TW201038552A - Indole derivatives as anticancer agents - Google Patents

Description

201038552 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於吲哚化合物及含該作為抗癌劑 之化合物的組成物。此外，本發明提供所揭示化合 物之製備方法、含其之組成物及使用其之方法，例 如作為一種藥劑，特別是用於治療癌症。 本申凊案主張歐洲專利申請案No. 09152089.0 之優先權，其併於本文參考。不受任何理論所拘 0 束，現今s忍為，雖然在腫瘤細胞生物學中，MDM2 及p53代表關鍵要素，且在對於細胞損傷或緊迫的 細胞反應上具有關鍵角色，儘管本化合物增加 之表現，藉由本化合物引出其之已證實有效的臨床 前抗腫瘤活性，似乎其不能代表主要分子標靶。最 初的觀察資料指出在DNA合成及/或複製_緊迫反 應上直接或間接的效果作為支持所觀察到的化合 物臨床前抗腫瘤活性。本化合物在缺乏p53、缺乏 ^ 機能性P53、或具有突變之p53之踵瘤細胞亦呈現 抗增殖效果，此外，其可使腫瘤形成細胞對於化學 療法及放射療法敏感。 【先前技術】 p53為一種腫瘤抑制因子蛋白質，其在調節細 胞增殖與細胞生長抑止/細胞凋零之間的平衡上扮 演一種樞紐的角色。在正常狀況下，p53之半生期 非常短暫，因此p53在細胞中之濃度很低。然而， 對於細胞DNA損害或細胞緊迫（例如致癌基因活 化、端粒（telomere)蝕化、組織缺氧）的反應，p53 3 蝎 201038552 之濃度增加。此增加p53濃度導致活化驅動細胞進 入生長抑止或進入細胞凋零程序之一些基因的轉 錄。因此，p53重要的功能是避免受損細胞不受控 制之增殖，從而保護生物避免癌症生長。本文所使 用之“MDM2”（鼠雙微粒體 2 ; Murine Double Minute 2) —詞意指由於mdm2基因表現而獲得之蛋白質。 在此術語之意義内，MDM2包含所有經mdm2編碼 之蛋白質、期之突變體，或者是其薄片蛋白質（slice protein)、及其填酸化蛋白質。此外，如本文中所使 用，“MDM2” 一詞包括MDM2類似物，例如 MDMX，亦已知為MDM4，及MDM2同系物及其他 動物之類似物，例如人類同系物HDM2或人類類似 物HDMX。MDM2為一種p53功能之關鍵負調節 劑，其經由結合至p53之胺基端反式激活域 (transactivation domain)形成負的自動調節環，因此 MDM2抑制p53活化轉錄之能力及將p53蛋白質水 解降解。在正常狀況下，此調節環是維持p53低濃 度的原因。 JP11130750尤其敘述經取代苯基胺基羰基吲 哚基衍生物，作為5-HT受體拮抗劑。 EP1129074敘述鄰胺苯曱酸醯胺，作為血管内 皮生長因子受體（VEGFR)之抑制劑，並用於治療血 管生成疾病。WO01/42224提供羧基醯胺衍生物’ 用於治療阿滋海默症。EP1317443揭示三環三級胺 衍生物，使用作為趨化素（chemokine)受體CXCR4 或CCR5調控劑，用於治療人類免疫不全病毒及貓 201038552 免疫不全病毒。 EP1379239揭示N-(2-芳基乙基）苯甲基胺，作 為5-HT6受體之拮抗劑。WOOO/15357提供哌啡 苯基衍生物，作為MDM2與p53間相互作用之抑制 劑。EP1137418提供三環化合物，用於恢復p53家 族蛋白質之構形安定性。W003/040402提供抑制蛋 白質間相互作用之化合物，例如MDM2與p53間之 相互作用。EP1443937敘述經取代1，4-笨并二氮呼 (benzodiazepines)及其作為MDM2-p53相互作用抑 制劑之用途。EP1458380提供順-2,4,5-三苯基-咪唾 酮，其抑制MDM2蛋白質與類p53胜肽之相互作 用，並具有抗增殖活性。 EP15 19932揭示雙芳基磺醯胺化合物，其結合 至MDM2，並可用於癌症治療。 W02006/032631 、 W02007/107543 、 W02007/107545 、 W02009/019274 、 W02009/037308、及 W02009/037343 揭示 MDM2 與p53相互作用之抑制劑。 對於腫瘤細胞生長具有有效抑制效果、具有寬 廣的安全輪廓，及較少非所欲之副作用的小分子有 所需求。 【發明内容】 本發明化合物顯示優異活體外活性及優異的 活體内抗腫瘤效果，其對於P450酵素具有低親合 性，降低不利的藥劑-藥劑相互作用的風險，容許較 寬廣的安全限度。此外，本發明化合物具有低的藥 201038552 劑誘導神經效果，且具有改良的心血管輪廓，其可 適宜地影響化合物之劑量限制毒性（dose limiting 本發明提供化合物、組成物、及治療癌症之方 法。此外’本發明化合物及組成物用於增強化學療 法及放射療法之效力。 本發明涉及式（I)化合物

包括其任何立體化學異構型式，其中

Rl為羥基烷基或Gy烯基；前提為Rl取代基位於 吲哚部分的位置6或7 ; ' R2為氫或烷基； Z為選自下列之基

R3為氫或羥基Ci_4燒基； R4為羥基或Cm烷氧基； R5為氫或cN4烷基；或 R及R結合在一起形成綱基； 其醫藥可接受性鹽或其溶劑化物。 式（I)化合物亦可存在為其之互變異構型式，雖 201038552 然於上式中並未明確指出，這些型式意圖包括於本 發明之範圍内。 本發明亦關於式（I)化合物於製造用於治療癌 症之藥劑上之用途，及關於一種用於治療癌症 (I)化合物。 工 用於前述定義及下文中的一些術語如下說 明’這些術語有時依其使用或以組合術語使用。

〇 做為基團或基團之一部分的C1_4烷基定義為具 有1至4個碳原子之直鏈或支鏈飽和碳氫殘基，例 如曱基、乙基、丙基基乙基、丁基；^為基 ，或基團之一部分的Cw烷基定義為具有i至6個 碳原子之直鏈或支鏈飽和碳氫殘基，例如烷基 所定義之基及戊基、己基、2-甲基丁基等。烯 基定義為含一雙鍵及具有2至6個碳原子之直2二及 支鏈碳氫殘基，例如乙烯基、孓丙烯基、3_丁烯基、 2-戊烯基、3-戊烯基、弘甲基_2_ 丁烯基等。 由取代基劃至環系統中的線表示鍵可連接至 任何適當的環原子。 關於治療用途，式⑴化合物之鹽類為相對離子 是醫樂上可接受者。然;而，非f藥上可接受之酸及 驗的鹽類亦可供給制，例如在製備錢化醫藥上 :接文化合物。所有鹽類，無論醫藥上可接受或不 能接受者皆包含於本發明之範圍内。 〆 勺A彳5、： I文申所述之醫藥上可接受鹽類意指 :二_成之治療上活性無毒性酸 加成|型式，後者可便利地經由以此適當之酸處理 7 201038552 驗形式而獲得’該酸如無機酸’例如氫齒酸，例如 氫氯酸、氫溴酸等；硫酸；硝酸；磷酸等；或有機 酸，例如乙酸、丙酸、羥基乙酸、2_羥基丙酸、 酮基丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬 酸、蘋果酸、酒石酸、2-羥基-l，2,3_丙烷三羧酸、 曱烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、4_曱基苯磺酸、環 己烷磺酸、2-羥基苯曱酸、4-胺基-2-羥基苯甲酸等 酸。相反地，鹽型式可經由鹼處理轉變成游離鹼的 型式。 含酸性質子之（I)化合物經由以適當有機及無 機鹼處理，可轉變成其治療上活性無毒性金屬或胺 加成鹽型式。如前文或下文中所述之醫藥上可接受 鹽類意指亦包含式（I)化合物能夠形成之治療上活 性無毒性金屬或胺加成鹽型式（鹼加成鹽型式）。適 當的驗加成鹽型式包含’例如銨鹽、驗金屬及驗土 金屬鹽類’例如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣鹽等、有機鹼 之鹽類，例如一級、二級及三級脂族及芳族胺，例 如曱胺、乙胺、丙胺、異丙胺、四丁基胺異構物、 二曱胺、二乙胺、二乙醇胺、二丙胺、二異丙胺、 二-正丁胺、吡咯啶、哌啶、嗎啉、三曱胺、三乙胺、 三丙胺、哏啶、吡啶、喹啉及異喹啉、苄星 (benzathine)、曱基-D-還原葡糖胺、2-胺基-2-(羥 基曱基）-1,3 -丙一醇、海巴明（hy drab amine)鹽類、及 具有胺基酸之鹽類，例如精胺酸、離胺酸等。相反 地’鹽型式可經由酸處理轉變成游離酸的型式。 鹽類一詞亦包含四級銨鹽（四級胺），經由式⑴ 201038552 化合物之鹼性氮與適當之四級化試劑間之反應可 形成式（I)化合物’該四級化試劑例如為任意地經取 代之C!_6烷基齒化物、芳基鹵化物、a—烷基羰基 鹵化物、芳基羰基鹵化物、或芳基烷基鹵化物， 例如f基碘或苯甲基碘、其中芳基代表未經取代或 絰取代之苯基。其它具有優異離去基之反應物亦可 使用’例如Ci_6烷基三氟甲烷磺酸酯、Ci6烷基甲 烷磺酸酯、及Ci_6烷基對甲苯磺酸酯。四級胺具 〇 有，電氮。醫藥上可接受相對離子包括氯、漠、蛾、 二氟乙酸根、乙酸根、三氟甲烷磺酸根、硫酸根、 磺酸酯。可使用離子交換樹脂導入相對離 擇。 、 、車乂佳地，鹽類一詞意指醫藥上可接受酸加成鹽 型式及醫藥上可接受金屬或胺加成鹽型式。 溶劑化物一詞包含式⑴化合物可形成之水合 物及溶劑加成型式，及其鹽類。此型 3 為水合物、醇化物等。 貝J ^ 將了务知些式⑴化合物及其鹽類、及溶劑化 物可包含—或多個對掌t心，並存在立體化學異構 型式。 士、，文中所使用，“式⑴化合物之立體化學異 構型式”-詞定義經由相同鍵之順序鍵結相同原 子A，但具有不可交換之不同立體結構所組成之所有 可月b的化口物，其可具有式⑴化合物及其醫藥上可 接受性鹽類或生理機能性衍生物。 Μ 除另有提及或指出外，化合物之化學命名代表 9 201038552 所有可能之立體化學異構型式的混合物，且各個別 的式⑴異構型式及其鹽類或溶劑化物實質上不含 相關其他異構物，即少於50%，較佳地少於20〇/〇， 更佳地少於1 〇% ’更佳地少於5%，更佳地少於2%， 且最佳地少於1%。因此，當式⑴化合物為例如特 定為R，此意指化合物實質上不含s異構物。或若 式⑴化合物為例如特定為E，此意指化合物實質上 不含Z異構物。 尤其是’立體中心可具有r-或s_組態；在二價 環（部分）飽和殘基上之取代基可具有順式-或反式_ 組態。包含雙鍵之化合物在該雙鍵上可具有E (對 側）或z (同侧）-立體化學。術語順式、反式、R、s、 E及Z為熟悉技術者所熟知。 式⑴化合物之立體化學異構型式顯然地意圖 包含於本發明之範圍内。 特別受關注的是立體化學上純的這些式⑴化 合物。 依據CAS-命名規定，當已知絕對組態之二個 立體中心存在於分子中時’ A或W述符號被指定 (基於Cahn-Ingold-Prelog順序規則）為最小編號對 掌中心，參考中心。使用相關描述符號或 表示第二立體中心之組態，其巾Ρ經常被特 定為參考中心，且表示具有相同對掌之中 心，且表示不同對掌之中心。例如，若分子 中最小編號對掌中心具有S組態，而第二令心為及， 立體描述符號將被特定為若使用“α，，及 201038552 “P”：在具有最低環數之環系統的不對稱碳原子上， ，優先取代基之位置任意地經常位於環系統所決 定之平均平面的“OC”位置。在環系統中，相對於在 參考原子上最優先取代基之位置，在其他不對稱碳 ^子上最優先取代基之位置’若其位於環系統所決 疋之平均平面的同侧，則被命名為“α”，若盆位於 環系統所決定之平均平面的另—側，則齡名為 “β”。 〇 當於本文使用時，述語順式及反式符合

Chemical Abstracts nomenclature (J. 〇rg. Chem. 1970, 35 (9)，2849-2867)，且涉及環部分上取代基之 位置。 式⑴化合物可被合成為對映異構物之外消旋 此合物形式，其可依技術中已知之解析程序相互分 離。外消旋式（I)化合物可經由與適當對掌性酸反 應，被轉換成對應之非鏡像異構鹽形式。隨後分離 ❹ 該非鏡像異構鹽形式，例如經由選擇性或部分結 曰曰並將對映異構物經由驗解離。式⑴化合物之分 離對映異構物形式的另一方式包含使用對掌性靜 止相之液體層析。倘若反應立體特異性地發生，該 純的立體化學異構型式亦可衍生自對應的適當起 始物質之純立體化學異構型式，較佳地，若特定立 體異構物為所欲，該化合物將經由製備之立體特異 性方法合成，這些方法將有利地使用對映異構性純 的起始物質。 本發明亦意圖包括任何存在於本發明化合物 201038552 , 中之原子的同位素，例如氯之同位素，包括氣及 汛，及碳之同位素，包括CM3及C_14。 ，每當於下文使用時’”式（I)化合物，，或“本發明化 二t表不亦包括醫藥上可接受鹽類’特別是酸或鹼 (至屬或胺）加成鹽、所有立體異構型式、溶劑化物、 及所有多型結晶型式或非晶型式。 ☆沾：田於刖文或下文使用時，取代基各自可被獨 多定義之列表中選出，所有可能之組合被 預期為化學上可能的。 本發明令人關注的具體實施例為Ri取代基位 =°弓卜朵部分之位i 7的這些式（1)化合物，因此 合物具有下式 t> 1

(I-a) 本發明令人關注的具體實施例為代基位 合位置6的這些式(ι)化合物，因此，化 R2

R1、 (I-b) 本發明令人關注的具體實施例為這些式（I :物、㈣或（I_b)，其中Rl為經基Cl.6烧基，,

^ -ch2.〇h . -C(CH3)2-〇H , -CH(CH3)-OH 12 201038552 -ch2-ch2-oh 、 -CH2-CH2-CHOH-CH3 -CH(CH(CH3)2)-〇H 尤其是-C(CH3)2-〇h。 式(I)化 特別是 本發明令人關注的具體實施例為這些 合物、（I-a)或（I-b) ’其中R1為c2_6烯基， -ch=ch2、-c(ch3)=ch2。 本發明令人關注的具體實施例為這些式⑴化 合物、（I-a)或（I-b)或上述其之令人關注的具體 例，其中R2為氫。 &

本發明令人關注的具體實施例為這些式⑴化 合物、（I-a)或（I-b)、或只要可能，上述其之令人 注的具體實施例’其中尺2為Cl_4烷基，特別是7甲基W 本發明令人關注的具體實施例為這些式化 合物、（I-a)或（I-b)、或只要可能，上述其之令人 注的具體實施例，其中R3代表氫。 飞 W 本發明令人關注的具體實施例為這些式⑴化 合物、（I-a)或（I-b)、或只要可能，上述其之令人 注的具體實施例，其中R3代表羥基Gw烷基，特Z 是-CH2_OH。較佳地，此R3取代基位於吡咬部分之 本發明令人關注的具體實施例為這些式（j)化 合物、（I-a)或（I-b)、或只要可能，上述其之令人 注的具體實施例，其中R4代表羥基。 _ 本發明令人關注的具體實施例為這些式⑴化 合物、（I-a)或（I-b)、或只要可能，上述其之令人 注的具體實施例’其中R4代表Cm烷氧基別， 曱氧基。 & 13 201038552 本發明令人關注的具體實施例為這些式 合物、（I-a)或（I-b)、或只要可能，上述其之令〇化 注的具體實施例，其中R5代表氫。 ~ 7人關 本發明令人關注的具體實施例為這些式 合物、（I-a)或（I-b)、或只要可能’上述豆之人= 注的具體實施例，其中R5代表Cw烷基’特^是= 基。 本發明令人關注的具體實施例為這些式（ι)化 合物、（I-a)或（I-b)、或只要可能，上述其之令人關 注的具體實施例’其中R4及R5 —起形成酮基。 本發明令人關注的具體實施例為 合物、(I-a)或㈣、或只要可能，上述其-之= 注的具體實施例，其中R4為經基且R5為氯。 本發明令人關主的具體實施例為^些式⑴化 合物、（I-a)或（I-b)、或只要可能，上述其之令人關 注的具體實施例’其中R4為羥基且R5為Ch烧基， 特別是曱基。 4 & 本發明令人關/主的具體實施例為這些式⑴化 合物、（I-a)或（I-b)、或只要可能，上述其之令人關 庄的具體實施例’其中R4為C 1 _4院氧基且R5為氫。 本發明令人關注的具體實施例為這些式⑴化 合物、（I-a)或（I-b)、或只要可能，上述其之令人關 注的具體實施例’其中Z為式（z-1)之基。 本發明令人關注的具體實施例為這些式（I)化 合物、（I-a)或（I-b)、或只要可能，上述其之令人關 注的具體實施例，其中Z為式（z-2)之基。 14 201038552 上述令人關注的具體實施例的所有可能組合 被認為包含於本發明之範圍内。 本發明令人關注的具體實施例為這些式（1)化 合物、（I-a)或（I-b) ’ 其中 R1 為 _CH2_〇h、 -C(CH3)2-OH、-CH(CH3)-OH、-CH2-CH2-〇H、 -CH(CH(CH3)2)-〇H、_CH2-CH2-CH〇H-CH3 、 -CH=CH2或C(CH3)=CH2 ;R2為氫或甲基；R3為氫 或-CH2_OH;R4為羥基或甲基氧基；R5為氫或甲基、 〇 或尺4與r5結合在一起形成酮基。 較佳地，上述令人關注的具體實施例之化合物 為立體化學性純的。 本發明較佳的化合物選自下列所組成之群組

15 201038552

16 201038552

17 201038552

包括任何其立體化學異構型式； 其醫藥可接受性鹽或其溶劑化物。 (*表示相關立體化學） 本發明較佳的化合物選自下列所組成之群組 18 201038552

19 201038552

其醫藥可接受性鹽或其溶劑化物。 本發明較佳的化合物為具有下式之化合物

20 201038552 其醫藥可接受性鹽或其溶劑化物

、V0H 本發明較佳的化合物為具有下式之化合物

包括其任何立體化學異構型式； Ο 其醫藥可接受性鹽或其溶劑化物。 物

本發明較佳的化合物為具有下式之對映異構 Ο 且具有左旋旋光性，其以鈉（589奈米）之D_線波長 的光’於溫度20。(： ’及晶格路徑長度1公寸，在濃 度8.59毫克/¾升之氯仿中量測；或 其醫藥可接受性鹽或其溶劑化物。 物 本發明較佳的化合物為具有下式之對映異構

且具有右旋旋光性’其以鈉（589奈米）之D-線波長 201038552 公寸，在濃 之對映異構 度10.33毫克/毫升之田日曰才。路徑長度 笑升之甲醇中量測；或 八西樂可接堂性鹽或其溶劑化物。 本發明較佳的化合物為具有 物

OH 2有左旋旋光性，其以鈉(589奈求 ^先，於溫度，C，及晶格路徑長度1公寸，在ί 又10.74毫克/毫升之甲醇中量測；或 其醫藥可接受性鹽或其溶劑化物。 興里合物、其醫藥上可接受鹽類及其立體化 予”構里式可於習知方法中製備。起始物質及一些 中間產物為已知的化合物，且為商業上可獲得，; 可根據技術中通常已知之習知反應程序製傷。敛述 於W〇2006/03施之合成方法亦作為關於此方面 之參考資料。 一些此類製備方法將於下文中更詳細的敘 述，獲得最終式（I)化合物之其他方法敘述於實施 中〇 一般而言，式（I)化合物可經由式（11)中間產物 與式（III)中間產物反應而製備，其中Wi為適當之離 去基，例如鹵素，例如氟、氯'溴或碘、或磺醯氧 22 201038552

基，例如甲基磺醯氧基、4_甲基苯基磺醯氧基等。 反應可於反應-惰性溶劑中完成，例如醇，例如甲 醇、乙醇、2-曱氧基乙醇、丙醇、丁醇等；醚，例 如1,4-一喝烧，較佳地有適當的酸存在，例如HQ、 u’-氧基雙丙烷等；酮，例如4_甲基_2_戊酮；或 N，N-二甲基甲醯胺、硝基苯、乙腈等。添加適當的 鹼，例如鹼金屬或鹼土金屬碳酸鹽或碳酸氫鹽，或 有機鹼，例如N，N-二異丙基乙基胺、三乙基胺、碳 酸鈉或碳酸鉀，可被用於收取在反應過程中被解離 之酸。可添加少量適當的金屬碘化物，例如碘化鈉 或碘化鉀，以促進反應。攪拌可增強反應速率。反 應可便利地於室溫與反應混合物之回流溫度間的 溫度Η範圍進行，如果需要，反應可於增壓下進行。

2-W, (ΙΠ)

(I) 在上述反應中，式（Π)中間產物，其中Rl為 -C(OH)(CH3)2可產生對應之最終式⑴化合物，其中 R1 為-C(CH3)=CH2。 上述式（III)中間產物與式（II)中間產物之反應亦 可在適當的催化劑，例如Pd(dba)2(雙[(ι,2,4,5-η)-1,5-一本基-1，4-戊二烯]·|β)、適當的配位基，例如 ΒΙΝΑΡ (2,2'·雙（二苯基膦）4，广雙萘基）、適當的鹼， 例如二級丁醇鈉、及適當的溶劑，例如曱苯，存在下 23 201038552 完成。 式（i)化合物，其中Ri代表羚 物以式（1-1)代表，其亦可+二悉Cw烷基，該化合

NaBH4 ’及適當的溶劑，例如醇田的還原劑，例如

ΝΗ-2 (IV) 經由還原對應之式（IV)羰基街^=例如曱醇等存在下， ^-3^^0(=0) Η 王物而製備。 Η

•ΝΗ-Ζ 式（1-1)化合物亦可在適當 L1A1H4’及適當的溶劑，例如四氫咳喃存:下例 由還原對應之式（彻衍生“㈣，其中在ϋ Ci-3烷基C(=〇)〇CV4烷基。 弋

▲式（1-1)化合物，其中R1代表羥基Ci 4烷 忒羥基C〗-4烷基位於吲哚部分之位置7,該^人 -a)表示，其亦可經由以適t的驗二 氧化鈉，及適當的溶劑，例如四氫呋喃，或風 如乙醇等，水解式（VI)中間產物而製備。 例 24 201038552

經由技術中已知的反應或官能基轉變，式⑴化 合物亦可被相互轉換。 經由在適當的溶劑中’例如醇，例如2_丙醇、 一乙醚、一異丙醚，與適當的酸反應，例如氫氯酸， 式⑴化合物亦可被轉換成醫藥上可接受性酸加成 键i 〇 一些中間產物及起始物質為已知化合物，且為 商業上可獲得或可根據技術中已知之製程製備。 一般而言，在適當的金屬催化劑存在下，例如 雷氏鎳（Raney Nickel)，於適當的溶劑存在下，例如 醇，例如曱醇或乙醇等；或含鉑之炭，在適當的催 化劑毒（catalyst poison)存在下，例如噻吩溶液及五 氧化叙’在適當的溶劑存在下，例如四氫咬喃，式 (Π)中間產物可經由氫化式（VII)中間產物而製備。

在適當的溶劑存在下，例如n，n-二甲亞碾，式 (VII)中間產物可經由反應式（VIII)中間產物與式 25 201038552 (IX)中間產物而製備，其中W2代表適當的離去基， 例如鹵原子，例如氯、溴、氟等。添加適當的鹼例 如，例如鹼金屬或鹼土金屬碳酸鹽或碳酸氫鹽或有 機鹼，例如N，N-二異丙基乙胺、三乙胺、碳酸鈉、 碳酸氫鈉、或碳酸鉀，可用於收取反應過程期間所 解離之酸。

在雷氏鎳及NH3存在下，在適當的溶劑存在下，例 如醇，例如甲醇等，式（VIII)中間產物可由相對應 之式（X)中間產物製備。 〜

(X) (VIII) 式（X)中間產物，其中R1代表羥基C,_4燒基， 例如-CH(OH)(CH3) ’該中間產物以式（χ_&)表示，| 可經由在適當的溶劑存在下，例如四氫咬喃，^ Ci^MgCl反應’由式（XI)中間產物製備。 、

(XI) (X-a) 相同的反應可用於製備其他另一經基c _ 土 1*4 燒^ 26 201038552 基。例如，其Ri代表/(OHXCH3)2之中間產物可由 對應之具有-C(=〇)-CH3的中間產物製備。 式（XI)中間產物可在適當的溶劑存在下，例如 N，N•二甲基曱醯胺，經由反應式（ΧΠ)中間產物盥 化鈉而製備。 一月

或者是，式（XI)中間產物亦可在戴斯-馬丁過碘 烧（Dess-Martin periodinane)及例如二氣曱烧之適當 溶劑存在下，經由氧化對應羥基類似物而製備。

(XI) 式（XII)中間產物可在適當的溶劑存在下，例如 Q 醇，例如乙醇’經由反應式（XIII)中間產物與CH3] 而製備。

(XIII) (χπ) 式（XIII)中間產物可在乙酸存在下，經由反應 式（XIV)中間產物與埃申莫瑟氏鹽類酸 (Eschenmosser’s salt acid)而製備。 27 201038552

式（XIV)中間產物可在適當的氧化劑存在下，例 如Mn〇2，在適當的溶劑存在下，例如二氯甲烷， 經由氧化對應之經基類似物而製備。 式（III)中間產物，其中Z為式（z_2)基，且R4 為羥基，該中間產物以式（III_a)表示，其可在適當 的溶劑存在下，例如醇，例如甲醇，經由以適當的 還原劑，例如NaBH4，還原式（III_b)中間產物而製 備。 式（III-a)中間產物可在適當的鹼，例如氫化 鈉，及適當的溶劑’例如四氫吱喃存在下，經由與 C!-4烷基碘化物反應’轉換成式（111_勾中間產物。可 在適當的溶劑存在下，例如二氯甲烧，經由與適當 的氧化劑反應，例如Mn〇2，氧化式（m_a)中間產物 而製備式（ΠΙ-b)中間產物。在適當的溶劑存在下， 例如四氫呋喃，式（m_b)中間產物可經由與Cl 4院 基MgCl反應，轉換成式（ΠΙ-d)中間產物。 28 201038552

(III-a)

OCu烷基 απ-c) Ο 式（III-a)中間產物亦可經由在曱醇/nh3之混人 物中攪拌式（XV)中間產物而製備。如果需要，^ (ΙΙΙ-a)中間產物可經由在乙酸酐與σ比咬之混合物中 攪拌’轉換成式（XV)中間產物。

中間產物（ΙΙΙ-a)之S-對映異構物（本文稱為式 (ΙΠ-a-l)中間產物），及式（xv)中間產物之R_對映異 構物（本文稱為式（XV-b)中間產物），可經由在適當 的溶劑中’例如乙酸乙烯酯，添加南極假絲酵母脂 肪酶 B(Lipase Candida Antartica B)至式（ΠΙ-a)中間 產物之外消旋混合物中而製備（詳見流程圖1)。當需 要時’式（XV-b)中間產物可經由在]yieOH/NH3中反 應’轉換成中間產物（ΙΠ-a)之R對映異構物，本文 稱為式（III-a-2)中間產物。 29 201038552 由外消旋混合物起始，此方法提供以ee>99% 及58%產率轉換一種對映異構物成為其之乙酸鹽， 且第二種對映異構物以ee〉99%及42%產率被分離。 對映異構物過量（ee)—詞為熟悉立體化學之人 所熟知。關於（+)及㈠對映異構物之混合物，以F(+) 及F(-)之莫耳或重量分率給予之組成物（其中 F(+)+F(-)=l)，對於F(*)之對映異構物過量定義為 F(+)-F(-)，且百分比對映異構物過量定義為 100*[F(+)-F ㈠]。 流程圖1

或者是，中間產物（m-a)之R-對映異構物（本文 稱為式（III-a-2)中間產物）及式（XV)中間產物之S-對 映異構物（本文稱為式（XV-a)中間產物）可經由在水 中，添加南極假絲酵母脂肪酶B至式（XV)中間產物 之外消旋混合物而製備（詳見流程圖2)。當需要時， 式（XV-a)中間產物可經由在MeOH/NH3中反應，轉 換成中間產物（ΠΙ-a-l)。 流程圖2

30 201038552 或者是，式（ΙΙΙ-a)中間產物亦可經由對掌性管 柱層析分離成其之對映異構物。 式（XV)中間產物可經由在乙酸酐酐攪掉式 (XVI)中間產物而製備。 工

Ο 式（XVI)中間產物’其中Wi為氯，本文稱為式 (XVI-a)中間產物’其之製備可經由添加氯化苯甲基 三乙基銨及氯化鈉至含式（XVII)中間產物之乙腈溶 液中，之後添加濃氫氯酸。

式（XVII)中間產物可經由添加發煙罐酸至硫酸 中’之後逐份添加6,7-二氫-5H-環戊[b]吡啶，1_氧 化物而製備。 Ο 式（IV)中間產物可根據上述關於式（^)中間產 物之反應規則而製備。 式（V)中間產物可在適當的酸，例如氫氣酸，及 適當的溶劑，例如乙腈存在下，經由去保護式（χνΙΙΙ) 中間產物而製備，其中Ρ代表適當的保護基，例如 -C(=0)-0-C(CH3)3。

• X P

(V) 31 (XVIII) 201038552 在反應-惰性溶劑，例如醇，例如甲醇、乙醇、 2-甲氧基-乙醇、丙醇、異丙醇丁醇等；醚，例如〖，心 =啐烷存在下，較佳地在適當的酸，例如丨、ι，|，_ 氧基雙丙燒等；酮，例如甲基戊酮；或n，n_ -曱基曱醯胺、硝基苯、乙腈等存在下，式（xvm) 中間產物可經由反應式（XIX)中間產物與式（HI)中 間產物而製備。添加適當的驗，例如驗金屬或驗土 金屬碳酸鹽或碳酸氫鹽或有機鹼，例如N，N_二異丙 基乙基細、二乙胺、碳酸納或碳酸鉀，可用於收取 反應過程間所解離之酸。添加少量適當的金屬碘化 物，例如碘化鈉或碘化鉀，以促進反應。攪拌可增 強反應速率。反應可便利地於室溫與反應混合物之 回流溫度間的溫度範圍進行，如果需要，反應可於

(XVIII) 增壓下進行。

P (XIX) (ΙΠ) 式（XIX)中間產物可根據上述關於式（11)中間產 物之反應規則而製備。 式（VI)中間產物可在適當的酸，例如三氟乙酸 及適當的溶劑，例如二氣曱烷存在下，經由反應式 (XX)中間產物而製備，其中P代表上述定義之適當 保護基，且 Ry 代表-Cm 烷基-0-Si(CH3)2C(CH3)3。 32 201038552

Ο 在反應-惰性溶劑，例如醇，例如Τ醇、乙醇、 氧基-乙醇、丙醇、異丙醇丁醇等；醚，例如1，4- 二畤烷存在下，較佳地在適當的酸，例如hci、^，_ 氧基雙丙貌等，·酮，例如4_甲基_2_戊嗣；或Ν，Ν_ 二f基甲醯胺、硕基苯、乙料存在下，式（χχ)令 間產物可經由反應式（ΧΧΙ)中間產物與式（m)中間 f物而製備。添加適當的驗，例如驗金屬或驗土金 屬奴，鹽或碳酸氫鹽或有機鹼，例如N，N-二異丙基 乙基胺、三乙胺、碳酸鈉或碳酸鉀，可用於收取反 應過程間所解離之酸。添加少量適當的金屬碘化 物’例如破化納或峨化鉀，讀進反應。攪拌可增 強反應速率。反應可便利地於室溫與反應混合物之 回流溫度間的溫度範圍進行，如果需要，反應可於 增壓下進行。

(XX) 在適w的催化劑，例如雷氏鎳，及適當的溶 d /列^醇，例如曱醇等存在下，式（χχι)中間產物 可經由氫化’由對應之式(XX酬基中間產物製備。 33 201038552

式（XXII)中間產物’其中p代表-cpopoTw 烷基，該中間產物以式（XXII-a)表示，其可在適當 的鹼’例如三乙胺’及適當的溶劑，例如4_(二曱基） 胺基吡啶存在下，經由反應式（XXIII)中間產物與二 -第三丁基二碳酸醋而製備。

式（XXIII)中間產物可在適當的鹼，例如碳酸氫 鈉，及適當的溶劑，例如N，N-二甲亞砜存在下，經 由反應式（XXIV)中間產物與式（IX) t間產物而製 備。

b (ΧΧΠΙ) 式（XXIV)中間產物可在適當的催化 ’例如f氏n，在適當的溶劑存在下 例如甲醇等，、經由反應式（xxv)+ j如醇 製備。 ’甲間產物與贿3, 34 201038552

式（XXV)中間產物可在適當的鹼，例如咪唑， 及適當的溶劑，例如四氫吱喃存在下，經由反應式 (XXVI)中間產物與第三丁基二曱基石夕烧基氯而製 備

CN 式（XXVI)中間產物可如上述關於式（XI)中間產 物所述製備。

本發明中式（I)化合物及一些中間產物可包含 不對稱碳原子。該化合物及該中間產物之純的立體 化學異構型式可經由應用技術中已知之製程獲 得，例如非鏡像異構物可經由物理方法分離，例如 選擇性結晶或層析技術，例如逆流分佈（counter current distribution)、液體層析等方法。對映異構物 可由外消旋混合物獲得，其首先經由以適當的解析 劑，例如對掌性酸，轉換該外消旋混合物成為非鏡 像異構鹽類或化合物之混合物；然後物理性分離該 非鏡像異構鹽類或化合物之混合物，例如選擇性結 晶、超臨界液體層析或層析技術，例如液體層析等 方法；且最後轉換該經分離的非鏡像異構鹽類或化 合物成為相對應之對映異構物。純的立體化學異構 35 201038552 型式亦可獲自適當的中間產物及起始物質之純的 立體化學異構型式，倘若巾間反應立體特異性地發 生。 医化合物，包括任何其立體化學異構型式、 其j藥上可接受性鹽類或其溶劑化物，因其增加 P53之表現而具有有用的藥理學特性，顯示有效的 抗增殖活性，顯示有效的抗腫瘤活性。 、如前所示，本發明化合物在C1所述之分析中 增加p53之表現，此增加可歸因於，但不限於一或 多種下列作用機制： _與上游或下游標靶之相互作用，例如包含於泛素 化作用（ubiquitination)或SUMO修飾之激酶、或 酵素活性， _ p53蛋白質之直接或間接安定化作用，例如經由 保持其在其之機能性結構形式，或經由防止錯誤 摺疊， 、 _增強p53表現或p53家族成員之表現，例如p63 及 p73， -增加p53活性，例如經由（但不限於）增強其之轉 錄活性，及/或 _增加P53-發信路徑之基因及蛋白質的表現，例如 (但不限於）p21wafl、Cipi、MIC-1(GDF-15)、 PIG-3、Bax、Puma、Noxa、及 ATF-3 〇 因此，本發明揭示式⑴化合物使用作為藥劑， 特別是用於治療癌症或相關疾病，用於抑制腫瘤生 長，用於增加p53之表現。 36 201038552 此外，本發明亦涉及化合物於製造藥劑上之用 返"亥藥劑用於治療經由p53之降低表現所調控之 疾病，特別是用於治療癌症，其中該化合物為式（1) 化合物。 本文中所使用之“治療”一詞涵蓋動物t，特別 疋人類的疾病及/或症狀之任何治療，且包括：⑴ 預防病患所發生之疾病及/或症狀，該病患可能感染

疾病及/或症狀但尚未被診斷出來；（ii)抑制疾病及/ 或症狀，即阻止其發展；（出)緩解疾病及/或症狀， 即引起疾病及/或症狀之逆行。 立t關於“經由P53之降低表現所調控之疾病，，一詞 忍指可經由細胞凋零、誘導細胞死亡、或調節細胞 循環而被阻止發展、被缓解或被引起逆行的任何非 所欲或有害之症狀。 本發明亦提供治療經由p53之降低表現所調控 之疾病的方法，特別是治療癌症，其經由投與有效 量之本發明化合物於所需此治療之病患，例如哺乳 動物（且更具體為人類）。 本發明化合物對於腫瘤細胞可具有抗增殖作 用’即使此細胞缺乏機能性p53。更特別是，本發 明化合物對於具有廣泛型式或突變p53之腫瘤及/ 或對於過度表現MDM2之腫瘤，可具有抗增殖作 用。化合物可影響血管生成作用、腫瘤細胞遷移、 侵入或轉移。 因此，本發明亦提供一種抑制腫瘤生長之方 法，其經由投與有效量之本發明化合物於所需此治 37 201038552 療之病患，例如哺乳動物（且更具體而言為人類）。 腫瘤之實例包括可被本發明化合物抑制之成 人及小兒惡性腫瘤，包括但不限於肺癌，包括小細 胞肺癌及非小細胞肺癌（例如腺癌）、胰臟癌、結腸 癌（例如結腸直腸癌，例如結腸腺癌及結腸腺瘤）、 食道癌、口腔鱗狀細胞癌、舌癌、胃癌、肝癌、菖 咽癌，淋巴系統之造血性腫瘤（例如急性淋巴細^ 白血病、B細胞淋巴瘤、伯奇（Burkitt)s淋巴瘤）、 非霍奇金（non-Hodgkin)氏淋巴瘤（例如外套細胞淋 巴瘤）、霍奇金氏症、顆粒性白血病（例如急性骨 腾性白血病（AML)或慢性粒細胞白血病（CN；L))、 急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病 (CLL )、甲狀腺濾泡癌、骨髓增生異常徵候群 (MDS )，間質起緣性腫瘤、軟組織肉瘤、脂肪肉 瘤、胃腸道基質肉瘤、惡性週邊神經鞘腫瘤 (MPNST)、尤英（Ewing)肉瘤、平滑肌肉瘤、間質 軟骨肉瘤、淋巴肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、黑 色素瘤、畸胎瘤、神經母細胞瘤、腦腫瘤、骨髓母 細胞瘤、神經膠質瘤、良性皮膚腫瘤（例如角化）、 乳房癌（例如後期乳腺癌）、腎臟癌、腎母細胞瘤、 卵巢癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膀胱癌、前列腺 癌，包括後期疾病和激素耐性前列腺癌、睾丸癌、 骨肉瘤、頭頸部癌症、表皮細胞癌、多發性骨髓瘤 (例如耐性多發性骨髓瘤）、間皮瘤。特別是可以 本發明化合物治療之癌症為乳癌、結腸癌、非小細 胞肺癌、急性骨髓細胞白血病（AML· )。 38 201038552 本發明化合物亦可用於治療及預防炎症性症 狀。 因此，本發明亦提供一種治療及預防炎症性症 狀之方法，其經由投與有效量之本發明化合物於所 需此治療之病患，例如哺乳動物（且更具體而言為人 類）。 本發明化合物亦可用於治療自體免疫疾病及 症狀。關於“自體免疫疾病”一詞意指動物的免疫系 統對於自己之抗原產生不利反應的任何疾病。關於 “自己之抗原”一詞意指通常發現於動物體之任何抗 原。代表性之自體免疫疾病包括，但不限於：橋本 (Hashimoto)曱狀腺炎、葛瑞夫（Grave)氏症、多發性 硬化症、惡性貧血，艾迪生（Addison)氏症、胰島素 依賴型糖尿病、類風濕關節炎、全身性紅斑狼瘡 (SLE或狼瘡）、皮肌炎、克隆（Crohn)氏症、韋格 納（Wegener)氏肉芽腫，抗腎小球基膜症、抗鱗脂徵 候群、25皰疹性皮炎、過敏性腦脊髓炎、腎小球腎 炎、膜性腎小球腎炎、古德帕斯丘（Goodpasture)氏 徵候群、藍伯特伊頓（Lambert-Eaton)徵候群、肌無 力徵候群、重症肌無力症、水大皰性天孢瘡樣病、 多内分泌腺疾病（Polyendocrinopathies)、賴特 (Reiter)氏症，和僵人（Stiff-Man)徵候群。 因此，本發明亦提供一種治療自體免疫疾病及 症狀之方法，其經由投與有效量之本發明化合物於 所需此治療之病患，例如哺乳動物（且更具體而言為 人類）。 39 201038552 本發明化合物亦可用於治療 錯誤槽叠之蛋白質相關疾病。 不文疋或 的實安定或錯誤指疊之蛋白質相關疾病 的貫例包括，但不限於：囊性纖維變性（cf 馬凡⑽rfan)氏徵候群（微纖維蛋白）、 =;=漿=7酸去_合 ^ 型原膠原Pro-α )、庫傑 (=mZfddt-jakob)二氏症（病原性蛋白顆粒）、阿 錄海默(Alzheimer)氏症（p選粉樣蛋白）、家族 粉樣變性（溶菌酶）、白内障（晶狀體）、家族性高 f固醇血症（LDL受體）、A抗胰蛋㈣缺乏症、 泰·薩（Tay_Sachs^氏症（ρ·己糖胺酶）、色素 網膜炎（視紫紅質）和矮妖症（leprechaunism)(騰 島素受體）。 因此，本發明亦提供一種治療與構造不安定或 錯誤摺疊之蛋白質相關疾病之方法，1經由 效量之本發明化合物於所需此治療之病患，例2哺 乳動物（且更具體而言為人類）。 、有鑒於其有用之醫藥特性，目標化合物可被調 配成各種用於投與目的之醫藥型式。 為了製備本發明醫藥組成物，作為活性成分之 有效1的本發明化合物與醫藥上可接受載劑充分 混合而組合，該載劑可根據所欲投與之製備型式廣 泛變化取用。這些醫藥組成物合於適當的單一劑 型，較佳地用於經口、直腸、經皮膚投與、或經由 201038552 非經腸胃這注射。例如在製備口服劑型組成物，在 :服液體製劑情況下，例如懸浮液、糖漿、酏劑及 广液，可使用任何通常之醫藥媒劑，例如水、二醇 ，主油類、醇類等；或在粉末、丸劑、膠囊、及錠 M b况下，固體載劑，例如殿粉、糖類、高嶺土、 潤滑劑、黏結劑、崩解劑等。

时因為易於投與，固錠劑及膠囊代表最有利之口 服早位劑型，在此情況，固體醫藥載劑顯著地被使 用關於非經腸胃道組成物，載劑通常將包含無菌 =(至少大部分），然而可包括其他成分(例如幫助溶 、、，如可製備注射溶液，其中載劑包含食鹽水溶 液、葡萄糖溶液、或食鹽水與葡萄糖之混合物溶 :二=備注射懸浮液’在此情況’可使用適當的 液體載劑、懸浮劑等。在適於經皮膚投盥之 $ ’載劑任意地包含滲透增強劑及/或適當的渴潤 :意地以較少比例合併適當的任何種類添加 =，該添加騎於皮膚並^引起明顯的有害作用。 劑：易於投與皮膚及/或可有助於製備所欲 、、且成物，這些組成物可以不同方式投盥，^ _ 滲透貼布、滴劑、軟膏。列如皮膚 軟貧其特別有利於調配上述醫 樂、、且成物於易於投與之單位劑型及劑量之均 二：於本文說明書及申請專利範圍中之單位劑型 理=之單位，適於作為單一劑量，$ 分：二頁：醫'之恭預計產生所欲治療效果的活性成 ΐ樂载劑。各單位劑型之實例為旋劑（包 括加截痕或財錠）、㈣、域、粉末包裝 41 201038552 =射溶液觸浮液、茶匙、湯匙等，及其分離之倍 /寺別有利於調配上述醫藥組成物於易於投愈 =1?量之均勻度。用於本文說明書及申、 :，適於作為單-劑量，各單位包含預定量 產生所欲治療效果的活性成分與所需之醫華載 劑。各單位劑型之實例為锭劑樂載 W、膠囊、丸劑、粉末包裝、粉片、注射溶液或懸 汙液、命廷、％匙等，及其分離之倍數。 =明:匕合物被投與之量足以引起細胞瑪 零、引起細胞死亡、或調節細胞周期。 因此，本發明化合物被投與之量足以增加p53 之表現、或發揮其抗腫瘤活性。 熟悉技術者可由T文之測試結果而易於決定 有，量。一般而言’需考量的是治療上有效量為 0/05毫克/公斤體重至i 〇〇毫克/公斤體重，且特別 疋0.005毫克/公斤體重至10毫克/公斤體重。盆可 適當的於一整天適當間隔投與所需劑量，如單二、 二、三、四或多個次劑量。該次劑量可調配成單位 劑型，例如每單位劑型包含0 5至500毫 是！毫克至毫克，更特別是1〇毫克至遍毫 克之活性成分。 根據投與方法，醫藥組成物較佳地將包含〇 〇5 至^9重量％之本發明化合物，更佳地由〇」至7〇 重量％，甚佳地由0.1至50重量％，及！至99 95 42 201038552 重量％之醫藥上可接受載劑、更佳地由30至99.9 重量％，甚佳地由50至99.9重量％，所有百分比基 於組成物之總重。 關於本發明其他方面，有設想到本發明化合物 與其他抗癌劑之組合物，尤其是使用作為藥劑’更 明確而言，於治療癌症或相關疾病。 關於治療上述症狀，本發明化合物可有利的被 使用於組合一或多種其他藥劑，更明確而言，在癌 0 症治療上組合其他抗癌劑或佐劑，抗癌劑或佐劑之 實例（治療中之支持劑）包括，但不限於： -鈾配位化合物，例如順銘（cisplatin)任意地結合氨 填汀（amifostine)，卡始（carboplatin)或奥沙利I白 (oxaliplatin)； -紫杉烧類（taxane)化合物，例如太平洋紫杉醇 (paclitaxel)，太平洋紫杉醇蛋白質結合粒子 (Abraxane™)或多西紫杉醇（docetaxel); ❹ -拓撲異構酶I(topoisomerase I)抑製劑，例如喜樹 鹼（camptothecin)化合物，例如依立替康 (irinotecan)、SN-38、拓撲替康（topotecan)、鹽酸 拓撲替康； -拓撲異構酶II抑製劑，例如抗腫瘤表鬼臼毒素類 (epipodophyllotoxins) 或鬼 臼毒素 (podophyllotoxin)衍生物，例如依托泊普 (etoposide)、依托泊苦碟酸鹽或替尼泊 (teniposide)； -抗腫瘤長春花生物驗類（vinca alkaloids)，例如長 43 201038552 春驗（vinblastine)、長春新驗（vincristin)、或長春 瑞賓（vinorelbine)。 -抗腫瘤核普衍生物，例如 5-氟尿哺咬 (5-fluorouracil)、亞葉酸（leucovorin)、吉西他濱 (gemcitabine)、鹽酸吉西他濱、卡培他濱 (capecitabine)、克拉屈濱（cladribine)、氟達拉濱 (fludarabine)、奈拉濱（nelarabine); -烧化劑，例如氮界（nitrogen mustard)或亞硝基脲 (nitrosourea)，例如環填酸胺（cyclophosphamide)、 苯丁酸氮芥（chlorambucil)、 卡莫司、;丁 (carmustine)、0塞替 π底（thiotepa)，馬法蘭 mephalan (mephalan ; melphalan)、洛莫司汀（lomustine)、 六曱蜜胺（altretamine)、白消安（busulfan)、達卡巴 0秦（dacarbazine)、滩莫司、;丁（estramustine)、異環磷 酿胺（ifosfamide)任意地結合美斯納（mesna)、α底泊 漠烧（pipobroman)、卡巴肼（procarbazine)、鏈脲菌 素（streptozocin)、替莫唾胺（telozolomide)、尿 °密 咬（uracil); -抗腫瘤蒽環類（anthracycline)衍生物，例如柔紅黴 素（daunorubicin)、多柔比星（doxorubicin)任意地 結合右雷佐生（dexrazoxane)、doxil®、依達比星 (idarubicin)、米托蒽酿（mitoxantrone)、表阿黴素 (epirubicin)、鹽酸表阿黴素、戊柔比星 (valrubicin)； -以IGF-1受體為標靶之分子，例如足葉苦素 (picropodophilin)； 44 201038552 -替曲卡星（tetracarcin)衍生物，例如替曲卡星a ; _糖皮質素’例如強體松（prednisone); -抗體，例如曲妥珠單抗（HER2抗體）、美羅華 (rituximab) ( CD20抗體）、吉妥單抗 (gemtuzumab)、吉姆單抗奥唑米星（gemtuzumab ozogamicin)、西妥昔單抗（cetuximab)、怕妥珠 (pertuzumab)、貝伐珠單抗（bevaeizumab)、阿來珠 單抗（alemtuzumab)’ 衣庫珠單抗（ecuiizurnab)、替 ❹ 伊莫單抗（ibritumomab tiuxetan)，疏諾莫单抗 (nofetumomab)、帕尼單抗（Panitumumab)、托西莫 單抗（tositumomab)、CNTO 328 ; -雌激素受體拮抗劑或選擇性雌激素受體調控劑或 雌激素合成抑制劑，例如它莫西芬（tamoxifen)、 氟維司群（fulvestrant)、托瑞米芬（toremifene)、屈 洛昔芬（droloxifene)、faslodex®、雷洛昔芬 (raloxifene)、或來曲唾（letrozole); q -芳香酶（aromatase)抑制劑，例如依西美坦 (exemestane)、阿那曲唾（anastrozole)、來曲 β坐、 睪内酯（testolactone)、和伏氯唾（vorozole); -分化劑（differentiating agent)，例如類視色素 (retinoid)、維生素D、或視黃酸和視黃酸代謝阻 斷劑（RAMBA)，例如 accutane® ; -DNA 曱基轉移酶抑制劑，例如氮雜胞苷 (azacytidine)或地西他濱（decitabine); -抗葉酸劑，例如培美曲塞二鈉（premetrexed disodium)； 45 201038552 -抗生素，例如放線菌素D(antinomycin D)、博萊 徽素（bleomycin)、絲裂黴素 C(mitomycin C)、放 線菌素、洋紅黴素（carminomycin)、柔紅黴素 (daunomycin)、左旋 °米 β坐（levamisole)、普卡黴素 (plicamycin)、光神黴素（mithramycin); -抗代謝劑，例如克羅拉濱（clofarabine)、胺基蝶吟 (aminopterin)、阿糖胞皆（cytosine arabinoside)或 曱氨蝶吟（methotrexate)、阿扎胞苷（azacitidine)、 阿糖胞苷（cytarabine)、氟脲苷（Hoxuridine)、喷司 他丁（pentostatin)、硫鳥 0票吟（thioguanine); -細胞调零誘導劑和抗jk管生成劑，例如Bel - 2抑 製劑，例如YC 137、BH 312、ABT 737、棉子酚 (gossypol) ’ HA 14-1、TW 37 或癸酸； -微管蛋白-結合劑，例如卡貝塔汀（combrestatin)、 秋水仙素或諾考達唾（nocodazole); -激酶抑制劑（例如EGFR (上皮生長因子受體）抑 制劑、MTKI (多標靶激酶抑制劑）、mTOR抑製 劑），例如夫拉平度（flavoperidol)、甲續酸伊馬替 尼（imatinib mesylate)、埃羅替尼（erlotinib)、吉非 替尼（gefitinib)、達沙替尼（dasatinib)、拉帕替尼 (lapatinib)、二曱苯石黃酸拉帕替尼（lapatinib ditosylate)、索拉非尼（sorafenib)、舒尼替尼 (sunitinib)、馬來酸舒尼替尼（sunitinib maleate)、 西羅莫斯（temsirolimus); -法尼基轉移酶抑制劑，例如替吼法尼（tipifarnib); -組蛋白去乙醯化酶（HDAC)抑制劑，例如丁酸鈉、 46 201038552 辛二醯苯胺異羥肟酸（SAHA )、縮酚酸肽 (depsipeptide) ( FR 901228 ) > NVP-LAQ824 ' R306465、JNJ-26481585、曲古菌素 A(trichostatin A)，伏立諾他（vorinostat); -泛素-蛋白酶體路徑抑制劑，例如PS-341、MLN 0.41 或硼替佐米（bortezomib); -Yondelis® ; -端粒末端轉移酶（Telomerase)抑制劑，例如端粒塔 iT (telomestatin)； -基質金屬蛋白酶抑制劑，例如巴馬司他 (batimastat)、立馬司他（marimastat)、匹諾司他 (prinostat)或美他司他（metastat); -重組介白素，例如阿地介白素（aldesleukin)、地尼 介白素（denileukin diftitox)、干擾素a2a、干擾素 ot 2b、聚乙二醇干擾素a 2b。 -MAPK抑制劑 -類視色素，例如9順維曱酸(Alitretinoin)、搭薩羅 丁（bexarotene)、維生素 A 酸（tretinoin)。 -三氧化二砷 -天門冬醢胺酶 -類固醇，例如屈他雄酮丙酸醋（dromostanolone propionate)、乙酸曱地孕酮（megestrol acetate)、諾 龍（nandrolone)(癸酸，苯丙酸），地塞米松 (dexamethasone)。 -促性腺激素釋放荷爾蒙激動劑或拮抗劑，例如阿 巴瑞克（abarelix)、乙酸戈舍瑞林（goserelin 47 201038552 acetate)、乙酸組胺瑞林（histrelin acetate)、乙酸亮 丙瑞林（leuprolide acetate)。 -沙利竇邁（Thalidomide)、來那度胺（lenalidomide)。 -疏基 β票吟（Mercaptopurine)、米托坦（mitotane)、帕 米德諾内（pamidronate)、培加酶（pegademase)、培 門冬酶（pegaspargase)、拉布立酶（rasburicase)。 • BH3結構類似物，例如ABT-737。 -MEK 抑制劑，例如 PD98059、AZD6244、CI-1040。 -集落刺激因子類似物，例如非格司亭 Λ (filgrastim)、培非司亭（pegfilgrastim)、沙格司亭 (sargramostim);其之促紅細胞生成素或類似物 (例如達貝泊、汀a(darbepoetin alfa));介白素11 ; 奥普瑞白介素（oprelvekin)、〇坐來填酸 (Zoledronate)、嗤來構酸（zoledronic acid);芬太尼 (fentanyl);雙膦酸鹽；帕里伏明（palifermin)。 -類固醇細胞色素P450 17α-羥基酶-17,20-解離酶 抑製劑（CYP17 )，例如阿比特龍（abiraterone)。 如上所述，本發明化合物在對於放射療法及化 學療法感光之腫瘤細胞上亦具有治療之應用。 因此，本發明化合物可使用作為“輕射敏化劑” 及/或“化學敏化劑”或可與“輻射敏化劑”及/或“化學 敏化劑”合併給予。 本文所使用之“輻射敏化劑”一詞定義為一種分 子，較佳地為一種低分子量分子，投與動物治療上 有效量，以增加細胞對於離子化輻射的敏感度，及 /或促進可以離子化輻射治療之疾病的治療。 48 201038552 本文所使用之“化學敏化劑”一詞定義為一種分 子，較佳地為一種低分子量分子，投與動物治療上 有效量，以增加細胞對於化學療法的敏感度，及/ 或促進可以化學療法之疾病的治療。 對於輻射敏化劑作用模式之數種機制在文獻 中已被建議，包括：細胞低氧射線輻射敏化劑（例如 2-硝基咪唑化合物、及苯并三畊二氧化物化合物） 仿效氧氣或或者是在低氧下表現類似生物還原 劑；非細胞低氧輻射敏化劑（例如鹵化°密咬）可為 DNA鹼基之類似物，且優先地併入癌症細胞之 DNA，因此促進輻射誘導破壞DNA分子，及/或避 免正常DNA修復機制；且在治療疾病中，對於輻 射敏化劑的各種其他作用之潛在機制已被假設。 現在許多癌症治療規則使用輻射敏化劑結合X 射線輻射，X射線活性化輻射敏化劑之實例包括， 但不限於下列：甲硝嗤（metronidazole)、米索石肖嗤 (misonidazole)、 去甲 基米索石肖0坐 (desmethylmisonidazole) 、 派 莫 石肖 嗤 (pimonidazole)、依他石肖哇（etanidazole)、尼莫拉唾 (nimorazole)、絲裂黴素 C(mitomycin C)、RSU 1069、SR 4233、E09、RB 6145、菸鹼醯胺 (nicotinamide) 、 5-漠去 氧尿普 (5-bromodeoxyuridine ; BUdR)、5-破去氧尿苷 (5-iododeoxyuridine ; IUdR )、漠去氧胞苷 (bromodeoxycytidine)、 氣去 氧尿苦 (fluorodeoxyuridine ; FudR)、經基腺、順始和其 49 201038552 治療上有效的類似物和衍生物。 癌症之光動力療法（Photodynamic therapy ; PDT) 使用可見光作為敏化劑之輻射活化劑。光動力輻射 敏化劑之實例包括，但不限於下列：血卟啉 (hematoporphyrin)衍生物、Photofrin®(福得靈®)， 苯并卟琳（benzoporphyrin)衍生物、錫初冬卟淋（tin etioporphyrin)、脫鎮葉綠酸-a (pheoborbide-a)、細 菌葉綠素-a (bacteriochlorophyll-a)、萘敌菁 (naphthalocyanines)、敌菁（phthalocyanines)、酿菁 鋅、和其治療上有效的類似物和衍生物。 輻射敏化劑可結合治療上有效量之一或多種 其他化合物投與，包括，但不限於：促進輻射敏化 劑併入標乾細胞之化合物；控制療法流程、營養 物、及/或氧至標靶細胞程之化合物；具有或不具附 加輻射之作用在腫瘤的化學治療藥劑；或其他對於 治療癌症或其他疾病治療上有效之化合物。 化學敏化劑可結合治療上有效量之一或多種 其他化合物投與，包括，但不限於：促進化學敏化 劑併入標乾細胞之化合物；控制療法流程、營養 物、及/或氧至標靶細胞程之化合物；作用在腫瘤的 化學治療藥劑或其他對於治療癌症或其他疾病治 療上有效之化合物。妈拮抗劑’例如维拉帕米 (verapamil)，被發現有用於組合抗腫瘤劑，以建立 對於所受化學治療藥劑有抗性之腫瘤細胞的化學 敏感性，並實現此化合物在藥劑-敏感性惡疾的效 力。 50 201038552 八鑑於其有用之藥理性質，本發明組合物之成 :久』田或夕種其他藥劑及本發明化合物可被調配 成ί種用於投與目的之醫藥型式。成份可分別被調 配成個別醫藥組成物或包含所有成分之單-醫^ 組成物。 干酋锻 因此本發明亦關於—種醫藥組成物，其包含一 或多種其他藥劑及本發明化合物與醫藥载劑。

:發明進一步關於本發明組合物在製造用於 抑制腫瘤細胞生長之醫藥組成物上之用途。 本發明進一步關於—種包含作為第一活性成 刀之本發明化合物及作為其他活性成分之一或多 種t癌劑的產品，作為在治療罹患癌症之病患時， 同日^·、分離或連續使用之一種組合製劑。 一或多種其他藥劑及本發明化合物可同時投 與（例如於分離或單-組成物），或以任何順序連續 投與。，在後者之情況’二種或多種化合物將在一期 門内並以足以確保達成有益或協同效果之數量及 方法技與。將可察知’較佳的方法及投與順序及個 別劑量及對於組合物各成份之攝生法將依據欲投 與之特^的其他藥劑及本發明化合物、其之投與路 徑、欲治療之特定腫瘤及欲治療之特定宿主。最理 想的投與方法及順序及劑量及攝生法可經由熟悉 技術者使用習知方法而易於決^，並可見於本文開 始之資料。 虽以組合物給予時，本發明化合物與一或多種 其他抗癌劑之重量比可經由熟悉技術者決定。該比 51 201038552 例及確切的劑量及投與頻率依據所使用之特定本 發明化合物及其他抗癌劑、欲治療之特定症狀、欲 治療之特定病患的症狀嚴重性、年齡、體重、性別、 飲食、投與時間及一般生理狀況、投與方式及個體 可攝取之其他藥劑，如熟悉技術者所熟知。此外， 顯然地，有效之每日藥量可依據授治療之病患的反 應及/或依據指定本發明化合物之醫師評估而減少 或增加。本式（I)化合物及其他抗癌劑之特定之重量 比可在1/10至1〇/1之範圍，更特別是1/5至5/1， 更特別是1/3至3/1。 鉑配位化合物有利地以體表面積每平方米】^ 5〇〇、笔2克（毫克/米2)之劑量投與，例如5〇至4〇〇毫 克/:米2 ’特別是，每-療程順翻的劑量約乃毫克 米，而卡翻約300毫克/米2。 紫杉烷類化合物有利地以體表面積每平方求 50至一 4〇〇笔克（毫克/米2)之劑量投與，例如乃至 二〇曰：克/米2，特別是，每一療程太平洋紫杉醇的 =Π5'250毫克/米2,而多西紫杉醇約75 至150宅克/米2。 吾樹鹼化合物有利地以體表面積每平方米】至 彻毫克（毫克/米2)之劑量投與，例如 /米2，特別是，每一瘆鞀价Λ枯Α 笔兄 黡耘依立替康的劑量約100至 35〇笔克/米，❼拓撲替康約！至2毫克/米2。 =瘤鬼臼毒素衍生物有利地以體表 平方米30至300臺吞± , 2 2克耄克米）之劑量投與，例如 米，特別是，每一療程依托泊苷的 52 201038552 劑里約35至100毫克/米2，而替尼泊約5〇至250 毫克/米2。 抗腫瘤長春彳匕生物驗類有利地以體表面積每 平方米2至30毫克（毫克/米2)之劑量投與，例如％ 至250毫克/米2，特別是，每一療程長春鹼的劑量 約3至12毫克/米2’長春新驗的劑量約^至]毫克 /米，而長春瑞賓的劑量約1〇至3〇亳克/米2。 ❹ 〇 抗腫瘤核苷衍生物有利地以體表面積每平方 米200至山2500毫克（毫克/米2)之劑量投與，例如700 至1500笔克/米2，特別是，每一療程Mu的劑量 =⑻Μ00毫克/米2,吉西他濱約_至12〇〇 笔克未，而卡培他濱約1000至2500毫克/米2。 面穑例如虱芬或亞硝基脲’有利地以體表 ^積母平方米100至毫克（毫克/米2)之劑量投 如120至200毫克/米2，特別是，每一療程 %磷醯胺的劑量約10 縻枉 界的劑量約0.1JL02真// ί克/未’苯丁酸氮 約150至200毫券/丰2毛克么斤，卡莫司㈣劑量 至150亳克/米2。 ” ，而洛莫司汀的劑量約1⑼ 抗腫瘤葱環類衍生物有 方米至75毫克(毫克/米2)=^:二 至6〇毫克/米2，特別β /之心技與’例如15 約4〇至75古古^疋，母—療程多柔比星的劑量 毫克/公斤，而^卡’柔紅徵素的劑量约25至45 抗雖激专劍達比星的劑量約10至15亳克/米2。 利地每日以i、至^特疋藥劑及欲治療之症狀，有 〇〇耄克之劑量投與。它莫西芬有 53 201038552 Π至50毫克之劑量σ 維持治療效果。二 療效果。阿那曲唾有二 次二 SC it依西美坦有利地以每曰-次約心ί 口： 抗體^地以體表面積每平方 (毫克/米）之劑量投與，或如果不同，則如枯^ 所知者。群司玦簞+ 則如技術中 程體矣二i _mab)有利地以每-療 耘體表面積母平方㈣丨至 = 量投與，特別是，約2至4毫克^克^ )之劑 這些劑量可例如以每—療程—次、二 投與二其可被分離’例如每7、14、21或2;曰。-人 “式⑴化合物、醫藥上可接受加成鹽，特別 樂上可接受酸加成鹽、及其立體異構型式可呈 =斷性質，因為其可用於悄測或確認標示化合 物與其他分子、胜肽、蛋白質 合物之形成。 酵素或X體之間複 偵測或確認方法可使用以例如放射線同位 素、酵素、螢光物質、發光物質等標示劑標示之化 合物。放射線同位素之實例包括uq、mi、3h及 〗4C。酵素一般製作係經由連接適當的基質，之後催 化可偵測反應而可被偵測。其之實例包括例如卜半 54 201038552 乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、鹼金屬磷酸酶、過氧化 酶和蘋果酸去氫酶，較佳為辣根過氧化酶 (horseradish peroxidase)。發光物質包括例如發光胺 (luminol)、發光胺衍生物、螢光素、水母素（aequorin) 和螢光素酶。 生物樣本可被定義為體組織或體液。體液之實 例為腦脊聽液、血液、血漿·、血清、尿液、痰、唾 液等。 【實施方式】 下列實施例說明本發明。 實驗部分 下文中，“DMF”定義為二曱基曱醯胺， “DCM”定義為二氯曱烷，“DIPE”定義為二異丙基 醚，‘DMSO’定義為二曱亞砜，“EtOAc”定義為乙酸 乙酯，“EtOH”定義為乙醇，‘‘MeOH’’定義為曱醇， 及“THF”定義為四氫呋喃。 A.中間產物化合物之製備 實施例A1 a)中間產物1之製備

0 將氧化錳（33.31克，13當量，0.3832莫耳）逐 份添加至含4-氣-6,7-二氫環戊[b]吡啶-7-醇（中 間產物 3) [CAS 126053-15-4](5 克，1 當量，0.029 莫耳）之DCM (50毫升）溶液中，將混合物於室溫攪 55 201038552 拌24小時，然後在塞里塑料（celite)上過濾，將溶 劑蒸發，產生3.25克（66%)之中間產物1。 b)中間產物2之製備

於-5至0°C，在N2流下，將氯化曱基鎂（1.47 毫升，3.2當量，0.0.004莫耳）逐滴添加至含中間產 物1(0.220克，1當量，0.0013莫耳）之THF(4毫升） 溶液，反應於室溫攪拌1.5小時。 於0-10°C，添加氯化銨（10%於水中）及EtOAc， 混合物以EtOAc萃取三次，然後分離有機層，在 MgS04上乾燥，過濾並將溶劑蒸發。殘餘物（0.215 克）以管柱層析在矽凝膠上純化（洗提液：環己烷 /EtOAc 50/50)。收集純的濾份並將溶劑蒸發，產生 0.120克（50%)之中間產物2。 實施例A2 a)中間產物3之製備

將四氫硼酸鈉（1.92克，50.67毫莫耳）於5°C逐 份添加至含中間產物1(7.72克，46.06毫莫耳）之 MeOH(80毫升）溶液中，反應混合物於室溫攪拌1 晚，然後倒入水中。混合物以EtOAc萃取三次，有 機層以水及NaCl溶液洗務，分離，在MgS〇4上乾 燥，過濾並將溶劑蒸發，產生6.38克（81.7%)之中 56 201038552 間產物3(50/50混合物RS)。此產物不再純化而於下 一步驟中使用。 b)中間產物4之製備

0— 在0°C及N2氣壓下，將氫化納（1.06克，44.22 毫莫耳）逐份添加至含中間產物3(3.00克，17.70毫 莫耳）之THF(無水，30毫升）溶液中，反應於0°C Ο 攪拌15分鐘，然後於0°C，將碘甲烷（1.65毫升， 26.53毫莫耳）逐滴添加至混合物中。反應於室溫攪 拌1晚，冷卻混合物至室溫，並逐滴添加冷水。攪 拌混合物1小時，然後以EtOAc萃取三次。分離有 機層，在MgS04上乾燥，過濾並將溶劑蒸發，產生 3.10克（95.4%)之中間產物4。此產物不再純化而於 下一步驟中使用。 實施例A3 〇 a)中間產物5之製備

將含1丑-吲哚-7-羧酸甲酯（0.091莫耳）、埃申莫 澤爾鹽（£5(：1^11111〇561''5 3310(0.1莫耳）之乙酸（300 毫 升）於65°C加熱2小時，過濾出沉澱物，溶於DCM 及碳酸鉀10%，添加碳酸鉀（固體），並將混合物於 室溫攪拌1小時，然後萃取。分離有機層，在MgS04 57 201038552 10克令間產物5。 上乾耜，過濾並將溶劑蒸發，產生 b)中間產物6之製備

將含中間產物5(0·043莫耳）、磁甲烧(〇 〇47莫 :)之扮0即〇〇毫升)於室溫授摔隔夜，過遽出沉殿 ，並乾燥，產生8.3克之中間產物6。 c)中間產物7之製備 將含中間產物6(0.023莫耳）、氰化鈉（〇 〇3莫耳) 之DMF(l〇〇宅升）於110〇c加熱2小時。將反應混 合物倒入冰水中，攪拌1小時。過濾出沉澱物，並 於DCM中收取。萃取溶液，分離有機層，在MgS〇4 上乾燥，過濾並蒸發，產生51克之中間產物7。 d)中間產物8之製備

Ho^yx 於5 C，N2流下，將氯化甲基鎂（〇 〇58莫耳） 逐滴添加至含中間產物7(〇.〇 18莫耳）之thF(50毫 升）溶液中，反應混合物於5。C攪拌1小時。於5。C 逐滴添加氣化銨1 〇%，反應混合物以Et〇Ac萃取。 分離有機層，在MgS〇4上乾燥，過濾並蒸發，產生 4克之中間產物8。 58 201038552 e)中間產物9之製備

將含中間產物8(0.019莫耳）、雷氏鎳（4克）之 MeOH/NH3 (50毫升）於室溫在3巴壓力下氫化2小 時，將反應混合物在塞里塑料上過濾’以DCM洗 滌，並將遽液蒸發，產生3.5克之中間產物9。

0 f)中間產物10之製備 將含中間產物9(0.016莫耳）、2_氟_5_硝基曱苯 (0.018莫耳）、碳酸一鈉陰離子（〇 〇19莫耳）之 DMSOUOO毫升）混合物於6(rc加熱隔夜，混合物 冷卻至室溫。添加冰水，添加DCM。萃取反應混合 物，分離有機層，在MgS04上乾燥，過濾並濃縮。 殘餘物以管柱層析在矽凝膠上純化（洗提液：環己烷 /EtOAc 60/40)，收集純的濾份，並將溶劑蒸發，產 生2.8克之中間產物1〇。 g)中間產物11之製備

將含中間產物1〇(〇.〇079莫耳）、氧化釩（〇〇5 克）、噻吩（4%)之DIPE (1毫升）溶液、Pt/C 5% (1 3 克）之THF (50毫升）於大氣壓力下於室溫氫化1 59 201038552 晚。過濾反應，並將溶劑蒸發，產生中間產物i j 此產物不再純化而於下一步驟中使用。 產物根據方法A3 ------ ------· - Η /^-ΟΗ 一·· — _^ * ρ - 中間產物No. 44 中間產物No.45 ' OH H HdV- 中間產物No.46 —--- -， '----- 中間產物No.47 ~ ΤΥ --— OH 中間產物Νο.48 ^----- 中間產物No. 47 — 實施例A4 中間產物7亦可另以下列製備。 a)製備中間產物12

將二苯基膦稀）-2-丙酮（34.4毫莫耳）於室溫 逐份添加至含1H_吲哚_7•甲醛（34 44毫莫耳）之^ 基-苯（60毫升）溶液中。將反應混合物於1〇〇。^加熱 3 i、時然後冷卻至室溫並蒸發至乾燥。殘餘物（I?」 克）、”玉HPLC於一氧化梦上純化：20-45微米（45C 201038552 克）’（洗提液99.5/0.5 DCM/MeOH)。收集純的遽份 並將溶劑蒸發，產生4.3克中間產物12。 b)製備中間產物π

將含中間產物12(3.4毫莫耳）及埃申莫澤爾鹽 (3.8毫莫耳）之乙酸（1〇毫升）於65 °c加熱2小時。 〇 濾出沉澱物，溶於DCM及碳酸鉀10%。添加碳酸 鉀（固體）’並將混合物於室溫攪拌1小時。萃取反 應混合物，分離有機層，在Mgs04上乾燥，過濾並 將溶劑蒸發’產生0.7克之中間產物13。 c)製備中間產物14

〇 將含中間產物13(0.13莫耳）、碘甲烷（〇14莫耳) 之Et〇H(300毫升）於室溫攪拌2日，濾出沉澱物並 乾燥，產生47克之中間產物14。 d)製備中間產物15

將含中間產物14(136.5亳莫耳）、氰化鈉（177 5 毫莫耳）之DMF(400毫升）於室溫攪拌2小時，添加 水並以EtOAc萃取反應混合物。分離有機層，在 61 201038552

MgS04上乾燥，過濾及蒸發。殘餘物以高效能液體 層析（Irregular SiOH 20_45 毫米 1000g MATREX)純 化。移動相：環己烷70%/EtOAc 30%)。收集純的 濾份，並將溶劑蒸發，產生11.8克之中間產物15。 e)製備中間產物16

將氯化曱基鎂（0.07莫耳）逐滴添加至含中間產 物15 (0.022莫耳）之THF (50毫升）溶液，添加NH4C1 10%及EOAc。萃取反應混合物，分離有機層，在 MgS04上乾燥，過濾並將溶劑蒸發。殘餘物（2.9克） 以高效能液體層析（Irregular SiOH 20-45微米450g MATREX)純化，移動相：環己燒60%/EtOAc 40%)。 收集純的濾份，並將溶劑蒸發，產生2克之中間產 物16。 f)製備中間產物7

將戴斯-馬丁過峨院（Dess-Martin periodinane)(24.9毫升）於室溫逐滴添加至含中間產 物16 (10毫莫耳）之DCM (20毫升）溶液。反應混合 物於室溫攪拌1小時，然後倒入冰水中，於塞里塑 料上過濾，並將濾液以DCM萃取。分離有機層， 在MgS〇4上乾燥’過濾並濃縮溶劑。殘餘物（2.8克） 以管柱層析在矽凝膠上純化（洗提液為環己烷 62 201038552 /EtOAc 60/40)。收集純的濾份並將溶劑蒸發，產生 0.8克之中間產物7。 實施例A5 中間產物15亦可另依下列製備。 a)製備中間產物17 ΌΗ

將四氫鋁酸鋰（0.018莫耳，〇·69克）於5。〇在乂氣 流下，逐份添加至含3_(氰基甲基）_1Η_吲哚= 甲醋（0.012莫耳，2.6克）之THF(50亳升）溶液中， 反應混合物於室溫攪拌30分鐘，於rc逐滴添加 水，並將反應混合物於塞里塑料上過濾，以Et〇Ac 洗滌並萃取。分離有機層’於MgS〇4上乾燥，過濾 及濃縮’產生2.4克之中間產物η。 “ b)製備中間產物15

〇 將戴斯-馬丁過碘烷（〇.〇16莫耳）於rc逐滴添 加至含中間產物17(0.0081莫耳）之DCM〇5毫升） 溶液中，反應混合物於室溫攪拌2小時。將反應混 合物於塞里塑料上過濾，蒸發濾液，殘餘物在矽凝 膠上以管柱層析純化（洗提液為環己烷/Et〇Ac 70/30)。收集純的濾份並將溶劑蒸發，產生〇.5克之 中間產物15。 實施例A6 63 201038552 製備中間產物18、19及20

中間產物18中間產物19 中間產物20 將4-氯-6,7-二氫-5H-環戊[b]吡啶-7-醇（5克， 〇,029莫耳）及南極假絲酵母脂肪酶B (Lipase

Candida Antartica B) (2.5克）之乙酸乙烯酯（5〇毫升） 此合物於室溫攪拌4小時，將反應混合物於塞里塑 料上過濾，塞里塑料以DCM洗滌，將濾液之溶劑 蒸發’殘餘物（6.3克）在矽凝膠上以管柱層析純化 (洗提液.DCM/MeOH 由 100/0 至 98/2; 15-40 微米）， 收集二種不同產物濾份，並將各產物濾份之溶劑蒸 發，產生2.1克之中間產物18(42% ; s_對映異構 物）’及3.6克之中間產物19 (58%; R-對映異構物）。 當所欲中間產物19可經由在MeOH/NH3反應被轉 換成中間產物18之R對映異構物時，產生中間產 物20。 中間產物18及20亦另可如下製備。 將四氫硼酸鈉（1.37克，36.10毫莫耳）於5°C 逐份添加至含中間產物1(5.50克，32.82毫莫耳）之 MeOH(50毫升）溶液中，反應混合物於室溫攪拌i 晚，然後倒入水中，並將混合物以EtOAc萃取三 次。有機層以水及NaCl水溶液洗滌，分離，在MgS〇4 上乾燥，過濾並將溶劑蒸發。殘餘物（4.42克）在對 64 201038552 掌性PAK AD-H 5微米25〇x20毫米上，經對掌性 超臨界液體層析純化，移動相：85% C02，15% MeOH。收集純的濾份並將溶劑蒸發，產生1.625 克（29.2%)化合物18(8-對映異構物）(〇]^?，20°(：， 濃度 〇.33w/v%，589 奈米：-77.58°)，及 1.620 克 (29.1%)化合物20(R-對映異構物）(DMF，20°C，濃 度 0.33w/v°/〇，589 奈米：+76.74°)。

實施例A7 製備中間產物21

將草醯氯（0.0079莫耳）於5 °C逐滴添加至含 7-[2-[[(1，1-二甲基乙基）二曱基矽烷基]氧基]乙 基]-1Η-吲哚（0.0047莫耳）之二乙醚（20毫升）。反應 混合物於5°C攪拌2小時。於5°C逐滴添加 〇 NH4OH(濃，20毫升）至溶液。反應混合物於室溫攪 拌隔夜。添加水及EtOAc，分離有機層，在MgS04 上乾燥，過濾並濃縮，產生1.8克之中間產物21。 製備中間產物22

HO 將四氫鋁酸鋰（0.021莫耳）於5°C逐份添加至 含中間產物21(0.0052莫耳）之THF(50毫升）溶液。 混合物於回流攪拌隔夜，然後冰浴冷卻至5 ° C。逐 65 201038552 滴添加水將過量四氫鋁酸鋰小心地水解，在塞里塑 料上濾出混合物，以DCM洗滌並萃取。分離有機 層，在MgS〇4上乾燥，過濾並濃縮，產生〇.6克之 中間產物22。 實施例A8 a)製備中間產物23

將草醯氯（2.9毫莫耳）於rC逐滴添加至含 朵_7_基）_3•丁烯_2_嗣（2 7毫莫耳）之二乙醚 (1〇毫升）溶液。移除冷浴，並使反應溫熱至室溫（15 小時）。濾出沉澱物並乾燥，產生0 49克之中間產 物23。 b)製備中間產物24

將氫氧化銨（10毫升）於5 〇c逐滴添加至含中間 產物23(0.725毫莫耳）之二乙醚（10毫升）溶液，反 應混合物於室溫授拌隔夜 生0.11克之中間產物24。 c)製備中間產物25 -G醚耄开）溶液，反 。濾出沉澱物並乾燥，產 66 201038552

將四氫鋁酸鋰（39.5毫莫耳）於5 °C逐份添加至 含中間產物24(7.9毫莫耳）之THF(20毫升）溶液， 混合物於80 °C攪拌2小時，然後在冰浴上於5 °C 冷卻。經由逐滴添加水，小心水解過量之四氫紹酸 鋰。在塞里塑料上濾出混合物，以DCM洗滌並萃 取。分離有機層，在MgS04上乾燥，過濾並濃縮， 產生1克之中間產物25。 d)製備中間產物26

將中間產物25 (4.3毫莫耳）、2-氟-5-硝基甲苯 (4.7毫莫耳）、碳酸一鈉陰離子（5.1毫莫耳）之 DMSO(10毫升）混合物於60°C加熱隔夜，將混合物 Q 冷卻至室溫，添加冰水，添加DCM。萃取反應混合 物，分離有機層，在MgS04上乾燥，過濾並蒸發。 殘餘物經由管柱層析純化（洗提液：DCM/MeOH 97/3)。收集純的濾份並將溶劑蒸發，殘餘物經高效 能液體層析（Irregular SiOH 15-40 微米 300g MERCK)純化，移動相（NH40H 0.1%-二氯曱烷 99%-MeOH 1%)。收集純的濾份並將溶劑蒸發，產 生200毫克之中間產物26。 e)製備中間產物27 67 201038552

將含中間產物26(0.35毫莫耳）、雷氏鎳（200毫 克）之MeOH(5毫升）混合物在大氣壓下於室溫氫 化，殘餘物於塞里塑料上過濾、，以DCM洗務:並將 殘餘物蒸發，產生0.14克之中間產物27。 實施例A9 a)製備中間產物28

將第三丁基二曱基矽烷基氯（195毫克，0.91毫 莫耳）於室溫添加至含中間產物16(162毫克，0.81 毫莫耳）、咪唑（143毫克，2.1毫莫耳）之THF(5毫 升）溶液，反應混合物於室溫攪拌隔夜，濾出沉澱物 並以DCM洗滌。蒸發濾液，殘餘物（365毫克）在矽 凝膠上以驟層析純化（15-40微米，30g， DCM/MeOH : 100/0至99/1)。收集純的濾份並蒸發 至乾燥，產生190毫克之中間產物28。 b)製備中間產物29

將含中間產物28(190毫克，0.6毫莫耳）、雷氏 鎳（0.7g)之NH3之MeOH 7N(10毫升）在3巴之H2 下於室溫攪拌4小時。將反應於塞里塑料上過濾並 68 201038552 將塞里塑料以DCM/MeOH(90/10)洗滌三次。將溶劑 蒸發而獲得147毫克之中間產物29。 c)製備中間產物3〇

將含中間產物29(147毫克，0.46毫莫耳）、 氟-2-甲基_4·硝基_苯（78毫克，〇 51毫莫耳）、碳酸

納鹽（1 : 1)(85亳克’ 1毫莫耳）之DMS〇(2毫升）混 合物於65°C加熱1晚，將混合物倒入冰中，並攪 拌1 〇分鐘，添加DCM並將混合物以DCM萃取二 次。有機層以水洗滌，然後在MgS〇4上乾燥，過濾 並將溶劑蒸發，殘餘物在上矽凝膠以驟層析純化 (15-40微米，3〇g，環己烷/Et〇Ac 85/15)。收集純 的濾份，並蒸發至乾燥，產生200毫克之中間^物 30 ° d)製備中間產物31

將含中間產物30(2.8克，6.17毫莫耳）、二第 三丁基二碳酸酯（8克，37毫莫耳）、4-二曱基胺基 吡啶（0.15克，1.2毫莫耳）及三乙胺（1 89毫升，13 6 耄莫耳）之THF(50毫升）於60°C攪拌24小時，蒸 發混合物至乾燥，殘餘物（7.4克）在矽凝膠（Cartddge 15 - 4 0微米，9 〇 g)上以高效能液體層析純化，移動相 69 201038552 (環己烷50% ;二氯甲烷50%)。收集純的濾份，並 將溶劑蒸發，產生3.3克之中間產物31。 e)製備中間產物32

將含中間產物31(3.3克，5毫莫耳）、雷氏鎳（3 克）之MeOH(l00毫升）混合物於2.5巴氫化2小時。 將殘餘物於塞里塑料上過濾，以DCM洗滌，並將 ’ 殘餘物蒸發，產生2.7克之中間產物32。 f)製備中間產物33

將含中間產物32(2.6克，4.2毫莫耳）、4-氯-6,7-二氫-5H-環戊[b]吼啶-7-醇（0.78克，4.6毫莫耳）、 HC1 4M之二噚烷（0.21毫升，0.8毫莫耳）於乙腈（28 毫升）及EtOH(7毫升）中於65 ° C加熱72小時。冷 卻至室溫後，添加水及碳酸鉀粉末，並將混合物以 EtOAc萃取二次。有機層以水洗滌，在MgS04上乾 燥，過濾並蒸發。殘餘物以高效能液體層析 (Irregular SiOH 20-45 微米 450g MATREX)純化， 移動相（NH4OH 0.5% ;二氣曱烷 95% ; MeOH 5%)。 70 201038552 收集純的濾份’並將溶劑蒸發，產生2.35克之中間 產物33。 g)製備中間產物34

將氧化錳（IV)(4.3克）於室溫逐份添加至含中間 產物33(2.2克’ 2.9毫莫耳）及三（2-(2_曱氧基乙氧 基）乙基）胺（47毫克，0.145毫莫耳）之DCM(50毫升） 溶液，混合物於室溫攪拌18小時。將混合物於塞 里塑料上過濾’塞里塑料以DCM洗滌，並將溶劑 蒸發’產生1.84克之中間產物34。 h)製備中間產物35

將含中間產物34(1.2克，1.6毫莫耳）之三氟乙 酸（1.2毫升，15.9毫莫耳）及DCM(1〇毫升）於室溫 攪拌2日，添加碳酸鉀1〇%，並將混合物以DCM 萃取二次’有機層在MgS〇4上乾燥，過濾並蒸發， 獲得0.8克之中間產物35。其不再純化而於下一步 驟使用。 實施例A10 71 201038552 a)製備中間產物36

將碘曱烷（0.024莫耳）添加至含3_[(二曱基胺基) 曱基]-1H-吲哚-7-羧酸甲酯（0.022莫耳）之Et〇H(5〇 毫升）溶液。混合物於室溫授拌隔夜，然後於真空中 浪縮至乾燥，產生5.6克（68%)之中間產物36。 b)製備中間產物37

將含中間產物36(0.015莫耳）及氰化鈉（〇〇19 莫耳）之DMF(60毫升）混合物於1〇〇。匚擾拌2小 時，添加水，過濾沉澱物，蒸發濾液，產生3 5克 (100%)之中間產物37。 c)製備中間產物38

將含中間產物37(0.016莫耳）及雷氏鎳（3克）之 MeOH/NH3(50毫升）混合物於室溫在3巴壓力下氣 化’然後於塞里塑料上過濾，蒸發濾液，產生32 克（89%)之中間產物38。 d)製備中間產物39

將含中間產物38(0.0092莫耳）、丨-氟·‘硝基 72 201038552 苯（0.01莫耳）及二異丙基乙基胺（0.023莫耳）混合物 於180°C攪拌2小時，添加水，混合物以DCM萃 取，分離有機層，乾燥（MgS04)，過濾並將溶劑蒸 發。殘餘物（2.6克）在kromasil®上以管柱層析純化 (洗提液：環己烷/EtOAc 60/40)。收集純的濾份並將 溶劑蒸發，產生1.4克（45%)之中間產物39。 e)製備中間產物40

將第三丁氧基羰基酐（0.015莫耳）於室溫添加 至含中間產物39(0.05莫耳）及4-(二甲基胺基）吡啶 (少量）之THF (50毫升）混合物中，將混合物於室溫 攪拌隔夜，混合物以EtOAc萃取，有機層以水洗 蘇，乾燥（MgS〇4)，過濾、並將溶劑蒸發。殘餘物（4 克）在矽凝膠上以管柱層析純化（洗提液：環己烷 /EtOAc 60/40)。收集純的濾份，並將溶劑蒸發，產 生3.3克（82%)之中間產物40。 f)製備中間產物41

將含中間產物40(0.0061莫耳）及雷氏鎳（3.3克） 73 201038552 之MeOH(50毫升）混合物於室溫在3巴壓力下氫 化，然後在塞里塑料上過濾，將塞里塑料以 DCM/MeOH(98/2)洗滌，蒸發濾液，殘餘物（2.8克） 在矽凝膠上以管柱層析純化（洗提液：環己烷/EtOAc 70/30)，收集純的濾份，並將溶劑蒸發，產生1.3 克之（42%)之中間產物41。 g)製備中間產物42

將含中間產物41(0.0018莫耳）、4-氣-6,7-二氫 -5H-環戊[b]吡啶-7-醇（0.33克）及HC1/異丙醇（5牴） 之乙腈（20毫升）混合物於65 °C攪拌24小時，添加 碳酸鉀10%，混合物以EtOAc萃取，分離有機層， 乾燥（MgS04)，過濾並將溶劑蒸發。殘餘物（1.1克） 在矽凝膠上以管柱層析純化（洗提液： DCM/Me0H/NH40H 95/5/0.1)。收集純的濾份並將 溶劑蒸發，產生0.054克之中間產物42。 h)製備中間產物43

將含中間產物 42(0.0009 莫耳）及 HC1 3N(0.0039莫耳）之乙腈（10毫升）混合物於65°C攪 74 201038552 拌3小時，添加碳酸鉀10%，混合物以EtOAc萃取， 分離有機層、乾燥（MgS04)、過濾並將溶劑蒸發。 殘餘物（0.4克，100%)由二乙醚/乙腈結晶，滤出沉 澱物並乾燥，產生0.3克之中間產物43,熔點164 °C。 B.製備最終化合物 實施例B1 製備化合物1

將中間產物11(1.00克，3.092毫莫耳）、中間 產物 2 (0.437 克，2.381 毫莫耳）、HC1(0.155 毫升， 0.618毫莫耳）之乙腈（10毫升）於65°C攪拌5小時， 將反應冷卻至室溫，然後以碳酸鉀（10%於水中）鹼 化，並以DCM萃取三次，有機層以水洗滌，在MgS04 上乾燥，過濾並將溶劑蒸發，殘餘物（1.37克）在二 氧化矽上以正相層析純化（5微米150x30.0毫米）。 移動相（梯度由 〇%NH4OH、100%DCM、0%MeOH 至 0.8% NH40H、92% DCM、8% MeOH)。收集純 的濾份並將溶劑蒸發，收取殘餘物（0.350克）至乙腈 中於室溫1週，結晶此產物並過濾及在真空中乾 燥，產生300毫克（20.8%)之化合物1，熔點209°0 實施例B2 製備化合物2及3 75 201038552

將含中間產物11(0.0031莫耳）、Ν,Ν-二異丙基 乙基胺（0.0028莫耳）、4-溴吡啶鹽酸鹽（0.0034莫耳） 之乙腈（20毫升）溶液於65 ° C加熱6小時，添加石炭 酸鉀10%及EtOAc。萃取反應混合物，分離有機層， 在MgS04上乾燥，過濾並濃縮。殘餘物（1.3克）在 矽凝膠上以管柱層析純化（洗提液95/5/0.5 DCM/MeOH/NH4OH)。收集二種濾份，並將溶劑蒸 發，獲得60毫克化合物3及80毫克F2。殘餘物 F2(80毫克）以超臨界液體層析純化（AMINO管柱 150x21.2mmm)洗提液：MeOH/C〇2 30/70)。收集純 的遽份並將溶劑蒸發，產生43毫克之化合物2。 實施例B3 製備化合物4

將含中間產物35(0.8克，1.7毫莫耳）及氫氧化 鈉3N(2.57毫升，2.57毫莫耳）之EtOH(22毫升）及 THF(10毫升）於室溫攪拌30分鐘，添加NH4C1 10% 及DCM，並將混合物在塞里塑料上過濾，傾析有機 層，在上MgS〇4乾燥，過濾並蒸發。殘餘物以在 76 201038552

Spherical SiOH 10 微米 60g (PharmPrep MERCK) 上以正相純化，移動相（NH4OH 0.1%，95% DCM， 5% MeOH)。收集純的濾份並將溶劑蒸發，產生250 毫克之化合物4。 實施例B4 製備化合物5

將四氫硼酸鈉（0.69毫莫耳）於5 °C添加至含中 間產物49(0.46毫莫耳）之MeOH(5毫升）溶液。反應 混合物於室溫攪拌隔夜，添加水，以EtOAc萃取反 應混合物，分離有機層，在MgS04上乾燥，過濾並 蒸發。殘餘物（0.14克）於乙腈中結晶，濾出沉澱物 並乾燥’產生0.1克之化合物5。 實施例B5 製備化合物6

Ο 將四氫鋁酸鋰（0.0003莫耳）於5°C逐份在N2 氣流下添加至含中間產物43(0.0002莫耳）之THF(4 毫升）溶液。混合物於室溫攪拌2小時，添加水。混 合物以EtOAc萃取，分離有機層，乾燥（MgS〇4)，

過濾、並將/谷劑蒸發。殘餘物（0.18克）在kromasil®上 以管柱層析純化（洗提液：DCM/MeOH/NH4OH 77 201038552 98/2/0.2至85/15/1 ; 3.5微米）。收集純的濾份並將 溶劑蒸發，產生0.066克（70%)之化合物6。 實施例B6 製備化合物7及8

化合物7 化合物8 將含中間產物47(1.00克，3_23毫莫耳）、中間 產物 4 (0.653 克，3.55 毫莫耳）、HC1/二哼烷（0.242 毫升，0.97毫莫耳）之乙腈（15毫升）於70° C攪拌1 晚。將反應混合物冷卻至室溫，然後添加水、碳酸 鉀（10%於水中），混合物以DCM萃取三次，分離有 機層，在MgS04上乾燥，過濾並將溶劑蒸發。殘餘 物在石夕凝膠（Cartridge 15-40微米30g)上以正相純 化，移動相（96% DCM，4% MeOH)。收集純的濾份 並將溶劑蒸發，產生0.092克（6.5%)之化合物7及 0.030克（2.0%)之化合物8。 實施例B7 製備化合物9

將中間產物27(0.41毫莫耳）及4-氯-6,7-二氫 -5H-環戊[b]吡啶-7-醇（0.46毫莫耳）於125°C加熱2 78 201038552 小時，殘餘物在矽凝膠上以管柱層析純化（洗提液 90/10/0.1 DCM/MeOH/NH4OH)。收集純的濾份並將 溶劑蒸發，產生5 8克之化合物9。 實施例B8 製備化合物24及25

Co.No.24 : *S Co.No.25 ： *R *意指相對立體化學（絕對之立體化學並未知）。因 此’若化合物24為S對映異構物，則化合物25為 R對映異構物，或若化合物24為R對映異構物， 則化合物25為S對映異構物。 反應在A氣壓下進行，將含中間產物47(11.31 毫莫耳）、中間產物4(12.44亳莫耳）、pd(dba)2(1.13 毫莫耳）、BINAP(1.13毫莫耳）及tBuONa(22.62毫莫 耳）之甲苯（100毫升）混合物於回流攪拌隔夜。過濾 混合物，以MeOH洗滌，並以高效能液體層析（管 柱Synergi 50*250毫米，1〇微米；洗提液： CH3CN/H2O(0.1%三氟乙酸）’ 15% CH3CN梯度於時 間0分鐘至40% CHsCN於時間25分鐘）純化。收集 所欲濾份，並將溶劑於真空中蒸發，殘餘物以DCM 萃取’以NaHC03水溶液洗滌，在Na2S04上乾燥， 79 201038552 過濾並蒸發，獲得化合物8(3.8克，98%純度，65% 產率），其分離係經由超臨界液體層析Chiralcel OJ， 20微米，250毫米* 20毫米；超臨界C02 :異丙醇 (0.05%二乙基胺），40 : 60 v/v, 70毫升/分鐘），穫得 二種濾份； 1000.79毫克（19%)之化合物 24 ，熔點 110.5-111.6°C > (ee%=99%，[a]D2° = + 5.034。，（波長=589，20oC 於 曱醇中，濃度10.33毫克/毫升） 及939.19毫克（18%)之化合物25，熔點 111.4-113.30C。 (ee%=99%，[a]D20 = -3.443°，（波長=589，20oC 於 MeOH，濃度10.74毫克/毫升） 實施例B9 製備化合物

Co.No. 26 :

Co.No. 27 i 思指相對立體化學（絕對之立體化學並未知）。因 此，若化合物26為S對映異構物，則化合物27為 R對映異構物’或若化合物26為R對映異構物‘: 則化合物27為s對映異構物。 201038552 反應在N2氣壓下進行’將含中間產物11(9.25 毫莫耳）、中間產物2(9.25亳莫耳）、tBuONa(18.5 毫莫耳）、Pd(dba)2(0.93毫莫耳）及ΒΙΝΑΡ(0·93毫莫 耳）之甲苯（40毫升）混合物於回流加熱並擾拌3小 時。將所產生之混合物冷卻至室溫並過濾，於真空 中蒸發滤液，並將殘餘物以高效能液體層析（管柱 Synergi 50*250毫米，1〇微米；洗提液： CH3CN/H2O(0.1%三氟乙酸）’梯度1〇% CH3CN於時 間〇分鐘至40% CH3CN於時間25分鐘）純化。收集 所欲濾份，並調整至pH>7。濃縮溶劑，並以乙酸 乙酯萃取（3次100毫升），所欲之有機層以鹽水洗 滌，在Na2S04上乾燥，過濾並將溶劑於真空中蒸 發，獲得2.5克（57%)之化合物1 ’其以超臨界液體 層析分離（AD 250毫米*20毫米’ 20微米；超臨界 C02 :異丙醇（0.05% 二乙基胺）40 : 60 ’ v/v，70 毫升/分鐘），獲得2種濾份。 濾份1 (1克）進一步以高效能液體層析純化（管 柱Synergi 50*250，10微米；洗提液： CH3CN/H2O(0.1%三氟乙酸），梯度10% CH3CN於時 間0分鐘至40% CH3CN於時間25分鐘）’獲得0.88 克（20%)化合物 26，熔點 122.3-124°C ’（ee=100%)。 濾份2(1克）進一步以高效能液體層析純化（管 柱Synergi 50*250，10微米；洗提液： CH3CN/H2O(0.1%三氟乙酸），梯度10% CH3CN於時 間0分鐘至40% CH3CN於時間25分鐘），獲得0.96 克（22%)之化合物27，疼點121.4-122.6 C ’ 81 201038552 (ee=99%)。 表1列出根據上述實施例之一者製備之化合 物。 表1 ΛΒ， ό HO N Co.No. 1； Ex. [B1] Co. No. 2 ; Ex. [B2] ό Ν 0 Co. No. 3 ； Ex. [B2] Co. No. 4 ; Ex. [B3] OH oh OH Co. No. 5 ； Ex. [B4] Co. No. 6 ; Ex. [B5] 〇、 Co. No. 7 ; Ex. [B6] Co. No. 8 ; Ex. [B6] 82 201038552

(¾ Η > OH Co. No. 9 ; Ex. [B7] HO ός> Hho OH Co. No. 10； Ex. [Bl] Co. No. 11； Ex. [Bl] C^> '。 OH ός> H 0H OH Co. No. 12； Ex. [Bl] Co. No. 13； Ex. [Bl] OH 方省 HO7 OH Co. No. 14； Ex. [Bl] Co. No. 15； Ex. [Bl] \ OH Co. No. 16； Ex. [Bl] Co. No. 17； Ex. [Bl] 83 201038552 (¾ '。 OH OH Co. No. 18 ； Ex. [Bl]; Co. No. 19； Ex. [Bl]； (¾ Hho OH Co. No. 20； Ex. [Bl] Co. No. 21； Ex. [Bl] > ΗΟ-Λ \ NH o卢 (¾ 〇H OH Co. No. 22 ; Ex. [B2] Co.No.23; Ex. [Bl] 〇> ’N OH ψ OH Co. No. 24 ; Ex. [B8] Co. No. 25 ； Ex. [B8] OH OH Co. No. 26 ； Ex. [B9] Co. No. 27 ； Ex. [B9] 84 201038552

化合物特性 熔點： 數值為峰值或熔化範圍，且其之獲得具有實驗 不確定度，通常與其分析方法有關。

Kofler 對於化合物4，以軌氏加熱座（Kofler hot bench) 獲得熔點，由具有線性溫度梯度之加熱板、游標及 攝氏溫標組成。

WRS-2A 對於化合物 1卜 24、25、26、27、28、29、30、 85 201038552 3 1，熔點以WRS-2A熔點儀決定，其購自Shanghai Precision and Scientific Instrument Co. Ltd.。熔點以 0.2-5.0°C/分鐘之線性加熱速率測定，報告值為熔化 範圍，最大溫度為300°C。

DSC 對於化合物1，熔點以DSC(微差掃描熱量測定 法；differential scanning calorimetry)決定，炼點以 10°C/分鐘之溫度梯度測定，最大溫度為35(rc:，數 值為峰值。

LCMS 對於本發明化合物之LCMS-定性，使用下列程 序。

一般程序A

使用包含具脫氣機之四級泵浦、自動取樣機、 二及陣列探測器（DAD)及管柱之Alliance HT 2795(Waters)系統進行HPLC測量，具體說明於下 列各別之方法’管柱保持於溫度3〇。〇來自管柱之 流被分流至MS光譜儀，MS探測器配有電噴灑離 子化源。毛細管針頭之電壓為3 kV，且在LCT上 之來源溫度維持在 100cC (Time 〇f FHght ZsprayTM 質譜儀’ Waters)。使用氮氣作為噴霧器氣體，以

Waters-Micromass MassLynx-Openlynx 數據系統進 行數據之取得。

一般程序B 使用包含具脫氣機之二元泵浦、自動取樣機、 二及陣列探測器（DAD)及管柱之XJPLC(超效能液體 86 201038552 層析）Acquity(Waters)系統進行LC測量，具體說明 於下列各別之方法，管柱保持於溫度40°C。來自管 柱之流被分流至MS光譜儀，MS探測器配有電喷 灑離子化源。毛細管針頭之電壓為3 kV，且在 Quattro上之來源溫度維持在130°C(三連式四極質 譜儀，Waters)。使用氮氣作為喷霧器氣體，以 Waters-Micromass MassLynx-Openlynx 數據系統進 行數據取得。

一般程序C 使用包含泵浦、自動取樣機、二及陣列探測器 (DAD)(波長使用220奈米）及管柱加熱器及管柱之 Agilent 1100模式進行HPLC測量，具體說明於下 列各別之方法。來自管柱之流被分流至Agilent MSD Series G1946C 及 G1956A，MS 探測器配有 API-ES (大氣壓電喷灑離子化）。經由100至1000 之掃描獲得質譜。毛細管針頭之電壓用於正離子化 模式為2500 V，而用於負離子化模式為3000 V。碎 裂電壓（fragmentation voltage)為50 V，乾燥氣體溫 度維持在350°C，流速10公升/分鐘。 方法1 除了一般程序A之外：逆相HPLC進行於 Xterra-MS C18管柱（5微米，4.6 X 150毫米），流速 1.0毫升/分鐘。二種移動相（移動相A : 100% 7 mM 乙酸銨；移動相B : 100%乙腈），用於進行梯度條 件由85°/。A，15% B(保持3分鐘），在5分鐘内至 20% A、80% B，保持在 20% A 及 80% B 6 分鐘， 87 201038552 以起始條件再平衡3分鐘。使用注射體積為2〇微 升。錐口電壓（cone vohage)用於正離子化模式為2〇 V，而用於負離子化模式為2〇 v。使用〇 〇8秒之内 掃描延遲（interscan delay)’經由在〇 8秒之i⑽至 900之掃描獲得質譜。 方法2 除了一般程序B之外：逆相HpL(：進行於 Waters Acquity BEH(橋接乙基矽氧烷/二氧化矽混 ^源）C18管柱（1.7微米，χ 1〇〇毫米），流速〇35 毫升/分鐘。二種移動相（移動相A : 95% 7 mM乙酸 銨/5%乙腈；移動相b : 1〇〇%乙腈），用於進行梯度 條件由90% A及10% B(保持〇 5分鐘），在3 5分鐘 内至8% A、92% B，保持2分鐘，並在〇 5分鐘内 回到起始條件，保持1.5分鐘。使用注射體積為2 微升。錐口電壓用於正及負離子化模式為2〇v。使 用0.1秒之内掃描延遲，經由在0 2秒之100至1〇〇〇 之掃描獲得質譜。 方法3 除了一般程序c之外··逆相ΗΡΙΧ進行於 YMC^Pack ODS-AQ，5〇χ2.0毫米5微米管柱，流速 0.8宅升/分鐘。使用二種移動相（移動相a :具有 0.1%TFA之水；移動相b:具有〇 〇5〇/〇TFA之乙腈）。 首先，90%A及10%B保持〇·8分鐘，然後施用梯 度在3.7分鐘内至20〇/〇 Α及80% Β並保持3分鐘。 使用一般注射體積為2微升。烘箱溫度為5〇c>c>(ms 極性：正）。 88 201038552 表2 : LCMS數據及熔點（滯留時間：Rt以分鐘計）， (MH)+尖峰，LCMS程序表示用於LCMS之方法。 化合物編號 LCMS 溶點 Rt (MH)+ 程序 1 3.39 471 2 209°C 2 3.35 401 2 4 3.19 441 2 121°C 5 2.97 417 2 6 7.47 415 1 7 3.94 439 2 8 3.45 457 2 9 8.51 471 1 10 3.05 457 2 11 3.01 473 3 221.0-222.5°C 12 3.07 443 2 13 3.00 443 2 14 3.49 425 2 15 8.22 443 1 16 3.34 457 2 17 3.32 457 2 18 8.68 457 1 89 201038552

化合物編號 LCMS 熔點 20 8.62 457 1 21 8.2 443 1 22 8.95 415 1 23 2.93 443 3 24 110.5-111.6°C 25 111.4-113.3°C 26 122.3-124°C 27 121.4-122.6°C 28 98.3-100°C 29 96.8-99°C 30 111.5-112.3°C 31 112.7-113.6°C 旋光度 使用偏極計量測旋光度，[a]D2G指出以鈉之D-線波長（589奈米）之光，於溫度20°C量測旋光度，晶 格光徑為1分米（dm)。實際值之後，述及濃度及用於 量測旋光度溶液之溶劑。 表3 :旋光度

化合物編號 [a]D20 濃度 溶劑 18 -37.4° 0.516 w/v% DMF 20 +36.87° 0.575 w/v% DMF 201038552

化合物編號 Nd2° 濃度 溶劑 21 -39.68° 0.378 w/v% DMF 24 +5.03° 10.30毫克/毫升 MeOH 25 -3.44° 10.70毫克/毫升 MeOH 26 -13.74 8.59毫克/毫升 氣仿 27 +11.89 9.00毫克/毫升 氯仿 30 -5.25 4.00毫克/毫升 MeOH 31 +7.99 4.00毫克/毫升 MeOH 28 -4.90 10.00毫克/毫升 MeOH 29 +5.69 9.89毫克/毫升 MeOH c.藥理實施例：

本化合物保存p53於A2780細胞之能力以p53 酵素連結免疫吸附分析量測。p53分析為一種應用 二種多株抗體之“三明治式’’酵素免疫分析。多株抗 體，對於p53蛋白質特異性，已被免疫固定於塑膠 小孔之表面，存在於欲分析之樣本的任何p53將結 合至捕捉抗體。生物素標記偵測劑多株抗體亦認識 p53蛋白質，並將結合至任何已被捕捉抗體保留之 p53。之後，偵測抗體經由經辣根過氧化酶結合之 鏈黴抗生物素蛋白（streptavidin)結合。辣根過氧化 酶催化顯色基質〇-二胺苯之轉變，其之強度與結合 至板上之p53蛋白質的量成比例。呈色反應產物使 用分光光度計定量。使用已知濃度的純化重組HIS 91 201038552 標示p53蛋白質，經由標準曲線之濃度達成定量（詳 見實施例C.I.)。

C.l. p53 ELISA A2780細胞（ATCC)以補充10%胎牛血清 (FCS)、2 mM L-麵醯胺及健他徽素（gentamycin)之 RPMI 1640，培養於37°C、濕潤、備有5% C02之培 養箱中。 A2780細胞以每孔20.000個細胞接種於96孔盤 中，培養24小時，並以化合物在37°C、於濕潤培養 箱中處理16小時。培養後，細胞以磷酸鹽緩衝食鹽 水洗滌一次，並於每孔添加30微升之低鹽RIPA緩衝 液（20 mM tris，ρΗ7·0，0.5 mM EDTA，1% Nonidet P40，0.5% DOC，0.05% SDS，ImM PMSF，1 微克/ 毫升抑肽酶（aprotinin)及0.5μ/微升亮肽素 (leupeptin)。將培養盤置於冰上30分鐘，以完全分 解。使用下述之三明治ELISA檢測溶解產物中之p53 蛋白質。 高結合聚苯乙烯EIA/RIA 96孔盤（Costar 9018) 以濃度為含1微克/毫升之塗覆緩衝液（0.1M NaHC03 pH8.2)的捕捉抗體 pAbl801(Abcam ab28-100)塗覆每孔50微升。使抗體於4°C黏附隔 夜。經塗覆之盤以磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS)/0.05% Tween 20清洗，並添加300微升之阻斷緩衝液（PBS， 1%牛血清白蛋白（BSA))，於室溫培養2小時。在阻 斷緩衝液中稀釋純化重組HIS標示p53蛋白質，範圍 為3-200奈克/毫升，並作為標準液。 92 201038552 盤以PBS/0.05% Tween 20清洗二次，並以80 微升/每孔添加阻斷緩衝液或標準液。在標準液中， 添加20微升溶解緩衝液。以20微升溶解產物/每 孔，添加樣本至其他孔中。於4°C隔夜培養後，將 盤以PBS/0.05% Tween 20清洗二次。整倍數之100 微升第二多株抗體p53 (FL-393) (Tebubio， sc-6243)，以含1微克/微升之阻斷緩衝液的濃度添 加至各孔中，並使其於室溫粘附2小時。將盤以 PBS/0.05% Tween 20清洗三次。偵測抗體抗兔 HRP(sc-2004，Tebubio)，其以含 0.04 微克/毫升之 PBS/1% BSA濃度添加，並於室溫培養1小時。盤 以PBS /0.05% Tween 20清洗三次，並添加100微 升之基質缓衝液（基質缓衝液子使用前立即製備，其 經由添加1錠10毫克〇-二胺苯（OPD，Sigma)及125 微升3%H202至25毫升OPD緩衝液：35 mM檸檬 酸、66 mM Na2HP04，pH5.6)。5 至 10 分鐘之後， 經由每孔添加50微升終止緩衝液（1M H2S04)停止 呈色反應。使用Biorad微盤讀取機量測在雙波長 490/655奈米之吸光度，然後分析結果。 對於每一實驗，對照組（不包含藥劑）及空白培 養組（不包含細胞或藥劑）平行進行。所有對照組及 樣本之值減去空白值。對於各樣本，p53之值（以吸 光度單位）表示為存在於對照組之p53之值的百分 比。百分比維持高於140%被定義為顯著。本文中 測試化合物之效果表示為最低劑量給予存在於對 照組之p53之值的至少140%(LAD)(詳見表4)。 93 201038552 在一些實驗中，分析適於並用於384-孔培養 盤。 表4 :測試於上述p53 ELISA規則（A2780細胞）之 化合物的結果 化合物編號 p53-elisa LAD [microM] 6 1.0 17 0.10 12 0.10 13 1.00 19 0.10 2 0.10 5 0.10 22 3.00 15 0.10 20 0.03 18 0.03 21 1.0 9 1.0 11 0.30 14 1.0 4 0.10 94 201038552 化合物編號 p53-elisa LAD [microM] 10 1.0 7 0.30 8 0.10 16 0.30 23 3.00 1 0.10 27 0.10 24 0.03 25 0.10 31 0.10 26 0.10 30 0.10 29 0.03 28 0.10 C.2增殖分析 人類A2780卵巢癌細胞係來自 Dr. T.C. Hamilton (Fox Chase Cancer Centre, Pennsylvania, U.S.A.)之令人感激的禮物。細胞培養於補充2 mM L-麩醯胺、50微升/毫升健他黴素及10%胎牛血清 95 201038552 之RPMI 1640培養基。 使用於阿爾瑪藍分析（Alamar Blue assay)之試 劑 刃天青（resazurin)購自 Aldrich(Prod. No. 199303)。氰亞鐵酸鉀、鐵氰化鉀、κΗ2Ρ04& Κ2ΗΡ04 購自 Sigma (各為 pr〇(i· Nos. P9387、P8131、P5655 及 P8281)。 磷酸鉀緩衝液O.IM(PPB)如下製備：將2.72克 KH2P〇4& 13.86 克 K2HP04 溶於 500 毫升 milli-Q H20，pH調整至PH 7.4，且體積以milli-Q H20帶 至1公升；緩衝液過濾消毒，並儲存於室溫。刃天 青儲備液（PPB-A)經由溶解45毫克刃天青於15毫 升PBS中新鮮製備。30 mM鐵氰化钟（PPB-B)經由 溶解0.987克鐵氰化鉀於1〇〇毫升ppb中而製備。 30 mM氰亞鐵酸鉀（ΡΡΒ-C)經由溶解1.266克氰亞鐵 酸鉀於100毫升PPB而製備。 PPB-A、PPB-B及PPB-C之混合物經由混合等 量之各溶液而製備。刃天青工作溶液（本文稱為‘‘阿 爾碼藍（Alamar Blue)’’溶液）經由稀釋該混合物 2()x(v〇l/v〇l)於ppb中並過濾消毒而製備；阿爾瑪藍 溶液可保持於4。(：最長2週。 阿爾瑪藍分析之程序 關於實驗於384孔盤，細胞以5x 1 〇3細胞/毫升 之密度接種於具45微升培養基之Falcon 384孔培 養盤（Life Technologies, Merelbeke，Belgium)，黑色 具透明底部。使細胞黏附於塑膠24小時，預先稀 96 201038552 釋測試化合物（1/50於培養基），並添加5微升預先 稀釋之化合物至小孔中。之後培養4日，添加10 微升阿爾瑪藍溶液至各小孔，且細胞於37°C進一 步培養5小時（A2780)。以榮光盤讀取機（Fluorskan, Labsystems，540奈米激發及590奈米放射）量測每 一小孔之螢光強度。 抗增殖活性計算為在治療相對對照（未治療細 胞）條件中，仍發育細胞之百分比。在實驗中，每一 ^ 實驗條件之結果為3個平行實驗小孔之平均。當適 當時，重複實驗以建立完全的濃度-反應曲線。當適 當時，使用用於等級資料之機率單位分析（probit analysis)(Finney, D.J., Probit Analyses, 2nd Ed. Chapter 10, Graded Responses, Cambridge University Press, Cambridge 1962)，估算 IC50-值（降 低細胞生長至對照組之50%所需的藥劑之濃度）。本 文中，測試化合物之效果表示為pIC50(IC50-值（M) 之負數對數值）(詳見表5A)。 表5 A :測試於上述細胞增殖規則之化合物的結果 (A2780 細胞） 化合物編號 A2780細胞增殖抑制pIC50 6 6.67 17 7.40 12 7.20 13 6.90 〇 97 201038552 化合物編號 A2780細胞增殖抑制pIC50 19 7.34 2 7.38 5 7,28 22 6.26 15 7.27 20 7.29 18 7.47 21 6.85 9 6.85 11 6.55 14 6.43 4 6.74 10 6.70 7 6.96 8 7.06 16 6.87 23 6.52 1 6.94 27 6.85 24 7.18 98 201038552 化合物編號 A2780細胞增殖抑制pIC50 31 6.84 26 7.11 30 7.04 29 7.14 28 6.89

化合物亦根據上述規則測試，但使用其他細胞 株：結腸直腸癌細胞株HCT116、非小細胞肺癌細 胞株H1299、人類前列腺癌細胞株DU145。結果報 導於表5B。

表5B 化合物 編號 HCT116細胞增 殖抑制pICso H1299細胞增殖 抑制pICso DU145細胞增殖 抑制pICso 6 5.39 5.03 17 7.05 6.18 6.17 12 6.06 5.2 13 5.61 <5 19 5.46 5.74 2 5.94 6.16 5 6.46 5.23 5.56 22 5.09 5.07 15 6.69 5.82 99 201038552 化合物 編號 HCT116細胞增 殖抑制pIC50 H1299細胞增殖 抑制pIC50 DU145細胞增殖 抑制pICso 20 5.72 5.73 18 7.27 6.38 6.40 21 6.83 6.12 5.22 9 6.02 5.17 5.26 11 6.67 5.81 6.21 14 <5 5.40 5.14 i 4 6.00 5.43 5.29 10 6.47 5.68 5.65 7 7.00 6.39 6.60 8 7.06 16 6.68 6.73 5.98 23 5.53 5.61 5 1 6.82 6.06 5.92 1 27 7.08 5.99 6.00 24 7.42 6.63 6.53 31 6.94 5.84 6.04 26 7.26 6.27 6.18 30 7.19 6.02 6.14 29 7.37 6.67 6.58 100 201038552 化合物 HCT116細胞增 H1299細胞增殖 DU145細胞增殖 編號 殖抑制pICso 抑制pIC50 抑制pICso 28 7.11 6.73 6.52 C.3.P450 分析 CYP P450(E.coli 表現）蛋白質（3A4、2D6、2C9、 1A2 & 2C19)轉變其特異性基質成為螢光分子1 2。 使用螢光盤讀取機量測螢光分子，化合物抑制酵素 反應將造成螢光信號之降低。 〇 經個別的cDNA表現細胞色素P450同功酶調控之 轉變

CEC : 7-乙氧基-3-氰基香豆素（coumarin) ; CHC : 3- 氰基-7-羥基香豆素， MFC : 7-曱氧基-4-三氟曱基香豆素；7-HFC : 7-羥 基-三氟i曱基香丑素5 CEC : 7-乙氧基-3-氰基香豆素；CHC : 3-氰基-7-羥 基香豆素， AMMC : 3-[2-(N,N-二乙基-N-曱基胺基）乙基]-7-曱 101 201038552 氧基-4-曱基香豆素； AHMC:3-[2-(N，N-二乙基胺基）乙基]-7-羥基-4-曱基 香豆素鹽酸鹽， BFC : 7-苯曱基氧基_三氟曱基香豆素； DBF :二苯曱基螢光素，7-BQ :苯曱基氧基喹啉。 輔因子混合物：（對於所有CYP酵素，除了 CYP 2D6 之外） 工作溶液 最終濃度 G-6-P 8.25mM 25.10 mg 3.3 mM G-6-P-DH 1 U/ml 14.29 μΐ 0.4 U/ml 0.5MMga2.6H2O 8· 25 mM 165.0 μΐ 3.3 mM NADP 3.25mM 25.59 mg 1.3 mM 溶解於〇. 1M Na-K-峨酸鹽緩樹液 10 ml

縮寫：G-6-P :葡萄糖-6-磷酸鹽；G-6-P-DH :葡萄 糖-6-磷酸鹽-去氫酶。 輔因子混合物：（對於CYP2D6) 工作溶液 最終滾度 G-6-P 1.025 mM 3.12 mg 0.41 mM G-6-P-DH lU/ml 14.29 μΐ 0.4TJM 0.5MMga2.6H2O 1.025 mM 20.5 μΐ 0.41 mM NADP 20.5 μΜ 0.161 mg 8.2 μΜ 溶解於0.1M Na-K-磷駿鹽緩掬液 10 ml

CYP P450酵素溶液：

CYP1A2: (CEQ 最終濃度5 pmd P450/rd CYP2C9: (MFC) 最終濃度®1 pnool P450/nd CYP2C19-. (CEQ 最終濃度2.5pmolP45〇M CYP2D6-. (AMMC) 最終滚度42pmolP45〇M CYP3A4: (BFC) 最終濃度83 pmol P450M (DBF) 最終滾度5pmolP45Ctol (7-BQ) 最終濃度20 pmol FM50M 102 201038552 :所有逆些CYP酵素溶於0.01 MNa-K-磷酸鹽 缓衝液+1·15% κα 1保持在冰上直到使用。cyp P450酵素儲存於。 化合物及參考抑制齊彳稀釋： 化合物及參考抑_劑被運送至部門，作為含5 mM之DMSO溶液。經由使用乙連續稀釋製作 5.10 Μ之工作浴液’最終化合物濃度為i〇_5m用於 初'級缔選’且最終溶劑濃度為2%。在濃度1〇-5]^初 Ο 級篩選後’被選擇之有效抑制劑之IC5〇值於 3·1〇 -10 Μ之濃度範圍測試。在初級篩選中’所 有化合物測試三次。 參考抑制劑於1〇'1〇-4 Μ之濃度範圍測試。 參考抑制劑 化 ^部部部部 U内内内内 VJ )^ e .g ) )d- m e e)azrzol _ /IX /',',. 、XIN胺 鹼咕丙 茶笨環丁唑 杻胺笨尼康 九靖反奎網 用於CYP1A2 用於CYP2C9 用於 CYP2C19 用於CYP2D6 用於CYP3A4 液溶質受 CEC (CYP1A2.受質） 6. S μΐ 2〇 mM CEC 溶液/5ml 總雉種 5μΜ MFC (CYP2C9 受質） 200 μΐ 25mM MFC 溶液/5ml 總艏種 200 μΜ CEC (CYP2C19 受質） 31.25 μΐ 20mM CEC 溶液/5ml 總艚積 25 μΜ AMMC(CYP2D6 受質） 150 μΐ 0.5 mM AMMC 溶液/5ml 總·艘種 3μΜ BFC (CYP3AA 受質） 750 μΐ 5 mM BFU溶液/5ml總饞積 150 μΜ DBF (CYP3A4 受質） 12.5 μΐ 2 mM DBF 溶液/5ml 總艚稍 ΙμΜ 7-BQ (CYP3A4 受質） 6〇 μΐ 25 mM7-BQ 溶液/5ml 總敢積 60 μΜ 將受質儲備液溶於乙腈，並儲存於-20°C，將最 終工作溶液溶於0.1 M Na-K-磷酸緩衝液pH 7.4， 且此溶液總是在開始分析前新鮮製備。 103 201038552 資料分析 盤之製備、資料連結、資料分析、結果確認及 認可與資料上載以 Lexis-Laplace 軟體 (Laplace-DLM-RVAM)半自動執行。 計算所使用之方程式為： %活性=(100/(陽性對照平均-陰性對照平均）)x(樣本 平均-陰性對照平均） %抑制=100-%活性 當計算時，經由在RVAM之圖解外推法 (graphical extrapolation)，基於與 50%對照軸相交， 自動產生IC5〇值。 方法 分析進行於黑色96孔Costar盤，每孔分析包 含：40微升CYP P450酵素溶液（於陰性對照樣本 40微升之O.lMNa-Κ-磷酸緩衝液pH 7.4,無酵素添 加）；40微升輔因子混合；2微升化合物或參考抑制 劑用於陰性對照樣本或溶劑用於陽性對照樣本。於 37°C在震盪培養箱中預培養5分鐘後，添加20微 升受質溶液。將盤於 37°C培養 10分鐘 (CYP3A4/DBF) > 15 分鐘（CYP1A2)、30 分鐘 (CYP2C9、CYP3A4/BFC 及 CYP3A4/7-BQ & CYP2C19)及45分鐘（CYP2D6)。反應經由添加200 微升乙腈而終止。對於CYP3 A4/DBF，反應經由添 加200微升2M NaOH而終止。對於CYP3A4/7-BQ， 反應經由添加40微升Tris/乙腈（1 : 5)(V : V，之後 於2000 rpm離心10分鐘）。經由螢光Victor2(Wallac) 104 201038552 或Fluoroskan(Labsystems)讀取機偵測螢光信號。不 同酵素及其特異性基質之激發及放射波長敘述於 表6。 表6:激發及放射波長 -酵素 受質 激發波長 放射波長 CYP1A2 CEC 410奈米 460奈米 CYP3A4 BFC 405奈米 535奈米 CYP3A4 DBF 485奈米 538奈米 CYP3A4 7-BQ 405奈米 535奈米 CYP2C9 MFC 405奈米 535奈米 CYP2C19 CEC 410奈米 460奈米 CYP2D6 AMMC 390奈米 460奈米 參考資料 [1] Microtiter Plate Assays for Inhibition of human, Drug-Metabolizing Cytochromes P450

Charles L. Crespi, Vaughn P. Miller, Bruce W. Penman(Gentest) Analytical Biochemistry 248, 188-190(1997) Article n° AB972145 [2] Novel High Throughput fluorescent P450 assays V.P. Miller, J. Ackermann, D.M. Stresser, C.L. Crespi Gentest Internet site· 105 201038552 表7提供當與先前技術之化合物比較時，測試 於7個試驗之本發明化合物（化合物編號18、20、9、 14及4)的數據。如上所述，測試五種P450酵素， 其中之一在三種不同基質上（因此總計7個試驗）。 在表7中指出在多少P450試驗中，化合物顯示具 有IC5〇 < 1.00E-06之抑制活性。 表7 : CYP抑制上之比較資料 化合物 Ρ450 影響 IC50 ό ΕΡ1809622之化合物47 7次 <1.00E-06 ό ΕΡ1809622之化合物36 3次 <1·00Ε-06 ό Ύ Ν ΕΡ1809622之化合物197 7次 <1.00Ε-06 CA Η Ν ΟΗ ΕΡ1809622之化合物195 0次 <1.00Ε-06 106 201038552

107 201038552 C-4.R〇-4-1284在小鼠之拮抗作用M，5 試驗係修改Colpaert et al.(1975)3所述之程 序雄性NMRI小氣（22士3克）圈養於macrolon觀察 籠（L X W X Η : 11x12x17公分；n=每籠3隻）。在開 始貝驗時，緊接投與測試化合物之前，以經由插入 電子溫度計（Comark)之熱感應探針（直徑1〇毫米） ，食道3公分之固定深度，直到獲得穩定之讀數， 量測小鼠之起始體溫至精確度〇 ·丨。以刻度顯微 鏡量測右眼瞳孔直徑，並以1/24毫米單位表示。投 與測试化合物15分鐘後，以R〇_4_1284(1〇毫克/公 斤，s.c.)考驗小鼠，1^0-44284為一種類蛇根鹼 (reSerpine-like)囊泡膜上轉運（vesicular m〇n〇amine VMAT_2)抑制劑，其快速地耗盡分泌囊 ’包 在考驗15、30及60分鐘後，將小鼠之眼 驗張開（0小2、3、4、5)及移動活動力（_卜〇、卜 2、3)記分。於60分鐘之間隔，緊接在記分明顯的 仃為後，再次量測右眼瞳孔直徑及食道溫度。紀錄 反常現象，例如密集吸氣、口且嚼、賢直、充血、軟 毛、流涎、顫抖、抽搐及死亡（當發生在R〇_4_i2^ 投與之前時’亦紀錄後面現象）。對於藥物引發 之判定標準：反覆眼瞼下垂：眼瞼張開積分 15、30或60分鐘（各為27、〇5及〇%僞陽· ^^叫：誘發虛脫：積分一於運動^/: :鐘(未見於對照組)；反覆運動減弱：積分 動15、30及60分鐘（久先”、n Q 於運 照反覆瞳孔縮小:(=> .= 僞陽性對 直位3早位，於60分鍺 108 201038552 (0·8%僞陽性）；加強低體溫效力：溫度降低（超過小 時時間間隔）>9.〇°C(1.4%僞陽性）；反覆體溫降低： 溫度降低<3.〇°C(1.8%僞陽性）。 根據標準程序，R0-4-1284依皮下注射或口服 投與15分鐘，並開始觀察15分鐘。劑量開始給予 3隻動物，當3隻動物中至少2隻對於至少一種觀 察顯示活性，則化合物被認為是有效的。在其他情 況，化合物在特定時間-路徑-劑量攝生法被認為是 〇 無效的，並歸類為完成。 化合物編號 20、18、1、27、24、、30、 7、29、28、26及17依口服投與濃度8〇毫克/公斤 各測試於3隻動物，且其並未顯示在反覆瞳孔縮 小、反覆眼瞼下垂、反覆體溫降低上之活性。化合 物4僅測試40毫克/公斤，且並未顯示在反覆瞳孔 縮小、反覆眼瞼下垂、反覆體溫降低上之活性。 EP 1809622之化合物亦於相同試，驗中測試，且 Q 結果顯示於下表8。 表8 :比較數據

109 201038552 化合物 藥劑誘導神 經學副作用 ό H EPl809622之化合物36 是 1 H 1 ό EP1809622之化合物197 是 jCrN^0 (A H N OH EP1809622之化合物195 是 力^]〇 Ca h N OH EPl809622之化合物229 是 參考資料 [3] Colpaert, F.C., Lenaerts, F.M., Niemegeers, C.J.E., Janssen, RAJ. ： "A critical study on Ro-4-1284 antagonism in mice.", Arch. Int. Pharmacodyn. 215 40-90(1975).

[4] Colzi, A., D'Agostini, R., Cesura, A.M., Borroni, E., Da Prada, M. : "Monoamine oxidase-A inhibitors and dopamine metabolism in rat caudatus · evidence that an increased cytosolic level of dopamine displaces reversible monoamine 110 201038552 oxidase-A inhibitors in vivo.", J. Pharmacol. Exp. Ther. 265 103-111(1993).

[5] Filinger，E.J.: "Effect of a reserpine-like agent on the release and metabolism of [3H]NA in cell bodies and terminals.", Gen. Pharmacol. 25 1039-1043(1994). C.5膜片钳制試驗（patch-clamp test)-在HEK293細胞 之經HERG調控K+電流之抑制 〇 使用穩定表現HERG鉀通道之ΗΕΚ293細胞進 行實施例，細胞於37°C及5%C02之培養瓶中，生長 於補充10%熱去活化胎牛血清、1% L_麩醯胺酸-青 黴素-鏈黴素-溶液、1%非必要胺基酸（ΙΟΟχ)、1%丙 酮酸鈉（100 mM)及0.8%遺傳黴素（Geneticin)(50毫 克/毫升）之MEM培養基。使用前，將細胞再次培養 於不含5毫升L-麩醯胺酸-青黴素-鏈黴素之MEM培 養基。用於自動化膜片钳制系統PatchXpress 0 7000A(Axon Instruments)，將細胞收取以獲得單一 細胞之細胞懸浮液。 細胞外溶液包含（mM) : 150 NaCH、4 KC1、1 ]\^(：12、1.8€&(：12、10 1^?£8、5葡萄糖（？117.4以 NaOH調整）。吸量管溶液包含(mM) : 120 KC卜10 HEPES'5 EGTA'4 ATP-Mg2'2 MgCl2O.5 CaCl2(pH 7.2以KOH調整）。 膜片鉗制實驗在電壓-鉗模式進行，且全細胞電 流以利用 PatchXpress 7000A系統（Axon Instruments) 111 201038552 之自動化膜片钳制分析記錄。經由Multiclamp放大 器放大及數位化電流信號，經由PatchXpress、 DataXpress軟體及 Igor 5.0(Wavemetrics)儲存及分 析。 鉗制電位（holding potential)為-80 mV，在 2秒去 極化至+60 mV後，確定HERG電流（K+-選擇性流出 電流）為最大尾電流於-40 mV。脈動循環率為15秒。 在各試驗脈動前，獲得由鉗制電位至-60mV之短暫 脈動（0.5秒）’以確定（線性）漏流（leak current)。在建 立全細胞組態及穩定期後，施用媒劑5分鐘，之後 經由10-7 Μ、3x10-7 Μ及3x10-6 Μ之漸增濃度施用 測試物質。各測試物質之濃度施用二次，各濃度之 效果以5分鐘後3個連續電壓脈動之平均電流確 定。為了確定阻斷的程度，將殘餘電流與預測試之 媒劑相比較。數據（表9)以相較於對照組（對照組為 100%)之百分比抑制的平均值（如果可得，±平均值 之標準差（SEM))呈現。 表9 :於ΗΕΚ293細胞之經HERG調控Κ+電流之抑制 112 201038552

化合物 1.107 Μ 3.107 Μ 3.106 Μ ό Η ΕΡ1809622之化合物47 76 58 13 j Η 1 ό ΕΡ1809622之化合物187 68 36 5 <Α Η Ν ΟΗ ΕΡ 1809622之化合物195 80 65 19 jcr^gO Ca η ^ OH EP1809622之化合物229 81 63 18 jT-gO Ca h N 、OH EP1809622之化合物110 86 66 22 Op H 〇、 EP1809622之化合物21 35 8 0 EP1809622之化合物112 74 45.7 5.7 113 201038552 化合物 1.107 Μ 3.107 Μ 3.10 6 Μ ό Η：χ 化合物編號2 89 75 18 方 0Qr ηΛ OH 化合物編號20 88 76 26 ,Λν^χο 0qs a OH 化合物編號18 90 82 % 41 方 09 Η0^ OH 化合物編號1(η=4) 86 ±2.5 82± 1.1 69±5·1 _1 〇、 化合物編號7(η=3) 86 ± 2.9 53 ±6.8 2 ±0.3 ^Ν^πη OH 編號6 89 87 69 114 201038552

化合物 1.107 Μ 3.10 7 Μ 3.10 6 Μ "α〇Η OH 編號17 84 70 21 (¾ '。 OH 編號12 87 78 58 jcy^^ OH w OH 編號13 91 85 75 (X '。 OH 編號19 89 72 26 jcVn^ 6, '。 OH 編號5 89 74 33 V HO— 中 \ NH 編號22 76 49 9 115 201038552 化合物 1.107 Μ 3.107 Μ 3.10 6 Μ η H0卜 w OH 編號15 93 88 66 OH 編號21 91 86 65 (¾ Η > OH 編號9 87 72 f 47 (¾ Ηη〇 OH 編號 11(η=3) 90 ±8.7 80 ± 7.2 43 ±3.3 OH 編號14 84 57 10 編號4(n=3) 89 ±4.2 85 ± 1.7 66 ±3.3 116 201038552

化合物 1.107 M 3.10 7 M 3.106 M HO 編號 1〇(ϊΐ=3) 82 ±2.1 72 ± 2.6 62 ±1.8 (¾ H) Os 編號8(n=3) 93 ± 7.3 83 ± 6.4 25 ± 5.4 °\ 編號 16(n=3) 89 士 6.0 74 士 7·9 34 ±4.4 勿 〇H OH 編號 23(11=3) 92 ±1.0 87 ± 2.0 72 ± 0.4 r 0 xf办汾 H 編號 27(n=3) 90 ±1.8 75 土 3.3 53 ±8.1 ( OH 編號 24(n=3) 88 ±3.2 77 ± 4.2 29 ±2.9 117 201038552 化合物 1.107 Μ 3.107 Μ 3.10 6 Μ

編號 25(11=3) ΟΗ

編號 31(η=3)

編號 26(η=3)

82 ± 1.7 65 ±2.8 27 ±2.7 91 ±0.9 87 ± 1.7 98 ± 1,6 82 ± 2.3 78 ± 1.8 93 ± 6.3 55 ±3.8 51 ±5.9 80±7_2 118 201038552 化合物 1.107 Μ 3.107 Μ 3.10'6Μ 編號 30(n=3) J^OH 編號 29(n=3) 89 ±2.3 82 ±3.9 39 ±0.8 編號 28(n=4) 84 ±4.4 79 ± 8.8 60 ± 6.4 Ο 令人驚訝地，本化合物顯示優異之活體外活 性，其兼備對於Ρ450酵素低親合性及無活體内藥劑 誘導神經學效果及低心血管效果。 C.6.活體内抗腫瘤效果 活體内抗腫瘤活性可如下試驗： NCI標準參考資料：

Bissery, Μ-C., and Chabot, G.G. History and new development of screening and evaluation methods of anticancer drugs used in vivo and in vitro. Bull. Cancer. 1991, 78 ： 587-602. 動物模式： 免疫缺陷（無胸腺）小鼠NMRI(WA^)裸鼠 (20-25克，獲自Janvier，France)用於這些研究，初始 體重接近23至34克。所有動物維持在SPF “完全隔 離”與自由取用食物及飲水條件之下。將小鼠分組圈 119 201038552 養於12小時白日：黑夜循環（光照於06 : 00小時）、 溫度於19至22°C及濕度35至40%之Techniplast第3 型IVC籠中。小鼠飼養標準實驗室飼料。所有實驗 依據 European Communities Council Directives(86/609/EEC)進行，且必須經由地方倫理 委員會核准。為了建立腫瘤異體移植模式（腫瘤體積 〜200毫米3)，根據腫瘤體積，以每一測試組1〇至14 隻小鼠隨機化小鼠。 測試系統： 人類U87神經膠質瘤腫瘤細胞株由44歲女性 白種人病患取得，細胞於37°C、濕潤氣壓（5% C02， 95%空氣），培養於補充2 mM L-麩醯胺酸、2.0 mM 丙酮酸鈉、25單位/毫升青黴素/25微克/毫升鏈黴素 及10%胎牛血清之DMEM培養基中。使用下列程 序，以每T175瓶3x106個細胞，每週繼代二次，將 細胞維持在單層細胞培養。簡而言之，在添加胰蛋 白酶-EDTA至培養瓶之前，細胞以PBS(不含Mg2+、 Ca2+)洗滌。細胞分離後，以添加完整培養基將胰蛋 白酶-EDTA去活化。然後將細胞懸浮液轉移至50 毫升Falcon試管，並以1200 rpm離心3分鐘。吸 出培養基，且細胞再懸浮於適當體積之完整培養基 中。於血球計數器中計數細胞，且以0.25%剛果藍 (trypan blue)排除法估計其發育能力。然後將適當體 積之細胞懸浮液添加至含新鮮培養基之新的T175 培養瓶或滾瓶中。為了 U87腫瘤細胞大規模生長， 在接種於小鼠前，以0.5至lxl〇7個細胞接種於適 120 201038552 15%起始體重時被認為為臨床毒性，且將動物自研 究中移除並予以犧牲。腫瘤生長之時間進程以中位 數值表示，或標準化成為開始治療之曰之起始腫瘤 體積，並表示為平均值±平均值之標準差（SEM)(每 組7至10隻動物）。關於預先建立之腫瘤，計算各 小鼠之相對腫瘤體積（被治療腫瘤體積/第〇日之腫 瘤體積），且對於每一治療組別表示為平均值 土SEM。最後處理之24小時後，將動物犧牲，切除 〇 腫瘤並秤重。經由Wilc〇xon-Mann-Whitney分析之 單邊值（魏克森等級和檢定；wilc〇x〇n rank印瓜 test)表不統計之顯著性，且户<〇 〇5被認為為具有統 計上之意義。使用NCI標準，根據最終相對腫瘤體 積計算測試/對照（T/C)比例，T/C比例之有效標準為 42%。 ‘ D.組成物樣本：膜衣旋 錠劑核心之製備 ❹ 將10〇克式⑴化合物、570克乳糖及200克澱 粉之混合物充份混合，之後以含5克十二基硫酸鈉 及1〇克聚乙烯吡咯酮於約2〇〇毫生之水的溶液潤 濕。將濕性粉末混合物過篩、乾燥並再次過篩，然 後添加100克微晶纖維素及15克氫化蔬菜油。將 整體充份混合，並壓製成錠劑，獲得1〇〇〇〇顆錠 劑’各含10毫克之式⑴化合物。 塗覆 在含10克甲基纖維素之75毫升變性乙醇溶液 中，添加含5克乙基纖維素之15〇毫升二氯甲烷溶 222 201038552 當數量之滾瓶1週。在此期間充填培養基二次，且 最後充填曰係在細胞注射之前。除了離心後之外， 如上所述收集細胞，細胞再懸浮於冷的無血清 培養基中。小鼠於鼠蹊部位以總計1χ1〇7個細胞之 200微升體積注射。 研究設計： 於第〇日（D0)，將人類U87神經膠質瘤細胞直 接注射於雄性NMRI裸鼠之鼠蹊部位（1><1〇7個細胞 /200微升/動物）。於第8曰⑽），當腫瘤體積已達 約平均200毫米3 ’根據腫瘤體積，以每一測試組 10至14隻小鼠隨機化小鼠。然後以媒劑（1 〇% ΗΡ-β-CD)或含測試化合物之媒劑強迫投與（p.〇_)體 積10毫升/公斤體重，將小鼠每曰測試一次（QD)， 計21日。腫瘤大小及體重每週量測二次，並在治 療期間，每日監視小鼠毒性之臨床症狀。毒性之^ 床症狀包括（但不限於）持續食慾不振或脫水、臥 姿、垂死、昏睡、體溫下降及/或用力呼吸（根據用 於實驗腫瘤形成之動物福利之UKCCCR指南（The UKCCCR(UK Coordinating Committee on Cancer

ResearchXJuly 1997);及 Workman，p 以 UKCCCR guideline.方r. 乂 Ctfwcer. 1998, 77 : i_i〇)。 資料分析： ^ 對於每一個別動物，體重及腫瘤大小[使用通常 認可的方程式：腫瘤體積（毫米3)=(axb2/2);其中 ‘a’代表長度，而‘b，代表經測徑器量測所決定之腫瘤 寬度]在研究期間每週監測2次。持續體重減少大二 121 201038552 液。然後添加75毫升二氯甲烷及2 5毫升丙 三醇，將10克聚乙二醇熔化並溶解於75毫升二氯 甲烷，將後述溶液添加至前者中，然後添加2·5克 十八酸鎂、5克聚乙烯吡咯酮及3〇毫升濃縮著色懸 浮液’並將整體均質化。在塗覆裝置中錠添 ^ 此所得之混合物塗覆。 X、以 【圖式簡單說明】 广' 益 【主要元件符號說明】

123

Claims (1)

1. 201038552 七、申請專利範圍： 1. 一種式（I)化合物，

   包括其任何立體化學異構型式，其中 R1為羥基烷基或c2_6烯基；前提為R1取代基位於 吲哚部分的位置6或7 ; R2為氫或cN4烧基； z為選自下列之基

   R 一起形成酮基； 藥可接受性鹽或其溶劑化物。 潰專利範圍第1項之化合物， R3為氫或羥基Cw烧基； R4為羥基或(^_4烷氧基； R5為氫或Cm烷基；或 R4及R5 —起形成酮基； 其醫藥可接受性鹽或其; 其中該化合物具有 如申請專利範圍第！項 下式

   124 201038552 ^ 3. 如申請專利範圍第i或2項之化合物’其中Rl為羥 基c 烧基。 4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之化合物，其中 R為Ci_4燒基。 5·如申請專利範圍第1至4項中任一項之化合物，其中 z為式（z-1)之基。 ' 6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之化合物，其中 z為式（z-2)之基。 7. 如申請專利範圍第6項之化合物，其中R4為羥基且 R5為氫。 8. 如申請專利範圍第6項之化合物，其中R4為羥基且 R5為Cb4烧基。 9. 如申請專利範圍帛1項之化合物，其中該化合物為且 有下式之對映異構物， /、

   =左旋旋光性，其以納（589奈米）之D'線 -二==:及晶格路徑長度1公寸，在濃度 氅克/毫升之氧仿中量測；或 ”醫藥可接受性鹽或其溶劑化物。 為Γ有申圍第1項之化合物，其中該化合物 有下式之對映異構物， 125

   且具有右旋旋光性’其以鈉（589奈米）之D'線波長的 光’於^度2〇c>c，及晶格路徑長度1公寸，在濃度 10.33亳克/毫升之曱醇中量測；或 其醫藥可接受性鹽或其溶劑化物。 U· 一種使用作為藥劑之中請專利範圍第1至H)射任 一項之化合物。 12. 一種醫f組成物，其包含醫藥上可接受载劑及治療 上有效量之作為活性成分的申請專利範圍第丨至ι〇 項中任一項之化合物。 A-種申請專利範圍第以1〇項中任一項之化合物於 製造治療癌症藥劑上之用途。 14. 一種一或多種抗癌劑與申請專利範圍第1至1〇項中 任一項之化合物之組合物。 、 15. -種製備申請專利範圍第】項之化合物之方法，其◎ a)於任意地有鹼存在之反應_惰性溶劑中，將式 中間產物與式（III)中間產物反應，其中^為適^之 離去基，或在適當之催化劑、適當之配位基、^去 之鹼及適當的溶劑存在下，將式（11)中間產物與 = t間產物反應，其尹W!為適當之離去基， ） 126 201038552

   (Π)

   + Z-W! -^ (III)

   1 ® 且R、R2及ζ如申請專利範圍第i項之定義； b)在適當之還原劑及適當之溶劑存在下，反應對應 之式（IV)羰基衍生物，

   且R及Z如申請專利範圍第1項之定義； c)在適當之還原劑及適當之溶劑存在下，反應相對 應之式（V)酯衍生物，其中Rx代表-Ci-3烷基 c(=o)oc〗_4 烷基，

   R2 油、〉~NH—2 00 且r2及f如申請專利範圍第1項之定義·， d)在適當之溶劑存在下，以適當之鹼水解式（VI)中 間產物， 127 201038552

   (VI)

   2 (I-l-a) 如申請專利範圍第1項之定義； 已知之轉換方法將式⑴化合 人 、"果而要，經由以酸處理將式（I)化 ".換成治療上活性無毒性酸加成鹽，或經由以 处理將式⑴化合物轉換成治療上活性無毒性驗加 成鹽，或相反地，經由以鹼金屬處理將酸加成鹽形 式轉換成游離鹼，或經由以酸處理將鹼加成鹽轉換 成游離酸；或如果需要，製備其立體化學異構型式 或溶劑化物。 128 201038552 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（無）圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 無 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：

   (I) 2