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TW201036626A - Alpha-4-beta-7 heterodimer specific antagonist antibody - Google Patents

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TW201036626A
TW201036626A TW099107689A TW99107689A TW201036626A TW 201036626 A TW201036626 A TW 201036626A TW 099107689 A TW099107689 A TW 099107689A TW 99107689 A TW99107689 A TW 99107689A TW 201036626 A TW201036626 A TW 201036626A
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Ian Foltz
Taruna Arora
Frederick W Jacobsen
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Amgen Inc
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Publication date
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Description

201036626 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本申凊案提供一種關於a4p7雜二聚體專一性抗原結合蛋 白之組合物及方法。 本申明案根據35 U.S.C. 119(e)之規定主張2〇〇9年3月20 曰申請之美國專利申請案第W/M2J54號及2〇1〇年2月22日 申明之美國專利申請案第61/3〇6,829號的權益該兩個申 請案皆以引用的方式併入本文中。 ® 【先前技術】 . 整合素為由兩個次單元（一個α次單元及一個β次單元）形 . 成之雜二聚體1型跨膜蛋白，且介導許多不同的細胞-細胞 及細胞-細胞外基質相互作用。在功能方面，整合素已顯 示參與眾多生物過程，包括白血球遷移與再循環及免疫反 應。在哺乳動物中，存在18種已知α次單元及8種已知 單元，該等次單元組合形成24種不同整合素。配位體專一 〇 性在彳艮大程度上係由所表現之α次單元與β次單元之特定組 合來決；t，而對配位體之親和力由整合素構形變化調節且 具一價&離子依賴性。 整合素之配位體形成結構上不同之群，其包括細胞外基 質蛋白，諸如膠原蛋白、纖維結合蛋白（fibronection)、玻 璃連結蛋白（Vitronectin)及層黏連蛋白（laminin);相對受 體，諸如細胞黏附分子（例如灰管細胞黏附分子或 VCAM);及血㈣白。眾多病原性微生物亦利用整合素來 引發感染或作為毒素結合位點。結構上不同之配位體共有 146681.doc 201036626 暴露之麩胺酸或天冬胺酸殘基，該殘基通常存在於延伸之 可撓性環中且對由整合素識別而言較為重要。 α4整合素（α4與βΐ或β7次單元搭配）在免疫系統中起重要 作用。α4β 1於淋巴細胞及骨髓細胞上表現；其似乎為血管 細胞黏附分子（VCAM)之主要結合搭配物。VCAM普遍表 現於血管内皮細胞上，在發炎期間上調，且結合α4β7以及 α4β 1 (不過與α4β7結合較弱）。雖然在周邊Τ細胞、Β細胞、 ΝΚ細胞及嗜伊紅血球上亦偵測到α4β7，但α4β7最主要表 現於CD4 + CD45RA-記憶Τ細胞之亞群上，該亞群已顯示優 先駐留於腸中。α4β7雜二聚體之主要配位體為於腸内皮細 胞中表現之黏膜地址素細胞黏附分子1 (mucosal address in cell adhesion molecule 1，MAdCAM-1 或 MAdCAM)。 除與α4鏈配對以外，β7次單元亦與αΕ搭配形成αΕβ7， 該αΕβ7主要表現於腸、肺及泌尿生殖道中之上皮内淋巴細 胞（IEL)上。αΕβ7亦表現於腸中之樹突狀細胞上。αΕβ7雜 二聚體與表現上皮細胞上之E-#弓黏素（E-cadherin)結合。據 信，IEL細胞提供上皮區内免疫監視之機制。 結合α4且抑制α4β1與VCAM-1及纖維結合蛋白之結合的 抗體定位於α4中具52個胺基酸之區域，該區域介於殘基 152 與 203 之間（Schiffer 等人，J· Biol. Chem. 270:14270; 1995)。Tidswell等人（J. Immuno 159:1497; 1997)在小鼠 / 人 類嵌合β7次單元方法中利用一組結合β7之抗體鑑別出對與 MAdCAM-Ι結合重要之β7域。其發現七種抑制與 MAdCAM-Ι及Ε-鈣黏素結合之抗體中有六種定位於包含胺 146681.doc 201036626 基酸176至250之區域，該區域似乎與其他整合素次單元之 金屬離子依賴性黏附位點（MIDAS)具有同源性。Tidswell 等人所用之抗體之一為α4β7雜二聚體專一性抗體，稱作 ACT-1。 ACT-1 抗體最初由 Lazarovitz 等人（J. Immunol· 133:1857; 1984)描述為藉由以來自PBMC之人類破傷風類毒素 (tetanus toxoid)專一性τ淋巴細胞株免疫小鼠而產生之抗 體。稍後顯示，ACT-1與α4β7雜二聚體專一性結合 (Schweighoffer 等人，J. Immunol. 151:717，1993)。儘管 ACT-1並不結合鼠類α4β7，但其結合來自至少一些非人類 靈長類動物物種之α4β7，且已顯示減輕豢養棉冠獠狨 (cotton-top tamarin)之自發性結腸炎（Hesterberg 等人， Gastroenterology 111:1373; 1996) ° 已對ACT-1進行人類化且經評估作為潰瘍性結腸炎之人 類治療劑（Feagan等人，N Engl J Med. 352:2499; 2005)， 且近來作為克羅恩氏病（Crohn's disease)之人類治療劑 (Feagan 等人，Clinical Gastroenterology and Hepatology, 6:1370，2008)。人類化ACT-1亦稱為維多珠單抗 (ve do lizumab )，且描述於 WO 98/06248及美國專利 7,147,85 以及W0 07/061679及US 2007-0122404中。另一人類化抗 體那他珠單抗（natalizumab ’ Tysabri®)已用於治療克羅恩 氏病。那他珠單抗為α4專一性鼠類抗體之人類化型式。維 多珠單抗已顯示在一部分患者中產生中和抗人類化抗體反 應，且那他珠單抗已與進行性多病竈腦白質病（PML)相 146681.doc 201036626 關，PML為與免疫功能不全個體中先前感染之JC病毒再活 化相關聯的神經病症。因此，需要一種改善此等不足，同 時破壞a4p7/MAdCAM-l路徑之治療劑。 【發明内容】 在一態樣中，本發明提供一種與人類α4β7專一性結合之 經分離抗原結合蛋白（亦即，α4β7雜二聚體專一性抗原結 合蛋白）。在本發明之另一態樣中，抗原結合蛋白與非人 類靈長類動物、獼猴、黑猩猩、非靈長類哺乳動物、齧齒 動物、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、I苗或狗之α4β7專一性 結合。在另一實施例中，經分離抗原結合蛋白包含人類抗 體、嵌合抗體、單株抗體、重組抗體、抗原結合抗體片 段、單鏈抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、 Fab片段、F(ab’）2片段、域抗體、IgD抗體、IgE抗體、IgM 抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、IgG4抗體，或在 鉸鏈區中具有至少一個降低Η鏈内二硫鍵形成趨勢之突變 的IgG4抗體。在另一態樣中，經分離抗原結合蛋白包含上 述抗體之·—的重鍵怪定區，在另一態樣中’該恒定區為包 含SEQ ID NO:72之多肽，與SEQ ID NO:72至少90%—致之 多肽，具有已移除一個、兩個、三個、四個或五個N端及/ 或C端胺基酸之SEQ ID NO:72所述胺基酸序列的多肽，或 含_有一或多個轉譯後修飾之上述多狀之一。在一實施例 中，經分離抗原結合蛋白包含κ輕鏈恆定區；在另一實施 例中，其包含λ輕鏈區。在一實施例中，輕鏈恆定區為包 含SEQIDNO:70之多肽，與SEQIDNO:70至少90%—致之 146681.doc 201036626 多肽，具有已移除一個、兩個、三個、四個或五個N端及/ 或C端胺基酸之SEQ ID NO:70所述胺基酸序列的多肽，或 含有一或多個轉譯後修飾之上述多肽之一。 本發明之一實施例提供一種具有各包含一或多個互補決 定區或CDR之重鏈及輕鏈之α4β7雜二聚體專一性抗原結合 ' 蛋白。在本發明之另一態樣中，重鏈可變區包含CDR1、 CDR2及CDR3，且輕鏈可變區包含CDR1、CDR2及CDR3， 其中各個各別CDR係選自由以下組成之群：SEQ ID ΝΟ:55 ❹ 之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3，及SEQ ID ΝΟ:58之重鏈 ' CDR1、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:56 之輕鏈 CDR1、 • CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:59 之重鏈 CDR1、CDR2 及 CDR3 ;以及SEQ ID NO:57 之輕鏈 CDR1、CDR2 及 CDR3， 及 SEQ ID NO:60 之重鏈 CDR1、CDR2 及 CDR3。 在本發明之另一態樣中，重鏈可變區進一步包含四個構 架區（FR)，稱為FR1、FR2、FR3及FR4 ;且輕鏈可變區進 Q 一步包含四個構架區（FR)，稱為FR1、FR2、FR3及FR4。
在一態樣中，FR係選自與CDR相同之SEQ ID NO ;在另一 態樣中，FR係選自不同SEQ ID NO。在另一實施例中，本 發明提供一種α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白，其中輕 . 鏈可變區包含SEQ ID ΝΟ:55，且重鏈可變區包含SEQ ID NO:58 ;輕鏈可變區包含SEQ ID NO:56，且重鏈可變區包 含SEQ ID NO:59 ;或輕鏈可變區包含SEQ ID NO:57，且 重鏈可變區包含SEQ ID NO:60。 在本發明之另一態樣中，本發明提供一種具有各包含一 146681.doc 201036626 或多個互補決定區或CDR之重鏈及輕鏈之經分離α4β7雜二 聚體專一性抗原結合蛋白。在本發明之另一態樣中，重鏈 可變區包含CDR1、CDR2及CDR3，且輕鏈可變區包含 CDR1、CDR2及CDR3。在一實施例中，輕鏈CDR係選自 由以下組成之群：分別與SEQ ID ΝΟ:3之CDR1、CDR2及 CDR3 至少 90%—致之 CDR1、CDR2 及 CDR3 ;分別與 SEQ ID ΝΟ:5 之 CDR1、CDR2 及 CDR3 至少 90%—致之 CDR1、 CDR2 及 CDR3 ;分別與SEQ ID ΝΟ:7 之 CDR1、CDR2 及 CDR3 至少 90%—致之 CDR1、CDR2 及CDR3 ;分別與SEQ ID ΝΟ:22之 CDR1、CDR2及 CDR3 至少 90%—致之 CDR1、 CDR2 及 CDR3 ;及分別與 SEQ ID ΝΟ:24 之 CDR1、CDR2 及 CDR3至少90%—致之CDR1、CDR2及CDR3 ;且重鏈可變 CDR1、CDR2及 CDR3係來自 SEQ ID ΝΟ:58。 在本發明之另一態樣中，重鏈可變區進一步包含四個構 架區（FR)，稱為FR1、FR2、FR3及FR4 ;且輕鏈可變區進 一步包含四個構架區（FR)，稱為FR1、FR2、FR3及FR4。 在一態樣中，FR係選自與CDR相同之SEQ ID NO ;在另一 態樣中，FR係選自不同SEQ ID NO。在另一實施例中，本 發明提供一種α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白，其中輕 鏈可變區係選自由以下組成之群：與SEQ ID ΝΟ:3至少 90%—致之輕鏈可變區；與SEQ ID ΝΟ:5至少90%—致之輕 鏈可變區；與SEQ ID ΝΟ:7至少90%—致之輕鏈可變區； 與SEQ ID ΝΟ:22至少90%—致之輕鏈可變區；及與SEQ ID NO:24至少90%—致之輕鏈可變區；且重鏈可變區包含 146681.doc 201036626 SEQ ID NO:58。 本發明之另一態樣提供一種經分離α4β7雜二聚體專一性 抗原結合蛋白，其具有包含CDR1、CDR2及CDR3之重鏈 可變區與包含CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變區，其中 輕鏈CDR1、CDR2及CDR3係選自由以下組成之群：分別 與 SEQ ID ΝΟ:12之 CDR1、CDR2及 CDR3 至少 90%—致之 CDR1、CDR2 及 CDR3 ;分別與 SEQ ID ΝΟ:25 之 CDR1、 CDR2 及 CDR3 至少 90%—致之 CDR1、CDR2 及 CDR3 ;及分 別與8丑(^10 1^0:26之€0111、00112及€0113至少90%—致之 CDR1、CDR2 及 CDR3 ;且重鏈CDR1、CDR2 及 CDR3 係選 自由以下組成之群：分別與SEQ ID ΝΟ:41之CDR1、CDR2 及CDR3至少90%—致之CDR1、CDR2及CDR3 ;及分別與 SEQ ID ΝΟ:54 之 CDR1、CDR2 及 CDR3 至少 90% —致之 CDR1、CDR2及CDR3。在一實施例中，輕鏈可變區係選 自由與SEQ ID ΝΟ··12、25及26中任一者至少90%—致之可 變區組成之群，且重鏈區係選自由與SEQ ID ΝΟ:41及54中 任一者至少90% —致之可變區組成之群。在本發明之另一 態樣中，重鏈可變區進一步包含四個構架區（FR)，稱為 FR1、FR2、FR3及FR4 ;且輕鏈可變區進一步包含四個構 架區（FR)，稱為FR1、FR2、FR3及FR4。在一態樣中，FR 係選自與CDR相同之SEQ ID NO ;在另一態樣中，FR係選 自不同SEQ ID NO。 在一實施例中，本發明提供一種經分離α4β7雜二聚體專 一性抗原結合蛋白，其具有包含CDR1、CDR2及CDR3之 146681.doc 201036626 重鏈可變區與包含CDRl、CDR2及CDR3之輕鏈可變區， 其中各個各別CDR與選自由以下組成之群的CDR至少90% 一致：SEQ ID NO:10之輕鏈 CDRl、CDR2及 CDR3，及 SEQ ID NO:38 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:2 之輕鏈CDRl、CDR2及CDR3，及SEQ ID NO:30之重鏈 CDRl ' CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:20 之輕鏈 CDRl、 CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:51 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:ll 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:39 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:13 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:42 之重 鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:17 之輕鏈 CDRl、 CDR2及 CDR3，及 SEQ ID NO:46之重鏈 CDRl、CDR2及 CDR3 ; SEQ ID NO:8 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:36 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:19 之 輕鍵 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:49 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:18 之輕鏈 CDRl、 CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:47 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:21 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:52之重鏈 CDRl、CDR2及 CDR3 ; SEQ ID NO:3 之輕鏈CDRl、CDR2及CDR3，及SEQ ID NO:31之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:7 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID ΝΟ·35 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:6 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:34 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:l 之輕鏈 146681.doc 201036626
CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:29 之重鏈 CDRl、 CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:22 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:50之重鏈 CDRl、CDR2及 CDR3 ; SEQ ID N〇:24 之輕鏈 CDRl、CDR2及 CDR3，及 SEQ ID NO:40之重鍵 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:9之輕鏈 CDRl、CDR2及 CDR3，及 SEQ ID NO:37 之重鏈 CDRl、 CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:4 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID ΝΟ_·32 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:28 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:53 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:16 之輕鏈 CDRl、CDR2及 CDR3，及 SEQ ID NO:45 之重鏈 CDRl、 CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO: 15 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:44 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:14之輕鏈 CDRl、CDR2及 CDR3，及 SEQ ID NO:43 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:27 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:43 之重鏈 CDRl、 CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:5 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:33 之重鏈 CDRl、CDR2及 CDR3 ; SEQ ID N〇：12 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:41 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:23 之輕鏈 CDRl、CDR2及 CDR3，及 SEQ ID NO:48 之重鏈 CDRl、 CDR2 及 CDR3 ; SEQ ID NO:25 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:54 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ;及 SEQ ID NO:26之輕鏈 CDRl、CDR2及 CDR3，及 SEQ ID -11 - 146681.doc 201036626 NO:54之重鏈CDRl、CDR2及CDR3。在另一態樣中，重鏈 CDR及輕鏈CDR與所列SEQ ID NO之各別CDR—致。在本 發明之一實施例中，重鏈可變區進一步包含四個構架區 (FR)，稱為FR1、FR2、FR3及FR4 ;且輕鏈可變區進一步 包含四個構架區（FR)，稱為FR1、FR2、FR3及FR4。在一 態樣中，FR係選自與CDR相同之SEQ ID NO ;在另一態樣 中，FR係選自不同SEQ ID NO。 在另一實施例中，α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白包 含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中輕鏈可變區與SEQ ID NO:10至少90%—致，且重鏈可變區與SEQ ID NO:38至少 90%—致；輕鏈可變區與SEQ ID NO:2至少90%—致，且重 鏈可變區與SEQ ID NO:30至少90%—致；輕鏈可變區與 SEQ ID NO:20至少90% —致，且重鏈可變區與SEQ ID N0:51至少90%—致；輕鏈可變區與SEQ ID ΝΟ:11至少 90%—致，且重鏈可變區與SEQ ID NO:39至少90%—致； 輕鏈可變區與SEQ ID ΝΟ:13至少90%—致，且重鏈可變區 與SEQ ID NO:42至少90% —致；輕鏈可變區與SEQ ID NO: 17至少90%—致，且重鏈可變區與SEQ ID NO:46至少 90%—致；輕鏈可變區與SEQ ID N0:8至少90%—致，且重 鏈可變區與SEQ ID NO:36至少90%—致；輕鏈可變區與 SEQ ID N0:19至少90%—致，且重鏈可變區與SEQ ID NO:49至少90%—致；輕鏈可變區與SEQ ID N0:18至少 90%—致，且重鏈可變區與SEQ ID NO:47至少90%—致； 輕鏈可變區與SEQ ID N0:21至少90%—致，且重鏈可變區 146681.doc -12- 201036626
與SEQ ID NO:52至少90% —致；輕鏈可變區與SEQ ID NO:3至少90%—致，且重鏈可變區與SEQ ID NO:31至少 90%—致；輕鏈可變區與SEQ ID ΝΟ_·7至少90%—致，且重 鏈可變區與SEQ ID ΝΟ:35至少90%—致；輕鏈可變區與 SEQ ID ΝΟ:6至少90% —致，且重鏈可變區與SEQ ID NO:34至少90%—致；輕鏈可變區與SEQ ID ΝΟ:1至少90% 一致，且重鏈可變區與SEQ ID NO:29至少90%—致；輕鏈 可變區與SEQ ID NO:22至少90%—致，且重鏈可變區與 SEQ ID NO:50至少90%—致；輕鏈可變區與SEQ ID NO:24 至少90%—致，且重鏈可變區與SEQ ID NO:40至少90% — 致；輕鏈可變區與SEQ ID NO:9至少90%—致，且重鏈可 變區與SEQ ID NO:37至少90%—致；輕鏈可變區與SEQ ID NO:4至少90%—致，且重鏈可變區與SEQ ID NO:32至少 90%—致；輕鏈可變區與SEQ ID NO:28至少90%—致，且 重鏈可變區與SEQ ID NO:53至少90%—致；輕鏈可變區與 SEQ ID NO:16至少90%—致，且重鏈可變區與SEQ ID NO:45至少90%—致；輕鏈可變區與SEQ ID NO: 15至少 90%—致，且重鏈可變區與SEQ ID NO :44至少90%—致； 輕鏈可變區與SEQ ID N0:14至少90%—致，且重鏈可變區 與SEQ ID NO:43至少90% —致；輕鏈可變區與SEQ ID NO:27至少90%—致，且重鏈可變區與SEQ ID NO:43至少 90%—致；輕鏈可變區與SEQ ID N0:5至少90%—致，且重 鏈可變區與SEQ ID NO:33至少90%—致；輕鏈可變區與 SEQ ID N0:12至少90%—致，且重鏈可變區與SEQ ID 146681.doc -13 - 201036626 ΝΟ·.41至少90%—致；輕鏈可變區與SEQ ID NO:23至少 90%—致，且重鏈可變區與SEQ ID NO:48至少90%—致； 輕鏈可變區與SEQ ID NO:25至少90%—致，且重鏈可變區 與SEQ ID NO:54至少90%—致；或輕鏈可變區與SEQ ID NO:26至少90%—致，且重鏈可變區與SEQ ID NO:54至少 90%—致。在另一態樣中，重鏈可變區及輕鏈可變區與所 列SEQ ID NO之各別可變區一致。 本發明之一態樣提供一種在CD4+記憶T細胞結合檢定中 具有小於35 ng/ml之EC5G的經分離α4β7雜二聚體專一性抗 原結合蛋白；本發明之另一態樣提供一種在CD4 +記憶Τ細 胞結合檢定中具有小於10 ng/ml之EC5G的經分離α4β7雜二 聚體專一性抗原結合蛋白。在另一實施例中，本發明提供 一種在MAdCAM競爭檢定中具有小於30 ng/ml之IC50的經 分離α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白；在另一實施例 中，本發明提供一種在MAdCAM競爭檢定中具有小於10 ng/ml之IC5Q的經分離α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白。 本發明之一態樣提供一種結合α4β7之S250N突變體的經分 離α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白。 在本發明之一態樣中，本發明提供編碼上述多肽之核 酸。在本發明之另一態樣中，該核酸為載體。在本發明之 另一實施例中，本發明提供經本發明核酸轉型或轉染之宿 主細胞.。在本發明之另一態樣中，提供一種製備多肽之方 法，其包含在促進多肽表現之條件下培育宿主細胞及收集 該等多肽。 146681.doc -14- 201036626 在另一態樣中，本發明提供一種分泌與以”結合之抗原 結合蛋白的經分離細胞。在另一實施例中，該細胞為融合 瘤。在另一實施例中，本發明提供一種製備專一性結合 α4β7(亦即人類α4β7)之抗原結合蛋白的方法，其包含在允 許該經分離細胞表現該抗原結合蛋白之條件下培育該經分 離細胞。 在一態樣中，本發明提供一種與α4β7雜二聚體專一性結 ❹纟之經分離抗原結合蛋白。在另—實施例中，經分離抗原 結合蛋白在與人類α4β7結合時，抑制α4β7與MAdCAM_l之 • 結合。因此，本發明之一實施例提供一種抑制α4β7之至少 ' 一種活性的方法，其包含使表現《4β7之細胞與以”雜二聚 體專一性抗原結合蛋白接觸，以使活性部分或完全受抑 制。在一態樣中，該方法係於活體内進行。在本發明之一 態樣中，經分離抗原結合蛋白抑制表現α4β7之細胞黏附於 表現MAdCAM-1之細胞。在本發明之另一態樣中經分離 〇 抗原結合蛋白抑制表現α4β7之細胞運輸至表現MAdCAMd 之細胞所聚集之區域或組織；在此類實施例之一實例中， 經分離抗原結合蛋白抑制淋巴細胞運輸至腸。 在另一態樣中，本發明提供一種包含抗原結合蛋白之醫 二、_匆在實把例_，本發明提供一種治療個體之病 狀=方法，其包含將醫藥組合物投與該個體，其中該病狀 可藉由（部分或完全）降低個體中α4β7之活性來治療。在另 /實施例中，個體為人類。在另-實施例中，病狀為胃腸 系統之發炎柯, 病狀。因此’提供一種治療罹患特徵在於表 146681.doc -15· 201036626 現α4β7之細胞不當運輸至包含表現MAdCAM之細胞的組織 之病狀之個體的方法，該方法包含向該個體投與足以（部 分或完全）抑制表現α4β7之細胞運輸至包含表現MAdCAM 之細胞之組織的量的α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白。 在一貫施例中，該病狀為發炎性腸病，例如潰瘍性結腸 炎、克羅恩氏病、乳糜瀉（非熱帶性口瘡）、與血清陰性關 郎病相關之腸病、顯彳放結腸炎（miCI1〇SC〇piC C〇HtiS)或膠原 性結腸炎（collagenous c〇liUs)、嗜伊紅血球性胃腸炎，或 直腸結腸切除術（proct〇c〇lectomy)及迴腸肛門吻合術 (ileoanal anastomosis)後所致之貯袋炎（p〇uchitis)。在另一 實施例中，病狀為胰臟炎、胰島素依賴性糖尿病、乳房 炎、膽囊炎、膽管炎、膽管周圍炎、慢性支氣管炎、慢性 竇炎、哮喘或移植物抗宿主疾病。 在另一貫施例中，該方法進一步包含向個體投與第二治 療。在另一實施例中，該第二治療係在將醫藥組合物投與 個體之前及/或同時及/或之後投與該個體。在另一實施例 中，第二治療包含消炎劑。在另一實施例中，第二醫藥組 合物包含選自由非類固醇消炎藥、類固醇及免疫調節劑組 成之群的藥劑。在另一實施例中，該方法包含向個體投與 第三治療。 在另一態樣中，本發明提供一種延長個體壽命之方法， 其包含向該個體投與醫藥組合物。在另一態樣中，本發明 提供一種降低有需要之個體中α4β7之活性的方法，其包含 向該個體投與醫藥組合物。在另一態樣中，本發明提供一 146681.doc -16- 201036626 種減少有需要之個體中α4β7介導之運輸（例如α4β7介導之 腸駐留）的方法，其包含向該個體投與醫藥組合物。 【實施方式】 本發明提供關於與整合素α4β7(「α4β7」）結合之分子的 組合物、套組及方法，該等分子包括促進或拮抗α4ρ7之分 子，諸如抗α4β7抗體、抗體片段及抗體衍生物，例如拮抗 性抗α4β7抗體、抗體片段或抗體衍生物。亦提供包含編碼 ❹ 與α4Ρ7結合之多肽之全部或一部分之核苷酸序列的核酸及 其衍生物及片段，例如編碼抗α4β7抗體、抗體片段或抗體 衍生物之全部或一部分的核酸；包含該等核酸之質體及載 • 體；及包含該等核酸及/或載體及質體之細胞或細胞株。 所提供之方法包括例如製備、鑑別或分離與以卩入结合之分 子（諸如抗α4β7抗體）之方法、判定分子是否與α4β7結合之 方法、判定分子促進抑或拮抗α4β7之方法、製備包含與 α4β7結合之分子之組合物（諸如醫藥組合物）之方法，及將 〇 、、’n s α4β7之为子投與個體之方法，例如治療介導之病 狀的方法及在活體内或活體外促進或拮抗α4β7之生物活性 的方法。 使用標準單字母或三字母縮寫來表示聚核苷酸及多肽序 列。除非另有指示，否則各多肽序列在左側具有胺基端且 在右側具有羧基端；各單股核酸序列以及各雙股核酸序列 之上股在左側具有5,端且在右側具有3,端。特定多肽或聚 核苷酸序列亦可藉由說明其與參考序列之不同程度來描 述0 146681.doc 201036626 除非本文另有定義，否則與本發明相結合使用之科學及 技術術語應具有一般技術者通常所理解之含義。此外，除 非上下文另有需要，否則單數術語應包括複數且複數術語 應包括單數。一般而言，本文所述之與細胞及組織培養、 分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸 化學以及雜交相結合使用之命名法及其技術為此項技術中 所熟知且通常所用者。除非另有指示，否則本發明之方法 及技術一般係根據此項技術中所熟知及如本說明書通篇引 用及論述之各種一般及更具體之參考文獻中所述之習知方 法來進行。參見，例如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, .Cold Spring Harbor, Ν·Υ· (1989);及 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992);及 Harlow 與 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y· (1990)，該等文 獻係以引用的方式併入本文中。酶促反應及純化技術係根 據製造商之說明書，如此項技術中通常所實現或如本文所 述來進行。本文所述之與分析化學、合成有機化學及醫學 與醫藥化學相結合使用之術語及其實驗室程序與技術為此 項技術中所熟知及通常所用者。對於化學合成、化學分 析、醫藥製備、調配及傳遞以及患者治療可使用標準技 術。 除非另有指示，否則以下術語應理解為具有以下含義： 146681.doc •18· 201036626 /語「經分離分子」（其中該分子為例如多肤、聚核苦 駄或杬體)為根據其起源或衍生來源而具有以下性質之分 ()二伴隨其原生狀態_起出現之天然相關組份無關 K2)實質上不含來自相同物種之其他分子，⑺由來自 5物種之、、®胞表現，或⑷在無人為干預之情況下在自然 界中不會出現。因此， 風 以化于方式合成或在不同於其天然 起源之細胞的細胞奉φ人 「八 肥糸統中合成之分子將與其天然相關組份
❹ /刀離」。亦可藉由使用此項技術中所熟知之純化技術進 行分離而使分子實質上不含天然相關⑽。可由此項技術 :斤U之許多方式來檢定分子純度或均質性。舉例而 ，言’可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳及凝膠染色以使用此項技 術中所熟知之技術觀測多肽來檢定多肽樣本之純度。出於 某些目的’可藉由使用HpLC或此項技術中所熟知之其他 純化方式來提供較高解析度。 、術語「哪7抑制劑」與「_7拮抗劑」可互換使用。各 為可偵測地抑制α4β7之至少—種功能的分子。相反地， 「α4β7促效劑」為可賴地增強α4β7之至少—種功能的分 子。α4Ρ7抑制劑所產生之抑制無需為完全抑制，只要該抑 ，可㈣’例如使用檢^。可使用任何關於《4β7功能之檢 定’其實例提供於本文中。可由α4β7抑制劑抑制(或由 β7促效刎增強）之α4β7功能之實例包括配位體結合（亦即 與MAdCAM-Ι結合），黏附於配位體表現細胞，運輪至特 定隔區（諸如腸），釋放細胞激素、趨化激素及其他介體，、 增強或加重發炎反應及組織損傷等^ α4ρ7抑制劑及⑽N促 146681.doc •19- 201036626 效劑類型之實例包括（但不限於）《邻7結合多肽，諸如抗原 結合蛋白（例如α4β7抗原結合蛋白）、抗體、抗體片段及抗 體衍生物。 術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」各指包含兩個或兩個 以上胺基酸殘基由狀鍵彼此聯接之分子。此等術語涵蓋例 如蛋白質序列之天然及人工蛋白f、蛋白質片段及多肽類 似物（諸如突變蛋白質（mutein) '變異體及融合蛋白），以 及轉譯後修飾或其他共價或非共價修飾之蛋白質。肽、多 肽或蛋白質可為單體或聚合體。 本文所用之術語「多肽片段」係指與相應全長蛋白質相 比具有胺基端及/或羧基端缺失之多肽。片段長度可為例 如至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、2〇、 50、70、80、90、100、150或200個胺基酸。片段長度亦 可為例如最多 1，000、750、500、250、200、175、150、 125 、 1〇〇 、 90 、 80 、 70 、 60 、 50 、 40 、 30 、 20 、 15 、 u 、 13、12、11或1〇個胺基酸。片段亦可由蛋白水解（或其他） 加工而產生，例如使得胺基端及/或羧基端與預期者相比 有一至五個胺基酸之變化。片段可在其任一端或兩端進一 步包含一或多個其他胺基酸，例如天然產生之不同蛋白質 之胺基酸序列（例如Fc或白胺酸拉鏈域）或人工胺基酸序列 (例如人工連接子序列或標籤蛋白）。 本發明之多肽包括已經任何方式及由任何原因修飾之多 肽’例如為：（1)降低對蛋白水解之敏感性，（2)降低對氧 化之敏感性，（3)改變形成蛋白質複合物之結合親和力， 146681.doc -20. 201036626 (4)改變結合親和力，及（4)賦予或改變其他物理化學或功 能特性。類似物包括多肽之突變蛋白質。舉例而言，可於 天然產生之序列中（例如於形成分子間接觸之結構域外的 多肽部分中）進行單或多個胺基酸取代（例如保守性胺基酸 取代）。共同序列可用於選擇供取代之胺基酸殘基；熟習 此項技術者應瞭解，亦可取代其他胺基酸殘基。 「保守性胺基酸取代」為不實質上改變親本序列之結構 特徵的胺基酸取代（例如，置換胺基酸不應傾向於斷開親 本序列中所存在之螺旋，或破壞其他類型表徵親本序列或 為其功能性所需的二級結構）。業内公認之多肽二級及三 級結構之實例描述於 Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton編，W. H. Freeman and Company, New York (1984)) ； Introduction to Protein Structure(C. Branden 及 J. Tooze 編，Garland Publishing, New York, N.Y. (1991));及 Thornton等人，Nature 354:105 (1991)，該等 文獻各以引用的方式併入本文中。 本發明亦提供α4β7結合多肽之非肽類似物。非肽類似物 在醫藥工業中通常用作特性與模板肽類似之藥物。此等類 型之非肽化合物稱為「肽模擬物（peptide mimetics)」或 「擬肽（peptidomimetics)」。參見，例如Fauchere，J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986) ; Veber及 Freidinger，TINS 第 392 頁（1985);及 Evans 等人，J. Med. Chem. 30:1229 (1987)，該等文獻以引用的方式併入本文中。結構上類似 於治療上適用之肽的肽模擬物可用於產生等效治療或預防 146681.doc -21 - 201036626 作用。一般而言，擬肽在結構上類似於樣板肽（亦即，具 有所要生物化學特性或藥理學活性之多肽），諸如人類抗 體；但其一或多個肽鍵視情況藉由此項技術中所熟知之方 法經選自由以下組成之群的鍵聯置換：__Ch2NH—、--ch2s— 、--CH2--CH2--、--CH=CH--(順式與反式）、__c〇CH2-_、 --CH(OH)CH2--及--CH2SO--。共同序列之一或多個胺基酸 經相同類型之D-胺基酸的系統性取代（例如D_離胺酸替代 L-離胺酸）亦可用於產生更穩定之肽。另外，包含共同序 列或貫質上相同之共同序列變化的限制性肽可由此項技術 中已知之方法產生（Rizo及Gierasch, Ann. Rev_ Biochem. 61.3 87 (1992)，其以引用的方式併入本文中），例如藉由添 加能夠形成使肽環化之分子内二硫橋鍵的内部半胱胺酸殘 基而產生。 多肽（例如抗體）之「變異體」包含如下胺基酸序列：其 中相對於另一多肽序列，有一或多個胺基酸殘基插入該胺 基酸序列中、自該胺基酸序列缺失及/或取代入該胺基酸 序列中。本發明之變異體包括融合蛋白。 多肽之「衍生物」為已經化學修飾之多肽（例如抗體）， 例如經由與另一化學部分（諸如聚乙二醇或白蛋白，例如 人類血清白蛋白）結合、磷酸化及/或糖基化而修飾。除非 另有^ 7F ’否則術語「抗體」除包含兩條全長重鏈及兩條 全長輕鏈之抗體以外亦包括其衍生物、變異體、片段及突 變蛋白質，該等「抗體」之實例描述於下文中。 抗原結合蛋白」為如下蛋白質：其包含與抗原結合之 146681.doc -22· 201036626 部分且視情況包含允許抗原結合部分採用促進抗原結合蛋 白與抗原！吉合之構形的骨架或構架部分。抗原結合蛋白之 只例包括抗體、抗體片段（例如抗體之抗原結合部分）、抗 胃何生物及抗體類似4勿。抗原結合蛋白可包含例如具有移 植CDR或CDR衍生物之替代性蛋白質骨架或人工骨架。該 等骨架包括（但不限於）：抗體來源之骨架，其包含經弓丨入 以例如使抗原結合蛋白之三维結構穩定之突變；以及完全 ❹ 合成骨架，其包含例如生物相容性聚合物。參見，例如 Korndorfer等人，2003, Pr〇teins:如⑽㈣，Functi〇n，福
Bi〇informatics，第 53卷，Issue 1:121l29 ; R〇que等人， • 2004, Biotechn〇l. Pr〇g. 20:639-654。另外，可使用肽抗體 模擬物（「PAM」），以及基於利用纖維結合蛋白組份作為 骨架之抗體模擬物的骨架。 抗原結合蛋白可具有例如天然產生之免疫球蛋白之結 構。「免疫球蛋白」為四聚體分子。在天然產生之免疫球 ❹蛋白中，各四聚體由兩個相同多肽鏈對組成，各對具有一 條「輕」鏈（約25 kDa)及一條「重」鏈（約5〇_7〇 kDa)。各 鏈之胺基端部分包括主要負責抗原識別且具有約1〇〇至11〇 個或110個以上胺基酸的可變區。各鏈之羧基端部分界定 主要負責效應功能之恆定區。人類輕鏈分類為κ或λ輕鏈。 重鏈分類為μ、δ、γ、€1或8，且將抗體之同型分別定義為 IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈内，可變區及 恆定區係由具有約12個或12個以上胺基酸之「j」區聯 接’其中重鏈亦包括具有約10個以上胺基酸之「〇」區。 146681.doc -23- 201036626 一般參見Fundamental Immunology 第7章（Paul，W.編，第2 版Raven Press, N.Y. (1989))(其出於所有目的以全文引用 的方式併入本文中）^各輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結 合位點，使得完整免疫球蛋白具有兩個結合位點。 天然產生之免疫球蛋白鏈之可變區展現由三個高變區聯 接之相對保守構架區（FR)的相同通用結構，該等高變區亦 稱為互補決定區或CDR。自N端至C端，輕鏈與重鏈均包 含如下結構域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4。根據 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest > 5^S. > US Dept, of Health and
Human Services，PHS，NIH, NIH 出版物第 91-3242 號，1991 中之定義將胺基酸指定至各結構域。免疫球蛋白鏈中之胺 基酸的其他編號系統包括IMGT®(國際免疫遺傳學資訊系 統（international ImMunoGeneTics information system); Lefranc 等人，_Dev. Comp. Immunol. 29:185-203; 2005)及 AHo(Honegger A Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-670; 2001)。 抗體可自含有抗原專一性不同之免疫球蛋白的來源（諸 如血清或血漿）獲得。若對該等抗體進行親和純化，則其 特定抗原專一性可得到增濃。該等增濃之抗體製劑通常由 少於約10%之對特定抗原具有專一性結合活性的抗體構 成。對此等製劑進行數輪親和純化可增加對抗原具有專一 性結合活性之抗體的比例。以此方式製備之抗體常稱作 「單專一性」抗體。單專一性抗體製劑可由約10%、 146681.doc -24- 201036626 20%、30〇/〇、40%、50%、60%、70〇/〇、75%、80%、85%、 90%、95%、97%、99%或99.9%之對特定抗原具有專一性 結合活性的抗體構成。 除非另有規定，否則「抗體」係指完整免疫球蛋白或其 關於專一性結合而與完整抗體競爭之抗原結合部分。抗原 結合部分可由重組DNA技術或藉由酶促或化學裂解完整抗 體而產生。抗原結合部分尤其包括Fab、Fab’、F(ab')2、 Fv、域抗體（dAb)及互補決定區（CDR)片段、可變區片段、 單鏈抗體（scFv)、嵌合抗體、雙功能抗體、三功能抗體、 四功能抗體及含有足以賦予多肽專一性抗原結合性之免疫 球蛋白之至少一部分的多肽。
Fab片段為具有VL、VH、CL及CH1域之單價片段； F(ab〇2片段為具有兩個由鉸鏈區之二硫橋鍵連接之Fab片 段的二價片段；Fd片段具有VH及CH1域；Fv片段具有抗體 單臂之VL及VH域；且dAb片段具有VH域、VL域，或VH或 VL域之抗原結合片段（美國專利第6,846,634號、第 6,696,245號；美國申請公開案第05/0202512號、第 04/0202995 號、第 04川038291 號、第 04/0009507 號、第 03/0039958號；Ward等人，Nature 341:544-546, 1989)。 單鏈抗體（scFv)為VL及VH區經由連接子（例如胺基酸殘 基之合成序列）聯接形成連續蛋白質鏈的抗體，其中該連 接子足夠長而允許蛋白質鏈自身對折且形成單價抗原結合 位點（參見，例如Bird等人，1988，Science 242:423-26 ;及 Huston等人，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879- 146681.doc -25- 201036626 83)。雙功能抗體為包含兩條多肽鏈之二價抗體，其中各 多肽鏈包含由連接子聯接之VH及VL域，該連接子過短而使 同一鏈上之兩個域無法配對，由此使得各域與另一多肽鏈 上之互補域配對（參見，例如Holliger等人，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 ；及 Poljak 等人，1994, Structure 2:1121-23)。若雙功能抗體之兩條多肽鏈相同， 則其配對產生之雙功能抗體將具有兩個相同抗原結合位 點。具有不同序列之多肽鏈可用於製備具有兩個不同抗原 結合位點之雙功能抗體。類似地，三功能抗體及四功能抗 體為分別包含三條及四條多肽鏈且分別形成三個及四個抗 原結合位點之抗體，該等多肽鏈及該等抗原結合位點可相 同或不同。 可使用Kabat等人（同上）、Lefranc等人（同上）及/或 Honegger及Pluckthun(同上）所述之系統來鑑別既定抗體之 互補決定區（CDR)及構架區（FR)。可將一或多個CDR以共 價方式或非共價方式併入分子中以使*該分子成為抗原結合 蛋白。抗原結合蛋白可將CDR併入在内作為較大多肽鏈之 一部分，可使CDR共價連接於另一多肽鏈，或可以非共價 方式將CDR併入在内。CDR使抗原結合蛋白能與相關特定 抗原專一性結合。 抗原結合蛋白可具有一或多個結合位點。若存在一個以 上結合位點，則該等結合位點可彼此相同，或可不同。舉 例而言，天然產生之人類免疫球蛋白通常具有兩個相同結 合位點，而「雙專一性」或「雙功能」抗體具有兩個不同 146681.doc -26- 201036626 結合位點。 術語「人類抗體」包括所有具有一或多個來源於人類免 疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。在一實施例中， 所有可1域及恆定域均來源於人類免疫球蛋白序列（完全 人類抗體）。此等抗體可以多種方式製備，其實例描述於 下文中，包括經由以相關抗原免疫小鼠，該小鼠經遺傳修 飾以表現來源於人類重鏈編碼基因及/或輕鏈編碼基因之 抗體。 ❹ 人類化抗體具有如下序列：該序列與來源於非人類物種 之抗體序列因—或多個胺基酸取代、缺失及/或添加而不 . 同，使得該人類化抗體與非人類物種抗體相比，在投與人 類個體時不太可能誘發免疫反應及/或誘發較不嚴重之免 疫反應。在一實施例中，使非人類物種抗體之重鏈及/或 輕鏈之構架域及恆定域中之某些胺基酸突變來產生人類化 抗體。在另一實施例中，使來自人類抗體之恆定域與非人 〇 類物種之可變域融合。在另一實施例中，改變非人類抗體 之一或多個CDR序列中之一或多個胺基酸殘基以降低在將 該非人類抗體投與人類個體時其可能產生之免疫原性，其 中該等改變之胺基酸殘基對抗體與其抗原之免疫專一性結 合並非至關重要，或對胺基酸序列所進行之改變為保守性 改變，使得人類化抗體與抗原之結合與非人類抗體與抗原 之結合相比並不顯著變差。製備人類化抗體之方式的實例 可見於美國專利第6,054,297號、第5,886，152號及第 5,877,293號中。 146681.doc •27_ 201036626 術語「嵌合抗體」係指含有一或多個來自一種抗體之區 域及一或多個來自一或多種其他抗體之區域的抗體。在一 實施例中’一或多個CDR係來源於人類抗α4β7抗體。在另 一實施例中，所有CDR皆來源於人類抗α4β7抗體。在另一 只施例中’將來自一種以上人類抗α4β7抗體之CDR混合且 匹配成嵌合抗體。舉例而言’嵌合抗體可包含來自第一人 類抗α4β7抗體之輕鏈的CDR1、來自第二人類抗α4β7抗體 之輕鏈的CDR2及CDR3，及來自第三抗α4β7抗體之重鏈的 CDR。可能存在其他組合且包括於本發明之實施例中。 此外，構架區可來源於相同抗α4βΝ^體之一，來源於一 或多種不同抗體（諸如人類抗體），或來源於人類化抗體。 在嵌合抗體之一實例中，重鏈及/或輕鏈之一部分與來自 特疋物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體相同、同源或 來源於來自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體， 而該（該等）鏈之其餘部分與來自另一物種或屬於另一抗體 類別或子類之抗體相同、同源或來源於來自另一物種或屬 於另一抗體類別或子類之抗體。亦包括該等抗體之展現所 要生物活性（亦即，專一性結合α4β7之能力）的片段。參 見，例如美國專利第4,816,567號及M〇rris〇n，1985, 229:1202-07。 中和抗體」或「抑制抗體」為抑制以”與河八此八河」 相互作用之抗體，屆時使用諸如本文實例中所述之檢定分 析過里抗α4Ρ7抗體使相互作用量減少至少約2〇〇/0。在各 種實施例中’抗原結合蛋白使“pWMAdCAMq叫7之 146681.doc -28- 201036626 相互作用減少至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、97%、99%及 99.9%。
抗體之片段或類似物可易於由一般技術者遵循本說明書 之教示及使用此項技術中所熟知之技術來製備。片段或類 似物之胺基端及羧基端存在於功能域之邊界附近。結構域 及功能域可藉由比較核苷酸及/或胺基酸序列資料與公共 或專屬序列資料庫來鑑別。可使用電腦化比較方法來鑑別 序列基元或預測具有已知結構及/或功能之其他蛋白質中 所存在的蛋白質構形域。鑑別摺疊成已知三維結構之蛋白 質序列的方法為已知的。參見，例如B〇wie等人，1991，
Science 253:164 ° CDR移植抗體」為包含一或多個來源於特定物種或同 型之抗體的CDR以及相同或不同物種或同型之另一抗體的 構架的抗體。 「多專一性抗體」為識別一或多個抗原上之一個以上抗 原決定基的抗體。此類型抗體之子類為「雙專一性抗 體」’其識別相同或不同抗原上之兩個相異抗原決定基。' 若抗原結合i白與抗原（❹人類_7)結合之解離常數 為！奈莫耳濃度或以莫耳濃度以下，則該抗原結合蛋白與 該抗原「專一性結合」。如本文所用’若抗原結合蛋白結 合第一雜二聚體整合素，而不結合與該第一整合素共有一 條鏈之其他整合素’則該抗原結合蛋白具有「雜二聚體專 二性」。舉例而言，具有α4β7雜二聚體專一性之抗體將結 &α4β7，而不結合〇1401或 αΕβ7。 146681.doc -29- 201036626 在==其之細胞的活化狀態及某些金屬離子存 配位==形]活性」構形之整合素與其同源 配位壯合之親和力高於呈「非活性」構形之相同整合 :。抗原結合蛋白可僅與呈活性構形之整合素結合，僅與 壬非活性構形之整合素結合，或與呈兩種構形或任-構形 之&合素均結合。舉例而言，α4β7雜二聚體專-性抗原結 合蛋白可在存在或不存在二價錳2+(Μη2+)陽離子之情況下 & α4β7表明§亥抗原結合蛋白結合活性α4β7與非活性 α4β7 ° 「抗原結合域」、「抗原結合區」或「抗原結合位點」為 含有與抗原相互作用且對抗原結合蛋白對抗原之專一性及 親和力有利之胺基酸殘基（或其他部分）的抗原結合蛋白之 一部分。對於與抗原專一性結合之抗體，此將包括該抗體 之至少一個CDR域的至少一部分。 「抗原決定基」為抗原結合蛋白（例如抗體）所結合之分 子部分。抗原決定基可包含分子之非連續部分（例如，於 多肽中，在多肽一級序列中不連續，但在多肽三級結構及 四級結構之情形下彼此之接近程度足以由抗原結合蛋白結 合的胺基酸殘基）。 兩個聚核苷酸序列或兩個多肽序列之「一致性百分比」 係藉由使用GAP電腦程式（10.3版GCG Wisconsin套件 (Accelrys, San Diego，CA)之一部分）、使用其預設參數對 序列進行比較來確定。 術語「聚核苷酸」、「寡核苷酸」及「核酸」通篇可互換 146681.doc -30- 201036626 使用，且包括DNA分子（例如cDNA或基因組DNA)、RNA 分子（例如mRNA)、使用核苷酸類似物（例如肽核酸及非天 然產生之核苷酸類似物）產生之DNA或RNA類似物，及其 雜交體。核酸分子可為單股或雙股。在一實施例中，本發 明之核酸分子包含編碼本發明之抗體或其片段、衍生物、 突變蛋白質或變異體之連續開放閱讀框架^ 若兩個單股聚核苷酸之序列可在反向平行方向上進行比 ❹ 對’使得在未引入間隙之情況下且在任一序列之5,末端或 3末端無未配對核苦酸之情況下’一個聚核芽酸中之每個 核苷酸與另一聚核苷酸中之其互補核苷酸相對，則該兩個 ' 單股聚核苷酸為彼此之「互補序列」。若兩個聚核苷酸可 在中等嚴格條件下彼此雜交’則一聚核苷酸與另一聚核苦 酸「互補」。因此，聚核苷酸可與並非其互補序列之另一 聚核苷酸互補。 「载體」為可用於將與其所連接之另一核酸引入細胞中 〇 之核酸。一種類型之載體為「質體」，其係指可連接其他 核酸區段之線性或環狀雙股DNA分子。另一類型之載體為 病毒載體（例如複製缺陷型反轉錄病毒、腺病毒及腺相關 病毒），其中其他DNA區段可引入病毒基因組中。某些載 體能夠在該等載體所引入之宿主細胞中自主複製（例如包 含細菌複製起點之細菌冑體及游離型哺乳動物載體）。其 他載體（例如非游離型哺乳動物載體）可在引入宿主細胞中 後整合至宿主細胞之基因組中，且進而與宿主基因組一起 複製。「表現載體」為可指導所選聚核苦酸表現之載體類 146681.doc -31 - 201036626 型。 +右調控序㈣響核苦序狀表現⑼如表現量、表現 時序或表現位置），則該㈣酸序列「可操作地連接」於 忒凋控序列。「調控序列」為影響可操作地連接於其之核 酸之表現（例如表現量、表現時序或表現位置）的核酸。調 控序列可例如對所調控之核酸直接發揮影響，或經由一或 多個其他分子（例如與調控序列及/或核酸結合之多肽）之作 用而發揮影響。調控序列之實例包括啟動子、強化子及其 他表現控制元件（例如聚腺苷酸化信號）。調控序列之其他 實例描述於例如 Goeddel，199〇, Gene Expressi〇n
Technology； Methods in Enzymology 185, Academic Press,
San Diego, CA;及 Baron 等人，1995，Nucleic Acids Res. 23:3605-06 中。
「宿主細胞」為可用於表現核酸（例如本發明核酸）之細 胞。宿主細胞可為原核細胞，例如大腸桿菌（；五c〇/z·);或 可為真核細胞，例如單細胞真核細胞（例如酵母或其他真 菌）、植物細胞（例如於草或番茄植物細胞）、動物細胞（例 如人類細胞、猴細胞、倉鼠細胞、大鼠細胞、小鼠細胞或 昆蟲細胞）或融合瘤細胞。宿主細胞之實例包括猴腎細胞 之 COS-7 細胞株（ATCC CRL 1651)(參見 Gluzman 等人， 1981，Cell 23:175)、L細胞、C127細胞、3T3 細胞（ATCC CCL 163)、中國倉鼠卵巢（CHO)細胞或其衍生物（諸如 Veggie CHO及於無血清培養基中生長之相關細胞株（參見 Rasmussen等人，1998, Cytotechnology 28:31)或缺乏DHFR 146681.doc -32- 201036626 之 CHO 品系 DX-B11(參見 Urlaub 等人，1980，Proc.Natl· Acad. Sci. USA 77··4216-20))、海拉細胞（HeLa cell)、ΒΗΚ (ATCC CRL 10)細胞株、來源於非洲綠猴腎細胞株CV1 (ATCC CCL 70)之 CV1/EBNA細胞株（參見 McMahan等人， 1991，EMBO J. 10:2821)、人類胚腎細胞（諸如 293、293 EBNA或MSR 293)、人類表皮A431細胞、人類C〇1〇205細 胞、其他經轉型之靈長類動物細胞株、正常二倍體細胞、 來源於初級組織之活體外培養物的細胞品系、原代外植 體、HL-60、U93 7、HaK或Jurkat細胞。通常，宿主細胞為 可用編碼多肽之核酸轉型或轉染之培養細胞，該核酸接著 可於該宿主細胞中表現。片語「重組宿主細胞」可用於表 示已用有待表現之核酸轉型或轉染之宿主細胞。宿主細胞 亦可為如下細胞：其包含核酸，但除非將調控序列引入宿 主細胞中以使其變得與核酸可操作地連接，否則該細胞不 以所要量表現該核酸。應瞭解，術語宿主細胞不僅指特定 個體細胞，而且亦指此類細胞之子代或潛在子代。由於某 些修飾可能因例如突變或環境影響而出現於後代中，因此 該子代實際上可能與親本細胞不同，但仍包括於如本文所 用之該術語的範疇内。 抗原結合蛋白 在一態樣中，本發明提供與α4β7(例如人類α4β7)結合之 抗原結合蛋白（例如抗體、抗體片段、抗體衍生物、抗體 突變蛋白質及抗體變異體）。 本發明之抗原結合蛋白包括抑制α4β7之生物活性之抗原 146681.doc -33 - 201036626 結合蛋白。該等生物活性之實例包括以…與MAdCAM-1之 結合，及表現α4β7之細胞與表現MAdCAM-l之細胞之間的 黏附。其他生物活性包括於活體内由α4β7介導之生物活 性，諸如運輸或駐留；特定言之，α4β7與淋巴細胞運輸至 腸有關。在發炎之腸中MAdC AM-1之表現增加增強了表現 α4β7之淋巴細胞募集至腸，在此處異常淋巴細胞活化使發 炎反應及組織損傷增加。 不同抗原結合蛋白可與α4β7之不同結構域或抗原決定基 、、、σ 5，或可由不同作用機制起作用。實例包括（但不限於） 干擾α4β7與MAdCAM-1結合之能力或抑制細胞相互作用 (諸如表現α4β7之細胞與表現ΜΑπΑΜ」之細胞之間的黏 附）之抗原結合蛋白。作用部位可為例如細胞内（例如藉由 干擾細胞内信號級聯）或細胞外。抗原結合蛋白無需完全 抑制α4β7誘導之活性以便可用於本發明；實際上，降低 α4β7之特定活性的抗原結合蛋白同樣涵蓋在内以供使用。 (本文中關於結合α4β7之抗原結合蛋白治療特定疾病之特 定作用機制的論述僅為說明性的，且本文所呈現之方法並 不受其約束。） 處於本發明範疇内之抗α4ρ7抗體之其他衍生物包括抗 α4β7抗體或其片段與其他蛋白質或多肽之共價共軛物或聚 集共軛物（aggregative conjugate) ’諸如藉由表現重組融合 蛋白，包含與抗α4β7抗體多肽之N端或C端融合之異源多 肽。舉例而言，共軛之肽可為異源信號（或前導）多肽，例 如酵母α因子前導肽或諸如抗原決定基標籤之肽。含有抗 146681.doc •34- 201036626 原結合蛋白之融合蛋白可包含經添加以有助於純化或I監別 抗原結合蛋白之肽（例如聚His)。抗原結合蛋白亦可連接於 FLAG® 肽 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK) (SEQ ID NO:62)，如 Hopp 等人，e/o/rec/zwo/ogy 6:1204, 1988及美國專利5,011，912中所述。FLAG®肽具高度抗原 性且提供由專一性單株抗體（mAb)以可逆方式結合之抗原 決定基，從而使得能夠對所表現之重組蛋白進行快速檢定 及簡易純化。適用於製備FLAG®肽與指定多肽融合之融合 ❹ 蛋白的試劑可購得（Sigma-Aldrich, St. Louis MO)。 含有一或多個抗原結合蛋白之寡聚物可用作α4β7拮抗 • 劑。寡聚物可呈共價連接或非共價連接之二聚體、三聚體 或更高級寡聚物之形式。包含兩個或兩個以上抗原結合蛋 白之寡聚物涵蓋在内以供使用，其中一個實例為均二聚 體。其他寡聚物包括雜二聚體、均三聚體、雜三聚體、均 四聚體、雜四聚體等。 Q 一實施例係關於寡聚物，其包含多個抗原結合蛋白經由 與該等抗原結合蛋白融合之肽部分之間的共價或非共價相 互作用聯接。該等肽可為肽連接子（間隔子），或具有促進 - 寡聚之特性的肽。白胺酸拉鏈及某些來源於抗體之多肽為 可促進與其連接之抗原結合蛋白寡聚之肽，如下文更詳細 描述。 在特定實施例中，寡聚物包含兩個至四個抗原結合蛋 白。寡聚物之抗原結合蛋白可呈任何形式，諸如上文所述 之任一形式，例如變異體或片段。寡聚物較佳包含具有 146681.doc -35- 201036626 α4β7結合活性之抗原結合蛋白。 在一實施例中，寡聚物係使用來源於免疫球蛋白之多肽 製備。包含某些與抗體來源之多肽之各種部分（包括以域） 融合之異源多肽之融合蛋白的製備已由例如Ashkenazi等 A ^ 1991, PNAS USA 88:10535 ； Byrnf A > 1990, Nature 344:677 ;及 Hollenbaugh 等人，1992，r c〇nstructi〇n 〇f hmunoglobuiin Fusion Pr〇teins」，心卿广〜⑽仏 & /顯⑽〇/〇灯，增刊4，第1〇 19 H〇 19 u頁描述。 本發明之一實施例係關於包含兩個藉由使抗α4β7抗體之 (χ4β7結合片段與抗體之Fc區融合而產生之融合蛋白的二聚 體。二聚體可由以下方式製得：例如，將編碼融合蛋白之 基因融口體插人適當表現載體中，在經重組表$見载體轉型 之宿主細胞中表現該基因融合體，及使所表現之融合蛋白 組裝為更擬似抗體分子，其後在&部分之間形成鏈間二硫 鍵以得到該二聚體。 如本文所用之術語「Fe多肽」包括來源於抗體^區之原 生形式及突變蛋白質形式之多肽。亦包括含有促進二聚之 较鏈區的截短形式之該等多肽。包含分之融合蛋白 (及自其形成之寡聚物）提供藉由在蛋白質A或蛋白fG管柱 上親和層析來進行簡易純化之優勢。 PCT中請案w〇93/㈣i(以引用的方式併入本文中）中 述之-種適合Fe多肽為自人類IgG1抗體之N端鉸鍵區延 至Fc區之原生C端的單鏈多肽。另一適用Fc多肽為美國 ^5s457,035^Baum#A > 1994, EMBO J. 13:3992-4001 1466Sl.doc 36 - 201036626 所述之Fc突變蛋白質。除了胺基酸19已自Leu變為Aia，胺 基酸20已自Leu變為Glu，且胺基酸22已自Gly變為Ala以 外，此突變蛋白質之胺基酸序列與W〇 93/1〇151中所呈現 之原生Fc序列之胺基酸序列一致。該突變蛋白質對Fe受體 之親和力降低。 在其他實施例中’可用抗α4β7抗體之重鏈及/或輕鏈之 可變部分取代抗體重鏈及/或輕鏈之可變部分。 〇 或者’养聚物為包含多個抗原結合蛋白同時有或無肽連 接子（間隔肽）之融合蛋白。適合肽連接子為美國專利 4,751，180及4,935,233中所述之肽連接子。 另一製備募聚抗原結合蛋白之方法涉及使用白胺酸拉 鍵。白胺酸拉鏈域為促進内部存在該等白胺酸拉鏈域之蛋 白質寡聚之肽。白胺酸拉鏈最初在數種DNA結合蛋白中鑑 別出（Landschulz等人，1988，science 240:1759)，且此後 已在多種不同蛋白質中發現。已知之白胺酸拉鏈為二聚或 〇 二聚之天然產生肽及其衍生物。適於產生可溶性募聚蛋白 之白胺酸拉鏈域之實例描述於PCT申請案WO 94/10308 中’且來源於肺界面活性蛋白D(spD)之白胺酸拉鏈描述於
Hoppe專人，1994，febS Letters 344:191 中，該等文獻以 引用的方式併入本文中。使用允許與白胺酸拉鏈融合之異 源蛋白穩定三聚之經修飾白胺酸拉鏈描述於Fansl〇w等 人 ’ 1994，Semin. Immunol. 6:267-78 中。在一種方法中， 於適合宿主細胞中表現包含與白胺酸拉鏈肽融合之抗α4β7 抗體片段或衍生物的重組融合蛋白，且自培養物上清液中 146681.doc •37· 201036626 回收所形成之可溶性寡聚抗α4β7抗體片段或衍生物。 在一態樣中，本發明提供干擾α4β7與MAdCAM-Ι結合之 抗原結合蛋白。該等抗原結合蛋白可針對α4β7或其片段、 變異體或衍生物製備，且在習知檢定中針對干擾α4β7與 MAdCAM-Ι結合之能力進行篩選。適合檢定之實例為測試 抗原結合蛋白抑制MAdCAM-Ι(亦即，可溶性MAdCAM-1) 與表現α4β7之細胞結合的能力或測試抗原結合蛋白減少由 MAdCAM-Ι與α4β7相互作用（亦即，表現α4β7之細胞與 MAdCAM-1或表現MAdCAM-1之細胞黏附）所引起之生物 反應或細胞反應的能力的檢定。測試抗原結合蛋白之其他 檢定包括定性或定量比較抗原結合蛋白與α4β7多肽之結合 同已知抗原結合蛋白與α4β7多肽之結合的檢定，其若干實 例揭示於本文中。 在另一態樣中，本發明提供一種顯示物種選擇性之抗原 結合蛋白。在一實施例中，抗原結合蛋白與一或多種哺乳 動物α4β7結合，例如人類α4β7，及小鼠、大鼠、天竺鼠、 倉鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、綿羊、牛、馬、駱.1它及 非人類靈長類動物α4β7中之一或多者。在另一實施例中， 抗原結合蛋白與一或多種靈長類動物α4 β 7結合，例如人類 α4β7，及獼猴、狨猿、恆河猴、獠狨及黑猩猩α4β7中之一 或多者。在另一實施例中，抗原結合蛋白與人類、獼猴、 狨猿、恆河猴、獠狨或黑猩猩α4β7專一性結合。在另一實 施例中，抗原結合蛋白不與小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、 沙鼠、貓、兔、狗、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝及非人類 146681.doc -38- 201036626 靈長類動物α4β7中之—或多者結合。在另—訾 原結合蛋白不與新世界猴物種（諸如拭猿）結人貫施例中，抗 在另-實施例中，抗原結合蛋白與除μ二 。產生蛋白質均不展現專—性結合。在另之任何天 原結合蛋白與除哺乳動物,以外之任=中，抗 均不展現專一性結合w產生蛋白質 除霤具猫&仏 貫施例中，抗原結合蛋白盥 除靈長類動物·外之任何天然產生蛋 Ο 〇 一性結合。在另一實施二 以外之杯行工姑* 柷原，，，。合蛋白與除人類α4β7 可天然產生蛋白質均不展現專一性結合。在另— 抗原結合蛋白與來自至少一種非人類靈長類動 物（例如獮猴）之叫7及人類α4β7專一性結合。在另一實施 Γ中絲抗原結合蛋白以類似結合親和力與非人類靈長類動 ^㈣及人類叫7專一性結合。在另一實施例中，抗原 ^蛋白阻斷非人類靈長類動物、獼猴及人類#之活 另貫她例中，抗原結合蛋白在如本文所述之檢定 中對非人類靈長類動物、獼猴及人類哪7具有類似心或 EC50。 可使用此項技術令所熟知之方法且遵循本說明書之教示 來確定抗原結合蛋白對α4β7之選擇性。舉例而言，可使用 西方墨點法（Western blot)、FACS、ELISA或RIA來確定選 擇性。 在另一態樣中’本發明提供一種結合α4ρ7之抗原結合蛋 白（例如抗α4β7抗體）’其具有一或多種以下特徵：與人類 α4β7及非人類靈長類動物α4(37均結合，抑制MAdCAM-l與 146681.doc -39- 201036626 α4β7之結合，抑制表現α4β7之細胞黏附於MAdCAM-l，抑 制表現α4β7之細胞黏附於表現MAdCAM-Ι之細胞，抑制表 現α4β7之細胞運輸至包含表現MAdCAM-Ι之細胞的組織， 結合活性與非活性形式之α4β7，引起相對極小程度的細胞 表面表現之α4β7的下調。 本發明之抗原結合蛋白之抗原結合片段可由習知技術產 生。該等片段之實例包括（但不限於）Fab及F(ab，）2片段。亦 涵蓋藉由遺傳工程改造技術所產生之抗體片段及衍生物。 其他實施例包括嵌合抗體’例如非人類（例如鼠類）單株 抗體之人類化型式。該等人類化抗體可由已知技術製備， 且提供將抗體投與人類時免疫原性降低之優勢。在—實施 例中，人類化單株抗體包含鼠類抗體之可變域（或其抗原 結合位點之全部或一部分）及來源於人類抗體之恆定域。 或者’人類化抗體片段可包含鼠類單株抗體之抗原結合位 點及來源於人類抗體之可變域片段（缺乏抗原結合位點）。 產生傲合單株抗體及經進一步工程改造之單株抗體的程序 包括 Riechmann 等人，1988，Nature 332.323 ; Liu 等人 1987，Proc. Nat· Acad. Sci. USA 84:3439 ; Larrick等人， 1989，Bio/Technology 7:934，及 Winter 等人，1993 Tips 14:139中所述之程序。在一實施例中，嵌合抗體為(：〇反移 植抗體。使抗體人類化之技術論述於例如美國專利申請案 第10/194,975號（2003年2月27日公開）；美國專利第 5,869,619 號、第 5,225,539 號、第 5,821，337 號、第 5,859,205號 ’ Padlan等人，1995，FASEB J. 9:133-39 .及 146681.doc -40· 201036626
Tamura等人，2000，J. Immunol. 164:1432-41 中。 已開發出在非人類動物體内產生人類抗體或部分人類抗 體之程序。舉例而言，已製備一或多個内源免疫球蛋白基 因已利用各種方式失活之小鼠。已將人類免疫球蛋白基因 引入小鼠中置換失活之小鼠基因。在動物體内產生之基因 併有由引入該動物中之人類遺傳物質所編碼之人類免疫球 蛋白多肽鏈。在一實施例中，用α4β7多肽免疫諸如轉殖基 因小鼠之非人類動物，使得在該動物體内產生針對α4β7多 肽之抗體。適合免疫原之一個實例為可溶性人類α4β7，諸 如包含α4β7之一部分或α4β7之其他免疫原性片段的多肽。 適合免疫原之另一實例為表現高含量α4β7的細胞或自其製 備之細胞膜製劑。 產生及使用供製備人類抗體或部分人類抗體用之轉殖基 因動物之技術的實例描述於以下文獻中：美國專利 5,814,318、5,569,825 Sl 5,545,806 ； Davis 等人，2003, Production of human antibodies from transgenic mice, Lo 編，Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press，NJ:191-200 ; Kellermann 等人，2002，Curr Opin Biotechnol. 13:593-97 ; Russel等人，2000, Infect Immun. 68:1820-26 ; Gallo等人，2000，Eur J Immun. 30:534-40 ； Davis 等人，1999, Cancer Metastasis Rev. 18:421-25 ; Green, 1999, J Immunol Methods. 231:11-23 ； Jakobovits, 1998, Adv Drug Deliv Rev 3 1:33-42 ; Green等人，1998, J Exp Med. 188:483-95 ； Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. 146681.doc -41 - 201036626
Invest. Drugs. 7:607-14 ; Tsuda 等人，1997，Genomics 42:413-21 ; Mendez等人，1997，Nat Genet. 15:146-56 ; Jakobovits, 1994，Curr Biol. 4:761-63 ; Arbones等人， 1994，Immunity. 1:247-60 ; Green等人，1994, Nat Genet. 7:13-21 ; Jakobovits 等人，1993，Nature 362:255-58 ; Jakobovits等人，1993，ProcNatlAcadSciUSA·90:2551-5 5 ; Chen, J.等人，1993, lnt Immunol 5: 647-656 ; Choi 等 人，1993，Nature Genetics 4: 117-23 ; Fishwild 等人， 1996, Nat Biotechnol 14: 845-5 1 ; Harding等人，1995，Ann NY Acad Sci ; Lonberg等人，1994，Nature 368: 856-59 ; Lonberg, 1994， Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies, Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-10 1 ; Lonberg 等人，1995, lnt Rev Immunol 13 : 65-93 ; Neuberger, 1996, Nat Biotechnol 14: 826 ; Taylor等人， 1992, Nucleic Acids Research 20: 6287-95 ; Taylor等人， 1994，lnt Immunol 6: 579-91 ; Tomizuka等人，1997，Nat Gen 16: 133-43 ; Tomizuka等人，2000，Proc Natl Acad Sci U S A. 97: 722-27 ; Tuaillon等人，1993，Proc Natl Acad Sci U S A. 90: 3720-24 ;及 Tuaillon 等人，1994, J Immunol 152: 2912-20。此等及其他實例亦論述於2007年5月3日公 開之美國專利申請公開案2007-0098715中。 在另一態樣中，本發明提供與α4β7結合之單株抗體。可 使用此項技術中已知之任何技術來產生單株抗體，例如藉 由在完成免疫時程後使自轉殖基因動物收集之脾細胞永生 146681.doc -42- 201036626 化。可使用此項技術中已知之任何技術使脾細胞永生化， 例如藉由使該等脾細胞與骨髓瘤細胞融合產生融合瘤。用 於產生融合瘤之融合程序的骨髓瘤細胞較佳不產生抗體， 具有較高融合效率，且具有致使該等骨髓瘤細胞不能在某 些僅支持所要融合細胞（融合瘤）生長之選擇性培養基中生 長的酶缺陷。適合用於小鼠融合之細胞株之實例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NSl/l.Ag 4 1、
Sp210-Agl4、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7及SI 94/5XX0 Bui;用於大鼠融合之細胞株之實例包括 R210.RCY3 ' Y3-Ag 1.2.3、IR983F及 4B210。其他適用於 細胞融合之細胞株為U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及 UC729-6。 在一實施例中，融合瘤細胞株係由以下方式產生：用 α4β7免疫原免疫動物（例如具有人類免疫球蛋白序列之轉 殖基因動物）；自經免疫動物收集脾細胞；使所收集之脾 細胞與骨髓瘤細胞株融合，藉此產生融合瘤細胞；自融合 瘤細胞建立融合瘤細胞株；且鑑別產生結合α4β7多肽之抗 體的融合瘤細胞株。該等融合瘤細胞株及由其產生之抗 α4β7單株抗體為本發明所涵蓋。 可使用此項技術中已知之任何技術來純化融合瘤細胞株 所分泌之單株抗體。可進一步篩選融合瘤或mAb以鑑別具 有特定特性之mAb，諸如阻斷α4β7誘導之活性的能力。該 等篩選之實例提供於以下實例中。 亦可使用稱作遺傳免疫之方法來產生單株抗體。舉例而 146681.doc -43- 201036626 言，可將編碼相關抗原之核酸併入病毒載體（諸如腺病毒 載體）中。接著使用所得載體在適合宿主動物（例如非肥胖 性糖尿病或NOD小鼠）體内產生針對相關抗原之免疫反 應。此技術實質上由Ritter等人，Biodrugs 16(1): 3-10 (2002)描述，該文獻之揭示内容以引用的方式併入本文 中。 亦已使用抗體結合位點中心之互補決定區（CDR)的分子 次化來分離具有較大親和力之抗體’例如對c_ei*bB-2具有 較大親和力之抗體’如Schier等人’ 1996，J. Mol. Bi〇i 263:551所述。因此’該等技術適用於製備針對α4β7之抗 體。 針對α4 β7之抗原結合蛋白可用於例如檢定中以於活體外 或活體内偵測α4β7多肽或表現α4β7之細胞的存在。抗原结 合蛋白亦可用於藉由免疫親和層析來純化α4ρ7蛋白。彼等 另外可阻斷MAdCAM-1與α4β7相互作用之抗原結合蛋白可 用於抑制由戎相互作用產生之生物活性。阻斷性抗原結合 蛋白可用於本發明之方法中。該等起到α4β7拮抗劑作用之 抗原結合蛋白可用於治療任何α4β7誘發之病狀，包括（但 不限於）發炎性病狀。在一實施例中，在該等病狀之治療 中使用由涉及轉殖基因+鼠免疫之程序產生之人類抗α4β7 單株抗體。 抗原結合蛋白可用於活體外程序中或活體内投與以抑制 Ρ7誘導之生物活性。由此可治療因α4β7及其與 MAdCΑΜ_ 1之相互作用（直接或間接）所致或惡化之病症Υ 14668l.doc •44- 201036626 其實例提供於本文中。在一實施例中，本發明提供一種治 療方法，其包含活體内投與有需要之哺乳動物有效降低 α4β7誘導之生物活性之量的以^^阻斷性抗原結合蛋白。 本發明之柷原結合蛋白包括抑制α4β7之生物活性的部分 人類單株抗體及完全人類單株抗體。一實施例係關於至少 部分阻斷人類α4β7與MAdCAM-Ι相互作用之人類單株抗 體在一貫細*例中，藉由用α4β7免疫原免疫轉殖基因小鼠 0 來產生抗體。在另一實施例中，免疫原為人類α4β7多肽 (例如經轉型或轉染以表現α4β7之細胞，或天然表現dp 之細胞）。本文中亦提供來源於該等經免疫小鼠之融合瘤 • 細胞株，其中該融合瘤分泌結合α4β7之單株抗體。 儘管人類抗體、部分人類抗體或人類化抗體將適合於許 多應用，尤其涉及將抗體投與人類個體之應用，但其他類 型之抗原結合蛋白亦將適合於某些應用。本發明之非人類 抗體可例如來源於任何產生抗體之動物，諸如小鼠、大 ◎ 鼠、兔、山羊、驢或非人類靈長類動物（諸如猴（例如獼猴 或怪河猴）或猿（例如黑猩猩））。本發明之非人類抗體可用 於例如基於活體外及細胞培養之應用，或針對本發明抗體 之免疫反應不出現、不顯著、可避免、無關緊要或合乎需 要之任何其他應用。在一實施例中，將本發明之非人類抗 體投與非人類個體。在另一實施例中，非人類抗體在非人 類個體中不引發免疫反應。在另一實施例中，非人類抗體 係來自與非人類個體相同之物種，例如將本發明之小鼠抗 體投與小鼠。來自特定物種之抗體可由以下方式製得.例 146681.doc -45- 201036626 如，用所要免疫原（例如表現α4β7之細胞，或可溶性α4β7 多肽）免疫彼物種之動物，或使用產生彼物種之抗體的人 工系統（例如產生特定物種之抗體的基於細菌或噬菌體呈 現之系統）；或藉由用來自其他物種之恆定區置換來自一 個物種之抗體的恆定區或藉由置換該抗體之一或多個胺基 酸殘基以使其與來自其他物種之抗體序列的相似程度更加 接近而使來自一個物種之抗體轉化成來自另一物種之抗 體。在一實施例中，抗體為包含來源於兩個或兩個以上不 同物種之抗體之胺基酸序列的嵌合抗體。 抗原結合蛋白可由許多習知技術中之任一者製備。舉例 而言’抗原結合蛋白可自天然表現其之細胞純化（例如抗 體可自產生其之融合瘤純化），或在重組表現系統中使用 此項技術中已知之任何技術產生。參見，例如Mowoc/⑽《/ Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Kennet 等人（編），Plenum Press, New York (1980)，及 Harlow 及
Land (編)’ Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY, (1988) ° 此項技術中已知之任何表現系統可用於製備本發明之重 組多肽。一般而言，用包含編碼所要多肽之DNA的重組表 現載體轉型宿主細胞。可採用之宿主細胞為原核細胞、酵 母或南級真核細胞。原核細胞包括革蘭氏陰性（gram negative)或革蘭氏陽性（gram positive)生物體，例如大腸 桿菌或桿菌。高級真核細胞包括昆蟲細胞或哺乳動物來源 146681.doc -46 - 201036626 之既定細胞株。適合哺乳動物宿主細胞株之實例包括猴腎 細胞之 COS-7 細胞株（ATCC CRL 1651 )(Gluzman 等人， 1981, Cell 23:175)、L細胞、293細胞、C127細胞、3T3 細 胞（ATCC CCL 163)、中國倉鼠卵巢（CHO)細胞、海拉細 胞、BHK(ATCC CRL 10)細胞株，及來源於非洲綠猴腎細 胞株 CVI(ATCC CCL 70)之CVI/EBNA細胞株，如 McMahan 等人，1991，EMBO J. 10: 2821所述。供細菌、真菌、酵母 及哺乳動物細胞宿主使用之適當選殖及表現載體由 Pouwels ^ Λ. {Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)描述。 可在促進多肽表現之條件下培養經轉型細胞，且由習知 蛋白質純化程序回收多狀。一種此類純化程序包括例如在 α4β7之全部或一部分（例如胞外域）與之結合之基質上使用 親和層析。預期用於本文中之多肽包括實質上均質之重組 哺乳動物抗α4β7抗體多肽，其實質上不含污染内源物質。 多肽之胺基酸序列可由此項技術中已知之任何方式來驗 證，且其可與本文序列表中所揭示之序列一致，或可能因 加工而與彼等序列有一或多個胺基酸殘基不同。舉例而 言，對實質上均質多肽之全部或一部分，可藉由蛋白水解 加工或在培養期間進行之其他加工，例如對C端Lys殘基之 加工來移除輕鏈或重鏈（或相關單鏈分子）之C端胺基酸。 或者，移除一個以上C端胺基酸殘基，例如兩個C端胺基 酸，或三個、四個或五個C端胺基酸。舉例而言，可將C 端截短以使所揭示抗體之重鏈的脯胺酸醯胺化。類似地， 146681.doc • 47· 201036626 可缺少N端胺基酸’例如可缺少一個、兩個、三個、四個 或五個N端胺基酸。 或者或另外’可對胺基酸殘基進行轉譯後修飾，例如 (但不限於）可使麩胺醯胺（特定言之，N端之麩胺醯胺）環化 或轉化成焦麩胺酸；或者或另外，可對胺基酸進行脫醯 胺、異構化、糖化及/或氧化。可對本發明之多肽進行其 他轉譯後修飾，包括在此項技術中熟知之位點處進行糖基 化’例如N連接型糖基化或〇連接型糖基化。如先前所 述，可對多肽之胺基酸序列作出改變以排除該等變化或使 »亥等變化減至最少，或在該加工有益之情況下促進該等變 化。 實質上均質多肽之製劑可包含約1%、5%、1〇%、2〇%、 30〇/〇、40%、50%、60%、70%、75%、8〇%、85%、9〇%、 95〇/。、97%、98%或99%已進行特定形式之加工的多肽。實 質上均質多肽之製劑可包含一些（小於或等於、多數 (大於5〇%，但小於90%)或實質上所有（大於9〇%)特定形式 之經加工多肽。此外，該等製劑可包含具有不同程度之一 種類型以上之加工相關修飾的多肽，例如多肽中可有一 些、多數或實質上所有c端離胺酸（例如seqidn〇:72中之 C端胺基酸）經移除及—些、多數或實f上所有㈣胺基酸 已轉化成焦麩胺酸（例如表丨及/或表2中或共同序列中所示 之任何多肽）。 抗原結合蛋白可由許多已知技術t之任—者製備，且針 對所要特性進行筛選。某些技術包括分離編碼相關抗原結 I46681.doc -48- 201036626 合蛋白（例如抗α4β7抗體）之多肽鏈（或其部分）的核酸，及 經由重組DNA技術操縱核酸。舉例而言，可使核酸與另— 相關核酸融合，或改變該核酸（例如藉由突變誘發或其他 習知技術）以添加一或多個胺基酸殘基、使一或多個胺基 酸殘基缺失或取代一或多個胺基酸殘基。 在一態樣中’本發明k供本發明之抗α4β7抗體之抗原結 合片Ί又。a亥專片段可元全由抗體來源之序列組成或可包含 其他序列。抗原結合片段之實例包括Fab、F(ab，）2、單鏈 抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及域抗體。 其他實例提供於Lunde等人，2002，Biochem. Soc. Trans. 30:500-06中。 單鏈抗體可由重鏈及輕鏈可變域（Fv區）片段經由胺基酸 橋（短肽連接子）連接產生單一多肽鏈而形成。該等單鍵 Fvs(scFvs)已藉由編碼肽連接子之DNA融合於編碼該兩個 可變域多肽（VL及Vh)之DNAs之間而製備。所得多肽可自 身對折形成抗原結合單體’或可形成多聚體（例如二聚 體、三聚體或四聚體），視兩個可變域之間可撓性連接子
之長度而定（Kortt等人，1997，Prot. Eng. 10: 423 ; Kortt等 人，2001，Biomol. Eng. 18:95-108)。藉由組合不同的含 vL 及VH之多肽，可形成結合不同抗原決定基之多聚 scFvs(Kriangkum等人，2001，Biomol. Eng_ 18: 31-40)。開 發用於產生單鏈抗體之技術包括美國專利第4,946,778號； Bird，1988, Science 242:423 ; Huston等人，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 ; Ward等人，1989, Nature 1466Sl.doc •49- 201036626 334:544 I de Orapf^ #
Uraai等人，2002，Methods Mol Biol· 178: 379-87中所述之技術。 本發明之抗原結合蛋白（例如抗體、抗體片段及抗體衍 生物）可包含此項技術中已知之任何恆定區。輕鏈恆定區 可為例如κ型或λ型輕鏈恆定區，例如人類κ型或1型輕鏈恆 疋區。重鏈恆定區可為例如α型、δ型、ε型、γ型或μ型重 鏈恆定區’例如人類α型、δ型、ε型、γ型或μ型重鏈恆定 區在個實施例中，輕鏈恆定區或重鏈恆定區為天然產 生1·亙疋區之片段、衍生物、變異體或突變蛋白質。 自相關k體得到不同子類或同型抗體的技術為已知，亦 即子類轉換。因此’舉例而言，可自IgM抗體得到吵抗 體’反之亦然。該等技術允許製備新抗體，其具有指定抗 體(親本抗體)之抗原結合特性，而且亦展現不同於親本抗 體之抗體同型或子類相關之生物特性。可採用重組蘭A技 術在。亥等程序中可採用編碼特定抗體多狀之選殖腿八， 例如編碼所要同型抗體之惶定域的DNA。亦參見Lantt0等 人，2002, Methods M〇1 咖 178:3〇316。此外，若砂4 為所需，則亦可能需要將點突變（cpscp_>cppcp)引入鉸 鏈區中，如Bloom等人，1997, pr〇tein 6:4〇7所述 (以引用的方式併人本文中），以降低形成可能導致^以抗 體異質性之Η鏈内二硫鍵之趨勢。 此外，得到具有不同特性(料，對所結合之抗原具有 不同親和力）之抗原結合蛋白的技術亦為已知。—種此類 技術稱作鏈改組（chain shuffling)，涉及在絲狀嗟菌體表面 146681.doc -50· 201036626 上呈現免疫球蛋白可變域基因譜系，通常稱作噬菌體呈 現。鏈改組已用於製備針對半抗原2_苯基喔。坐_5_酮之高親 和力抗體，如Marks等人，1992, Bi〇Techn〇1〇gy, 1〇:779所 述0 在另一實施例中，本發明提供一種自α4β7解離之低解離 常數之抗原結合蛋白。在一個實施例中，抗原結合蛋白具 有100 ρΜ或100 ρΜ以下之Kd。在另一實施例中，心為1〇 ❹ PM或1〇 pM以下，在另一貫施例中，其為5 pM或5 pM以 下’或其為1 pM或1 pM以下。在另一實施例中，Kd實質 上與本文實例中所述之抗體相同。在另一實施例中，抗原 1 結合蛋白與α4Ρ7結合之Kd實質上與本文實例中所述之抗體 相同。 在另一態樣中’本發明提供一種抑制α4β7活性之抗原結 合蛋白，該活性為例如與MAdCAM-Ι結合（或黏附於 MAdCAM-Ι)、與表現MAdCAM-Ι之細胞結合，或表現 Q α4β7之細胞與表現MAdCAM-Ι之細胞之間的黏附。在一實 施例中，抗原結合蛋白具有1000 PM或1000 PM以下之 IC5〇。在另一實施例中’ IC50為500 pM或500 pM以下；在 另一實施例中，IC50為100 pM或100 pM以下。在另一實施 例中’ ICw實質上與本文實例中所述之抗體相同。在另一 實施例中，抗原結合蛋白抑制α4β7活性之IC50實質上與本 文實例中所述之抗體相同。 在一實施例中，本發明之抗原結合蛋白對α4β7(或表現 α4β7之細胞）之表觀親和力為1000 ρΜ或1000 ρμ以下。在 146681.doc -51 - 201036626
八他貫施例中’抗原結合蛋白所展現之表觀親和力為MO pM或 500 pM以下、200 pM或 200 pM以下、100 pM或 1〇〇 pM以下、80 pM或80 PM以下、40 pM或40 pM以下，或15 PM或1 5 PM以下。在另一實施例中，抗原結合蛋白所展現 之表觀親和力實質上與本文實例中所述之抗體相同。在另 一實施例中，抗原結合蛋白具有實質上與本文實例中所述 之抗體相同之表觀親和力。 在另一態樣中，本發明提供一種結合活性形式與非活性 形式兩者之α4β7的抗原結合蛋白。在另一實施例中，抗原 ¢) 結合蛋白僅結合一種形式之α4β7，或優先結合一種形式之 α4β7。舉例而言，抗原結合蛋白可在存在或不存在Μη2+之 ’ί月況下均結合α4β7(亦即，其結合活性形式與非活性形 式）或者，抗原結合蛋白可僅在存在]νΐη2+之情況下或僅 在不存在Μη2之情況下結合α4β7，或其可能在一種此類條 件下結合之親和力高於另一條件下結合之親和力，表明與 特定形式之α4β7優先結合。 在另一實施例中’本發明提供一種與本文所揭示之抗體 ◎ 競爭結合α4β7之抗原結合蛋白。該競爭能力可由此項技術 中煞知之方法來確定，例如藉由如使用螢光活化細胞分選 (FACS)技術或其他類似檢定所觀測，在與表現以^7之細胞 結合方面進行競爭，藉由在諸如黏附檢定（亦即，表現 α4β7之細胞與表現MAdCAM—丨之細胞之間）之檢定中進行 脱爭，或藉由在本文所述之另一檢定十進行競爭。在一態 樣中，與本文所揭示之抗體競爭結合α4β7之抗原結合蛋白 146681.doc -52- 201036626 結合與該抗體相同之抗原決定基或重疊（或相鄰）之抗原決 疋基。在另一態樣中，與本文所揭示之抗體競爭結合α4ρ7 之抗原結合蛋白抑制α4β7之活性。 在另一態樣中，本發明提供一種與細胞表面上所表現之
〇 人類α4β7結合且在如此結合時抑制α4β7與MAdCAM-Ι相互 作用，而不會顯著降低細胞表面上α4ρ7之量的抗原結合蛋 了使用测疋或估算細胞表面上及/或細胞内部7之 里的任何方法。在_實施例中，本發明提供—種與細胞表 面上所表現之α4β7結合且在如此結合時抑制以卩了與 CAM 1相互作用，而不會顯著增加自細胞表面内 化之速率的抗原結合蛋白。在其他實施例中’抗原結合蛋 白與表現《4β7之細胞結合使小於約75%、5〇%、4〇%、 3〇〇/。、20%、15%、㈣、5%、⑼或㈣之細胞表面鄉7 被内化。 -匕、樣中，I發明提供一種於活體外或活體内(例 2當投與人類個體時)具有至少一天之半衰期的抗原結合 在實施例中，抗原結合蛋白具有至少三天之半衰 期。，另一實施例中，抗原結合蛋白具有四天或四天以上又 之半哀期。在另一實施例中，抗原結合蛋白具有八天或八 :::之半衰期。在另一實施例中’抗原結合蛋白經衍生 ==飾’以使其與未經衍生處理或未經修 7蛋白相比具有較長半衰期。在另—實施例中，抗原結 。蛋白含有—或多個用以增加血清半衰期之點突變，諸如 _年2月24日公開之w〇 〇〇/〇956〇(以引用的方式併入）中 146681.doc -53- 201036626 所述。 本發明進一步提供多專一性抗原結合蛋白，例如雙專一 性抗原結合蛋白，例如經由兩個不同抗原結合位點或抗原 結合區與α4β7之兩個不同抗原決定基結合或與α4β7之抗原 決定基及另一分子之抗原決定基結合的抗原結合蛋白。此 外，如本文所揭示之雙專一性抗原結合蛋白可包含來自一 種本文所述之抗體的α4(37結合位點及來自另一種本文所述 之抗體的第二α4β7結合區，包括本文中參考其他公開案所 述者。或者，雙專一性抗原結合蛋白可包含來自一種本文 所述之抗體的抗原結合位點’及來自此項技術中已知之另 一 α4β7抗體或來自藉由已知方法或本文所述方法製備之抗 體的第二抗原結合位點。 製備雙專一性抗體之眾多方法在此項技術中已知，且論 述於2001年4月20日申請之美國專利申請案〇9/839,632(以 引用的方式併入本文中）中。該等方法包括使用雜交融合 瘤（如Milstein等人，1983, Nature 305:537所述）及其他（美 國專利4,474,893、美國專利6，1〇6,833)，及使抗體片段進 行化學偶合（Brennan等人，1985, Science 229:81 ; Glennie 等人，1987, J. Immunol. 139:2367 ;美國專利 6,010,902)。 此外，雙專一性抗體可經由重組方式產生，例如藉由使用 白胺酸拉鏈部分（亦即，來自F〇s及Jun蛋白之白胺酸拉鏈部 分’其優先形成雜二聚體；Kostelny等人，1992，J.
Immnol. 148:1547)，或如美國專利5,582,996中所述之其他 鎖-鑰相互作用域結構。其他適用技術包括K〇rU等人， 146681.doc •54- 201036626 b97，同上；美國專利5,959,083及美國專利5,8〇7,7〇6中所 述之技術。 在另一態樣中’本發明之抗原結合蛋白包含抗體衍生 物°經衍生處理之抗體可包含在特定用途中賦予該抗體所 要特性（諸如較長半衰期）之任何分子或物質。經衍生處理 之抗體可包含例如可偵測（或標記）部分（例如放射性分子、 有色分子、抗原分子或酶分子、可偵測珠粒（諸如磁性珠 ❹ 粒或電緻密（例如金）珠粒），或與另一分子（例如生物素或 抗生蛋白鏈菌素）結合之分子，治療性或診斷性部分（例如 放射性部分、細胞毒性部分或醫藥活性部分），或增強抗 • 體對特定用途（例如投與個體，諸如人類個體，或其他活 體内或活體外用途）之適合性的分子。可用於對抗體進行 衍生處理之分子的實例包括白蛋白（例如人類血清白蛋白） 及聚乙二醇（PEG)。與白蛋白連接及經聚乙二醇化之抗體 衍生物可使用此項技術令熟知之技術來製備。在一實施例 ❹ 中’使抗體與轉曱狀腺素蛋白（transthyretin，TTR)或TTR 變異體共輛或以其他方式連接。可用例如選自由葡聚糖、 聚（η-乙烯基。比咯啶酮）、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物 '聚 環氧丙烧/聚環氧乙烧共聚物、聚氧乙稀化多元醇及聚乙 烯醇組成之群的化學物質對TTR或TTR變異體進行化學修 飾。美國專利申請案第20030195 154號。 在另一態樣中’本發明提供使用本發明之抗原結合蛋白 師選與α4β7結合之分子的方法。可使用任何適合篩選技 術。在一實施例中，使與本發明之抗原結合蛋白結合之 146681.doc •55· 201036626 分子或其片段與本發明之抗原結合蛋白及與另一 接觸，其中若該另-分子減少抗原結合蛋白與α4β二 合，則該分子與α4β7結合。可使用任何適合方法㈣ ELISAM貞測抗原結合蛋白之結合。可藉由如上所論述，對 抗原結合蛋白進行可偵測標記來簡化對抗原結合蛋白與 州結合之_。在另—實施例中，進—步分析結合以㈣ 之分子以判定其是否抑制α 4 Ρ 7活化及/或信號傳導。 核酸 在-態樣中’本發明提供經分離之核酸分子。核酸包含 例如編碼抗原結合蛋白之全部或一部分，例如本發明抗體 ，其片段、衍生物、突變蛋白質或變異體之一或兩條鏈的 聚核苷酸；足以用作用以鑑別、分析、突變或擴增編碼多 肽之聚核皆酸之雜交探針、PCR引子或定序引子的聚核苦 酸；抑制聚核苷酸表現之反義核酸；及上述各核酸之互補 序列。核酸可具有任何長度。其長度可為例如5、10、 15、2〇、25、3〇、35、4〇、45、5〇、75、1〇〇、125、 150 、 175 、 200 、 250 、 3GG 、 35G 、 4G0 、 45G 、 5G0 、 750 、 1,000 1’5〇〇、3,〇〇〇、5 〇〇〇個或 5,〇〇〇個以上核苷酸，及， 或可包合—或多個額外序列（例如調控序列），及/或為較大 核酸（例如葡微\ + . 執組）之—部分。核酸可為單股或雙股，且可包 s RNA及/或〇1^八核苷酸及其人工變異體（例如肽核酸）。 可自已經α4β7免疫之小鼠之b細胞中分離編碼抗體多肽 (例如僅編碼重鏈或輕鏈、可變域，或編碼全長抗體多肽） 之核酸。可cb 4 , 田睹如聚合酶鏈反應（PCR)之習知程序來分離 146681.doc 201036626 核酸。 本發明進一步提供在特定雜交條件下與其他核酸雜交之 核酸。使核酸雜交之方法在此項技術中已熟知。參見，例 如 Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y. (1989)，6.3.1-6.3.6。如本文所定義，中等嚴格 雜交條件使用含有5χ氣化鈉/檸檬酸鈉（SSC)、0.5% SDS、 1.0 mM EDTA(pH 8.0)之預洗溶液，約50%甲醯胺、6χ SSC之雜交緩衝液，及55°C之雜交溫度（或其他類似雜交溶 〇 液，諸如含有約50%甲醯胺之溶液，使用42°C之雜交溫 ' 度），及在60°C下於〇.5xSSC、0.1% SDS中之洗滌條件。嚴 • 格雜交條件為在45°C下於6xSSC中雜交，接著在68°C下於 0.1 X S S C、0 _ 2 % S D S中洗滌一或多次。此外，熟習此項技 術者可操縱雜交及/或洗滌條件以增強或降低雜交嚴格 度，以使得包含彼此至少65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、98%或99%—致之核苷酸序列的核酸通常保持 Q 彼此雜交。影響雜交條件選擇之基本參數及擬出適合條件 之指南係由例如 Sambrook, Fritsch 及 Maniatis(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.，第 9章 及第 11 章；及 Current Protocols in Molecular Biology, 1995，Ausubel等人編，John Wiley & Sons, Inc.，第 2.10節 及第6.3-6.4節）闡述，且可易於由一般技術者基於例如 DNA之長度及/或鹼基組成來確定。 可由以下方式引入變化：使核酸中發生突變，藉此在該 146681.doc -57- 201036626 核酸所編碼之多肽（例如抗原結合蛋白）之胺基酸序列中產 生變化。可使用此項技術中已知之任何技術引入突變。在 一實施例中，使用例如定點突變誘發方案來改變一或多個 特定胺基酸殘基。在另一實施例中，使用例如隨機突變绣 發方案來改變一或多個隨機選擇之殘基。然而，可表現突 變型多肽，且針對所要特性（例如與α4)37結合，或阻斷 α4β7與諸如MAdCAM之地址素（addressin)結合）對該多肽進 行篩選。 可將突變引入核酸中，而不會顯著改變該核酸所編碼之 多狀的生物活性。舉例而言’可進行核苷酸取代，使得在 非必需胺基酸殘基處發生胺基酸取代。在一實施例中，使 核苷酸序列或其所要片段、變異體或衍生物突變，以使得 其編碼包含一或多個胺基酸殘基缺失或取代之胺基酸序 列。在另一實施例中，突變誘發在一或多個胺基酸殘基鄰 近插入胺基酸。或者，可將一或多個突變引入核酸中，其 選擇性地改變該核酸所編碼之多肽的生物活性（例如 結合、抑制α4β7與諸如MAdCAM之地址素結合，等）。舉 例而。、大變可定量或定性改變生物活性。定量變化之實 G強降低或消除活性。定性變化之實例包括改變 抗原結合蛋白之抗原專一性。 在另態樣中’本發明提供適合用作用以偵測本發明核 酸序列之引早―、址 1卞攻雜父探針的核酸分子。本發明之核酸分子 "T僅包含編碼本絡日日+人e々 +發明之全長多肽之核酸序列的一部分， 如可用作探針式 子之片段或編碼本發明多肽之活性部分 146681.doc 201036626
(例如α4β7結合部分）之片段D 用於偵測核酸或類似核 。探針可包含標記群， S#或酶輔因子。該等探 基於本發明核酸之序列的探針可 酸’例如編碼本發明多肽之轉錄物 例如放射性同位素、螢光化合物、 針可用於鑑別表現多肽之細胞。 在另一態樣中，本發明提供包含編碼本發明多肽或其 部分之核酸的載體。載體之實例包括（但不限於）：質體 Ο 病毒載體、非游離型哺乳動物載體及表現載體，例如重 表現載體。 本發明之重組表現載體可包含本發明之核酸，其呈適人 . 在宿主細胞中表現該核酸之形式。重組表現載體包括一或 多個基於欲用於表現之宿主細胞而選擇之調控序列，其可 操作地連接於待表現之核酸序列。調控序列包括指導核苷 酸序列在許多類型之宿主細胞中組成性表現之調控序列 (例如SV40早期基因強化子、R〇us肉瘤病毒啟動子及細胞 〇 巨大病毒啟動子）、指導核苷酸序列僅在某些宿主細胞中 表現之調控序列（例如組織專一性調控序列，參見v〇ss等 人 ’ 1986，Trends Biochem. Sci. 11:287 ; Maniatis等人， 1987，Science 236:1237，該等文獻以全文引用的方式併入 本文中），及指導核苷酸序列回應於特定處理或條件而誘 導性表現之調控序列（例如哺乳動物細胞中之金屬硫蛋白 啟動子（metallothionin promoter)及原核系統與真核系統中 之四環素反應性啟動子（tet-responsive promoter)及/或鏈徽 素反應性啟動子（streptomycin responsive promoter)(見 146681.doc -59- 201036626 上））。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計可視諸如 待轉型之伤主細胞之選擇、所要蛋白質之表現量等因素而 定。可將本發明之表現載體引入宿主細胞中，藉此產生由 本文所述之核酸編碼之蛋白質或肽，包括融合蛋白或融合 肽。 σ 在另態樣中，本發明提供本發明之重組表現載體已引 入内部之宿主細胞。宿主細胞可為任何原核細胞（例如大 腸桿菌）或真核細胞（例如酵母、昆蟲或哺乳動物細胞（例如 CHO細胞））。可經由習知轉型或轉染技術將載體dna引入 原核細胞或真核細胞中。對於哺乳動物細胞之穩定轉染， 已知，視所用表現載體及轉染技術而$，僅―小部分細胞 可將外來DNA整合至其基因組中。為鑑別及選擇此等整合 體，-般將編碼可選擇標言己（例如抗生素抗性）之基因連同 相關基因-起引人宿主細胞中。較佳可選擇標記包括使對 諸2 G418、潮黴素（hygr〇mycin)及甲胺喋啥㈣如如价） 之藥物具有抗性之可選擇標記。經所引人之核酸穩定轉染 之細胞可藉由藥物選擇(例如已併有可選擇標記基因之細 胞將存活’而其他細胞將死亡)以及其他方法來鑑別。 適應症 在一態樣中，本發明提供治療個體之方法。該方法可例 士對個體具有-般有益健康之作用，例如其可延長個體之 預期壽命。或者，肖方法可例如治療、預防、^癒、減輕 或改善（「治療」）疾病、病症、病狀或疾患（「病狀」）。 欲根據本發明治療之病狀為特徵在於α寧之不當表現或活 146681.doc 201036626 f之病狀該等病狀包括與細胞不當運輸相關之病狀，例 如白血球（諸如淋巴細胞或單核細胞）運輸至包含表現 MAdCAM-I之細胞的胃腸道或其他組織（由於白血球與表 現MAdCAM.l之細胞結合所導致p可據此治療之疾病包 括發炎性腸病，諸如潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、乳糜瀉 (非熱帶性口瘡）、與血清陰性關節病相關之腸病、顯微結 腸炎或膠原性結腸炎、嗜伊紅血球性胃腸炎，或直腸結腸 〇 切除術及迴腸肛門吻合術後所致之貯袋炎。可根據本發明 /α療之其他病狀包括胰臟炎、胰島素依賴性糖尿病、乳房 炎、膽囊炎、膽管炎、膽管周圍炎、慢性支氣管炎、慢性 竇炎、哮喘及移植物抗宿主疾病。 抗原結合蛋白之治療方法及投藥 本文所提供之某些方法包含將α4ρ7雜二聚體專一性抗原 結合蛋白投與個體，藉此減少在特定病狀中起作用的α4β7 誘導之生物反應。在特定實施例中，本發明之方法涉及例 〇 如經由投與個體或在離體程序中，使内源《4β7與α4β7抗原 結合蛋白接觸。 術語「治療」涵蓋緩解或預防病症之至少一種症狀或其 他態：’或減輕疾病嚴重度’及其類似情況。抗原結合蛋 白無需達成完全治癒或根除疾病之每種症狀或表現，即可 構成有效治療劑。如相關領域中所公認，用作治療劑之藥 物可減輕指定疾病病況之嚴重度，而無需消除疾病之每種 表現，即可視為適用之治療劑。類似地，出於預㈣投與 之治療無需完全有效地預防病狀發作，即可構成有效預防 146681.doc -61 201036626 = = 藉由減少其症狀之數目或減 輕症狀厫重度，或藉由增加另—治療之有^ 生另一有益效果)或降低疾病在個體中出現或惡二ΐ 性即足以。本發明之一實施例係關於如下方法：該方法包 含以足以誘導優於反映特定病 洛咖生 ^ α ^ ^ <嚴重度之指標基線的持 續改善之量且歷時足以誘導該持續改善之時 α4β7拮抗劑。 仅，、 如相關領域中所瞭解，以適於適應症之方式將包 明分子之醫藥組合物投與個體。醫藥組合物可藉由任㈣ ^技純與、，包括（但不限於）非經腸、局部或藉由吸入投 Ί订庄射’則醫藥組合物可由以下方式投與：例如 、…丄 η肌肉内、病灶内、腹膜内或皮下途 :=:夬速注射，或連續輸注。涵蓋例如在疾病或損傷 處局指_，亦涵蓋經皮傳遞及自植入物持續釋放。 :由吸入進行傳遞包括例如經鼻或經口吸入、使用喷霧 益吸入耽霧劑形式之拮抗劑，及其類似情況。其他替代 物包括滴眼液；口服製劑，包括丸劑、糖漿、口含錠或口 爵旋，及局部製劑，諸如洗劑、凝膠、喷霧及軟膏。 亦涵蓋在離體程序中使用抗原結合蛋白。舉例而言，可 離體使患者之a液或其他體液與結合α4β7之抗原結合蛋白 可使抗原結合蛋自與適合不溶性基質或固體 料結合。 啊 抗原結合蛋白宜以包含—或多種其他組份之組合物形式 投與’該等組份為諸如生理學上可接受之載劑、赋形劑或 146681.doc -62- 201036626 稀釋劑。視情況，組合物另外包含一或多種生理學活性 劑’例如第二發炎抑制物質或免疫抑制物質、抗灰其生成 物質、止痛物質等，其非排他性實例提供於本文中。在各 種特定實施例除結合α4β7之抗原結合蛋白以外，組合 物亦包含1、2、3、4、5或6種生理學活性劑。 在一實施例中，醫藥組合物包含本發明之抗原結合蛋白 以及一或多種選自由以下組成之群的物質：緩衝劑；抗氧 〇 化劑，諸如抗壞血酸；低分子量多肽（諸如具有少於10個 胺基酸之多肽）；蛋白質；胺基酸；碳水化合物，諸如葡 萄糖、蔗糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA ;麩胱甘肽；穩 定劑；及賦形劑。中性緩衝鹽水或與同種血清白蛋白混合 之鹽水為適當稀釋劑之實例。根據適當工業標準，亦可添 加防腐劑，諸如苯甲醇。可使用適當賦形劑溶液（例如蔗 糖）作為稀釋劑將組合物調配成凍乾物。適合組份在所採 用之齊丨里及展度下對接受者無毒。醫藥調配物中可採用之 ❹、、且伤的其他實例呈現於Remington's Pharmaceutical SCienCeS ’第 16版（1980)及第 20版（2000), Mack Publishing
Company, Easton, PA 中。 供從業邊師所用之套組包括本發明之α4β7抑制物質及關 於在&療本文所論述之任—病狀中使用之標記或其他指 不在一實施例中，該套組包括一或多種結合α4β7之抗原 蛋白之無菌製劑’其可呈如上所揭示之組合物形式且 可處於一或多個小瓶中。 投藥劑量及頻率可根據以下因素而變化··諸如投藥途 146681.doc
S -63 - 201036626 採用之特疋抗原結合蛋白、待治療疾病之性質及嚴 重度、病狀為急性抑或慢性，及個體之體型及一般狀況。 ，當劑量可藉由相關技術中已知之程序，例如在可包括劑 置遞增研究之臨床試驗中確定。 本發明之α4β7抑制物質可投與例如一次或一次以上例 如經-定時段以規律之時間間隔投與。在特定實施例中， 經至少1個月或i個月以上之時段’例如歷經i、2或3個月 ，甚至，„、限期地投與抗原結合蛋白。對於治療慢性病狀， 長期治療-般最為有效。然而，對於治療急性病狀，歷妹 較短時段（例如⑴週）投藥即足以。一般而言，投與抗原 結合蛋白直至患者表現出優於所選指標之基線的關 程度的改善。 本發明之特定實施例包括以每天每公斤個體體重約上夺 克抗原結合蛋白（M奈克/公斤/天」）至約H)毫克/公斤/ 天、更佳約5〇0奈克/公斤/天至約5毫克/公斤/天且最佳約5 微克/公斤/天至約2毫克/公斤/天之劑量將抗原結合蛋白投 與個體。在其他實施例中’每週一次、每週兩次或每週三 次或三次以上將抗原結合蛋白投與成人，以治療以邻7介導 之疾病、病狀或病症，例如本文所揭示之醫學病症。若進 行注射，則每-成人劑量中抗原結合蛋白之有效量可在五· 2〇一範圍内，且較佳為約5_12mg/m2。或者，可投盘 均-劑量_ dose)，該量可在5]⑽毫克/劑之範圍内。— 種均-劑量範圍為約20.30毫克/劑。在本發明之—實施例 中，藉由注射重複投與25毫克/劑之均_劑量。若使用除 146681.doc • 64 - 201036626 ;射乂外之技藥途杈，則根據標準醫學規範適當調整劑 里/口療方案之—個實例包括經至少三週之時段、每週一 至三次注射約20-30毫克劑量之抗原結合蛋白，不過可能 &需治療更㈣段以料所要程度之改善。料小兒個體 (4_17歲），一種例示性適合方案包括皮下注射0.4 mg/kg、 直至25 mg最大劑量之抗原結合蛋白，每週投與兩次或三 次。 ❹ 本文所提供方法之特定實施例包括每週一或兩次皮下注 射0.5 mg至10 mg、較佳3 „^至5 mg之抗原結合蛋白。另 一實施例係關於每週一次肺部投與（例如利用噴霧器p • 或3 mg以上之抗原結合蛋白。 本文所提供治療方案之實例包含每週一次皮下注射i. 5 至3 mg劑量之抗原結合蛋白，以治療α4ρ7起作用之病狀。 該等病狀之實例提供於本文中，且包括例如先前所述之風 濕性病狀，及表現α4β7之細胞的過量或不當運輸起作用之 〇 其他病狀（如本文所述；例如發炎性腸病、胰臟炎等）。持 續每週投與抗原結合蛋白直至達成所要結果，例如個體之 症狀消退。需要時可恢復治療，或者可投與維持劑量。 本文所提供治療方案之其他實例包含皮下或靜脈内投與 每公斤個體身體質量1、3、5、6、7、8、9、10、11、 12、15或20毫克（mg/kg)劑量之本發明制劑。可將 劑量一次投與個體’或以一定時間間隔投與一次以上，例 如每天一次、每週三次、每週兩次、每週一次' 每月三 次、每月兩次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一 146681.doc •65- 201036626 次、每六個月—违士益 人。在治療過程巾可改變或變 滿足特定個體需要。 或頻率之任何變化，以 之實施例中’収以誘導至少-個反映所治療病症 2重度之指標的改善、較佳持續改善之量且持續足以誘 改善之時間將抗原結合蛋白投與個體。可評估反映個 體之疾患、_或絲程度之各種指標以判定治療之量及 時間是否充分。該等指標包括例如所述病症之疾病嚴重 度、症狀或表現的臨床上公認之指標。在—實施例卜若 個體在至少兩個隔開2至4週之時刻展現出改善，則該改善 視為持續的。改善程度一般係由醫師確定，該醫師可基於 徵象、症狀、活組織檢查或其他測試結果作出此確定，且 亦可採用投與個體之問卷，諸如開發用於指定疾病之生活 品質問卷。 α4β7表現之改變及/或&4|37及/或其結合搭配物MAdcAM-1活化之改變與許多病症相關，包括例如胃腸系統之發炎 性病狀。可篩選患有指定病症之個體以鑑別α4ρ7或 MAdCAM-1表現及/或活化改變之個體，進而鑑別可在很 大程度上受益於用結合α4β7之抗原結合蛋白治療之個體。 因此’本文所提供之治療方法視情況包含量測個體之α4ρ7 或MAdC AM-1活化程度或表現量之第一步驟。可將抗原結 合蛋白投與a4p7&/4MAdCAM-l表現及/或活化升高超過 正常之個體。 可在用抗原結合蛋白治療之前、期間及/或之後監測個 146681.doc -66- 201036626 體之α4β7或MAdCAM-I活性程度，以偵測α4β7或 之變化（若有變化）。對於一些病症，〇邻7 及/或圖⑽七舌性升高之發生率可根據諸如疾病階段 或特定疾病形式之因素而變化。可採用已知技術來量測例 如個體血液或組織樣本令之該活性。可使用任何適合之技 術來量測α4β7或MAdCAMl活性。 Ο Ο 本务月之方法及組合物之特定實施例包括使用抗原結合 蛋白及一或多種其他α4β7拮抗劑，例如兩種或兩種以上本 發明抗原結合蛋白’或本發明抗原結合蛋白及一或多種其 他α4β7拮抗劑。在其他實施例中，單獨或與適用於治療^ 者所罹患之病狀的其他藥劑組合投與抗原結合蛋白“亥等 藥劑之實例包括蛋白質類藥物與非蛋白質類藥物。當;;同 =與多種治療劑時，如相關技術中所公認，可據此調整劑 里。「共同投藥」及組合療法並不限於同時投藥而且亦 包括如下治療方案：其中在涉及將至少—種其他 與患者之治療過程中，至少—次投與抗原結合蛋卜 可與抗原結合蛋白一起共同投與之其他藥劑之實例為根 療之特定病狀而選擇之其他抗原結合蛋白或治療夕 Χ 肽或者，可與哪7拮抗劑一起共同投與適用於治療二 所論述之特定病狀之一的非蛋白質類藥物。 ’、 組合療法 :二,中，本發明提供一種用抑制—之抗… 或夕種其他治療來治療個體之方法。在/ 中此類組合療法藉由例如攻擊禮瘤中之多個部位或分^ 146681.doc -67· 201036626 目標而達成協同效應或加和效應。可與本發明相結合使用 之組合療法之類型包括抑制或活化（適當時）單一疾病相關 路仅令之多個結點、目標細胞中之多個路徑、及目標組織 内之多個細胞類型。 在另一實施例中，組合療法包含向個體投與2、3、4、 5、6或6種以上本文所述之α4β7促效劑或拮抗劑。在另一 實施例中，該方法包含向個體投與兩種或兩種以上共同抑 制或活化（直接或間接）α4β7介導之信號轉導的治療。該等 方法之實例包括使用兩種或兩種以上抑制α4ρ7之抗原結合 蛋白之組合，抑制α4β7之抗原結合蛋白與一或多種具有消 炎特性之其他治療部分（例如非類固醇消炎劑、類固醇及/ 或免疫調節劑）之組合，或抑制α4β7之抗原結合蛋白與一 或多種其他治療（例如手術、超音波或有效減輕炎症之治 療）之組合。可與α4β7抑制劑組合之適用藥劑包括用於治 療例如克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎之藥劑，諸如胺基水揚 鷇鹽（例如美沙拉嗪（mesalamine));皮質類固醇（包括潑尼 松（predlsone));抗生素，諸如曱硝噠唑（metr〇nidaz〇ie)或 環丙沙星（ciprofloxacin)(或適用於治療例如罹患瘺病之患 者的其他抗生素）；及免疫抑制劑，諸如硫唑嘌呤 (azathioprine)、6_ 酼基嘌呤（6_mercapt〇purine)、甲胺喋 呤、他克莫司（tacrolimus)及環孢黴素（cycl〇sp〇rine)。亦預 期該等藥劑之組合與本發明α4β7抑制劑—起使用。該（該 等）藥劑可經口或由另一途徑投與’例如經由栓劑或灌腸 劑。 146681.doc -68- 201036626 此外，一或多種抗α4β7抗體或抗體衍生物可與一或多種 分子或其他治療組合使用，其中該（該等）其他分子及/或治 療不直接結合或影響α4ρ7，但該組合有效治療或預 防所治 療之病狀。舉例而言，以卩抑制劑可與益生菌療法或與用 於恢復或維持正常腸道菌叢之其他療法組合使用。在一實 施例中，-或多種分子及/或治療可治療或預防在療法過 程中由一或多種其他分子或治療所致之病狀，例如嗔心、 Ο ❹ 疲勞、充髮、惡病質、失眠等。在使用分子及/或其他治 療之組合的每種情況下，可以任何有效次序或經任何有效 時間長度投與個別分子及/或治療，例如同時、依序或交 替投與。在一實施例中，治療方法包含以一種分子或其他 治療完成第-療程，繼而開始第二療程。第—療程結束與 第二療程開始之間㈣間長度可為使總體療法過程有效之 任何時間長度’例如數秒、數分鐘、數小時、數天、數 週、數月或甚至數年。 在另-實施例中’該方法包含投與—或多種本文所述之 州抬抗劑及—或多種其他治療（例如治療性或緩解性治 :)二當方法包含將一種以上治療投與個體時，應瞭解， 投樂之次序、時序、+奴 數、》辰度及體積僅受限於治療之醫 療品求及限制，亦g 可例如同時、依序、交替或根據任 -/、他方案將兩種治療投與個體。 出於說明本發明夕姓 之特疋實靶例或特徵之目的提供以下實 際實例與預示實例， 亥#貫例亚不限制本發明之範疇。 實例1 :抗體製備 146681.doc -69· 201036626 藉由用表現人類α4β7之細胞，亦即經短暫轉染之人類胚 腎（ΗΕΚ)293細胞（293-a4b7)或經穩定轉染之中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞（CHO-a4b7)免疫 XenoMouseTM XG2ia(kl)小鼠 及XG4kl小鼠（分別表現人類IgG2或IgG4及人類κ及λ輕鏈之 轉殖基因小鼠；Abgenix Inc., Fremont CA)來產生針對人 類α4β7之單株抗體。藉由螢光活化細胞分選器（FACS)分析 比較經α4β7轉染之細胞與各別親本對照細胞來監測血清效 價。將來自任一免疫活動之高免疫動物處死，且對脾及淋 巴結組織進行融合瘤融合。 使用一系列檢定來鑑別α4β7雜二聚體專一性抗體。首先 藉由螢光微容量檢定技術（Fluorometric Microvolume Assay Technology 5 FMAT™ Applera Corporation, Foster City CA ;高產量篩選細胞偵測系統）針對與經α4β7轉染之細胞 相較於經虛擬轉染之細胞的結合來篩選融合瘤上清液。以 與所述（Erie, J· Immunol, (1994) 153:517)類似之方式評估 經鑑別對與α4β7結合呈陽性之上清液（1 〇〇 1份來自CHO-a4b7細胞免疫活動之陽性結合上清液及1143份來自293-a4b7細胞免疫活動之陽性結合上清液）抑制HUT78細胞黏 附於MAdCAM-1-Fc之能力。在此檢定中，60份來自CHO-a4b7活動之上清液及174份來自293-a4b7活動之上清液顯 示抑制超過90%(n=2)且對該等上清液進行進一步專一性及 效能分析。
製備經α4β7轉染、經α4β1轉染及經αΕβ7轉染之293細 胞，且與抑制檢定中鑑別之融合瘤上清液一起用於FACS 146681.doc •70· 201036626 分析中。將顯示僅與經α4 β 7轉染之細胞結合之上清液歸類 為具雜二聚體專一性，因為針對此整合素之α4次單元的抗 體亦將結合經α4β 1轉染之細胞，且結合β7鏈之抗體將結合 經αΕβ7轉染之細胞。亦藉由FACS分析來分析融合瘤上清 液與經獼猴α4β7轉染之293細胞的結合活性。選擇7個來自 CHO-a4b7活動之細胞株及25個來自293-a4b7活動之細胞株 以供次選殖及進一步分析。 實例2 :抗體分析 選殖所獲得之抗體分泌細胞，且分離編碼抗體之核酸並 定序。使用定點突變誘發來製備與經分離序列有一或多個 胺基酸殘基不同之變異體。抗體及變異體之輕鏈及重鏈之 胺基酸序列展示於下表1及表2中。應瞭解，CDR及FR區之 邊界可與以下所示不同，如本文先前所論述。 表1 :輕鏈之序列分析
輕鏈 FR1 CDR1 FR2 1A10K DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGVSSWLA WYQQKPGMAPKLLIY 11E7K1 EIVMTQSPATLSVSPGETATLSC RASQTVSSNLA WYQQKPGQAPRLLIY 11E7K2 DIQMTQSPSSLSASIGDRVTITC RASQGIRNYLA WYQRKPGKVPKLLIY 2F12K DIQMTQSPSSVFASVGDRVTITC RASQGISSWLA WYQQKPGKAPNLLIY 14E4L QSVLTQPPSYSAAPGOKVTISC SGSSSNIGNNYVS WYQQLPGTAPKLLIY 3A5K DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGVISWLA WYQQKPGMAPKLLIY 10D7K DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGVNNWLA WYQQKPGKAPKLLIF 27D8K EIVMMQSPATLSVSPGERATLSC RASQSVSTNLA WYQQKPGQAPRLLIY 18A11K DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLA WYQQKPGKAPKLLIY 20D7K EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIY 23H6K EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC RASQSVNSNLA WYQQKPGQAPRLLIY 27G8L QSVLTQPPSVSEAPRQRVTISC SGSNSNIGNNPVN WYQLFPGRAPKLLIY 26C7K EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC RASQSVSDNLA WYQQKPGQPPRLLIY 146681.doc •71 · 201036626
26H3K DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC QASQDISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY 19G6K DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISC QASQDINTYLN WYQQKPGKVPKLLIY 22B2K DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITC QASQDITDYLN WYQQKPGKAPKLLIY 24A2K EVMMTQSPATLSVSPGERATLSC RASQSVSSNLA WYQQKPGQAPRLLIF 26E9K ELVMTQSPATLSVSPGERATVSC RASQSVSSDLA WYQQKPGQAPRLLIY 22F5K EIVMTQSPATLSVFPGEGATLSC RASQSVSSDLA WYQQKPGQAPRLLIY 26C10K EIVLTQSPGTLSLSPGEGATLSC RASQTVTSSYLA WYQQSPSQSPRLLIY 17C8K EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC RASQSVSSNLV WYQQKPGQAPRLLIY 25C9k DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQDISSWLA WYQRKPGKAPKVLIY 19E6L SYELTQPPSVSYSPGQTASITC SGDKLGDKYAC WYQQKPGQSPVLVIY 26G2k DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQDISSWLA WYQQKPGTAPKVLIY 27G8L (a) QSVLTQPPSVSGAPRORVTISC SGSNSNIGNNPVN WYQLFPGRAPKLLI^ 27G8L (b) QSVLTQPRSVSGAPRQRVTISC SGSNSNIGNNPVN ^ j WYQLFPGRAPKLLIY 26H3K (c) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC QASQDISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY lA10K(d) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGVSSWLA WYQQKPGKAPKLLIY 表u續）
輕鏈 CDR2 FR3 1A10K AASILQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 11E7K1 GASTRAT GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC 11E7K2 AASTLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYCC 2F12K GASSLQN GVPLRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 14E4L DNNKRPS GIPDRFSGSKSGTSAILDITGLQTGDEADYYC 3A5K AASILQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 10D7K ATSSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYC 27D8K GASTRAT GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYFC 18A11K GASNLES GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFANYYC 20D7K GASSRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC 23H6K GASTRAT GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC 27G8L HDDLLPS GVSDRFSGSRSGTSASLAISGLQSEDETDYYC 26C7K GASTRAT GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC 26H3K DASNLET GVPSRFSGSGSGTDFTFTINSLQPEDIATYFC 19G6K DASNLET GVPSRFSGSGSGTDFTFTISGLQPEDIATYYC 22B2K DTSNLEA GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC 146681.doc -72- 201036626
24A2K GASTRAT GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYCC 26E9K GASSRAT GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC 22F5K GASARAT GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC 26C10K GASTRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAYYYC 17C8K GASTRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYC 25C9k SASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 19E6L QDSKRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYC 26G2k SASSLQN GVPSRFSGRGSGTDFALTISSLQPEDFATYYC 27G8L (a) HDDLLPS GVSDRFSGSRSGTSASLAISGLQSADETDYYC 27G8L (b) HDDLLPS GVSDRFSGSRSGTSASLAISGLRSADETDYYC 26H3K (c) DASNLET GVPSRFSGSGSGTDFTFTINSLQPEDIATYFC lA10K(d) AASILQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
表ι(續）
輕鏈 CDR3 FR4 1A10K QQANSFPWT FGQGTKVEIK 11E7K1 QQYDYWPPLT FGGGTRVEIK 11E7K2 QKYDSAPFT FGPGTKVDIK 2F12K QQANSFPWT FGQGTKVEIK 14E4L GTWDSSLSAGRV FGGGTKLTVL 3A5K QQANSFPWT FGQGTNVEIK 10D7K QQVNSFPGT FGQGTKVEIK 27D8K QQYNDWPT FGGGTKVEIK 18A11K QQANSFPWT FGQGTKVEIK 20D7K QQYDSSPPT FGGGTKVAIK 23H6K QQYDDWPPVT FGQGTRLEIK 27G8L TAWDDSLNGWV FGGGTKLTVL 26C7K QQYDDWPT FGGGTRVEIK 26H3K QQYDNLPCS FGQGTKLEIK 19G6K QQFDNLPIT FGQGTRLEIK 22B2K QQYDILPYS FGQGTDLEIK 24A2K QQYDDWPT FGGGTKVEIK 26E9K QQYNNWPPLT FGGGTKVEIK 22F5K QQYHDWPPLS FGGGTKVEIK 146681.doc •73· 201036626
26C10K QQYDSSPPT FGGGTKVEIK 17C8K QQYDDWPPLT FGGGTTVEIK 25C9k QQADSFPWT FGQGTKVEIK 19E6L QAWDSSTVV FGGGTKLTVL 26G2k QQADSFPWT FGRGTKVEIK 27G8L(a) TAWDDSLNGWV FGGGTKLTVL 27G8L(b) TAWDDSLNGWV FGGGTKLTVL 26H3K (c) QQYDNLPSS FGQGTKLEIK 1A10K (d) QQANSFPWT FGQGTKVEIK 表2 :重鏈之序列分析
重鏈 FR1 CDR1 FR2 i 1A10H QVQLVQSGAEYKKPGASVKVSCKVSGYTLN DLSMH WYRQAPGKGLEWMG 11E7H1 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCVASGFTFS DYYMS WIRQAPGKGLEWVS 11E7H2 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA 2F12H QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTVT DLSMH WYRQAPGKGLEWMG 14E4H QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS DYYMS WIRQAPGKGLEWVS 3A5H QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLN DLSMH WVRQAPGKGLEWMG 10D7H QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS DYYMS WIRQAPGKGLEWVS 27D8H QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS DNYMS WIRQAPGKGLEWVS 18A11H QVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLS DLSIH WVRQAPGKGLEWMG 20D7H QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCTASGFTFS DYYMS WIRQAPGKGLEWVS 23H6H QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS DYYMS WIRQAPGKGLEWVS 26G2H QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS DYYMS WIRQAPGKGLEWVS 27G8H EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYWMS WVRQASGKGLEWVA 26C7H QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS DYYMS WIRQAPGKGLEWVS 26H3H EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT GYWIG WVRQMPGKGLEWMG 19G6H QVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCAASGFTFS DYYMS WIRQAPGKGLEWIS 22B2H EVQLVOSGAEVKEPGESLKISCKGSGYIFT SYWIA WVRQLPGKGLEWMG 24A2H QVQLVESGGDLVEPGGSLRLSCAASGFTFR DYYMS WIRQAPGKGLEWVS 26E9H QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFR DYYMS WIRQAPGKGLEWVS 19E6H EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMS WVRQAPGKGLEWVS 22F5H QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS DYYMS WIRQAPGKGLEWVS 25C9H QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFN DYYMS WIRQAPGKGLEWVS 146681.doc -74·
201036626
26C10H QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCVASGFTFS DYYMS WIRQTPGKGLEWVS 17C8H QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS DYYMS WIRQAPGKGLEWLS 1A10H ⑻ QVQLVOSGAEVKKPGASYKVSCKVSGYTLN DLSMH WVRQAPGKGLEWMG 27G8H(b) EVQLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFS SYWMS WVRQASGKGLEWVA 表2(續）
重鏈 CDR2 FR3 1A10H GFDPAEGKIISAQKFQD RVTMTDDTSTDTAYMELSSLRSEDSAVYYCAT 11E7H1 YISSSGSAIYYADSVKG RFTISRDNAKNSLYLQLNSLRAEDTAVYYCAR 11E7H2 VIWYDGSNKYYADSVKG RPTISRDNSKNTLHLQMNSLRAEDTAVYYCAR 2F12H GFDPQDGETIYAQKFQG RVTMTEDTSTDTAYMELRSLRSEDTAVYYCTT 14E4H YISNSGSVVYYADSVKG RFTISRHNAKNSLYLQMNSLRADDTAVYYCAR 3A5H GFDPAEGKIISAQKFQD RVTMTDDTSTDTAYMELSSLRSEDSAVYYCAT 10D7H YISSTGSAMYDADSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 27D8H YISSSGSATYYADSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMSSLRAEDTAVYYCAR 18A11H GFDPQDGETIYAQKFQG RVTMTEDTSTDTAYMELSSLKSEDTAVYYCAT 20D7H YISSSGSAIYYADSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMDSLRAEDTAVFYCAR 23H6H YISSSGSAMYSADSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 26G2H YISSIGSAIHYADSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 27G8H NIKQDGSEKYYVDSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 26C7H YISRVGSTTYYADSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 26H3H IIYPYDSDTRYSPSFQG OYTISADKSINTAYLQWSSLKASDTAMFYCAS 19G6H YISSSGSTMYYADSVKG RFTISRVNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 22B2H IIDPNDSDTRYSPSFQG OVTISADKSIHTAYLQWSSLKASDTAMYYCAT 24A2H YISSSGSAIYYADSVKG RFTISRDNPKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 26E9H YISSSGSTSYCADSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 19E6H AISGSGGSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK 22F5H YISSTGSTLYYADSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMDSLRADDAAVYYCTR 25C9H YISSSGSAIHYADSYKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 26C10H YISSSGSAIHYADSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMDSLRAEDTAVFYCAR 17C8H YISNSGSAMYYADSVKG RFTISRDNARNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 1A10H ⑻ GFDPAEGKIISAQKFQD RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR 27G8H (b) NIKQDGSEKYYVDSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCAR 146681.doc -75- 201036626 表2(續）
重鏈 CDR3 FR4 1Α10Η LDFSSWFDP WGQGTLVTVSS 11Ε7Η1 DYSSGWFYFDY WGRGTLVTVSS 11Ε7Η2 EHWNYAFDI WGQGTMVTVSS 2F12H ESSSAWFDP WGQGTLVTVSS 14Ε4Η DRSSAWDEAFDI WGQGTMVTVSS 3Α5Η LDFSSWFDP WGQGTLVTVSS 10D7H EFSSGWSYFDY WGQGTLVTVSS 27D8H DYSSGWYYFDY WGQGTLVTVSS 18Α11Η GSSSSWFDP WGQGTLVTVSS 20D7H EHSSGYWYFDL WGRGALVTVSS 23Η6Η EYSSGWYYFDY WGRGTLVTVSS 26G2H EYSSGWAYFDY WGQGTLVTVSS 27G8H EGGYDWNYADYYGMDV WGQGTTVTVSS 26C7H DYSSGWYYFDY WGQGTLVTVSS 26Η3Η HRLWLGEFPGPLNI WGQGTMVTVSS 19G6H DRSSGLVSFDY WGQGTLVTVSS 22Β2Η HRLWLGTLPGGFYI WGQGTMVTVSS 24Α2Η DFSSGYYYFDY WGHGTLVTVSS 26Ε9Η DYSSGWFYFDY WGQGTLVTVSS 19Ε6Η APYSSSWALGLGMDV WGQGTTVTVSS 22F5H EYSSGWFFFDY WGQGTLVTVSS 25C9H EYSSGWAYFDY WGQGTLVTVSS 26C10H DHSSGYWYFDL WGRGTLVTVSS 17C8H EYSSGWFFFES WGQGTLVTVSS 1Α10Η ⑻ LDFSSWFDP WGQGTLVTVSS 27G8H (b) EGGYDWNYADYYGMDV WGQGTTVTVSS 進一步分析抗體之胺基酸序列的相似性。將κ輕鏈分成 三組，且產生各組之共同序列。存在三種具有λ輕鏈之抗 體，其中無一者彼此具有足以形成可產生共同序列之相關 146681.doc -76- 201036626 序列組的相似性。所產生之變異體中之兩者在λ輕鏈中有 所不同。將重鏈分成四組，其中單一重鏈歸入第五組，立 產生組1至組4之共同序列。此等結果展示於下表3(a)及表 3(b)中；共同序列展示於序列表中。圓括號中之數字表示 序列表中之SEQ ID NO。 表3(a):根據κ輕鏈將抗體分組，具有相應重鏈 Κ 組1 (10個成員） 重鏈組 (H1-H5) K 組2 (9個成員） 重鏈組 (H1-H5) K 組3 (4個成員） 重鍵組 (H1-H5) 20D7K(10) HI (3 8) 11E7K2(3) Hl(31) 22B2K(16) H4(45) 11E7KK2) HI (30) 10D7K(7) Hl(35) 19G6K(15) ' HI(44) 26C10K(20) Hl(51) 3A5K ⑹ H2(34) 26H3K(14) H4(43) 23H6K(11) Hl(39) 1A10K(1) H2(29) 26H3K(c)(27) H4(43) 26C7K(13) HI (42) 25C9K(22) HI (50) 24A2K(17) HI (46) 26G2K(24) HI (40) 27D8K(8) Hl(36) 18A11K ⑼ H2(37) 22F5(19) HI (49) 2F12K(4) H2(32) 26E9K(18) HI (47) lA10K(d)(28) H2(53) 17C8K(21) Hl(52) | 表3(b):根據λ輕鏈將抗體分組，具有相應重鏈 λ鏈 (3種抗體，無共同序列） 重鍵組 (H1-H5) 14E4(5) Hl(33) 27G8(12) H3(41) 27G8(a)(25) H3(54) 27G8(b)(26) H3(54) 19E6(23) H5(48) 共同序列内之CDR邊界（如先前所論述，其可能不同）如 下：κ組 1 : CDR1 24-35、CDR2 51-57、CDR3 90-99 ; κ組 2 : CDR1 24-34、CDR2 51-56、CDR3 89-97 ; κ 組 3 : 146681.doc •77· 201036626 CDRl 24-34、CDR2 50-56、CDR3 89-97 ;重鏈組 1 : CDR1 31-35、CDR2 50-66、CDR3 99-110 ;重鏈組2 : CDR1 31-35、CDR2 50-66、CDR3 99-107 ;重鏈組3 : CDR1 31-35、CDR2 50-66、CDR3 99-114 ;及重鏈組 4 : CDR1 31-35、CDR2 50-66、CDR3 99-114。 實例3 :功能檢定 此實例描述用於表徵抗體之各種檢定。 HUT78黏附檢定 藉由在4°C下用稀釋於磷酸鹽緩衝液（pH 9·0)中之20 pg/mL MAdCAM-1(或類似濃度之人類IgGl作為塗布對照） 塗布96孔盤隔夜來製備經塗布之盤（例如Costar® 3368 96 孑L 盤；Corning Incorporated Life Sciences, Lowell MA)。 移除塗層，且用100 μΐ 3% BSA/PBS阻斷盤，在室溫下培 育1小時或1小時以上。用漢克氏平衡鹽溶液（Hank's balanced salt solution，HBSS)洗務盤三次。 將生長至匯合之HUT78細胞（展現具有誘導/輔助表型之 成熟T細胞株之特徵的人類T細胞淋巴瘤細胞株；ATCC TIB 161)製成小球且於HBSS中洗滌三次，接著以適當濃度 再懸浮於HBSS中以得到於50 μΐ中之約30,000個細胞。 將待測試之抗體稀釋至兩倍最終濃度，且接著以1:4滴 定於含有1% BSA及1 mM Μη2+的無鈣、無鎂HBSS中。將 50 μΐ抗體滴定液或對照添加至VEE底盤之各孔中，繼而添 加50 μΐ HUT78細胞。將細胞及抗體在4°C下培育30分鐘， 接著添加至經塗布之盤中且在37°C下培育40分鐘。在室溫 146681.doc -78- 201036626 下於HBSS中洗滌經塗布盤上之細胞三次，在洗滌之間輕 拍除去HBSS。將黏附細胞於-2〇°C下進行冷凍-解凍，繼而 添加100 μΐ CyQuant®染色/溶解缓衝液（基於螢光之細胞定 量檢定中所用之緩衝液’適用於高產量篩選Molecular Probes® ; Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA)。 在4 8 5 nm激發及5 3 0 nm發射下，例如使用多標記微定量盤 讀取器 Tecan GENiosPro(Tecan Group Ltd. Mannedorf, Switzerland)來定量各孔之螢光信號。 人類CD4+細胞黏附檢定 在4〇C下用人類MAdCAM-1-Fc或人類IgG(3 pg/m卜於20 mM磷酸鹽緩衝液（pH 9.0)、130 mM NaCl中）以100微升/孔 塗布盤隔夜，接著在室溫下用200微升/孔阻斷試劑（於PBS 中之3%牛血清白蛋白）阻斷至少2小時。接著用黏附緩衝液 (30 mM HEPES(pH 7.4) ' 120 mM NaCl ' 1 mM MnCl2 ' 10 pg/ml人類IgG)洗務盤三次。 製備待測試抗體之連續稀釋液，且將其添加至盤中（35 微升/孔）；添加經分離之CD4+ T細胞（250,000個細胞/35微 升/孔），且在4°C下將盤培育2小時。用黏附緩衝液洗滌三 次後，在-20°C下將盤冷凍隔夜。添加偵測試劑（100微升/ 孔 CyQUANT® 試劑；Life Technologies Corporation, Carlsbad，CA)，且在37°C下將盤培育45分鐘。藉由在485 nm激發及530 nm發射下讀取螢光來測定結果。 結合人類CD4+CD45RA-記憶T細胞之EC50 洗滌人類周邊血液單核細胞（PBMC ;新鮮的或經冷凍與 146681.doc -79- 201036626 解凍，例如於含2% FBS之磷酸鹽缓衝鹽水中），且將其再 懸浮於含1% BSA、含或不含1 mM MnCl2(視實驗而定； Mn2+為MAdCAM-Ι結合所必需）之HEPES緩衝液（30 mM HEPES + 140 nM NaCl)中，且塗鋪於96孔盤中（106個細胞/ 孔）。將細胞與10 pg/ml人類IgG—起於冰上培育30分鐘以 阻斷非專一性結合。接著將細胞與經生物素標記之抗α4β7 抗體的連續稀釋液一起在96孔盤中於冰上培育1小時，繼 而添加抗生蛋白鏈菌素-藻紅素之1:100稀釋液（ΡΕ ; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA)、4 μΐ CD3-太平洋藍（Pacific Blue)、CD4-PerCP-Cy5.5 及 CD45RA-異硫氰酸螢光素（FITC)(BD Biosciences，San Jose CA)達100 μΐ之最終體積，且於冰上再培育1小時。用 HEPES緩衝液（相應地含或不含MnCl2)洗滌細胞兩次，且 接著固定於200 μΐ HEPES緩衝液加0.5%三聚曱醛（又，相 應地含或不含MnCh)中。使用螢光活化細胞分選器 (FACS)，例如BDtm LSR II桌面式流式細胞儀（Bd Biosciences, San Jose CA)測定結合CD4+CD45RA-記憶了、細 胞之陽性α4β7抗體之百分率。CD4CD45RA-記憶細胞上 50%之α4β7位點由α4β7抗體結合之α4β7抗體濃度即定義為 EC50。 阻斷MAdCAM-1-Fc與人類CD4+CD45RA-記憶Τ細胞結合 之 IC5〇
洗滌PBMC(如先前所述為新鮮的或經冷凍），且將其再 懸浮於含1% BSA及1 mM MnCl之HEPES緩衝液（3〇 mM 146681.doc -80- 201036626 HEPES + 140 nM NaCl)中，達107個細胞/毫升之最終濃度。 如先前所述阻斷細胞；阻斷後，將細胞與抗α4β7抗體之連 續稀釋液（或適當對照）一起在96孔盤中於冰上培育30分 鐘，且接著與0.3 pg/ml經生物素標記之MAdCAM-1-Fc蛋 白一起再培育1小時。 • 於含1 mM MnCl之HEPES緩衝液中洗滌兩次後，如先前 所述用抗生蛋白鏈菌素-PE之1:100稀釋液、4 μΐ CD3-太平 洋藍、CD4-PerCP-Cy5.5 及 CD45RA-FITC處理細胞，達100 〇 μΐ之最終體積。於冰上培育1小時後，用含1 mM MnCl之 HEPES緩衝液洗滌細胞兩次，且接著固定於200 μΐ緩衝液 • 加0.5%三聚曱醛中。如先前所述，藉由螢光活化細胞分選 器（FACS)分析來測定結合CD4+CD45RA-記憶Τ細胞之陽性 MAdCAM-1-Fc之百分率。MAdCAM-1-Fc 與 CD4CD45RA-記憶細胞上之α4β7的結合50%受抑制之α4β7抗體濃度即定 義為IC50。 q 已活化T細胞上之視黃酸對(*4p7之誘導 在存在或不存在視黃酸（1000 nM)之情況下利用抗 CD3(結合於盤，5 pg/ml)、人類IL-2(20 ng/ml)活化經分離 之人類PBMC，歷時7天。用染色緩衝液（PBS加0.5% BSA 及1 mM MnCl)洗滌經活化之細胞兩次_，且與100 pg/ml人 類Ig—起培育30分鐘以阻斷非專一性結合。首先在抗α4β7 抗體之連續稀釋液中於冰上培育細胞30分鐘，且接著再用 1 pg/ml經生物素標記之MAdCAM-1-Fc染色30分鐘。用染 色緩衝液洗滌兩次後，用抗生蛋白鏈菌素-PE(1:1000)將細 146681.doc -81 - 201036626 胞染色30分鐘。藉由例如用 FACSCaliburTM(BD Biosciences， San Jose CA)進行螢光活化細胞分選來分析細胞。可將以 此方式製備之細胞用於其他實驗，諸如競爭檢定。 競爭檢定 亦藉由實質上如Fiscella等人，价ciiec/mo/ogy 21:302-3 07; 2003所述之螢光微容量檢定技術或FMAT來檢 測α4β7抗體與其他抗α4β7抗體及/或抗β7抗體競爭結合表 現α4β7之細胞之能力。簡言之，藉由例如用編碼α4之核酸 及表現β7之核酸短暫共轉染細胞來製備表現高含量α4β7的 細胞。以類似方式，使用適於穩定轉染之細胞及方案來製 備穩定細胞株。藉由例如使用針對α4之抗體、針對β7之抗 體及/或配位體（亦即，MAdCAM-Ι，例如MAdCAM-1-Fc融 合蛋白）進行FACS來篩選經轉染之細胞。可對細胞進行數 輪分選及選擇以得到具有可再現、高含量之α4β7表現的純 系細胞株。 與S250N突變體結合 亦評估抗體識別β7鏈中S250N點突變體之能力，其已知 對 ACT-1 結合至關重要（J Immunol. 159:1497，1997)。以與 先前關於製備表現高含量α4β7的細胞所述類似之方式來製 備短暫共表現在β鏈中具有S250N突變之α4β7的293細胞（參 考文獻）。 簡言之，使用細胞解離溶液收集總共1 X 1 〇6個經轉染細 胞以供概況分析，且以1 〇〇〇 rpm向下旋轉5分鐘。接著在 4°C、震蘯下，用0.5 m丨阻斷緩衝液（1%山羊血清/PBS)阻斷 146681.doc -82- 201036626 細胞30分鐘至1小時。對於MAdCAM-1-Fc染色，在4°C、 震盪下，於Mn2+缓衝液（30 mM HEPES + 1%山羊血清中之1 mM MnCl2)中培育細胞1小時。接著將細胞以1〇〇〇 rpm向下 旋轉5分鐘，且添加0.5 ml新鮮阻斷緩衝液以及1 〇 pg/mi一 次抗體，繼而在4°C、震盪下培育30分鐘至1小時。用4 ml 冷PBS(每次洗滌）洗滌兩次後，添加於〇·5 ml阻斷緩衝液中 之二次抗體（亦即’山羊抗IgG-藻紅素共概抗體；Southern Biotech，經1:250稀釋或0.1微克/106個細胞），且在4。〇下 培育細胞20-30分鐘。最後一次用4 ml冷PB S洗務細胞，接 著再懸浮於0.5 ml FACS緩衝液中以供概況分析。 與單一核苷酸多形性（SNP)結合 對於α4次單元之SNP分析，藉由聚合酶鏈反應（pcr)擴 增來自90名代表不同種族群之個體（180個單倍體基因組）的 α4基因外顯子1 -28，且隨後定序。鑑別α4基因之編碼區中 之三個候選SNP，且三者之一引起胺基酸變化 (Arg878Gln)。以類似方式進行β7次單元之SNP分析，對來 自90名代表不同種族群之個體（180個單倍體基因組）的β7基 因外顯子2-1 5之編碼區進行PCR擴增，且隨後定序。鑑別 三個SNP，且其中兩者引起胺基酸變化。將内部SNP分析 資料與NCBI資料庫（NCBI :國家生物技術資訊中心 (National Center for Biotechnology Information)，國家衛 生研究院（National Institutes of Health，NIH)之國家醫學 圖書館（National Library of Medicine，NLM)的分部）之資 訊相比較。僅在α4次單元中引起Gln878Arg之A/G突變以 146681.doc -83- 201036626 咼頻率發生-在内部SNP與公共資料庫中分別為2〇。/〇或 30%。其他SNP以低頻率發生。此資訊概述於下表4中。 表4.人類β7&α4中§NP之頻率 SNP 替代性對偶基因 頻率-NCBI資料庫 替代性對偶基因 頻率-内部分析 位置 β7 E97V NA Α(0.989)/Τ(0.019) 細胞外 R213S C(0.975VA(U25、 無觀測資料 細胞外 G611E ΝΑ 無觀測資料 細胞外 G629S ΝΑ Α(0.989)/Τ(0.019) 細胞外 H672Y ΝΑ 無觀測資料 細胞外 α4 V824A T(0.972)/C(0.028) 無觀測資料 細胞外 Q878R A(0.648)/G(0.352) A(0.783)/G(0.217) 細胞外 R1007S ΝΑ 無觀測資料 細胞内 產生代表ct4與β7之胞外域中改變胺基酸之SNP(a4b7 (E97V)、a4b7(R213S)、a4b7(G629S)、a4(V824A)b7、a4 (Q878R)b7)的點突變構築體。將各點突變構築體連同野生 型搭配物表現構築體一起轉染至293細胞中。首先用1 pg/ml人類IgG或抗α4β7抗體將經轉染之293細胞染色，用 PBS洗滌，且用藻紅素共軛之二次抗體山羊抗人類IgG染 色。用PBS洗滌後，藉由例如使用FACSCaliburTM(BD Biosciences，San Jose CA)進行螢光活化細胞分選來分析細 胞。各抗體染色之螢光染色強度（幾何平均值）展示於下表5 中。 146681.doc -84- 201036626 表5 :與SNP結合 野生型 E97V R213S G629S V824A Q878R IgG 8 7 7 7 7 7 1A10 122 135 31 80 102 70 3A5 124 135 31 80 110 71 2F12 129 134 37 80 112 73 18A11 92 105 30 63 82 56 22B2 97 108 58 65 85 58 26H3 93 106 49 62 82 55 27G8 102 116 59 68 88 58 26G2 99 113 38 64 86 58 17C8 93 96 49 58 74 51 19G6 94 108 46 59 67 46 25C9 96 106 33 59 77 51 此等結果指示所測試之所有抗體皆與α4β7之已知SNP結 合。 在下表6中比較若干不同檢定中各種α4β7雜二聚體專一 性抗體之活性。 表6 :表徵針對α4β7之抗體
抗體 HUT78黏附 IC5〇(ng/ml) MAdCAM-1 競 爭 IC50(ng/mL) CD4+CD45RA-細 胞結合EC50(ng/mL) a4b7(S250N) 結合 1A10 6.1 6.2 4.9 - 3A5 7.5 6.2 5.6 - 2F12 11.4 4.6 3.3 - 18A11 7.4 7.3 4.7 - 22B2 3.7 23.2 5.1 - 26H3 8.9 14.1 9.3 - 27G8 14.9 8.7 6.3 - 26G2 6.9 99.6 32.6 + 17C8 6.8 31.1 22.9 + 19G6 12.2 103.3 32.9 + 25C9 13.7 77.6 ΝΑ + 14668 丨.doc -85- 201036626
Soler等人報導稱為維多珠單抗之人類化抗〇1407抗體之結 合專一性（J Pharmacol Exp Ther 330:864; 2009)。據報導， 此抗體對記憶CD4+ T淋巴細胞具有0.042 pg/ml(42 ng/ml) 之ECso。維多珠單抗亦抑制可溶性MAdCAM-1與α4β71ή記 憶Τ細胞結合’其IC50為0.034 pg/ml(34 ng/ml)。相比之 下’表6中所示之許多抗體對記憶τ細胞（亦即， CD4 + CD45RA-細胞）具有小於1 〇 ng/ml之EC5〇，且其中所 有抗體皆具有小於35 ng/ml之EC5〇(在此檢定中，所有抗體 亦具有大於0.1 ng/ml之EC”）。另外，表6中所示之數種抗 體在MAdCAM競爭檢定中顯示小於ng/ml之IC5G，且許 多抗體顯示小於30 ng/ml之ic5〇(在此檢定中，所有抗體亦 展現大於0.1 ng/ml之IC^)。儘管Soler等人並未提及維多珠 單抗結合α4β7之S250N突變體之能力，但已知維多珠單抗 所來源之鼠類抗體ACT-1不能結合S25〇n突變體（Tidswell 等人，J Immunol 159:1497; 1997)，且根據 S〇ier 等人，維 多珠單抗與ACT-1展現相同抗原專一性。因此，維多珠單 柷亦不會結合S250N突變體，與表6中所示之數種抗體形成 對比。 實例4 :其他分析 璉擇在上述功能檢定中具有不同特性之數種代表性抗體 用於如下所述之其他分析。 與人類a4b7之結合親和力 為里測人類抗α4β7抗體之細胞結合親和力，可使用量測 /奋液相中之結合事件的動力學排阻檢定（Kinetic Exclusi〇n 146681.doc 201036626
Assay)來計算平衡解離常數Kd。實質上如先前Xie等人，J. Imm, Methods 304:1 (2005)及 Rathanaswami 等人， 373:52 (2008)所述，使用 KinExA® 技術（Sapidyne Instruments, Boise, ID)。簡言之，將表現人類α4β7之 HUT78細胞以1:3自約506個細胞/毫升滴定至約400個細胞/ 毫升，且接著在4°C下用最終濃度為2或30 pM之mAb 2F12 或18A11及30或500 pM之17C8平衡18小時。藉由KinExA® 技術使上清液通過預塗有山羊抗人類Fc之PMMA珠粒來量 測平衡狀態下上清液中剩餘之游離抗體，且用山羊抗人類 (H+L) Cy5 Ί1貞測（實質上如 Rathanaswami 等人，价oc/zem Biophys Research Commurt: 1004 (2005)戶斤述）。使用
KinExA®軟體，藉由將所有指定曲線同時擬合於單一Kd值 之「η曲線分析」來獲得平衡解離常數（Kd)(Rathanswami等 人，2005及Xie等人，同上）；結果展示於下表7中。 表7 :抗體之結合親和力 抗體 Kd(pM) 比率 (低 Ab) 誤差％ 低Kd 高Kd 2F12 4.56 0.44 3.80 1.94 11.12 18 All 0.90 2.22 4.40 0.23 2.29 17C8 29.36 1.02 3.58 12.09 74.53 此等抗體在KinExA®檢定中顯示大於〇.〇5 pM，但小於 80 pM、小於15 pM或小於5 pM之Kd。 PK/PD特徵 在靜脈内（IV ; 5 mg/kg)或皮下（sc ; 0.5或5 mg/kg)投藥 之後對雄性獼猴體内三種完全人類抗α4β7抗體進行單劑量 146681.doc •87. 201036626 藥物動力學（PK)及藥效學（PD)研究。在靜脈内投與5 g g後觀測到中框循環中類似的初始ρκ暴露（C〇 ;零時 濃度）=分布。皮下投藥後，Cmax(血清中之最大濃度）與 AUCG辰度-時間曲線下之面積）在〇 5巧mg/kg皮下劑量範圍 内對於所有二種抗體展現與劑量成比例。皮下投藥後，三 種測°式抗體之絕對生物可用性在44。/。至68%之範圍内。 利用PE共軛之抗α4β7抗體27(}8來定量抗體處理之前及 之後τ細胞上之游離α4β7。藉由在抗體處理之前及之後、 ;斤測式之1〇 mg/ml抗體存在下用ΡΕ共輛之抗抗體 27G8染色來控制背景值。利用與處理前相比各抗體之游離 α4β7位點之百分率來確定部分飽和度。使用cD4_perCp、 CD99 APC及CD28-FITC來區分原初細胞、中樞記憶細胞 及效應記憶細胞。因獼猴記憶細胞群體之可變性及有限檢 定敏感性而顯示原初τ細胞上α4β7之部分飽和度。對於 18Α11處理，所有三個劑量組自第1天至第14天保持飽和。 第29天，所有三個組皆失去覆蓋。在2F 12與17C8處理中， 第14天於低劑量5 mg/Kg)組中觀測到失去目標覆蓋。 除偵測游離α4β7以外，亦藉由在不存在或存在1〇 mg/ml 抗體之情況下用pE共軛之抗人類抗體A35染色來確定目標 飽和度。藉由將樣本與10 mg/m]^^a4p7抗體一起預培育， 接著用抗人類抗體染色來估算全部a4(37位點。對於各樣 本，利用由抗(Χ4β7抗體佔據之全部α4β7位點之百分率來確 定目標飽和度。三種完全人類抗α4β7抗體顯示在靜脈内投 與5 mg/kg後14天内，α4β7之飽和度平均維持於81%至 -8S- 146681.doc 201036626 100%。 使用直接Eraax模型對血清抗α4β7抗體濃度及相應α4β7受 體飽和度數據進行PK/PD模擬。該模型估算出以下Pd參 數.Emax(最大α4β7受體飽和度）為92%，EC5〇(達到50% Emax之抗α4β7抗體濃度）為52 ng/mL，且E〇(初始α4β7受體 飽和度）為1 8 %。所有三種抗體對飽和α4 β7受體皆展現有效 的活體内PD作用’其中在獼猴體内之平均^,2為約3 5天 ❹ 146681.doc -89- 201036626 序列表 <11〇>美商安美基公司 <120> α·4-β·7雜二聚體專一性拮抗抗體 <130> Α-1459-_-ΝΡ <140> 099107689 <141> 2010-03-16 <150> 61/162,154; 61/306,829 <154> 2009-03-20; 2010-02-22 <160〉 72 <170> Patentln version 3. 5 <210〉 1 <211〉 107 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 1
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Val Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Met Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 <210> 2 <211〉 108 <212> PRT <213〉智人 <400> 2
Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Thr Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Thr Val Ser Ser Asn 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He 35 40 45 146681-序列表.doc 201036626
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Tyr Trp Pro Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 3 <211〉 107 <212> PRT <213〉智人 <400> 3
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser lie Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Arg Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Cys Cys Gin Lys Tyr Asp Ser Ala Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp He Lys 100 105 <210〉 4 <211> 107 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 4
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Phe Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gin Asn Gly Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 146681-序列表.doc 201036626 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 5 <211〉 111 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 5
Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gin 15 10 15
Lys Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asn Asn
Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly He Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala lie Leu Asp lie Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95
Ser Ala Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110
<210> 6 <211> 107 <212> PRT <213〉智人 <400> 6
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Val lie Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Met Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Trp 85 90 95 146681-序列表.doc 201036626
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Asn Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 7 <211> 107 <212> PRT <213〉智人 <400> 7
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Val Asn Asn Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Phe Ala Thr Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Asn Ser Phe Pro Gly 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 8 <211〉 106 <212> PRT <213〉智人 <400> 8
Glu lie Val Met Met Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Thr Asn 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asn Asp Trp Pro Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 -4- 146681-序列表.doc 201036626 <210> 9 <211〉 107 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 9
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asn Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 10 <211〉 108 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 10
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Ser Ser Pro 85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Ala lie Lys 100 105 <210> 11 <211〉 108 <212> PRT <213〉智人 146681-序列表.doc 201036626 <400〉 11
Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Asn Ser Asn 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Asp Trp Pro Pro 85 90 95
Val Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 12 <211> 110 <212> PRT <213〉智人 <400〉 12
Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Glu Ala Pro Arg Gin 1 5 10 15
Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn lie Gly Asn Asn 20 25 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gin Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr His Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly Leu Gin 65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Thr Asp Tyr Tyr Cys Thr Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95
Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 13 <211> 106 <212> PRT <213〉智人 <400> 13
Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15 14668卜序列表.doc 201036626
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Asp Asn 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Asp Trp Pro Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu lie Lys 100 105 <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213〉智人 <400> 14
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asp Asn Leu Pro Cys 85 90 95
Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210〉 15 <211〉 107 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 15
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Ser Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Asn Thr Tyr 20 25 30 146681·序列表.doc 201036626
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Gly Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asp Asn Leu Pro lie 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 100 105 <210〉 16 <211〉 107 <212> PRT <213〉智人 <400〉 16
Asp Val Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Thr Asp Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp lie Leu Pro Tyr 85 90 95
Ser Phe Gly Gin Gly Thr Asp Leu Glu lie Lys 100 105 6 T人 7 o R Di 1 1 p智 <210> <211〉 <212〉 <213〉 <400〉 17
Glu Val Met Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He 35 40 45 146681-序列表.doc 201036626
Phe Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Cys Cys Gin Gin Tyr Asp Asp Trp Pro Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 18 <211〉 108 <212> PRT <213〉智人 <400> 18
Glu Leu Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Val Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Asn Trp Pro Pro 85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 <210〉 19 <211〉 108 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 19
Glu He Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Phe Pro Gly 15 10 15
Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ala Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser 146681·序列表.doc 201036626 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr His Asp Trp Pro Pro 85 90 95
Leu Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 20 <211〉 108 <212> PRT <213〉智人 <400> 20
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Thr Val Thr Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Ser Pro Ser Gin Ser Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Ser Ser Pro 85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 21 <211〉 108 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 21
Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30
Leu Val Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Asp Trp Pro Pro 85 90 95 -10- 146681-序列表.doc 201036626
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Val Glu lie Lys 100 105 <210> 22 <211〉 107 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 22
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Arg Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu lie 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asp Ser Phe Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 23 <211> 106 <212〉 PRT <213〉智人 〈400〉 23
Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30
Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45
Gin Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Met 65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 -11 - 146681-序列表.doc 201036626 <210〉 24 <211〉 107 <212> PRT <213〉智人 <400> 24
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp He Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu lie 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Gin Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asp Ser Phe Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210〉 25 <211〉 110 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 25
Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Arg Gin 15 10 15
Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn lie Gly Asn Asn 20 25 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gin Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr His Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly Leu Gin 65 70 75 80
Ser Ala Asp Glu Thr Asp Tyr Tyr Cys Thr Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95
Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210〉 26 <211〉 110 <212> PRT <213〉智人 -12- 14668卜序列表.doc 201036626 <400> 26
Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Arg Ser Val Ser Gly Ala Pro Arg Gin 15 10 15
Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn lie Gly Asn Asn 20 25 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gin Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr His Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80
Ser Ala Asp Glu Thr Asp Tyr Tyr Cys Thr Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95
Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 27 <211〉 107 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 27
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Asn Ser Leu Gin Fro 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asp Asn Leu Pro Ser 85 90 95
Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210〉 28 <211〉 107 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 28
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 -13- 14668〗·序列表.doc 201036626
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Val Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 <210〉 29 <211> 118 <212> PRT <213〉智人 <400〉 29
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Asn Asp Leu 20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Ala Glu Gly Lys lie lie Ser Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Asp Arg Val Thr Met Thr Asp Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr Leu Asp Phe Ser Ser Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 30 <211〉 120 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 30
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15 •14- 146681-序列表.doc 201036626
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Ser Ser Gly Ser Ala lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Sei" Ser Gly Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 118 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 31
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu His 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu His Trp Asn Tyr Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 118 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 32 15- 146681-序列表.doc 201036626
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Leu 20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Gin Asp Gly Glu Thr lie Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Thr Glu Ser Ser Ser Ala Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211〉 121 <212> PRT <213〉智人 <400> 33
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp He Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Asn Ser Gly Ser Val Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg His Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ser Ser Ala Trp Asp Glu Ala Phe Asp lie Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211〉 118 <212> PRT <213〉智人 -16- 146681-序列表.doc 201036626 <400〉 34
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Asn Asp Leu 20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Ala Glu Gly Lys lie lie Ser Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Asp Arg Val Thr Met Thr Asp Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr Leu Asp Phe Ser Ser Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 35 <211〉 120 <212> PRT <213〉智人 <400> 35
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Ser Thr Gly Ser Ala Met Tyr Asp Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu A.rg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Phe Ser Ser Gly Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 •17- 146681-序列表.doc 201036626 <211> 120 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 36
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30
Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Ser Ser Gly Ser Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 37 <211> 118 <212> PRT <213〉智人 <400> 37
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Asp Leu 20 25 30
Ser lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Gin Asp Gly Glu Thr lie Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr Gly Ser Ser Ser Ser Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 -18- 14668卜序列表.doc 201036626 <210〉 38 <211〉 120 <212> PRT <213〉智人 <400〉 38
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Ser Ser Gly Ser Ala lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
❹
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu His Ser Ser Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg 100 105 110
Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 39 <211〉 120 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 39
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Ser Ser Gly Ser Ala Met Tyr Ser Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg 100 105 110 •19- 146681-序列表.doc 201036626
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 40 <211〉 120 <212> PKT <213〉智人 <400> 40
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Ser lie Gly Ser Ala lie His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Ser Ser Gly Trp Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 5 T人 4112PR智 <210〉 <211〉 <212〉 <213> <400> 41
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Asn lie Lys Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 -20- 146681-序列表.doc 201036626
Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Asp Trp Asn Tyr Ala Asp Tyr Tyr Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 42 <211〉 120 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 42
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Arg Val Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 123 <212> PRT <213〉智人 <400> 43
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly lie lie Tyr Pro Tyr Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys -21 · 146681-序列表.doc 201036626 85 90 95
Ala Ser His Arg Leu Trp Leu Gly Glu Phe Pro Gly Pro Leu Asn lie 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 44 <211〉 120 <212> PRT <213〉智人 <400> 44
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp He Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He 35 40 45
Ser Tyr He Ser Ser Ser Gly Ser Thr Met Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Val Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ser Ser Gly Leu Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 45 <211〉 123 <212> PRT <213〉智人 <400> 45
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Glu 15 10 15
Sei' Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr lie Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp lie Ala Trp Val Arg Gin Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly lie lie Asp Pro Asn Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie His Thr Ala Tyr 65 70 75 80 •22· 14668卜序列表.doc 201036626
Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr His Arg Leu Trp Leu Gly Thr Leu Pro Gly Gly Phe Tyr lie 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 46 <211〉 120 <212> PRT <213〉智人 <400〉 46
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Glu Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr He Ser Ser Ser Gly Ser Ala lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Phe Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly His 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thi" Val Ser Ser 115 120 <210> 47 <211〉 120 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 47
Gin Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp He Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Cys Ala Asp Ser Val 50 55 60 23- 146681-序列表.doc 201036626
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Ser Ser Gly Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 48 <211> 124 <212> PRT <213〉智人 <400> 48
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Ala Pro Tyr Ser Ser Ser Trp Ala Leu Gly Leu Gly Met Asp 100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 49 <211〉 120 <212> PRT <213〉智人 <400> 49
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 24- 146681-序列表.doc 201036626
Ser Tyr lie Ser Ser Thr Gly Ser Thr Leu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Ala Asp Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Arg Glu Tyr Ser Ser Gly Trp Phe Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210〉 50 <211〉 120 <212> PRT <213〉智人 <400> 50
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Ser Ser Gly Ser Ala lie His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Ser Ser Gly Trp Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 51 <211> 120 <212> PRT <213〉智人 <400> 51
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val -25- 146681·序列表.doc 201036626 35 40 45
Ser Tyr He Ser Ser Ser Gly Ser Ala lie His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp His Ser Ser Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211〉 120 <212> PRT <213〉智人 <400> 52
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Asn Ser Gly Ser Ala Met Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Ser Ser Gly Trp Phe Phe Phe Glu Ser Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 53 <211〉 118 <212> PRT <213〉智人 <400> 53
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Asn Asp Leu 20 25 30 -26· 146681-序列表.doc 201036626
Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Ala Glu Gly Lys lie lie Ser Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Leu Asp Phe Ser Ser Trp Phe Asp Px~o Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
<210> 54 <211> 125 <212> PRT <213〉智人 <400> 54
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Asn lie Lys Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Asp Trp Asn Tyr Ala Asp Tyr Tyr Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 55 <211〉 109 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉輕鏈共同序列 <220> 146681-序列表.doc -27- 201036626 <221> MISC_FEATURE <222〉 （2)..(2) <223〉X可為Val、Leu或lie <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222〉 （3)..(3) <223> X 可為 Met 或 Val <220> <221〉 MISC一FEATURE <222〉 （4)..(4) <223〉X可為 Met 或Leu <220> <221〉MISC—FEATURE <222〉 （5)..(5) <223〉X可為Met 或 Thx <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （9)··⑼ <223〉X 可為 Ala 或 Gly <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (13).. (13) <223〉X可為Leu 或 Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223〉X可為Phe 或Ser <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （18)..(18) <223〉X可為Gly、Arg或Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 (21). . (21) <223〉X可為 Val 戒 Leu <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （28)..(28) <223〉X可為 Τΐιτ或Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30).. (30) <223〉X可為thr、Asn或Ser <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （30)..(30) <223〉X可為Thr ' Asn或Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 （31). (31) <223〉X可為Thr、Asp或Ser <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223〉X可為Asn、Asp或Ser <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (33).. (33) <223〉X可為Tyr或不存在 <220> 28 146681·序列表,doc 201036626 <221〉 MISC一FEATURE <222〉 （35)..(35) <223〉X可為 Val 或 Ala <220〉 <221〉 MISC—FEATURE <222〉 （40)..(40) <223〉X可為 Ser 或 Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223〉X 可為 Ser 或 Gly <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222〉 （44).. (44) <223〉X可為Ser、Fro或Ala <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222〉 (50).. (50) <223〉X可為Phe 或 Tyr
<220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (54).. (54) <223〉X可為Thr、Ala或Ser <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222〉 (61).. (61) <223〉X可為 Ala 或 Asp <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （71)..(71) <223〉X 可為 Glu 或 Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 （78)..(78) <223〉X 可為 Ser 或 Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80) <223〉X可為 Gin 或 Glu <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （81)..(81) <223〉X可為 pro 或 Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 （88)..(88) <223〉X可為Phe、Cys或Tyr <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （93)..(93) <223〉X可為His、Asn或Asp <220〉 <221〉 MISC—FEATURE <222〉 （94)..(94) <223〉X可為Asp、Asn、Tyr或Ser <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222> (95).. (95) <223〉X可為Trp或Ser <220〉 -29 146681-序列表.doc 201036626 <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(97) <223〉X可為Pro或不存在 <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222〉 （98)..(98) <223〉X可為Val、Leu或不存在 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(99) <223〉X可為Thr或Ser <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (1027.. (102) <223> X可爲 Gin 或Glu <220> <221〉MISCJFEATURE <222> (105).. (105) <223〉X可^Arg、Thr或Lys <220〉 <221〉 MISC—FEATURE <222> (1065".. (106) <223〉X可JbLeu或Val <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222〉(1077.. (107) <223〉X可為Glu或Ala <400> 55
Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gin Ser Pro Xaa Thr Leu Ser Xaa Xaa Pro Gly 15 10 15
Glu Xaa Ala Thr Xaa Ser Cys Arg Ala Ser Gin Xaa Val Xaa Xaa Xaa 20 25 30
Xaa Leu Xaa Trp Tyr Gin Gin Xaa Pro Xaa Gin Xaa Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Xaa Gly Ala Ser Xaa Arg Ala Thr Gly lie Pro Xaa Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Phe Thr Leu Thr lie Ser Xaa Leu Xaa 65 70 75 80
Xaa Glu Asp Phe Ala Val Tyr Xaa Cys Gin Gin Tyr Xaa Xaa Xaa Pro 85 90 95
Xaa Xaa Xaa Phe Gly Xaa Gly Thr Xaa Xaa Xaa lie Lys 100 105 <210> 56 <211> 107 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉輕鏈共同序列 <220>
<221> MISC_FEATURE •30· 146681·序列表.doc 201036626 <222〉 （11)..(11) <223〉X可為 Val 或Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 （12)..(12) <223〉X 可為 Ser 或 Phe <220〉 <221〉 MISC-FEATURE <222〉 (15).. (15) <223〉X可為 Val 或 He <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223〉X可為Asp或Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 （29).. (29) <223〉X 可為 lie 或 Val
<220> <221〉 MISC一FEATURE <222〉 （30)..(30) <223〉X可為Ser、He、Asn或Arg <220〉 <221〉MISC 一 FEATURE <222〉 （31)·· (31) <223〉父可為Ser或Asn <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （32)..(32) <223〉X可為 Trp 或Tyr <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (38).. (38) <223〉X可為Arg或Gin <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （42)..(42) <223〉X可為Lys、Met或Thr <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (43)., (43) <223〉X可為Ala或Val <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 （45)..(45) <223〉乂可為 Lysi^Asn <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (46). . (46) <223〉X可為Val或Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 （49).. (49) <223〉X可為Tyr或Rie <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （50)..(50) <223〉X 可為 Ser、Ala 或 Gly <220>
<221> MISC_FEATURE • 31 - 146681-序列表.doc 201036626 <222> (51)..(51) <223〉X可為 Ala 或 Thr <220> <221〉 MISC—FEATURE <222> (53)..(53) <223〉X 可為 Ser、Ile、Asn 或 Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 (55).. (55) <223〉X可為Gin 或Glu <220〉 <221〉 MISC_FEATURE <222〉 (56). . (56) <223〉X 可為 Ser 或 Asn <220〉 <221〉 MISC_FEATURE <222〉 （60). (60) <223〉X 可為 Ser 或 Leu <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (65). . (65) <223〉X 可為 Ser 或 Arg <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （72).. (72) <223〉X可為 Ala或Thr <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （76)..(76) <223〉X可為Ser政Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (83)..(83) <223〉X 可為Phe 或 Val <220〉 <221> MISC_FEATUR£ <222〉 (85). . (85) <223〉X可為Thr或Asn <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222〉 (87). . (87) <223〉X可為Tyr或Cys <220> <221〉 MISC—FEATURE <222〉 （90)·· (90) <223〉X可為Gin或Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 (91). . (91) <223〉X可為Ala、Val或Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 （92)..(92) <223〉X可為Asp或Asn <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (94). . (94) <223〉χ可為 Phe 或 Ala <220〉
<221> MISC_FEATURE -32 146681-序列表.doc 201036626 <222〉 (96).. (96) <223〉X可為Trp、Gly或Phe <220〉
<221〉 MISC一FEATURE <222〉(10〇y.. (100) <223〉X可爲Gin、Aig或Pro <220> <221〉 MISC—FEATURE <222〉 (103j.. (103) <223〉X可為Lys或Asn <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (105).. (105) <223〉X可為Glu或Asp <400> 56
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Xaa Xaa Ala Ser Xaa Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Xaa Lys Fro Gly Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Leu lie 35 40 45
Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Leu Xaa Xaa Gly Val Pro Xaa Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Xaa Gly Ser Gly Thr Asp Phe Xaa Leu Thr lie Xaa Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Xaa Ala Xaa Tyr Xaa Cys Gin Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Pro Xaa 85 90 95
Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Xaa Val Xaa lie Lys 100 105 <210> 57 <211〉 107 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉輕鏈共同序列 <220〉
<221〉 MISC一FEATURE <222〉 （2)..(2) <223〉X可為He或Val <220〉
<221〉 MISC—FEATURE <222〉 （22)..(22) <223〉X可為Ser或Thr <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223〉X可為Ser、Asn或Thr <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222〉 （31)·. (31) 33- 146681-序列表.doc 201036626 <223〉X可為Asn、Thr或Asp <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (43).. (43) <223〉X可為Ala或Val <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （51).. (51) <223〉X可為Ala或Thr <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （56). · (56) <223〉X可為 Thr 或 Ala <220> <221〉 MISC一FEATURE <222〉 （76)..(76) <223〉X可為Asn或Ser <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （77)..(77) <223〉X可為 Gly 或 Ser <220〉 <221〉 MISC—FEATURE <222> (87)..(87) <223〉X 可為 Phe 或 Tyr <220> <221〉 MISC一FEATURE <222〉 (91). . (91) <223〉X 可為 Phe 或 Tyr <220〉 <221〉 MISC—FEATURE <222〉 （93)..(93) <223〉X 可為 Asn 或 lie <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (96).. (96) <223〉X可為Cys、Ser、lie或Tyr <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (97). . (97) <223〉X可為Ser或Thr <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (103).. (103) <223〉X可為Lys、Arg或Asp <400> 57
Asp Xaa Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Xaa Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Xaa Xaa Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Xaa Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Xaa Ser Asn Leu Glu Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 146681-序列表.doc -34- 201036626
Ser Gly 65
Ser Gly Thr
Asp Phe Thr Phe Thr lie Xaa Xaa Leu Gin Pro 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr 85
Tyr Xaa Cys Gin Gin Xaa Asp Xaa Leu Pro Xaa 90 95
Xaa Phe
Gly Gin Gly 100
Thr Xaa Leu Glu lie Lys 105 <210〉 58 <211〉 121 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉重鏈共同序列 <220>
<221> MISC_FEATURE <222〉 （10)..(10) <223〉X可為Gly或Asp <220〉 <221〉 MISC_FEATURE <222> ⑽..（13) <223〉X 可為 Lys 或 Glu <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222> (23).. (23) <223〉X 可為 Thr、Val 或 Ala <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （30)..(30) <223〉X可為Ser、Arg或Asn <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222〉 （32)..(32) <223〉X可為Tyr或Asn <220〉 <221〉 MISC_FEAT脈 <222〉 （40)..(40) <223〉X可為Ala或Thr <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (48).. (48) <223〉X可為Val、lie或Leu <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （53)..(53) 〈223> X可為Ser、Arg或Asn <220> <221〉 MISC一FEATURE <222〉 (54).. (54) <223〉X可為Ser ' Thr、Val或He <220〉 <221〉MISC一FEATURE <222〉 （57)..(57) <223〉X可為Ala、Thr或Val <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （58)..(58) <223〉X可為 thr、Val'Met'He、Leu 或Ser •35- 146681-序列表.doc 201036626 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （59)..(59) <223〉X可為Tyr或His <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (60). . (60) <223〉X可為Tyr、Ser、Asp或Cys <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （73).. (73) <223〉X 可為 Asp、Val 或 His <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 (75). . (75) <223〉X可為 Ala 或 Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76). . (76) <223〉X可為Lys或Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (83). . (83) <223〉X可為]Viet 或 Leu <220> <221〉 MISC一FEATURE <222〉 （84)..(84) <223〉X可為Asp、Asn或Ser <220〉 <221〉MISC一 FEATURE <222〉 (89). . (89) <223〉X可為Glu或Asp <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222〉 （91)..(91) <223〉X可為Thr或Ala <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （94)..(94) <223〉X可為Pile 或Tyr <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （97). . (97) <223〉X可為Ala或Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 （99)..(99) <223〉X可為Glu或Asp <220〉
<221〉 MISC一FEATURE <222〉(10〇y. . (100) <223〉X可爲His、Tyr、Phe或Arg <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉(103).. (103) <223〉X可為 Gly 或Ala <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (104y.. (104) <223〉X可為 Tyr、Trp 或 Leu -36 146681·序列表.doc 201036626 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉(1057.. (105) <223> 父可·^^)或 noe <220> <221> MISC_FEATURE <222〉（106)"·. (106) <223〉X可為Tip、Ala、Phe、Tyr、Ser、Val或Glu <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (107)".. (107) <223〉X 可為 Tyr、Phe、Ser 或 Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222〉（10¾ · (109) <223〉X可為Asp或Glu <220〉
<221> MISC_FEATURE <222〉 (110).. (110) <223〉X可爲Leu、fyr、Servile <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (113T.. (113) <223〉X可為Arg、Gin或His <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (115)-.. (115) <223〉X可為Ala或Thr <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (116)-.. (116) <223〉X可為Leu 或Met <400> 58
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Xaa Leu Val Xaa Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Xaa Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Asp Xaa 20 25 30
Tyr Met Ser Trp lie Arg Gin Xaa Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa 35 40 45
Ser Tyr lie Ser Xaa Xaa Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Xaa Asn Xaa Xaa Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Xaa Xaa Ser Leu Arg Ala Xaa Asp Xaa Ala Val Xaa Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Xaa Xaa Ser Ser Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Phe Xaa Xaa Trp Gly 100 105 110
Xaa Gly Xaa Xaa Val Thr Val Ser Ser 115 120 37- 146681-序列表.doc 201036626 <210> 59 <211〉 118 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉重鏈共同序列 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （29)..(29) <223〉X 可為 Leu 或 Val <220> <221〉 MISC一FEATURE <222> (30)..(30) <223〉X可為Asn、Thr或Ser <220〉 <221〉 MISC—FEATURE <222〉 (34).. (34) <223〉X可為Met或lie <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （54). . (54) <223〉X可為Ala或Gin <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (55). . (55) <223〉X可為Glu或Asp <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222〉 (57). . (57) <223〉X可為Lys戒Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223〉X 可為 He 或 Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 （60)..(60) <223〉X可為Ser或Tyr <220〉 <221> MISC_FEATL)RE <222〉 （66)..(66) <223〉X 可為 Asp 或 Gly <220〉 <221〉 MISC—FEATURE <222〉 (72). . (72) <223〉X可為Asp、Arg或Glu <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (77).. (77) <223〉X可為Asp或Ser <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （79)..(79) <223〉X可為Ala或Val <220> <221> MISC_FEATURE <222〉 （84)..(84) <223〉X 可為 Ser 或 Arg <220> -38 146681-序列表.doc 201036626 <221> MISC_FEATURE <222〉 （87)· . (87) <223〉X 可為_Axg 或 Lys <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （91).. (91) <223〉X 可為 Ser 或 Thr <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （97)..(97) <223〉X可為Ala或Thr <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222〉 （98)..(98) <223〉X可為Thr或Arg <220> <221〉 MISC—FEATURE <222〉 （99)..(99) <223〉X可為Leu、Glu或Gly
<220〉
<221〉 MISC一FEATURE 〈222〉(100).. (100) <223〉X可為 Asp 或Ser <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 (101).. (101) <223〉X可為Phe或Ser <220〉 <221〉 MISC—FEATURE <222〉(103).. (103) <223〉X可為Ser或Ala <400> 59
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Xaa Xaa Asp Leu 20 25 30
Ser Xaa His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa lie Xaa Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Xaa Arg Val Thr Met Thr Xaa Asp Thr Ser Thr Xaa Thr Xaa Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Xaa Ser Leu Xaa Ser Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 60 <211〉 125 39- 146681-序列表.doc 201036626 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉重鏈共同序列 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223〉X可為Gin或Lys <220> <221〉 MISC一FEATURE <222> (16)..(16) <223> X 可為 Gly 或 Arg <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 （89)..(89) <223〉X可為Glu或Asp <400> 60
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Xaa Pro Gly Xaa 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Asn lie Lys Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Asp Trp Asn Tyr Ala Asp Tyr Tyr Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 61 <211> 123 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉重鏈共同序列 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223〉X 可為 Lys 或 Glu <220〉 <221〉 MISC—FEATURE <222〉 （28)..(28) <223〉X 可為 Ser 或 He 40· 146681-序列表.doc 201036626
<220〉 <221〉 MISC FEATURE <222〉 (31).· (31) <223〉 X可為Gly或Ser <220〉 <221〉 MISC FEATURE <222〉 (35).. (35) <223〉 X可為Gly或Ala <220〉 <221> MISC FEATURE <222〉 (40).. (40) <223〉 X可為Met或Leu <220〉 <221> MISC FEATURE <222> (52).. (52) <223> 乂可為Tyr或Asp <220> <221〉 MISC FEATURE <222〉 (54).. (54) <223〉 X可為Tyr或Asn <220〉 <221〉 MISC FEATURE <222〉 (77).. (77) <223〉 X可為Asn或His <220〉 <221〉 MISC FEATURE <222〉 (94).. (94) <223> X可為Phe或Tyr <220> <221> MISC FEATURE <222〉 (98).. (98) <223〉 X可為Ser咸Thr <220〉 <221> MISC FEATURE <222〉 (105)-.. (105) <223〉 X可為Glu或Thr <220> <221〉 MISC FEATURE <222〉 (1061.. (106) <223〉 X可爲Phe或亡eu <220> <221〉 MISC FEATURE <222〉 (1095*·. (109) <223〉 X可爲Pro或01y <220> <221〉 MISC FEATURE <222〉 (110).. (110) <223> X可爲Leu或乒he <220〉 <221〉 MISC FEATURE <222〉 (llO-. (Ill) <223> X可為Asn或Tyr <400〉 61 Glu Val 1
Ser Leu
Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Xaa 5 10 Lys He Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Xaa Phe 20 25
Pro Gly Glu 15
Thr Xaa Tyr 30 146681-序列表.doc •41 · 201036626
Trp lie Xaa Trp Val Arg Gin Xaa Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly lie lie Xaa Pro Xaa Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Xaa Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Xaa Tyr Cys 85 90 95
Ala Xaa His Arg Leu Trp Leu Gly Xaa Xaa Pro Gly Xaa Xaa Xaa lie 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 62 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉FLAG (註冊商標）肽 <400> 62
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 63 <211〉 321 <212> DNA <213〉智人 <400> 63 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca acagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatctatggt gcatccaatt tggaaagtgg ggtcccatca aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct gaagattttg caaattacta ttgtcaacag gctaacagtt tcccgtggac gttcggccaa gggaccaagg tggaaatcaa a <210> 64 <211> 354 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 64 caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc tcctgcaagg tttccggata caccctcagt gatttatcca tccactgggt gcgacaggct cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcctc aagatggtga aacaatctac gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac atggagctga gcagcctgaa atctgaggac acggccgtgt attactgcgc aacggggagc agctcgtcct ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc tagt •42- 146681·序列表.doc 201036626 <210> 65 <211> 324 <212〉DM <213〉智人 <400> 65 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctcccgggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt agcaacttag tctggtatca gcagaaacct ggccaggctc ccaggctcct catttatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct gaagattttg cagtttatta ctgtcagcaa tatgatgact ggcctccgct cactttcggc ggagggacca cggtggagat caaa
<210〉 66 <211〉 360 <212> DNA <213〉智人 <400> 66 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg gctttcatac attagtaata gtggtagtgc catgtactac gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaggaa ctcactgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt actactgtgc gagagagtat agcagtggct ggttcttctt tgagtcctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctctagt <210〉 67 <211> 321 <212> DNA <213〉智人 <400> 67 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtttgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaatctcct gatctatggt gcatccagtt tacaaaatgg ggtcccatta aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tcccgtggac gttcggccaa gggaccaagg tggaaatcaa a <210〉 68 <211〉 354 <212〉 DNA <213〉智人 <400> 68 caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc tcctgcaagg tttccggata caccgtcact gatttatcca tgcactgggt gcgacaggct cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcctc aagatggtga aacaatctac gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac atggagctga gaagcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtac aacagaaagc agctcggcct ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc tagt -43- 146681-序列表.doc 201036626 <210 69 <211〉 324 <212〉 DNA <213〉智人 <400> 69 cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttga 324 <210> 70 <211〉 107 <212〉 PRT <213〉智人 〈400〉 70
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210〉 71 <211〉 981 <212> DNA <213〉智人 <400> 71 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300 eiaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420 -44- 14668丨-序列表.doc 201036626 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600 aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960 tccctgtctc cgggtaaatg a 981 〇
<210> 72 <211〉 326 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 72
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Px-〇 Cys Pro Ala Pro 100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125
Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp 180 185 190 -45- 146681·序列表.doc 201036626
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205
Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 210 215 220
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 • 46· 146681-序列表.doc

Claims (1)

  1. 201036626 七、申請專利範圍： 1. 一種經分離之α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白’其具 有包含CDR1、CDR2及CDR3之重鏈可變區及包含 CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變區，其中各CDR係選自 由以下組成之群： a) SEQ ID ΝΟ:55 之輕鏈 CDR1、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:58 之重鏈 CDR1、CDR2 及 CDR3 ; b) SEQ ID NO:56 之輕鏈 CDR1、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:59 之重鏈 CDR1、CDR2 及 CDR3 ;及 c) SEQ ID NO:57 之輕鏈 CDR1、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:60 之重鏈 CDR1、CDR2 及 CDR3。 2. 如請求項1之α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白，其係 選自由以下組成之群： a) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO :55且該重鏈可變區包 含SEQIDNO:58之抗原結合蛋白； b) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:55，其中一些、大多 數或所有N端Glu經環化，且該重鏈可變區包含SEQ ID NO:58之抗原結合蛋白； c) 該輕鏈可變區包含SEQ ID ΝΟ··56且該重鏈可變區包 含SEQIDNO:59之抗原結合蛋白；及 d) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:57且該重鏈可變區包 含SEQIDNO:60之抗原結合蛋白。 3. —種經分離之α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白，其具 有包含CDR1、CDR2及CDR3之重鏈可變區及包含 146681.doc 201036626 CDRl、CDR2及CDR3之輕鏈可變區，其中該輕鏈 CDR1、CDR2及CDR3係選自由以下組成之群： a) 分別與 SEQ ID NO:3 之 CDRl、CDR2 及 CDR3 至少 90%—致之 CDRl、CDR2及 CDR3 ; b) 分別與 SEQ ID NO:5 之 CDRl、CDR2 及 CDR3 至少 90%—致之 CDRl、CDR2及 CDR3 ; c) 分別與 SEQ ID NO:7 之 CDRl、CDR2 及 CDR3 至少 90%—致之 CDRl、CDR2及 CDR3 ; d) 分別與 SEQ ID NO:22 之 CDRl、CDR2 及 CDR3 至少 90%—致之 CDRl、CDR2及 CDR3 ;及 e) 分別與 SEQ ID NO:24 之 CDRl、CDR2 及 CDR3 至少 90〇/〇—致之 CDRl、CDR2及 CDR3 ; 及該重鏈可變CDRl、CDR2及CDR3係來自SEQ ID NO:58。 4.如請求項3之α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白，其中 該輕鏈可變區係選自由以下組成之群： a) 與SEQIDNO:3至少90%—致之輕鏈可變區； b) 與SEQIDNO:5至少90%—致之輕鏈可變區； c) 與SEQIDNO:7至少90°/。一致之輕鏈可變區； d) 與SEQIDNO:22至少90%—致之輕鏈可變區；及 e) 與SEQIDNO:24至少90°/。一致之輕鏈可變區； 及該重鏈可變區包含SEQ ID NO:5 8。 5· —種經分離之α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白，其具 有包含CDRl、CDR2及CDR3之重鏈可變區及包含 146681.doc 201036626 CDRl、CDR2及CDR3之輕鏈可變區，其中該輕鏈 CDR1、CDR2及CDR3係選自由以下組成之群： a) 分別與 SEQ ID N〇:12 之 CDRl、CDR2 及 CDR3 至少 90%—致之 CDRl、CDR2及 CDR3 ; b) 分別與 SEQ ID NO:25 之 CDRl、CDR2及 CDR3 至少 90%—致之CDRl、CDR2及 CDR3 ;及 c) 分別與 SEQ ID NO:26 之 CDRl、CDR2 及 CDR3 至少 90%—致之 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; 及該重鏈CDRl、CDR2及CDR3係選自由以下組成之 群： a’）分別與 SEQ ID NO:41 之 CDRl、CDR2及 CDR3 至少 90%—致之 CDRl、CDR2及 CDR3 ;及 b，）分別與 SEQ ID NO:54 之 CDRl、CDR2 及 CDR3 至少 90%—致之 CDRl、CDR2及 CDR3。 6. 如請求項5之α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白，其中 該輕鏈可變區係選自由與SEQ ID NO: 12、25及26中任一 者至少90%—致之可變區組成之群；及該重鏈可變區係 選自由與SEQ ID NO:41及54中任一者至少90% —致之可 變區組成之群。 7. —種經分離之α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白，其具 有包含CDRl、CDR2及CDR3之重鏈可變區及包含 CDRl、CDR2及CDR3之輕鏈可變區，其中各CDR與選自 由以下組成之群的CDR至少90%—致： a)SEQ ID ΝΟ:10之輕鏈CDRl、CDR2及 CDR3，及 SEQ 146681.doc 201036626 IDNO:38 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; b) SEQ ID NO:2 之輕鏈 CDR1、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:30 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; c) SEQ ID NO:20 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:51之重鏈 CDRl、CDR2及 CDR3 ; d) SEQ ID NO:ll 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:39 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; e) SEQ ID NO:13 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:42 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; f) SEQ ID NO:17 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:46 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; g) SEQ ID NO:8 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:36 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; h) SEQ ID NO:19 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:49 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; i) SEQ ID NO:18 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:47 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; j) SEQ ID NO:21 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:52 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; k) SEQ ID NO:3 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:31 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; l) SEQ ID NO:7 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:35 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; m) SEQ ID NO:6 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ 146681.doc -4- 201036626 IDNO:34 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; n) SEQ ID NO:l 之輕鏈 CDR1、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:29 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; o) SEQ ID NO:22 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:50 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; p) SEQ ID NO:24 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:40 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ;
    q) SEQ ID NO:9 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:37 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; r) SEQ ID NO:4 之輕鏈 CDRl、CDR2及 CDR3，及 SEQ IDNO:32 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; s) SEQ ID NO:28 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:53 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; t) SEQ ID NO:16 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:45 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; u) SEQ ID NO:15 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:44之重鏈 CDRl、CDR2及 CDR3 ; v) SEQ ID NO:14 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:43 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; w) SEQ ID NO:27 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:43 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; x) SEQ ID NO:5 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:33之重鏈 CDRl、CDR2及 CDR3 ; y) SEQ ID NO:12 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ 146681.doc 201036626 IDNO:41 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; z)SEQ ID NO:23 之輕鏈 CDR1 ' CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:48 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; a')SEQ ID NO:25 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:54 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ;及 b，）SEQ ID NO:26 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ 1〇购:54之重鏈0〇111、€〇112及匸〇113。 8.如請求項7之α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白，其中 各CDR係選自由以下組成之群： a) SEQ ID ΝΟ:10 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:38 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; b) SEQ ID NO:2 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:30 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; c) SEQ ID NO:20 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:51之重鏈 CDRl、CDR2及 CDR3 ; d) SEQ ID ΝΟ:11 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:39之重鏈 CDRl、CDR2及 CDR3 ; e) SEQ ID NO:13 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:42 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; f) SEQ ID NO:17 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:46 之重鏈 CDRl ' CDR2 及 CDR3 ; g) SEQ ID NO:8 之輕鍵 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:36 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; h) SEQ ID NO:19 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ 146681.doc 201036626 IDNO:49 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; i) SEQ ID NO:18 之輕鏈 CDR1、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:47 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; j) SEQ ID NO:21 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:52 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; k) SEQ ID NO:3 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:31 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ;
    l) SEQ ID NO:7 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:35 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; m) SEQ ID NO:6 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:34之重鏈CDRl、CDR2及 CDR3 ; n) SEQ ID NO:l 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:29之重鏈CDRl、CDR2及 CDR3 ; o) SEQ ID NO:22 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:50 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; p) SEQ ID NO:24 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:40之重鏈 CDRl、CDR2及 CDR3 ; q) SEQ ID NO:9之輕鏈 CDRl、CDR2及 CDR3，及 SEQ IDNO:37 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; r) SEQ ID NO:4之輕鏈 CDRl、CDR2及 CDR3，及 SEQ IDNO:32 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; s) SEQ ID NO:28 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:53 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; t) SEQ ID NO:16 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ 1466Bl.doc 201036626 IDNO:45 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; u) SEQ ID NO:15 之輕鏈 CDR1 ' CDR2 及 CDR3，及 SEQ 1〇1^0:44之重鏈€〇111、〇〇112及€〇113; v) SEQ ID NO:14 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:43 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; w) SEQ ID NO:27 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:43之重鏈 CDRl、CDR2及 CDR3 ; x) SEQ ID NO:5 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:33 之重鏈 CDRl、CDR2及 CDR3 ; y) SEQ ID NO:12 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:41 之重鏈 CDRl、CDR2及 CDR3 ; z) SEQ ID NO:23 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:48 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ; a')SEQ ID NO:25 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ IDNO:54 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3 ;及 b')SEQ ID NO:26 之輕鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3，及 SEQ ID NO:54 之重鏈 CDRl、CDR2 及 CDR3。 9·如請求項7之α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白，其 中： a) 該輕鏈可變區與SEQ ID ΝΟ:10至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQ ID ΝΟ:38至少90%—致； b) 該輕鏈可變區與SEQ ID ΝΟ:2至少90%—致，及該重 鏈可變區與SEQIDNO:30至少90%—致； c) 該輕鏈可變區與SEQ ID NO:20至少90%—致，及該 146681.doc 201036626 重鏈可變區與SEQ ID NO:51至少90%—致； d) 該輕鏈可變區與SEQ ID ΝΟ:11至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQ ID NO:39至少90%—致； e) 該輕鏈可變區與SEQ ID NO:13至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQ ID NO:42至少90%—致； f) 該輕鏈可變區與SEQ ID NO: 17至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQ ID NO:46至少90%—致； g) 該輕鏈可變區與SEQ ID N0:8至少90%—致，及該重 鏈可變區與SEQ ID NO:36至少90%—致； h) 該輕鏈可變區與SEQ ID N0:19至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQ ID NO:49至少90°/。一致； i) 該輕鏈可變區與SEQ ID NO:18至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQ ID NO:47至少90%—致； j) 該輕鏈可變區與SEQ ID N0:21至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQ ID NO:52至少90°/。一致； k) 該輕鏈可變區與SEQ ID NO:3至少90%—致，及該重 鏈可變區與SEQ ID N0:31至少90%—致； l) 該輕鏈可變區與SEQ ID NO:7至少90%—致，及該重 鏈可變區與SEQ ID NO:35至少90%—致； m) 該輕鏈可變區與SEQ ID N0:6至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQ ID NO:34至少90%—致； η)該輕鏈可變區與SEQ ID N0:1至少90%—致，及該重 鏈可變區與SEQ ID NO:29至少90%—致； 〇)該輕鏈可變區與SEQ ID NO:22至少90%—致，及該 146681.doc 201036626 重鏈可變區與SEQIDNO:50至少90%—致； P)該輕鏈可變區與SEQ ID NO:24至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQIDNO:40至少90%—致； q) 該輕鏈可變區與SEQ ID NO:9至少90%—致，及該重 鏈可變區與SEQ ID NO:37至少90%—致； r) 該輕鏈可變區與SEQ ID NO:4至少90%—致，及該重 鏈可變區與SEQ ID NO:32至少90%—致； s) 該輕鏈可變區與SEQ ID NO:28至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQIDNO:53至少90%—致； t) 該輕鏈可變區與SEQ ID NO:16至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQ ID NO:45至少90%—致； u) 該輕鏈可變區與SEQ ID NO: 15至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQIDNO:44至少90%—致； v) 該輕鏈可變區與SEQ ID NO: 14至少90°/。一致，及該 重鏈可變區與SEQIDNO:43至少90%—致； w) 該輕鏈可變區與SEQ ID NO:27至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQ ID NO:43至少90%—致； X)該輕鏈可變區與SEQ ID NO:5至少90%—致，及該重 鏈可變區與SEQIDNO:33至少90%—致； y) 該輕鏈可變區與SEQ ID N0:12至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQ ID N0:41至少90%—致； z) 該輕鏈可變區與SEQ ID NO:23至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQ ID NO:48至少90%—致； a’）該輕鏈可變區與SEQ ID NO:25至少90%—致，及該 146681.doc -10- 201036626 重鏈可變區與SEQ ID NO:54至少90%—致；及 b1)該輕鏈可變區與SEQ ID NO:26至少90%—致，及該 重鏈可變區與SEQ ID NO:54至少90%—致。 10.如請求項9之經分離之α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋 白，其中： a) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 10，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:38 ; b) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:2，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:30 ; c) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:20，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:51 ; d) 該輕鏈可變區包含SEQ ID ΝΟ:11，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:39 ; e) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 13，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:42 ; f) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 17，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:46 ; g) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:8，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:36 ; h) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:19，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:49 ; i) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:18，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:47 ; j) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:21，及該重鏈可變區 146681.doc -11 - 201036626 包含 SEQ ID ΝΟ··52 ; k) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:3，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:31 ; l) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:7，及該重鏈可變區包 含 SEQ ID NO:35 ; m) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:6，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID N0.34 ; η)該輕鏈可變區包含SEQ ID ΝΟ:1，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:29 ; 〇)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:22，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:50 ; p) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO :24，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:40 ; q) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO :9，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:37 ; r) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:4，及該重鏈可變區包 含 SEQ ID NO:32 ; s) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:28，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:53 ; t) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 16，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:45 ; u) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:15，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:44 ; v) 該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:14，及該重鏈可變區 146681.doc -12- 201036626 包含 SEQ ID NO:43 ; w)該輕鏈可變區包含SEQ id n〇:27，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:43 ; X)s亥輕鏈可變區包含SEQ ID n〇:5，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:33 ; y)該輕鏈可變區包含SEQ lD no:12，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:41 ; Z)該輕鏈可變區包含SEQ ID NCh23 ,及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:48 ; 3’）該輕鏈可變區包含SEQ ID n〇:25，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:54 ; b·)該輕鏈可變區包含SEq ID n〇:26，及該重鏈可變區 包含 SEQ ID NO:54。 11·如請求項1至10中任一項之經分離之α4ρ7雜二聚體專— 性抗原結合蛋白，其進一步包含輕鏈恆定區及重鏈恆定 區。 12.如請求項丨丨之經分離之α4β7雜二聚體專—性抗原結合蛋 白，其中該輕鏈恆定區係選自由以下組成之群： α a)K型輕鏈恆定區；及 ΐ>)λ型輕鏈恆定區； 及該重鏈恆定區係選自由以下組成之群： a'WgD抗體之恆定區； b')IgE抗體之恆定區； c’）IgM抗體之恆定區； 146681.doc 13 201036626 d’）IgGl抗體之恆定區； e')IgG2抗體之恆定區； f)IgG3抗體之恆定區； g|)IgG4抗體之恆定區；及 h’）在鉸鏈區中具有至少一個減少Η鏈内二硫鍵形成趨 勢之突變的IgG4抗體之恆定區。 13. 如請求項12之經分離之α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋 白，其中該輕鏈恆定區係選自由以下組成之群： a) 包含SEQ ID ΝΟ:70之多肽； b) 與SEQIDNO:70至少90%—致之多肽； c) 具有SEQ ID NO:70所述胺基酸序列已移除一個、兩 個、三個、四個或五個N端及/或C端胺基酸之多肽；及 d) 併入一或多個轉譯後修飾之a)、b)或c)多肽； 及該重鏈恆定區係選自由以下組成之群： a')包含SEQ ID NO:72之多肽； b1)與SEQ ID NO:72至少90%—致之多肽； c')具有SEQ ID NO:70所述胺基酸序巧已移除一個、兩 個、三個、四個或五個N端及/或C端胺基酸之多肽；及 d')併入一或多個轉譯後修飾之a1)、b’）或c')多肽。 14. 一種經分離之α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋白，其在 CD4+記憶Τ細胞結合檢定中具有小於35 ng/ml之EC50。 15. 如請求項14之經分離之α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋 白，其在CD4+記憶Τ細胞結合檢定中具有小於10 ng/ml 之ec50。 146681.doc -14- 201036626 16_ —種經分離之α4β7雜二聚體專—性抗原結合蛋白其在 MAdCAM競爭檢定中具有小於30 ng/mkIC5〇。 17.如請求項16之經分離之α4β7雜二聚體專一性抗原結合蛋 白，其在MAdCAM競爭檢定中具有小於1〇 丨之 IC50。 18· —種經分離之α4β7雜二聚體專—性抗原結合蛋白，其結 合α4β7之S250N突變體。 19. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項丨至“中任一項之 抗原結合蛋白。 2〇·種載體，其包含如請求項19之核酸。 21. —種經分離之宿主細胞，其經如請求項2〇之載體轉染或 轉型。 ^ 22_ —種製備抗原結合蛋白之方法，其包含如請求項η之宿 主細胞在促進表現之條件下培養，及自培養基回收該蛋 白0 〇 23.種組合物，其包含如請求項1至18中任一項之多肽及 生理學上可接受之稀釋劑、賦形劑或載劑。 24. 一種如請求項1至18中任一項之α4β7雜二聚體專一性抗 原、。蛋白之用途，其係用於製造用以抑制α4ρ7之至少 一種活性的藥物。 25. 種如凊求項1至18中任一項之α4β7雜二聚體專一性抗 原、。蛋白之用途’其係用於製造用以抑制表現α4ρ7之 、’田胞運輸至包含表現MAdCAM-Ι之細胞之組織的藥物。 •種如晴求項23之組合物之用途，其係用於製造用以治 146681.doc •15- 201036626 療個體罹患特徵在於表現·細胞不當運輸至包含表 現MAdC AM- i之細胞的組織之病㈣藥物。 27. 如請求項26之用途，其中該病狀為發炎性腸病。 28. 如請求項27之用途，其中該病狀係選自由以下組成之 群：潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病（Cr〇hn，s disease)、乳糜 瀉（非熱帶性口瘡）、與血清陰性關節病相關之腸病、顯 微結腸炎（microscopic colitis)或膠原性結腸炎 (collagenous colitis)、嗜伊紅血球性胃腸炎，及直腸結 腸切除術（proctocolectomy)及迴腸肛門吻合術（ileoanai anastomosis)後所致之貯袋炎（p〇uchii；is)。 29. 如請求項26之用途，其中該病狀係選自由以下組成之 群：胰臟炎、胰島素依賴性糖尿病、乳房炎、膽囊炎、 膽管炎、膽管周圍炎、慢性支氣管炎、慢性竇炎、哮喘 及移植物抗宿主疾病。 30. —種足以用作雜交探針、PCR引子或定序引子之經分離 之聚核苷酸’其為如請求項19之核酸分子或其互補之片 段0 146681.doc -16- 201036626 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 146681.doc -2-
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