TW201106977A

TW201106977A - Development of universal cancer drugs and vaccines

Info

Publication number: TW201106977A
Application number: TW099118198A
Authority: TW
Inventors: Shi-Lung Lin; David Tang-Xi Wu
Original assignee: Shi-Lung Lin; David Tang-Xi Wu
Priority date: 2009-08-26
Filing date: 2010-06-04
Publication date: 2011-03-01
Also published as: CA2769289A1; CA2769289C; EP3222723A1; JP2015214570A; JP6019186B2; EP3222723B1; WO2011025566A1; EP2470655A1; US20100240126A1; JP2013503164A; JP5852959B2; CN102656268A; US9394538B2

Description

201106977 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明一般而言係關於有治療功能的DNA/RNA藥物在癌症治療上的設計及利用。更明確言之，本發明係關於設計 5 及使用一核酸組成物之方法，其中該核酸組成物在人類細胞中可產生/表現小型核糖核酸(small 基因靜默效應子，以靜默mir-302標的之細胞週期調節者與致癌基因，進而對腫瘤 /癌細胞之生長及轉移產生抑制作用。小型核糖核酸基因靜默效應子較佳包含微型核糖核酸(micro^]^A，miRNA)，像是 ίο mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d、mir-302e、微型核糖核酸前驅物(前驅微型核糖核酸，pre_miRNAs)和人造重設之小髮夾型核糖核酸/小干擾核糖核酸(shRN A/siRNA)之同源物/ 衍生物’以及其組合。感興趣之該等人類細胞包括體外(in vitro)、離體(ex vivo)及/或體内(in vivo)之體細胞或腫瘤/癌細 15 胞。【先前技術】

Mir-302 是在人類胚胎幹細胞(human embryonic stem，hES cell)及誘發型多能性幹細胞(induced pluripotent stem，iPS cell) 2〇中發現到的最主要的微型核糖核酸(microRNA，miRNA)，然而其功能尚不清楚。先前的研究已顯示mir-302的異位表現能 201106977 將人類癌細胞重新編程為似hES的多能性細胞，其具有明顯缓慢的細胞週期速率以及似休眠細胞之細胞型態(Lin等人， 2008)。相對靜止是這些由mir-302重新編程而成之多能性幹細胞(mirPS)的一項清楚的特徵；然而，以其他三/四個因子(即

Oct4-Sox2-Klf4-c-Myc 良 Oct4-Sox2-Klf4-c-Myd)讓發而得之多能性幹細胞(iPS)則具有另人注目的增生能力及不可擋的腫瘤生成傾向(Takahashi 等人，2006 ; Yu 等人，2007 ; Wernig 等人’ 2007)。存在於mirPS細胞之抗增生特性背後的機制儘管大部分仍不甚清楚，吾人發現兩個mir-302標的的G1檢控點調節者(Gl-checkpoint regulators)可能參與其中，他們是：週期素依賴性激酶2 (cyclin-dependent kinase 2，CDK2)及週期素D (cyclin D) ’（Lin等人’ 2008)。真核細胞細胞週期的進行是經由週期素依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs) 的活化來驅動的，週期素依賴性激酶與正調節次單元 (subunits):週期素，以及負調節者(regulators):週期素依賴性激酶抑制子（CDK inhibitors，CKI，像是 pl4/pl9Arf、 pl5Ink4b、pl6Ink4a、pl8Ink4c、p21Cipl/Wafl 與 p27Kipl) 形成功能性複合體。在哺乳動物細胞中，不同的週期素—週期素依賴性激酶複合體(cyclin-CDK complexes)參與調節細胞週期中不同時期的轉換，像是參與G1期行進的Cydin-D-CDK4/6、Gl —S 期轉換的 cyclin-E-CDK2、S 期行進的 201106977 cyclin-A-CDK2 ’ 以及參與]v[期進入的 cyclinA/B-CDC2 (cyclin-A/B-CDKl)。由此推測，mir_3〇2之抗增生功能是由於 CDK2及cyclin D在G1 — S期轉換期間被共同抑制的結果。然而’在有關人類mir-302類似物：小鼠mir-291/294/295 家族的研究中，顯示其與人類mirpS細胞内之mir-302的功能全然不同的結果。在小鼠胚胎幹細胞（mES)中，mir-291/294/295 的異位表現透過直接靜默 p2icipl (又名 CDKN1A) 與絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶Lats2 (Wang等人，2008)引發細胞快速增生以及G1 — S期轉換。該腫瘤傾向(tumor_prone)之結果被認為是由於p21Cipl及Lats2腫瘤抑制者的天性使然。缺乏p21Cipl/\Vafl的基因的轉殖小鼠在缺乏gi檢控點的控制下能表現正常的發展(Deng等人，1995)。然而，由於Lats2 在有絲分裂開始時具有徵召又-微管蛋白及參與紡錘體形成等功能，因此其角色仍待釐清。此外，小鼠胚胎中Lats2的缺乏已被發現會導致嚴重的有絲分裂缺陷且具致命性，此亦指出Lats2的靜默會阻礙而非促進細胞分裂 (Yabuta 4人，2007)。綜合來說，p21Cipl之靜默似是mir_ 291/294/295引介誘導之腫瘤生成背後的主要機制。然而，吾人近來在審查人類P2/Qpi基因之mir-302標的位的結果，是陰性的。同樣陰性的結果亦可由線上演算程式「TARGETSCAN」(http://www.targetscan.nm/)及「PICTAR- 201106977 VERT」rhttp://pictar.mdc-berlin.deA 預測而得。因此，mir-302 及其類似物，mir-291/294/295很可能在hES和mES細胞中各具有不同的功能，而導致人類iPS及小鼠iPS細胞不同的特性。在以上發現的啟發下，吾人可以理解mir-291/294/295在 5 mES細胞中的角色不能作為評估mir-302在hES及iPS細胞内的功能的等效模型。

MiRNA是細胞質中的抑制子(inhibitor)，其通常的功能為抑制與其高度互補之標的基因轉錄分子(mRNAs)的轉譯。 MiRNA與標的基因結合的嚴謹度決定了該miRNA的真正 10 功能。依據細胞條件的不同，miRNA在基因標的偏好上也會有不一樣的表現。然而，至目前並沒有與mir-302之濃度效應或mir-302與標的基因交互作用之嚴謹度相關的報告。為解答此疑問，本發明揭露其中重要的細節並首次揭示mir-302在人類及小鼠細胞中的功能非常不同。在人類 15 細胞中’ mir-3〇2強烈地標的CZIO、、以及撕/-/，但有趣的是，不包含⑽匸叫。與小鼠p2/Cz>l不同’人類戶27Cz>l不含任何mir_3〇2的標的位。基因標的上的不同導致兩者在細胞週期調節上的重要分歧 (schism)。在小鼠胚胎幹細胞（mE幻中，mir_3〇2靜默 20 P2icipl並且促進似腫瘤(tumor-like)的細胞增生(wang等人，2008 ; Judson，2009)，然而在人類mirPS細胞中， 201106977 v p21 Cip 1依然維持表現並導致較缓慢的細胞增生與較低的腫瘤生成能力。此外，小鼠的也因缺乏適當的標的位，因此非mir-302的標的基因。吾人發現在mirps細胞中，靜默人類的BMI-1會刺激pi6Ink4a/pl4ARF表現而減 5 弱細胞增生；反之，爪匕3〇2無法靜默小鼠ΒΜμι來在小鼠細胞中引起相同的效應。由於在人類mirps細胞中 pl6Ink4a/pl4ARF的表現提升而p2icipl不受影響，因此 mir-302在人類細胞中除了共抑制cyclin_E_CDK2及 cydin-D —CDK4/6路徑以外，最有可能再透過pl6Ink4a_ 10 Rb及/或pi4/l9ARF-p53途徑來達到其抗增生的功能。 Μπ·-302標的人類及小氣基因偏好的顯著差別意味著兩者的細胞週期調節機制有根本上的不同。總而言之’先前技術忽略了微型核糖核酸(miRNA)與八‘的基因父互作用的嚴謹度而對人類的功能做了錯誤的假叹。為了澄清此誤解，本發明採用一誘導式 mir-302表現系統而揭示了他_3〇2在抑制人類腫瘤八癌細胞生長方面的新穎功能。吾人從中的新發現可用於發展針對癌症，α療與預防之普適性抗腫瘤/癌症的藥物以及/或疫田。所以，在發展藥物/疫苗及其癌症治療上，以有效及安 2〇全的設計與方法使用mir-3〇2是有其必要的。 201106977 【發明内容】、本發明是料療功能的DNA/RNA藥物及/或疫苗在癌症治療上之設計與使用。具體而言，本發明使用—重組核酸級成物，其在被傳送至人類細胞後能表現小型核糖核酸基因靜 5 RKA gene silencing effector) > #pf.j mir-302 ^ 的的細胞職調節者以及致癌細的活性，導致—對於人類腫瘤/癌、”田胞生長及轉移的腫瘤抑制效應。小型核糖核酸基因基因靜默效應子較佳包含微型核糖核酸(microRKA， miRNA)，例如 mir_3〇2a、mir_3〇2b、mir_3〇2c、mir_3〇2d、以

i〇及其似髮夾微型核糖核酸前驅物（hairpin-like microRNA precursors，pre_miRNAs)、人造重設之小髮夾型核糖核酸 (small hanpm RNA，shRNA)同源物/衍生物及其組合。小髮夾型核糖核酸同源物/衍生物的設計包含在小髮夾型核糖核酸 (shRNA)與小干擾核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)結 15 構中，個別單員或多員群集（cluster)内核酸組成物的失配 (mismatched)與完全配對(perfectly matched)。其皆可促進標的專一性並減少傳送與治療所需的mir_302數量(拷貝數，c〇py number) ° 天然微型核糖核酸(miRNA)的大小大約為18〜27個核苷 2〇酸(nucleotides，nt)長度，並且，依微型核糖核酸(miRNA)與其標的之間的互補情況，能夠直接降解其所標的的傳訊核糖核 201106977 酸(messemger RNA，mRNA)或抑制其標的傳訊核糖核酸 (mRNA)之轉譯。Mir-302家族(mir-302s)是一群高度同源、並且保存(conserved)於許多哺乳動物身上的微型核糖核酸 (miRNAs)。Mir-302家族(mir-302s)包含四個家族成員，他們 5 一起被轉錄成一非編碼核糖核酸群集（non-coding RNA cluster)，其包含，由五端至三端依序是mir-302b、mir-302c、 mir-302a、mir-302d、以及 mir-367 (Suh 等人，2004)。近來，科學家發現了在原先群集之外的第五個mir-302成員：mir-302e。雖然mir-367與mir-302s共同被表現，但他們的功能實 1〇際上彼此不同’吾人傾向重新設計此mir-302群集來只表現 mir-302s。此外，吾人亦使用人工重設之髮夹環(haijpin loops) ’ 像是 5’ -GCTAAGCCAG GC-3’ （SEQ.ID.N0.1)與 5’ -GCCTGGCTTA GC-3’（SEQ.ID.N0.2)取代原本論-3〇2 前驅物(pre-mir-302)的環序列，以形成較為緊密的群集而便於 15 傳送與表現。正常來說，mir_3〇2僅在小鼠以外的哺乳動物胚胎幹細胞(embryonic stem (ES) cell)中大量表現，然後在細胞分化與/或增生後快速減少（Tang等人，2007 ; Suh等人， 2004)。由於miRNA之特徵在於其為能夠靜默與其高度互補之標的基因的小型抑制性核糖核酸（small丨祕一 20 (Bartel ’ D.P·，2〇〇4)，因此論-3〇2s很可能是防正Es細胞在早期胚胎發育中迷途生長及過早生長的關鍵抑制子，並防止 201106977 幹細胞的腫瘤形成。事實上，在桑椹期(morula stage , 32〜64 細胞期)之前的ES細胞通常表現非常慢的細胞週期速率。這些發現指出mir-302在正常幹細胞維持與恢復的調控上扮演一重要角色’並有助於抑制腫瘤/癌細胞形成。 5 所有的mir_302成員在五端最前方的17個核苷酸共有一完全相同的序列，其中包含種子基序（seed m〇tif) 5，_ UAAGUGCU1JC： CAUGUUU-3’（SEQ.ID.N0.3);並且在其同樣擁有23個核苷酸的成熟微型核糖核酸(miRNA)中具有高於 85%的序列同源性（homology)。根據線上演算程式 10 「TARGETSCAN」（http://www.targetscan.org/)及「PICTAR- VERT」（http://pictar.mdc-berlin.de/)目前的預測結果，這些成員同時標的幾乎相同的細胞基因，其中包含超過607個人類基因。此外’ ηώ-302與在功能上也許有某程度相似的mir_ 93、mir-367、mir-37卜 mir-372、mir-373 及 mir-520 家族亦共 15 有許多標的基因。大部分的標的基因為有關於早期胚胎發育當中特定細胞系分化(lineage-specific cell differentiation)之起始與/或建立的發育訊號(developmental signals)及轉錄因子(Lin等人’ 2008)。另外，許多標的基因也是為人所熟知的致癌基因 (oncogenes)。因此，mir_3〇2的功能更可能是抑制發育訊號及 20 分化相關轉錄因子的總體製造，而不同於先前誘導式多能性幹細胞〇PS)方法所做的，在某些胚胎訊息傳遞路徑上刺激轉 12 201106977 錄作用。再者，由於其中許多標的的發育訊號及分化相關的轉錄因子為致癌基因，因Kmir_3〇2並具有抑制腫瘤的功能而防止正常hES細胞之生長朝向腫瘤/癌細胞形成的方向進行。在一較佳實施例中，發明人已設計並發展出一可誘導的 5 户以-0糾瓜历阳必表現載體(圖1A)，再配合病毒感染、電穿孔法或微脂體/多聚體(polysomal)轉染以將mir-302傳送到正常及/或癌人類細胞中。重新設計的mir_3〇2構造包含四個小非編碼核糖核酸成員（small non_c〇ding rnA members):同在一個群集中的 mir-302a、mir-302b、mir-302c、與 mir-302d (mir- 10 ，圖IB)。在去氧經四環素(DoxycycUne，Dox)的刺激之下，此mir-302s構造受到一由四環黴素反應元件(tetracycline_ responsive element，TRE)所控制的 Cyt〇megal〇virai (CMF)啟動子的驅動而被表現。在感染/轉染之後，mir_3〇2的表現依自然的微型核糖核酸(miRNA)生合成路徑進行。其中mir_3〇2s構 15 造與一報告基因，像是紅移螢光蛋白基因（red-shifted fluorescent protein，及GFP)，共同被轉錄，然後進一步被剪接複合體(spliceosomal components)及/或細胞質内的RNA内切酶 (RNaselll)值塞爾(Dicers)(圖2A) (Lin等人，2003)處理成個別的mir-302成員。此策略的結果是，在微型核糖核酸微陣列核 20 糖核酸分析中(實施例3)，所有正義(sense) mir-302成員在去 13 201106977 氧羥四環素的刺激後有效地在被轉染的細胞中表現(圖1C)。將mir-302表現載體轉導至人類細胞的步驟概述於圖2B — C。發明人仿效自然的内含子微型核糖核酸(intronic miRNA) 生合成路徑（圖2A)，設計了一内含子微型核糖核酸(miRNA) 5 表現系統，即办，以轉錄重組基因；包含一人造/人工的剪切勝任内含子(splidng competent intron，〇，其能夠產生内含子微型核糖核酸 (intronic miRNA)及/或類小髮夾型核糖核酸(shRNA-like)基因靜默效應子(Lin等人，2003 ; Lin等人，（2006)施決〇办M?/ 5/〇/. 10 342 : 295-312)。與及共同被第二型rna聚合酶 (Pol-II RNA polymerase)轉錄而包含在基因的傳訊核糖核酸前驅物(pre-mRNA)中，並且被RNA剪接複合體(RNA splicing components)剪出。接著，被剪出的 SpRNAi進一步被處理為成熟的基因靜默效應子，像是天然的 15 微型核糖核酸(miRNA)以及人造小髮夾型核糖核酸(shRNAs)，以引發對於標的基因的特定的核糖核酸干擾效應(咖A interference，RNAi)。同時，在内含子剪出(intr〇n splidng)之後’办基因轉錄分子(transcript)的外顯子(ex〇ns)被連接在一起而形成成熟的傳訊核糖核酸(mRNA)，其接著被轉 20 譯成RGFP報告蛋白質，作為鑑別miRNA/s_A表現之用。在定量上，一倍的RGFP濃度相當於四倍的mir_3〇2濃度表 201106977 現。此外，亦可選擇性地以一些功能性蛋白之外顯子取代 RGFP來提供附加的基因功能’例如體細胞重新編程(somatic cell repr〇gramming，SCR)中的hEs基因標記。鑑於目前在脊椎動物中’有超過1〇〇〇個、功能尚未釐清的天然微型核糖核酸(miRNA)種類已被發現，且更多新的微型核糖核酸亦陸續被識別’因此吾人的内含子微型核糖核酸表現系統能作為一測試微型核糖核酸在體外及體内之功能的一有利工具。内含子包含數個一致性核苷酸組成分，包括一五端剪接位(5’_splice site)、一分支點基序(Branch-Point，BrP)、一多嘧啶段(poly-pyrimidine tract)、以及一三端剪接位(3，_ splice site)。另外，並有被插入在五端剪接位及分支點基序之間的一髮夾形微型核糖核酸(miRNA)或小髮失型核糖核酸 (shRNA)前驅物。此内含子部份在rna剪接及處理過程當中通常形成一套索(lariat)構造。再者’伞三端包含—多樣的轉譯終止密碼子區域(translational stop codon region (τ codon))，以增加内含子 rna 剪接(intronic RNA splicing)與處理的準確度。當T c〇d〇n表現於細胞質内的傳訊核糖核酸 (mRNA)，該T codon會通知細胞内無意義調節之衰敗 (nonsense-mediated decay，NMD)系統的活化，降解任何累積在細胞中、非結構化的核糖核酸以防止細胞毒性之產生。然而’高度結構化的小髮夾型核糖核酸(shRNA)及微型核糖核酸 15 201106977 前驅物（pre-miRNA)將被保留，並接著經岱塞爾(Dicers)切割而分別形成成熟小干擾核糖核酸(siRNA)及微型核糖核酸 (miRNA)。為了表現内含子miRNA/shRNA，吾人人工地將併入到及GFP基因的乃似//限制位點中(Lin等人， 5 2006與2008) ’如此形成了重組办基因。以Dra// 限制酶切割i?GF_P可在每一端產生具有三個内凹核苷酸的 AG-GN核苦酸斷口，其在习谈似/插入後，將分別形成五端與三端剪接位。内含子插入中斷了 RGFP蛋白質的完整性，但由於其能藉由内含子剪切而恢復完整性，因此吾人能透過 10 在被轉染細胞中出現的紅色紅移螢光蛋白(RGFP)來測定成熟 miRNA/shRNA的表現。及G/P基因亦包含複數個外顯子剪接增強子(exonic splicing enhancers，ESEs)以增加 RNA 剪接的準確度及效率。詳細來說，知内含子包含一五端剪接位(5，_ splicing 15 site) ’ 其與 5’-GTAAGAGK-3’ （SEQ.ID.N0.4)或 GU(A/G)AGU 基序（即 5，-GTAAGAGGAT-3，、5，-GTAAGAGT-3’、5’_GTAGAGT-3’ 與 5’-GTAAGT-3，）同源；該办_ζ·内含子三端為一三端剪接位(3’- spiicing Site)，其與 GWKSCYRCAG (SEQ.ID.N0.5)或 CT(A/G)A(C/T)NG 基序 20 (即 5’-GATATCCTGC AG_3’ ’ 5’-GGCTGCAG-3’ 與 5，_ CCACAG-3 )同源。此外’ 一分支點基序(branch point sequence) 201106977 位於五端及三端剪接位之間，其與5，-TACTWAY-3, (SEQ.ID.N0.6)基序，像是 5，_taCTAAC-3,與 5，-TACTTAT-3, '高度同源。分支點基序的腺嘌呤核苷酸(adenosine)，「A」核皆酸，在幾乎所有的剪接體内含子（spliceosomalintrons)中， 5 能藉由細胞2，-5,寡腺苷酸合成酶（(2，-5，)-〇lig0adenylate synthetases)與剪接體(Spiiceosomes)形成一透過(2，_5，)鍵結連接之套索内含子RNA (intron RNA)的一部份。再者，一多嘧。定段(poly-pyrimidine tract)位在接近分支點基序與三端剪接位之間，係為一高T (胸線嘧啶核甘酸)或高c (胞嘧啶核甘酸)含量 1〇的序列，其與 5，-(TY)m(C/-)(T)nS(C/->3,（SEQ.ID.N0.7)或 5 _(TC)nNCTAG(G/-)_3’（SEQ.ID.N0.8)基序同源。其中符號「m」及「n」表示多個重複n m的數量最佳等於η 且η的數量等於7〜12。符號「―」係指在該序列中可被略過之核普酸。另外’序财亦包含_些鏈接核_序列，其係用 15 來連接所有合成的内含子成分。根據37 CFR 1.822中有關表示核芽酸及/或氨基酸序料之符號及格式的準則，符號^ 係指腺。票呤(Α)或胸腺輕(Τ)/尿喷咬(υ)，符號κ係指鳥〜 ⑼或胸腺敏(Τ)/尿較(U)，符號s係指胞♦定(c)或鳥^ (G)，符號Y係指胞做(Q或胸腺錢(τ)/尿♦定⑼，符^ 2〇係指腺11 票吟⑷或鳥口票呤⑹，且符號Ν係指腺嗓呤(Α)、胞 13定(C)、鳥嗓呤(G)或胸腺嘧啶(Τ)/尿嘴咬(υ)。 17 201106977 在其他較佳實施例中，本發明是一直接的（外顯子）mir_ 302 miRNA/shRNA表現系統，其能直接產生類mir-302基因靜默效應子而不需透過細胞内的RNA剪接及/或NMD機制。然而’此方式的缺點為類mir-302基因靜默效應子的表現不受 5 到任何細胞内監視系統(surveillance system)，像是無意義調節之衰敗(NMD)的調控’因此可能造成自然微型核糖核酸生合成路徑的過度飽和而導致細胞毒性的產生(Grimm等人， 2006)。此方法所使用的表現系統可以是線型或環型的核酸組成’其選自質體(plasmid)、病毒載體(viral vector)、慢病毒載 10 體（lentiviral vector)、轉位子（transpos〇n)、反轉位子 (retrotransposon)、跳躍基因(jumping gene)、蛋白質編碼基因 (protein-coding gene)、非編碼基因(non_c〇ding gene)、人工重組轉殖基因(artificially recombinant transgene)，以及其組合。類mir-302基因靜默效應子，包含微型核糖核酸、小髮夾型核 15 糖核酸、小干擾核糖核酸，及其前驅物和同源物/衍生物，受到組織特異性或非特異性的RNA啟動子的控制而表現。⑽八啟動子係選自第二型RNA聚合酶(PoKQ)、病毒聚合酶(viral polymerase)、第三型RNA聚合酶(ρ〇ΐ_πΐ)、第一型·Α聚合酶(Pol-I)，及四環黴素反應元件控制的⑽八聚合酶啟動 20 子。病毒啟動子為類第二型RNA啟動子，其係分離自但不限於巨細胞病毒(cytomegalovirus，_、反轉錄病毒終端重複 201106977 序列(retrovirus long-terminal region，灯抑、B 型肝炎病毒 (hepatitis B vims ’ 你幻、腺病毒(aden〇vims、、以及腺相關病毒(adeno-associated virus ’ 尤。舉例來說，一,ρ病毒LTR啟動子在每細胞中能夠生產五十萬個前驅傳訊核糖核 5 酸轉錄分子(Pre_mRNA transc_)(拷貝）。此外，基因靜默效應子的轉錄速率亦可藉由在RNA聚合酶啟動子前方插入一藥敏感抑制子(drug-sensitive repressor，即/7¾)來控制。抑制子可以被化學藥物或選自G418、新黴素(neomycin)、四環黴素 (tetracycline)、去氧羥四環素（d〇xycydine)、安比西林 10 (amPicillin)、卡那黴素⑽namycin)、嘌呤黴素(pur〇mycin)，及其衍生物等等的抗生素抑制。在另一方面，亦可使用表現數個内含子基因靜默效應子的複數個轉殖基因(transgenes)以及/或載體來達成對mir_3〇2標的基因的基因靜默效應。此外，複數個基因靜默效應子亦可 15 從一個内含子插入子(intronic insert)產生。舉例來說，有報導指出’斑馬魚中一含有微型核糖核酸前驅物A)的抗 (anti-^EGi7/5)内含子的異位表現(ect〇pic eXpressi〇n)能產生兩個不同大小的miRNA，即miR-EGFP(282/300)與miR-EGFP(280/302) ’因此顯示出一個办腦z•插入子能產生複數 '° 個基因靜默效應子(Lin等人（2005) Gene 356 : 32-38)。在某些例子中’内含子基因靜默效應子能與一標的的基因轉錄分子 19 201106977 (即，傳訊核糖核酸，mRNA)雜合，形成雙股小干擾核糖核酸 (siRNAs)而引發次級核糖核酸干擾效應(RNAi)。由於這些基因靜默效應子由轉殖基因載體持續地被產生，因此可減輕對於 RNA在體内快速降解的顧慮。此策略的好處在於載體轉染或 5 者病毒感染的穩定性能提供一可靠、長效的基因靜默效力。由於某些天然刖驅微型核糖核酸(pre_mi^NAs)的莖環 (stem-loop)結構太大及/或太複雜而不適合用於微型核糖核酸表現糸統/載體，因此發明人常使用人工重設甲硫胺酸的轉運核糖核酸環(tRNAmetl〇〇p，即 5’-(A/U)UCCAAGGGGG-3，)取 10 代天然前驅微型核糖核酸的環。tRNAmet環能有效使得人工重設的微型核糖核酸(miRNA)透過與天然微型核糖核酸相同的運送機制’藉者Ran-GTP與輪出蛋白5 (Exp〇rtin-5)，由細胞核輸出至細胞質(Lin等人，2005)。本發明的優點在於使用一對人工改良的前驅微型核糖核酸環，包括5’-GCTAAGCCAG 15 GC-3’ (SEQ.ID.N0.1)與 5，-GCCTGGCTTA GC-3, (SEQ.ID.N0.2)，該等環能提供人工重設的微型核糖核酸由 miRNA)與天然前驅微型核糖核酸輪出相同的核輸出(nudeus export)效率，同時不干擾tRNA輸出。再者，此改良亦促進 mir-302a-mir-302a*雙股及 mir-3〇2c-mir_3〇2c* 雙股的形成， 20 因而增加mir_302s總體的功能與穩定度。此新穎的前驅微型核糖核酸環之設計是修飾tRNAmet環與mir_3〇2b/mir_3〇2a短莖 20 201106977 環之組合而完成，其中mir_3()2b/mir_3()2a之短莖環在人類es 細胞中高度表現但在其他已分化組織的細胞内則否。如此，在mir-302構造中使用該重組/人造/人工髮夾環不會干擾人體中自然的miRNA路徑，因而減低細胞毒性且增加安全性。

Mir-302前驅微型核糖核酸的家族群集是經由雜合與鏈接/ 連結合成的mir-302同源物而形成，該群集由五端至三端包含四個部分：mir-302a、mir-302b、mir-302c，及 mir-302d 的前驅微型核糖核酸(pre-miRNAs ’圖1B)。所有人工重設的mir_ 302 mirRNA/shRNA分子在其五端最前面具有相同的I?個核 10 15

苷酸[例：5’ -UAAGUGCUUC CAUGUUU-3， (SEQ.ID.N0.3)]。Mir-302之前驅微型核糖核酸群集使用的合成寡核苷酸如下所列：包含mir-302a-正義，5’-GTCACGCGTT CCCACCACTT AAACGTGGAT

GTACTTGCTT TGAAACTAAA GAAGTAAGTG CTTCCATGTT TTGGTGATGG ATAGATCTCT C-3,

(SEQ.ID.N0.9)； TCCATCACCA CTTTAGTTTC

mir-302a-反義， AAACATGGAA AAAGCAAGTA

5，-GAGAGATCTA GCACTTACTT CATCCACGTT

TAAGTGGTGG GAACGCGTGA C_3，（SEQ.ID.NO. 10) ; mir-302b-正義，5’-ATAGATCTCT CGCTCCCTTCAACTTTAACA

TGGAAGTGCT TTCTGTGACT TTGAAAGTAA 21 20 201106977 GTGCTTCCAT GTTTTAGTAG GAGTCGCTCA TATGA-3, 5

mir-302b-反義，5’-TCATATGAGC (SEQ.ID.NO.il)；

GACTCCTACT

TTCAAAGTCA

AAGTTGAAGG (SEQ.ID.NO. 12)；

ACCTTTGCTT

TGTGAAACAG

AAAACATGGA CAGAAAGCAC GAGCGAGAGA mir-302c-正義， TAACATGGAG AAGTAAGTGC

AGCACTTACT

TTCCATGTTA TCTAT-3,

5，-CCATATGGCT

GTACCTGCTG

TTCCATGTTT CAGTGGAGGC GTCTAGACAT-35 (SEQ.ID.NO. 13) ； mir-

302c- 反義 AAACATGGAA CAGCAGGTAC 10

5 ’ -ATGTCTAGAC GCCTCC ACTG GCACTTACTT CTGTTTCACA CTCCATGTTA AAGCAAAGGT AGCCATATGG-3’（SEQJD.NO.14) ; mir-302d-正義，5，_ 15

CGTCTAGACA ACTTAGCTAA

TAACACTCAA GCCAGGCTAA

ACATGGAAGC GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TCGCGATCGC AT-3, (SEQ.ID.NO· 15);及 mir-302d-反義，5，-ATGCGATCGC GAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCCTG GCTTAGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TATGTCTAGA CG-3, (SEQ.ID.NO.16)。或者，吾人亦使用人工重設之小髮夾型核糖核酸(shRNA)。該人工重設之小髮夾型核糖核酸是由合成的 22 20 201106977

miR-302s·正 GCGTCCTCTT GTGCTTCCAT TCGATATCTC 義，5，-GCAGATCTCG TACTTTAACA GTTTGAGTGG TAGAGGATCC ACATC-3, AGGTACCGAC TGGAAATTAA TGTGGCGCGA (SEQ.ID.NO. 17) 5

與 mir-302s-反義，5’-GATGTGGATC CTCTAGAGAT ATCGATCGCG CCACACCACT CAAACATGGA AGCACTTAAT TTCCATGTTA AAGTAAAGAG 10 GACGCGTCGG TACCTCGAGA TCTGC-3’（SEQ.ID.NO· 18)雜合形成，取代mir-302前驅微型核糖核酸的群集(mir-302 pre-miRNA cluster)，作簡單的内含子插入。Mir-302小髮夾型核糖核酸(mir-302 shRNA)與所有天然的mi-302成員共有超過 85%的同源性並且標靶相同的人類細胞基因。在設計mir_3〇2 同源物時’胸腺嘧啶可以尿嘧啶取代，反之亦然 15 在mir-302的前驅miRNA/shRNA之内含子插入(intronic insertion)的部份’由於在重組办轉殖基因插入位的側翼分別有五端的户vw/與三端的滅w/限制/選殖位，因此最初的插入子能被移除、再以各種前驅miRNA/s_A插入子取代之(例：mir_3〇2的前驅瓜丨抓八^胃八），其中該等前驅 miRNA/shRKA插入子具有與Pvw/及滅限制位相匹配的黏性末端(cohesive ends)。藉著更換標的不同的基因轉錄分子的内各子插入子’本發明的内含子mir-302s (intronic mir_302s)表 23 20 201106977 現系統能作為在體外(沅、離體(以、及體内(如中引發標的基因靜默的一個有力工具。在内含子插入後，此在内含子插入位含有mir-302之知UMGFP轉殖基因接著再被插入至一能受到去氧羥四環素誘導的户57喂/以7^/2_ 載體之限制/選殖位(即：一恐0/_初·„£>///限制/選殖位），形成能在細胞内表現之江5^识如25表現載體(圖1A)。將表現mir-302的核酸組成物傳送到人類細胞的方法係使用一非轉殖基因或轉殖基因方法，其係選自微脂體/多聚體/化學轉染法(liposomal/polysomal/chemical transfection)、DNA 重組(DNA recombination)、電穿孔法(electroporation)、基因槍穿透（gene gun penetration)、轉位子/反轉位子插入 (transposon/retrotransposon insertion)、跳躍基因整合(jumping gene integration)、顯微注射扭丨咖刮⑽丨⑽）、病毒感染(virai infection)、反轉錄病毒 / 慢病毒感染（retr〇virajyientivirai infection) ’及其組合。為了預防轉殖基因隨機的插入及細胞突變的風險，本發明較佳係使用微脂體或多聚體轉染法來將載體傳送至標的人類細胞中（即，腫瘤/癌細胞）。Mir-302s的表現取決於在各種濃度的去氧羥四環素之下’户似指-仍-續·?似s·載體上由服調控的匸縱啟動子之活化。因此，本發明提供了透過明確藥物(即，去氧羥四環素) 進行的一可誘導式機制，來控制mir_302s在體外、離體、體 24 201106977 内的表現；其亦為除了細胞内NMD系統以外之第二防線。藉由去氧羥四環素的調節控制，吾人在受測細胞中未觀察到由於RNA累積或過飽和所造成的任何細胞毒性。另外，本發明亦提供一持續的(constitutive) mir_3〇2表現系統’其能在—期 5 間内持續表現類mir-302基因靜默效應子。類mir-302基因靜默效應子的表現較佳係透過一 CMF啟動子驅動，其在人類細胞中經常在為期一個月的活化狀態之後，因DNA曱基化而靜止。此活化一個月的機制因能防止被處理的細胞中RNA的累積或過度飽和而有益於癌症治療。 10 總而言之’本發明採用一新穎設計與策略’在被轉染的細胞中可誘導地或持續地表現類mir_3〇2基因靜默效應子。類 mir-302 基因靜默效應子包括 mir-302a、mir-302b、mir-302c、 mir_302d及他們的似髮夾微型核糖核酸前驅物(pre_miRNAs)、人工重設的小髮夾型核糖核酸(shRNA)同源物/衍生物，以及 15 其組合。在較佳實施例中，本發明提供使用一在標的細胞中能被傳送、被轉錄及被處理成類mir_3〇2基因靜默效應子，從而引發mir-302標的的細胞週期調節者與致癌基因之特定基因靜默效應的重組核酸組成物的設計與方法。其包含以下步驟：a)提供一重組核酸組成物，其能被傳送、被轉錄、被處理 20 成至少一基因靜默效應子以干擾複數個mir-302標的的細胞基因，以及b)以該重組核酸組成物處理一細胞受質。類mir_3〇2 25 201106977 基因靜默效應子的轉錄係透過一持續性啟動子(即，或藥物誘導式啟動子(即，77u；_CMF)來驅動。該受藥物誘導的重組核酸組成較佳為-⑸載體，其包含插入有重組論_3〇2 家族群集(mir-302s ; SEQ.ID.NOs.9-16的雜合物)或一人工重 5 設的mir_302小髮夾型核糖核酸同源物（shRNA，即， SEQ.ID.NOs.17肖18的雜合物)的一重組轉殖基因。該細胞受夤旎在體外、離體或體内表現mir_3〇2的標的基因。透過靜默 mir-302標的的細胞週期調節者與致癌基因，本發明能抑制細胞腫瘤生成能力並能將受試細胞重新編程為非腫瘤/癌細胞。 10 發明人由本發明在六個方面獲得mir-302介導之腫瘤/癌症治療之成功的證明：第一，轉染mir_3〇2至正常人類細胞 (mirPS-hHFC)巾導致細朗賴弱但柯起細胞壯或細胞死亡(圖1D-F與圖3A-C)。第二，轉染mir_3〇2至正常人類細胞能將細胞重新編程為類幹細胞狀態；有益於治癒受損組織 15 (圖4A_B與圖5A—D)。第三，將mir-302轉染至腫瘤/癌細胞 (mirPS-MCF7，mirPS-HepG2 與 mirPS-NTera2)會強烈抑制腫瘤/癌細胞的腫瘤生成能力並導致> 9 8 %細胞的死亡或細胞凋亡(圖6A-E)。第四，mir_302不僅能藉由共同抑制數種細胞週期調節者，像是週期素依賴性激酶2 (CDK2)，週期素d1/d2 20 (cyclin D1/D2)與bmi-i，亦能藉著活化腫瘤抑制者： pl6INK4a與pl4/pl9Arf來抑制腫瘤/癌細胞的生成（圖7八一 26 201106977 D)。第五’在體内將mir-302傳送至腫瘤中能抑制〉9〇%的腫瘤細胞生長(圖8A-C)。最後一點’ mir-302不會引起端粒縮短 (telomere shortening)所導致的細胞衰老(ceu senescence^圖 9a_ C)。此外，發明人已成功地使用多聚體/微脂體 5 (polysome/liposome)將類mir-302基因靜默效應子轉染至體内標的的腫瘤細胞中，因此能預防反轉錄病毒感染與轉殖基因突變的風險(圖8A-C)。這些發現提供了能使用類mir_3〇2基因靜默效應子作為腫瘤/癌症治療之治療藥物及/或疫苗的有力證明。另外，考慮到mir-302亦有回復人類細胞之幹細胞性 10 (sternness)的功能(Lin等人，2008)，因此本發明皆有益實施於幹細胞與癌症治療。【實施方式】 15 儘官現將參考附圖描述本發明之特定具體實施例，但應了解此等具體實施例僅作為實施例之用，並僅例示性舉出少數之可能特定具體實施例，其可代表本發明之原理的應用。熟習本技術者人士顯然應了解各種改變及修正皆屬隨附申請專利範圍中所進一步定義的本發明之精神、範缚 μ 及構想内。 ^ 27 201106977 本發明提供一新穎核酸組成物以及利用重組的類mir_3〇2 基因靜默效應子來抑制人類腫瘤/癌細胞增生與腫瘤生成的方法。不同於先前小髮夾型核糖核酸(S_A)的設計，本發明的小髮夾型核糖核酸包含一錯配的莖幹(mismatched stem-arm)， 5 其相似於天然mir-302之前驅物(pre-mir-302)。再者，本發明的小髮夾型核糖核酸含有一改良的pre-mir_3〇2莖環：5，-

GCTAAGCCAG GC-3’（SEQJD.N0.1)與 5’-GCCTGGCTTA

GC-3’（SEQ.ID.N0.2)，其能提供與輸出天然微型核糖核酸前驅物(pre-miRNAs)相同的核輸出(nucleus export)效率，但不干 10 擾轉運核糖核酸(tRNA)的輸出。不受任何特定理論的約束，本發明之抗增生、抗腫瘤生成的效應指出一新發現的、藉由轉染一可表現mir-302家族群集(mir-3〇2s)或mir-302同源性小髮夹型核糖核酸的重組核酸組成物所引發的mir_3〇2介導之基因靜默機制。所有人工重設的miRNA/shRNA分子，其五端 15 最前方的17個核苷酸具有相同的序列，5，-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’（SEQ.ID.N0.3)。構築類 mir-302 基因沉默效應子及表現mir-302的之核酸組成物的步驟將在實施例2與3中描述。在設計與mir-302同源的序列時，胸腺嘧啶(丁)可用來取代尿嘧啶〇L〇。 2〇為了定位mir-302在人類細胞週期中的角色，吾人設計了一可誘導式的必表現載體(圖ία ;實施例2) 28 201106977 並將其轉染到正常的人類癌細胞中。Mir-302s為一 hES特有的微型核糖核酸(miRNA)家族，家族群集中含有四個小非編碼 (non-coding) RNA 成員：mir-3〇2b、mir-302c、mir-302a、及 mir-302d (mir-302s ;圖 IB) (Suh 等人，2004)。本發明中， mir-302s的表現在去氧經四環素(d〇x)的刺激下，透過一藉由四環黴素反應元件(tetracycline-response-element，控制的巨細胞病毋啟動子(cytomegaloviral (CA/F) promoter)來驅動。在轉染之後’ mir_302的生合成依照自然的内含子微型核糖核酸生合成途徑進行’其中mir-302與編碼紅螢光蛋白的報告基因⑺gfp)—起被轉錄’並進一步被剪接複合體(spliceosomal components)及細胞質RNA内切酶RNaselll，岱塞爾(Dicers)切割成個別的mir-302成員（圖2A) (Lin等人，2008)。在定量上’ 一倍的RGFP〉農度相當於有四倍濃度的mjr_3〇2存在。微型核糖核酸微陣列分析確認了在去氧羥四環素(D〇x)刺激下， mir-302b*以外的所有mir-302成員皆能在被轉染的細胞中有效表現(圖1C ;實施例3)。以兄?必表現載體轉染細胞的步驟概述於圖2B —C。此外，表現mir-302的核酸組成物，像是户 ’含有.用以增加真核細胞轉譯效率之K〇zak —致性轉譯起始位(Kozak consensus translation initiation site)、位於表現mir-302之構成物(mir-302 construct)之下游的多個SV40聚 29 201106977 腺苷酸化訊息(SV40 polyadenylation signals)、在原核細胞中繁殖用的一 pUC複製起始點、用來將表現mir_3〇2之構成物 (即’ 合併至該核酸組成物之至少兩個限制位、在表現SV40 T抗原之哺乳動物細胞中複製所需的一選擇性的 5 SV40複製起始點、以及在一複製勝任原核細胞中表現抗生素抗藥性基因所需之一選擇性SV40早期啟動子。抗生素抗藥性基因之表現係作為一篩選標記，用來分離有轉殖基因之表現的陽性群落。該等抗生素係選自G418、新黴素(neomycin)、嘌呤黴素(puromycin)、盤尼西林G(penicillin G)、安比西林 10 (ampiciUin)、卡那黴素(kanamycin)、鏈黴素(streptomycin)、紅黴素(eiythromycin)、斯派克黴素(spectromycin)、霍火黴素 (phophomycin)、四環黴素（tetracycline)、去氧羥四環素 (doxycycline)、利服平(rifapicin)、兩性黴素 B(amphotericin B)、健他徽素(gentamycin)、氣黴素(chloramphenicol)、頭孢黴 15 素(cephalothin)、泰黴素(tylosin)及其組合。

Mir-302減弱正常細胞細胞遇期而不引起細胞凋亡吾人先刖的研究顯示在人類黑色素細胞瘤細胞Colo-829與前列腺癌細胞PC3中，mir-302表現增加會將這些 20 惡性癌細胞重新編程至一似hES的多能(pluripotent)狀態 (Lin等人，2008)。在體細胞重新編程(SCR)的過程中， 30 201106977 mir-302導致大於98°/q (>98%)的癌細胞細胞凋亡並且大幅減低餘下（<2%)重新編程細胞的增生速率。雖然這些特性有益於癌症治療’但是mir-302在正常人類細胞中的功能仍然是不確定的。為了評估其效應，吾人將可被誘導的 5 所识列a表現載體導入正常人類毛囊細胞 (hHFCs)中。選擇hHFCs的原因是由於其量充足、具可及性、並且生長快速。隨著去氧羥四環素(Dox)濃度增加至 ΙΟμΜ，吾人觀察到在去氧經四環素濃度大於7.5μΜ (> 7.5μΜ)(圖ID ’實施例5)的閾值下，核心重新編程因子 10 (core reprogramming factors) Oct4 —Sox2 — Nanog — 致受到促進，同時增生的細胞族群下降70%，即，由原先的 37%±2%降至11%±2% (圖IE，Μ期；實施例7)。相應之下，休眠的細胞族群增加了 41%，即，由原先的56%±3〇/〇增至79%士5% (圖IE，G0/G1期；實施例7)，因而反映出 15 相似於吾人先前在mir-3〇2重新編程多能性幹細胞(mir_^〇2 —reprogrammed pluripotent stem cells)所發現的（mirps cells ; Lin等人，2008)—強烈的抗增生作用。然而mir_3〇2 重新編程之hHFC細胞(mirPS-hHFC)不表現任何能夠測得的細胞凋亡的DNA斷裂(DNA laddering)或細胞死亡的徵 20 象(圖1F，實施例6)，這表示相較於腫瘤/癌細胞，正常細胞更可以忍受mir-302造成的抗增生作用。可以想見腫瘤/ 31 201106977 癌細胞旺盛的新陳代謝及快速的生長擴張使其很難以在這樣的休眠狀態下存活。 a 值得注意的是，當以濃度大於7·5μΜ的去氧羥四環素處理後，mirPS-hHFC的形態由紡錘狀轉變成類似休眠細 5 胞的球狀(圖3A-B，紅色RGFP陽性細胞）。在7.5μΜ去氧經四環素刺激下所產生的細胞mir-302濃度大約是人類胚胎幹細胞H1及H9細胞中mir-302濃度水平的1.3倍（圖 4A ;實施例4)。在此更高的濃度水平之下，mirPS-hHPCs 強烈表現Oct3/4、Sox2、Nanog、及其他標準人類胚胎幹 1〇細胞(hES)標記（圖4A)。全基因表現的微陣列分析進—步顯示大約一半的轉錄體(transcriptome)由hHFC體細胞的形式轉變為似hES的表現形式，並且與H1/H9細胞有超過 93% (>93%)的相似度（圖5A ;實施例8)。體細胞重新編程(SCR)起始的第一徵象：全基因體DNA的去曱基化亦能 15 清楚地在這些mirPS-hHFCs中測得，且去甲基化型式亦與 H1/H9細胞中的相同（圖5B與5C ;實施例9)。此外，每一個別的mirPS-hHFC細胞能長成一單一似類胚胎體群落，並且其每週期20〜24小時的細胞分裂速率亦符合 mir-302的抗增生效應（圖3C)。吾人特別注意到這些 20 mirPS-hHFCs係多能的(pluripotent)但非具有腫瘤生成能力 (tumoregenetic)，因為這些mirPS-hHFCs只在假性懷孕免 32 201106977 疫功能不足的SCID-beige小鼠子宮與腹腔中形成似畸胎瘤組織囊腫。這些似畸胎瘤囊腫包含各種源自三種胚層 (embryonic germ layer):外胚層、中胚層、及内胚層的組織(圖5D ;實施例1〇)。另外，當mirPS-hHFCs被異種移 5 植至正常雄性小鼠體内，mirPS-hHFCs則被周圍組織同化並與其表現相同的組織標記；這亦表示了將mir-302用於治癒受傷細胞的可能（圖4B)。以上發現綜合顯示mir-3〇2 能將體細胞hHFCs重新編程為似hES的iPS細胞(誘導多能幹細胞）。〇ct3/4與Sox2等轉錄因子對mir-302的表現 1〇而言具重要性（Marson等人，2008 ; Card等人，2008)， mir-302或許能取代Oct3/4~Sox2來誘導體細胞重新編程 (SCR)的發生。由Mir-302所誘導SCR，其與細胞週期減弱之並行取決於mir-302的濃度。吾人發現當mir_3〇2濃度超過其在人 15 類胚胎幹細胞H1/H9中濃度的13倍時，這兩件事幾乎同時發生，因此而指出了此特殊濃度為起始該兩事件的最小閾值。先前實驗中’使用單一個mir_3〇2成員或者使用相當於H1/H9細胞中之較低濃度的牆-302無法引發前述事件。並且，吾人証實了以較低濃度之5μΜ去氧羥四環素 20 所誘導的mir_302，其濃度無法靜默報告基因的標的位置或是標的的G1檢控點調節者。與自然發生相較，桑椹期 33 201106977 (momla stage，32〜64細胞時期）之前的胚胎細胞常呈現與 mirPS細胞的情況相似之非常慢的細胞週期速率。然而了這樣的細胞週期調節作用並未在源自囊胚（biast'〇cyA derived)的hES細胞中發現。由此可推測，hES細胞質中較低濃度的mM02不足以靜默標的的G1檢控點調節者以及致癌基因。這可能也解釋了源自囊胚的hES為何具有戲劇性的增生能力以及發展成腫瘤的傾向。因此，本發明可應用於在幹細胞治療中降低hES細胞的腫瘤生成能力 (tumorigenecity)。

15 鐾於mir-302具有導致癌細胞細胞凋亡與細胞週期減弱的功能，吾人接著研究使用mir-302作為普適性人類腫瘤/癌細胞治療用藥的可能性。吾人先前的研究已顯示此方式在黑色素瘤(melanoma)及攝護腺癌細胞上有可行性(Lin 專人，2008)，在目前的研究中，吾人進一步測試其在乳癌細胞MCF7、肝癌細胞Hep G2、以及胚胎性畸胎瘤細胞 NTera-2中的可行性。如圊6A — B所示，三種腫瘤/癌細胞在以載體轉染並在1 ΟμΜ去氧經四學素的刺激下，皆被重新編程為休眠mirPS細胞並形成似類胚胎體群落(embryoid body-like colonoes)。此濃度水平的 34 20 201106977 mir-302在所有三種腫瘤/癌細胞中亦引發顯著的細胞凋亡 (> 95%)(圖1F，貫施例6)。以流式細胞儀進一步分析細胞週期各時期的DNA含量之後，結果顯示在所有mirps細胞中有絲分裂的細胞族群顯著地減少（圊6C ;實施例7)。 5 有絲分裂的細胞族群(M期）在mirPS-MCF7細胞中減少了 78% :由 49%±3%降低至 ιι〇/。士2% ;在 mirPS-HepG2 細胞中減少了 63。/。：由 46%±4%降低至 17%±20/。；在 mirPS-NTera2細胞中減少了 62〇/〇 :由50%±6%降低至19%士4% ; 反之，停滯/休眠的細胞族群(G〇/Gl期）在mirPS-MCF7、 ίο mirPS-HePG2 與 mirPS-NTera2 細胞中分別增加了 80〇/〇、 65%與72% :在mirps-MCF7細胞中由41%±4%增加至 74%±5%，在mirps-HepG2細胞中由43%±3%增加至 71%±4°/。，在 mirps_NTera2 細胞中由 40〇/〇±7%增加至 69%±8%。這些結果指出mir_3〇2能有效地減弱這些腫瘤/ 15 癌細胞快速的細胞週期速率，並導致顯著的細胞凋亡。細胞侵犯試驗（使用Matrigel小室）以及細胞貼附試驗 (細胞貼附於人類骨髓内皮細胞(hBMEC)的單細胞層）等體外腫瘤生成能力試驗(In vitro tumorigenecity assays)顯示 mir-302除了抗增生特性以外，再兩種抗腫瘤生成的效 20 應。細胞侵犯試驗(Cell invasion assay)顯示所有三種休眠的mirPS-腫瘤/癌細胞失去其遷移的能力（降低至<1%)，而 35 201106977 原本的腫瘤/癌細胞侵略性地侵入補充有較高營養物的間隔區：在MCF7細胞中佔了超過9%±3°/〇、在Hep G2細胞中佔了 16%±4%、在NTera-2細胞中佔了 3%±2%的細胞族群 (圖6D ;實施例11)。細胞貼附試驗(Cell adhesion assay)亦 5 一致顯示該些mirPS-腫瘤/癌細胞不能貼附hBMEC單細胞層，然而原本的MCF7、Hep G2細胞在經過50分鐘的培養之後，其中顯著的細胞族群(MCF7 7%±3%、Hep G2 2〇%±2%)快速轉移至hBMEC單細胞層（圖6E;實施例 12)。總結來說’迄今所有的發現強烈且一再顯示mir-302 ίο 是一人類腫瘤抑制者，其能減弱快速的細胞生長、導致腫瘤/癌細胞細胞凋亡、以及抑制腫瘤/癌細胞侵入(invasi〇n) 及轉移(metastasis)。最重要的是，此新穎的mir_3〇2功能可以提供一種能對抗多樣人類腫瘤/癌，包括但不限於惡性的皮膚癌（Colo-829)、攝護腺癌(p(>3)、乳癌(MCF7)、肝 15癌(HePG2)、以及以畸胎瘤(NTera_2)包含各不同組織的觀點而言，各種腫瘤的普適性治療。

Mir-302調觫之括. DX/D2 > ^ BMT-1 為確認mir-302

由其對 CDKL cydill· ^ , 、払的的G1檢控點調節者之間實際的交互作用，吾人進杆A 貫退仃冷先酵素三端非轉譯區報告基因 36 20 201106977 (luciferase3’UTR region reporter)試驗（圖 7八；實施例 15)。結果顯示以不同濃度的mir_3〇2處理，將對標的的檢控點調節者，包括細胞週期素依賴性蛋白2 (CDK2)、細胞週期素D1/D2 (cydins-Dl/D2)、及BMI-1小組蛋白環指致癌基因（BMI1 polycomb ring finger oncogene)造成很不一樣的抑制效應。在ΙΟμΜ去氧羥四環素存在下，mir_3〇2有效也與CDK2、cycHns W/D2、A 轉錄分子的標的位置結合並且成功地靜默超過80%(> 8〇%)的報告冷光酵素之表現(圖7B ;實施例IS)。Mir_302在而們細胞中對真正的標的 1〇基因的抑制作用則藉由西方墨點分析法來確認，其結果與冷光酵素二端非轉譯區報告基因試驗(圖7C ;實施例5)之結果一致。相反地’在5μΜ去氧經四環素誘導下之油撕，其較少 1的跡搬表現’無論對於報告基_標雜或者對週期素 D2以外的標的的G1檢控點調節者，皆無法引發任何顯著的靜 15默效應(圖7B與7D)。這指出了秦302表現的劑量相關性 (dose-dependem ma職)及其基於該劑量性微調細胞週期速率的能力。在哺乳動物細胞週期中，Gl—S期的轉換正常來說是以兩個代償的週齡-週期素朗性_複合齡咖―咖 complexes) : cyclin_D_CDK搞及⑽me·所控制 2〇呀伽等人，2〇〇6)。吾人則發現高濃度的*302透過對 CDK2及cyclins臟2的共同抑制使兩複合體失去活性，於是 37 201106977 阻礙兩個控制Gl-S _換的路徑並_重新編程恤朽細胞中的細胞週期速率。在_Cs及mirPS細胞中，⑽n D3有限的表現量使其不足以代償milPS峨巾eydins Di/〇2的損失。 ' 5 伴^ BMI]的靜默，吾人進-步偵測到pl6Ink4a及 pl4Arf表現的輕微增加(在hHFCs巾上升的百分比分別為挪 ±17%與57%±130/〇) ’然而沒有發現p21Cipl的表現有改變(圖 7C)。致癌性癌症幹細胞(onc〇genic cancer stem cell)標記： BMI-1的缺乏，會藉由增強piQn^a及等腫瘤抑制 10 者的活性，抑制G1 — S期轉換(jac〇bs等人，1999)。在這種情況下 ’ 16Ink4a 直接抑制依賴 CyCiin_D 的 CDK4/6 (cyclin-D-dependent CDK4/6)鱗酸化視網膜母細胞瘤蛋白(retin〇biast〇ma protein，Rb)的活性，於是防止Rb釋放進入s期所需的 E2F ’ 而進行 E2F 依賴性轉錄(E2F-dependent transcription) 15 (Parry 等人 ’ 1995 ; Quelle 等人，1995)。另外，pl4Arf 防止 HDM2與p53結合而允許p53依賴性轉錄（p53-dependent transcription)，其負責G1期的停滯或細胞凋亡(Kamijo等人， 1997)。然而，就目前所知，胚胎幹細胞不受cyclin-D依賴性 CDK (cyclin-D - dependent CDK)的調節（Burdon 等人， 20 2002 ; Jirmanova 等人，2002 ; Stead 等人，2002)，因此目前對hES細胞細胞週期調節的認知是為CDK2是發生Gl—S期 38 201106977 轉換的主要決定因素。因此，CDK2的靜默很可能在造成 mirPS細胞的G1停滯(Gl-arrest)上有最大的影響，而cyclin-D 與BMI-1的共同抑制以及pl6Ink4a及pl4Arf的共同活化則附加地抑制腫瘤生成訊號所誘發(tumorigenetic signal-induced)的 5 細胞增生。此外，cyclin-D的損失以及pl6Ink4a的活化也解釋了在胚胎幹細胞中依賴cyclin-D (cyclin-D — dependent)的 CDK其活性的缺乏。因此，微型核糖核酸(miRNA)與標的基因交互作用的嚴謹度能決定微型核糖核酸真正的功能。依細胞條件不 10 同’微型核糖核酸會表現不同的基因標的偏好。本發明洞悉此重要細節並首次揭示mir-302在人類及小鼠細胞中的功能非常不同。在人類細胞中，mir-302強烈標的CD欠2、 D7/D2、以及5M/-7，但有趣的是，不包括。與小鼠；?27Cz>l不同，人類不含任何的 15 mir_302標的位。不同的基因標的導致兩者在細胞週期調節上的重要分歧(schism)。在小鼠胚胎幹細胞(mEs)中， mir-302靜默p21Cipl並且促進類腫瘤(tum〇r_iike)細胞增生 (Wang 等人，2008 ; Judson，2009)，然而 p21Cipl 的表現在人類mirPS細胞中保留下來並導致較慢的細胞增生與較 20 弱的腫瘤生成能力。此外，小鼠的也因缺乏適當的標的位而非mir-302的標的基因。吾人已揭示在mirPS細 39 201106977 胞中’人類ΒΜΙ-l的靜默會輕微刺激pi6Ink4a/pl4ARF的表現’而減弱細胞增生，反之mir_3〇2無法靜默小鼠BMI-1來引起相同的效應。由於在mirPS細胞中 pl6Ink4a/pl4ARF的表現上升了而p2iCipl不受影響，因此可理解的是人類mirPS細胞中的抗增生及抗腫瘤生成效應最有可能在共同抑制cyclin-E - CDK2及cyclin-D — CDK4/6 路徑以外，透過 pl6Ink4a_Rb 及/或 pl4/19ARp — p53途徑來達成。Mir_302標的人類及小鼠基因偏好的顯著區別意味著兩者的細胞週期調節機制有根本上的不同。

Mir-302的處理減消趙過90%的體内腫痼細胞的生县祐反不改變幹細胞的多能性在確認mir-302的腫瘤抑制功能及其在正常與腫瘤/癌細胞間不同的作用之後，吾人接著試驗是否可以mir-302 15 作為一治療八週大雄性無胸線小鼠(BALB/c-nu/nu品系）體内一 NTera2衍生之畸胎瘤的藥物(實施例13)。腫瘤Tera-2 細胞株(neoplastic Tera-2，NTera-2)是一多能性人類胚胎畸胎癌細胞株(human embryonal teratocarcinoma cell line)，其能在體内分化成多種原始的體細胞組織(primitive somatic 20 tissue)，特別是原始腺組織及原始神經組織(Andrews等人，1984)。由於其多能性，NTera-2衍生的畸胎瘤可作為 40 201106977 體内各種腫瘤形式治療之模型。在藥物投遞方面，吾人採原位注射(in situ )將以聚乙烯亞胺(p〇lyethylenimine，pEI) 配製的；?CMF.㈣^表5見載體注㈣卜極接近腫瘤的位置。户CMF-所认如2s載體是將由四環黴素所控制的（7及五_ 5 controiled) CMF啟動子換成一般的啟動子而構成(實施例2)，由於DNA甲基化的緣故，在人類細胞中表現的時間持續接近一個月。在注射上限至1〇)ig/ 每g小鼠重（一次注射的最大量）的^CMFL?m•幻載體後，吾人觀察到小鼠無患病或惡病質(cachexia)的徵象，因 ίο 此證明此方法之安全性。紐織學檢查亦顯示在腦、心、肺、肝、腎、及脾臟中無可測得的組織損害(lesi〇n)。本發明實施例測得以2pg/每g小鼠重的户CMF-進行五次處理(相鄰處理間隔三天）對畸胎瘤生長具有顯著的抑制作用。如圖8A (實施例13)所示，以 15 載體處理後，NTem2衍生之畸胎瘤的平均尺寸(11 士5mm。，n=6)與未處理的組別（1〇4±23ιηιη3，n=4)相較之下減少超過89°/〇(>89%)。相反地，施予相同量的由 PEI 配製的反義-mir-302d (antisense-mir-302d)表現載體將使畸胎瘤大小增為原來的14〇% 20 (2 5 0±73mm' ’ n=3)。基於以上的結果，本發明發現NTera- 2細胞表現中等水平之8B)。北方墨點分析的結 201106977 杲亦顯不在這些受到不同處理的的畸胎瘤細胞中，‘搬的表現與__圖8B_負相關，亦即，調控* 302的表現能有效控制體内畸胎瘤的生長。為證實先前在體外(in vit，魏，吾从行衫墨點分析絲確認在處以mir-302的畸胎瘤中’ G1檢控點調節者⑶幻― 10 cyclins-Dl/D2 —ΒΜΙ-1 被共同抑制 w 乂及核心重新編程因子 Oct3/4 —Sox2 —Nanog 的共同活化（阁 QtJ、亿（圖8B)。以免疫組織化學(imm刪chemicd，IHC)染色法分析崎月台瘤組織中的該些蛋白質’亦證實了 _的結果(圖8C ;實施例14)。最值得注意的是’吾人發現薩-302能抑制畸胎瘤細胞生長而不影響其天然的多能分化能力此亦指出高濃度的 mir- 15 302扮演腫瘤抑制者與重新編程因子的雙重角色。美於 mir-302的雙重功能以及從體内與體外(in vitr〇，记得到的相符合的結果’吾人因此可推論：發現於體外的 mir-302抗增生機制可以被應用於抑制體内崎胎瘤生長，因此能作為可針對各種腫瘤的一可能治療方式。 Μ汰-302藉由P161nk4a/D14ARF的法化而非媸教_被^^ 胞老化（cell senescence) 有報告指出，人類誘導式多能幹細胞(iPS)會有提早老化與有限擴張的問題(Banito等人，2009 ; Feng等人， 42 201106977 2010)。正常成熟細胞亦進行一有限數量的分裂並最終達到一靜止狀態(quiescence state)，稱為複製性老化(replective senescence)。逃避複製性老化的細胞常常變成永生細胞 (mimortal cells) ’像是腫瘤/癌細胞；因此，複製性老化是 5 對抗腫瘤/癌細胞形成的正常防禦機制。在本發明中，吾人

發現mir-302能直接靜默顧]^而引發pl6Ink4a/pl4ART 相關的細胞週期調控。其他研究進一步指出BMM能活化人類端粒扭反轉錄酶⑴㈣如telomerase reverse transcriptase，hTERT)的轉錄作用，端粒酶的活性因此增加 10 而繞過複製性老化，並且增加細胞壽命(Dimri等人， 2002)。由此可見，mir-302的過度表現會導致mirPS細胞的 hTERT 相關性老化(hTERT-associated senescence)。為了釐清這點，吾人進行端粒重複序列擴增試驗(tel〇meric repeat amplification protocol，TRAP)(實施例 16)，來測量 15 端粒酶活性。如圖9A所示，所有經1〇μΜ去氧羥四環素處理的mirPS細胞意外地與其原本的腫瘤/癌細胞及Η1/Η9細胞相似，展現強烈的端粒酶活性。此外，西方墨點分析亦顯示在這些mirPS細胞中’ hTERT表現增加而非減少（圖9B)。端粒酶 PCRELISA試驗亦證實相對端粒酶活性的增加(圖9C)。另外， 2〇吾人進一步測得mirPS細胞中賴胺酸特異性甲基酶(iysine specific histone demethylase AOF2，又名 KDM1/LSD1)與組蛋白 43 201106977 去乙醯基酵素(histone deacetylase HDAC2)的靜默(圖9B)。先前的研究指出，AOF2為抑制hTERT轉錄所需，而AOF2及 HDAC2兩者的缺乏將引起hTERT過度表現（Won等人， 2002 ; Zhu等人，2008)。吾人在本發明中亦發現A〇F2與 5 HDAC2為mir·302的強大標的且在mirPS細胞中皆被靜默了 (圖10)。因此，mir-302在mirPS細胞中實際上增加mirps細胞之端粒酶的活性而非引起hTERT相關性老化。然而，hTERT 活性增加的效應會被mir-3〇2所引起的BMH抑制與 pl6Ink4a/Pl4ARF活化所中和，而在―搬細胞中達到防止 10 腫瘤/癌細胞發生的平衡。總結來說，本發明使用一具新穎腫瘤抑制功能之咖搬作為癌症治療藥物。吾人發現mMG2介導的細胞職調控，包含共同抑制G1檢控點調節者與活化CDK抑制子之間高度協調的機轉。這些事件必須同時發生以防止在Gi—s行進= 15 城任何漏洞。細胞週射⑽G1 _停滯龍細胞重新:程 (SCR)的起始很重要。在該休眠狀態，體細胞基因體大量地被去甲基化’並且有超過91%的細胞轉錄體被重新編程為似磁，基因表現形態。吾人經由破解mW〇2與其標的基因之間的父互作用，認識到與mir_302相關之細胞週期調控在scr期間 2〇錯綜複雜的機制(圖U)。吾人先前的研究證實ηώ·302靜默其 ^的外基因調时(epigenetie regula㈣，而活化—s〇x2 44 201106977 —Nanog的共同表現，這些核心重新編程轉錄因子接著再引發 SCR (Lm等人，2008)。本發明進一步率先揭示mir_3〇2在Scr 期間同呀靜默CDK2、cyclins D1/D2、與BMI-1而減弱細胞分裂。適當控制細胞週期速率對於防止時常在SCR期間活化的 5 致癌基因之腫瘤生成能力具有生物學上的重要性。對此，mir_ 302靜默CDK2與cyclins D1/D2並阻礙G1-S期轉換。同時，BMI-1的抑制進一步增強pl6Ink4a與pl9Arf的腫瘤抑制活性。透過這些細胞週期途徑的協同調控，mir_3〇2能起始體細胞重新編程(SCR)的進行而不使細胞惡化成具有腫瘤生成能 10 力（tumorigenecity)。本發明至少有五項正面突破。第一，一類mir_3〇2基因靜默效應子可取代所有四個核心重新編程轉錄因子~ Klf-c-Myc 〇ct4 -Sox2 -Nanog -Lin28 VX ^ ^ ^ 編程為似hES幹細胞。這些重新編程細胞有助於幹細胞療 15 法。第二，由於類mir-302基因靜默效應子具有小尺寸(含有約23個核糖核苦酸），因此此小尺寸類mir_3〇2基因靜默效應子的表現載體在結構上可更為緊緻而提高體内轉染的效率。第三，細胞内的無意義調節之衰敗(NMD)系統以及誘導式的表現系統能防止與RNA有關的細胞毒性。第四，mir_3〇2介 2〇導的細胞凋亡只發生於腫瘤/癌細胞而不發生於正常人類細胞。最後，本發明使用多聚體(polysomal)、微脂體(liposomal) 45 201106977 及電穿孔树絲歧觸/慢病毒感染，來將表現mir-3 02 的核酉文組，物傳送至腫瘤/癌細胞中，以確保安全性及類mir- 302 ^因靜默效應子在體外(ώ vi加)及體内(土 viv〇)治療上的使用。總而言之，這些突破顯示了使用類論-302基因沉默效應子及表現該類mir-302基因沉默效應子之組成物來治療腫瘤/ 癌症之可仃性，並且提供了-能發展為普適_症藥物及/或疫苗之新穎設計。 A.定義 10 為促進對本發明的了解，以下定義一些術語 ^IIXNucleotide):-單分子之去氧核難_NA)或核糖核酸(RNA)，其包含：-糖部份體(戊糖卿㈣、一鱗酸根 (phosphate)及一含氮雜環驗基㈣r〇gen〇us ^)。該驗基係經由糖普碳(glycosidic Carb〇n，該戊糖之i端碳)與該 15糖雜體鏈結，脑·及糖的組合係-«(—de)。於該戊糖之三端與五端位置鍵結至少__酸的—核苦係為一核普酸(nucleotide)〇寡歷酸馳—)_ ：包含兩個以上之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的一個分子，其較佳係超過三個， 20 而通常包含超過十個。確切的長度取決於許多因素，其並且 201106977 依照該寡核苷酸之最佳功能或用途而定。寡核苷酸可用任何方式生成，包括：化學合成、DNA複製、反轉錄、或其組合。 (Nucleic Acid):可為單股或雙股的一核苷酸 5 (nucleotide)聚合物。趁_^酸相似物iNucleotide Analog! :一°票吟(purine)或喊咬 (pyrimidine)核苷酸，其在結構上a (腺嘌呤）、T (胸腺嘧啶）、 G (鳥嘌呤）、C (胞嘧啶)或u (尿嘧啶)核苷酸不同但足夠相似’因此可在一核酸分子中取代正常核苷酸。 10 核酸組成物(Nucleic Acid Composition):一核酸組成物係指多核苷酸(polynucleotide)，如：以單股或雙股分子結構的形式存在的去氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸 (RNA)。 ^ gl_(Gene)：一核酸，其核苷酸序列針對一 RNA及/ 15 或一多肽(蛋白質)編碼。一基因可以是RNA或DNA。鹼基對(Base Pair，bp):於一雙股DNA分子中之腺嘌呤（adenine ’ A)與胸腺嘧啶（thymine，T)，或胞嘧啶 (cytosine ’ C)與鳥0票吟(guanine，G)之配對(partnership)。在RNA中’尿响咬(uracil ’ IJ)取代胸腺喷σ定(thymine， 47 201106977 T)。一般來說，該配對透過氫鍵(hydrogen bonding)來連接。前驅僂訊核糖核酸（Precursor messenger RNA，pre_ mRNA)：一基因經由一細胞内機制在真核細胞中透過第二 5 型RNA聚合酶(Ροΐ-Π)而產生之初級核糖核苷酸轉錄分子 (primary ribonucleotide transcript)，其中該機制稱為轉錄 (transcription)。一前驅傳訊核糖核酸序列包含：五端非轉譯區（5’-end untranslated region)、三端非轉譯區（3,_end untranslated region)、外顯子(exon)及内含子(intron)。 10 含子(Intron): —基因轉錄分子序列之一部分或多個部分’其編碼非蛋白質讀框。如：同一讀框内含子(in_ frame intron)、五端非轉譯區（5’-UTR)及三端非轉譯區（3，_ UTR)。外顯子（Exon): 一基因轉錄分子序列之一部分或多個 15 部分，其編碼蛋白質讀框(cDNA)，如：細胞基因、哺乳動物基因、胚胎幹細胞標記基因、螢光蛋白質標記基因、冷光酵素基因、lac-Z乳糖報告基因、病毒基因、跳躍基因、轉位子、及其組合的cDNA。盤訊核糖核酸(Messenger RNA，mR^)；由前驅傳訊 20 核糖核酸的外顯子組合而成。前驅傳訊核糖核酸在經由枝 48 201106977 内剪接機制（intranuclear spliceosomal machineries)移除内含子之後形成，並且在蛋白質合成中作為編碼蛋白質的 RNA 〇核酸fcDNA、：與一 mRNA序列互補且不含任何内含子序列之單股去氧核糖核酸(DNA)。 —核酸分子，其序列順序及組成與同源之mRNA相同。以「+」、rs」或rsense」符號來表示此同義核酸構造形態。與個別mRNA分子互補之一核酸分子。以「―」符號來表示此反義核酸構造形態，或是在DNA或RNA之前加上「a」或「antisense」，例如：「aDNA」或「aRNA」。在連續核苷酸之5端位置缺少一核苷酸的一端。在該連續核苦酸中，一個核苦酸之五端氫氧基係以一磷酸二酯鍵連接至下一個核苷酸之三端氫氧基。在該端可以有其它基，如一或多個磷酸根。連續核苷酸之3端位置缺少一核苷酸的端。在該連續料酸巾’—健㈣之五端氫氧基係以 —填酸二_接連接至下—個料酸之三端氫氧基。在該端可以有其它基’通f為-氫氧根。 49 201106977 核板.(Template} ••能以一核酸聚合酶複製之一核酸分子。根據不同的聚合酶，一模板可為單股、雙股或部分雙股。合成後之複製物係與該模板、雙股模板中之至少一股、或部分雙股模板互補。RNA與DNA皆以由五端往三 5 端的方向合成。一核酸雙鏈體(duplex)之兩股總是排列在一起，使得該等兩股之五端係在該雙鏈體之相對端上(必要的話，該等兩股之三端亦然）。核酸模板(Nucleic Acid Template): 一雙股 DNA 分子、雙股RNA分子、雜合分子(如：DNA-RNA或RNA-1〇 DNA雜合物）、或單股DNA或RNA分子。二^性（Conserved)：若一核苷酸序列係與一預選(參考) 序列之確切互補物非隨機地雜合，則兩者的序列為一致性。 _Μ__(Complemetary 成 complementarity 成 complementation).係依驗基對原則（base-pairing rule)而產生關聯之多核普酸（即：一序列之核普酸）。例如：序列「A-G-T」與序列「T-C-A」及「T-C-U」互補。互補可以發生於兩股DNA之間、一股DNA與一股RNA之間、或是在兩股RNA之間。互補可以是「部分」或「完全」或是「整體」的。當僅一些核酸鹼基根據該等鹼基對原則相配對’則發生部分互補（partiai compiernentarity或 50 201106977 complementation)。當鹼基在該等核酸股之間完全相配時，則發生完全或整體互補（Complete or total C〇mplementarity complementation)。在核酸股之間的互補程度對於核酸股之間的雜合效率及強度有重要的影響。此對於擴增 (amplification)反應特別重要，且對於依據核酸間之鍵合 (binding)來達成的偵測方法也很重要。互補率（percent complementarity 或 complementation)係指在該核酸之一股中失配驗基數與全部驗基數的比。因此，5〇〇/0的互補率意指一半的驗基失配，而另一半的驗基相配對。即使核酸之兩股其驗基數不同’核酸之兩股也能互補。在此情況下，互補發生於部分之較長股間，該較長股之部分鹼基與較短股之驗基成對。 (homologous^ homology^):意指一多核苷酸序列’其與一基因或傳訊核糖核酸(mRNA)序列相似。例如.一核酸序列可能與一特定基因或mRNA序列完全或部分同源。同源也可用相似核苷酸數與全部核苷酸數的比率 (百分比)表示。互補驗基(complemetarv base):當 DNA 或 RNA 形成一雙股結構時正常配對之核苷酸。互補核苦醆序 jj (Comr>lemetarv Nucleotide Sequence): 在一單股分子之DNA或RNA中的一核苷酸序列，其充份 51 201106977 與在另一單股上之核苷酸序列互補，以致兩股之間藉由氫鍵而專對地雜合。 li^XHybndi,ze,..A-Hybridization^):雙鏈體的形成，其係核苷酸序列之間充分地互補並藉由鹼基配對形成複合體。當一引子（或剪接模板)與標的(模板）「雜合」，則雜合所形成之複合體（或雜合物’ hybrids)係充分地穩定以提供一 DNA聚合酶引發DNA合成所需的引子功能。在兩條互補夕核音酸之間有一競♦性抑制(c〇mpetitiveiy inhibited)的特殊交互作用（即：非隨機）。 I 轉_錄基因靜默__(Posttranscriptional Gene Silencing): 在mRNA降解或轉譯抑制下之，一標的基因剔除 (knockout)或減弱(knockdown)的效應，其通常為外來/病毒 DNA轉殖基因或小型抑制性rna任一者所觸發。核糖核酸干擾(RNA interference，RNAJJ : 一種在真核細胞中之後轉錄基因靜默機制，其可用小型抑制性RN a 分子觸發，如：微型核糖核酸(miRNA)、小髮夾型核糖核酸(shRNA)及小干擾核糖核酸(siRNA)。該等小RNA分子通常可作為基因靜默子，其干擾細胞内與該等小型RN A 完全或部分互補之基因的表現。 52 201106977 1L输碼核糖核酸(Non-coding RNA):無法以之用來經由細胞内轉譯機制合成肽類或蛋白質的一 RNA轉錄分子。徵遣控糖核酸(MicroRNA，miRNA):能夠與和該微型核糖核酸(miRNA)部分互補之標的基因轉錄分子結合的單股RNA。MiRNA通常長約17到27個寡核苷酸，並能依照在該miRNA與其標的mRNA之間的互補程度來直接降解細胞内之mRNA標的，或抑制其標的mRNA之蛋白質轉譯。幾乎在所有的真核細胞中都能發現天然的miRNA， 10 其作用有如對抗病毒感染之防衛物一般，並且能在動植物發育期間調節基因表現。核酸，其包含用來與細胞内RNA内切酶，RNaseni交互作用的幹臂(stem-arm)及幹環(stem_i〇〇p)區域，以產生一或多個微型婦賊⑽RNAs)。微型減減可靜默該等微塑核糖核酸之標的基因，或與該等微型核糖核酸序^互補之基因。刖驅微型核糖核酸(pre_miRNA)的幹I區域可形成-完全(1_)或部分（失配)之雜合雙鏈體，而邮域係連接至婦臂雙鏈體之—端而形成—圓二型環狀構造形態。 53 20 201106977 小干擾核糖核酸(small interfering RNA，siRNA彳:短雙股核糖核酸’其為具有約18到25個完全驗基對之核糖核苷酸雙鏈體，並可降解與之幾乎完全互補的標的基因轉錄分子。 5 小髮夾型或短髮决型核糖核酸(small ha彳rpin < hairpin RNA，shRNA):單股核糖核酸，其包含一對部分或完全相配之幹臂核苷酸序列，該序列係以一失配寡核苦酸環分隔開而形成一似髮夾型結構。許多天然微型核糖核酸(miRNAs)係源自似髮夾型核糖核酸前驅物，即：前驅微 1〇核型糖核酸(pre-miRNA)。直體(Vector)_ ：能於不同基因環境中移動或滯留之_ 重組核酸組成物，如：重組DNA(recombinant DNA， rDNA)。一般來說，另外的核酸分子係操作性地連結於此。該載體能於一細胞中自動複製，其中該載體及所貼附 15 之片段也會複製。一較佳類型之載體係一游離基因體 (episome)，即：可染色體外複製的一核酸分子。較佳的載體為可自動複製及表現的核酸。能引導可編碼一或多個多肽及/或非編碼（n〇n-coding) RNA之基因之表現的載體在此稱為「表現載體(expression vector)」。特別重要之載體 20 能夠使用反轉錄酶(reverse transcriptase)來由mRNAs選殖 cDNA。一載體之成份可包含一病毒的啟動子、或第二型 54 201106977 (Type-II) RNA聚合酶(Pol-ΙΙ)啟動子或兩者、Kozak —致性轉譯起始位(Kozak consensus translation initiation site)、聚腺苷酸化訊息(polyadenylation signals)、複數個限制/選殖位 (restriction/doning site)、一 pUC 複製起始點(pUC origin of replication)、提供來於複製勝任原核細胞中表現至少一個抗生素抗藥性基因的一 SV40早期啟動子（SV40 early promoter)、一選擇性的SV40複製起始點（SV40 origin)以供於哺乳動物細胞中複製、及/或一四環黴素反應元件。 ϋ且子(Cistron):在一 DNA分子中之一核苷酸序列，其編碼一胺基酸殘基序列並包含上游及下游的DNA表現控制元件。. ^^j£,(Promoter),：一核酸，其被一聚合酶分子所辨識（或與其結合)並引發合成。針對本發明之目的，一啟動子可以是一已知的聚合酶結合位置、一增強子及類似者，以及任何可使用一所需聚合酶來引發合成的序列。故置(Antibody)：一肽類或蛋白質分子，其具有一預選之一致範圍結構，該結構編碼一可結合一預選配位子 Gigand)的受體。巡叛核糖核酸轉錄分子(Primary RNA JYanseripp :一核糖核苷酸序列，其係選自傳訊核糖核酸(mRNA)、核内 55 20 201106977 異質核糖核酸(hnRNA)、核糖體核糖核酸(rRNA)、轉運核糖核酸(tRNA)、核仁小核糖核酸(snoRNA)、核内小核糖核酸(snRNA)、前驅微型核糖核酸(pre-microRNA)、病毒核糖核酸(viral RNA)及其前驅物和衍生物。 5 内含子切除(Intron Excision): 一負責RNA處理、成熟、及降解之細胞機制，包含RNA剪接(RNA splicing)、外體消化（exosome difestion)、無意義調節之衰敗過程 (nonsense-mediated decay，NMD)，及其組合。剪接授位（Donor Splice Site):一核酸序列其包含 1〇 SEQ.ID.N0.4 序列、SEQ.ID.N0.4 同源序列，或序列 5，-GTAAG-3’。前接受位(Acceptor Sulice Site):一核酸序列其包含 SEQ.ID.N0.5序列、SEQ.ID.N0.5同源序列，或序列5，-CrGCAGi。 15 分支點基序(Branch Point): —仂於一梓醯序列中气膝嘌呤核苷酸，其中該核酸序列包含SEQ.ID.N0.6序列、 SEQ.ID.NO.6 同源序列，或序列 5，_TACTAAC-3,。多嘧啶段(Poly-Pvrimidine : 一含高比例胸腺嘧啶核苷酸及胞嘧啶核苷酸之核酸序列，該核酸序列包含 20 SEQ.ID.NO.7或SEQ.ID.N0.8序列或其同源序列。 56 201106977 盤的細胞(Targeted Cell):單一或複數個人類細胞，其係選自一體細胞、一組織、一幹細胞、一生殖細胞、一畸胎瘤細胞、一腫瘤細胞、一癌細胞，及其組合。癌組織（Cancerous Tissue):一腫瘤組織，其係來自皮 5 膚癌、攝5蔓腺癌、乳癌、肝癌、肺癌、腦瘤/癌、淋巴痒、血癌，及其組合。表現勝任載體(Expression-Competent Vector): 一線型或環型之單股或雙股DNA，其係選自質體、病毒載體、轉位子、反轉位子、DNA轉基因、跳躍基因，及其組 10 合。抗生素抗藥性某因(Antibiotic Resistance Gene) ••一基因，該基因之表現具有使抗生素降解的能力，該抗生素係選自盤尼西林G、安比西林、新黴素、G418、巴龍黴素 (paromycin)、卡那黴素、鏈黴章、紅黴素、斯派克黴素、霍 15 火黴素、四環黴素、利服平、兩性黴素B、健他黴素、氣黴素、頭孢黴素、泰黴素及其組合。 J-^A_RKA 聚合醢相算物(Tvpe-II RNA_P〇lyme_mgg

Equivalent):一轉錄機構，其係選自第二型(Pol-II)、第三型 (Pol-III)、第一型(Po1_q及病毒RNA聚合酶。 57 201106977 限希/ 選殖位（Restriction/Cloning Site) :一 DNA 基序 (DNA motif)，其係限制酶切割之位置；該等限制/選殖位包含但不於 Aatll，AccI，AflII/III，Agel，Apal/LI，Asel, Asp718I, BamHI, Bbel, BclI/II, Bglll, Bsml, Bspl20I, BspHI/LUl 11/1201, 5 BsrI/BI/GI, BssHII/Sl BstBI/Ul/XI, Clal, Csp6I, Dpnl, Dral/II, EagI, EcU36Il EcoRI/RlI/47111/RV, Ehel, FspI, Haelll, Hhal, HinPl Hindlll, Hinfl, Hpal/II, KasI, Kpnl, Maell/III, Mfel, Mlul, MscI, Msel, Nael, Narl, Ncol, Ndel, NgoM, Notl, Nrul, Nsil, Pmll, PpulOI, PstI, PvuI/II, Rsal, SacI/II, Sail, Sau3AI, Smal, SnaBI, 0 Sphl, SspI, StuI，Tail, Taql, Xbal, XhoI,XmaI 之M熱也l。基固傳送(Gene DeHygry) ••基因工程方法，其係選自多聚體(polysomal)轉染、微脂體(liposomal)轉染、化學轉染、電穿孔法、病毒感染、DNA重組、轉位子插入、跳躍基因插入、顯微注射、基因槍穿透，及其組合。 5 基因工程(Genetic Engineering) : DNA重組方法，其係選自DNA限制酶反應及接合反應、同源重組、轉殖基因併入、轉位子插入、跳躍基因插入、反轉錄病毒感染，及其組合。 I?胞過勘_5周卽者(Cell Cycle Regulator):細胞基因，其參與控制細胞分裂及細胞增生的速率，該等基因包含但不限於 0 週期素依賴性激酶2 (CDK2)、週期素依賴性激酶4 (CDK4)、週期素依賴性激酶6 (CDK6)、週期素(cydins)、BMI4、 58 201106977 pl4/pl9Arf、P151nk4b、pl6Ink4a、pl8Ink4c、p21Cipl/Wafl 和p27Kipl，及其組合。廬瘤_抑制(Tumor如ppression):細胞抗腫瘤及抗癌症的機制’其包含但不限於細胞週期減弱、G0/G1檢控點停滯、腫瘤抑制'抗腫瘤生成、癌細胞凋亡，及其組合。基里靜默效應(Gene Silencing Effect、: 一基因功能被抑制後的一細胞反應，其包含但不限於細胞週期減弱、檢控點停滯、腫瘤抑制、抗腫瘤生成、癌細胞凋亡，及其組合0 10 组成物關於使用一重組核酸組成物之設計及方法，該重組核酸組成物能被傳送至標的人類細胞，並且被轉錄及處理成為類贿·302基因靜默效應子’其引起細胞中‘搬標的的細胞 15補調節者及致癌基因之特定基因的靜默效應；包含以下步驟：提供-重域酸域物，其能被傳送，並且被轉錄及處 ^為至少—基因靜默效應子，該基因靜默效應子干擾複數個mir-302標的之細胞基因，·及以該重組核酸組成物處理—細胞受質。 a) 20 b) 59 201106977 上述之重組核酸組成物進一步包含： a) 複數個外顯子，其中該等外顯子可被連結而形成一具有所需功能之一基因轉錄分子；及 b) 至少一個内含子，其中該内含子包含一重組mir-302同源物，並可經由細胞内RNA剪接及處理機制切割後而與該等外顯子分開。上述重組基因組成物的内含子進一步包含： 10 a) 用於剪接體結合之一五端剪接授位； b)與該mir-302家族成員同源的一基因靜默效應子插入子； c) 用於剪接體辨識之一分支點基序； d) 用於剪接體交互作用之一多嘧啶段； 15 e) 用於剪接體結合之一三端剪接受位；及 ί)複數個連接子，其用來以-五端至三端方向連接上述每一成分。較佳地’本剌_-漏設計與料來軸泰3〇2基因靜默效應子在被轉染的細胞中可誘導地或持續地表現類 201106977 mir-302 基因靜默效應子包含 mir-302a、mir-302b、mir-302c、 mir-3 02d，以及他們的似髮夾型(hairpin-like)微型核糖核酸前驅物(pre-miRNAs)和人造重設小髮夾型(shRNA)同源物/衍生物，及其組合。Mir-302基因靜默效應子的轉錄由一持續表現 5 的（即CMF)或以藥物誘導的（即77^：-CMF)啟動子所驅動。該藥物誘導式的重組核酸組成物較佳為一載體，其包含一被插入有一重組mir-302家族群集（mir-302s ; SEQ.ID.NOs.9- I6的雜合物)或一人造重設mi_3〇2 shRNA同源物(即SEQ.ID.NOs.17與18的雜合物)的重組轉殖基因。該 10 細胞受質在體外㈨竹>〇)、離體(ex Ww)或體内⑼Wvo)表現 mir-302的標的基因。藉著靜默該mir-302標的的細胞週期調節者與致癌基因’本發明能抑制細胞的腫瘤生成能力，以及將被處理的細胞重新編程為非腫瘤/癌細胞。 15 實施例以下實施例係作為舉例說明本發明之某些較佳具體實把例及態樣，其不應視為限制本發明之範轉。在以下揭不之實驗文件中，所用的簡稱如下：Μ(莫耳，molar) ·，mM(毫莫耳，mimm〇lar);哗(微莫耳， 20 micr〇m〇lar) ; mol(摩耳，咖丨⑼；pm〇1(微微摩耳， picomole) ’ gm( a 克，grains) ; (毫克 ’ milligrams); 61 201106977 pg(微克 ’ micrograms) ; ng(毫微克，nanograms) ; L(公升，liters) ; ml(毫升，milliliters) ; μ1(微升，microliters); 0C(攝氏度，degrees Centigrade) ; cDNA(DNA 之拷貝或互補；copy or complementary DNA) ; DNA(去氧核糖核酸， 5 deoxyribonucleic acid) ; ssDNA(單股 DNA，single stranded DNA) ; dsDNA(雙股 DNA，double-stranded DNA); dNTP(去氧核糖核苷三填酸，deoxyribonucleotide triphosphate) ; RNA(核糖核酸，ribonucleic acid) ; PBS(磷: 酸鹽緩衝液，phosphate buffered saline) ; NaCl(氯化鈉， i〇 sodium chloride) ; HEPES(N-2-經乙基痕〇秦-N-2-乙燒確酸， N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid) ； HBS(HEPES 緩衝液，HEPES buffered saline) ; SDS(十二烷基硫酸納，sodium dodecyl sulfate) ; Tris-HCl(三經曱基胺基曱烧-氯化氫，tris-hydroxymethylaminomethane-15 hydrochloride) ; ATCC(美國菌種保存中心，American Type Culture Collection，Rockville，MD) ; hES(人類胚胎幹細胞，human embryonic stem cells) ; iPS(誘發型多能性幹細胞，induced pluripotent stem cells);以及 SCR(體細胞重新編程，somatic cell reprogramming) 〇 62 20 201106977 實施例1 細胞培卷輿轉染人類癌症細胞株NTera-2、HepG2、MCF7、PC3與 Colo829係取得自美國菌種培養中心(ATCC，Rockville， 5 MD);而人類毛囊細胞(hHFCs)則以4 mg/ml膠原蛋白酶分解自最少兩個毛真皮乳頭(hair dermal papillae)，其中膠原蛋白酶之消化環境為在補充有20%胎牛血清(FBS)的新鮮RPMI 1640培養液中作用45分鐘。黑色素細胞 (melanocytes)則於37°C及5% C02下，培養於添加有人類 10 黑色素細胞生長補充劑-2 (HMGS-2，Invitrogen， Carlsbad，CA)，並且不含有抗生素的254培養液(Medium 254)中。當細胞生長達70%-80%滿盤(confluency)時，則將細胞暴露在trypsin-EDTA溶液1分鐘以分離細胞，並以無紛紅之 DMEM 培養液(phenol red-free DMEM medium， 15 Invitro§en)淋洗一次，再將該等分離之細胞以1:10稀釋後於新鮮含HMGS-2補充劑之254培養液中繼代培養《關於以電穿孔法進行基因轉殖之步驟，係將 m/及302s 載體（10 pg)與户㈠載體（50 pg) 之混合加入到一低滲性緩衝溶液（200 μι ; EPpendorf， 20 Westbury，NY)中之分離細胞（2〇,〇〇〇—5〇,〇〇〇顆）當中，且電穿孔係以電穿孔儀在300〜400伏特下實行15〇微秒 63 201106977 以將該等載體傳送進該等細胞内。經電穿孔後之細胞係先於無紛紅、含20%血清替代品(Knockout serum)、1% MEM 非必需氨基酸、l〇ng/ml鹼性成纖維細胞生長因子 (bFGF)、lmM GlutaMax、及 ImM 丙酮酸納之 DMEM 培 5 養液(hvitrogen)中，於37。(：及5% C02的條件下培養24 小時。接著加入850 pg/ml G418及大於3.75 pg/ml濃度之四環黴素（Dox)，每天更新’持續3至5天，直到細胞表現強烈的紅色螢光（RGFP)。接下來，以TE200倒立顯微鏡系統（Nikon’Melville，NY)監看單獨的紅色螢光細胞 10 (mirPS)，並以MO-188NE 3D顯微操作系統（Nikon)將其個別收集至一 96孔盤當中。在缺少去氧羥四環素的條件下 (Dox) ’將mirps細胞培養於一含20%血清替代品 (Knockout serum)、1% MEM 非必需氨基酸 ' 100 μΜ β—硫基乙醇、ImM GlutaMax、ImM丙酮酸鈉、i〇ng/ml鹼性成 15 纖維細胞生長因子（bFGF)、100 IU/ml盤尼西林/ 1〇〇 pg/ml 鏈黴素/250 pg/ml G418、0.1 μΜ A83-01、以及 0.1 μΜ 丙戊酸（Stemgent，San Diego，CA)之 DMEM/F-12 培養基’以37°C及5% C〇2的條件培養。另一方面，在去氧羥四環素（Dox ’ 3.75-5 pg/ml ; Sigma-Aldrich，St- 20 Louis，MO)存在之下，將mirPS細胞培養於同樣的無飼

養層（feeder-free)培養條件’並且再另外添加〇 GSK 64 201106977 抑制劑SB216763 (Stemgent^GSK抑制劑的添加將促進 mirPS的增殖但輕微的神經分化傾向。在神經細胞誘導方面’則將mirPS細胞培養於含有〇.〇5 μΜ SB216763、並且不包含去氧羥四環素（Dox)之上述無飼養層培養條件。實施例2 表現之重组載想之缉竿

Mir-3 02家族群集(wz>-3必)之產生如先前的報導中所描述(Lin等人’ 2008)。MfrdOZs群集含有四個部分，包括mir_ 10 302a、mir-302b、mir-302c、與 mir-302d 的前驅微型核糖核酸 (pre-miRNAs)。構築群集所用之合成寡核苷酸 (Sigma-Genosys，St. Louis , MO)如下方所列。在表現載體的構桌上，吾人混合相等量（1 : 1)之wzV-30251及一先作好的分重組基因(Lin等人，2006與2008)，接著以 15 Mw///W限制酶在37°C消化此混合物4小時。接下來以一膠體萃取工具（Qiagen，CA)將該消化後的混合物純化並收集於 30 μΐ二次水中(ddH20)，並且使用T4 DNA接合酶(T4 ligase) 在8°C作用16小時以接合該混合物。該步驟形成一重組的表現mir-302之*基因，其能進一步經恐〇//所w//// 20 限制酶切割後，插入到一可以去氧經四環素誘導之 65 201106977 d 載體（Clontech ’ Palo Alto，CA)中，而形成一可誘導式的〆必表現載體。接著，吾人進一步修改該尸如-⑶-仍-所/幻必載體，即，用一分離自p舰挪質體(Clontech)的服-CMK啟動子取代肥必 5 載體原先的U6啟動子。為了產生一非誘導式的户cw_ 連續表現載體，吾人以五〇5似限制酶切割該修改後之 /?7^-6^-仍-/«阳必載體，再透過膠體電泳移除仍*_應上游序列(1.5 kb) ’並且自該膠體重新獲得該被切割之載體以進行DNA接合(ligation)步驟，完成一非誘導式pcW-w7«似 10 載體之構築。用於mir-302家族前驅核糖核酸(pre-miRNA)群集之DNA 重組的合成寡核苷酸列於下方：mir-302a-正義，5’- 15 CCCACCACTT AAACGTGGAT TGAAACTAAA GAAGTAAGTG TTGGTGATGG ATAGATCTCT C-3, GAACGCGTGA C-3’（SEQ.ID.N0.10) ;mir-

GTCACGCGTT GTACTTGCTT CTTCCATGTT (SEQ.ID.N0.9)； TCCATCACCA CTTTAGTTTC TAAGTGGTGG

mir-302a-反義， AAACATGGAA AAAGCAAGTA

5，_GAGAGATCTA GCACTTACTT CATCCACGTT

302b-正義，5’-ATAGATCTCTCGCTCCCTTCAACTTTAACA

TGGAAGTGCT TTCTGTGACT TTGAAAGTAA 66 20 201106977 GTGCTTCCAT GTTTTAGTAG GAGTCGCTCA TATGA-3’ 10 15 GTCTAGACAT-3’ (SEQ.ID.NO. 13) ； mir- (SEQ.ID.NO.14) ; mir-302d-正義，5’-

(SEQ.ID.NO.il)； GACTCCTACT TTCAAAGTCA AAGTTGAAGG (SEQ.ID.NO. 12)； ACCTTTGCTT TGTGAAACAG CAGTGGAGGC 302c- 反義， AAACATGGAA CAGCAGGTAC AGCCATATGG-3, CGTCTAGACA ACTTAGCTAA

mir-302b-反義， AAAACATGGA CAGAAAGCAC GAGCGAGAGA mir-302c-正義， TAACATGGAG AAGTAAGTGC

5，-ATGTCTAGAC

GCACTTACTT

CTCCATGTTA

TAACACTCAA

GCCAGGCTAA

5’-TCATATGAGC

AGCACTTACT

TTCCATGTTA TCTAT-3’

5’-CCATATGGCT

GTACCTGCTG

TTCCATGTTT

GCCTCCACTG

CTGTTTCACA

AAGCAAAGGT

ACATGGAAGC

GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TCGCGATCGC AT-3, (SEQ.ID.NO.15);以及 mir-302d-反義，5，-ATGCGATCGC GAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCCTG GCTTAGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TATGTCTAGA CG-3’ (SEQ.ID.NO.16)。另外，吾人使用由合成之miR-302s-正義，

5，-GCAGATCTCG AGGTACCGAC GCGTCCTCTT 67 20 201106977

TACTTTAACA TGGAAATTAA GTGCTTCCAT

GTTTGAGTGG TGTGGCGCGA TCGATATCTC

TAGAGGATCC ACATC-3’（SEQ.ID.NO.17)及 mir-302s-反義 ’ 5’-GATGTGGATC CTCTAGAGAT ATCGATCGCG 5 CCACACCACT CAAACATGGA AGCACTTAAT TTCCATGTTA AAGTAAAGAG GACGCGTCGG TACCTCGAGA TCTGC-3,（SEQ.ID.NO. 18)雜合而成的一人工重設之shRNA ’來取代mir_3〇2前驅微型核糖核酸(pre-miRNA)群集以進行簡易内含子插入。在設計mir-302同源物 1〇時，可用胸線嘧啶(T)取代尿嘧啶(U)，反之亦然。所有該等合成序列在進行接合反應(ligation)之前’皆經過聚丙烯醯胺膠體電泳(PAGE)萃取純化。重組的mir-302家族之前驅微型核糖核酸群集(wz>_%2s) 是連接四個mir-302a—d雜合物而形成的，包括mir-302a-正義 15 與 mir-3〇2a-反義，mir-302b-正義與 mir-302b-反義，mir-302c-正義與mir-302c-反義，以及mir-302d-正義與mir-302d-反義。該等雜合物 mir-302a、mir-302b、mir-302c、以及 mir-302d 皆分％\痤由 Pvul丨Xhol、Xhol/Nhel、Nhel/Xbal 认反 Xbal/Mlul fk 制酶消化’再經膠體萃取，然後以過濾管柱(Qiagen，CA)共 20 同收集於35 μΐ的滅菌二次水中。接著以T4 DNA接合酶 (ligase) (Roche，20U)接合該雜合物之混合，使其形成一群 68 201106977 集。最後將該mir-302家族之前驅微型核糖核酸群集插入到經由尸vW//MW/限制酶線性化之办細重組基因中。另外，可以#合 SEQ.ID.NO.17 及 SEQ.ID.NO.18，再使用

Pvw//Mw/限制酶切割該雜合物並將切割後之雜合物插入到以 5 線性化之办麵/-ππρ中，形成mir_3〇2 shRNA。將DH5a大腸；f干滅_株培養於含有ggymi濃度之安比西林(Sigma Chemica卜St. Louis ’ MO)的LB培養基中以增殖及載體。再使用一無内毒素大里質體羊取工具(Endo-Free Maxi-Prep Plasmid Extraction ίο Kit ’ Qiagen ’ CA)分離及純化增殖後的及CA/F-w/兄?似?載體。實施例3 微型核糖核酸(miRNA)微陳列分折 15 在70%細胞滿盤下，使用w/rVanaTM微型核糖核酸分離工具〇m>Vana™ miRNA isolation kit，Ambion)自每一細胞培養物中分離小RNAs。使用1%曱醛-瓊脂凝膠電泳及光譜儀量測(Bio-Rad)來評估該等分離之小RNAs的純度及含量，然後立刻以乾冰冷涑並送往LC Sciences(San 20 Diego，CA)進行微型核糖核酸微陣列分析。每一微陣列晶 69 201106977 片分別與標示以Cy3或Cy5之一單一樣本雜合，或是與標示以Cy3與Cy5之一對樣本雜合。接著進行背景相減 (background subtraction)與正規化(normalization)。在一雙重樣本測驗方面，執行；？值計算，超過3倍之差異表現的 5 轉錄分子顯示於一列表。結果如圖1C所示。實施例4 北方墨點分折法以mz>VanaTM微型核糖核酸分離工具（Ambion， ίο Austin，TX)分離出總體 RNAs (10 pg)後，再以 15% TBE-尿素聚丙烯醯胺凝膠或3.5%低熔點瓊脂凝膠電泳分餾該總體RNAs，並將該分餾後之總體RNAs電轉潰至尼龍膜 (nylon membrane)上。接著以[LNA]-DNA 探針（5’-[TCACTGAAAC] ATGGAAGCAC TTA-3，）（SEQ.ID.NO. 19) 15 偵測所/>-3犯；偵測其他基因的探針則進一步合成，其序列如表1所列。所有的探針係經過高效液相層析法(HPLC) 純化並且在[32P]_dATP (> 3000 Ci/mM，Amersham International，Arlington Heights，IL)存在下以末端轉移酶 (terminal transferase，20 units)進行尾端標示。雜合反應於 2〇 50% 的新鮮去離子曱酿胺(freshly deionized formamide， 201106977 pH 7.0)、5 倍 Denhardt’s 溶液、0.5% SDS、4 倍 SSPE 及 250 mg/mL的變性鮭魚精子DNA片段的混合物中進行(18 小時’ 42°C)。接著將膜在2倍SSC、0.1%的SDS中連續清洗兩次（15分鐘’ 25°C)，並在〇.2倍SSC、0.1%的SDS 中清洗一次(45分鐘，37。〇，然後進行自動放射顯影。結果示於圖1D、圖4A及8B。實施例5 香方墨點分耕法 10 以補充有蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)、亮抑酶肽 (Leupeptin)、TLCK、TAME 及 PMSF 的 CelLytic-M 裂解/ 萃取試劑（CelLytic-M lysis/extraction reagent，Sigma)溶解細胞(1，000,000顆），如製造商建議。接著以12,〇〇〇 rpm於 4°C離心該裂解液20分鐘然後再取得離心後的上清液。然 15 後以改良過之SOFTmax蛋白質測定套裝軟體在一 E-max 微罝盤測讀儀(microplate reader，Molecular Devices，CA) 上測量蛋白質濃度。在還原(reducing，+50 mM DTT)及非還原(non-reducing ’無DTT)的條件下，各將每30 之細胞裂解後產物加入SDS-PAGE樣本緩衝液中，並在裝載到 6%〜8%聚丙烯醯胺凝膠上之前沸騰3分鐘。接著以SDS- 71 20 201106977 聚丙烯醯胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)解析蛋白質，而後將蛋白質電轉潰至一硝酸纖維膜上（nitrocellulose membrane)，並將膜於奥德塞阻斷試劑（Odyssey blocking reagent ; Li-Cor Biosciences，Lincoln，NB)中在室溫下培 5 育2小時。然後，在該試劑中加入一初級抗體並在4°c下培育該混合物。使用的初級抗體包括：〇ct3/4 (Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、Sox2 (Santa Cruz)、 Nanog (Santa Cruz)、Lin28 (Abeam Inc.，Cambridge， MA)、UTF1 (Abeam)、Klf4 (Santa Cruz)、TRP1 (Santa io Cruz)、keratin 16 (Abeam)、CDK2 (Santa Cruz)、cyclin D1 (Santa Cruz)、cyclin D2 (Abeam)、BMI-1 (Santa Cruz)、 AOF2 (Sigma) ' HDAC2 (Abeam) ' hTERT (Santa Cruz) ' B-actin (Chemicon，Temecula，C A)，以及 RGFP (Clontech)。經過一夜後，以TBS-T漂洗該膜三次，然後在室溫下將其暴露在羊抗小鼠IgG (goat anti-mouse IgG)中 1小時。該羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 680反應性染料 (1:2,000 ; Invitrogen-Molecular Probes)結合形成二級抗體。再經三次TBS-T漂洗後，使用Li-Cor奥德塞紅外線影像儀(Li-Cor Odyssey Infrared Imager)及奥德塞軟體第 10 20 版(Li-Cor)來處理免疫轉潰之螢光掃描及影像分析。結果如圖1D、圖4B、圖7C — 7D、圖8B及9B所示。 72 201106977 實施例6 'Μ^Μ&ΆΜα^μ 依照製造商之建議，使用一凋亡細胞斷裂DNA分離工具 (Apoptotic DNA Ladder Kit ，Roche Biochemicals ， Indianapolis，IA)從約2,000,000顆細胞中分離出基因體 DNA，然後取2 pg的分離DNA ’並以2%之瓊脂凝膠電泳法進行評估。結果顯示於圖1F。 10 實施例7 PNA含量之流式細胞儀分妍在完成所需之實驗後，將細胞以胰蛋白酶水解、離心成粒狀，並將其再懸浮於1 ml預冷的含70%曱醇之PBS 中，以在-20。(：下固定該等細胞1小時。將該等細胞離心 15 成粒狀並以1 ml之PBS清洗一次。將該等細胞再次離心成粒狀並於37°C下再懸浮於1 ml含1 mg/ml峨化丙咬 (propidium iodide，PI)、0.5 pg/ml 核糖核酸酶(RNase)之 PBS溶液中30分鐘。然後，在BD FACSCalibur流式細胞儀(San Jose，CA)上分析約15,〇〇〇個細胞。藉由繪製脈衝 20 寬度對脈衝面積的圖並圈選該等單一細胞來排除細胞雙連 73 201106977 體。使用套裝軟體Flowjo以「Watson Pragmatic」演算法來分析所收集之資料。結果如圖3A —B、圖6A —B及6C 所示。實施例8 金基里體微陣·列分析使用人類基因體GeneChip U133 plus 2.0陣列 (Affymetrix，Santa Clara ’ CA)偵測受試細胞中超過 47,〇〇〇個人類基因表現型式之變化。依據製造商之建議，使用 10 而>VanaTM微型核糖核酸分離工具(w>VanaTM miRNA Is〇lati〇n

Kit ’ Ambion)分離每一受試樣本中的總體jysfA。分離之RNA 的純度及含量則由1 %曱醛·瓊脂凝膠電泳及光譜儀量測(Bio_ Rad)來評估。使用完全相配探針與失配探針之間總平均的差來將該專樣本訊號正規化。之後’使用Affymetrix Microarray 15 Suite 5 ·〇版、Expression Console™ 1.1.1 版（Affymetrix)及 Genesprings (Silicon Genetics)軟體來分析全基因體基因表現型式的變化。基因表現變化超過一倍被視為陽性分化基因。在基因叢集試驗(gene clustering)中’搭配使用外掛程式Genetrix (Epicenter Software)與Affymetrix軟體。以每一微陣列中的控 201106977 制組管家基因之平均正規化該樣本的訊號。結果表示於圖 5A。實施例9 5 DNA去甲篡化毯致約2,000,000顆細胞中之基因體DNA係以一 DNA分離工具(DNA isolation kit，Roche)來分離。取1 pg分離的 DNA ’並根據製造商建議之方式處以二亞硫酸鹽(CpGen〇me DNA modification kit ’ Chemicon，Temecula，CA)。另一方 i〇面’取2 pg分離之DNAs，並以CCGG切割限制酶你來解消，然後再經由1%瓊脂凝膠電泳法判別全基因體的去曱基化(圖5Β)。以二亞硫酸鹽處理DNA ’會將所有未甲基化之胞喊咬轉變成尿鳴咬，而已甲基化之胞嘴。定則仍維持為胞嘧啶。在二亞硫酸鹽DNA定序分析方面，吾人使 15 用聚合酶連鎖反應(PCR)擴增及A^zog的啟動子區域。擴增啟動子區域所使用的引子包含5’_ GAGGCTGGAGCAGAAGGATTGCTTTGG-3’（SEQ.ID.NO.20) 及 5’-CCCTCCTGAC CCATCACCTC CACCACC-3, (SEQ.ID.NO.21);擴增啟動子區域所使用的引子包含 2〇 5’-TGGTTAGGTT GGTTTTAAAT TTTTG-3’（SEQ.ID.NO.22) 75 201106977 及 5，_AACCCACCCT TATAAATTCT CAATTA-3, (SEQ.ID_NO.23)。首先，將二亞硫酸鹽修飾後的DNAs (50 ng) 與該等引子(總共100 pmole)混合在1倍PCR緩衝液中，加熱至94°C後持續2分鐘，然後立即於冰上冷卻。其 5 後，進行25個如下之PCR循環：在94°C下進行1分鐘，在70°C下進行3分鐘。其係使用一高準確度PCR工具(Expand High Fidelity PCR kit，Roche)。擴增反應結束後，進一步地以3%瓊脂凝膠電泳法分餾出具有正確長度之 DNA產物’接著以膠體萃取工具(Qjagen)純化該DNA產 10 物，然後進行DNA定序。DNA曱基化位之詳細圖譜係藉由比較在已經過二亞硫酸鹽修飾之DNA序列中之未改變的胞嘧啶、與在未經過二亞硫酸鹽修飾之DNA序列中之未改變的胞嘧啶來產生。結果如圖5C所示。 15 實施例10 1¾與畸胎癍形成將大約5-10個衍生自mirps細胞的類胚胎體(4〜8細胞階段)懸浮於50 μΐ的聰舰培養液與基底膜基質之2 · 1混合液中’接著將該等衍生自瓜㈣細胞的類胚胎 20體移植到一六週大雌性假性懷孕免疫功能不足之SCID- 76 201106977 beige小鼠的子宮中。產生該假性懷孕小鼠的方法為：在腹膜内注射1 IU之人類停經後促性腺激素（human menopausal gonadotrophin，HMG)兩天，然後再注射人類絨毛膜性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)-~ 天。該細胞及該小鼠在移植前或移植後不處以去氧羥四環黴素(Dox)。在移植期間，使用2.5%的三溴乙醇(Avertin) 溶液’以每隻小鼠0.4 ml的劑量麻醉小鼠。在移植後或者當該移植細胞團發展至超過1〇〇 mm3大小時，監看該異種皮移植團(Xenografted masses) 3至4週。將該囊腫/畸胎瘤切下之後，使用公式：（長X寬2)/2計算其體積，並且對其再進行計數、秤重及進一步的組織學分析。似畸胎瘤組織囊腫的形成（teratoma-like tissue cysts)通常在移植後大約2.5週可觀察到。結果如圖5D所示。實施例11 細胞侵犯試驗首先’單獨使用200 yg/ml Matrigel或使用補充有含 20% FBS及1%左旋麵醮胺酸（L-Glutamine)之無齡紅 DMEM培養液之Matrigel來塗覆插入腔(chamber inserts，孔徑12Mm，Chemicon)，並且將其置於無菌環境下變乾， 77 20 201106977 直到隔天。使用無酚紅DMEM培養液收集、淋洗、並再懸浮細胞，以達最終之100,000顆細胞/ml的細胞密度。取 500 μΐ該細胞懸浮液分配到上層腔(top chamber)内，而將 1.5ml DMEM條件培養液加入到下層腔當中以製造一趨化 5 梯度(chemotactic gradient)。經過37°C隔夜培養16小時後’接著對侵犯情況進行測量。首先以脫脂棉將上層腔擦乾，然後使用100%曱醇固定位在膜下側的侵犯細胞丨〇分鐘、風乾，以曱酚紫(cresyl violet)染色20分鐘，再和緩地以水清洗。待其變乾之後，使用含1 : 1 100%乙醇及0.2 10 Μ檸檬酸鈉(NaCitrate)的洗液洗提膜上的甲酚紫染色20分鐘，並以 Precision 微量盤測讀儀（Precision Microplate Reader ’ Molecular Dynamics)讀取波長 570 nm 的吸光值。表示細胞侵犯率之方式為以受測樣本的吸光值對比於不擦乾插入腔膜層（總細胞數)之後所得吸光值的百分比。結果 15 表示於圖6D。實施例12 細胞貼附試驗細胞貼附試驗之進行如先前報導所描述(Lin等人， 2〇 2007)。將人類骨髓内皮細胞(hBMECs)以100,000顆細胞/ml 78 201106977

的密度種於96孔盤中，並且在進行試驗之前以貼附培養液 (adhesion medium) [RPMI 1640/0.1% BSA/20 mM HEPES (pH7.4)]淋洗。使用胰蛋白酶(用於腫瘤/癌細胞)或膠原蛋白酶 (用於mirPS細胞)將受測細胞分離下來，以無菌生理食鹽水淋 5 洗細胞’然後讓細胞以1，000,000顆細胞/ml的密度再懸浮於含有10 μΜ fura-4乙醯氧甲基酯之螢光探針(acetoxymethyl ester ’ fluorescent probe，Sigma)的 PBS 中，在 370C 的黑暗環境下經過1小時。接著將該細胞離心並以含有1% (v/v)丙續舒(probenecid ’ 1〇〇 mM)的無血清之培養液淋洗細胞，然後 1〇將該細胞培養於貼附培養液及37。(：的黑暗環境20分鐘，以活化細胞内的螢光探針。之後，將該1〇〇,〇〇〇顆細胞(在3〇〇 μΐ的細胞懸浮液/well)加入至滿盤的(conf|uent) 内皮細胞單層上，並在37°C培養50分鐘。使用250 μΐ的貼附培養基淋洗兩次將未貼附的細胞移走。使用一螢光盤測讀儀 15 (fluorescent Plate reader，Molecular Dynamics)在 370C 以激發波長485 nm及發射波長53〇來讀取螢光。結果表示於圖 6E。實施例13 适董内腫痼生县钛路吾人將NTera_2細胞(在總體積為100 μΐ之Matrigel-PBS 中的2，_，_顆細胞)異種移植到八週大雄性小鼠(BA·· 79 201106977 nu/nu品系）的脅腹中(即，右後肢）。對該腫瘤進行每週監測，並且在異種移植NTera-2後一週，以原位注射將户d /mT«似s載體或〆:載體導入其中。以2吨（每克小鼠重)經由聚乙烯亞胺(PEI)製備的pCMF-/T?/i?3i?2s·或户 5 載體(總重10 μ§)，進行五次處理(兩次處理之間間隔二天）。依照製造商之使用建議，使用體内_jetPEI傳送試劑 (Polyplus-transfection Inc.，New York，NY)。在注射完三週後或當未經載體處理的腫瘤生長至大約1〇〇_3的平均大小後始收集樣本。主要器官像是血液、腦、心、肺、肝、腎和 1〇脾’以及異種移植瘤皆被取出以進行腫瘤之組織學評估及免 ^反應細胞毒性測試。其中，以觸診監測腫瘤的形成，並以 A式.（長X寬）/2計异腫瘤體積。此外，亦對腫瘤進行計數、解剖、與秤重’並以蘇木紫-伊紅染色(H&E)及免疫染色試驗 [5 進行、”且織予檢驗。組織學撿驗未顯示在腦、心、肺、肝、腎矛脾中有偵測得到的組織病變。結果顯示於圖8A。實施例14 染色試驗〜將組織樣本以4%多聚曱醛(paraformaldehyde)在4°C 固疋整仪。在將該等樣本包埋人减中前，先將該等樣 201106977 本相繼地以1倍PBS、曱醇、異丙醇及四氫萘 (tetrahydronaphthalene)清洗。接著將包埋後之樣本以切片機(microtome)依照7〜10 μπι之厚度切割並固定在乾淨、以TESPA塗佈之玻片上。然後，以二曱苯(xylene)去除該 5 等玻片之纖，並使用封片膠（mounting media ; Richard Allan Scientific，Kalamazoo，MI)固定於蓋玻片下；接著以蘇木精(hematoxylin)及曙紅(eosin) (H&E，Sigma)染色以進行形態觀察。免疫組織化學（IHC)染色工具係購自 Imgenex(San Diego ’ CA)。根據製造商的建議實行抗體稀 10 釋及免疫染色法之程序。所用之初級抗體包括：〇ct3/4 (Santa Cruz), Sox2 (Santa Cruz) > Nanog (Santa Cruz) > CDK2 (Santa Cruz)，cyclin D1 (Santa Cruz)，cyclin D2 (Abeam) ’ BMI-1 (Santa Cruz)，與 RGFP (Clontech)。二級抗體則採用生物素鍵結的羊抗兔(g〇at anti_rabbit)或生物素 15 鍵結的馬抗鼠（horse anti-mouse)抗體（Chemicon， Temecula ’ CA)。加入作為三級抗體的帶有鏈黴卵白素的辣根過氧化酶（Streptavidin-HRP)。將載玻片以PBT洗過二-人之後’接著以DAB受質（DAB substrate)谓測已結合的抗體。在具全場掃描之100倍顯微鏡下觀察到陽性結 20 果’並以—Metamorph影像處理程式(Nikon 80i顯微鏡定 201106977 量分析系統）在200倍之放大倍率下測量以作定量分析。結果如圖8C所示。實施例15 5 金光酵素三端非棘課區赧告基因試驗冷光酵素試驗係使用一修飾過的pMir-Report miRNA表現報告载體系統(pMir-Report miRNA Expression Reporter Vectof System，Ambion)來進行。Mir-302的標的位(正常與/或犬隻)被插入到而e及夺叹你報告載體的三 10 端非轉譯區(3’-UTR)的選殖位。以12個-CAGT-重複序列分隔開兩個合成的標的位。另一個CWro/載體則用來作為一無報導(no reporter)控制載體。在有或無去氧羥四環素(Dox)處理下，使用FuGene HD試劑(R0che)，依照製造商建議之方式，以200 ng的報告载體轉染5〇,〇〇〇個 15 mirpS細胞。在轉染後48小時收集細胞裂解液；冷光酵素的降解程度被正規化(normalize)並以相對冷光酵素活性(rdative lucifemse activity，RLA)來表示；其計算方式為將經過去氧經四環素處理(Dox-οη)的mirPS細胞的冷光酵素活性水平除以未經去氧羥四環素處理(Dox-off)的mirPS細胞的冷光酵素活性水 20 平。另外，表現mir-434的細胞則經由電穿孔法將户 82 201106977 仍導入hHFCs來產生以作為陰性控制組。結果表示於圖7B與圖10B ° 實施例16 5 端粒重複序列擴增訧路依照製造商提供之建議，使用一補充有蛋白酶抑制劑、亮抑酶肽(Leupeptin)、TLCK、TAME以及PMSF的細胞裂解/ 萃取試劑(CelLytic-M lysis/extraction reagent，Sigma)溶解約 1，000,000顆細胞。以12,000 rpm的轉速在4°c離心該裂解液 10 20分鐘，並收集離心後之裂解液(上清液）。接著以改良過的 SOFTmax蛋白質測定套裝軟體在一 E-max微量盤測讀儀 (microplate reader，Molecular Devices，CA)上測量蛋白質濃度。使用一標記有紅外螢光染劑（infrared Alexa Fluor 680 dye，TS Primer ; Sigma-Genosys)的寡核苦酸 5·-15 AATCCGTCGAGCAGAGTT-31 (SEQ.ID.NO.24)以及序列 5 -GTGTAACCCTAACCCTAACCC-31 (CX primer ; 30 jiM) (SEQ.ID.N0.25)來彳貞測聚合酶連鎖反應(PCR)產物。端粒酶抑制劑被直接加入主要混合液中。對於所有受試細胞株，每反應使用50 ng蛋白質可達最佳結果。在30°C下經過 20 30分鐘的培育之後’將樣本置於聚合酶連鎖反應器中加熱 83 201106977 至94°C持續2分鐘，然後進行35個如下之pcr循環. 在94°C進行變性反應(denaturation) 30秒、在57°C進行人成反應(synthesis) 30秒。最後再於57°C進行一單一合成後步驟30秒。接著以6%非變性聚丙烯醯胺凝膠 (Nondenaturing polyacrylamide gel)電泳法分餾 pcr 產物，並使用Li-Cor奥德塞紅外線影像儀（Li_c〇r 〇dyssey Infrared Imager)及奥德塞軟體第ι〇版(Li_c〇r)來進行影像偵測及分析。結果表示於圖9A。實施例17 統計分析在免疫染色、西方墨點以及北方墨點的分析上，任何大於75%的訊號強度變化即被視為一陽性結果，該等結果被分析後以平均值±標準差(mean ± SE)表示之。資料之統計分析係以單因子變異數分析(one-way ANOVA)來計算。當主要效應顯著時，使用杜納的事後比較(Dunne枕’s posihoc test)來別與控制組有顯著差異之群。在兩處理組之間進行配對比較時’使用雙尾司徒頓t檢驗(two-tailed student ί test)。對於包含超過兩處理組之實驗，則在ANOVA後進行一事後多變域測 201106977 驗(post-hoc multiple range test)。機率值p <0.05 被認為是具有統計上的意義。所有p值係由雙尾檢定來決定。表格一：實施例4之相關序列 -------- 探針序列 0ct3/4 - 5，-GCAGTGTGGG TTTCGGGCAC TGCAGGAACA AATTCTCCAG GTTGCCTCTC ACTCGGTTCT CGATACTGGT TCGCTTTCTC TTTCGGGCCT GCACGAGGGT TTCTGCTTTG-3’（SEQ_ID.NO.26) S〇x2 — —- 5，-TGCTGTAGGT GGGCGAGCCG TTCATGTAGG TCTGCGAGCT GGTCATGGAG TTGTACTGCA GGGCGCTCAC GTCGTAGCGG TGCATGGGCT GCATCTGCGC TGCGCCGTGC-3’（SEQ.ID_NO.27) Nanog ---- 5，-CGTGTGAGGC ATCTCAGCAG AAGACATTTG CAAGGATGGA TAGTTTTCTT CAGGCCCACA AATCACAGGC ATAGGTGAAG ATTCTTTACA GTCGGATGCT TCAAAGCAAG-3, (SEQ.ID.NO.28) Lin28 --—----- 5’-AGGTCCGGTG ACACGGATGG ATTCCAGACC CTTGGCTGAC TTCTTAAAGG TGAACTCCAC TGCCTCACCC TCCTTCAAGC TCCGGAACCC TTCCATGTGC AGCTTACTCT-3’（SEQ.ID.NO.29) UTF1 ----_ 5，-CTGCTGGGCC AGCGCGGCCG ACACGCGGCG GTAGGTGGGC AGGGCCTGGC GGCGGTCCAG GAGCAGCGCG CGCCACACGG CCGGTTGCAG CAGCGTCCCC AGCAGCAGCT-3’（SEQ.ID.NO.30) Klf4 ------ 5，-CTGCTCGACG GCGACGACGA AGAGGAGGCT GACGCTGACG AGGACACGGT GGCGGCCACT GACTCCGGAG GATGGGTCAG CGAATTGGAG AGAATAAAGT CCAGGTCCAG -3’（SEQ.ID.N0.31) FUT3 5’-GAGCCCTAGG GGATCCAGTG GCATCGTCTC GGGACACACG CAGGTAGGAG AAGAAACACA CAGCCACCAG CAGCTGAAAT AGCAGTGCGG CCAGACAGCG GCGCCATGGC-3,（SEQ.ID.NO.32) 紅色螢光蛋白 —----_ 5，-CGAAGGGGTT GCCGTCGCCC TCGCCCTCGC ACTTGAAGTA GTGGCCGTTC ACGGTGCCCT CCATGTACAT CTTGATGCGC ATACTCTCCT TCAGCAGGCC GCTCACCATA-3, (SEQ.ID.NO.33) |3~肌動蛋白 _ 5’-AATGTCACGC ACGATTTCCC GCTCGGCCGT GGTGGTGAAG CTGTAGCCGC GCTCGGTGAG GATCTTCATG AGGTAGTCAG TCAGGTCCCG GCCAGCCAGG TCCAGAGCGA-3, (SEQ.ID.NO.34) 85 201106977 【圖式簡單說明】明確&之，以下說明的圖示僅供舉例說明之用而非限制本發明：圖1A —F描述可誘導的mir_3〇2表現及其對正常人類毛囊 5 細胞（册1^)增生之效應。（A)可受去氧羥四環素(Dox)誘導之户财指-版滅3必載體之構造。⑻mir_3〇2家族(咖> 2他)之構造。（C)以1〇μΜ去氧羥四環素(D〇x)處理後(n = 3，p <〇〇1)經 6小時，誘導表現的mir_3〇2經微型核糖核酸微陣列分析的結果。（D)北方與西方墨點分析法分析mjr_3〇2對核心重新編程 1〇轉錄因子〇ct3/4 —Sox2—Nanong與黑色素細胞 §己基因之蛋白質產物、細胞角蛋白(Cyt〇keratin 16)之表現型式的劑量相關效應(η = 5<〇·〇ΐ)。（E)流式細胞儀分析結果之長條圖顯示mir-302對mirPS-hHFC細胞族群有絲分裂(Μ期) 與休眠(G0/G1期)改變之劑量相關效應。⑺以10μΜ去氧羥四 15 環素(Dox)處理後，各mirPS細胞株在mir-302誘導下發生的細胞凋亡DNA斷裂之DNA梯度(DNA laddering)特徵。圖2A —C描述mir-302s的生合成以及mirPS細胞的產生。 (A)内含子mir-302生合成的機制。Mir-302家族與一編碼紅色螢光蛋白的基因(/?GFP) —同被轉錄並進一步被剪接複合體 20 (spliceosomal components)及細胞質酵素：RNA 内切酶 (RNaselll) ’岱塞爾(Dicers)，剪切成個別的mir-302成員。其中 86 201106977 紅色螢光蛋白作為mir-302產量的指標。一倍的紅色螢光蛋白濃度相當於有四倍濃度的mir-302生產。（B)以微脂體/多聚體/ 電穿孔法轉染mir-302之步驟示意。誘導式的mir-302表現載體兄302s (圖 1A)在一低滲性 pH 缓衝液(200μ1 ; 5 Eppendorf)中以電穿孔法在150微秒的300〜400伏特之下被導入成熟(adult) hHFC細胞。在每一試驗中使用lOpg m奶必轉染200,000個源自兩個人類毛囊(真皮乳頭)之培養的 hHFC細胞。經去氧羥四環素(doxyxycline，Dox)誘導而表現後’ mir-302的生合成依照自然的内含子微型核糖核酸(intr〇nic ίο miRNA)途徑。圖3A-C描述經去氧羥四環素φ〇χ = 5或10pg)誘導後表現的mir-302對mirPS-hHFC細胞特性之改變。（A)在去氧羥四環素誘導細胞重新編程之前與之後，細胞形態及細胞週期速率之改變。每細胞週期階段與相對之DNA含量之流式細胞儀分 15 析結果以一圖表表示於細胞形態學上方(n = 3，p < 0.01)。表中第一(左)與第二(右）高峰分別表示停滯期(G〇/G丨)細胞與有絲分裂期（Μ)細胞和全部的受試細胞族群之比率。比例尺= 100μηι°(Β)單一 mirpS-hHFC細胞在限數稀釋後形成類胚胎體 (EB)之時間過程。細胞週期估計起先約為2〇〜24小時，但在 2〇 72小時之後逐漸加速。比例尺=1〇〇μιη。圖4Α — Β描述多能性標記表現之分析與活體内多能性分化 87 201106977 及同化。（A)人類胚胎幹細胞(hES)標記基因在mirps細胞中以高濃度mir-302誘導後之表現型式與在人類胚胎幹細胞”八01· Η1 (Η 1)及WA09-H9(H9)中之表現型式經北方墨點分析後之比較 (n = 5 ’ p <0.01)。以7.5μΜ去氧羥四環素(d〇x)處理後，mir_ 302在mirPS細胞中的濃度與其在HI及H9細胞内的濃度相較多了 30% (是未經處理的hHFC之>30倍)並且開始引發主要多能性標記Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28與未分化胚胎細胞轉錄因子1(UTF1)之共同表現。（B)將mirPS細胞植入免疫功能不足SCID-beige小鼠後經過一個星期，由mirPS細胞分化而來之組織同化為注射位置附近的周圍組織。白色箭頭指示注射方向。閏盤(intercalated disks)位置以黃色三角形標示。衍生自 mirPS-hHFC的組織囊腫不會在小鼠子宮及腹腔以外的器官/組織生長。吾人進一步在植入後一週解剖及檢查注射位置周圍之組織形成。在解剖前一天’小鼠經尾部靜脈注射方式被施以 iOgg去氧羥四環素。吾人觀察到呈RGFP陽性之mirPS細胞分化成為與注射位置周圍組織相同的細胞類型，包括在腹膜内注射後形成腸上皮組織、心臟注射後之心肌、以及在腰背(d〇rsal flank)注射後形成骨骼肌。此外’同化的mirPS細胞亦表現與周圍組織相同的組織特異性標記，例如腸上皮的MUC2、心肌的第一型肌鈣蛋白T (troponin T type 2，cTnT)、以及骨骼肌的肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)。 201106977 圖5A-D表示去氧羥四環素(D〇x = 1〇μΜ)誘導下之mirPS· hHFCs得到類人類胚胎幹細胞(证心丨此)的特性。（A)使用人類基因體基因晶片（Human genome GeneChip U133 plus 2.0 array， Affymetnx)分析mir-3〇2誘導體細胞重新編程(SCR)之前與之後 5 的全基因表現型態(η = 5，p < 0.01〜0.05)。（B)在限制酶切割後，較小DNA片段的出現與增加證實了以ι〇μΜ而非5μΜ去氧羥四環素(D〇x)處理後，mirPS細胞内基因體規模之總體CpG曱基化的大量減少。（c)以二亞硫酸鹽〇ΝΑ定序法定序與施《叹的啟動子區域後，得到詳細的曱基化地 10 圖。黑色圓形與白色圓形分別代表曱基化與未曱基化的胞嘧啶位置。（D)由mirPS-hHFCs多能分化成的似畸胎瘤組織囊腫 (teratoma-like tissue cysts)包含源自三個胚層（embry〇nic germ layers)的各楂組織。

圖6A—E顯示，10μΜ去氧羥四環素(Dox)誘導mir-3〇2表 15 現後，源自各種腫瘤/癌細胞之mirPS細胞的體外腫瘤生成能力分析。（A)以去氧經四環素(Dox)誘導mir-302表現之前與之後，細胞形態與細胞週期速率之改變。細胞週期各階段與相對之 DNA含量之流式細胞儀分析結果以圖表表示於細胞形態學上方 (n = 3，p < 〇_〇1)。（B)流式細胞儀分析結果之長條圖顯示mir_ 20 302對於源自各種腫瘤/癌細胞之mirPS細胞族群在有絲分裂(M 期)及休眠(G0/G1期)變化上的劑量相關效應。（C)Mir-3〇2抑制 89 201106977 腫瘤(及/或癌細胞)在Matrigel小室中之表現侵犯行為的功能性分析(n = 4，P < 〇_〇5)。（D)在去氧羥四環素誘導mir_3〇2表現之前與之後，比較細胞貼附於人類骨髓内皮細胞(hBMECs)單層之百分比（n = 4，p<〇.〇5)。 5 圖7A_D冷光酵素三端非轉譯區報告基因試驗(ludferase 3 -UTR reporter gene assay)顯示 mir-302 在標的的 G1 檢控點調節者(Gl-checkpoim regulators)引發的基因靜默效應。⑷冷光酵素三端非轉譯區報告基因之構造為在三端非轉譯區帶有兩個正常(T1+T2)、或兩個突變(M1+M2)、或正常與突變混合 ίο (T1+M2或M1+T2)之mir-302標的位置。突變位置含有一錯配 (mismatChed)TCC基序，其取代正常標的位置之一致的3，_CT丁知。⑻去氧經四環素(Dox)誘導的mir-302表現對冷光酵素表現之影響(n = 5，P < 〇.〇1)。Dox 濃度=5 或 1〇μΜ。CCND1 與 CCND2分別表示週期素D1與週期素D2。（c)與⑼以西方墨點 15 分析法比較在高濃度(1〇μΜ Dox)及低濃度(5μΜ Dox) mir_302誘導下’ mir-302主要標的之G1檢控點調節者在mirps細胞與在人類胚胎幹細胞：WAOl-Hl(Hl)及WA09-H9(H9)中的變化(n = 4，ρ<0·01)。圖8Α —C的活體内(m Wv〇)腫瘤生成能力分析顯示mirps_ ⑴ NTera2 細胞對持續表現的 mir-302s (NTera2+mir-302s)或！^!·-302d* (NTera2+mir-302d*) (η = 3 ’ p < 0.05)之反應。被轉染的 201106977 腫瘤細胞NTera-2中的mir-302s及mir-302d*分別轉錄自pCMF- 及載體。（A)實施原位注射(p〇st-is)後經過三週，對平均腫瘤大小進行型態學評估。所有的腫瘤皆位於原本植入的位置(黑色箭頭所指之處）。在所有受試小鼠(雄 5 性，BALB/c-nu/nu品系）中皆沒有觀察到惡病質或腫瘤轉移的症候。（B)北方墨點分析與西方墨點分析以及(〇免疫組織化學染色分析圖顯示體内mir-302對於核心重新編程轉錄因子 Oct3/4-Sox2-Nanog與mir-302標的的G1檢控點調節者：週期素依賴性激酶 2(CDK2)、週期素 Dl/D2(cyclins D1/D2)、BMI- 10 1、以及pl6Ink4a和pl4Arf表現型態之效應。圖9A-C為mir-302在10 μΜ去氧羥四環素之誘導而表現下，mirPS-hHFC與衍生自各種腫瘤/癌細胞的mirPS細胞株的端粒酶活性分析。（A)以端粒重複序列擴增試驗(trap)分析端粒酶活性(n = 5，p < 0.01)。端粒酶活性會受到RNase處理的影 15 響(hHFC+RNase)。（B)西方墨點法的分析證實人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)在各種mirPS細胞株中的表現為一致的增加，而 A0F2與HDAC2的表現減少(η = 5, p < 〇.〇1)。（〇以端粒酶 PCR ELISA試驗測量端粒酶活性(OD470-OD680 ; η = 3，ρ < 0_01)。 20 圖10A-D的分析結果顯示mir-302對其標的的外基因 (epigenetic gene)之靜默效應的。（A)冷光酵素三端非轉譯區報告 91 201106977 基因之構造為在三端非轉譯區帶有兩個正常(Τ1+Τ2)或兩個突變 (Μ1+Μ2)、或正f*與突魏合(Τ1+Μ2 或 M1+T2)^ 標的位置。突變位置包含一錯配的Tcc基序，取代正常標的位置上一致的二端CTT。⑻去氧㈣環素(Dox)誘導表現的mir_ 302對冷光酵素表現的影響(n = 5，p < 〇.〇1)。（c)與(D)以西方墨點分析法比較在高濃度(10 μΜ D〇x)與低濃度(5 μΜ D〇x) mir_ 302誘導下，mir_3〇2主要標的之外基因（epigenetic明沉)在 mirPS細胞與在人類胚胎幹細胞WAOl-Hl(Hl)及WA09-H9(H9) 中表現的變化(η = 4，p < 0.01)。圖Π為mir-3〇2介導的體細胞重新編程(s〇matic cen TepiOgramming ’ SCR)與細胞週期調節機制的示意圖。基於先前與目則的研究，吾人發現了兩並行事件。第一，mir_3〇2透過對多種外基因調節者(epigenetic reguiat〇rs) : a〇f1/2、MECP1/2 與HDAC2強烈的靜默作用而開始了重新編程並引發全基因體 DNA的去曱基化，藉此再活化誘發SCR所需(灰色標記)的人類胚胎幹細胞細胞標記基因。第二，透過對G1檢控點調節者週期素依賴性激酶(CDK2)、週期素Dl/D2(cyclins D1/D2)與BMI-1的共同抑制以及p16lnk4a與pl4/pl9Arf的活化而造成細胞週期的減弱，以抑制所有細胞活動來為SCR作準備(黑色標記）。休眠期(G0/G1)的停滯亦防止可能的隨機生長(rand〇rn growth)與/ 或被重新編程的多能性幹細胞的類腫瘤轉形(transformation)。 92 201106977 整體而言，此兩事件協同效應的結果為一更精確與安全的重新編程過程；亦能同時抑制預先成熟(pre-mature)與腫瘤生成。【主要元件符號說明】 10 15 20 25 30 93 35 201106977 【序列表】 <110> Lin, Shi-Lung 林希龍 5 Wu, David TS 吳堂熙

<120> 普適性抗癌藥物及疫苗/Development of Universal Cancer Drugs and Vaccines <130> 10P044001TWA 10 <150> 61/323190 <151> 2010-04-12 <150〉 61/272169 15 <151〉2009-08-26 <150〉 12/318806 <151〉2009-01-08 20 <150> 12/149725 <151> 2008-05-07 <160> 34 25 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212〉DN A 30 <213> 人造序列 <220〉 <223>化學合成寡核苷酸 35 <400> 1 gctaagccag gc 12 <210〉 2 40 <211> 12 <212〉DNA <213> 人造序列 94 <220〉 201106977 <223>化學合成寡核苷酸 <400〉 2 gcctggctta gc 5 <210> 3 <211> 17 <212> RNA 10 <213> 人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 15 <400> 3 uaagugcuuc cauguuu <210> 4 20 <211> 8 <212> DNA <213>人造序列 <220> 25 <223>化學合成寡核苷酸 <400> 4 gtaagagk 30 <210> 5 <211> 10 <212〉DN A <213> 人造序列 35 <220〉 <223>化學合成寡核苷酸 <400〉 5 40 gwkscyrcag <210> 6 <211> 7

45 <212> DNA 201106977 <213> 人造序列 <220> <223> 5 化學合成寡核苷酸 <400〉 tactway 10 <210> <211> <212> <213> 7 17 DNA 人造序列 15 <220> <223> 化學合成寡核苷酸 <400〉 7 tytycttttt tttttts 20 <210〉 8 <211> <212> 25 <213> 19 DNA 人造序列 <220〉 <223> 化學合成寡核苷酸 30 <220> <221> <222> <223> 35 misc feature (15).7(15) n is a, c, g, or t <400〉 8 tctctctctc tctcnctag 40 <210> <211> <212> <213> 9 91 DNA 人造序列 45 <220> 60201106977 <223>化學合成寡核苷酸 <400> 9 gtcacgcgtt cccaccactt aaacgtggat gtacttgctt tgaaactaaa gaagtaagtg cttccatgtt ttggtgatgg atagatctct c 91 <210〉 10 10 <211> 91 <212〉DN A <213>人造序列 <220〉 15 <223>化學合成寡核苷酸 <400> 10 gagagatcta tccatcacca aaacatggaa gcacttactt ctttagtttc aaagcaagta 20 catccacgtt taagtggtgg gaacgcgtga c 60 91 <210> 11 <211> 95 25 <212〉DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 30 <400〉 11 atagatctct cgctcccttc aactttaaca tggaagtgct ttctgtgact ttgaaagtaa gtgcttccat gttttagtag gagtcgctca tatga 60 95 <210> 12 <211> 95 <212〉DNA 40 <213>人造序列 <220〉 <223>化學合成寡核苷酸 45 <400> 12 s: 97 201106977 tcatatgagc gactcctact aaaacatgga agcacttact ttcaaagtca cagaaagcac ttccatgtta aagttgaagg gagcgagaga tctat 5 <210> 13 <211> 90 <212> DNA <213>人造序列 10 15 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400> 13 ccatatggct acctttgctt taacatggag gtacctgctg tgtgaaacag aagtaagtgc ttccatgttt cagtggaggc gtctagacat 20 25 30 <210> 14 <211> 90 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400> 14 atgtctagac gcctccactg aaacatggaa gcacttactt ctgtttcaca cagcaggtac ctccatgtta aagcaaaggt agccatatgg <210> 15 35 40 45 <211> 82 <212> DNA <2丨3>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400> 15 cgtctagaca taacactcaa acatggaagc acttagctaa gccaggctaa gtgcttccat gtttgagtgt tcgcgatcgc at 201106977 <210> 16 <211> 82 5 <212〉DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 10 <400〉 16 atgcgatcgc gaacactcaa acatggaagc acttagcctg gcttagctaa gtgcttccat gtttgagtgt tatgtctaga eg 15 <210> 17 <211> 105 <212> DNA 20 <213>人造序列 <220〉 <223>化學合成寡核苷酸 25 <400> 17 gcagatctcg aggtaccgac gcgtcctctt tactttaaca tggaaattaa gtgcttccat gtttgagtgg tgtggcgcga tcgatatctc tagaggatcc acatc 60 82 60 105 <210> 18 <21 卜 105 <212> DNA <213>人造序列 35 <220〉 <223>化學合成寡核苷酸 <400> 18 40 gatgtggatc ctctagagat ategategeg ccacaccact caaacatgga ageaettaat ttccatgtta aagtaaagag gaegegtegg tacctcgaga tctgc 60 105 45 <210> 19 99 201106977 <211> 23 <212> <213> DNA 人造序列 5 <220〉 <223> 化學合成寡核苷酸 <400> 19 tcactgaaac atggaagcac tta 10 <210〉 20 <211> <212> 15 <213> 27 DNA 人造序列 <220> <223> 引子 20 <400> 20 gaggctggag cagaaggatt gctttgg <210> 21 25 <211> <212> <213> 27 DNA 人造序列 <220> 30 <223> 引子 <400> 21 ccctcctgac ccatcacctc caccacc 35 <210> <211> <212> <213> 40 <220〉 <223> 22 25 DNA 人造序列 Primer <400〉 22 45 tggttaggtt ggttttaaat ttttg 201106977

<210> 23 <211> 26 5 <212> DNA <213>人造序列 <220〉 <223> 引子 10 <400〉 23 aacccaccct tataaattct caatta 15 <210> 24 <211> 18 <212〉DNA <213>人造序列 20 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400〉 24 aatccgtcga gcagagtt 25 <210> 25 <211> 21 <212> DNA 30 <213> 人造序列 <220〉 <223>化學合成寡核苷酸 35 <400> 25 gtgtaaccct aaccctaacc c <210> 26 40 <211> 110 <212> DNA <213>人造序列 <220〉 60201106977 <223>化學合成寡核苷酸 <400〉 26 gcagtgtggg tttcgggcac tgcaggaaca aattctccag gttgcctctc actcggttct cgatactggt tcgctttctc tttcgggcct gcacgagggt ttctgctttg 110 <210> 27 10 <211> 110 <212〉DNA <213>人造序列 <220〉 15 <223>化學合成寡核苷酸 <400> 27 tgctgtaggt gggcgagccg ttcatgtagg tctgcgagct ggtcatggag ttgtactgca 20 gggcgctcac gtcgtagcgg tgcatgggct gcatctgcgc tgcgccgtgc 60 110 <210> 28 <211> 110 25 <212〉DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 30 <400> 28 cgtgtgaggc atctcagcag aagacatttg caaggatgga tagttttctt caggcccaca aatcacaggc ataggtgaag attctttaca gtcggatgct tcaaagcaag 35 <210> 29 <211> 110 <212〉DNA 40 <213>人造序列 <220〉 <223>化學合成寡核苷酸 60 110 45 <400> 29 102 201106977 60 110 aggtccggtg acacggatgg attccagacc cttggctgac ttcttaaagg tgaactccac tgcctcaccc tccttcaagc tccggaaccc ttccatgtgc agcttactct <210〉 30 <2ll> 110 <212> DNA <213>人造序列 10 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400> 30 60 110 15 ctgctgggcc agcgcggccg acacgcggcg gtaggtgggc agggcctggc ggcggtccag gagcagcgcg cgccacacgg ccggttgcag cagcgtcccc agcagcagct 20 <210> 31 <211> 110 <212〉DNA <213>人造序列 25 <220> <223>化學合成募核苷酸 <400> 31 60 110 ctgctcgacg gcgacgacga agaggaggct gacgctgacg aggacacggt ggcggccact 30 gactccggag gatgggtcag cgaattggag agaataaagt ccaggtccag <210> 32 35 <211> 110 <212> DNA <213>人造序列 <220> 40 <223>化學合成寡核苷酸 <400〉 32 60 gagccctagg ggatccagtg gcatcgtctc gggacacacg caggtaggag aagaaacaca 45 cagccaccag cagctgaaat agcagtgcgg ccagacagcg gcgccatggc 110 103 201106977

<210> 33 <211> 110 5 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 10 <400> 33 60 110 cgaaggggtt gccgtcgccc tcgccctcgc acttgaagta gtggccgttc acggtgccct ccatgtacat cttgatgcgc atactctcct tcagcaggcc gctcaccata <210 34 <211> 110 <212> DNA 20 <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 25 <400 34 60 110 aatgtcacgc acgatttccc gctcggccgt ggtggtgaag ctgtagccgc gctcggtgag gatcttcatg aggtagtcag tcaggtcccg gccagccagg tccagagcga 104 201106977 20101126 Development of Cancer Drugs_ST25 TWA in Chinese 序列表 <110〉Lin，Shi-Lung 林希龍 Wu，David TS 吳堂熙 <120> 普適性抗癌藥物及疫苗/Development 〇f Universal Cancer Drugs and Vaccines

<130> 10P044001TWA <150> 61/323190 <151> 2010-04-12 <150〉 61/272169 <151> 2009-08-26 <150> 12/318806 <151> 2009-01-08 <150〉 12/149725 <151> 2008-05-07 <160> 34 <170> Patentin version 3.5 <210〉 1 <211> 12 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400> 1 gctaagccag gc 12 <210> 2 <211〉 12 <212〉 DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400> 2 gcctggctta gc 12 <210〉 3 <211> 17 <212> RNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400> 3 uaagugcuuc cauguuu 17 <210> 4 <211> 8 <212〉 DNA <213>人造序列 <220〉 <223>化學合成寡核苷酸 <400> 4 gtaagagk 8 <210> 5 <211> 10 第1頁 201106977 20101126 Development of Cancer Drugs—ST25 TWA in Chinese <212> DNA f <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400> 5 gwkscyrcag 10 <210> 6 <211> 7 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400〉 6 tactway 7 <210〉 7 <211> 17 <212> DNA <213>人造序列 <220〉 <223>化學合成寡核音酸 <400> 7 tytycttttt tttttts 17 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <220> <221> misc feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 8 tctctctctc tctcnctag 19 <210〉 9 <211> 91 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核音酸 <400> 9 gtcacgcgtt cccaccactt aaacgtggat gtacttgctt tgaaactaaa gaagtaagtg 60 cttccatgtt ttggtgatgg atagatctct c 91 <210〉 10 <211> 91 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 化學合成寡核苷酸 <400> 10 第2頁 201106977 20101126 Development of Cancer Drugs_ST25 TWA in Chinese gagagatcta tccatcacca aaacatggaa gcacttactt ctttagtttc aaagcaagta catccacgtt taagtggtgg gaacgcgtga 60 91 <210> 11 <211〉 95 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400> 11 atagatctct cgctcccttc aactttaaca tggaagtgct ttctgtgact ttgaaagtaa gtgcttccat gttttagtag gagtcgctca tatga 60 95 <210> 12 <211> 95 <212〉 DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400> 12 tcatatgagc gactcctact aaaacatgga agcacttact ttcaaagtca cagaaagcac ttccatgtta aagttgaagg gagcgagaga tctat 60 95 <210> 13 <211> 90 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 化學合成寡核苷酸 <400> 13 ccatatggct acctttgctt taacatggag gtacctgctg tgtgaaacag aagtaagtgc 60 ttccatgttt cagtggaggc gtctagacat 90 <210> 14 <211> 90 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400> 14 atgtctagac gcctccactg aaacatggaa gcacttactt ctgtttcaca cagcaggtac ctccatgtta aagcaaaggt agccatatgg 60 90 <210> 15 <211> 82 <212> DNA <213> 人造序列 <220〉 <223> 化學合成寡核苷酸 <400> 15 cgtctagaca taacactcaa acatggaagc acttagctaa gccaggctaa gtgcttccat 60 gtttgagtgt tcgcgatcgc at 82 第3頁 201106977 20101126 Development of Cancer Drugs_ST25 TWA in Chinese <210〉 16 <211> 82 <212> DNA <213> 乂造序列 <220> <223> 化學合成》核苷酸 <400> 16 atgcgatcgc gaacactcaa acatggaagc acttagcctg gcttagctaa gtgcttccat 60 gtttgagtgt tatgtctaga eg 82 <210〉 17 <211> 105 <212〉 DNA <213> 人造序列 <220〉 <223> 化學合成諄核苷酸 <400> 17 gcagatctcg aggtaccgac gcgtcctctt tactttaaca tggaaattaa gtgcttccat 60 gtttgagtgg tgtggcgcga tcgatatctc tagaggatcc acatc 105 <210> 18 <211> 105 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 化學合成寡核苷酸 <400> 18 gatgtggatc ctctagagal atcgatcgcg ccacaccact caaacatgga agcacttaat 60 105 ttccatgtta aagtaaagag gacgcgtcgg tacctcgaga tctgc <210〉 19 <211> 23 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400〉 19 tcactgaaac atggaagcac tta 23 <210〉 20 <211> 27 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>引子 <400> 20 gaggctggag cagaaggatt gctttgg 27 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> 人造序列 <220〉 <223> 引子 <400> 21 第4頁 201106977 20101126 Development of Cancer Drugs_ST25 TWA in Chinese ccctcctgac ccatcacctc caccacc 27 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223> Primer <400> 22 tggttaggtt ggttttaaat ttttg 25 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>引子 <400> 23 aacccaccct tataaattct caatta 26 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400〉 24 aatccgtcga gcagagtt 18 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400> 25 gtgtaaccct aaccctaacc c 21 <210> 26 <211> 110 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400> 26 gcagtgtggg tttcgggcac tgcaggaaca aattctccag gttgcctctc actcggttct 60 cgatactggt tcgctttctc tttcgggcct gcacgagggt ttctgctttg 110 <210> 27 <211> 110 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223>化學合成寡核苷酸 <400> 27 tgctgtaggt gggcgagccg ttcatgtagg tctgcgagct ggtcatggag ttgtactgca 60 第5頁 201106977 20101126 Development of Cancer Drugs_ST25 TWA gggcgctcac gtcgtagcgg tgcatgggct gcatctgcgc tgcgccgtgc <210> 28 <211> 110 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 化學合成茲核苷酸 <400> 28 cgtgtgaggc atctcagcag aagacatttg caaggatgga tagttttctt caggcccaca aatcacaggc ataggtgaag attctttaca gtcggatgct tcaaagcaag <210> 29 <211> 110 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 化學合成S核苷酸 <400> 29 aggtccggtg acacggatgg attccagacc cttggctgac ttcttaaagg tgaactccac tgcctcaccc tccttcaagc tccggaaccc ttccatgtgc agcttactct <210> 30 <211> 110 <212〉 DNA <213> 人造序列 <220> <223> 化學合成寡核苷酸 <400> 30 ctgctgggcc agcgcggccg acacgcggcg gtaggtgggc agggcctggc ggcggtccag gagcagcgcg cgccacacgg ccggttgcag cagcgtcccc agcagcagct <210〉 31 <211> 110 <212> DNA <213> 人造序列 <220〉 <223> 化學合成》核苷酸 <400> 31 ctgctcgacg gcgacgacga agaggaggct gacgctgacg aggacacggt ggcggccact gactccggag gatgggtcag cgaattggag agaataaagt ccaggtccag <210〉 32 <211〉 110 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 化學合成»核苷酸 <400> 32 gagccctagg ggatccagtg gcatcgtctc gggacacacg caggtaggag aagaaacaca cagccaccag cagctgaaat agcagtgcgg ccagacagcg gcgccatggc <210> 33 第6頁 201106977 <211> 110 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 化學合成寡核苷酸 <400〉 33 20101126 Development of Cancer Drugs_ST25 TWA in Chinese cgaaggggtt gccgtcgccc tcgccctcgc acttgaagta gtggccgttc acggtgccct 60 ccatgtacat cttgatgcgc atactctcct tcagcaggcc gctcaccata 110 <210〉 34 <211> 110 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 化學合成寡核苷酸 <400> 34 aatgtcacgc acgatttccc gctcggccgt ggtggtgaag ctgtagccgc gctcggtgag 60 gatcttcatg aggtagtcag tcaggtcccg gccagccagg tccagagcga 110 第7頁

Claims

201106977 七、申請專利範圍： 1. 一種使用一重組核酸組成物在一標的細胞中來引發特定的基因靜默效應的方法，包含下列步驟： (a) 提供該重組核酸組成物，其被傳送、被轉錄及被處理成至少一基因靜默效應子，以干擾複數個mir_3〇2標的的細胞基因；以及 (b) 以該重組核酸組成物處理一含有該標的細胞並且表現 mir-302標的之細胞週期調節者及致癌基因的細胞受質。 2. 如申請專職圍第丨項所述之方法，其中該標的細胞包含-人類細胞，該人類細胞之分類屬於發現於崎胎瘤當中的一腫瘤細胞類型。 3·如申請專利範圍第丨項所述之方法，其_該標的細胞包含一源自癌組織的人類細胞。 4. 如申請專利範圍第1項所述方 15 包含一表現勝任載體。其中該重組核酸組成物 5. 如申請專利範圍第！項所述之包含-藥物誘導式基因表現啟動子〜組核酸組成物 6·如申請專利範圍第5項所述之方法，表現啟動子受到-四環黴素衍生物或;等:=導式基因】05 201106977 7·如申請專利範圍第！項所述之包含一持續性基因表現啟動子、該重組核酸組成物 8.如申請專利範圍第7項所敬動子受^_私喊制#2^。基西表現 10.如申請專利範圍第！項所述複數個秦302標的之細胞基因/其中该細胞受質表現 Η.:請補圍第1項所述之方法，其中處理該細胞受質係在跡搬抑制秦迎標的之細胞基_條件下進行β 12. C=第1項所述之方法，其中該重组核酸組成物^3-五&剪紐位、—内含伟场、—分支點基序、一多嘧啶段，以及一三端剪接受位。 15 13. 如申請專利範圍帛12項所述之方法，其中該内含子插入位包含與mir-302同源之該基因靜默效應子。 H.如申請專利範圍第i項所述之方法，其中該重組核酸組成物進一步包含複數個外顯子。 I5.如申請專利範圍帛1項所述之方法，其中該基因靜默效應子包含一序列，該序列與一 SEq ID N〇a序列戋一 SEQ.ID.N0.2序列同源。 106 20 201106977 16. 如申請專利範圍帛丨項所述之方法，其中該基因靜默效應子與一 SEQ.ID.N0.3序列同源或互補，或兩者皆是。心 17. 如申請專利範圍第.丨項所述之方法，其中該基因靜默效應子由一 SEQ.ID.NO_9 序列、一 SEQ.ID.NO.10 序列、一 SEQ.ID.NO.ll 序列、一 SEqIRN〇12 序列一 SEQ.ID.NO. 13 序列、一 SEqJDN〇14 序列一 SEQ.ID_NO.15序列，以及一崎腿〇16序列的雜合物以接合作用連接而形成。 18. 如申請專利範圍第！項所述之方法，其中該基因靜默效應子為由一 SEQ.ID.NO.17序列與一 SEQ.ID.NO.18序列之雜合物所形成的一重紐核酸組成物。 19. 如申請專利範圍第i項所述之方法，其中該重組核酸組成物經由一基因傳送方法被傳送至該細胞受質中。 20. 如申凊專利圍第j項所述之方法，其中該mir_3〇2標的的細胞週期調節者與致癌基因係選自CDK2、cDK4、 CDK6、CydinD、BMI_卜及其組合。 21. 如申5月專利範圍第i項所述之方法，其中該特定的基因靜默政應至>、包含細胞週期減弱、⑽⑴檢控點停滯、腫瘤抑制、抗腫瘤生成’以及癌細胞社之其中一項。 107 201106977 22. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該特定的基因靜默效應起因於RNA干擾。 23. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該重組核酸組成物是由一基因工程方法產生。 108