染 :在本發明之上下文中’增強藥效動力學性質之基團包 3可改良攝取、增強降解抗性、及/或增強與㈣酸之序 列特異性雜交的基團。在本發明之上下文中，肖強藥物代 身動力學性質之基團包含可改良本發明化合物之攝取、分 佈、代謝或分泌的基團。代表性偶聯基團揭示於㈣㈣ 月23日提出中請之國際專利中請案第pcT/us92/()9⑼號、 及美國專利第6,287,86〇號中，其以引用方式併入本文中。 7聯部分包含但不限於脂質部分（例如膽固醇部分）、膽 巟醚（例如，己基-5-二苯甲基硫醇）、硫代膽固醇、脂 肪族鏈（例如，十二烧二醇或十—燒基殘基）、碟脂（例如， 157514.doc -70· 201209163 二-十六烷基-外消旋·甘油或三乙基銨丨，2_二_〇_十六烷基_ 外消旋-甘油-3-H膦酸酯）、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷 乙酸、棕櫚基部分、或十八胺或己基胺基_羰基_氧基膽固 醇部分。本發明之寡核苷酸亦可偶聯至活性藥物物質，例 如’阿司匹林（aspirin)、華法林（warfarin)、保泰松 (phenylbutazone)、布洛芬（ibuprofen)、舒洛芬 (suprofen)、芬布芬（fenbufen)、_ 洛芬（ket0pr0fen)、（S)- (+)-普拉洛芬（(S)-(+)-pranoprofen)、卡洛芬（carprofen)、 丹肌胺酸（dansylsarcosine)、2,3,5-三埃笨曱酸、氟芬那酸 (flufenamic acid)、亞葉酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮 呼、吲哚美辛（indomethicin)、巴比妥酸鹽、頭孢菌素 (cephalosporin)、磺胺藥、抗糖尿病藥、抗菌劑或抗生 素。 教示該等寡核苷酸偶聯物之製備之代表性美國專利包含 但不限於美國專利第4,828,979號、第4,948,882號、第 5,218，105 號、第 5,525,465 號、第 5,541，313 號、第 5.545.730 號、第 5,552,538 號、第 5,578,717 號、第 5.580.731 號、第 5,580,731 號、第 5,591，584 號、第 5，109，124 號、第 5，118,802 號、第 5，138,045 號、第 5,414,077 號、第 5,486,603 號、第 5,512,439 號、第 5,578,718 號、第 5,608,046 號、第 4,587,044 號、第 4,605,735 號、第 4,667,025 號、第 4,762,779 ·號、第 4,789,737 號、第 4,824,941 號、第 4,835,263 號、第 4,876,335 號、第 4,904,582 號、第 4,958,013 號、第 157514.doc •71- 201209163 5.082.830 號、 5.082.830 號、 5,245,022 號 ' 5,262,536 號 ' 5,317,098 號、 5,416,203 號、 5,512,667 號、 5,567,810 號、 第 5，112,963 號、第 5,214，136 號、第 第 5，112,963 號、第 5,214，136 號、第 第 5,254,469 號、第 5,258,506 號、第 第 5,272,250 號、第 5,292,873 號、第 第 5,371，241 號、第 5,391，723 號、第 第 5,451，463 號、第 5,510,475 號、第 第 5,514,785 號、第 5,565,552 號、第 第 5,574，142 號、第 5,585,481 號、第 5,587,371 號、第 5,595,726 號、第 5,597,696 號、第 5,599,923號、第 5,599,928號及第 5,688,941 號。 調配物 本發明化合物亦可與其他分子、分子結構或化合物混合 物（例如，脂質體、靶向受體之分子、經口、直腸、局部 或其他調配物）混合、囊封、偶聯或以其他方式結合以有 助於攝取、分佈及/或吸收。教示該等有助於攝取、分佈 及/或吸收之調配物之製備的代表性美國專利包含但不限 於美國專利第5，1〇8,921號、第5,354,844號、第5,416,016 號、第 5,459,127號、第 5,521,291 號、第 5,543,165 號、第 5,547,932 號、第 5,583,020 號、第 5,591，721 號、第 4,426,330 號、第 4,534,899 號、第 5,013,556 號、第 5，108,921 號、第 5,213,804 號、第 5,227,170 號、第 5,264,221 號、第 5,356,633 號、第 5,395,619 號、第 5,416,016 號、第 5,417,978 號、第 5,462,854 號、第 5,469,854 號、第 5,512,295 號、第 5,527,528 號、第 157514.doc •72· 201209163 5,534,259 號、第 5,543，152 號、第 5,556,948 號、第 5,580,575號及第5,595,756號，每一者皆以引用方式併入本 文中。 儘管為調節靶表現及/或功能不需要在載體背景中投與 反義募核苷酸’但本發明實施例係關於用於表現反義寡核 普酸之表現載體構成物’其包括啟動子、雜合啟動子基因 序列且具有較強組成型啟動子活性，或可在期望情形下誘 導之啟動子活性。 〇 在一實施例中’本發明實踐涉及使用適宜核酸遞送系統 投與上述反義寡核苷酸中之至少一者。在一個實施例中， 該系統包含可操作地連接至聚核苷酸之非病毒載體。該等 非病毒載體之實例包含僅寡核苷酸（例如，SEQ ID NO: 3 至8之任一者或多者）或與適宜蛋白質、多糖或脂質調配物 之組合。 另外’適宜核酸遞送系統包含病毒載體，其通常係來自 Q 腺病毒、腺病毒有關病毒（AAV)、辅助細胞依賴性腺病 毋、逆轉錄病毒、或日本脂質體血凝病毒（HVJ)複合物中 之至少一者之序列。較佳地’病毒載體包括可操作地連接 至I核苷酸之強真核生物啟動子（例如’巨細胞病毒（Cmv) 啟動子）。 另外’較佳载體包含病毒載體、融合蛋白及化學偶聯 物°逆轉錄病毒載體包含M〇i〇ney鼠類白企病病毒及基於 HIV的病毒。一種較佳之基於HIV的病毒載體包括至少兩 種載體’其中gag及P〇l基因來自HIV基因組且env基因來自 157514.doc -73- 201209163 另—病毒。dNA病毒載體較佳。該等載體包含ρ〇χ载體（例 如正痘病毒或鳥痘病毒載體)、皰疹病毒载體(例如單純皰 疹I病毒(HSV)载體)、腺病毒載體及腺有關病毒載體。’ 本發明之反義化合物涵蓋任一醫藥上可接受之鹽、酯、 或該等醋之鹽、或在投與動物（包含人類）後能夠提供接 或間接）生物活性代謝物或其殘基的任一其他化合物。 術語「醫藥上可接受之鹽」係指本發明化合物之生理上 及醫藥上可接受之鹽：亦即，可保留母體化合物之期望生 物活性且並不賦予其不期望毒理學效應之鹽。對於寡核普 酸而言，醫藥上可接受之鹽及其應用之較佳實例進一步闡 述於美國專利第6,287,860號中，其以引用方式併入本文 中。 本發明亦包含含有本發明之反義化合物之醫藥組合物及 調配物。端視期望局部抑或全身性治療及擬治療區域，本 發明之醫藥組合物可以各種方式投與。投與可為局部（包 含眼部投與及投與至黏膜，包含陰道及直腸遞送卜肺部 (例如，藉由吸入或噴射粉末或氣溶膠，包含藉由霧化 器）；氣管内、鼻内、表皮及經皮、經口或非經腸投與。 非經腸投與包含靜脈内、動脈内、皮下、腹膜腔内或肌内 注射或輸注，或顱内（例如，勒内或腦室内）投與。 為治療中樞神經系統中之組織，可藉由（例如）注射或輪 注至腦脊髓液中來進行投與。反義RNA在腦脊髓液中之投 與闡述於（例如）美國專利申請公開案第2〇〇7/〇117772號之 「Methods for —g familial ALS disease pr〇gressi〇n」 157514.doc -74- 201209163 中，其全部内容以引用方式併入本文中。 在意欲將本發明之反義募核普酸投與中樞神經系統之細 胞中時，可投與-或多種能夠促進標的反義寡核普酸渗透 經過血腦障壁之藥齊!。可在(例如)内。臭皮層或海馬區中進 行注射。藉由向肌肉組織中之運動神經元投與腺病毒載體 來遞送神經營養因子闡述於(例如)美國專利第M32,427 號之「Adenoviral-vector_mediated 卜咖⑷

medullary motor neur〇ns」中，其以引用方式併入本文 中。業内已知將載體直接遞送至腦（例如，紋狀體、丘 腦 '海馬區或黑質）t並闡述於（例如）美國專利第⑺乂⑵ 號之「Aden〇virus vectors f〇r加㈣咖〇f⑽如y⑽ into cells of the central nervous system particularly in bram」中’其以引用方式併人本文中。可藉由注射快速投 〃或Ik疋時間藉由緩慢輸注或投與緩釋調配物進行投 與。 〇 標的反義寡核㈣亦可與提供期望醫藥或藥效動力學性 質之藥劑連接或偶聯。舉例而言，反義寡核普酸可與業内 已知的促進渗透或輸送跨過血腦障壁之任一物質（例如鐵 傳遞蛋白受體之抗體）偶合，並藉由靜脈内注射投與。反 義化β物可與病毒載體連接，該病毒載體可（例如）使反義 化合物更有效及/或促進反義化合物輸送跨過血腦障壁。 亦可藉由（例如）輸注以下物質來破壞滲透性血腦障壁： 糖’包含但不限於内消旋赤藻糖醇、木糖醇、D㈩半乳 糖、D⑴乳糖、D(+)木糖、衛矛醇、肌_肌醇、L(_)果糖、 157514.doc -75- 201209163 D(-)甘露醇、D(+)葡萄糖、D(+)阿拉伯糖、D(-)阿拉伯 糖、纖維二糖、D(+)麥芽糖、D(+)棉子糖、L(+)鼠李糖、 D(+)蜜二糖、D㈠核糖、核糖醇、D(+)阿糖醇、L(-)阿糖 醇、D(+)岩藻糖、L㈠岩藻糖、D㈠來蘇糖、L(+)來蘇糖 及L(-)來蘇糖；或胺基酸，包含但不限於麩醯胺酸、離胺 酸、精胺酸、天門冬醯胺、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺 酸、甘胺酸、組胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯 胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、纈胺酸及牛磺酸。用於 增強血腦障壁滲透之方法及材料闡述於（例如）美國專利第 4,866,042號之「Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier」、第 6,294,520 號之 「Material for passage through the blood-brain barrier」及 第 6,936,589號之「Parenteral delivery systems」中.，其全 部内容皆以引用方式併入本文中。 本發明標的之反義化合物可與其他分子、分子結構或化 合物混合物（例如，脂質體、把向受體之分子、經口、直 腸、局部或其他調配物）混合、囊封、偶聯或以其他方式 結合，以有助於攝取、分佈及/或吸收。舉例而言，陽離 子型脂質可包含於調配物中以促進寡核苷酸攝取。一種顯 示可促進攝取之該組合物係LIPOFECTIN(購自018(：0-BRL, Bethesda，MD)。 據信，具有至少一個2'-0-曱氧基乙基修飾之寡核苷酸尤 其適用於經口投與。用於局部投與之醫藥組合物及調配物 可包括經皮貼片、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓 157514.doc -76- 201209163 劑、嘴霧劑、液體及粉末。可能需要或期望習用醫藥载 劑、水性、粉末或油性基質、增稠劑及諸如此類。經過塗 覆之避孕套、手套及諸如此類可能亦適用。 可便利地以單位劑型呈現之本發明醫藥調配物可根據醫 . f 4中熟知之習用技術製得。料技術包括使活性成份 . 與醫藥载劑（群）或賦形劑（群）結合之步驟。一般而言，調 配物可藉由使活性成份與液體載劑或微細固體載劑或二者 0 均勻且充分結合，且然後（若必要）使該產物成型來製備。 可將本發明組合物調配成許多可能劑型中之任一者，例 如但不限於錠劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿、軟質凝 膠、栓劑、及灌腸劑。本發明組合物亦可調配成存於水 性、非水性或混合介質中之懸浮液。水性懸浮液可進一步 含有可增加懸浮液黏度之物質，其包含（例如说甲基纖維 素鈉山柒糖醇及/或右旋糖酐。懸浮液亦可含有穩定 劑。 Ο I發明之醫藥組合物包括但不限於溶液、乳液、發泡體 及含有脂質體之調配物。本發明之醫藥組合物及調配物可 包括或多種渗透增強齊j、載齊1、賦形劑或其他活性或無 '活性成份》 札液通常係一種液體分散於另一液滴形式液體（直徑通 常超過〇_ι μιη)的不均相系統。乳液除分散相外亦可含有額 外組伤、及可存於水相、油相中呈現溶液形式或自身作為 刀離相的活性藥物。本發明一實施例包含微乳液。乳液及 其應用在業内已眾所周知且進一步闡述於美國專利第 157514.doc •77· 201209163 6,287,860號中。 本發明調配物包含脂質體調配物。本發明所用之術語 「脂質體」意指由兩親性脂質佈置成一或多個球形雙層所 組成的囊泡。脂質體係單層或多層囊泡，其具有自親脂性 材料形成之膜及含有擬遞送組合物之水性内部結構。陽離 子型脂質體係帶正電之脂質體，據信其可與帶負電之DnA 分子相互作用以形成穩定複合物。對pH敏感或帶負電之脂 質體據信可捕獲DNA而非與其複合。陽離子型及非陽離子 型脂質體皆可用於向細胞遞送DNA。 脂質體亦包含「空間穩定」之脂質體’本文所用之該術 語係指包括一或多種特定脂質之脂質體。在納入脂質體中 時’該等特定脂質會產生相對於缺乏該等特定脂質之脂質 體具有延長之循環壽命的脂質體。空間穩定脂質體之實例 係彼等脂質體中形成囊泡之脂質部分包括一或多種糖脂或 衍生自一或多種親水性聚合物（例如聚乙二醇（pEG)部分） 者。脂質體及其應用進一步闡述於美國專利第6,287,86〇號 中。 ，〜 本發明之醫藥調配物及組合物亦可包含表面活性劑。表 面活性劑在藥物產物、調配物及乳液令之應用在業内已眾 所周知。表面活性劑及其應用進一步闡述於美國專利第 6,287,860號中，其以引用方式併入本文中。 广個實施例中，本發明採用各種滲透增強劑來實現核 :楚、尤其寡核苦酸之有效遞送。除有助於非親脂性藥物在 胞膜中之擴散外，滲透增強劑亦增強親脂性藥物之洚透 157514.doc -78· 201209163 性。滲透增強劑可歸類為屬於5大類中之一者：亦即，表 面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑及非螯合性非表面活 性劑。滲透增強劑及其應用進一步閣述於 6取_號中，其以引用方式併入本文中。國專㈣ 熟習此項技術者應認識到’調配物通常根據其預期應用 (亦即投與途徑）來進行設計。 用於局部投與之較佳調配物包含彼等本發明寡核芽酸與 Ο

局部遞送劑混合者，該局部遞送劑係（例如）脂質、脂質 體、脂肪酸、脂肪酸醋、類固醇、螯合劑及表面活性劑。 較佳脂質及脂質體包含中性脂質及脂質體（例如二油酿基_ 码月曰醯基DOPE乙醇胺、二肉豆蔬酿基麟脂酿基膽驗 C 一硬月曰醯基磷脂醯基膽鹼）、負脂質及脂質體（例 如二肉豆謹醯基磷脂醯基甘油DMpG)及陽離子型脂質及脂 質體（例如二油酿基四甲基胺基丙基D〇TAp及二油酿基-麟 脂醯基乙醇胺DOTMA)。 ^ f於局。卩或其他投與而言，本發明之寡核普酸可囊封於 月曰質體内或可與其形成複合物（尤其陽離子型脂質體）。另 選擇為，寡核Μ可與脂質、尤其陽離子型脂質複合。 較佳月θ肪酸及S旨、其醫藥上可接受之鹽、及其應用進一步 闡述於美國專利第6,287,86〇號中。 ^ 2 = 口奴與之組合物及調配物包含粉末或粒子、微顆 r不米顆粒、存於水或非水性介質中之懸浮液或溶液、 '^凝膠膠囊、藥囊、錠劑或微錠劑。可能期望使用增 ^場味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劍或黏合劑。較 157514.doc -79- 201209163 佳口服調配物係彼等本發明募核苦 甘自欠與一或多種滲透增強 劑、表面活性劑及螯合劑聯合梪鱼本 又與考。較佳表面活性劑包 含脂肪酸及/或其酯或鹽、膽汁酸另/ τ暖及/或其鹽。較佳膽汁酸/ 鹽及脂肪酸及其應用進一步闡沭於i W連於美國專利第6,287,860號 中’其以引用方式併入本文中。，t h ^ 升又T 亦較佳者係滲透增強劑之 組合，例如，脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽之組合。尤佳之組合 係月桂酸之鈉鹽、癸酸及UDCA。苴从办* 。其他滲透增強劑包含聚 氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙嫌__加鈴純甘 乳C"碎20_鯨蠟基醚。本發明之寡 核芽酸可以粒子形式(包含噴霧乾燥顆粒、或經複合以形 成微顆粒或奈米顆粒）經口遞送。寡核*酸複合劑及其應 用進一步闡述於美國專利第6 287 # 乐b’287,860唬中，其以引用方式 併入本文中。 用於非經腸、勒内或心室内投與之組合物及調配物可包 含亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適宜添加劑之無菌水溶 液，該等其他適宜添加劑係（例如）但不限於滲透增強劑、 載劑化合物及其他醫藥上可接受之載劑或賦形劑。 本發明某些實施例提供含有一或多種寡聚化合物及一或 多種藉由非反義機制發揮作用之其他化學治療劑之醫藥組 合物。該等化學治療劑之實例包含但不限於癌症化學治療 藥物例如柔紅黴素（daunorubicin)、道諾黴素 (daunomycin)、更生黴素（dactjn〇mycin)、多柔比星 (doxorubicin)、表柔比星（epirubicjn)、伊達比星 (idarubicin)、依素比星（es〇rubicin)、博來黴素、馬磷醯胺 (mafosfamide)、異環磷醯胺（if〇sfamide)、胞嘧啶阿糖核苷 157514.doc 201209163

(cytosine arabinoside)、亞石肖脲氮齐（bischloroethyl-nitrosurea)、白消安（busulfan)、絲裂黴素 C(mitomycin C)、 放線菌素D(actinomycin D)、 光輝黴素 (mithramycin) 、潑 尼松(prednisone) 、經 孕酮 (hydroxyprogesterone)、睪酮（testosterone)、他莫昔芬 (tamoxifen)、達卡巴嗪（dacarbazine)、丙卡巴肼 (procarbazine)、六曱三聚氰胺（hexamethylmelamine)、五 甲三聚氣胺（pent ame thy lmel amine)、 米托蒽西昆 (mitoxantrone)、安 °丫 α定（amsacrine)、苯丁 酸氮芥 (chlorambucil)、環己亞石肖脲（methylcyclohexylnitrosurea)、氮 芥（nitrogen mustards)、美法侖（melphalan)、環墻酿胺 (cyclophosphamide)、6-酼 口票呤（6-mercaptopurine)、6-硫鳥 嗓吟（6-thioguanine)、阿糖胞苦（cytarabine)、5-氮雜胞普 (5-azacytidine)、經基脲（hydroxyurea)、喷司他丁 (deoxycoformycin)、4-經基過氧環鱗酿胺、5-氟尿痛咬（5-fluorouracil) (5-FU)、5-敗去氧尿 ^(5-fluorodeoxyuridine) (5-FUdR)、曱胺蝶呤（MTX)、秋水仙鹼（colchicines)、紫杉 醇（taxol)、長春新驗（vincristine)、長春驗（vinblastine)、 依託泊戒（etoposide)(VP-16)、三曱曲沙（trimetrexate)、伊 立替康（irinotecan)、托泊替坎（topotecan)、吉西他濱 (gemcitabine)、替尼泊武（teniposide)、順舶（cisplatin)及己 稀雌紛（diethylstilbestrol)(DES)。在與本發明化合物一起 使用時，該等化學治療劑可單獨（例如，5-FU及寡核苷 酸）、依序（例如，5-FU及寡核苷酸，隨後在一定時間之後 157514.doc -81 - 201209163 係MTX及募核苷酸）、或與一或多種其他該等化學治療劑 組合（例如，5-FU、MTX及寡核苷酸，或5_Fu、放射療法 及寡核苷酸）使用。抗炎藥（包含但不限於非類固醇抗炎藥 及皮質類固醇，以及抗病毒藥，包含但不限於利巴韋林 (ribivirin)、阿糖腺苷（vidarabine)、阿昔洛韋（acycl〇vir)及 更昔洛韋（ganciclovir))亦可組合於本發明組合物中。反義 化合物及其他非反義藥物之組合亦屬於本發明範疇内。兩 種或更多種組合之化合物可一起或依序使用。 在另一相關實施例中，本發明組合物可含有一或多種靶 向第一核酸之反義化合物（尤其募核苷酸）及一或多種靶向 第二核酸靶之額外反義化合物。舉例而言，第一靶可為 BCL2結合部分3(BBC3)之特定反義序列，且第二靶可為來 自另-核苷酸序列之區$。另—選擇為，I發明組合物可 含有兩種或更多種乾向同一 BCL2結合部分3⑽c3)核酸起 之不同區域的反義化合物。反義化合物之諸多實例闇釋於 本文中且其他實例可選自業内已知之適宜化合物。兩種或 更多種組合之化合物可一起或依序使用。 投藥： 據信，彼等熟習此項技術者應瞭解治療性組合物之調配 及其隨後之投與(投藥)。投藥取決於欲治療疾病狀態之嚴 重程度及反應性，其中治療過程可持續數天至數月，或直 至實現治癒或減輕疾病狀態為止。可藉由量測患者體内之 樂物積累來計算最適投藥方案。孰 π 呆热各此項技術者可容易地 確疋农適劑量、投藥方法及重 吸疋手。敢適劑量可端視個 1575l4.doc -82- 201209163 別寡核普酸之相對功效而有所變化，且通常可基於發現在 活體外及活體内動物模型中有效之£(：5〇進行估計。一般而 :，劑量為0.01 叫/kg體重至100 mg/kg體重，且可每曰、 母週、每月或每年給予一次或更多次，或甚至每2至20年 給予一次。熟習此項技術者可容易地基於體液或組織中藥 物之所量測滯留時間及濃度來估計投藥的重複速率。成功 治療後，可期望使患者維持該療法以預防疾病狀態復發， 〇 其中以介於0.01 pg/kg體重至100 mg/kg體重之間之維持劑 量投與寡核苷酸，且每日投與一次或更多次至每20年投與 一次。 在實施例中，使用以下劑量之藥物來治療患者：至少約 1 mg/kg體重、至少約2 mg/kg體重、至少約3 mg/kg體重、 至少約4 mg/kg體重、至少約5 mg/kg體重、至少約6 mg/kg 體重、至少約7 mg/kg體重、至少約8 mg/kg體重、至少約9 mg/kg體重、至少約1〇 mg/kg體重、至少約μ mg/kg體重、 Q 至少約20 mg/kg體重、至少約25 mg/kg體重、至少約3〇 mg/kg體重、至少約35 mg/kg體重、至少約40 mg/kg體重、 至少約45 mg/kg體重、至少約50 mg/kg體重、至少約6〇 mg/kg體重、至少約70 mg/kg體重、至少約80 mg/kg體重、 至少約90 mg/kg體重或至少約1〇〇 mg/kg體重。反義寡核芽 酸之某些注射劑量闡述於（例如）美國專利第7,563,884號之 「Antisense modulation of PTP1B expression」中，其全部 内容以引用方式併入本文中。 儘管上文已闡述本發明之各個實施例，然而，應理解， 157514.doc -83 - 201209163 該等實施例僅係以實例方式而非限制方式提供。可根據本 文之揭示内容對所揭示實施例作出諸多改變，此並不背離 本發明之精神或料。因此，本發明之廣度及料不應受 上述實施例中之任一者限制。 又 本文所提及之所有文件皆以引用方式併入本文中。出於 所有目的’在本中請案中引用之所有出版物及專利文件皆 係乂引用方式併入，其併入程度如同每一個別出版物或專 利文件係單獨闡述一般。對於此文件中引用之各個參考文 獻，申請者不承認任一特定參考文獻係其發明之「先前技 術」。本發明組合物及方法之實施例闡釋於下列實例中。 實例 以下非限制性實例用於闡釋本發明之所選實施例。應瞭 解，所示組份之元素之比率變化及代替物已為彼等熟習此 項技術者所明瞭且屬於本發明實施例之範疇内。 實例1 :對BCL2結合部分3(BBC3)之反義核酸分子及,或 BBC3聚核苷酸之正義鏈具有特異性之反義寡核苷酸的設計 如上所述，術語「對…具有特異性之募核苷酸」或「無 向…之寡核苷酸」係指具有如下序列之募核苷酸··（i)能 夠與乾向基因之一部分形成穩定複合物，或（ii)能夠與乾 向基因之mRNA轉錄物之一部分形成穩定雙鏈體。

藉由使用電腦程式（例如IDT AntiSense Design, IDT

OligoAnalyzer)來促進適當募核苷酸之選擇，該等電腦程 式自動鑑別每一給定序列中之19-25個核苷酸之子序列， 該等子序列與靶聚核苷酸序列形成雜合體且具有期望熔融 157514.doc • 84 - 201209163 溫度（通常為50°C至60°C )，且不會形成自身二聚體或其他 複雜二級結構。 藉由使用自動對準核酸序列並指示一致性或同源性區域 之電腦程式來進一步促進適當寡核苷酸的選擇。使用該等

程式藉由（例如）搜索諸如GenBank等數據庫或藉由對PCR 產物測序來比較所獲得的核酸序列。對來自給定基因組中 一定範圍基因及基因間區域之核酸序列進行比較使得可選

擇對目標基因顯示適當特異性程度的核酸序列。該等程序 使得可選擇對給定基因組中之靶核酸序列顯示高互補性程 度且對其他核酸序列顯示較低互補性程度絲核苦酸。熟

習此項技術者應認識到，可在較大範圍中選擇適用於本發 明中之基因區域。 X 可特異性雜交」：化合物 在以下情形時反義化合物係 與乾核酸之結合可干擾乾核酸之正常功能以調節功能及/ 或活性’且存在足夠互補性程度以避免反義化合物斑非乾 核酸序列在期望發生特異性結合之條件下(亦即，在活體 内分析或治療性治療情形中之生理條件下，及在活體外分 析情形中實施分析之條件下）發生非特異性結合。 ^ 本文所述寡料酸之雜交性f可藉由業内已°知之 個活體外分析進行測^。舉例而言 八iff、&丨—蜡由使用炼融曲線 刀^測疋無天錢義分子與潛在藥物分子間之結合強度來 獲得本文所述寡核苷酸之性質。 又 =量測分子間相互作用之強度之已確立方法中的任 一者（例如’㈣曲線分析）來估料天然反義分子與潛在 157514.doc •85· 201209163 藥物分子（分子）間之結合強度。 熔融曲線分析可測定對於天然反義分子/分子複合物自 雙鏈快速轉變成單鏈形態時之溫度。此溫度已廣泛接受作 為兩個分子間相互作用強度之可靠量度。 可使用實際天然反義RNA分子之cDNA拷貝或對應於分 子結合位點之合成DNA或RNA核苷酸來實施熔融曲線分 析。可使用含有所有必需試劑以實施此分析之多個套組 (例如 Applied Biosystems公司，MeltDoctor套組）。該等套 組包含含有雙鏈DNA (dsDNA)結合染料（例如ABI HRM染 料、SYBR Green、SYTO等）中之一者的適宜缓衝溶液。 dsDNA染料之性質在於其幾乎不發射游離形式之螢光，但 在與dsDNA結合時具有高螢光性。 為實施分析，以由特定製造商方案界定之濃度將cDNA 或相應寡核苷酸與分子混合。將混合物加熱至95°C以離解 所有預形成之dsDNA複合物，然後缓慢冷卻至室溫或由套 組製造商界定之其他較低溫度以使DNA分子退火。然後將 新形成複合物缓慢加熱至95°C，同時繼續收集關於反應中 所產生螢光之量的數據。螢光強度與反應中存在之dsDNA 量成反比。可使用與套組相容之實時PCR儀器（例如ABI’s StepOne Plus 實時 PCR 系統或 lightTyper 儀器，Roche Diagnostics, Lewes, UK)來收集數據。 藉由使用適當軟體（例如lightTyper (Roche)或SDS Dissociation Curve, ABI)繪製螢光相對於溫度之負導數 (-d(螢光）/dT)，y轴）與溫度（X軸）的圖線來構建熔融峰。分 157514.doc -86- 201209163 析數據以確定自dsDNA複合物快速轉變成單鏈分子時之、田 度。此溫度稱為Tm且與兩個分子間之相互作用強度成= 比。通常，Tm高於40。(：。 實例2 : BBC3聚核苷酸之調節 使用反義募核苷酸處理MCF-7細胞 實例2中所用之所有反義募核普酸皆如實例丨中所述進行 没计。指示製造商（IDT公司，Coralville，IA)來製造所設計 之硫代磷酸酯鍵寡核苷酸並提供表丨中所示之所設計硫代 磷酸酯類似物。核苷酸間之星形符號表示存在硫代磷酸酯 鍵。實例2中之實驗所需的寡核苷酸可使用任一適當技術 狀態之方法來合成’例如IDT所用之方法：在固體載體（例 如5微米定孔玻璃珠（CPG))上使用亞磷醯胺單體（常見核苷 酸，其所有活性基團皆經保護基團保護，例如糖上之三苯 甲基、A及C上之苯曱醢基及G上之N-2-異丁酿基）。保護 基團在寡核苷酸合成期間可防止發生不期望之反應。在合 ◎ 成過程結束時去除保護基團。經由3,碳使初始核苷酸連接 至固體載體且在3'至5,方向上進行合成。在以下4步中向生 長之募核苷酸鏈中添加新鹼基：1)使用三氣乙酸自固定核 苷酸之5’氧處去除保護基團；2)使用四唑使經固定核苷酸 與序列中之下一個核苷酸偶合至一起；經由四唑基亞磷醯 胺中間體使反應繼續進行；3)洗滌除去未反應之游離核苷 酸及反應副產物且將未反應之固定募核苷酸封端以防止其 參與下一輪合成；藉由使用乙酸酐及N-曱基咪唑對游離5, 經基實施乙醯化來達成封端；4)為穩定核苷酸間之鍵，使 157514.doc -87- 201209163 用姨及水（若欲產生構酸二酯鍵）、或Beaucage試劑（3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物）（若期望硫代磷酸酯鍵）來 氧化磷。藉由交替使用兩種氧化劑，可構建嵌合主鏈。對 於序列中之每一核苷酸而言，皆重複上述4步循環。合成 完整序列時，在高溫下使用氫氧化銨自固體載體解離寡核 苷酸並實施去保護。藉由去鹽來洗滌除去保護基團且將剩 餘寡核苷酸凍乾。為實施實例2中所設計之實驗，在37°C 及5% C02下於生長培養基（MEM/EBSS(Hyclone目錄編號： SH30024，或 Mediatech 目錄編號：MT-10-010-CV)+10% FBS(Mediatech 目錄編號：MT35-011-CV)+ 青黴素 (penicillin)/鏈黴素（streptomycin)(Mediatech 目錄編號： MT30-002-CI))中生長來自ATCC之MCF-7細胞（目錄編號： HB-22)。在實驗前一天，以1.5χ105個細胞/ml之密度將細 胞再次平鋪於6孔板中並在37°C及5% C02下培育過夜。在 實驗當天，將6孔板中之培養基更換為新鮮生長培養基。 將由製造商以凍乾形式運送之寡核苷酸在不含 RNAse/DNAse之去離子水中稀釋至濃度為20 μΜ。將2 μΐ 此溶液與400 μΐ OptiMEM培養基（Gibco目錄編號：31985-070)及 4 μΐ Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄編號： 11668019)在室溫下一起培育20 min，然後逐滴施加至6孔 板中具有MCF-7細胞之一個孔中。使用包含2 μΐ水代替寡 核苷酸溶液之相似混合物作為模擬轉染對照組。在37°C及 5% C02下培育3至18 h之後，將培養基更換為新鮮生長培 養基。添加反義寡核苷酸48 h後，去除培養基，且使用來 157514.doc •88· 201209163 自Promega之SV Total RNA分離系統（目錄編號：Z3105)或 來自Qiagen之RNeasy Total RNA分離套組（目錄編號·· 74181)根據製造商說明書自細胞提取RNA。將6〇〇 ng提取 之RNA添加至使用來自Thermo Scientific之Verso cDNA套 組（目錄編號：AB1453B)或高容量cDNA逆轉錄套組（目錄 編號：4368813)實施的逆轉錄反應中，如製造商方案中所 述。使用來自此逆轉錄反應之cDNA藉由實時PCR使用ABI Taqman Gene Expression Mix(目錄編號：4369510)及由 ABI 設計之引物 / 探針（Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay ： Hs00248075_m 1 > Applied Biosystems 公司，Foster City CA)來監測基因表現。使用stepOne Plus 實時PCR機器（Applied Biosystems)來實施下列PCR循環： 在50°C下保持2 min，在95°C下保持10 min，40個循環之 (在95 C下保持15秒，在60°C下保持1 min)。基於經處理及 模擬轉染試樣間18S標準化dCt值之差值來計算使用反義寡 核苷酸處理後基因表現的變化倍數。 潜耒.·實時PCR結果顯示，在使用設計為BBC3反義 mRNA CA306306之寡核苷酸處理48 h之後，MCF-7細胞中 之BBC3 mRNA之含量顯著增加（圖1) 〇 實例3 :用耙向PUMA特異性天然反義轉錄物之反義募核苦 酸處理後原代人類纖維母細胞中的細胞凋亡程度增大 在實例3中’在原代人類纖維母細胞中以20 nM之最終濃 度測試靶向PUMA特異性天然反義轉錄物之反義寡核苷 酸。以下數據確認’經由調節PUMA特異性天然反義轉錄 157514.doc •89· 201209163 物之功能來上調PUMA mRNA與如由TUNEL分析測定之細 胞凋亡程度增大有關。 材料及方法 用乾向#異磔天资及4 #錄勿之及J募核苷酸處 理次托乂庸.鐵襻母鈿虑。於37。(：及5% C02下使由Dr. N-Kenyon (University of Miami)引入培養基中之原代人類 皮膚纖維母細胞在由a-MEM(Gibco，目錄號：12561- 056)+10% FBS(Mediatech，目錄號：35-015 CV)+l〇/〇 Antimycotic-Antibiotic(Gibco，目錄號：15240-062)組成 之生長培養基中生長。使用Next Day方法用反義募核苷酸 處理細胞。在實驗前一天，以約2X1 〇5個細胞/孔之密度將 細胞平鋪於生長培養基中之6孔板中並在37°C及5% C02下 培育過夜。第二天，將6孔板中之培養基更換為新鮮培養 基（1.5 ml/well)並對細胞投與反義募核苷酸。所有反義募 核普酸均係由IDT公司（Coralville，IA)製造。所有寡核苷酸 之序列列於表1中。將寡核苷酸之儲存溶液於不含 DNAse/RNAse之無菌水中稀釋至20 uM之濃度。向一個孔 中投與2 ul此溶液與400 ul 〇pti_MEM培養基（Gibc〇目錄編 號：31985-070)及 4 ul Lip〇fectamine 2000 (Invitrogen 目錄 編號：11668019)，將其在室溫下一起培育2〇 min，且逐滴 施加至6孔板中具有細胞之一個孔中。使用包含2 ul水代替 寡核苷酸溶液之相似混合物作為模擬轉染對照組。使用相 同濃度之無活性募核苷酸CUR-1 505作為無活性對照組。 在37 C及5% C〇2下培育約18 h之後，將培養基更換為新鮮 157514.doc •90- 201209163 生長培養基。添加反義寡核苷酸48小時後，去除培養基並 使細胞胰蛋白酶化並以約70,000個細胞/孔之密度重新平鋪 於96孔板中。在37°C及5% C〇2下培育24小時後，使用細胞 進行TUNEL細胞凋亡分析。 . rt/见知虑源亡分於。使用HT Titer TACS分析套組根 據製造商之說明書（Trevigen目錄編號：4822-96-K)檢測細 胞中之細胞凋亡程度。簡言之，將細胞固定於3.7%緩衝曱 醛溶液（Sigma-252549)中，用 PBS 及 100% 甲醇（Sigma_ 〇 厘1775-1〇八）沖洗並在用於分析之前在+4°(：下儲存於80%乙 醇（Sigma-493511)中。為標記DNA斷裂，去除乙醇，且使 用PB S洗務細胞並與蛋白酶K溶液在室溫下一起培育15分 鐘，在水及PBS中沖洗，然後與TACS核酸酶溶液在37°C下 一起培育10分鐘。培育後，使用PBS沖洗細胞，且添加過 氧化氫溶液（Sigma-MKBD1394)。在室溫培育5分鐘後，於 室溫下將細胞與1X TdT標記缓衝液一起培育5分鐘，然後 q 丟棄缓衝液。隨後將細胞與標記反應混合物在37。(：下一起 培育一小時，然後添加lx TdT終止缓衝液並保持5分鐘。 標記反應停止後，使用PBS洗蘇細胞，與Strep-HRP溶液在 ’ 室溫下一起培育10分鐘，使用PBS/Tween洗務且與TACS蘭 寶石在暗處一起培育30分鐘。藉由添加0.2N HC1 (Fluka-343102)來停止反應，且在450 nm下於板讀數儀中讀取吸 光度。除非另有說明，否則上述所有溶液均係以HT Titer TACS分析套組供應。 .结耒，如圖2中所示，在用20 nM靶向PUMA特異性天然 157514.doc •91- 201209163 反義轉錄物之反義寡核苷酸處理後，原代人類纖維母細胞 中之細胞凋亡程度增大超過5倍，該反義寡核苷酸先前顯 示可上調PUMA mRNA含量（圖1，實例2)。與經具有類似 化學性質之無活性寡核苷酸處理的對照組試樣相比，此上 調顯著。結果指示，使用靶向PUMA特異性天然反義轉錄 物之寡核苷酸上調PUMA mRNA可上調功能PUMA蛋白並 增大細胞 >周亡程度。 實例4 :用靶向PUMA特異性天然反義轉錄物之反義寡核普 酸處理的原代人類纖維母細胞中的降低增殖能力 在實例4中’測試靶向PUMA特異性天然反義轉錄物之反 義寡核苷酸抑制原代人類纖維母細胞之菌落形成的能力。 以下數據確認，經由調節PUMA特異性天然反義轉錄物之 功能來上調PUMA mRNA可使寡核苷酸處理之細胞中的增 殖降低。 材料及方法 選產#立分#。於37°C及5% C02下使由Dr. N.Kenyon (University of Miami)引入培養基中之原代人類皮膚纖維母 細胞在由 a-MEM(Gibco，目錄號：12561-056)+10% FBS(Nlediatech ’ 目錄 . 35-015 CV)+1% Antimycotic-

Antibiotic(Gibco，目錄號：1 5240-062)組成之生長培養基 中生長。使用Next Day方法用反義寡核苷酸處理細胞。在 實驗前一天，以約2x 105個細胞/孔之密度將細胞平鋪於生 長培養基中之6孔板中並在37°C及5% C02下培育過夜。第 -一天’將6孔板中之培養基更換為新鮮培養基（1.5 ml/well) 157514.doc -92- 201209163 並對細胞投與反義寡核。所有反義寡核苦酸均係由 IDT公司（C〇ralviUe，IA)製造。所有寡核苷酸之序列列於表 1中。將寡核苷酸之儲存溶液於不含DNAse/RNAse之無菌 水中稀釋至20 uM之濃度。向一個孔中投與2 ul此溶液與 400 ul Opu-MEM 培養基（Gibco 目錄編號：31985-070)及 4 ui Lipofectamine 2000 (invitrogeng 錄編號：ι1668〇19)， 將其在室溫下一起培育2〇 min，且逐滴施加至6孔板中具 有細胞之一個孔中。使用包含2 ul水代替募核苷酸溶液之 相似混合物作為模擬轉染對照組。使用相同濃度之無活性 券核苷酸CUR-1505作為對照組。在37°C及5% C02下培育 約1 8 h之後’將培養基更換為新鮮生長培養基。添加反義 寡核苦酸48小時後，去除培養基並使細胞胰蛋白酶化並以 約5000個細胞/孔之密度重新平鋪於6孔板中。將板於 3 7°C、5% C〇2下培育5至7天直至形成3至10個細胞之菌 落°固定菌落並為具有更好可視性而使用存於95%乙醇中 之0.25 % 1,9-二曱基-亞曱基藍（sigma Aldrich，目錄號 34，108.8)染色並用PBS沖洗。對菌落進行計數並將其數量 與經無活性募核苷酸處理之對照孔及經模擬轉染對照組進 行比較。 .结果’如圖3中所示，與經無活性寡核苷酸及模擬轉染 對照組處理之細胞相比，由經靶向PUMA特異性天然反義 轉錄物之反義募核苷酸處理之原代纖維母細胞形成的菌落 的數量減少。結果指示，由反義募核苷酸上調之PUMA mRNA產生功能蛋白並減少活體外細胞增殖。 157514.doc •93- 201209163 儘管已根據一或多個實施方案闡釋及闡述了本發明，但 熟習此項技術者在閱讀並理解本說明書及附圖後可作出等 效改變及修改。此外，儘管可能只根據多種實施方案中之 一者揭示了本發明之特定特徵，但該特徵可與其他實施方 案之一或多個其他特徵組合，此對於任何給定或特定之應 用而言可能係合乎要求且有利的。 本揭示内容之摘要使得讀者可快速地確定技術揭示内容 之性質。提交本摘要係基於以下理解：其並非用於解釋或 限制下列申請專利範圍之範疇或含義。 【圖式簡單說明】 圖1顯示藉由投·與MCF7細胞靶向PUMA特異性天然反義 轉錄物之反義寡核苷酸的PUMA mRNA之上調。對MCF7乳 腺癌細胞系投與20 nM靶向PUMA特異性天然反義轉錄物 之不同反義寡核苷酸（CUR-1675、CUR-1676、CUR-1677 、 CUR-1678 及 CUR-1679) 。 投與48h後 ，藉由 逆轉錄 (RT)實時聚合酶鏈反應（PCR)對PUMA mRNA進行定量。基 於經投與細胞（向細胞中添加CUR募核苷酸）與模擬細胞（未 向細胞中添加寡核苷酸）之間之1 8S標準化差值計算因 PUMA mRNA之募核苷酸處理的相對表現變化。表示為 CUR-1675、CUR-1676、CUR_1677、CUR-1678 及 CUR-1679之條形 分別對應於經SEQ ID NO: 3 至 7處理之試樣。 圖2顯示用靶向PUMA特異性天然反義轉錄物之反義寡核 苷酸處理後之原代人類纖維母細胞中的細胞凋亡程度的增 大，如由TUNEL分析所測定。CUR-1675-先前顯示上調 157514.doc -94· 201209163 PUMA mRNA之靶向PUMA天然反義轉錄物的寡核苷酸； CUR-1505-具有類似化學性質之無活性寡核苷酸。.表示 為CUR-1675及CUR-1505之條形分別對應於使用SEQ ID NO: 3及8處理之試樣。***指示Ρ<0·001 圖3顯示用靶向PUMA特異性天然反義轉錄物之反義寡核 苷酸處理之原代人類纖維母細胞中的降低增殖能力，如由 選殖發生分析所測定。CUR-1675-先前顯示上調PUMA mRNA之靶向PUMA天然反義轉錄物的寡核苷酸；CUR-1505- 具有 類似化 學性質 之無活 性寡核 苷酸。 表示為 CUR-1675 及 CUR-1509 之條形分別對應於使用 SEQ ID NO: 3及 8 處理之試樣。*指示Ρ<0·05。 序列表說明-SEQ ID NO: 1 :智人（Homo sapiens) BCL2 結合部分3(BBC3)，轉錄物變體3，mRNA(NCBI登錄號： NM_001127242); SEQ ID NO: 2:天然 BBC3反義序列 (CA3 06306) ; SEQ ID NO: 3至8 :反義寡核苷酸。*表示硫 代磷酸酯鍵。 157514.doc 95- 201209163 序列表 <110>美商歐科可娜有限責任公司 <120>藉由抑制BCL2結合部分3 (BBC3)之天然反義轉錄物以治療BBC3相關疾病 <130> BBC3 <140> 100124653 <141> 2011-07-12 <150> 61/363,535 <151> 2010-07-12 <160> 8 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 1347 <212> m <213 >智人 <400> 1 gaggegattg cgattgggtg agacccagta aggatggaaa gtgtagagga gacaggaatc 60

Ο cacggctttg gaaaaaggaa ggacaaaact caccaaacca gageagggea ggaagtaaca 120 atgagaaact gaaaaagaaa cggaatggaa agetatgaga caggatgaaa tttggcatgg 180 ggtctgccca ggcatgtcca tgccaggtgc ccagggctgc ttccacgacg tgggtcccct 240 gccagatttg tgagacaaga ggagcagcag cggcaccgcc cctcaccctg gagggtcctg 300 tacaatctca tcat£ggact cctgccctta cccaggggcc acagagcccc egagatggag 360 cccaattagg tgcctgcacc cgcccggtgg acgtcaggga ctcggggggc aggcccctcc 420 cacctcctga caccctggcc agcgcggggg actttctctg caccatgtag catactggac 480 tcccagccct gcctgtcccg ggggcgggcc ggggcagcca ctccagcccc agcccagcct 540 ggggtgcact gaeggagatg cggactcctg ggtccctggc caagaagcca ggagagggac 600 ggctgatgga ctcagcatcg gaaggtggcg gtgaccgagg gggtggggac tgagccgccc 660 gcctctgccg cccaccacca tctcaggaaa ggctgttgtg ctggtgcccg ttccagctgc 720 aggggtgaca ctgggagggg ggggctctcc tctcggtgct ccttcactct gggcctggcc 780 tcaggcccct ggtgcttccc cccctcctcc tgggaggggg cccgtgaaga gcaaatgagc 840 caaacgtgac cactagcctc ctggagccag agagtggggc tcgtttgccg gttgctccag 900 cccggcgccc agccatcttc cctgagccag ccggcgggtg gtgggcatgc ctgcctcacc 960 ttcatcaggg ggtggccagg aggggcccag actgtgaatc ctgtgctctg cccgtgaccg 1020 ccccccgccc catcaatccc attgeatagg tttagagaga gcacgtgtga ccactggcat 1080 tcatttgggg ggtgggagat tttggctgaa gccgccccag ccttagtccc cagggccaag 1140 cgctgggggg aagacgggga gtcagggagg gggggaaatc teggaagagg gaggagtetg 1200 ggagtgggga gggatggccc agcctgtaag atactgtata tgcgctgctg tagataccgg 1260 aatgaatttt ctgtacatgt ttggttaatt ttttttgtac atgatttttg tatgtttcct 1320 tttcaataaa atcagattgg aacagtg 1347 <210> 2 <211> 689 <212> DNA <213>智人 <400> 2 cttttctttt ctttttttag taaagatggg gtctcattat gttgcccagg ttggtctcaa 60 actcctgggc tcaa£tgatc ctccctcctt ggcctcccaa agtgcctgga ttatggtcat 120 157514-序列表.doc 201209163 gaggcaccat gcccagcccc ggaatgttct tatttstttg tttgtttgta gagacagggt 180 ctcactatgt tgcccaggct ggtctcaaat tccagacctc aagcaatcgt tcatccttga 240 cctcccaaaa tgctgggatt acaggtgtga gccaccacac cggcctataa tgttcttttg 300 agaagaaaat gagtgtgaag gatagtg££a atctggcttg gtggctggag gtagaaaaga 360 tggggasagg ccaagagtct atttggccat aagcgttatc actagtcaaa atcctcccca 420 cagctgggcg tggtggctca cgtctgcaat cccagtatca cggaaggccg agatgggtgg 480 atcacctgag cccaggagtt ccagaccagc ctgggcaaca tgcggaaacc taactgggga 540 ggctggggtg ggaggaacgc ttgagcctgt gaggtcgagg ctgcagtagg ctgtgatcgc 600 acattgcact ccagcttggg cgacagagcg agaccctttc tcaaaaaaaa aaaaaacggc 660 atggccgcgg ccctcgtgcc gaattcttg 689 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>反義募核苷 <400> 3 ccaccaagcc agattcccac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>反義募核苷 <400> 4 atccacccat ctcggccttc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>反義寡核苷 <400> 5 aggctcaagc gttcctccca 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>反義寡核苷 <400> 6 cccagttagg tttccgcatg t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>反義募核苷 -2 - 157514-序列表.doc 201209163 <4〇0> 7 tctgtcgccc aagctggagt <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>反義寡核苷 <400> 8 cctctccacg cgcagtacat

157514-序列表.doc

Claims (1)

1. 201209163 七、申請專利範圍·· 1. 一種在活體外調節生物系統中BCL2結合部分3(BBC3)聚 核苷酸之功能及/或表現的方法，其包括：使該系統與至 少一種長度為5至30個核苷酸之反義寡核苷酸接觸，其 中該至少一種寡核苷酸與BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷 酸之天然反義轉錄物的反向補體具有至少50%的序列一 致性；由此調節該BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之功 能及/或表現。 Ο 2.如請求項1之調節生物系統中BCL2結合部分3(BBC3)聚 核苷酸之功能及/或表現的方法，其包括：使該生物系統 與至少一種長度為5至30個核苷酸之反義寡核苷酸接 觸，其中該至少一種寡核苷酸與聚核苷酸之反向補體具 有至少50%的序列一致性，該聚核苷酸包括SEQ ID NO: 2之天然反義轉錄物核苷酸1至689内之5至30個連續核苷 酸；由此調節該BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之功能 及/或表現。 〇 3. —種在活體外調節患者細胞或組織中BCL2結合部分 3(BBC3)聚核苷酸之功能及/或表現的方法，其包括：使 , 該等細胞或組織與至少一種長度為5至30個核苷酸之反 義寡核苷酸接觸，其中該寡核苷酸與該BCL2結合部分 3(BBC3)聚核苷酸之反義寡核苷酸具有至少50%的序列一 致性；由此在活體外調節患者細胞或組織中該BCL2結合 部分3(BBC3)聚核苷酸之功能及/或表現。 4. 如請求項3之調節患者細胞或組織中BCL2結合部分 157514.doc 201209163 3(BBC3)聚核苷酸之功能及/或表現的方法，其包括：使 該生物系統與至少一種長度為5至30個核苷酸之反義寡 核苷酸接觸，其中該至少一種寡核苷酸與聚核苷酸之反 向補體具有至少50%的序列一致性，該聚核苷酸包括 SEQ ID NO: 2之天然反義轉錄物核苷酸1至689内之5至30 個連續核苷酸；由此調節該BCL2結合部分3(BBC3)聚核 苷酸之功能及/或表現。 5 _ 一種在活體外調節生物系統中BCL2結合部分3 (BBC3)聚 核苷酸之功能及/或表現的方法，其包括：使該系統與至 少一種乾向該BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之天然反 義寡核苷酸中區域之反義募核苷酸接觸；由此調節該 BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之功能及/或表現。 6. 如吻求項5之方法，其中該BCL2結合部分3(BBC3)在活 體外之功能及/或表現比對照組增加。 7. 如π求項5之方法，其中該至少一種反義寡核苷酸靶向 BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之天然反義序列。 8·如：求項5之方法’纟中該至少一種反義寡核苷酸靶向 核I序列，該核酸序列包括BCL2結合部分3(BBC3)聚核 苷酸之編碼及/或非編碼核酸序列。 9·如响求項5之方法，其中該至少一種反義寡核苷酸靶向 σ。4分3(BBC3)聚核苷酸之重疊及/或非重最 列。 且々' 1 0.如請求項5 $ f、土 ^ . _ 一〆夕 方法，其中该至少一種反義募核苷酸包括 5個k自以下之修飾：至少一個經修飾糖部分、至 157514.doc 201209163 少一個經修飾核苷間鍵聯、至少一個經修飾核苷酸及其 組合。 11.如請求項10之方法，其中該 選自以下之經修飾糖部分： 或多個修飾包括至少 經2'-〇-甲氧基乙基修飾 一個 之糖 部分、經2，·甲氧基修飾之糖部分、經2,_q_㈣修飾之糖 部分、二環糖部分及其組合。 12. 如請求項1〇之方法，其中該—或多個修飾包括至少一個 選自以下之經修飾核苦間鍵聯：硫代磷酸酯、2,_〇甲氧 基乙基(ΜΟΕ)、2’-氟、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、硫 代膦酸烷基醋、胺基磷酸醋、胺基甲酸酿、碳酸醋、磷 酸三酯、胺基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。 13. 如請求項10之方法，其中該一或多個修飾包括至少一個 選自以下之經修飾核苦酸：肽核酸（ρΝΑ)、鎖核酸 (LNA)、阿糖核酸（FANA)、其類似物、衍生物及組合。 14. 如請求項1之方法，其中該至少一種寡核苷酸包括至少 一個闡述為SEQ ID NO: 3至8之寡核苷酸序列。 15. —種在活體外調節哺乳動物細胞或組織中BCL2結合部分 3(BBC3)基因之功能及/或表現的方法，其包括：使該等 細胞或組織與至少一種長度為5至3 〇個核苷酸之短干擾 RNA(siRNA)募核苷酸接觸，該至少一種siRNA寡核苷酸 對BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之反義聚核苷酸具有 特異性，其中該至少一種siRNA寡核苷酸與該BCL2結合 部分3(BBC3)聚核苷酸之反義及/或正義核酸分子中至少 約5個連續核酸之互補序列具有至少5〇%的序列一致性； 157514.doc 201209163 及在活體外調節哺乳動物細胞或組織中之結合部分 3(BBC3)之功能及/或表現。 16. 如味求項15之方法，其中該寡核苷酸與具有至少約$個 連續核酸之序列具有至少8〇%的序列一致性，該序列與 該BCL2結合部分3(BBC3)聚核苦酸之反義及/或正義核酸 分子互補。 17. 種在,¾•體外6周_哺乳動物細胞或、组織中队[2結合部分 3(BBC3)之功施及/或表丨見的方法，丨包括：使該等細胞 或組織與至少一種長度為約5至30個核苷酸之反義寡核 苷馱接觸，δ亥反義寡核苷酸對8(：]^2結合部分3(BBC3)聚 核苷酸之正義及/或天然反義鏈之非編碼及/或編碼序列 具有特異性’其令該至少一種反義寡核苷酸與至少一個 闡述為SEQ ID NO: 1及2之核酸序列具有至少5〇%的序列 一致性，及在活體外調節哺乳動物細胞或組織中該bcL2 結合部分3(BBC3)之功能及/或表現。 18. —種反義券核苷酸之用途，其用以製造用於調節生物系 統中BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之功能及/或表現的 藥劑’其中該募核苷酸之長度為5至3 〇個核苷酸且與 BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之天然反義轉錄物之反 向補體具有至少50%的序列一致性。 19. 如睛求項18之用途’其中該寡核苷酸與包括SEq id Ν〇· 2之天然反義轉錄物核苷酸1至689内之5至30個連續核苦 酸之聚核苷酸之反向補體具有至少5〇%的序列一致性。 20. —種反義寡核苷酸之用途，其用以製造用於調節患者細 157514.doc 201209163 胞或組織中BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之功能及/或 表現的藥劑，其中該反義寡核苷酸之長度為5至30個核 苷酸且與該BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之反義寡核 苷酸具有至少50%的序列一致性。 21. 如請求項20之用途，其中該寡核苷酸與包括SEQ ID NO: 2之天然反義轉錄物核苷酸1至689内之5至30個連續核苷 酸之聚核苷酸之反向補體具有至少50%的序列一致性。 22. —種反義寡核苷酸之用途，其用以製造用於調節生物系 統中BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之功能及/或表現的 藥劑，其中該反義寡核苷酸靶向該BCL2結合部分 3(BBC3)聚核苷酸之天然反義寡核苷酸的區域。 23. 如請求項22之用途，其中該BCL2結合部分3(BBC3)在活 體内之功能及/或表現比對照組增加。 24. 如請求項22之用途，其中該反義寡核苷酸靶向BCL2結合 部分3(BBC3)聚核苷酸之天然反義序列。 25. 如請求項22之用途，其中該反義寡核苷酸靶向包括BCL2 結合部分3(BBC3)聚核苷酸之編碼及/或非編碼核酸序列 之核酸序列。 26. 如請求項22之用途，其中該反義寡核苷酸靶向BCL2結合 部分3(BBC3)聚核苷酸之重疊及/或非重疊序列。 27. 如請求項22之用途，其中該反義寡核苷酸包括一或多個 選自以下之修飾：至少一個經修飾糖部分、至少一個經 修飾核苷間鍵聯、至少一個經修飾核苷酸及其組合。 28. 如請求項27之用途，其中該一或多個修飾包括至少一個 157514.doc 201209163 選自以下之經修飾糖部分：經2，-〇-甲氧基乙基修飾之糖 部分、經2，-甲ft基修飾之糖部分、經2,_〇_炫基修飾之糖 部分、二環糖部分及其組合。 29. 如請求項27之用途，其中該—或多個修飾包括至少一個 選自以下之經修飾核苦間鍵聯：硫代磷酸醋、2,_〇甲氧 基乙基（ΜΟΕ)、2，-說、膦酸燒基酯、二硫代磷酸醋、硫 代膦酸烷基醋、胺基磷酸輯、胺基甲酸醋、碳酸醋、磷 酸三酿、胺基乙酸醋、羧甲基酯及其組合。 30. 如請求項27之用途，其中該一或多個修飾包括至少一個 選自以下之經修飾核苷酸：肽核酸（ρνα)、鎖核酸 (LNA)、阿糖核酸（FANA)、其類似物、衍生物及組合。 31. 如請求項18之用途，其中該寡核苷酸包括至少一個闡述 為SEQ ID NO: 3至8之寡核苷酸序列。 32. —種短干擾RNA (siRNA)募核苦酸之用途，其用以製造 用於調節哺乳動物細胞或組織中BCL2結合部分3(BBC3) 基因之功能及/或表現的藥劑’其中該siRNA募核苦酸之 長度為5至30個核音酸且對BCL2結合部分3(BBC3)聚核 苷酸之反義聚核苷酸具有特異性，其中該siRNA募核苦 酸與該BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之反義及/或正義 核酸分子中之至少約5個連續核酸之互補序列具有至少 5 0 %的序列一致性。 33·如清求項32之用途’其中該养核苦酸與具有至少約$個 連續核酸之序列具有至少80%的序列一致性，該序列與 該BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之反義及/或正義核妒 157514.doc 201209163 分子互補。 34. —種反義寡核苷酸之用途，其用以製造用於調節哺乳動 物細胞或組織中BCL2結合部分3(BBC3)之功能及/或表現 的藥劑’其中該反義募核苷酸之長度為約5至30個核苷 酸且對BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之正義及/或天然 反義鏈之非編碼及/或編碼序列具有特異性，其中該反義 寡核苷酸與至少一個闡述為SEQ ID N〇: 之核酸序列 具有至少50%的序列一致性。 〇 35. —種包括至少—個修飾之合成的經修飾寡核苷酸，其中 該至少一個修飾選自：至少一個經修飾糖部分、至少一 個經修飾核苷酸間鍵聯、至少一個經修飾核苷酸及其組 口，其中β亥券核苷酸係在活體内或活體外與bcl2結合部 分3(BBC3)基因雜交且與正常對照組相比，可調節該 BCL2結合部分3(BBC3)基因之功能及/或表現之反義化合 物’且其中該募核苷酸與至少約5個連續核酸之序列具 ❹ 有至少50°/°的序列一致性，該序列與該BCL2結合部分 3(BBC3)聚核苷酸之反義及/或正義核酸分子及其等位基 因、同系物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或 、組合互補。 36. 如請求項35之募核苷酸，其中該募核苷酸之長度為5至 30個核苦酸，且與該BBC3基因之天然反義轉錄物内5至 30個連續核苷酸之反向補體具有至少5〇%的序列一致 性。 37. 如請求項36之募核苷酸，其中該至少一個修飾包括選自 157514.doc 201209163 由以下組成之群之核苷酸間鍵聯：硫代磷酸酯、膦酸院 基酯、二硫代磷酸酯、硫代膦酸烷基酯、胺基磷酸酯、 胺基曱酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、胺基乙酸酯、羧甲基 酯及其組合。 3 8.如請求項36之募核苷酸，其中該寡核苷酸包括至少一個 硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。 39. 如請求項36之募核苷酸，其中該募核苷酸包括硫代磷酸 酯核苷酸間鍵聯之主鏈。 40. 如請求項36之募核苷酸，其中該募核苷酸包括至少一個 經修飾核苷酸，該經修飾核苷酸選自：肽核酸、鎖核酸 (LNA)、其類似物、衍生物及組合。 41 ·如請求項3 6之募核苷酸，其中該寡核苷酸包括複數個修 飾’其中該等修飾包括選自以下之經修飾核苷酸：硫代 磷酸酯、膦酸烧基酯、二硫代磷酸酯、硫代膦酸烷基 酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯、碳酸酯 '磷酸三酯、胺 基乙酸醋、缓甲基S旨及其乡且合。 42. 如請求項36之募核苷酸，其中該寡核苷酸包括複數個修 飾，其中該等修飾包括選自以下之經修飾核苷酸：肽核 酸、鎖核酸（LNA)、其類似物、衍生物及組合。 43. 如請求項36之募核苷酸，其中該寡核苷酸包括至少一個 選自以下之經修飾糖部分：經2，_〇_甲氧基乙基修飾之糖 部分、經2'-曱氧基修飾之糖部分、經2，_〇_烷基修飾之糖 部分、二環糖部分及其組合。 44. 如請求項36之寡核苦酸，其中該寡核苦酸包括複數個修 157514.doc 201209163 飾’其中該等修飾包括選自以下之經修飾糖部分：經2，_ 〇-曱氧基乙基修飾之糖部分、經2，·曱氧基修飾之糖部 分、經2，-〇-烷基修飾之糖部分、二環糖部分及其組合。 45. 如請求項36之寡核苷酸，其中該寡核苷酸之長度為至少 約5至30個核苷酸且與BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸 之反義及/或正義鏈雜交，其中該寡核苷酸與該BCL2結 合部分3(BBC3)聚核苷酸之反義及/或正義編碼及/或非編 碼核酸序列中至少約5個連續核酸之互補序列具有至少 約60%的序列一致性。 46. 如請求項36之寡核苷酸，其中該寡核苷酸與該8(：1^結合 部分3(BBC3)聚核苷酸之反義及/或正義編碼及/或非編碼 核酸序列之至少約5個連續核酸之互補序列具有至少約 8 0 %的序列一致性。 47. 如請求項36之寡核苷酸，其中該募核苷酸在活體内或活 體外與至少一種BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸雜交， 並相對於正常對照組，可調節該BCL2結合部分3(BBC3) 聚核苷酸之表現及/或功能。 48. 如請求項36之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括閉述為 SEQ ID NO: 3至8之序列。 49. 一種醫藥組合物，其包括一或多種如請求項35之對一或 多種BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸具有特異性之寡核 苷酸及醫藥上可接受之賦形劑。 50. 如請求項49之組合物，其中該等寡核苷酸與闡述為seq ID NO: 3至8之核苷酸序列中之任一者比對，具有至少約 157514.doc 201209163 40%的序列一致性。 51. 如請求項49之組合物，其中該等寡核苷酸包括闡述為 SEQ ID NO: 3至8之核苷酸序列。 52. 如請求項51之組合物，其中該等闡述為SEQ ID NO: 3至8 之养核苷酸包括一或多個修倚或取代。 53·如請求項52之組合物，其中該一或多個修飾選自··硫代 磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、鎖核酸（LNA)分子及其組 合。 54. —種反義募核苷酸之用途，其用以製造用於預防或治療❹ 與至 種BCL2結合部分3(BBC3)聚核普酸及/或其至少 一種編碼產物有關之疾病的藥劑，其中該反義寡核苷酸 與5亥至少一種BCL2結合部分3(BBC3)聚核苷酸之天然反 義序列結合並調節該至少一種BCL2結合部分3⑺BC3)聚 核苷酸的表現。 55. 如请求項54之用途，其中與該至少一種8〇^2結合部分 3(BBC3)聚核苷酸有關之疾病選自：與BBC3之異常功能 及/或表現有關之疾病或病症、癌症、增殖性疾病或病 症' 與細胞增殖有關或特徵在於細胞增殖之疾病或病 狀、與BBC3之突變或異常表現或功能有關之疾病或病 症、神經疾病或病症、發炎、以發炎關節成為病變之— · 部分的病狀（例如，骨關節炎、關節炎、牛皮癬性關節 . 炎、幼年型關節炎、萊特爾氏症候群 syndrome)、與潰瘍性結腸炎有關之關節炎、惠伯爾病 (Wlnpple’s disease)、與肉芽腫回腸結腸炎有關之關節 157514.doc -10- 201209163 56. Ο 57. 58. 59. 〇 60. 61. 炎貝切特氏病（Behcet's disease)、全身性紅斑狼瘡、 乾燥症候群（Sjogrenis syndr〇me)及混合型結締组織病 等）、與粒線體細胞凋亡途徑損傷有關之疾病或病症、自 體免疫性疾病或病症，及與神經元細胞死亡有關之疾病 或病症、衰老或特徵在於不期望細胞損失之其他病狀。 一種活體外誘導生物系統中之細胞凋亡的方法，其包括 向该系統投與募核苷酸，該募核苷酸之長度為5至30個 核苷酸且與BBC3聚核苷酸之天然反義轉錄物之反向補體 内的5至30個連續核苷酸至少50。/。一致。 如咕求項56之方法，其中該天然反義轉錄物具有犯〇 IDNO·· 2 〇 如β求項56之方法，其中該生物系統係患者細胞或組 織。 種活體外誘導生物系統中之細胞凋亡的方法，其包括 向该系統投與長度為約5至30個核苷酸之募核苷酸，其 中邊寡核苦酸藉由靶向靶基因之天然反義轉錄物來上調 δ亥基因’且其中該募核苷酸與該經上調基因之天然反義 轉錄物的反向補體至少5〇%一致。 一種募核苷酸之用途，其用以製造用於誘導生物系統中 之、、’田胞〉周亡之藥劑’其中該募核苷酸之長度為5至3 0個 核苦酸且與BBC3聚核苷酸之天然反義轉錄物之反向補體 内的5至3〇個連續核苷酸至少5〇%一致。 如β求項60之用途’其中該天然反義轉錄物具有SEq IDNO: 2。 157514.doc -11 - 201209163 Μ.如請求項6G之用途，其中該生物系統係患者細胞或組 織。 63· -種寡核苦酸之用途，其用以製造用於誘導生物系統中 之、、田胞/周亡之帛劑，其中該募核普酸之長度為約5至W 個核苷酸且藉由靶向靶基因之天然反義轉錄物來上調該 基因且其中該养核苷酸與該經上調基因之天然反義轉 錄物之反向補體至少5〇% —致。 64. —種鑑別及選擇至少一種對作為選定靶聚核苷酸之 基因之天然反義轉錄物具有選擇性之寡核苷酸供於活體 内投與之方法，該方法包括：鑑別至少一種包括至少5 個連續核苷酸的寡核苷酸，該等至少5個連續核苷酸與 "亥選疋乾聚核皆酸之反義聚核苦酸至少部分互補；在嚴 格雜交條件下量測反義募核苷酸與該靶聚核苷酸或該選 疋乾聚核苷酸之反義聚核苷酸之雜合體的熱熔點；及基 於所獲得資訊選擇至少一種寡核苷酸用於活體内投與。 157514.doc 12-