TW201120043A - Fused pyrazine compounds as their salts, useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases - Google Patents

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201120043 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一類能夠結合絲胺酸/蘇胺酸激酶之活性 位點之呈鹽形式之稠合吡畊化合物，該絲胺酸/蘇胺酸激 酶之表現涉及於導致細胞外基質（ECM)降解、關節退化及 涉及此降解及/或發炎之疾病的路徑中。 涉及細胞外基質降解之疾病包括（但不限於）牛皮癣性關 節炎、青少年關節炎、早期關節炎、反應性關節炎、骨關 節炎、類風濕性關節炎、僵直性脊椎炎（ankyl〇sing spondylitis)、骨質疏鬆症、肌肉骨路疾病（如肌腱炎及牙 周病（periodontal disease))、癌症轉移（cancer metastasis)、 呼吸道疾病（COPD、哮喘）、腎及肝纖維化、心血管疾病 (如動脈粥樣硬化症（atherosclerosis)及心臟衰竭（“州 failure))及神經學疾病（如神經發炎及多發性硬化症）。主要 涉及關節退化之疾病包括（但不限於）牛皮癬性關節炎、青 少年關節炎、早期關節炎 '反應性關節炎、類風濕性關節 炎、骨關節炎及僵直性脊椎炎。 類風濕性關節炎（RA)為一種慢性關節退化疾病，其特徵 在於關節結構發炎及破壞。當該疾病未受抑制時，其由於 關節功能性之喪失而導致實質性殘廢及疼痛且甚至導致過 早死亡s此，RA療法之目的不在於延緩疾病而在於獲 得緩解以阻止關節破壞。除疾病後果之嚴重性外，RA之 高發病率（全世界約08%之成人受影響）亦意謂巨大社會經 濟影響。（對於關於RA之評述，參見Sm〇le4Steiner 151374.doc 201120043 (2003) ; Lee及 Weinblatt (2001) ; Choy 及 Panayi (2001); O’Dell (2004)及 Firestein (2003))。 儘管廣泛接受RA為一種自體免疫疾病，但關於驅動該 疾病之「引發階段（initiation stage)」之確切機制並未達成 一致意見。所知曉的為初始觸發物在易感染宿主中會介導 導致各種細胞類型（B-細胞、T-細胞、巨嗟細胞、纖維母細 胞、内皮細胞、樹突狀細胞等）活化之事件級聯。伴隨於 此，觀測到關節及關節周圍組織中各種細胞激素（例如 TNF-α、IL-6、IL-1、IL-15、IL-18 等）的產生增加。當疾 病發展時，細胞活化及細胞激素產生級聯變得具有自身延 續性（self-perpetuating)。在此早期時，關節結構之破壞已 極其明顯。30%患者在診斷時具有骨侵蝕之放射照相跡象 且此比例在兩年後增加至6〇%。 對RA患者關節之組織學分析明確表明RA相關之退化過 程中所涉及的機制。此分析顯示造成⑽目關之關節退化 的主要效應物為血管翳（pannus) ’其中滑液纖維母細胞藉 由產生多種蛋白水解酶而成為軟骨及骨侵敍之主要驅動者 (dnVer)。傳統上，關節含有兩塊相鄰骨，其由關節連接於 軟骨層上且由滑膜及關節囊包圍。在晚期RA患者中，關 節滑膜之尺寸因滑液纖維母細胞增殖及單核細胞（諸如，Τ_ 細胞細胞' 單核球H細胞及嗜中性白血球）浸潤 而增加》從而形成血營。二Μελ 血管繫介導相鄰軟骨之退化， 從而導致關節間隙變窄，且有可能侵入相鄰骨及軟骨。因 為骨及軟骨組織分別主要由1型或η型膠原蛋白構成，所以 151374.doc 201120043 血管翳之破壞性及侵襲性係由溶膠原蛋白酶（主要為基質 金屬蛋白酶（MMP))之分泌來介導。在軟骨下方且與軟骨 相鄰之骨的侵蝕亦為RA過程之一部分，且主要由骨與血 管翳之界面處存在破骨細胞引起。破骨細胞為在黏附至骨 組織後形成封閉隔室（compartment)之多核細胞，在該封閉 隔室内破骨細胞分泌降解骨組織之蛋白酶（組織蛋白酶 K(Cathepsin K)、MMP9)。關節中之破骨細胞群體因由活 化SF及T-細胞分泌NFkB配位體之受體活化劑（RANKL)所 誘發的自前驅細胞形成骨母細胞而異常增加。 多種膠原蛋白類型在確定細胞外基質（ECM)之穩定性中 起關鍵作用。舉例而言，I型膠原蛋白及II型膠原蛋白分別 為骨及軟骨之主要組分。膠原蛋白通常組織成稱為膠原蛋 白原纖維之多聚體結構。天然膠原蛋白原纖維對蛋白水解 裂解極具抗性。已報導僅少數類型之ECM降解蛋白質具有 降解天然膠原蛋白之能力，該等ECM降解蛋白質為MMP及 組織蛋白酶。在組織蛋白酶中，主要在破骨細胞中具有活 性之組織蛋白酶K已經充分表徵。在MMP中，已知 MMP1、MMP2、MMP8、MMP13 及 MMP14 具有溶膠原 性。滑液纖維母細胞（SF)對MMP1之表現增加與關節炎疾 病之進展之間的關係為吾人所公認且可預示關節侵蝕過程 (Cunnane等人，2001)。因此，在RA之情形下，MMP1表 示高度相關之膠原蛋白降解蛋白質。在活體外，用與RA 病變相關之細胞激素（例如TNF-α及IL1P)處理培養之SF將 增加此等細胞對MMP1之表現（Andreakos等人，2003)。因 151374.doc 201120043 此，監測由SF表現之MMP1之含量為rA領域中之相關讀數 (readout)，因為其指示SF向活體内造成軟骨退化之侵蝕性 表型的活化。抑制SF表現MMP1表示一種治療尺八之有價值 治療方法。 ECM降解蛋白質之活性亦可導致不同於RA之各種疾病 (如例如涉及關節退化之其他疾病）或與該等疾病進展相 關。此等疾病包括（但不限於）牛皮癣性關節炎 '青少年關 節炎、早期關節炎、反應性關節炎、骨關節炎及僵直性脊 椎炎。可用根據本發明及使用如本文所述涉及於MMP表現 之標靶鑑別出的化合物治療之其他疾病為骨質疏鬆症、肌 肉骨路疾病（如肌腱炎及牙周病）（Gap ski等人，2004)、癌 症轉移（Coussens等人，2002)、氣管疾病（C〇pd、哮 喘KSuzuki等人，2004)、肺纖維化、腎纖維化（Schanstra 等人’ 2002)、與慢性C型肝炎相關之肝纖維化（Reiff等 人，2005)、心血管疾病（如動脈粥樣硬化症及心臟衰 竭）（Creemers等人，2001)及神經學疾病（如神經發炎及多 發性硬化症）（Rosenberg，2002)。罹患此等疾病之患者可受 益於使ECM穩定（藉由保護其免遭降解）。 經鑑別為有絲分裂原活化蛋白激酶·活化蛋白激酶 5(MAPKAPK5或PRAK)之471個胺基酸之絲胺酸/蘇胺酸激 酶表現於廣大組織中。該蛋白質在N末端含有其催化域且 在其C末端含有核定位信號（NLS)及核輸出信號（NES)兩 者。儘管内源性MAPKAPK5主要存在於細胞質中，但細胞 之應激（stress)或細胞激素活化介導其易位進入核中（New 151374.doc 201120043 等人，2003)。此事件視MAPKAPK5之磷酸化而定。 Thrl82為MAPKAPK5之調控性磷酸化位點。儘管ρ38α激酶 能夠在過度表現環境中使ΜΑΡΚΑΡΚ5磷酸化，但關於内源 性ΜΑΡΚΑΡΚ5之實驗並不支持此假設（Shi等人，2003)。已 產生可存活及能生育之MAPKAPK5基因剔除小鼠。此等小 鼠之表型與缺乏MAPKAPK2(—種受p38調控之MAPKAPK5 相關激酶）之小鼠的表型極其不同（Shi等人，2003)。此指 示各蛋白質之功能不同且兩激酶皆不可補償對方之活性。 總之，MAPKAPK5及MAPKAPK2表示具有非冗餘作用之不 同標靶。近來MAPK6(亦稱為ERK3)已經鑑別為MAPKAPK5 之生理學相關受質，從而確定一條新穎信號轉導路徑 (Seternes等人，2004)。 【先前技術】 NSAIDS(非類固醇消炎藥）用於降低與RA相關之疼痛且 改善患者之生活品質。然而，此等藥物將不會使RA相關 之關節破壞削弱。 如以放射照相術所偵測，發現皮質類固醇可減緩RA2 進展且以低劑量使用以治療部分RA患者（3〇至60%)。然 而，長期使用皮質類固醇會伴隨發生嚴重副作用（皮膚變 薄、骨質疏鬆症、白内障、高血壓及高脂質血症）。 合成DMARD(疾病改善抗風濕藥物）（例如曱胺喋呤 (methotrexate)、來 米特（leflunomide)、柳氣續胺0比咬 (sulfasalazine)、金諾芬（auranofin)、金硫 丁二納（s〇dium aurothiomalate)、青黴胺（penicillamine)、氯喧（chloroquine)、

S 151374.doc 201120043 經氯喹（hydroxychloroquine)、硫唑嘌呤（azathi〇prine)及環 抱素（ciCl〇sporin))主要應付RA之免疫發炎性組分。作為一 個主要缺點’此等藥物僅具有有限功效（DMARD僅減緩而 非阻斷關節破壞’以致自長遠觀點來看疾病繼續進展）。 功效缺乏係由以下事實指示：平均而言，僅3 〇%患者在用 甲胺嗓吟治療24個月後達成ACR50計分。此意謂根據美國 風濕病學會（American College of Rheumat〇l〇gy)僅 30% 患 者改善50。/。其症狀（CVDell等人，1996^此外，常不清楚 DMARD之確切作用機制。 生物DMARDs(央利昔單抗（infliximab)、依那西普 (Etanercept)、阿達木單抗（Adalimumab)、利妥昔單抗 (Rituximab)、阿巴西普（Abatacept))為治療性蛋白質，其使 RA病理生理學中起重要作用之細胞激素（例如TNF-α)或細 胞（例如B-細胞或T-細胞）不活化（Kremer等人，2003 ; Edwards等人，2004)。儘管TNF-a阻斷劑（英利昔單抗、依 那西普、阿達木單抗）與曱胺喋呤組合療法為當前可用之 最有效的RA治療法’但驚人的是即使此療法亦僅於5〇_ 60%患者在治療12個月後達成疾病症狀的5〇%改良 (ACR50)(St Clair 等人，2004)。抗 TNF-a 藥物存在一些不 良事件警告’顯示此類型藥物相關之副作用。已描述TNF-a阻斷劑有增加感染（結核）、血液學事件及脫髓鞘病症的 風險（亦參見Gomez-Reino等人，2003)。除嚴重副作用之 外’ TNF-a阻斷劑亦具有生物類治療劑的一般缺點，該等 缺點為不愉快之投藥方式（頻繁注射伴隨輸注位點反應）及 151374.doc 201120043 高生產成本。後期研發階段中之較新藥劑靶向細胞激素， 諸如IL-6，T-細胞共刺激分子及B細胞。預期此等藥劑之 功效類似於TNF-α阻斷劑。多種靶向療法具有類似但有限 功效的事實表明RA有多種致病因素《此亦指示吾人對RA 相關病原事件缺乏瞭解。 當前RA療法由於功效有限而不令人滿意（對於3〇%患者 無適當療法）。此需要其他策略以緩解症狀。症狀緩解為 必需的’因為殘留疾病有進行性關節損傷及由此導致進行 性殘廢的風險。抑制RA疾病之免疫發炎組分（其代表當前 RA治療所用藥物的主要標靶）並不阻斷關節退化（該疾病之 主要標認）。 US 2005/0009832描述經取代之咪唑并[丨义^吡畊_8_基_ 胺作為蛋白激酶（包括MAPKAPK5)之調節劑。w〇 02/056888描述MAPKAPK5之抑制劑作為能夠調控某些細 胞激素表現的TNF調節劑。此等先前技術參考文獻中無一 者揭示下文所述化合物種類範疇内的任何化合物。 此外，各種生物活性物質（例如（但不限於）醫藥、藥品及 殺生物劑，通常稱為藥物）之重要特徵為其「生物可用 性」或活性濃度呈可由靶器官或有機體吸收並利用之形 式。在許多情況下’生物可用性與藥物在水中之溶解性相 關。 為了適用作、治療劑’藥物應以可溶形式在適當濃度範圍 内可用一段所需時間。多種選擇可用來達成此等性質，包 括將藥物調配成丸劑、膠囊、溶液、軟膏或其他類似調配 151374.doc 201120043 物。尤其關注的為「容级 琴級釋放（zero-order release：)」荦 物，其令藥物釋放速率恆定。妙 ’、 疋一而’研發此等系統通常複 雜且昂貴。

通常’呈游離驗形式夕越4in -bV I I 式之樂物於水中之溶解性不良，但酸 性位點（例如羧酸、絡、# ΜΜ 酚磺馱）或鹼性位點（例如胺基、鹼性 氮中心）之存在可有利地用於產生藥物之鹽。所得離子化 合物由於其離子特性及較低溶解能而變得更加可溶於水 中’因此改良生物可用性。對於水溶性，叫㈣等人提 供了 50 pg/mL之準則（Lipinsky 等人 Adv Drug _ Rev， 1997, 23, 3-25)。 為藥物候選者之研«擇最佳胸彡式在獲得穩健產品方 面至關重要且需要實驗研究以作出最佳選擇。 此外，選擇藥物候選者之適當鹽形式提供一種調節藥物 特徵以及改良生物可用性、穩定性、可製造性及患者順應 性的方法。可利用大量成鹽劑且鹽之選擇必須仔細設計。 選擇鹽之目的在於鏗別適於研發之最佳鹽形式，且鹽之選 擇主要基於四個主要準則：各種pH值下之水溶性、高結晶 度、低潮解性及最佳化學穩定性。其他準則亦包括多晶型 物形成有限性及合成容易性（Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties，Selecti〇n and Use，StaM，p H 及 ^⑽禮， C.G.編 Wiley-VCH，Weinheim，Germany, 2002)。 因此’本發明之目標在於揭示本發明化合物之鹽形式， 其具有合乎需要之藥理學性質，預期至少一些實施例中之 鹽形式相較於化合物之游離鹼形式展現其醫藥型態的改

151374.doc S 201120043 良。 【發明内容】 本發明係基於如下發現：MAPKAPK5在導致MMP1表現 之路徑中起作用且MAPKAPK5活性之抑制劑（諸如本發明 化合物）適用於治療涉及MMp活性之異常高表現的疾病。 本發明之鹽可一般描述為5_位置經3_醯胺基-呋喃·4_基 取代且8-位置經4_(二氮雙環[2 2丨]庚烷·2基）_4_苯胺基取 代之[1.2.4]三唑并⑴弘…吡畊的鹽。 本發明之鹽可展示一或多種以下有利性質：高結晶性 改良之可加工性、改良之化學穩定性、低潮解性、較低$ 解此、較佳吸收、較低毒性、良好吸收、良好半衰期、| 好/合解、低蛋白質結合親和力、較小藥物·藥物相互^ =及良好代謝穩定性。在—特定態樣中，本發明化合物； 藥理學性質方面展現超越類似化合物之出乎意料的顯著g 良。特定言之’其可展現改良之功效、改良之穩定性、^ 良之命解性、改良之可加工性及改良之耐受性，該等改丨 亦反映於其鹽形式中。在至少—些實施例中，預期本發ς 之鹽在化學穩定性及/或溶解性方面展現超越相應游離4 之出乎意料的顯著改良。 更特疋S之’本發明係關於式I化合物之鹽： 151374.doc

•12· S 201120043

其中該鹽為與以下酸形成之鹽：己二酸、L-天冬胺酸、 苯磺酸、苯曱酸、辛酸（caprylie acid)、檸檬酸、反丁稀二 酸、2,5-二羥笨曱酸（gentisic acid)、L-楚胺酸、乙醇酸、 鹽酸、L-乳酸、L-蘋果酸、順丁烯二酸、L_杏仁酸 (L-mandelic acid)、曱橫酸、萘-1，5-二續酸、卜羥基_2_萘 甲酸、磷酸、糖精（saccharin)、丁二酸、硫酸、L_酒石酸 或甲苯橫酸。在本發明之一較佳態樣中，本發明之鹽為與 苯曱酸、反丁烯二酸、曱磺酸或檸檬酸形成之鹽。 在另一態樣中’本發明提供包含本發明之鹽及醫藥載 劑、賦形劑或稀釋劑之醫藥組合物。在本發明之此態樣 中’醫藥組合物可包含一或多種本文所述之本發明之鹽。 此外，適用於本文揭示之醫藥組合物及治療方法中之本發 明之鹽在製備及使用時皆為醫藥學上可接受的。 本發明之另一態樣係關於本發明之鹽在治療方法、醫藥 組合物及此組合物之製造中的用途，其適用於治療涉及發 炎、膠原蛋白降解之疾病，且特定言之治療特徵在於異常 基質金屬蛋白酶（MMPi)*/或有絲分裂原活化蛋白激酶活 151374.doc 201120043 化蛋白激酶5(ΜΑΡΚΑΡΚ5)活性之疾病，在該等疾病中類 風濕性關節炎（RA)為特定此類疾病。本發明亦係關於製備 本發明之鹽之方法。 由結合以下說明性圖示考慮隨後之[實施方式]，其他目 標及優點將對熟習此項技術者顯而易知。 【實施方式】 定義 以下術語意欲具有下文隨其呈現之含義且適用於瞭解本 發明之描述及預定範疇。 當描述可包括化合物、含有此等化合物之醫藥組合物及 使用此等化合物及組合物之方法的本發明時，除非另有指 示，否則以下術語若存在則具有以下含義。亦應瞭解，當 在本文中描述時，下文定義之任何部分皆可經多種取代基 取代’且各別定義意欲包括在如下文所述之其範嘴内的此 等經取代部分。除非另有陳述，否則術語「經取代」將如 以下所述來定義。應另外瞭解術語「基團（gr〇up)」與「基 團（radical)」在本文中使用時可視為可互換。 在本文中可使用冠詞「一」來意指一個或一個以上(亦 即：少-個)該冠詞之語法對象。舉例而言，「一·類似物」 意s胃一個類似物或一個以上類似物。 4藥學上可接受」意謂已獲美國聯邦或州政府之管理 機構或除美國以外之國家的相應機構核准或可由該等機構 核准或列於美國藥典或用於動物且更特定言之人類之其他 一般公認藥典中者。 151374.doc •14· £ 201120043 藥物之「生物可用性」係指經由除靜脈内注射（根據定 義，當藥物靜脈内投與時，其生物可用性為1〇〇%)以外之 途徑投與之到達全身性循環circulati〇n)的劑量分 數。絕對生物可用性比較非靜脈内投藥後（例如口服、直 腸、經皮 '皮下或舌下投藥後）全身性循環中活性藥物之 生物可用性（估計為曲線下面積或AUC)與靜脈内投藥後同 -藥物之生物可射生。其為相較於同一藥物之相應靜脈内 投藥，經由非靜脈内投藥所吸收之藥物的分數。若使用不 同劑量’貝|!比較必須經劑量校正；因此，各Auc係藉由除 以所投與之相應劑量來修正。 「醫藥學上可接受之媒劑」係指與本發明化合物一起投 與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或載劑。 各劑合物」係旨通常經由溶劑分解反應而與溶劑締合 之化合物形式。此物理締合包括氫鍵結。習知溶劑包括 水、乙醇、乙酸及其類似物。本發明化合物可例如以結晶 形式製備且可經溶劑合或水合。適合溶劑合物包括醫藥學 亡可接受之溶劑合物’諸如水合物，且進一步包括化學計 量溶劑合物與非化學計量溶劑合物兩者。在某些情況下， 例如當—或多個溶劑分子併人結晶固體之晶格中時，溶劑 tr能夠分離。「溶劑合物溶液相與可分離溶劑 =兩者。代表性溶劑合物包括水合物、乙醇合物及甲醇 「患者」及「個體 個體」包括人類。術語「人類 在本文中可互換使用。 151374.doc •15- 201120043 >台療有效量」意謂本發明化合物在投與個體以用於治 療疾病時足以治療該疾病的量。「治療有效量」可視化合 物、疾病及其嚴重程度及欲治療個體之年齡、體重等而變 化0 「預防」係指降低患上或染上某一疾病或病症之風險 (亦即在疾病發作之前不使疾病之至少一種臨床症狀在可 月匕暴露於致病劑（disease-causing agent)或易患疾病的個體 中產生）。 術語「預防治療（prophylaxis)」與「預防」相關，且係 指旨在預防而非治療或治癒疾病的措施或程序。預防措施 之非限制性實例可包括投與疫苗；投與處於栓塞（例如歸 因於固定術（immobilizati〇n))風險中的醫院患者低分子量 肝素；及在遊覽瘧疾為地方流行病或感染瘧疾之風險較高 的地理區域前投與抗瘧疾劑，諸如氯喹。 「治療」任何疾病或病症在一實施例中係指改善疾病或 病症（亦即遏止疾病或降低其至少一種臨床症狀之表現、 程度或嚴重性）。在另·實施例中，「治療」係指改善至少 一個不可由個體辨別之身體參數。在另一實施例中，「治 療」係指在身體上（例如使可辨別症狀穩定）、生理上（例如 使身體參數穩定）或在兩者上調節疾病或病症。在另一實 施例中，「治療」係關於減緩疾病進展。 如本文所用’術語「本發明化合物」及等效表述意欲包 含如本文所述之式卜IIa或IIb之化合物，該表述包括該等 化合物之醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物以及該等醫藥學

S 151374.doc 201120043 上可接受之鹽的溶劑合物，例如水合物（在上下文如此允 許時）。類似地’提及中間物’無論是否主張其本身，均 意謂包含其鹽及溶劑合物（在上下文如此允許時）。 如本文所用，術語「本發明之鹽」及等效表述意欲包含 如本文所述之式I、Ila或lib之化合物的醫藥學上可接受之 鹽，该表述包括該等醫藥學上可接受之鹽之溶劑合物，例 如水合物（在上下文如此允許時）。 如本文所用，術語「成鹽劑」係指用其使本發明化合物 形成鹽的物質。成鹽劑之實例包括己二酸、L_天冬胺酸、 苯磺酸、苯曱酸、辛酸、檸檬酸、反丁烯二酸、2,5_二羥 苯甲酸、L-麵胺酸、乙醇酸、鹽酸、L_乳酸、^頻果酸、 順丁烯二酸、L_杏仁酸、甲續酸、蔡二確酸、i-經 基-2-蔡甲酸、填酸、糖精、丁二酸、硫酸、l•酒石酸或甲 苯續酸。 个人ηγ _ —」 叫，q 口…，口-奶仕一執多 個構成此化合物之原子處含有非天然比例之同位素。舉例 而言’化合物之「同位素變體」可含有一或多個非放射性 同位素，諸如氛作或D)、碳，13c)、氮 似物。應瞭解在進行此同位素取代之化合物中，以下原子 (在存在時）可變化，以使例如任 ” ^ π,. , 7 J軋J马H/D，任何碳可 為C’或任何氮可為〗5n， 兑此4原子之存在及置放 此項技術之技能内確定。同#， 罝双了在 化合物可用於藥物及/或受f 斤传 具有放射性同位素之同位紊 備 “立素k體。放射性同位素氣(亦即 151374.doc 201120043 3h)及碳-14(亦即mc)由於其易於併入且偵測手段簡便而尤 其適用於此目的.此外，可製備經諸如、Uf、i5〇及 %之正電子發射同位素取代之化合物且該等化合物將適 用於正電子斷層掃描（p〇sitr〇n Emissi〇n 丁，附） 研究以檢查受質受體佔有率（〇ccupancy)。 本文提供之本發明化合物之所有同位素變體（放射性或 非放射性）皆意欲涵蓋於本發明範疇内。 亦應瞭解，具有相同分^但其原子之鍵結性質或順序 或其原子之空間排列不同的化合物稱為「異構體」。原子 之空間排列不同之異構體稱為「立體異構體」。 彼此不為鏡像之立體異構體稱為「非對映異構體」且彼 此為不重疊鏡像之異構體稱為「對映異構體」。當化合物 具有不對稱中心時’例如’其與四個不同基團鍵結時，可 能存在一對對映異構體。對映異構體可由其不對稱 絕對構型表徵且經由c — 1〇g4定序規則及s定序 ==或經由其中分子繞偏振光平面旋轉之方式描述 且=為右旋性的或左旋性的（亦即’分別為（+)_異構體或 )。對掌性化合物可以個別對映異構體形式或以 -混合物H存在。含有相等比狀對映 1 稱為「外消旋混合物」。 昆^物 「互變異構體」係指作為特定化合物結構之可互換 于及電子之位移（disp〗acement)方面不同的 物。因此，兩個έ士禮w & 保持平衡。舉㈣ Γ 子（通常為Η)之移動 举幻而$，烯醇與酮為互變異構體，因為其藉 151374.doc 201120043 由用酸或驗處理而快速互變。互變I播丨日A ^ 文共搆現象之另一實例為 苯基硝基曱烷之酸形式及硝基形式， 、 具冋樣藉由用酸或鹼 處理來形成。視情況而定，此等互轡里 _ &雙異構體涵蓋於如本文 所揭示之本發明化合物内。 互變異構形式可與獲得相關化合物之最佳化學反應性及 . 生物活性相關。 本發明化合物可具有一或多個不對稱中心；因此此類化 合物可以個別（R)-或（s)_立體異構體形式或以其混合物形 式產生。 除非另有指示，否則本說明書及申請專利範圍中之特定 化合物的描述或命名意欲包括個別對映異構體及其混合物 (外4紅或其他）兩者。測定立體化學及分離立體異構體之 方法在此項技術中為熟知的。 化合物 本發明係基於如下發現：MAPKAPK5在導致MMP1表現 之路徑中起作用且MAPKAPK5活性之抑制劑（諸如本發明 化合物）適用於治療涉及MMp活性之異常高表現的疾病。 本發明之鹽可一般描述為5_位置經3_醯胺基-呋喃_4_基 - 且8-位置經4_哌畊基-4-苯胺基取代之[1.2.4]三唑并[1,5-a] °比p井的鹽。 更特定言之’本發明係關於式丨化合物之鹽： 151374.doc -19· 201120043

式i 其中該鹽為與以下酸形成之鹽：己二酸、L-天冬胺酸、 苯磺酸、苯甲酸、辛酸、檸檬酸、反丁烯二酸、2,5-二羥 苯曱酸、L-麩胺酸、乙醇酸、鹽酸、L-乳酸、L-蘋果酸、 順丁烯二酸、L-杏仁酸、曱磺酸、萘-1，5-二磺酸、1-羥 基-2-萘曱酸、磷酸、糖精、丁二酸、硫酸、L-酒石酸或甲 苯續酸。 在一特定實施例中，本發明係關於式Ila化合物之鹽：

式Ila 其中該鹽為與以下酸形成之鹽：己二酸、L-天冬胺酸、

S 151374.doc 201120043 苯確酸、苯曱酸、辛酸、檸樣酸、反丁稀二酸、2,5 -一經 苯曱酸、L -麵胺酸、乙醇酸、鹽知'、L -乳®文、L -频果3九 順丁烯二酸、L-杏仁酸、甲磺酸、萘_丨，5_二磺酸、卜羥 基-2·萘甲酸、鱗酸、糖精、丁二酸、硫酸、酒石酸或肀 苯續酸。 在另一特定實施例中’本發明係關於式1lb化合物之 鹽：

式lib 其中該鹽為與以下酸形成之鹽：己二酸、L-天冬胺酸、 苯續酸、苯曱酸、辛酸、檸檬酸、反丁烯一酸、2,5 -二經 笨甲酸、L-麩胺酸、乙醇酸、鹽酸、L-乳酸、L-蘋果酸、 順丁烯二酸、L-杏仁酸、甲磺酸、萘-1，5·二磺酸、1-羥 基-2-萘曱酸、磷酸、糖精、丁二酸、硫酸、L•酒石酸或甲 苯續酸。 在一更特定實施例中，根據式I、IIa或Hb之本發明之鹽 為與笨甲酸、檸檬酸、反丁烯二酸或曱磺酸形成之鹽。在 一甚至更特定實施例中，根據式I、Ila或lib之本發明之鹽 151374.doc •21 · 201120043 為與反丁烯二酸形成之鹽。 在另一更特定實施例中，根據式I、Ila或lib之本發明之 鹽為與苯磺酸、萘-1，5-二磺酸或甲苯磺酸形成之鹽。在一 甚至更特定實施例中，根據式I、113或111)之本發明之踏為 與苯續酸形成之鹽β Μ 在一特定實施例中’根據式I、Ila或lib之本發明之趟為 與己一酸形成之鹽。 在一特定實施例中’根據式I、Ila或lib之本發明 為 與L -天冬胺酸形成之鹽。 在一特定實施例中，根據式I、Ila或lib之本發明之细為 與笨項酸形成之鹽。 在一特定實施例中，根據式I、Ila或lib之本發明之晒為 與苯甲酸形成之鹽。 在一特定實施例中’根據式I、Ila或lib之本發明之趟為 與辛酸形成之鹽。 在一特定實施例中，根據式I、Ila或lib之本發明之睡 與棒檬酸形成之鹽。 在一特定實施例中，根據式I、Ila或lib之本發明之_為 與反丁烯二酸形成之鹽》 在一特定實施例中’根據式I、Ila或lib之本發明之睡為 與2,5·二羥苯甲酸形成之鹽。 1 在一特定實施例中，根據式I、Ila或Hb之本發明之趟 與L-麵胺酸形成之鹽。 | 在一特定實施例中，根據式I、Ila或Hb之本發 151374.doc -22- 201120043 與乙醇酸形成之鹽。 在一特定實施例中，根據式I、Ila或lib之本發明 與鹽酸形成之鹽。 在一特定實施例+，根據式I、Ila或lib之本發明 與L -乳酸形成之鹽。 在一特定實施例中，根據式I、Ila或lib之本發明 與L-蘋果酸形成之鹽。 在一特定實施例中，根據式〗' 113或1115之本發明 與順丁烯二酸形成之鹽。 在一特定實施例中，根據式Ϊ、113或111：)之本發明 與L-杏仁酸形成之鹽。 在一特定實施例中，根據式I、na*IIb之本發明 與甲磺酸形成之鹽。 在一特定實施例中，根據式I、Ila或lib之本發明 與秦-1，5 -二續酸形成之鹽。 在一特定實施例中，根據式I、Ila或lib之本發明 與1-羥基-2-萘甲酸形成之鹽。 在一特定實施例中’根據式I、Ila或lib之本發明 與磷酸形成之鹽。 在一特定實施例中，根據式I、Ila或lib之本發明 與糖精、丁二酸形成之鹽。 在一特定實施例中，根據式I、Ila或lib之本發明 與硫酸形成之鹽。 在一特定實施例中，根據式I、Ila或lib之本發明 之鹽為 之鹽為 之鹽為 之鹽為 之鹽為 之鹽為 之鹽為 之鹽為 之鹽為 之鹽為 之鹽為 之鹽為 151374.doc •23- 201120043 與L-酒石酸形成之鹽。 在一特定實施例中，根據式了、ττ + TTU >丄v 佩八卜Ila或lib之本發明之鹽為 與曱苯續酸形成之鹽。 在另-態樣中，本發明提供式卜⑴或仙之化合物的己 二酸鹽、L-天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯曱酸鹽、辛酸鹽、 檸檬酸鹽、反丁烯二酸鹽、2,5·二羥苯甲酸鹽、l_麩胺酸 鹽、乙醇酸鹽、鹽酸鹽、L_乳酸鹽、卜蘋果酸鹽、順丁烯 二酸鹽、L-杏仁酸鹽、甲磺酸鹽、萘q，％:磺酸鹽、卜羥 基2萘甲g夂鹽、碗酸鹽、蔗糖酸鹽 (saccharate)、丁二酸鹽、硫酸鹽、L_酒石酸鹽或曱苯磺酸 鹽。 在另一態樣中，本發明提供式j、113或nb之化合物的己 二酸鹽、L-天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯曱酸鹽 '辛酸鹽、 檸檬酸鹽、反丁烯二酸鹽、2,5_二羥苯甲酸鹽、l-麩胺酸 鹽、乙醇酸鹽、鹽酸鹽、L-乳酸鹽、L_蘋果酸鹽、順丁烯 二酸鹽、L-杏仁酸鹽、曱磺酸鹽、萘二磺酸鹽、羥萘甲酸 鹽、構酸鹽、糖精鹽（saccharinate)、丁二酸鹽、硫酸鹽、 L-酒石酸鹽或甲苯續酸鹽。 在一實施例中’關於式I、IIa或IIb之化合物之鹽，鹽為 苯甲酸鹽、檸檬酸鹽、反丁烯二酸鹽或甲磺酸鹽。在一甚 至更特定實施例中，關於式I、IIa或lib之化合物之鹽，鹽 為反丁缚二酸鹽。 在另—實施例中，關於式I、IIa或nb之化合物之鹽，鹽 為苯續酸鹽、萘-1，5-二磺酸鹽（萘二磺酸鹽）或甲苯磺酸 151374,〇〇 . £ 201120043 鹽。在一甚至更特定實施例中，關於式卜Ha或IIb之化合 物之鹽，鹽為苯磺酸鹽。 在另一態樣中’本發明之鹽為1:1游離驗/成鹽劑加合 物。 在另-態樣中，本發明提供包含本發明之鹽及醫藥載 劑、賦形劑或稀釋劑之醫藥組合物。在本發明之此態樣 中，醫藥組合物可包含-或多種本文所述之本發明之鹽。 此外’適用於本文揭示之醫藥組合物及治療方法中之：發 明之鹽在製備及使用時皆為醫藥學上可接受的。 在另-實施例中’本發明之鹽呈結晶形式。在—特定實 施例中，本發明之鹽係由如圖10A上所示以⑼角表示的 XPRD圖案表徵。 在另一實施例中，本發明之鹽呈結晶形式。在一特定實 施例中，本發明之鹽係由如圖11A上所示以“角表== XPRD圖案表徵，該圖案尤其在以下各處顯示峰值：$卜 9.4、 10.0、η>1、化6、13.〇、13 6、14 3、Μ》、b 卜 16_〇、18.2、18.6、20.0、21.2、21.9、22 3、22 8 23:8 : 25.4、 25.7、26.0、27.3、28.1、28.8、31.1 及 31 6。 在另-實施例中，本發明之鹽呈結晶形式。在-特定實 施例中’本發明之鹽係由如圖11B上所示以_表示的 XPRD圖案表徵，該圖案尤其在以下各處_示峰值.75、 16.5、 17.2、17.7、18.5、19.7、2〇·4、21.1、21·9、22.2、 22·6、22·9、24.0、24.5、24.8、25.7、26.6及 28 8。 151374.doc -25- 201120043 在另一實施例中，本發明之鹽呈結晶形式。在一特定實 施例中，本發明之鹽係由如圖丨丨C上所示以2Θ角表示的 XPRD圖案表徵’該圖案尤其在以下各處顯示峰值：8.3、 9.7、11.0、12.3、13.6、15.2、16.0、18.7、20.4、21.2、 21.8、22.6、24.6、26.9及 28.2。 在一實施例中，本發明之鹽係藉由將式I、na* nb之化 合物與選自以下之酸在惰性溶劑中化合且使該鹽自該溶劑 中沈澱出來而獲得：己二酸、L_天冬胺酸、苯磺酸、苯甲 酸、辛酸、檸檬酸、反丁烯二酸、2,5-二羥苯甲酸、L-麵 胺酸、乙醇酸、鹽酸、L-乳酸、L·蘋果酸、順丁烯二酸、 L-杏仁酸、甲磺酸、萘_丨，5_二磺酸、丨_羥基_2萘甲酸、磷 酸、糖精、丁二酸、硫酸、L-酒石酸及甲苯續酸。在一特 定實施例中，本發明之鹽係藉由將式〗化合物及成鹽劑添 加於適合溶劑中以達成完全溶解，隨後控制溶劑蒸發以達 成過飽和並因此使相應鹽結晶而獲得。 在一實施例中，本發明之鹽係藉由將式！、Ha或nb之化 合物與酸以化合物：酸介於5:1與1:5之間的莫耳比混合並化 合而獲得。在-特定實施例中’本發明之鹽係藉由將式 I、Ila或lib之化合物與酸以化合物：酸介於2:1與1:2之間的 莫耳比混合並化合而獲得。在一更特定實施例中，本發明 之鹽係藉由將式I、Ila或lib之化合物與酸以1:1之莫耳比混 合並化合而獲得》 在另-特定實施例中，製備本發明之鹽之溶劑係選㊁ DMSO、丙酮、THF、MTBE、二⑨燒、Et〇Ac、 151374.doc -26- 201120043 或甲苯。在一更特定實施例中，溶劑係選自DMS〇及

MeOH/DCM。 在另一特疋實施例中，製備本發明之鹽之溶劑係選自 iPrOH/水、iPrOH、iBu0H或tBu〇He在一更特定實施例 中，溶劑為iPrOH/水。 在另一態樣中，本發明提供製備任何所述式〖、11&或111? 之鹽的方法’該方法包含以下步驟： i) 使式I、Ila或lib之化合物與選自以下之酸在惰性溶劑 中反應：己二酸、L-天冬胺酸、苯確酸、苯甲酸、辛酸' #檬酸、反丁烯二酸、2,5_二經笨甲酸、卜麵胺酸、乙醇 酸、鹽酸、L-乳酸、L_類果酸、順丁稀二酸、l•奸酸、 甲績酸、蔡-1，5·二續酸、卜經基_2_蔡甲酸、碟酸、糖精、 丁二酸、硫酸、L-酒石酸及甲笨項酸；及 ii) 使該鹽自該溶劑中沈澱出來。 在本發明之一實施例中，就鹽之製 辰備而§ ’酸係選自苯 甲I '檸檬酸、反丁稀二酸及甲續酸。 在本發明之-特定實施例中，就鹽之製 丁烯二酸。 =酸為反 在本發明之另一特定實施例中，就鹽之製備而 苯磺酸 '萘-1，5-二磺酸或甲笨磺酸。 。馼為 在本發明之一更特定實施例 苯績酸。 枕鹽之製備而言，酸為 在本發明之另一態樣中，亦提供可藉 獲得之式I、IIa或IIb之化合物的鹽。 -错由上述方法 151374.doc -27- 201120043 在本發明之一實施例中，就鹽之製備而言，使該式i、 Ila或lib之化合物與該酸以介於5:1與1:5之間的莫耳比反 應。 在本發明之一實施例中，就鹽之製備而言，使該式I、 Ila或lib之化合物與該酸以介於2:1與1:2之間的莫耳比反 應。 在本發明之一實施例中，就鹽之製備而言，使該式I、 Ila或lib之化合物與該酸以1:1的莫耳比反應。 在本發明之一實施例中，就鹽之製備而言，惰性溶劑係 選自 DMSO、丙酮、THF、MTBE、二噁烷、EtOAc、 MeOH/DCM或曱苯。 在本發明之一特定實施例中，就鹽之製備而言，惰性溶 劑係選自DMSO及MeOH/DCM。 在一實施例中，就惰性溶劑MeOH/DCM而言， MeOH/DCM比率在3/1至1/3範圍内。在一特定實施例中， MeOH/DCM比率為 1/3。 在另一特定實施例中，就鹽之製備而言，惰性溶劑係選 自 iPrOH/水、iPrOH、iBuOH及 tBuOH。 在另一特定實施例中，就鹽之製備而言，惰性溶劑係選 自 iPrOH及 tBuOH。 在另一特定實施例中，就鹽之製備而言，惰性溶劑係選 自iPrOH/水。在一更特定實施例中，就惰性溶劑iPrOH/水 而言，iPrOH/水比率在3/1至9/1範圍内。在另一特定實施 例中，iPrOH/水比率為3/1。

S 15I374.doc -28- 201120043 在一態樣中’根據本文所述任 本發明之鹽的溶劑合物。 一實施例之本發明 之鹽為 醫藥組合物 當本發明之鹽用作醫藥時， 與。此等組合物可以醫藥技術 少一種活性成分。 其通常以醫藥組合物形式投 中熟知之方式製備且包含至 方又叩吕，不*5賞 -…丁丄巧从里议興。實際 投與之鹽的量將通常由醫師根據相關情形確定，該等情形 包括欲治療之病狀、所選投藥途徑、所投與之實際：人 物、個別患者之年齡、體重及反應、患者症狀 ： 其類似情形。 本發明之醫藥組合物可經由多種包括口服、直腸、經 皮、皮下、靜脈内'肌肉内及經鼻内之途徑投與。視預定 傳遞途徑而定，本發明化合物較佳調配成可注射或口服組 合物或調配成皆用於經皮投藥之油膏（salve)、洗劑或貼 片。 用於口服投藥之組合物可採用散裝液體溶液或懸浮液或 散裝散劑之形式。然而’更通常地，組合物以單位劑型呈 現以便於精確給藥。術語「單位劑型」係指適用作為單一 劑量用於人類個體及其他哺乳動物的物理個別單元，各單 70含有經計算以產生所要治療效果之預定量的活性物質與 適合醫藥賦形劑缔合。典型單位劑型包括液體組合物之預 先填充、預先量測之安瓿或注射器或在固體組合物情況下 之丸劑、錠劑、膠囊或其類似物。在此等組合物中，吱喃 151374.doc • 29· 201120043 磺酸化合物通常為少量組分（約…至㈣重量❶錢較佳則 至約40重^%)’其餘為有助於形成所要給藥形式之各種媒 劑或載劑及加工助劑。 適於口服投藥之液體形式可包括適合水性或非水性媒劑 以及緩衝劑、料似分配劑、著色劑、調味劑及其類似 物。固體形式可包括例如任何以下成分或具有類似性質之 化合物：黏合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠；賦 形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、澱粉羥基 乙酸納或玉米殿粉；骨劑，硬脂酸鎮；助_，諸如膠 狀二氧化矽’·甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如 胡椒薄荷、水揚酸曱酯或橙味調味劑。 可注射組合物係通常基於可注射滅菌鹽水或磷酸鹽緩衝 鹽水或此項技術巾已知之其他可注射㈣。如前所述，此 等組合物中之活性化合物通常為少量組分，通常為約〇 〇5 至10重量％，其餘為可注射載劑及其類似物。 經皮組合物通常調配成活性成分含量一般在約001至約 20重量。/❶、較佳約〇」至約2〇重量％、較佳約〇丨至約1〇重量 %且更佳約0.5至約15重量％之範圍内的局部軟膏或乳膏。 當調配成軟膏時，活性成分將通常與石蠟或水可混溶之軟 膏基劑組合。或者，活性成分可與例如水包油型乳膏基劑 一起調配成乳膏。此等經皮調配物在此項技術中為熟知的 且一般包括增強調配物之活性成分之皮膚穿透性或穩定性 的其他成分。所有此等已知經皮調配物及成分皆包括在本 發明範疇内。

151374.doc •30· S 201120043 本發明之鹽亦可經由經皮裝置投與。因此，可使用儲集 囊型或多孔膜型或固體基質種類之貼片來經皮投藥。 用於可經口投與'可注射或可局部投與之組合物的上述 組分僅為代表性的。其他物質以及加工技術及其類似物闡 述於Remington’s Pharmaceutical Sciences，第 17版，1985, Mack Publishing Company，Easton, Pennsylvania之第 8部分 中’該文獻以引用的方式併入本文中。 本發明之鹽亦可以持續釋放形式或自持續釋放藥物傳遞 系統投與。代表性持續釋放物質之描述可見KRerningt〇n，s

Pharmaceutical Sciences 中。 以下調配實例說明可根據本發明製備之代表性醫藥組合 物。然而，本發明並不限於以下醫藥組合物。 調配物1-錠劑 可將本發明之鹽與無水明膠黏合劑以約1 :2之重量比混 合成乾粉。添加少量硬脂酸鎂作為潤滑劑。在製錠機中使 混合物形成為240-270 mg錠劑（每一錠劑80-90 mg活性化合 物）。 調配物2-膠囊 可將本發明之鹽與澱粉稀釋劑以約1:1之重量比混合成 乾叔。混合物填充成為250 mg膠囊（每一膠囊125 mg活性 化合物）。 調配物3-液體 可將本發明之鹽（125 mg)與蔗糖（1.75 g)及三仙膠（4 mg) 混合且所得混合物可經摻合，通過10號篩目之美國篩，接 151374.doc -31 · 201120043 著與先前製備之微 mg)之水溶液現合。 用水稀釋且在搜拌 生5 mL之總體積。 晶纖維素及羧甲基纖維素鈉〇1:89，5〇 >將苯甲酸鈉（1 〇 mg)、調味劑及著色劑 下進行添加。接著可添加足夠的水以產 調配物4-錠劑 可將本發明夕 〈鹽與無水明膠黏合劑以約1 :2之重量比混 合成乾粉。禾, n 、 , 加少量硬脂酸鎂作為潤滑劑。在製錠機中使 ’昆0物形成為450_900 mg錠劑（150-300 mg活性化合物）。 調配物5-注射液 可將本發明之鹽溶解或懸浮於緩衝滅菌鹽水可注射水性 介質中，達到約5 mg/mL之濃度。 調配物6-局部型 可使硬脂醇（250 g)及白凡士林（25〇 g)在約听下炫融， 接著可添加本發明之鹽（50 g)、對羥基苯曱酸曱酯⑺乃 g)、對經基苯甲酸丙醋（G.15 g)、月桂基硫酸鈉⑽幻及丙 二醇02G g)溶於水（約37G g)中之混合物且料所得混合物 直至其凝結。 治療方法 本發明之鹽可用作治療哺乳動物與mmp1及/或 MAPKAPK5之異常活性有因果關係或可歸因於該異常活L 之病狀的治療劑。因此，本發明之鹽及其醫藥組合物用作 預防及/或治療包括人類之哺乳動物中發炎疾病的治療 劑。因此且如前所述’本發明在其料内包括所述治療方 法且延及該等治法以及用於此等方法中及用於製備適

S 151374.doc 201120043 用於此等方法之藥劑的鹽。 在一治療方法態樣中，本發明提 的冰I断，r 风货/〇療易患或罹患與細 月匕外基質（ECM)降解相關之病狀，特^ 定言之類風濕性關節炎之哺乳 P ' Ί卩K f摘物的方法，該方S包含投 、有效I之本發明之鹽或其醫藥組合物。 在另-治療方法態樣中’本發明提供治療易患或羅患與 MP1之異常細胞表現相關之病狀之哺乳動物的方法，豆 包含投與治療有效量之本發明之鹽或其醫藥組合物。〃 療方法態樣中’本發明提供治療或預防特徵在 基質金屬蛋白酶活性之病狀的方法，其包含投與治 二效抑制基質金屬蛋白酶之量的本發明之鹽或其醫藥組 合物。 ^另-治療方法態樣中’本發明提供治療易患或羅患經 炎介導或導致發炎之疾病及病症（諸如類風濕性關節 二及骨關節炎、心肌梗塞、各種自體免疫疾病及病症、葡 =膜炎及動脈粥樣硬化症；發疼/搔饔，諸如牛皮癖；及 臟病症）之喝乳動物的方法，該方法包含投與有效治療 病狀或預防病狀之量的本發明之鹽或其醫藥組合物。 本發明亦係關於本發明之鹽的用途，其用於製造供治療 〆預防如下病狀的藥劑’該病狀為可藉由投與有絲分裂原 活化蛋白激酶-活化蛋白激酶5之抑制劑而預防、改善或消 除之病狀或特徵在於異常膠原蛋白酶活性之病狀或與肛Μ 降解相關之病狀或自、Β+ 選自及心炎之疾病的病狀，最佳用於 治療類風濕性關節炎。 ' 151374.doc -33· 201120043 作為本發明之另一態樣，提供尤其在上述病狀及疾病之 治療或預防中用作醫藥的本發明之鹽。本文亦提供本發明 之鹽在製造供治療或預防一種上述病狀及疾病之藥劑中的 用途。 在另一態樣中，本發明提供用於預防或治療哺乳動物之 與MMP1及/或MAPKAPK5之異常活性有因果關係或可歸因 於該異常活性之病狀的本發明之鹽。特定言之，本發明提 供用於治療或預防包括人類之哺乳動物之發炎疾病的本發 明之鹽及/或其醫藥組合物。 在另一態樣中，本發明提供用於預防或治療與細胞外基 質（ECM)降解相關之病狀，特定言之關節炎且更特定言之 類風濕性關節炎的本發明之鹽。 在另一態樣中，本發明提供用於預防或治療與MMp丨之 異常細胞表現相關之病狀的本發明之鹽。 在另一態樣令，本發明提供用於預防或治療特徵在於異 常基質金屬蛋白酶活性之病狀的本發明之鹽。 在另一態樣中’本發明提供用於預防或治療經由發炎介 導或導致發炎之疾病及病症（諸如類風濕性關節炎及骨關 知炎、心肌梗塞、各種自體免疫疾病及病症、葡萄膜炎及 動脈粥樣硬化症；發瘩/搔疼，諸如牛皮癬；及腎臟病症） 的本發明之鹽。 本發明方法之一種特定方案包含投與罹患特徵在於細胞 外基質降解之疾病病狀的個體有效抑制基質金屬蛋白酶之 量的本發明鹽，持續一段足以降低患者細胞外基質降解之

S 151374.doc •34- 201120043 異*私度且較佳終止導致該降解之自續過程的時間。該方 個特^實施例包含投與罹患或易發生類風濕性關節 炎之個體患者有效抑制基質金屬蛋白酶之量的本發明鹽， 持續-段足以分別降低或防止該患者關節中膠原蛋白及骨 降解且較佳終止導致該降解之自續過程的時間。 本發明化合物可展示高結晶性、改良之可加工性、改良 2化學穩定性、低潮解性、較低溶解能、較佳吸收、較低 毒性、良好吸收、良好半衰期、良好溶解性、低蛋白質結 合=和^較小藥物_藥物相互作用及良好代謝穩定性。 寺疋悲樣中，本發明化合物在藥理學性質方面展現超 越類似化合物之出乎意料的顯著改良，特別是其可展現改 良之功效、改良之穩定性1良之溶解性、改良之可加工 性及改良之耐受性，該等改良亦反映於其鹽形式中。在至 少一些實施财，預期本發明之鹽在化學穩定性及/或溶 解性方面展現超越游離驗之出乎意料的顯著改良。當本發 明化合物展現任何-或多種此等改良時，此可對其用於或 本發明鹽用於本文所述病狀中產生影響。舉例而言，當本 毛月化合物展現改良之功效時’預期本發明化合物或鹽可 以較低劑量投與，從而減少任何可能不合需要副作用的發 生。類似地’在本發明化合物展現增加之耐受性時，此可 使本發明化合物以較高濃度給藥而不引起不需要之副作 用。可預期此等功效或耐受性變化會使該等本發明化合物 之治療窗改良’該改良之治療窗同樣見於本發明之越中。 類似地’以上所列其他性質之改良亦在本發明化合物之可 151374.doc -35- 201120043 能用途賦予優點。 本發明之鹽可展示超越各別本發明化合物之游離鹼形式 之改良溶解性，從而相較於溶解性較小之本發明化合物更 易調配。較佳調配形式又由於投藥途徑較容易而可導致較 佳患者順應性，從而便於治療以上提及之病狀。舉例而 言，口服調配物相較於（例如且不限於）注射或輸注可能特 別適合患者。 本發明之鹽亦可展示改良之化學及/或物理穩定性，從 而導致化合物之儲藏期限延長。 熟習此項技術者亦將瞭解當相較於呈游離鹼形式之相應 本發明化合物時，本發明之鹽可提供改良之可加工性及可 製造性。&改良可由本文所述之鹽的性質改良(包括較高 結晶性及低潮解性）產生。 注射劑量在約0.1 mg/kg/h至至少1〇 mg/kg/h之範圍内， 均歷時約1至約12G小時且尤其24至96小時。亦可投與約 (M _至、約10喻或1〇 一以上之預載大：劑 (preloading b〇lus)以達成足夠之穩態含量。不期望4〇至8〇 kg人類患者之最大總劑量超過約2公克/天。 為了預防及/或治療長期病狀，諸如發炎及自體免疫病 狀，治療方案通常延續多月或"，且因此就患者便利性 及对又|±而5 ’ 〇服給藥值得注意。& 口服給藥情況下， 每天1至5次且尤其2至4次並通常3次口服給藥為代表性方 之 累。使用此等給藥方式’各劑量提供約G.G1至約20叫 本發明之鹽’其中特定劑量各提供約0.1至約10 mg/k s 151374.doc • 36 · 201120043 尤其約1至約5 mg/kg。 經皮劑量一般經選擇以使血汸冬旦#s / 优血液含里類似於或低於使用注 射劑量所達成者。 當用於預防發炎病狀發作時，本發明之鹽將通常基於醫 師建議及在醫師監督下以上述劑量投與處於患該病狀之風 險中的患者。處於患某一特定病狀之風險中的患者一般包 括具有该病狀之家族史的患者或已經由遺傳測試或篩檢鑑 別為特別易於患該病狀的患者。 本發明之鹽可以單一活性劑形式投與或其可與其他治療 劑組合投與，該等其他治療劑包括展示相同或類似治療活 性且經測定對於此組合投藥而言安全且有效的其他鹽。在 一特定實施例中，兩種（或兩種以上）藥劑之共投與使各自 欲使用之劑量顯著降低’進而減少可見之副作用。 在一實施例中，本發明之鹽與用於治療及/或預防涉及 發炎之疾病的另一治療劑共投與；特定藥劑包括（但不限 於）免疫調節劑’例如硫唑嘌呤（azathioprine)、皮質類固 醇、環磷醯胺（eye 丨 ophosphamide)、環孢菌素 A(cyclosporin A)、FK506、徽酌·酸嗎淋乙酉旨（Mycophenolate Mofetil)、 OKT-3 及 ATG。 在一實施例中，本發明之鹽與用於治療及/或預防類風 濕性關節炎之另一治療劑共投與；特定藥劑包括（但不限 於）鎮痛劑、非類固醇消炎藥（NSAIDS)、類固醇、合成 DMARDS(例如（但不限於）甲胺喋呤、來氟米特、柳氮磺胺 吡啶' 金諾芬、金硫丁二鈉、青黴胺、氣喹、羥氣喹、硫 151374.doc •37· 201120043 唑嘌呤及環孢素）及生物dmards(例如（但不限於）英利昔 單抗、依那西普、阿達木單抗、利妥昔單抗及阿巴西 普）。 如熟習此項技術者將顯而易知，共投與包括任何將兩種 或兩種以上治療劑傳遞至患者作為同一治療方案之一部分 的手段。儘管可以單一調配物同時投與兩種或兩種以上藥 劑，但此並非必需。藥劑可以不同調配物及在不同時間投 與。 一般合成程序 本發明化合物可使用以下一般方法及程序自容易獲得之 起始物質來製備。應瞭解，當給定典型或較佳加工條件 (亦即反應溫度、時間、反應物之莫耳比、溶劑、壓力等） 時’除非另有陳述，否則亦可使用其他加工條件。儘管最 佳反應條件可隨所用特定反應物或溶劑而變化，但此等條 件可由熟習此項技術者經由常規最佳化程序來確定。 另外，如熟習此項技術者將顯而易知，需要習知保護基 來防止某些官能基發生不合需要之反應。選擇適用於特定 官能基之保護基以及適用於保護及脫除保護基之條件在此 項技術中為熟知的。舉例而言，眾多保護基及其引入與移 除係描述於 T. W. Greene 及 P. G. M. Wuts，Pro/ecihg Oowps ζ·” ⑴.c ，第 2版，Wiley, New York 1991及其中引用之參考文獻中。 以下詳細呈現關於已在上文列出之代表性雙環雜芳基之 製備的方法。本發明化合物可由熟習有機合成之技術者自 151374.doc -38- 201120043 已知或市售起始物質及試劑製備。 除非另有陳述，否則所有試劑皆為商品級且不經進一步 純化而按原樣使用。市售無水溶劑用於在惰性氛圍下進行 之反應。除非另有說明，否則試劑級溶劑用於所有其他情 況中。管柱層析係在矽膠60(35-70 μηι)上進行。使用預塗 佈矽膠F-254板（厚度0.25 mm)進行薄層層析。1H NMR光譜 係在Bruker DPX 400 NMR光譜儀（400 MHz)上記錄。1Η NMR光譜之化學位移（δ)係以相對於作為内部參考之四曱 基矽烷（δ 0.00)或適當殘餘溶劑峰（亦即，CHC13(S 7.27))的 百萬分率（ppm)報導。多重性係以單峰（s)、二重峰（d)、三 重峰（t)、四重蜂（q)、多重蜂·（m)及寬峰（br)給出。耗合常 數（Coupling constant，J)係以Hz給出。電喷霧MS譜係在 Micromass平台LC/MS譜儀上獲得。用於所有LCMS分析之 管柱：Waters Acquity UPLC BEH C18 1.7 μιη，2.1 mm IDx50 mm L(部件號 186002350)。製備性HPLC: Waters XBridge Prep C18 5 μιη ODB 19 mm IDxlOO mm L(部件號 186002978)。所有方法皆使用MeCN/H20梯度。H20含有 0.1% TFA或 0.1% NH3。 實驗章節中使用之縮寫表 DCM ： 二氯曱烷 DMF AUV-二曱基曱醯胺 DiPEA ： AUV-二異丙基乙胺 TFA 三氟乙酸 MeCN 乙腈 THF 四氫。夫喃 BOC 第三丁氧基-羰基 NMR 核磁共振 151374.doc -39- 201120043 DMSO 二曱亞礙 DPPA 二苯基磷醯基疊氮 化物 LC-MS 液相層析-質譜 Ppm 百萬分率 EtOAc 乙酸乙酯 APCI 常壓化學電離 Rt 滯留時間 RT 室溫 s 單峰 br s 寬單峰 m 多重峰· d 雙重峰 PdCLdppf [l，r-雙(二苯基膦 基)二茂鐵]二氣鈀 (Π) TEA 三乙胺 AIBN 2,2'-偶氮二異丁腈 IPA 異丙醇 BINAP 2,2丨-雙(二苯基膦 基)-1，1'-聯奈 MTBE 曱基第三丁基醚 2-MeTHF 2-曱基四氫呋喃 EDTA 乙二胺四乙酸 ATP 三磷酸腺苷 EGTA 乙二醇四乙酸 BSA 牛血清白蛋白 DTT 二硫蘇糖醇 FBS 胎牛血清 PBST 含有吐溫(Tween) 之磷酸鹽緩衝鹽 水，其配方為 3.2 mM Na2HP04 ' 0.5 mM KH2P〇4 ' 1.3mMKCl、135 mM NaQ、0.05% 吐溫20，pH 7.4 ΜΜΡ 基質金屬蛋白酶 shRNA 短髮夾狀RNA RNA 核糖核酸 Ad-Si RNA 腺病毒編碼之 siRNA DMEM 達爾伯克氏改良伊 格爾培養基 (Dulbecco's Modified Eagle Medium) ΑΡΜΑ 乙酸-4-胺基苯汞 hCAR 人類細胞腺病毒 受體 dNTP 三磷酸去氧核糖 核苷 QPCR 定量聚合酶鏈反應 cDNA 複本去氧核糖核酸 151374.doc • 40- 201120043 GAPDH 甘油醛磷酸去氫酶 ip 腹膜内 PVDF 聚偏二氟乙烯 iv 靜脈内 RIPA緩衝液 放射免疫沈澱分析 緩衝液 RH 相對濕度 MAPKAPK5 有絲分裂原活化蛋 DSC 差示掃描熱量測定 白激轉-活化蛋白 DVS 動態蒸汽吸附 激酶5 TG-FTIR 聯合傅立葉 PBMC 末梢血液單核細胞 (Fourier)轉換紅外 光譜分析之熱重量 TNFa 腫瘤壞死因子a 分析 LPS 脂多醣 PXRD 粉末X射線繞射 本發明化合物之合成製備 實例1 :中間物之合成 中間物la : 3,6-二溴·吡畊-2-基胺之製備 一般反應流程：

中間物la

COzH (B)

UOH, THF MeOH, H^O 1. DPPA,t-BuOH TEA,回流 2. TFA/DCM 4:1 步驟1 :如一般反應流程中所述之化合物（B)3，6-二溴-。比 喷-2-甲酸的合成。 將 LiOH(655 mg，27 mmol)添加至 3,6_二溴-〇比 __2-甲酸 曱酯（A)(·/. Mei C/2ew. 1969，12，285-87)(2.7 g’ 9 mm〇1) 於THF:水：MeOH(18:4.5:4.5 mL)中之溶液中。反應在5亡下 攪拌30 min，真空濃縮，溶解於DCM中並用1 N HC1洗 151374.doc .41 - 201120043 滌。有機相經無水MgS〇4乾燥並真空濃縮，得到化合物 (B) 〇 *H NMR (250 MHz, CDC13) δ ppm 8.70 (s, 1H) 〇 步驟2 :如一般反應流程中所述之中間物la 36_二溴吼 _-2-基胺的合成。 將一苯基碌醯基疊氮化物（2.59 mL，12 mmol)及三乙胺 (1.67 mL，12 mmol)添加至 3,6-二溴-吡畊-2-曱酸（3.52 g， 12 mmol)於第三丁醇（90 mL)中之溶液申。反應在回流下 加熱18小時。反應用水淬滅，接著真空濃縮並溶解於dcm 中。有機溶液用水及IN NaOH洗滌，經無水MgS04乾燥並 真空濃縮。所得固體使用EtOAc經二氧化矽襯墊過濾，接 著濃縮且將TFA:DCM(4:1，12 mL)添加至固體中並授拌30 min。溶液在真空中濃縮，接著用1 N NaOH中和並用DCM 萃取。有機層經無水MgS04乾燥並真空濃縮產生產物。 NMR (250 MHz, DMSO-i/5) δρριη 7.25 (br s, 2H), 7.68 (s, 1H); m/z (APCI) 254 (M+H)+; m.p 135-139。。。 中間物la之替代途徑 或者，中間物1 a亦可使用以下合成順序來獲得：

D， 151374.doc • 42· 201120043 步驟1 :如一般流程中所述之中間物B，2_胺基_3_醯胺基吼 喷的合成。 A'(270 g ’ 1.763 M)、曱醇（1.05 L)及液氨（25%)(1.68 L) 之混合物在3〇t下攪拌24小時》所得固體藉由過濾加以分 離’用水（210 mLx2)洗滌並在50-55t下真空乾燥，得到 B'，其在不經進一步處理下用於下一步驟中。 步驟2 :如一般流程中所述之中間物c，2_胺基_3_醯胺基_5_ 溴。比喷的合成。 將B’（210 g，1.52 mM)、乙酸（630 mL)及乙酸鈉三水合 物（310 g ’ 2.28 mM)之混合物升溫至50°C。在1.5小時内向 此溶液中添加於乙酸（105 mL)中之溴（93.43 mL，1824 mM)並在50-55 °C下授拌混合物30 min。反應混合物冷卻至 15°C ’經20-30 min添加水（2.1 L)且將所得懸浮液再攪拌3〇 min。固體藉由過濾加以分離，用水（21〇 mLx2)洗滌並在 45°C下真空乾燥’得到C，，其在不經進一步處理下用於下 一步驟中。 步驟3 :如一般流程中所述之中間物D，二溴_3_醢胺基 °比畊的合成。 C'(200 g，922 mM)、47%氫溴酸水溶液（5〇〇 mL)及乙酸 (100 mL)之混合物冷卻至-HTC。接著在-i(TC下經45 min 將溴（47.25 mL，922 mM)添加至反應混合物中。接著經2 h添加亞硝酸鈉（190 g ’ 2.765 M)於水（400 mL)中之溶液， 同時維持反應混合物溫度在-5°C以下。在添加完成之後， 將反應混合物再授拌30 min。接著經30 min添加硫代硫酸 151374.doc • 43- 201120043 鈉（250 g)於水（712 mL)中之溶液，從而形成懸浮液。固體 藉由過濾加以分離，用水（400 mLx2)洗滌並在50-55°C下 真空乾燥，得到粗D’。粗D'(186 g)懸浮於2-丁酮（93 mL)及 己烷（279 mL)溶液中’接著在3〇。匚下攪拌1小時。固體藉 由過濾加以分離，濾餅用2-丁酮（93 mL)與己烷（186 mL)之 1:3混合物洗條且在5〇°C下乾燥3小時，得到潔淨D·。 步驟4.中間物la之合成。 在-5°C下經0.5-1 h向氫氧化鉀（130 g，2.314 M)於水（1.3 L)中之授拌溶液中添加溴（23.7 mL，463 mM)。將中間物 D'(100 g ’ 356 mM)添加至反應混合物中並在_5。〇下搜拌15 min。經20 min使反應混合物溫度上升至15°c且在此溫度 下再攪拌30 min。所得固體藉由過濾加以分離，用水（50 mLx3)洗滌並在50-55°C下真空乾燥，得到粗中間物ia。 中間物la(51 g)在70°C下於10%氫氧化鉀水溶液（510 mL) 中加熱2小時’接著冷卻至30°C並過濾固體。濾餅用水（25 mLx2)洗滌並乾燥，得到潔淨中間物U。 中間物lb : 3-氣-6-溴-吡畊-2-基-胺之製備 或者，3·氯-6-溴。比叫*-2-基-胺可代替3,6-二溴-η比畊-2-基 胺加以使用且根據以下流程加以製備：

中間物lb 步驟1 :如一般反應流程中所述之化合物（A")2-氯-3,5-二 -44 - 151374.doc 201120043 溴-°比畊的合成 向冷卻至0°C之2-胺基-3,5 -二溴η比唯（3 21 g，12.692 mmol)於DCM(20 mL)中之充分搜拌溶液中一次性添加 TiCl4(2.41 g，12.692 mmo卜1.00當量），從而產生暗紅色 漿液。接著逐滴添加亞硝酸第三丁酯（2.62 g，25.385 mmol ’ 2.00當量）’從而使溶液轉變成亮黃色。接著移除 冰谷’隨後使反應在室溫下繼續進行。添加更多 TiCl4(1.50 g ’ 1.2當量）且將混合物再攪拌1小時。此刻， 形成橙色溶液，且LC-MS顯示起始物質完全轉化成所要產 物，該產物極少離子化。將水（100 mL)添加至反應中，從 而形成乳液。添加DCM(50 mL)，且將DCM層分離，並將 水層進一步用DCM(3x50 mL)萃取直至DCM層無色。將 DCM層聚集，用鹽水洗滌並經無水NhSO4乾燥，移除溶劑 之後產生呈橙色油狀之化合物A，，（2.81 g，82%)，其按原 樣用於以下步驟中。 步驟2 :如一般反應流程中所述之中間物lb 3-氣_6_溴吨 _- 2-基胺的合成 前一步驟中所述之化合物A，，（9.5 g，37.55 mmol)懸浮於 濃NH4〇H(60 mL)中且所得混合物在高壓釜（pressure autoclave)中加熱至80°c，通常隔夜。接著使容器緩慢冷 卻至室溫，接著於冰浴中進一步冷卻，從而使所要物質沈 瓜。固體藉由過攄加以分離，用環己烧洗務，乾燥之後得 到呈區位異構物之83/17混合物形式的標題中間物lb(5 g) °混合物接著經由管柱層析純化。M+H+，m/z=209 151374.doc •45· 201120043 中間物2 : 5,8_二溴-[1，2,4】三唑并[l，5_a卜比畊

Br 一般流程：

Br Br Br (D) (E) 中間物2 PPA, 70°C OH 2b_►

步驟1:}^’-(3,6-二溴-吼嗜-2-基）-1^，^[-二甲基甲脒（1)) ,Br Βγ，、|νΤ'Ν 使懸浮於乙醇（150 mL)中之3,6-二溴-吡畊-2-基胺（15.37 g’ 60.80 mmol)與二甲基甲醯胺二甲縮醛（1〇 1 mL， 76.00 mmol)之混合物回流2小時。反應混合物在真空中蒸 發從而得到標題化合物。i-NMR (400 MHz，CDC13) δ min(99.1%) ， m/z(APCI)307 (PPm) 3·20 (S，3Η)，3.21 (s，3Η)，7.93 (s，1Η)，8·48 (s， 1H)。LCMS : Rt 3 81 (M+H)+。 步驟2 : N-(3 a -、、白,Λ ^ 溴-吡啡-2·基）-ΙΤ·羥基甲脒（E) s 151374.doc -46 - 201120043

OH 向 #’-(3,6-二溴-吡畊-2-基）二曱基甲脒（18 6 g， 60.80 mmol)於甲醇（200 mL)中之溶液中-次性添加經胺鹽 酸鹽（5.91 g，85.12 mmol)。反應在室溫下攪拌16小時。蒸 發溶劑且固體殘餘物用冷（用冰冷卻）水處理並藉由過滅加 以收集。沈殿用水及石油謎洗務兩次並在真空中乾燥，從 而產生標題化合物。W-NMR (400 MHz，δ(ρριι〇 7.82 (br s,lH), 8.21 (s, 1H), 8.34 (m, 1H), 11.17 (br s, 1H) ° LCMS ： Rt 3.17 min (98.7 %) > m/ Z(APCI) 295 (M+H)+。 或者，N-(3,6-二溴-吡畊-2-基）·Ν’-羥基甲脒（e)可直接由 在80°C下將中間物la(100 g ’ 395.3 mM)溶解於添加 DMF.DMA(188_4 g，1581 mM)之異丙醇（180 mL)中而獲 得。反應混合物冷卻至3〇°C且添加羥胺鹽酸鹽（49.45 g， 711.5 mM)。反應混合物再次在50〇c下加熱1.5小時，接著 冷卻至30°C並添加水（2〇〇 mL)。進一步攪拌混合物，且將 所得固體過濾，用水（100 mL><3)洗滌並在30°C下真空乾 燥，得到粗（Ep 粗（E)(102 g)再懸浮於異丙醇〇632 mL)中並在80t下加 熱0·5·1小時得到澄清溶液。使混合物達到30eC並在此溫度 下攪拌12小時。將所得固體過濾，用異丙醇（5〇〇 mL><2)洗 蘇並乾無以得到潔淨（E)。 151374.doc -47- 201120043 步驟3 : 5,8-二溴-[1，2,4]三唑并[Ha]吡哜（中間物2)

在50°C下用聚磷酸（15〇 g)處理iV-(3,6-二溴_ 0比u井_2_ 基）-#’-羥基甲脒（17.4 1^’58.80 〇1111〇1)1小時，接著在 70 C下處理1.75小時。在冷卻至至溫後，將水添加至反應 混合物中。藉由以小份方式小心添加固體NaHc〇3而使所 得懸浮液之pH值達到8。所形成沈澱藉由過濾加以收集， 用1 N NaOH洗滌一次，用水洗滌3次並在真空中乾燥。殘 餘物分配於乙酸乙酯與丨N NaOH之間且有機相再次用i N NaOH洗滌一次並用鹽水洗滌一次。有機相經無水MgS〇4 乾燥，過濾並蒸發產生呈白色固體狀之標題化合物（1〇15 g)。^-NMR (400 MHz, DMSO-办）δ (ppm) 8 43 (s，1H)， 8.92 (s, 1H) 〇 LCMS ： Rt 2.73 min(94.2%) » m/z(AVCl) 277 (M+H)+ 〇 步驟3之替代方案 在45 C下將#-(3,6-二溴-吡畊_2_基）_；^，_羥基甲脒（15〇 g，506.8 mM)添加至存於二噁烷（45〇 mL)中之ppA(195 g)中。反應混合物溫度上升至8〇〇c並維持3〇 min。反應混 合物冷卻至40C，用冰水淬滅並用2_甲基τΗρ(15〇〇 mLx3) 萃取。經合併有機相用1 M氫氧化鈉溶液（15〇〇 mLx3)、鹽 水〉谷液（1500 mL)洗務’經硫酸鈉乾燥並濃縮產生粗中間 物2，其接著再懸浮且攪拌於二異丙醚（225 mL)中。固體

S 151374.doc -48· 201120043 藉由過濾加以分離，最終濾餅用二異丙醚（37.5 mLx2)洗滌 得到潔淨中間物2。 中間物3 : 4-(4,4,5,5-四甲基-【1，3,2]二氧硼咪-2-基）-呋 喃-2-甲酿胺

步驟1 : 4-漠·吱。南-2-甲醯胺

向 4,5-二溴-n夫喃-2-甲酸（12.5 g，46.32 mmol)於 NH4〇H(1〇〇 mL)中之冷卻（使用冷水浴）溶液中以小份方式 添加鋅屑[活化粉末狀（用2 M HC1、水、MeOH、DCM洗 務）4.54 g ’ 65.3 9 mmol]。反應混合物在室溫下撥拌1〇分 鐘’接著經石夕藻土過渡並用水洗務。渡液冷卻至· 1 〇 °C (冰/ 鹽浴）且使用濃HC1緩慢酸化至pH 1。水層即刻用乙酸乙酯 (4χ)萃取。有機相用鹽水洗滌，經無水Mgs〇4乾燥，過遽 並真空濃縮產生油狀物（4.96 g)，其靜置時凝固產生白色 固體’其在不經進一步純化下使用。 固體（4.93 g，25.81 mmol)溶於亞硫醯氣（44.2 mL)中且 回流1小時。在真空移除溶劑之後，殘餘物溶於二氣曱烷 (75 mL)中且添加〇.5 M NH#二噁烷（52爪“中之溶液。反 151374.doc • 49· 201120043 應混合物在室溫下攪拌丨小時，接著添加33%氨水（5 mL)且 將反應再搜拌2小時。在真空中移除溶劑且殘餘物用飽和 NaHC〇3溶液溶解。使用乙酸乙酯（3 χ)萃取鹼性溶液，經 合併有機層經無水MgS〇4乾燥且真空濃縮。矽膠管柱層析 (用乙酸乙醋：石油醚：乙酸（5〇:49:1)之混合物溶離）純化提 供標題化合物（1.2 g，。 步驟2 : 4-(4,4,5,5-四甲基-[H2]二氧硼咮-2-基）-呋喃-2- 曱醯胺（中間物

將4 /臭夫喊-2-甲醯胺（12 g，6.32 mmol)、雙（頻哪醇根 基）一硼（1.76 g ’ 6.94 mmol)、PdCl2.dppf(〇.l54 g，0.189 _01 及 K〇Ac(1.85 g’ 18.94 mm〇l)懸浮於二。惡烧（2〇 mL) 中’用氮氣沖洗5分鐘’接著在85〇c下加熱隔夜。在真空 中移除溶劑且殘餘物分配於乙酸乙酯與鹽水之間。水層用 乙酸乙酯萃取四次，經無水MgS〇4過濾並蒸發。固體殘餘 物用己烧濕磨並在真空中乾燥，得到呈固體狀之標題化合 物（0.984 g ’ 66%)。N.B，化合物純度通常為5〇 6〇%(經由 iH-NMR)。 中間物3之替代途徑：

I51374.doc •50- S 201120043

Ο 3-(4,4,5,5-四甲基-[1，3,2]二氧硼味-2-基）-呋喃（5.0 g， 25.77 mmol)溶於無水乙腈（30 mL)中。在室溫下將存於無 水乙腈（2〇 mL)中之氣確醯基異氰酸酯（5.47 g，38.65 mmol，1.5當量）溶液一次性添加至呋喃中，從而產生粉紅 色溶液，其隔夜減退變成黃色。所得溶液用冰浴冷卻且添 加水（5 mL)，從而導致放熱（exotherm)。所得混合物分配 於DCM(100 mL)與水（30 mL)之間。水層用DCM(50 mL)再 萃取3次’接著將有機層聚集，用鹽水（1〇 mL)洗滌，經無 水NasSCn乾燥且最終在真空下移除溶劑。油狀殘餘物溶於 DCM(3 mL)中’經音波處理產生結晶固體之懸浮液。固體 藉由過濾加以分離，且濾餅依次用極少量DCM、乙醚洗滌 並在抽吸下乾燥，得到3 g呈白色粉末狀之標題化合物。 NMR !H (400 MHz, DMSO-i/6) 5ppm: 8.16 (1H, m)； 7.15 (1H, m); 7.11 (ih，s); 4.33 (2H，q); 1_38 (3H，t); 1.34 (12H， s) o 中間物4 : 異丙基_2,5二氮_雙環卩丄:^庚-2- 基）-苯胺 步驟 1 : ((lS，4S)-5-(4-硝基-苯基）-2>5_ 二氮-雙環[2.2.1]庚 统·2·甲酸第三丁醋 151374.doc 51 201120043

將 4-氟硝基苯（4.00 g，28.348 mmol)、DiPEA(5.89 mL， 60.667 mmol，2.14 當量）及（7&45>2-ΒΟ(：-2,5-二氮雙環 [2.2.1]庚烷（6.02 g，30.333 mmol，1.07 當量）混合於乙腈 (20 mL)中。所得溶液加熱至回流，隔夜，此後已完全轉 化。在真空下移除溶劑，且固體黃色殘餘物在環己烷（50 mL)中攪拌0.25 h，接著使其沈降，丟棄上清液且重複過 程兩次。在第三次時，固體藉由過濾加以分離，使其在抽 吸下乾燥，得到呈黃色固體狀之潔淨標題化合物（8.8 g)。 步驟2 : (lS,4S)-2-(4-硝基-苯基）-2,5-二氮-雙環[2·2·1]庚烧

前一步驟中獲得之固體（8.2 g)溶於DCM(12 mL)與 TFA(12 mL)之混合物中。使反應在RT下進行2 h，此刻已 完全脫除保護基。揮發性組分在真空下移除且所得粗固體 在不經進一步處理下按原樣使用。 步驟3 : (lS,4S)-2-異丙基-5-(4-硝基-苯基）-2,5-二氮-雙環 [2.2.1]庚烷（中間物4)

£ 151374.doc -52- 201120043 刖步驟中獲得之粗化合物（6.22 g，28·356 mmol)溶於 乙猜（7〇 mL)中。依次添加 K2C03(19.59 g，141.770 _〇1 ’ 5.〇〇當量）' 異丙基碘（9.64 g，56.708 mmol，2.00 當量）且所得懸浮液在攪拌下加熱至回流，持續3 h，此刻 已兀全轉化。反應混合物分配於DCM(100 mL)與水（50 mL)之間。有機層用水（5G mL)、鹽水（25 mL)洗蘇，經無 水NajO4乾燥，過濾並在真空中蒸發，產生呈黃色固體狀 之標題化合物（9.9〇 g)。 步麻 4 . 4-((1 S，4S)-5-異丙基-2,5-二氮-雙環[2.2.1]庚-2· 基）-苯胺 h2n

前一步驟中獲得之化合物（3.30g，9 35 mmol)溶於 EtOH(107 mL)中。將系統脫氣且置放在氮氣下。依次添加 Pd/C 10〇/。（0.50 g ’ 5莫耳 ％)、35%肼水溶液（4 3 ^，杯 75 mmol，5當量），且使反應在1〇〇。〇下進行直至已完全轉化 (通常1 h)。接著使反應冷卻，經矽藥土過濾且在真空中蒸 發濾液，得到呈粉紅色油狀之標題化合物（2 〇7 g)。 實例2 :本發明化合物之特定實例 化合物1 : 4-{8-【4_((以，叫·5·異丙基_2 5二氮雙環[2 21] 庚冬基）-苯胺基】-【1，2,4】三吐并[1，S-啦呼_s•基卜吱喃_2_ 甲醯胺 步驟1 (5-溴-[1，2,4]三唑并[l，5-a]n比喷 _8 151374.doc -53- 201120043 ~基）-苯基]•胺 5-異丙基-2,5-二氮-雙環[2.2,1]庚_2

在氮氣下將5,8-二溴-『1,2.41= 4并Γ1 e^

庚-2-基）-苯胺（2.07 g，8.95 mm〇i， 1.10 當量）及 DiPEA(4.3

mL，24.42 mmol，3·00當量）混合於異丙醇（28 mL)中。反 應加熱至85C直至反應完成（通常5 h)。在真空下移除溶劑 且殘餘物分配於60 mL水性磷酸鈉緩衝液（pH 7)與2〇〇 mL DCM之間’有機層用60 mL飽和NaCl洗滌，經無水Na2S04 乾燥，過渡且在真空中蒸發，產生呈綠黑色泡沫固體狀之 標題化合物（3.67 g)。 步驟2 ·· 4-{8-[4-((、1 S，4S)-5-異丙基-2,5-二氮-雙環[2·2.1]庚· 2-基）-苯胺基]-[1,2,4]三。坐并[1，5-(1]°比!1井-5-基}-1>夫。南_2-甲 醮胺

S 201120043 將則一步驟中獲得之化合物（3 Μ g，7.59 mmol)與 (4,4,5,5-四甲基_[13,2]二氧硼咪·2基呋喃_2_曱醯胺（2 7〇 8’11-40111111〇卜1.50當量）、1>(1(：：12£1131^1)(：]^(0.310§， 〇·38 mmol ’ 5 莫耳 ％)、DiPEA(2.65 mL，15.20 mmo卜 2_〇〇當量）一起混合於14二噁烷（Η mL)及水（13 mL)中。 將系統密封，經由真空/N2沖洗且加熱至u〇〇c，持續6 h， 此刻已完全轉化。反應混合物用DCM(6〇 mL)及MeOH(60 mL)稀釋且經石夕藻土過濾。蒸發濾液產生泥狀棕色殘餘 物。此殘餘物用 EtOH(50 mL)、MeOH(25 mL)及DCM(20 mL)處理’且蒸發至乾燥，接著在4〇t下再置於真空中1 h 以試圖儘可能消除水分及醇。無水殘餘物懸浮於DcM(丨〇〇 mL)中並音波處理約1 h以分散所有固體小塊。獲得精細固 體之懸浮液。其冷卻至〇。(： ’經布曲納（Buchner)過濾，且 固體用DCM(3 0mL)洗蔣:並真空乾燥。 殘餘物用1 M KOH(40 mL)處理，經音波處理直至固體 充分分散，並經燒結玻璃漏斗過濾。最終，固體溶於 DCM(450 mL)及 MeOH(50 mL)中，用飽和 NaF 水溶液（250 mL)、水（500 mL)及iPrOH(250 mL)之混合物洗滌。有機層 經無水NaaSO4乾燥’過濾且在真空中蒸發，產生呈黃棕色 固體狀之 4-{8-[4-((/5,45)-5 -異丙基-2,5-二氮-雙環[2.2.1] 庚-2-基）-苯胺基]-[1，2,4]三。坐并[1，5-&]。比_-5-基}-咬喃-2-曱醯胺（2.34 g)。 NMR (400 MHz，DMSO-o^): δ 9.76 (s，1 H); 8.74 (s, 1 H); 8.69 (d. 1 H); 8.13 (s, 1 H); 7.93 (br s, 1 H); 7.86 (d, 1 151374.doc •55· 201120043 H); 7.72 (d5 2 H); 7.54 (br s5 1 H); 6.59 (d5 2 H); 4.31 (d, 1 H (iPrOH)); 4.25 (s, 1,1 H); 3.78 (m, 1 H (iPrOH)); 3.69 (s5 1 H); 3.30 (H2〇)； 3.16 (d(d), 1 H); 3.00 (d(d), 1 H); 2.50 (DMSO); 2.42-2.37 (m, 2 H); 1.81 (s5 2 H); 1.04 (d, 7 H) (i-PrOH); 0·95 (2 d，6 H)。 化合物2:4-[8-({4_[(^?^7?)-5-異丙基-2,5-二氮雙環[2.2.1】 庚-2-基]苯基}胺基）[1，2,4】三唑并[l，5-a】吼畊-5·基】-2·糠醯胺

ΗΝ

0

Κ2〇〇3, η2ο, 加熱 | 4_氯硝基笨1" DMSO, 2-MeTHF 2

H2_ Pd/C

2-MeTHF

4

Et3N, 2-MeTHF, 加熱 5,8·二漢[1，2,4]·三唑幷 [l;5-a]吡畊

[5(胺基羰基)-3· 呋喃基S明酸 Pd(dppf)CI2.CH2CI2 Et3N, 2WeTHF, H20,加熱 化合物2 步驟1 : (lR,4R)-2-異丙基-5-(4-硝基苯基）-2,5-二氮雙環 [2.2.1]庚烷（3) 向（7足M)-5-異丙基-2,5-二氮雙環[2.2.1]庚烷二氫溴酸

S 151374.doc -56- 201120043 鹽（2)(3.0 g ; 9.9 mmol)、4-氣硝基苯（1.7 g ; 11 mmol)、二 甲亞砜（6.2 mL)及自來水（2_5 mL)之混合物中添加固體 K2C03(1.7 g ; mmol ;氣體逸出）。所得懸浮液加熱至 5(TC ’ 此後添加 2-MeTHF(0.5 mL)及更多固體K2C03(1.9 g ; mmol)。反應溫度增至125°C且反應器内含物在此溫度 下保持隔夜。反應混合物冷卻至環境溫度，此後添加自來 水（25 mL)。用乙酸乙酯（3x3 0 mL)萃取水性混合物並在真 空中濃縮經合併有機萃取液，產生固體殘餘物，其再溶解 於熱MTBE(300 mL)中。熱溶液經過濾以移除殘餘固體並 真空濃縮以提供粗（2)。藉由以下步驟來純化：將粗物質分 配於乙酸乙酯（70 mL)與稀鹽酸（pH 1 ; 250 mL)之間，分離 各層’用乙酸乙酯（2x50及2x100 mL)洗滌水相，用稀鹽酸 (pH 1 ; 100 mL)萃取經合併有機層，用1〇 n NaOH水溶液 將經合併水層鹼化至pH 1〇，用MTBE(2x200 mL)及乙酸 乙酯（2x200 mL)萃取鹼性水層，經Na2S〇4乾燥並在真空中 浪縮’產生白色固體。此固體再調漿於庚烷/MTbe 1:1 v/v(20 mL)中，將所得懸浮液過濾且濾餅用庚烷/MTbe 1:1 v/v(20 mL)洗務並風乾，產生呈白色固體狀之（3)。 LC純度：99.3面積〇/〇。 步驟2 : 4-[(lR，4R)-5-異丙基·2,5_ 二氮雙環[22 1：1庚_2•基] 苯胺（4} 在 30 C ’ Pd/C觸媒（1〇%德固賽（Degussa)型 E1〇i NE/W ; 〇1 g)存在下，將 3(1.6 g; 6.1 mmol)於 2-MeTHF(25 mL)中 之溶液在1巴氫氣氛圍下攪拌3 h。觸媒經一層Dicalite 478 I51374.doc •57· 201120043 濾除且濾餅用2-MeTHF(2x 10 mL)洗滌。濾液在真空中濃 縮至體積為25 mL且所得溶液按原樣用於下一步驟中。 步驟3:5-溴4-{4-[(1厌，4幻-5-異丙基-2,5-二氮雙環[2.2.1] 庚-2-基]苯基}[1，2,4]三唑并[l，5-a]-吼畊-8-胺（5) 向自步驟2獲得之溶液中添加5,8·二溴^2,4]三唑并[丨，％ a]-"比啡（1.6 g ; 5.8 mmol)及三乙胺（3·4 mL)。所得混合物 在回流下加熱70 h ’此後反應器内含物冷卻並過濾移除固 體。濾餅用2-MeTHF(2x5 mL)洗滌且濾液按原樣用於下一 步驟中。 步驟4 :化合物2 4-[8-({4-[(lR，4R)-5-異丙基-2,5-二氮雙環 [2.2.1]庚-2-基]苯基}胺基）三唑并[15_a]_a比畊_5_ 基]-2-糠醯胺 向自步驟3獲得之溶液中添加2-MeTHF(5 mL)、自來水 (6.5 mL)、[5-(胺基羰基）-3-呋喃基]麵酸（1.3 g; 8.6 mmol) 及卩(!((1??〇2(：12(0.26 8;0.3 111111〇1)。藉助於真空/氮氣沖洗 循環將所得混合物脫氣5次且在801下加熱6 h。反應器内 含物接著冷卻至環境溫度，添加1，2-二胺基-丙烷（2 mL)， 將所得懸浮液過濾（緩慢！），且濾餅用2-MeTHF(6x5 mL) 洗滌’獲得呈綠色固體狀之粗化合物2。粗物質再調毁於 曱醇（15 mL)中’過濾，且濾餅用甲醇（5 mL)洗滌。濾餅接 著與水/乙酸（pH 1 ;約50 mL)混合，過濾所得懸浮液直至 獲得澄清濾液’且濾餅用水洗滌直至洗滌液變為無色。經 合併濾液及洗滌液在50°C下真空濃縮移除水，殘餘物用2-丙醇（兩次）及甲苯（三次）洗提且隨後溶解於甲醇（70 mL)及 -58- 151374.doc s 201120043 甲苯（5 mL)中。向所得懸浮液中添加1，2-二胺基丙垸（2 mL)及dppe(0.08 g ; 0.2 mmol)，此後繼續攪拌隔夜。純化 產物藉由過滤加以分離，用曱醇洗蘇渡餅直至洗務液變為 淺黃色，隨後用乙酸乙酯洗務，且在40°C下真空乾燥，得 到呈黃色固體狀之化合物2。 LC純度：98.6面積％。 LC-MS : m/z=459 (100) [M+H]+。 表1:本發明化合物之實例。 化合物 編號 結構 名稱 MW M+H+， m/z 1 h2n 4-(8-(4-((/5WS)-5-異丙基-2,5-二氮 雙環[2.2.1]庚烷-2-基)苯胺基)-[1,2,4] 三0坐并[l，5-a]>^ p井-5-基)°夫>»南-2-曱 醯胺 458 459 2 j〇r° HN八〆 ~Vnh2 O 4- {%-[4-((lR,4R)- 5- 異丙基-2,5-二 氮-雙環[2.2.1]庚- 2-基)-苯胺基]-[1，2,4]三唑并[1，5-丑]°比《1井-5-基}-呋 喃-2-曱醯胺 458 459 實例3:鹽形式製備及篩檢 151374.doc •59· 201120043 應瞭解，當給定典型或較佳加工條件（亦即反應溫度、 時間、反應物之莫耳比、溶劑、壓力等）時，除非另有陳 述，否則亦可使用其他加工條件。儘管最佳反應條件可隨 所用特定反應物或溶劑而變化，但此等條件可由熟習此項 技術者經由常規最佳化程序來確定。 除非另有陳述，否則所有試劑皆為商品級且不經進一步 純化而按原樣使用。市售無水溶劑用於在惰性氛圍下進行 之反應。 鹽IUPAC名稱與俗名之間的對應： 酸 鹽 己二酸 己二酸鹽 L-天冬胺酸 天冬胺酸鹽 苯續酸 苯磺酸鹽 (Benzenesulfonate 或 besylate) 苯甲酸 苯曱酸鹽 辛酸 辛酸鹽 檸檬酸 檸檬酸鹽 反丁烯二酸 反丁稀二酸鹽 2,5-二羥苯甲酸 2,5-二羥苯甲 酸鹽 L-麩胺酸 麩胺酸鹽 乙醇酸 乙醇酸鹽 鹽酸 鹽酸鹽 L-乳酸 乳酸鹽 L-蘋果酸 蘋果酸鹽 順丁烯二酸 順丁烯二酸鹽 L-杏仁酸 杏仁酸鹽 甲磺酸 曱磺酸鹽 (Methanesulfonate 或 mesylate) 奈-1，5-二續酸 萘二磺酸鹽 1-羥基-2-萘曱酸 羥萘曱酸鹽 (Nathpthoate 或 xinafoate) 磷酸 磷酸鹽 糖精 糖精鹽 丁二酸 丁二酸鹽 硫酸 硫酸鹽 L-酒石酸 酒石酸鹽 甲苯磺酸 甲苯磺酸鹽 (Toluenesulfonate 或 tosylate) 乙磺酸 乙磺酸鹽 (Ethylenesulfonate 或 Esylate) 1，2-乙二磺酸 乙二磺酸鹽

S 151374.doc -60 201120043 3.1分析條件及儀器配備 DSC(差示掃 描熱量測定） Perkin Elmer DSC 7。 封閉AuJ#渦’加熱速率：10或2(TC/min，範圍：_5〇°c至 250°C，或在配備有34個位置自動取樣器的Metder DS(： 823e上收集DSC資料。使用有證銦對儀器進行能量及溫产 校準。通常0.5-3 mg各樣品在針孔紹盤(pin-h〇ied pan)中以10 °C/min自25°C加熱至300°C。樣品上方保持5〇 ml/min之氮氣沖洗。 儀器控制及資料分析軟體為STARe9.10版。 DVS(動態蒸 汽吸附） Projekt Messtechnik SPS ll-100n多樣品水蒸汽吸附分析 器。 使樣品在50%相對濕度(r.h.)下平衡，然後開始預定濕度程 式。 程式：在0%r.h.下2h 0 ^ 95% r.h.(5%/h) 在95% r.h.下3 h 95 -> 0%(10%/h) 在0〇/〇 r.h.下2 h 重量蒸汽吸 附(GVS) 吸附等溫線係使用經由SMS分析套件軟體控制之SMS DVS 内在水’吸附分析器來獲得。樣品溫度經由儀器控制而維 持在25°C下。藉由將乾及濕氮氣流混合（總流速為2〇〇 ml/min)來控制濕度。藉由位於樣品附近之經校準R〇tr〇nic 探針(動態範圍為1.0-100% RH)來量測相對濕度。作為％ RH之函數之樣品重量變化（質量鬆驰）由微量天平(精度土 0.005 mg)持續監測。 NMR H NMR光s普係在300.13 MHz下在Bruker DPX300儀器上加 以記錄，或使用Varian Unity Inova 400 NMR光譜儀以及5 mm反向三重共振探針來獲得ιΗ及丨七譜，質子在4〇〇12 MHz下操作。 除非另有陳述，否則樣品製備於d6-DMSO中。 拉曼顯微法 RenishawRM 1000。 穩定之二極體雷射785-nm激發，NIR增強之帕耳帖(Peltier) 冷卻CCD相機作為偵測器。量測係使用長工作距離2〇x物鏡 進行。量測範圍2000-1〇〇 cm·1。 151374.doc -61 · 201120043 FT-拉曼光 譜法 Bruker RFS100 〇 Nd : YAG 1064 nm激發’ 100 mW雷射功率，Ge谓測器， 64掃辑，範圍25-35〇0〇11-1’2(；111-1解析度。 TG-FTIR(聯 合傅立葉轉 換紅外光譜 分析之熱重 量分析） 具有Bruker FT-IR光譜儀Vector 22之Netzsch煞微量天平TG 209 '、 Ali#禍(敞式或具有微孔）’ N2氛圍，加熱速率1〇 t/min， 範圍25-25(TC。 … TGA(熱解重 量分析） TGA資料係在配備有34個位置自動取樣器的Mettler TGA/SDTA 851e上收集。使用有證銦對儀器進行溫度校 。準。通常5-30 mg各樣品裝載於預稱重鋁坩堝上且以1〇 °C/min自環境溫度加熱至400°C。樣品上方保持5〇 ml/min之 氮氣沖洗。 儀器控制及資料分析軟體為STARe 9.10版。 偏振光顯微 術(PLM) 在具有用於俘獲影像之數位視訊相機之Leica DLM偏振光 顯微鏡上研究樣品。將少量各樣品置於玻璃載片上，安放 於浸油中且用一玻璃片覆蓋，使個別粒子儘可能分開。用 適當放大率及與λ假色濾光器耦合之部分偏振光觀測樣品。 高溫載台顯 微術(HSM) 使用Leica DLM偏振光顯微鏡組合Mettier_T〇led〇 =TFP82HT向溫載台及用於影像俘獲之數位視訊相機進行 尚溫載台顯微術。將少量各樣品置於玻璃載片上，使個別 粒子儘可能分開。用適當放大率及與λ假色濾光器耦合之部 分偏振光觀測樣品’同時通常以6 ec/min自環境溫度加孰。 溶解度測定 用蹲自Eppendorf之溫度控制「Thermomixer c〇mf〇rt」以8〇〇 rpm授拌懸浮液(24小時’ 23 °C )。用Millipore離心過濾裝置 ^C30WNB(0.1 μ)及Hettich EBA 12 R離心機(l〇〇〇& g)過 經由HPLC之 熱力學水溶性 性係藉由將足夠化合物懸浮於水或緩衝液中以得到最 濃度$ 1 mg.m丨1之原始游離形式化合物來測定。參 準校準曲線經由HPLC進行定量。藉由對在與標準注 二ΐ之主峰相同的滯留時間處可見之峰值進行積分測定峰 面積’使用峰面積來計算溶解度。 經由UPLC之 化學純度測定 f配備有二極體陣列偵測器及使用MassLynx軟體^ gK^omass ZQ質譜儀的Waters Acquity系統上進行純度分 151374.doc s -62- 201120043 PXRD 或 XRPD (粉末X射線 繞射）

Bruker D8 ； 銅Κα輻射，40 kV/40 mA ; LynxEye偵測器，〇.〇202θ步長， 37 s步進時間(贫印time) » 樣品製備A : 樣π〇除施用低壓以獲得平整表面以外一般在不經任何特殊 下進行量測。矽單晶樣品固持器類型：a)用於多形現 象師檢之標準固持器，〇.1 mm深，需要樣品小於20 mg ; 1^0.5 mm深，12 mm空腔直徑，針對約4〇 mg ; c)i.〇 mm 冰’ 12 mm空穴直徑，針對約8〇 mg。所有在Bmker D8上量 測之樣品在量測期間皆經旋轉。 樣品製備B : 始樣品粉末，將在環境條件丁操作之樣品製備成平 严試樣。將約35 mg樣品緩和裝入切割成經拋光之零背景 f)石夕晶圓的空腔中。使樣品在分析期間在其自身平面内 旋轉。 資料收集： 角度範圍：2至42 ;。20步長：〇.〇5。20 ;收集時間：每步05 秒。

Bruker D2 Phaser 粉末繞射圖係使用Cu K輻射(30 kV，10 mA)、Θ-Θ幾 】Τ(使用Lynxeye偵測器形式5_42 2Θ)在Bruker AXS D2繞射 儀上加以收集。 集之軟體為DIFFRACSUITE且使用Diffiac Plus EVA13.0.0.2版分析並呈現資料β 資料收集： 0角ιϋ圍：5至42 °2Θ;步長：0.012 °2Θ ;收集時間：每步 樣品製備： 始Ϊ品粉末’將娜竟條件下操作之樣 得平板°式樣。將約i·2 品輕壓在石夕晶圓上以獲 ~~---------- 除非另有說明，否則試劑級溶劑用於所有其他情況中。 3.2鹽篩檢之方案 151374.doc -63· 201120043 3·2· Jf ·结邊才案 在96孔石英微量滴定盤中進行結晶實驗。游離藥物之儲 備溶液製備於DMSO、THF、1，4-二噁烷&Me〇H/DCM 1:3 v/v中。相對離子（己二酸、L·天冬胺酸、笨磺酸、苯甲 酸、辛酸、擰檬酸、反丁烯二酸、2,5_二羥苯甲酸、^麩 胺酸、乙醇酸、鹽酸、L-乳酸、L-蘋果酸、順丁烯二酸、 L-杏仁酸、甲磺酸、萘_1，5_二磺酸、卜羥基_2_萘甲酸、磷 酸、糖精、丁二酸、硫酸、L_酒石酸及甲苯磺酸）之儲備 溶液係製備於DMSO、THF、M_二噁烷&Me〇Ht。對於 胺基酸及無機酸而言，僅使用於水中之儲備溶液。添加化 予计量體積之游離藥物及所選成鹽劑的儲備溶液。在受控 制之N2流動（約0.4 L/min)下蒸發溶劑。在記錄所得殘餘物 之拉又資料之後，添加四種新溶劑（丙鋼、Mtbe、EtOAc 及甲苯）用於相平衡（漿液）。兩天後再次在受控制之乂流動 (約0.4L/min)下蒸發溶劑。 對於各殘餘物，收集至少一個拉曼光譜及一個影像（使 用正交偏振器（crossed poladzer)) 〇殘餘物之光譜與游離藥 物及相對離子之光譜㈣較。此組合提供成功鹽形成（游 離鹼、成鹽劑及可能鹽之拉曼光譜之間的差異）及結晶（拉 曼銳峰及強峰’雙折射）的明確指示。 所獲得以進一步進行快速篩檢之固體係經由lH nmr& 拉曼光谱法針對鹽形成加以分析。接著使用光學顯微術 (使用正交偏振器）對結晶程度分級，且將所選鹽按比例擴 大0 £ 151374.doc -64- 201120043 3.2.2使用二噁烷作為溶劑之篩檢 22個批次之5〇 mg化合物1用二噁烧（5 mL，100體積）處 理且加熱直至完全溶解。添加酸溶液（1.1當量）且使反應冷 卻至RT(鹽酸、萘-1,5-二磺酸、硫酸、曱苯磺酸、苯磺 酸、糖精、L-天冬胺酸、順丁烯二酸、磷酸、L-麩胺酸、 1-羥基-2-萘甲酸、2,5-二羥苯曱酸、L-酒石酸、檸檬酸、 L-杏仁酸、L-蘋果酸、乙醇酸、L-乳酸、苯甲酸、丁二 酸、己二酸、辛酸）。將所產生之固體過濾，經濾床（filter bed)乾燥，接著經由XPRD加以分析。 3.2.3使用異丙醇作為溶劑之篩檢 22個批次之50 mg化合物1用異丙醇（1.5 ml，30體積）處 理且升溫至50°C，隨後添加酸溶液（鹽酸、萘-1,5-二磺 酸、硫酸、甲苯磺酸、苯磺酸、糖精、L-天冬胺酸、順丁 烯二酸、磷酸、L-麩胺酸、1-羥基-2-萘甲酸、2,5-二羥苯 甲酸、L-酒石酸、檸檬酸、L-杏仁酸、L-蘋果酸、乙醇 酸' L-乳酸、苯曱酸'丁二酸、己二酸、辛酸）。反應接 著在50°C下振盪隔夜，隨後冷卻至RT，過濾且經由XRPD 加以分析。 3.2.4使用OMF之篩檢 22個批次之50 mg化合物1用DMF(2.5 m卜50體積）處理 且升溫直至所有物質皆溶解。添加酸溶液（鹽酸、萘-1，5-二磺酸、硫酸、甲苯磺酸、苯磺酸、糖精、L-天冬胺酸、 順丁烯二酸、磷酸、L-麩胺酸、卜羥基-2-萘曱酸、2,5-二 羥苯甲酸、L-酒石酸、檸檬酸、L-杏仁酸、L-蘋果酸 '乙 151374.doc -65- 201120043 醇酸、L-乳酸、苯曱酸、丁二酸、己二酸、辛酸）且使反 應冷卻至RT。將不產生固體之反應冷卻至4°C且若無固體 產生，則將實驗升溫至50°C，隨後添加2 ml TBME。接著 使反應冷卻至RT或4°C。 3.3鹽形成之按比例擴大的方案。 3.3.1苯甲酸鹽之製備。 如下進行此鹽之製備：99.3 mg呈游離鹼形式之化合物1 溶於1 2 mL DCM/MeOH 3:l(v/v)中。添加4.33 mL苯曱酸溶 液（0.05 mol/L於MeOH中）。溶劑在RT下在輕微1^2流動（無 流量控制）下蒸發。將2 mL MTBE添加至黏性殘餘物中且 混合物在RT下攪拌3天。將所得固體濾除且在真空中乾 燥。 3.3.2檸檬酸鹽之製備。 如下進行此鹽之製備：99.8 mg呈游離鹼形式之化合物1 溶於12 mL DCM/MeOH 3:l(v/v)中。添加4.35 mL檸檬酸溶 液（0·05 mol/L於MeOH中）。溶劑在RT下在輕微1^2流動（無 流量控制）下蒸發。將2 mL MTBE添加至黏性殘餘物中且 混合物在RT下攪拌3天。將所得固體濾除且在真空中乾 燥。 3.3.4反丁烯二酸鹽之製備。 可經由以下方案之一製備此鹽：

方案A

將100.8 mg呈游離鹼形式之化合物1溶於4.5 mL DMSO 中。添加4.40 mL反丁稀二酸溶液（0.05 mol/L於DMSO £ 151374.doc -66- 201120043 中）溶％丨在RT下在輕微N2流動（無流量控制）下蒸發。獲 付部分結晶粉末。

方案B

將99.3 mg呈游離驗形式之化合物1溶於i2 mL DCM/Me〇H 3:1(V/V)中。添加4.32 mL反 丁烯二酸溶液 (〇_〇5 mol/L於Me0H中）。觀測到沈澱。將懸浮液在rt下攪 拌5天》將所得固體濾除且在真空甲乾燥。

方案C 將151.4 mg呈游離驗形式之化合物1溶於18紅 DCM/Me〇H 3:1(V/V)中。添加 6_6 mL 反丁烯二酸溶液（〇 〇5 mol/L於MeOH中）。觀測到沈澱。將懸浮液在rt下攪拌6 天。將所得固體濾除且在真空中乾燥。 3-3.5曱磺酸鹽之製備。 將71叫曱續酸添加至50 mL Me〇_5〇〇叫呈游離驗形 式之化合物1的混合物中。形成澄清溶液。在4〇它下真空 蒸發MeOH。將50 mL乙醚添加至殘餘物中且將混合物攪拌 隔夜。將所得固體濾除且在真空中乾燥。 ·6製備確酸鹽之一般方案。 以類似方式製備磺酸鹽：2〇〇 mg化合物1用水（1〇〇 mi)及 . 1當量適當酸處理。使反應升溫以有助於溶解，且需要時 添加諸如tBuOH之共溶劑（約60 ml)。接著藉由凍乾來乾燥 反應。物質接著未經進一步表徵用於成熟實驗（mat⑽州αη experiment)中。 對於成熟實驗，約20 mg非晶鹽用1 ml溶劑（描述於下表 151374.doc -67· 201120043 中）處理且置放於成熟腔室中，該成熟腔室在環境溫度與 5 〇 C之間循環’在各條件下消耗4小時。2.5天後，經由光 學顯微法檢查樣品之結晶跡象。 表2:用於使苯磺酸鹽及乙二磺酸鹽成熟的溶劑。 鹽 溶劑 苯磺酸鹽 2-丙醇或2-丁醇 乙二磺酸鹽 甲基乙基酮、或2-丙醇、或2-丁醇、或2-曱基-1·丙醇 3結晶笨磺酸鹽形式i之形成 使非晶苯續酸鹽（50 mg)在丙酮（2 mL)或乙腈（2 mL)中成 熟。樣品置放於成熟腔室中，自環境溫度至5〇〇c進行循 各條件下消耗4小時。4天後’終止實驗，過濾固體， 經遽床乾燥且經由XPRD加以分析，如圖11A所示。 3.3.8結晶苯磺酸鹽形式2之形成 使非晶苯磺酸鹽（50 mg)在1，2-二甲氧基乙烷（2 mL)中成 熟。樣品置放於成熟腔室中，自環境溫度至5〇〇c進行循 環，各條件下消耗4小時。4天後，終止實驗，過濾固體， 經濾床乾燥且經由XPRD加以分析，如圖丨1B上所示。 H9結晶苯磺酸鹽形式3之形成 使非晶苯磺酸鹽（50 mg)在1，4-二噁烷（2 mL)中成熟。樣 品置放於成熟腔室中，自環境溫度至5〇t進行循環，各條 件下消耗4小時》4天後，終止實驗，過濾固體，經濾床乾 燥且經由XPRD加以分析，如圖11 c上所示。 3.3.10苯磺酸鹽之形成 舉例而言，將化合物1(4 g)與水（16〇 mL，4〇體積）混合

151374.doc -68- S 201120043 且添加苯續酸（1.0 5當量）。混合物在攪拌下升溫至回流以 完全溶解化合物。為了獲得結晶非晶鹽，使混合物冷卻， 從而導致形成固體’該固體藉由過濾加以分離，經濾床乾 燥並用少量異丙醇洗蘇。獲得結晶固體，如經由PXRD (圖 10Α)所示。 為了獲得非晶形式’添加第三丁醇（丨00 mL)，且將混合 物進一步加熱直至已完全溶解，並藉由凍乾獲得非晶固 體，如經由PXRD(圖10B)所示。 3.3.11笨磺酸鹽之大規模形成 將呈游離鹼形式之化合物1(1當量，30 g)與溶劑（iPr〇H/ 水’ 3 /1或9/1 ’ 1 3體積）混合。將批量加熱至回流，隨後添 加溶於很小比例溶劑（2體積）中之酸（1.05當量）。溶液在回 流下攪拌且溶解快速發生，所得溶液用3.3.7中之以上方案 中獲得的固體進行加晶種’並使其冷卻至室溫（_1(rc 至-30°C /小時）。藉由過濾來分離所得固體並真空乾燥（在 40°C /0.5毫巴下隔夜）。 實例4 :水溶性測定 各鹽皆懸浮於水中且在22 °C及400 rpm下振盈24 h。將所 得懸浮液過濾（0.2 μιη濾紙）。經由FT拉曼分析所得固體。 量測濾液pH值並經由HPLC測定游離驗濃度。 15l374.doc •69· 201120043 表3:化合物1相對於反丁烯二酸鹽及甲磺酸鹽之水溶 性。 樣品 懸浮液 含量 測得之 溶解度 (mg/mL) 濾液 pH值 溶解度 改良 呈游離鹼形式之化合物1 0.5mL 中 22.6 mg 0.07 6.9 N/A 呈反丁烯二酸鹽形式之化合物1 0.5 mL 中 20.7 mg 1.91 3.2 27倍 呈曱磺酸鹽形式之化合物1 0.5 mL 中 97.5 mg 126.9 2.6 1813 倍 實例5:熱力學水溶性研究 水溶性係藉由將足夠化合物懸浮於水或緩衝液中以得到 最大最終濃度2 1 mg.πιΓ1之原始游離形式化合物來測定。 參考標準校準曲線經由HPLC進行定量。藉由對在與標準 注射液中之主峰相同的滯留時間處可見之峰值進行積分測 定峰面積，使用峰面積來計算溶解度。若有足夠固體剩 餘，則收集XRPD。 表4 :研究參數 參數 值 吸附-掃描1(RH) 40-90 解吸附/吸附-掃描2(RH) 90-乾，乾-40 間隔(％RH) 10 掃描數 2 流速(ml/min) 200 溫度(°C) 25 穩定性(°C/min) 0.2 .吸附時間(小時） 6小時中斷 151374.doc •70- 201120043 表5:動態鹽溶解度結果 鹽 溶解介質 溶解度 游離驗 緩衝液pH 7.4 緩衝液pH 2.0 純水 0.01 mg.mL'1 0.3 mg.mL'1 0.01 mg.mL'1 曱磺酸鹽 缓衝液pH 7.4 缓衝液pH 2.0 純水 0.3 mg.mL'1 2.6 mg.mL'1 2.7 mg.mL'1 苯磺酸鹽 缓衝液pH 7.4 缓衝液pH 2.0 純水 0.046 mg.mL'1 0.33 mg.mL'1 1.2-1.3 mg.mL'1 磷酸鹽 缓衝液pH 7.4 緩衝液pH 2.0 0.071 mg.mL'1 0.32 mg.mL'1 實例6 :動態蒸汽吸附分析（DVS)研究 對根據以上方案獲得之甲磺酸鹽及反丁烯二酸鹽進行 DVS研究。如下進行相對濕度之循環：（50% + 0% + 95〇/〇今 50%) ° 圖8A展示反丁烯二酸鹽之DVS型態，指示該鹽為弱潮解 性（10%)，且圖8B展示曱磺酸鹽之DVS型態，指示該鹽為 弱潮解性（6%)。 實例7:重量蒸汽吸附分析（GVS)研究 通常在環境條件下將5-20 mg樣品置放於配衡篩網不鏽 鋼吊籃中。樣品係在40% RH及25°C (典型ί内條件）下進行 裝卸。如下文所概述（2個掃描產生1個完整循環）作出吸濕 等溫線。標準等溫線係在25°C下在10% RH間隔下在0.5- 151374.doc -71 - 201120043 90〇/〇 RH範圍内作出。 樣σ〇在完成等溫線之後加以回收且經由XRPD再分析。 备進行此測試時，苯磺酸鹽僅展示微小潮解性，在自乾 燥變為9〇%rH時，吸收小於〗45%質量。（圖8c)。 實例8 :穩定性研究 8 · 1 :物理穩定性研究。 此實驗之目的在於測定本發明之鹽相對於游離驗之穩定 性。測試之本發明之鹽及游離驗係以大塊形式加以使用， 且研究在3種條件下進行： -在一敞式容器中，在RT，5%相對濕度下 -在一敞式容器中，在RT，56%相對濕度下 -在一敞式容器中，在RT, 75%相對濕度下。 在4個時間點獲取鹽形式及游離鹼之樣品：斤〇、丨爿個 個月及t-3個月。各樣品接著經由拉曼光譜法、 DSC及PXRD分析加以分析。 8.2 :化學穩定性 貫驗之目的在於測定本發明之鹽相對於游離鹼之穩定 、式之本發明之鹽及游離鹼係以大塊形式加以使用， 且研九在4種條件下進行： •在一敞式容器中，在25t，60。/〇相對濕度下 -在一敞式容器中，在4〇t，75%相對濕度下 _在一进閉容器中，在50。(：下 •在一密閉容器中，在5t下❶ 在4個時間點獲取鹽形式及游離鹼之樣品：t=〇、t=l個

S I51374.doc -72· 201120043 月、t=2個月及t=3個月。監測各樣品之外觀且進一步經由 HPLC分析樣品純度，且水含量係使用卡耳-費雪（Karl-Fisher)分析加以量測。 實例9 :拉曼光譜法及PXRD表徵。 呈游離鹼形式之化合物1及相應反丁烯二酸鹽、曱磺酸 鹽及苯磺酸鹽之結晶性係經由拉曼光譜法及PXRD測定， 如圖9A、9B、9C、9D、9E、9F及9G中所呈現。所有四種 形式皆為結晶。 實例10 :鹽應力測試。 在多種條件下研究所產生之鹽的化學穩定性，且樣品接 著經由UPLC加以分析。 通常，對於一種鹽而言，6個樣品保持40°C下、60°C 下、80°C 下、40°C 75% RH 下、60°C 7 5% RH 下及 80〇C 75% RH下歷時8天，此後其經由UPLC加以分析。 舉例而言，當苯磺酸鹽儲存在40°C，75% RH下2週時， 對樣品之分析揭示99.29%之純度，從而指示樣品之化學純 度無變化。 生物實例 實例11 : MAPKAP-K5分析 MAPKAP-K5 反應係使用 0.1 或 0.2 μ(：ί 33P-ATP; 0·6 μΜ ATP ; 1 mU ΜΑΡΚΑΡ-Κ5 ; 3 μΜ ΜΑΡΚΑΡ-Κ5肽受質於閃 爍板形式（Fla shP late format)中在室溫下培育30分鐘來進 行。 閃爍板檢定： 151374.doc -73- 201120043 MAPKAP-K5激酶反應係於384孔聚丙烯培養盤（Matrix Technologies)中進行，接著轉移至抗生蛋白鏈菌素塗佈之 3 84 孔閃爍板（Perkin-Elmer)中。使用 Hydra(Robbins Scientific)向含有2 pL測試化合物或標準抑制劑之各孔中 添加13 μί酵素混合物或稀釋劑。反應係藉由使用 Multidrop(Thermo-Labsystems)添加 10 pL [2·5χ]受質混合 液來起始，在分析中產生以下最終濃度： 1 mU ΜΑΡΚΑΡ-Κ5 3 μΜ MAPKAP-K5肽受質

0.6 μΜ ATP 0.004 μα [33Ρ]-γ-ΑΤΡ/μί lx反應緩衝液 培養盤在室溫下培育30分鐘。反應係藉由使用Micro-fill(Biotek)向各孔中添加25 μί EDTA(50 mM)來終止。反 應使用Zymark機器人系統轉移至抗生蛋白鏈菌素塗佈之閃 爍板中。培養盤在室溫下培育60分鐘。所有孔皆使用 Tecan盤洗滌器以1 00 pL磷酸鹽緩衝鹽水洗滌3次。藉由在 Packard Top Count上對閃爍板（空孔）進行閃爍計數來測定 放射性。 酵素混合物： 酵素 50 mM Tris Hcl(pH 7.5)

0.1 mM EGTA 2 mM DTT 151374.doc -74- 201120043

1 mg/mL BSA 反應緩衝液： 50 mM Tris Hcl(pH 7.5) 0.1 mM EGTA 10 mM乙酸鎮

2 mM DTT 化合物1及化合物2已或可根據上述合成方法製備。可使 用實例12中描述之MAPKAPK5分析法測定之各化合物的活 性介於0.1 nM與100 nM之間。 實例12·用於鑑別活化初級滑液纖維母細胞之ΜΜρι表現 之調控劑之分析的開發。 為了鑑別降低細胞之ECM降解活性之化合物，可誘發細 胞之ECM降解活性以允許對此活性進行適當偵測且獲得較 明確讀數。在RA之情形下，所選細胞為哺乳動物滑液纖 維母細胞且可用於誘發ECM降解活性之觸發物為關節炎領 域中相關之細胞激素：例如TNF-α、ILlp、IL6、OSM、 IL17及MIFl-a。此清單由於RA發病機制中可能涉及之細 胞激素（Smolen及Steiner，2003)過多而並不全面。為了建 立儘可能接近病變之複雜性的活體外分析，施用之觸發物 應為藉由使關節炎領域中相關之產生細胞激素的細胞（諸 如單核球、巨噬細胞、τ_細胞及B_細胞）與觸發物接觸所產 生之因子混合物。產生細胞激素的細胞對接觸起反應產生 複合及無偏之因子混合物。若所用產生細胞激素的細胞亦 見於血管翳中且用於產生此觸發物之細胞激素見於類風濕 151374.doc •75· 201120043 性關節炎患者之滑液中，則最終產生之因子混合物將含有 一部分存在於關節炎患者關節中之因子。 「MMP分析」之原理 基質金屬蛋白酶（MMP)具有各種生理作用，例如使其他 蛋白酶、生長因子成熟及使細胞外基質組分降解。ΜΜρι 為能夠降解天然膠原蛋白（骨及軟骨之主要組分）2MMp家 族的成員之一。滑液纖維母細胞（817)之ΜΜρι表現增加可 診斷關節炎疾病之進展且可預示關節中之侵蝕過程 (Cunnane等人，2001)。可藉由以與類風濕性關節炎相關 之觸發物（如類似TNF-α或ILlp之細胞激素）活化SF來增加 SF之MMP1表現（Andreakos等人，2003)。總之，對活化81? 產生之MMP1含量的量測結果為在RA之情形下高度相關的 讀數，因為此事件反映SF向如血管翳中所見之侵蝕性表型 活化之程度。若活化SF中候選藥物標靶之表現降低導致此 等細胞之MMP1表現降低，則證實該藥物標靶涉及於 MMP1表現之調控且因此視為對於開發治療尺八之治療策略 而言為相關的。 在以下實例中，進一步稱為「MMP分析」之分析的開發 監測滑液纖維母細胞（SF)對各種活化觸發物起反應產生的 MMP 1 (貫例9.1)»接著描述使用此分析來驗證視為開發R a 療法之藥物標靶的基因產物（實例9 2)。藥物標靶之驗證係 使用重組腺病毒來進行，該等重組腺病毒進一步稱為阻斷 基因表現之病毋（knock-down virus)或Ad-siRNA，其介導 經由基於RNAi(RNA干擾）之機制（參見WO 03/020931)使靶

S 151374.doc •76- 201120043 基因表現量降低的shRNA在細胞中之表現。下文進一步描 述使用「MMP分析」來測試調節鑑別出之藥物標靶活性的 化合物。 分析實例 使用之對照病毒： 用於此等研究中對照病毒列於以下。如W099/64582中 所述，dEl/dE2A腺病毒係藉由於PER.E2A包裝細胞 (packaging cell)中共轉染辅助質體 pWEAd5AflII-rITR.dE2A而自此等接頭質體（adapter plasmid)產生。 陰性對照病毒：

Ad5-eGFP_KD ：靶序列：GCTGACCCTGAAGTTCATC (SEQ ID NO: 1)。使用Sapl位點選殖入載體中且如 W003/02093 1中所述產生病毒。

Ad5-Luc_vl3_KD :靶序歹GGTTACCTAAGGGTGTGGC (SEQ ID NO: 2)。使用Sapl位點選殖入載體中且如 W003/02093 1中所述產生病毒。

Ad5-M6PR_vl_KD ：靶序列 CTCTGAGTGCAGTGAAATC (SEQ ID NO: 3)。使用Sapl位點選殖入載體中且如 W003/02093 1中所述產生病毒。 陽性對照病毒：

Ad5-MMPl_vl0_KD :靶序列 ACAAGAGCAAGATGTGGAC (SEQ ID NO: 4)。使用Sapl位點選殖入載體中且如 W003/02093 1中所述產生病毒。 用於標靶驗證之病毒： 151374.doc •77- 201120043

Ad5-MAPKAPK5_vl3_KD :靶序列CGGCACTTTACAGAGAAGC (SEQ ID NO: 5)。使用Sapl位點選殖入載體中且如 W003/02093 1中所述產生病毒。

Ad5-MAPKAPK5_vl2_KD :靶序列 ATGATGTGTGCCACACACC (SEQ ID NO: 6)。使用Sapl位點選殖入載體中且如 W003/〇2〇931中所述產生病毒。 實例12.1 : MMP分析之開發 開發384孔形式之ELISA用於量測MMP1。測試各種初級 抗體以及各種ELISA方案。以下方案經開發並驗證以量測 3 84孔培養盤中之8尸上清液中的]\41^?1含量：白色1^111七&〇 600 384孔培養盤（Greiner)塗有2 pg/mL抗MMP1抗體 1^八81346(0^111卜〇11)»抗體稀釋於緩衝液40(1.218 1'1^鹼 (Sigma)、0.58 g NaCl(Calbiochem)及 5 mL 10% NaN3 (Sigma)於1 L milliQ水中且pH值調整至8.5)中。在4°C下培 育隔夜之後，培養盤用PBS(80 g NaCl、2 g KCl(Sigma)、 11·5 g Na2HP04.7H20及 2 g KH2P〇4於 10 L milliQ 中；pH 7.4)洗滌並用100微升/孔之酪蛋白緩衝液（2%酪蛋白（VWR International)於PBS中）阻斷。次日，酷·蛋白缓衝液自 ELISA培養盤移除且經50微升/孔之EC缓衝液（4 g酪蛋白、 2-13 g Na2HP04(Sigma)、2 g 牛白蛋白（Sigma)、0.69 g NaH2P04.H20(Sigma)、0.5 g CHAPS(Roche)、23.3 g NaCl、4 mL 0,5 M EDTA pH 8(Invitrogen)、5 mL 10% NaN3於1 L milliQ中且pH值調整至7.0)置換。將0.25 mM DTT(Sigma)添加至解凍樣品培養盤中。在移除EC緩衝液

S 151374.doc • 78· 201120043 之後，20 μί樣品轉移至ELISA培養盤。在4°C下培育隔夜 之後，培養盤用PBS洗滌兩次且用PBST洗滌一次（含有 0.05°/。吐溫-20(Sigma)之PBS)並與35微升/孔之經生物素標 記抗MMP1抗體溶液（R&D)—起培育。此二次抗體稀釋於 緩衝液 C(0.82 g NaH2P04.H20、4.82 g Na2HP〇4、46.6 g NaCU、20 g牛白蛋白及4 mL 0,5M EDTA pH 8於2 L milliQ 中且pH值調整至7.0)中，濃度為5 pg/mL。在RT下培育2 h 之後，如上所述洗滌培養盤且與50微升/孔之抗生蛋白鏈 菌素-HRP接合物（Biosource) —起培育。抗生蛋白鏈菌 素-HRP接合物稀釋於缓衝液C中，濃度為0.25 pg/mL。45 min後，如上所述洗蘇培養盤且與50微升/孔之BM Chem ELISA受質（Roche)— 起培育 5 min。在Luminoscan Ascent 光度計（Labsystems)上以200毫秒之積分時間或以Envision 讀取器（Perkin Elmer)進行讀數。 在用RA領域中相關之細胞激素（TNF-α、IL1P及OSM)或 其組合處理後，SF之MMP1表現增加以白條展示於圖2 中。對於此實驗，SF接種於96孔培養盤中，3,000個細胞/ 孔。24 h後，將培養基換成補充有1% FBS之Ml 99培養 基。在更換培養基後一天，將細胞激素或其組合添加至培 養物中，各細胞激素經添加直至最終濃度為25 ng/mL。添 加細胞激素後72 h，上清液經收集並如以上給出之方案中 所述於MMP1 ELISA中進行處理。與此實驗並行，使用相 同方案用經相同細胞激素或細胞激素組合於Μ199培養基 + 1% FBS中處理48 h之ΤΗΡ1細胞上清液（2倍稀釋於 151374.doc -79- 201120043 M199+1% FBS中）觸發SF。此等樣品之MMP1含量係以灰 條展示於圖2中。相較於用單獨重組TNF-α觸發之SF(3倍誘 發），用經TNF-a處理之THP1細胞之上清液觸發對SF之 MMP1表現誘發較強（> 4.5倍誘發）且幾乎等於經由3種純化 細胞激素（TNF-a、Ιίΐβ、OSM)之混合物獲得之誘發的5 倍。此結果指示經TNF-a誘發之THP1細胞的上清液除TNF-a 外亦含有活化SF以表現MMP1的其他促發炎因子。因為 TNF-a在RA發病機制中之作用經驗證（諸如英利昔單抗及 依那西普之TNF-a阻斷劑展示一些治療RA患者之功效）且 THP-1細胞代表存在於RA患者關節中之單核球/巨噬細 胞，所以藉由使THP-1細胞與TNF-a接觸所製備之基於 TNF-a的觸發物混合物將含有存在於RA患者關節中隨後與 RA相關之因子。此基於TNF-a之複合觸發物，進一步稱為 「複合觸發物」，將進一步用作「MMP分析」之基礎。 對「複合觸發物」引起之SF活化的抑制係使用地塞米松 (dexamethasone)，一種亦強烈降低齧齒動物中膠原蛋白誘 發之關節炎的有效消炎劑（Yang等人，2004)來展示（圖3)。 地塞米松經證明以劑量依賴性方式降低複合觸發物活化之 SF所產生之MMP1的量。SF以3000個細胞/孔之密度接種於 96孔培養盤中。接種後24小時，將遞增濃度之地塞米松添 加至細胞中。在培育隔夜之後，每孔之培養基再新成經 TNF-ct處理之THP-1細胞上清液（50%稀釋於M199 + 0.5% FBS中）及與前一天所添加相同之濃度的地塞米松。在處理 後48小時，收集上清液且進行上述MMP1 ELISA。添加地 151374.doc -80 · 201120043 塞米松明顯降低了 SF之MMP1表現，IC5〇值約1 nM(參見圖 3)。此等資料顯示可藉由添加生理相關抑制劑來降低活化 SF之MMP1表現且表示「MMP分析」之原理驗證。 實例12.2 : MAPKAPK5調節SF「複合觸發物」誘發之 MMP1表現 (A)Ad-siRNA病毒阻斷MAPKAPK5表現之功能。 根據W003/020931中描述之程序來產生介導靶向 MAPKAPK5及eGFP之siRNA之表現的重組腺病毒。用於重 組腺病毒中之靶序列為：CGGCACTTTACAGAGAAGC (SEQ ID NO: 5)以及 ATGATGTGTGCCACACACC(SEQ ID NO: 6)。用於重組腺病毒中之eGFP mRNA内的乾序列為： GCTGACCCTGAAGTTCATC(SEQ ID NO: 1)。此等序列係 使用Sapl位點選殖入接頭質體中。如W099/64582中所 述，dEl/dE2A腺病毒係藉由於PER.E2A包裝細胞中共轉染 輔助質體pWEAd5AflII-rITR.dE2A而自此等接頭質體產 生。 靶向MAPKAPK5之腺病毒之功能性係如下進行測試。此 等腺病毒用於如下對培養於皮氏培養皿（petri dish)中之初 級人類SF進行感染。在第1天，每個皮氏培養皿接種 500.000個SF。1天後，細胞在4000 MOI(基於經由Q-n-PCR確定之病毒效價（每毫升之病毒粒子數））下經Ad5-MAPKAPK5-vl3_KD(1.6E9 VP/mL)或 Ad5-eGFP-v5—KD (1 _3E10 VP/mL)感染。在第7天，使用胰蛋白酶EDTA溶液 根據標準程序使細胞自皮氏培養皿分離。接著藉由添加補 151374.doc •81· 201120043 充有10%FBS之DMEM生長培養基來中和胰蛋白酶。接著 經由離心步驟（1000 rpm，5 min)收集細胞。離心塊溶解於 100 μι 新鮮 RIPA 緩衝液（50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaC卜 1%去氧膽酸鹽（deoxycholate)、1% 曲通 Xl〇〇(Triton X100)、0.1% SDS)中。接著音波處理樣品10秒。接著如提 供者所述使用BCA套組（Pierce，目錄號23227) ’使用BSA 作為標準物來測定樣品之蛋白質濃度。向30 pg於RIPA緩 衝液中稀釋至19.5 μΐ之細胞溶解產物中添加3.5 kL還原劑 (NuPage還原劑第 10號，Invitrogen NP0004)及7.5 μι樣品 緩衝液（NuPage LDS樣品緩衝液，Invitrogen ΝΡ0007)。接 著將30 μί樣品煮沸5 min並裝載於10%聚丙烯醯胺凝膠 (Invitrogen NP0301)上。為了估計蛋白質阻斷之程度，亦 將 15 pg、7.5 pg 及 3.75 pg 經 Ad5-eGFP-v5_KD 感染之細胞 的溶解產物裝載於凝膠上。接著在100 V下於lxMOPS/SDS NuPage電泳緩衝液（Invitrogen NP001)中跑膠2小時。10 μΐ 外加預染色標準物之Seablue(Invitrogen LC5925)用於估計 凝膠上之蛋白質大小。凝膠上之蛋白質接著使用藉由混合 100 mL Nupage轉移緩衝液20*(NP0006-1)、400 mL 甲醇及 1500 mL Milli Q水製備之轉移緩衝液，經由濕式墨點程序 轉移至PVDF膜（Invitrogen LC2002)上。在轉移之前，膜首 先浸泡於甲醇中及轉移緩衝液中。轉移在100 V下進行90 分鐘。接著膜浸泡於阻斷緩衝液（2%阻斷粉末 (Amersham，RPN 2109)在 PBST(補充 0.1% 吐溫 2〇(Sigma， P1379)之PBS)中製備）中30 min阻斷。在阻斷之後，使用於

S 151374.doc -82· 201120043 阻斷緩衝液中稀釋250倍之對抗MAPKAPK5之小鼠單株抗 體（BD Biosciences，目錄號612080)來進行免疫偵測。在 與此初級抗體一起培育隔夜之後，膜用PBST洗滌3次且_ 於阻斷緩衝液中稀釋50000倍之二次抗體（多株山羊抗小鼠 Ig，HRP接合物（DAKO P0447))—起培育1小時。墨點接著 於PBST中洗滌3次且根據製造商說明書在Kodak影像儀上 以 ECL advance(RPN2109，Amersham)進行偵測。西方墨 點揭示相較於經Ad5-eGFP-v5_KD陰性對照病毒感染之細 胞，MAPKAPK5在經Ad5-MAPKAPK5-vl3_KD感染之細胞 中表現量較低。與經稀釋Ad5-eGFP-v5_KD感染樣品之比 較使得可估計表現降低2倍。相等載量之30 樣品係藉由 在經由「洗提程序」（使膜在PBST中煮沸5分鐘）移除 ΜΑΡΚΑΡΚ5抗體之後免疫偵測β-肌動蛋白（actin)來說明。 對β-肌動蛋白之免疫偵測係根據關於MAPKAPK5偵測所述 之方法，但使用對抗β-肌動蛋白之山羊多株抗體（Santa Cruz，目錄號SC-161 5)作為初級抗體在1000倍稀釋度下及 兔抗山羊抗體作為二次抗體在50000倍稀釋度下進行。此 實驗之結果於圖4中給出。總之，此實驗說明所產生Ad-siRNA病毒降低初級人類SF中MAPKAPK5表現量的功能 性。 (Β) MAPKAPK5阻斷性Ad-siRNA降低SF之誘發性MMP1 表現 如下測試Ad5-MAPKAPK5-vl3_KD病毒在「MMP分析」 中之功效。第1天，SF(第9至第10代）以每孔3000個細胞之 151374.doc -83- 201120043 密度接種於96孔培養盤中之完全滑液生長培養基（Cell Applications)中。一天後，細胞經遞增量（3、6、9、12或 15 μΐ)之以下病毒感染：Ad5-eGFP-v5_KD、Ad5-MAPKAPK5-vl2_KD > Ad5-MAPKAPK5-vl 3_KD、Ad5-MMPl-vlO_KD。藉由添加中性病毒Ad5-Luc-vl3_KD來修 正病毒載量以使每孔中關於細胞之最終病毒體積皆為15 μΐ^。此修正保證觀測之效應不由施用於細胞之病毒載量產 生。接著將細胞培育5天，隨後進行活化步驟。此步驟涉 及由75 μί補充有25 pL「複合觸發物」之Ml99培養基置換 每孔中的生長培養基。活化步驟後48小時，收集上清液且 進行如實例1中所述之MMP1 ELISA。實驗結果展示於圖5 中。實驗品質由靶向MMP1之Ad-siRNA病毒自身之功效來 說明。此陽性對照病毒強烈降低SF之MMP1表現，而經設 計以靶向螢光素酶表現之陰性對照病毒不影響MMP1表現 量。用於驗證MAPKAPK5標靶之兩種病毒（Ad5-MAPKAPK5-vl2_KD 及 Ad5-MAPKAPK5-vl3)亦導致複合觸 發物誘發之初級人類SF的MMP1表現明顯降低。可由此實 驗斷定MAPKAPK5表示經證明可調節SF中MMP1表現的有 價值藥物標靶。類似地，預期小分子化合物對MAPKAPK5 酵素活性之抑制可降低「MMP分析」中「複合細胞激素」 誘發之MMP1表現。亦預測小分子化合物對MAPKAPK5酵 素活性之抑制可降低與RA相關之關節退化。 (C)測試抑制MAPKAPK5之化合物的活體外「MMP分析」 根據以下方案於「MMP分析」中測試在生物化學分析

S 151374.doc -84- 201120043 (亦即無細胞，使用純化酵素）中抑制MAPKAPK5活性之化 合物。 將化合物母儲備溶液（於100% DMSO中濃度皆為10 mM) 於水（蒸餾水，GIBCO，無DNA酶及RNA酶）中稀釋10倍以 獲得於10% DMSO中為1 mM之中間工作儲備溶液。此中間 工作儲備溶液進一步於10% DMSO中稀釋3倍（或10倍）以獲 得於10% DMSO中為333 μΜ(或100 μΜ)濃度之中間工作儲 備溶液。1 mM以及33 3 μΜ(或100 μΜ)中間工作儲備溶液 接著進一步於1.1% DMSO中稀釋10倍以獲得於2% DMSO 中為100 μΜ及33.3 μΜ(或10 μΜ)濃度的1〇χ工作儲備溶 液。此l〇x工作儲備溶液接著於補充有1% FBS之Μ199培養 基中稀釋10倍以獲得含有10 μΜ及3.33 μΜ(或1 μΜ)化合物 以及0.2% DMSO的最終「lx化合物製劑」。此等為對於細 胞測試化合物之最終條件。同時，l〇x工作儲備溶液於在 補充有1% FBS之M199中稀釋2倍的「複合觸發物」（亦即 如實例1中所述產生之經TNF-α處理之THP 1細胞的上清液） 中稀釋10倍以產生「於50%複合觸發物製劑中之lx化合 物」。 在第1天，RASF以3 000個細胞/孔之密度接種於96孔培 養盤（平底，經處理組織培養盤，Greiner)中之完全滑液生 長培養基（Cell Applications)中。第5天，如下將化合物添 加至培養之細胞中。培養基自細胞完全移除且經75 μί於 補充有1% FBS及0.2% DMSO之Μ199培養基中含有10 μΜ 或3.33 μΜ(或1 μΜ)化合物的「lx化合物製劑」置換。在 151374.doc -85 - 201120043 使化合物平衡且進入細胞之2小時培育期之後，將25 pL 「於50%複合觸發物製劑中之1 X化合物」添加至於含有相 應濃度之相應化合物之孔中之「1 X化合物製劑」上方的孔 中。以此方式，稀釋8倍之複合觸發物最終施用於細胞。 接著培育48小時且隨後於如上所述之MMP1 ELISA中處理 20 μΐ細胞上清液，從而提供原始資料（RLU :相對發光單 位）。以下對照包括在實驗中。最大信號對照，其中細胞 經由複合觸發物活化但僅添加0.2% DMSO媒劑（且因此無 化合物）。此對照指示可於測試中達成之最大ΜΜΡ1含量。 最小信號對照亦包括在此等實驗中。此時，細胞不經觸 發。細胞培養基接著在第5天換成補充有1% FBS之100 μί Μ199培養基。此對照獲得RASF產生之基線ΜΜΡ1含量。 接著基於由ELIS Α獲得之RLU資料用以下公式來計算化合 物對MMP1表現的抑制百分比： [[(最大MMP1含量-最小MMP1含量）-(Y濃度之化合物X下 之ΜΜΡ1含量-最小ΜΜΡ1含量）]/(最大ΜΜΡ1含量-最小 ΜΜΡ1 含量）]χ100。 如下評估化合物毒性。第1天，SF以每孔3000個細胞之 密度接種於白色經處理96孔組織培養盤中之100 μί完全滑 液生長培養基中。在此實例中，如上所述進一步處理化合 物、向細胞中添加化合物以及活化細胞以測定ΜΜΡ 1含 量。在48小時培育期之後，培養基自孔中移除，經50 μί 補充有1% FBS之新鮮Ml 99培養基置換。接著將5 0 pL受質 (Promega Celltiter Glow細胞活力套組）添加至孔中。在10

S 151374.doc -86- 201120043 mm之培育期之後，量測發光信號。發光信號相較於最大 對照孔降低50%以上視為反映顯著毒性。「MMp分析」中 未觀測到所測試化合物之毒性。 應瞭解諸如各種化合物之差異性細胞穿透能力之因素可 造成化合物活性在活體外生物化學分析與細胞MMP分析之 間的差異。 使用上述測定MMP1活性之方案，化合物1具有介於ι〇〇 nM與 1〇〇〇 nM之間的 IC50。 實例13:評估化合物對人類pBMc釋放細胞激素之影響的 分析 人類末梢血液單核細胞（PBMC)係分離自由健康志願者 之血液製備之「白灰球層」，一般係根據B0yum(1984)2* 法加以分離。簡言之，白血球層用lxPBS(Gibco)l :1稀釋 且將30 mL小心置放於50 mL Falcon管中之20 mL Lymphoprep™(Lucron Bioproducts)的上方。在離心（35 min，400 g，18°C)之後，自白色界面相（interphase)收集單 核細胞並藉由再懸浮及離心（1 〇 min，200 g)來用1 xpBS洗 滌3次。經分離PBMC最終再懸浮於補充有1 〇%熱不活化 FBS(Hyclone)之 RPMI 1640(目錄號 21875，Gibco)中。 對於分析而言，將PBMC以160 μ：ί 2.5E6個細胞/毫升接 種於96孔培養盤（Nunc)中。連續稀釋之測試化合物係首先 製備於DMSO(Sigma)中’接著於含有1%熱不活化fbs之 M199培養基（Gibco)中稀釋50倍。化合物於分析培養盤中 進一步稀釋10倍，獲得0.2°/。之最終DMSO濃度。細胞在 I5I374.doc -87- 201120043 37°C、5% C02下與化合物一起預培育1小時。接著，細胞 用添加20 pL體積以達到1 pg/mL之最終濃度的LPS(大腸桿 菌co")血清型 026:B6，目錄號L2654，Sigma) 刺激並將細胞進一步培養24小時。將培養盤離心且收集上 清液並儲存在-80°C下直至於ELISA中對適當稀釋液加以分 析。 開發以下384孔化學螢光ELISA方案來量測上清液中 TNFa含量：白色Lumitrac 600 384孔培養盤（Greiner)塗有 (40微升/孔）於lxPBS(Gibco)中稀釋成1 Mg/mL之抗TNFa捕 捉抗體（目錄號551220,8〇?1^111丨1^611)。在4°(：下培育隔 夜之後，培養盤用 lxPBS(80 g NaCl、2 g KCl(Sigma)、 11·5 g Na2HP04.7H20及 2 g KH2P〇4於 l〇 L milliQ 中；pH 7.4)洗滌並用100微升/孔之緩衝液B(含有1% BSA(Sigma)、 5% 蔗糖（Sigma)及 0.05°/。NaN3(Sigma)之 1XPBS)阻斷。在 RT 下培育4小時後，移除阻斷緩衝液且培養盤用PBST(含有 0.05%吐溫-20(Sigma)之 lxPBS)洗滌一次。接著，將40 μί 樣品轉移至ELISA培養盤中且將培養盤在4°C下培育。次 日’將培養盤洗滌3次（兩次用PBST及一次用PBS)且添加 3 5微升/孔首先於緩衝液〇(含有1%88八之1><?88)中稀釋成 250 ng/mL之濃度的經生物素標記抗TNFa抗體（目錄號 554511，BD Pharmingen)。在RT下培育2 h後，如上所述 洗滌培養盤且添加35微升/孔之於緩衝液D中稀釋2000倍的 抗生蛋白鏈菌素-HRP接合物（目錄號SNN2004， Bio sour ce)。45 min後，如上所述洗蘇培養盤且與50微升/ s 151374.doc -88 - 201120043 孔之BM化學發光ELISA受質POD(Roche)—起培育5 min。 在 Luminoscan Ascent光度計（Labsystems)上以 100 毫秒之積 分時間進行讀數，從而提供原始資料（RLU :相對發光單 位）。以下對照包括在實驗中：最大信號對照，其中細胞 由LPS活化但僅添加0.2% DMSO媒劑（且因此無化合物）。 此對照指示可於測試中達成之最大TNFa含量。最小信號 對照亦包括在此等實驗中。此時，細胞不經觸發。此對照 獲得PBMC產生之基線TNFa含量。接著基於由ELISA獲得 之RLU資料用以下公式來計算化合物對TNFa釋放的抑制百 分比（PIN): 100 - [((Y濃度之化合物X下之TNFa含量-最小 TNFa含量）/(最大TNFa含量-最小TNFa含量））χ 1〇〇]。當化 合物在8個濃度（連續稀釋3倍）下測試時，可藉由對在各測 試濃度下達成之化合物之PIN資料的平均值進行曲線擬合 來計算EC5Q值。 為了分析化合物對經LPS刺激之PBMC培養物釋放IL1及 IL6的影響，可使用與以上所述相同之ELISA方案來量測適 當稀釋度之上清液。可如下使用用於IL1及IL6 ELIS A之配 對抗體（皆購自R&D Systems):抗IL1捕捉抗體（目錄號 MAB601)在0.5 pg/mL下使用；經生物素標記抗IL1偵測抗 體（目錄號BAF201)，在50 ng/mL下使用；抗IL6捕捉抗體 (目錄號MAB206)，在1 pg/mL下使用；經生物素標記抗 IL6偵測抗體（目錄號BAF206)，在50 ng/mL下使用。

I 實例14 : MMP13分析 MMP 13 ELISA之方案描述於章節14.1中，接著於章節 151374.doc -89- 201120043 14.2中描述測試化合物對於SWl353軟骨肉瘤細胞株中il-1/OSM驅動之MMP13表現。 14.1 MMP13 ELISA 方案 開發3 84孔形式之ELISA用於量測MMP13。測試各種初 級抗體以及各種ELISA方案。以下方案經開發並驗證以量 測於3 84孔培養盤中之細胞培養物上清液中的MMP 13含 量。 黑色maxisorb 384孔培養盤（Nunc 460518)塗有35 pL含有 1.5 pg/mL 抗 MMP13 抗體 MAB511(R&D systems)之緩衝溶 液。抗體於碳酸鹽-碳酸氩鹽塗佈緩衝液（1.59 g Na2C03(Sigma S-7795)及 2.93 g NaHC03(Sigma S-5761)於 1 []^丨11丨()水中，？11值調整至9.6)中稀釋。在4°〇：下培育隔夜 後，各孔用 100 μι PBST(80 g NaCl、2 g KCl(Sigma)、

11.5 g Na2HP04.7H20及 2 g KH2P04於 10 L milliQ水中；pH 7.4 + 0.05°/。吐溫-20(8丨§11^))洗滌兩次且用100微升/孔阻斷緩 衝液（於PBS中之5%無脂乳粉）阻斷。在4°C下培育隔夜後， 各孔用100 pL PBST洗滌兩次。移除PBST且將35 μΐ^樣品轉 移至ELISA培養盤中。在RT下培育4小時後，培養盤用 PBST洗滌兩次且在37°C下與35微升/孔之1.5 mM ΑΡΜΑ溶 液（10 mM ΑΡΜΑ儲備溶液係在一天前製備（35.18 mg APMA(Sigma A-9563)於 10 mL 0·1 M NaOH(Merck 1.06469.1000)中）並儲存在4°C下）一起培育1小時。在使用 之前，將10 mM ΑΡΜΑ儲備溶液於lxAPMA緩衝液 (ΙΟχΑΡΜΑ緩衝液：500 mM Tris(Roche 708976)、50 mM s 151374.doc -90- 201120043

CaCl2(Sigma C-5080)、500 μΜ ZnCl2(Sigma Z-0173)、1.5 M NaCl(Calbiochem 567441)、0.5% Brij35(Sigma 430 AG-6)且pH值調整至7.0)中稀釋成1.5 mM。在經由ΑΡΜΑ 活化ΜΜΡ13之後，培養盤再次用100微升/孔之PBST洗滌 兩次且將35 pL受質溶液添加至各孔中。如下製備受質溶 液：OmniMMP螢光受質（Biomol P-126)儲備溶液（2 mM於 DMSO中，儲存在-20°C下）於IxOmniMMP緩衝液（1〇χ OmniMMP緩衝液：500 mM Hepes(Sigma H4034)、100 mM CaCl2(Sigma C5080) > 0.5% Brij35(Sigma 430 AG-6) ； pH 值調整至7.0)中稀釋成0.01 mM之最終濃度。在37°C下培 育隔夜後，樣品中之活性MMP13已裂解受質並釋放螢光。 使用320 nm激發波長/405 nm發射波長的渡光鏡（filter)在 EnVision(Perkin Elmer)上進行讀數。 14.2 評估化合物對SW1353細胞中細胞激素驅動之MMP13 表現之影響 人類軟骨肉瘤細胞株SW1353係自ATCC獲得且在37°C下 於含濕氣5°/。C02培育箱中生長於補充有10%熱不活化FBS 及 1χ 青徽素（penicillin)/鏈黴素（streptomycin)之 DMEM (Invitrogen)中。將細胞之等分試樣冷凍並冷藏於液氮中。 以冷藏等分試樣為起始物，藉由一週兩次在1/5-1/8比率下 藉由膜蛋白酶消化（trypsinisation)進行繼代培養（subculture)來 使細胞 進一步 生長。 以化合物母儲備溶液（於100% DMSO中之濃度皆為10 mM)為起始物，3倍連續稀釋液用100% DMSO製備於96孔 151374.doc -91 - 201120043 培養盤中。接著，培養盤進一步於補充有1%熱不活化FBS 之Ml99培養基中稀釋50倍以獲得中間工作儲備溶液。 第1天，SW1353細胞以15000個細胞/孔之密度接種於96 孔培養盤（平底，經處理組織培養盤，Greiner)中之120 pL 生長培養基中。次日，添加15 μί化合物中間工作儲備溶 液。在使化合物平衡且進入細胞之60分鐘培育期之後，細 胞用添加15 μί體積以獲得1 ng/mL IL-1 β及25 ng/mL OSM 之最終濃度之IL-Ιβ與OSM的混合物刺激。對此，IL-1(10 pg/mL)及OSM(25 pg/mL)之儲備溶液（均購自PeproTech)於 補充有1% FBS之Ml99培養基中分別稀釋至10 ng/mL及250 ng/mL。在培育48小時之後，收集細胞上清液且於如上所 述之MMP13 ELISA中處理適當稀釋液，從而提供原始資料 (RFU :相對螢光單位）。以下對照包括在實驗中：最大信 號對照：其中細胞由ILl-p/OSM細胞激素混合物活化但僅 添加0.2% DMSO媒劑（且因此無化合物）。此對照指示可於 測試中達成之最大MMP13含量。亦包括最小信號對照，其 申細胞僅接受0_2% DMSO媒劑且不觸發。此對照獲得 SW1353 細胞產生之基線MMP13含量。接著基於由ELISA 獲得之RFU資料用以下公式來計算化合物對MMP13表現的 抑制百分比：[[(最大MMP13含量-最小MMP13含量）-(Y濃 度之化合物X下之MMP13含量-最小MMP13含量）]/(最大 MMP13含量-最小MMP13含量）]χ100。基於抑制百分比相 對於Log(莫耳濃度）之曲線及曲線擬合，可計算特定化合 物之IC5〇值。 151374.doc •92- 201120043 使用上述測定MMP13活性之方案，化合^具有介於5〇 nM與500 nM之間的ic5〇。 活體内研究 實例15 :化合物之耐受性 設計此方案以評估本發明化合物在健康dba/u小鼠中 之耐又性以確疋「治療窗」，其可經由介於有效劑量（小鼠 治療性膠原蛋白誘發之關節炎模型）與有毒劑量之間之給 樂純圍定義。 m動物 使用DBA/1J裸小鼠（CERJ(France))，該等小鼠為1〇七週 齡且體重約20 g。 15.2化合物製備 製備化合物以用於以下給藥方案：1〇〇 mg/kg/d，口服， 游離鹼，每10 g小鼠0J mL標準注射體積（相當於i〇 mg/i mL)。對於溶液製劑，將化合物溶於〇 5%曱基纖維素及 DMSO中，補充丨莫耳當量之曱磺酸以確保完全溶解，一週 一次。 實驗組 各組係基於體重加以隨機化且接受治療多達兩週。各組 含有5隻小鼠且接受100 mg/kg之測試化合物、1〇()爪以“乂 之比較化合物（化合物A)或每天每隻小鼠2〇〇吣給藥體積 的媒劑。 151374.doc •93- 201120043

0八 )=0 η2ν 化合物Α- 15.4動物監測（臨床徵象及體重) 藉由每天觀測及藉由一週三次記錄體重的重量減輕來監 測潛在藥物毒性。所有統計分析皆使用史都登氏t試驗法 (Student’s t test)來進行。 為了評估治療之總耐受性，在研究之整個過程中追蹤總 體重。圖6A展示化合物1對總體重之影響，圖6B展示比較 化合物A(結構參見以上）之影響。資料指示橋式化合物 (bridged compound)财受性優於非橋式化合物。特定言 之，相較於媒劑，經1 00 mg/kg/d化合物1處理之動物的體 重之間無統計學上顯著之差異。 實例16 : CIA模型 在實驗開始時將完全弗氏佐劑（Freund Adjuvant)/膠原蛋 白 II(CFA/Coll II，牛）注射（1 mg/mL，每個動物 100 μΙ〇入 尾（皮内）中。在CFA/Coll II注射之後21天，將不完全弗氏 佐劑/膠原蛋白II(IFA/Coll II)以相同含量（1 mg/mL，每個 動物1 00 pL)注射入尾中。 151374.doc -94- 201120043 各動物接著基於計分加以隨機化且分配至治療組中， ' - 保 證計分均等分佈於不同組中。 測試化合物（1 mg/kg/d、3 mg/kg/d或30 mg/kg/d)、陽性 對照（Enbrel ’ 10 mg/kg，每週3次，腹膜内）或媒劑（甲基纖 維素’ 1% DMSO)之治療在IFA/Coll II增強免疫後第8天（亦 即實驗之第28天）開始。 每天用測試化合物、陽性對照或媒劑對動物給藥，持續 14天。每天對動物之臨床症狀計分，報導個別爪之計分。 在治療期期間監測動物體重。藉由X射線成像對骨保護進 行分析。 化合物1在3或30 mg/kg/d下有效。 實例17 :敗血性休克模型 注射脂多醣（LPS)會誘發可溶性腫瘤壞死因子（ΤΝρ_α)快 速釋放入末梢中。此模型用於分析活體内TNF釋放之預期 阻斷劑。 每組6隻BALB/cJ雌性小鼠（20 g)接受口服預定劑量處理 一次。30分鐘後，腹膜内注射LPS( 15 pg/kg ;大腸桿菌（_£：. 清型〇lll:B4)。90分鐘後，使小鼠安樂死並收集血 液。使用市售ELISA套組測定循環TNFa含量。地塞米松（5 pg/kg)用作參考消炎化合物。化合物1在口服3、1〇及2〇 mg/kg下有效。 實例18 :小鼠膠原蛋白抗體誘發之關節炎（CAIA)模型（亦 稱為小鼠單株抗體（MAB)模型） 每組8隻BALB/cJ雌性小鼠（20 g)接受口服預定劑量處理 15I374.doc •95- 201120043 一次。同日，每隻小鼠靜脈内注射2 mg四種單株抗體之混 合物（MDBiosciences;參考號CIA-MAB-50)。3天後腹膜内 投與LPS(50微克/小鼠；大腸桿菌血清型55:B5)。用測試化 合物、陽性對照（Enbrel，10 mg/kg，每週3次，腹膜内， 或地塞米松’ 1 mg/kg ’每天，口服）或媒劑（曱基纖維素， 1 % DMSO)進行之治療在注射抗體當天開始。每天用測試 化合物、陽性對照或媒劑對動物給藥，持續多達10天。對 動物之臨床症狀計分且報導個別爪之計分。在治療期期間 監測動物體重。 參考文獻

Choy EH, Panayi GS. (2001). N Engl J Med. 344: 907-16o

Firestein GS. (2003). Nature. 423:356-61 o

Smolen JS, Steiner G. (2003). Nat Rev Drug Discov. 2: 473-88 °

Lee DM，Weinblatt ME (2001). Lancet. 358: 903-11。 Kremer J. M., Westhovens R., Leon M., Di Giorgio E., Alten R., Steinfeld S., Russell A., Dougados M., Emery P., Nuamah I. F.，Williams G. R.，Becker J.-C.，Hagerty D. T.， Moreland L. W. (2003) N Engl J Med. 349:1907-1915。

Edwards J. C.W·， Szczepanski L.， Szechinski J., Filipowicz-Sosnowska A., Emery P., Close D. R., Stevens R. M·，Shaw T. (2004) N Engl J Med. 350:2572-2581。 O’Dell JR，Leff R, Paulsen G, Haire C，Mallek J，Eckhoff 151374.doc -96- 201120043 PJ, Fernandez A, Blakely K, Wees S, Stoner J, Hadley S, Felt J, Palmer W, Waytz P, Churchill M, Klassen L, Moore G. (2002) Arthritis Rheum. 46:1164-70。

St Clair EW, van der Heijde DM, Smolen JS, Maini RN, Bathon JM, Emery P, Keystone E, Schiff M, Kalden JR, Wang B, Dewoody K, Weiss R, Baker D; (2004) Combination of infliximab and methotrexate therapy for early rheumatoid arthritis: a randomized, controlled trial. Arthritis Rheum. 50 :3432-43。

Gomez-Reino JJ等人（2003). Arthritis Rheum. 48: 2122-Ί。 O'Dell JR. (2004) Therapeutic strategies for rheumatoid arthritis. N Engl J Med. 350(25):2591-602。

New L, Jiang Y, Han J. (2003) Regulation of PRAK subcellular location by p38 MAP kinases. Mol Biol Cell. 14(6):2603-16 0

Shi Y, Kotlyarov A, Laabeta K, Gruber AD, Butt E, Marcus K, Meyer HE, Friedrich A, Volk HD, Gaestel M. (2003) Elimination of protein kinase MK5/PRAK activity by targeted homologous recombination. Mol Cell Biol. 23:7732-41 。

Seternes OM, Mikalsen T, Johansen B, Michaelsen E, Armstrong CG, Morrice NA, Turgeon B, Meloche S, Moens U, Keyse SM. (2004) Activation of MK5/PRAK by the 151374.doc -97- 201120043 atypical MAP kinase ERK3 defines a novel signal transduction pathway· EMBO J. 23:4780-91 0

Andreakos E等人（2003). Arthritis Rheum. 48: 1901-12。

Cunnane G等人（2001). Arthritis Rheum 44: 2263-74 〇

Coussens LM等人（2002). Science 295: 2387-92。

Creemers EE 等人（2001). Circ Res. 2001 89:201-10

Gapski R等人（2004). J Periodontol. 75:441-52。

Reif S, Somech R, Brazovski E, Reich R, Belson A, Konikoff FM, Kessler A. (2005) Digestion. 71:124-130 o

Rosenberg GA. (2002). Glia. 39:279-91。

Schanstra JP等人（2002). J Clin Invest. 110:371-9。

Suzuki R等人（2004). Treat Respir Med. 3:17-27。 US 2005/0009832 WO 02/056888 WO 99/64582

Bundgard, H., Design of Prodrugs, Elsevier, Amsterdam 1985 K. Widder等人，Methods in Enzymology, Ed. Academic Press, 42, (1985)

Advanced Drug Delivery Reviews, H. Bundgard, 8 ,1-38, (1992) H. Bundgaard等人，J. Pharm. Sci·，77,285 (1988); N. Nakeya等人，Chem· Pharm. Bull.，32，692 (1984);

Pro-drugs as Novel Delivery Systems, T. Higuchi 及 V. 151374.doc -98- 201120043

Stella, 14 A.C.S. Symposium Series, Bioreversible Carriers in Drug Design, E.B. Roche 編, American

Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987

Remington’s Pharmaceutical Sciences，第 17 版，1985,

Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania T. W. Greene 及 P· G. M. Wuts，/Voiecikg Growps ζ·« Organic Synthesis，第 2版，Wiley, New York，1 99 1 J.H. Jones等人，J. Med. Chem. 1969，12，285-87 H. Newman 等人，J. Heterocycl. Chem，1974, 11，449-451 D. Barlocco等人，J· Med.Chem·，1998，41，674-681 DiMauro等人，J. Med. Chem.,2008, 51，1681-1694 J.M. Keith等人，Bioorg. Med Chem Lett，2008; 4838-4843

Lipinsky等人 Adv. Drug Del. Rev·，1997, 23, 3-25 熟習此項技術者應瞭解上文描述實質上為例示性及說明 性的且意欲說明本發明及其較佳實施例。技術人員經由常 規實驗將認識到可在不脫離本發明精神下作出之顯而易知 的修改及變化。因此，本發明意欲不由以上描述而由以下 申請專利範圍及其等效物加以界定。 熟習此項技術者將根據上文描述想到本發明之組合物及 方法的各種修改及變化。來自隨附申請專利範圍之範疇内 之所有此等修改皆意欲包括在其中。 應瞭解諸如各種化合物之差異性細胞穿透能力之因素可 151374.doc -99- 201120043 造成化合物活性在活體外生物化學分析與細胞分析中的差 異。 本說明書中引用之所有公開案，包括（但不限於）專利和 專利申請案，皆以引用的方式併入本文中，該引用之程度 就如同已特定地及個別地將各個別公開案之全部闡述内容 以引用的方式併入一般。 如本申請案中給出及闡述之本發明化合物之至少一些化 學名稱可已藉由使用市售化學命名軟體程式而自動產生且 尚未獨立地加以驗證。執行此功能之代表性程式包括由

Open Eye Software，Inc.出售之Lexichem命名工具及由 MDL，Inc出售之Autonom軟體工具。在所指定化學名稱與 所述結構不同之情況下，將以所述結構為準。 本文所示化學結構係使用ChemDraw®或ISIS®/DRAW來 製作。出現在本文結構中之碳、氧或氮原子上之任何開放 原子價（open valency)皆指示存在氫原子。當對掌性中心存 在於結構中但對於該對掌性中心’無特定立體化學展示 時，該結構涵蓋與對掌性結構相關之兩種對映異構體。 【圖式簡單說明】 圖1此圖展示健康關節與RA患者關節之間驚人的組織 學差異。 圖2此圖展示以類風濕性關節炎病變中涉及之細胞激素 觸發之滑液纖維母細胞中MMP1之增加的表現。 圖3此圖展示已知消炎化合物對「基於TNF-α之觸發 物」誘發SF產生之MMP1表現的劑量依賴性抑制。 151374.doc •100· 201120043 圖4此凝膠展示藉由用靶向MAPKAPK5之Ad-siRNA病 毒感染細胞所導致之MAPKAPK5在SF中之表現在蛋白含量 上之降低。 圖5此圖展示由靶向MAPKAPK5之Ad-siRNA病毒導致 之「複合觸發物」誘發SF之MMP1表現量的降低。 圖6A此圖展示用化合物1進行之耐受性研究結果，其 中量測之效應係相對於總體重。 圖6B此圖展示相對於比較化合物之财受性研究結果。 圖7此圖展示注射LPS(細菌脂多醣）之後以化合物1獲得 之TNFa釋放之抑制百分比。 圖8A此圖展示化合物1之曱磺酸鹽之DVS研究結果。 圖8B此圖展示化合物1之反丁烯二酸鹽之DVS研究結 果。 圖8C此圖展示化合物1之苯磺酸鹽之GVS研究結果。 圖9A此圖表示化合物1之拉曼光譜（Raman spectrum)。 圖9B此圖表示化合物1之PXRD光譜。 圖9C此圖表示呈反丁烯二酸鹽形式之化合物1的拉曼 光譜。 圖9D此圖表示呈反丁烯二酸鹽形式之化合物1的PXRD 光譜。 圖9E此圖表示呈曱磺酸鹽形式之化合物1的拉曼光 譜。 圖9F此圖表示呈曱磺酸鹽形式之化合物1的PXRD光 譜。 151374.doc -101 - 201120043 圖9G此圖表示鹽篩檢獲得之呈苯磺酸鹽形式之化合物 1的PXRD光譜。 圖10A此圖表示以結晶苯磺酸鹽形式獲得之化合物1之 PXRD光譜。 圖10B此圖表示以非晶苯磺酸鹽形式獲得之化合物1之 PXRD光譜。 圖11A此圖表示以結晶苯磺酸鹽形式1獲得之化合物1之 PXRD光譜。 圖11B此圖表示以結晶苯磺酸鹽形式2獲得之化合物1之 PXRD光譜。 圖11C此圖表示以結晶苯磺酸鹽形式3獲得之化合物1 之PXRD光譜。

S 151374.doc - 102- 201120043 序列表 <110>比利時商葛萊伯格有限公司 <120>用於治療退化及發炎疾病之稠合吡畊化合物之鹽

<130> GAL-164-US-PSP <140> 099136367 <141> 2010-10-25 <150> 61/258,258 <151> 2009-11-05 <160〉 6 <170> Patentln version 3. 5 <210〉 1 <211> 19 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> SEQ ID N0:1 <400〉 1 19 gctgaccctg aagttcatc <210〉 2 <211〉 19 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> SEQ ID N0:2 <400〉 2 19 ggttacctaa gggtgtggc <210〉 3 〈211〉 19 <212> DNA <213〉人工序列 151374-序列表.doc 201120043 <220〉 <223> SEQ ID NO:3 〈400〉 3 ctctgagtgc agtgaaatc <210〉 4 <211〉 19 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> SEQ ID N0:4 <400〉 4 acaagagcaa gatgtggac <210〉 5 <211〉 19 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉SEQ ID NO:5 <400> 5 cggcacttta cagagaagc 〈210〉 6 〈211〉 19 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉SEQ ID NO:6 <400〉 6 atgatgtgtg ccacacacc 151374·序列表.doc

Claims (1)

1. 201120043 七、申請專利範圍： 1. 一種式I化合物之鹽，

   其中該鹽為與以下酸形成之鹽：己二酸、L-天冬胺酸、 苯磺酸、苯甲酸、辛酸、檸檬酸、反丁烯二酸、2,5-二 經苯曱酸（gentisic acid)、L-麵胺酸、乙醇酸、鹽酸、 L -乳酸、L -蘋果酸、順丁烯二酸、L -杏仁酸、曱石黃酸、 奈-1，5-二績酸、1-經基-2 -奈曱酸、填酸、糖精、丁二 酸、硫酸、L-酒石酸或曱苯磺酸。 2.如請求項1之鹽，其中該化合物係根據式Ila :

   式 Ila。 151374 201120043 3.如請求項1之鹽，其中該化合物係根據式lib:

   式 lib。 4. 如請求項1至3中任一項之鹽，其中該鹽為與苯甲酸、擰 檬酸、反丁烯二酸或甲磺酸形成之鹽。 5. 如請求項4之鹽，其中該鹽為與反丁烯二酸形成之鹽。 6. 如請求項1至3中任一項之鹽，其中該鹽為與苯磺酸、萘_ 1，5-二磺酸或甲苯磺酸形成之鹽。 7·如請求項6之鹽，其中該鹽為與笨磺酸形成之鹽。 8. 如明求項1至3中任一項之鹽，其中該鹽係呈結晶形式。 9. 如。月求項1至3中任一項之鹽，其中該鹽為以游離驗/成 鹽劑加合物。 10· -種製備如請求項⑴中任一項之鹽之方法，其包含以 下步驟： 使忒式I、IIa或IIb化合物與選自以下之酸在惰性溶劑 中反應：己二酸、L_天冬胺酸、苯磺酸、苯甲酸、辛 ^檸搽酸、反丁烯二酸、2,5-二羥苯甲酸、L-麩胺 酸、乙醇酸、鹽酸、L-乳酸、L_韻果酸、順丁烯二 151374 201120043 酸、L_杏仁酸、甲磺酸、萘-1，5-二磺酸、1-羥基_2_萘 甲酸、磷酸 '糖精、丁二酸、硫酸、L-酒石酸及甲苯 續酸；及 b·使該鹽自該溶劑中沈澱出來。 U·如印求項1〇之方法，其中該式j、11&或nb化合物與酸以 介於5:1與1:5之間的莫耳比反應。 如凊求項10之方法，其中該式〗、11&或丨沁化合物與酸以 介於2:1與1:2之間的莫耳比反應。 U·如咕求項10之方法，其中該式〗、〗。或iib化合物與酸以 1:1之莫耳比反應。 14_如請求項10至13.中任一項之方法，其中該惰性溶劑係選 自 DMSO、丙酮、THF、MTBE、二噁烷、Et〇Ac、 MeOH/DCM、及甲笨。 1 5.如明求項1 〇至丨3中任一項之方法其中該惰性溶劑係選 自 iPrOH/水、iPrOH、iBu〇H及 tBuOH。 種4藥組合物’其包含治療有效量之如請求項1至9中 任一項之鹽及醫藥學上可接受之載劑。 17. 如清求項丨至3中任一項之鹽，其用於藥品。 18. 如凊求項1至3中任—項之鹽，其用於治療或預防特徵在 於ECM降解之病狀。 19. 如吻求項1至3中任—項之鹽，其用於治療或預防選自涉 及發炎疾病的病狀。 20. 如凊求項19之鹽’其中該疾病為類風濕性關節炎。 1’種如求項1至9中任一項之鹽之用途，其用於製造供 151374 201120043 治療涉及發炎疾病的藥劑。 其用於製造供 22. -種如請求項!至9中任—項之鹽之用途 治療類風濕性關節炎的藥劑。 其用於製造供 23. 一種如請求項1至9中任-項之鹽之用途 治療特徵在於ECM降解之病狀的藥劑。 24. 如請求項16之醫藥組合物，其用於藥品。 25. 如請求項16之醫藥組合物， 其用於治療或預防特徵在於 ECM降解之病狀。 26. 如請求項16之醫藥組合物 發炎疾病的病狀。 27. 如請求項26之醫藥組合物 炎0 其用於治療或預防選自涉及 ”中π亥疾病為類風濕性關節 其用於製造供治 28. —種如請求項16之醫藥組合物之用途 療涉及發炎疾病的藥劑。 、 29. —種如請求項16之醫藥組合物之用途 療類風濕性關節炎之藥劑。 ' 30. —種如請求項16之醫藥組合物之用途 療特徵在於ECM降解之病狀的藥劑/ 31·如請求項16之醫藥組合物 囊形式。 32.如請求項16之醫藥組合物 注射形式。 其用於製造供治 其用於製造供治 其中°亥紱合物係呈錠劑或膠 其中該組合物係呈液體或可 151374